DE69435044T2

DE69435044T2 - Rapamycin - Konjugate und Antikörper

Info

Publication number: DE69435044T2
Application number: DE69435044T
Authority: DE
Inventors: Katherine L. Worcester Molnar-Kimber; Craig E. New-York Caufield; Timothy D. Framingham Ocain
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2014-04-23
Also published as: EP0710110B1; JP2004149542A; DE69430060D1; US6328970B1; ES2295093T3; EP1181938B1; EP0710110A4; JP2004168782A; CA2161101A1; EP0710110A1; DE69435044D1; AU686629B2; US20010010920A1; EP1181938A3; AU6772094A; US6541612B2; JPH08509499A; EP1181938A2; ES2176245T3; DE69430060T2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Derivate von Rapamycin, die als antigene Moleküle für die Herstellung von Rapamycin-spezifischen Antikörpern nützlich sind.
Rapamycin ist ein makrozyklisches Trien-Antibiotikum, hergestellt von Streptomyces hygroscopicus, von dem festgestellt wurde, dass es antifungale Wirksamkeit hat, insbesondere gegen Candida albicans, sowohl in vitro als auch in vivo [C. Vezina u. a., J. Antibiot. 28, 721 (1975); S.N. Sehgal u. a., J. Antibiot. 28, 727 (1975); H.A. Baker u. a., J. Antibiot. 31, 539 (1978); U.S.-Patent 3,929,992 und U.S.-Patent 3,993,749 ].
Es ist gezeigt worden, dass Rapamycin alleine ( U.S.-Patent 4,885,171 ) oder in Kombination mit Picibanil ( U.S.-Patent 4,401,653 ) Antitumorwirkung hat. R. Martel u. a. [Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977)] offenbarten, dass Rapamycin wirksam ist im "allergische Enzephalomyelitis"-Versuchsmodell, einem Modell für Multiple Sklerose, im Arthritis-Hilfsmodell, einem Modell für Rheumatoidarthritis, und die Bildung von IgE-artigen Antikörpern wirksam hemmte.
Die immunosuppressiven Effekte von Rapamycin wurden in FASER 3, 3411 (1989) offenbart. Es ist gezeigt worden, dass auch Cyclosporin A und FK-506, andere makrozyklische Moleküle, als Immunosuppressiva wirksam und daher zur Verhinderung von Transplantatabstoßung nützlich sind. [FASER 3, 3411 (1989); FASER 3, 5256 (1989); R. Y. Calne u. a., Lancet 1183 (1978) und U.S.-Patent 5,100,899 ].
Es ist auch gezeigt worden, dass Rapamycin nützlich ist, um Lupus erythematodes visceralis [ U.S.-Patent 5,078,999 ], Lungenentzündung [ U.S.-Patent 5,080,899 ], Insulin-abhängigen Diabetes mellitus [Fifth Int. Conf. Inflamm. Res. Assoc. 121 (Zusammenfassung), (1990)], adulte T-Zellen-Leukämie/-Lymphom [ EP-A-0 525 960 ] und Proliferation der glatten Muskelzellen und Intimaverdickung nach Gefäßverletzung [Morris, R.J., Heart Lung Transplant 11 (Teil 2): 197 (1992)] zu verhindern oder zu behandeln.
Es ist gezeigt worden, dass mono- und diacylierte Derivate von Rapamycin (verestert an den 28- und 43-Positionen) nützlich sind als Antimykotika ( U.S.-Patent 4,316,885 ), und sie sind verwendet worden, um wasserlösliche Prodrugs von Rapamycin herzustellen ( U.S.-Patent 4,650,803 ). In jüngster Zeit wurde die Nummerierungskonvention für Rapamycin geändert; daher würden sich gemäß der Nomenklatur der Chemical Abstracts die oben beschriebenen Ester an der 31- und der 42-Position befinden. Das U.S.-Patent 5,100,883 offenbart fluorierte Ester von Rapamycin. Das U.S.-Patent 5,118,677 offenbart Amidester von Rapamycin. Das U.S.-Patent 5,118,678 offenbart Carbamate von Rapamycin. Das U.S.-Patent 5,130,307 offenbart Aminoester von Rapamycin. Das U.S.-Patent 5,177,203 offenbart Sulfonate und Sulfamate von Rapamycin. Das U.S.-Patent 5,194,447 offenbart Sulfonylcarbamate von Rapamycin. Die PCT-Veröffentlichung WO 92/05179 offenbart Carbonsäureester von Rapamycin.
Yatscoff hat berichtet, dass Rapamycin-Mengen mit Hilfe des HPLC-Verfahrens mit einer Empfindlichkeit von 1 ng/ml quantitativ bestimmt werden können [Ther. Drug Monitoring 14: 138 (1992)]. Dieses Verfahren ist zeitaufwendig, und jede Probe muss einzeln untersucht werden.
Immunoassays sind für zahlreiche Proteine sowie verschiedene Arzneimittel entwickelt worden, einschließlich Cyclosporin A [Morris, R.G., Ther. Drug Monitoring 14: 226-(1992)] und FK506 [Tamura, Transplant Proc. 19: 23 (1987); Cadoff, Transplant Proc. 22: 50 (1990)]. Zahlreiche Arten von Immunoassays, die entwickelt wurden, um Proteine oder Verbindungen zu messen, basierten auf konkurrierender Hemmung, dualen Antikörpern, Rezeptor-Antikörper-Interaktionen, Antigenerfassung, Teststreifen, Antikörper- oder Rezeptor-Abfangen oder einer Affinitätschromatographie. Es ist über Affinitätssäulen mit Rapamycin berichtet worden, in denen ein Rapamycin-Analogon kovalent an eine Matrix gebunden war [Fretz J. Am. Chem. Soc. 113: 1409 (1991)]. Diese Säulen sind verwendet worden, um Rapamycin bindende Proteine zu isolieren.
Das U.S.-Patent 5,164,495 offenbart die Herstellung von Antikörpern gegen FK-506 unter Verwendung eines FK-506-Antigens, hergestellt wie in EP-A-0 293 892 beschrieben, und die Verwendung solcher Antikörper in einem Mikropartikel-Enzym-Immunoassay für FK-506. Tamura u. a. (1987) Trans. Proc. 19, Nr. 5, Anhang 6, 23–29, offenbaren die Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper für FK-506 unter Verwendung eines BSA-FK-506-Konjugats und die Verwendung solcher Antikörper in Enzym-Immunoassays für FK-506. WO 94/24304 , das Stand der Technik im Sinne von Artikel 54(3) und (4) EPC ist, offenbart Rapamycin-Konjugate, worin ein geeignetes antigenes Protein über eine Carbonsäure an die 42-Position konjugiert wird, Antikörper, die unter Verwendung solcher Konjugate hergestellt werden, und einen heterogenen Enzymimmuntest für Rapamycin.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung liefert ein Rapamycin-Konjugat mit der Formel I oder ein Salz davon mit der Struktur
worin R¹ -OCH₂(CH₂)_qR⁴- ist;
R⁴ gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carbonyl, -NH-, -S-, -CH₂- und -O-;
q = 0–6;
z ist von ungefähr 1 bis ungefähr 120;
und Träger ist ein antigenes Trägermaterial.
Das antigene Trägermaterial kann gewählt werden aus allen, die herkömmlicherweise bekannt sind. In den meisten Fällen ist der Träger ein Protein oder Polypeptid, obwohl andere Materialien, wie Kohlenhydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren und Ähnliches von ausreichender Größe und antigener Stärke ebenfalls verwendet werden können. In den meisten Fällen haben antigene Proteine und Polypeptide Molekulargewichte zwischen 5.000 und 10.000.000, vorzugsweise mehr als 15.000 und häufiger mehr als 40.000. Im Allgemeinen sind Proteine, die von einer Tier-Spezies genommen werden, antigen, wenn sie in den Blutkreislauf einer anderen Spezies eingeführt werden. Besonders nützliche Proteine sind solche wie z. B. Albumine, Globuline, Enzyme, Hämocyanine, Gluteline oder Proteine mit signifikanten nicht proteinischen Bestandteilen, z. B. Glykoproteine und Ähnliches. Weitere Bezugnahme auf den Stand der Technik im Hinblick auf herkömmliche antigene Trägermaterialien und Techniken zur Kopplung von Haptenen daran sind zu entnehmen aus: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., USA, 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1–24 (1975) und Pharmacol. Rev. 29(2): 103–163 (1978); Weinryb und Shroff, Drug Metab. Rev. 10: P271–283 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726–732 (1976) und Playfair u. a., Br. Med. Bull. 30: 24–31 (1974). Bevorzugte antigene Trägermaterialien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Ovalbumin und Schlüssellochschnecken-Hämocyanin. Besonders zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird Ovalbumin.
Es ist anzumerken, dass, wie in den Formeln oben verwendet, welche die spezifischen Rapamycin-Konjugate beschreiben, z die Anzahl von Rapamycinen darstellt, die an das Trägermaterial konjugiert sind. Der Wert z wird manchmal als die Epitopdichte des Antigens, Detektors oder der festen Matrix bezeichnet und beträgt in der normalen Situation durchschnittlich von ungefähr 1 bis ungefähr 120 und typischer von 1 bis 50. Die Dichten können jedoch stark variieren, je nachdem, welches spezielle Trägermaterial verwendet wird.
