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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein immunmagnetisches Verfahren zum
Nachweis spezifischer Zielzellen in Zellpopulationen und Lösungen von
Zellpopulationen. Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit und eine Apparatur,
womit das Verfahren mit verschiedenen Zellpopulationen durchgeführt werden
kann.
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In
der Biologie, Biochemie und angrenzenden Fachgebieten werden dringend
Verfahren benötigt,
wobei chemische Einheiten aneinander gekoppelt werden. Solche Verfahren
werden für
die Erforschung von normalen und auch von abnormen Zellpopulationen
immer wichtiger. Insbesondere wenn feste Träger verwendet werden, können die
Zellen immobilisiert, nachgewiesen und isoliert sowie gereinigt
werden. Ferner kann der Zellgehalt durch eine Reihe komplizierter
Verfahren untersucht werden. Außerdem
ist es wichtig, daß die
Zellen in lebensfähigen
Formen isoliert werden können.
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Die
Affinitätsbindung
ist ein hochentwickeltes Verfahren, wodurch chemische/biochemische
Einheiten aneinander gekoppelt werden können. In einem solchen Verfahren
binden die Bindungspartner eines Paars, die z.B. an die zu verknüpfenden
Substanzen gekoppelt sind, aneinander, wenn sie miteinander in Kontakt
gebracht werden. Einer der Bindungspartner in einer solchen Verknüpfung kann
ein Molekül
auf der Zelloberfläche
darstellen. Verschiedene solche Bindungspartner-Systeme sind bekannt,
z.B. Antigen-Antikörper-,
Enzym-Rezeptor-, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Zellen und
die Biotin-Avidin-Bindung, von denen am häufigsten die Antigen-Antikörper-Bindung eingesetzt
wird.
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Wenn
solche Verfahren zum Isolieren spezifischer Zellen verwendet werden,
die noch weiter untersucht werden sollen, ist es erforderlich, daß die Zellen
ihre Funktion wieder aufnehmen können,
wenn man sie den ursprünglichen
Bedingungen aussetzt. Das ist nicht immer der Fall, auch wenn ein
Verfahren angewendet wird, bei dem physiologische Bedingungen bereitgestellt
werden, so daß die
isolierten spezifischen Zellen sich in ausreichender Zahl entwickeln
und sie weiter charakterisiert werden können.
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Verfahren
sind bekannt, wobei einer der Bindungspartner an einen unlöslichen
Träger
gekoppelt wird, z.B. an paramagnetische Partikel, und wobei die
Isolierung von Zielzellen in einer gemischten Zellpopulation als
eine negative Isolierung oder als eine positive Isolierung durchgeführt wird.
In einem negativen Isolierungsverfahren können die unerwünschten
Zellen aus dem Zellpräparat
entfernt werden, indem die Zellen mit Antikörper-beschichteten Partikeln
inkubiert werden, die für
die unerwünschten
Zellen spezifisch sind. Nach der Inkubation kann der Zellen-Antikörper-Partikel-Komplex
anhand der Partikel entfernt werden, so daß die gewünschten Zielzellen zurückbleiben.
Dieses Verfahren führt
häufig
zu keinem zufriedenstellenden Ergebnis, da die gewünschten
Zellen mehr oder weniger gereinigt in der Zellpopulation verbleiben
und da außerdem
der Zweck des Isolierungsverfahrens darin besteht, die spezifischen
Zielzellen zu untersuchen und/oder weitere Studien damit durchzuführen. Versuche
wurden unternommen, wobei Partikel für eine positive Isolierung
eingesetzt wurden, um die gewünschten
Zielzellen aus der gemischten Zellpopulation zu entfernen. Diese
Verfahren waren jedoch auf bestimmte Zielzellen gerichtet und sind
nicht für
alle Zielzellen-Systeme
geeignet. Kürzlich
wurde ein Verfahren zur positiven Isolierung vorgeschlagen, das
das Hapten/Anti-Hapten-Kopplungssystem umfaßt (WO 91/01368), hierbei handelt
es sich um ein Verfahren zum Verbinden von Zielzellen mit einem
unlöslichen
Träger,
indem die Fähigkeiten
von Hapten, Anti-Hapten-Antikörpern
und Anti-Zellen-Antikörpern
aneinander zu binden genutzt werden, so daß eine Verknüpfung zwischen
dem unlöslichen
Träger,
d.h. dem Partikel, und der Zielzelle, konstruiert wird, die mindestens
aus Hapten und Anti-Hapten-Antikörper
oder aus Kombinationen von Hapten und Anti-Hapten-Antikörpern und Anti-Anti-Hapten-Antikörpern oder
sekundären
Anti-Zellen-Antikörpern besteht.
Die spätere
Spaltung des Komplexes erfolgt, indem er wieder mit einem Hapten
oder einem Hapten-Analogon in Kontakt gebracht wird. Somit besteht
die konstruierte Bindungseinheit immer aus einem Hapten und zusätzlich aus
einem oder mehreren Elementen. Das Verfahren bezieht sich auf nicht-spezifizierte
Zielzellen und auf das Isolieren von Zielzellen und das Freisetzen
des unlöslichen
Trägers.
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Ferner
beschreibt WO 91/09938 die Verwendung einer Kombination aus positiver
und negativer Selektion zum Isolieren und möglicherweise Züchten spezifischer
Zellen, d.h. hämatopoetischer
Vorläuferzellen im
Knochenmark, wobei das Verfahren auf das Entfernen der Partikel
angewiesen ist. WO 92/04961 umfaßt ein Verfahren und eine komplizierte
Vorrichtung zum Abscheiden von Zellen oder verschiedenen Molekülen aus
einem nicht-magnetischen Testmedium unter Verwendung von kolloidalen
magnetischen Partikeln. In diesem Verfahren werden kleine (kleiner
als μm („sub micron")) Partikel eingesetzt,
da es erforderlich ist das Ausfällen
der Partikel in der Lösung
zu vermeiden, wobei für
dieses Verfahren eine komplizierte Apparatur benötigt wird, in der ein Mittel
zur magnetischen Verstärkung
im Testmedium immergiert wird. Dies kann eine ungünstige Wirkung
auf die Zellen haben.
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In „Application
of Magnetic Beads in Bioassays",
B. Haukanes und C. Kvam, Bio/Technology 11: 60–63, 1993, werden verschiedene
Verfahren beschrieben, wobei magnetische Partikel dazu verwendet
werden, um Tumorzellen aus Knochenmark zu entfernen, Lymphoidzellen
aus peripherem Blut zu isolieren und DNA, RNA und DNA-bindende Proteine
zu isolieren. Alle beschriebenen Verfahren weisen Spezifitäten auf, die
für den
vorliegenden Zweck zum Nachweis von ausschließlich Zielzellen ungeeignet
sind. Die vorstehenden Verfahren binden außer an die Zielzellen noch
an sonstige Zellen, dies ist auf eine Kreuzreaktivität und eine
unspezifische Anlagerung des Antikörper-Partikel-Komplexes zurückzuführen.
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Außerdem werden
eine Mehrschacht („multiwell")-Filtervorrichtung
für den
Test von Mengen im Mikroliter-Bereich (EP-A-0 098 534), ein Filterstreifen
und zusammengesetzte Einheiten zum Filtern von Mengen einer Flüssigkeit
im Mikroliter-Bereich (EP-A-0
339 769) und eine Testkassette beschrieben, die eine im wesentlichen
rechteckige Basisplatte, eine im wesentlichen rechteckige Deckplatte
und vier Seitenwände
aufweist (EP-A-0 131 934). Keine der vorstehenden Apparaturen kann
für den
vorliegenden Zweck verwendet werden, da bei ihnen die beschriebenen
Porengrößen zu klein
sind, um nur die Partikel-Zellen-Rosetten zurückhalten zu können, wie
es im vorliegenden Fall gewünscht
wird. Außerdem
sind die Filter nicht so gestaltet, daß mit ihnen mehrere Tests an
den zurückgehaltenen
Zellen durchgeführt
werden können,
ohne daß sie
aus dem Filtermedium entnommen werden müssen.
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Eine
einfache Verknüpfung
wird benötigt,
mit der eine Zielzelle an einen unlöslichen Träger gekoppelt werden kann,
wobei keine Verbindungen einer weniger spezifischen Hapten-Gruppe
beteiligt sein sollen, und die auf den Nachweis von spezifischen
Zielzellen gerichtet ist, wobei ein Minimum an unspezifischer Zellanlagerung
vorliegt, und die eine spätere
Spaltung zwischen dem unlöslichen
Träger
und der spezifischen Zielzelle unnötig macht.
