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Diese
Erfindung wurde mit Unterstützung
der Regierung unter NIH SPORE Grant P50 CA 58236-01, zuerkannt von
den National Institutes of Health, DK-19300, National Institute
of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, und CA
15416, National Cancer Institute, hervorgebracht.
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Hintergrund der Erfindung
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1. Fachgebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft im Allgemeinen ein Verfahren zum Nachweis von
Zellproliferationsstörungen unter
Verwendung eines Antikörpers,
der spezifisch an bestimmte Kernmatrix-Proteine mit definierten
Gewebe-Expressionsmustern in normalen Zellen und in Zellen, die
mit Zellproliferationsstörungen
assoziiert sind, bindet.
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2. Beschreibung des verwandten
Fachgebiets
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Fortschritte
in der rekombinanten DNA-Technologie führten zur Entdeckung von normalen
zellulären Genen
(Proto-Onkogene und Tumor-Suppressorgene), die das Wachstum, die
Entwicklung und die Differenzierung kontrollieren. Unter bestimmten
Bedingungen wird die Regulation dieser Gene verändert und normale Zellen nehmen
ein neoplastisches Wachstumsverhalten an. In einigen Fällen kann
der normale zelluläre
Phänotyp
durch verschiedene Manipulationen, die mit diesen Genen assoziiert
sind, wiederhergestellt werden. Es existieren zur Zeit über 40 bekannte
Proto-Onkogene und Suppressorgene, die in Abhängigkeit von ihren funktionalen
Kennzeichen in verschiedene Kategorien unterteilt werden. Diese
schließen
1) Wachstumsfaktoren und Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, 2) Botenstoffe
der intrazellulären
Signaltransduktionswege wie zum Beispiel zwischen dem Cytoplasma
und dem Nucleus und 3) regulatorische Proteine, welche die Genexpression
und die DNA-Replikation beeinflussen und die sowohl innerhalb als
auch außerhalb
des Nucleus lokalisiert sind, ein.
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Während ihrer
Lebensspanne starten normale Zellen in einem unreifen Zustand mit
proliferativen Potential, durchlaufen sequentielle Stadien der Differenzierung
und enden schließlich
im Zelltod. Auf der anderen Seite ist Krebs ein aus vielen Stufen
bestehender Verlauf, der anhand der Stadien seiner Bösartigkeit
definiert werden kann, wobei die normale geordnete Progression anormal
ist, wahrscheinlich aufgrund von Veränderungen in Onkogenen, Tumor-Suppressorgenen und
anderen Genen. Die Erforschung von Onkogenen und ihrer Produkte
führte
zu einem grundlegenderen Verständnis
der Mechanismen der Ursachen und Erhaltung von Krebs und erlaubten
rationalere Mittel zur Diagnose und zur Behandlung von bösartigen
Erkrankungen.
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Gene,
die mit der Kontrolle des normalen Wachstums und der normalen Differenzierung
von Zellen assoziiert sind, schließen Gene ein, die regulatorische
Proteine codieren, welche die Genexpression und die DNA-Replikation
beeinflussen. Die Genprodukte von vielen dieser Gene sind im Nucleus
lokalisiert und viele sind DNA bindende Proteine. Der Nucleus einer
tierischen Zelle enthält
zelluläre
DNA, die einen Komplex mit Proteinen bildet, der als Chromatin bezeichnet
wird. Das Chromatin ist durch das interne Skelett des Nucleus, das
Kernmatrix genannt wird, organisiert. Kernmatrix-Proteine (NMP),
die mit DNA assoziiert sind, können
regulatorische Proteine für
Wachstum/Differenzierung sein, die eine Rolle in der Regulierung
der Genexpression in einer Zelle spielen. Man kann sich vorstellen,
dass in Zellen, welche die Mechanismen verloren haben, die ihr Wachstum
regulieren, ein Nucleus spezifisches Protein kontinuierlich eine
transkriptionelle Promotorregion eines Gens aktivieren kann, was
zu einer Überexpression
dieses Gens führt.
Auf ähnliche
Weise kann ein nucleäres
Protein, das als ein Suppressor arbeitet, um die Expression von
verschiedenen Proto-Onkogenen zu kontrollieren oder zu unterdrücken, unterexprimiert
oder als eine mutierte Form exprimiert werden, wodurch eine anormale
Expression eines Gens ermöglicht
wird, das ansonsten unterdrückt
werden würde.
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Übliche Krebstests
sind im Allgemeinen nicht spezifisch, intensiv und daraus folgend
nur von begrenzter klinischer Anwendung. Ein biochemischer Test,
der im hohen Maße
sowohl für
die Diagnostik als auch für die Überwachung
von Krebs verwendet wird, misst zum Beispiel die Mengen des carcinoembryonalen
Antigens (CEA). CEA ist ein onkofötales Antigen, das in großen Mengen
im embryonalem Gewebe, aber nur in geringen Mengen in normalen erwachsenen
Geweben detektiert werden kann. Das Serum von Patienten mit bestimmten
gastrointestinalen Krebsarten enthält erhöhte Mengen an CEA, die durch
immunologische Verfahren bestimmt werden können. Die Menge an CEA im Serum
korreliert mit einer Remission oder mit einem Rezidiv dieser Tumore,
wobei die Mengen nach der chirurgischen Entfernung des Tumors abrupt
sinken. Die Rückkehr
von erhöhten
Mengen an CEA bedeutet eine Rückkehr
der bösartigen
Zellen. CEA ist jedoch auch ein normales Glycoprotein, das in niedrigen
Mengen in fast allen erwachsenen Zellen gefunden wird. Des weiteren
kann dieses Protein unter verschiedenen, nicht bösartigen Bedingungen erhöht sein
und es ist in der Gegenwart von vielen Krebsarten nicht erhöht. Daher
ist es weit davon entfernt, ein idealer Marker für Krebs zu sein.
