DE69434604T2

DE69434604T2 - Thermisches kreisprozessgerät mit temperaturgradientblock

Info

Publication number: DE69434604T2
Application number: DE69434604T
Authority: DE
Inventors: L. John San Diego DANSSAERT; J. Robert San Diego SHOPES; Abrahms Apartment 7C Daniel D. Stanford SHOEMAKER
Original assignee: Stratagene California
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1993-10-20
Filing date: 1994-10-20
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2014-10-21
Also published as: US6054263A; EP0733098A4; US20060105460A1; US6962821B2; JP4103964B2; JPH09510863A; DE69434604D1; US20030157563A1; EP1609849A1; EP0733098B1; WO1995011294A1; US20020127660A1; US5779981A; US5525300A; EP0733098A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Temperaturzyklus ausführenden Apparat bzw. sogenannten "Cycler", der zur Durchführung einer Nukleinsäurevervielfältigung, DNA-Sequenzierung und dergleichen nützlich ist, wobei der Apparat einen oder mehrere Heiz- und/oder Kühl-Blöcke enthalten kann, welche Probenlöcher enthalten, in welchen ein Temperaturgradient über einen vorgegebenen Block hinweg erzeugt werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das US Patent Nr. 4,679,615 betrifft ein Verfahren und einen Apparat zum gleichzeitigen Erhitzen und/oder Kühlen von Objekten auf unterschiedliche vorgewählte Temperaturen. Das US Patent Nr. 4,679,615 betrifft nicht die Ermittlung optimaler Temperaturen in mehreren oder zyklischen chemischen Reaktionen.
Das US Patent Nr. 4,679,615 beschreibt einen Apparat mit einem wärmeleitenden Element in der Form einer festen Platte mit einem Paar sich davon weg erstreckender Schenkel an jedem Ende der Platte, wobei die Schenkel über eine gesteuerte Erhitzungs- oder Kühlquelle erhitzt oder gekühlt werden. Diese Quelle erwärmt oder kühlt einen Schenkel auf eine Temperatur T₁ und den anderen Schenkel auf eine zweite Temperatur T₂ und hält diese Schenkel während der Benutzung des Apparates mit dem Ziel einer Erzeugung eines konstanten und gleichmäßigen Temperaturgradienten über der Länge der Platte auf diesen Temperaturen. Eine Matrix von Blindbohrungen, die sich in der Oberseite der Platte öffnen, dient als eine Matrix von Aufnahmeöffnungen, welche eine Flüssigkeit für einen guten Wärmeaustausch enthalten können.
Systeme, welche mehrfache oder zyklische chemische Reaktionen erfordern, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen, erfordern oft eine sorgfältige Temperatursteuerung, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Derartige Reaktionen beinhalten Nukleinsäurevervielfältigungsreaktionen, wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR – polymerase chain reaction) und die Ligasekettenreaktion (LCR – ligase chain reaction). Aus diesen Gründen wurden Apparate entwickelt, welche die genaue Steuerung der Temperatur von Reaktionsbehältern zulassen, in welchem derartige Vervielfältigungsreaktionen durchgeführt werden.
Beispielsweise gibt es eine Anzahl thermische "Cycler", die zur DNA-Vervielfältigung und zur Sequenzierung in der herkömmlichen Technik verwendet werden, in welchen ein oder mehrer temperaturgesteuerte Elemente oder "Blöcke" das Reaktionsgemisch enthalten und die Temperatur eines Blockes über der Zeit variiert wird.
Ein weiteres herkömmliches System wird von einem Temperatur-Cycler dargestellt, in welchem mehrere temperaturgesteuerte Blöcke auf unterschiedlichen gewünschten Temperaturen gehalten werden, und ein Roboterarm dazu verwendet wird, Reaktionsgemische von Block zu Block zu versetzen.
Alle von diesen Systemen enthalten Einrichtungen, welche es dem Benutzer ermöglichen, Temperaturen oder Temperaturprofile über der Zeit für einen Block auf dem Instrument zu programmieren, so dass verschiedene Prozesse (z.B. Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung) effizient erzielt werden können, sobald die optimalen Temperaturen für diese Schritte ermittelt sind. Wichtig ist jedoch, dass die Ermittlung der optimalen Temperatur für jeden der verschiedenen Schritte in jedem Reaktionssystem, und insbesondere für jede Nukleinvervielfältigung oder Inkubationsreaktion einschließlich eines Anlagerungsschrittes keine sehr einfache Aufgabe ist.
PCR ist eine Technik, welche mehrere Zyklen beinhaltet, die jedes Mal zu einer geometrischen Vervielfältigung einer bestimmten Polynukleotidsequenz führt, wenn ein Zyklus abgeschlossen ist. Die Technik der PCR ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannt. Die Technik der PCR wird in vielen Büchern einschließlich PCR: A Practical Approach, M.J. McPherson, et al. IRL Press (1991), PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications, by Innis et al. Academic Press (1990), und PCR-Technology: Principals and Applications for DNA-Amplification, H.A. Erlich, Stockton Press (1989) beschrieben. PCR wird auch in vielen US Patenten einschließlich der US Patente 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 4,889,818; 5,075,216; 5,079,352; 5,104,792; 5,023,171; 5,091,310; und 5,066,584 beschrieben.
