DE69534389T2 - Mit PNA- und Amidat-Etiketten bestückte Festphasenträger - Google Patents

Mit PNA- und Amidat-Etiketten bestückte Festphasenträger Download PDF

Info

Publication number
DE69534389T2
DE69534389T2 DE69534389T DE69534389T DE69534389T2 DE 69534389 T2 DE69534389 T2 DE 69534389T2 DE 69534389 T DE69534389 T DE 69534389T DE 69534389 T DE69534389 T DE 69534389T DE 69534389 T2 DE69534389 T2 DE 69534389T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
oligonucleotide
microparticles
solid phase
nucleotides
polynucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69534389T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69534389D1 (de
Inventor
Sydney Brenner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Solexa Inc
Original Assignee
Solexa Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Solexa Inc filed Critical Solexa Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69534389D1 publication Critical patent/DE69534389D1/de
Publication of DE69534389T2 publication Critical patent/DE69534389T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B80/00—Linkers or spacers specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. traceless linkers or safety-catch linkers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/005—Beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00646—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports
    • B01J2219/00648—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports by the use of solid beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B20/00—Methods specially adapted for identifying library members
    • C40B20/04—Identifying library members by means of a tag, label, or other readable or detectable entity associated with the library members, e.g. decoding processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen zur Sequenzierung von Polynucleotiden und insbesondere Zusammensetzungen und Kits zur gleichzeitigen Sortierung und Sequenzierung vieler Polynucleotide.
  • Hintergrund
  • Gegenwärtig gibt es zwei elementare Ansätze zur DNA-Sequenzbestimmung: das Kettenterminationsverfahren, z.B. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5463–5467; und das chemische Abbauverfahren, z.B. Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 560–564. Das Kettenterminationsverfahren wurde seit seiner Erfindung auf vielfältige Weise verbessert und dient als Grundlage für alle gegenwärtig zur Verfügung stehenden automatischen DNA-Sequenzierungsvorrichtungen, z.B. Sanger et al., J. Mol. Biol. 143 (1980), 161–178; Schreier et al., J. Mol. Biol. 129 (1979), 169–172; Smith et al., Nature 321 (1987), 674–679; Prober et al., Science 238 (1987), 336–341; Hunkapiller et al., Science 254 (1991), 59–67; Bevan et al., PCR-Methods and Applications 1 (1992), 222–228. Außerdem werden ohne Frage weitere Verbesserungen für möglich gehalten, die den Durchsatz und die Effizienz des Ansatzes erheblich steigern würden, z.B. Huang et al., Anal. Chem. 64 (1992), 2149–2154 (kapillare Anordnungen); Best et al., Anal. Chem. 66 (1994), 4063–4067 (nicht-vernetzte polymere Trennmedien für Kapillaren); bessere Farbstoffzusammenstellungen etc..
  • Nichtsdestoweniger, auch bei solchen vernünftigerweise für möglich gehaltenen Verbesserungen, weisen diese Ansätze mehrere damit verbundene technische Probleme auf, die sie sowohl kostenaufwendig als auch zeitraubend machen, insbesondere wenn sie bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab angewendet werden. Solche Probleme schließen i) den gelelektrophoretischen Trennungsschritt, der arbeitsintensiv ist, schwer zu automatisieren ist und der einen zusätzlichen Grad an Variabilität in die Analyse von Daten einbringt, z.B. Bandenverbreiterung infolge von Temperatureinflüssen, Komprimierungen auf Grund der Sekundärstruktur in den DNA-Sequenzierungsfragmenten, Inhomogenitäten im Trenngel etc.; ii) Nucleinsäurepolymerasen, deren Eigenschaften, wie Prozessivität, Genauigkeit, Polymerisierungsrate, Einbaurate von Kettenterminatoren etc., oft sequenzabhängig sind; iii) den Nachweis und die Analyse von DNA-Sequenzierungsfragmenten, die üblicherweise in fmol-Mengen in räumlich überlappenden Banden in einem Gel vorliegen; iv) schwächere Signale, da die Markierungseinheit über die vielen Hundert räumlich getrennten Banden verteilt, anstatt in einer einzigen homogenen Phase konzentriert ist; v) im Falle eines Eine-Bahn-Fluoreszenznachweises die Verfügbarkeit von Farbstoffen mit geeigneten Emissions- und Absorptionseigenschaften, Quantenausbeute und spektrale Auflösbarkeit; und vi) die Notwendigkeit für eine getrennt hergestellte Sequenzierungsmatrize für jede Sequenzierungsreaktion, um maximal etwa 400–600 Basen zu identifizieren, ein, z.B. Trainor, Anal. Biochem. 62 (1990), 418–426; Conell et al., Biotechniques 5 (1987), 342–348; Karger et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 4955–4962; Fung et al., US-Patent 4,855,225; Nishikawa et al., Electrophoresis 12 (1991), 623–631; und Hunkapiller et al. (a.a.O.).