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Ein ähnlicher
onkofötaler
Tumormarker ist das alpha-Fetoprotein, eine embryonale Form von
Albumin. Auch dieses Antigen wird in hohen Mengen im embryonalen
Gewebe und in niedrigen Mengen in normalen erwachsenen Geweben detektiert.
Es ist bei einer Anzahl von bösartigen
gastrointestinalen Erkrankungen einschließlich des Lebertumors erhöht. Ähnlich wie
bei CEA korreliert eine Abnahme mit der Remission des Krebses und
eine erneute Erhöhung
mit einem Rezidiv. Die Sensitivität und die Spezifität sind nicht
ausreichend, um diesen Marker für
das Absuchen nach bösartigen
Veränderungen
oder für
das Überwachen
einer zuvor diagnostizierten Krebsart außer für einige wenige ausgewählte Fälle zu verwenden.
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Getzenberg
et al., Cancer Research 51, 6514-6520 (1991), beschreiben Muster
von Kernmatrix-Proteinen (NMP) in Ratten. Es werden NMPs beschrieben,
die spezifisch verschiedene Lappen der Prostata der Ratten identifizieren.
Des weiteren offenbaren Anderson et al., The Prostate 6, 315-323
(1985), 2-dimensionale Gele mit einem normalen, einem gutartigen
hypertrophen und einem adenokarzinogenen, menschlichen Prostatagewebe
und die Verwendung von Mustern in der Proteinexpression für die Diagnose
von menschlichem Prostatakrebs.
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In
Hinsicht auf das vorstehend Beschriebene bleibt ein Bedarf für neue Krebsmarker
bestehen, die eine effizientere Diagnose, Prognose und Behandlungssysteme
ermöglichen
würden.
Die Identifizierung von NMPs, die mit der Regulierung der Genexpression
oder der zellulären
Struktur in normalen Zellen und in Krebszellen assoziiert sind,
würden
ideale Marker zur Identifizierung des Stadiums der Bösartigkeit
einer Zelle zur Verfügung
stellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von neuen Kernmatrix-Proteinen (NMP),
die definierte Muster der Gewebe-Expression in verschiedenen Stadien
des abnormalen Wachstums und der Bösartigkeit einer Zelle besitzen.
Die NMPs der Erfindung werden durch ein Gewebe-Expressionsmuster
definiert, das für
jedes der Proteine NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6, NPB-7,
NP-1, NP-2, NP-3,
BPC-1, BPC-2, BPC-3 und PC-1 charakteristisch ist. Diese Proteine
wurden ursprünglich
dadurch identifiziert, dass sie mit normalem Prostatagewebe (NP),
sowohl mit normalem als auch mit gutartigem hyperplastischem Prostatagewebe
(NBP), mit gutartigen Hyperplasie- und kanzerösem Prostatagewebe (BPC) oder
mit Prostatakrebsgewebe (PC) assoziiert sind.
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Die
identifizierten NMPs stellen die Basis für ein Verfahren zum Nachweis
einer Zellproliferationsstörung
in einem Individuum zur Verfügung,
das das Inkontaktbringen einer zellulären Komponente mit einem Antikörper, der
spezifisch an das NMP bindet, umfasst. Das Verfahren ist besonders
zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung in einem Gewebe des Urogenitalsystems
und im Speziellem in der Prostata nützlich.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt die Zusammensetzung der Kernmatrix-Proteine
einer normalen menschlichen Prostata (A), einer gutartigen Prostata-Hyperplasie
(B) und eines Prostatakrebses (C). Großer Pfeil Bild A, veränderliche
Gruppe von Proteinen, die in verschiedenen Gewebetypen nicht gleichbleibend
vorhanden waren. Kleine Pfeile, Proteine, die gleichbleibend in
allen Geweben verändert
waren und die durch das Molekulargewicht und den isoelektrischen
Punkt in Tabelle 1 identifiziert wurden. Abkürzungen: LA – Lamin
A, LB – Lamin
B, LC – Lamin
C, A – Aktin,
NP – normale
Prostata, NPB – normale
Prostata und BPH, BPC – BPH
und Prostatakrebs, PC – Prostatakrebs,
kD – Molekulargewicht
in Tausend, SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und pI – isoelektrischer
Punkt.
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2 zeigt
spezifische Kernmatrix-Proteine in BPH und Prostatakrebs. Schematische
Darstellung der wichtigsten gewebespezifischen Kernmatrix-Proteine
von einer normalen Prostata, von BPH und von Prostatakrebs. Abkürzungen:
kD – Molekulargewicht
in Tausend, SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und pI – isoelektrischer
Punkt und BPH – gutartige
Prostata-Hyperplasie.
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3 zeigt
zwei Modelle einer aus mehreren Stufen bestehenden Progression von
einer normalen Prostata (Normal) zu einer gutartigen Prostata-Hyperplasie (BPH)
oder zu Prostatakrebs (Krebs). Modell I sagt vorher, dass ähnliche
Ereignisse in beiden Wegen erfolgen. Modell II sagt vorher, dass
verschiedene Ereignisse stattfinden, wenn die Progression von normal
zu BPH fortschreitet, als wenn sie zum Krebs fortschreitet.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Beschreibung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer
Zellproliferationsstörung
zur Verfügung,
wobei ein Antikörper
verwendet wird, der spezifisch an Kernmatrix-Proteine (NMP) bindet,
wobei das Protein ein Gewebe-Expressionsmuster
besitzt, das für
ein Protein charakteristisch ist, das aus der Gruppe ausgewählt wurde,
die NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6, NPB-7, NP-1, NP-2, NP-3,
BPC-1, BPC-2, BPC-3 und PC-1 umfasst. Die identifizierten NMPs können im
Allgemeinen durch ihre Anwesenheit in einer Zelle während eines
spezifischen Stadiums einer Zellproliferationsstörung charakterisiert werden.