Die Salze sind diejenigen, die abgeleitet sind von solchen anorganischen Kationen wie z. B. Natrium, Kalium und dergleichen; organischen Basen, wie z. B. Mono-, Di- und Trialkylaminen von 1–6 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe und Mono-, Di- und Trihydroxyalkylaminen von 1–6 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe und dergleichen; und organischen und anorganischen Säuren, wie z. B. Essig-, Milch-, Zitronen-, Wein-, Bernstein-, Malein-, Malon-, Glucon-, Salz-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Salpeter-, Schwefel-, Methansulfon- und ähnlich bekannten akzeptablen Säuren.
Die Herstellung der 27-Oxim-Vernetzungsgruppen kann erreicht werden durch Anwendung der Methodik, die im U.S.-Patent 5,023,264 offenbart und in Beispiel 21 beschrieben ist.
Die an Rapamycin gebundene Vernetzungsgruppe kann unter Anwendung von Standard-Methodik, die in der Peptid-Literatur beschrieben ist, mit einer zweiten Vernetzungsgruppe gekoppelt werden; typischerweise durch Aktivierung des elektrophilen Anteils, mit einem Kopplungsreagens vom DCC-Typ oder mit N-Hydroxysuccinimid, oder als aktivierter Ester oder Anhydrid. Das aktivierte elektrophile Ende eines Vernetzungsanteils kann dann mit dem nukleophilen Ende des anderen Vernetzungsanteils zur Reaktion gebracht werden.
Die Kopplung des Rapamycin-Vernetzungsgruppen-Anteils mit dem antigenen Träger kann unter Standardbedingungen aus der Literatur erzielt werden. Im Allgemeinen wird zur Reaktion mit einer nukleophilen Gruppe auf dem antigenen Trägermaterial ein elektrophiler Anteil, z. B. eine Carbonsäure, an der Vernetzungsgruppe mit einem geeigneten Aktivierungsmittel, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid, aktiviert und dann mit dem nukleophilen Anteil auf dem antigenen Trägermaterial zur Reaktion gebracht. Die Beispiele 2 und 3 stellen speziell dieses Verfahren exemplarisch dar. Eine ähnliche Methodik wird angewandt zur Kopplung eines nukleophilen Anteils an der Vernetzungsgruppe mit einem elektrophilen Anteil an dem antigenen Trägermaterial. In solchen Fällen wird der elektrophile Anteil an dem antigenen Trägermaterial wie oben beschrieben aktiviert und dann mit dem nukleophilen Ende der Vernetzungsgruppe zur Reaktion gebracht.
Die Reagenzien, die verwendet werden, um die Verbindungen der Erfindung herzustellen, sind im Handel erhältlich oder können durch Verfahren hergestellt werden, die in der Literatur offenbart sind.
Rapamycin-spezifische Antikörper oder ein Derivat davon, das die Rapamycin-Antigen-Konjugate dieser Erfindung verwendet, können mit Standardtechniken erzeugt werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Typischerweise wird das Antigen-Konjugat einem Wirtstier an einer oder mehreren Stellen eingeimpft, entweder alleine oder in Kombination mit einem Adjuvans. Die typischen Wirtssäugetiere schließen Mäuse, Ziegen, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe oder Pferde ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Anschließende Injektionen können durchgeführt werden, bis ein ausreichender Titer von Antikörpern erzeugt wurde. Die Antikörper, die aus den Rapamycin-Antigen-Konjugaten dieser Erfindung hergestellt werden, können zur Bestimmung von Rapamycin-Mengen in zahlreichen Immunoassays verwendet werden, in ELISAs, Radioimmunoassays, in Chemilumineszenz-Immunoassays und in Fluoreszenz-Immunoassays. Obwohl viele Variationen des Immunoassays eingesetzt werden können (Antigenerfassung, Antikörpererfassung, Konkurrenzhemmung oder Zwei-Antikörper-Immunoassay), kann ein grundlegender Konkurrenzhemmungs-Immunoassay wie folgt durchgeführt werden: Antikörper, der spezifisch für den Liganden ist, ist normalerweise an eine Matrix gebunden. Eine Lösung wird aufgetragen, um die nicht spezifische Bindung des Liganden an die Matrix zu verringern. Nach Fortspülen des Überschusses kann die an den Antikörper gekoppelte Matrix in einigen Fällen so behandelt werden, dass sie gelagert werden kann. In einem Konkurrenzhemmungs-Assay wird die Ligand-Standardkurve erstellt, und das Rapamycin-Detektor-Konjugat wird hinzugefügt und konkurriert um die Bindung an den Rapamycin-spezifischen Antikörper. Falls nötig, wird der Überschuss entfernt. Das Detektormolekül wird durch die Standardverfahren erfasst, die vom Fachmann angewandt werden. Verschiedene Formate können verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Teststreifen-Assays, FPIA, EMIT, ELISA, VISTA, RIA und MEIA. Detektor-Konjugate können zur Verwendung in den oben genannten Assays hergestellt werden. Zum Beispiel können die Detektor-Konjugate ein Trägermaterial mit markierten fluoreszenten, chemilumineszenten oder enzymatischen Anteilen sein.
Diese Erfindung sorgt auch für die Nutzung der Rapamycin-Antigen-Konjugate oder -Antikörper, die für Rapamycin oder ein Derivat davon spezifisch sind, in einem Testkit, das kommerziell vermarktet werden kann. Das Testkit kann verwendet werden, um Mengen von Rapamycin in biologischen oder Labor-Flüssigkeiten zu messen. Testkit-Komponenten können Antikörper für Rapamycin oder ein Derivat davon, Antiseren oder Rapamycin-Träger-Konjugate einschließen. Die Konjugate oder Antikörper können an eine feste Matrix gebunden werden, und Rapamycin-Derivate oder -Antikörper können radioaktiv markiert werden, wenn der Assay dies verlangt. Standard-Konzentrationen von Rapamycin können eingeschlossen werden, so dass eine Standard-Konzentrationskurve erstellt werden kann. Geeignete Behälter, Mikrotiter-Schalen, feste Träger, Reagenzgläser, Tabletts können ebenfalls in jedes derartige Kit eingeschlossen sein. Zahlreiche Varianten von Reagenzien können in das Kit eingeschlossen sein, je nach Art des verwendeten Assays.
Obwohl kein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist das Folgende exemplarisch für die Verwendung eines Rapamycin-Antigen-Konjugats zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind, und zur Erfassung derselben mit Hilfe eines Immunoassays des ELISA-Formats. Fünf Mäuse wurden mit 50 μg Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Schlüssellochschnecken-Hämocyanin in vollständigem Freundschen Adjuvans intrasplenal immunisiert und nach ungefähr einem Monat mit 50 μg Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Schlüssellochschnecken-Hämocyanin in unvollständigem Freundschen Adjuvans in die Footpads (Straßenräuber) erneut geimpft. Mikrotiter-Platten (Immunolon I) wurden über Nacht mit 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (10 μg/ml in 10 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,2) bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden umgedreht und mit 100 μl von 1%igem Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Salzlösung über Nacht bei 4°C blockiert. Nach dreimaligem Umdrehen und Waschen der Platten mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,05, 30 mM NaCl, 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal-Waschpuffer wurden 100 μl jedes Mausserums, verdünnt mit Phosphatpufferlösung, in eine Vertiefung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Umdrehen und Waschen der Platten mit Waschpuffer wurde Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Meerrettichperoxidase (Verbindung in Beispiel 10 (100 μl, 0,5 ng/ml) hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach Umdrehen und dreimaligem Waschen der Platten mit Waschpuffer wurde Tetramethylbenzidin(TMB)-Substrat mit H₂O₂ hinzugefügt, und die Schalen wurden abgedeckt 30 min. lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die optische Dichte wurde auf einem Spektralphotometer bei 450 nm abgelesen. Wie in Tabelle I dargestellt, hatten fünf der fünf Mäuse Antikörper, die für Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Meerrettiperoxidase (Verbindung in Beispiel 10) reaktiv waren. TABELLE 1

MAUS # VERDÜNNUNG^a O.D.