  • Die Notwendigkeit für die getrennte Herstellung von Sequenzierungsmatrizen ist insbesondere bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab lästig, z.B. Hunkapiller et al. (a.a.O.) (94,4 Kilobasen-Zielmolekül-2399 Matrizen); und Alderton et al., Anal. Biochem. 201 (1992), 166–169 (230 Kilobasen-Zielmolekül-13.000 Matrizen). Versuche, die Matrizenherstellung zu automatisieren, haben sich als schwierig erwiesen, insbesondere in Verbindung mit gegenwärtigen Sequenzierungsmethoden, z.B. Church et al., Science 240 (1988), 185–188; Beck et al., Anal. Biochem. 212 (1993), 498–505; Wilson et al., Biotechniques 6 (1988), 776–787; etc..
  • Im Hinblick auf das Vorstehende würde ein bedeutender Fortschritt in der Sequenzierungstechnik erfolgen, wenn Mittel zur Verfügung stehen würden, die den Engpaß bei der Matrizenherstellung überwinden. Insbesondere würde die Möglichkeit, viele Tausende von Matrizen gleichzeitig ohne einzelne Matrizenselektion und -behandlung herzustellen, zu signifikanten Steigerungen in Bezug auf den Sequenzierungsdurchsatz und zu einer wesentlichen Senkung der Sequenzierungskosten führen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Ziel der Erfindung ist, Kits und eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Analysieren und/oder Sequenzieren von vielen Tausend verschiedenen Polynucleotiden bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren, Kits und eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Analysieren und/oder Sequenzieren von vielen Tausend verschiedenen Polynucleotiden bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur erheblichen Reduzierung der bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab erforderlichen Anzahl von getrennten Matrizenherstellungsschritten.
  • Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur gleichzeitigen Anwendung von Eine-Base-Sequenzierungs-Methoden (single Base sequencing methodologies) auf viele verschiedene Ziel-Polynucleotide.