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Der
Ausdruck „Zellproliferationsstörung" bezeichnet sowohl
bösartige
als auch nicht bösartige
Zellpopulationen, die häufig
den Anschein erwecken, dass sie sich von dem umgebenen Gewebe sowohl
morphologisch als auch genotypisch unterscheiden. Eine bösartige
Veränderung
(das heißt
Krebs) ist ein aus mehreren Stufen bestehender Verlauf und die durch
die Erfindung identifizierten Proteine sind mit den drei großen Stufen des Übergangs
von einer normalen Zelle zu einer Krebszelle assoziiert. In großen Stufen
kann normales Gewebe (Stadium 1) anfangen, Zeichen einer Hyperplasie
(Stadium 2) zu zeigen oder es kann Zeichen einer Neoplasie (Stadium
3) zeigen. Die „Hyperplasie", wie sie hierin
verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die eine abnormale Vermehrung
oder eine abnormale Anordnung in einem Gewebe zeigen. Gutartige
Zellproliferationsstörungen
einschließlich
gutartiger Tumore sind in dem Ausdruck Hyperplasie eingeschlossen.
Die Proteine der Erfindung, die ein Gewebe-Expressionsmuster sowohl
im normalen Gewebe als auch im Gewebe einer gutartigen Hyperplasie
(NPB) (nicht bösartig)
zeigen, schließen
NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6 und NPB-7 ein. Der Ausdruck „Gewebe-Expressionsmuster" bezieht sich auf
die Synthese eines Genprodukts eines NMP-Gens in einer Menge, die
durch die Verfahren, die im Allgemeinen durch den Fachmann verwendet werden
(z.B. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese),
nachweisbar ist. Der Ausdruck „Neoplasie", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf ein abnormales neues Wachstum, das zu einem
Tumor führt.
Anders als bei der Hyperplasie besteht die neoplastische Proliferation
auch bei Abwesenheit des ursprünglichen
Stimulus weiter und ist als unkontrolliert und progressiv gekennzeichnet.
Bösartige
Neoplasien oder bösartige
Tumore unterscheiden sich von gutartigen Tumoren dahingehend, dass
die zuerst genannten einen höheren
Grad der Anaplasie zeigen und die Eigenschaften der Invasion und
der Metastasenbildung besitzen. Ein durch die Erfindung identifiziertes
Protein, PC-1, ist ein Beispiel eines Proteins, das ein Expressionsmuster
besitzt, das in bösartigen
Neoplasien gefunden wird. Die durch die Erfindung identifizierten
Proteine BPC-1, BPC-2 und BPC-3 sind Beispiele von Proteinen, die
sowohl in einem gutartigen hyperplastischen Gewebe oder in gutartigen
Tumoren als auch in neoplastischen Geweben oder Tumoren exprimiert
werden. Andererseits besitzen die Proteine NP-1, NP-2 und NP-3 Gewebe-Expressionsmuster
in normalem (nicht tumorösen),
in nicht hyperplastischem und in nicht neoplastischem Gewebe. Daher
schließt
die Anwesenheit dieser zuletzt aufgeführten Proteine im Wesentlichen
die Anwesenheit einer Zellproliferationsstörung aus.
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Zusammenfassend
sind BPC-1, BPC-2 und BPC-3 und PC-1 mit Tumorzellen assoziiert;
NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6 und NPB-7 sind mit normalen
und nicht bösartigen
hyperplastischen Zellen oder nicht bösartigen Tumorzellen assoziiert;
PC-1 ist mit bösartigen
Zellen assoziiert; und NP-1, NP-2 und NP-3 sind mit Nicht-Tumorzellen
assoziiert. Der Ausdruck „assoziiert
mit" bezieht sich
auf die Wechselbeziehung zwischen dem Expressionsmuster des Proteins
und des Stadiums der Progression zu Krebs.
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Verfahren,
die verwendet werden können,
um die durch die Erfindung identifizierten Proteine zu isolieren,
schließen
solche ein, die im Allgemeinen zur Trennung von Proteinsubstanzen
verwendet werden, einschließlich
zum Beispiel der Behandlung einer Probe, die NMP enthält, mit üblichen
Fällungsmitteln
für Proteine,
gefolgt von Fraktionierungstechniken wie z.B. die Ionen-Austausch-Chromatographie,
Affinitätschromatographie,
molekulare Siebchromatographie, Adsorptionschromatographie, Ultrafiltration
und verschiedene Kombinationen davon. Die NMPs können aus einer Zellsuspension
durch Verfahren gereinigt werden, die zum Beispiel im US-Patent
Nr. 4,885,236 und 4,882,268 beschrieben wurden. Andere Verfahren
zur Reinigung der durch die Erfindung identifizierte Polypeptide
werden dem Fachmann bekannt sein (vergl. zum Beispiel Current Protocols
in Immunology, Coligan et al., Hrsg., 1992).
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Die
NMP enthaltenen Fraktionen können
einer SDS-PAGE unter geeigneten Bedingungen unterzogen werden und
die Gelschnitte, welche die NMP-Aktivität enthalten oder die dem Molekulargewicht
des NMP des Interesses entsprechen, werden gewonnen. Die SDS-PAGE
wird gemäß dem Verfahren
von Laemmli et al. (Nature 227: 680, 1970) durchgeführt und
sie ist eine Technik, die dem Fachmann gut bekannt ist. Es sollte selbstverständlich sein,
dass Veränderungen
der Bedingungen, die innerhalb eines geeigneten Bereichs liegen,
innerhalb des Reinigungsverfahrens eingeschlossen sind.
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Die
NMP enthaltende Fraktion aus der SDS-PAGE wird einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen und zum
Beispiel mit Acetonitril eluiert. Das NMP, das erhalten wird, ist
im Wesentlichen so rein, dass die N-terminale Aminosäuresequenzierung
möglich
ist. Die Lösung
wird unter Vakuum getrocknet und in einem kleinen Volumen Acetonitril
95% + TFA (0,08%) wieder gelöst.
Die konzentrierte Probe wird anschließend in ein Sequenziergerät eingeführt, das
an ein Phenylthiohydantoin (PTH)-Analysegerät angeschlossen ist.
