DE69530323T2

DE69530323T2 - Verfahren und vorrichtung zur eichung eines optischen abtasters

Info

Publication number: DE69530323T2
Application number: DE69530323T
Authority: DE
Inventors: J. Louis DIETZ; M. Thomas BAER
Original assignee: BD Biosciences Systems and Reagents Inc
Current assignee: BD Biosciences Systems and Reagents Inc
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2015-09-01
Also published as: CA2198853A1; EP0801738A4; JP3577317B2; DE69530323D1; AU3542695A; WO1996007888A1; JPH10507828A; AU702267B2; US5689110A; EP0801738B1; EP0801738A1; ATE237129T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Kalibrieren eines Fluoreszenzspektrometers, das nachstehend auch optischer Abtaster oder Abtaster genannt wird, zum Erfassen der Fluoreszenz von Teilchen in einer Flüssigkeit und insbesondere Verbesserungen an einem Verfahren und einer Vorrichtung zum Kalibrieren einer optischen Abtastabbildungsvorrichtung.
Es ist häufig vorteilhaft, verschiedene Proben, beispielsweise menschliche Blutproben, unter Verwendung von optischen Abtastverfahren zu analysieren. Ein solches Verfahren analysiert die Fluoreszenz, die erzeugt wird, wenn eine Probe, die eine Substanz, wie z. B. einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper, enthält, durch eine Anregungsenergie wie z. B. Laserlicht angeregt wird. Wenn der optische Abtaster angemessen empfindlich und korrekt kalibriert ist, kann die Probe auf die Anwesenheit und tatsächlich die Intensität von Bereichen mit erhöhten Fluoreszenzkonzentrationen, wie z. B. Zellen, die reich an dem Antigen sind, an das der markierte Antikörper anhaftet, analysiert werden.
In einer solchen Anwendung unter Verwendung einer Fluoreszenz-Abtastabbildungsvorrichtung wird eine Blutprobe mit einem Überschuss von verschiedenen Arten Antikörper vermischt, wobei jede Art mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der für diese Art Antikörper spezifisch ist. Die Antikörper weisen eine spezifische Affinität zu bestimmten Zielproteinen auf, die für eine spezielle Art Zelle, die in der Blutprobe zu finden ist, charakteristisch sind. Die Probe wird in eine Kapillare mit bekanntem Volumen gegeben und dann mit Anregungsstrahlung abgetastet, die bewirkt, dass der Farbstoff fluoresziert. Der Inhalt der gesamten Kapillare wird mit einem kleinen Punkt auf einmal unter Verwendung eines Abtastsystems, das in der Lage ist, die erzeugte Fluoreszenz zu erfassen und zu quantifizieren, abgetastet. Die Fluoreszenzmesswerte von jedem der Punkte werden dann digital verarbeitet, um ein vollständiges Fluoreszenzbild der Kapillare zu bilden. Da die Antigene, an die die Antikörper binden, in relativ hoher Konzentration in oder an einer bestimmten Art Zelle zu finden sind, sind die fluoreszenzmarkierten Antikörper in relativ hoher Konzentration in oder an dieser Art Zelle gehäuft. Eine relativ hohe Konzentration an Fluoreszenz dient somit zum Identifizieren dieser Art Zelle.
Ein System, das ein Fluoreszenzspektrometer verwendet, ist die Durchflusszytometrie. Ein weiteres, das in der Lage ist, Fluoreszenzkonzentrationen zu erfassen, ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Seriennummer 08/236 342 mit dem Titel "Apparatus and Method for Volumetric Capillary Cytometry", erfunden von Thomas M. Baer, Louis J. Dietz, Robert S. Dubrow, Paul G. Hayter, Michael Hodges, Bala S. Manian und Robert J. Shartle, im Eigentum des gleichen Anmelders wie diese Anmeldung, offenbart. Das Verfahren und die Vorrichtung zum Sammeln und Analysieren von Daten, um die Abtastungen von Kapillaren zu interpretieren, die von diesem System durchgeführt werden, ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nummer 08/236 645 mit dem Titel "Method and Apparatus for Cell Counting and Cell Classification", erfunden von Ning L. Sitzo und Louis J. Dietz, auch im Eigentum desselben Anmelders wie diese Anmeldung, beschrieben.
Ein signifikantes Problem, das den Konstrukteuren und Herstellern von solchen optischen Abtastern gegenübersteht, ist die Unfähigkeit, dass verschiedene optische Abtaster konsistent denselben Wert an Fluoreszenzintensität für dieselbe Probe melden. Die erfasste Fluoreszenzintensität kann beim Feststellen, ob die Menge an mit einer Probe vermischtem Farbstoff geeignet ist, oder beim Überwachen der fortgesetzten korrekten Funktion des Instruments nützlich sein.
Außerdem kann der absolute Intensitätswert für verschiedene Bereiche mit hoher Fluoreszenz, wie z. B. Zellen mit angelagerten Farbstoffmolekülen, eine nützliche Information für Diagnosezwecke bereitstellen. Irgendein Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen Tests (oder vielleicht zwischen optischen Abtastern) erfordert einen gewissen Standard der absoluten Fluoreszenzintensität. Die Eigenschaften von optischen Komponenten von verschiedenen optischen Abtastern können jedoch variieren und daher können die verschiedenen Instrumente unterschiedliche Ergebnisse melden, wenn sie dieselbe Probe abtasten. Ohne einen gewissen endgültigen Bezugsstandard (nachstehend "Goldstandard"), gegen den die verschiedenen optischen Scanner kalibriert werden können, existiert für solche Vergleiche kein brauchbarer Standard von Fluoreszenzeinheiten.
Außerdem können die Komponenten des einzelnen optischen Abtasters über die Zeit und Temperatur sich ändern oder driften. Wenn ferner eine oder mehrere der Komponenten eines optischen Abtasters eine Reparatur oder einen Austausch erfordern, könnte irgendeine neue oder reparierte Komponente von den ursprünglichen Komponenten abweichen, so dass der optische Abtaster nicht mehr denselben Wert für dasselbe Eingangssignal meldet.
Einige optische Abtaster, die derzeit in Gebrauch sind, sind in der Lage, gleichzeitig Fluoreszenz in verschiedenen Detektoren (Kanälen) zu erfassen, wobei einiges der Fluoreszenz von demselben Farbstoff in mehr als einem Kanal gleichzeitig erfasst werden kann. Solche optischen Mehrkanal-Abtaster erfordern eine zusätzliche Kalibrierung. Sie müssen kalibriert werden, nicht nur um Standard-Fluoreszenzeinheiten in jedem Kanal zu melden, sondern auch, um die Empfindlichkeit jedes Kanals relativ zu den anderen festzulegen.
Jede Art von zu erfassendem Fluoreszenzfarbstoff weist ein charakteristisches Fluoreszenzspektrum auf. Das Verhältnis der in jedem Kanal erfassten Fluoreszenz kann daher verwendet werden, um einen speziellen Farbstoff zu identifizieren. Wenn sich jedoch die Detektoren in der Empfindlichkeit relativ zueinander ändern, scheint sich dieses Verhältnis zu ändern. Eine falsche Identifikation eines Farbstoffs oder die Unfähigkeit, den Farbstoff zu identifizieren, kann sich dadurch ergeben.
Ein optischer Abtaster mit einer Vielzahl von Kanälen, wie vorstehend beschrieben, wird manchmal verwendet, um gleichzeitig die Fluoreszenz von zwei oder mehreren Arten von Farbstoff zu erfassen, die verschiedene, aber überlappende Emissionsspektren aufweisen. In einem solchen Fall erfasst mindestens ein Kanal die Emission von mehr als einem Farbstoff. Durch Analysieren des Verhältnisses der in jedem Kanal erfassten Fluoreszenz ist es möglich festzustellen, welcher der Farbstoffe für die Emission verantwortlich war, oder ob eine Kombination von Farbstoffen für die Emission verantwortlich war. Wenn sich die Empfindlichkeit der Detektoren relativ zueinander ändert, ist dies jedoch nicht mehr möglich.
Um die Probleme eines Mangels einer konsistenten Einheit zum Messen der Fluoreszenzintensität und zum Justieren der Abwanderung der Empfindlichkeit von optischen Mehrkanal-Abtastern anzugehen, ist eine Kalibrierung des optischen Abtasters erforderlich. Mit Kalibrierung ist das Korrelieren einer Vorrichtung gegen einen Bezug (Standard) gemeint. Fluoreszenzspektrometer haben historisch den Farbstoff, nach dessen Erfassung in einer Probe gestrebt wird, als Kalibrierungsstandard für den optischen Abtaster verwendet, wobei der Farbstoff entweder an Zellen in einer Blutprobe oder vielleicht an Polystyrolkugeln gebunden ist. Solche Farbstoffe weisen jedoch signifikante Mängel als Kalibrierungsstandards auf. Die Farbstoffe sind beispielsweise häufig instabil und weisen eine begrenzte Nutzlebensdauer auf. Außerdem ist der Benutzer dem Hersteller des Farbstoffs ausgeliefert, um sicherzustellen, dass der Standard genau ist. Wenn er nicht jedes Mal genau gleich hergestellt wird, variiert er gewöhnlich in der Fluoreszenzreaktion von einer Farbstoffpartie zur nächsten. Der Farbstoff kann auch durch die Konzentration, die Form, das Material und andere Details des Behälters, der zum Enthalten des Farbstoffs verwendet wird, sowie den pH-Wert und die Temperatur des Farbstoffs beeinflusst werden, so dass, selbst wenn er zuverlässig hergestellt wird, die Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffs nicht gleichmäßig sein können und in einer unvorhersagbaren Weise von einem Benutzer zum anderen variieren können. Somit ist es äußerst schwierig, einen zuverlässigen, reproduzierbaren Standard zum Kalibrieren von absoluten Fluoreszenzeinheiten unter Verwendung von solchen Farbstoffen zu erzeugen. Obwohl es möglich war, wenn auch mühselig, teuer und im Allgemeinen schwierig, einen optischen Abtaster unter Verwendung von Farbstoff zu kalibrieren, um ein Verhältnis der von den verschiedenen Kanälen erfassten Fluoreszenz für diesen Farbstoff zu ermitteln, war es tatsächlich im Allgemeinen nicht möglich, diese Farbstoffe zu verwenden, um gleichmäßige Einheiten der absoluten Intensität, d. h. Standard-Fluoreszenzeinheiten, festzulegen.
Die Verwendung solcher Farbstoffe als Standard erfordert, selbst wenn sie genau ist, häufig eine ausgedehnte, komplexe und präzise Herstellung und Handhabung, die signifikantes Training erfordert, zeitaufwändig ist und die Kosten und Wahrscheinlichkeit für einen Fehler in einem solchen Verfahren erheblich erhöht. Aus diesen Gründen wäre ein relativ stabiler Standard, der leicht zu handhaben und in der Fluoreszenzreaktion voraussagbar ist, ein signifikanter Fortschritt.