  • Die Erfindung erreicht dieses Ziel durch die Bereitstellung von Materialien zum Sortieren von Polynucleotiden mit Oligonucleotid-Markierungen. Erfindungsgemäße Oligonucleotid-Markierungen sind in der Lage, mit komplementären oligomeren Verbindungen zu hybridisieren, die aus Untereinheiten mit höherer Bindungsstärke und -Spezifität bestehen, verglichen mit natürlichen Oligonucleotiden. Solche komplementären oligomeren Verbindungen werden hier als "Markierungskomplemente" bezeichnet. Untereinheiten von Markierungskomplementen können aus Monomeren von nicht-natürlichen Nucleotidanalogen bestehen, die hier als "Antisense-Monomere" bezeichnet werden, oder sie können Oligomere mit Längen im Bereich von 3 bis 6 Nucleotiden oder Analoge davon einschließlich Antisense-Monomere umfassen, wobei die Oligomere ausgewählt sind aus einem minimal kreuzhybridisierenden Satz. In einem solchen Satz enthält ein Doppelstrang, der aus einem Oligomer des Satzes und dem Komplement eines anderen Oligomeren des Satzes besteht, mindestens zwei Fehlpaarungen. Anders ausgedrückt bildet ein Oligomer eines minimal kreuzhybridisierenden Satzes bestenfalls einen Doppelstrang mit mindestens zwei Fehlpaarungen mit dem Komplement eines anderen Oligomeren des gleichen Satzes. Die in einer bestimmten Ausführungsform verfügbare Zahl von Oligonucleotid-Markierungen hängt von der Anzahl der Untereinheiten pro Markierung und von der Länge der Untereinheit ab, wenn die Untereinheit ein Oligomer aus einem minimal kreuzhybridisierenden Satz ist. Im letzteren Fall ist die Anzahl im Allgemeinen viel kleiner als die Zahl aller möglichen Sequenzen der Länge der Markierung, die für eine n Nucleotide lange Markierung 4n wäre. Bevorzugte Antisense-Monomere schließen Peptidnucleinsäuremonomere und Nucleosidphosphoramidate mit einer 3'-NHP(O)(O-)O-5'-Bindung mit ihrem benachbarten Nucleosid ein. Die letzteren Verbindungen werden hier als 3'N→5'P-Phosphoramidate bezeichnet.
  • Unter einem Gesichtspunkt der Erfindung werden an einen Festphasenträger gebundene Markierungskomplemente verwendet, um Polynucleotide, die jeweils eine Markierung enthalten, aus einem Gemisch von Polynucleotiden zu sortieren. In dieser Ausführungsform werden Markierungskomplemente auf der Oberfläche eines Festphasenträgers, wie ein mikroskopisch kleines Kügelchen, oder einer spezifischen Stelle in einer Anordnung von Synthesestellen auf einem einzigen Träger, so daß Populationen von identischen Sequenzen in spezifischen Regionen erzeugt werden, synthetisiert. Das heißt, die Oberfläche jedes Trägers, im Fall eines Kügelchens, oder jeder Region, im Fall einer Anordnung, wird nur durch einen Markierungskomplement-Typ derivatisiert, der eine bestimmte Sequenz aufweist. Die Population solcher Kügelchen oder Regionen enthält einen Vorrat an Markierungskomplementen mit verschiedenen Sequenzen, wobei die Größe des Vorrats von der Zahl der Untereinheiten pro Oligonucleotid-Markierung und der Länge der verwendeten Untereinheiten abhängt, wenn oligomere Untereinheiten verwendet werden. In ähnlicher Weise umfassen die zu sortierenden Polynucleotide jeweils eine Oligonucleotid-Markierung in dem Vorrat, so daß identische Polynucleotide die gleiche Markierung und unterschiedliche Polynucleotide verschiedene Markierungen aufweisen. Wie nachstehend ausführlicher erläutert, wird diese Bedingung durch Auswählen einer hinreichend kleinen Probe von markierten Polynucleotiden aus der gesamten Zusammenstellung der markierten Polynucleotide erreicht. Folglich, wenn die Populationen von Trägern und Polynucleotiden unter Bedingungen gemischt werden, die die spezifische Hybridisierung der Oligonucleotid-Markierungen mit ihren jeweiligen Komplementen zulassen, werden Subpopulationen von identischen Polynucleotiden auf bestimmten Kügelchen oder in bestimmten Regionen sortiert. Die Subpopulationen von Polynucleotiden können dann auf dem Festphasenträger durch mikrobiochemische Verfahren manipuliert werden.