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Polyclonale
Antikörper
werden durch die Immunisierung eines Tiers, z.B. eines Kaninchens,
mit einer immunogenen Probe von NMP immunisiert, gefolgt von einer
Reinigung des Antikörpers
durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.
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Die
Antikörper,
die in der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden, sind
mit dem durch die Erfindung identifizierten NMP immunreaktiv. Die Antikörper, die
im Wesentlichen aus vereinigten monoclonalen Antikörpern mit
verschiedenen epitopischen Spezifitäten bestehen, sowie getrennte
monoclonale Antikörperherstellungen
werden zur Verfügung
gestellt. Monoclonale Antikörper
werden von Antigen enthaltenden Fragmenten des Proteins durch Verfahren
hergestellt, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (Köhler et
al., Nature 256 : 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel et al., Hrsg., 1989).
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Die
Antikörper
der Erfindung können
in der Immunaffinitätschromatographie
zur Isolation von Sequenzen verwendet werden, die ein NMP der vorliegenden
Erfindung enthalten. Eine Möglichkeit,
in der eine solche Immunaffinitätschromatographie
verwendet werden kann, ist durch die Bindung des Antikörpers der
Erfindung an CNBr-Sepharose-4B oder Tresyl aktivierte Sepharose
(Pharmacia). Diese Festphasen gebundenen Antikörper können anschließend dazu
verwendet werden, um spezifisch an Sequenzen zu binden, die NMP
von Gemischen von anderen Proteinen enthalten, um deren Isolation
und die Reinigung zu ermöglichen.
Gebundene NMP-Sequenzen können
vom Affinitätschromatographiematerial
eluiert werden, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann
bekannt sind, wie zum Beispiel chaotrope Wirkstoffe, niedriger pH-Wert oder
Harnstoff.
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Das
diagnostische Verfahren der Erfindung verwendet polyclonale und
monoclonale Antikörper,
die mit dem NMP-Polypeptid immunreaktiv sind. Wenn es erwünscht ist,
können
polyclonale Antikörper
weiter gereinigt werden, zum Beispiel durch die Bindung an und die
Elution von einer Matrix, an der das NMP-Polypeptid gebunden ist.
Der Fachmann wird verschiedene andere Techniken kennen, die auf
dem immunologischen Fachgebiet für
die Reinigung und/oder für
die Konzentration von polyclonalen Antikörpern sowie von monoclonalen
Antikörpern üblich sind.
Antikörper,
die im Wesentlichen aus vereinigten monoclonalen Antikörpern mit unterschiedlichen
epitopischen Spezifitäten
bestehen, sowie getrennte monoclonale Antikörperherstellungen werden zur
Verfügung
gestellt. Der Ausdruck Antikörper
oder Immunglobulin, wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt intakte
Moleküle
sowie Fragmente davon ein, wie z.B. Fab und F(ab')2, die funktionell
an einer epitopischen Determinante auf NMP binden können.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung und Isolation einer Antikörper bindenden
Domäne,
welche die Bindung an NMP zeigt, ist das Bakteriophage λ- Vektorsystem. Dieses
Vektorsystem wurde verwendet, um eine kombinatorische Bibliothek
von Fab-Fragmenten des Antikörperrepertoires
der Maus in Escherichia coli (Huse et al., Science 246: 1275-1281,
1989) und des menschlichen Antikörperrepertoires
(Mullinax, et al., Proc Natl Acad Sci 87: 8095 – 8099, 1990) zu exprimieren.
Wie darin beschrieben wurde, wurden Rezeptoren (Fab-Moleküle), die
eine Bindung an einem zuvor ausgewählten Liganden zeigten, von
diesen Antikörper
exprimierenden Bibliotheken identifiziert und isoliert. Dieses Verfahren
kann auch bei Hybridomzelllinien angewendet werden, die monoclonale
Antikörper
exprimieren, die an einem zuvor ausgewählten Liganden binden. Hybridome,
die einen gewünschten
monoclonalen Antikörper
sezernieren, können
auf verschiedene Wege hergestellt werden, wobei Techniken verwendet
werden, die dem Fachmann gut bekannt sind und die hierin nicht wiederholt
werden. Einzelheiten dieser Techniken sind in solchen Dokumenten
wie z.B. Monoclonal Antibodies-Hybridomas: A new Dimension in Biological
Analysis, herausgegeben von Roger H. Kennett et al., Plenum Press,
1980; und US-Patent Nr.: 4,172,124 beschrieben.
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Der
Ausdruck „Zellproliferationsstörung", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet bösartige
sowie nicht bösartige
(oder gutartige) Störungen.
Des weiteren umfasst dieser Ausdruck hyperplastische Störungen. Die
Zellen, die diese proliferativen Störungen umfassen, erscheinen
häufig
morphologisch und genotypisch unterschiedlich zu dem sie umgebenden
normalen Gewebe. Wie zuvor beschrieben wurde, können Zellproliferationsstörungen zum
Beispiel mit der Expression oder der Abwesenheit der Expression
der durch die Erfindung identifizierten NMPs assoziiert zu sein.
Die Expression von NMP zu einem ungeeigneten Zeitpunkt während des
Zellzyklus oder in einem falschen Zelltyp kann zu einer Zellproliferationsstörung führen.
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung, die
mit NMP assoziiert ist, in einem Individuum zur Verfügung, wobei
eine Zellkomponente, von der angenommen wird, dass sie NMP exprimiert
oder eine NMP assoziierte Störung
besitzt, mit einem Antikörper,
der spezifisch an die Komponente bindet, in Kontakt gebracht wird.
Die Zellkomponente ist ein Protein. Die Antikörper sind direkt oder indirekt nachweisbar
markiert, zum Beispiel mit einem Radioisotop, mit einer fluoreszierenden
Verbindung, mit einer biolumineszenten Verbindung, mit einer chemilumineszenten
Verbindung, mit einem Metallchelat oder mit einem Enzym. Der Fachmann
wird andere geeignete Markierungen zur Bindung an die Sonde kennen
oder er wird sie unter Verwendung von Routineuntersuchungen ermitteln
können.