Daher haben jene, die mit der Entwicklung und Verwendung von Fluoreszenzspektrometern zu tun haben, lange den Bedarf für verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zum Festlegen einer gleichmäßigen Fluoreszenzeinheit erkannt, die verwendet werden kann, um Daten von verschiedenen Tests und von verschiedenen Fluoreszenzspektrometern sinnvoll zu vergleichen, die verwendet werden kann, um eine relative Empfindlichkeit zwischen Kanälen eines Mehrkanal-Detektors zu ermitteln, und für einen stabilen, permanenten Kalibrierungsstandard, der den Bedarf für ein hohes Niveau an Geschicklichkeit, Training und Sachkenntnis und signifikante Bedienpersoneneingabe vermeidet, wenn eine Kalibrierung an einem Fluoreszenzspektrometer durchgeführt wird. Die vorliegende Erfindung erfüllt alle diese Bedürfnisse.
EP-A-0 296 259 offenbart ein Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines Mehrkanal-Spektrometers, offenbart auch eine Vorrichtung mit allen Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 5.
EP-A-0 424 644 offenbart ein Zweikanal-Fluoreszenzspektrometer zum Messen von Chlorophyllfluoreszenz, wobei das Empfindlichkeitsverhältnis der zwei Kanäle unter Verwendung eines NBS-Standards kalibriert wurde.
Die Verwendung von Rubinkristallen zum Kalibrieren von Fluoreszenzspektrometern ist aus US-A-4150295 bekannt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Kurz gesagt und in allgemeiner Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Kalibrieren eines Fluoreszenzspektrometers mit Bezug auf einen homogenen, kristallinen Festkörperstandard nach Anspruch 1 bereit. Grundsätzlich kann dies gemäß der Erfindung durch Anregen des Standard zum Fluoreszieren, Sammeln der Fluoreszenz als Strahl und Richten des Strahls auf einen Detektor, der dann eingestellt wird, um die Fluoreszenzreaktion des Kristalls anzuzeigen, durchgeführt werden. Die Einstellung kann eine physikalische Einstellung des Detektors sein oder kann eine mathematische Einstellung sein, die auf vom Detektor gemeldete Daten angewendet werden soll.
Temperaturschwankungen eines Standards zum Zeitpunkt der Anregung beeinflussen die Intensität der Fluoreszenzemission. Gemäß der Erfindung wird ein Temperaturfühler in der Nähe des Standards angeordnet und die Temperatur wird zum Zeitpunkt der Anregung aufgezeichnet. Irgendeine Änderung der Fluoreszenzemission aufgrund einer Temperaturdifferenz kann im voraus festgestellt werden und aus einer Nachschlagetabelle zur Verfügung gestellt werden.
Ein Verfahren zum Kalibrieren eines optischen Abtasters gegen einen "Goldstandard" verwendet einen Zwischenstandard, der hier Kalibrierungsstandard genannt wird. Als Beispiel und nicht notwendigerweise als Begrenzung kann der Kalibrierungsstandard zur Verwendung bei der Erfindung gegen den Goldstandard bewertet werden. In dieser Hinsicht werden beide Standards zur Emission von Fluoreszenz durch dieselbe Menge an Anregungsenergie zueinander angeregt und die Intensität der Fluoreszenz wird durch denselben Detektor gemessen. Ein Korrekturfaktor wird dann ermittelt, so dass derselbe Intensitätswert der Emission des Kalibrierungsstandards als gleicher Wert wie jener des Goldstandards ausgedrückt wird. Anschließend kann in irgendeinem optischen Abtaster, der durch den Kalibrierungsstandard kalibriert wurde, die Intensität der Fluoreszenz, die von diesem optischen Abtaster erfasst wird, durch den Korrekturfaktor eingestellt werden, so dass der optische Abtaster Fluoreszenzeinheiten meldet, die sinnvoll mit allen anderen optischen Abtastern verglichen werden können, die durch einen Kalibrierungsstandard kalibriert wurden, welcher gegen denselben Goldstandard kalibriert wurde.
Gemäß der Erfindung können bei optischen Abtastern mit mehr als einem Kanal ihre verschiedenen Kanäle gleichzeitig mit Bezug auf einen einzelnen Standard kalibriert werden. Dies ist möglich, wenn das Fluoreszenzspektrum des Standards einen Bereich von Wellenlängen abdeckt, der durch einen Strahlteiler in verschiedene resultierende Strahlen aufgespalten wird, wobei jeder resultierende Strahl auf einen anderen Detektor gerichtet wird. Die Intensität der Fluoreszenz, die von jedem Kanal gemeldet wird, kann dann wie vorstehend beschrieben kalibriert werden.
Gemäß der Erfindung kann ein optischer Abtaster mit mehr als einem Kanal durch einen einzelnen Kalibrierungsstandard kalibriert werden, um das Verhältnis des in jedem Kanal erfassten Lichts zu einzustellen, um jegliche Abwanderung der relativen Empfindlichkeit zwischen den Kanälen zu kompensieren. Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung wird ein Kalibrierungsstandard bereitgestellt, der Fluoreszenz über einen Spektralbereich emittiert, der die Wellenlängen enthält, die zum Erfassen von bestimmten nützlichen Fluoreszenzfarbstoffen geeignet sind, so dass dieselben optischen Komponenten, die zum Erfassen dieser Farbstoffe nützlich sind, verwendet werden können, um die Kalibrierung der Erfindung durchzuführen.
Da ein Kristall als Standard verwendet wird, sorgt die Erfindung ferner für die Orientierung der inneren Kristallstruktur des Kristalls in bezug auf die Anregungsquelle, um die Fluoreszenzintensität und Polarisation des Emissionsstrahls des Standards zu steuern. Dies kann beispielsweise durch Formen des Kristalls als rechteckigen Quader durchgeführt werden. Der Kristall wird dann bündig in eine ortsfeste rechteckige Vertiefung eingesetzt. Wenn die rechteckige Vertiefung in derselben Orientierung zum Anregungsstrahl wie bei vorherigen Abtastungen liegt, ist die innere Kristallstruktur des Kristalls auch in derselben Orientierung ausgerichtet.
In einer speziellen Anwendung der Erfindung wurde festgestellt, dass ein Rubin insofern ein besonders nützlicher Kristall ist, als das Emissionsspektrum des Rubins mit den Emissionsspektren von verschiedenen Farbstoffen, die in Verbindung mit biologischen Proben nützlich sind, überlappt, und das Anregungsspektrum des Rubins derart ist, dass der Rubin durch Licht mit einem breiten Bereich von Wellenlängen angeregt werden kann, die das meiste Laserlicht im sichtbaren Bereich umfassen. Dieser Bereich von Anregungsenergie umfasst die Anregungsenergie, die zum Anregen der vorstehend erwähnten Farbstoffe geeignet ist. Somit kann ein optischer Abtaster zum Anregen und Erfassen von Fluoreszenz aus solchen Farbstoffen durch die Verwendung eines Rubins zweckmäßig kalibriert werden.
Synthetischer Rubin ist zur Verwendung in einigen optischen Abtastern besonders vorteilhaft. Rubin fluoresziert mit einem Intensitätspegel, der von der Konzentration von Chromionen in dem Kristall abhängt, und die Chromionenkonzentration eines synthetischen Rubins kann während der Herstellung gesteuert werden, um einen Rubin mit einer geeigneten Konzentration für die beabsichtigte Verwendung zu erhalten.
Ein Rubin ist sehr haltbar und kann bequem gehandhabt und versandt werden. Ein Rubin ist auch sehr stabil und verschlechtert sich nicht über die Zeit. Er unterliegt nicht den Variablen des pH-Werts, chemischen Wechselwirkungen mit Umgebungsmolekülen in Lösung, einer Konzentrationsvarianz und dergleichen, die eine problematische Quelle für Variabilität in einem anderen Fluoreszenzmaterial waren, das vorher als Standard verwendet wurde. Er kann zuverlässig reproduziert werden und sogar synthetisch hergestellt werden, so dass er eine geeignete Fluoreszenzintensität aufweist. Der Rubin kann permanent in einen optischen Abtaster zur wiederholten Verwendung, Routine- und automatischen Verwendung eingebaut werden.
Das neue und verbesserte Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung stellen eine zweckmäßige, zuverlässige und kostengünstige Weise zum Kalibrieren von Fluoreszenzspektrometern bereit, um Standardeinheiten der Fluoreszenzintensität bereitzustellen, um das Gleichgewicht der Empfindlichkeit gegen Fluoreszenz zwischen Kanälen eines Mehrkanal-Fluoreszenzspektrometers zu kalibrieren, und dies mittels eines stabilen, festen und permanenten Kalibrierungsstandards, der als Teil des Fluoreszenzspektrometers konstruiert werden kann, um für eine einfache, automatische, häufige und kostengünstige Kalibrierung des Instruments zu sorgen.
Diese und weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den zugehörigen Zeichnungen ersichtlich, die beispielhaft die Merkmale der Erfindung darstellen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Systemdiagramm eines optischen Abtasters zur Verwendung bei der Erfindung;
2 ist ein schematisches Diagramm, das eine Kapillare darstellt, die durch den optischen Abtaster von 1 abgetastet wird;
3 ist eine Draufsicht auf eine Patrone, die einen "Goldstandard"-Rubin zur Verwendung bei der Erfindung enthält;
4 ist ein Seitenaufriss eines Rubins zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung;
5 ist eine Draufsicht auf eine Modulplatte zur Verwendung in einem optischen Abtaster, die einen eingebauten Kalibrierungsrubin gemäß der Erfindung zeigt;
6 ist eine vergrößerte Draufsicht auf den Bereich des gestrichelten Kreises in 5, welche den Kalibrierungsrubin zeigt;
7A ist ein Kurvenbild, das Fluoreszenzeinheiten darstellt, die vom Abtaster von 1 erfasst werden, wobei die vom Kanal Eins erfassten Fluoreszenzeinheiten gegen die vom Kanal Null erfassten Fluoreszenzeinheiten aufgetragen sind;
7B ist ein Kurvenbild, das dieselben Daten wie in 7A dargestellt darstellt, jedoch von denselben zwei Kanälen eines Abtasters wie in 7A nach einer Änderung der relativen Empfindlichkeit zwischen den Kanälen erfasst;
8 ist ein Kurvenbild, das die Emissionsspektren von zwei verschiedenen Farbstoffen und das Durchlassspektrum eines dichroitischen Spiegels, der die Emissionsspektren des Farbstoffs aufteilt, darstellt;
9 ist eine Temperatur-Nachschlagetabelle zur Verwendung bei der Erfindung;
10 ist ein Blockdiagramm, das die Schritte zeigt, die beim Ermitteln der Fluoreszenzintensität eines Kalibrierungsrubins durch Bezugnahme auf einen Goldstandard-Rubin beteiligt sind;
11 ist ein Ablaufplan der Prozedur zum automatischen Festlegen der Empfindlichkeit eines optischen Abtasters gegen Fluoreszenz, sobald die Leistung für den optischen Abtaster eingeschaltet wird;
12 ist ein Blockdiagramm der Schritte, denen gefolgt wird, um das ch1/ch0-Verhältnis für Cy5^TM, Cy5.5^TM und Rubin in einem Zweikanal-Detektor zu ermitteln; und
13 ist ein Blockdiagramm, das die Schritte zeigt, denen gefolgt wird, um das aktuelle ch1/ch0-Farbstoffverhältnis für einen Farbstoff, wie vorher in einem optischen Abtaster wie in 12 erfasst, zu ermitteln, um jegliche Abwanderung der relativen Kanalempfindlichkeit zu korrigieren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
Das Kalibrierungsverfahren und die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels können an einem optischen Abtaster der Art, die in der US-Patentanmeldung Seriennummer 08/236 342 mit dem Titel "Apparatus and Method for Volumetric Capillary Cytometry", erfunden von Thomas M. Baer, Louis J. Dietz, Robert S. Dubrow, Paul G. Hayter, Michael Hodges, Bala S. Manian und Robert J. Shartle, im Eigentum des gleichen Anmelders wie diese Anmeldung, offenbart ist, verwendet werden. Es ist dazu ausgelegt, in Verbindung mit dem Verfahren und der Vorrichtung zum Interpretieren von Daten verwendet zu werden, wie in der US-Patentanmeldung Nummer 08/236 645 mit dem Titel "Method and Apparatus for Cell Counting and Cell Classification", erfunden von Ning L. Sitzo und Louis J. Dietz, auch im Eigentum desselben Anmelders wie diese Anmeldung, offenbart.
