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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung dieser Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Verringerung
von Primerunabhängigen
Hintergrundsignalen in einem DNA-Replikations- / Nachweis-Assay,
insbesondere in einem direkten in situ PCR-Amplifikations- / Nachweis-Assay.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verringerung oder
zur wesentlichen Eliminierung von Primer-unabhängigen Hintergrundsignalen,
die entstehen, wenn DNA in paraffiniertem Gewebe oder Zellkulturen
in einem direkten in situ PCR-Amplifikations- / Nachweis-Assay amplifiziert
wird.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Diagnostische
Verfahren zum Nachweis von Pathogenen oder anderen Zielmolekülen setzten
markierte DNA-Sonden ein, die zu DNA-Proben hinzugefügt werden
und denen erlaubt wird, an die fixierte DNA-Probe zu hybridisieren.
Eine Hybridisierung zeigt die Gegenwart des Pathogens oder eines
anderen Zielmoleküls
an. Eine Erhöhung
in der Empfindlichkeit des Assays kann durch Amplifikation der DNA-Probe
erhalten werden.
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Vor
relativ kurzer Zeit wurde eine wesentliche Verbesserung in der DNA-Amplifikation
zur Verfügung gestellt.
Als die Polymerase Kettenreaktions (PCR)- Technik bekannt, wird
sie im Allgemeinen in der folgenden Weise beschrieben. Die Technik
ist eine enzymatische in vitro Synthesemethode zur Replikation oder
Amplifikation spezifischer Ziel-DNA-Sequenzen in DNA-Proben. Die
Technik setzt DNA-Polymerase, Deoxynukleosidtriphosphate und zwei
Oligonukleotid-Primer ein, die an gegenüberliegende Stränge der
DNA-Probe hybridisieren und die Region von Interesse in der Ziel-DNA-Sequenz
flankieren. Es wird eine exponentielle Amplifikation der Zielsequenz
durch eine sich wiederholende Serie von Schritten erhalten, die
Template-Denaturierung, Primer-Bindung und Verlängerung des gebundenen Primers
durch DNA-Polymerase umfassen, die im Allgemeinen als thermische
Zyklusschritte bezeichnet werden. Solch eine PCR-Technik ist in
der Lage, eine Amplifikation der Zielsequenz, deren Enden durch
die 5'-Enden der eingesetzten
Oligonukleotid-Primer definiert sind, über einen Faktor von bis zu
109 herzustellen. Die PCR-Technik wird z.
B. in den US-Patenten 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159 und 4,965,188
offenbart.
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in
situ-PCR ist eine relativ neue Variante der Standard PCR-Technik.
In der in situ-PCR ist die DNA-Probe typischerweise eine Scheibe
von fixiertem Gewebe mit morphologisch erkennbaren Zellen. Die PCR-Amplifikationsprodukte
verbleiben bei und können
an dieser Stelle des Ursprungs nachgewiesen werden, was anzeigt,
welche Zellen die Ziel-DNA-Sequenz enthalten.
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Sobald
eine DNA-Probe physikalisch in einem PCR-Amplifikationsverfahren
amplifiziert wird, kann der Nachweis des Vorhandenseins oder der
Abwesenheit der gewünschten
Zielgensequenz durch eine Reihe isotopischer oder nicht-isotopischer
Nachweisverfahren erreicht werden. Eine der am wünschenswertesten und bevorzugten
Verfahren zum Nachweis einer solcher PCR-Zielsequenz ist es, die
DNA-Probe in der Gegenwart eines markierten Moleküls, wie
einem markierten Oligonukleotid-Primer oder markiertem Deoxynukleotid
zu amplifizieren, das in die amplifizierte DNA eingebracht wird.
Dieses wird im Allgemeinen als direkter in situ-PCR-Nachweis bezeichnet.
Im Allgemeinen werden die markierten Moleküle in Nukleotidanaloga von
dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP eingebaut und werden direkt in
die PCR-Amplifikationsprodukte eingebaut. Die Marker sind im Allgemeinen
kleine Moleküle
wie Biotin, Meerrettichperoxidase, Digoxigenin, 32P
und Ähnliche. PCR-Amplifikationsprodukte,
die diese Marker enthalten, können
direkt nachgewiesen werden oder mit Enzymen, die an Antikörper gegen
den Marker gekoppelt sind. Die Enzyme können jegliche von vielen unterschiedlichen
Reportermolekülen
generieren wie z. B. isotopische, fluoreszierende oder kolorimetrische
Reportermoleküle.