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Für die Ziele
der Erfindung kann ein Antikörper,
der spezifisch für
NMP ist, verwendet werden, um die Anwesenheit eines NMP-Polypeptids
in biologischen Flüssigkeiten
oder Geweben nachzuweisen. Jede Probe, die eine nachweisbare Menge
des Antigens besitzt, kann verwendet werden. Eine bevorzugte Probe
dieser Erfindung, besonders für
den Nachweis von Prostatakrebs, ist Gewebe, das vom Urogenitalsystem
stammt, besonders das Gewebe der Prostata. In einer anderen Ausführungsform
können
biologische Flüssigkeiten,
die Zellen enthalten können,
die bezeichnend für
eine NMP assoziierte Zellproliferationsstörung sind, wie z.B. Ejakulat
oder Urin, verwendet werden. Vorzugsweise ist das Individuum ein
Mensch.
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Eine
weitere Technik, die ebenfalls zu einer größeren Sensitivität führen kann,
besteht aus der Bindung der Sonde an Haptene mit niedrigem Molekulargewicht.
Diese Haptene können
anschließend
mittels einer sekundären
Reaktion spezifisch nachgewiesen werden. Zum Beispiel ist es üblich, solche
Haptene wie Biotin, das mit Avidin reagiert, oder wie Dinitrophenol,
Pyridoxal und Fluorescein, die mit spezifische Antihapten-Antikörper reagieren
können,
zu verwenden.
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Das
Verfahren zum Nachweis einer Zelle, die ein bestimmtes NMP der Erfindung
exprimiert, oder einer Zellproliferationsstörung, die mit einem NMP assoziiert
ist, wie vorstehend beschrieben wurde, kann zum Nachweis eines Residualprostatakrebses
oder anderer bösartiger
Veränderungen
oder gutartiger Hyperplasiezustände
in einem Individuum, das sich im Zustand der klinischen Remission
befindet, verwendet werden. Zusätzlich
ist das Verfahren zum Nachweis eines NMP-Polypeptids in Zellen für den Nachweis
einer Zellproliferationsstörung
durch die Identifizierung von Zellen, die spezifische NMPs exprimieren,
im Vergleich mit NMPs, die in normalen Zellen exprimiert werden,
nützlich.
Durch die Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann die Expression
von NMP in einer Zelle identifiziert werden. Weil die Expressionsmuster
der durch die Erfindung identifizierten NMPs mit dem Stadium der
Bösartigkeit
einer Zelle variieren, kann eine Probe wie z.B. ein Prostatagewebe
mit einer Gruppe von NMP spezifischen Antikörpern abgesucht werden, um
die Expression von NMP nachzuweisen und das Stadium der Bösartigkeit
der Zelle zu diagnostizieren.
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Die
monoclonalen Antikörper
der Erfindung sind zum Beispiel für die Verwendung in Immunanalysen geeignet,
in denen sie in einer flüssigen
Phase oder gebunden an einem Festphasenträger verwendet werden können. Zusätzlich können die
monoclonalen Antikörper
in diesen Immunanalysen auf verschiedenen Wegen nachweisbar markiert
werden. Beispiele von Arten der Immunanalysen, welche die monoclonalen
Antikörper der
Erfindung verwenden können,
sind kompetitive und nicht kompetitive Immunanalysen, entweder in
einem direkten oder einem indirekten Format. Beispiele solcher Immunanalysen
sind die Radioimmunanalyse (RIA) und die (immunometrische) Sandwich-Analyse.
Der Nachweis der Antigene unter Verwendung der monoclonalen Antikörper der
Erfindung kann durch die Verwendung von Immunanalysen, die entweder
im Vorwärts-, Rückwärts- oder
Simultanmodus durchgeführt
werden, einschließlich
immunhistochemischer Analysen, an physiologischen Proben durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform
kann der Antikörper
der Erfindung verwendet werden, um NMPs nachzuweisen, die in elektrophoretisch
aufgetrennten Gelprotokollen wie z.B. Western-Blots und 2-dimensionalen Gelen
vorhanden sind. Der Fachmann wird andere Formate von Immunanalysen
kennen oder er kann diese ohne übermäßiges Experimentieren
leicht erkennen.
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Die
monoclonalen Antikörper
der Erfindung können
an vielen verschiedenen Trägern
gebunden sein und sie können
dazu verwendet werden, die Anwesenheit von NMP nachzuweisen. Beispiele
von gut bekannten Trägern
schließen
Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen,
natürliche
und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit
ein. Die Natur der Träger
kann für
die Ziele der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein.
Der Fachmann wird andere geeignete Träger zur Bindung von monoclonalen
Antikörpern
kennen oder wird diese durch die Verwendung von Routineexperimenten
bestimmen können.
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Bei
der Durchführung
der Analysen kann es wünschenswert
sein, bestimmte „Blockierungsmittel" in das Inkubationsmedium
einzuschließen
(die meistens zusammen mit dem markierten löslichen Antikörper zugegeben
werden). Die „Blockierungsmittel" werden zugegeben,
um sicherzustellen, dass unspezifische Proteine, Proteasen oder
anti-heterophile Immunglobuline gegen anti-NMP-Immunglobuline, die in der experimentellen
Probe vorhanden sind, die Antikörper
auf dem Festphasenträger
oder die radiomarkierten Indikator-Antikörper nicht vernetzen oder zerstören, um
falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse ergeben. Die Auswahl
der „Blockierungsmittel" kann daher im Wesentlichen
zu der Spezifität
der Analyse beitragen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben
wird.
