DE69533940T2

DE69533940T2 - Therapeutische zusammensetzungen von venösdilatoren und arterielldilatoren

Info

Publication number: DE69533940T2
Application number: DE69533940T
Authority: DE
Inventors: Wayne H. Kaesemeyer
Original assignee: Angiogenix Inc
Current assignee: Angiogenix Inc
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-05
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2015-10-06
Also published as: MX9702527A; DK0784429T3; PT784429E; EP1552745A1; ATE388700T1; AU3889695A; CA2201784C; DE69533940D1; EP0784429B1; ES2236716T3; US5767160A; DE69535734D1; US5543430A; EP0784429A1; ATE287212T1; CA2201784A1; JPH10507443A; EP0784429A4; EP1552745B1; AU705002B2

Description

HINTERGRUND
Die Erfindung beitrifft im Allgemeinen Zusammensetzungen zur Behandlung von hypertonischer kardiocerebro-renovaskulärer Erkrankung sowie nicht-hypertonischer kardiocerebro-renovaskulärer Erkrankung, insbesondere die einzigartige Formulierung, die bei der Behandlung dieser Erkrankungen und ihrer Symptome verwendet wird, wobei eine endogene biologische Quelle für Stickoxid (L-Arginin) und ein Stimulator für die Stickoxid-Synthase (NOS), insbesondere Nitroglycerin, vor der Verabreichung gemischt werden, so dass ein Gemisch erhalten wird, das sich zur Behandlung von Nitroglycerintoleranz eignet.
BESCHREIBUNG DES DAZUGEHÖRIGEN FACHGEBIETES
Seit mehreren Jahrzehnten wird Nitroglycerin als Gefäßdilatator bei der Behandlung von kardiovaskulärer Erkrankung an Menschen verabreicht. Nitroglycerin oder Glyceryltrinitrat ist ein organischer Nitratester, der bei der Verabreichung an ein Individuum biologisch in Stickoxid (NO), einen pharmakologisch aktiven Metaboliten, umgewandelt wird. NO aktiviert beispielsweise lösliche Guanylatcyclase in glatten Gefäßmuskelzellen, was wiederum das cyclische Guanosinmonophosphat (cGMP) erhöht. Dadurch kommt es zu einer Gefäßrelaxation (Waldmann et al., 1987, Cyclic GMP synthesis and function, Pharmacol. Rev. 39, 163) und schließlich zur Gefäßdilatation und zu einer Reduktion des Blutdrucks. Die Wirksamkeit von Nitroglycerin ist jedoch stark verringert, weil der Empfänger einer therapeutischen Verabreichung von Nitroglycerin rasch eine Toleranz für die vorteilhaften Wirkungen von Nitroglycerin entwickelt. Daher schränkt der Beginn der Nitroglycerin-Toleranz den therapeutischen Wert von Nitroglycerin signifikant ein, weil die erhöhten Dosen nur wenig oder gar keine Wirkung auf die Gefäßrelaxation oder Gefäßdilatation ausüben. (Bogaert, M., 1991, Clinical relevance of tolerance to nitrovasodilators, J. Cardiovas. Pharmacol. 17 (Suppl. 3), S 313; und Unger, P., et al., 1991, Tolerance to intravenous nitrates, J. Cardiovasc. 17 (Suppl. 3), S 300.). Der genaue Mechanismus der Nitroglycerin-Toleranz ist unbekannt. Folgende Theorien erklären die Toleranz. Die zur direkten Biotransformation von Nitroglycerin in aktives Stickoxid nötigen Sulfhydryl-Pools werden durch überschüssiges Nitroglycerin-Substrat abgereichert. (Boesgaard, S. et al., 1991, Nitrate Tolerance: Effect of thiol supplementation during prolonged nitroglycerin infusion in an in vivo rat model, J. Pharmacol. Exp. Ther. 258, 851). Die Aktivierung der vaskulären Guanylatcyclase wird durch Nitroglycerin verringert (Henry P. J. et al., 1989, S-Nitrosothiols as vasodilators: Implications regarding tolerance to nitric-oxide-containing vasodilators, Br. J. Pharmacol. 98, 757), oder die Rate des cGMP-Abbaus kann während der Toleranz gegenüber Nitroglycerin erhöht werden (Axelsson, K. L., et al., 1987, Nitrate tolerance from a biochemical point of view, Drugs 33, 63).
Gerade wurde ebenfalls gezeigt, dass Stickoxid enzymatisch als normaler Metabolit aus Arginin im Gefäßendothel gebildet wird, so dass eine wichtige Komponente für die Bildung von dem aus Endothel hergeleiteten Relaxationsfaktor (EDRF) bereitgestellt wird. Makrophagen und Nervenzellen produzieren ebenfalls Stickoxid im Körper als Komponente ihrer zelltötenden und/oder cytostatischen Funktion.
Vor Kurzem wurde festgestellt, dass eine Familie von als NOS bezeichneten Enzymen Stickoxid aus L-Arginin bildet, und dass das erzeugte Stickoxid für die endothelabhängige Relaxation und Aktivierung von löslicher Guanylatcyclase, die Neurotransmission in den zentralen und peripheren Nervensystemen und für die aktivierte Makrophagen-Cytotoxizität verantwortlich ist (Sessa, William, C., 1994, The Nitric Oxide Synthase Family of Proteins, Review, S. 131–143).
Die Stickoxidsynthase kommt in vielen bestimmten Isoformen vor, die eine konstitutive Form (cNOS) und eine induzierbare Form (iNOS) umfassen. Die konstitutive Form ist in normalen Endothelzellen, Neuronen und einigen anderen Geweben zugegen. Die Bildung von Stickoxid durch die konstitutive Form in Endothelzellen spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der normalen Blutdruckregulation. Die induzierbare Form der Stickoxidsynthase ist in aktivierten Makrophagen zugegen und wird in glatten Gefäßmuskelzellen, beispielsweise durch verschiedene Cytokine und/oder mikrobielle Produkte, induziert. Man nimmt an, dass die Überproduktion von Stickoxid durch die induzierbare Form von Stickoxidsynthase bei Sepsis oder durch Cytokin induziertem Schock eine wichtige Rolle bei der beobachteten lebensbedrohlichen Hypotonie spielt.
Wie vorstehend erwähnt wird die Umwandlung von L-Arginin in Stickoxid enzymatisch durch NOS katalysiert, und das resultierende Nebenprodukt ist L-Citrullin. Die NOS-Aktivität wurde zwar wie vorstehend erörtert zu Beginn im Endothel beschrieben, jedoch wird sie mittlerweile in vielen Zelltypen beschrieben. Gehirn-, Endothel-, und Makrophagen-Isoformen scheinen Produkte oder verschiedene Gene zu sein, die etwa 50% Aminosäure-Identität aufweisen. Gehirn- und Endothel-NOS haben sehr ähnliche Eigenschaften und unterscheiden sich hauptsächlich dadurch, dass Gehirn-NOS cytosolisch ist und das Endothel-Enzym vorwiegend ein membranassoziiertes Protein ist.
Die konstitutive Form der Stickoxid-Synthase (cNOS) ist die Hauptsynthase im Gehirn und im Endothel. Sie kann unter Grundbedingungen aktiv sein und kann durch Anstiege des intrazellulären Calciums, die in Reaktion auf rezeptorvermittelte Agonisten oder Calciumionophore erfolgen, weiter stimuliert werden. cNOS scheint die "physiologischen" Form des Enzyms zu sein und spielt eine Rolle bei einer anderen Gruppe biologischer Prozesse. In vitro-Untersuchungen legen nahe, dass die Aktivität der Stickoxidsynthase in Form einer negativen Rückkopplung durch Stickoxid selbst reguliert werden kann. Beim kardiocerebro-renovaskulären Kreislauf ist das Primärziel für konstitutiv produziertes Stickoxid lösliche Guanylatcyclase im glatten Gefäßmuskel, Myokard (Myocyten) und im koronären glatten Gefäßmuskel.
In Gegenwart von normalem Substrat wird Stickoxid vorzugsweise durch Stickoxidsynthase hergestellt. Bei Fehlen von L-Arginin erzeugt wahrscheinlich die Stickoxidsynthase im Gehirn das radikalische Superoxid und Wasserstoffperoxid. Diese Eigen-schaft der Stickoxidsynthase hat potentielle größere Bedeutungen für die Neurotoxizität und pathophysiologische Bedingungen, wie Ischämie.
Im Gegensatz zu der konstitutiven Form des Enzyms war die induzierbare calciumabhängige Form zu Beginn nur in Makrophagen beschrieben. Es ist jetzt bekannt, dass die Induktion der Stickoxidsynthase in Reaktion auf geeignete Stimuli in vielen anderen Zelltypen auftreten kann. Dies umfasst sowohl Zellen, die gewöhnlich keine konstitutive Form der Stickoxidsynthase exprimieren, wie glatte Gefäßmuskelzellen, sowie Zellen, wie diejenigen des Myokards (Levine B., et al., 1990, Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure. N. Engl. J. med. 323: 236–241), die vergleichbare Mengen der konstitutiven Isoform exprimieren.
iNOS weist unter basalen Bedingungen eine vernachlässigbare Aktivität auf, aber in Reaktion auf Faktoren, wie Lipopolysaccharid und bestimmte Cytokine, erfolgt die Expression über einen Zeitraum von Stunden. Die induzierte Form des Enzyms erzeugt eine viel größere Menge NO als die konstitutive Form und induziertes NOS scheint die "pathophysiologische" Form des Enzyms zu sein, weil hohe NO-Konzentrationen, die durch iNOS erzeugt werden, für die Zellen toxisch sein können. Die Induktion von iNOS kann durch Glucocorticoide und einige Cytokine gehemmt werden. Relativ wenig ist über die posttranskriptionelle Regulation von iNOS bekannt. Cytotoxische Wirkungen von NO sind wahrscheinlich zum Großteil von Guanylatcyclase und der Bildung von cyclischem GMP unabhängig.
Ein Großteil der Forschung auf dem Gebiet hat sich mit Inhibitoren der iNOS-Stimulation mittels verschiedener Derivate von L-Arginin beschäftigt. Es wurde jedoch wenig an der Stimulation von cNOS und ihrer Wirkung auf die Nitroglycerintoleranz geforscht. Die Nitroglycerintoleranz frustriert die Gesundheitsfürsorgegemeinschaft immer mehr, weil es bisher keinen wirksamen Weg zur Stimulation der physiologischen NO-Produktion über den Toleranz- oder Resistenzgrund von Nitroglycerin gibt, damit die vorteilhafte Wirkung der Verabreichung von Nitroglycerin für längere Zeiträume aufrechterhalten wird.
Ein wirksames Verfahren zur Behandlung hypertonischer kardiocerebrorenovaskulärer Erkrankungen und Symptome sowie nicht-hypertonischer kardiocerebrorenovaskulärer Erkrankungen und Symptome, mit dem der Resistenz-Toleranzgrund von Nitroglycerin überwunden wird, im Stand der Technik vonnöten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Mit dem hier verwendeten Begriff "Individuum" wird ein beliebiges Säugetier, einschließlich Menschen, bezeichnet, wobei die Stickoxidbildung aus Arginin erfolgt. Die hier genannten Zusammensetzungen zur Verwendung bei Individuen beabsichtigen die prophylaktische Verwendung sowie die heilende Verwendung bei der Therapie eine bestehenden Zustands. Der Begriff "natives NO" wie er hier verwendet wird, betrifft Stickoxid, das durch die Biotransformation von L-Arginin oder von dem L-Arginin-abhängigen Weg produziert wird. Der Begriff "Endpunkte" wie er hier verwendet wird betrifft klinische Ereignisse, denen man im Verlauf der Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung begegnet, bis hin zu und einschließlich Tod (Mortalität).