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Einer
der Hauptvorteile des direkten in situ-PCR-Nachweises ist es, dass
viele Marker in die Amplifikationsprodukte an vielen unterschiedlichen
Stellen eingebracht werden können,
insbesondere, wenn man ein markiertes Nukleotid einsetzt. Dieses
erhöht
im Allgemeinen das generierte Signal und verringert somit die Nachweisgrenze.
Ein weiterer Vorteil der direkten in situ-PCR ist es, dass das Nachweisverfahren
stark vereinfacht wird, da keinerlei DNA-Sonden, DNA-Hybridisierung
oder Waschschritte notwendig sind.
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Alternativ
dazu können
nicht-markierte PCR-Amplifikationsprodukte indirekt mit einer DNA-
oder RNA-Sonde nachgewiesen werden, die selbst ein Signal enthält. Dieses
Verfahren wurde uneinheitlich in situ PCR-Hybridisierung, indirekter
PCR-Nachweis oder Sonden-basierter PCR-Nachweis genannt. Dieses
Verfahren hat den Nachteil, dass es verschiedene Zugabeschritte
voraussetzt. Es wird auch deutlich weniger Signal produziert, so
dass die Nachweisgrenze oft nachteilig betroffen ist. Dieses Verfahren
stellt jedoch eine bessere Spezifität zur Verfügung als die direkte in situ-PCR
zur Verfügung,
da die meisten nicht-spezifischen Amplifikationsprodukte nicht an
die Sonde hybridisieren werden.
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Daher
wird man zu schätzen
wissen, dass es einige gute Gründe
gibt, die direkte in situ-PCR-Nachweisprozedur
zu empfehlen, und sie wäre
in vielen Fällen
das Verfahren der Wahl. Jedoch ist eine hauptsächliche Einschränkung des
direkten in situ-PCR-Nachweises, dass nicht-spezifische PCR-Amplifikationsprodukte
von spezifischen Amplifikationsprodukten nicht unterscheidbar sind.
Wenn große
Menge an nicht-spezifischen Produkten hergestellt werden, kann ein
falsches positives Ergebnis hergestellt werden. Die Produktion nicht-spezifischer
Produkte sogar in reproduzierbaren Mengen erhöht auch die Hintergrundmenge
und hat daher einen negativen Einfluss auf die minimale Nachweismenge.
Die Qualität
der Ergebnisse, die unter Verwendung des direkten in situ-PCR-Nachweises
erhalten werden, ist von der Qualität der PCR-Amplifikationsreaktion
selbst abhängig.
Im Gegensatz dazu ist der Sonden-basierende PCR-Nachweis deutlich
weniger empfindlich gegenüber
dem Vorhandensein nicht-spezifischer Produkte.
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Seit
der Entdeckung der PCR-Technik wurden eine Reihe von Faktoren in
Lösungsphasen-PCR
identifiziert, die einen Einfluss auf die Spezifität der PCR-Amplifikationsreaktion
haben. Unter diesen Faktoren sind die folgenden Quellen an Nicht-Spezifitätsproblemen:
Nicht-optimiertes PCR-Protokoll, mangelnde Primer-Spezifität, Primer-Oligomerisierung
und Primer-unabhängige
mangelnde Spezifität,
Die Lösung
zu dem Problem, das durch ein nicht-optimiertes PCR-Protokoll bedingt
ist, ist es, dass PCR-Protokoll
zu optimieren sowie die thermischen Zyklusparameter. Eine Lösung zu
dem Problem der mangelnden Primer-Spezifität ist die Auswahl eines Primers
von einer unterschiedlichen Nukleotidsequenz. Eine andere Lösung zu
dem Problem der mangelnden Primer-Spezifität sowie zu dem Problem der
Primer-Oligomerisierung ist die sog.