Der optische Abtaster zur Verwendung bei der Erfindung, der mit Bezug auf 1 beschrieben wird, umfasst einen Laser 10 wie z. B. einen Heliumneonlaser (nachstehend HeNe-Laser), der einen Laserstrahl 80 erzeugt, der auf eine Glasplatte 12 auftrifft. Die Glasplatte reflektiert einen signifikanten Teil des Laserstrahls 80 auf eine Leistungsüberwachungseinrichtung 11, die die vom Laser ausgegebene Leistung misst. Der Teil des Anregungsstrahls 81, der von der Glasplatte 12 vielmehr durchgelassen als reflektiert wird, wird durch ein Laserlinienfilter 13 und dann auf eine spektrale Zerlegungsvorrichtung 14 gerichtet, die beispielsweise ein dichroitischer Spiegel, ein Prisma oder ein Gitter sein kann. Die spektrale Zerlegungsvorrichtung 14 reflektiert den Anregungsstrahl 81, der im Fall eines HeNe-Lasers eine Wellenlänge von ungefähr 633 Nanometern aufweist.
Der Anregungsstrahl 81 wird dann auf einen Spiegel 15 gerichtet und von diesem Spiegel auf ein rechtwinkliges Prisma 16 reflektiert. Der Strahl läuft durch das rechtwinklige Prisma zu einer Abtastanordnung 34.
Die Abtastanordnung 34 umfasst ein Galvanometer 17, einen Galvanometerspiegel 18, Linsen 26 und 27 und eine Objektivlinse 19. Das Galvanometer 17 steht mit dem Galvanometerspiegel 18 in Verbindung, um diesen Spiegel in Schwingung zu versetzen, während der Anregungsstrahl 81 auf den Galvanometerspiegel gerichtet wird. Der Anregungsstrahl 81 wird dadurch über die Objektivlinse 19 abgetastet. Der Anregungsstrahl 81 wird durch die Objektivlinse 19 gerichtet und dadurch wird eine Kapillare 20 mit diesem abgetastet. Die Kapillare 20 enthält innerhalb dieser beispielsweise eine biologische Probe 53, die mit Fluoreszenzfarbstoff in dieser gefärbt ist.
Wie am besten in 2 beobachtet, trifft der Anregungsstrahl 81 während einer Probenabtastung auf die Außenwand der Kapillare 20 auf, durchquert die Wand und beleuchtet einen Säulenbereich 51 der Probe 53, was Fluoreszenzemissionen aus der Probe bewirkt. Die Fluoreszenzemissionen aus der Probe sind in 2 durch die Strahlen 32A und 32B dargestellt. Einige der so erzeugten Fluoreszenzemissionen fallen auf die Objektivlinse 19 und werden gesammelt und von der Probe als Rückstrahl 83 zurückgelenkt.
Von der Probe infolge der Anregung emittierte und durch die Objektivlinse 19 gesammelte Fluoreszenz wird durch die Abtastanordnung 34 zurückgelenkt. Mit Bezug auf insbesondere 1 läuft der Rückstrahl 83 von der Abtastanordnung 34 durch das rechtwinklige Prisma 16 zum Spiegel 15 und zur spektralen Zerlegungsvorrichtung 14. Der Rückstrahl weist einen Spektralbereich auf, der eine andere Wellenlänge einschließt als der Anregungsstrahl und daher durch dieselben optischen Komponenten, die den Anregungsstrahl auf die Abtastanordnung 34 richten, anders gerichtet werden kann als der Anregungsstrahl. Aufgrund seiner Wellenlänge wird der Rückstrahl 83 beispielsweise durch die spektrale Zerlegungsvorrichtung 14 vielmehr durchgelassen als durch diese Vorrichtung reflektiert und dann durch ein Bandpassfilter 21 zu einem Spiegel 22, wo er durch eine Kollimationslinse 23 gerichtet wird.
Irgendein Licht mit der Wellenlänge des Anregungsstrahls 81, beispielsweise Licht vom Anregungsstrahl, das durch die Oberfläche der Kapillare 20 entlang des Weges des Rückstrahls 83 zurückreflektiert wird, wird durch den dichroitischen Spiegel 14 von dem Weg des Rückstrahls weg und zurück zum Laser 10 reflektiert. Der Rückstrahl 83 wird dadurch vom reflektierten Anregungslicht gereinigt. Der Rückstrahl 83 wird durch die Kollimationslinse 23 durch eine Lochblende eines räumlichen Filters 24 fokussiert, der zum Beseitigen von jeglichem anderen Licht als Fluoreszenzemissionen von einem definierten Bereich 51 innerhalb des abgetasteten Objekts aus diesem Rückstrahl wirkt.
Nach dem Durchtritt durch das räumliche Filter 24 wird der Rückstrahl 83 auf ein Erfassungsmittel 35 gerichtet. Das Erfassungsmittel 35 umfasst einen Erfassungskanal wie z. B. eine PMT 30, der das Fluoreszenzsignal des Rückstrahls 83 empfängt, das empfangene Signal verstärkt und die verstärkten Ergebnisse einem Datenleser 50 meldet, der es von der analogen in die digitale Form umwandelt und es in Einheiten der Fluoreszenzintensität aufzeichnet. Für Zwecke dieser Beschreibung werden diese Einheiten als Analog-Digital-Zählwerte oder "A/D-cts" bezeichnet.
Das Erfassungsmittel 35 enthält zwei Erfassungskanäle, wobei jeder Kanal seine eigene PMT 30, 31 aufweist. Eine spektrale Zerlegungsvorrichtung 25 kann zwischen dem räumlichen Filter 24 und den PMTs 30 und 31 angeordnet sein, um den Rückstrahl 83 auf der Basis der Wellenlänge des Lichts aufzuspalten und einen Strahl 84 auf die erste PMT 30 und den anderen Strahl 85 auf die andere PMT 31 zu richten. In dieser Weise weist der einzelne optische Abtaster zwei Kanäle auf, von denen jeder einen unterschiedlichen Teil des Rückstrahls 83 empfängt.
Mit Bezug auf 5 werden die Kapillaren 20 jeweils von einer Patrone 49 getragen, wobei jede Patrone zwei Kapillaren trägt. Die Patrone 46 wird auf eine Drehmodulplatte 48 gelegt, die sich unterhalb des Objektivs 19 dreht. Ein Motor (nicht dargestellt) dreht die Modulplatte 48, um jede Kapillare 20 unterhalb des Objektivs 19 zu positionieren, und hält an, während sich die Kapillare unterhalb des Objektivs befindet, bis eine Abtastung an dieser Kapillare vollständig ist. Der Motor dreht die Modulplatte 48 dann wieder, bis sich die nächste Kapillare 20 unterhalb des Objektivs 19 befindet, und eine Abtastung dieser Kapillare kann dann durchgeführt werden.
Mit Bezug auf 5 und 6 ist die Modulplatte 48 dazu ausgelegt, zehn Patronen 49 zu halten, und enthält zehn radiale Trägerarme 46. Ein Kalibrierungskristall wie z. B. der Rubin 45 ist in einen dieser Trägerarme 46 installiert. Um den Kalibrierungsrubin 45 abzutasten, wird die Modulplatte 48 gedreht und in einer Position gestoppt, in der sich der Kalibrierungsrubin unterhalb der Objektivlinse 19 befindet. Der Rubin 45 wird dann mit einem Anregungsstrahl 81 vom Laser 10 angeregt und die als Folge emittierte Fluoreszenz wird als Rückstrahl 83 gesammelt und in die Kanäle 30, 31 des optischen Abtasters aufgeteilt und von diesen erfasst. In der Praxis kann ein mittlerer Maximalwert für die Fluoreszenzintensität, die als Folge dieser Rubinabtastung erfasst wird, durch nacheinander Abtasten einer Anzahl von Punkten an dem Rubin und Mitteln des Maximalwerts der Fluoreszenzintensität von jeder Abtastung erhalten werden, um einen Mittelwert zu erhalten, der dann für die Zwecke der Kalibrierung verwendet wird. Dies verbessert die Zuverlässigkeit des verwendeten Werts.
Im Gegensatz zum Durchführen einer Abtastung an einer Probe 53 ist der Galvanometerspiegel 18 beim Durchführen einer Abtastung eines Rubins 45 stationär. Ein Rubin weist eine relativ lange Fluoreszenzperiode nach der Anregung auf. Der optische Abtaster stellt die Fluoreszenz vom Rubin durch dasselbe Objektiv 19 zurück, das zum Fokussieren des Anregungsstrahls 81 auf den Rubin 45 verwendet wird, fest. Somit stammt die erfasste Fluoreszenz vom gleichen Punkt und von der gleichen Zeit wie der Anregungsstrahl 81. Wenn der Galvanometerspiegel 18 schwingen würde, wie es der Fall ist, wenn mit dem Anregungsstrahl 81 eine Kapillare 20 abgetastet wird, würde das gemessene Signal vom Rubin 45 erheblich gedämpft werden, da der Erfassungspunkt sich weiter bewegt hätte, bevor der Rubin 45 einen stationären Zustand der Fluoreszenzemission erreicht.
Optische Abtaster mit einer Vielzahl von Erfassungskanälen sind bei der Identifikation der Fluoreszenz von verschiedenen Farbstoffen nützlich. Im einfachsten Fall könnte beispielsweise eine Probe zwei Farbstoffe enthalten, die mit Spektren mit einem Bereich von Wellenlängen fluoreszieren, so dass ein Rückstrahl 83 mit Licht von der Fluoreszenz von diesen zwei Farbstoffen durch eine spektrale Zerlegungsvorrichtung 25 in separate und unterschiedliche Strahlen 84, 85 aufgespalten wird, die jeweils eine Fluoreszenz von einem und nur einem Farbstoff darstellen und jeweils auf verschiedene PMT 30, 31 gerichtet werden. In einem solchen Fall stellt die gesamte Fluoreszenz, die von einem speziellen Kanal erfasst wird, Fluoreszenz von einem speziellen Farbstoff dar, und die gesamte Fluoreszenz, die vom anderen Kanal erfasst wird, würde den anderen Farbstoff darstellen. Unter Verwendung eines einzelnen Anregungsstrahls 81 und durch Durchführen einer einzelnen Abtastung könnten diese zwei verschiedenen Farbstoffe leicht durch Zerlegen des Rückstrahls 83 und Richten der resultierenden Strahlen 84, 85 in separate Kanäle erfasst und unterschieden werden.