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung der pharmakologischen Toleranz für Nitroglycerin.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen zum Vorbeugen, Behandeln, Unterbrechen oder Verbessern der Erkrankungsbedingungen, die durch die Biotransformation von L-Arginin in endogenes Stickoxid oder "natives" Stickoxid begünstigt werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Formulierung, die eine kombinierte arterien- und venendilatatorische Wirkung hat.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die die Tachykardie lindern oder verhindern und Ischämie vorbeugen oder behandeln.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist das Vormischen von L-Arginin und Nitroglycerin damit eine synergistische Wirkung zur Behandlung der Nitroglycerintoleranz durch Steigern oder Maximieren der Fähigkeit von Nitroglycerin zur Produktion von "nativem" Stickoxid erzielt wird, und das Reduzieren der klinischen Endpunkte, die Mortalität beinhalten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Reperfusionsverletzung in Individuen verhindern, die einen plötzlichen Wiederaufbau des Blutstroms hatten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung der Kombination oder des Gemischs, das zur Reduktion der Dosierungsanforderungen von L-Arginin und der entsprechenden schädlichen Konsequenzen der Volumenüberlastung gebildet wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Gemischs von Nitroglycerin und L-Arginin zur Behandlung von Hypertonie, hypertonischer Herzerkrankung; Koronaerkrankung, einschließlich Angina, Myokardinfarkt und plötzlichem Tod; sowie einem breiten Bereich von kardiovaskulären Erkrankungen (Herzversagen, Schlaganfall und peripheren Gefäßerkrankungen) und renovaskulärer Ischämie/Hypertonie.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch eine oder mehrere der nachstehend angegebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
Ein Aspekt der Erfindung stellt eine therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung einer Erkrankung in einem Individuum durch Gefäßdilatation oder Gefäßrelaxation bereit, umfassend einen Venendilatator im Gemisch mit einem Arteriendilatator.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein therapeutisches Gemisch bereit, umfassend ein Gemisch aus L-Arginin und einen Agonisten der Stickoxidsynthase.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden therapeutisch wirksame Mengen L-Arginin und ein cNOS-Agonist vor der Verabreichung an ein Individuum miteinander vermischt.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden therapeutisch wirksame Mengen L-Arginin und Nitroglycerin bei einem physiologisch verträglichen pH-Wert vor der Verabreichung miteinander vereinigt.
Bei einer Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen zur Behandlung von Hypertonie bei einem Individuum durch Gefäßdilatation oder Gefäßrelaxation das Auswählen eines hypertonischen Individuums; das Verabreichen einer antihypertonischen Formulierung, umfassend ein Gemisch eines Venendilatators und eines Arteriendilatators, an das Individuum; periodisches Blutdruckmessen bei dem Individuum; und weiteres Verabreichen der Formulierung, bis ein wünschenswerter Blutdruck oder eine therapeutische Wirkung in dem Individuum erfasst wird. Ein wünschenswerter Blutdruck in einem hypertonischen Individuum sollte schließlich innerhalb der folgenden Bereiche liegen: systolisch vorzugsweise im Bereich von 95 bis 180 mm Hg, stärker bevorzugt im Bereich von 105 bis 165 mm Hg, und sogar noch stärker bevorzugt im Bereich von 120 bis 140 mm Hg; und diastolisch vorzugsweise im Bereich von 55 bis 115 mm Hg, stärker bevorzugt 65 bis 100 mm Hg, und sogar noch stärker bevorzugt im Bereich von 70 bis 90 mm Hg, und am stärksten bevorzugt 75 bis 85 mm Hg. Unter keinen Umständen sollte der systolische Blutdruck 95 mm Hg unterschreiten dürfen.
Eine weitere Ausführungsform ist das Bereitstellen von Verbindungen zur Vorbeugung oder Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung in einem nicht-hypertonischen Individuum durch Gefäßdilatation oder Gefäßrelaxation, umfassend: das Auswählen des Individuums; Verabreichen einer Formulierung, umfassend ein Gemisch von einem Venendilatator und einem Arteriendilatator an das Individuum, wobei der Venendilatator eine kombinierte Nicht-Endothel- und Endothel-abhängige Quelle für Stickoxid (d. h. Nitroglycerin) ist, und der Arteriendilatator eine Endothel-abhängige Quelle für Stickoxid (L-Arginin) ist; periodisches Messen der Gefäßrelaxation bei dem Individuum, und; weiteres Verabreichen der Formulierung bis ein wünschenswerter Zustand der Gefäßrelaxation oder ein wünschenswerter therapeutischer Effekt an dem Individuum erfasst wird. Ein wünschenswerter Zustand der Gefäßrelaxation ist beispielsweise das Senken des systolischen Blutdrucks um etwa 20 mm Hg und das Senken des diastolischen Blutdrucks um etwa 10 mm Hg. Unter keinen Umständen sollte der systolische Blutdruck auf weniger als 95 mm Hg gesenkt werden.
Eine weitere Ausführungsform ist das Bereitstellen von Verbindungen zur Behandlung von Hypertonie in einem Individuum durch Gefäßdilatation, umfassend das Auswählen eines hypertonischen Individuums; das Verabreichen einer anti-hypertonischen Formulierung, umfassend ein Gemisch von L-Arginin und Nitroglycerin, an ein Individuum; das periodische Blutdruckmessen bei dem Individuum; und das weitere Verabreichen der anti-hypertonischen Formulierung, bis ein wünschenswerter Blutdruck in dem Individuum erfasst wird.
Eine weitere Ausführungsform ist das Bereitstellen von Verbindungen zur Stimulation von cNOS in einem Individuum, umfassend das Auswählen eines Individuums; das Verabreichen einer Formulierung, umfassend ein Gemisch von L-Arginin und Nitroglycerin, an ein Individuum, damit die Produktion von "nativem" NO maximiert wird, und so die Toleranz behandelt wird und die Endpunkte, die die Mortalität einschließen, reduziert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt:
1, eine schematische Darstellung der Stickoxid-Produktion, die vorgeschlagenen L-Arginin-abhängigen und -unabhängigen Wege.
2, ein Säulendiagramm, die cNOS-stimulierende Wirkung der kombinierten Verabreichung von L-Arginin und Nitroglycerin auf Rattenaorta.
3, ein Säulendiagramm, das Fehlen der cNOS-stimulierenden Wirkung der kombinierten Verabreichung von L-Arginin und SNP auf Rattenaorta.
4, eine Human-Dosis-Untersuchung, das Fehlen von Tachykardie während der Verabreichung der hier beschriebenen Formulierung.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Man hat entdeckt, dass das Vereinigen von L-Arginin und Nitroglycerin vor der Verabreichung das Resistenz- oder Toleranz-Niveau, das gewöhnlich bei der Verabreichung von nur Nitroglycerin festgestellt wird, überwindet. Man nimmt an, dass NOS durch Nitroglycerin stimuliert werden kann und dass das Vormischen mit L-Arginin eine synergistische vorteilhafte Wirkung hat, die auf der Bildung eines Komplexes oder einer Koordinationsverbindung zwischen Nitroglycerin und L-Arginin beruhen kann. Überschüssiges L-Arginin stellt zusätzliches Substrat für die stimulierte Stickoxidsynthase bereit, die die Biotransformation von L-Arginin in Stickoxid katalysiert.
Eine solche Stimulation von NOS in der Gegenwart von überschüssigem L-Arginin kann zum Vorbeugen, Behandeln, Aufhalten oder Verbessern einer beliebigen Erkrankung oder eines beliebigen Zustands verwendet werden, die/der durch die NO-Produktion positiv beeinflusst werden kann. Solche Bedingungen umfassen hypertonische kardiocerebro-renovaskuläre Erkrankungen und Symptome, sowie nicht-hypertonische kardiocerebro-renovaskuläre Erkrankungen. Das Gemisch ist besonders geeignet für Individuen, die eine native NO-Produktion benötigen. Die Anwendung eines solchen Gemischs ist vorteilhaft für: (1) chronisch stabile Angina; (2) instabile Angina; (3) akuten Myokard-Infarkt; (4) hibernierendes Myokard; (5) starres Myokard; (6) die Einschränkung der ventrikulären Remodellierung bei Post-Myokard-Infarkt und die anschließende Gefahr von kongestivem Herzversagen; (7) die Prophylaxe von rezidivierendem Myokard-Infarkt; (8) die Verhinderung von plötzlichem Tod nach Myokard-Infarkt; (9) vasospastische Angina; (10) systolisch gesehenes kongestives Herzversagen in Zusammenhang mit 1 bis 6 oben; (11) diastolisch gesehenes kongestives Herzversagen in Zusammenhang mit 1 bis 10 oben und 12 bis 15 unten; (12) mikrovaskuläre Angina, gesehen in Zusammenhang mit 1 bis 11 oben und 15 und 16 unten; (13) stille Ischämie, gesehen in Zusammenhang mit 1 bis 12 oben und 15 und 16 unten; (14) die Reduktion der ventrikulären ektopischen Aktivität, gesehen in Zusammenhang mit 1 bis 13 oben und 15 unten; (15) für einen beliebigen oder alle der vorstehenden Zustände 1 bis 14 von ischämischem Myokard in Zusammenhang mit hypertonischer Herzerkrankung und gestörter Korona-Vasodilatator-Reserve; (16) die Steuerung des Blutdrucks bei der Behandlung von hypertonischer Krise, perioperativer Hypertonie, unkomplizierter essentieller Hypertonie und sekundärer Hypertonie; (17) die Regression der linken ventrikulären Hypertrophie, gesehen in Zusammenhang mit 15 und 16 oben; (18) die Vorbeugung und/oder Regression von epikardialer Korona-Atherosklerose, gesehen in 1 bis 17 oben; (19) die Vorbeugung von Restenose nach Angioplastie; (20) die Vorbeugung und/oder Verbesserung der radikalisch vermittelten Reperfusionsverletzung in Zusammenhang mit 1 bis 19 oben; (21) die Verwendung der Kombination bei der Vorbeugung von Myokard-Verletzung während des kardioplegischen Stillstands während des Korona-Bypass oder einer anderen offenen Herzoperation, d. h. die Verwendung der Kombination als kardioplegische Lösung; (22) die Post-Transplantat-Kardiomyopathie; (23) die renovaskuläre Ischämie; (24) die cerebrovaskuläre Ischemie (Transiente ischämische Attacke (TIA) und Schlaganfall).