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In
einer schwebenden Anmeldung durch einen der Anmelder (WO 94/07139,
angemeldet am 10. September 1993) wird ein Verfahren zum Nachweis
spezifischer Zielzellen für
diagnostische Zwecke beschrieben, bei dem es keine Probleme mit
einer unspezifischen Bindung an normale Zellen gibt. Hierbei handelt
es sich um empfindliche Nachweisverfahren für eine Vielzahl von Zelltypen,
so daß eine
große
Zahl von Zellen einfach unter dem Mikroskop abgesucht werden kann,
wobei die Verfahren schnell und einfach sind. Außerdem eignen sich die Verfahren
zum Isolieren von Zellen für
biochemische, biologische und immunologische Untersuchungen sowie
für die
Erforschung spezifischer Gene auf Nucleotid- oder Proteinebene,
ohne daß eine
Spaltung des Zellen-Partikel-Komplexes erforderlich ist. Jedoch
sind Verbesserungen erforderlich, z.B. sollte das Abtrennen der
Partikel-gebundenen Zielzellen in der Zielzellen-Suspension von
ungebundenen Kügelchen,
unspezifisch gebundenen sonstigen Zellen und ungebundenen sonstigen
Zellen verbessert werden, so daß es einfach
durchzuführen
ist, nicht viel Zeit erfordert und die Zielzelten-Partikel-Komplexe
so erhalten werden, daß weitere
Analysen damit durchgeführt
werden können,
z.B. mikroskopische Untersuchungen.
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Diese
Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt und
durch das Verfahren, die Apparatur und das Kit erläutert, und
sie sind in den beiliegenden Patentansprüchen dargestellt.
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Das
Verfahren zum immunmagnetischen Nachweis von Zielzellen in einer
gemischten Zellpopulation und in physiologischen Lösungen,
die Zellpopulationen enthalten, ist für den Nachweis geeignet, es
kann jedoch auch für
eine positive Isolierung von spezifischen Arten von sowohl normalen
als auch pathogenen Zellen eingesetzt werden. Das Verfahren stellt
eine Verknüpfung
zwischen einer spezifischen Zielzelle und einem paramagnetischen
Partikel her, die aus einem oder zwei Elementen besteht. Das Partikel
ist entweder mit einem Anti-Zellen-Antikörper murinen oder menschlichen
Ursprungs beschichtet, der gegen die spezifischen Antigen-Determinanten
in den Membranen der gewünschten
Zielzellen gerichtet ist, oder die Partikel sind mit einem polyklonalen
Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörper beschichtet, der an die
Fc-Teile des spezifischen Anti-Zellen-Antikörpers binden kann, der gegen
die Antigen-Determinanten in den Membranen der Zielzellen gerichtet
ist. Anstatt zum Beschichten der Partikel den polyklonalen Anti-Maus/Anti-Mensch-Antikörper zu
verwenden, kann auch ein monoklonaler Anti-Maus/Anti-Mensch-Antikörper der
Ratte eingesetzt werden. Bei Verwendung dieses letzteren Antikörpers kann,
teilweise aufgrund seines monoklonalen Ursprungs, eine spezifischere
Bindung an den Anti-Zellen-Antikörper
erhalten und die Gefahr möglicher
Kreuzreaktionen mit anderen Zellen in Lösungen wie Blut reduziert werden.
Außerdem
kann die Spezifität
des Verfahrens entscheidend gesteigert werden, wenn die Inkubation
der Zellsuspension mit einem milden Detergens und/oder einem zweiten Satz
von Antikörpern
oder Antikörperfragmenten
erfolgt, die vorher mit fluoreszierenden Mitteln, Metallkolloiden,
Radioisotopen, Biotin-Komplexen oder bestimmten Enzymen, die eine
Sichtbarmachung erlauben, markiert oder nicht damit markiert wurden.
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Ferner
wird das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung deutlich verbessert und vereinfacht, indem die Suspension
der Zielzellen-Partikel-Komplexe in die Filtervorrichtung für Zellen
oder den Zellabscheider gemäß der vorliegenden
Erfindung überführt wird
und die Gesamtzahl der Zielzellen unter dem Mikroskop bestimmt wird.
Zeichnungen
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1.1 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform
der Filtervorrichtung für
Zellen oder des Zellabscheiders, die teilweise zusammengesetzt ist.
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1.2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer anderen
Ausführungsform
des Zellabscheiders, die teilweise zusammengesetzt ist.
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2 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Version der Mehrschacht-Anordnung („multiwells") des Zellabscheiders,
wobei das Membranfilter von den Multiwells abgenommen ist.
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4 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Version der Vorrichtung einer
Kulturschale mit Deckel für
die Mehrschacht-Anordnung des Zellabscheiders und/oder das Membranfilter.
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4a zeigt
eine Seitenansicht der Mehrschacht-Anordnung in der Kulturschale.
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5 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Version des Filtratsammelbehälters des
Zellabscheiders.
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6 zeigt
Melanom-Partikel-Zielzellen-Komplexe, die auf einer Filtervorrichtung
für Zellen
unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens eingefangen wurden.
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Im
Folgenden ist eine genauere Beschreibung des Verfahrens dargestellt,
wobei Krebszellen als Zielzellen für den Nachweis, die Abscheidung
und die mögliche
Isolierung verwendet werden. Das Verfahren ist jedoch nicht auf
Krebszellen beschränkt,
und die Beschreibung soll das Verfahren keinesfalls auf diesen bestimmten
Anwendungsbereich einschränken,
denn das Verfahren ist für
einen weiten Bereich von zytologischen Forschungsgebieten geeignet.
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Bei
der Behandlung von Krebspatienten ist die Bestimmung des Stadiums
der Krankheit („Staging") für die Wahl
der richtigen Therapie für
den jeweiligen Patienten von größter Wichtigkeit,
wobei festgestellt wird, ob der Krebs lokalisiert vorliegt oder
ob eine metastatische Ausbreitung auf andere Gewebe erfolgt ist.
Bösartige
Zellen verbreiten sich durch ein direktes Eindringen in das umgebende
Gewebe, über
die Lymphgefäße oder
durch ein Verteilen von Tumorzellen mit dem Blut auf entfernte Organe,
einschließlich
Knochenmark, Zentralnervensystem und zerebrospinale Flüssigkeit.
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Der
Nachweis von metastatischen Tumorzellen beruhte bis vor kurzem auf
morphologischen Verfahren, wobei licht- und elektronenmikroskopische
Untersuchungen von biopsierten Tumorproben, von Abstrichen von Knochenmark
und peripherem Blut sowie von Objektträgern durchgeführt wurden,
die nach der Zyto-Zentrifugation verschiedener Körperflüssigkeiten angelegt wurden.
Seit der Einführung
von monoklonalen Antikörpern,
die Antigene erkennen, die hauptsächlich auf der Oberfläche verschiedener
Zelltypen von bösartigen Zellen
exprimiert werden, wurden metastatische Zellen in zunehmendem Maße auch
durch Verfahren der Immunzytochemie und Immunfluoreszenz identifiziert.
Hierfür
wurden die aus biopsierten Tumorproben nach der Zyto-Zentrifugation hergestellten
Objektträger
mit monoklonalen Antikörpern
behandelt und deren Bindung an die Tumorzellen kolorimetrisch oder
durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Für das letztere Verfahren ist
ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich, alternativ kann eine Zellsuspension
hergestellt und ein Durchflußzytometer
verwendet werden.
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Die
früheren
Verfahren haben den Nachteil, daß sie eine eingeschränkte Empfindlichkeit
und/oder Spezifität
aufweisen, außerdem
sind sie normalerweise arbeits- und
zeitaufwendig, wobei auch ein großes Maß an Erfahrung erforderlich
ist. Für
durchflußzytometrische
Untersuchungen ist außerdem
eine teure Apparatur nötig.
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Die
morphologischen Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in Blut und
Knochenmark sind weniger empfindlich als Verfahren, die Immunzytochemie
und Immunfluoreszenz umfassen. Dabei sind die letzteren Verfahren
jedoch in Fällen
ungeeignet, wenn die Tumorzellen weniger als 1% der Gesamtzahl der
kernhaltigen Zellen darstellen. Mit der Durchflußzytometrie kann man eine bessere
Empfindlichkeit erhalten als mit den mikroskopischen Verfahren,
jedoch ist hierfür
eine hohe Zellzahl erforderlich, und außerdem können verschiedene technische
Schwierigkeiten auftreten. So kann es durch die Aggregation von
Zellen zu Problemen kommen, und außerdem ist es mit dem Verfahren
nicht möglich,
zwischen markierten Tumorzellen und unspezifisch fluoreszierenden
normalen Zellen zu unterscheiden.
