DE69529225T2

DE69529225T2 - Verfahren zur herstellung dopppelschichtiger lipidmembranen

Info

Publication number: DE69529225T2
Application number: DE69529225T
Authority: DE
Inventors: Stefan LÖFAS
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1994-09-26
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 2009-09-17
Anticipated expiration: 2015-09-27
Also published as: WO1996010178A1; EP0784793A1; EP0784793B1; SE9403245D0; US5922594A; JPH10507126A; DE69529225D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Lipidmembranen und insbesondere die Herstellung von Lipidmembran-tragenden Oberflächen, die zur Verwendung in biologischen Sensoren geeignet sind.
Es besteht gegenwärtig ein allgemeines Bedürfnis nach Sensoren, die auf der Integration von Lipidmembran-Komponenten, wie etwa Membran-gebundenen Rezeptorproteinen, in Planare doppelschichtige Lipidmembranen, sogenannte BLMs, beruhen. Solche Lipiddoppelschichten können sich spontan bilden und sind unter geeigneten Bedingungen und mit geeigneten Oberflächen selbstbildend. Die gebildeten BLMs können dann zur Untersuchung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen an der Lipid-Wasser-Grenzfläche verwendet werden.
Brian und McConnell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 6159–6163, beschreibt die spontane Fusion von Phospholipidvesikeln an hydrophile Glasoberflächen für Untersuchungen mit Fluoreszenztechniken.
Poglitsch und Thompson (1990) Biochemistry 29, 248–254, beschreibt die spontane Fusion von Phospholipidvesikeln an hydrophile Glasoberflächen durch Hindurchführen der Vesikellösung durch eine Anordnung aus einem Substrat aus Quarzgut und einem Mikroskopobjektträger, zusammengebaut mit einem Abstandsstück mit einer Dicke von etwa 100 μm.
Zot et al. (1992) J. Cell Biol. 116, 367–376, offenbart die Herstellung von Planaren Lipidoberflächen in einer Durchflußzelle und die Untersuchung des Actinfilamentgleitens auf der Lipidschicht durch Fluoreszenzmikroskopie.
Terrettaz et al. (1993) Langmuir 9, 1361–1369, beschreibt die Bildung von Lipid-Monoschichten durch die Adsorption von Alkanthiolen mit hydrophoben Endgruppen in einem diskontinuierlichen Verdünnungsprozeß. Wechselwirkungen mit Membrankomponenten wurden durch Oberflächenplasmonresonanz und -impedanzmessungen untersucht.
Gitler et al., Bridging Research and Applications, 43–61, Hrg. D. Kamely et al., 1991 Kluwer Ac Publ., und Lang H. et al. (1994) Langmuir 10, 197–210, offenbaren Ansätze, um eine Wasserschicht zwischen dem Träger und der BLM bereitzustellen, was wünschenswert ist, um Bedingungen zu erhalten, die für Transmembranproteine geeignet sind. Zu diesem Zweck werden Lipide mit einem Oligoethylen-Spacer und einer Thiogruppe (Thiol oder Disulfid) modifiziert. Diese Thiolipide werden anschließend zusammen mit einem nicht-modifizierten Lipid an einer Goldoberfläche verankert, wodurch sich spontan eine BLM bildet, die über die Thiogruppen an der Metalloberfläche verankert ist. Der Oligoethylen-Spacer wurde eingeführt, um den gewünschten Wasserschicht-Abstand zu schaffen.
Stelzle, M., et al. (1993) J. Phys. Chem. 97, 2974–2981, offenbart die Herstellung einer doppelschichtigen Lipidmembran auf einem biologischen Sensor, in dem zunächst eine negativ geladene Monoschicht aus einem Carboxymercaptan auf Gold abgeschieden wird und anschließend Vesikel aus positiv geladenen Dioctadecyldimethylammoniumbromid zugegeben werden, die spontan an die negative Schicht kondensieren, oder alternativ kondensieren von negativ geladenem Dimyristoylphosphatidylglycerol an die negative Schicht durch die Zugabe von Calciumionen.