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Heißstarttechnik,
die durch Chou et al., Nucleic Acid Research, Band 20, Nr. 7, 1717 -1723 (1992) offenbart
wird. In dieser Technik wird die gesamte PCR-Reaktionsmischung zu
allen Zeiten, aber vor den thermischen Zyklusschritten, relativ
warm gehalten, sobald sie zusammengesetzt ist. Dieses verhindert
eine nicht-spezifische Primer-Bindung und Verlängerung, die ansonsten bei
geringeren Temperaturen vorkommen könnte. Die Heißstarttechnik
hat sich als von großem
Wert bei der in situ-PCR herausgestellt bei der Verringerung eines
unspezifischen Signals bedingt durch mangelnde Primer-Spezifität und Primer-Oligomerisierung, siehe
Nuovo et al., Amer. Journal of Pathology, Band 139, Nr. 6, 1239 – 1244 (Dez.
1991).
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Jedoch
ist die vierte Quelle an nicht-spezifischem Signal, die zuvor identifiziert
wurde, namentlich die Primer-unabhängige nicht-spezifische Amplifikation,
ein Phänomen,
das in der Abwesenheit von Primern beobachtet wird und durch die
Heißstarttechnik
nicht zu beseitigen ist. Dieses Problem der Primer-unabhängigen mangelnden
Spezifität
wurde von verschiedenen Forschern beobachtet, die zu dem Schluss
kamen, dass das Problem so groß ist,
dass der direkte Nachweis einer amplifizierten Zielsequenz durch
in situ-PCR nicht
als geeignete Technik angesehen werden kann.
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Während das
Problem der Primer-unabhängigen
mangelnden Spezifität
hierin zuvor in Bezug auf in situ-PCR-Amplifikation illustriert
wurde, wo es ein besonders ärgerliches
Problem ist, wird man zu schätzen wissen,
dass eine solche Primer-unabhängige
mangelnde Spezifität
auch ein Problem in anderen DNA-Replikationsverfahren sein kann,
wie einer Lösungsphasen-PCR-Amplifikation
oder in der Primer-unterstützten
in situ Verlängerungs-
(primed in situ extension, PRINS) Replikationstechnik, die nur einen
einzigen Oligonukleotid-Primer verwendet, der an chromosomale DNA
gebunden wird und in situ mit dem Einbau von markierten Oligonukleotiden
verlängert
wird. In den verschiedenen DNA-Replikations- / Amplifikations- Verfahren
stellt die Produktion von Primerunabhängigen, nicht-spezifischen
Produkten ein ernsthaftes Problem in der Nachweisphase eines Assayverfahrens
dar, da die nicht-spezifischen Produkte die Hintergrundsignale auf
solche Mengen erhöhen
können,
dass falsche positive Ergebnisse produziert werden und sie können auch
einen negativen Einfluss auf die minimale oder untere Nachweisgrenze
des Assays ausüben.
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Es
ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verringerung
oder wesentlichen Eliminierung der Produktion von Primer-unabhängigen,
nicht-spezifischen Probukten während
eines Verfahrens zur Replikation oder Amplifikation und Nachweis
einer Ziel-DNA-Sequenz in einer DNA-Probe zur Verfügung zu stellen,
die einem DNA-Replikations-
/ Amplifikations-Verfahren ausgesetzt wird. Es ist eine weitere
Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verringerung oder im
Wesentlichen Eliminierung der Herstellung Primer-unabhängiger,
nicht-spezifischer Produkte während
eines PCR-Amplifikationsverfahrens,
insbesondere eines in situ-PCR-Amplifikationsverfahrens und ganz
besonders in einem direkten in situ-PCR-Amplifikationsverfahren
und Nachweisverfahren zur Verfügung
zu stellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verringerung oder
wesentlichen Eliminierung von Primer-unabhängigen, nicht-spezifischen
Hintergrundsignalen zur Verfügung,
die durch die Produktion von Primer-unabhängigen, nicht-spezfischen Produkten
während
der Verfahren zur Replikation oder Amplifikation und zum Nachweis
einer Ziel-DNA-Sequenz
in einer DNA-Probe durch DNA-Replikations- oder Amplifikationsverfahren
hergestellt werden, bei dem:
- (a) die Ziel-DNA-Sequenz
durch ein Verfahren repliziert wird, das Deoxynukleosidtriphosphate
und einen oder mehrere Oligonukleotid-Primer verwendet, die an mindestens