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Man
hat herausgefunden, dass eine Anzahl von nicht relevanten (das heißt unspezifischen)
Antikörpern
der gleichen Klasse oder Unterklasse (Isotyp) wie die, die in den
Analysen verwendet werden (z.B. IgG1, IgG2a, IgM, etc.), als „Blockierungsmittel" verwendet werden
können.
Die Konzentration dieser „Blockierungsmittel" (normalerweise 1-100 μg/μl) ist wichtig,
um die richtige Sensitivität
zu erhalten, aber jede ungewollte Störung durch eine wechselseitig
auftretende Vernetzung von Proteinen in der Probe zu hemmen.
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Der
Ausdruck „Epitop", wie er in dieser
Erfindung verwendet wird, schließt jede Determinante ein, die eine
spezifische Interaktion mit den monoclonalen Antikörpern der
Erfindung eingehen kann. Epitopische Determinanten bestehen im Allgemeinen
aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen
von Molekülen
wie z.B. Aminosäuren
oder Zuckerseitenketten und besitzen im Allgemeinen spezifische
dreidimensionale Strukturkennzeichen sowie spezifische Ladungskennzeichen.
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Bei
der Verwendung der monoclonalen Antikörper der Erfindung für den Nachweis
eines Antigens in einer Probe, die von einem menschlichen Individuum
erhalten wurde, wird der nachweisbar markierte monoclonale Antikörper in
einer Dosis gegeben, die diagnostisch effizient ist. Der Ausdruck „diagnostisch
effizient" bedeutet,
dass die Menge des nachweisbar markierten, monoclonalen Antikörpers in
einer ausreichenden Quantität
verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle, die das NMP-Antigen
besitzt, für
das der monoclonale Antikörper
spezifisch ist, zu ermöglichen.
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Die
Konzentration des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers, der
verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an
solchen Zellen, die das NMP besitzen, im Vergleich zum Hintergrund nachweisbar
ist.
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Die
monoclonalen Antikörper
der Erfindung können
verwendet werden, um den Verlauf der Verbesserung einer NMP assoziierten
Zellproliferationsstörung
zu beobachten. Durch die Bestimmung des Anstiegs oder der Abnahme
der Anzahl von Zellen, die ein NMP exprimieren, oder der Veränderungen
beim NMP, die in verschiedenen Körperflüssigkeiten
wie z.B. im Ejakulat oder im Urin vorhanden ist, würde es möglich sein, zu
bestimmen, ob ein bestimmter therapeutischer Behandlungsplan, der
die Verbesserung der Störung
anstrebt, effizient ist.
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Die
Antikörper
zur Verwendung in den Analysen der Erfindung sind idealerweise für die Herstellung eines
Kits geeignet. Ein solcher Kit kann ein Trägermittel umfassen, das in
verschiedene Fächer
unterteilt ist, um in engen Grenzen einen oder mehrere Behälter wie
z.B. Glasfläschchen,
Röhren
und dergleichen zu erhalten, wobei jeder der Behälter eines der getrennten Elemente
umfasst, die in dem Verfahren zu verwenden sind.
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Zum
Beispiel kann einer der Behälter
einen Antikörper
umfassen, der nachweisbar markiert ist oder werden kann. Dieser
Antikörper
ist für
ein Zielprotein spezifisch, wobei das Ziel bezeichnend für die Anwesenheit
eines erfindungsgemäß identifizierten
NMP ist oder damit korreliert.
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BEISPIEL 1
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IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG
VON KERNMATRIX-PROTEINEN
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Patienten.
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Frisch
präpariertes
Gewebe der Prostata wurde von 21 Männern untersucht, die einer
radikalen retropubischen Prostataentfernung aufgrund eines klinisch
lokalisierten (Stadium B, T2) Prostatakrebses (N = 19) (Gleason-Grad
5-9) oder einer offenen Prostataentfernung aufgrund einer gutartigen
Hyperplasie der Prostata (BPH, N = 2) unterzogen wurden.
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Herstellung des Gewebes.
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Frisch
präpariertes
Gewebe wurde innerhalb von 15 Minuten nach der chirurgischen Entfernung
erhalten. Ungefähr
ein Gramm des makroskopischen Tumors wurde von einem fühlbaren
Tumorknoten von 14 Proben entnommen. Ein Gramm normales Prostatagewebe
wurde von dem Prostatalappen, der kontralateral zum Tumorknoten
gelegen war, von 13 Proben entnommen. Ein Gramm des BPH-Gewebes
wurde von der periurethralen Region des kontralateralen Lappens
von 12 Proben und 25-30 Gramm von jeder der Proben der zwei offenen
Prostataentfernungen erhalten. Alle entfernten Gewebe wurden histologisch
mit Hämatoxylin-
und Eosinschnitten sowohl am proximalen als auch am distalen Ende
des Schnittes bestätigt.
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Reinigung von Kernmatrix-Proteinen.
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Die
Kernmatrix-Proteine wurden gemäß dem Verfahren
von Fey und Penman (Proc Natl Acad Sci USA 85: 121-125, 1988) isoliert.
Kurz zusammengefasst wurde frisch präpariertes, menschliches Prostatagewebe in
kleine (1 mm3) Stücke zerkleinert und auf Eis
mit einem Stößel aus
Teflon mit 0,5% Triton X-100 in einer Lösung, die 2mM Vanadylribonucleosid
(RNase-Hemmstoff) enthielt und die 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Serin-Protease-Hemmstoff)
enthielt, homogenisiert, um die Lipide und die löslichen Proteine freizugeben.