Duschl, C. et al. (1994) Biophys. J. 67, 1229–1237, beschreibt die Herstellung von doppelschichtigen Lipidmembranen (BLM), indem eine mit Gold beschichtete Substratoberfläche bereitgestellt wird, die Muster aus hydrophoben Flächen, mit einer daran gebundenen Monoschicht aus Thiolipiden, und hydrophilen Flächen, mit einer daran gebundenen Monoschicht aus Hydroxythiolen HS(CH₂)₂₁OH, aufweist, und des Substrats in eine Vesikellösung des Lipids 1-Palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) eingetaucht wird, wodurch spontan eine Phospholipid-Monoschicht auf den hydrophoben Thiolipid-Flächen gebildet wird und sich auf den hydrophilen Bereichen eine Phospholipid-Doppelschicht bildet. Dies erzeugt eine strukturierte Lipiddoppelschicht auf Träger, bei der kleine Flächen aus freistehenden Doppelschichten nicht-kovalent in einer Thiolipid-Matrix gehalten werden, die an das mit Gold beschichtete Substrat gebunden ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Verbesserungen bei der Herstellung und Verwendung planarer BLMs bereitzustellen und insbesondere die Stabilität der gebildeten BLMs zu verbessern. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese und andere Aufgaben und Vorteile durch kovalente Bindung der BLM an eine selbstgebildete Monoschicht auf einer Substratoberfläche erreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt dabei ein Verfahren zur Herstellung einer Substratoberfläche zur Verfügung, die eine kontinuierliche Planare doppelschichtige Membran trägt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß ein Substrat bereitgestellt wird, das eine selbstgebildete Monoschicht aus im wesentlichen geraden langkettigen Molekülen mit funktionellen Gruppen hält; und an die funktionellen Gruppen der selbstgebildeten Monoschicht eine Micellen- oder Vesikelzubereitung kovalent gebunden wird.
Durch Verankerung der Lipid-Doppelschicht an die SAM durch kovalente Bindungen wird ein effizientes Verankerungsverfahren erhalten, das die Stabilität der Doppelschicht gegenüber verschiedenen Umgebungen sicherstellt, wie etwa unterschiedlichen Puffer und Regenerationslösungen. Im Gegensatz zu den Ansätzen, die von Gitler et al. bzw. Lang H. et al., aaO., beschrieben sind, kann einerseits auch der Anzahl der mit der Doppelschicht überzogenen Oberfläche gesteuert und eine reproduzierbare Oberfläche geschaffen werden. Andererseits werden von der Doppelschicht nicht überzogene, nackte Metallteile vermieden, die hochaktiv in zufälliger Adsorption sind oder einen hydrophoben Charakter zeigen und daher einen negativen Effekt auf die Bildung einer Wasserschicht haben können.
Oberflächen, die zur Herstellung kontinuierlicher planarer Doppelschichtmembranen geeignet sind, halten selbstgebildete Monoschichten, sogenannte SAMs, aus im wesentlichen geradkettigen, vorzugsweise von Kohlenwasserstoff abgeleiteten, Molekülen, deren freie Enden funktionelle Gruppen aufweisen, die so ausgewählt sind, daß sie Oberflächeneigenschaften für optimale Membranbildung im Hinblick auf Stabilität, Funktionalität, etc. liefern. Solche Oberflächen können somit für optimale Bindung verschiedener Typen von Membranstrukturen durch Auswahl unterschiedlicher Endgruppen oder durch Mischen von Molekülen mit unterschiedlichen Endgruppen definiert und geschaffen werden. Fakultativ können die Funktionalitäten der Oberfläche so angeordnet werden, daß sie Gradienten in einer oder mehreren Richtungen zeigen.