  • Ein wichtiger Gesichtspunkt der Erfindung ist die Verwendung der Oligonucleotid-Markierungen, um Polynucleotide zur parallelen Sequenzbestimmung zu sortieren. Vorzugsweise umfaßt dieser erfindungsgemäße Gesichtspunkt die folgenden Schritte: (a) Erzeugen einer Vielfalt von Fragmenten aus einem Ziel-Polynucleotid, die das Ziel-Polynucleotid abdecken; (b) Anbringen einer Oligonucleotid-Markierung aus einem Vorrat an Markierungen an jedes Fragment der Fragmentvielfalt, (i) so daß im Wesentlichen alle gleichen Fragmente die gleiche Oligonucleotid-Markierung gebunden haben, und (ii) so daß jede Oligonucleotid-Markierung aus dem Vorrat eine Vielzahl von Untereinheiten umfaßt und jede Untereinheit der Untereinheitenvielfalt aus einem komplementären Nucleotid eines Antisense-Monomeren oder eines Oligonucleotids mit einer Länge von drei bis sechs Nucleotiden besteht, wobei die Oligonucleotide ausgewählt sind aus einer minimal kreuzhybridisierenden Gruppe; (c) Sortieren der Fragmente durch spezifisches Hybridisieren der Oligonucleotid-Markierungen mit ihren jeweiligen Markierungskomplementen; (d) Bestimmung der Nucleotidsequenz eines Teils von jedem Fragment der Fragmentvielfalt; und (e) Bestimmung der Nucleotidsequenz des Ziel-Polynucleotids durch Zuordnen der Sequenzen der Fragmente.
  • Bei der Verwendung in Kombination mit Festphasenträgern, wie mikroskopisch kleinen Kügelchen, stellt die Erfindung ein leicht zu automatisierendes System zum Manipulieren und Sortieren von Polynucleotiden bereit, das bei parallelen Verfahren im großen Maßstab, wie der DNA-Sequenzierung im großen Maßstab, dem mRNA-Fingerprinting etc., wo viele Ziel-Polynucleotide oder viele Segmente eines einzigen Ziel-Polynucleotids gleichzeitig sequenziert und/oder analysiert werden, besonders nützlich ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1a–1c veranschaulichen Strukturen von markierten Sonden, die in einer bevorzugten Methode der "Eine-Base"-Sequenzierung verwendet werden, die erfindungsgemäß angewendet werden kann.
  • 2 veranschaulicht die relativen Positionen der Nuclease-Erkennungsstelle, Ligierungsstelle und Spaltstelle in einem ligierten Komplex, der zwischen einem Ziel-Polynucleotid und einer bei einer bevorzugten "Eine-Base"-Sequenzierungs-Methode verwendeten Sonde gebildet wird.
  • 3 zeigt ein Flußdiagramm, das einen allgemeinen Algorithmus zur Erzeugung von minimal kreuzhybridisierenden Sätzen veranschaulicht.
  • 4 veranschaulicht ein Schema zur Synthese von Oligonucleotid-3'N→5'P-Phosphoramidaten.
  • 5 veranschaulicht schematisch eine Vorrichtung zur Ausführung von parallelen Verfahren, wie der Polynucleotid-Sequenzierung, gemäß der Erfindung.
  • Definitionen
  • "Komplement" oder "Markierungskomplement", so wie hier in Bezug auf Oligonucleotid-Markierungen verwendet, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, mit dem eine Oligo nucleotid-Markierung spezifisch hybridisiert, um einen perfekt passenden Doppelstrang oder Dreifachstrang zu bilden. In Ausführungsformen, wo die spezifische Hybridisierung einen Dreifachstrang ergibt, kann die Oligonucleotid-Markierung so gewählt sein, daß sie entweder doppelsträngig oder einzelsträngig ist. Folglich, wenn Dreifachstränge gebildet werden, soll der Begriff "Komplement" entweder ein doppelsträngiges Komplement einer einzelsträngigen Oligonucleotid-Markierung oder ein einzelsträngiges Komplement einer doppelsträngigen Oligonucleotid-Markierung einschließen.
