DE69434431T2

DE69434431T2 - Methoden zur behandlung von muskelerkrankungen und muskelstörungen

Info

Publication number: DE69434431T2
Application number: DE69434431T
Authority: DE
Inventors: Robert Sklar; Mark Marchionni; I. David GWYNNE
Original assignee: Acorda Therapeutics Inc
Current assignee: Acorda Therapeutics Inc
Priority date: 1993-05-06
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2014-05-07
Also published as: US7384756B1; US7115554B1; KR100306244B1; ES2243928T3; US6444642B1; US20090018073A1; JPH11507201A; JP4018028B2; DE69434431D1; WO1994026298A1; ATE299710T1; AU6827894A; EP0703785B8; CA2162262A1; US7718606B2; EP0703785B1; US20110144015A1; KR960702318A; EP0703785A1; JP2004043437A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine prophylaktische oder tatsächliche Behandlung von Krankheiten und Fehlfunktionen der Muskulatur durch Verabreichung von Polypeptiden, die in Wirbeltierarten vorkommen, wobei diese Polypeptide Wachstums-, Differenzierungs- und Überlebensfaktoren für Muskelzellen sind.
Muskelgewebe regeneriert sich in erwachsenen Wirbeltieren aus Reserve-Myoblasten, die Satellitenzellen genannt werden. Satellitenzellen sind im ganzen Muskelgewebe verteilt und befinden sich in einem mitotischen Ruhezustand, solange keine Verletzung oder Krankheit vorliegt. Nach einer Muskelverletzung oder während der Genesung von einer Krankheit treten die Satellitenzellen wieder in den Zellzyklus ein, proliferieren und 1) dringen in vorliegende Muskelfasern ein oder 2) durchlaufen eine Differenzierung zu mehrkernigen Myotubuli, die neue Muskelfasern bilden. Die Myoblasten ergeben schließlich Ersatzmuskelfasern oder fusionieren mit vorliegenden Muskelfasern, wodurch der Umfang der Fasern durch die Synthese von Komponenten des kontraktilen Apparats vergrößert wird. Dieser Prozess wird z.B. durch die nahezu vollständige Regeneration verdeutlicht, die in Säugern nach einer induzierten Muskelfaserdegeneration zustande kommt; die Muskel-Vorläuferzellen proliferieren und fusionieren miteinander, wodurch die Muskelfasern regeneriert werden.
Verschiedene Wachstumsfaktoren wurden identifiziert, die die Proliferation und Differenzierung von erwachsenen (und embryonalen) Myoblasten in vitro regulieren. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) ist für Muskelzellen mitogen und stellt einen Hemmstoff der Muskeldifferenzierung dar. Der transformierende Wachstumsfaktor β (TGFβ) hat keine Wirkung auf die Proliferation von Myoblasten, ist jedoch ein Inhibitor der Muskeldifferenzierung. Für Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) wurde gezeigt, dass sie sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung von Myoblasten in Nagern stimulieren. Der aus Blutplättchen Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor (PDGF) ist auch für Myoblasten mitogen und stellt einen wirksamen Inhibitor der Muskelzelldifferenzierung dar, vgl. Florini und Magri, 256: C701–C711, 1989.
In Wirbeltierarten können Faktoren, die die Proliferation und Differenzierung von Myoblasten stimulieren, möglicherweise sowohl aus Muskelgewebe als auch aus Neuronen stammen. Bei Krankheiten, die das neuromuskuläre System beeinträchtigen und die neuralen Ursprungs (d.h. neurogen) sind, wird das durch den betroffenen Nerv innervierte Muskelgewebe paralysiert und verfällt immer mehr. Während einer Regeneration und Genesung von peripheren Nerven von einer neurologischen und myopathischen Krankheit können aus Neuronen Wachstumsfaktoren hervorgehen, welche die vorstehend beschriebene Muskelregeneration zustande bringen und einen Mechanismus für die Genesung des Muskels von Verfall und Atrophie bereitstellen.
Eine kürzlich beschriebene Familie von Wachstumsfaktoren, die Neureguline, werden durch motorische Neuronen (Marchioni et al., Nature 362: 313, 1993) und Entzündungszellen synthetisiert (Tarakhovsky et al., Oncogene 6: 2187–2196, 1991). Die Neureguline und verwandte p185^erbB2-bindende Faktoren wurden gereinigt, cloniert und exprimiert (Benveniste et al., PNAS 82: 3930–3934, 1985; Kimura et al., Nature 348: 257–260, 1990; Davis und Stroobant, J. Cell Biol. 110: 1353–1360, 1990; Wen et al., Cell 69: 559, 1992; Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 443, 1988; Holmes et al., Science 256: 1205, 1992; Dobashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8582,1991; Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 2287, 1992). Für rekombinante Neureguline wurde gezeigt, dass sie für periphere Glia mitogen sind (Marchionni et al., Nature 362: 313, 1993), außerdem wurde für sie gezeigt, dass sie die Bildung der motorischen Endplatte beeinflussen (Falls et al., Cell 72: 801, 1993). Somit stellen das regenerierende Neuron und die Entzündungszellen, die mit der Genesung von einer neurogenen Krankheit und Nervenverletzung assoziiert sind, Faktoren bereit, welche die Remyelinierung von motorischen Neuronen und ihre Fähigkeit koordinieren, die geeignete Verbindung mit ihrem Ziel zu bilden. Nachdem der Muskel wieder innerviert wurde, kann das motorische Neuron Faktoren für den Muskel bereitstellen, welche das Wachstum und Überleben von Muskeln stimulieren.
Zurzeit gibt es keine geeignete Therapie, mit der die Differenzierung und das Überleben von Muskeln unterstützt werden kann. Eine solche Therapie wäre für die Behandlung von verschiedenartigen neuralen und muskulären Krankheiten und Fehlfunktionen geeignet.
Wir haben entdeckt, dass eine gesteigerte Mitogenese, Differenzierung und ein gesteigertes Überleben von Muskelzellen unter Verwendung von Proteinen erreicht werden können, die bisher als Glia-Wachstumsfaktoren, Acetylcholin-Rezeptor-induzierende Aktivität (ARIA), Hereguline, Neu-Differenzierungsfaktor und allgemeiner als Neureguline beschrieben wurden. Wir haben entdeckt, dass diese Verbindungen in der Lage sind, sowohl die Proliferation von Muskelzellen als auch die Differenzierung und das Überleben von Myotubuli zu induzieren. Diese Phänomene können in Herzmuskelgewebe und in glattem Muskelgewebe und außerdem in Skelettmuskelgewebe vorkommen. Somit sind die vorstehenden Verbindungen, regulatorische Verbindungen, welche die Synthese dieser Verbindungen induzieren, und kleine Moleküle, welche diese Verbindungen nachahmen, indem sie an die Rezeptoren auf dem Muskel binden oder indem sie auf andere Weise die Systeme der zweiten Messenger stimulieren, die durch den Ligand-Rezeptor-Komplex aktiviert werden, alle als prophylaktische und tatsächliche Therapien für Muskelkrankheiten außerordentlich nützlich.
Ein neuer Aspekt der Erfindung umfasst die Verwendung der vorstehend angesprochenen Proteine als Wachstumsfaktoren für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer Krankheit oder Fehlfunktion der Muskulatur durch Steigerung von Mitogenese, Überleben, Wachstum und Differenzierung von Muskelzellen. Die Behandlung der Muskelzellen, so dass diese Effekte erreicht werden, kann erfolgen, indem Muskelzellen mit einem hier beschriebenen Polypeptid in Kontakt gebracht werden. Die Verwendung kann bereitgestellt werden, um den Netto-Muskelverlust zu verlangsamen und aufzuhalten oder um die Menge und Qualität der in einem Wirbeltier vorliegenden Muskeln zu erhöhen.
Diese Faktoren können verwendet werden, um die Mitogenese, die Differenzierung und das Überleben von Muskelzellen in einem Wirbeltier (vorzugsweise einem Säuger, stärker bevorzugt einem Menschen) zu erreichen, indem eine wirksame Menge eines Polypeptids oder einer verwandten Verbindung verwendet wird. Neuregulin-Effekte auf einen Muskel können z.B. erfolgen, indem eine Zunahme der Muskelleistung bewirkt wird, indem die Synthese von bestimmten Isoformen des kontraktilen Apparats induziert wird, z.B. der langsamen und schnellen Isoformen der schweren Kette des Myosins; indem das Überleben von Muskelfasern durch die Induktion der Synthese von Schutzmolekülen, z.B., jedoch nicht beschränkt auf Dystrophin, gefördert wird; und/oder indem die Muskelinnervation gesteigert wird, z.B. durch Vermehren von Acetylcholin-Rezeptor-Molekülen an der motorischen Endplatte.
Der hier verwendete Begriff Muskelzelle bezieht sich auf eine beliebige Zelle, die zum Muskelgewebe beiträgt. Myoblasten, Satellitenzellen, Myotubuli und Myofibrillengewebe sind alle im Begriff „Muskelzellen" enthalten und können alle unter Verwendung der Verfahren der Erfindung behandelt werden. Die Effekte auf Muskelzellen können innerhalb von Skelettmuskeln, Herzmuskeln oder glatten Muskeln induziert werden.
Die Mitogenese kann in Muskelzellen, umfassend Myoblasten oder Satellitenzellen des Skelettmuskels, glatten Muskels oder Herzmuskels induziert werden. Mitogenese bezieht sich in der Verwendung hier auf eine beliebige Zellteilung, die im Patienten zur Produktion von neuen Muskelzellen führt. Insbesondere ist Mitogenese in vitro als eine Zunahme des Mitose-Indexes im Vergleich zu unbehandelten Zellen von 50 %, stärker bevorzugt von 100 %, und am stärksten bevorzugt von 300 %, definiert, wenn die Zellen einem Markierungsmittel eine Zeit ausgesetzt werden, die zwei Verdopplungszeiten entspricht. Der Mitose-Index ist die Fraktion von Zellen in Kultur, die markierte Kerne aufweisen, wenn sie in Gegenwart einer Markierungssubstanz gezüchtet werden, die nur während der S-Phase eingebaut wird (d.h. BrdU), und die Verdopplungszeit ist als die durchschnittliche Zeit definiert, die erforderlich ist, dass die Zellzahl in der Kultur um einen Faktor zwei zunimmt).
Eine Wirkung auf die Mitogenese in vivo ist als eine Steigerung der Aktivierung von Satellitenzellen definiert, die durch das Auftreten von markierten Satellitenzellen im Muskelgewebe eines Säugers gemessen wird, der einer Markierungssubstanz ausgesetzt wird, die nur während der S-Phase eingebaut wird (d.h. BrdU). Ein geeignetes Therapeutikum ist als eine Verbindung definiert, die bei einer in vivo-Verabreichung die Aktivierung von Satellitenzellen im Vergleich zu einem Kontrollsäuger um mindestens 10 %, stärker bevorzugt um mindestens 50 % und am stärksten bevorzugt um mehr als 200 % steigert, wenn der Säuger einem Markierungsmittel einen Zeitraum ausgesetzt wird, der größer als 15 Minuten ist, und die Gewebe zwischen zehn Stunden und 24 Stunden nach der Verabreichung des Mitogens in der therapeutischen Dosis getestet werden. Andererseits kann die Aktivierung von Satellitenzellen in vivo nachgewiesen werden, indem das Auftreten des intermediären Filaments Vimentin durch immunologische Methoden oder RNA-Analyse-Verfahren überwacht wird. Wenn Vimentin getestet wird, ist das geeignete Mitogen als eines definiert, das die Expression von nachweisbaren Spiegeln von Vimentin im Muskelgewebe bewirkt, wenn die therapeutisch wirksame Dosis bereitgestellt wird.
Myogenese bezieht sich in der Verwendung hier auf eine beliebige Fusion von Myoblasten, so dass Myotubuli entstehen. Am stärksten bevorzugt ist ein Effekt auf die Myogenese als eine Zunahme in der Fusion von Myoblasten und das Inkrafttreten des Muskel-Differenzierungsprogramms definiert. Das geeignete myogene Therapeutikum ist als ein Polypeptid definiert, das eine beliebige Zunahme des Fusions-Indexes in vitro bewirkt. Stärker bevorzugt bewirkt das Polypeptid mindestens eine 2,0-fache Zunahme, und am stärksten bevorzugt bewirkt die Verbindung eine dreifache oder größere Zunahme des Fusions-Indexes im Vergleich zur Kontrolle. Der Fusions-Index ist als die Fraktion von Kernen definiert, die in mehrkernigen Zellen in der Kultur im Vergleich zur Gesamtzahl der in der Kultur vorliegenden Kerne vorhanden ist. Die vorstehend angegebenen prozentualen Anteile beziehen sich auf Zellen, die nach sechs Tagen Kontakt mit dem myogenen Polypeptid getestet wurden, und stellen einen Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle dar. Die Myogenese kann auch bestimmt werden, indem die Zahl von Kernen pro Bereich in Myotubuli ermittelt wird oder indem die Spiegel eines Muskel-spezifischen Proteins durch Western-Analyse gemessen werden. Vorzugsweise bewirkt das Polypeptid unter Verwendung des z.B. hier bereitgestellten Tests mindestens eine 2,0-fache Zunahme der Dichte der Myotubuli, und am stärksten bevorzugt bewirkt das Polypeptid eine dreifache oder größere Zunahme.
Das Muskelwachstum kann durch die Zunahme in der Fasergröße und/oder durch die Steigerung der Zahl der Fasern erfolgen. Das Muskelwachstum kann in der Verwendung hier durch A) eine Zunahme des Feuchtgewichts, B) eine Zunahme des Proteingehalts, C) eine Zunahme der Zahl der Muskelfasern oder D) eine Zunahme des Durchmessers der Muskelfasern gemessen werden. Eine Zunahme des Wachstums einer Muskelfaser kann als eine Zunahme im Durchmesser definiert sein, wobei der Durchmesser als die kleinere Achse der Ellipse des Querschnitts definiert ist. Das geeignete Therapeutikum ist eines, welches das Feuchtgewicht, den Proteingehalt und/oder den Durchmesser um 10 % oder mehr, stärker bevorzugt um mehr als 50 % und am stärksten bevorzugt um mehr als 100 % in einem Tier steigert, dessen Muskeln vorher um mindestens 10 % degeneriert waren, wobei dies im Vergleich zu einem ähnlich behandelten Kontrolltier gilt (d.h. einem Tier mit degeneriertem Muskelgewebe, das nicht mit der Muskelwachstumsverbindung behandelt wird). Eine Verbindung, die das Wachstum steigert, indem sie die Zahl der Muskelfasern erhöht, ist als Therapeutikum nützlich, wenn sie die Zahl der Fasern in dem erkrankten Gewebe um mindestens 1 %, stärker bevorzugt um mindestens 20 %, und am stärksten bevorzugt um mindestens 50 % erhöht. Diese prozentualen Anteile werden mit Bezug auf den Basiswert in einem vergleichbaren unbehandelten, nicht erkrankten Säuger oder in dem kontralateralen, nicht erkrankten Muskel bestimmt, wenn das Polypeptid verabreicht wird und lokal wirkt.
Der hier verwendete Begriff Überleben von Muskelfasern bezieht sich auf die Prophylaxe eines Verlusts von Muskelfasern, der durch Nekrose oder Apoptose deutlich wird, oder auf die Prophylaxe anderer Mechanismen des Muskelfaserverlusts. Das Überleben zeigt in der Verwendung hier eine Abnahme in der Rate des Zelltods von mindestens 10 %, stärker bevorzugt von mindestens 50 % und am stärksten bevorzugt von mindestens 300 % im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle. Die Überlebensrate kann gemessen werden, indem die Zellen, die mit einem für tote Zellen spezifischen Farbstoff angefärbt werden können (z.B. Propidiumiodid), in Kultur gezählt werden, wenn die Zellen sich acht Tage nach der Differenzierung befinden (d.h. acht Tage nach Wechsel des Mediums von 20 % zu 0,5 % Serum).
Die Muskelregeneration bezieht sich in der Verwendung hier auf den Prozess, durch den sich neue Muskelfasern aus Muskel-Vorläuferzellen bilden. Das geeignete Therapeutikum zur Regeneration bewirkt eine Zunahme der Zahl neuer Fasern um mindestens 1 %, stärker bevorzugt um mindestens 20 % und am stärksten bevorzugt um mindestens 50 %, wie vorstehend definiert.
Die Differenzierung von Muskelzellen bezieht sich in der Verwendung hier auf die Induktion eines Muskelentwicklungs-Programms, das spezifisch die Komponenten der Muskelfaser wie den kontraktilen Apparat (die Myofibrille) betrifft. Das für die Differenzierung geeignete Therapeutikum erhöht die Menge einer beliebigen Komponente der Muskelfasern in dem erkrankten Gewebe um mindestens 10 % oder mehr, stärker bevorzugt um 50 % oder mehr und am stärksten bevorzugt um mehr als 100 % im Vergleich zu dem gleichwertigen Gewebe in einem ähnlich behandelten Kontrolltier.
Die Atrophie eines Muskels bezieht sich in der Verwendung hier auf einen signifikanten Verlust an Umfang der Muskelfaser. Mit einer signifikanten Atrophie ist eine Reduktion des Muskelfaser-Durchmessers in einem erkrankten, verletzten oder ungenutzten Muskelgewebe von mindestens 10 % im Vergleich zu einem nicht erkrankten, unverletzten oder normal genutzten Gewebe gemeint.
Wir beabsichtigen die Verwendung der hier beschriebenen Polypeptide für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder Fehlfunktionen. Beispiele von muskulären Fehlfunktionen, die behandelt werden können, umfassen Krankheiten und Fehlfunktionen von Skelettmuskeln, z.B. Myopathien, Dystrophien, neuromuskuläre Leitungsstörungen, traumatische Muskelverletzungen und Nervenverletzungen. Außerdem können auch Erkrankungen des Herzmuskels, z.B. Kardiomyopathien, ischämische Schäden, kongenitale Krankheiten und traumatische Verletzungen, ferner Krankheiten und Fehlfunktionen der glatten Muskulatur, z.B. Arteriosklerose, Gefäßverletzungen und kongenitale Gefäßerkrankungen, unter Verwendung unserer Verfahren behandelt werden. Z.B. sind die Duchenne-Muskeldystrophie, Becker-Dystrophie und Myasthenia gravis nur drei der Krankheiten, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung behandelt werden können.
Außerdem beabsichtigen wir die Prophylaxe oder Behandlung eines Tumors, der von Muskelzellen stammt, z.B. eines Rhabdomyosarkoms. Dies kann die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Substanz umfassen, die die Bindung von einem oder mehreren der hier beschriebenen Polypeptide hemmt, wodurch die Proliferation der Zellen gehemmt wird, die am Tumor beteiligt sind.
Wir nutzen die Tatsache aus, dass die Neuregulin-Proteine durch das gleiche Gen codiert werden. Aus diesem Gen werden verschiedene Messenger-RNA-Spleiß-Varianten (und ihre resultierenden Proteine) hergeleitet, und viele dieser Produkte zeigen die Bindung an P185^ergB2 sowie die Aktivierung davon. Wir haben Produkte dieses Gens eingesetzt, um die mitogene Aktivität (vgl. die nachstehenden Beispiele 1 und 2), die Differenzierung (Beispiele 3 und 6) und das Überleben (Beispiele 4 und 5) von Muskelzellen zu zeigen. Wir stellen eine Verwendung von Produkten des Neuregulin-Gens bereit (hier und in der vorstehend angegebenen Referenzlisten beschrieben), welche die angegebenen Aktivitäten als Muskelzellmitogene, Differenzierungsfaktoren und Überlebensfaktoren besitzen. Am stärksten bevorzugt wird das rekombinante menschliche GGF2 (rhGGF2) verwendet.
Außerdem beabsichtigen wir die Verwendung von anderen, bisher noch nicht aus der Natur isolierten Spleißvarianten des Neuregulin-Gens. 29 zeigt die bekannten Spleißmuster. Diese Muster stammen aus Polymerasekettenreaktions-Experimenten (auf revers transkribierter RNA), der Analyse von cDNA-Clonen (wie hier präsentiert) und der Analyse von veröffentlichten Sequenzen, die Neureguline codieren (Peles et al., Cell 69: 205, 1992; und Wen et al., Cell 69: 559, 1992). Diese Muster und weitere hier beschriebene Muster stellen mögliche Spleißvarianten dar, die existieren. Die Spleißvarianten werden vollständig beschrieben in Goodearl et al., USSN 08/036 555, angemeldet am 24. März 1993, hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Insbesondere können Zellteilung, Überleben, Differenzierung und Wachstum von Muskelzellen erreicht werden, indem Muskelzellen mit einem Polypeptid in Kontakt gebracht werden, das durch die Formel
WBAZCX
definiert ist, wobei WBAZCX aus den Polypeptidsegmenten zusammengesetzt ist, die in 30 dargestellt sind (SEQ ID NO: 132, 134, 135, 137–139, 156); wobei W das Polypeptidsegment F umfasst oder fehlt; wobei Z das Polypeptidsegment G umfasst oder fehlt; und wobei X das Polypeptidsegment C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL oder C/D C/D' D' HKL umfasst, und/oder indem Muskelzellen mit einem Polypeptid in Kontakt gebracht werden, das durch die Formel
YBAZCX
definiert ist, wobei YBAZCX aus den Polypeptidsegmenten zusammengesetzt ist, die in 30 dargestellt sind (SEQ ID NO: 133–135, 156, 159); wobei Y das Polypeptidsegment E umfasst oder fehlt; wobei Z das Polypeptidsegment G umfasst oder fehlt; und wobei X das Polypeptidsegment C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL oder C/D C/D' D' HKL umfasst.
Im Allgemeinen beginnt der N-Terminus der vorstehend beschriebenen Polypeptide entweder mit dem Polypeptidsegment F oder mit dem Polypeptidsegment E. Wenn das Polypeptid F vorliegt, kann es bei der Reifung des Proteins gespalten werden, so dass das reife Polypeptid erhalten wird. Wenn die Sequenz E vorliegt, können die ersten 50 Aminosäuren, die die N-terminale Signalsequenz darstellen, in den Polypeptiden fehlen.