Die obengenannten langkettigen, von Kohlenwasserstoff abgeleiteten Moleküle können z. B. von der Art sein, die in unserem US-A-5,242,828 beschrieben sind, d. h. Kohlenwasserstoffe, fakultativ unterbrochen durch Heteroatome, mit einer Länge, die 10 Atome übersteigt, und mit einer Funktionalität an einem Ende zur Verankerung an der Oberfläche und der gewünschten Funktionalität für die vorliegenden Zwecke am anderen Ende.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die selbstgebildete Monoschicht so ausgewählt, daß sie eine hydrophile Oberfläche liefert. Eine neutrale hydrophile Oberfläche kann z. B. geliefert werden durch ein 6-Mercaptohexadecanol (THD). Dementsprechend wird langkettiges Alkanthiol mit einer endständigen Carbonsäuregruppe eine negativ geladene hydrophile Oberfläche liefern. In ähnlicher Weise wird eine positiv geladene Oberfläche mit einem langkettigen Alkanthiol mit einer endständigen Amingruppe erhalten werden.
Weitere gewünschte Oberflächeneigenschaften können erreicht werden durch Mischungen von zwei oder mehr der obigen Alkanthiole. Verschiedene andere Endgruppen sind natürlich auch denkbar und entsprechende Alkanthiole können auf verschiedene Weisen kombiniert werden.
Das Substrat kann z. B. ein Metall sein, wie etwa Gold.
Das SAM-bildende Molekül, wie etwa ein Alkanthiol, kann so ausgewählt werden, daß die bestmögliche Oberfläche zur Schaffung der gewünschten hydrophilen Umgebung der Schicht zwischen dem Träger und der BLM erhalten wird. Wenn z. B. Alkanthiole mit Hydroxygruppen die SAM bilden, wird eine hydrophile Oberfläche, wie oben erwähnt, erhalten, und die Hydroxygruppen können dann zur kovalenten Bindung der Lipide verwendet werden. Andere Funktionalitäten, wie etwa saure oder basische Gruppen, können geeigneterweise über die SAM eingeführt werden, fakultativ durch Mischungen verschiedener Alkanthiole. Auch wird die Metalloberfläche vollständig passiviert und es besteht daher kein Risiko einer unerwünschten Adsorption an das Metall.
Die Lipidschicht sollte vorzugsweise unvollkommen sein, um Transmembranproteine oder andere biologisch aktive Membran-gebundene Komponenten einarbeiten zu können.
Um eine Doppelschicht-Lipidmembranoberfläche herzustellen, läßt man eine Micellen- oder Vesikel-Zubereitung, die vorzugsweise ein Membranprotein oder eine andere biologisch aktive Membran-gebundene Komponente enthält, fakultativ über einen hydrophilen Spacer, an die Lipidschicht (SAM), fakultativ nach Modifikation der letzteren, kovalent kondensieren. Die Modifikation von Metalloberflächen mit Alkanthiolen für die Zwecke von biologischen Sensoren und Vorteile solcher Oberflächen sind in der obengenannten US-A-5,242,828 beschrieben worden.
Es gibt mehrere mögliche Verfahren zur kovalenten Bindung der Doppelschicht-Lipidmembran an die SAM, die für unterschiedliche Zwecke optimiert werden können. So wird, bei einem Verfahren, die kovalente Kopplung direkt an die SAM durchgeführt, unter Verwendung von z. B. einem reaktiven Phosphatidylester, den man mit der Alkoholgruppe in einer SAM reagieren läßt, die aus einem Hydroxyalkanthiol hergestellt ist.
Alternativ wird die SAM mit einem hydrophilen Spacer modifiziert, wie etwa eine Oxyethylen-Gruppe, der dann zur Kopplung des Lipids verwendet wird. Diese Modifikation der SAM kann entweder direkt durch Kopplung eines geeigneten Oligoethylen-Moleküls vorgenommen werden, oder indem zunächst das Alkanthiol mit einem Oligoethylen-Schwanz modifiziert und es anschließend zusammen mit einem nicht-modifizierten Alkanthiol auf die Oberfläche aufgebracht wird, um eine gemischte SAM zu bilden. Bei Verwendung dieses Ansatzes kann der Anteil der Oberfläche, der mit Oligoethylen-Ketten modifiziert ist, leicht variiert und gesteuert werden, um die optimalen Bedingungen zu schaffen.