1 ist eine schematische Darstellung, die den vorgeschlagenen Wirkmechanismus, der von Nitro-Gefäßdilatatoren auf der Erzeugerzelle und einer Zielzelle ausgelöst wird und ihre Beziehung untereinander zeigt. Es scheint, dass der Wirkmechanismus von Nitroglycerin oder Glyceryltrinitrat (GTN) sowohl L-Arginin-abhängig als auch L-Arginin-unabhängig ist, und dieser Zusammenhang hat weitreichende Auswirkungen auf die Entwicklung und die Behandlung der Nitroglycerin-Toleranz und die Reduktion der klinischen Endpunkte und Mortalität. Eine Art von Erzeugerzelle ist eine Endothelzelle, kann aber auch eine Endokard-Zelle oder eine Korona-Endothelzelle sein; und ein entsprechender Typ von Zielzelle ist eine glatte Gefäßmuskelzelle, kann aber auch eine Myokardzelle (Myocyt) sein. Glatte Gefäßmuskelzellen befinden sich hauptsächlich in den Venen, Arterien und Korona-Arterien. Die folgende Diskussion konzentriert sich auf die Glattmuskel- und Myocyten-Relaxation, die durch Nitro-Gefäßdilatatoren stimuliert wird, wobei die Stickoxidsynthase cNOS, die konstitutive, Form der Stickoxidsynthase, ist, die Erzeugerzellen Endothelzellen sind, und die Zielzellen glatte Gefäßmuskelzellen sind. Diese Veranschaulichung soll nicht auf irgend eine zelluläre Beziehung zwischen den verschiedenen Wirkstellen hinauslaufen, sondern eher ihre funktionelle Beziehung veranschaulichen.
In 1 kann die Produktion von NO auf einer Vielzahl von Quellen und Mechanismen beruhen, die eingehend in Ignarro, (Louis J. PhD., 1991, Pharmacology of Endothelium-Derived Nitric Oxide and Nitrovasodilators, The Western Journal of Medicine, S. 51–62) beschrieben sind, das hierin vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen ist. Bei dem L-Arginin-unabhängigen oder Nicht-Endothel-abhängigen Weg hängt die Aktivierung der Guanylatcyclase (GC) durch Stickoxid (NO) von dem Typ des verwendeten Nitro-Gefäßdilatators ab. Anorganisches Nitrit (NO₂ ^–) wird eingespeist, und nur begrenzte Mengen können die Zelle durchdringen, aber das intrazelluläre Nitrit kann zu NO umgewandelt werden. Lipophile organische Nitratester (R-OH) werden durch Reaktionen, die durch saures Thiol (R-SH) erleichtert werden, in NO umgewandelt. S-Nitrosothiole (R-SNO) sind labile Zwischenprodukte, die sich spontan zersetzen und NO erzeugen. Man nimmt an, dass einer der Mechanismen, durch den Thiole die Wirkung von Nitroglycerin vervielfachen und die Toleranz gegenüber Nitroglycerin in gewissem Maße umkehren, durch direkte Reaktion zwischen dem Thiol (R-SH) und Nitroglycerin (GTN) erfolgt, so dass das labile Zwischenprodukt S-Nitrosothiol (R-SNO) erhalten wird, das sich wie vorstehend beschrieben zersetzt (R-SH + GTN → R-SNO ist nicht in 1 gezeigt). Eine nicht-enzymatische Bildung von exogenem NO tritt wahrscheinlich mit Thiolquellen, wie Cystein, Dithiothreitol, N-Acetylcystein, Mercaptobernsteinsäure, Thiosalicylsäure, und Methylthiosalicylsäure auf. Nitrate, wie Isosorbid-Dinitrat und Isosorbid-5'-Mononitrat können auch zur Herstellung von NO verwendet werden, da sie einfach kommerziell erhältliche Zwischenprodukte in dem bekannten L-Arginin-unabhängigen Weg sind. Nitroprussid ((CN)₅-FeNO) bildet beim Abbau NO und ist nicht Thiol-abhängig. GTP ist Guanosintriphosphat; HONO ist salpetrige Säure; Meth.-Blau ist Methylenblau; R-ONO steht für organische Nitritester; und R-SS-R steht für ein Disulfid. Bei dem L-Arginin-unabhängigen Weg ist die Glyceryltrinitrat (GTN)-Reaktion durch R-ONO₂ dargestellt, und sie benötigt wahrscheinlich einen bestimmten Pool an Thiolen, wie ein sulfhydrylhaltiges Enzym, damit NO erzeugt wird, und es wurde vorher angenommen, dass die intrazelluläre Thioldefizienz zu einer Toleranz gegenüber den pharmakologischen Wirkungen von Nitroglycerin führt. Dies ist jedoch nicht für die Toleranz verantwortlich, da exogene dosisabhängige Thiole nicht zu einer Umkehr der Nitroglycerin-Toleranz führen (Fung H. L., 1988, Journal of Pharmacology and experimental Therapeutics. 245: 2, 524–30.), sondern gegenüber einer Erleichterung der spontanen Freisetzung von Stickoxid eine vorteilhafte Wirkung als unabhängige Donatoren von NO ausüben können. (Munzel, T., M. D. et al., 1994, What Causes Nitroglycerin Tolerance? Clinical Cardiology. 20 Nr. 9: 40–47.
Es wird jedoch hier erstmalig die Hypothese aufgestellt, dass die Toleranz für Nitroglycerin einen sekundären Weg beinhaltet oder dass tatsächlich dieser "sekundäre Weg" der primäre Weg sein kann. Dieser sekundäre Weg ist der L-Arginin-abhängige Weg oder der Endothel-abhängige Weg, der in 1 gezeigt ist. Der 1 zufolge hat die Erzeugerzelle bekanntlich mehrere rezeptorvermittelte Agonisten, wie den Endothel-B-Rezeptor (ET_B); Acetylcholin (Ach); Substanz P (SP), Histamin (H); Arginin-Vasopressin (AVP); Bradykinin (BK); Adenosintriphosphat (ATP); Prostaglandin F_2a (F_2a); Oxytocin (OT); und den Calciumionophor (A23187), die die NOS-Produktion stimulieren. Es wurde aber bisher nicht spekuliert, dass Nitroglycerin in doppelter Weise als Agonist für NOS und Prodrug für den Sulfhydryl-vermittelten L-Arginin-unabhängigen Weg dienen kann.
Es wurde zuvor angenommen, dass Nitroglycerin keine Wirkung auf die Biotransformation von L-Arginin in "natives" Stickoxid hatte, doch jetzt geht man davon aus, dass Nitroglycerin oder ein Nitroglycerin-Komplex oder eine -Koordinationsverbindung (GTN-Komplex in 1) mit L-Arginin eine stimulierende Wirkung auf cNOS hat. Der Mechanismus ist nicht gut verstanden, aber es scheint, dass die neue Kombination von Nitroglycerin und L-Arginin vor der Verabreichung eine bisher unerwartete synergistische Wirkung auf die cNOS-Stimulation hat, die zum Teil auf einer neuen Komplexformulierung beruhen kann, die als Abgabesystem für nicht verarbeitetes Nitroglycerin dient. Die Stimulation von cNOS kann dagegen ein Ergebnis von cNOS mit einer einzelnen Rezeptorstelle für den Komplex oder Nitroglycrin sein, das sich mit L-Arginin im Zustand des Disassoziationsgleichgewichts befindet. Das Verabreichen der beiden in Kombination stellt auch ein angemessenes Substrat für cNOS-Verarbeitung von L-Arginin bereit, da das L-Arginin im Überschuss zugegeben wird.
Zwischen L-Arginin und Nitroglycerin scheint es in gewissem Maße zu Komplex- oder Koordinationsverbindungen zu kommen, wenn die beiden gemischt werden. Dies ist in der Tabelle I gezeigt, wobei die Koordinationsverbindung mit einem Bruker 300 MHz NMR untersucht wurde. Die untersuchten Proben bestanden aus den folgenden: Probe A, ein konzentrierter Standard (100 mg L-Arg in 0,5 ml D₂O); Probe B, ein konzentriertes Gemisch (100 mg L-Arg plus eine Tablette Nitrostat in 0,5 ml D₂O; Probe C, ein verdünnter Standard (1 Tropfen Probe A in 1,0 ml D₂O); und Probe D, ein verdünntes Gemisch (13 mg L-Arg plus 3 Tabletten Nitrostat in 1 ml D₂O). Diese Proben wurden verglichen und im Computer vereinigt und so bestimmt, ob sich ein Komplex gebildet hatte. Die Zugabe von Nitroglycerin zu L-Arginin führte zu einer Änderung der chemischen Verschiebungen für das L-Arginin-Multiplett bei δ 1,9 und das Triplett bei δ 3,2, den am häufigsten untersuchten Signalen. Diese Änderung ist in der Tabelle I gezeigt.
Tabelle O Analyse des δ 3,2-Signals
Analyse des δ 1,9-Signals
Die Änderung der chemischen Protonenverschiebungen bei L-Arginin in der Anwesenheit von Nitroglycerin ist ein starker Indikator dafür, dass sich ein Komplex der Substanzen in Lösung bildet, so dass ein Zwischenprodukt erhalten wird, das sich erheblich von den beiden unabhängigen Substanzen unterscheidet. Dies wird weiter durch die Tatsache gestützt, dass die Verschiebung nicht konzentrationsabhängig war. Somit kann deutlich geschlossen werden, dass L-Arginin und Nitroglycerin nicht unabhängig in Lösung wirken, sondern eher auf gewisse Weise an der Bildung eines Komplexes beteiligt sind, die die chemische Umgebung der L-Arginin-Protonen ändert und die mit der Hochauflösungs-NMR-Spektroskopie erfasst werden können. Dies kann das einzigartige vorteilhafte NO-Abgabesystem erklären, das die vorher bei der Verabreichung von Nitroglycerin allein beobachtete Resistent-Toleranzschwelle überwindet. Die vorteilhafte Wirkung kann jedoch lediglich aus der gleichzeitigen Verareichung von L-Arginin und eines cNOS-Stimulators resultieren.
Die Kombination von L-Arginin und Nitroglycerin kann ebenfalls zu einer kombinierten und venendilatatorischen Wirkung führen. Allein verwendet ist Nitroglycerin prinzipiell ein Venendilatator und verursacht aufgrund seiner Ansammlung in den Venen einen raschen Anstieg des Herzschlags, wohingegen L-Arginin dagegen bei alleiniger Verwendung prinzipiell ein Arteriendilatator ist. Daher bildet die Kombination der beiden Ergebnisse bei ausgeglichener arterien- und venendilatatorischer Wirkung ein Gegengewicht zu den Tendenzen der einen oder anderen Substanz, so dass eine Tachykardie erzeugt wird, die der Ischämie bei einem entstehenden Myokardinfarkt entgegenwirkt. Dies wird durch vorläufige Daten in Untersuchungen an Hunden erwogen, und ist am bemerkenswertesten in den in Tabelle II gezeigten Daten. Die Daten in der Tabelle II wurden durch Verabreichen von 5 cm³/min L-Arginin erzeugt, wobei das L-Arginin bei 10% w/v (g/ml) und das Nitroglycerin bei 3,38 μg/kg/min durch intravenöse (IV) Verabreichung über einen 5-Minutenzeitraum verabreicht wurde. Der Hund war ein Beagle mit 13,6 kg Gewicht. Bei der Verabreichung in Kombination blieben die relativen Konzentrationen und Dosen gleich. BP ist der Blutdruck (systolisch/diastolisch in mm Hg); MAP ist der mittlere Arteriendruck (mm Hg); CO ist der Herz-Ausstoß (Liter/min.); TPVR ist die periphere Gefäß-Gesamtresistenz (Dyn*sec/cm³); ΔTPVR ist die Änderung der peripheren Gefäß-Gesamtresistenz (%); und HR ist die Herzrate (bpm).
TABELLE II – Hundeuntersuchung
Wie aus der Wirkung auf CO oder auf den Herzausstoß ersichtlich beruht ein Anstieg des Herzausstoß nach der Verabreichung von L-Arginin allein auf der Wirkung von L-Arginin prinzipiell als Arteriendilatator; und die Abnahme des Herzausstoßes, der mit Nitroglycerin allein beobachtet wird, beruht prinzipiell auf einer venendilatatorischen Wirkung; wohingegen die Kombination eine im Wesentlichen ausgeglichene arterien- und venendilatatorische Wirkung hervorbringt (eine Änderung des Herzausstoßes von nur 0,04 (1,60 – 1,56)). Folglich fehlt eine Tendenz zur Tachykardie (d. h. es gibt kein Anzeichen für eine Barorezeptor-Reflex-Aktivierung).