Außerdem beabsichtigen wir die Verwendung eines Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer Krankheit oder Fehlfunktion der Muskulatur durch Steigerung von Mitogenese, Wachstum, Differenzierung oder Überleben einer Muskelzelle, wobei das Polypeptid an Rezeptoren bindet und Systeme der zweiten Messenger der Muskelzelle aktiviert, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus:
einem 35 kD Polypeptidfaktor, der aus der transformierten I-EJ-Ratten-Fibroblastenzelllinie auf die Gliazelle isoliert wurde; oder
einem 75 kD Polypeptidfaktor, der aus der menschlichen SKBR-3-Brustzelllinie isoliert wurde; oder
einem 44 kD Polypeptidfaktor, der aus der transformierten I-EJ-Ratten-Fibroblastenzelllinie isoliert wurde; oder
einem 25 kD Polypeptidfaktor, der aus aktivierten peritonealen Makrophagen der Maus isoliert wurde; oder
einem 45 kD Polypeptidfaktor, der aus der menschlichen MDA-MB-231-Brustzelle isoliert wurde; oder
einem 7 bis 14 kD Polypeptidfaktor, der aus der menschlichen T-Zelllinie ATL-2 auf die Gliazelle isoliert wurde; oder
einem 25 kD Polypeptidfaktor, der aus den Rindernierenzellen isoliert wurde; oder
ARIA-Polypeptid; oder
einem Polypeptid, umfassend G6FIII; oder
einem 42 kD ARIA-Polypeptidfaktor, der aus Gehirn isoliert wurde;
einem 46 bis 47 kD Polypeptidfaktor, der 0-2A-Glia-Vorläuferzellen stimuliert; oder
einem 43 bis 45 kD Polypeptidfaktor, GGFIII 175, US-Patentanmeldung Seriennummer 07/931 041, eingereicht am 17. August 1992, hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Weiterhin beabsichtigen wir die Verwendung der Polypeptide EGFL1, EGFL2, EGFL3, EGFL4, EGFL5 und EGFL6, 37 bis 42 und SEQ ID Nrn. 150 bis 155, für die Behandlung von Muskelzellen in vivo und in vitro.
Außerdem ist die Verabreichung des Polypeptids GGF2, dessen Sequenz in 44 dargestellt ist, für die Behandlung von Muskelzellen enthalten.
Andere wichtige Aspekte unserer Beschreibung sind die Verwendung, wie vorstehend definiert, von:

a) einer Reihe von menschlichen und Rinder-Polypeptidfaktoren, die eine zellmitogene Aktivität besitzen, umfassend das Stimulieren der Teilung von Muskelzellen. Diese Peptidsequenzen sind in den 30, 31, 32 bzw. 33 und SEQ ID Nrn. 132–133 dargestellt.

Die Verwendung der Polypeptide bei der Herstellung eines Medikaments für Behandlungen von Muskelzellen kann auch durch die Verwendung einer DNA erreicht werden, welche die vorstehend beschriebenen Polypeptidverbindungen in einem exprimierbaren genetischen Konstrukt codiert. Die das Polypeptid codierende DNA kann an den Patienten anhand von Verfahren zur Abgabe von DNA an die Zellen verabreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z.B. können Retrovirus-Vektoren, Elektroporation oder Liposomen verwendet werden, um die DNA abzugeben.
Wir beabsichtigen die Verwendung der vorstehend angesprochenen Familie von Proteinen, die aus natürlichen Quellen (Geweben oder Zelllinien) extrahiert wurden oder die durch rekombinante Verfahren hergestellt wurden.
Auch andere Peptide, die spezifisch an den p185^erbB2-Rezeptor binden, können gemäß unseren Anweisungen als Muskelzell-Mitogene verwendet werden. Ein als Kandidat geeignetes Polypeptid kann routinemäßig auf eine p185^erbB2-Bindung durchgemustert werden, und, wenn es bindet, kann es anschließend unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren auf eine gliazellmitogene Aktivität durchgemustert werden.
Außerdem beabsichtigen wir die Verwendung beliebiger Modifikationen oder Äquivalente der vorstehenden Polypeptidfaktoren, die keine signifikant reduzierte Aktivität aufweisen. Z.B. sind Modifikationen enthalten, bei denen der Aminosäuregehalt oder die Aminosäuresequenz verändert ist, ohne dass die Aktivität wesentlich negativ beeinflusst wird. Die hier enthaltenen Feststellungen zur Wirkung und Verwendung müssen somit entsprechend ausgelegt werden, wobei eine solche Verwendung und Wirkung beim Einsatz von modifizierten oder äquivalenten Faktoren einen Teil der Erfindung darstellen.
Die menschlichen Peptidsequenzen, die vorstehend beschrieben und in den 30, 31, 32 bzw. 33 und in den SEQ ID NOs: 132 bis 146 angegeben sind, stellen eine Reihe von Spleißvarianten dar, die durch den Fachmann als komplementäre DNAs der vollen Länge (cDNAs) aus natürlichen Quellen (cDNA-Banken, hergestellt aus den geeigneten Geweben) isoliert oder als DNA-Konstrukte mit einzelnen Exons (z.B. hergeleitet als getrennte Exons) zusammengebaut werden können.
Das Medikament der vorliegenden Erfindung wird hergestellt, indem das Polypeptid zusammen mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger, gegebenenfalls zusammen mit einem verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Excipiens und/oder in Einheitsdosierungsform verabreicht wird. Bei Verwendung der Faktoren können herkömmliche pharmazeutische oder tiermedizinische Verfahren eingesetzt werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen bereitzustellen.
So können die zu verwendenden Formulierungen als parenterale Verabreichung verwendet werden, z.B. als intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraorbitale, ophthalmische, intraventrikuäre, intrakraniale, intrakapsuläre, intraspinale, intrazisternale, intraperitoneale, topische, intranasale, Aerosol-, Skarifikations- und auch orale, bukkale, rektale oder vaginale Verabreichung.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auch durch Transplantation von Wirtszellen, welche die DNA exprimieren, die Polypeptide codiert, die für den Zweck wirksam sind, in den Patienten oder durch die Verwendung von chirurgischen Implantaten verabreicht werden, welche die Formulierungen der Erfindung freisetzen.
Parenterale Formulierungen können in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen vorliegen; für eine orale Verabreichung können die Formulierungen in Form von Tabletten oder Kapseln vorliegen; und für intranasale Formulierungen können sie in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen vorliegen.
Verfahren zur Herstellung von Formulierungen, die dem Fachmann bekannt sind, finden sich z.B. in „Remington's Pharmaceutical Sciences". Formulierungen für die parenterale Verabreichung können z.B. als Excipienten steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, z.B. Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs oder hydrierte Naphthaline enthalten, biologisch verträgliche, biologisch abbaubare Lactid-Polymere oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere eingesetzt werden, um die Freisetzung der vorliegenden Faktoren zu steuern. Andere möglicherweise geeignete parenterale Freisetzungssysteme für die Faktoren umfassen Ethylen-Vinylacetat-Copolymer-Partikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen. Formulierungen für die Inhalation können als Excipienten z.B. Lactose enthalten, oder sie können wässrige Lösungen darstellen, die z.B. Polyoxyethylen-9-laurylether, Glykocholat und Desoxycholat enthalten, oder sie können ölige Lösungen für die Verabreichung in Form von Nasentropfen oder als ein intranasal zu verabreichendes Gel sein. Formulierungen für die parenterale Verabreichung können auch für eine bukkale Verabreichung Glykocholat, für eine rektale Verabreichung Methoxysalicylat oder für eine vaginale Verabreichung Citronensäure enthalten.
Die vorliegenden Faktoren können als die einzigen Wirkstoffe eingesetzt werden, oder sie können in Kombination mit anderen aktiven Bestandteilen verwendet werden, z.B. anderen Wachstumsfaktoren, die das Überleben von Nervenzellen bei neurologischen Krankheiten verbessern könnten, oder Peptidase- oder Protease-Inhibitoren.
Die Konzentration der vorliegenden Faktoren in den Formulierungen der Erfindung variiert abhängig von einer Reihe von Punkten, umfassend die zu verabreichende Dosierung und die Verabreichungsroute.
Allgemein gesagt können die Faktoren in einer wässrigen physiologischen Pufferlösung bereitgestellt werden, die für eine parenterale Verabreichung etwa 0,1 bis 10 % (Gew./Vol.) der Verbindung enthält. Die allgemeinen Dosisbereiche liegen bei etwa 1 mg/kg bis etwa 1 g/kg Körpergewicht pro Tag; ein bevorzugter Dosisbereich liegt bei etwa 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die bevorzugte Dosierung, die verabreicht werden soll, hängt wahrscheinlich vom Typ und dem Ausmaß der Progression des behandelten pathophysiologischen Zustands, dem Gesundheitszustand des Patienten insgesamt, der Zubereitung der Formulierung und der Verabreichungsroute ab.
Obwohl dies keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, können die in den Verfahren der Erfindung genutzten Polypeptidfaktoren auch als Immunogene zum Herstellen von Antikörpern, z.B. monoclonalen Antikörpern, gemäß herkömmlichen Verfahren verwendet werden. Diese Antikörper können ihrerseits dann für therapeutische oder diagnostische Zwecke eingesetzt werden. So können Zustände, die möglicherweise mit Muskelkrankheiten assoziiert sind, die durch abnorme Spiegel des Faktors zustande kommen, unter Verwendung solcher Antikörper behandelt werden. In vitro-Verfahren können eingesetzt werden, wobei Tests an isolierten Proben unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt werden. Außerdem können bildgebende Verfahren verwendet werden, bei denen die Antikörper z.B. mit radioaktiven Isotopen markiert werden, die außerhalb des Körpers sichtbar gemacht werden können, wobei auch bekannte bildgebende Verfahren zum Tumornachweis verwendet werden können.
Die Bezeichnung „GGF2" wird für alle Clone verwendet, die früher mit Peptidsequenzangaben isoliert wurden, die vom GGF-II-Protein stammten (d.h. GGF2HBS5, GGF2BPP3), und, wenn sie alleine steht (d.h. GGF2 oder rhGGF2), um ein rekombinantes menschliches Protein zu bezeichnen, das durch Plasmide codiert wird, die anhand von Peptidsequenzangaben isoliert wurden, die aus dem GGF-II-Protein stammten (d.h. wie in Insektenzellen aus dem Plasmid HBS5 produziert). Rekombinanter menschlicher GGF aus dem Clon GGFHBS5 wird mit GGF2-, rhGGF2- und GGF2HBS5-Polypeptid bezeichnet.
Eine Behandlung bedeutet in der Verwendung hier eine beliebige Verabreichung der hier beschriebenen Verbindungen für den Zweck, die Mitogenese, das Überleben und/oder die Differenzierung von Muskelzellen zu steigern und/oder die Muskelatrophie und -degeneration abzuschwächen. Am stärksten bevorzugt dient die Behandlung dem Zweck, die Symptome oder die Progression einer Krankheit oder Fehlfunktion der Muskelzellen zu reduzieren oder abzuschwächen. Der hier verwendete Begriff Behandlung bedeutet auch die Verabreichung der Verbindungen zur Steigerung oder Änderung der Muskelzellen in gesunden Individuen. Die Behandlung kann auch erfolgen, indem die Muskelzellen, die gegenüber den hier beschriebenen Verbindungen empfindlich sind oder darauf ansprechen, mit einer wirksamen Menge der Verbindung, wie vorstehend beschrieben, in Kontakt gebracht werden. Inhibitoren der hier beschriebenen Verbindungen können auch eingesetzt werden, um Krankheiten mit einer Proliferation von Muskelzellen aufzuhalten oder zu verlangsamen.
Zuerst werden die Zeichnungen beschrieben.
1 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse von rhGGF2 in einem Myoblast-Mitogenese-Test zeigt.
2 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung von rhGGF2 auf die Zahl von Kernen in Myotubuli zeigt.
3 ist eine grafische Darstellung eines Überlebens-Tests, welcher die Wirkung von rhGGF2 auf das Überleben von differenzierten Myotubuli zeigt.
4 ist eine grafische Darstellung von Überlebens-Tests, welche die Wirkung von rhGGF2 auf differenzierte Myotubuli im Vergleich zu dem menschlichen aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor, dem menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor, dem menschlichen Leukocyten-Hemmfaktor und den menschlichen Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II zeigen.
5 ist eine grafische Darstellung, welche das gesteigerte Überleben an Duchenne-Muskeldystrophie-Zellen in Gegenwart von rhGGF2 zeigt.
6 ist eine grafische Darstellung der gesteigerten Expression des menschlichen Wachstumsfaktors (hGH) in C2-Zellen aus einem hGH-Reporter-Gen unter der Kontrolle der transkriptionalen Kontrollelemente der AChR-Delta-Untereinheit. Diese Steigerung steht in Zusammenhang mit der Zugabe von GGF2 zu den Medien.
7 ist eine grafische Darstellung der gesteigerten hGH-Reporter-Synthese und Bungarotoxin (BTX)-Bindung an AChRs, welche auf die Zugabe von steigenden Mengen von GGF2 zu C2-Zellen folgen.
Die 8, 9, 10 und 11 sind die Peptidsequenzen, hergeleitet von GGF-I und GGF-II, SEQ ID Nrn. 1 bis 20, 22 bis 29, 32 bis 50 und 165 (vgl. die nachstehenden Beispiele 11 bis 13).
9, Abbildung A, stellt die Sequenzen von GGF-I-Peptiden dar, die verwendet wurden, um degenerierte Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, wobei degenerierte PCR-Primer aufgelistet sind (SEQ ID Nrn. 1, 17 und 22 bis 29). Einige der Sequenzen in Abbildung A wurden auch verwendet, um synthetische Peptide zu entwerten. In Abbildung B sind Sequenzen von neuen Peptiden aufgelistet, die für den Entwurf von degenerierten Sonden oder degenerierten PCR-Primern zu kurz waren (weniger als sechs Aminosäuren) (SEQ ID Nrn. 17 und 32).
11, Abbildung A, stellt eine Liste der Sequenzen von GGF-II-Peptiden dar, die zum Entwerfen von degenerierten Oligonucleotid-Sonden und degenerierten PCR-Primern verwendet wurden (SEQ ID Nrn. 42 bis 49). Einige der Sequenzen in Abbildung A wurden zum Entwerfen von synthetischen Peptiden verwendet. In Abbildung B ist das neue Peptid aufgelistet, das für das Entwerfen von degenerierten Sonden oder degenerierten PCR-Primern (SEQ ID Nr. 50) zu kurz war (weniger als sechs Aminosäuren).
Die 12, 13A, 13B, 14, 15, 16, 17, 18 und 19 betreffen das nachstehende Beispiel 8 und zeigen die mitogene Aktivität der Faktoren.
Die 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 und 27 betreffen das nachstehende Beispiel 10 und werden nachstehend kurz beschrieben:
In 20 sind die degenerierten Oligonucleotid-Sonden (SEQ ID Nrn. 51 bis 84) aufgelistet, die aus den neuen Peptidsequenzen in 7, Abbildung A, und 9, Abbildung A, entworfen wurden.
21 (SEQ ID Nr. 85) zeigt einen Abschnitt der mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gensequenz aus dem rekombinanten genomischen Rinder-Phagen GGF2BG1, enthaltend die Bindungsstelle der degenerierten Oligonucleotid-Sonden 609 und 650 (vgl. 18, SEQ ID Nrn. 66 bzw. 69). Die Figur stellt den codierenden Strang der DNA-Sequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz im dritten Leseraster dar. Die Sequenz von Peptid 12 aus Faktor 2 (fett) ist Teil eines aus 66 Aminosäuren bestehenden offenen Leserasters (Nucleotide 75272).
22 stellt die degenerierten PCR-Primer (Abbildung A, SEQ ID Nrn. 86 bis 104) und die einmaligen PCR-Primer (Abbildung B, SEQ ID Nrn. 105 bis 115) dar, die in den Experimenten zur Isolierung von Segmenten der Rinder-GGF-II-codierenden Sequenzen verwendet wurden, die in RNA aus dem Hypophysenhinterlappen vorlagen.
23 zeigt die neun einzelnen benachbarten Rinder-GGF-II-cDNA-Strukturen und Sequenzen, die in PCR-Amplifikationsexperimenten erhalten wurden. Die obere Linie in der Figur ist eine schematische Darstellung der codierenden Sequenzen, die an den cDNA-Strukturen beteiligt sind, die charakterisiert wurden.
24 ist eine physikalische Karte des rekombinanten Rinder-Phagen von GGF2BG1. Das Rinderfragment hat eine Länge von etwa 20 kb und enthält zwei Exons (fett) des Rinder-GGF-II-Gens. Auf dieser physikalischen Karte wurden Restriktionsstellen für die Enzyme XbaI, SpeI, NdeI, EcoRI, KpnI und SstI lokalisiert. Die getönten Teile entsprechen Fragmenten, die für die Sequenzierung subcloniert wurden.
25 ist eine schematische Darstellung der Struktur der drei alternativen Genprodukte des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens. Die Exons sind als A bis E in der Reihenfolge ihrer Entdeckung angegeben. Die alternativen Spleißmuster 1, 2 und 3 erzeugen drei überlappende hergeleitete Proteinstrukturen (GGF2BPP1, 2 und 3), die in den verschiedenen 27A, 27B und 27C angegeben sind (nachstehend beschrieben).
26 (SEQ ID Nrn. 116 bis 128) ist ein Vergleich der Sequenzen GGF-I und GGF-II, die in den hergeleiteten Proteinsequenzen identifiziert wurden, gezeigt in den 27A, 27B, 27C (nachstehend beschrieben), mit den neuen Peptidsequenzen, die in den 9 und 11 angegeben sind. Die Figur zeigt, dass sechs der neun neuen GGF-II-Peptidsequenzen in diesen hergeleiteten Proteinsequenzen zu finden sind. Außerdem liegen noch zwei Peptidsequenzen vor, die den GGF-I-Sequenzen ähnlich sind.
In 27 (SEQ ID Nr. 129) sind die DNA-Sequenz des codierenden Strangs und die hergeleitete Aminosäuresequenz der cDNA angegeben, die aus dem Spleißmuster Nr. 1 in 25 erhalten wurde. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens codiert ein Protein mit einer Länge von 206 Aminosäuren. Die fett geschriebenen Peptide sind diejenigen, die aus den in den 9 und 11 dargestellten Listen identifiziert wurden. Mögliche Glycosylierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA).
In 27 (SEQ ID Nr. 130) sind die DNA-Sequenz des codierenden Strangs und die hergeleitete Aminosäuresequenz der cDNA angegeben, die aus dem Spleißmuster Nr. 2 in 25 erhalten wurde. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens codiert ein Protein mit einer Länge von 281 Aminosäuren. Die fett geschriebenen Peptide sind diejenigen, die aus den in den 7 und 9 dargestellten Listen identifiziert wurden. Mögliche Glycosylierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA).
In 27 (SEQ ID Nr. 131) sind die DNA-Sequenz des codierenden Strangs und die hergeleitete Aminosäuresequenz der cDNA angegeben, die aus dem Spleißmuster Nr. 3 in 25 erhalten wurde. Diese partielle cDNA des mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gens codiert ein Protein mit einer Länge von 257 Aminosäuren. Die fett geschriebenen Peptide sind diejenigen, die aus den in den 9 und 11 dargestellten Listen identifiziert wurden. Mögliche Glycosylierungsstellen sind unterstrichen (zusammen mit dem Polyadenylierungssignal AATAAA).
28, die sich auf das nachstehende Beispiel 16 bezieht, stellt ein Autoradiogramm einer Kreuz-Hybridisierungs-Analyse von mutmaßlichen Rinder-GGF-II-Gensequenzen mit verschiedenen Säuger-DNAs auf einem Southern-Blot dar. Das Filter enthält verschiedene Bahnen mit der EcoRI-gespaltenen DNA (5 μg pro Bahn) aus den in der Figur angegeben Arten. Die Sonde weist in jeder DNA-Probe eine einzelne starke Bande nach, umfassend ein vier-Kilobasen-Fragment in der Rinder-DNA, wie aufgrund der physikalischen Karte in 24 zu erwarten war. Außerdem werden noch Banden mit einer relativ schwachen Intensität festgestellt, die möglicherweise verwandte DNA-Sequenzen repräsentierten. Die stark hybridisierende Bande aus jeder der anderen Säuger-DNA-Proben repräsentiert vermutlich das GGF-II-Homologon dieser Arten.
29 ist eine schematische Darstellung von repräsentativen Spleißvarianten. Die codierenden Segmente sind durch F, E, B, A, G, C, C/D, C/D', D, D', H, K und L dargestellt. Die Lage der Peptidsequenzen, die von gereinigtem Protein hergeleitet wurden, sind durch „o" bezeichnet.
In 30 (SEQ ID Nrn. 136 bis 143, 156, 157, 169 bis 178) sind die DNA-Sequenzen und vorausgesagten Peptidsequenzen der codierenden Segmente von GGF aufgelistet. In Zeile 1 sind die vorausgesagten Aminosäuresequenzen des Rinder-GGF angegeben, in Zeile 2 sind die Nucleotidsequenzen des Rinder-GGF angegeben, in Zeile 3 sind die Nucleotidsequenzen des menschlichen GGF (Heregulin) angegeben (Übereinstimmungen in Nucleotidbasen sind durch eine senkrechte Linie bezeichnet), und in Zeile 4 sind die vorausgesagten Aminosäuresequenzen des menschlichen GGF/Heregulin angegeben, wo Unterschiede zu der vorausgesagten Rindersequenz vorliegen. Die codierenden Segmente E, A' und K stellen nur die Rindersequenzen dar. Das codierende Segment D' repräsentiert nur die menschliche (Heregulin) Sequenz.
31 (SEQ ID Nr. 144) zeigt die vorausgesagte GGF2-Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz von BPP5. Die obere Zeile stellt die Nucleotidsequenz dar, und die untere Zeile gibt die vorausgesagte Aminosäuresequenz an.
32 (SEQ ID Nr. 145) zeigt die vorausgesagte Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz von GGF2BPP2. Die obere Zeile stellt die Nucleotidsequenz dar, und die untere Zeile stellt die vorausgesagte Aminosäuresequenz dar.
33 (SEQ ID Nr. 146) zeigt die vorausgesagte Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz von GGF2BPP4. Die obere Zeile stellt die Nucleotidsequenz dar, und die untere Zeile stellt die vorausgesagte Aminosäuresequenz dar.
34 (SEQ ID Nrn. 147 bis 149) zeigt das Ausrichten von zwei GGF-Peptidsequenzen (GGF2BPP4 und GGF2BPP5) an dem menschlichen EGF (hEGF). Die Sternchen bezeichnen die Positionen von konservierten Cysteinen.
35 zeigt das Ausmaß der GGF-Aktivität (Schwann-Zellen-Mitogen-Test) und die Tyrosin-Phsophorylierung eines etwa 200-kD-Proteins (Intensität einer 200-kD-Bande auf einem Autoradiogramm eines Western-Blots, entwickelt mit einem gegen Phosphotyrosin gerichteten polyclonalen Antikörper) als Antwort auf steigende Mengen von GGF.
In 36 sind Spleißvarianten aufgelistet, die von den in 30 angegebenen Sequenzen hergeleitet wurden.
37 stellt unten die vorausgesagte Aminosäuresequenz und oben die Nucleinsäuresequenz von EGFL1 (SEQ ID Nr. 150) dar.
38 zeigt unten die vorausgesagte Aminosäuresequenz und oben die Nucleinsäuresequenz von EGFL2 (SEQ ID Nr. 151).