In einem typischeren Fall besteht jedoch die Fluoreszenz des Rückstrahls 83 aus Fluoreszenz, die von zwei verschiedenen Farbstoffen mit überlappenden Emissionsspektren emittiert wird, so dass ein Teil der Fluoreszenz von mindestens einem der Farbstoffe auf beide der zwei Kanäle gerichtet wird. In einer solchen Situation ist es dennoch möglich, festzustellen, ob ein Farbstoff oder der andere oder eine Kombination von beiden für die Fluoreszenz, die von den zwei Kanälen des optischen Abtasters erfasst wird, verantwortlich ist. Dies erfordert eine Ermittlung des Verhältnisses der gesamten Fluoreszenzenergie, die auf die zwei verschiedenen Kanäle gerichtet wird. Dies kann durch Ermitteln eines Verhältnisses dessen, welcher Teil der Fluoreszenz jedes Farbstoffs auf jeden Kanal gerichtet wird, und Analysieren der relativen Menge an Fluoreszenzemission, die von jedem Kanal erfasst wird, durchgeführt werden.
Ein Beispiel einer solchen Situation wäre eine Probe, die Zellen enthält, die mit sowohl Cy5^TM-Farbstoff als auch Cy5.5^TM-Farbstoff markiert sind. Der Cy5^TM-Farbstoff ist ein reaktives Cyanin mit Fluoreszenzkennlinien ähnlich Allophycocyanin mit einem Molekulargewicht von weniger als eintausend. Es handelst sich um einen Succinimidylester, der als getrockneter Farbstoff bereitgestellt wird, der zum Markieren von Verbindungen bereit ist, die freie Aminogruppen enthalten, und von Biological Detection systems, Inc., in Pittsburgh, Pennsylvania, erhältlich ist. Er weist ein Absorptionsmaximum bei 652 Nanometern und ein Emissionsmaximum von 667 Nanometern und ein Emissionsspektrum von etwa 630 Nanometern bis etwa 800 Nanometern auf, wie durch die Linie 91 in 8 gezeigt.
Cy5.5^TM ist ein ähnlicher Farbstoff, der auch von Biological Detection Systems, Inc., in Pittsburgh, Pennsylvania, erhältlich ist, mit einem Emissionsmaximum bei etwa 695 Nanometern und einem Spektralbereich von etwa 650 Nanometern bis etwa 780 Nanometern, wie durch die Linie 93 in 8 gezeigt. Wenn ein Rückstrahl, der aus Fluoreszenz von diesen zwei Farbstoffen besteht, auf eine spektrale Zerlegungsvorrichtung gerichtet wird, die die Fluoreszenz in zwei Strahlen auftrennt, einen mit Wellenlängen größer als und einen kleiner als ungefähr 684 Nanometer, wie durch die Linie 95 gezeigt, und die resultierenden Strahlen auf verschiedene Kanäle 30, 31 gerichtet werden, wird ein Teil der Fluoreszenz von jedem der Farbstoffe in jeden der Kanäle gerichtet.
Jeder Farbstoff kann mittels des charakteristischen ch1/ch0-Verhältnisses seiner Fluoreszenz identifiziert werden. Dieses Verhältnis ist von der Menge an Fluoreszenz, die in jeden Kanal gerichtet wird, wie vorstehend beschrieben. Das Verhältnis ist für den Farbstoff, der fluoresziert, charakteristisch und kann, wie in 7A gezeigt, aufgetragen werden, wobei die vom Kanal Eins (ch1) erfassten Fluoreszenzeinheiten die Y-Achse sind und die vom Kanal Null (ch0) erfassten Fluoreszenzeinheiten die X-Achse sind.
Das charakteristische Verhältnis für jeden Farbstoff führt dazu, dass alle Fluoreszenzemissionen von diesem Farbstoff entlang einer Linie aufgetragen werden, wobei die Steigung dieser Linie das Verhältnis ist und der Punkt entlang der Linie die gesamte erfasste Fluoreszenzenergie ist. Mit Bezug auf beispielsweise 7A zeigt die Linie 101A eine solche Kurve von Fluoreszenzeinheiten einer Emission von Cy5^TM. Die Steigung dieser Linie stellt das Verhältnis der Fluoreszenzenergie, die in ch1 geht, relativ zu ch0 (d. h. ch1/ch0) dar. Eine weitere solche Linie ist in 7A als 100A gezeigt, die beispielsweise die Fluoreszenzemission für Cy5.5^TM darstellt. Das Verhältnis für jeden Farbstoff ist für diesen Farbstoff charakteristisch und eine erfasste Emission kann wie gezeigt aufgetragen werden. Wenn die aufgetragene Fluoreszenzemission entlang der charakteristischen Linie für einen speziellen Farbstoff fällt, kann sie als durch diesen Farbstoff emittiert korrekt identifiziert werden.
Wenn sich jedoch die relative Empfindlichkeit der Kanäle 30, 31 über die Zeit ändert, wie es manchmal auftreten kann, wenn PMTs als Detektoren verwendet werden, oder andere optische Elemente wie z. B. Spiegel oder Linsen verschmiert sind oder sich anderweitig über die Zeit ändern, ändert sich das scheinbare Verhältnis des auf jeden Kanal gerichteten Lichts. Eine solche Änderung wird mit Bezug auf 7A und 7B demonstriert. Die Linie 100A in 7A stellt das Verhältnis von ch1/ch0 dar, das durch einen speziellen optischen Abtaster für Fluoreszenzemissionen von Cy5^TM beobachtet wird. Die Linie 100B in 7B stellt dieses gleiche Verhältnis dar, das im gleichen optischen Abtaster nach einer Änderung der relativen PMT-Empfindlichkeit beobachtet wird. Der optische Abtaster kann immer noch denselben Anteil der Fluoreszenzemission auf jeden Kanal richten, aber aufgrund der relativen Änderung der Empfindlichkeit der Kanäle scheint sich das Verhältnis verändert zu haben, und eine Kurve von Emissionen von Cy5^TM 100B zeigt dann eine Linie mit einer anderen Steigung als es vorher der Fall war. Andere charakteristische Emissionsspektren, die von dem gleichen optischen Abtaster erfasst und aufgetragen werden, erfahren dieselbe scheinbare Verschiebung der charakteristischen Steigung ihrer Linien, wie durch die Linien 101A in 7A und 101B in 7B gezeigt, die das ch1/ch0-Verhältnis für Cy5^TM darstellen.
Kristalle wie z. B. ein Rubin oder Glas, das mit Ionen wie z. B. Chromionen dotiert ist, weisen auch ein charakteristisches Fluoreszenzspektrum auf, und wenn sie durch einen optischen Zweikanal-Abtaster erfasst werden, können sie auch durch ihr charakteristisches ch1/ch0-Verhältnis identifiziert werden. Dieses kann, wie durch die Linie 102A in 7A dargestellt, aufgetragen werden. Wenn sich die Empfindlichkeit der Detektoren ändert, ändert sich das scheinbare Verhältnis von ch1/ch0 für die Rubinemission auch. Dieses ändert sich um denselben Grad wie alle anderen charakteristischen Emissionen, die durch denselben optischen Abtaster erfasst werden. Mit Bezug auf die scheinbare Änderung in der Steigung der Rubinemissionslinie kann daher die Steigung der Linien für die Emission anderer Farbstoffe so ermittelt werden, dass solche Emissionen korrekt identifiziert werden können. Dies kann ohne den Bedarf durchgeführt werden, eine Kalibrierungspatrone, die reinen Farbstoff enthält, laufen zu lassen, da, wenn die Verschiebung in der Steigung der Rubin-ch1/ch0-Linie bekannt ist, sie verwendet werden kann, um die Verschiebung in den ch1/ch0-Linien für alle anderen Emissionen zu ermitteln. Rubin, der ein Kristall von Saphir, der mit Chromionen dotiert ist, ist, weist ein Emissionsspektrum auf, das durch dieselben optischen Komponenten eines optischen Abtasters angeregt, aufgespalten und erfasst wird, die zum Analysieren von vielen Farbstoffen nützlich sind, die zum Färben von biologischen Proben nützlich sind, wie z. B. Cy5^TM und Cy5.5^TM, die vorstehend beschrieben wurden. Das Emissionsspektrum von Rubin ist relativ schmal, zwischen 692 nm und 694 nm, und tritt durch die spektrale Zerlegungsvorrichtung 14 in derselben Weise wie ein Rückstrahl 83, der durch die Fluoreszenzemissionen von Cy5^TM und Cy5.5^TM erzeugt wird. Dieselbe spektrale Zerlegungsvorrichtung 25 des bevorzugten Ausführungsbeispiels, die den Rückstrahl 83 von Cy5^TM und Cy5.5^TM aufspaltet, spaltet auch einen Rückstrahl 83 auf, der durch den Rubin erzeugt wird. Das genaue Verhältnis, in dem der Rubinrückstrahl 83 aufgeteilt wird, ist nicht entscheidend, sondern für Zwecke der Erläuterung ist es in 7A als etwa 50/50 gezeigt, wobei jeder resultierende Strahl 84, 85 auf einen anderen Kanal 30, 31 gerichtet wird. Eine Kurve der ch1/ch0-Fluoreszenzeinheiten für Rubin ist durch die Linie 102A in 7A dargestellt. Wenn sich die relative Empfindlichkeit von ch1 und ch0 ändert, ändert sich die scheinbare Steigung der Linie 102A ebenfalls, wie durch die Änderung von 102A in 7A zu 102B in 7B dargestellt ist. Die Steigung dieser Linien ändert sich um denselben Faktor wie die Steigung der Linien für Cy5^TM und Cy5.5^TM. Mit Bezug auf die scheinbare Änderung im ch1/ch0-Verhältnis des Kalibrierungsrubins, kann die scheinbare Änderung im Verhältnis von ch1/ch0 für andere Farbstoffe, wie durch denselben optischen Abtaster erfasst, somit ermittelt werden und die beobachteten Daten dementsprechend justiert werden.
Die Intensität der Fluoreszenzreaktion des Rubins auf die Anregung hängt von der Konzentration von Chromionen im Rubinkristall ab. Wenn der Kristall eine zu hohe Konzentration an Chromionen enthält, weist das Fluoreszenzlicht eine zu große Intensität auf und die Strahlen 84 und 85 sättigen die Detektoren 30, 31. Die Konzentration an Chromionen im synthetischen Rubin kann während der Herstellung des synthetischen Rubins gesteuert werden, so dass ein Rubin mit der geeigneten Konzentration an Chromionen für die gewünschte Fluoreszenzintensität erhalten werden kann. Der Rubin 40 dieses Ausführungsbeispiels wird mit einer relativ niedrigen Konzentration an Chromionen, beispielsweise 37 ± 12 Parts per million, hergestellt.