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Die
Erfindung ermöglicht
einen sehr empfindlichen Nachweis von z.B. metastatischen Tumorzellen,
da ein großes
Volumen und eine hohe Zahl von Zellen einfach unter dem Mikroskop
abgesucht werden kann und die daran gekoppelten magnetischen Kügelchen
leicht zu erkennen sind. Durch das beschriebene Verfahren und die
beschriebene Apparatur wird ein fester Träger und eine dauerhafte Vorrichtung
bereitgestellt, die einfach unter dem Mikroskop betrachtet werden
kann, ferner wird die Untersuchung und Quantifizierung der gesamten
Probe und nicht nur von kleinen Fraktionen davon möglich gemacht
und außerdem
können
für die
Analyse große
Probenvolumina eingesetzt werden, wobei die Vorrichtung auch anhand
der herkömmlichen
densitometrischen Technologie automatisch gescannt werden kann.
Die verwendeten monoklonalen Antikörper binden mit einer ausreichenden
Spezifität
an z.B. Tumorzellen und nicht an andere Zellen als die Zielzellen,
die in gemischten Zellsuspensionen, wie Blut, Knochenmark und in
anderen Tumormanifestationen vorliegen, so daß alle Zellen mit daran gekoppelten
Kügelchen
die Zielzellen darstellen. Außerdem
ist das Verfahren schnell und einfach und kann durch eine beliebige
Person durchgeführt
werden, die Zugang zu einem herkömmlichen Mikroskop
hat.
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Das
neue Verfahren umfaßt
die Bindung von monoklonalen Antikörpern, die z.B. murinen oder menschlichen
Ursprungs sind und die spezifisch Antigene erkennen, die auf Tumorzellen
und nicht auf den in Frage kommenden normalen Zellen vorliegen,
oder die für
andere Zwecke spezialisierte Subpopulationen von normalen Zellen
erkennen, an paramagnetische Partikel entweder direkt oder an Kügelchen,
die zuerst mit Antikörpern
beschichtet werden, die spezifisch die entsprechenden Antikörper oder
den Fc-Teil von IgG-Antikörpern
erkennen, die an die Tumorzellen binden. Die zellbindenden Antikörper können Antikörper des
IgG- oder IgM-Typs sein, oder sie können ein Fragment eines IgG-
oder IgM-Antikörpers
darstellen. Beispiele von verwendeten Anti-Zielzellen-Antikörpern können solche sein, die gegen
Gruppen von Antigen-Determinanten
gerichtet sind, z.B. CD56/NCAM-Antigen (MOC-1), Cluster 2-Epithel-Antigen (MOC31),
Cluster 2 (MW 40 kD)-Antigen (NrLuI0) (Myklebust et al., Br. J.
Cancer Suppl. 63: 49–53,
1991), HMW-Melanom-assoziiertes Antigen (9.2, 27) (Morgan et al.,
Hybridoma 1: 27–36,
1981), 80 kd, Sarkom-assoziiertes Antigen (TP1 & TP3) (Cancer Res. 48: 5302–5309, 1988),
Muzin-Antigene (Diel et al., Breast Cancer Res. Treatm., 1991) oder EGF-Rezeptor-Antigen
(425.3) (Merck), außerdem
der Anti-Pan-Mensch-Antikörper (Bruland
et al., unveröffentlicht),
der zum Nachweis von menschlichen Zellen unter tierischen Zellen
geeignet ist. Der Antikörper
425.3 ist gegen Antigene in sowohl normalen als auch bösartigen
Zellen gerichtet. Antikörper
können
außerdem
gerichtet sein gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren, z.B., den EGF-Rezeptor,
PDGF (A und B)-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, Insulin-ähnlichen
Rezeptor, Transferrin-Rezeptor,
die NGF- und FGF-Rezeptoren, die Gruppe von Integrinen, andere Adhäsionsmembran-Moleküle und MDR-Proteine,
sowohl in normalen Zellen als auch in abnormen Zellen, und gegen
Antigene, die auf Subpopulationen normaler Zellen vorliegen, außerdem gegen
onkogene Produkte, die auf den Membranen von normalen und bösartigen
Zellen und auf bösartigen
Zellen alleine exprimiert werden, z.B. Neu/erb B2/HER2. Bei den
bösartigen
Zellen kann es sich um Brust-, Ovar- und Lungenkarzinomzellen, Melanom-,
Sarkom-, Glioblastomzellen, Krebszellen des Gastrointestinaltrakts und
des retikuloentothelialen Systems handeln, oder die Zielzellen können mit
nicht-neoplastischen Krankheiten in Zusammenhang stehen, z.B. mit
kardiovaskulären,
neurologischen, Lungen-, Autoimmun-, gastrointestinalen, urogenitalen,
retikuloendothelialen Krankheiten oder anderen Störungen.
Ferner kann die bösartige Zellpopulation
im Knochenmark oder im peripheren Blut vorliegen, sie kann aus Pleura-
oder peritonealen Ergüssen
und anderen Körperflüssigkeiten,
wie Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit,
Sperma, Lymphe, oder von soliden Tumoren in normalen Geweben oder
Organen stammen, z.B. Leber, Lymphknoten, Milz, Lunge, Pankreas,
Knochengewebe, Zentralnervensystem, Prostata, Haut und Schleimhäute. Eine
vollständigere
Aufstellung der Antigen-Determinanten und der entsprechenden Antikörper oder
Antikörperfragmente,
die in dem vorliegenden verbesserten Verfahren verwendet werden,
findet sich in Tabelle 1 (vgl. Anhang). Die Zielzellen, die nachgewiesen
und abgeschieden werden sollen, sind nicht normale und bösartige
hämatopoietische
Zellen im Blut und Knochenmark.
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Methoden
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Das
Verfahren umfaßt
die direkte Kopplung der Antikörper
an die paramagnetischen Partikel, oder die Kopplung kann über die
Kopplung an Oberflächen-gebundene
Antikörper
erfolgen, wie polyklonale Anti-Maus-Antikörper, monoklonale Anti-Maus-Antikörper der
Ratte oder monoklonale Anti-Mensch-Antikörper, die spezifisch den Fc- Teil der jeweiligen
Antikörper
erkennen. Die mit Antikörpern
beschichteten paramagnetischen Kügelchen
werden sodann mit der zu untersuchenden Zellsuspension gemischt
und 5–10
Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 25°C, vorzugsweise
bei 4°C,
unter leichtem Rühren
inkubiert. Das vorliegende Verfahren kann auch in einer anderen
Reihenfolge der Schritte durchgeführt werden, wobei die freien
Zielzellen-Antikörper zu
der Zellsuspension zugegeben und 5–10 Minuten bis 2 Stunden,
vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 20°C, vorzugsweise bei 4°C, unter
leichtem Rühren
inkubiert werden. Die vorher mit Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörpern beschichteten
paramagnetischen Partikel werden sodann zu der wie vorstehend beschrieben
inkubierten Zellsuspension zugefügt
und die resultierende Suspension einer weiteren Inkubation von 5–10 Minuten
bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 25°C, vorzugsweise
bei 4°C,
unter leichtem Rühren
unterworfen. Das vorliegende Verfahren kann auch in einer geänderten
Anzahl von Schritten durchgeführt
werden, wobei die freien Zielzellen-Antikörper zu der Zellsuspension
gleichzeitig und zusammen mit den vorher beschichteten paramagnetischen
Partikeln zugegeben und einer Inkubation von 5–10 Minuten bis 2 Stunden,
vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 25°C, vorzugsweise bei 4°C, unter
leichtem Rühren
unterworfen werden. Die Zahl der zur Zellsuspension zugefügten Antikörperbeschichteten
Kügelchen sollte
zwischen dem 0,5- und 10-fachen Wert der Zahl der Zielzellen liegen.
Wenn diese Zahl unbekannt ist, sollte die zugegebene Menge der beschichteten
Kügelchen
1 bis 10% der Gesamtzahl der Zellen betragen. Für spezifische Zwecke und in
den Fällen,
wenn die Dichte der Zielzellen niedrig ist, z.B. bei bösartigen
Zellen, oder wenn die Zielzellen eine sehr kleine Fraktion der gesamten
Zellzahl darstellen (etwa 1%), können
die Zielzellen von den sonstigen Zellen in einem magnetischen Feld
positiv abgetrennt werden. Die isolierten Zielzellen in der Zellsuspension
können
sodann in eine Vorrichtung zur Zellzählung überführt werden, und die Zahl der
Zellen mit daran gekoppelten Kügelchen
kann unter dem Mikroskop bestimmt werden. Das vorliegende Verfahren
wird durchgeführt,
indem die isolierte Zielzellen-Suspension in die in dieser Anmeldung
beschriebene Filtervorrichtung für
Zellen überführt wird
und die Gesamtzahl der isolierten Zielzellen unter dem Mikroskop betrachtet
wird. Die in der Filtervorrichtung isolierten Zielzellen sollen
fixiert und gefärbt
werden, wodurch die Betrachtung unter dem Lichtmikroskop erleichtert
wird. Außerdem
können
die Zielzellen auf das Vorliegen von spezifischen biochemischen
und biologischen Merkmalen charakterisiert werden. Von besonderer
Wichtigkeit ist die Verwendung solcher Zellen für molekularbiologische Untersuchungen.