39 zeigt unten die vorausgesagte Aminosäuresequenz und oben die Nucleinsäuresequenz von EGFL3 (SEQ ID Nr. 152).
40 zeigt unten die vorausgesagte Aminosäuresequenz und oben die Nucleinsäuresequenz von EGFL4 (SEQ ID Nr. 153).
41 zeigt unten die vorausgesagte Aminosäuresequenz und oben die Nucleinsäuresequenz von EGFL5 (SEQ ID Nr. 154).
42 zeigt unten die vorausgesagte Aminosäuresequenz und oben die Nucleinsäuresequenz von EGFL6 (SEQ ID Nr. 159).
43 ist eine maßstabsgerechte Karte des codierenden Segments des Clons. T3 bezieht sich auf den Bakteriophagen-Promotor, der zur Herstellung von mRNA aus dem Clon verwendet wurde. R = flankierende EcoRI-Restriktionsenzymstellen. 5'-UT bezieht sich auf die untranslatierte 5'-Region. E, B, A, C, C/D' und D beziehen sich auf die codierenden Segmente. O = die Translations-Startstelle. ^ = die 5'-Grenze der Region, die zum Rinder-E-Segment homolog ist (vgl. Beispiel 17), und 3'-UT bezieht sich auf die untranslatierte 3'-Region.
44 stellt die vorausgesagte Aminosäuresequenz (Mitte) und Nucleinsäuresequenz (oben) von GGF2HBS5 (SEQ ID Nr. 21) dar. Die untere (unterbrochene) Sequenz zeigt Peptidsequenzen, die von GGF-II-Präparaten stammen (vgl. die 8 und 9).
45(A) ist ein Diagramm, das die Reinigung von rGGF auf einer Kationenaustauscher-Säule pro Fraktion zeigt; 45(B) ist ein Foto eines Western-Blots unter Verwendung der in (A) angegebenen Fraktionen und eines GGFII-spezifischen Antikörpers.
In 46 ist die Sequenz der Polypeptide GGFHBS5, GGFHFB1 und GGFBPP5 (SEQ ID Nrn. 166, 167 und 168) angegeben.
47 zeigt eine Karte des Plasmids pcDHRFpolyA.
Es ist offensichtlich, dass das Gen, welches GGF/p185^erbB2-bindende Neuregulin-Proteine codiert, eine Reihe von verschieden gespleißten RNA-Transkripten unterschiedlicher Größen produziert, die verschiedene Proteine hervorbringen. Diese Proteine haben verschiedene Längen und enthalten einige gemeinsame Peptidsequenzen und einige einmalige Peptidsequenzen. Die Folgerung, dass diese Faktoren durch ein einzelnes Gen codiert werden, wird durch die verschieden gespleißten RNA-Sequenzen gestützt, die aus Rinder-Hypophysenhinterlappen und menschlichen Brustkrebszellen gewonnen werden können (MDA-MB-231). Weiterhin wird diese Folgerung durch den Größenbereich von Proteinen bestätigt, die sowohl als Mitogene für Muskelgewebe (wie hier beschrieben) als auch als Liganden für den p185^erbB2-Rezeptor wirken (vgl. nachstehend).
Ein weiterer Beweis, der für die Tatsache spricht, dass die Gene, die GGF/p185^erbB2-bindende Proteine codieren, homolog sind, kommt aus dem Nucleotidsequenz-Vergleich. Holmes et al. (Science 256: 1205–1210, 1992) zeigen die Reinigung eines 45 Kilodalton großen menschlichen Proteins (Heregulin-α), das spezifisch mit dem Rezeptorprotein p185^erbB2 interagiert. Peles et al. (Cell 69: 205, 1992) und Wen et al. (Cell 69: 559, 1992) beschreiben eine komplementäre DNA, die aus Rattenzellen isoliert wurde und die ein Protein codiert, das „Neu-Differenzierungs-Faktor" (NDF) genannt wird. Das Translationsprodukt der NDF-cDNA hat eine p185^erbB2-bindende Aktivität. Verschiedene andere Gruppen haben die Reinigung von Proteinen mit verschiedenen Molekulargewichten mit einer p185^erbB2-bindenden Aktivität beschrieben. Zu diesen Gruppen zählen Lupu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2287, 1992); Yarden und Peles (Biochemistry 30: 3543, 1991); Lupu et al. (Science 249: 1552, 1990); Dobashi et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1536, 1991); und Huang et al. (J. Biol. Chem. 257: 11508–11512, 1992).
Wir haben gefunden, dass p185^erbB2-Rezeptor-bindende Proteine die Mitogenese von Muskelzellen stimulieren, wodurch die Bildung von Myotubuli (Myogenese) stimuliert wird. Diese Stimulierung führt zu einer gesteigerten Bildung von Myoblasten und zu einer gesteigerten Bildung von Myotubuli (Myogenese). Die hier beschriebenen Polypeptide stimulieren auch ein gesteigertes Muskelwachstum, Differenzierung und Überleben von Muskelzellen. Diese Liganden umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die GGFs, die Neureguline, die Hereguline, NDF und ARIA. Aufgrund dieser mitogenen Aktivität können diese Proteine, eine diese Proteine codierende DNA und verwandte Polypeptide an Patienten verabreicht werden, die an traumatischen Schäden oder Krankheiten des Muskelgewebes leiden. Es ist so zu verstehen, dass alle Verfahren, die für den Zweck der Mitogenese bereitgestellt werden, auch für den Zweck der Myogenese geeignet sind. Obwohl sie nicht Teil der vorliegenden Erfindung sind, können Inhibitoren dieser Liganden (z.B. als Antikörper oder Peptidfragmente) zur Behandlung von Tumoren, die aus einem Muskel hervorgegangen sind, verabreicht werden.
Diese Polypeptide können unter Verwendung der Protokolle erhalten werden, die hier (Beispiele 9 bis 17) und in Holmes et al., Science 256: 1205, 1992; Peles et al., Cell 69: 205, 1992; Wen et al., Cell 69: 559, 1992; Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2287, 1992; Yarden und Peles, Biochemistry 30: 3543, 1991; Lupu et al., Science 249: 1552, 1990; Dobashi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1536, 1991; Huang et al., J. Biol. Chem. 257: 11508–11512, 1992; Marchionni et al., Nature 362: 313, 1993; und in dem GGF-III-Patent beschrieben sind, die alle hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Für viele dieser Verbindungen werden die Sequenzen bereitgestellt und die Eigenschaften beschrieben. Für die Sequenzen vgl. die 8 bis 11, 20 bis 27, 29 bis 34, 36 bis 44 und 46. Für die Proteineigenschaften vgl. die 12 bis 19, 28, 35, 45A und 45B.
Polypeptide können auf ihre Eignung in vitro unter Verwendung der in den nachstehenden Beispielen bereitgestellten Verfahren getestet werden. Ein in vivo- Test kann durchgeführt werden, wie in Beispiel 1 und in Sklar et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A: 433–434, 1991, beschrieben ist.
Die Erfindung umfasst Verfahren zur Verwendung, wie vorher definiert, eines beliebigen Proteins, das zu den codierenden Segmenten in 30 (SEQ ID Nrn. 132 bis 143, 156, 1576 bis 147) im Wesentlichen homolog ist, für den Zweck zum Induzieren der Muskel-Mitogenese. Auch enthalten sind die Verwendung von: allelen Variationen; natürlichen Mutanten; induzierten Mutanten; Proteinen, die durch eine DNA codiert werden, die unter Bedingungen hoher oder niedriger Stringenz mit einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure hybridisiert (Definitionen von hoher oder niedriger Stringenz finden sich in: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1 bis 6.3.6, hier durch Bezugnahme eingeschlossen); und die Verwendung von Polypeptiden oder Proteinen, die spezifisch durch Antiseren gegen GGF-Polypeptide gebunden werden. Der Begriff umfasst auch die Verwendung von chimären Polypeptiden, die die GGF-Polypeptide umfassen, welche Sequenzen aus 28 enthalten, für die Induktion einer Muskel-Mitogenese.
Wie aus dem nachstehenden Beispiel 8 ersichtlich ist, zeigen die vorliegenden Faktoren bei einem Spektrum von Zelltypen eine mitogene Aktivität. Die vorstehenden allgemeinen Feststellungen der Erfindung in Bezug auf Formulierungen und/oder Medikamente und ihre Herstellung sollten eindeutig so verstanden werden, dass sie geeignete Produkte und Verwendungen umfassen.
Eine Reihe von Experimenten folgen, die weitere Grundlagen für die hier beschriebenen Ansprüche bereitstellen. Die folgenden Beispiele, die sich auf die vorliegende Erfindung beziehen, sollen in keiner Weise die Erfindung oder Variationen der Erfindung einschränken, die jetzt bekannt sind oder erst später entwickelt werden.
Die Beispiele erläutern unsere Entdeckung, dass rekombinanter menschlicher GGF2 (rhGGF2) verschiedene Effekte auf eine primäre menschliche Muskelkultur bewirkt. rhGGF2 zeigt in drei unabhängigen Test auf eine biologische Aktivität bei Muskelkulturen signifikante Effekte. Das Polypeptid steigerte die Mitogenese, wie durch Proliferation von subkonfluenten ruhenden Myoblasten gemessen wurde, erhöhte die Differenzierung durch konfluente Myoblasten in Gegenwart von Wachstumsfaktor und steigerte das Überleben von differenzierten Myotubuli, wie durch den Verlust des Farbstoffausschlusses und eine gesteigerte Acetylcholin-Rezeptor-Synthese gemessen wurde. Diese Aktivitäten zeigen die Wirksamkeit von GGF2 und anderen Neuregulinen beim Induzieren der Muskel-Wiederherstellung, -Regeneration und von prophylaktischen Effekten auf die Muskeldegeneration.
Beispiel 1
Mitogene Aktivität von rhGGF auf Myoblasten
Clon GGF2HBS5 wurde in Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert worden waren, wie im nachstehenden Beispiel 14 beschrieben, exprimiert, und das resultierende rekombinante menschliche GGF2 wurde zu Myoblasten in Kultur zugegeben (konditioniertes Medium zugegeben mit 40 μl/ml). Die Myoblasten (057A-Zellen) wurden in einer Platte mit 24 Vertiefungen solange gezüchtet, bis sie fast die Konfluenz erreichten. Das Medium wurde entfernt und durch 0,5 % fetales Kälberserum enthaltendes DMEM mit oder ohne GGF2-konditioniertes Medium in einer Konzentration von 40 μl/ml ersetzt. Nach zwei Tagen wurde das Medium ausgetauscht und die Zellen wurden nach fünf Tagen fixiert und gefärbt. Die Kerne insgesamt wurden gezählt, außerdem wurde die Zahl der Kerne in Myoblasten bestimmt (Tabelle 1).
Tabelle 1
Die GGF-behandelten Myoblasten zeigten eine erhöhte Gesamtzahl der Kerne (636 Kerne) gegenüber den unbehandelten Kontrollen (395 Kerne), dies macht eine mitogene Aktivität deutlich. Die mit rhGGF2 behandelten Myotubuli besaßen eine größere Zahl von Kernen (381 Kerne) als die unbehandelten Kontrollen (204 Kerne). Somit erhöht rhGGF2 die Gesamtzahl der Kerne durch Proliferation und gesteigertes Überleben der Zellen. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass rhGGF2 die Bildung von Myotubuli steigert.
Die mitogene Aktivität von rhGGF2 kann in vivo gemessen werden, indem einem Rattenmuskel über eine osmotische Minipumpe GGF2 und [³H]-Thymidin kontinuierlich zugeführt wird. Die Muskelmasse wird nach einer und zwei Wochen Behandlung durch das Feuchtgewicht bestimmt. Die DNA-Replikation wird gemessen, indem die markierten Kerne in einem zum Schein behandelten Muskel und im rhGGF2-behandelten Muskel in Schnitten gezählt werden, nachdem diese für die Autoradiographie beschichtet wurden (Sklar et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A: 433–434, 1991). Außerdem wird in diesem Ratten-Tiermodell ein denervierter Muskel durch diese Verfahren untersucht, wobei es dieses Verfahren möglich macht, die Rolle von rhGGF2 bei der Atrophie und Wiederherstellung von Muskeln zu bestimmen. Auch der durchschnittliche Faserdurchmesser kann verwendet werden, um die Effekte von FGF auf die Prävention einer Atrophie zu bestimmen.
Beispiel 2
Wirkung von rhGGF2 auf die Mitogenese von Muskelzellen
Ruhende primäre clonale menschliche Myoblasten wurden, wie früher beschrieben, hergestellt (Sklar, R., Hudson, A., Brown, R., In vitro Cellular an Developmental Biology 27A: 433–434, 1991). Die ruhenden Zellen wurden mit den angegebenen Mitteln (rhGGF2-konditionierte Medien, PDGF mit und ohne Methylprednisolon, und Kontrollmedien) in Gegenwart von 10 μM BrdU, 0,5 % FCS in DMEM behandelt. Nach zwei Tagen wurden die Zellen in 4 % Paraformaldehyd in PBS 30 Minuten fixiert und mit 70 % Ethanol gewaschen. Danach wurden die Zellen mit einem anti-BrdU-Antikörper inkubiert und gewaschen, sodann wurde die Antikörperbindung durch eine Peroxidase-Reaktion sichtbar gemacht. Anschließend wurde die Zahl der gefärbten Kerne pro Bereich quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass GGF2 eine Zunahme der Zahl der markierten Kerne pro Bereich gegenüber den Kontrollen induziert (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2 Mitogene Effekte von GGF auf menschliche Myoblasten
Der aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor (PDGF) wurde als positive Kontrolle verwendet. Außerdem wurde zusätzlich zu rhGGF2 Methylprednisolon (ein Corticosteroid) eingesetzt und zeigte keine signifikante Zunahme in der Markierung der DNA.
Auch das zur Homogenität gereinigte rhGGF2 (> 95 % rein) ist für menschliche Myoblasten mitogen (1).
Rekombinantes menschliches GGF2 bewirkt auch die Mitogenese von primären menschlichen Myoblasten (vgl. Tabelle 2 und 1). Der Mitogenese-Test wird, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Anschließend wird der Mitose- Index berechnet, indem die Zahl der BrdU-positiven Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen geteilt wird.
Beispiel 3
Wirkung von rhGGF2 auf die Differenzierung von Muskelzellen
Die Effekte des gereinigten rhGGF2 (zu 95 % rein) auf die Differenzierung einer Muskelkultur wurden untersucht (2). Konfluente Myoblastenkulturen wurden zum Differenzieren induziert, indem der Serumgehalt des Kulturmediums von 20 % auf 0,5 % gesenkt wurde. Die Testkulturen wurden sechs Tage mit der angegebenen Konzentration von rhGGF2 behandelt, wobei das Kulturmedium alle zwei Tage erneuert wurde. Danach wurden die Kulturen fixiert, gefärbt und die Zahl der Kerne pro mm² gezählt. Die in 2 angegebenen Werte zeigen im Vergleich zu den Kontrollen eine große Zunahme der Zahl der Kerne in Myotubuli, wenn rhGGF2 vorliegt.
Beispiel 4
Wirkung von rhGGF2 auf das Überleben von differenzierten Myotubuli
Das Überleben von differenzierten Myotubuli wurde durch eine Behandlung mit rhGGF2 signifikant gesteigert. Muskelkulturen wurden in Gegenwart von rhGGF2 differenziert, außerdem wurde zu verschiedenen Zeiten die Zahl der toten Myotubuli durch Propidiumiodid-Färbung gezählt. Wie in 3 zu sehen ist, ist die Zahl der toten Myotubuli in der mit rhGGF2 behandelten Kultur an den Tagen 4, 5, 6 und 8 der Differenzierung niedriger. Die Zahl der Kerne in den Myotubuli wurde durch die GGF2-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten Kulturen nach acht Tagen Differenzierung signifikant erhöht. Insbesondere zeigte die Kontrolle 8,6 Myokerne pro mm², während rhGGF2-behandelte Kulturen 57,2 Myokerne pro mm² aufwiesen (p = 0,035), wenn sie auf den gleichen Platten nach Giemsa-Färbung gezählt wurden.
Der Überlebens-Test wurde auch mit anderen Wachstumsfaktoren durchgeführt, deren Effekte auf Muskelkulturen bekannt sind. Die Wirkung von rhGGF2 war einmalig unter den getesteten Wachstumsfaktoren (4). In diesem Experiment wurden Kulturen parallel zu den rhGGF2-behandelten Platten mit den angegebenen Konzentrationen der verschiedenen Wachstumsfaktoren behandelt. Das Überleben von Myotubuli wurde wie vorstehend nach acht Tagen Differenzierung von 057A-Myoblastenzellen gemessen. Die Konzentrationen der Faktoren waren wie folgt: rhGGF2: 100 ng/ml; menschlicher, aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor: 20 ng/ml; menschlicher basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor: 25 ng/ml; menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor: 30 ng/ml; menschlicher Leukocyten-Hemmfaktor: 10 ng/ml; menschlicher Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I: 30 ng/ml; menschlicher Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor II: 25 ng/ml.
Der festgestellte Schutz von differenzierten Myotubuli vor dem Absterben zeigt, dass rhGGF2 eine vielversprechende Therapie zum Aufhalten einer Muskeldegeneration erwarten lässt, die bei zahlreichen Muskelkrankheiten auftritt. So können Mittel, die die extramuskuläre Konzentration von Neuregulinen erhöhen, eine prophylaktische Wirkung zeigen oder das Fortschreiten von Muskelschädigenden Störungen verlangsamen und die Raten der Differenzierung, Wiederherstellung, Konditionierung und Regeneration von Muskeln steigern.
Beispiel 5
rhGGF2 fördert das Überleben von differenzierten Myotubuli mit einem genetischen Defekt am Duchenne-Muskeldystrophie-Locus
Die positiven Effekte von rhGGF2 auf das Überleben von Myotubuli könnten eine mögliche Wirksamkeit bei degenerativen Störungen bedeuten. Diese Effekte auf das Überleben von Myotubuli wurden auf einem clonal-hergeleiteten primären Duchenne-Myoblasten getestet, um zu bestimmen, ob die in einer normalen Muskelkultur festgestellte Antwort auch in Kulturen gezeigt werden kann, die von erkrankten Individuen stammen. Die in 5 dargestellten Werte wurden unter Verwendung der gleichen Muskelkulturbedingungen erhalten (Beispiel 4, vorstehend), die für normale Individuen eingesetzt wurden. rhGGF2 senkte die Zahl der toten Myotubuli in der differenzierten Duchenne-Muskelkultur im Vergleich zu den Kontrollen signifikant (p = 0,032). Die Konzentrationen waren wie folgt: GGF2: 100 ng/ml; menschlicher aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor: 20 ng/ml; menschlicher Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I: 30 ng/ml.
Dieses Beispiel zeigt, dass rhGGF2 auch das Überleben von differenzierten Duchenne-Myotubuli fördern kann, und bietet einen starken Beweis, dass rhGGF2 den Verlauf einer Muskeldegeneration und eines Muskelschwunds in Säugern möglicherweise verlangsamt oder verhindert.
Beispiel 6
Wirkung von rhGGF2 auf das Differenzierungsprogramm: Induktion von langsamen MHC- und Dystrophin-Proteinen
Die Effekte des gereinigten rhGGF2 auf die Muskelkulturdifferenzierung wurden auch durch Western-Analyse von Kulturlysaten untersucht. Die Spiegel von Muskel-spezifischen Proteinen wurden in behandelten und unbehandelten Kulturen in dreifacher Ausführung bestimmt. Diese Kulturen wurden wie vorstehend hergestellt und behandelt, mit der Ausnahme, dass die Plattengröße auf 150 mm vergrößert wurde und die Muskelkulturschicht für die Western-Analyse abgekratzt wurde, wie in Sklar, R., und Brown, R., (J. Neurol. Sci. 101: 73–81, 1991) beschrieben. Die in Tabelle A dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit rhGGF2 die Spiegel von verschiedenen Muskel-spezifischen Proteinen erhöht, umfassend Dystrophin, schwere Kette von Myosin (MHC, langsame und schnelle Isoformen der Erwachsenen), jedoch die Spiegel von HSP72 oder der MHC-Neugeborenen-Isoform nicht auf einen ähnlichen Spiegel erhöht, bezogen auf die beim Western-Test aufgetragene Menge Protein. Die durch rhGGF2 induzierten Spiegel von Muskel-spezifischen Proteinen waren ähnlich wie die quantitativen Anstiege in der Zahl der Myokerne pro mm² (Tabelle 3).
Tabelle 3
Die rhGGF2-abhängige Zunahme der Isoformen der schweren Kette des Myosins der Erwachsenen (die langsame wird in menschlichen Muskelfasern vom Typ I gefunden; die schnelle wird in menschlichen Muskelfasern vom Typ 2A und 2B gefunden) zeigt möglicherweise die Reifung der Myotubuli, da die Neugeborenen-Isoform durch die rhGGF2-Behandlung nicht signifikant erhöht wurde. Während der Entwicklung des Rattenmuskels ändern sich die MHC-Isoformen von fetalen zu Neugeborenen-Formen, worauf eine Umwandlung zu den reifen langsamen und schnellen MHC-Isoformen der Erwachsenen folgt (Periasamy et al., J. Biol. Chem. 259: 13573–13578, 1984; Periasamy et al., J. Biol. Chem. 260: 15856–15862, 1985; Wieczorek et al., J. Cell Biol. 101: 618–629, 1985). Während der Muskel in Abwesenheit von Nervenzellen oder -gewebe einige dieser Isoform-Übergänge autonom durchlaufen kann, exprimieren Muskelexplantate der Maus die schnelle MHC-Isoform der Erwachsenen nur dann, wenn sie in Gegenwart des Rückenmarks der Maus gezüchtet werden (Ecob-Prince et al., J. Cell Biol. 103: 995–1005, 1986). Ein weiterer Beweis, dass MHC-Isoform-Übergänge durch Nerven beeinflusst werden, wurde durch Whalen et al. (Deve. Biol. 141: 24–40, 1990) erbracht; nach der Regeneration von mit Notexin behandeltem Soleus der Ratte wurde in dem neuen denervierten Muskel nur die schnelle MHC-Isoform der Erwachsenen produziert, während der innervierte regenerierte Muskel sowohl die schnelle als auch die langsame MHC-Isoform der Erwachsenen hervorbrachte. So machen die Ergebnisse in Tabelle 3, dass rhGGF2 die Synthese der MHC-Isoformen der Erwachsenen steigert, deutlich, dass rhGGF2 möglicherweise eine entwicklungsgemäße Reifung des Muskels induziert, die vermutlich eine neuronale Innervierung nachahmt.