Eine weitere Möglichkeit ist, das Lipid mit dem hydrophilen Spacer zu modifizieren und anschließend das modifizierte Lipid über eine Funktionalität auf dem hydrophilen Spacer, die gegenüber der SAM reaktiv ist, an die SAM zu koppeln.
Durch Verwendung einer SAM, die aus einer Mischung von zwei unterschiedlichen Alkanthiolen besteht, wo nur eines der Alkanthiole Aktivität für das Lipid aufweist (fakultativ modifiziert mit einem hydrophilen Spacer), kann der Modifikationsgrad leicht auf das gewünschte Niveau eingestellt werden.
Man wird ohne weiteres verstehen, daß es eine Vielzahl alternativer kovalenter Bindungsverfahren gibt. Die SAM kann mit einer nukleophilen Gruppe wie einem Amin (primär, sekundär oder tertiär) modifiziert werden, entweder direkt oder über einen Spacer, wie etwa die obengenannte Oxyethylen-Gruppe. Auch nukleophile Gruppen wie Thiole, Hydrazide, Carboxylate sind mögliche Alternativen. In diesen Fällen sollten die Liposome Lipide enthalten, in denen die polaren Kopfgruppen mit elektrophilen Gruppen, wie Phosphatidylestern oder Elektrophilen auf der Basis aktivierter Carbonsäuren, wie etwa Ester oder Säurehalogenide, modifiziert sind. Auch Lipid-Kopfgruppen, die Carbonyl-, Epoxid-, Vinyl-Gruppen enthalten, sind denkbar als reaktive Gegenstücke zu den Nukleophilen auf der Oberfläche. Für selektive Reaktionen gegenüber Thiol-Funktionen, sind Pyridyldisulfide, Maleimide oder Haloacetat-Gruppen bevorzugt.
Alternativ kann die nukleophile Gruppe in das Liposom eingebracht werden, wie etwa ein Amin- oder Thiol-haltiges Lipid. Beispiele hierfür sind Lipide mit Phosphatidylethanolamin-Kopfgruppen, die ein reaktives primäres Amin liefern. In diesen Fällen sollte die SAM mit einer elektrophilen Funktionalität modifiziert werden, wie etwa einem aktivierten Carbonsäureester oder dergleichen, fakultativ über eine Spacer-Verknüpfung, wie etwa eine Oxyethylen-Gruppe. Andere Paare von nukleophilen/elektrophilen Gruppen sind hier auch mögliche Alternativen.
Die Beschränkungen für die Auswahl von Funktionalitäten für die Bildung einer kovalenten Verankerung der Lipid-Doppelschicht sind aufgrund der Stabilität der SAM-Schicht und der Liposomen nur begrenzt. Da Liposome normalerweise in Wasserlösung gebildet werden und die Fusion an die Oberfläche unter wäßrigen Bedingungen bei 5 bis 50°C stattfinden soll, muß die Auswahl geeigneter Recktanten z. B. kompatibel mit solchen Bedingungen sein. Dies werden die Fachleute ohne weiteres verstehen, ebenso daß die Auflistung möglicher Alternativen oben nicht vollständig ist, sondern daß eine Reihe von alternativen chemischen Funktionen zur Ausbildung kovalenter Bindungen verwendet werden kann.
Die kontinuierlichen Planaren Membranen, die erfindungsgemäß hergestellt werden, können geeigneterweise für Untersuchungen von Wechselwirkungen mit Membran-gebundenen Komponenten mittels Oberflächen-Meßtechniken verwendet werden. In diesem Falle wird die Membran vorzugsweise in einer Durchflußzelle unter Verwendung aus kontrollierten Laminarstromes gebildet und die anschließenden Wechselwirkungsuntersuchungen werden in derselben Durchflußzelle durchgeführt.