6902 1/300 0,199

6903 1/100 0,231

6904 1/500 0,412

6905 1/100 0,121

6906 1/300 0,321

Hintergrund – 0,076

^a Verdünnung von Maus-Seren in PBS

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass Maus 6904 die meisten Antikörper gegen die Verbindung in Beispiel 10 produzierte. Hybridomzellen wurden mit Standard-Methodik erzeugt. Nach einer Splenektomie einer Maus, die immunisiert und dreimal mit der Verbindung in Beispiel 4 erneut geimpft worden war, wurden Milzzellen zur Erzeugung von Hybridomzellen mit SP20-Zellen verschmolzen. Die Hybridomzellen wurden unter Anwendung eines ELISA-Assays wie unten kurz beschrieben auf die Produktion von Antikörpern hin bewertet, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind.
Mikrotiter-Platten (Immunolon I) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (10 μg/ml in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2) beschichtet. Die Platten wurden umgedreht und über Nacht bei 4°C mit 100 μl von 1%igem Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) blockiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit 0,2 × PBS gewaschen worden waren, die 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurden 100 μl jedes Hybridomzellen-Überstands in eine Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit 0,2 × PBS gewaschen worden waren, die 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurde die Verbindung in Beispiel 22 (100 μl, 0,17 μM) hinzugegeben und 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit 0,2 × PBS gewaschen worden waren, die 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurden Streptavidin oder Avidin hinzugegeben, das an Meerrettichperoxidase (100 μl, 0,2 μg/ml) konjugiert war, und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang im Dunkeln inkubiert. Nachdem die Schalen umgedreht und dreimal mit 0,2 × PBS gewaschen worden waren, die 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurden TMB-Substrat und H₂O₂ hinzugefügt, und die Platten wurden 30 min. lang abgedeckt bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die optische Dichte wurde auf einem Spektralphotometer bei 450 nm abgelesen. Die Ablesung einer optischen Dichte von 0,25–3 weist auf spezifische Antikörperbindung hin. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass die Hybridomzellen von Vertiefung P4G1 positiv für die Bindung an die Verbindung in Beispiel 22 und daher spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind. TABELLE 2 Screening auf monoklonale Antikörper, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind

VERTIEFUNG OPTISCHE DICHTE

P3H4 0,120

P4H5 0,105

P4G1 1,940
Die Hybridomzelllinie in P4G1 wurde geklont durch Einschränkung der Verdünnung und wird als Hybridomzelllinie, RAP-42-OVAF₂#1hc- bezeichnet. In einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (FPIA) wurde Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit 5-Glycinylfluoreszeinamin (Beispiel 23a) als Tracer bei einer Konzentration von 10 nM verwendet und wies eine Polarisierung von 77 mP in 100 mM Natriumphosphat pH 7,5 auf. Nach Hinzugeben eines Überschusses von FKBP12 betrug die Polarisierung 195 mP, während das Hinzugeben eines Überschusses von RAP-42-OVAF2#1MoAb 84 mP ergab. Das Ring-geöffnete nicht enzymatisch umgewandelte Produkt des oben genannten Tracers (Secorapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäurekonjugat mit 5-Glycinylfluoreszeinamin; Beispiel 24) wurde auf einer TLC-Platte isoliert (50 Chloroform:4 Methanol:0,5 Essigsäure; migrierte am langsamsten von drei Komponenten).
Die Rapamycin- und Secorapamycin-Fluoreszein-Derivate in den Beispielen 23 und 24 wurden charakterisiert durch Darstellung ihrer Bindung an FKBP12 und RAP-42-OVAF2#1 MoAb. Bei Hinzufügen von 0,01 μg FKBP12 zu 1,00 ml 10 nM Rapamycin-Fluoreszein stieg die Fluoreszenz-Polarisation von 57 mP auf 148 mP an, während die Fluoreszenz-Polarisation des Secorapamycin-Fluoreszein-Derivats von 49 mP nur auf 58 mP anstieg, was eine deutlich schwächere Bindung des Seco-Derivats anzeigte. Bei Hinzugabe von 5 μg/ml RAP-42-OVAF2#1 MoAb zu dem Rapamycin-Derivat betrug die Fluoreszenz-Polarisation unverändert 58 mP, während die Secorapamycin-Derivat-Fluoreszenz-Polarisation von 44 mP auf 136 mP anstieg. Dies zeigt, dass sich RAP-42-OVAF2#1 MoAb spezifisch an das Secorapamycin-Fluoreszein-Derivat, aber nicht an seinen Rapamycin-Fluoreszein-Vorläufer bindet.
Die Spezifität der zwei Systeme wurde auch in einem Assayformat verdeutlicht. Zu 500 μl 10 μg/ml RAP-42-OVAF2#1 wurde Rapamycin oder Secorapamycin gegeben, um Endkonzentrationen im Bereich von 0 bis 100 nM zu ergeben. Die Hinzugabe von 500 μl 20 nM Secorapamycin-Fluoreszein resultierte in einer Fluoreszenz-Polarisation von 124 mP in Abwesenheit von Analyt, 120 mP in Anwesenheit von 100 nM Rapamycin und 74 mP in Anwesenheit von 100 nM Secorapamycin. Secorapamycin-Analyt hemmt so die Bindung des Secorapamycin-Fluoreszein-Derivats an RAP-42-OVAF2#1, während Rapamycin keine Auswirkung hat. Im umgekehrten Experiment wurde zu 500 μl 0,02 μg/ml FKBP12 Rapamycin oder Secorapamycin gegeben, um Endkonzentrationen im Bereich von 0 bis 100 nM zu ergeben. Das Hinzufügen von 500 μl 20 nM Rapamycin-Fluoreszein resultierte in einer Fluoreszenz-Polarisation von 128 mP in Abwesenheit von Analyt, 61 mP in Anwesenheit von 100 nM Rapamycin und 122 mP in Anwesenheit von 100 nM Secorapamycin. Hier hemmte Rapamycin die Bindung, während Secorapamycin keine Auswirkung hatte.
Ein zweiter Antikörper mit der Bezeichnung 34-294-163MoAb, der spezifisch für Rapamycin ist, wurde hergestellt wie folgt. Eine weibliche, 6–8 Wochen alte, RBF/DnJ-Maus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) wurde immunisiert mit Rapamycin, das an der 42-Position mit einem Hemisuccinat-Linker (bezeichnet als RAPA-42-HS-BSA), der in Freundschem Adjuvans (Difco, Detroit, Michigan) emulgiert war, an Rinderserumalbumin konjugiert war. Die primäre Immunisierung wurde vollzogen mit vollständigem Freundschen Adjuvans, und anschließende Auffrischungen mit unvollständigem Freundschen Adjuvans. Das Tier-Wiederholungsimpfungs-Intervall für dieses langfristig immunisierte Tier war in den Wochen 1, 3, 9 und 19, wobei die entsprechende Dosierung 50, 25, 25 und 100 μg pro Tier jedes Mal an zwei subkutanen Stellen betrug. Dem Tier wurde eine 14-wöchige Ruhephase gegönnt, bevor 3 Tage vor der Fusion der Milz eine 5 μg-Präfusions-Wiederholungsimpfung verabreicht wurde.
Am Tag der Fusion wurde die Maus durch eine schnelle Hals-Dislokation euthanasiert, und die Milz wurde entfernt. Die Splenozyten wurden einmal in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (GIBCO, Grand Island, New York) gewaschen und 10 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Die pelletierten Splenozyten wurden mit SP2/0-Myelomzellen (Dr. Milstein, Cambridge, Vereinigtes Königreich) in einem Verhältnis von 1:1 kombiniert, in IMDM gewaschen und zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und 1 ml 50%iges Polyethylenglykol (PEG) (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) wurde über einen Zeitraum von 1 Minute zum Pellet gegeben, während das Pellet durch Klopfen und Schwenken vorsichtig dispergiert wurde. Dreißig ml IMDM wurden zu der Mischung gegeben und zentrifugiert wie oben beschrieben. Überstand wurde dekantiert, das Pellet wurde in IMDM mit Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin (HAT) (GIBCO) und 10% Fötalem Rinderserum (Fetal Bovine Serum, FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) erneut suspendiert. Um die Fusionshäufigkeit zu verbessern, wurden 0,5% Salmonella typhimurium-Mitogen v/v (STM; RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana) und 1% v/v ORIGEN (Igen, Rockville, Maryland) zu der Fusionszellsuspension gegeben, mit welcher Gewebekulturplatten à 96 Vertiefungen beschichtet wurden.
Das primäre Screening der Fusion fand an Tag-10-konfluierenden Kulturen statt. Ein EIA wurde verwendet, um Anti-Rapamycin-Reaktivität in den Überstands-Proben zu erfassen. Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit 100 μl einer 2 μg/ml-Lösung von 42-HS-BSA in Phosphat-gepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) beschichtet und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 1 Stunde lang mit 200 μl von 3%igem Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) in PBS pro Vertiefung blockiert. Nach dreimaligem Waschen der Platten mit destilliertem Wasser wurden 100 μl überstehender Kulturflüssigkeit pro Vertiefung hinzugegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, und 100 μl Ziegen-Anti-Maus-IgG + M-HRPO-Konjugat (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland), verdünnt in der Blockierlösung, wurden pro Vertiefung für eine Inkubationszeit von 30 Minuten in die Platte gegeben. Die Platte wurde ein letztes Mal gewaschen, und die Farbentwicklung verwendete O-Phenylendiamin:2HCl (OPD) (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Die relative Intensität von Ablesungen optischer Dichte identifizierte das Hybrid 34-294 mindestens 5-mal so oft wie beim Blindproben-, normalen Mausserum (NMS) (Organon Teknika-Cappel, Malvern, Pennsylvania), und das Hybrid wurde als Kandidat zum Klonen und zur weiteren Bewertung ausgewählt.
Das Hybrid #34-294 wurde durch Begrenzung der Verdünnungen von 1–100 auf 1–100.000 geklont. Das verwendete Klonierungsmedium war IMDM mit 10% v/v FBS und 1% v/v HT-Zusatz (GIBCO). Eine 200-μl-Zellsuspension wurde in jede der 96 Vertiefungen in der Gewebekulturplatte gegeben.
Klon #34-294-163 (bezeichnet als 34-294-163hc) wurde zur weiteren Bewertung ausgewählt, basierend auf zusätzlichem EIA-Screening des Klon-Überstands konfluierender Kulturen. Das verwendete EIA-Screening-Protokoll wurde oben beschrieben.
Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers, der von den mit 34-294-163 bezeichneten Zelllinien sezerniert wurde (bezeichnet als 34-294-163MoAb), wurde auf einem Maus-monoklonal-Antikörper-Isotyp-Kit, RPN 29 (Amersham Life Science, Arlington Heights, 11) bestimmt. Der Assay wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, und die Ergebnisse lieferten einen Isotyp von IgG1, leichte kappa-Kette.
Die Verbindungen in den Beispielen 12 und 13 können in einem Assay für den Nachweis polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind, verwendet werden wie unten beschrieben.
Mikrotiter-Platten (Immunolon I) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (10 μg/ml in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2) beschichtet. Die Platten wurden umgedreht und über Nacht bei 4°C mit 100 μl von 1%igem Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Salzlösung blockiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit Waschpuffer gewaschen worden waren, wurden 100 μl von Kaninchenserum, verdünnt 1:5 in Phosphat-gepufferter Salzlösung, in eine Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit Waschpuffer gewaschen worden waren, wurde Rapamycin 42-Ester mit 3-[3-(4-Iminobutyl thio)succinimidyl]phenacylglycinkonjugat mit Meerrettichperoxidase (Verbindung in Beispiel 12) (100 μl, 0,5 ng/ml) oder Rapamycin 42-Ester mit (N-(3-Carboxyphenyl)-3-thiosuccinimidyl)glycinkonjugat mit Meerrettichperoxidase (Verbindung in Beispiel 13) (100 μl, 0,5 ng/ml) hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit Waschpuffer gewaschen worden waren, wurde TMB-Substrat mit H₂O₂ hinzugefügt, und die Platten wurden abgedeckt 30 min. lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
Die optische Dichte wurde auf einem Spektralphotometer bei 450 nm ausgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. TABELLE 3 Vergleich von Anti-Rapamycin-Antikörperspiegeln bei Kaninchen, die mit der Verbindung in Beispiel 3 immunisiert wurden, im Vergleich zu Naive Rabbits (Kaninchenart), unter Anwendung eines Erfassungs-ELISA-Assays