Beispiel 7
Neureguline, umfassend rhGGF2, induzieren die Synthese von Acetylcholin-Rezeptoren im Muskel
Die Expression von Untereinheit-Proteinen des Acetylcholin-Rezeptors (AChR) kann induziert werden, indem die Muskelzellen Neuregulinen ausgesetzt werden. Insbesondere haben wir gezeigt, dass das Inkontaktbringen von Muskelzellen mit rhGGF2 die Synthese von AChR-Untereinheiten-Proteinen induzieren kann. Diese Induktion nach einer rhGGF2-Exposition wurde auf zwei verschiedene Arten festgestellt: erstens wiesen wir eine gesteigerte Expression von menschlichem Wachstumshormon über das Produkt eines Reporter-Gen-Konstrukts nach, und zweitens wiesen wir eine erhöhte Bindung von alpha-Bungarotoxin an Zellen nach.
Im folgenden Beispiel wurde die Maus-Myoblastenzelllinie C2 verwendet. C2-Zellen wurden mit einem Transgen transfiziert, das die regulatorische 5'-Sequenz des Gens der AChR-delta-Untereinheit der Maus enthielt, gekoppelt an eine cDNA der vollen Länge des menschlichen Wachstumshormons (Baldwin und Burden, J. Cell Biol. 107: 2271–2279, 1988). Dieses Reporterkonstrukt ermöglicht die Messung der Induktion der Expression des AChR-delta-Gens, indem die Menge des ins Medium ausgeschiedenen Wachstumshormons bestimmt wird. Die Linie kann dazu induziert werden, Myotubuli zu bilden, indem die Serumkonzentration im Medium von 20 % auf 0,5 % erniedrigt wird.
Insbesondere wurden Maus-C2-Myoblasten mit einem AChR-menschliches Wachstumshormon-Reporter-Konstrukt transfiziert und nach der Behandlung mit rhGGF2 auf eine Expression von hGH getestet. Die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten sind in Tabelle 4 und in den 6 (hGH-Expression) und 7 (hGH-Expression und alpha-Bungarotoxin-Bindung) zusammengestellt. Dargestellt sind die Dosis-Antwort-Kurven für ausgeschiedenes menschliches Wachstumshormon und für die Bungarotoxin-Bindung von Muskelkulturen, die mit rhGGF2 behandelt wurden.
Tabelle 4 Effekte von rhGGF2 auf die Expression des AChR-delta-Untereinheit/hGH-Transgens und die Synthese von AChR
C2-Myotubuli wurden eine Stunde bei 37°C mit kaltem α-BTX (20 nM) behandelt, zweimal mit Kulturmedium gewaschen und danach mit GGF2 behandelt. Das Kulturmedium wurde mit Rinderserumalbumin auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. 24 Stunden später wurde das Kulturmedium entfernt und für den hGH-Test aufbewahrt. Die Muskelkulturen wurden eine Stunde bei 37°C mit ¹²⁵I-α-BTX (20 nM) behandelt, gewaschen und in 1 % SDS enthaltende PBS geschabt. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von kaltem α-BTX (40 nM) bestimmt. Im Zellhomogenisat wurde die Radioaktivität ermittelt und der Gesamt-Proteingehalt bestimmt.
Das Vorliegen von rhGGF2 führte zu einer mehr als zweifachen Zunahme der Expression des hGH-Gens, wodurch gezeigt wurde, dass rhGGF2 die Synthese der delta-Untereinheit des Acetylcholin-Rezeptors induzierte. Weiterhin spricht eine gesteigerte Bindung von Bungarotoxin für den Zusammenbau dieser Untereinheiten-Proteine zu funktionellen Acetylcholin-Rezeptoren. Um die Interpretation dieser Ergebnisse zu bekräftigen, wurde die Analyse an Kulturen wiederholt, bei denen der hGH-Reporter an einen Metallothionein-Promotor gekoppelt war, der auf rhGGF2 nicht ansprechen sollte. Die Ergebnisse dieses Kontrollexperiments zeigten, dass die hGH-Antwort durch die transkriptionale Aktivierung der Kontrollelemente des Gens der AChR-delta-Untereinheit vermittelt wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, dass rhGGF2 zur Ergänzung von AChRs eingesetzt werden könnte und damit zur Therapie der Autoimmunkrankheit Myasthenia gravis beitragen könnte. Diese Aktivität kann auch für die Behandlung der Regeneration von peripheren Nerven und Neuropathie vorteilhaft sein, indem ein Schlüsselschritt in der Re-Innervierung des Muskels stimuliert wird.
Beispiel 8
Weitere mitogene Aktivitäten der gereinigten GGF-I und GGF-II
Die mitogene Aktivität einer hochgereinigten Probe, die sowohl GGF-I als auch GGF-II enthielt, wurde anhand eines quantitativen Verfahrens untersucht, mit dem es möglich ist, eine einzelne Mikrokultur auf DNA-Synthese, Zellmorphologie, Zellzahl und Expression von Zellantigenen zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde aus dem Verfahren modifiziert, das früher von Muir et al., Analytical Biochemistry 185: 377–382, 1990, beschrieben wurde. Die wichtigsten Modifikationen sind: 1) die Verwendung von unbeschichteten Mikrotiterplatten, 2) die Zellzahl pro Vertiefung, 3) die Verwendung von 5 % fetalem Rinderplasma (FBP) anstelle von 10 % fetalem Kälberserum (FCS), und 4) die Inkubationszeit in Gegenwart von Mitogenen und Bromdesoxyuridin (BrdU), die gleichzeitig zu den Kulturen zugegeben wurden. Außerdem wurde der einschichtige Zellrasen vor der Fixierung nicht gewaschen, um den Verlust von Zellen zu vermeiden, und die Inkubationszeit des monoclonalen Maus-anti-BrdU-Antikörpers und die Inkubationszeit des Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin (IgG)-Antikörpers wurden verdoppelt, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen. Der Test, der für Ischiasnerv-Schwann-Zellen der Ratte optimiert war, wurde außerdem für verschiedene andere Zelllinien verwendet, nachdem er für die Zellkulturbedingungen entsprechend modifiziert worden war.
I. Verfahren zum Testen der Mitogenese
Am Tag 1 wurden gereinigte Schwann-Zellen in 5 % FBP/Dulbeccomodifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf unbeschichtete Platten mit 96 Vertiefungen plattiert (5000 Zellen pro Vertiefung). Am Tag 2 wurden GGFs oder andere Testfaktoren und außerdem BrdU in einer Endkonzentration von 10 μM zu den Kulturen zugegeben. Nach 48 Stunden (Tag 4) wurde der Einbau von BrdU beendet, indem das Medium abgesaugt wurde, und die Zellen wurden mit 200 μl/Vertiefung von 70 % Ethanol 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Als nächstes wurden die Zellen mit Wasser gewaschen und die DNA wurde durch Inkubation mit 100 μl 2 N HCl zehn Minuten bei 37°C denaturiert. Nach dem Absaugen wurde die restliche Säure neutralisiert, indem die Vertiefungen mit 0,1 M Boratpuffer, pH 9,0, gefüllt wurden, und die Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Danach wurden die Zellen 15 Minuten bei 37°C mit 50 μl Blockierungspuffer behandelt (PBS, enthaltend 0,1 % Triton X-100 und 2 normales Ziegenserum). Nach dem Absaugen wurde ein gegen BrdU gerichteter monoclonaler Antikörper der Maus (Dako Corp., Santa Barbara, CA) zugegeben (50 μl/Vertiefung, 1,4 μg/ml verdünnt in Blockierungspuffer) und zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch drei Waschgänge in PBS, enthaltend 0,1 % Triton X-100, entfernt, sodann wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper (Dako Corp., Santa Barbara, CA) zugegeben (50 μl/Vertiefung, 2 μg/ml verdünnt in Blockierungspuffer) und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach drei Waschgängen in PBS/Triton und einer endgültigen Spülung in PBS wurden die Vertiefungen mit 100 μl/Vertiefung von 50 mM Phosphat/Citrat-Puffer, pH 5,0, enthaltend 0,05 % des löslichen Chromogens o-Phenylendiamin (OPD) und 0,02 % H₂O₂, versetzt. Die Umsetzung wurde nach fünf bis 20 Minuten bei Raumtemperatur beendet, indem 80 μl aus jeder Vertiefung auf eine saubere Platte pipettiert wurden, die 40 μl/Vertiefung einer 2 N Schwefelsäure enthielt. Die Absorption wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Plattenlesegeräts (Dynatech Labs) aufgezeichnet. Die Testplatten, welche die einschichtigen Zellrasen enthielten, wurden zweimal mit PBS gewaschen und sodann immuncytochemisch auf BrdU-DNA gefärbt, indem 100 μl/Vertiefung des Substrats Diaminobenzidin (DAB) und 0,02 % H₂O₂ zugegeben wurden, um ein unlösliches Produkt zu erzeugen. Nach zehn bis 20 Minuten wurde die Färbereaktion durch Waschen mit Wasser gestoppt und die BrdU-positiven Kerne anhand eines umgekehrten Mikroskops festgestellt und gezählt. Gegebenenfalls wurden negative Kerne mit 0,001 % Toluidinblau gegengefärbt und wie vorstehend gezählt.
II. Zelllinien, die für Mitogenese-Tests verwendet wurden
Swiss 3T3-Fibroblasten: Die Zellen, die von Flow Labs stammten, wurden in DMEM, angereichert mit 10 % FCS, Penicillin und Streptomycin, bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10 % CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle zwei Tage gefüttert oder subkultiviert. Für den Mitogenese-Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Vertiefung in Vollmedium plattiert und eine Woche inkubiert, bis die Zellen konfluent und ruhend vorlagen. Das Serumenthaltende Medium wurde entfernt und der einschichtige Zellrasen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen. 100 μl serumfreies Medium, enthaltend Mitogene und 10 μM BrdU, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und 48 Stunden inkubiert. Die Dosis-Antworten auf GGFs und Serum oder PDGF (als positive Kontrolle) wurden durchgeführt.
BHK (Baby-Hamster-Niere) 21-C13-Fibroblasten: Die Zellen, die von der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) stammten, wurden in Glasgow-modifiziertem Eagle-Medium (GMEM), angereichert mit 5 % Tryptose-Phosphat-Brühe, 5 % FCS, Penicillin und Streptomycin, bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle zwei bis drei Tage gefüttert oder subkultiviert. Für den Mitogenese-Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Vertiefung in Vollmedium 24 Stunden plattiert. Danach wurde das Serum-enthaltende Medium entfernt und, nach dem Waschen mit serumfreiem Medium, durch 100 μl eines 0,1 % FCS-enthaltenden GMEM oder GMEM alleine ersetzt. GGFs und FCS oder bFGF wurden gleichzeitig mit 10 μM BrdU als positive Kontrollen zugegeben und 48 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellkulturen, wie für die Schwann-Zellen beschrieben, verarbeitet.
Ratten-C6-Gliom-Zelllinie: Die Zellen, die in Passage 39 erhalten wurden, wurden in DMEM, enthaltend 5 % FCS, 5 % Pferdeserum (HS), Penicillin und Streptomycin, bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10 % CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle drei Tage gefüttert oder subkultiviert. Für den Mitogenese-Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Vertiefung in Vollmedium plattiert und 24 Stunden inkubiert. Danach wurde das Medium durch ein Gemisch von 1:1 aus DMEM und F12-Medium, enthaltend 0,1 % FCS, ersetzt, nachdem ein Waschgang in serumfreiem Medium erfolgt war. Anschließend wurden die Dosis-Antworten auf GGFs, FCS und αFGF durchgeführt und die Zellen anhand eines ELISA, wie früher für die anderen Zelltypen beschrieben, verarbeitet.
PC12 (Ratten Nebennieren-Phäochromozytom-Zellen): Die Zellen, die von ECACC stammten, wurden in RPMI 1640, angereichert mit 10 % HS, 5 % FCS, Penicillin und Streptomycin, in Kollagen-beschichteten Kolben bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ in Luft gehalten. Die Zellen wurden alle drei Tage gefüttert, indem 80 % des Medium ersetzt wurden. Für den Mitogenese-Test wurden die Zellen mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Vertiefung in Vollmedium auf Kollagen-beschichtete Platten plattiert (50 μl/Vertiefung Collagen, Vitrogen Collagen Corp., verdünnt 1:50, 30 Min. bei 37°C) und 24 Stunden inkubiert. Danach wurde das Medium durch frisches RPMI entweder alleine oder enthaltend 1 mM Insulin oder 1 % FCS ersetzt. Die Dosis-Antworten auf FCS/HS (1:2) als positive Kontrolle und auf GGFs wurden wie vorstehend durchgeführt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen fixiert und der ELISA, wie früher beschrieben, durchgeführt.
III. Ergebnisse der Mitogenese-Tests
Alle in diesem Beispiel dargestellten Experimente wurden unter Verwendung einer hochgereinigten Probe aus einem Reinigungsschritt einer Sepharose-12-Chromatographie durchgeführt, wobei die Probe ein Gemisch aus GGF-I und GGF-II (GGFs) enthielt.
Zuerst wurden die mit dem BrdU-Einbau-Test erhaltenen Ergebnisse mit dem klassischen Mitogenese-Test für Schwann-Zellen, der auf dem Einbau von ¹²⁵I-UdR in die DNA von sich teilenden Zellen beruht, wie von J. P. Brockes (Methods Enzymol. 147: 217, 1987) beschrieben, verglichen.
12 zeigt den Vergleich der Werte, die mit den zwei Tests erhalten wurden, welche unter den gleichen Zellkulturbedingungen durchgeführt wurden (5000 Zellen/Vertiefung, in 5 % FBP/DMEM, 48 Stunden inkubiert in Gegenwart von GGFs). Wie deutlich zu sehen ist, sind die Ergebnisse vergleichbar, jedoch scheint der BrdU-Einbau-Test etwas empfindlicher zu sein, dies legt die Verschiebung der Kurve zur linken Seite des Diagramms, d.h. zu niedrigeren Konzentrationen von GGFs, nahe.
Wie im Abschnitt „Verfahren zum Testen der Mitogenese" beschrieben wurde, können die ursprünglichen Testplatten, die einschichtige Zellrasen enthalten, nachdem die immunreaktive BrdU-DNA durch Ablesen der Intensität des löslichen Produkts der OPD-Peroxidase-Reaktion quantitativ bestimmt worden war, einer zweiten Umsetzung unterworfen werden, die zu dem unlöslichen DAB-Produkt führt, das die BrdU-positiven Kerne anfärbt. Danach können die Mikrokulturen unter einem Umkehrmikroskop untersucht und die Zellmorphologie und die Zahl der BrdU-positiven und negativen Kerne ermittelt werden.
In 13A und 13B wird die Immunreaktivität der BrdU-DNA, die durch Ablesen der Absorption bei 490 nm ermittelt wurde, mit der Zahl der BrdU-positiven Kerne und mit dem prozentualen Anteil der BrdU-positiven Kerne an der Gesamtzahl von Zellen pro Vertiefung, die in den gleichen Kulturen gezählt wurden, verglichen. Standardabweichungen lagen unter 10 %. Die zwei Bestimmungsmethoden zeigen eine sehr gute Korrelation, wobei der Unterschied zwischen den Werten bei der höchsten Dosis der GGFs durch das unterschiedliche Ausmaß der DNA-Synthese in Zellen, die als BrdU-positiv nachgewiesen wurden, erklärt werden kann.
Der BrdU-Einbau-Test kann somit weitere nützliche Informationen über die biologische Aktivität von Polypeptiden auf Schwann-Zellen bereitstellen, wenn er mit dem ¹²⁵I-UdR-Einbau-Test verglichen wird. Z.B. zeigen die in 15 dargestellten Werte, dass GGFs auf Schwann-Zellen so wirken können, dass sie die DNA-Synthese induzieren, dass sie in niedrigeren Dosen jedoch die Zahl von negativen Zellen, die in den Mikrokulturen nach 48 Stunden vorliegen, erhöhen.
Anschließend wurde der Test auf verschiedenen Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs angewendet. In 15 werden die mitogenen Antworten von Schwann-Zellen und Swiss-3T3-Fibroblasten auf GGFs verglichen; trotz der in 3T3-Fibroblasten erhaltenen schwachen Antwort wurden in diesen Kulturen einige deutlich BrdU-positive Kerne nachgewiesen. Die Kontrollkulturen wurden in Gegenwart von verschiedenen Dosen von FCS oder menschlichem rekombinantem PDGF parallel laufen gelassen, wobei gezeigt wurde, dass die Zellen in der Lage waren, auf geeignete Stimuli zu reagieren (nicht dargestellt).
Die Fähigkeit von Fibroblasten, auf GGFs zu reagieren, wurde weiterhin unter Verwendung der Zelllinie BHK21-C13 untersucht. Diese Fibroblasten, die aus der Niere stammen, zeigen keine Kontakthemmung oder erreichen bei Konfluenz kein Ruhestadium. Deshalb wurden die Versuchsbedingungen so gewählt, dass eine sehr geringe Hintergrundproliferation vorliegt, ohne dass die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt wird. Die GGFs zeigen eine signifikante mitogene Aktivität auf BHK21-C13-Zellen, wie in 16 und 17 zu sehen ist. 16 zeigt den BrdU-Einbau in DNA durch BHK21-C13-Zellen, die durch GGFs in Gegenwart von 0,1 % FCS stimuliert wurden. Die gute mitogene Antwort auf FCS macht deutlich, dass die Zellkulturbedingungen keine Einschränkung darstellten. In 17 ist die mitogene Wirkung von GGFs als die Zahl von BrdU-positiven und BrdU-negativen Kernen und als die Gesamtzahl von Zellen, die pro Vertiefung gezählt wurden, ausgedrückt. Die Werte wurden aus zwei Experimenten erhalten, die man in doppelter Ausführung laufen ließ; pro Vertiefung wurden mindestens drei Felder gezählt. Wie bei den Schwann-Zellen festgestellt, erhöhen die GGFs, zusätzlich zu einer proliferativen Wirkung bei niedrigen Dosen, auch die Zahl von nicht-reagierenden Zellen, die überleben. Der prozentuale Anteil der BrdU-positiven Zellen ist proportional zu den steigenden Mengen der GGFs, die zu den Kulturen zugegeben wurden. Die Gesamtzahl der Zellen ist nach 48 Stunden in Gegenwart von höheren Dosen von GGFs mindestens verdoppelt, dies bestätigt, dass GGFs die DNA-Synthese und die Proliferation in BHK21-C13-Zellen induzieren. Unter den gleichen Bedingungen zeigten Zellen, die 48 Stunden in Gegenwart von 2 % FCS gehalten wurden, eine etwa sechsfache Zunahme (Werte nicht dargestellt).
C6-Gliomzellen bieten ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Eigenschaften von Gliazellen. Der exprimierte Phänotyp scheint von der Zellpassage abhängig zu sein, wobei die Zellen in einem frühen Stadium eher einem Astrocyt-Phänotyp und in späteren Stadien (später als Passage 70) einem Oligodendrocyt-Phänotyp gleichen. In diesen Experimenten wurden C6-Zellen von Passage 39 bis Passage 52 verwendet. C6-Zellen sind eine sehr proliferative Population, weshalb die Versuchsbedingungen so optimiert wurden, dass ein sehr geringer Hintergrund des BrdU-Einbaus vorlag. Das Vorliegen von 0,1 % Serum war erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, ohne die mitogenen Antworten signifikant zu beeinträchtigen, wie durch die Dosis-Antwort auf FCS gezeigt wird (18).
In 19 sind die mitogenen Antworten auf aFGF (saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) und GGFs als Prozentsätze des maximalen BrdU-Einbaus angegeben, der in Gegenwart von FCS (8 %) erhalten wurde. Die Werte sind Durchschnittswerte aus zwei Experimenten, die in doppelter Ausführung durchgeführt wurden. Die Wirkung von GGFs war mit der eines reinen Präparats von aFGF vergleichbar. aFGF wurde als ein spezifischer Wachstumsfaktor für C6-Zellen beschrieben (Lim, R., et al., Cell Regulation 1: 741–746, 1990), und aus diesem Grund wurde er als positive Kontrolle eingesetzt. Die direkte Zählung von BrdU-positiven und negativen Zellen war aufgrund der hohen Zelldichte in den Mikrokulturen nicht möglich. Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Zelllinien zeigten PC12-Zellen keine deutliche Reaktion auf GGFs, wenn sie unter Kulturbedingungen behandelt wurden, unter denen die PC12-Zellen auf Seren ansprechen konnten (Gemisch aus FCS und HS, das routinemäßig zum Halten von Zellen verwendet wird). Dessen ungeachtet scheint die Zahl der pro Vertiefung plattierten Zellen das Verhalten der PC12-Zellen zu beeinflussen, weshalb weitere Experimente erforderlich sind.
Beispiel 9
Aminosäuresequenzen des gereinigten GGF-I und GGF-II
Aminosäuresequenzanalyse-Untersuchungen wurden mit hochgereingtem Rinder-Hypophyse-GGF-I und -GGF-II durchgeführt. Zum Beschreiben der Sequenzen wurde der herkömmliche Ein-Buchstaben-Code verwendet. Peptide wurden durch Spaltungen mit Lysyl-Endopeptidase und Protease-V8 erhalten, die an reduzierten und carboxymethylierten Proben durchgeführt wurden, wobei die Spaltung mit Lysyl-Endopeptidase von GGF-II auf einem Material durchgeführt wurde, das aus dem 55-65-kD-Bereich einer 11 % SDS-PAGE eluiert wurde (MG bezogen auf die vorstehend angegebenen Marker).
Insgesamt wurden für GGF-I 21 Peptidsequenzen erhalten (vgl. 8, SEQ ID NOs: 1 bis 20, 165), von denen 12 Peptide (vgl. 9, SEQ ID NOs: 1, 22 bis 29, 17, 19 und 32) nicht in herkömmlichen Protein-Datenbanken vorliegen und somit einmalige Sequenzen darstellen. Für GGF-II wurden insgesamt 12 Peptidsequenzen erhalten (vgl. 10, SEQ ID NOs: 42 bis 50 und 161 bis 163), von denen zehn Peptide (vgl. 11, SEQ ID NOs: 42 bis 50) nicht in herkömmlichen Protein-Datenbanken vorliegen und deshalb einmalige Sequenzen darstellen (eine Ausnahme ist Peptid GGF-II 06, das in zahlreichen Proteinen identische Sequenzen zeigt, die jedoch aufgrund der kleinen Zahl von Resten möglicherweise ohne Bedeutung sind). Diese neuen Sequenzen entsprechen mit größter Wahrscheinlichkeit Teilen der echten Aminosäuresequenzen der GGFs-I und -II.
Besondere Aufmerksamkeit kann den Sequenzen von GGF-I-07 und GGF-II-12 gewidmet werden, die eindeutig eng miteinander verwandt sind. Die Ähnlichkeiten zeigen, dass die Sequenzen dieser Peptide fast sicher diejenigen der angegebenen GGF-Arten sind, und dass es sehr unwahrscheinlich ist, dass sie von Proteinen aus einer Verunreinigung stammen.
Außerdem ist die Sequenz X S S in dem Peptid GGF-II-02 mit dem Vorliegen eines N-gebundenen Kohlenhydratrestes auf einem Asparagin an der durch X bezeichneten Position vereinbar.