Der eingebaute Kalibrierungsrubin 45 ist relativ dünn, im Allgemeinen zwischen 0,5 mm und 1,0 mm dick. Während einer Abtastung wird der Anregungsstrahl 81 durch die Objektivlinse 19 auf den Rubin gerichtet, die auf eine gaußartige Einschnürung 51 fokussiert, die einen Durchmesser von 10 Mikrometern aufweist und 100 Mikrometer tief ist. Der Anregungsstrahl 81 kann eine maximale Emission von einem beliebigen Rubin, der eine Tiefe von über 100 Mikrometern aufweist, anregen, mit anderen Worten, sobald die gesamte gaußartige Einschnürung innerhalb des Rubins 40 liegt. Während einer Abtastung wird die Objektivlinse 19 allmählich in Richtung des Rubins 40 bewegt, was die gaußartige Einschnürung durch den Rubin bewegt, um einen maximalen Emissionswert zu bestimmen. Die maximale Anregung wird erreicht, sobald die gaußartige Einschnürung vollständig innerhalb des Kristalls enthalten ist. Wenn der Brennbereich (d. h. gaußartige Einschnürung) des Objektivs über die ferne Oberfläche des Rubins hinaus bewegt wird, beginnt die emittierte Fluoreszenz, sich zu verringern. Somit kann die Software, die die Emission erfasst, feststellen, dass der erfasste Emissionswert zugenommen hat, sich für eine Zeit auf dem Maximalwert stabilisiert hat, und dann begonnen hat, abzunehmen. Die Software kann somit den höchsten erreichten Wert als Maximalwert auswählen, mit dem Vertrauen, dass sich der Wert nicht erhöht hätte, wenn die Rubinabtastung fortgesetzt worden wäre.
Die Ausrichtung der Kristallstruktur des Rubins bezüglich des Anregungsstrahls 81 beeinflusst sowohl die Intensität der Fluoreszenz als auch die Wellenlänge, bei der die spektrale Zerlegungsvorrichtung 25 den emittierten Strahl 83 aufspaltet. Im Rubin kann die Intensität des emittierten Lichts beispielsweise um nicht weniger als einen Faktor von drei in Abhängigkeit von der Rubinausrichtung relativ zum Anregungsstrahl 81 variieren. Obwohl die Änderung der Intensität den Spektralbereich der Emission des Rubins nicht beeinflusst und daher das Verhältnis des emittierten Lichts, das von jedem der Kanäle 30, 31 erfasst wird, nicht signifikant beeinflusst, variiert die erfasste Gesamtintensität. Da Daten hinsichtlich der beobachteten absoluten Intensität zum Überwachten der fortgesetzten korrekten Funktion der Anlage und des geeigneten Pegels an Farbstoff, der mit der Probe 53 vermischt ist, wichtig ist und eine nützliche Diagnoseinformation erzeugen kann, sollte die absolute Intensität von Zeit zu Zeit kalibriert werden. Um den optischen Abtaster für die Empfindlichkeit gegen die Fluoreszenzintensität zu kalibrieren, muss die Ausrichtung der Kristallstruktur des Kalibrierungsrubins jedes Mal relativ zum Anregungsstrahl gleich sein.
Die Ausrichtung der Kristallstruktur relativ zum Anregungsstrahl ist auch wichtig, um Emissionen mit jedes Mal der gleichen Polarisation zu erzeugen. Die Wellenlänge, bei der ein dichroitischer Spiegel 25 die Spektralemission vom Rubin aufspaltet, variiert in Abhängigkeit von der Polarisation des Lichts, das auf den Spiegel auftrifft. Um eine Konsistenz im ch1/ch0-Verhältnis von Abtastung zu Abtastung aufrechtzuerhalten, wobei alle anderen Faktoren gleich sind, muss die Polarisation der emittierten Fluoreszenz folglich jedes Mal gleich sein. Die Polarisation des emittierten Lichts variiert in Abhängigkeit von der Ausrichtung der Kristallstruktur. Aus diesem Grund sowie wegen der Intensität der Fluoreszenzemission muss die Ausrichtung der Kristallstruktur daher von Abtastung zu Abtastung konsistent sein.
Beide dieser Besorgnisse über die Umgebungskristallausrichtung, Intensität und Polarisation, werden durch die Form des Rubins gelöst. Mit Bezug auf 6 ist der Rubin 45 ein rechteckiger Quader. Die Kristallstruktur des Rubins 40 wird in bezug auf die parallelen Seiten des Rechtecks festgelegt. Der Rubin 45 kann beispielsweise erhalten werden, wobei die optische Kristallachse 60°–65° von der polierten Oberfläche 42 senkrecht ist. Mit Bezug auf 5 ist der Rubin 45 rechteckig geformt und so bemessen, dass er bündig in eine rechteckige Vertiefung in einem Trägerarm 46 der Modulplatte 48 passt. Vom Rubin 45 emittiertes Licht dreht sich in der Polarisation einmal für jede Drehung des Kristalls von 180°, so dass, wenn der rechteckige Rubin 45 in eine rechteckige Vertiefung im Trägerarm 44 eingesetzt wird, der Rubin nur in zwei möglichen Orientierungen orientiert werden kann, und beide führen zur gleichen Polarisation des vom Rubin emittierten Lichts. Der relativ dünne Rubin kann auch mit einer der großen Flächen als obere Fläche angeordnet um 180° gedreht werden. Dies führt auch zu einer Orientierung der inneren Kristallstruktur, die Licht mit der korrekten Polarisation erzeugt.
Ein ähnliches Verfahren zum Orientieren des Rubins in einer vorhersagbaren Weise kann für den "Goldstandard"-Rubin 41 verwendet werden. Anstatt in eine rechteckige Vertiefung eingefügt zu werden, die sich in einem Trägerarm 46 in der Modulplatte 48 befindet, wie der Kalibrierungsrubin 45, kann der "Goldstandard"-Rubin 41 ebenso geformt und bündig in einer rechteckigen Vertiefung in einer Patrone 60 angeordnet werden, wie in 3 dargestellt, wobei der Rubin 41 auf der Patrone dort angeordnet wird, wo sich ein Teil der Kapillare 20 in der Probenpatrone 49 befindet. Die Patrone 60 kann auf der Modulplatte 48 in der Weise von Patronen 49 zum Abtasten angeordnet werden.
Mit Bezug auf 2 wird, wenn eine Abtastung an einem Rubin, entweder am "Goldstandard"-Rubin 41 oder am Kalibrierungsrubin 45, durchgeführt wird, der Rubin unterhalb der Objektivlinse 19 angeordnet und ein Anregungsstrahl 81 wird auf den Rubin gerichtet, wobei der Galvanometerspiegel 18 stationär ist. Der Anregungsstrahl 81 bewirkt, dass der Rubin mit einem Spektrum über die Wellenlängen von 692 Nanometern bis 694 Nanometern fluoresziert. Die Fluoreszenz wird durch die Objektivlinse 19 gesammelt und auf das Erfassungsmittel 35 als Rückstrahl 83 zurück gerichtet. Wenn er auf den dichroitischen Spiegel 14 auftrifft, wird der Strahl nicht reflektiert, sondern wird vielmehr durch den dichroitischen Spiegel und von dort durch das Bandpassfilter 21 zum Spiegel 22 durchgelassen. Er wird vom Spiegel 22 durch die Kollimationslinse 23 hindurch reflektiert und anschließend durch das räumliche Filter 24 und in das Erfassungsmittel 35.
Das Erfassungsmittel 35 bildet mindestens einen Erfassungskanal wie z. B. PMT 30, der das Fluoreszenzsignal des Rückstrahls 83 liest und mit dem Datenleser 50 in Verbindung steht, der das von der PMT gemeldete Signal von der analogen in die digitale Form umwandelt. In dem in 1 dargestellten Detektor wird der Rückstrahl 83 auf eine spektrale Zerlegungsvorrichtung 25 gerichtet, die den Rückstrahl in resultierende Strahlen 84, 85 aufspaltet, von denen jeder dann auf jeweils separate Erfassungskanäle 30, 31 gerichtet wird. Das von jeder PMT erzeugte Signal wird vom Datenleser in Einheiten der Fluoreszenzintensität gelesen, die als A/D-cts bezeichnet werden können, was sich auf die Daten in analoger Form vom Detektor bezieht, die vom Datenleser in digitale Datenzählwerte umgewandelt werden.
Der optische Abtaster kann direkt gegen einen "Goldstandard"-Rubin 41 kalibriert werden, um Standard-Fluoreszenzeinheiten zu melden. Dadurch können Standard-Fluoreszenzeinheiten zum Messen der absoluten Fluoreszenzintensität unter allen optischen Abtastern, die gegen den Goldstandard-Rubin 41 kalibriert werden, festgelegt werden.
In der Praxis werden die optischen Abtaster indirekt gegen den "Goldstandard"-Rubin 41 kalibriert; ein in den optischen Abtaster eingebauter Kalibrierungsrubin 45 wird gegen den Goldstandard-Rubin bewertet. Wenn der optische Abtaster anschließend gegen den eingebauten Kalibrierungsrubin 45 kalibriert wird, kann der optische Abtaster eingestellt werden, um Standard- Fluoreszenzeinheiten zu melden, wie durch den "Goldstandard"-Rubin 41 festgelegt.
Diese Kalibrierung zum Melden von Standard-Fluoreszenzeinheiten durch einen speziellen optischen Abtaster wird folgendermaßen durchgeführt. Ein Kalibrierungsrubin 45 wird in den Trägerarm 46 der Modulplatte 48 eingebaut. Die Modulplatte wird gedreht, bis sich der Kalibrierungsrubin direkt unter dem Objektiv 19 des optischen Abtasters befindet. Die Modulplatte stoppt dann die Drehung und der Kalibrierungsrubin liegt stationär unter dem Objektiv. Ein Strahl vom Laser 10 wird auf den Rubin gerichtet, der als Ergebnis Fluoreszenz emittiert. Die vom Kalibrierungsrubin 45 emittierte Fluoreszenz wird zu einem Rückstrahl 83 gesammelt und wird auf den Detektor oder in einem optischen Zweikanal-Abtaster jeden Detektor 30, 31 gerichtet. Der maximale Fluoreszenzwert, der auch als Spitzenwert bekannt ist, der Fluoreszenz des Kalibrierungsrubins 45 wird ermittelt.
Jeder Detektor 30, 31 ist eine Photovervielfacherröhre (PMT), deren Empfindlichkeit durch Einstellen der an ihre Vorspannung angelegten Spannung eingestellt werden kann. Wenn die vom Kalibrierungsrubin emittierte Fluoreszenz erfasst wird, wird die Vorspannung eingestellt, bis ihre Empfindlichkeit auf die maximale erfasste Fluoreszenz innerhalb eines vorbestimmten Bereichs, beispielsweise etwa 1000 A/D-Zählwerte, liegt. In einem Zweikanal-Detektor kann dieselbe Prozedur verwendet werden, um anfänglich die Vorspannung hinsichtlich jedes Kanals festzulegen.
Anschließend wird ein Goldstandard-Rubin 41, der sich im Allgemeinen auf einer Patrone 60 befindet, wie in 3 dargestellt, auf der Modulplatte 48 angeordnet. Die Modulplatte 48 wird gedreht, bis sich der Goldstandard-Rubin 41 direkt unter dem Objektiv 19 befindet. Die Modulplatte 48 stoppt dann die Drehung und der Goldstandard-Rubin 41 liegt stationär unter dem Objektiv 19. Ein Anregungsstrahl 81 vom Laser 10 wird auf den "Goldstandard"-Rubin 41 gerichtet, welcher als Folge Fluoreszenz emittiert. Die vom "Goldstandard"-Rubin 41 emittierte Fluoreszenz wird zu einem Rückstrahl 83 gesammelt und auf den Detektor oder die Detektoren 35 gerichtet wie der Rückstrahl des Kalibrierungsrubins 45. Die maximale Intensität der Fluoreszenz des "Goldstandard"-Rubins 41 (Spitzenwert) wird dann ermittelt und der Kalibrierungsrubin 45 wird dann gegen den "Goldstandard"-Rubin 41 bewertet, indem ein Faktor ermittelt wird, durch den die Fluoreszenzeinheiten des Spitzenwerts des Kalibrierungsrubins 41 in Fluoreszenzeinheiten des Spitzenwerts des "Goldstandard"-Rubins 41 umgewandelt werden können. Diese Einstellung kann an der Empfindlichkeit der Detektoren wie durch Einstellen der Vorspannung an einer PMT durchgeführt werden oder kann eine mathematische Korrektur sein, die auf Daten angewendet wird, die vom optischen Abtaster abgeleitet werden.