Vorentnahme A450 (3. Entnahme-Vorentnahme)

Kaninchen Nr. Beispiel 10 Beispiel 10 Beispiel 12 Beispiel 13

81 0,119 0,713 0,217 0,114

89 0,136 0,037 0,026 0,020
Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass die Verbindungen in den Beispielen 12 und 13 verwendet werden können, um Antikörper, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind, in einem Säugetier nachzuweisen, wie bei Kaninchen Nummer 81 zu sehen ist.

Das Folgende ist ein Beispiel für die Messung von Rapamycin-Konzentrationen unter Anwendung eines Konkurrenzhemmungs-Assays für Rapamycin mit einem ELISA-Format mit Hilfe eines Rapamycin-spezifischen Antikörpers. Mikrotiter-Platten (Immunolon I) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (10 μg/ml in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2) beschichtet. Die Platten wurden umgedreht und über Nacht bei 4°C mit 100 μl von 1%igem Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Salzlösung blockiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit Waschpuffer gewaschen worden waren, wurde der oben beschriebene Rapamycin-spezifische Antikörper (100 μl von 1 μg/ml) in jede Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur 1–4 Stunden lang inkubiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit Waschpuffer gewaschen worden waren, wurde Rapamycin 31,42-bis(hemiglutarat)kanjugat mit Meerrettichperoxidase (100 μl, 0,5 ng/ml) hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nachdem die Platten umgedreht und dreimal mit Waschpuffer gewaschen worden waren, wurde TMB-Substrat hinzugefügt, und die Platten wurden abgedeckt 5 min. lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die optische Dichte wurde auf einem Spektralphotometer bei 450 nm abgelesen. Ergebnisse der Konkurrenz zwischen Rapamycin und Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Meerrettichperoxidase-Bindung an Maus-Seren sind in Tabelle 4 dargestellt. Aus diesen Ergebnissen kann eine Standardkurve erstellt werden, und die Konzentration von Rapamycin in einer Probe kann bestimmt werden. TABELLE 4

Freies Rapamycin	Optische Dichte x 1000			% Hemmund
	1	2	Avg
10 μM	158	158	158	74,1
5	182	194	188	69,2
0,5	304	322	313	48,6
0,05	494	501	498	18,4
0,005	528	546	537	11,9
0,0005	601	611	606	0,6
0	583	636	610	–