Anschließend
wurden die Extrakte durch ein 350 Micron-Nylonnetz filtriert und mit 0,25 M Ammoniumsulfat
extrahiert, um die löslichen
Elemente des Cytoskeletts freizusetzen. Eine Behandlung mit DNase
bei 25°C
wurde verwendet, um das lösliche
Chromatin zu entfernen. Die verbleibende Fraktion enthielt die Intermediärfilamente
und die Kernmatrix-Proteine. Diese Fraktion wurde anschließend mit
8 M Harnstoff abgebaut und die unlöslichen Komponenten, die hauptsächlich aus
Kohlenhydraten und extrazellulären
Matrixkomponenten bestanden, wurden pelletiert. Der Harnstoff wurde
mittels Dialyse entfernt, die Intermediärfilamente konnten sich wieder
zusammenlagern und wurden durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wurden
die Kernmatrix-Proteine mittels Ethanol präzipitiert. Die Proteinkonzentrationen
wurden mit dem Coomassie®-Plus-Proteintest-Reagenzkit (Pierce, Rockfort,
IL) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Zur Vorbereitung
für die
Gelelektrophorese wurden die Kernmatrix-Proteine in einem Probenpuffer, der
aus 9 M Harnstoff, 65 mM 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamin]-1-propansulfonat,
2,2% Ampholyte und 140 mM Dithiothreit bestand, wieder gelöst.
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Zweidimensionale Elektrophorese.
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Eine
zweidimensionale Gelelektrophorese mit hoher Auflösung wurde
durchgeführt,
wobei das Investigator 2-D-Gelsystem (Milligan/Biosearch, Bedford,
MA) (Patton WF et al., BioTechniques 8: 518-527, 1990) verwendet
wurde. Eine eindimensionale isoelektrische Fokussierung wurde bei
18.000 V-h durchgeführt,
wobei auf 1 nm × 18
auf Röhrengelen
nach 1,5 Stunden Vorfokussierung verwendet wurden. Die Röhrengele
wurden extrudiert und auf vorgegossene 10%ige Tris-Acetat-Natriumdodecylsulfat-DuracrylTM (Millipore, Co., Bedford, MA)-Polyacrylamid-Elekrophorese-Plattengele
von 1 mm mit hoher Zugfestigkeit (HTS) platziert und die Gele wurden
mit einer konstanten Temperaturregulierung von 12°C für ungefähr 5 Stunden
einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden mit 50% Methanol
und 10% Essigsäure
fixiert. Nach dem gründlichen
Waschen und einer Rehydratisierung wurden die Gele mit 5% Glutaraldehyd
und 5 mM Dithiothreit behandelt, nachdem sie mit 50 mM Phosphat
(pH-Wert 7,2) gepuffert wurden. Die Gele wurden mit Silberfarbstoff
gefärbt, wobei
das Verfahren von Wray (Wray W et al., Anal Biochem 118: 197-203,
1981) (Accurate Chemical Co., Inc., Westbury, NY) verwendet wurde.
50 Mikrogramm der Kernmatrix-Proteine wurden auf jedes Gel aufgetragen.
Die Protein-Molekulargewichtsstandards
wurden mit dem GELCODE (Dacheng H et al., J Cell Biol 110: 569-580,
1990), Protein-Molekulargewichtsmarker-Kit (MG 12.400-97.400), (Pierce,
Rockford, IL) bestimmt. Die isoelektrischen Punkte wurden unter
Verwendung von carbamylierten Kreatin-Kinase-Standards (pH-Wert 7,0-4,950,
BDH Limited, England)) bestimmt. Nur Proteinpunkte, die deutlich
und reproduzierbar beobachtet wurden oder die in allen Proben der
verschiedenen Geweben abwesend waren, wurden berücksichtigt, wenn Unterschiede
von Kernmatrix-Proteinen zwischen den Geweben bestimmt wurden.
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Es
bestand eine auffallende Ähnlichkeit,
die in den Mustern von Kernmatrix-Proteinen zwischen den Patienten beobachtet
wurden, bei ungefähr
120 von 150 Proteinpunkten, die gleichbleibend von Patient zu Patient
beobachtet wurden. 14 Kernmatrix-Proteine wurden identifiziert,
die gleichbleibend vorhanden oder nicht vorhanden waren, wenn normale
Prostata-BPH und Prostatakrebs verglichen wurden. Ein Protein (PC-1)
mit einem Molekulargewicht von 56 Kd und einem pI = 6,58 stellte
ein Kernmatrix-Protein dar, das in allen untersuchten (14/14) Proben
von menschlichem Prostatakrebs erschien, das aber in keiner normalen
Prostata (0/13) oder im BPH-Gewebe (0/14) nachgewiesen wurde.
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1 zeigt die Zusammensetzung der Kernmatrix-Proteine
einer normalen menschlichen Prostata (A), einer gutartigen Prostata-Hyperplasie
(B) und eines Prostatakrebses (C). Vier Proteine, von denen bekannt
ist, dass sie in den meisten Herstellungen der Kernmatrix vorhanden
sind, Lamin A, Lamin B, Lamin C und Aktin, wurden basierend auf
den zuvor veröffentlichten
Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten identifiziert (Fey
EG et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 121-125, 1988) und wurden in 1A als
LA, LB, LC bzw. A bezeichnet.
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1 zeigt die typischen Muster einer zweidimensionalen
Gelelektrophorese mit hoher Auflösung
von Kernmatrixproteinen einer normalen menschlichen Prostata (1A),
einer menschlichen BPH (1B) und eines
menschlichen Prostatakrebses (1C). Gelpunkte,
die sich zwischen der normalen Prostata, der BPH und dem Prostatakrebs
(in allen untersuchten Proben) unterschieden, wurden mit Pfeilen
markiert und mit Bezeichnungen, die denen in Tabelle 1 entsprechen,
identifiziert. Tabelle 1 zeigt das Molekulargewicht und die isoelektrischen
Punkte der 14 verschiedenen Proteinpunkte, die gleichbleibend vorhanden
oder nicht vorhanden waren, wenn die Kernmatrix-Proteine des Gewebes
einer normalen Prostata, einer BPH und eines Prostatakrebses für diese
Gruppe von 21 Patienten verglichen wurden.