Im Gegensatz zu den vorstehend zitierten Verfahren nach dem Stand
der Technik ermöglicht
das vorliegende Verfahren Untersuchungen und die Züchtung der
Zielzellen, ohne daß die
Kopplung von paramagnetischem Partikel und Zielzelle aufgespalten werden
muß. Aus
mehreren Gründen
ist es von Interesse, spezifische Gene in einer reinen Population
von Zielzellen auf DNA-, mRNA- und Proteinebene zu untersuchen,
sowohl in Tumorbiopsien als auch in Tumorzellen, die im Blut, im
Knochenmark und in anderen Körperflüssigkeiten,
z.B. Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit, Sperma,
Lymphe, vorliegen oder die aus ansonsten normalen Geweben und Organen
stammen, z.B. Leber, Lymphknoten, Milz, Lunge, Pankreas, Knochengewebe,
Zentralnervensystem, Prostata, Haut und Schleimhäuten, sowie auf anderen Gebieten
der zytologischen Forschung. Bei den Verfahren nach dem Stand der Technik
gelten die Signale, die auf Southern-, Northern- und Western-Blots
erhalten werden, sowohl für
die normalen als auch für
die Tumorzellen in der Biopsie. Wenn dagegen zuerst eine Einzelzell-Suspension
aus dem Tumormaterial hergestellt wird und die Tumorzellen dann
positiv immunmagnetisch nachgewiesen und abgeschieden werden, würden die
an diesem Material durchgeführten
Genstudien nur die Ergebnisse der Zielzellen darstellen. Dies betrifft
auch z.B. bösartige
Zellen, die in Säugergeweben
vorliegen, z.B. in Knochenmark, peripherem Blut, Pleura- und peritonealen
Ergüssen
und anderen Körperflüssigkeiten,
z.B. Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit,
Sperma und Lymphe. Auch Untersuchungen, bei denen die Verfahren
der Polymerasekettenreaktion („polymerase
chain reaction",
PCR) eingesetzt werden, zeigen eine erhöhte Spezifität und Reproduzierbarkeit,
wenn sie mit den reinen Tumorzellpopulationen durchgeführt werden,
die durch das neue Verfahren erhalten werden.
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Die
Anwendung der neuen Verfahrensschritte kann abhängig von der zu untersuchenden
Gewebeart unterschiedlich sein.
- a) Das Gewebe
aus soliden oder Nadel-Tumorbiopsien wird mechanisch oder unter
milder enzymatischer Behandlung zu einer Einzelzell-Suspension zubereitet,
zu welcher die primären
spezifischen Antikörper oder
Antikörperfragmente
direkt oder nach Waschen der Zellsuspension mit Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
oder Kulturmedium mit oder ohne Serum, wie fetales Kälberserum,
Rinder-, Pferde-, Schweine-, Ziegen- oder menschliches Serum, zugegeben
werden.
- b) Wenn das Material eine Probe von Pleura- oder Asziteserguß, zerebrospinaler
Flüssigkeit,
Urin, Lymphe oder Körperflüssigkeiten
ist, wie z.B. Ergüssen
in den Gelenken von Patienten mit verschiedenen Formen von Arthritis,
erfolgt die Zugabe der spezifischen Antikörper oder Antikörperfragmente
zu den Proben entweder direkt oder nach einer Zentrifugation mit
oder ohne Waschen, bevor oder nachdem die Zellen in den Proben abzentrifugiert
und wieder in Suspension gebracht werden.
- c) Wenn das Material aus Blut oder Knochenmark-Aspirat besteht,
erfolgt die Zugabe der spezifischen Antikörper oder Antikörperragmente
zu den Proben entweder direkt oder nach Zentrifugation mit oder
ohne Waschen, bevor oder nachdem die Zellen in den Proben abzentrifugiert
und wieder in Suspension gebracht werden, oder eine Fraktion einkerniger
Zellen kann durch Gradientenzentrifugation auf z.B. „Lympho prep" vor dem Waschen,
dem Resuspendieren und dem Zugeben der geeigneten Antikörper oder
Antikörperfragmente
hergestellt werden.
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Die
Bedingungen des Verfahrens für
a) und b) stehen fest, wie aus den Ergebnissen der nachstehend beschriebenen
erfolgreichen Experimente ersichtlich ist.
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Für c) wurde
gefunden, daß die
Ergebnisse durch viele Faktoren beeinflußt werden, die in Einzelheiten untersucht
wurden. Hierzu zählen
die Antikörper-Konzentration,
das Verhältnis
der Zahl der paramagnetischen Partikel zu der Zellzahl, die Inkubationszeiten
und Volumina, die Art des Inkubationsmediums und der pH-Wert. Das
Verhältnis
der Partikel zu den einkernigen Zellen sollte in allen Experimenten
im Bereich von 0,5/1 bis 2/1 liegen, abhängig von der Bindungsaffinität der primären spezifischen
Antikörper
oder Fragmente.
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Ein
Hauptproblem war die unspezifische Kopplung von Partikeln, die entweder
mit Schaf- oder Ratten-Anti-Maus-Antikörpern alleine oder außerdem mit
den spezifischen Antikörpern
beschichtet waren, an normale Blut- oder Knochenmarkzellen. Experimente
haben gezeigt, daß die
unspezifische Bindung ohne das Vorliegen der spezifischen Antikörper gleich
hoch ist, dies macht deutlich, daß das Problem nicht durch eine Kreuzreaktivität, d.h.
indem Antikörper
mit normalen Zellen reagieren, verursacht wird. Die Möglichkeit,
daß die
weniger als optimale Spezifität
durch Ionenbindung verursacht werden könnte, wurde ausgeschlossen. Eine
andere Möglichkeit
bestand darin, daß Subpopulationen
von normalen Zellen der B-Linie sich an die Partikel-Antikörper-Komplexe anlagern
könnten.
Wenn die B-Zellen jedoch aus der Zellsuspension vor der Zugabe der
spezifischen Antikörper/Antikörper-Partikel-Komplexe
immunmagnetisch entfernt wurden, konnte auf diese Weise ihre Spezifität trotzdem
nicht verbessert weiden.
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Das
Problem mit dem Verfahren, das an isolierten einkernigen Fraktionen
aus Knochenmark und peripherem Blut angewendet wurde, das darin
bestand, daß möglicherweise
auch einige sonstige Zellen an die paramagnetischen Partikel binden,
wurde umgangen oder behoben. So wurde mit Schaf-Anti-Maus-Antikörper-beschichteten
Partikeln alleine oder zusammen mit spezifischen Antikörpern die
Zahl der Partikel, die sich unspezifisch an eine kleine Fraktion
von einkernigen Blut- oder Knochenmarkzellen anlagerten, von einem Durchschnitt
von 10 auf etwa 1 reduziert, und parallel dazu fiel die Fraktion
der normalen Zellen mit Partikeln von 1 bis 2% auf 0,5 bis 1% oder
weniger ab.
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Anhaltspunkte
wurden deutlich, daß die
Ursache des Problems in den hydrophoben Kräften liegen könnte, die
mit den an die paramagnetischen Partikel gebundenen Antikörpern zusammenhängen. Somit
werden die Verfahren zur Verminderung dieser Hydrophobie beansprucht.
Ein solches Verfahren besteht aus der Vor-Inkubation der Antikörper-beschichteten
Partikel und der Zellsuspension mit milden Detergentien in geeigneten
Konzentrationen, z.B. Tween 20TM in Konzentrationen
von weniger als 0,1% für
30 Minuten bei 4°C. Wenn
die Selektion der Zielzellen erforderlich ist, sollte die Zellsuspension
eine niedrige Konzentration des Detergens enthalten, z.B. 0,01%
Tween 20TM. In verschiedenen Experimenten
konnte durch dieses Verfahren das Problem der unspezifischen Bindung,
die bei den einkernigen Zellfraktionen aus Blut oder Knochenmark
auftrat, fast vollständig
behoben oder zumindest sehr stark abgeschwächt werden.
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Die
weitere Verbesserung, sofern sie erforderlich erscheint, kann zusammen
mit dem Detergens-Schritt wie folgt eingesetzt werden:
Nach
Inkubation der Zellsuspension mit den primären Antikörpern oder den Antikörperfragmenten
und den Antikörper-beschichteten
paramagnetischen Partikeln, wie vorstehend beschrieben, wird die
Zellsuspension mit einem zweiten Satz von Antikörpern oder Antikörperfragmenten
inkubiert, die gegen andere extrazelluläre oder gegen intrazelluläre Determinanten
der Zielzellen gerichtet sind, mit oder ohne Vorbehandlung mit Fixiermitteln für Zellen,
wie Formaldehyd oder Alkoholen. Diese Antikörper oder ihre Fragmente sollten
vorher mit fluoreszierenden Mitteln, Metallkolloiden, Radioisotopen,
Biotin-Komplexen oder Enzymen, wie Peroxidase und alkalischer Phosphatase,
markiert worden sein, so daß sie
durch bekannte Verfahren unter dem Mikroskop und/oder in einer geeigneten
Zählvorrichtung
sichtbar gemacht werden können.