Die Intensität der Fluoreszenzemission eines Rubins wird durch die Temperatur beeinflusst. Über einen Bereich von 15°C bis 35°C kann die Signalamplitude beispielsweise um nicht weniger als 30% in jedem Kanal variieren. Es ist daher notwendig, die Temperatur des Kalibrierungsrubins 45 zum Zeitpunkt seiner Bewertung gegen den "Goldstandard"-Rubin 41 und wieder später, sobald der optische Abtaster gegen den Kalibrierungsrubin 45 kalibriert wird, zu ermitteln, um jegliche Differenz zu kompensieren. Die Einstellung, die für eine spezielle Temperaturschwankung geeignet ist, ist durch Bezugnahme auf eine Nachschlagetabelle erhältlich. Für den in diesem Ausführungsbeispiel beschriebenen Rubin wurde die Nachschlagetabelle experimentell ermittelt, gegen eine Temperatur von 25°C normiert, und ein Faktor zur Normierung der Intensität ist aufgelistet, der in einem Bereich zwischen einem Faktor von 0,71 für 5°C und 1,30 für 45°C liegt. Die Nachschlagetabelle ist in 9 dargestellt.
In der Praxis wurde festgestellt, dass es angemessen ist, die Temperatur vielmehr der unmittelbaren Umgebung des Rubins 45, wie z. B. des Inneren des optischen Abtasters im Allgemeinen, zu messen als die Temperatur des Rubins selbst direkt zu messen, vorausgesetzt, dass ausreichend Zeit und Bestrahlung vorgesehen werden, um zu ermöglichen, dass der Rubin ungefähr dieselbe Temperatur erreicht wie seine Umgebung. Daher wurde es als angemessen festgestellt, einen Temperaturfühler 75 innerhalb des optischen Abtasters anzuordnen und nicht die Temperatur des Kalibrierungsrubins 45 direkt zu messen. Der Kalibrierungsrubin 45 wird auf der Modulplatte 48 montiert, die sich als Teil der Abtastprozedur dreht, und der Goldstandard-Rubin 41 befindet sich an einer Patrone 60, die auf der Modulplatte 48 angeordnet ist und sich auch bei der Verwendung dreht. Ein Temperaturfühler 75, der die Temperatur eines Rubins, der sich frei drehen können muss, nicht direkt messen muss, wurde als zweckmäßiger und weniger teuer herzustellen und zu bedienen als ein Temperaturfühler, der die Temperatur eines solchen Rubins direkt misst, befunden.
Wenn der Abtaster zwei Kanäle aufweist, können beide gleichzeitig durch einen einzelnen Kalibrierungsrubin 45 kalibriert werden. Die Anregung des Kalibrierungsrubins 45 und die Erzeugung eines Rückstrahls 83 dadurch sind wie vorstehend beschrieben. Wenn der Rückstrahl 83 auf die spektrale Zerlegungsvorrichtung 25, wie z. B. einen dichroitischen Spiegel, gerichtet wird, wird der Strahl in resultierende Strahlen 84 und 85 zerlegt, die auf zwei Detektoren 30 und 31 wie z. B. PMTs gerichtet werden. Jeder dieser resultierenden Strahlen kann dann verwendet werden, um die Empfindlichkeit der PMTs 30, 31 durch Einstellen ihrer Vorspannung festzulegen. Anschließend wird ein Goldstandard-Rubin 41 abgetastet, sein Rückstrahl 83 wird ebenso aufgespalten und die resultierenden Strahlen 84, 85 auf die PMTs 30, 31 gerichtet und die Intensität von jedem für jeden Kanal aufgezeichnet. Ein Kompensationsfaktor für jeden Kanal 30, 31 wird dann ermittelt, durch den die Emission des Kalibrierungsrubins 45 gegen den Goldstandard-Rubin 41 kalibriert wird, um einen Wert zu erhalten, durch den der Kalibrierungsrubin so bewertet werden kann, dass sein Ausgangssignal Standardeinheiten der absoluten Fluoreszenzintensität meldet. Wenn der Kalibrierungsrubin 45 abgetastet ist, können anschließend beide Kanäle 30, 31 gleichzeitig kalibriert werden, um Standard-Fluoreszenzeinheiten zu melden, wie mit Bezug auf den Goldstandard-Rubin 41 festgelegt.
Mit Bezug auf 7A und 7B, in denen zwei Farbstoffe mit überlappenden Spektren wie z. B. Cy5^TM und Cy5.5^TM in einem optischen Zweikanal-Abtaster wie z. B. dem in 1 dargestellten erfasst werden, führen Änderungen der Empfindlichkeit von einem oder beiden der Kanäle über die Zeit zu Änderungen des scheinbaren ch1/ch0-Verhältnisses des Fluoreszenzsignals für jeden. Das ch1/ch0-Verhältnis der Rubinemission erfährt eine gleiche scheinbare Änderung, aber die drei Verhältnisse bleiben relativ zueinander konstant. Da die Identifikation des relevanten Farbstoffs (und somit der Zelle, an der er konzentriert ist) von einer genauen Ermittlung des charakteristischen ch1/ch0-Verhältnisses abhängt, ist es erforderlich, dieses Verhältnis zum Zeitpunkt irgendeines Tests genau zu ermitteln, um eine korrekte Identifikation des Farbstoffs und somit der Zelle sicherzustellen. Dies kann durch Bezugnahme auf Fluoreszenzemissionen vom Kalibrierungsrubin 45 durchgeführt werden. Anders ausgedrückt, wenn das ch1/ch0-Verhältnis für irgendeinen Farbstoff eine scheinbare Änderung aufgrund von Änderungen der Kanalempfindlichkeit aufweist, weist die Rubinemission eine scheinbare Änderung in ihrem ch1/ch0-Verhältnis um denselben Faktor auf. Daher kann das korrekte ch1/ch0- Verhältnis für irgendeinen Farbstoff nach einer scheinbaren Änderung ermittelt werden, wenn das ch1/ch0-Verhältnis für diesen Farbstoff relativ zu einem ch1/ch0-Verhältnis des Kalibrierungsrubins 45 ermittelt wurde. Das ch1/ch0-Verhältnis des Rubins nach der scheinbaren Änderung kann dann ermittelt werden und die zwischen dem ursprünglichen ch1/ch0-Verhältnis für den Rubin und für den Farbstoff scheinbar erfahrene Änderung ist dieselbe.
In der Praxis können mehrere verschiedene Kalibrierungen des optischen Abtasters durchgeführt werden, alle mit Bezug auf den Standard des synthetischen Rubins. Anfänglich wird der optische Abtaster gegen einen Goldstandard-Rubin 41 kalibriert, um die Empfindlichkeit gegen die Fluoreszenzintensität festzulegen, die einen gleichmäßigen Standard von Fluoreszenzeinheiten für alle optischen Abtaster vorsieht, die direkt oder indirekt gegen den Goldstandard-Rubin 41 kalibriert werden. Außerdem kann ein Kalibrierungsrubin 45 mit jedem optischen Abtaster geliefert und gegen den Goldstandard-Rubin 41 kalibriert werden. Dieser Kalibrierungsrubin 41 kann dann in den optischen Abtaster eingebaut werden, so dass der optische Abtaster routinemäßig und automatisch (beispielsweise sobald der optische Abtaster eingeschaltet wird) mit Bezug auf den Kalibrierungsrubin kalibriert werden kann, um genau Fluoreszenzeinheiten zu melden, die Standard-Fluoreszenzeinheiten darstellen. Wenn ein Zweikanal-Detektor vorgesehen ist und die Spektralemission des Rubins in zwei Strahlen 84, 85 aufgetrennt wird, wobei jeder auf zwei verschiedene Kanäle 30, 31 gerichtet wird, können beide Kanäle gleichzeitig mit Bezug auf einen einzelnen Rubinkristall kalibriert werden. Selbst wenn keine absolute Kalibrierung von jedem der zwei Kanäle durchgeführt wird, kann ein ch1/ch0-Verhältnis für den Rubin ermittelt werden und anschließende Einstellungen physikalisch oder mathematisch vorgenommen werden, um jegliche Änderungen in der relativen Empfindlichkeit der zwei Kanäle zu justieren.
Mit Bezug auf 10 ist ein Verfahren zum indirekten Kalibrieren eines optischen Abtasters gegen einen Goldstandard-Rubin 41 durch Vergleichen der von einem Kalibrierungsrubin 45 emittierten Fluoreszenz mit der vom Goldstandard-Rubin 41 emittierten, Ermitteln eines Korrekturfaktors, der auf den Kalibrierungsrubin 45 anwendbar ist, und anschließend Kalibrieren des optischen Abtasters gegen den Kalibrierungsrubin 45 und Einstellen des optischen Abtasters mit Bezug auf den Korrekturfaktor, um eine Einstellung von Standard-Fluoreszenzeinheiten zu erhalten, dargestellt. Dieses Verfahren wird hier mit Bezug auf einen Zweikanal-Detektor und mit Bezug auf die Messung der Fluoreszenzintensität vom Kalibrierungsrubin 45 vor der Messung der Fluoreszenzemission vom Goldstandard-Rubin 41 beschrieben. Es ist jedoch für Fachleute leicht zu erkennen, dass die Kalibrierung zur Verwendung in einem Einkanal-Detektor ähnlich ist. Es wird von einem Fachmann auch leicht wahrgenommen, dass die Reihenfolge der Erfassung der Fluoreszenz so sein kann, dass entweder die Fluoreszenz vom Kalibrierungsrubin 45 zuerst erfasst wird oder vom Goldstandard-Rubin 41 zuerst erfasst wird.
Um die Kalibrierung zu beginnen, wird der optische Abtaster eingeschaltet und seine Komponenten, insbesondere der Laser 10, die PMTs 30, 31, der Temperaturfühler 75 und der Kalibrierungsrubin 45 läßt man aufwärmen. Dies stellt während der Kalibrierung eine relativ stabile Temperatur bereit. Die Detektoren von jedem Kanal 30, 31 werden jeweils auf eine anfängliche Empfindlichkeit eingestellt. Für eine zukünftige Bezugnahme kann dieser Wert zur Verwendung während der automatischen Einstellung gespeichert werden, wenn der optische Abtaster erstmals eingeschaltet wird. Im Fall von PMTs wird die Empfindlichkeit durch die Vorspannung eingestellt und es ist der Wert dieser Spannung, der für die spätere Verwendung aufgezeichnet werden kann. Für die Erörterung hier werden die Vorspannungen von ch1 und ch0 als hv1 bzw. hv0 bezeichnet. Der Laser wird eingeschaltet und seine Leistung wird mit der eingebauten Photodiode 11 gemessen und die Laserleistung wird dann gespeichert. Für die Erörterung hier wird dieser Laserleistungswert als laser0 bezeichnet.