Im Allgemeinen stellt X in den 8 und 10 einen unbekannten Rest dar, womit auf einen Sequenzierungszyklus hingewiesen wird, in dem eine einzelne Position nicht mit Sicherheit bestimmt werden konnte, entweder weil mehr als ein Signal von gleicher Größe in dem Zyklus vorlag oder weil kein Signal vorlag. Ein Sternchen bezeichnet diejenigen Peptide, bei denen die letzte angegebene Aminosäure auch der letzten, in diesem Peptid vorliegenden Aminosäure entspricht. In den restlichen Peptiden war die Signalstärke nach der letzten angegebenen Aminosäure nicht ausreichend, um die Bestimmung der Sequenz bis zum Ende dieses Peptids fortzusetzen. Die Spalte auf der rechten Seite gibt die Ergebnisse einer Datenbank-Suche auf dem Computer an, wobei das GCG-Paket der Programme FASTA und TFASTA verwendet wurde, um die NBRF- und EMBL-Sequenz-Datenbanken zu analysieren. Der Name eines Proteins in dieser Spalte gibt die Identität eines Teils seiner Sequenz mit der angegebenen Peptid-Aminosäuresequenz an, wobei maximal zwei Abweichungen erlaubt sind. Ein Fragezeichen bezeichnet drei erlaubte Abweichungen. Die verwendeten Abkürzungen sind wie folgt:
HMG-1 Hoch-Mobilitäts-Gruppen-Protein-1
HMG-2 Hoch-Mobilitäts-Gruppen-Protein-2
LH-alpha Luteinisierungshormon, alpha-Untereinheit
LH-beta Luteinisierungshormon, beta-Untereinheit
Beispiel 10
Isolierung und Clonierung von Nucleotidsequenzen, die Proteine codieren, die GGF-I- und GGF-II-Peptide enthalten
Die Isolierung und die Clonierung der GGF-II-Nucleotidsequenzen erfolgten, wie hier beschrieben, wobei Peptidsequenzinformationen und Bank-Durchmusterung verwendet wurden, außerdem wurden die Verfahren, wie nachstehend angegeben, durchgeführt. Es ist so zu verstehen, dass die Peptide der 10 und 11 als Ausgangspunkt für die Isolierung und Clonierung von GGF-I-Sequenzen verwendet werden können, indem die hier beschriebenen Verfahren befolgt werden. Dabei zeigt 20, SEQ ID NOs: 51 bis 84, mögliche degenerierte Oligonucleotid-Sonden für diesen Zweck, und in 22, SEQ ID NOs: 86 bis 115, sind mögliche PCR-Primer aufgelistet. Mit diesen Hilfsmitteln wie mit GGF-II sollte es möglich sein, die DNA-Sequenz und die Polypeptidsequenz zu erhalten, und außerdem DNA-Konstrukte und Expressionsvektoren, die eine solche DNA-Sequenz einbauen, Wirtszellen, die durch Einbau solcher Konstrukte/Vektoren genetisch verändert wurden, und ein Protein, das durch Züchten solcher Zellen hergestellt werden kann. Die Erfindung betrifft solche Gegenstände.
I. Entwurf und Synthese von Oligonucleotid-Sonden und Primern
Degenerierte DNA-Oligomer-Sonden wurden durch Zurück-Übersetzen der Aminosäuresequenzen (die von den Peptiden stammen, die aus gereinigtem GGF-Protein hergestellt wurden) zu den Nucleotidsequenzen entworfen. Oligomere stellen entweder den codierenden Strang oder den nicht-codierenden Strang der DNA-Sequenz dar. Wenn Serin, Arginin oder Leucin im entworfenen Oligomer enthalten waren, wurden zwei getrennte Synthesen durchgeführt, um eine Mehrdeutigkeit zu vermeiden. Z.B. wurde Serin entweder durch TCN oder durch AGY wie in 537 und 538 oder 609 und 610 codiert. Eine ähnliche Codon-Aufspaltung wurde für Arginin oder für Leucin durchgeführt (z.B. 544, 545). Die DNA-Oligomere wurden auf einem Biosearch 8750-4-Säulen-DNA-Synthesegerät unter Verwendung der β-Cyanoethyl-Chemie synthetisiert, wobei die Synthese in einem Maßstab von 0,2 μMol erfolgte. Die Oligomere wurden von der Säule abgespalten (500 Angström-CpG-Harze) und die Schutzgruppen in konzentriertem Ammoniumhydroxid 6 bis 24 Stunden bei 55 bis 60°C entfernt. Die Oligomere ohne Schutzgruppen wurden unter Vakuum getrocknet (Speedvac) und durch Elektrophorese in Gelen aus 15 % Acrylamid (20 mono : 1 bis), 50 mM Tris-Borat-EDTA-Puffer, enthaltend 7 M Harnstoff, gereinigt. Oligomere der vollen Länge wurden in den Gelen unter UV-Beschattung nachgewiesen, danach wurden die Banden ausgeschnitten und die DNA-Oligomere in 1,5 ml H₂O unter Schütteln in 4 bis 16 Stunden eluiert. Das Eluat wurde getrocknet, in 0,1 ml H₂O wieder gelöst und sodann wurden Messungen der Absorption bei 260 nm durchgeführt.
Die Konzentrationen wurden gemäß der folgenden Formel bestimmt: (A 260 × Einheiten/ml)(60,6/Länge = × μM)
Alle Oligomere wurden durch Zugabe von H₂O auf eine Konzentration von 50 μM eingestellt.
Die degenerierten Sonden, die wie vorstehend entworfen wurden, sind in 20, SEQ ID NOs: 54 bis 88, dargestellt.
PCR-Primer wurden im Wesentlichen durch die gleichen Verfahren hergestellt, die für Sonden verwendet wurden, wobei die folgenden Modifikationen erfolgten. Aus 13 Nucleotiden bestehende Linker, die Restriktionsstellen enthielten, wurden für die Verwendung bei der Clonierung in Vektoren an den 5'-Enden der degenerierten Oligomere angefügt. Die DNA-Synthese erfolgte im Maßstab von 1 μMol unter Verwendung von 1000 Ångström-CpG-Harzen, und an den Positionen, an denen in die degenerierten Sonden normalerweise alle vier Nucleotide eingebaut werden, wurde Inosin verwendet. Die Reinigung der PCR-Primer umfasste eine Ethanol-Fällung, die auf die Reinigung durch Gel-Elektrophorese folgte.
II. Konstruktion und Durchmusterung einer Bank
Eine genomische DNA-Bank des Rindes wurde von Stratagene bezogen (Katalog Nr.: 945701). Die Bank enthielt 2 × 10⁶ Sau3A1-teilgespaltene Rinder-DNA-Fragmente von 15–20kb, die in den Vektor Lambda DashII cloniert waren. Eine Rinder-Gesamtgehirn-cDNA-Bank wurde von Clonetech bezogen (Katalog Nr.: BL 10139). Komplementäre DNA-Banken wurden aus mRNA konstruiert (In Vitrogen; Stratagene), die aus Rinder-Gesamtgehirn, aus Rinder-Hypophyse und aus Rinder-Hypophysenhinterlappen hergestellt wurde. In Vitrogen stellte zwei cDNA-Banken her: eine Bank lag im Vektor Lambda g10 vor, die andere im Vektor pcDNAI (eine Plasmid-Bank). Die Stratagene-Banken wurden im Vektor Lambda Unizap hergestellt. Zusammen enthielten die cDNA-Banken 14 Millionen primäre rekombinante Phagen.
Die genomische Rinder-Bank wurde auf E. coli K12, Wirtsstamm LE392, auf 23 × 23 cm großen Platten (Nunc) mit 150 000 bis 200 000 Phagenplaques pro Platte plattiert. Jede Platte stellte etwa ein Rinder-Genom-Äquivalent dar. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Platten gekühlt und Replika-Filter gemäß den Verfahren von Maniatis et al. (2: 60–81) hergestellt. Von jeder Platte wurden vier Plaques-Abzüge auf ungeladene Nylonmembranen (PalI Biodyne A oder MSI Nitropure) hergestellt. Die DNA wurde auf den Membranen immobilisiert, indem diese unter UV-Licht fünf Minuten vernetzt wurden oder indem sie bei 80°C unter Vakuum zwei Stunden gebacken wurden. DNA-Sonden wurden unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) mit γ-³²P-ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mMol) nach den Anweisungen des Herstellers markiert. Kurz gesagt wurden 50 pMol des degenerierten DNA-Oligomers in Gegenwart von 600 μCi γ-³²P-ATP und fünf Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden beendet, ein Gelelektrophorese-Auftragepuffer wurde zugegeben, und danach wurden die radiomarkierten Sonden durch Elektrophorese gereinigt. ³²P-markierte Sonden wurden aus Gelscheiben ausgeschnitten und in Wasser eluiert. Andererseits wurden DNA-Sonden über eine PCR-Amplifikation durch den Einbau von α-³²P-dATP oder α-³²P-dCTP gemäß den Anweisungen von Schowalter und Sommer, Anal. Biochem. 177: 90–94, 1989, markiert. Die in PCR-Reaktionen markierten Sonden wurden durch Entsalzen auf Sephadex G-150-Säulen gereinigt.
Die Vorhybridisierung und die Hybridisierung erfolgten in GMC-Puffer (0,52 M NaPi, 7 % SDS, 1 % BSA, 1,5 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 10 mg/ml tRNA). Das Waschen erfolgte in Oligowash (160 ml 1 M Na₂HPO₄, 200 ml 20 % SDS, 8,0 ml 0,5 M EDTA, 100 ml 5 M NaCl, 3632 ml H₂O). Typischerweise wurden 20 Filter (mit jeweils 400 cm²), die Replika-Kopien von zehn Rinder-Genom-Äquivalenten darstellten, in 200 ml Hybridisierungslösung mit 100 pMol der degenerieren Oligonucleotid-Sonde (128- bis 512-fach degeneriert) inkubiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 5°C unter der minimalen Schmelztemperatur, die für die degenerierte Sonde berechnet worden war. Bei der Berechnung der minimalen Schmelztemperatur werden 2°C für ein AT-Paar und 4°C für ein GC-Paar angenommen.
Die Filter wurden in wiederholt ausgetauschten Oligowash-Lösungen bei den Hybridisierungstemperaturen vier bis fünf Stunden und schließlich in 3,2 M Tetramethylammoniumchlorid, 1 % SDS zweimal 30 Minuten bei einer Temperatur gewaschen, die von der Länge der DNA-Sonde abhängig war. Für 20-Mere betrug die Temperatur des letzten Waschgangs 60°C. Die Filter wurden fixiert und danach auf einem Röntgenfilm (Kodak XAR5) unter Verwendung von Verstärkungsschirmen (Dupont Cronex Lightening Plus) exponiert. Normalerweise reichte eine Film-Exposition von drei bis fünf Tagen bei minus 80°C aus, um in diesen Bank-Durchmusterungsfiltern doppelte Signale nachzuweisen. Nach Auswertung der Ergebnisse konnten die Sonden von den Filtern entfernt werden und erneut mit Sonden getestet werden. Die Sonden wurden von den Filtern entfernt, indem sie in zwei aufeinander folgenden Zyklen 15 Minuten in einem Mikrowellen-Ofen bei voller Stärke in einer Lösung von 1 % SDS, enthaltend 10 mM EDTA, pH 8, inkubiert wurden. Die Filter wurden mindestens drei bis vier Zyklen mit Sondenentfernung und erneutem Testen mit verschiedenen Sonden ausgesetzt.
III. Isolierung, Wachstum und DNA-Präparation von rekombinanten Phagen
Diese Verfahren wurden nach dem Standardprotokoll durchgeführt, das in Recombinant DNA (Maniatis et al., 2:60–2:81) beschrieben ist.
IV. Analyse von isolierten Clonen unter Verwendung von DNA-Spaltung und Southern-Blots
Die Proben der rekombinanten Phagen-DNA (2 μg) wurden gemäß den Bedingungen gespalten, die vom Hersteller der Restriktionsendonuclease empfohlen wurden (New England Biolabs). Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Reaktionsprodukte in Gegenwart von 0,1 M Natriumacetat und drei Volumina Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde abzentrifugiert, in 75 % Ethanol gespült und getrocknet. Alle resuspendierten Proben wurden auf Agarose-Gele aufgetragen (typischerweise 1 % in TAE-Puffer; 0,04 M Tris-Acetat, 0,002 M EDTA). Die Gele wurden bei 1 Volt pro cm vier bis 20 Stunden laufen gelassen. Die Marker umfassten HindIII-Lambda-DNA-Fragmente und/oder HaeIII-ϕX174-DNA-Fragmente (New England Biolabs). Die Gele wurden mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Für das Southern-Blotting wurde die DNA zuerst im Gel durch Behandlung mit 0,125 N HCl depuriniert, in 0,5 N NaOH denaturiert und in 20× SSC (3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumcitrat) auf ungeladene Nylonmembranen überführt. Das Blotting erfolgte sechs bis 24 Stunden, danach wurden die Filter in 0,5 Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M Natriumchlorid neutralisiert und danach kurz in 50 mM Tris-Borat-EDTA gespült.
Für die Vernetzung wurden die Filter zuerst in transparente Kunststofffolie eingewickelt und danach wurde die DNA-Seite fünf Minuten einem UV-Licht ausgesetzt. Die Hybridisierung und das Waschen erfolgten, wie für die Durchmusterung der Bank beschrieben (vgl. Abschnitt 2 dieses Beispiels). Für die Hybridisierungs-Analyse, um zu bestimmen, ob ähnliche Gene in anderen Arten vorliegen, wurden geringfügige Modifikationen durchgeführt. Das DNA-Filter wurde von Clonetech (Katalog Nr.: 7753-1) bezogen und enthält 5 μg einer EcoRI-gespaltenen DNA aus verschiedenen Arten pro Bahn. Die Sonde wurde durch PCR-Amplifikationsreaktionen, wie im vorstehenden Abschnitt 2 beschrieben, markiert, und die Hybridisierungen erfolgten in 80 % Puffer B (2 g Polyvinylpyrrolidin, 2 g FicoII-400, 2 g Rinderserumalbumin, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 58 g NaCl, 1 g Natriumpyrophosphat, 10 g Natriumdodecylsulfat, 950 ml H₂O), enthaltend 10 % Dextransulfat. Die Sonden wurden denaturiert, indem sie zehn Minuten gekocht und danach rasch in Eiswasser abgekühlt wurden. Die Sonde wurde zum Hybridisierungspuffer mit 10⁶ ZpM ³²P pro ml zugegeben und über Nacht bei 60°C inkubiert. Die Filter wurden bei 60°C zuerst in Puffer B gewaschen, worauf 2× SSC, 0,1 % SDS und anschließend 1× SSC, 0,1 % SDS folgten. Für Experimente mit hoher Stringenz erfolgten die letzten Waschgänge in 0,1× SSC, 1 SDS, wobei die Temperatur auf 65°C erhöht wurde.
Anhand der Werte aus dem Southern-Blot wurde eine Restriktionskarte des genomischen Clons erstellt und angegeben, welche Subfragmente mit den GGF-Sonden hybridisierten (Kandidaten für die Subclonierung).
V. Subclonierung von DNA-Segmenten, die zu Hybridisierungssonden homolog sind
DNA-Spaltprodukte (z.B. 5 μg) wurden auf 1 % Agarose-Gele aufgetragen, dann wurden nach der Färbung geeignete Fragmente aus den Gelen ausgeschnitten. Die DNA wurde durch Adsorption an Glasperlen gereinigt, worauf eine Elution unter Verwendung des durch den Hersteller empfohlenen Protokolls folgte (Bio 101). Die gewonnenen DNA-Fragmente (100 bis 200 ng) wurden in linearisierte dephosphorylierte Vektoren, z.B. pT3T7 (Ambion), wobei es sich um ein Derivat von pUC18 handelt, unter Verwendung von T4-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Dieser Vektor enthält das β-Lactamase-Gen von E. coli, somit können Transformanten auf Platten, die Ampicillin enthalten, selektiert werden. Der Vektor bewirkt bei den Wirtszellen außerdem die Ergänzung der β-Galactosidase, weshalb Nicht-Rekombinanten (blau) unter Verwendung von Isopropylthiogalactosid und Bluogal (Bethesda Research Labs) nachgewiesen werden können. Ein Teil der Ligierungsreaktionsgemische wurde verwendet, um kompetente E. coli-Zellen K12 XL1 blue (Stratagene, Katalog Nr.: 200236) zu transformieren, und danach wurden die Transformanten auf LB-Platten, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, selektiert. Weiße Kolonien wurden selektiert und sodann Plasmid-Minipräparate für die DNA-Spaltung und für die DNA-Sequenzanalyse hergestellt. Die selektierten Clone wurden erneut getestet, um zu bestimmen, ob ihre Insertions-DNA mit den GGF-Sonden hybridisierte.
VI. DNA-Seguenzierung
Doppelsträngige Plasmid-DNA-Matrizen wurden aus 5-ml-Kulturen gemäß Standardprotokollen hergestellt. Die Sequenzierung erfolgte durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung der Sequenase 2.0 und eines Didesoxynucleotid-Sequenzierungs-Kits (US Biochemical) gemäß den Anweisungen des Herstellers (eine Modifikation von Sanger et al., PNAS USA 74: 5463, 1977). Alternativ wurde die Sequenzierung in einem DNA-Thermozykler (Perkin Elmer, Modell 4800) unter Verwendung eines Zyklus-Sequenzierungs-Kits (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories) durchgeführt, wobei ein 5'-endmarkierter Primer eingesetzt und die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Die Sequenzprimer waren entweder solche, die zusammen mit den Sequenzierungs-Kits bereitgestellt wurden, oder sie wurden gemäß der aus den Clonen bestimmten Sequenz synthetisiert. Die Sequenzierungs-Reaktionsgemische wurden auf 0,4 mm dicke Sequenzierungs-Gele aus 6 % Polyacrylamid aufgetragen und aufgetrennt. Die Gele wurden getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Typischerweise war ³⁵S eingebaut, wenn Standard-Sequenzierungs-Kits verwendet wurden, und bei zyklischen Sequenzierungsreaktionen wurde ein ³²P-endmarkierter Primer eingesetzt. Die Sequenzen wurden von dem Gel von unten nach oben (Richtung von 5' nach 3') abgelesen und in einen DNA-Sequenz-Editor eingegeben und die Werte sodann unter Verwendung von Programmen analysiert, die von der Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin) stammten.
VII. RNA-Herstellung und PCR-Amplifikation
Offene Leseraster, die in der genomischen DNA nachgewiesen wurden und die eine Sequenz enthielten, welche GGF-Peptide codiert, wurden mittels einer PCR-Amplifikation der Hypophysen-RNA verlängert. Die RNA wurde aus gefrorenem Rindergewebe (Pelfreeze) gemäß dem Guanidin-Neutral-CsCl-Verfahren (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294, 1979) hergestellt. Die polyadenylierte RNA wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Säulenchromatographie selektiert (Aviv und Leder, PNAS (USA) 69: 1408, 1972).
Spezifische DNA-Zielsequenzen wurden amplifiziert, wobei entweder mit Gesamt-RNA- oder mit polyadenylierten RNA-Proben begonnen wurde, die unter Verwendung des Perkin Elmer PCR/RNA-Kits Nr. N808-0017 zu cDNA umgewandelt worden waren. Für die reversen Transkriptionsreaktionen des ersten Strangs wurden 1 μg Matrizen-RNA und entweder Primer von Oligo-dT mit angefügten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen-Linkern oder spezifische Antisense-Primer, die aus clonierten Sequenzen bestimmt wurden, mit angefügten Restriktionsstellen verwendet. Um den zweiten Strang zu erzeugen, waren die Primer entweder einmalige Sequenzen des Plus-Strangs, wie in 3'-RACE-Reaktionen verwendet (Frohman et al., PNAS (USA) 85: 8998, 1988), oder es waren Oligo-dT-Primer mit angefügten Restriktionsstellen, wenn die zweite Zielstelle durch Anhängen von dATP an die Erststrang-Reaktionsprodukte mittels terminaler Transferase angefügt worden war (z.B. 5'-RACE-Reaktionen, Frohman et al., vorstehend). Alternativ, wie in verankerten PCR-Reaktionen, waren die Zweitstrang-Primer degeneriert, wobei sie somit bestimmte Peptidsequenzen darstellten.
Die Amplifikationsprofile erfolgten gemäß dem folgenden allgemeinen Schema: 1) fünf Minuten Einweichen-File bei 95°C; 2) Thermozyklus-File von 1 Minute, 95°C; 1 Minute Abkühlen auf eine Anelierungstemperatur von 45°C, 50°C oder 55°C; Beibehalten der Anelierungstemperatur 1 Minute; Erwärmen auf 72°C innerhalb von 1 Minute; Verlängern bei 72°C 1 Minute oder 1 Minute plus eine 10 Sekunden Auto-Verlängerung; 3) Verlängerungszyklus bei 72°C, fünf Minuten, und; 4) Einweichen-File bei 4°C eine unbestimmte Zeit. Die Thermozyklus-Files (# 2) wurden üblicherweise 30 Zyklen laufen gelassen. Von jedem 100-μl-Amplifikations-Reaktionsgemisch wurde eine 16-μl-Probe durch Elektrophorese in 2 % Nusieve 1 % Agarose-Gelen analysiert, die in TAE-Puffer bei 4 Volt pro cm drei Stunden laufen gelassen wurden. Die Gele wurden gefärbt und anschließend auf ungeladene Nylonmembranen geblottet, die mit markierten DNA-Sonden getestet wurden, die innerhalb der Primer lagen.
In den Blotting-Experimenten konnten spezifische Sätze von DNA-Amplifikationsprodukten identifiziert werden, und ihre Positionen konnten als Richtlinie für die Reinigung und Re-Amplifikation verwendet werden. Gegebenenfalls wurden die restlichen Teile von ausgewählten Proben auf präparative Gele aufgetragen, dann wurden nach der Elektrophorese vier bis fünf Scheiben mit einer Dicke von 0,5 mm aus dem Gel entnommen (wobei diese die erwartete Position des spezifischen Produkts umrahmten). Die Agarose wurde zerkleinert und dann in 0,5 ml Elektrophorese-Puffer zwei bis 16 Stunden bei 40°C eingeweicht. Die zerkleinerte Agarose wurde zwei Minuten zentrifugiert und die wässrige Phase in frische Röhrchen überführt.
Die Re-Amplifikation erfolgte mit 5 μl (etwa 1 % des Produkts) des eluierten Materials unter Verwendung des gleichen Satzes von Primern und der Reaktionsprofile wie in den ursprünglichen Reaktionen. Wenn die Re-Amplifikationsreaktionen vollständig abgelaufen waren, wurden die Proben mit Chloroform extrahiert und in frische Röhrchen überführt. Konzentrierte Restriktionsenzym-Puffer und Enzyme wurden zu den Reaktionsgemischen zugegeben, um sie an den in den Linkern vorliegenden Restriktionsstellen zu spalten. Die gespaltenen PCR-Produkte wurden durch Gel-Elektrophorese gereinigt und danach in Vektoren subcloniert, wie im vorstehenden Abschnitt Subclonierung beschrieben. Die DNA-Sequenzierung erfolgte, wie vorstehend beschrieben.