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Die
Zielzellen werden durch das letztere Verfahren sichtbar gemacht
und weisen außerdem
auf ihrer Oberfläche
gebundene Partikel auf, somit können
sie gezählt
werden.
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Um
die Unterscheidung zwischen sonstigen Zellen und Zielzellen zu erleichtern,
kann die Zellsuspension oder ein Teil davon vor dem zweiten Sichtbarmachungs-Schritt
entweder einer Zytospin-Zentrifugation unterworfen werden, oder
Teile der Suspension werden an beschichtete Glasobjektträger gekoppelt,
worauf die Partikel-gebundenen Zellen sodann in einer dünnen Schicht
aufgebracht werden, so daß die
doppelt-„gefärbten" Zellen leichter
zu erkennen sind.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung erleichtert weiter die Unterscheidung zwischen den sonstigen
Zellen und den Zielzellen, umfaßt
die Verwendung der Filtervorrichtung für Zellen, wobei die gesamte
Zellsuspension nach den Schritten zur Selektion der Zielzellen direkt
in die Filtervorrichtung für
Zellen überführt werden
kann. Die freien ungebundenen Kügelchen,
die unspezifisch gebundenen sonstigen Zellen und alle ungebundenen
sonstigen Zellen werden durch das Filter durchlaufen, während die
gebundenen Zielzellen auf dem Filter verbleiben und sichtbar gemacht
werden können.
Das Filter mit den isolierten Zielzellen kann aus der Vorrichtung
entnommen und die Zellen sollen fixiert und gefärbt werden, wobei bekannte
immunhistochemische Verfahren eingesetzt werden können, sodann
kann die Betrachtung unter dem Mikroskop erfolgen. Nachdem das Filter
aus der Vorrichtung entnommen wurde, kann es wie ein herkömmlicher
mikroskopischer Objektträger
gemäß den bekannten
und üblichen
Verfahren der Immunhistochemie behandelt werden.
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Kits
wie in den Ansprüchen
23 und 24 werden bereitgestellt, die in dem Verfahren eingesetzt
werden sollen. Die Kits enthalten z.B. vorher beschichtete paramagnetische
Partikel, die für
jeden monoklonalen Antikörper
hergestellt werden können.
In einer anderen Ausführungsform
enthalten die Kits paramagnetische Partikel, die einerseits mit
einem IgG-Isotyp-spezifischen Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörper und
andererseits mit Antikörpern
beschichtet sind, die unterschiedliche Zielzellen, z.B. Tumorzellen,
betreffen. In einer dritten Ausführungsform
enthält
das Kit paramagnetische Partikel, die mit spezifischen Anti-Fc-Antikörpern beschichtet
sind, z.B. polyklonalen Anti-Maus- oder monoklonalen Ratten-Anti-Maus-,
oder Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörpern, die
an den Fc-Teil der Zielzellen-betreffenden Antikörper binden können, welche
an spezifische Anti-Zielzellen-Antikörper gebunden sind. In einer
vierten Ausführungsform
enthalten die Kits verschiedene Partikel mit paramagnetischer oder
nicht-magnetischer
Natur, die mit einem Zielzellen-Antigen oder einer Gruppe von Zielzellen-Antigenen beschichtet
sein können
oder nicht beschichtet sein können,
so daß diese
Partikel beim Durchlaufen des Verfahrens in der Filtervorrichtung
für Zellen
eingefangen werden, wodurch sie als Kontrolle wirken, indem sie
zeigen, daß alle
Aspekte der Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen in
dem Verfahren korrekt arbeiten. Diese Partikel können zu der Zellsuspension
in einem Stadium vorher oder während
des Verfahrens zugefügt
werden, oder die Partikel können
als eine getrennte „Zellsuspension" eingesetzt werden,
die genauso durch das gleiche Verfahren bearbeitet wird wie die
Zellsuspension, welche die abzutrennenden Zielzellen umfaßt. In einer
weiteren Ausführungsform
enthält
das Kit andere spezifische Antikörper
oder Antikörperfragmente,
die gegen Antigene/Rezeptoren innerhalb oder auf den gewünschten
Zielzellen gerichtet sind, wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente
an Peroxidase, alkalische Phosphatase oder andere Enzyme konjugiert
sind, und außerdem
die entsprechenden Substrate für
solche Enzyme, oder wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment
zusammen mit spezifischen Farben oder mit gebundenen Enzymen, wie
Peroxidase und alkalische Phosphatase, an nicht-paramagnetische
Partikel gebunden ist.
-
Apparatur
-
Das
neue Merkmal des Verfahrens betrifft eine Filtervorrichtung für Zellen,
die auch als ein Mehrschacht-Zellabscheider bezeichnet werden kann
und Teil des Kits ist, wie beschrieben wird. Die Vorrichtung betrifft
eine Mehrschacht-Zellabscheider-Anordnung,
die zum Auftrennen von gemischten Populationen von unterschiedlich
großen
Zellen verwendet wird, z.B. von Zellen, die im Blut oder im Knochenmark
vorliegen. Die resultierenden Zellen können direkt auf der Membran
unter dem Mikroskop oder in automatischen Scannern betrachtet werden.
Die vorliegende Erfindung kann in Kombination mit herkömmlichen
Zellisolierungs-Techniken anhand von magnetischen Partikeln eingesetzt
werden, wodurch ein schnelles, empfindliches und einfaches Verfahren
zum Absuchen von großen
Zahlen von Proben mit einem großen
oder kleinen Volumen auf das Vorliegen von Tumorzellen innerhalb
von einer bis vier Stunden bereitgestellt wird.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Filtervorrichtung für Zellen wie in Anspruch 19
definiert bereitgestellt.
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Der
Filtratsammelbehälter
und der Deckel können
aus einem Material bestehen, das für eine Sterilisation bei hohen
Temperaturen geeignet ist, oder sie können aus einem transparenten
oder undurchsichtigen Kunststoffmaterial bestehen, das von den Kunststoffartikeln
der Gewebekultur bekannt ist.
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Das
Membranfilter zum Abscheiden von Zellen kann an den Mikroschächten so
befestigt sein, daß es nach
dem Zellabscheidungs-Verfahren entnommen werden kann, wodurch die
Untersuchung erleichtert wird. Die Membran zum Abscheiden von Zellen
kann außerdem
eine Karte oder einen Kunststoffrahmen umfassen, wodurch die Untersuchung
nach dem Entfernen von den Mikroschächten erleichtert wird.
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Der
Filtratsammelbehälter
kann einen Rahmen umfassen, in welchen entnehmbare Streifen aus
mehr als einem Schacht eingesetzt werden können.
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Der
Filtratsammelbehälter
kann ähnlich
wie eine herkömmliche
96-Schacht-Platte
gebaut sein, wobei er entsprechend konstruiert ist, daß die Membran
zum Abscheiden von Zellen, der Sammelbehälter und das Anschlußteil für Unterdruck
untergebracht werden können.
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Die
Erfindung wird durch die folgende Beschreibung mit Bezug auf die
Figuren der beiliegenden Zeichnungen weiter erläutert, wobei eine Form der
Mikroschacht-Zellabscheider-Anordnung
gezeigt wird, die lediglich ein Beispiel darstellen soll.
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Mit
Bezug auf die 1 bis 5 der
Zeichnungen ist ersichtlich, daß die
Mikroschacht-Zellabscheider-Anordnung 20 aus einem Deckel
oder Überzug 21 und
einem Filtratsammelbehälter 22,
der ein Anschlußteil 23 für Unterdruck
aufweist, und außerdem
entnehmbaren Mehrschacht-Streifen 24 besteht, die mit einem abnehmbaren
Membranboden 25 mit einer Unterlage 25a versehen
sind.
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Die 1.1 und 1.2 zeigen
zwei alternative Ausführungsformen
der Erfindung, die teilweise zusammengesetzt sind.
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Der
Filtratsammelbehälter 22 kann
in gewisser Weise ähnlich
gebaut sein wie eine herkömmliche 96-Schacht-Platte
mit entnehmbaren Schacht-Streifen, wobei die Anordnung so erfolgen
kann, daß ein
oder mehrere Streifen von Schächten
hineinpassen.
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Die
Mehrschacht-Anordnung 24 kann wie dargestellt in Doppelstreifen
oder als einzelner Streifen oder als mehrere Streifen angeordnet
sein.
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Die
Mehrschacht-Anordnung 24 wird so in den Filtratsammelbehälter 22 eingesetzt,
daß nur
eine Ausrichtung möglich
ist, dies wird durch Führungszapfen 28 oder
Kerben 29 erreicht.