Der Laser 10 erzeugt dann einen Anregungsstrahl 81, der dann auf den Kalibrierungsrubin 45 gerichtet wird, und die so erzeugte Fluoreszenz wird als Rückstrahl 83 gesammelt und auf die Detektoren 30, 31 gerichtet. Das maximale Signal für jeden Kanal wird dann aufgezeichnet. Für die Erörterung hier wird dieser maximale festgestellte Wert für den Kanal 1 als ref1 und für den Kanal 0 als ref0 bezeichnet.
Die Temperatur wird vom Temperaturfühler gelesen und für die spätere Verwendung aufgezeichnet. Für die Erörterung hier wird diese als temp0 bezeichnet.
Der "Goldstandard"-Rubin 41, der in einer Kunststoffpatrone 60 montiert sein kann, wird unter dem Objektiv 19 angeordnet, zur Fluoreszenz durch den Anregungsstrahl 81 angeregt, die emittierte Fluoreszenz wird durch dieselben optischen Komponenten aufgetrennt wie es für den Kalibrierungsrubin 45 im vorherigen Absatz der Fall war, und das maximale Signal für jeden Kanal wird dann aufgezeichnet. Diese maximalen Werte für das in ch1 und ch0 abgetastete Signal werden für diese Erörterung als gold1 bzw. gold0 bezeichnet.
Der Kalibrierungsrubin wird dann durch Ermitteln eines Korrekturfaktors für jeden Kanal bewertet, durch den Einheiten der Fluoreszenz, die für die Fluoreszenz vom Kalibrierungsrubin 45 gemeldet werden, auf gleiche Fluoreszenzeinheiten eingestellt werden können, wie für Fluoreszenz gemeldet, die vom "Goldstandard"-Rubin 41 erzeugt wird. Unter Verwendung der vorstehend dargelegten Begriffe und mit Bezug auf diese Korrekturfaktoren für ch1 bzw. ch0 als corr1 und corr0 kann die Ermittlung dieser Korrekturfaktoren folgendermaßen ausgedrückt werden: corr1 = gold1/ref1 und corr0 = gold0/ref0. Dieser Korrekturfaktor gilt für den Kalibrierungsrubin 45 und kann anschließend somit verwendet werden, um die Empfindlichkeit des optischen Abtasters in bezug auf den "Goldstandard"-Rubin 41 einzustellen. Als Beispiel, selbst wenn die optischen Komponenten abwandern, wie z. B. eine Senkung der Leistung des Lasers 10 oder eine Gesamtverringerung oder -erhöhung der Effizienz, mit der der optische Abtaster die Fluoreszenz erfasst, gilt der Korrekturfaktor für den Kalibrierungsrubin 45, da alles abgetastete denselben optischen Effekten wie der Kalibrierungsrubin 45 unterliegt. (Dies gilt natürlich mit Bezug auf die Intensität der Fluoreszenz, nicht die Spektralkennlinien.) Wenn der Kalibrierungsrubin 45 Fluoreszenz mit zweimal der Intensität des "Goldstandard"-Rubins 41 erzeugt und gold1 2000 A/D-cts ist, dann wäre die in ch1 erfasste Fluoreszenz für den Kalibrierungsrubin 45 4000 A/D-cts. Der Standardwert in Fluoreszenzeinheiten, der sinnvoll mit anderen optischen Abtastern, die ebenso kalibriert werden, verglichen werden kann, wäre folglich: corr0* (erfasste Einheiten), was in dieser Erläuterung (2000 A/D-cts/4000 A/D-cts) × (erfasste Einheiten) wäre.
Mit Bezug auf 11 kann der Kalibrierungsrubin 45 verwendet werden, um die Empfindlichkeit der Detektoren 30, 31 automatisch einzustellen, sobald der optische Abtaster eingeschaltet wird. Die Empfindlichkeit der Detektoren wird anfänglich auf das Niveau gesetzt, das beim vorherigen Mal, als der optische Abtaster eingeschaltet wurde, festgelegt wurde. Wenn beispielsweise PMTs als Detektoren verwendet werden, ist die anfängliche Vorspannung der PMTs hv1 und hv0 für ch1 bzw. ch0. Wenn der optische Abtaster eingeschaltet wird, wird die Leistung des Lasers 10 gemessen (in dieser Erörterung als laser1 bezeichnet), der Kalibrierungsrubin 45 wird unterhalb des Objektivs 19 angeordnet, eine Rubinabtastung wird an dem Kalibrierungsrubin 45 durchgeführt und das maximale Signal für den Kanal Eins 30 und den Kanal Null 31 werden jeweils aufgezeichnet. Für unsere Erörterung hier werden diese Werte als ruby1 bzw. ruby0 bezeichnet.
Wenn ruby1 und ruby0 außerhalb einen vorbestimmten Bereich fallen, wobei der Bereich eine Funktion von laser1, laser0, ref1 und ref0 ist, dann stellt der optische Abtaster automatisch die Empfindlichkeit jedes Detektors durch Einstellen von beispielsweise hv1 und hv0 ein, um das Signal dieses Kanals in den vorbestimmten Bereich zurückzubringen. Bis sich der Laser aufwärmt, was so lang wie 20 Minuten dauern kann, ist laser1 geringer als laser0. Der annehmbare Bereich für ruby1 und ruby0 ist:
Die neuen Einstellungen für die Empfindlichkeit der Detektoren wird dann gespeichert, um als anfängliche Einstellung beim nächsten Mal, wenn der optische Abtaster eingeschaltet wird, verwendet zu werden. Wenn die Detektoren beispielsweise PMTs sind, ersetzen die neu ermittelten hv0 und hv1 die vorherigen Werte für hv0 und hv1.
Es kann angemerkt werden, dass diese Kalibrierung automatisch und ohne Benutzereingriff stattfinden kann. Der optische Abtaster kann somit ausgelegt werden, um zweckmäßig, automatisch und ohne Benutzereingriff sich selbst zu kalibrieren jedes Mal, wenn der optische Abtaster eingeschaltet wird. Wenn sich irgendeine Komponente hinsichtlich der Empfindlichkeit so verändert hat, dass keine zuverlässige Kalibrierung durchgeführt werden kann, kann der Benutzer benachrichtigt werden, dass beispielsweise eine Wartung oder Reparatur des optischen Abtasters erforderlich ist.
Wenn ein optischer Detektor eine Vielzahl von Kanälen aufweist, wobei jeder einen Teil der emittierten Fluoreszenz von einer speziellen Art Farbstoff in einer Probe erfasst, kann es möglich sein, die Quelle der emittierten Fluoreszenz durch Bezugnahme auf das Verhältnis der in jedem Kanal erfassten Fluoreszenz zu identifizieren. Um dies durchzuführen, muss jedoch ein charakteristisches ch1/ch0-Verhältnis zum Identifizieren der emittierten Fluoreszenz von jedem derartigen Farbstoff erhalten werden. Wenn die Empfindlichkeit von einem Kanal des optischen Abtasters relativ zum anderen variiert, muss das ch1/ch0-Verhältnis zweckmäßiger eingestellt werden, um die Differenz zu kompensieren.
In der Praxis kann dies automatisch von dem vorstehend beschriebenen optischen Abtaster mit Bezug auf den eingebauten Kalibrierungsrubin 45 durchgeführt werden. Mit Bezug auf 12 kann dies folgendermaßen beschrieben werden:
Das charakteristische ch1/ch0-Verhältnis, das anfänglich für den interessierenden Farbstoff geeignet ist, wird durch Durchführen einer Abtastung an einer Probe, die nur diesen Farbstoff enthält, und Aufzeichnen des Verhältnisses der in ch1 erfassten Fluoreszenz im Vergleich zu ch0 (d. h. ch1/ch0) ermittelt. Eine Patrone kann beispielsweise hergestellt werden, die Blut enthält, das nur mit Cy5^TM markiert ist, und eine Abtastung an dieser Patrone durchgeführt werden und die Menge an von jedem Kanal erfasster optischer Fluoreszenz aufgezeichnet werden. Für Zwecke der Erörterung wird der Wert für die Fluoreszenz, der im Kanal 1 und Kanal 0 empfangen wird, als ch1Cy5 bzw. ch0Cy5 bezeichnet. Das charakteristische ch1/ch0-Verhältnis für Cy5^TM ist daher ch1Cy5/ch0Cy5 und wird für diese Erörterung als compCy5 bezeichnet. (Derselben Prozedur kann für andere Farbstoffe mit einem charakteristischen Fluoreszenzspektrum gefolgt werden, z. B. Cy5.5^TM.)
Der Kalibrierungsrubin 45 wird zur Emission von Fluoreszenz angeregt und das maximale Signal in jedem Kanal wird aufgezeichnet. Für Zwecke der Erörterung werden diese als calib1 für ch1 und calib0 für ch0 bezeichnet. Das Rubin-ch1/ch0-Verhältnis zu diesem Zeitpunkt ist daher calib1/calib0.
Mit Bezug auf 13 kann jegliche Änderung im ch1/ch0-Verhältnis für irgendeinen Farbstoff anschließend mit Bezug auf den Kalibrierungsrubin ermittelt werden. Dies kann folgendermaßen mit Bezug auf Cy5^TM dargestellt werden. Unmittelbar vor dem Abtasten irgendeiner Serie von Probenpatronen, beispielsweise einer Modulplatte 48, die zehn Patronen 49 mit Proben, die mit Cy5^TM gefärbt sind, enthält, kann ein genaues ch1/ch0-Verhältnis zur Identifikation des Cy5^TM-Farbstoffs wie hier beschrieben erhalten werden. Der Kalibrierungsrubin 45 wird zum Fluoreszieren und zum Erzeugen eines Rückstrahls 83 angeregt, der Rückstrahl wird in zwei resultierende Strahlen 84, 85 aufgetrennt und die Fluoreszenz dieser resultierenden Strahlen wird in den jeweiligen Kanälen 30, 31 des optischen Abtasters erfasst. Das Verhältnis von Licht, das in jedem Kanal empfangen wird, wird ermittelt (beispielsweise als newruby1 für Kanal Eins und newruby0 für Kanal 0), ein Verhältnis wird ermittelt (newruby1/newruby0) und dieses Verhältnis wird mit dem Verhältnis verglichen, das ermittelt wurde, als compCy5 festgestellt wurde (calib1/calib0). Die relative Änderung dieser Verhältnisse ist die gleiche wie die relative Änderung des Verhältnisses für compCy5. Ein korrigiertes charakteristisches ch1/ch0-Verhältnis kann durch Justieren dieser Änderung ermittelt werden (newcompCy5 = compCy5 ([newruby1/newruby0]/[calib1/calib0]).
Außerdem können die gemeldeten Werte für die Spitzen- und die Hintergrundfluoreszenz, d. h. für die absolute Empfindlichkeit gegen die Fluoreszenz, für irgendeine Temperaturänderung normiert werden. Der Temperaturfühler kann die Temperatur zum Zeitpunkt des Serientests erfassen und diese mit der Temperatur zu dem Zeitpunkt, zu dem der optische Abtaster anfänglich kalibriert wurde, vergleichen. Ein Faktor kann aus einer Nachschlagetabelle erhalten werden, um die gemeldeten Daten zu korrigieren, um diese Temperaturdifferenz zu justieren.