Dieses Verfahren liefert mehrere Vorteile. So erhöht die Bildung der Membran in situ in einem Durchflußzellsystem mit einer kombinierten Durchfluß- und Meßzelle die Reproduzierbarkeit, beschleunigt das Verfahren und verringert das Risiko der Kontamination und Zerstörung der Membran in den folgenden Wechselwirkungsuntersuchungen. Außerdem erlaubt die Verwendung einer Oberflächen-Meßtechnik, daß die Bildung der Membran in Echtzeit verfolgt werden kann. Dies ist natürlich auch in den anschließenden Wechselwirkungsuntersuchungen im Hinblick auf Reproduzierbarkeit, Schnelligkeit und aus Quantifizierungsgründen vorteilhaft.
Der Begriff ”Oberflächen-Meßtechniken”, wie hierin verwendet, bezeichnet Techniken, bei denen die Adsorption der Lipidschicht auf der Oberfläche ebenso wie anschließende Wechselwirkungen mit der Lipidschicht meßbare Veränderungen einer Eigenschaft der Meßoberfläche bewirken. Beispiele für solche Techniken sind diejenigen, die auf Massennachweismethoden beruhen, wie etwa piezoelektrische, optische, thermooptische und Oberflächen-Akustikwellen(SAW)-Methoden, und elektrochemische Methoden, wie etwa potentiometrischen, konduktometrischen, amperometrischen und kapazitive Methoden.
Unter den optischen Methoden können insbesondere diejenigen erwähnt werden, die Massenoberflächenkonzentration oder Brechungsindex bestimmen, wie etwa optische Methoden auf der Basis von Reflexion, einschließlich von sowohl Methoden mit innerer als auch äußerer Reflexion, z. B. Ellipsometrie und Subwellen-Spektroskopie (EWS), wobei die letztere Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPRS), Brewster-Winkelrefraktometrie, Grenzwinkelrefraktometrie, gestörte Totalreflexion (FTR), Subwellen-Ellipsometrie, gestreute innere Totalreflexion (STIR), optische Wellenleitersensoren, Abbildung auf Subwellenbasis, wie etwa nach Grenzwinkel aufgelöste Abbildung, nach Brewster-Winkel aufgelöste Abbildung, nach SPR-Winkel aufgelöste Abbildung, etc., sowie Verfahren, die auf abklingender Fluoreszenz (TIRF) und Phosphoreszenz beruhen.
Im unten beschriebenen Beispiel wurde ein kommerzielles Instrument verwendet, das auf Oberflächenplasmonresonanz(SPR)-Nachweis beruht (BIAcore^®, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden). Das SPR-Phänomen ist gut bekannt. Kurz gesagt wird SPR als ein Abfall der Intensität des Lichts beobachtet, das mit einem spezifischen Winkel von der Grenzfläche zwischen einem optisch durchlässigen Material, z. B. Glas, und einem dünnen Metallfilm, üblicherweise Silber oder Gold, reflektiert wird, und hängt unter anderen Faktoren vom Brechungsindex des Mediums (z. B. einer Probenlösung) ab, die zur Metalloberfläche benachbart ist. Eine Veränderung des Brechungsindex an der Metalloberfläche, wie etwa durch die Adsorption oder Bindung von Material daran, wird eine entsprechende Verschiebung des Winkels bewirken, bei dem SPR auftritt. Um das Licht an die Grenzfläche zu koppeln, so daß SPR auftritt, werden zwei alternative Anordnungen verwendet, entweder ein metallisiertes Diffraktionsgitter (Wood-Effekt) oder ein metallisiertes Glasprisma oder ein Prisma in optischem Kontakt mit einem metallisierten Glassubstrat (Kretschmann-Effekt). Für weitere Details über SPR wird Bezug genommen auf unsere WO 90/05295 . Anwendungen der Erfindung sind unten beschrieben.
Die Lipid-Doppelschichten werden vorzugsweise aus Liposomen (sphärischen Vesikeln) gebildet, z. B. aus Phospholipiden.