Ein weiterer vorteilhafter Mechanismus der Kombination betrifft die Tatsache, dass allein verwendetes Nitroglycerin nur einen minimalen Vorteil bei der Eindämmung der Reperfusionsverletzung bei Patienten bietet, die kürzlich Herzattacken und einen plötzliche Wiederaufbau des Blutstromes hatten. Das Gleiche wird bei Patienten beobachtet, die einen Wiederaufbau des Blutstroms nach Korona-Bypass-Operationen nach dem Entfernen der Bypass-Pumpe durchlaufen. Diese Form der Reperfusionsverletzung wird wahrscheinlich durch eine Radikal-Erzeugung bei der Reperfusion vermittelt, und vorläufige Daten insbesondere bei Katzen zeigen, dass allein verabreichtes L-Arginin die Produktion von Radikalen einschränkt. (Weyrich, A. S., PhD., et al., 1992, The Role of L-Arginine in Ameliorating Reperfusion Injury After Myocardial Ischemia in the Cat. Circulation. 86: 289–288). Daher schränkt eine Kombination im Vergleich zu allein verwendetem Nitroglycerin die Reperfusionsverletzung wahrscheinlich ein.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung der Kombination gegenüber den jeweils allein verwendeten Substanzen betrifft die Tatsache, dass die Freiwilligen-Untersuchung bisher mit nur L-Arginin ergaben, dass es eine schwacher Gefäßdilatator in Bezug auf die Dosierungsanforderungen ist (600 ml/Std. wie beschrieben von Nakaki T. et al., 1990, L-Arginine Induced Hyportension. The Lancet, S. 696). Patienten die instabile Koronasyndrome und Myokardinfarkt mit oder ohne Komplikation des kongestiven Herzversagens haben, sind gegenüber einer Volumenüberlastung bei der Verabreichung von IV-Flüssigkeiten anfällig. Daher kann man durch Kombinieren von Nitroglycerin und L-Arginin die Gesamt-L-Arginin-Dosierungsanforderung und dadurch die Gefahr zur Entwicklung von kongestivem Herzversagen erheblich einschränken. Dies kann ebenfalls bei Patienten von Bedeutung sein, die eine gestörte Nierenfunktion aufweisen und die gegenüber Azidose und Nierenversagen mit großen L-Arginin-Volumina anfällig sind.
Die einzusetzende prinzipielle Kombination ist ein Gemisch, das die therapeutischen Konzentrationen von L-Arginin und Nitroglycerin in Wasser beinhaltet. Jedes beliebige L-Arginin mit pharmazeutischem Grad ist ausreichend, und es sollte verdünnt werden, und zwar vorzugsweise auf 2,5 bis 60% w/v (g/ml), stärker bevorzugt 5 bis 45% (w/v) (g/ml), noch stärker bevorzugt zwischen 7,5 bis 40% w/v (g/ml), sogar noch stärker bevorzugt 10 bis 15% w/v (g/ml), und am stärksten bevorzugt 10% w/v (g/ml) L-Arginin. Die üblichen erwarteten Dosen sind 30 g L-Arginin in sterilem Wasser (Gesamtvolumen 300 ml). Man erwartet, dass das L-Arginin schließlich in einem Verhältnis von Hydrochloridsalz : L-Arginin als Base von etwa 10 : 1 bis etwa 25 : 1 vorliegt, und noch stärker bevorzugt 15 : 1 bis etwa 20 : 1 Hydrochloridsalz zu Base, und am stärksten bevorzugt 15 : 1 Hydrochloridaslz zu Base. In diesem Beispiel sind 28 bis 29 g das Hydrochloridsalz und 1 bis 2 g L-Arginin sind die Base. Man erwartet, dass das mit L- Arginin zu kombinierende Nitroglycerin eine von der Masse des Individuums in kg und von der Dosierungsdauer abhängige Konzentration im Bereich von vorzugsweise 0,1 μg/kg/min bis 5 μg/kg/min, stärker bevorzugt im Bereich von 0,2 μg/kg/min bis 4 μg/kg/min, noch stärker bevorzugt im Bereich von 0,5 μg/kg/min bis 3 μg/kg/min, noch stärker bevorzugt im Bereich von 0,75 μg/kg/min bis 2 μg/kg/min und am stärksten bevorzugt 1 μg/kg/min hat. Daher wird das Nitroglycerin je nach dem IV-Volumen, der Verabreichungsdauer und dem Gewicht des Individuums in einer so großen Menge zugegeben, dass der gewünschte Bereich erhalten wird (d. h. 1 μg/kg/min). Wird ein transdermales System verwendet, sollte die Abgabe von Nitroglycerin vorzugsweise zwischen 0,2 mg/Std. und 1 mg/Std., stärker bevorzugt zwischen 0,3 mg/Std. und 0,8 mg/Std. und sogar noch stärker bevorzugt zwischen 0,4 mg/Std. und 0,6 mg/Std. betragen. Man erwartet, dass die Verpackung gefriergetrocknetes L-Arginin in einer Glasflasche enthält, wozu das Nitroglycerin und das sterile Wasser derart zugegeben werden sollten, dass 30 g L-Arginin und 1 bis 960 mg Nitroglycerin insgesamt mit sterilem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 300 cm³ verdünnt werden. Alternativ können Nitroglycerin, L-Arginin und Wasser in sterilen Glasflaschen zugegeben und auf einen physiologischen pH-Wert eingestellt werden. Der pH-Wert beim Wiederauflösen in Wasser sollte vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis 8, stärker bevorzugt im Bereich von 6 bis 7,5, noch stärker bevorzugt im Bereich von 7 bis 7,5 liegen, und noch stärker bevorzugt etwa 7,4 betragen, d. h. es handelt sich um einen physiologischen pH-Wert, damit das vorhandene Problem vermieden wird, das in solchen Lösungen zugegen ist, welche eine pH-Wert-Einschränkung auf 5,6 erfordern, so dass ein bakterielles Überwachsen in Perioden längeren Stehenlassens beim Versand in Lösung vermieden wird.
Die Nitroglycerin-Dosis kann je nach den künftigen Untersuchungen an der Wirkung des Kombinationsverhältnisses auf die Herzrate variieren. Die Diskussion konzentriert sich zwar auf die intravenöse Verabreichung, jedoch sind zudem auch buccale, intrakoronare, intramuskuläre, topische, intranasale, rektale, sublinguale, orale, subkutane oder Pflaster-Verabreichungsformen allein oder in Kombination zulässig. Die Kombination von L-Arginin und Nitroglycerin in einem Pflaster kann aufgrund ihrer Kompatibilität die üblichste Verwendung sein, wie es derzeit der Fall ist für die Verwendung von nur Nitroglycerin in Pflasterform. Die Anwendbarkeit der Pflastertechnologie wird durch den Löslichkeitstest von L-Arginin in Tridil^TM unterstützt. Der Löslichkeitstest zeigte Folgendes: ohne die Zugabe von Wasser lösen sich etwa 170 mg L-Arginin in 1,0 ml Tridil^TM (5 mg Nitroglycerin/ml); ein klares farbloses Gemisch wurde erhalten, wenn 2500 mg L-Argininhydrochlorid, 1,0 ml Tridil^TM und 2,8 ml deionisiertes Wasser bei 30°C unter vorsichtigem Rühren vereinigt wurden und dann auf Umgebungstemperatur (etwa 24°C) gekühlt wurden; und es wurde ein sehr dicker aber dennoch gießfähiger Schlamm erhalten, wenn 2500 mg L-Arginin, 1 ml Tridil^TM und nur 0,5 ml deionisiertes Wasser ver einigt wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass L-Arginin und Tridil^TM ein starkes Ausmaß an Löslichkeitskompatibilität aufweisen, und sie daher leicht in die gängige Pflaster-Verabreichungstechnologie eingebracht werden können.
Folgendes veranschaulicht den vorstehend beschriebenen Wirkmechanismus kardiocerebro-renovaskulärer Erkrankungen:
Beispiel 1
Es wurde vor kurzem entdeckt, dass Hunde, die bis zum Grund einer Nitroglycerinwirkung behandelt wurden, durch gemeinsame Verabreichung von Nitroglycerin und L-Arginin weiter ansprechbar gemacht werden konnten, und zwar auf ähnliche Weise, wie man es gewöhnlich klinisch bei Zugabe von Natriumprussid (SNP) zu Nitroglycerin beobachtet; im Vergleich zu SNP hatte jedoch das mit Nitroglycerin kombinierte L-Arginin viel günstigere hämodynamische Wirkungen. Verglichen mit SNP war die Gefäßwiderstand um 50% reduziert, der Herzausstoß verdoppelt und die Kontraktilität erhöht. Dies führte zu der Hypothese, dass die Kombination von L-Arginin und Nitroglycerin im Gegensatz zu SNP, das bekanntlich auf direkte Weise Stickoxid produziert, EDRF erzeugte.
Da es bekanntlich immer noch Diskussionen darüber gibt, ob EDRF identisch zu Stickoxid ist, wurde die Hypothese aufgestellt, dass EDRF, das nicht identisch zu NO ist, für den Unterschied bei der hämodynamischen Wirkung verantwortlich ist. Zur Erklärung des zusätzlichen EDRF wurde die Hypothese aufgestellt, dass Nitroglycerin nicht nur ein Prodrug für Stickoxid ist, sondern auch ein Agonist für die cNOS-Aktivierung ist, und dass die Einschränkungen der L-Arginin-Rate im Hundemodell erklärt werden können durch ein gestörtes Verhältnis zwischen Angebot und Nachfrage bei der L-Arginin-Aufnahme, insbesondere bei einem Krankheitszustand, wie Hypertonie, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, bei der die Endothelzelle beteiligt ist, wobei es sich wahrscheinlich um einen aktiven Transportprozess mit potentiellen Einschränkungen der Rate handelt, die möglicherweise durch passive Diffusion von in Überschuss zugeführtem L-Arginin aufgehoben werden können. Folglich besteht eine vernünftige Erklärung zur Kombination von L-Arginin mit Nitroglycerin zur Behandlung von Nitrat-Resistenz und Toleranz. Diese Hypothese wurde getestet, indem die Einwirkungen von Nitroglycerin in Kombination mit L-Arginin in wässriger Lösung auf Ratten-Aorta untersucht wurde, und die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die mit SNP erhalten wurden, das in wässriger Lösung mit L-Arginin kombiniert war. Die Wirkung der Kombination von L-Arginin und Nitroglycerin erscheint in 2. Die klinischen Präparate waren wie folgt:
TIERPRÄPARATION
Acht Sprague-Dawley-Ratten wurden in dieser Nitroglycerin-Untersuchung verwendet, und zwei wurden in der SNP-Untersuchung verwendet. Die Aorten wurden nach der Entnahme aus den Ratten jeweils gereinigt und in 5 Segmente geschnitten. Die Segmente wurden statistisch verteilt, damit die Variation der Grundlinienwerfe minimiert war. Danach wurden die Segmente in Earl's-Salzlösung bei 37°C inkubiert.
BEHANDLUNGSPROTOKOLL
Nitroglycerin-Gruppe – Eines der 5 entfernten Segmente diente als Kontrolle, mit der die Integrität des Endothels bestimmt wurde (Basisaktivität). Die anderen vier erhielten jeweils 50 μmol L-Arginin. Nach 30 min wurde 1 ml IBMAX (50 μmol) zu den 5 Segmenten gefügt, um jeglichen weiteren cGMP-Abbau durch Phosphodiesterase zu verhindern (IBMAX ist Isobutylmethylxanthin). Die 5 Segmente wurden folgendermaßen behandelt: A – Kontroll-Basisaktivität; B ist die L-Arginingruppe – 50 μmol L-Arginin wurden zur Basisgruppe gegeben; C ist die Nitroglyceringruppe – 5 μmol Nitroglycerin in 50 μmol L-Arginin; D ist die Gruppe Nitroglycerin + N^G-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME, ein bekannter Inhibitor mit NOS-Funktion) – 5 μmol Nitroglycerin + 0,5 μmol L-NAME und 50 μmol L-Arginin; und E ist die L-NAME-Gruppe – 0,5 μmol L-NAME und 50 μmol L-Arginin. Nach 50 min wurden die Segmente jeweils entnommen und in 500 μl 0,1 NHCl untergebracht. Sie wurden für eine Std. stehen gelassen, wobei sie entnommen und gewogen wurden.
TEST AUF CYCLISCHES AMP
Zur Bestimmung von cGMP wurden 400 μl HCl-Lösung, die nach dem Entnehmen und Wiegen der Streifen verblieb, in Gamma-Flow-Röhrchen überführt, und cyclisches GMP wurde durch Radioimmuntest bestimmt.
DATENINTERPRETATION