einem Strang in der Zielsequenz der DNA-Probe hybridisieren, und
wobei der Nachweis der Zielsequenz der Replikation folgt, oder
- (b) die Ziel-DNA-Sequenz durch ein PCR-Amplifikationsverfahren
durch thermische Zyklusschritte zwischen Bindungs- / Verlängerungs-
und Denaturierungsschritten unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern,
die an entgegengesetzte Stränge
einer DNA-Probe
hybridisieren und die Ziel-DNA-Sequenz flankieren, amplifiziert
wird, und wobei der Nachweis der Zielsequenz der Amplifikation folgt,
oder
- (c) die Ziel-DNA-Sequenz durch ein direktes in situ-PCR-Amplifikations-
und Nachweisverfahren amplifiziert wird durch die Zugabe zur DNA-Probe
von: DNA-Polymerase, jedem der vier Deoxynukleosidtriphosphate und
einem Satz an Oligonukleotid-Primern, die an die gegenüberliegenden
Stränge
der DNA-Probe binden und die Zielsequenz flankieren, wobei mindestens
eines der vier Deoxynukleosidtriphosphate markiert ist, und das
Amplifizieren der Ziel-DNA-Sequenz durch thermische Zyklusschritte
mit besagten Komponenten unter Bedingungen, die eine sich wiederholende
Serie von PCR-Zyklusschritten
erlauben: Denaturieren der DNA-Probe in gegenüberliegende Stränge, Binden
der Primer an die denaturierten Stränge und die Verlängerung
der gebundenen Primer durch DNA-Polymerase, wodurch die Ziel-DNA-Sequenz
exponentiell amplifiziert wird, wodurch markierte gezielt DNA-Sequenzen
hergestellt werden, wobei besagtes Verfahren zur Verringerung oder
wesentlichen Eliminierung Primer-unabhängiger, nichtspezifischer Produkte
und Hintergrundsignale das Aussetzen der DNA-Probe einer Vorbehandlung
vor dem Replikations- / Amplifikations-Verfahren umfasst, worin
besagte Vorbehandlung das Inkontaktbringen der DNA-Probe mit mindestens
einem Dideoxynuikleosidtriphosphat und einer DNA-Polymerase für einen
Zeitraum und bei einer Temperatur, der/die ausreichend ist, um ein
Dideoxynukleosid kovalent an die 3'-terminalen Enden der DNA in der DNA-Probe
zu binden und dann das Abtrennen der behandelten DNA-Probe von dem
Dideoxynukleosidtriphosphat und der DNA-Polymerase vor dem Replikations-
/ Amplifikations-Verfahren umfasst.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bei
der Untersuchung des Problems der Primer-unabhängigen Nicht-Spezifität wurde
festgestellt, dass ein hoher Primer-unabhängier, nicht-spezifischer Hintergrund
routinemäßig beobachtet
wurde, wenn paraffinierte Gewebe als DNA-Probe eingesetzt wurden,
nicht aber in Zellsuspensionen, die nicht Gegenstand der Paraftinierung
sind. Zusätzlich
wurde ein solcher hoher Primer-unabhängiger, nicht-spezifischer
Hintergrund nicht in gefrorenen Gewebeschnitten beobachtet, die
auch nicht Gegenstand einer Paraftinierung sind, aber den meisten
der anderen Gewebezubereitungsschritte ausgesetzt werden, wie dem
Schneidern und Aufsetzen, der Formalinfixierung und den Proteaseverdauungsschritten.
Manchmal wurde ein hoher PCR-Hintergrund mit Zellsuspensionen beobachtet,
aber dieser konnte jedes Mal mit der zuvor genannten Heißstarttechnik
oder mit zurückhaltenden
Primern blockiert werden. Dieses deutet an, dass das Hintergrundproblem
in Zellsuspensionen mangelnde Primer-Spezifität, nicht Primer-unabhängige mangelnde
Spezifität
war.
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Dieser
Beweis führte
zu der Annahme, dass einer der Schritte, die in dem Paraffinierungs-
oder Deparaftinierungsverfahren involviert sind, für das Primer-unabhängige, nicht-spezifische
Hintergrundproblem verantwortlich war. Es wurde auch entdeckt, dass
wenn der Paraffinierungsschritt ausgelassen wurde, erhöhte Temperatur
allein ausreichend war, um Primer-unabhängigen, nicht-spezifischen
Hintergrund zu generieren. Dieses wurde beobachtet, wenn Gewebeschnitte
von Vulva- und Mandelbiopsien auf Silanobjektträger platziert wurden und für 4 bis
15 Stunden in 10 % gepuffertem Formalin fixiert wurden und Schnitte
von jedem Gewebe in einem Trockenofen bei 65 °C für 4 Stunden erwärmt wurden.