Die PCR-Technik beinhaltet typischerweise den Schritt der Denaturierung eines Polynukleotids, gefolgt von dem Schritt einer Anlagerung wenigstens eines Paares von Primer-Oligonukleotiden zu dem denaturierten Polynukleotid, d.h., der Hybridisierung des Primers mit der denaturierten Polynukleotidschablone. Nach dem Anlagerungsschritt katalysiert ein Enzym mit Polymeraseaktivität einen neuen Polynukleotidstrang, der das Primeroligonukleotid enthält und verwendet das ursprüngliche denaturierte Polynukleotid als eine Syntheseschablone. Diese Reihenfolge von Schritten (Denaturierung, Primerausheilung und Primerverlängerung) stellt einen PCR-Zyklus dar. Da die Zyklen wiederholt werden, nimmt die Menge eines neu synthetisierten Polynukleotids geometrisch zu, da die neu synthetisierten Polynukleotide aus einem vorherigen Zyklus als Schablonen für die Synthese in anschließenden Zyklen dienen können. Primeroligonukleotide werden typischerweise in Paaren ausgewählt, die sich an gegenüberliegende Stränge einer vorgegebenen Doppelstrang-Polynukleotidsequenz anlagern, so dass der Bereich zwischen den zwei Anlagerungsstellen vervielfältigt wird.
Die Temperatur des Reaktionsgemisches muss während eines PCR-Zyklusses variiert werden, und demzufolge viele Male während eines mehrzyklischen PCR-Experimentes. Beispielsweise findet die Denaturierung von DNA typischerweise bei etwa 90 bis 95°C statt, die Anlagerung eines Primers an die denaturierte DNA wird typischerweise bei etwa 40 bis 60°C durchgeführt, und der Schritt der Verlängerung des angelagerten Primers mit einer Polymerase wird typischerweise bei etwa 70 bis 75°C ausgeführt. Jeder von diesen Schritten hat eine optimale Temperatur zum Erzielen des gewünschten Ergebnisses. Viele Experimente sind erforderlich, um die optimale Temperatur für jeden Schritt zu bestimmen.
Beispielsweise werden, obwohl die Temperatur, bei welcher DNA denaturiert im Allgemeinen zwischen 90 bis 95°C liegt, leichte Veränderungen in der notwendigen speziellen Temperatur beobachtet, die von der Länge der DNA und dem Prozentsatz von jedem der vorhandenen Desoxynukleotide (Guanin/Cytosin-Paare und Adenin/Thymin-Paare). Eine unzureichende Erhitzung während des Denaturierungsschrittes ist ein üblicher Grund für das Versagen einer PCR-Reaktion. Jedoch kann eine Überhitzung während des Denaturierungsschrittes zu einer übermäßigen Denaturierung der Polymerase führen.
Die Erzielung der optimalen Temperatur für den PCR-Anlagerungsschritt ist sogar noch kritischer. Eine Anlagerungstemperatur, welche zu niedrig ist, führt zu einer Vervielfältigung nicht-spezifischer DNA-Fragmente. Bei einer zu hohen Anlagerungstemperatur lagern sich die Primer weniger effizient an, was zu einer verringerten Ausbeute der gewünschten Produkte und möglicherweise reduzierter Reinheit führt. In dem Anlagerungsschritt hängt die optimale Temperatur von vielen Faktoren einschließlich der Länge des Primers und dem Prozentsatz von jedem der vier vorhandenen Desoxynukleotide (Guanin/Cytosin-Paare und Adenin/Thymin-Paare) ab. Für einen typischen 20-Basenoligonukleotidprimer, der grob aus 50 Prozent Guanin/Cytosin besteht, ist eine Temperatur von 55°C ein guter Schätzwert für das untere Ende des Temperaturbereichs. Sobald man jedoch die Primerlänge vergrößert, um eine größere Primerspezifität zu erhalten, können unterschiedliche Anlagerungstemperaturen erforderlich sein. Somit macht die Anzahl feiner Einflüsse auf die optimale Anlagerungstemperatur die Aufgabe der schnellen Identifizierung des Optimums für ein gegebenes System schwierig.
Die Erzielung der optimalen Temperatur für die Verlängerungsreaktion ist ebenfalls für die Erzielung des gewünschten PCR-Ergebnisses wichtig. Die Temperatur kann sowohl die Rate als auch die Genauigkeit der Verlängerungsreaktion beeinflussen. Wenn die Rate der Polymerasereaktion zu langsam ist, kann dann das neu synthetisierte Polynukleotid keine Stelle für eine Primeranlagerung enthalten. Zusätzlich kann die denaturierte Polynukleotidsequenz zur Vervielfältigung einen oder mehrere Bereiche einer sekundären Struktur enthalten, die sich abhängig von der gewählten Temperatur ausbilden oder verschwinden können. Ferner können mehrere unterschiedliche Enzyme mit Polymeraseaktivität für PCR verwendet werden. Jedes Enzym hat seine eigene optimale Temperatur für die Aktivität, Stabilität und Genauigkeit.
Die Bestimmung der optimalen Denaturierungs-, Anlagerungs- und Verlängerungstemperaturen für eine spezielle PCR ist aufgrund des Umstandes kompliziert, dass das Optimum für jede der Reaktionen unterschiedlich ist. Somit müssen zur Ermittlung der drei optimalen Temperaturbereiche mehrere getrennte Experimente durchlaufen werden, wobei zwei Temperaturvariablen konstant gehalten werden, während eine dritte Temperaturvariable verändert wird. Demzufolge kann die Ermittlung der optimalen Temperatur für den Betrieb eines PCR-Systems eine zeitaufwendige Aufgabe sein.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, effiziente Mittel bereitzustellen, mittels welcher optimale Reaktionstemperaturen effizienter für PCR und andere Reaktionen ermittelt werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren laut Definition in den beigefügten Ansprüchen bereitgestellt.