Die Verbindung in Beispiel 11 (Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycin) kann durch das in Beispiel 12 angewandte Verfahren entschützt (um Rapamycin-42-Ester mit Glycin zu ergeben) und an eine feste Matrix konjugiert werden. Sie kann sich an Antikörper binden, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind, wie sie in manchen Teststreifen-Immunoassay-Verfahren verwendet werden, oder um Rapamycin bindende Proteine zu isolieren. Das folgende Beispiel zeigt, dass 803 Resonanzeinheiten (resonance units, RU) der Verbindung in Beispiel 11 unter Verwendung des BIAcore-Standard-Protokolls auf der Grundlage von EDC und NHS, die in einem BIAcore verwendet werden, auf einer festen Matrix immobilisiert werden können. Diese Matrix band 1401 RUs von Rapamycin-spezifischem Antikörper. Die Kinetik der Assoziation und Dissoziation wurde für jede getestete Konzentration von Antikörper (0,625; 1,25; 2,5; 5,0; 10,0 μg/ml) bestimmt. Diese Daten zeigen, dass die Verbindung in Beispiel 11, selbst wenn sie an eine Matrix gebunden war, für die Bindung durch einen Ring-geöffneten Rapamycin-spezifischen Antikörper zur Verfügung stand, und die Interaktion konnte charakterisiert werden. Ähnliche Verfahren können eingesetzt werden, um ein Rapamycin bindendes Protein an entschützten Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycin-konjugierter Matrix zu binden. Diese Matrix kann auch zur Isolation von neuen Bindungsproteinen verwendet werden, wie vom Fachmann praktiziert wird. Entschützter Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycin kann verwendet werden, um Bindungsproteine des Rapamycin-FKBP-Komplexes durch eines der folgenden Verfahren zu isolieren. Bei einer Vorgehensweise werden Gewebe oder Zelllysate, welche die entsprechenden Proteaseinhibitoren enthalten, mit FKBP inkubiert, das mit einem entschützten Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycin-konjugierter Matrix inkubiert wurde, über einen ausreichenden Zeitraum, um die Bindung zu ermöglichen. Verschiedene Puffer werden verwendet, um die Proteine fortzuspülen, die unspezifisch gebunden sind. Proteine werden freigesetzt durch das Hinzufügen zusätzlicher Puffer, welche die Bindung zwischen dem Rapamycin-Nukleus-FKBP und den Bindungsproteinen aufspalten.
Die Hybridomzelllinie, RAP-42-OVAF₂#1hc, wurde unter den Bedingungen des Budapest-Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklaven Drive in Rockville, Maryland, 20852, USA, am 10. März 1994 hinterlegt und erhielt die Zulassungsnummer HB 11568.
Die Hybridomzelllinie 34-294-163hc wurde ebenfalls unter den Bedingungen des Budapest-Vertrags bei der ATCC am 6. April 1994 hinterlegt und erhielt die Zulassungsnummer HB 11606.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung verschiedener Rapamycin-Derivate. Beispiel 21 ist ein Rapamycin-Derivat, das zur Erzeugung eines Rapamycin-Konjugats gemäß der Erfindung an antigene Träger konjugiert werden kann. Die anderen Beispiele sind nicht Beispiele gemäß der Erfindung, werden jedoch für Vergleichszwecke oder zur Verdeutlichung synthetischer Verfahren geliefert.
Beispiel 1
Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure
1,1 g (11 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 400 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden zu einer gerührten Lösung aus 5 g (5,5 mmol) Rapamycin und 880 μl Pyridin in 15 ml Methylenchlorid gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt, mit Methylenchlorid verdünnt und mit drei 50-ml-Portionen von 1 N HCl gewaschen. Die organische Schicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert, was das Rohprodukt ergab. Reines Material wurde gewonnen durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit vertauschten Phasen mit 55% Acetonitril/Wasser als Eluent, was 1g (18%) der Titelverbindung ergab. Spektraldaten sind: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) 4,650 (m, 1H, H₂COC=O), 4,168 (d, 1H, H₂COH), 2,795 (s, 4H, OC=OCH₂CH₂C=O).
Beispiel 2
Rapamycin-42-Ester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemisuccinat))
21 mg (0,098 mmol) DCC und 12 mg (0,098 mmol) N-Hydroxysuccinimid wurden in eine gerührte Lösung aus 100 mg Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure in 3 ml Ethylacetat gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und in vacuo konzentriert und ergab so das Rohprodukt. Reines Material wurde gewonnen durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit vertauschten Phasen mit 80% Acetonitril/Wasser als Eluent, was 75 mg (69%) der Titelverbindung ergab. Spektraldaten sind: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) 4,650 (m, 1H, H₂COC=O), 4,168 (d, 1H, H₂COH), 2,951 (m, 2H, OC=OCH₂), 2,795 (m, 4H, OC=OCH₂CH₂C=O), 2,705 (m, 2H, OC=OCH₂); MS (neg.ion FAB) 1110 (M^–), 1056, 1012, 913, 148 (100).
Beispiel 3
Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit Schlüssellochschnecken-Hämocyanin
197 mg Schlüssellochschnecken-Hämocyanin in 6 ml von 0,05 M Phosphatpuffer wurden in eine gerührte Lösung von 37 mg Rapamycin-42-Ester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemisuccinat)) in 3 ml von 1,4-Dioxan gegeben, und die Reaktion wurde 3 Tage lang bei 4°C rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde dann 24 Stunden lang bei 4°C in 1500 ml von 0,05 M Phosphatpuffer dialysiert, um die Titelverbindung zu ergeben, die ohne weitere Reinigung verwendet werden konnte. Die Anzahl von Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Anteilen pro Schlüssellochschnecken-Hämocyanin betrug ungefähr 42:1.
Beispiel 4
Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit Ovalbumin
197 mg Ovalbumin in 6 ml von 0,05 M Phosphatpuffer wurden zu einer gerührten Lösung aus 37 mg Rapamycin-42-Ester mit (N-Hydroxysuccinimid-(hemisuccinat)) in 3 ml von 1,4 Dioxan gegeben, und die Reaktion wurde 3 Tage lang bei 4°C rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde dann 24 Stunden lang bei 4°C in 1500 ml von 0,05 M Phosphatpuffer dialysiert, um die Titelverbindung zu ergeben, die ohne weitere Reinigung verwendet werden konnte.
Beispiel 5
Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit Meerrettichperoxidase
16 mg Meerrettichperoxidase in einer Lösung aus 0,4 ml von 1,4 Dioxan und 0,4 ml von 0,5%igem Natriumbicarbonat wurden zu 1 mg Rapamycin-42-Ester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemisuccinat)) in 40 μl von 1,4 Dioxan gegeben, und die Reaktion wurde 2,5 Stunden lang bei 4°C rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde dann 24 Stunden lang bei 4°C in 1500 ml von 0,05 M Phosphatpuffer dialysiert, um die Titelverbindung zu ergeben, die ohne weitere Reinigung verwendet werden konnte.
Beispiel 6
Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure
Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 angewandt wurde.
Beispiel 7
Rapamycin-31,42-Diester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemiglutarat))
Zu einer Lösung von 15,9 mg Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure in 160 μl Dimethylformamid wurden 3,65 mg N,N-Dimethylaminopropylethylcarbodiimid und 1,8 mg N-Hydroxysuccinimid gegeben. Die Reaktionsmischung wurde rühren gelassen, bis die Reaktion abgeschlossen war, in Wasser gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in vacuo konzentriert, um die Titelverbindung zu ergeben, die bei 4°C in 0,1 N Natriumphosphatpuffer gelagert und ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Beispiel 8
Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Schlüssellochschnecken-Hämocyanin
Zu 20 mg Schlüssellochschnecken-Hämocyanin in 2 ml von 0,1 M NaHCO₃ wurden 55 μl Rapamycin-31,42-Diester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemiglutarat)) bei 0°C in 10-μl-Schritten über einen Zeitraum von 30 min. gegeben. Die Lösung wurde leicht geschüttelt, bis die Reaktion abgeschlossen war, bei 6000 U/min 20 min. lang zentrifugiert, und nicht konjugiertes Ausgangsmaterial wurde von der Titelverbindung auf einer G-25-Säule mit Phosphatpufferlösung getrennt. Das Konjugat wurde zu 50% mit Glycerol gemischt und bei –70°C gelagert. Die Anzahl von Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Anteilen pro Schlüssellochschnecken-Hämocyanin lag im Bereich von 17–45:1.
Beispiel 9
Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Ovalbumin
Zu 20 mg Ovalbumin in 2 ml von 0,1 M NaHCO₃ wurden 55 μl Rapamycin-31,42-Diester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemiglutarat)) bei 0°C in 10-μl-Schritten über einen Zeitraum von 30 min. gegeben. Die Lösung wurde leicht geschüttelt, bis die Reaktion abgeschlossen war, 20 min. lang bei 6000 U/min zentrifugiert, und nicht konjugiertes Ausgangsmaterial wurde von der Titelverbindung auf einer G-25-Säule mit Phosphatpufferlösung getrennt. Das Konjugat wurde zu 50% mit Glycerol gemischt und bei –70°C gelagert.
Beispiel 10
Rapamycin-31,42-Diester mit Glutarsäure-Konjugat mit Meerrettichperoxidase
Zu 10 mg Meerrettichperoxidase in 1 ml von 0,1 M NaHCO₃ wurden 105 μl Rapamycin-31,42-Diester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemiglutarat)) in 10-μl-Schritten über einen Zeitraum von 30 min. gegeben. Die Lösung wurde leicht geschüttelt, bis sie abgeschlossen war, bei 6000 U/min 20 min. lang zentrifugiert und von einer G-25-Säule mit Phosphatpufferlösung eluiert. Das Konjugat wurde zu 50% mit Glycerol gemischt und bei –20°C gelagert.
Beispiel 11
Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycin
Zu einer gekühlten (0°C) Lösung von Rapamycin (0,73 g, 0,08 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) wurden 0,6 g (1,19 mmol) von N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycinpentafluorphenylester gegeben, gefolgt von Pyridin (0,85 ml, 10,5 mmol) und Dimethylaminopyridin (18 mg, 0,14 mmol), um eine heterogene Lösung zu bilden, die bei Erwärmung auf Raumtemperatur homogen wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Ein großer Überschuss von EtOAc wurde hinzugefügt. Die organische Schicht wurde mit 0,5 N HCl (2×) und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, um einen gebrochen weißen Schaum zu liefern. Flashchromatographie (30–50% Hexan/EtOAc) ergab die Titelverbindung in 71%iger Ausbeute (0,679 g, 0,57 mmol). Mass spec (negatives Ion FAB) M^– bei m/z 1192.
Beispiel 12
Rapamycin-42-Ester mit 3-[3-(4-Iminobutylthio)succinimidyl]phenacylglycin-Konjugat mit Meerrettichperoxidase
Zu einer Lösung aus Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)-carbonyl]glycin (10 mg, 8,4 μmol) in Acetonitril (84 μl) wurden 10 μl Diethylamin (in Acetonitril bei 0,84 M) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten lang gerührt, und das Lösungsmittel wurde mit einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde in Acetonitril (100 μl) aufgelöst und mit Hexan gewaschen (5-mal, 200 μl), gefolgt von Konzentration des Lösungsmittels mit einem Stickstoffstrom. Der resultierende Rapamycin-42-Ester mit Glycin wurde in einer Lösung von m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS) (2 mg) in DMF (200 μl) aufgenommen und zwei Stunden lang bei 4°C inkubieren gelassen, gefolgt von der Hinzugabe von 50 nM Ethanolamin (20 μl) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Meerrettichperoxidase (5 mg) und Kaninchen-IgG (10 mg) wurden mit 2-Iminothiolan behandelt und mit Sephadex G-25 gereinigt, gefolgt von der Hinzugabe des MBS-Rapamycin-Glycinester-Addukts. Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 gereinigt, um die Titelverbindung zu liefern.
Beispiel 13
Rapamycin-42-Ester mit (N-(3-Carboxyphenyl)-3-thiosuccinimidyl)glycin-Konjugat mit Meerrettichperoxidase
Zu einer Lösung von Rapamycin-42-Ester mit N-[9H-Fluoren-9-ylmethoxy)-carbonyl]glycin (10 mg, 8,4 μmol) in Acetonitril (84 μl) wurden 10 μl Diethylamin (in Acetonitril bei 0,84 M) ge geben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten lang gerührt, und das Lösungsmittel wurde mit einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde in Acetonitril (100 μl) aufgelöst und mit Hexan gewaschen (5-mal, 200 μl), gefolgt von Konzentration des Lösungsmittels mit einem Stickstoffstrom. Der resultierende Rapamycin-42-Ester mit Glycin wurde in einer Lösung von N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (2 mg) in DMF (200 μl) aufgenommen. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang und dann bei 4°C über Nacht gerührt. Eine Lösung von Hydroxylamin-HCl (7 mg in 50 μl DMF) wurde zu der Lösung der Rapamycin-Reaktionsmischung gegeben, eine Stunde lang inkubiert, gefolgt von der Hinzugabe von MBS-Meerrettichperoxidase-Addukt und MBS-Kaninchen-IgG, um die Titelverbindung zu ergeben, die durch Sephadex G-25-Gelfiltration gereinigt wurde.
Beispiel 14
Rapamycin 1,3, Diels-Alder-Addukt mit Diethylazodicarboxylat
Rapamycin (1g, 1,093 mmol) und Diethylazodicarboxylat (0,381 g, 2,187 mmol) wurden in Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und bei 65°C über Nacht erhitzt, TLC zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war. Die Mischung wurde auf einer Silikagelsäule unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, um einen weißen Feststoff (0,750 g) zu ergeben, der mit Hexan verrieben und luftgetrocknet wurde, um die Titelverbindung (0,666 g) als Pulver zu ergeben.
Anal Calc for C₅₇H₈₉N₃O₁₇: C, 62.91; H, 8.24; N, 3.86. Found: C, 62.81; H, 8.12; N, 3.91
IR (KBr, cm^–1) 3450, 1720
NMR (CDCl₃) δ 6.15 (m, 1H), 5.20 (d, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 0.9 (t, 3H), 0.72 (q, 1H)
MS (-FAB) 1087 (M^–)
Beispiel 15
Rapamycin 1,3, Diels-Alder-Addukt mit Phenyltriazolindion
Rapamycin (0,66 g, 721 mmol) wurde in Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und auf 0°C gekühlt. Dazu wurde tropfenweise eine Lösung von Phenyltriazolindion (0,133 g, 758 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, TLC zeigte, dass die Reaktion nicht abgeschlossen war. Zusätzliches Phenyltriazendion (0,025 g, 27 mmol) wurde hinzugefügt. Die Reaktion wurde unter Anwendung von HPLC (4,1 × 31 cm, SiO₂) mit Ethylacetat als Eluent gereinigt, um die Titelverbindung als Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde mit 30 ml Hexan und 1 ml Ethylacetat verrieben, filtriert und luftgetrocknet, um die Titelverbindung als Pulver zu ergeben (0,383 g).
Anal Calc for C₅₉H₈₄N₄O₁₅: C, 65.05; H, 7.77; N, 5.14. Found: C, 65.39; H, 7.98; N, 4.92
IR (KBr, cm^–1) 3450, 1715
NMR (DMSO) δ 7.50 (m, 3H), 7.40 (m, 2H), 3.11 (s, 3H), 3.00 (s, 3H) 2.95 (s, 3H), 0.8 (q, 1H).
MS (-FAB) 1088 (M^–)
Die folgenden sind repräsentative Beispiele für fluoreszierende Rapamycin-Derivate, die über einen Linker an die 31-Position von Rapamycin konjugiert werden können.
Beispiel 16
42-Dansylrapamycin
Rapamycin (200 mg, 0,22 mmol) in trockenem Pyridin (2 ml) wurde auf 0°C gekühlt und mit Dansylchlorid (840 mg, 3,1 mmol) behandelt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in kaltes 2N HCl (30 ml) gegossen und mit Ethylacetat (4 × 25 ml) extrahiert. Das Ethylacetat wurde in einen Pool getan und mit Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde auf Silika mit 25%igem Ethylacetat in Benzen chromatographiert. Dies ergab 150 mg der Titelverbindung als gelbes Pulver, Smp. 101–104°C.
Beispiel 17
Rapamycin-42-Ester mit Pyren-Butansäure
Rapamycin (459 mg, 0,5 mmol) und Pyren-Butansäure (216 mg, 0,75 mmol) wurden in THF/CH₂Cl₂ (10 ml, 1:1) aufgelöst. 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (146 mg, 0,67 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (15 mg) wurden zu der Lösung gegeben. Die Reaktion wurde über einen Zeitraum von 15 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit 5%igem HCl, dann Salzlösung, gewaschen. Die Lösung wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und zu einem Feststoff verdampft. Der Feststoff wurde auf eine 3-mm-Silikagel-Chromatronplatte aufgetragen, die mit 50%igem Ethylacetat in Hexan eluiert wurde, um 180 mg der Titelverbindung als Schaum zu liefern. Die Reaktion lieferte auch 100 mg von 31,42-di-verestertem Rapamycin.
IR (KBr, cm^–1) 3420, 1740
NMR (CDCl₃) d 8.3 (d, 1H), 8.14 (dd, 2H), 8.10 (d, 2H), 7.85 (d, 1H), 3.34 (s, 3H), 3.30 (s, 3H). 3.11 (s, 3H)
MS (-FAB) 1183 (M^–)
Die folgenden sind repräsentative Beispiele für Rapamycin-Derivate, die durch die oben beschriebenen Verfahren an antigene Träger konjugiert oder mit einem anderen Linker verbunden und dann konjugiert werden können.
Beispiel 18
Rapamycin-42-Carbomethoxymethylether und Rapamycin-42-bis(Carbomethoxymethylether)
Rapamycin (2,0 g, 2,187 mmol) und Rhodium(II)-acetat (0,37 g, 0,08 mmol) wurden in Benzen auf Rückfluss erhitzt und über einen Zeitraum von 10 Minuten mit einer Lösung aus Ethyldiazoacetat (500 ml) in Benzen (10 ml) behandelt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und über Nacht gerührt. TLC zeigte, dass die Reaktion nicht abgeschlossen war. Zwei zusätzliche Portionen Ethyldiazoacetat (3 ml) wurden in Abständen von 24 Stunden hinzugefügt. Die Mischung wurde konzentriert und mit Ethylacetat durch Flashchromatographie über Silika gereinigt. Dies lieferte den 42-Monoether (1 g) und den 31,42-Diether (0,850 g) als Öle. Der 42-Monoether wurde in einer Mischung aus Hexan, Ethylacetat und Dichlormethan über das Wochenende verrieben, um das Produkt als Pulver zu liefern. Der Diether wurde durch HPLC auf einer Silikagelsäule mit Ethylacetat als Eluent gereinigt. Dies lieferte das Produkt als Feststoff.
Analysis Calc for C₅₅H₈₅NO₁₅: C, 66.04; H, 8.57; N, 1.40. Found: C, 65.29; H, 8.64; N, 1.60
IR (KBr, cm^–1) 3420, 1715
NMR (CDCl₃) d 4.82 (s, 1H), 3.41 (s. 3H), 3.33 (s, 3H), 3.13 (s, 3H), 1.28 (t, 3H), 0.70 (q, 1H).
MS (-FAB) 999 (M–)
Analytical data for the diether:
Analysis Calc for C₅₉H₉₁NO₁₇: C, 65.23; H, 8.44; N, 1.29. Found: C, 63.29; H, 8.40; N, 1.44
IR (KBr, cm^–1) 1740
NMR (CDCl₃) δ 6.36 (q, 2H), 5.24 (s, 1H), 3.39 (s, 3H), 3.32 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 0.65 (q, 1H)
MS (-FAD) 1085 (M^–)
Beispiel 19
Rapamycin-42-(4-nitrophenyl)carbonat und Rapamycin-31,42-bis(4-nitrophenyl)carbonat
Rapamycin (0,450 g, 0,49 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und auf 0°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden Pyridin (0,4 ml, 5,7 mmol) und ein Kristall von 4-Dimethylaminopyridin gegeben. Eine Lösung aus 4-Nitrophenylchlorformiat (0,3 g 1,49 mmol) in Dichlormethan (3 ml) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde in 0,1N HCl (5 ml) gelöscht, und die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und in vacuo verdampft, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Chromatographie über Silikagel mit 75%igem Ethylacetat in Hexan ergab 180 mg des 42-Monocarbonats und 47 mg des 31,42-Dicarbonats als gelbe Feststoffe.
Beispiel 20
42-O-(Phenoxythiocarbonyl)-Rapamycin