VIII. DNA-Sequenzanalyse
Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung eines Fragment-Zusammenbau-Programms und der Aminosäuresequenzen, die durch die GCG-Programme GelAssemble, Map and Translate hergeleitet wurden, zusammengebaut. Die hergeleiteten Proteinsequenzen wurden als eine Abfragesequenz verwendet, um Proteinsequenz-Datenbanken unter Verwendung von WordSearch zu durchsuchen. Die Analyse erfolgte auf einer Arbeitsstation VAX Station 3100, die unter VMS 5.1 lief. Die Datenbanksuche wurde auf SwissProt Version Nr. 21 unter Verwendung der GCG-Version 7.0 durchgeführt.
IX. Ergebnisse der Clonierung und Sequenzierung von Genen, die GGF-I und GGF-II codieren
Wie vorstehend angegeben, wurden zur Identifizierung der DNA-Sequenz, die Rinder-GGF-II codiert, aus GGF-II-Peptidsequenzen degenerierte Oligonucleotid-Sonden entworfen. GGF-II-12 (SEQ ID NO: 44), ein Peptid, das durch Lysyl-Endopeptidase-Spaltung eines gereinigten GGF-II-Präparats erzeugt wurde (vgl. 16 und 12), zeigte eine starke Homologie in der Aminosäuresequenz mit GGF-I-07 (SEQ ID NO: 39), einem tryptischen Peptid, das aus einem gereinigten GGF-I-Präparat hergestellt wurde. GGF-II-12 wurde deshalb verwendet, um zehn degenerierte Oligonucleotid-Sonden zu erzeugen (vgl. Oligos 609, 610 und 649 bis 656 in 20, SEQ ID NOs: 66, 67, 68 bzw. 75). Ein doppelter Satz von Filtern wurde mit zwei Sätzen von Sonden (Satz 1 = 609, 610; Satz 2 = 649 bis 5656 getestet, die zwei überlappende Teile von GGF-II-12 codieren. Hybridisierungsignale wurden festgestellt, wobei jedoch nur ein Clon mit beiden Sondensätzen hybridisierte. Der Clon (der mit GGF2BG1 bezeichnet wurde) wurde gereinigt.
Die Southern-Blot-Analyse von DNA aus dem Phagenclon GGF2BG1 bestätigte, dass beide Sätze von Sonden mit dieser Rinder-DNA-Sequenz hybridisierten, und sie zeigte weiterhin, dass beide Sonden mit dem gleichen Satz von DNA-Fragmenten innerhalb des Clons reagierten. Aufgrund dieser Experimente wurde ein 4-kb-EcoRI-Subfragment des ursprünglichen Clons identifiziert, subcloniert und teilweise sequenziert. 21 zeigt die Nucleotidsequenz, SEQ ID NO: 89, und die hergeleitete Aminosäuresequenz der anfänglichen DNA-Sequenzdaten, die die Hybridisierungsstellen der Sonden 609 und 650 umfassten, wodurch bestätigt wurde, dass ein Teil dieser genomischen Rinder-DNA das Peptid 12 codierte (KASLADSGEYM).
Die weitere Sequenzanalyse zeigte, dass GGF-II-12 auf einem aus 66 Aminosäuren bestehenden offenen Leseraster lag (vgl. nachstehend), das zum Ausgangspunkt für die Isolierung von überlappenden Sequenzen wurde, die ein mutmaßliches Rinder-GGF-II-Gen und eine cDNA darstellten.
Verschiedene PCR-Verfahren wurden eingesetzt, um weitere codierende Sequenzen für das mutmaßliche Rinder-GGF-II-Gen zu erhalten. Gesamt-RNA und Oligo-dT-selektierte (Poly-A enthaltende) RNA-Proben wurden aus der gesamten Hypophyse, dem Hypophysenvorderlappen, dem Hypophysenhinterlappen und dem Hypothalamus des Rindes hergestellt. Unter Verwendung von Primern aus der in 22 dargestellten Liste, SEQ ID NOs: 109 bis 119, wurden einseitige PCR-Reaktionen (RACE) eingesetzt, um cDNA-Enden sowohl in 3'- als auch in 5'-Richtung zu amplifizieren, und außerdem wurden verankerte PCR-Reaktionen mit degenerierten Oligonucleotid-Primern durchgeführt, die weitere GGF-II-Peptide darstellten. In 29 sind die aneinander angrenzenden DNA-Strukturen und -Sequenzen zusammengestellt, die in diesen Experimenten erhalten wurden. Durch die 3'-RACE-Reaktionen wurden drei verschieden gespleißte cDNA-Sequenzen produziert, die cloniert und sequenziert wurden. Eine 5'-RACE-Reaktion führte zur Entdeckung einer ein weiteres Exonenthaltenden codierenden Sequenz für mindestens 52 Aminosäuren. Die Analyse dieser hergeleiteten Aminosäuresequenz ergab die Peptide GGF-II-6 und eine Sequenz, die dem GGF-I-18 ähnlich war (vgl. nachstehend). Die verankerten PCR-Reaktionen führten zur Identifizierung von (cDNA) codierenden Sequenzen der Peptide GGF-II-1, 2, 3 und 10, die innerhalb eines weiteren cDNA-Segments von 300 bp enthalten waren. Die 5'-Grenze dieses Segments (d.h. Segment E, vgl. 30) ist durch das Oligonucleotid definiert, das das Peptid GGF-II-1 codiert und das in der PCR-Reaktion verwendet wurde (weitere 5'-Sequenz-Daten liegen vor, wie für den menschlichen Clon in Beispiel 11 beschrieben). Somit enthält dieser Clon Nucleotidsequenzen, die sechs der insgesamt vorliegenden neun neuen GGF-II-Peptidsequenzen codieren.
Das clonierte Gen wurde charakterisiert, indem zuerst eine physikalische Karte von GGF2GB1 konstruiert wurde, die es uns möglich machte, die codierenden Sequenzen, die gefunden wurden, zu positionieren (vgl. nachstehend, 30). DNA-Sonden aus den vorstehend beschriebenen codierenden Sequenzen wurden verwendet, um weitere DNA-Fragmente zu identifizieren, welche die Exons auf diesem Phagenclon enthielten, und um Clone zu identifizieren, die in beiden Richtungen überlappen. Das mutmaßliche Rinder-GGF-II-Gen ist in mindestens fünf codierende Segmente aufgeteilt. Codierende Segmente sind als Strecken einer DNA-Sequenz bestimmter Länge definiert, die unter Verwendung des universellen genetischen Codes in Polypeptidsequenzen translatiert werden können. Die codierenden Segmente, die in 36 beschrieben und in der vorliegenden Anmeldung angesprochen werden, sind: 1) bestimmte Exons, die innerhalb des GGF-Gens vorliegen (z.B. codierendes Segment a), oder 2) hergeleitet von Sätzen von zwei oder mehr Exons, die in spezifischen Subgruppen von mRNAs erscheinen, wobei jeder Satz in die spezifischen Polypeptidsegmente translatiert werden kann, wie in den Genprodukten gezeigt. Die in den Patentansprüchen angesprochenen Polypeptidsegmente sind die Translationsprodukte der analogen codierenden DNA-Segmente. Nur die codierenden Segmente A und B wurden als Exons definiert und bisher sequenziert und kartiert. Die Zusammenfassung der identifizierten, aneinander angrenzenden, codierenden Sequenzen ist in 31 dargestellt. Die Exons sind (alphabetisch) aufgelistet in der Reihenfolge ihrer Entdeckung. Aus den Intron/Exon-Grenzen ist ersichtlich, dass Exon B in cDNAs enthalten sein kann, die das codierende Segment E und das codierende Segment A verbinden. Das heißt, Exon B kann nicht herausgespleißt werden, ohne dass das Leseraster beeinträchtigt wird. Deshalb vermuten wir, dass drei alternative Spleißmuster die mutmaßlichen Rinder-GGF-II-cDNA-Sequenzen 1, 2 und 3 erzeugen können. Die codierenden Sequenzen hiervon, genannt GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS bzw. GGF2BPP3.CDS, sind in den 27A (SEQ ID NO: 129), 27B (SEQ ID NO: 130) bzw. 27C (SEQ ID NO: 131) angegeben. Die hergeleitete Aminosäuresequenz der drei cDNAs ist auch in den 27A (SEQ ID NO: 129), 27B (SEQ ID NO: 130) und 27C (SEQ ID NO: 131) angegeben.
Die drei hergeleiteten Strukturen codieren Proteine mit Längen von 206, 281 und 257 Aminosäuren. Die ersten 183 Reste der hergeleiteten Proteinsequenz sind in allen drei Genprodukten identisch. An Position 184 unterscheiden sich die Clone signifikant. Ein Codon für Glycin GGT in GGF2BPP1 dient auch als ein Spleiß-Donor für GGF2BPP2 und GGF2BPP3, bei denen alternativ die Exons C, C/D, C/D' und D bzw. C, C/D und D angefügt sind, wie in 32, SEQ ID NO: 145, gezeigt. GGFIIBPP1 ist ein verkürztes Genprodukt, das erzeugt wird, indem über die Spleißstelle des codierenden Segments A in die folgende intervenierende Sequenz (Intron) hinein abgelesen wird. Dies stellt das codierende Segment A' in 30 (SEQ ID NO: 136) dar. Das Transkript endet angrenzend an eine kanonische AATAAA-Polyadenylierungssequenz, und wir nehmen an, dass dieses verkürzte Genprodukt ein reifes bona-fide-Transkript darstellt. Die anderen zwei längeren Genprodukte haben die gleiche untranslatierte 3'-Sequenz und Polyadenylierungsstelle gemeinsam.
Alle drei dieser Moleküle enthalten sechs der neun neuen GGF-II-Peptidsequenzen (11), und ein weiteres Peptid ist sehr homolog zu GGF-I-18 (vgl. 26). Aufgrund dieses Ergebnisses besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass dieses rekombinante Molekül mindestens einen Teil des Rinder-GGF-II codiert. Weiterhin sind für die drei Peptide die berechneten isoelektrischen Punkte mit den physikalischen Eigenschaften von GGF-I und II vereinbar. Da die Molekülgröße von GGF-II etwa 60 kD beträgt, sollte die längste der drei cDNAs ein Protein mit etwa einer Hälfte der vorausgesagten Zahl von Aminosäuren codieren.
Eine Sonde, welche die Exons B und A umfasste, wurde durch PCR-Amplifikation markiert und eingesetzt, um eine cDNA-Bank durchzumustern, die aus einer aus Rinder-Hypophysenhinterlappen isolierten RNA hergestellt worden war. Ein Clon (GGF2BPP5) zeigte das Muster, das in 29 angegeben ist, und enthielt ein weiteres codierendes DNA-Segment (G) zwischen den codierenden Segmenten A und C. Die gesamte Nucleinsäuresequenz ist in 31 dargestellt (SEQ ID NO: 144). Das vorausgesagte Translationsprodukt aus dem längsten offenen Leseraster weist 241 Aminosäuren auf. Außerdem wurde ein Teil einer zweiten cDNA (GGF2BPP4) aus der Rinder-Hypophysenhinterlappen-Bank unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Sonde isoliert. Dieser Clon zeigte das in 29 angegebene Muster. Dieser Clon ist am 5'-Ende unvollständig, er ist jedoch eine Spleißvariante in dem Sinn, dass ihm die codierenden Segmente G und D fehlen. BPP4 zeigt auch ein neues 3'-Ende mit den Regionen H, K und L, die hinter der Region C/D liegen. Die Sequenz von BPP4 ist in 33 dargestellt (SEQ ID Nr. 146).
Beispiel 11
GGF-Sequenzen in verschiedenen Arten
Die GGF-Proteine sind Mitglieder einer neuen Superfamilie von Proteinen. In Kreuzhybridisierungs-Studien mit hoher Stringenz (DNA-Blotting-Experimenten) mit anderen Säuger-DNAs haben wir deutlich gezeigt, dass DNA-Sonden aus diesem rekombinanten Rinder-Molekül in einer Vielzahl von getesteten Proben spezifische Sequenzen einfach nachweisen können. Auch in menschlicher genomischer DNA wird eine stark homologe Sequenz nachgewiesen. Das Autoradiogramm ist in 28 dargestellt. Die Signale in den Bahnen, die Ratten- und menschliche DNA enthalten, stellen die Äquivalente des GGF-Gens der Ratte und des Menschen dar, wobei die Sequenzen von verschiedenen cDNAs, die durch dieses Gen codiert werden, kürzlich von Holmes et al. (Science 256: 1205, 1992) und von Wen et al. (Cell 69: 559, 1992) beschrieben wurden.
Beispiel 12
Isolierung einer menschlichen Sequenz, die ein menschliches GGF2 codiert
Verschiedene menschliche Clone, die Sequenzen aus dem codierenden Segment E des Rinder-GGFII enthalten, wurden durch Durchmusterung einer menschlichen cDNA-Bank isoliert, die aus Hirnstamm hergestellt worden war (Stratagene, Katalog Nr. 935206). Diese Strategie wurde aufgrund des deutlichen Zusammenhangs zwischen den meisten GGF2-Peptiden (einmalig für GGF2) und der vorausgesagten Peptidsequenz aus Clonen, die das Rinder-Segment E enthalten, verfolgt. Diese Bank wurde, wie in Beispiel 8, Abschnitt II, beschrieben, durchgemustert, wobei die nachstehend angegebenen Oligonucleotid-Sonden 914 bis 919 verwendet wurden.
Die mit diesen Sonden nachgewiesenen Clone wurden durch Hybridisierung noch weiter analysiert. Außerdem wurde eine Sonde, die vom codierenden Segment A stammte (vgl. 30) und durch Markierung eines Produkts der Polymerasekettenreaktion (PCR) aus Segment A hergestellt wurde, zum Durchmustern der primären Bank verwendet. Mehrere Clone, die sowohl mit von A als auch von E stammenden Sonden hybridisierten, wurden selektiert, und ein bestimmter Clon, GGF2HBS5, wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Dieser Clon wird durch das folgende Muster von codierenden Segmenten dargestellt (EBACC/D'D, wie in 30 angegeben). Das Segment E in diesem Clon ist das menschliche Äquivalent der verkürzten Rinder-Version von E, wie in 30 gezeigt. GGF2HBS5 ist von allen beschriebenen „mutmaßlichen" GGF-II-Kandidaten der Kandidat, der mit größter Wahrscheinlichkeit GGF-II codiert. Die Länge des Segments E der codierenden Sequenz beträgt 786 Nucleotide plus 264 Basen einer untranslatierten Sequenz. Die vorausgesagte Größe des durch GGF2HBS5 codierten Proteins beträgt etwa 423 Aminosäuren (etwa 45 Kilodalton, vgl. 44, SEQ ID NO: 21), dies ist ähnlich der Größe der deglycosylierten Form von GGF-II (vgl. Beispiel 20). Außerdem haben sieben der GGF-II-Peptide, die in 26 angegeben sind, äquivalente Sequenzen, die in die Proteinsequenz fallen, die aus Region E vorausgesagt wurde. Die Peptide II-6 und II-12 sind Ausnahmen, die in das codierende Segment B bzw. das codierende Segment A fallen. Eine RNA, die das Protein GGF2HBS5 codiert, wurde in einem in vitro-Transkriptionssystem erzeugt, das durch den Promotor des Bakteriophagen T7 gesteuert wurde, der im Vektor vorlag (Bluescript SK [Stratagene Inc.], vgl. 47), welcher die GGF2HBS5-Insertion enthielt. Diese RNA wurde in einem zellfreien (Kaninchen-Retikulocyten) Translationssystem translatiert, wobei die Größe des Proteinprodukts 45 kD betrug. Außerdem wurde das zellfreie Produkt in einem Schwann-Zellen-Mitogenese-Test getestet, um die biologische Aktivität zu bestätigen. Die mit konditioniertem Medium behandelten Schwann-Zellen zeigen sowohl eine gesteigerte Proliferation, die durch den Einbau von ¹²⁵I-Uridin gemessen wurde, als auch eine Phosphorylierung am Tyrosin eines Proteins im Bereich von 185 Kilodalton.
Somit bestätigen die Größe des Produkts, das durch GGF2HBS5 codiert wird, und das Vorliegen von DNA-Sequenzen, die menschliche Peptide codieren, die stark homolog sind zu den Rinder-Peptiden, die in 11 dargestellt sind, dass GGF2HBS5 das menschliche Äquivalent des Rinder-GGF2 codiert. Die Tatsache, dass konditionierte Medien, die aus Zellen hergestellt wurden, die mit diesem Clon transformiert waren, eine Mitogenese-Aktivität auf Schwann-Zellen hervorbringen, bestätigt, dass das GGFIIHBS5-Genprodukt (anders als das BPP5-Genprodukt) ausgeschieden wird. Außerdem scheint das GGFIIBPP5-Genprodukt die Proliferations-Antwort von Schwann-Zellen über eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase, wie p185^erba2, oder einen nah verwandten Rezeptor zu vermitteln (vgl. Beispiel 19).
Beispiel 13
Expression eines menschlichen rekombinanten GGF2 in Säuger- und Insektenzellen
Der GGF2HBS5-cDNA-Clon, der menschliches GGF2 codiert (wie in Beispiel 12 beschrieben, der hier auch als HBS5 bezeichnet wird), wurde in den Vektor pcDL-SRα296 cloniert, und sodann wurden COS-7-Zellen in 100-mm-Schalen durch das DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert. Danach wurden Zelllysate oder konditionierte Medien aus transient exprimierenden COS-Zellen drei oder vier Tage nach der Transfektion geerntet. Um Lysate herzustellen, wurden einschichtige Zellrasen mit PBS gewaschen, von den Platten abgeschabt und durch drei Zyklen mit Einfrieren und Auftauen in 150 μl 0,25 M Tris-HCl, pH 8, lysiert. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert und der Überstand gewonnen. Proben der konditionierten Medien (7 ml) wurden entnommen, anschließend eingeengt und der Puffer gegen 10 mM Tris, pH 7,4, unter Verwendung von Centriprep-10- und Centricon-10-Einheiten, wie von den Herstellern beschrieben (Amicon, Beverly, MA), ausgetauscht. Schwann-Zellen des Rattennervs wurden auf den Einbau von DNA-Synthese-Vorläufern, wie beschrieben, getestet. Proben von konditionierten Medien oder von Zelllysaten wurden im Schwann-Zellen-Proliferations-Test, wie in Marchionni et al., Nature 362: 313, 1993, beschrieben, getestet. Die cDNA, GGF2HBS5, die GGF2 codiert, steuerte die Sekretion des Proteinprodukts in das Medium. Eine minimale Aktivität konnte innerhalb der Zellen nachgewiesen werden, wie durch Tests unter Verwendung von Zelllysaten bestimmt wurde. Die GGF2HFB1- und GGFBPP5-cDNAs bewirkten keine Sekretion des Produkts ins extrazelluläre Medium. Die GGF-Aktivität aus diesen Clonen war nur in Zelllysaten nachweisbar.
Rekombinanter GGF2 wurde auch in CHO-Zellen exprimiert. Die GGF2HBS5-cDNA, die GGF2 codiert, wurde in die EcoRI-Stelle des Vektors pcdhfrpolyA cloniert und durch das Calciumphosphat-Co-Fällungsverfahren in die DHFR-negative CHO-Zelllinie (GG44) transfiziert. Die Clone wurden in Nucleotid- und Nucleosid-freiem α-Medium (Gibco) in Platten mit 96 Vertiefungen selektiert. Nach drei Wochen wurden die Proben der konditionierten Medien der einzelnen Clone durch den Schwann-Zellen-Proliferations-Test auf die Expression von GGF durchgemustert, wie in Marchionni et al., Nature 362: 313, 1993, beschrieben. Stabile Clone wurden identifiziert, die signifikante Spiegel der GGF-Aktivität ins Medium ausgeschieden hatten. Die Werte der Schwann-Zellen-Proliferations-Aktivität von Aliquots mit unterschiedlichem Volumen des CHO-Zellenkonditionierten Mediums wurden verwendet, um die in 46 dargestellte Dosis-Antwort-Kurve zu erzeugen (Graham und Van Der Eb, Virology 52: 456, 1973). Dieses Material wurde auf einem Western-Blot analysiert, der mit polyclonalen Antiseren durchgeführt wurde, die gegen ein spezifisches GGF2-Peptid hervorgebracht worden waren. Eine Bande mit etwa 65 kD (die erwartete Größe des aus der Hypophyse extrahierten GGF2) ist spezifisch markiert (48, Bahn 12).
Außerdem wurde ein rekombinanter GGF2 durch eine Baculovirus-Expression in Insektenzellen exprimiert. Sf9-Insektenzellen wurden mit einem Baculovirus, das den cDNA-Clon GGF2HBS5 enthielt, mit einer Multiplizität von 3 bis 5 (10⁶ Zellen/ml) infiziert und in Medium Sf900-II gezüchtet. Die Schwann-Zellen-Mitogenese-Aktivität wurde in das extrazelluläre Medium ausgeschieden. Verschiedene Volumina des Insektenzellen-konditionierten Mediums wurden in dem Schwann-Zellen-Proliferations-Test in Abwesenheit von Forskolin getestet, sodann wurde anhand der Daten eine Dosis-Antwort-Kurve erstellt.
Dieses Material wurde auch auf einem Western-Blot analysiert (45B), der mit dem vorstehend beschriebenen GGF-II-spezifischen Antikörper durchgeführt wurde.