In einer ersten Ausführungsform ist die Erfindung ein Verfahren, um gleichzeitig eine Vielzahl von Reaktionsgemischen in einem Apparat mit einem Temperaturgradientenblock zur Reaktion zu bringen, das die Schritte aufweist:
Platzieren der Reaktionsgemische in einer Vielzahl von Reaktionslöchern in dem Gradientenblock, wobei der Gradientenblock ein oberes Teil, ein jeweils gegenüberliegendes erstes und zweites Teil und ein Bodenteil aufweist, und wobei die Vielzahl an Reaktionsgemischlöchern in dem Block zwischen den gegenüberliegenden Teilen ausgebildet ist, und
Erzeugen eines Temperaturgradienten über dem Gradientenblock und zwischen den gegenüberliegenden Teilen, wobei das Verfahren eine PCR- oder Ligasekettenreaktion ist; wobei der Apparat ferner mindestens einen zusätzlichen Wärmeleitblock aufweist, der ein oberes Teil, ein jeweils gegenüberliegendes erstes und zweites Teil und ein Bodenteil und eine Vielzahl von Reaktionsgemischlöchern in dem zusätzlichen Block zwischen gegenüberliegenden Abschnitten ausgebildet hat; wobei das Verfahren ferner den Schritt des Versetzens der Reaktionsgemische zwischen dem Gradientenblock und dem zusätzlichen Block oder den Blöcken aufweist.
In dieser Ausführungsform kann der Schritt der Erzeugung eines Temperaturgradienten die Schritte der Erhitzung des ersten gegenüberliegenden Abschnittes des Gradientenblockes und die Kühlung des zweiten gegenüberliegenden Abschnittes des Gradientenblockes beinhalten. Das Verfahren kann auch den Schritt der Steuerung des Temperaturgradienten unter Verwendung einer Steuereinrichtung beinhalten. Durch die Verwendung einer Steuereinrichtung kann das Verfahren auch die Schritte der Sammlung und Speicherung eines Temperatursollpunktes und von Ist-Temperaturdaten aus den Löchern und Übertragung dieser Information an einen Mikroprozessor enthalten.
Demzufolge betrifft die Erfindung ein Verfahren gemäß vorstehender Beschreibung, wobei der Steuerungsschritt die Schritte des Vergleichs des Temperatursollpunktes und der Ist- Temperaturdaten aus den Löchern aufweist. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß vorstehender Beschreibung, wobei die Steuereinrichtung einen Mikroprozessor aufweist.
Die Erfindung beinhaltet auch einen Apparat zum Durchführen von PCR- oder Ligasekettenreaktionen, mit:
Haltemitteln zum Festhalten eines Reaktionsgemisches, wobei die Haltemittel einen Wärmeleitblock mit einem oberen Abschnitt, ersten und zweiten gegenüberliegenden Abschnitten und einen Bodenabschnitt und mehrere Reaktionsgemischlöcher umfassen, die in dem oberen Abschnitt und zwischen den ersten und zweiten gegenüberliegenden Abschnitten ausgebildet sind, und Mittel zum Erzeugen eines Temperaturgradienten über dem Wärmeleitblock und zwischen den ersten und zweiten gegenüberliegenden Abschnitten; wobei die Apparatur ferner wenigstens ein zusätzliches Haltemittel aufweist, um ein Reaktionsgemisch festzuhalten, wobei das zusätzliche Haltemittel umfasst: (i) wenigstens einen zusätzlichen Wärmeleitblock mit mehreren Reaktionsgemischlöchern; und (ii) Mittel zum Erhitzen des zusätzlichen Wärmeleitblocks.
Die Erfindung stellt ferner einen Apparat bereit, in welchem die Mittel zum Erzeugen eines Temperaturgradienten Mittel zum Erhitzen des ersten gegenüberliegenden Abschnittes des Blockes umfassen, sowie eine Apparatur, welche ein Mittel zum Kühlen des zweiten gegenüberliegenden Abschnittes des Blockes umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Wärmeleitblock oder "Gradienten"-Block im Wesentlichen aus Messing oder weist Messing auf.
Die Apparatur der Erfindung kann zusätzliche Elemente enthalten. Somit enthält in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die Apparatur mehr als einen Wärmeleitblock zusammen mit dem Gradientenblock. Die Temperatur kann auch eine Steuerung zum Steuern des Temperaturgradienten über dem Gradientenblock enthalten, und in einer Mehrblockapparatur kann die Steuerung auch die Temperatur von Blöcken, welche auf eine gleichmäßige Temperatur erhitzt oder gekühlt werden, steuern. Bevorzugt enthält die Steuerung einen Mikroprozessor zum Sammeln und Speichern des Temperatursollpunktes und von Ist- Temperaturdaten und mehrere Temperatursensoren zum Sammeln der Ist-Temperaturdaten aus den Löchern und Übertragen der Information an den Mikroprozessor.