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2 fasst
die Orte der Proteinpunkte zusammen, die sich zwischen den verschiedenen
Geweben unterscheiden, und zeigt spezifische Kernmatrix-Proteine
bei BPH und Prostatakrebs. Schematische Darstellung der wichtigsten,
gewebespezifischen Kernmatrix-Proteine der normalen Prostata, der
BPH und des Prostatakrebses. Abkürzungen:
kD – Molekulargewicht
in Tausend, SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und pI – isoelektrischer
Punkt und BPH – gutartige
Prostata-Hyperplasie.
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Es
wurden keine NMPs nachgewiesen, die nur in BPH vorhanden waren und
die in der normalen Prostata und im Prostatakrebs nicht vorhanden
waren. Es waren genauso keine NMPs sowohl in der normalen Prostata
als auch im Prostatakrebs vorhanden, jedoch in BPH nicht vorhanden.
PC-1 (Molekulargewicht 56 Kd und isoelektrischer Punkt 6,58) ist
ein NMP, das nur im Gewebe von menschlichem Prostatakrebs gefunden wurde
und das gleichbleibend in allen Proben der normalen Prostata und
BPH nicht vorhanden war. In zusätzlichen
Untersuchungen wurde PC-1 in Proben von Nieren- und Blasenkrebs
nachgewiesen, wurde aber nicht im normalen Nieren- oder Blasengewebe
nachgewiesen.
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Die
Abwesenheit von NMB-1-7 und NP-1-3 in bösartigen Zellen deutet darauf
hin, dass Gene, die diese NMPs codieren, als Krebs-Suppressorgene
arbeiten. Dies gilt im besonderen Maße für NP-1-3, das ebenfalls im
gutartigen hyperplastischen Gewebe nicht vorhanden war. TABELLE
1 KERNMATRIX-PROTEINE
AUS FRISCH PRÄPARIERTEN
GEWEBE VON NORMALER PROSTATA, BPH UND PROSTATAKREBS
- NP
- normale Prostata
- B
- BPH
- PC
- Prostatakrebs
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Die
Bezeichnung jedes Proteins entspricht den in 1 identifizierten
Proteinen.
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BEISPIEL 2
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MODELLE FÜR DIE PROGRESSION
VON NORMALEN PROSTATAZELLEN ZUM PROSTATAKREBS
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Obwohl
die genauen molekularen und/oder umweltbedingten Ereignisse, die
für die
Entwicklung einer Prostatastörung
notwendig sind, größtenteils
unbekannt sind, ist jedoch die Tatsache gut etabliert, dass die Entwicklung
eines Prostatakrebs ein aus mehreren Schritten bestehender Prozess
ist (Carter HB et al., J Urol 143: 742-746, 1990). Epidemiologische
Untersuchungen, die auf der ursprünglichen Arbeit von Ashley
(Ashley DFB, J Path Bact 90: 217-225, 1965) und Armitage und Doll
(Armitage P und Doll R, Brit J Cancer 8: 1-15, 1954) basierten und
welche die altersspezifischen Häufigkeitsraten
für Prostatakrebs
und BPH in den Vereinigten Staaten verwendeten, zeigen, dass die
Entwicklung von BPH sehr wahrscheinlich ein aus zwei Schritten bestehender
Prozess ist, während
die Entwicklung eines offenkundigen klinischen Prostatakrebses sehr
wahrscheinlich ein aus mehreren Schritten (mehr als zwei Ereignisse)
bestehender Prozess ist (Carter HB et al., J Urol 143: 742-746,
1990).
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Zwei
verschiedene Modelle können
für die
Progression einer normalen epithelialen Prostatazelle entweder zur
BPH oder zum Prostatakrebs postuliert werden. 3 zeigt
zwei Modelle einer aus mehreren Schritten bestehenden Progression
einer normalen Prostata (Normal) zur einer gutartigen Prostatahyperplasie (BPH)
oder zum Prostatakrebs (Krebs). Model I sagt vorher, dass ähnliche
Ereignisse in beiden Signalwegen stattfinden. Modell II sagt vorher,
dass verschiedene Ereignisse stattfinden, wenn eine Progression
von normal zu BPH stattfindet, als wenn eine Progression zum Krebs
stattfindet. Das erste Modell (Model I) sagt vorher, dass die frühen Ereignisse
einer Progression entweder von normal zur BPH oder von normal zum
Prostatakrebs ähnlich
sind (Ereignisse A-B in Modell I). Das zweite Model (Model II) sagt
vorher, dass in der Progression zur BPH und zum Krebs verschiedene
Ereignisse stattfinden (Ereignisse A-B gegen Ereignisse E-H). Unter
Verwendung der Anwesenheit oder der Abwesenheit der Kernmatrix-Proteine
als einen phänotypischen Marker,
um diese Modelle zu testen, würde
vorhergesagt werden, dass Modell 1 genügt würde, wenn eine spezifische
Gruppe von Proteinpunkten sowohl in BPH als auch Prostatakrebs entweder
nicht vorhanden oder vorhanden (NP1-3, BPC 1-3) sind und wenn zusätzliche
Proteinpunkte nur im Prostatakrebs vorhanden oder nicht vorhanden
sind (NMB1-7 oder PC-1). Daher stellen alle der beobachteten Unterschiede
in den Kernmatrix-Proteinen
Modell I zufrieden. Um Modell II zu genügen, müsste(n) ein Protein oder mehrere
Proteine nur in BPH vorhanden oder nicht vorhanden sein, und dieses
wurde in keiner der Proben beobachtet. Daher unterstützen diese
Daten Modell I, in dem ähnliche
phänotypische
Merkmale in der Kernmatrix von Zellen auftauchen, die zu BPH fortschreiten,
wie in solchen Zellen, die zum Prostatakrebs fortschreiten. Als
ein Ergebnis können
die NMPs der Erfindung verwendet werden, um das Stadium und die
Progression einer Zellproliferationsstörung wie z.B. Prostatakrebs
von der Normalität
zu einer gutartigen Störung
zu einer bösartigen
Veränderung
zu beobachten und nachzuweisen. Diese Information kann wiederum
dazu verwendet werden, um eine geeignete Therapie zu initiieren.