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Das
Membranfilter 25 zum Abscheiden von Zellen wird an der
Unterseite der Mehrschacht-Anordnung befestigt und bildet den Boden
der Schächte.
Das Membranfilter 25 wird so an der Unterseite der Mehrschacht-Anordnung 24 befestigt,
daß diese
voneinander getrennt werden können,
ohne daß das
Membranfilter 25 oder die Unterlage 25a des Membranfilters
verformt wird.
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Das
Membranfilter 25 kann unter dem Mikroskop betrachtet werden,
oder es kann durch ein densitometrisches oder ähnliches Verfahren gescannt
werden.
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Das
Membranfilter 25 umfaßt
Poren mit einer regelmäßigen und
gleichbleibenden Form und Größe und ist
eine Nylon-Monofilament-Membran, dieses Filter stellt den Boden
der einzelnen Schächte
dar und kann eine Porengröße von 5
bis 75 μm,
vorzugsweise 20 μm
aufweisen.
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Die
Mehrschacht-Anordnung 24 innerhalb des Filtratsammelbehälters 22 oder
ohne einen solchen kann auch aus einem für die Gewebekultur geeigneten
Material bestehen, das zur Auswertung in Scannern für herkömmliche
96-Schacht-Platten oder in Plattenlese-Apparaturen eingesetzt werden
kann.
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Die
Kulturschale 26 und der Kulturschalen-Deckel 27 können auch
aus einem für
die Gewebekultur geeigneten Material bestehen. Auf diese Weise ist
es möglich,
das Kulturmedium sowohl von oben in die Mehrschacht-Anordnung als
auch unten in die Kulturschale 26 einzufüllen.
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Alle
Größenangaben
in den Figuren stellen Beispiele dar, wobei die Vorrichtung 20 zum
Abscheiden von Zellen durch diese Angaben in keiner Weise eingeschränkt werden
soll. Außerdem
soll die Erfindung nicht auf das vorstehende Beispiel beschränkt sein,
vielmehr sind zahlreiche Variationen möglich, ohne daß vom Umfang
der Erfindung abgewichen wird. Das vorliegende Verfahren wird im
Folgenden durch Modellexperimente, Beispiele der Nützlichkeit
des neuen Verfahrens und Beispiele von praktischen Anwendungen erläutert. Diese
Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
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Modellexperimente
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1. Binden von Antikörper-Kügelchen-Komplexen
an Tumorzelllinien
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Die
Konzentrationen des Antikörpers
und die optimalen Bedingungen für
das Binden der Komplexe aus Antikörpern und paramagnetischen
Partikeln an die Tumorzellen wurden bestimmt, hierfür wurden
viele verschiedene Krebszelllinien eingesetzt. Die paramagnetischen
Kügelchen
wurden an die Zellen gebunden, indem entweder die spezifischen Antikörper an
Schaf-Anti-Maus-Antikörper
(SAM)-beschichtete paramagnetische Partikel angelagert wurden oder
indem die Zellen zuerst mit den spezifischen Antikörpern inkubiert
wurden, sie dann gewaschen wurden und anschließend eine zweite Inkubation
mit SAM-beschichteten Partikeln folgte. Die Ergebnisse dieser Experimente
sind in den Tabellen 2a und 2b dargestellt (siehe Anhang), in denen +
bedeutet, daß an
alle Zellen mehrere Kügelchen
gebunden sind, (+) bedeutet, daß entweder
eine geringere Anzahl von Kügelchen
an jede Zelle gebunden ist oder daß nicht alle Tumorzellen auf
ihrer Oberfläche
gekoppelte Kügelchen
aufwiesen, was bedeutet, daß keine
Bindung erfolgt ist, und (–)
zeigt eine sehr schwache Bindung an.
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2. Nachweis
von Tumorzellen in der einkernigen Fraktion von Knochenmark oder
peripherem Blut
-
Modellexperimente
wurden durchgeführt,
indem spezifische Antikörper
und SAM-beschichtete paramagnetische Partikel entweder zu den einkernigen
Zellen oder zu einer Zellsuspension zugefügt wurden, wobei eine unterschiedliche
Zahl von Krebszellen aus in vitro-gezüchteten Zelllinien zu den mononukleären Zellen
zugegeben wurde. In einigen Experimenten wurden entweder die einkernigen
Zellen oder die bösartigen Zellen
vorher mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt, so daß die zwei Zelltypen unterschieden
werden konnten. In allen Experimenten wurden nicht-bindende primäre Antikörper und/oder
Schaf-Anti-Maus-Antikörper-beschichtete
Kügelchen
getrennt als Kontrollen eingesetzt. Weitere Experimente wurden ohne
die Herstellung einer einkernigen Zellfraktion aus peripherem Blut
durchgeführt.
Dabei wurde gefunden, daß beim
Abscheiden von Zellen auf diese Weise das Ausmaß der unspezifischen Bindung
im Vergleich zu den durch „Lymphoprep" aufgetrennten Blutfraktionen
reduziert war.
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3. Abscheiden
und Sichtbarmachen von Antikörper-Kügelchen-Komplexen
mit Tumorzelllinien unter Verwendung der Filtervorrichtung für Zellen
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Die
Tumorzell-Suspensionen und die mit Blut oder Knochenmark-Suspensionen
gemischten fluoreszierend markierten Tumorzellen wurden zubereitet
und behandelt, wie in den Modellexperimenten 1 und 2 beschrieben,
und sie wurden auf die Filtervorrichtung für Zellen aufgetragen. Nach
dem Waschen, Fixieren und Färben
der Zellen auf dem Filter in der Vorrichtung wurde das Filter unter
dem Mikroskop betrachtet. Die Ergebnisse der Tumorzell-Suspension
alleine zeigten, daß die
Komplexe aus Antikörper-Kügelchen
und Tumorzellen eindeutig isoliert auf dem Filter vorlagen. Die
Ergebnisse der fluoreszierend markierten Tumorzell-Suspension zusammen
mit Blut oder Knochenmark zeigten, daß auch die Komplexe aus Antikörper-Kügelchen und
Tumorzellen eindeutig isoliert auf dem Filter vorlagen (6).
Weitere Experimente, mit denen die Empfindlichkeit des Verfahrens
getestet wurde, machten deutlich, daß unter Verwendung dieses Verfahrens
100 Tumorzellen nachgewiesen werden konnten, die gemischt in einer
Suspension von 107 Blut- oder Knochenmarkzellen
vorlagen.
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4. Wachstum der abgeschiedenen
Zellen. die unter Verwendung der Filtervorrichtung für Zeilen
isoliert wurden
-
Die
Tumorzell-Suspensionen wurden behandelt und isoliert, wie in den
Modellexperimenten 1 und 2 beschrieben, sie wurden auf eine Filtervorrichtung
aufgetragen und das Filter anschließend in einem halbfesten Medium
inkubiert, das in einem 20% Kälberserum
umfassenden Kulturmedium 0,3% Agarose enthielt. Die Zellen wurden
in einer Atmosphäre
von 5% CO2 bei 37°C inkubiert. Die Tumorzellen
zeigten die Fähigkeit
sich zu teilen und zu wachsen.
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In
verschiedenen Experimenten wurde eine gewisse unspezifische Bindung
an die einkernigen Zellen beobachtet, wobei gefunden wurde, daß sie nicht
mit der Art des spezifischen Antikörpers zusammenhing und daß sie mit
SAM-beschichteten Partikeln alleine genauso ausgeprägt auftrat.
Das Ausmaß dieser
unspezifischen Bindung variierte von fast 0% bis zu einem Wert zwischen
0,5 und 2%. Diese unspezifische Bindung konnte durch eine milde
Behandlung mit einem Detergens (Tween 20TM)
fast vollständig
verhindert werden, durch diese Behandlung wurde das Problem der
hydrophoben Wechselwirkungen der Zellen abgeschwächt.
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Beispiele der Nützlichkeit
des Verfahrens
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1. Nachweis
der mikrometastatischen neoplastischen Krankheit in Blut und Knochenmark
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Eine
frühe und
zuverlässige
Diagnose der Ausbreitung von Krebszellen auf das Blut und/oder das Knochenmark
gewinnt immer mehr an Bedeutung, um eine optimale Therapie auswählen zu
können,
die bei vielen Krebsarten, einschließlich der in Anwendungsbeispiel
1 beschriebenen Karzinome, zur Heilung führen kann. Ähnliche Verfahren wurden für das maligne
Melanom, Sarkom, Neuroblastom und verschiedene andere Krebserkrankungen
eingeführt,
oder sie sind in der Entwicklung.