Die Erfindung stellt auch eine Apparatur zum Erzeugen eines Temperaturgradienten über einem Wärmeleitblock gemäß vorstehender Beschreibung bereit, wobei das Haltemittel ferner ein Heizmittel zum Erhitzen des Bodenabschnittes umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform sind die mehreren Löcher in dem Gradientenblock in parallelen, ausgerichteten Reihen angeordnet. Ferner kann, wenn mehr als ein Block enthalten ist, die Vorrichtung einen Roboterarm für das Versetzen von Proben zwischen den Blöcken in einer programmierbar gesteuerten Weise enthalten.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine perspektivische Ansicht eines Thermal-Cyclers, der den Wärmegradientenblock der Erfindung enthält;
2 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Wärmegradientenblockes, der die Heizeinrichtungen und Kühler gemäß der Erfindung umgibt; und
3 ist eine Blockdarstellung, welche die Elemente eines Thermal-Cyclers darstellt, in welchem der Wärmegradientenapparat und das Verfahren der Erfindung angewendet werden können.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Erzeugen eines Wärmegradienten über einem Block, wie z.B. einem Block in bekannten Thermal-Cyclern für PCR-Reaktionen, welcher es ermöglicht, gleichzeitig eine Reihe von Experimenten bei ziemlich nahe beieinander liegenden Temperaturen durchzuführen. So wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Block" auf eine Struktur, üblicherweise Metall, deren Temperatur gesteuert werden kann, und in welcher Löcher angeordnet worden sind, um Behälter aufzunehmen, die Reaktionsgemische oder "Proben" enthalten. Der Ausdruck "Gradientenblock", so wie er hierin verwendet wird, soll einen derartigen Block mit der Ausnahme beschreiben, dass ein Gradientenblock ein Block ist, über welchem ein Temperaturgradient aufgebaut werden kann. Beispiele der speziellen Art, in welcher ein derartiger Temperaturgradient aufgebaut werden kann, werden hierin diskutiert, obwohl der Fachmann auf diesem Gebiet erkennen wird, dass sobald der Vorteil, über einen Gradientenblock zu verfügen, bekannt ist, viele weitere Varianten des hierin dargestellten Apparates leicht identifiziert werden können.
Durch den Einbau des Gradientenblockes in einen Thermal-Cycler mit mehreren Blöcken ist es auch möglich, gleichzeitig eine Reihe von Reaktionen durchzuführen, wobei die Temperatur, bei welcher die Reaktionen ablaufen, abhängig von dem Gradientenblock variiert ist. Dieses ermöglicht die rasche Bestimmung der optimalen Temperatur für diese spezielle Reaktion.
1 stellt das herkömmliche Stratagene-Gerät dar, das gemäß der Erfindung modifiziert ist, um einen Wärmegradientenblock 2 aufzunehmen.
Verschiedene Komponenten des in den 2 und 3 detaillierter dargestellten Cyclers kann man in 1 sehen, d.h., eine Anzeige 15, ein Tastenfeld 16, zusätzliche Blöcke 17, 18 und 19 und einen (in aufgeschnittener Ansicht dargestellten) Roboterarm 20.
Es dürfte sich verstehen, dass ein Mikroprozessor in die Steuerelektronik des Apparates eingebaut sein kann, wie es allgemein bekannt ist. Der Mikroprozessor kann dazu verwendet werden, den Bereich des Temperaturgradienten und auch die Versetzung der Proben in den und aus dem Wärmegradientenblock zu programmieren. Der Mikroprozessor führt in Software geschriebene Befehle aus, die eine über die Tastatur eingegebene Benutzereingabe sammeln, die Eingabe mit den Ist-Temperaturbereichen und die Heiz- oder Kühleinheiten zweckmäßig aus- oder einschalten. Die Elektronik enthält auch einen durch den Mikroprozessor lesbaren Zeitgeber. Dieser ermöglicht dem Mikroprozessor die verstrichene Zeit zu vergleichen, über die sich das Reaktionsgemisch in einem gegebenen Block befand und diese mit einer von dem Benutzer eingegebenen gewünschten Zeit vergleichen.
Der Mikroprozessor steuert auch den Roboterarm, welcher mittels zwei Schrittmotoren betrieben wird. Ein Motor hebt und senkt den Arm. Der andere dreht den Arm von Block zu Block.
Der Fachmann auf diesem Gebiet kann ohne weiteres erkennen, wie der Wärmegradientenblock in bekannte Thermal-Cycler eingebaut werden kann.
Natürlich muss der Wärmegradientenblock nicht notwendigerweise in einen bekannten Cycler eingebaut werden, um vorteilhaft genutzt zu werden. Beispielsweise kann eine selbständige Einheit, welche den Wärmegradientenblock verwendet, in Verbindung mit bekannten Zyklen verwendet werden, so dass optimale Reaktionstemperaturen identifiziert und dann in diesen Zyklen verwendet werden können.
2 stellt eine Explosionsansicht der Komponenten der Gradientenblockanordnung bereit. Somit ist in 2 die Gradientenblockvorrichtung insgesamt mit dem Bezugszeichen 1 bezeichnet. Die Vorrichtung weist einen Wärmeleitblock 2 auf, welcher eine Anzahl von Löchern 3 enthält, um die Reaktionsgemische oder die Behälter, in welchen die Reaktionsgemische gehalten werden können, aufzunehmen. In einem Abschnitt des Blockes 2 sitzt ein Heizer 5 in einer Öffnung 4. Der Heizer 5 ist ein üblicherweise erhältlicher zylindrisch geformter Patronenwiderstandsheizer (der Marke RAMA, San Jancinto, California).