Rapamycin (1,030 g, 1,12 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan (100 ml) aufgelöst und auf 0°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden Pyridin (0,27 ml, 3,33 mmol) und ein Kristall von 4-Dimethylaminopyridin gegeben. Eine Lösung aus Thiophenylchlorformiat (0,47 ml 1,49 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde zur Reaktionsmischung hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde in 0,1N HCl (5 ml) gelöscht, und die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und in vacuo verdampft, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Chromatographie auf einer 4-mm-Silikagel-Chromatotronplatte mit einem Gradienten von 40% bis 70% Ethylacetat in Hexan ergab 520 mg der Titelverbindung als gelben Schaum.
Analysis Calc for C₅₈H₈₃NOS₁₄: C, 66.32; H, 7.97; N, 1.33. Found: C, 66.48; H, 8.05; N, 1.12
IR (KBr, cm^–1) 3420, 1715
NMR (CDCl₃) δ 7.41 (t, 1H), 7.25 (t, 2H), 7.12 (d, 1H), 3.45 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.13 (s, 3H)
MS (-FAB) 1049 (M^–)
Beispiel 21
Rapamycin-O-carboxymethyl-27-oxim
Zu einer Lösung aus 600 mg (650 μM) Rapamycin in 6 ml Methanol wurden bei Raumtemperatur 100 mg (1,2 mmol) wasserfreies Natriumacetat und 140 mg (660 μM) Carboxymethoxylaminhemihydrochlorid gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur war die Reaktion abgeschlossen. Die Reaktionsmischung wurde in vacuo konzentriert, und der Rückstand wurde mit Wasser verrieben. Die Feststoffe wurden filtriert und gründlich mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Hochvakuum getrocknet, um 575 mg (89,7%) eines weißen Feststoffs zu ergeben. ¹³C und ¹H NMR wiesen auf eine Mischung von E- und Z-Isomeren für das Oximderivat an Position 27 hin.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): 3.43 and 3.41 (2s, 3H, CH₃O), 3.30 (s, 3H, CH₃O), 3.18 and 3.12 (2s, 3H, CH₃O), 1.82 (s, 3H, CH₃C=C), 1.695 and 1.633 (2s, 3H, CH₃C=C); ¹³C NMR (CDCl₃, MHz): 215.8 (C=O), 211.5 (C=O), 194.5 (C=O), 191.0 (C=O), 172.5 (C=O), 169.0 (C=O), 168.5 (C=O), 167.0 (C=O), 161.5 (C=NOC), 160.0 (C=NOC), 140.0; MS (neg. ion FAB: 985 (M–H)^–, 590, 167, 128, 97, 75 (100%)
Analysis Calcd for C₅₃H₈₂N₂O₁₅·0.15 H₂O: C 63.90; H 8.40; N 2.81
Found: C 63.81; H 8.41; N 2.85
Die folgende Verbindung wurde bei der Erzeugung von Antikörpern verwendet, die spezifisch für Rapamycin oder ein Derivat davon sind.
Beispiel 22
Rapamycin-42-Ester mit Glycylbiotin
Zu einer Lösung von Biotin (0,83 g, 3,4 mmol) in 60 ml DMF wurden Glycin-t-butylesterhydrochlorid (0,57 g, 3,4 mmol), N-Methylmorpholin (0,92 ml, 8,36 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (0,61 g, 3,99 mmol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (0,65 g, 3,4 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 7 Tage lang gerührt. Das DMF wurde konzentriert, Ethylacetat wurde hinzugefügt, und die organische Schicht wurde mit Wasser, 0,5 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Salzlösung gewaschen. Die Ethylacetat-Schicht wurde getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, um tert-Butylglycylbiotin als weißen Feststoff zu ergeben, der auf TLC hauptsächlich ein Fleck war (0,611 g, 1,71 mmol, 50%). Mass spec [M+H]⁺ bei m/z 358.
Zu einer Lösung aus tert-Butylglycylbiotin (0,271 g, 0,758 mmol) in CH₂Cl₂ (0,5 ml) wurden 0,5 ml Trifluoressigsäure gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, konzentriert und mit wasserfreiem Diethylether verrieben. Das gebrochen weiße Präzipitat wurde gesammelt und ergab 0,209 g (0,694 mmol, 92%) Glycylbiotin. Mass spec [M+H]⁺ bei m/z 302.
Zu einer Lösung von Glycylbiotin (0,65 g, 2,16 mmol) in 1-Methylpyrrolidinon (5 ml) wurden 6 ml CH₂Cl₂ gegeben, was zur Bildung eines Präzipitats führte, welches selbst nach der Hinzugabe von 0,33 ml (2,36 mmol) Triethylamin fortbestand. Zu dieser heterogenen Lösung wurden 2 g (2,19 mmol) Rapamycin, 0,43 g (2,24 mmol) von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid und 30 mg (2,46 mmol) DMAP gegeben. Nach mehreren Stunden wurde die Reaktionsmischung homogen und wurde weitere vier Tage gerührt. Ein großer Überschuss von Ethylacetat wurde hinzugefügt, und die organische Schicht wurde mit Wasser, 0,5 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄) und konzentriert. Der hellgelbe Schaum wurde mit heißem wasserfreiem Diethylether verrieben, um 1,2 g unreine Titelverbindung als hellgelben Feststoff zu ergeben. Eine Portion (0,5 g) dieses Materials wurde in 5%igem MeOH/CHCl₃ einer Flashchromatographie unterzogen und erneut in heißem Ether verrieben, um 87 mg der Titelverbindung, verunreinigt mit einer geringen Menge Rapamycin, zu ergeben. Dieses Material wurde erneut chromatographiert (Gradient 0–5% MeOH/CHCl₃) und ein letztes Mal mit Ether verrieben, um 34 mg (0,028 mmol) reine Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben. Mass spec, negatives FAB M^– bei m/z 1196.
Beispiel 23
a) Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit 5-Glycinylfluoreszeinamin
Zu 4,2 mg 5-Glycinylfluoreszeinamin, aufgelöst in 200 μl Methanol, das 10 μl Triethylamin enthielt, wurden 4 mg der Verbindung in Beispiel 2 gegeben. Nach 2 Stunden wurde ein Teil der Mischung auf eine Silika-Dünnschicht-Chromatographie-Platte aufgetragen und mit 100 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol, 1 Teil Essigsäure entwickelt. Nach dem Trocknen wurde das die Bande enthaltende Produkt von der Platte gekratzt, und das Produkt wurde aus der Silika mit Methanol eluiert. Das Produkt wurde charakterisiert durch die Änderung der Fluoreszenz-Polarisation wässeriger Lösung bei Hinzugabe von FKBP12.
b) Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit 5-Aminomethylfluoreszein
Durch Anwendung des Verfahrens in Beispiel 23a wurde die Titelverbindung hergestellt, indem 5-Glycinylfluoreszein durch 2,5 mg 5-Aminomethylfluoreszein ersetzt wurde.
c) Rapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit 4'-Aminomethylfluoreszein
Durch Anwendung des Verfahrens in Beispiel 23a wurde die Titelverbindung hergestellt, indem 5-Glycinylfluoreszein durch 1,1 mg 4'-Aminomethylfluoreszein ersetzt wurde. Das Dünnschicht-Chromatographie-Lösungsmittel war zu 100 Teilen Chloroform, zu 8 Teilen Methanol und zu 1 Teil Essigsäure.
Beispiel 24
Secorapamycin-42-Ester mit Bernsteinsäure-Konjugat mit 5-Glycinylfluoreszeinamin
Ein Teil des Produkts in Beispiel 23 wurde auf eine Silika-Dünnschicht-Chromatographie-Platte aufgetragen und mit einer Mischung aus 50 Teilen Chloroform, 4 Teilen Methanol und 0,5 Teilen Essigsäure eluiert. Drei bewegliche fluoreszente Banden wurden beobachtet, wobei unverändertes Ausgangsmaterial den höchsten Rf-Wert hatte und die Titelverbindung den niedrigsten Rf-Wert hatte. Die Silika, die das gewünschte Produkt enthielt, wurde von der Platte gekratzt, und die Titelverbindung wurde mit Methanol eluiert. Das Produkt wurde charakterisiert durch die Änderung der Fluoreszenz-Polarisation einer wässerigen Lösung bei Hinzugabe von RAP-42-OVAF2#1 MoAb.
Beispiel 25
a) Rapamycin-42-Ester mit Adipinsäure
Rapamycin-42-Ester mit Adipinsäure wurde durch eine Variation des Verfahrens in Beispiel 2 hergestellt. Adipinsäureanhydrid wurde hergestellt durch Kombination von 146 mg Adipinsäure in 1,0 ml Dimethylformamid mit 200 μl Dicyclohexylcarbodiimid und 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur. 300 μl des Überstands dieser Reaktion wurden zu 90 mg Rapamycin und 45 mg Dimethylaminopyridin, aufgelöst in 200 μl Methylenchlorid, gegeben. Nach 5 min. wurde die Mischung zentrifugiert, um präzipitiertes Material zu sedimentieren. Der Überstand wurde zwischen 3 ml Wasser mit 100 μl Essigsäure und 2 × 1 ml Methylenchlorid aufgeteilt. Die organischen Schichten wurden kombiniert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde in 1,0 ml Methanol und 0,5 ml Ethanol aufgelöst, in Eis gekühlt und durch Hinzufügen von 5 ml Wasser präzipitiert. Dieses wurde zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und der Rückstand in einem Vakuumexsikkator getrocknet, was 78 mg weißes Pulver ergab.
b) Rapamycin-42-Ester mit Adipinsäureester mit n-Hydroxysuccinimid
38 mg der Verbindung in Beispiel 25a, 38 mg von N-Hydroxysuccinimid und 40 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wurden mit 0,4 ml Dimethylformamid gemischt. Nach 60 min. wurden zusätzliche 40 mg Carbodiimid hinzugefügt. Nach weiteren 60 min. wurde die Mischung in Eis gekühlt, und 4 ml Wasser wurden unter Verwirbelung hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, durch erneute Suspendierung und zweifache Zentrifugation mit 5 ml Wasser gewaschen und in einem Vakuumexsikkator getrocknet, was 38 mg weißes Pulver ergab.
c) Rapamycin-42-Ester mit Adipinsäure-Konjugat mit 5-Glycinylfluoreszeinamin
2,3 mg 5-Glycinylfluoreszeinamin wurden aufgelöst in 200 μl Methanol durch Hinzugabe von 6 μl Triethylamin. 60 μl einer Lösung von 10,6 mg der Verbindung in Beispiel 25b in 200 μl Methanol wurden hinzugefügt. Nach 25 min. wurde die Mischung auf eine Silika-Dünnschicht-Chromatographie-Platte aufgetragen und mit einer Mischung aus 100 Teilen Chloroform, 12 Teilen Methanol und 1 Teil Essigsäure entwickelt. Die Silika, die das gewünschte Produkt enthielt, wurde von der Platte gekratzt, und die Titelverbindung wurde mit Methanol eluiert.
d) Rapamycin-42-Ester mit Adipinsäure-Konjugat mit 5-Aminomethylfluoreszein
Die Titelverbindung wurde hergestellt wie in Beispiel 25c, aber unter Verwendung von 2,6 mg 5-Aminomethylfluoreszein.
e) Rapamycin-42-Ester mit Adipinsäure-Konjugat mit 4'-Aminomethylfluoreszein
Die Titelverbindung wurde hergestellt wie in Beispiel 25c, aber unter Verwendung von 2,5 mg 4'-Aminomethylfluoreszein. Das Dünnschicht-Chromatographie-Lösungsmittel war zu 100 Teilen Chloroform, zu 4 Teilen Methanol und zu 2 Teilen Essigsäure.