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2. Nachweis von bösartigen
Zellen in Pleura- oder Aszitesergüssen und Urin
-
Die
Beschaffenheit solcher Ergüsse
kann ein wichtiges diagnostisches Problem darstellen, insbesondere
wenn eine geringe Zahl von Krebszellen zusammen mit normalen reaktiven
Zellen oder Epithelzellen vorliegt. In verschiedenen Fällen konnte
mit dem neuen Verfahren rasch eine eindeutige Diagnose gestellt
werden, und zwar in Fällen,
bei denen die herkömmliche
zytologische Untersuchung negativ oder nicht eindeutig war. Ähnlich vorteilhaft
war das Verfahren in Fällen
von Krebs der Nieren oder des Harntrakts und der Blase.
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3. Nachweis von neoplastischen
Zellen in der zerebrospinalen Flüssigkeit
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Seit
die systemische Behandlung vieler Krebsarten verbessert wurde, nimmt
die Häufigkeit
von Fällen von
Gehirnmetastasen mit Symptomen signifikant zu, weshalb der frühe Nachweis
einer solchen Ausbreitung immer wichtiger wird. Bei Verwendung des
neuen Verfahrens kann auch eine kleine Zahl von bösartigen
Zellen einfach identifiziert werden, so daß bereits in einem frühen Stadium
der intrakranialen Tumormanifestationen therapeutisch eingegriffen
werden kann.
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4. Diagnose von Krebs
in Biopsiegewebe
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Wenn
ein Krebs vermutet wird und Gewebebiopsien durch operative Verfahren
oder z.B. durch Nadelbiopsien erhalten werden, kann durch das neue
Verfahren, das mit den hergestellten Zellsuspensionen durchgeführt wird,
eine viel einfachere und schnellere Diagnose erfolgen als mit herkömmlichen
morphologischen oder immunhistochemischen oder zytochemischen Verfahren.
Durch die Verwendung der geeigneten Antikörper kann zwischen verschiedenen
möglichen
Krebsarten unterschieden werden.
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5. Identifizierung von
prognostischen Indikatoren
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Da
die Expression von verschiedenen Membranmolekülen bei etlichen Krebsarten
mit der Progression der malignen Erkrankung in Zusammenhang steht,
kann das vorstehende Verfahren zum Identifizieren von prognostischen
Indikatoren eingesetzt werden, wie z.B. in Anwendungsbeispiel 2
beschrieben wird.
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6. Identifizieren von
Zellen. die spezifische Krankheiten oder die Progression oder das
Stadium der Krankheit anzeigen
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Bei
verschiedenen Arten von rheumatoiden Erkrankungen (z.B. rheumatoider
Arthritis) und außerdem bei
allergischen, Autoimmun- und kardiovaskulären Leiden ist es für die Diagnose
und für
die Bestimmung des Stadiums der Krankheit wichtig, das systemische
oder lokale Vorliegen von spezifischen Subpopulationen von Zellen
zu identifizieren. Deshalb ist ein schneller Nachweis solcher Zellpopulationen
mit dem neuen Verfahren von großer
diagnostischer und therapeutischer Wichtigkeit.
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7. Nachweis von Subpopulationen
normaler Zellen
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Für verschiedene
Zwecke ist es wichtig, die Fraktion einer bestimmten Subpopulation
von normalen Zellen in einer Population nachzuweisen. Dies trifft
z.B. bei Leberbiopsien zu, wobei die Identifizierung von Zellen,
die das Gallenepithel-Antigen exprimieren, von Wichtigkeit sein
kann. Genauso kann die Identifizierung und Isolierung von spezifischen
Endothelzellen aus einer Zellsuspension, die aus verschiedenen normalen Geweben
hergestellt wurde, erforderlich sein.
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8. Isolierung und Wachstum
von selektierten Zellen
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Bei
vielen der vorstehend erwähnten
Zwecke ist es möglicherweise
erforderlich, daß für die Untersuchung
eine größere Population
von Zellen zur Verfügung
steht. Durch das vorliegende Verfahren unter Verwendung der Filtervorrichtung
für Zellen
können
die Bedingungen bereitgestellt werden, wodurch die positiv selektierten
Zielzellen vermehrt werden können,
ohne daß freie
ungebundene Partikel oder andere unspezifisch gebundene Zellen vorliegen.
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Verschiedene
der in den Abschnitten 1 bis 6 erwähnten Zellmembran-Moleküle können auch
als Ziele für
eine Immuntherapie eingesetzt werden, wobei unterschiedliche Arten
von aktivierten Killer-Zellen oder z.B. Immuntoxine eingesetzt werden.
Indem die Expression solcher Moleküle durch das neue Verfahren
identifiziert wird, kann bestimmt werden, in welchen Fällen solche
Therapieansätze
anzuraten sind.
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Beispiele einer praktischen
Anwendung von Teilen des Verfahrens oder des ganzen Verfahrens
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Beispiel 1
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Zur
Diagnose von verbreiteten Krebszellen im Blut und/oder im Knochenmark
in einem frühen
Stadium haben wir in dem neuen Verfahren die Anti-Karzinom-Antikörper MOC-31,
NrLuI0, BM2, BM7, 12H12 und MLuC1 eingesetzt, hierbei wurde bestimmt,
ob in solchen Körperflüssigkeiten
eine mikrometastatische Erkrankung an Brust-, Lungen-, Kolorektal-
und Prostatakrebs empfindlich identifiziert werden kann oder nicht.
Die mit diesen Antikörpern
erhaltenen erfolgreichen Ergebnisse haben signifikante Auswirkungen
auf die Klinik.
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Beispiel 2
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Bei
verschiedenen Krebsarten wurde gezeigt, daß die Expression vieler Zellmembran-Moleküle mit der
Progression der malignen Erkrankung in Zusammenhang steht. Durch
den Nachweis der Bindung solcher Moleküle an die entsprechenden Antikörper kann
somit eine Information von hohem prognostischem Wert erhalten werden.
Zu diesen Antigenen zählen
eine große
Zahl von Adhäsionsmolekülen, Kohlenhydrat-Antigenen, Glykolipiden,
Wachstumsfaktor-Rezeptoren und Karzinom-Markern, wie nachstehend
angeführt.
Wir haben mit dem neuen Verfahren die Bindung von Partikel-Antikörper-Komplexen
an CD44-Varianten, E-Cadherin, Leγ, CEA,
EGF-r, den Transferrin-Rezeptor, das MUC-1-Epitop, LUBCRU-G7-Epitop,
Prostatakarzinom-Antigen, UJ13A-Epitop, 2-Mikroglobulin, HLA-Antigene
und den Apoptose-Rezeptor identifiziert.
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Beispiel 3
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Zwei
Liter Pleuraerguß wurden
von einem Patienten erhalten, von dem vermutet wurde, daß er an
einem malignen Melanom litt. Nach der Zentrifugation wurden die
Zellen in einem Volumen von 2 ml RPMI mit 10% fetalem Kälberserum
suspendiert, mit dem Anti-Melanom-Antikörper 9.2.27 (10 g/ml) 30 Minuten
bei 4°C inkubiert,
gewaschen und mit DynabeadsTM SAM M450/IgG
2A erneut 30 Minuten bei 4°C
inkubiert. Die Zellsuspension wurde sodann unter dem Mikroskop untersucht,
wobei die Fraktion von Zellen bestimmt wurde, auf deren Oberfläche paramagnetische
Zellen gekoppelt waren. Die Diagnose eines malignen Melanoms wurde bestätigt, da
etwa 10% der Zellen eine signifikante Zahl von gebundenen Partikel-Rosetten
aufwiesen.
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Beispiel 4
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Biopsiertes
Gewebe wurde aus einem subkutanen Tumor entnommen, bei dem die klinischen
Zeichen entweder auf ein kleinzelliges Lungenkarzinom oder auf ein
malignes Melanom hinwiesen. Aus der Biopsie wurde eine Einzelzell-Suspension
hergestellt und diese in zwei Fraktionen aufgeteilt, eine davon
wurde mit dem Anti-Melanom-Antikörper 9.2
27 und die andere mit dem Anti-Karzinom-Antikörper MOC-31 inkubiert (beide
mit 10 g/ml). Die Inkubation wurde wie im vorstehenden Beispiel
durchgeführt.
Keine der mit dem Melanom-Antikörper
inkubierten Zellen band an Kügelchen,
wohingegen alle mit MOC-31 inkubierten Tumorzellen positiv waren.
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Beispiel 5
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Das
biopsierte Gewebe von einem Patienten, bei dem ein malignes Melanom
vermutet wurde, wurde untersucht, indem eine Einzelzell-Suspension
hergestellt, diese mit dem Anti-Melanom-Antikörper 9.2.27 inkubiert und anschließend das
Verfahren wie vorstehend durchgeführt wurde. Die meisten Zellen
waren positiv, wobei eine große
Zahl von Partikel-Rosetten an ihren Membranen gekoppelt vorlag.