Abhängig von dem gewünschten Temperaturbereich kann der gegenüberliegende Abschnitt des Blockes 2 gleichzeitig unter Verwendung eines aus einem gerippten Aluminiumblocks 7 und einem Lüfter 9 bestehenden Kühlkörpers gekühlt werden. Natürlich wird abhängig davon, ob der Kühlkörper betrieben wird oder nicht, ein Temperaturgradient zwischen den gegenüberliegenden Abschnittes des Blockes erzeugt. Jedoch kann, wenn der Temperaturgradient größer gemacht werden soll, der Kühlkörper betrieben werden. Um die Fähigkeit, einen Gradientenblock 2 zu erzeugen und zu betreiben, zu verbessern, besteht der Block 2 bevorzugt aus einem Material mit einem relativ niedrigen Wärmeleitfähigkeitskoeffizienten, um die Menge des zum Erzeugen des Temperaturgradienten über dem Block erforderlichen Wärmeflusses zu reduzieren. Messing wird bevorzugt.
Wenn ein System mit mehreren Blöcken verwendet wird (1) werden andere Blöcke als der Gradientenblock aus einem Material mit einem relativ hohen Wärmeleitfähigkeitskoeffizienten aufgebaut. Dadurch können die Blöcke auf eine gleichmäßige Temperatur erwärmt und gekühlt werden, sind aber nicht wärmeleitend genug, um eine übermäßige Erhitzung oder Kühlung zu erfordern, um eine Temperatur aufrechtzuerhalten. Aluminium ist für solche Anwendungen in der herkömmlichen Technik bekannt.
Abhängig von der Größe des Gradientenblockes und den Erhitzungs- und Kühlkapazitäten des Heizers und des Kühlkörpers können Temperaturgradienten von 1°C bis 22°C, bevorzugt 1°C bis 14°C über dem Block 2 erzielt werden. Löcher 6 können in dem Block 2 gebohrt sein, um die Wärmeleitfähigkeit zu begrenzen, so dass parallel angeordnete Reihen von Löchern in dem Block tendenziell auf einer Temperatur liegen. Die Verwendung von Löchern erlaubt, dass Temperaturprofile über dem Gradientenblock und von einer Lochreihe zur nächsten linear verlaufen.
Im Fachgebiet bekannte Heizer und Kühler können verwendet werden. Beispielsweise können thermoelektrische Peltier-Elemente verwendet werden, obwohl andere passive oder aktive Heizer ebenfalls nützlich wären (gekühlte oder erhitzte Flüssigkeiten oder Gase). Gemäß Darstellung in den 1 und 2 weist der Gradientenblock 2 bevorzugt acht bis zwölf Reihen von Probenlöchern 3 in gleichem Abstand zwischen dem Block auf. Jede Reihe kann fünf bis acht Probenlöcher enthalten. Es können 0,2 oder 0,5 ml Röhrchen verwendet werden. Die spezielle Anzahl und Konstruktion der Probenlöcher kann variiert werden, um die gewünschte Kapazität zu verändern. Wenn ein Temperaturgradient von 7°C bis 11°C zwischen den heißen und kalten Abschnitten des Blockes ausgebildet wird, unterscheidet sich jede Reihe der Probenlöcher in der Temperatur um angenähert 1°C.
Zurückkehrend zu 2 können auch zusätzliche Heizer 8 und 10 verwendet werden, so dass das System in derselben Weise wie die im Fachgebiet bekannten Blöcke betrieben werden können, d.h., mit einer gleichmäßigen Erhitzung über der gesamten Länge und Breite des Blockes 2. Die Heizer 8 und 10 sind bevorzugt dünne Heizfolien (der Marke MINCO Minneapolis, Minnesota). Die Heizer 8 und 10 können auch in Verbindung mit dem Heizer 5 verwendet werden, um den Block 2 so schnell wie möglich wenigstens auf die Kühlabschnitttemperatur zu bringen, wenn das System gestartet wird, oder der Temperaturbereich, über welchen der Block 2 zu betreiben ist, vergrößert ist.
Drahtverbinder 11, 12 und 13 verbinden die Heizer mit einer Energiequelle. Die Vorrichtung 1 kann auch einen Thermostaten 14 enthalten, welcher als eine Übertemperatur-Abschaltung verwendet werden kann, was ein erwünschtes Sicherheitsmerkmal ist.
Die Blockdarstellung von 3 enthält einen als ("zweiten Block" bezeichneten) Gradientenblock des in 2 dargestellten Typs als Block 2, der in einen Thermal-Cycler mit mehreren Heiz- und Kühlblöcken eingebaut ist. Die Bezeichnungen in 3 sind selbst erläuternd, und der in 2 dargestellte Apparat unterscheidet sich von dem bekannten Thermal-Cycler nur hinsichtlich der Ersetzung eines Nicht-Gradientenblockes durch einen Gradientenblock. Für PCR können die ersten, zweiten und dritten Blöcke in 3 so programmiert werden, dass sie in einem Temperaturbereich über 25 bis 99°C gehalten zu werden, und zur Denaturierung, Anlage bzw. Verlängerung verwendet werden. Der vierte Block wird im Allgemeinen zwischen 4 und 25°C gehalten, und wird zur Probenlagerung verwendet, nachdem die PCR-Reaktion abgeschlossen worden ist. Der aus Messing bestehende zweite Block wird für den Anlagerungsschritt verwendet.
Wie man in 3 sehen kann, kann mehr als ein Thermopaar entlang des Längsverlaufs des Gradientenblockes verwendet werden, so dass die Temperaturen entlang des Blockes sorgfältig überwacht und zur Rückführung von Information zu der Steuerelektronik und Anzeige verwendet werden können.