Ein Primer-unabhängiges
Signal war zum Zeitpunkt des optionalen Proteaseverdaus für jedes
Gewebe nach diesem Aufwärmschritt
erkennbar. Jedoch, wenn das Gewebe nicht auf 65 °C erhitzt wird, zeigt es nicht
den Primer-unabhängigen,
nicht-spezifischen PCR-Hintergrund. Das Vorhandensein des nichtspezifischen
Signals in der Abwesenheit von Primern deutet an, dass DNA-Polymerase-vermittelte
Reparatur von DNA-Lücken
vorkommen kann.
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Andere
Kontrollexperimente zeigten, dass das Problem eindeutig auf die
DNA in den Proben zurückzuführen ist.
RNA-basierende in situ-PCR zeigte keinerlei Hintergrundprobleme.
Der Hintergrund erschien auch nicht, wenn die DNA der Probe durch
vorherige Deoxyribonuklease-Behandlung eliminiert worden war. Er
verschwand auch, wenn die Proben einer längeren Proteasebehandlung unterzogen
wurden. Zellen im Gegensatz zu Geweben werden im Allgemeinen nicht
paraffiniert und dieses Hintergrundproblem wird im Allgemeinen nicht
bei Zellen beobachtet. Jedoch ist es manchmal wünschenswert, Zellen als Gewebe
zu behandeln. Wenn sie paraffiniert sind, zeigen diese paraffinierten
Zellen Primer-unabhängigen,
nicht-spezifischen Hintergrund.
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Nach
der Entdeckung, dass das Primer-unabhängige Hintergrundproblem durch
das Aussetzen der DNA-Proben gegenüber erhöhten Temperaturen bewirkt wurde,
wurde entdeckt, dass eine Vorbehandlung der DNA-Probe mit einem
Dideoxynukleosidtriphosphat und einer DNA-Polymerase und anschließender Abtrennung
der behandelten DNA-Probe von dem Dideoxynukleosidtriphosphat und
der DNA-Polymerase vor dem PCR-Amplifikationsverfahren wesentlich
das beobachtete Primer-unabhängige,
nichtspezifische Hintergrundproblem eliminiert oder verringert.
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Obwohl
man nicht an die folgende Erklärung
gebunden ist, wird angenommen, dass das Primer-unabhängige, nicht-spezifische
Hintergrundproblem und seine nichtoffensichtliche Lösung durch
das Folgende erklärt
werden kann. Es wird angenommen, dass der Grund der zuvor diskutierten
Primer-unabhängigen, nicht-spezifischen
Hintergrundprobleme das Schneiden eines Stranges des doppelsträngigen DNA-Proben
involviert, wodurch viele einzelsträngige Brüche in der DNA-Sequenz generiert
werden, wobei die Brüche
3'-endende Hydroxyl-terminale
Nukleotide aufweisen, die als Polymerisationsinitiationsstellen
für die
DNA-Polymerase und Deoxynukleosidtriphosphate während des PCR-Amplifikationsverfahrens
dienen. Die Zugabe von 2'3'-Dideoxynukleotid
von dem korrespondierenden Triphosphat zu dem 3'-terminalen Ende eines DNA-Stranges
an dem Bruchpunkt verhindert angenommener Weise seine spätere Verlängerung
während
des PCR-Amplifikationsverfahrens.