Im folgenden, das nicht in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallt, beschreibt das Beispiel die allgemeine Fusion einer Lipid-Doppelschicht an eine hydrophile Monoschicht in einer Durchflußzelle. Bezug genommen wird auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
1 ein Sensorgramm ist, das Reaktion gegen die Zeit für drei aufeinanderfolgende Kontakte von Liposomlösung mit einer hydrophilen Sensoroberfläche zeigt, um eine Lipid-Doppelschicht darauf zu bilden, die Gangliosid G_M1 enthält.
2 ein zu demjenigen 1 entsprechendes Sensorgramm ist und die Reaktion zeigt, wenn nacheinander die Lipidoberfläche mit negativer Kontrollsubstanz (BSA), Cholera-Toxin und Salzsäure in Kontakt gebracht wird.
3 ein zu demjenigen 1 und 2 entsprechendes Sensorgramm ist und die Reaktion für die Bildung einer hoch hydrophoben Lipidschicht und das anschließende Inkontaktbringen der Lipidschicht mit Cholera-Toxin zeigt.
BEISPIEL 1
Eine mit Gold beschichtete Glasoberfläche wurde in eine Petrischale gegeben und eine 5 mM-Lösung von 16-Mercaptohexadecanol in Ethanol/Wasser 80/20 wurde über die Oberfläche gegossen. Die Petrischale wurde mit einem Deckel versehen und auf einem Rüttelinkubator bei 40°C für 20 Minuten inkubiert. Die Oberfläche wurde mit 5 × 50 ml Ethanol/Wasser 80/20 und 5 × 50 ml Wasser gewaschen. Die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche wurden bestätigt durch Messung der Kontaktwinkel von Wasser, was Werte von < 10° ergab. (Nicht-modifizierte Goldoberflächen zeigen Kontaktwinkel von typischerweise > 75°, aufgrund unkontrollierter Dampfkontamination der Oberfläche mit nicht-polaren Verbindungen).
Die Sensoroberfläche wurde in ein kommerzielles Biosensorinstrument, BIAcore^® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden), eingebaut, das eine SPR-Meßinstrumentierung mit Durchflußzellen ist. Dieses Instrument ermöglicht das Überwachen von Massenveränderungen (Adsorptionen und Desorptionen) in der Nachbarschaft der Sensoroberfläche als eine Funktion der Zeit unter konstanten Durchflußbedingungen.
Liposomen, die aus 50 Mol-% Dipalmitoylphosphatidylcholin, 40 Mol-% Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, 10 Mol-% Cholesterol und 6 Mol-% Gangliosid G_M1 bestanden, wurden durch Tensidabreicherung mit Gelchromatographie gemäß dem Verfahren hergestellt, das von Mimms et a., Biochemistry (1980) 20, 833–840, beschrieben ist. Liposomen mit einem Durchmesser von 50–150 nm wurden erhalten und im folgenden verwendet.
Eine 20 μM Lösung der Liposomen (in Laufpuffer: 10 mM HEPES mit 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,4) wurde über der hydrophilen Oberfläche eingespritzt. 1 zeigt die Reaktionskurve, die nach drei aufeinanderfolgenden Injektionen der Liposomenlösung erhalten wurde (1), (2) und (3). Die Plateaus nach dem Ende der Probenpulse (2) und (3) zeigen die Bildung einer stabilen Lipidschicht auf der Sensoroberfläche. 2 zeigt die Injektion von (1) Rinderserumalbumin (50 μg/ml in Laufpuffer) als eine Negativkontrolle, (2) Cholera-Toxin, Untereinheit B (50 μg/ml in Laufpuffer) und (3) 100 mM Salzsäure. Die Albumin-Injektion zeigt sehr niedrige nicht-spezifische Bindung an die modifizierten Oberfläche (44 Resonanzeinheiten), RU ≈ 44 pg/mm²). Die Cholera-Toxin-Injektion zeigt die spezifische Bindung an das Gangliosid G_M1, das in der Lipidschicht eingebaut ist (941 RU ≈ 0,94 ng/mm²). Die Injektion der Salzsäure veranschaulicht die Regeneration der Lipidoberfläche durch Aufbrechen der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem Cholera-Toxin und dem Gangliosid. Mit dem einminütigen Puls werden 80% des gebundenen Cholera-Toxins von der Oberfläche desorbiert, die anschließend für erneute Bindung bereit ist (nicht dargestellt).