Die nachstehenden Beispiele werden für den Zweck der Veranschaulichung angeboten, ohne die zugrunde liegende Erfindung einzuschränken.
BEISPIEL 1
VERWENDUNG DES GRADIENTENWÄRME-CYCLERS ZUR POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
Ein Hochtemperatur-Primer-Verlängerungstest des Wärmegradientensystems der Erfindung wurde unter Verwendung von zwei Primer/Schablonen-Modellsystemen ausgeführt. Diese zwei Systeme zeigen deutlich unterschiedliche Verlängerungsproduktausbeuten in Abhängigkeit von der Anlagerungstemperatur, welche während des Verlängerungsprozesses verwendet wurde. Der Primer/Schablonensatz #1 vermehrt einen 105 bp Bereich des menschlichen Gaucher-Gens, während der Satz #2 einen 540 bp Bereich des menschlichen Fukosidase-Gens vermehrt. Das Wärmegradientensystem der Erfindung enthält einen Gradientenblock, der eine Primerverlängerung unter Verwendung eines optimalen Anlagerungstemperaturbereichs von 42 bis 56°C ermöglicht.
VERFAHREN UND MATERIALIEN
Primeranlagerungsreaktionen wurden unter Verwendung des Gradientenblockes der Erfindung ausgeführt. Der Primer/Schablonen-Testsatz #1 besteht aus einer genomischen menschlichen DNA-Schablone und zwei 22-merischen Oligomeren, welche ein 105 bp Verlängerungsprodukt ergaben. Die Sequenz des Primers A war 5'CTGAGGGCTCCCAGAGAGTGG 3'9 (SEQ ID Nr: 1). Die Sequenz des Primers B war 5' GGTTTAGCACACCACAACAGC 3' (SEQ ID Nr: 2). Der Primer/Schablonen-Testsatz #2 bestand aus einer genomischen menschlichen DNA-Schablone und zwei Oligomeren 20 bzw. 30 Basen, die ein 540 bp Verlängerungsprodukt ergaben. Die Sequenz des Primers A war 5'AGTCAGGTATCTTTGACAGT 3' (SEQ ID Nr: 3). Die Sequenz des Primers B war 5'AAGCTTCAGGAAAACAGTGAGCAGCGCCTC 3' (SEQ ID Nr: 4).
Das Primerverlängerungs-Reaktionsgemisch bestand aus 1X Taq DNA Polymerasepuffer (10 mM tris-HCL pH 8,8, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCL2, 0,001 (w/v) Gelatine), 250 mM von jeweils dNTP, 250 ng jeweils Primer und Schablone und 2,5 Einheiten Taq DNA Polymerase in einem 100 μl Reaktionsvolumen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl nukleasefreiem sterilen Mineralöl abgedeckt.
Die verwendeten Temperaturzyklusparameter waren wie folgt:
Acht Reaktionsgemische wurden pro Primer/Schablonen-Satz getestet – einer pro Gradiententemperatur Blockschlitz. Die verwendeten Anlagerungstemperaturen waren 42, 44, 46, 48, 50, 52 und 54°C (Schritte von 2°C über den Gradientenblock). Die Reaktionen wurden in 500 μl Röhrchen ausgeführt.
ERGEBNISSE
Beide Primer/Schablonen-Sätze 1 und 2 ergaben deutlich variierende Ergebnisse abhängig von der in dem Gradiententemperaturblock verwendeten Anlagerungstemperatur. Primerverlängerungsprodukte aus dem Satz #1 variierten von dem erwünschten einzelnen DNA-Band mit einer Größe von 105 bp (erhalten aus der Verlängerungsreaktion unter Verwendung einer Anlagerungstemperatur von 56°C) bis zu einem Reaktionsgemisch, das mehrfach vergrößerte zusätzliche DNA-Verlängerungsprodukte (von einer angenäherten Größe von 180, 280 und 800 bp) aus einer Reaktion unter Verwendung einer Anlagerungstemperatur von 48°C ergab. Die Primerverlängerungsprodukte aus dem Satz #2 variierten von dem gewünschten einzelnen DNA-Band der Größe 540 bp (erhalten aus der Verlängerungsreaktion unter Verwendung einer Anlagerungstemperatur von 42°C) bis zu einem Reaktionsgemisch, das ein zusätzliches DNA-Verlängerungsprodukt von angenähert 2000 bp aus einer Reaktion unter Verwendung einer Anlagerungstemperatur von 56°C ergab.