A. Kontrolle – Basal. Dies veranschaulicht die cGMP-Aktivität an der Grundlinie, welche erzeugt wurde durch Anhalten der NO-Quellen zur Aktivierung von löslicher Guanylatcyclase, d. h. die Grundlinie.
B. L-Arginin-Gruppe. Diese veranschaulicht die cGMP-Aktivität, die durch L-Arginin und EDRF (endogene oder "native" NO-Produktion) erzeugt wird.
C. Nitroglycerin-Gruppe. (L-Arginin plus Nitroglycerin). Die cGMP-Aktivität veranschaulicht die Summe von B (L-Arginin) plus Nitroglycerin-Induktion von cNOS, und anschließendes EDRF, das zusätzlich zu Stickoxid durch den L-Arginin-unabhängigen Weg aus Nitroglycerin erzeugt wurde (Prodrug-Effekte).
D. L-NAME-Gruppe. L-Arginin (L-Arginin plus Nitroglycerin plus L-NAME). Veranschaulicht die cGMP-Aktivität aus der enzymatischen Nitroglycerin-Umwandlung allein, da das im Überschuss verwendete L-NAME das von EDRF aus allen Quellen hergeleitete NOS hemmt.
E. L-Arginin + L-NAME – veranschaulicht die cGMP-Aktivität aufgrund von Nicht-Stickoxid-Quellen, die die lösliche Guanylatcyclase-Aktivierung aktiviert, und die von sämtlichen Messungen subtrahiert wurde, damit die Wirkungen aus der Nicht-NO-Aktivierung von cGMP eliminiert wurden. (atrialer natriuretischer Faktor, usw.).