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Obwohl
es beobachtet wurde, dass das Hintergrundproblem, das durch die
Primerunabhängige
mangelnde Spezifität
bedingt ist, das durch diese Erfindung gelöst wird, insbesondere dann
vorhanden ist, wenn eine DNA-Probe eingesetzt wird, die fixiert,
paraffiniert und deparaffiniert wurde, ist die Lösung auch auf ein solches Hintergrundproblem
anwendbar, das entsteht, wenn eine DNA-Probe eingesetzt wird, die
einer erhöhten
Temperatur von mindestens ungefähr
37 °C ausgesetzt
wurde und ganz besonders eine DNA-Probe, die einer erhöhten Temperatur
von ungefähr
45 ° bis
ungefähr
65 °C, vorzugsweise
50 °C oder
mehr für
einen Zeitraum von ungefähr
10 Minuten bis ungefähr
16 Stunden ausgesetzt wurde.
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Auch
hat die Lösung
des Problems des Primer-unabhängigen,
nicht-spezifischen Hintergrunds eine Anwendbarkeit nicht nur in
der direkten in situ-PCR-Amplifikation sondern auch in verschiedenen
PCR-Amplifikatüonsverfahren
sowie in anderen DNA-Replikationsverfahren,
wie in einem PRINS-Replikationsverfahren, bei dem Primerunabhängiger,
nicht-spezifischer Hintergrund ein Problem darstellt.
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In
dem Vorbehandlungsverfahren dieser Erfindung wird die DNA-Probe,
die einer Replikation oder Amplifikation ausgesetzt werden soll,
mit mindestens einem Dideoxynukleosidtriphosphat und einer DNA-Polymerase
bei einer Temperatur und für
einen Zeitraum, die/der ausreichend ist, um ein Dideoxynukleosid
kovalent an die 3'-terminalen
Enden in der DNA-Probe zu binden, ausgesetzt. Obwohl die Temperatur
so niedrig wie ungefähr 20 °C sein kann,
ist sie vorzugsweise eine Temperatur von mindestens ungefähr 37 °C bis ungefähr 72 °C für einen
Zeitraum von mindestens einer Minute oder mehr, mehr bevorzugt für einen
Zeitraum von ungefähr
1 bis ungefähr
15 Minuten oder mehr bei einer Temperatur von ungefähr 55 °C oder mehr.
In einer weiteren Ausführungsform
dieser Erfindung kann die DNA-Probe mit Dideoxynukleosidtriphosphat
und DNA-Polymerase
in einem thermischen Zyklusvertahren behandelt werden, worin diese
Komponenten während
der thermischen Zyklusschritte zwischen zwei Stadien in Kontakt
gebracht werden. Vorzugsweise umfassen die thermischen Zyklusstadien
dieses Vorbehandlungsverfahrens ein erstes Stadium bei einer Temperatur von
ungefähr
37 °C bis
ungefähr
72 °C für einen
Zeitrum von ungefähr
10 Sekunden bis ungefähr
1 Minute und ein zweites Stadium bei einer Temperatur von ungefähr 80 °C bis ungefähr 105 °C, vorzugsweise
ungefähr
94 °C, für einen
Zeitraum von ungefähr
10 Sekunden bis ungefähr
1 Minute. Im Allgemeinen werden ungefähr 1 bis ungefähr 10 Zyklen
zwischen diesen zwei Stadien eingesetzt, wenn eine solche thermische
Zyklussequenz in dem Vorbehandlungsverfahren eingesetzt wird.
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Während das
Vorbehandlungsverfahren dieser Erfindung unter Verwendung eines
einzigen Dideoxynukleosidtriphosphats wie einem ddTTP eingesetzt
wird, kann man, falls erwünscht,
zwei oder mehr Dideoxynukleosidtriphosphate wie ddATP, ddGTP, ddCTP
sowie ddTTP einsetzen. Wenn ein einzelnes Dideoxynukleosidtriphosphat
in dem Vorbehandlungsverfahren dieser Erfindung eingesetzt wird,
wird die Reaktionsmischung auf die anderen drei Deoxynukleotide
enthalten, so dass die Lücken
an der Stelle der Schnitte gefüllt werden
bis eine Position erreicht wird, bei der das Dideoxynukleotid sich
an die 3'-terminalen
Ende der Schnitte hinzufügt.
Wenn zwei oder mehr Dideoxynukleoside in dem Vorbehandlungsvertahren
dieser Erfindung eingesetzt werden, sollte die Reaktionsmischung
auch die anderen Deoxynukleotide einsetzen, die nicht als Dideoxynukleotide
vorhanden sind. Falls es erwünscht
ist, kann die Reaktionsmischung immer alle vier Deoxynukleotide
enthalten, wie es in den folgenden Beispielen der Fall ist.