Die in diesem Beispiel verwendeten Verfahren waren wie folgt:
Die Schwann-Zellen-Mitogenese-Aktivität von rekombinanten menschlichen und Rinder-Glia-Wachstumsfaktoren wurde wie folgt bestimmt: die mitogenen Antworten von gezüchteten Schwann-Zellen wurden in Gegenwart von 5 μM Forskolin gemessen, indem rohe rekombinante GGF-Präparate verwendet wurden, die aus transienten Säuger-Expressionsexperimenten erhalten worden waren. Der Einbau von ¹²⁵I-Urd wurde nach einer Exposition von 18 bis 24 Stunden gegenüber Stoffen bestimmt, die aus transfizierten oder zum Schein transfizierten COS-Zellen, wie in den Verfahren beschrieben, erhalten worden waren. Die durchschnittliche und Standardabweichung von vier Sätzen von Werten ist jeweils dargestellt. Die mitogene Antwort auf partiell gereinigtes natives Rinder-Hypophysen-GGF (Carboxymethylcellulose-Fraktion; Goodearl et al., eingereicht) ist als ein Standard von 100 % Aktivität dargestellt (GGF).
cDNAs (46, SEQ ID NOs: 166 bis 168) wurden in pcDL-SRα296 (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8: 466–472, 1988) cloniert, und COS-7-Zellen wurden in 100-mm-Schalen durch das DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert (Sambrook et al., in: Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)). Drei oder vier Tage nach der Transfektion wurden Zelllysate oder konditionierte Medien geerntet. Um Lysate herzustellen, wurden die einschichtigen Zellrasen mit PBS gewaschen, von den Schalen abgeschabt und durch drei Zyklen mit Einfrieren und Auftauen in 150 μl 0,25 M Tris-HCl, pH 8, lysiert. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen. Proben der konditionierten Medien (7 ml) wurden entnommen, anschließend eingeengt und der Puffer wurde gegen 10 mM Tris, pH 7,4, unter Verwendung von Centriprep-10- und Centricon-10-Einheiten, wie von den Herstellern beschrieben (Amicon, Beverly, MA), ausgetauscht. Schwann-Zellen des Ratten-Ischiasnervs wurden auf den Einbau von DNA-Synthese-Vorläufern, wie beschrieben, getestet (Davis und Stroobant, J. Cell Biol. 110: 1353–1360, 1990; Brockes et al., Brain Res. 165: 105–118, 1979).
Western-Blots eines durch rekombinante CHO-Zellen konditionierten Mediums wurden wie folgt durchgeführt: ein rekombinanter CHO-Clon wurde in MCDB302 proteinfrei drei Tage gezüchtet. 2 ml des konditionierten Mediums wurden geerntet, eingeengt, der Puffer wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, ausgetauscht und zur Trockne gefriergetrocknet. Das Pellet wurde in SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert, einer reduzierenden SDS-Gel-Elektrophorese unterworfen und durch Western-Blottting mit einem GGF-Peptid-Antikörper analysiert. Eine CHO-Kontrolle wurde durch Verwendung eines konditionierten Mediums aus nicht-transfizierten CHO-DG44-Wirtszellen erstellt, und die CHOHBS5-Spiegel wurden getestet, indem ein konditioniertes Medium aus einem rekombinanten Clon eingesetzt wurde.
Beispiel 14
Identifizierung von funktionellen Elementen von GGF
Die hergeleiteten Strukturen der Familie der GGF-Sequenzen zeigen, dass die längsten Formen (wie durch GGF2BPP4 dargestellt) Transmembranproteine codieren, bei denen der extrazelluläre Teil eine Domäne enthält, die dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnelt (vgl. Carpenter und Wahl, in: Peptide Growth Factors and Their Receptors I, S. 69–133, Springer-Verlag, NY, 1991). Die Positionen der Cysteinreste in der Peptidsequenz der codierenden Segmente C und C/D oder C/D' sind hinsichtlich der analogen Reste in der Peptidsequenz des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) konserviert (vgl. 32, SEQ ID NOs: 147 bis 149). Dies legt nahe, dass die extrazelluläre Domäne als Rezeptorerkennungs- und biologische Aktivierungsstellen fungiert. Bei mehreren der Varianten-Formen fehlen die codierenden Segmente H, K und L, weshalb sie möglicherweise als sekretierte, diffusionsfähige, biologisch aktive Proteine exprimiert werden. GGF-DNA-Sequenzen, die Polypeptide codieren, welche die EGF-ähnliche Domäne umfassen (EGFL), können die vollständige biologische Aktivität zum Stimulieren der Gliazellen-Mitogenese-Aktivität besitzen.
Membrangebundene Versionen dieses Proteins können eine Proliferation von Schwann-Zellen induzieren, wenn sie während der Embryogenese oder während der Nervenregeneration auf der Oberfläche von Neuronen exprimiert werden (wobei die Oberflächen von Neuronen mit den Oberflächen von proliferierenden Schwann-Zellen eng assoziiert sind).
Ausgeschiedene (nicht membrangebundene) GGFs können als klassisch diffusionsfähige Faktoren wirken, die mit Schwann-Zellen in einem gewissen Abstand vom Punkt der Sekretion aus interagieren können. Andere Formen können bei einer Gewebeverletzung und Zerstörung von Zellen aus intrazellären Quellen freigesetzt werden. Ein Beispiel eines sekretierten GGF ist das Protein, das durch GGF2HBS5 codiert wird; dieses Protein ist der einzige bekannte GGF, für den gefunden wurde, dass er zum Äußeren der Zelle geleitet wird. Die Sekretion wird möglicherweise über eine N-terminale hydrophobe Sequenz vermittelt, die nur in Region E gefunden wird, wobei es sich um die N-terminale Domäne handelt, die in dem durch GGF2HBS5 codierten rekombinanten GGF2 enthalten ist.
Andere GGFs scheinen nicht sekretiert zu werden. Diese GGFs können Formen als Antwort auf Verletzungen darstellen, die als Folge einer Gewebeschädigung freigesetzt werden.
Andere Regionen der vorausgesagten Proteinstruktur von GGF2 (codiert durch GGF2HBS5) und andere Proteine, welche die Regionen B und A enthalten, zeigen Ähnlichkeiten mit dem Heparansulfat-Proteoglycan-Kern-Protein der menschlichen Basalmembran. Das Peptid ADSGEY, das nah am zweiten Cysteinrest der C2-Immunglobulin-Falte in diesen GGFs liegt, kommt in neun von 22 C2-Wiederholungen vor, die in diesem Protein der Basalmembran gefunden werden. Dieser Hinweis legt überzeugend nahe, dass diese Proteine sich mit Matrixproteinen assoziieren können, z.B. solchen, die mit Neuronen und Glia assoziiert sind, wobei dies auf ein Verfahren hinweist, wie es dazu kommen könnte, dass Glia-Wachstumfaktoren an den Zielorten abgesondert vorliegen.
Beispiel 15
Reinigung von GGFs aus rekombinanten Zellen
Um GGFs der vollen Länge oder Teile davon zu erhalten, die dann auf ihre biologische Aktivität getestet werden können, können die Proteine unter Verwendung einer clonierten DNA überproduziert werden. Hierfür können verschiedene Ansätze verwendet werden. Eine rekombinante E. coli-Zelle, die die vorstehend beschriebenen Sequenzen enthält, kann konstruiert werden. Für diesen Zweck können Expressionssysteme wie pNH8a oder pHH16a (Stratagene, Inc.) nach den Verfahren der Hersteller eingesetzt werden. Andererseits können diese Sequenzen in einen Säuger-Expressionsvektor eingefügt werden und eine überproduzierende Zelllinie kann konstruiert werden. Als ein Beispiel für diesen Zweck wurde GGF-codierende DNA, Clon GGF2BPP5, in COS-Zellen exprimiert, außerdem kann sie in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters exprimiert werden, wobei der Expressionsvektor pMSXND eingesetzt wird (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263: 3521–3527, 1981). Dieser Vektor, der GGF-DNA-Sequenzen enthält, kann anhand von eingeführten Verfahren in Wirtszellen transfiziert werden.
Eine transiente Expression kann untersucht werden oder G418-resistente Clone können in Gegenwart von Methotrexat gezüchtet werden, um Zellen zu selektieren, die das dhfr-Gen (das auf dem Vektor pMSXND enthalten ist) amplifizieren und, in diesem Prozess, die benachbarte GGF-Protein-codierende Sequenz mit-amplifizieren. Da CHO-Zellen in einem vollständig proteinfreien Medium gehalten werden können (Hamilton und Ham, In Vitro 13: 537–547, 1977), kann das gewünschte Protein aus dem Medium gereinigt werden. Anhand der Western-Analyse unter Verwendung der in Beispiel 17 erzeugten Antiseren kann das Vorliegen des gewünschten Proteins in dem konditionierten Medium der überproduzierenden Zellen nachgewiesen werden.
Das gewünschte Protein (rGGF2) wurde aus dem Medium, das durch transient exprimierende COS-Zellen konditioniert worden war, wie folgt gereinigt. rGGF-II wurde aus dem konditionierten Medium geerntet und durch Kationenaustausch-Chromatographie (POROS-HS) gereinigt. Die Säule wurde mit 33,3 mM MES, pH 6,0, äquilibriert. Die konditionierten Medien wurden mit einer Fließrate von 10 ml/min aufgetragen. Der Peak, der eine Schwann-Zellen-Proliferations-Aktivität und eine Immunreaktivität besaß (unter Verwendung der polyclonalen Antiseren gegen ein GGF2-Peptid, wie vorstehend beschrieben), wurde mit 50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8,0, eluiert.
rhGGF2 wird auch unter Verwendung einer stabilen Zelllinie des Ovars des Chinesischen Hamsters exprimiert. rGGF2 aus den geernteten konditionierten Medien wurde durch die Kationenaustausch-Chromatographie (POROS-HS) teilweise gereinigt. Die Säule wurde mit PBS, pH 7,4, äquilibriert. Die konditionierten Medien wurden mit 10 ml/min aufgetragen. Der Peak, der eine Schwann-Zellen-Proliferations-Aktivität und eine Immunreaktivität besaß (unter Verwendung der polyclonalen GGF2-Antiseren), wurde mit 50 mM Hepes, 500 mM NaCl, pH 8,0, eluiert. Ein weiterer Peak wurde bei 50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 8,0, festgestellt, der sowohl Proliferations-Aktivität als auch Immunreaktivität besaß (45).
rhGGF2 kann weiter gereinigt werden, wobei als hochauflösender Schritt eine Hydrophobe Interaktions-Chromatographie; eine Kationenaustausch/Umkehrphasen-Chromatographie (sofern dies als zweiter hochauflösender Schritt erforderlich ist); ein Schritt zum Inaktivieren von Viren und ein Schritt zum Entfernen der DNA, z.B. eine Anionenaustausch-Chromatographie, verwendet werden können.
Die Schwann-Zellen-Proliferations-Aktivität des aus der Kationenaustausch-Säule eluierten Peaks des rekombinanten GGF2 wurde wie folgt bestimmt: Die mitogenen Antworten der gezüchteten Schwann-Zellen wurden in Gegenwart von 5 M Forskolin gemessen, wobei der Peak verwendet wurde, der durch 50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8,0, eluiert worden war. Der Peak wurde mit 20 l, 10 l (1:10) 10 l und (1:100) 10 l zugegeben. Der Einbau von ¹²⁵I-Uridin wurde bestimmt und nach einer Exposition von 18 bis 24 Stunden als CpM angegeben.
Ein Immunblot unter Verwendung eines gegen ein Peptid von GGF2 hervorgebrachten polyclonalen Antikörpers wurde wie folgt durchgeführt: 10 l von verschiedenen Fraktionen wurden auf 4 bis 12 % Gradientengelen laufen gelassen. Die Gele wurden auf Nitrocellulosepapier überführt und die Nitrocellulose-Blots mit 5 % BSA blockiert und mit dem GGF-2-spezifischen Antikörper getestet (Verdünnung von 1:250). Als zweiter Antikörper wurde das ¹²⁵I-Protein A verwendet (Verdünnung von 1:500, spezifische Aktivität = 9,0 Ci/g). Die Immunblots wurden sechs Stunden auf Kodak-Röntgenfilmen exponiert. Die mit 1 M NaCl eluierten Peak-Fraktionen zeigten eine immunreaktive Bande bei 69 K.
Die Reinigung von GGF2 auf Kationenaustauscher-Säulen wurde wie folgt durchgeführt: mit CHO-Zellen konditionierte Medien, die rGGFII exprimierten, wurden auf die Kationenaustauscher-Säule mit 10 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS, pH 7,4, äquilibriert. Die Elution wurde mit 50 mM Hepes, 500 mM NaCl, pH 8,0, bzw. 50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 8,0, durchgeführt. Alle Fraktionen wurden unter Verwendung des hier beschriebenen Schwann-Zellen-Proliferations-Tests (CpM) analysiert. Die Proteinkonzentration (mg/ml) wurde durch den Bradford-Test mit BSA als Standard bestimmt.
Ein Western-Blot unter Verwendung von 10 l von jeder Fraktion wurde durchgeführt, wobei festgestellt wurde, dass die Immunreaktivität und die Schwann-Zellen-Aktivität gemeinsam liefen.
Das Protein kann zu verschiedenen Zeitpunkten in dem Verfahren durch einen Western-Blot-Test getestet werden. Alternativ kann der hier beschriebene Schwann-Zellen-Mitogenese-Test eingesetzt werden, um das exprimierte Produkt des Clons der vollen Länge oder beliebige biologisch aktive Teile davon zu testen. Der Clon der vollen Länge GGF2BPP5 wurde in COS-Zellen transient exprimiert. Intrazelluläre Extrakte von transfizierten COS-Zellen zeigen eine biologische Aktivität, wenn sie im Schwann-Zellen-Proliferations-Test, wie in Beispiel 8 beschrieben, getestet werden. Außerdem wurde der GGF2HBS5 codierende Clon der vollen Länge in COS-Zellen transient exprimiert. In diesem Fall zeigen sowohl der Zellextrakt als auch die konditionierten Medien in dem in Beispiel 8 beschriebenen Schwann-Zellen-Proliferations-Test eine biologische Aktivität. Auf diese Weise kann jedes beliebige Mitglied der Familie von komplementären Spleißvarianten-DNAs, die vom GGF-Gen stammen (umfassend die Hereguline), durch den Fachmann exprimiert und in dem Schwann-Zellen-Proliferations-Test getestet werden.
Andererseits kann ein rekombinantes Material aus anderen Varianten gemäß Wen et al. (Cell 69: 559, 1992) isoliert werden, der die Spleißvariante Neu-Differenzierungsfaktor (NDF) in COS-7-Zellen exprimierte. cDNA-Clone, die in den eukaryontischen Plasmidvektor pJT-2 eingefügt sind, stehen unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors und sind 3'-flankiert durch die SV40-Terminations- und Polyadenylierungssignale. COS-7-Zellen wurden mit der pJT-2-Plasmid-DNA durch Elektroporation wie folgt transfiziert: 6 × 10⁶ Zellen (in 0,8 ml DMEM und 10 FEBS) wurden in eine 0,4-cm-Küvette überführt und mit 20 μg Plasmid-DNA in 10 μl TE-Lösung gemischt (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Die Elektroporation erfolgte bei Raumtemperatur bei 1600 V und 25 μF unter Verwendung einer Bio-Rad-Gene Pulser-Apparatur mit einer auf 200 Ohm eingestellten Puls-Kontrolleinheit. Danach wurden die Zellen in 20 ml DMEM, 10 % FBS verdünnt und in einen T75-Kolben (Falcon) überführt. Nach 14 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium durch DMEM, 1 % FBS, ersetzt und die Inkubation weitere 48 Stunden fortgesetzt. Das rekombinantes Protein enthaltende konditionierte Medium, das von den Zellen geerntet worden war, zeigte in einer Zelllinie, die den Rezeptor für dieses Protein exprimierte, eine biologische Aktivität. Diese Zelllinie (die gezüchtete menschliche Brustkrebs-Zelllinie AU 565) wurde mit dem rekombinanten Material behandelt. Die behandelten Zellen wiesen eine Veränderung der Morphologie auf, die für die Aktivierung des erbB2-Rezeptors charakteristisch ist. Ein konditioniertes Medium dieses Typs kann auch in dem Schwann-Zellen-Proliferations-Test getestet werden.
Beispiel 16
Analyse der N-terminalen Sequenz
Die hGGF2 codierende cDNA wurde in den amplifizierbaren Vektor pcdhfrpolyA cloniert und für eine stabile Expression in CHO-DG44-Zellen transfiziert. rhGGF2 wird in die konditionierten Medien ausgeschieden. Die Fähigkeit des rekombinanten GGF2, ausgeschieden zu werden, wird vermutlich durch den N-terminalen hydrophoben Bereich vermittelt (Signalsequenz). Eine Signalsequenz wird, nachdem sie das Ausschleusen einer wachsenden Proteinkette durch das raue endoplasmatische Retikulum hindurch initiiert hat, an einer spezifischen Stelle aus dem reifen Peptid abgespalten. Die N-terminale Sequenzanalyse des exprimierten und gereinigten rhGGF2 zeigt die Spaltstelle, wie nachstehend dargestellt. Die Sequenz der ersten 50 Aminosäurereste am N-Terminus des Proteins wurde durch N-terminale Sequenzanalyse bestätigt (Tabelle 5), vgl. nachstehend.
Tabelle 5 N-terminale Sequenzanalyse von rhGGF2

Die N-terminale Sequenzanalyse wurde anhand des Edman-Abbauprozesses durchgeführt.
*Cys-Reste werden durch den Edman-Abbauprozess zerstört und können nicht nachgewiesen werden.

Die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 185) stellt die Aminosäuresequenz von hGGF2 dar. Der schattierte Bereich zeigt die abgespaltene Signalsequenz.
Der schattierte Bereich stellt die experimentell bestimmten 15 Aminosäurereste am N-Terminus des rhGGF2 dar, wobei eine A₅₀-G₅₁-Bindung zu sehen ist, bei der es sich um die Spaltstelle für die Signalsequenz handelt.
Beispiel 17
Isolierung einer weiteren Spleißvariante
Durch Verfahren, mit denen andere Neureguline auf den neuesten Stand gebracht werden, die in der US-Patentanmeldung Seriennummer 07/965173, angemeldet am 23. Oktober 1992, hier durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben sind, wurden vier nah verwandte Sequenzen erzeugt (Heregulin-α, β1, β2, β3), die als Folge von Spleißvariationen zustande kommen. Peles et al. (Cell 69: 205, 1992) und Wen et al. (Cell 69: 559, 1992) haben eine weitere Spleißvariante (aus der Ratte) isoliert, wobei sie ein ähnliches Reinigungs- und Clonierungsverfahren wie dasjenige verwendeten, das in den Beispielen 1 bis 9 und 11 beschrieben ist, wobei ein Protein beteiligt ist, das an p185^erbB2 bindet. Der cDNA-Clon wurde wie folgt erhalten (über die Reinigung und Sequenzierung eines p185^erbB2-bindenden Proteins aus einer transformierten Ratten-Fibroblasten-Zelllinie). Ein p185^erbB2-bindendes Protein wurde aus einem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das vereinigte konditionierte Medium aus drei Ernten von 500 Rollerflaschen (insgesamt 120 Liter) wurde mittels Filtration durch 0,2-μ-Filter geklärt und sodann mit einem Pelicon-Ultrafiltrationssystem unter Verwendung von Membranen mit einem Molekulargewichts-Ausschluss von 20 kD 31-fach eingeengt. Alle Reinigungsschritte wurden unter Verwendung eines schnellen Protein-Flüssigchromatographiesystems von Pharmacia durchgeführt. Das eingeengte Material wurde direkt auf eine Säule mit Heparin-Sepharose aufgetragen (150 ml, voräquilibriert mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)). Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,2 M NaCl, so lange gewaschen, bis bei einer Wellenlänge von 280 nm keine Absorption mehr nachgewiesen werden konnte. Danach wurden die gebundenen Proteine mit einem kontinuierlichen Gradienten (250 ml) von NaCl (von 0,2 M bis 1,0 M) eluiert, wobei Fraktionen zu 5 ml gesammelt wurden. Proben (0,01 ml der gesammelten Fraktionen) wurden für den quantitativen Test der Kinase-stimularotischen Aktivität eingesetzt. Aktive Fraktionen aus drei Säulenläufen (Gesamtvolumen = 360 ml) wurden vereinigt, unter Verwendung einer YM10-Ultrafiltrationsmembran (Amicon, Danvers, MA) auf 25 ml eingeengt und mit Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine Konzentration von 1,7 M erreicht wurde. Nach dem Aufklären durch Zentrifugation (10 000 × g, 15 Min.) wurde das vereinigte Material auf eine Phenyl-Superose-Säule (HR10/10, Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem 45-ml-Gradienten von (NH₄)₂SO₄ (von 1,7 M bis kein Salz) in 0,1 M Na₂PO₄ (pH 7,4) entwickelt, wobei Fraktionen zu 2 ml gesammelt und auf Kinase-Stimulation getestet wurden (0,002 ml pro Probe) (wie in Beispiel 19 beschrieben). Der Haupt-Aktivitätspeak wurde vereinigt und gegen 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,3) dialysiert. Eine Mono-S-Kationenaustauscher-Säule (HR5/5, Pharmacia) wurde mit 50 mM Natriumphosphat voräquilibriert. Nach Auftragen des aktiven Materials (0,884 mg Protein; 35 ml) wurde die Säule mit dem Startpuffer gewaschen und dann mit einer Rate von 1 ml/min mit einem Gradienten von NaCl entwickelt. Die Kinase-stimulatorische Aktivität wurde bei 0,45 bis 0,55 M Salz gewonnen und war über vier Fraktionen von jeweils 2 ml verteilt. Diese wurden vereinigt und direkt auf eine Cu²⁺-chelatierende Säule aufgetragen (1,6 ml, HR2/5 chelatierende Superose, Pharmacia). Der größte Teil der Proteine wurde an das Harz adsorbiert, danach wurden sie jedoch nach und nach mit einem linearen Gradienten von Ammoniumchlorid (0 bis 1 M) von 30 ml eluiert. Die Aktivität wurde in einem einzelnen Proteinpeak im Bereich von 0,05 bis 0,2 M NH₄Cl eluiert. Proben aus den verschiedenen Reinigungsschritten wurden durch Gelelektrophorese analysiert, worauf eine Silberfärbung unter Verwendung eines Kits von ICN (Costa Mesa, CA) folgte, und der Proteingehalt der Proben wurde mit einem Coomassie-Blau-Farbstoff-Bindungstest unter Verwendung eines Kits von Bio-Rad (Richmond, CA) bestimmt.