Demzufolge gilt: Gesamt-NO aus Nitroglycerin ist C – B; NO aus dem enzymatischen Abbau von Nitroglycerin zu NO ist gleich D – E; EDRF (NOS)-Stimulation aus Nitroglycerin = (C – B) – (D – E)
SNP-Gruppe
Eine zweite Gruppe von zwei Ratten wurde wie oben untersucht, nur dass in dieser Gruppe Nitroglycerin im Behandlungsprotokoll durch SNP ersetzt wurde. Diese Ergebnisse sind in der 3 gezeigt, A', B' und E' entsprechen genau A, B und E von 2. C' ist gleich 50 μmol L-Arginin plus 1 μmol SNP und veranschaulicht die cGMP-Aktivität aus der L-Arginin-Stimulation der EDRF-Produktion plus jegliche cNOS-Aktivierung durch SNP plus NO aus SNP durch nicht-enzymatische Umwandlung. SNP benötigt anscheinend keine Sulfhydrylgruppe, aber es bildet eher NO und Cyanid nicht-enzymatisch als Nebenprodukt. D' ist SNP + L-NAME – veranschaulicht die cGMP-Aktivität, die durch nicht-enzymatische Umwandlung von SNP zu NO allein erzeugt wird, d. h. exogenes oder "nicht-natives" NO. Gesamt-NO aus SNP = C' – B'; Gesamt-NO aus SNP aus der nicht-enzymatischen Umwandlung = D' – E'; EDRF aus SNP durch NOS-Aktivierung = (C' – B') – (D' – E').
ERGEBNISSE
Die 2 und 3 fassen diese Ergebnisse jeweils mit einem Säulendiagramm zusammen, das die jeweils erfassten Picomole cGMP/100 mg Feuchtgewebe veranschaulicht. Wurden Nitroglycerin und L-NAME bei Abwesenheit von L-Arginin vereinigt, was in 2 allerdings nicht gezeigt ist, wurden ähnliche Ergebnisse in Bezug auf die cGMP-Produktion erhalten. In den 2 und 3 ist die als NOS bezeichnete Säule die Menge an erzeugten "nativem" NO gleich Gesamt-NO minus NO, produziert über den L-Arginin-unabhängigen Weg.
Die Nitroglycerin-Resistenz-Toleranz frustriert Kardiologen und Pharmakologen seit 1888. (Stewart D. D., 1888, Remarkable Tolerance to Nitroglycerin. Philadelphia Polyclinic. 172–5). Diese Ergebnisse unterstützen die in der 1 gezeigte Hypothese und klären den Mechanismus der Nitroglycerin-Toleranz. Man nimmt an, dass eine zusätzliche Nitroglycerin-Aktivierungsstelle cNOS in der Endothelzelle ist. Unter Bedingungen, die zu Toleranz führen, bewirkt der Agonisteneffekt von Nitroglycerin bei cNOS-Induktion eine Abreicherung von L-Arginin in der Endothelzelle sekundär zu den Einschränkungen der Raten bei den Kinetiken der aktiven L-Arginin-Transportpumpen in 1. Dies erzeugt eine gestörte Situation von Angebot und Nachfrage beim Membran- Aufnahme-Schritt und erklärt, warum Arginin im Hunde-Modell geschwindigkeitsbeschränkend ist. Dies kann auch erklären, warum während der Verabreichung von Nitroglycerin ein nitratfreies Intervall vonnöten ist. Man nimmt an, dass dies nötig ist, so dass die Endothelzellen das defiziente L-Arginin durch aktiven Transport wieder auffüllen können. Es wird vermutet, dass durch Zugabe von L-Arginin zu Nitroglycerin EDRF erzeugt werden kann, und bei dem Verfahren kann gegenüber der Verwendung von Nitroglycerin allein oder in Kombination mit SNP oder anderen Donatoren von exogenem NO eine signifikante Reduktion der klinischen und Mortalitäts-Endpunkte erhalten werden.
Die Tatsache, dass Venen im Vergleich zu Arterien gegenüber exogenem NO (und höchstwahrscheinlich auch "nativem" NO) empfindlicher sind, erklärt warum Nitroglycerin bei niedrigen Dosen prinzipiell ein Venendilatator verglichen mit SNP ist, welches ein ausgeglichener Arterien-Venendilatator ist. Es erklärt warum Nitroglycerin bei 37 μg/Std. arteriell wird, weil bei dieser Menge das gesamte EDRF-Potential realisiert wird und die Prodrug-Umwandlung von NO die letzte Quelle für das durch Nitroglycerin erzeugte Stickoxid übernimmt. Diese letzte Quelle für das aus der Prodrug-Umwandlung erzeugte NO ist äquivalent zu NO aus SNP und erzeugt einen ähnlichen arteriellen Effekt.
Möglicherweise ist EDRF nicht identisch zu NO und ist möglicherweise die Vorstufe (L-OH-NO hat eine Halbwertszeit von 3 bis 50 sek.) für NO. Dies würde erklären, warum die Versuche, bei denen Nitroglycerin gegen SNP in klinischen Situationen ersetzt wurde, wie bei instabiler Angina und akutem Myokardinfarkt, fehlschlugen (Flaherty, J. T., M. D., 1983, Comparison of Intravenous Nitroglycerin and Sodium Nitroprusside in Acute Myocardial Infarction. American Journal of Medicine. 53–60), weil EDRF bessere anti-ischämische Wirkungen hat, und weil EDRF nicht mit SNP erzeugt wird, führt SNP nicht zu den Vorteilen bei der Mortalität, die potentiell mit Nitroglycerin realisierbar wären. Ein weiterer vorteilhafter Effekt von EDRF, der durch die cNOS-Stimulation mit Nitroglycerin hervor gerufen wird, kann darauf beruhen, dass EDRF verglichen mit exogenem NO als Radikalfänger wirkt (Zembowicz A., et al., 1991, Nitric Oxide and Another Potent Vasodilator are Formed from N^G-Hydroxy-L-arginine by Culture Endothelial Cells. Pharmacology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11172–76). Bei einer Reperfusionsverletzung wird ein Radikalfänger (möglicherweise EDRF) zur Absorption der Radikale benötigt, was anscheinend mit L-Arginin und Nitroglycerin, aber nicht mit SNP, einer nicht-nativen NO-Quelle, geschieht. Dies lässt sich dadurch erklären, dass man das Zwischenprodukt EDRF nicht bei SNP erwartet. Die Toleranz wird aufgebaut, und die vorteilhafte Wirkung von Nitroglycerin geht verloren, weil kein EDRF mehr produziert wird, oder mindestens bis der geschwindigkeitseinschränkende Schritt durch Zugabe von L-Arginin-Substrat überwunden wird. Dies bietet einen zusätzlichen vorteilhaften Mechanismus aus der Kombination oder dem Komplex, weil es auf der Tatsache beruht, dass allein verwendetes Nitroglycerin bei der Eindämmung der Reperfusions verletzung bei Patienten, die vor Kurzem Herzattacken und einen plötzlichen Wiederaufbau des Blutstroms hatten, bald seine vorteilhafte Wirkung. Gleiches gilt für Patienten, die nach Korona-Bypassoperationen einen neuerlichen Aufbau des Blutstroms hatten, und die von der Bypasspumpe entfernt wurden. Diese Form der Reperfusionsverletzung wird wahrscheinlich durch radikalische Erzeugung von Reperfusion vermittelt, und vorläufige Daten insbesondere an Katzen belegen, dass allein verabreichtes L-Arginin ebenfalls die Produktion von Radikalen einschränkt. Daher lindert die Kombination wahrscheinlich die Reperfusionsverletzung im Vergleich zu allein verwendetem Nitroglycerin.
Diese Ergebnisse zeigen die Herstellung eines neuen Medikamentes durch Kombination von Nitroglycerin und L-Arginin im Überschuss, wobei man einen Vorteil aus dem passiven Diffusions-Aufhebemechanismus der Membrantransportpumpe der Endothelzellen als Behandlung für die Nitroglycerin-Resistenz-Toleranz erzielt. Eine solche Formulierung wird beispielsweise angewendet Hypertonie, hypertonischer Herzerkrankung, Koronaerkrankung (Angina, Myokardinfarkt, plötzlichem Tod), kardiovaskulären Erkrankungen (kongestives Herzversagen, Schlaganfall, peripherer Gefäßerkrankung), cerebro-vaskulärer Ischämie (TIA) und renovaskuläre Ischämie.
Eine weitere potentielle Verwendung dieses Komplexes ist die unabhängige Produktion von EDRF wie es hier bei den Rattenaorta- und Hunde-Ergebnissen beobachtet wird, die als Behandlung der Nitroglycerin-Toleranz ohne zusätzliche Toxizität oder Unbequemlichkeit bei der Verabreichung von dem derzeit allein verwendeten Nitroglycerin, sehr wertvoll ist. Das Verabreichungsverfahren bleibt unverändert.
Allerdings scheint das L-Arginin-Nitroglycerin-Gemisch cNOS selektiv zu stimulieren und induziert iNOS nicht. Dies wird durch folgendes unterstützt:

1. Die iNOS-Induktion führt gewöhnlich zu irreversiblem Gefäßkollaps und Tod. Das klassische Beispiel ist endotoxischer Schock. Dies wurden in den vorliegenden Untersuchungen nicht beobachtet.
2. Die iNOS-Induktion geht mit einem positiven Rückkopplungs-Mechanismus zur Steigerung des L-Arginin-Transportes in die iNOS-Endothelzelle einher (Lind, D. S., M. D., 1993, Endotoxin Stimulates Arginine Transport in Pulmonan Artery Endothelial Cells. Surgery; 114; 2; S. 199–205). Das Supplementieren der L-Arginin-Verabreichung beschleunigt daher nur die Tendenz des Gefäßkollapses.
3. Bei Zuständen, in denen die iNOS-Induktion an der Grundlinie nicht zugegen ist, führt die Verabreichung von Nitroglycerin, L-Arginin, allein oder kombiniert, nicht zu einem irreversiblen Gefäßkollaps. Sowohl Nitroglycerin allein als auch die Kombination erzeugt eine dosisabhängige Hypotonie, die beim Unterbrechen der Einwirkung der jeweiligen Medikamente reversibel ist.

Dem vorstehenden Absatz 2 zufolge ist in Zuständen der vorstehend beschriebenen iNOS-Induktion. wahrscheinlich die Entwicklung der Nitroglycerin-Toleranz eine entgegengesetzte Wirkung von Nitroglycerin auf die Membranpumpe, d. h. ein negativer Rückkopplungsmechanismus auf den aktiven L-Arginin-Membrantransport. Dies kann ein Faktor sein, der zur Entwicklung von Toleranz führt.
Dem vorstehenden Absatz 3 zufolge kann die iNOS-Induktion ein gemeinsames Merkmal von sämtlichen vaskulären Schocks, einschließlich hämorrhagischem und kardiogenem Schock, sein. Fortgeschrittene Stufen von kongestivem Herzversagen mit Low-Output-Syndrom (kardiogener Borderline-Schock) kann entsprechend mit einer Cytokin-Produktion (Tumornekrosefaktor) und einer Induktion von iNOS einhergehen. Beim künftigen Einsatz der Verabreichung von L-Arginin in Kombination mit Nitroglycerin in diesen Zuständen sollte man genauso vorsichtig vorgehen wie derzeit bei der Verabreichung von Nitroglycerin allein, wenn die Patienten an der Grundlinie hypotonisch sind.
Eine achtstündige Infusion bei einem normalen Freiwilligen wurde durchgeführt mit einem weiten Bereich von Nitroglycerin-Konzentrationen von 12,5 mg/250 ml Gesamtvolumen bis 100 mg/250 ml Gesamtvolumen 10% L-Arginin, und es wurde bedeutenderweise das Fehlen von Tachykardie gefunden, die zuvor bei nur L-Arginin oder Nitroglycerin beschrieben wurde. Bei der 2½fachen derzeit zugelassenen Dosierungen der L-Arginin-Einwirkung (75 g insgesamt) gab es zudem keinen Beweis für die metabolische Azidose von HCl, das in der derzeitig zugelassenen L-Arginin-Formulierung vorhanden ist. Diese Untersuchung ist nachstehend zusammengefasst.
Beispiel 2
Die folgende Untersuchung ist eine Dosisbereichsstudie an gesunden freiwilligen Personen für intravenöses Nitroglycerin mit L-Arginin. Die Aufgabe dieser Studie ist die Untersuchung der kombinierten Verabreichung von intravenösem Nitroglycerin mit 10% L-Arginin (wässrig) für Folgendes:

1. Reflex-Tachykardie (Barorezeptor-Reflexaktivierung.
2. Hypotonie-Aktivität (therapeutische Wirkung).
3. metabolische Störungen-Metabolische Azidose.
4. elektrokardiographische Anomalien bei verlängerter Infusion.

Der in dieser Dosisbereichsstudie untersuchte Patient war ein 47 Jahre alter Mann mit normalem Blutdruck ohne vorherige Krankheitsgeschichte oder ohne Krankenhausaufenthalt und ohne chronische Medikamenteneinnahme.
Die in dieser Studie verwendeten Materialien bestanden aus den folgenden:

1. Tridil-Marke von intravenösem Nitroglycerin (5 mg pro cm³)
2. 10% L-Arginin i wasser (R-Gene^TM-KABI).
3. Normale Salzlösung.
4. 5 × 150 cm³ vakuumversiegelte sterile Flaschen.
5. Zwei Ivac-Pumpen mit einem 3-Wegehahn für alternative Infusionen von Medikament und Salzlösung.
6. Ein Propac-Herzmonitor.
7. Ein Spacelabs 2000 24 Std-Blutdruck-Monitor.
8. Ein Cardionostics Dural Lite Model #2011 Holter-Rekorder.