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Das
Vorbehandlungsverfahren dieser Erfindung kann jegliche geeignete
DNA-Polymerase wie
z. B. Taq-Polymerase und Ähnliche
einsetzen. Die zur Verwendung in jeglichem Vorbehandlungsvertahren
dieser Erfindung gewählte
DNA-Polymerase wird im Allgemeinen so gewählt, dass sie die größte Menge
an Dideoxynukleosidtriphosphat(en) bei der geringsten Konzentration
an Dideoxynukleosidtriphosphat(en) in der kürzesten Zeit einzubaut. Die
optimale DNA-Polymerase würde
auch vorzugsweise jegliche Exonukleaseaktivität vermissen lassen, um die
Herstellung oder Verlängerung
jeglicher einzelsträngiger
Brüche
in der DNA-Probe zu vermeiden. Als ein Beispiel einer solchen DNA-Polymerase
kann AmpliTaq® DNA-Polymerase,
Stoffel-Fragment (verfügbar
von Perkin-Elmer Corporation als Produkt Nr. N808–0038) erwähnt werden.
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Nach
dem Reagieren der DNA-Probe mit dem Dideoxynukleosidtriphosphat
in der Gegenwart von DNA-Polymerase für einen Zeitraum und bei einer
Temperatur, der/die ausreicht, um ein Dideoxynukleosid an die 3'-terminalen Enden
in der DNA-Probe kovalent zu binden, wird die behandelte DNA von
dem Dideoxynukleosidtriphosphat und der DNA-Polymerase abgetrennt.
Es kann jegliche geeignete Trennungstechnik eingesetzt werden. Zum
Beispiel, wenn eine fixierte DNA-Probe zur in situ-PCR-Amplifikation
verwendet wird, dann kann die behandelte Probe durch Waschen behandelt
werden. Jedoch wird es für
andere Amplifikationsverfahren wie Lösungs-PCR notwenig sein, die
DNA-Probe durch ein geeignetes Entsalzungsverfahren zu fällen oder
die DNA-Probe durch jegliches anderes geeignetes Trennungsverfahren
abzutrennen wie z. B. durch Fällung
mit Alkohol oder durch verschiedene chromatographische Verfahren
wie lonenaustausch-, Umkehrphasen- und Größenausschlusschromatographie.
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Die
DNA-Probe kann aus jeglicher geeigneter biologischer Probe stammen
wie alle Zellen, wie z. B. Pflanzen-, Tier-, Bakterien-, Pilz- und
mikrobiologische Zellen sowie aus Viren und chromosomalen Verbreitungen.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele illustriert aber nicht
eingeschränkt.
In den Beispielen wurden die folgenden Verfahren zur Probenaufbereitung,
Amplifikation und Nachweis des bcl-2-Gens eingesetzt.
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Gewebeaufbereitung
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Vier μM-Schnitte
von Paraffin-eingebetteten Leber-, Vulva-, Mandel- und Lymphknotengeweben
wurden auf Silan-beschichtete Glasträger platziert. Gewebeproben
wurden in 10 % neutral gepuffertem Formalin für entweder 6 oder 8 Stunden
fixiert. Proteaseverdau wurde unter Verwendung von Pepsin bei 2
mg/ml in 0,01 N HCI bei Raumtemperatur durchgeführt. Drei serielle Schnitte
wurde auf jeden Objektträger
platziert, so dass Anpassungen einer vorgegebenen Variablen unter
identischen Reaktionsbedingungen verglichen werden konnten. Die
Schnitte wurden in Xylol für
5 Minuten deparaffiniert, in 100 % Ethanol für 5 Minuten gewaschen und dann
luftgetrocknet.