Claims

Ein Rapamycin-Konjugat, dargestellt durch Formel I, oder ein Salz davon:
worin R¹ -OCH₂(CH₂)_qR⁴- ist; R⁴ gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carbonyl, -NH-, -S-, -CH₂- und -O-; q = 0–6; z von ungefähr 1 bis ungefähr 120 ist; und Träger ein antigenes Trägermaterial ist.
Das Rapamycin-Konjugat von Anspruch 1, worin die Formel I ein Rapamycin-O-carboxymethyl-27-oxim ist, das an das antigene Trägermaterial konjugiert ist.
Das Rapamycin-Konjugat von Anspruch 1, worin das antigene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlüssellochschnecken-Hämocyanin und Ovalbumin.
Das Rapamycin-Konjugat von Anspruch 2, worin das antigene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlüssellochschnecken-Hämocyanin und Ovalbumin.
Ein Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern in nicht menschlichen Wirten, das die Verwendung des Konjugats in Anspruch 1 umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 5, worin die Formel I ein Rapamycin-O-carboxymethyl-27-oxim ist, das an das antigene Trägermaterial konjugiert ist.
Das Verfahren von Anspruch 5, worin das antigene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlüssellochschnecken-Hämocyanin und Ovalbumin.
Das Verfahren von Anspruch 6, worin das antigene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlüssellochschnecken-Hämocyanin und Ovalbumin.