BEISPIEL 2
VERWENDUNG DES GRADIENTEN-THERMAL-CYCLERS FÜR DIE LIGASEKETTENREAKTION
Die Ligasekettenreaktion (LCR) ist eine vor kurzem beschriebene DNA-Vermehrungstechnik, die dazu genutzt werden kann, um Spurenwerte bekannter Nukleinsäuresequenzen zu detektieren. Die LCR beinhaltet eine zyklische Zwei-Schritte-Reaktion, welche in einer DNA-Thermal-Cyclermaschine durchgeführt wird. Der erste Schritt ist ein Hochtemperaturschmelzschritt, in welchem sich eine Doppelstrang-DNA so aufwickelt, so sie zu einem Einzelstrang wird. Der zweite Schritt ist ein Kühlschritt, in welchem sich zwei Sätze benachbarter, komplementärer Oligonukleotide an die einsträngigen Target-DNA-Moleküle anlagern, und über ein DNA-Ligaseenzym ligiert werden. Die Produkte der Ligation aus einem ersten Zyklus dienen als Schablone für die Ligationsreaktion des nächsten Zyklus. Somit führt die LCR zu einer exponentiellen Vermehrung von Ligationsprodukten.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Die in diesem Experiment verwendeten Materialien wurden von Stratagene, La Jolla, California bezogen. Die optimale Temperatur für den zweiten Schritt des LCR-Zyklus, in welchem die Oligonukleotide an die DNA-Targetmoleküle angelagert werden, wurden empirisch durch die Verwendung des Gradienten-Thermal-Cyclers der Erfindung ermittelt. Zwei Reaktionssätze wurden aufgebaut, einer mit einer Wildtypschablone, zu welcher die Oligonukleotide komplementär waren, und eine mit einer Mutantenschablone, die sich von der Wildtypschablonen-DNA-Sequenz durch einen Basisübergang unterschied. Die in diesem Experiment verwendeten DNA-Schablonen waren Plasmid-Konstrukte, die den pBluescriptI Vektor und das lac I Gen enthielten. Die Wildtypschablone enthielt eine normale lac I-Sequenz und die Mutantenschablone enthielt eine C auf T Übergangsmutation an der Stelle 191 innerhalb des Einsatzes. Die vier Oligonukleotidproben bestanden aus zwei Paaren von jeweils zwei Oligonukleotiden. Der erste Satz, A und B, war zueinander benachbart und zu einem Strang der Target-DNA komplementär. Der zweite Satz, C und D, war zu dem ersten Satz komplementär, und belegte daher benachbarte Stellen auf dem zweiten Strang der Target-DNA. Die Oligonukleotid-Sondensequenzen (5' bis 3') waren wie folgt:
A:
TTGTGCCACG CGGTTGCGAA TCTA (SEQ ID Nr: 5)
B:
AGCAACGACT GTTTGCCCGC CAGTTC (SEQ ID Nr: 6)
C:
TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAAC (SEQ ID Nr: 7)
D:
AACTGGCGGG CAAACAGTCG TTGT (SEQ ID Nr: 8)
Die Oligonukleotidsonden A und D wurden während der Synthese 5'-phosphoryliert.
Die Sequenz des Wildtyps lac I Einsatzes beginnend an der Stelle 161 des Einsatzes war wie folgt:
5'CTGAATTACA TTCCCAACCG CGTGGCACAA CAACTGGCGG GCAAACAGTC GTTGCTGATT 3' (SEQ ID Nr: 9).
Die Mutantensequenz unterschied sich von dem Wildtyp durch einen C auf T Übergang an der Stelle 191. Das LCR-Experiment wurde wie folgt durchgeführt: Die nachstehenden Bestandteile wurden in sterilen 500 μl eines 10XZ Pfu LCR-Puffer, 15 μl eines sterilen dH₂O, 1 μl (10 ng jeweils) eines Oligonukleotidgemisches, 1 μl (100 pg) entweder der Wildtyp- oder Mutantenplasmidschablonen oder keine Schablone, und 1 μl (4U) eines Pfu DANN Ligaseenzyms kombiniert. Eine 25 μl Abdeckschicht aus sterilem Mineralöl wurde dem Röhrchen zugesetzt. Diese Prozedur wurde wiederholt, so dass insgesamt fünf Röhrchen jeweils entweder mit dem Wildtyp-Schablonenreaktionsgemisch oder dem Mutantenschablonenreaktionsgemisch vorhanden waren. Die Röhrchen wurden in dem Gradienten-Thermal-Cycler der Erfindung in den Positionen 1, 3, 5, 7 und 8 platziert, so dass bei jeder Isothermenspalte in der Maschine ein Wildtyp- und eine Mutantenschablonenreaktion stattfand. Die Maschine war für einen Zyklus zwischen einem Hochtemperaturblock von 92°C und dem Gradientenblock programmiert, welcher in der Temperatur zwischen 56°C und 70°C variiert wurde. Die Maschine war programmiert, dass sie auf den Hochtemperaturblock für 4 Minuten wechselte, dann auf den Gradientenblock für 3 Minuten, dann zwischen dem Hochtemperaturblock und dem Gradientenblock 25-mal wechselte, wobei sie 1 Minute bei jedem Block anhielt. Die Ligationskettenreaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese auf einem mit TBE gepufferten 6% Polyacrylamidgel, gefolgt von einer Färbung mit Ethidiumbromid und Photographie unter UV-Licht visualisiert.
ERGEBNISSE
Die Wildtypschablonenreaktion erzeugte das intensivste positive Signal in der Position 8, welche dem kältesten (56°C) Abschnitt des Gradientenblockes entspricht. Die Verwendung des Gradienten-Thermal-Cyclers der Erfindung ermöglichte die empirische Ermittlung der besten Anlagerungstemperatur für diese Reaktion in einem einzigen Experiment.
Es gibt viele Modifikationen und Varianten des Wärmegradientenblockes, welche vorteilhaft in diese oder verwandte Strukturen einbezogen werden können. Ferner könnten mehrfache Wärmegradientenblöcke als nur ein einziger Block eines Mehrfachblock-Thermal-Cyclers verwendet werden, in welchem Proben automatisch zwischen den verschiedenen Blöcken versetzt werden, um dadurch bei mehreren Temperaturen auszuführende Mehrfachreaktionen zu ermöglichen.