Als ein Vergleich wurde eine mit Gold beschichtete Oberfläche mit Pentadecan-1-thiol gemäß derselben Vorgehensweise, wie oben beschrieben, modifiziert. Diese modifizierte Oberfläche ist hoch hydrophob, mit einem Kontaktwinkel von > 105°. 3 zeigt die Injektionen [(1) und (2)] von zwei aufeinanderfolgenden Pulsen der Liposomenlösung, wie oben beschrieben, gefolgt von (3) der Injektion der Cholera-Toxin-Lösung. Obgleich 3 die Bildung einer Lipidschicht aus der Liposomenlösung anzeigt, ist die spezifische Aktivität dieser Schicht für die Bindung des Cholera-Toxins viel niedriger als für die oben beschriebene Situation (182 bzw. 941 RU). Dieses Beispiel veranschaulicht die Bedeutung der Oberflächeneigenschaften für die Bildung von funktionell aktiven Lipidschichten. Im Gegensatz zur hydrophoben Oberfläche ist es wahrscheinlich, daß die hydrophile Oberfläche Lipid-Doppelschichten mit Ähnlichkeit zur biologischen Membran liefert und somit eine hohe funktionelle Aktivität.
Diese Erfindung ist natürlich nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern umfaßt Modifikationen und Varianten, die den Fachleuten offensichtlich und von den folgenden Ansprüchen abgedeckt sind.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Substratoberfläche, die eine kontinuierliche planare Doppelschicht-Lipidmembran trägt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Bereitstellen eines Substrates, das eine selbstgebildete Monoschicht aus im wesentlichen geraden langkettigen Molekülen mit funktionellen Gruppen trägt; und kovalentes Binden einer Micellen- oder Vesikel-Zubereitung an die funktionellen Gruppen der selbstgebildeten Monoschicht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Micellen- oder Vesikel-Zubereitung an besagte funktionelle Gruppen der Monoschicht über hydrophile Spacer-Moleküle kovalent gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die geraden langkettigen Moleküle von Kohlenwasserstoffen abgeleitet sind.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die geraden langkettigen Moleküle Alkanthiole umfassen, vorzugsweise mit wenigstens 10 Atomen in ihrer Kette.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die geraden langkettigen Moleküle so ausgewählt werden, daß sie eine hydrophile Oberfläche liefern.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die geraden langkettigen Moleküle Hydroxyalkanthiole umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die geraden langkettigen Moleküle eine Mischung von Molekülen mit unterschiedlichen Funktionalitäten umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die geraden langkettigen Moleküle an ein Metall, z. B. Gold, gebunden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelschicht-Lipidmembran in einer Durchflußzelle, die einen gesteuerten Laminarstrom verwendet, ausgebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Micellen- oder Vesikel-Zubereitung ein Membranprotein oder eine andere biologisch aktive Membran-gebundene Komponente enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der Doppelschicht-Lipidmembran überwacht wird mit einer Oberflächen-Meßtechnik, die Adsorption der Lipid-Doppelschichtmembran an der Substratoberfläche als eine meßbare Veränderung der Eigenschaft der Oberfläche nachweist.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen-Meßtechnik auf Massenmessung beruht, vorzugsweise optisch durch Subwellenmessung, z. B. SPR.
Verwendung der Substratoberfläche, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 12, zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Lipid-Doppelschichtmembran durch eine Oberflächen-Meßtechnik, die die Wechselwirkung als meßbare Veränderungen einer Eigenschaft der Oberfläche nachweist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen-Meßtechnik auf Massenmessung beruht, vorzugsweise optisch durch Subwellenmessung, z. B. SPR.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14 einer Substratoberfläche, hergestellt nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Doppelschicht-Lipidmembran im selben Reaktionsgefäß durchgeführt wird wie dasjenige, in dem die Substratoberfläche hergestellt wurde.