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In situ-PCR
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Nach
Deparaffinierung und optimalem Proteaseverdau für 15 Minuten wurde die folgende
Reaktionsmischung (25 μl)
zu jedem Objektträger
hinzugefügt:
2,5 μl PCR-Puffer
II (GeneAmp® Kit,
Perkin-Elmer Corporation), 4,5 μl
MgCl2 (25 mM Stammlösung), 4,0 μl dNTP-Lösung (Stammlösung 800 μM), 1,0 μl 2 % Rinderserumalbumin,
0,4 μl Digoxigenin
dUTP-Lösung
(1 mM Stammlösung)
+/- 1 μl
des hiernach identifizierten bcl-2-Primers 1 (SEQ ID Nr: 1) und bcl-2-Primers
2 (SEO ID Nr: 2) (jede Stammlösung
20 μM) für das bcl-2-Gen
+ 11 μl
(oder 13 μl,
wenn die Primer ausgelassen wurden) Wasser, 0,6 μl Taq-Polymerase. Die Lösung wurde
zu dem Objektträger
hinzugefügt,
mit einem großen
Polypropylen-Deckelglas bedeckt, das mit 2 kleinen Tropfen Nagellack
verankert wurde und dann in ein "Boot" aus Aluminiumfolie
platziert. Dieses wurde auf einen Aluminiumblock des Thermozyklers
platziert, der stufenartig auf 80 °C erhöht wurde. Bei dieser Temperatur
wurde das Deckelglas mit 1 ml erhitztem Mineralöl überdeckt. Die DNA wurde bei
94 °C für 3 Minuten denaturiert,
gefolgt durch 20 Zyklen bei 55 °C
für 2 Minuten
und 94 °C
für 1 Minute.
Nach Entfernung des Deckelglases wurden aufeinanderfolgende 5 Minuten-Waschungen
in Xylol und 100 % Ethanol durchgeführt und die Objektträger luftgetrocknet.
Der Nachweis des in das PCR Produkt eingebauten Digoxigenins wurde
mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Antidigoxigenin-markierten
Antikörper
bei einer 1 : 50 Verdünnung durchgeführt. Das
alkalische Phosphatasebasierende kolorimetrische Nachweisverfahren
verwendete das Chromogen Nitroblautetrazolium (NBT), welches in
der Gegenwart von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) ein lilablaues
Präzipitat
als Marker für
positive Zellen ergibt. Die Gegenfärbung, "nuklear fast red", färbt Nuklei
und das Zytoplasma hellrosa. Die Tests wurden dreifach durchgeführt und
das Bewertungssystem für das
Signal war wie folgt: 0, 1 + = < 25
positive Zellen, 2 + = 25 – 50
% positive Zellen und 3 + = > 50
% positive Zellen. Die eingesetzten Primer sind:
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Die
Beispiele der in situ-PCR-Amplifikation wurden ohne zuerst die Durchführung der
Vorbehandlung mit Dideoxynukleosidtriphosphat und DNA-Polymerase
(Beispiele 1 und 2) durchgeführt
und dann wurden die gleichen PCR-Amplifikationsbeispiele wiederholt,
nachdem zuerst eine Dideoxynukleosidtriphosphat-Vorbehandlung gemäß dieser
Erfindung (Beispiele 3 und 4) durchgeführt wurde. Die Dideoxynukleosidtriphosphat-Vorbehandlung
in den Beispielen wurde in der folgenden Weise durchgeführt. Nach
Proteaseverdau der Gewebeschnitte und vor der in situ-PCR-Amplifikation
davon wurden die Gewebeschnitte durch Inkubation in einer Lösung vorbehandelt,
die 2,5 μl
PCR-Puffer, 4,5 μl
MgCl2 (25 mM Stammlösung), 4,0 μl dNTP-Lösung (Stammlösung 800 μM, d. h.
200 μM von
jedem der vier Deoxynukleotide), 2,5 μl Dideoxythymidintriphosphat (1000 μM Stammlösung), 1,0 μl 2 % Rinderserumalbumin,
+ 9,7 μl
Wasser, 0,8 μl
Taq-Polymerase (5 Einheiten / μl)
für 30
Minuten bei 55 °C.
Die behandelten Gewebeproben wurden dann von Dideoxythymidintriphosphat und
Taq-Polymerase durch Waschen mit destilliertem Wasser getrennt.
Danach wurde eine PCR-Amplifikation und ein Nachweis der vorbehandelten
Gewebeproben in einer Weise durchgeführt, die zu derjenigen identisch ist,
die zuvor beschrieben wurde, aber in der Abwesenheit von jeglichem
Primer. Die Ergebnisse der vorgenannten Beispiele werden in der
folgenden Tabelle gezeigt.
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Aus
den Daten in der oben genannten Tabelle ist es offensichtlich, dass
die Dideoxyvorbehandlung (0 Wert) das Primer-unabhängige nicht-spezifische
Signal (0 Wert), das ohne die Dideoxy-Vorbehandlung (3+ Wert) produziert
wurde, eliminiert.
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