Das Protein p44 (10 μg) wurde in 200 μl 0,1 M Ammoniumbicarbonat-Puffer (pH 7,8) rekonstituiert. Die Spaltung erfolgte mit L-1-Tosylamid-2-phenylethylchlormethylketon-behandeltem Trypsin (Serva) 18 Stunden bei 37°C bei einem Verhältnis von Enzym zu Substrat von 1:10. Das resultierende Peptidgemisch wurde durch Umkehrphasen-HPLC abgetrennt und bei 215 nm unter Verwendung einer Vydac C4-Mikrosäule (2,1 mm i. D. × 15 cm, 300 Å) und eines HP 1090-Flüssigchromatographiesystems überwacht, das mit einem Diodenarray-Nachweisgerät und einer Arbeitsstation ausgestattet war. Die Säule wurde mit 0,1 % Trifluoressigsäure (mobile Phase A) äquilibriert und die Elution mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 55 % mobile Phase B (90 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure) in 70 Minuten durchgeführt. Die Fließrate betrug 0,2 ml/min, und die Säulentemperatur wurde auf 25°C eingestellt. Ein-Drittel-Aliquots der Peptidpeaks, die per Hand aus dem HPLC-System gewonnen wurden, wurden durch Nterminale Sequenzanalyse mittels Edman-Abbau charakterisiert. Die nach 27,7 min eluierte Fraktion (T27.7) enthielt gemischte Aminosäuresequenzen und wurde anschließend nach der Reduktion wie folgt erneut chromatographiert: ein 70-%-Aliquot der Peptidfraktion wurde im Vakuum getrocknet und in 100 μl 0,2 M Ammoniumbicarbonat-Puffer (pH 7,8) rekonstituiert. DTT (Endkonzentration 2 mM) wurde zu der Lösung zugegeben, die sodann 30 min bei 37°C inkubiert wurde. Danach wurde das reduzierte Peptidgemisch durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac-Säule (2,1 mm i. D. × 15 cm) aufgetrennt. Die Elutionsbedingungen und die Fließrate waren genauso, wie vorstehend beschrieben. Die Aminosäure-Sequenzanalyse des Peptids wurde mit einem Proteinsequenziergerät Modell 477 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) durchgeführt, der mit einem Online-Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäureanalysator und einem System zur Analyse von Daten Modell 900 ausgestattet war (Hunkapiller et al. (1986), in: Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Shively, Hrsg., (Clifton, New Jersey: Humana Press, S. 223–247). Das Protein wurde auf eine mit Trifluoressigsäure behandelte Glasfaser-Scheibe aufgetragen, die vorher einen Zyklus mit Polybrene und NaCl durchlaufen hatte. Die PTH-Aminosäureanalyse wurde mit einem Mikro-Flüssigchromatographiesystem (Modell 120) unter Verwendung von Zweispritzenpumpen und Umkehrphasen (C-18)-Säulen mit enger Bohrung (Applied Biosystems, 2,1 mm × 250 mm) durchgeführt. Die RNA wurde aus Rat1-EJ-Zellen durch Standardverfahren isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982), und Poly-(A)⁺ wurde unter Verwendung eines mRNA-Separator-Kits (Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA) selektiert. Die cDNA wurde mit einem Superscript-Kit synthetisiert (von BRL Life Technologies, Inc., Bethesda, MD). Die Säulen-fraktionierte doppelsträngige cDNA wurde in einen mit SalI und NotI gespaltenen Plasmidvektor pJT-2, ein Derivat des Vektors pCD-X (Okayama und Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280, 1983), ligiert und in E. coli DH10B-Zellen durch Elektroporation transformiert (Dower et al., Nucl. Acids Res. 16: 6127, 1988). Etwa 5 × 10⁵ primäre Transformanten wurden mit zwei Oligonucleotid-Sonden durchgemustert, die von den Proteinsequenzen des N-Terminus von NDF (Reste 5 bis 24) und des tryptischen Peptids T40.4 (Reste 7 bis 12) hergeleitet waren. Ihre entsprechenden Sequenzen waren wie folgt (N bedeutet alle vier Nucleotide):
Die synthetischen Oligonucleotide wurden mit γ-³²P-ATP anhand der T4-Polynucleotid-Kinase endmarkiert und zum Durchmustern von Replika-Sätzen von Nitrocellulosefiltern verwendet. Die Hybridisierungslösung enthielt 6 × SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 2 × Denhardt-Lösung, 50 μg/ml Lachssperma-DNA und 20 % Formamid (für Sonde 1) oder kein Formamid (für Sonde 2). Die Filter wurden entweder bei 50°C mit 0,5 × SSC, 0,2 % SDS, 2 mM EDTA (für Sonde 1) oder bei 37°C mit 2 × SSC, 0,2 % SDS, 2 mM EDTA (für Sonde 2) gewaschen. Die Autoradiographie der Filter ergab zehn Clone, die mit beiden Sonden hybridisierten. Diese Clone wurden durch erneutes Plattieren und durch Sondenhybridisierung, wie vorstehend beschrieben, gereinigt.
Die cDNA-Clone wurden unter Verwendung des automatischen DNA-Sequenziergeräts 373A von Applied Biosystems und von Sequenzierungs-Kits, Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kits, von Applied Biosystems nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. In einigen Fällen wurden Sequenzen unter Verwendung von ³⁵S-dATP (Amersham) und Sequenase^TM-Kits von U.S. Biochemicals nach den Anweisungen des Herstellers erhalten. Beide Stränge des cDNA-Clons 44 wurden unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide als Primer sequenziert. Die Sequenz der am weitesten 5' gelegenen 350 Nucleotide wurde in sieben unabhängigen cDNA-Clonen bestimmt. Der resultierende Clon zeigte das in 27 dargestellte Muster (NDF).
Beispiel 19
Reinigung und Test von anderen Proteinen, die an den p185^erbB2-Rezeptor binden
I. Reinigung von gp30 und p70
Lupu et al. (Science 249, 1552, 1990) und Lippman und Lupu (Patentanmeldung Nr. PCT/US91/03443, 1990), hier durch Bezugnahme eingeschlossen, haben ein Protein aus konditionierten Medien einer menschlichen Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB-231 gereinigt.
Lupu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 2287, 1992) reinigten ein anderes Protein, das an den p185^erbB2-Rezeptor bindet. Dieses bestimmte Protein, p75, wurde aus einem konditionierten Medium gereinigt, das für das Wachstum von SKBr-3 (einer menschlichen Brustkrebs-Zelllinie) verwendet wurde, die in verbessertem Eagle-Medium (IMEM: GIBCO), angereichert mit 10 % fetalem Rinderserum (GIBCO), vermehrt wurde.
II. Andere p185^erbB2-Liganden
Peles et al. (Cell 69: 205, 1992) haben auch einen p185^erbB2-stimulierenden Liganden aus Rattenzellen gereinigt. Holmes et al. (Science 256: 1205, 1992) haben Heregulin-α aus menschlichen Zellen gereinigt, das an p185^erbB2 bindet und dieses stimuliert (vgl. Beispiel 5). Tarakovsky et al., Oncogene 6: 218, 1991) haben die Bindung eines 25-kD-Polypeptids, das aus aktivierten Makrophagen isoliert wurde, an den Neu-Rezeptor, ein p185^erbB2-Homologon, gezeigt, hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
III. NDF-Isolierung
Yarden und Peles (Biochemistry 30, 3543, 1991) haben ein 35-Kilodalton-Glycoprotein identifiziert, das den p185^erbB2-Rezeptor stimuliert.
In anderen Veröffentlichungen haben Davis et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 1536, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8582, 1991; und Greene et al., PCT-Patentanmeldung PCT/US91/02331 (1990)) die Reinigung eines Proteins aus dem konditionierten Medium einer Zelllinie menschlicher T-Zellen (ATL-2) beschrieben.
Huang et al. (J. Biol. Chem. 257: 11508–11512, 1992), hier durch Bezugnahme eingeschlossen, haben einen weiteren neu/erb-B2-Liganden-Wachstumsfaktor aus der Rinderniere isoliert. Der 25-kD-Polypeptidfaktor wurde isoliert durch ein Verfahren mit Säulenfraktionierung, anschließend aufeinander folgende Säulenchromatographie auf DEAE/Cellulose (DE52), Sulfadex (sulfatierte Sephadex G-50), Heparin-Sepharose 4B und Superdex 75 (schnelle Protein-Flüssigchromatographie). Der Faktor, NEL-GF, stimuliert eine Tyrosin-spezifische Autophosphorylierung des neu/erb-B2-Gen-Produkts.
IV. Reinigung einer Acetylcholin-Rezeptor-induzierenden Aktivität (ARIA)
ARIA, ein 42 kD Protein, das die Synthese des Acetylcholin-Rezeptors stimuliert, wurde im Labor von Gerald Fischbach isoliert (Falls et al., Cell 72: 801–815, 1993). ARIA induziert die Tyrosin-Phosphorylierung eines 185-kD-Muskel-Transmembran-Proteins, das dem p185^erbB2-Rezeptor ähnlich ist und die Synthese des Acetylcholin-Rezeptors in gezüchteten embryonalen Myotubuli stimuliert. ARIA ist mit sehr großer Wahrscheinlichkeit ein Mitglied der GGF/erbB2-Ligandengruppe von Proteinen und kann deshalb möglicherweise für die Stimulation der Gliazellen-Mitogenese und für andere Anwendungen von z.B. GGF2, wie hier beschrieben, eingesetzt werden.
Beispiel 19
Protein-Tyrosin-Phosphorylierung, vermittelt durch GGF
Ratten-Schwann-Zellen zeigen nach einer Behandlung mit ausreichenden Spiegeln des Glia-Wachstumsfaktors zur Induktion der Proliferation eine Stimulation der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung. Verschiedene Mengen eines teilweise gereinigten GGF wurden zu einer primären Kultur von Ratten-Schwann-Zellen gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren zugegeben. Die Schwann-Zellen wurden in DMEM/10 % fetalem Kälberserum/5 μM Forskolin/0,5 μg pro ml GGF-CM (0,5 ml pro Vertiefung) in mit Poly-D-Lysin beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet. Wenn die Zellen konfluent waren, wurden sie mit DMEM/10 fetalem Kälberserum mit 0,5 ml pro Vertiefung versetzt und über Nacht im Inkubator zum Ruhen belassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 0,2 ml DMEM/10 % fetalem Kälberserum gefüttert und eine Stunde im Inkubator belassen. Danach wurden Testproben direkt zum Medium in verschiedenen Konzentrationen und für unterschiedliche Zeitspannen wie erforderlich zugegeben. Anschließend wurden die Zellen in kochendem Lysepuffer (Natriumphosphat, 5 mM, pH 6,8; SDS, 2 %; β-Mercaptoethanol, 5 %; Dithiothreit, 0,1 M; Glycerin, 10 %; Bromphenol-Blau, 0,4 %; Natriumvanadat, 10 mM) lysiert, in einem kochenden Wasserbad zehn Minuten inkubiert und danach entweder direkt analysiert oder bei –70°C eingefroren. Die Proben wurden analysiert, indem sie auf 7,5 % SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen und danach auf Nitrocellulose mittels Elektroblot-Verfahren übertragen wurden, wobei Standardverfahren, wie von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–4354, 1979, beschrieben, verwendet wurden. Die mittels Elektroblot-Verfahren behandelte Nitrocellulose wurde mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern anhand von Standardverfahren getestet, die in Kamps und Selton, Oncogene 2: 305–315, 1988, beschrieben sind. Die getesteten Blots wurden auf einem Autoradiographie-Film über Nacht exponiert und mit einem herkömmlichen Labor-Entwickler entwickelt. Densitometrische Messungen wurden anhand eines verbesserten Laser-Densitometers Ultrascan XL (LKB) durchgeführt. Die Molekulargewichte wurden mit Bezug auf vorher gefärbte Standards mit hohem Molekulargewicht (Sigma) bestimmt. Die Dosis-Antworten der Protein-Phosphorylierung und der Schwann-Zellen-Proliferation sind sehr ähnlich (33). Das Molekulargewicht der phosphorylierten Bande liegt sehr nah bei dem Molekulargewicht von p185^erbB2. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Schwann-Zellen mit konditionierten Medien behandelt wurden, die aus COS-Zellen, translatiert mit dem GGF2HBS5-Clon, hergestellt wurden. Diese Ergebnisse stimmen gut mit der erwarteten Wechselwirkung der GGFs mit dem p185^erbB2 und der Aktivierung davon überein.
Dieses Experiment wurde mit einem rekombinanten GGF2 wiederholt. Das konditionierte Medium, das von einer CHO-Zelllinie stammte, die mit dem GGF2-Clon (GGF2HBS5) stabil transformiert war, stimuliert unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tests die Protein-Tyrosin-Phosphorylierung. Zum Schein transfizierte CHO-Zellen bewirken keine Stimulation dieser Aktivität.
Beispiel 20
N-Glycosylierung von GGF
Die Proteinsequenz, die aus der cDNA-Sequenz der als Kandidaten in Frage kommenden GGF-II-Clone GGF2BPP1, 2 und 3 vorausgesagt wurde, enthält mehrere Consensus-N-Glycosylierungsmotive. Eine Lücke in der GGFII-02-Peptidsequenz entspricht dem Asparaginrest in einem dieser Motive, dies zeigt, dass an dieser Stelle möglicherweise ein Kohlenhydrat gebunden ist.
Die N-Glycosylierung der GGFs wurde untersucht, indem die Mobilitätsänderungen auf einer SDS-PAGE nach der Inkubation mit N-Glycanase festgestellt wurden, einem Enzym, das die kovalenten Bindungen zwischen einem Kohlenhydrat und Asparaginresten in Proteinen spaltet.
Eine N-Glycanase-Behandlung von GGF-II ergab eine Hauptbande bei MG 40 bis 42 kD und eine schwächere Bande bei 45 bis 48 kD. Aktivität: Einzelne aktive deglycosylierte Vertreter fanden sich bei ca. 45 bis 50 kD.
Außerdem zeigen Aktivitäts-Elutionsexperimente mit GGF-I eine Zunahme der Elektrophorese-Mobilität, wenn er mit N-Glycanase behandelt wurde, wodurch ein aktiver Vertreter mit MG 26 bis 28 kD erhalten wird. Die Silberfärbung bestätigte, dass eine Mobilitätsverschiebung vorliegt, obwohl aufgrund der Hintergrundfärbung in der verwendeten Probe keine N-deglycosylierte Bande zugewiesen werden konnte.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung oder Fehlfunktion der Muskulatur durch Erhöhen von Mitogenese, Wachstum, Differenzierung oder Überleben einer Muskelzelle, wobei das genannte Polypeptid oder die genannte Verbindung Rezeptoren bindet oder zweite Messenger-Systeme der genannten Muskelzelle aktiviert und wobei das genannte Polypeptid oder die genannte Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die E-Sequenz, die durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr: 133 oder 159 codiert ist; b) einem Polypeptid, umfassend die F-Sequenz, die durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 132 codiert wird; c) einem Polypeptid, das durch die Formel YBAZCX definiert wird, wobei YBAZCX aus den in 30 gezeigten Polypeptidsegmenten besteht (SEQ ID Nrn. 132–143, 156, 157, 159); wobei Y das Polypeptidsegment E umfasst oder fehlt; wobei Z das Polypeptidsegment G umfasst oder fehlt; und wobei X die Polypeptidsegmente C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL oder C/D C/D' D' HKL umfasst; d) einem Polypeptid, das durch die Formel WBAZCX definiert wird, wobei WBAZCX aus den in 30 gezeigten Polypeptidsegmenten besteht (SEQ IN Nrn. 132–143, 156, 157, 159); wobei W das Polypeptidsegment F umfasst oder fehlt; wobei Z das Polypeptidsegment G umfasst oder fehlt; und wobei X die Polypeptidsegmente C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL oder C/D C/D' D' HKL umfasst; e) einem Polypeptidsegment, das spezifisch den p185^erbB2 Rezeptor von Muskelzellen bindet und zwiete Messenger-Systeme der genannten Muskelzellen aktiviert; f) einem Polypeptid, umfassend eine epidermale Wachstumsfaktor-ähnliche (EGF-ähnliche) Domäne, wobei die genannte epidermale Wachstumsfaktordomäne eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die Nukleinsäuresequenz codiert wird, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: i) SEQ ID Nr: 150 (EGFL1); ii) SEQ ID Nr: 151 (EGFL2); iii) SEQ ID Nr: 152 (EGFL3); iv) SEQ ID Nr: 153 (EGFL4); v) SEQ ID Nr: 154 (EGFL5); und vi) SEQ ID Nr: 155 (EGFL6); g) einem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i) einem 35 kD Polypeptidfaktor, der von der transformierten I-EJ-Ratten-Fibroblast-Zelllinie isoliert wurde; ii) einem 75 kD Polypeptidfaktor, der von der humanen SKBR-3 Brustzelllinie isoliert wurde; iii) einem 44kD Polypeptidfaktor, der von der transformierten I-EJ-Ratten-Fibroblast-Zelllinie isoliert wurde; iv) einem 45 kD Polypeptidfaktor, der von der humanen MDA - MB 231 Brustzelllinie isoliert wurde v) einem 7 bis 14 kD Polypeptidfaktor, der von der humanen ATL-2 T-Zelllinie isoloiert wurde; vi) einem 25 kD Polypeptidfaktor, der von aktivierten peritonealen Mausmakrophagen isoliert wurde; vii) einem 25 kD Polypeptidfaktor, der von Rinderniere isoliert wurde; viii) ARIA-Polypeptid; und ix) einem 46 bis 47 kD Polypeptidfaktor, der 0–2A Progenitor-Gliazellen stimuliert; und h) einem Polypeptid, das GGFIII umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid die E-Sequenz umfasst, die durch die Nukleinsäuresequnz gemäß SEQ ID Nr: 133 oder 159 codiert wird.
Verwendung nach 1, wobei das genannte Polypeptid die F-Seqenz umfasst, die durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr: 132 codiert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das ganannte Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das die Formel XBAZCX definiert wird, wobei YBAZCX aus den in 30 gezeigten Polypeptidsegmenten besteht (SEQ ID Nrn. 132–143, 156, 157, 159); wobei Y das Polpeptidsegment E umfasst oder fehlt; wobei Z das Polypeptidsegment G umfasst oder fehlt; und wobei X die Polypeptidsegmente C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL oder C/D C/D' D' HKL umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das durch die Formel WBAZCX definiert wird, wobei WBAZCX aus den in 30 gezeigten Polypeptidsegmenten besteht (SEQ ID Nrn. 132–143, 156, 157, 159); wobei W das Polypeptidsegment F umfasst oder fehlt; wobei Z Polypeptidsegment G umfasst oder fehlt und wobei X die Polypeptidsegmente C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL oder C/D C/D' D' HKL umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das spezifisch den p185^erbB2 Rezeptor von Muskelzellen bindet und zweite Messenger-Systeme von Muskelzellen aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid eine epidermale Wachstumsfaktor-ähnliche (EGF-ähnliche) Domäne umfasst, wobei die genannte epidermale Wachastumsfaktordomäne eine Aminosäureseqenz umfasst, die durch die Nukleinsäuresequenz codiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) SEQ ID Nr: 150 (EGFL1); ii) SEQ ID Nr: 151 (EGFL2); iii) SEQ ID Nr: 152 (EGFL3); iv) SEQ ID Nr: 153 (EGFL4); v) SEQ ID Nr: 154 (EGFL5); und vi) SEQ ID Nr: 155 (EGFL6);
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem 35 kD Polypeptidfaktor, der von der transformierten I-EJ-Fibroblast-Zelllinie isoliert wurde; ii) einem 75 kD Polypeptidfaktor, der von der humanen SKBR-3 Brustzelllinie isoliert wurde; iii) einem 44 kD Polypeptidfaktor, der von der transformierten I-EJ-Ratten-Fibroblast-Zelllinie isoliert wurde; iv) einem 45 kD Polypeptidfaktor, der von der humanen MDA - MB 231 Brustzelllinie isoliert wurde; v) einem 7 bis 14 kD Polypeptidfaktor, der von der humanen ATL-2 T-Zelllinie isoliert wurde; vi) einem 25 kD Polypeptidfaktor, der von aktivierten peritonealen Mausmakrophagen isoliert wurde; vii) einem 25 kD Polypeptidfaktor, der von Rinderniere isoliert wurde; viii) ARIA-Polypeptid; und ix) einem 46 bis 47 kD Polypeptidfaktor, der 0–2A Progenitor-Gliazellen stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid GGFIII umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das gennate Polypeptid die E-Seqenz umfasst, die SEQ ID Nr: 185 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte, die E-Sequenz umfassende Polypeptid auch wenigstens einen Teil des Peptids umfasst, das durch die DNA-Sequenzen 5' und 3' zur E-codierenden Sequenz auf Klon pGGF2HBS5 wird, hinterlegt bei der A.T.C.C. am 6. November 1992 (A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer 75347).
Verwendung des genannten Polypeptds, umfassend die E-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei 50 N-terminale Aminosäuren von dem genannten Peptid abgespalten werden, das die genannte E-Sequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte, die F-Sequenz umfassende Polypeptid die Polypeptidsegmente FBA mit den in 30 gezeigten Aminosäureseqenzen (SEQ ID Nrn. 132, 134, 135), die Polypeptidsegmente FBA' mit den in 30 gezeigten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nrn. 132, 134, 136), die Polypeptidsegmente FEBA mit den in 30 gezeigten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nrn. 132, 135, 159) oder die Polypeptidsegmente FEBA' mit den Aminosäuresequenzen umfasst, die den in 30 gezeigten Polypeptidsegmenten entsprechen (SEQ ID Nrn. 132–134, 136, 159).
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das genante Polypeptid rekombinantes humanes GGF2 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 7 bis 14, wobei das genannte Polypeptid durch eine DNA-Sequenz in einem exprimierbaren genetischen Konstrukt codiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Behandlung oder Prophylaxe die eines pathophysiologischen Zustands der Muskulatur in einem Säugetier ist, in dem der genannte Zustand einen Muskelzellentyp involviert, der für das genannte Polypeptid sensitiv oder responsiv ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Behandlung oder Prophylaxe die eines Zustands ist, der Muskelschäden in einem Säugetier involviert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Behandlung oder Prophylaxe die Minderung von Atrophie der genannten Muskelzellen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Behandlung oder Prophylaxe die Erhöhung der Zahl der in dem genannten Säugetier vorhandenen Muskelfasern ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Behandlung oder Prophylaxe die Steigerung der Muskelregeneration in dem genannten Säugetier ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genante Polypeptid, das spezifisch den p185^erbB2Rezeptor von Muskelzellen bindet und zweite Messenger-Systeme der genannten Muskelzellen aktiviert, ein gliärer Wachstumsfaktor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Muskelzelle ein Myoblast, eine Satellitenzelle, eine Muskelzelle im Skelettmuskel, eine Muskelzelle in Herzmuskel oder eine Muskelzelle in einem glatten Muskel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Erkrankung oder Fehlfunktion eine Skelettmuskelerkrankung oder -fehlfunktion ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die genannte Skelettmuskelerkrankung oder -fehlfunktion eine Myopathie oder eine Dystrophie ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das genante Dystrophie eine Duchennes-Muskeldystrophie oder eine Becker-Dystrophie ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Erkrankung oder Fehlfunktion eine Herzmuskelfehlfunktion ist.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei das genante Herzmuskelfehlfunktion Kardiomyopathie, ein Ischamieschaden, eine kongenitale Muskelerkrankung oder ein Herztrauma ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die genannte Erkrankung oder Fehlfunktion eine Glattmuskelfehlfunktion ist.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei das genante Glattmuskelfehlfunktion arterielle Sklerose, eine Gefäßverletzung oder eine kongenitale Gefäßerkrankung oder -fehlfunktion ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die gennante Muskelzelle unzureichende funktionelle Acetylcholinrezeptoren hat und eine Muskelzelle in einem Patienten mit Myasthenia gravis oder in einem Patienten mit einem Zustand ist, der Muskelschäden involviert.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die Behandlung oder Prophylaxe bei einem Menschen ist.