Diese Kalibrierung und Justierung können wieder automatisch ohne die Notwendigkeit für irgendeine Eingabe vom Benutzer durchgeführt werden. Daher können die Ergebnisse bequem und automatisch kalibriert und auf die Temperatur eingestellt werden, ohne die Notwendigkeit für ein Benutzertraining oder den Bedarf für eine Bedienpersonensteuerung, wodurch die Prozedur signifikant vereinfacht wird und das Potential für einen Bedienpersonenfehler minimiert wird.
Das vorstehend beschriebene Ausführungsbeispiel stand mit einem Festkörper-Rubinkristall und mit der Erfassung der als Cy5^TM und Cy5.5^TM beschriebenen Farbstoffe in Beziehung. Es ist jedoch für Fachleute leicht zu erkennen, dass die Verwendung von anderen kristallinen Festkörperstandards, die Fluoreszenz mit einem anderen Spektralbereich als Rubin emittieren, mit optischen Abtastern angewendet werden kann, die dazu ausgelegt sind, Farbstoffe mit anderen Emissionsspektren als jenen von Cy5^TM und Cy5.5^TM zu erfassen. Glas, das mit Ionen dotiert ist, die fluoreszieren, oder andere Kristalle können beispielsweise Fluoreszenzspektren aufweisen, die zur Verwendung mit optischen Abtastern geeignet sind. Wenn der fragliche Festkörperstandard ein konsistentes und charakteristisches Fluoreszenzspektrum aufweist, das unter Verwendung von optischen Komponenten, die z. B. für das Emissionsspektrum von irgendeinem brauchbaren Farbstoff geeignet sind, analysiert und erfasst werden kann, dann kann ein optischer Abtaster mit Bezug auf einen solchen anderen Kristall in der hier beschriebenen Weise kalibriert werden. Die Emissionsspektren von verschiedenen Kristallen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können mit Bezug auf allgemein zur Verfügung stehende Literatur erhalten werden, beispielsweise die Liste von Laserkristallen, die in L. G. DeShazer et al, Handbook of Laser Science and Technology, Band 5, Kapitel 2.9, mit dem Titel "Laser Crystals", (M. J. Weber, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, FL 1987), und in A. A. Kaminskii, Springer Ser. Opt. Sci., Band 14, Kapitel 2.55, mit dem Titel "Laser Crystals" (Springer, Berlin, Heidelberg 1981), zu finden ist.
In der Praxis können optische Abtaster der hier beschriebenen Art mit Bezug auf einen Goldstandard kalibriert werden, um einen absoluten Fluoreszenzstandard bereitzustellen, der verwendet werden kann, um Daten in einer sinnvollen Weise relativ zu anderen so kalibrierten optischen Abtastern zu quantifizieren. Wenn der optische Abtaster das emittierte Fluoreszenzspektrum zwischen zwei Erfassungskanälen aufteilt, kann ein Festkörperstandard verwendet werden, um beide Kanäle gleichzeitig zu kalibrieren und ein Verhältnis der Menge an Fluoreszenz von diesem Standard, die von einem Kanal erfasst wird, in bezug auf den anderen zu ermitteln. Wenn sich dieses Verhältnis über die Zeit ändert, kann dieser Festkörperstandard verwendet werden, um das Ausmaß und die Art der relativen Änderung zu ermitteln und Daten zu kompensieren, die von jeglicher Fluoreszenz beobachtet werden, wie z. B. Farbstoffe, um jegliche solche Änderung zu justieren.
Schließlich kann die Temperatur zum Zeitpunkt des Tests überwacht werden, um jegliche Temperaturänderungen zwischen den Tests zu kompensieren.
Da ein Festkörperstandard robust und stabil ist, kann er in einen optischen Abtaster eingebaut werden, um eine bequeme und automatische Kalibrierung als Teil der Routine und einen automatischen Betrieb des optischen Abtasters in einer weise vorzusehen, die keine Bedienpersonensteuerung oder -eingabe erfordert. Ein solcher Standard kann vorgesehen werden, der über einen signifikanten Zeitraum permanent und wiederverwendbar ist ohne den Bedarf, den Standard auszutauschen oder einzustellen. Dies ist eine ungeheure Verbesserung gegenüber den flüssigen Farbstoffen und dergleichen, die vorher als Standards verwendet wurden.
Wenn ein optischer Abtaster mit einem anderen Anregungsmittel, wie z. B. einem Laser mit einer anderen Wellenlänge als das hier beschriebene bevorzugte Ausführungsbeispiel, oder mit anderen optischen Komponenten, wie z. B. dichroitischen Spiegeln, die die Fluoreszenzspektren bei anderen Wellenlängen als das bevorzugte Ausführungsbeispiel auftrennen, konstruiert ist, kann ein Festkörperstandard ausgewählt werden, der ein Fluoreszenzspektrum aufweist, das für einen solchen optischen Abtaster geeignet ist.
Das neue und verbesserte Verfahren und die Vorrichtung, wie hier beschrieben, stellen eine kostengünstige, bequeme und automatische Kalibrierung eines Fluoreszenzspektrometers bereit. Eine zeitraubende und fehleranfällige Bedienpersoneneingabe kann unnötig gemacht werden und das hohe Niveau an Training und subjektiver Geschicklichkeit, die erforderlich sind, um den optischen Abtaster zuverlässig zu kalibrieren, kann verringert werden. Indem gleichmäßige Standard-Fluoreszenzeinheiten so aufrechterhalten werden und zuverlässige Erfassung und Meldung von Daten so verbessert werden, wird der Wert von solchen optischen Abtastern für wissenschaftliche und medizinische Untersuchungen erheblich erhöht.
Obwohl ein spezielles Ausführungsbeispiel der Erfindung im einzelnen beschrieben wurde, ist für Fachleute zu erkennen, dass verschiedene Modifikationen an der Struktur und der Verwendung der offenbarten Erfindung angesichts der gesamten Lehren der Offenbarung vorgenommen werden können.

Claims

Verfahren zum Kalibrieren eines Fluoreszenzspektrometers mit einer Vielzahl von Kanälen (30, 31) unter Verwendung eines Kalibrierungsstandards, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Vorsehen eines Fluoreszenzspektrometers mit einem Kanal (30) für lange Wellenlängen und einem Kanal (31) für kurze Wellenlängen; Anregen eines homogenen, kristallinen Festkörper-Kalibrierungsstandards (45), um einen ersten Kalibrierungsstrahl zu erzeugen; Auftrennen des ersten Kalibrierungsstrahls in einen ersten resultierenden langwelligen Kalibrierungsstrahl (84) und einen ersten resultierenden kurzwelligen Kalibrierungsstrahl (85); Erfassen des ersten resultierenden langwelligen Kalibrierungsstrahls (84) durch den Kanal (30) für lange Wellenlängen, um einen ersten langwelligen Intensitätswert zu erzeugen; Erfassen des ersten resultierenden kurzwelligen Kalibrierungsstrahls (85) durch den Kanal (31) für kurze Wellenlängen, um einen ersten kurzwelligen Intensitätswert zu erzeugen; Erzeugen eines ersten Verhältnisses zwischen dem langwelligen Kalibrierungsintensitätswert und dem kurzwelligen Kalibrierungsintensitätswert; anschließend Anregen des Kalibrierungsstandards, um einen zweiten Kalibrierungsstrahl zu erzeugen; Auftrennen des zweiten Kalibrierungsstrahls in einen zweiten resultierenden langwelligen Kalibrierungsstrahl und einen zweiten resultierenden kurzwelligen Kalibrierungsstrahl; Erfassen des zweiten resultierenden langwelligen Kalibrierungsstrahls in dem Kanal für lange Wellenlängen, um einen zweiten langwelligen Intensitätswert zu erzeugen; Erfassen des zweiten resultierenden kurzwelligen Kalibrierungsstrahls in dem Kanal für kurze Wellenlängen, um einen zweiten kurzwelligen Intensitätswert zu erzeugen; Erzeugen eines zweiten Verhältnisses zwischen dem zweiten langwelligen Intensitätswert und dem zweiten kurzwelligen Intensitätswert; und Erzeugen eines Kalibrierungsfaktors zwischen dem zweiten Verhältnis und dem ersten Verhältnis, wobei Daten, die vom Fluoreszenzspektrometer erzeugt werden, durch den Kalibrierungsfaktor kalibriert werden können.
Verfahren zum Ermitteln von Farbstoffgefällen mit den Schritten des Kalibrierens des Fluoreszenzspektrometers nach Anspruch 1: Ermitteln eines ersten Fluoreszenzfarbstoffgefälles; Ermitteln eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffgefälles; Einstellen des ersten Farbstoffgefälles durch den Kalibrierungsfaktor; und Einstellen des zweiten Farbstoffgefälles durch den Kalibrierungsfaktor.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte des Anregens eines Kalibrierungsstandards und des anschließenden Anregens eines Kalibrierungsstandards das Anregen eines Rubins (45) umfassen.
Verfahren nach Anspruch 3, mit den zusätzlichen Schritten: Feststellen der Temperatur des Rubins (45); Kompensieren des ersten kurzwelligen Intensitätswerts, des zweiten kurzwelligen Intensitätswerts, des ersten langwelligen Intensitätswerts und des zweiten langwelligen Intensitätswerts hinsichtlich einer Änderung der Intensität des Kalibrierungsstrahls, die durch die Temperatur des Kalibrierungsstandards verursacht wird.
Mehrkanal-Fluoreszenzspektrometer mit einem Kalibrierungsmerkmal mit: einem homogenen Festkörper-Kalibrierungsstandard; einem Mittel (10) zum Erzeugen eines Beleuchtungslichtstrahls (81); einem Mittel (19) zum Richten des Beleuchtungslichtstrahls (81) auf den Kalibrierungsstandard; einem Mittel (23) zum Sammeln von Licht (83), das durch das Beleuchtungslicht angeregt wird; einem Mittel (25) zum Aufteilen des gesammelten Lichts in eine langwellige und eine kurzwellige Komponente; einem Mittel (30, 31) zum Erfassen einer Intensitätsmessung der langwelligen und der kurzwelligen Komponente; einem Mittel (50), das dazu ausgelegt ist, ein erstes Verhältnis zwischen einem ersten langwelligen Kalibrierungsintensitätswert und einem ersten kurzwelligen Kalibrierungsintensitätswert und ein zweites Verhältnis zwischen einem zweiten langwelligen Kalibrierungsintensitätswert und einem zweiten kurzwelligen Kalibrierungsintensitätswert zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, dass der Kalibrierungsstandard aus einer kristallinen Substanz besteht und dass das Verhältnismittel ferner dazu ausgelegt ist, einen Kalibrierungsfaktor zwischen dem ersten und dem zweiten Verhältnis zu erzeugen und die Intensitätsmessungen des gesammelten Lichts unter Verwendung des Kalibrierungsfaktors zu kalibrieren.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei der Kristall ein Rubin (45) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei der Rubin (45) so ausgelegt ist, dass er eine Längenabmessung und eine Breitenabmessung aufweist, wobei die Längenabmessung nicht gleich der Breitenabmessung ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei das Mittel zum Erzeugen eines Kalibrierungsfaktors einen Temperaturfühler (75), um die Temperatur des Kalibrierungsstandards festzustellen, und ein Mittel zum Kompensieren einer Temperaturschwankung umfasst.