Die Patientenpräparation bestand aus der Vorbehandlung mit 40 mg Pepcid (Famotidin-Merck) und 50 mg Benadryl in der Nacht davor. 50 mg Benadryl wurden am Morgen der Untersuchung wiederholt gegeben. Dies erfolgte zur Blockierung von H₁- und H₂-Rezeptoren aus einer möglichen Aktivierung durch L-Arginin.
Am Morgen der Untersuchung wurde ein Grundlinien-EKG zusammen mit Serum-Chemien und vollständiger Blutzahl (CBC) erstellt. Danach wurde der 24 Std. Holter-Monitor, der ambulatorische Blutdruckmonitor, und Propac befestigt. Der Blutdruckmonitor wurde gegen den Propac kalibriert, und es wurde eine Diskrepanz von etwa 20 mm Hg systolischer und 10 mm Hg diastolischer Blutdruck im linken gegenüber dem rechten Arm beobachtet. Anschließend wurde eine IV im linken Fuß in der linken Saphena-Vene mit einem 18 Gauge Angiocath-Verweilkatheter etabliert. Eine anfängliche Erhaltungsinfusion mit Salzlösung wurde bei KVO-(Vene wird offen gelassen)-Rate begonnen. Danach wurden sechs schnelle Dosisreaktionstitrationen über die nachfolgenden 8 Std. durchgeführt, und diese sind in der 4 gezeigt mit ¼ (Flasche #1), ½ (Flasche #2) und Nitroglycerin voller Stärke in 10% L-Arginin (Flasche #3). Danach folgte eine Nitroglycerininfusion voller Stärke in Wasser ohne L-Arginin (Flasche #4). Anschließend wurde eine Infusion von reinem 10% L-Arginin ohne Nitroglycerin in 10% L-Arginin (Flasche #5) verabreicht. Zuletzt wurde eine Infusion, bestehend aus der doppelten Stärke Nitroglycerin in 10% Arginin (Flasche #6) verabreicht. Nitroglycerin voller Stärke wurde definiert als 50 mg Nitroglycerin in einem Gesamtvolumen von 250 cm³ L-Arginin 10% in Wasser oder Wasser allein (Flasche #4).
Mit jeder Infusion betrug die Anfangsrate 25 cm³ pro Std. Danach wurde die Infusion auf 50 cm³ verdoppelt. Dies wurde alle 5 bis 10 min um 50 cm³ pro Std. erhöht, bis eine Gesamtinfusionerate von 300 cm³ pro Std. erzielt wurde. Während dieser Infusionen wurden die Blutdruck- und Herzraten-Daten alle 2 min durch Propac vor der Erhöhung der Infusionsrate wie oben beschrieben aufgezeichnet. Während des Austausches der Flaschen wurde die Infusion in normale Salzlösung bei 100 ml pro Std. umgeändert. Zu Beginn jeder Infusion wurde ein etwa 100 ml "Totraum" aus dem über der vorherigen Flasche verbleibenden Infusat eliminiert, indem die ersten 100 ml bei einer "weit offenen" Rate liefen. Dann wurde die 25 ml-Abfolge wie bereits vorher beschrieben reinitialisiert.
Nach der letzten Infusion wurden die Serumchemien, CBC und EKG wiederholt.
Für jede Infusion wurde der systolische und diastolische Blutdruck am rechten Arm gemittelt. Die Herzrate wurde entsprechend gemittelt. Diese Durchschnittswerte wurden erhalten, indem jeder einzelne Messwert alle zwei Min abgelesen wurde, diese summiert wurden und die Zeitspanne, in der die Infusion erfolgte (Messungen zwischen den Infusionen während der Flaschenwechsel nicht enthalten), dividiert wurde.
Die Ergebnisse sind in der 4 zusammengefasst. In 4 bedeutet SBP systolischer Blutdruck, DBP bedeutet diastolischer Blutdruck, und HR bedeutet Herzrate. Es scheint überhaupt kein Beweis für eine Reflex-Tachykardie bei dem in 4 verwendeten Verhältnis von Nitroglycerin zu L-Arginin vorzuliegen. Es gab eine dosisabhängige Blutdruckreduktion zusammen mit einem Trend zur Abhängigkeit von der Nitroglycerin-Konzentration. Es gab keinen Beweis für eine metabolische Azidose, die sich sekundär auf L-Arginin entwickelte, das über einen längeren Zeitraum in einer Gesamtdosis von 75 g, verabreicht über 8 Std., infundiert wurde. Es gab keinen Beweis für eine Arrhythmie. Es gab keinen Beweis für elektrokardiographische Anomalien. Dies zeigt eindeutig, dass die Verabreichung von kombiniertem L-Arginin/Nitroglycerin keine nachteiligen Konsequenzen hat, die entweder mit allein verabreichtem L-Arginin oder Nitroglycerin beobachtet werden.
Die vorstehende Beschreibung der Erfindung veranschaulicht die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die derzeit von deren Erfinder in Erwägung gezogen werden. Es sollte jedoch eindeutig sein, dass die vorhergehende Beschreibung nicht als Einschränkung aufgefasst werden sollte, wobei es verschiedene äquivalente Systeme und Wege zur Durchführung der Erfindung gibt. Man geht davon aus, dass das L-Arginin von kommerziell erhältlichen Produkten, wie R-Gene^TM oder einer beliebigen anderen Quelle für L-Arginin von pharmazeutischer Qualität hergeleitet ist, und das Nitroglycerin kann von einer Vielzahl von Abgabesystemen des Standes der Technik für Nitroglycerin allein erhalten werden, beispielsweise Lingual-Aerosole, wie Nitrolingual^TM-Spray (0,4 mg/Messdosis von Poulenc Rorer); transdermale Systeme wie Minitran^TM (0,6 mg/Std.); topische Salben, wie Nitro-Bid^TM-Salbe (2% von Marion Merrell Dow), sowie eine Tabletten- und Pflasterform (derzeit mit einem kommerziellen Pflasterprodukt von DuPont, das als Tridil^TM bezeichnet wird). Diese Liste ist nicht allumfassend, sondern soll lediglich eine Vielzahl von Nitroglycerin-Abgabesystemen veranschaulichen, die sich leicht in ein Abgabesystem für die Kombination von L-Arginin und Nitroglycerin umwandeln lassen. Dies ist jeweils für kompatible Systeme zur gleichzeitigen Abgabe von Nitroglycerin und L-Arginin erforderlich.

Claims

Therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Vorsorge und Behandlung einer Krankheit eines Individuums durch Gefäßdilatation oder Gefäßrelaxation, umfassend einen Venendilatator gemischt mit einem Arteriendilatator.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die in einer Form vorliegt, geeignet für eine intravenöse, buccale, intrakoronare, intramuskuläre, topische, intranasale, rektale, sublinguale, orale, subkutane oder durch ein Pflaster erfolgende Verabreichung.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Arteriendilatator L-Argenin ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das L-Argenin als Salz der Salzsäure vorliegt.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Krankheit ist Hypertonie, hypertonische Herzerkrankung, Koronarherzerkrankung, kardiovaskuläre Erkrankung, cerebro-vaskuläre Erkrankung und renovaskuläre Ischemie.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Venendilatator eine exogene Stickoxidquelle ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die exogene Stickoxidquelle Nitroglycerin ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die exogene Stickoxidquelle ausgewählt ist aus der Gruppe Natriumnitroprussid, Nitratester, Isoamylnitrit, SIN-1, Cystein, Dithiothreitol, N-Acetylcystein, Mercaptobernsteinsäure, Thiosalicylsäure und Methylthiosalicylsäure.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des L-Arginins in der Zusammensetzung 7,5 bis 30% w/v (g/ml) ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des L-Arginins in der Zusammensetzung 10 bis 15% w/v (g/ml) ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des L-Arginins in der Zusammensetzung 10% w/v (g/ml) ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Menge an Nitroglycerin in der Zusammensetzung ausreicht für eine Dosis im Bereich von 0,2 μg/kg/Minute bis 5 μg/kg/Minute.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Menge an Nitroglycerin in der Zusammensetzung ausreicht für eine Dosis im Bereich von 0,5 μg/kg/Minute bis 5 μg/kg/Minute.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Menge an Nitroglycerin in der Zusammensetzung ausreicht für eine Dosis im Bereich von 0,75 μg/kg/Minute bis 2 μg/kg/Minute.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Menge an Nitroglycerin in der Zusammensetzung ausreicht für 1 μg/kg/Minute ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung auf 6 bis 8,0 eingestellt ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung auf 7 bis 7,4 eingestellt ist.
Therapeutisches Gemisch, umfassend ein Gemisch aus L-Arginin und einem Agonisten der Stickoxidsynthase.
Therapeutisches Gemisch nach Anspruch 18, wobei der Agonist Nitroglycerin ist.
Therapeutisches Gemisch nach Anspruch 18, wobei der Agonist weiterhin besteht aus einem Rezeptor vermittelten Agonisten, ausgewählt aus der Gruppe Acetylcholin, Substanz P, Histamin, Argininvasopressin, Bradykinin, Adenosintriphosphat, Prostaglandin F2a, Oxytocin, Endothelium-B und Calciumionophor A23187.