Die Erfindung wurde im Detail hinsichtlich ihrer Anwendung mit PCR beschrieben. Jedoch ist zusätzlich dazu, dass sie für die Bestimmung der optimalen Temperatur für die einzelnen Schritte in einer PCR-Prozedur außergewöhnlich nützlich ist, die Erfindung auch für die Bestimmung der optimalen Temperatur für andere chemische Reaktionen nützlich. Diese anderen chemischen Reaktionen umfassen jede Nicht-PCR Nukleinsäurevermehrung, die einen Anlagerungsschritt analog zu einem PCR Anlagerungsschritt verwendet, wie z.B. eine Ligasekettenreaktion (LCR) und eine DNA Zyklussequenzierung. Weitere Reaktionstypen, für welche die Erfindung nützlich sein kann, beinhalten DNA Sequenzierung, cDNA Synthese unter Verwendung einer zyklischen Reaktion, gekoppelte Vervielfältigungssequenzierung (CAS), die Schnellvervielfältigung von cDNA Enden (RACE) und weitere Inkubationsreaktionen, in welchen Inkubationen bei mehreren Temperaturen ausgeführt werden müssen. ALLGEMEINE INFORMATION:

Claims

Verfahren, in dem eine Vielzahl an Reaktionsgemischen gleichzeitig eine Reaktion eingehen kann, in einem Apparat, der einen Temperaturgradientenblock einschließt, das Verfahren umfassend die Schritte: Platzieren der Reaktionsgemische in eine Vielzahl an Reaktionslöchern in dem Gradientenblock, wobei der Gradientenblock ein oberes Teil, ein jeweils gegenüberliegendes erstes und zweites Teil, und ein Bodenteil hat, und wobei die Vielzahl an Reaktionsgemischlöchern in dem Block zwischen den gegenüberliegenden Teilen gebildet wird, und Erzeugen eines Temperaturgradienten über den Gradientenblock und zwischen den gegenüberliegenden Teilen; wobei das Verfahren eine PCR oder eine Ligasekettenreaktion ist; wobei der Apparat ferner mindestens einen zusätzlichen Wärmeleitblock umfasst, der ein oberes Teil, ein jeweils gegenüberliegendes erstes und zweites Teil, und ein Bodenteil hat, und wobei die Vielzahl an Reaktionsgemischlöchern in dem zusätzlichen Block zwischen den gegenüberliegenden Teilen gebildet wird; das Verfahren ferner umfassend den Schritt des Versetzens der Reaktionsgemische zwischen dem Gradientenblock und dem zusätzlichen Block oder Blöcken.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Erzeugens eines Temperaturgradienten den Schritt des Erhitzens des ersten gegenüberliegenden Teils des Gradientenblocks umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Erzeugens eines Temperaturgradienten den Schritt des Abkühlens des zweiten gegenüberliegenden Teils des Gradientenblocks umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den Schritt des Steuerns des Temperaturgradienten mittels Steuerungsmitteln einschließt.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Steuerschritt den Schritt des Vergleichens des gesetzten Temperaturpunkts mit den echten Temperaturdaten aus den Löchern umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Steuerungsmittel einen Mikroprozessor umfassen.
Ein Apparat zur Durchführung einer PCR oder Ligasekettenreaktion, umfassend Haltemittel zum Halten eines Reaktionsgemischs, die Haltemittel umfassend: (i) einen Wärmeleitblock, der ein oberes Teil, ein jeweils gegenüberliegendes erstes und zweites Teil, und ein Bodenteil hat, und eine Vielzahl an Reaktionsgemischlöchern, die in dem oberen Teil und zwischen dem ersten und zweiten gegenüberliegenden Teil gebildet werden; und (ii) Mittel zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über den Wärmeleitblock und zwischen dem ersten und zweiten gegenüberliegenden Teil; wobei der Apparat ferner mindestens ein zusätzliches Haltemittel zum Halten eines Reaktionsgemischs umfasst, das zusätzliche Haltemittel umfassend: (i) mindestens einen zusätzlichen Wärmeleitblock einschließlich einer Vielzahl an Reaktionsgemischlöchern; und (ii) Mittel zum Erhitzen des zusätzlichen Wärmeleitblocks.
Der Apparat zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach Anspruch 7, wobei die Mittel zur Erzeugung eines Temperaturgradienten Mittel zum Erhitzen des ersten gegenüberliegenden Teils des Blocks umfassen. '
Der Apparat nach Anspruch 8 umfassend Mittel zum Abkühlen des zweiten gegenüberliegenden Teils des Blocks.
Der Apparat zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der Wärmeleitblock Messing umfasst.
Der Apparat zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Vielzahl an Löchern in dem Wärmeleitblock über den Block in parallelen, aneinander ausgerichteten Reihen verteilt ist.
Der Apparat zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei der Apparat ferner Steuerungsmittel zur Erzeugung des Temperaturgradienten umfasst.
Der Apparat zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach Anspruch 12, wobei das Steuerungsmittel einen Mikroprozessor zum Vergleich des gesetzten Temperaturpunkts mit den echten Temperaturdaten umfasst.
Der Apparat zur Erzeugung eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei das Haltemittel ferner eine Heizung zum Erhitzen des Bodenteils umfasst.
Der Apparat zum Erzeugen eines Temperaturgradienten über einen Wärmeleitblock nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei der Apparat ferner einen Roboterarm umfasst, der von Roboterarmsteuerungsmitteln gesteuert wird, zum Versetzen des Reaktionsgemischs zwischen den Haltemitteln.