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Beispiel 6
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Ein
Pleuraerguß von
einer Brustkrebspatientin wurde untersucht, wobei festgestellt werden
sollte, ob Tumorzellen in der Flüssigkeit
nachzuweisen waren. Ein Liter der Flüssigkeit wurde zentrifugiert,
die Zellen resuspendiert und in getrennten Gläschen mit jedem von drei verschiedenen
Anti-Karzinom-Antikörpern (MOC-31,
2E11, 12H12) inkubiert. Nach Abschluß des Verfahrens wurde wie
im vorstehenden Beispiel gefunden, daß die meisten Zellen in allen
drei Fällen
an die Antikörper-beschichteten
Partikel banden.
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Beispiel 7
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Eine
Knochenmark-Suspension, die von einer Brustkrebspatientin stammte,
wurde untersucht, wobei festgestellt werden sollte, ob möglicherweise
mikrometastatische Tumorzellen vorlagen. Nach der Herstellung von
einkernigen Zellen wurden diese mit den gleichen drei Anti-Karzinom-Antikörpern inkubiert,
die auch im vorstehenden Beispiele verwendet wurden, wobei in diesem
Fall die Antikörper
jedoch zuerst an DynabeadsTM SAM IgG-paramagnetische
Partikel gekoppelt wurden. Nach einer Inkubation mit diesen direkt
beschichteten Partikeln wurde die Zellsuspension unter dem Mikroskop
untersucht, wobei sich zeigte, daß eine große Zahl von Zellen positiv
war, bei denen mehrere Partikelrosetten an ihrer Membran gekoppelt
vorlagen. Ähnliche
Experimente wurder mit verschiedenen Pleura- oder Aszitesergüssen und
mit Knochenmark von Brustkrebspatientinnen durchgeführt.
-
Beispiel 8
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Die
menschlichen Brustkrebszellen T47D wurden verschiedene Zeitspannen
mit Hoechst-Fluoreszenz-Farbstoff inkubiert und die Lebensfähigkeit
der markierten Zellen ermittelt. Anschließend wurden unterschiedliche
Zahlen von markierten Brustkrebszellen zu 1 × 106 Knochenmarkzellen
zugefügt,
die von gesunden Freiwilligen erhalten worden waren. In unterschiedlichen
Experimenten wurden verschiedene Konzentrationen von paramagnetischen
monodispersen Partikeln (DynabeadsTM P450)
zugefügt,
die mit einzelnen Anti-Karzinom-Antikörpern (NrLuI0, MOC31 oder 12H12)
beschichtet waren. Nach 30 Minuten Inkubation auf Eis wurden Proben
der verschiedenen Teströhrchen
in einer Zählkammer
unter einem Licht- und Fluoreszenzmikroskop untersucht. Wenn das
Verhältnis
von Tumorzellen zu den kernhaltigen Zellen insgesamt niedrig war, wurde
die Zellsuspension einem magnetischen Feld ausgesetzt, und die Zellen
mit daran gekoppelten Partikeln wurden vor der Untersuchung unter
dem Mikroskop isoliert. Dabei wurde gefunden, daß bei einem optimalen Verhältnis von
1 bis 10 paramagnetischen Kügelchen
pro Tumorzelle in dem Zellgemisch alle Tumorzellen 2 bis 15 Kügelchen
gekoppelt an ihrer Oberfläche
aufwiesen. Die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens lag etwa bei
einer Zielzelle pro 104 kernhaltigen Zellen.
In Kontrollexperimenten mit markierten Tumorzellen unter Verwendung
von Antikörpern,
von denen bekannt ist, daß sie
eine gewisse Kreuzreaktivität
zu normalen Zellen aufweisen, wurde diese Kreuzreaktivität mit den
Antikörper-beschichteten
paramagnetischen Partikeln bestätigt.
In Experimenten mit Kügelchen,
die nicht mit Tumor-assoziierten Antikörpern beschichtet waren, band
keine der Zielzellen an die Kügelchen.
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Ähnliche
Experimente wurden sowohl mit anderen Brustkrebs-Linien als auch
mit einer kleinzelligen Lungenkarzinom-Zelllinie durchgeführt. In
diesen Experimenten wurden eine ähnliche
Empfindlichkeit und eine ähnliche
Spezifität
erhalten.
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Beispiel 9
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Pleura-
und Aszitesergüsse
von Patientinnen mit Brustkrebs und Ovarialkarzinom wurden zentrifugiert,
die gleichen beschichteten paramagnetischen Partikel wie in Beispiel
1 wurden zugefügt,
inkubiert und in einem Magneffeld eingeengt, anschließend wurde
die Suspension unter dem Lichtmikroskop untersucht. Typischerweise
wiesen Zellen, die eindeutige morphologische Merkmale von Tumorzellen
besaßen,
gekoppelte Kügelchen
auf, während
keine der wenigen normalen Zellen an die Antikörperbeschichteten Kügelchen
banden. In zwei Fällen
mit Pleuraerguß ergab
eine unabhängige
morphologische Untersuchung kein Vorliegen von Tumorzellen, wohingegen
unter Verewendung von Antikörper-beschichteten
Kügelchen
eine signifikante Zahl bösartiger
Zellen nachgewiesen wurde. In einigen Fällen wurden Tumorzellen in
einem magnetischen Feld abgeschieden und auf Gewebekulturflaschen überführt, die
ein speziell für
die Kultur von Brustkrebszellen hergestelltes Wachstumsmedium enthielten,
das Ziel dieses Vorgehens war, aus diesen Kulturen permanente Zelllinien
anzulegen. Gleichzeitig wurden Zellen von malignen Ergüssen direkt
ohne eine positive Selektion mit magnetischen Kügelchen gezüchtet. Im letzteren Fall konnte
keine Zelllinie etabliert werden, wohingegen in mehr als 50% der
Fälle,
in denen positiv selektierte Tumorzellen verwendet wurden, erfolgreich
Zelllinien angelegt werden konnten.
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Beispiel 10
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In
einigen Fällen
wurden Knochenmark und peripheres Blut, die von Patientinnen mit
Brustkrebs erhalten wurden, mit dem vorliegenden Verfahren untersucht,
indem Antikörper-beschichtete
paramagnetische Kügelchen
zugegeben wurden, hierauf folgten 30 Minuten Inkubation bei 4°C und Einengen
in einem magnetischem Feld, sodann wurde die Suspension unter dem
Lichtmikroskop untersucht. In beiden Fällen wurde eine Bindung der
paramagnetischen Kügelchen
an Tumorzellen nachgewiesen, die 0,1 bis 1% der kernhaltigen Zellen
im Knochenmark und im Blut ausmachten, dies waren Zellen, die durch
kein anderes Verfahren nachgewiesen werden konnten.
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Beispiel 11
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Antikörper gegen
Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder andere Genprodukte, die auf der
Oberfläche
von spezifischen Zellpopulationen exprimiert werden, können zum
Identifizieren und positiven Selektieren dieser Zellen eingesetzt
werden. Mit Kügelchen,
die mit Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörpern beschichtet waren und die
in dem neuen Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt wurden, wurde gezeigt, daß sie ein schnelles, einfaches
und empfindliches Verfahren zum identifizieren von Zellen, die den
Transferrin-Rezeptor exprimieren, darstellen.
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Beispiel 12
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Für verschiedene
Zwecke ist das Isolieren spezifischer Populationen von normalen
Zellen erforderlich. Endothelzellen, welche die Kapillaren oder
kleinen Gefäße in normalem
und tumorösem
Gewebe auskleiden, konnten aus den aus den entsprechenden Geweben
hergestellten Zellsuspensionen positiv selektiert werden. Das Verfahren
umfaßte
die Verwendung von Kügelchen,
die mit einem Antikörper
beschichtet waren, der gegen Strukturen gerichtet war, die auf den
Endothelzellen, nicht jedoch auf den anderen normalen Zellen im
Zellgemisch exprimiert wurden.
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Beispiel 13
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Menschliche
Zellen, die in immundefiziente Nager injiziert wurden, wurden in
Zellsuspensionen nachgewiesen, die aus Tumor-Xenotransplantaten
und verschiedenen Wirtsorganen/Geweben unter Verwendung von magnetischen
Partikeln hergestellt wurden, die mit einem Anti-Pan-Mensch-Antikörper beschichtet
waren.
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Beispiel 14
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Tumorzelllinien
von Brustkrebs- und Melanompatienten wurden aus einer gemischten
Population von Blut- und Knochenmarkzellen abgeschieden und unter
Verwendung der hier beschriebenen Filtervorrichtung für Zellen
filtriert. Nach Zugabe von Kulturmedium und anschließender Inkubation
konnten die selektierten Tumorzellen auf dem Filter in Abwesenheit
von freien ungebundenen Partikeln oder anderen unspezifisch gebundenen
Zellen wachsen.
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Tabelle
1 Aufstellung der anwendbaren Antigene und Beispiele der entsprechenden
Antigen-bindenden Antikörper
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