  • Der hier verwendete Begriff "Oligonucleotid" schließt lineare Oligomere von natürlichen oder modifizierten Monomeren oder Verbindungen ein, einschließlich Desoxyribonucleoside, Ribonucleoside, α-anomere Formen davon, Peptidnucleinsäuren (PNAs) etc., die in der Lage sind, spezifisch an ein Ziel-Polynucleotid durch ein regelmäßiges Muster von Monomer-Monomer-Wechselwirkungen zu binden, wie die Basenpaarung vom Watson-Crick-Typ, Basenstapelung, Basenpaarungen vom Hoogsteen- oder reversen Hoogsteen-Typ oder ähnliche. Üblicherweise sind Monomere durch Phosphodiesterbindungen oder Analoge davon verknüpft, um Oligonucleotide mit einer Größe im Bereich von wenigen Monomereinheiten, z.B. 3–4, bis mehrere Dutzend Monomereinheiten zu bilden. Immer wenn ein Oligonucleotid durch eine Sequenz von Buchstaben, wie "ATGCCTG", dargestellt wird, ist selbstverständlich, daß die Nucleotide in 5'→3'-Richtung von links nach rechts angegeben sind und daß "A" Desoxyadenosin bedeutet, "C" Desoxycytidin bedeutet, "G" Desoxyguanosin bedeutet und "T" Thymidin bedeutet, wenn nicht anders angegeben. Analoge von Phosphodiesterbindungen schließen Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat etc. ein. Für den Fachmann ist erkennbar, daß, wenn Oligonucleotide mit natürlichen oder nicht-natürlichen Nucleotiden verwendet werden können, z.B. wenn eine Prozessierung durch Enzyme notwendig ist, üblicherweise aus natürlichen Nucleotiden bestehende Oligonucleotide erforderlich sind.
  • "Perfekt passend" in Bezug auf einen Doppelstrang bedeutet, daß die den Doppelstrang ausmachenden Poly- oder Oligonucleotidstränge eine doppelsträngige Struktur miteinander bilden, so daß jedes Nucleotid in jedem Strang eine Watson-Crick-Basenpaarung mit einem Nucleotid in dem anderen Strang eingeht. Der Begriff schließt auch die Paarung von Nucleosidanalogen, wie Desoxyinosin, Nucleotiden mit 2-Aminopurinbasen etc. ein, die verwendet werden können. In Bezug auf einen Dreifachstrang bedeutet der Begriff, daß der Dreifachstrang aus einem perfekt passenden Doppelstrang und einem dritten Strang besteht, worin jedes Nucleotid eine Hoogsten- oder reverse Hoogsten-Bindung mit einem Basenpaar des perfekt passenden Doppelstrangs eingeht. Umgekehrt bedeutet eine „Fehlpaarung" in einem Doppelstrang zwischen einer Markierung und einem Oligonucleotid, daß ein Paar oder Triplett von Nucleotiden in dem Doppel- oder Dreifachstrang keine Watson-Crick- und/oder Hoogsteen- und/oder reverse Hoogsteen-Bindung eingeht.
  • Wie hier verwendet, schließt "Nucleosid" die natürlichen Nucleoside einschließlich 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen ein, z.B. wie bei Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflage (Freeman, San Francisco, 1992) beschrieben. "Analoge" in Bezug auf Nucleoside schließen synthetische Nucleoside mit modifizierten Baseneinheiten und/oder modifizierten Zuckereinheiten ein, z.B. beschrieben von Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980); Uhlman und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990), 543–584 oder ähnlichen, mit der einzigen Maßgabe, daß sie zur spezifischen Hybridisierung in der Lage sind. Solche Analoge schließen synthetische Nucleoside ein, die entworfen wurden, um die Bindungseigenschaften zu verbessern, die Degeneration zu verringern, die Spezifität zu erhöhen etc..
  • "Stabil" in Bezug auf die Bildung einer kovalenten Bindung und/oder eines nichtkovalenten Komplexes zwischen Verknüpfungseinheiten bedeutet, daß die Schmelztemperatur der Oligonucleotid-Klammer, die das (die) bestimmte(n) Paar(e) von Bindungseinheiten und deren Ziel-Polynucleotid einschließt, mindestens 25 Prozent über der Schmelztemperatur von Oligonucleotid-Einheiten der Klammer allein erhöht ist, wobei die Schmelztemperatur durch Standardverfahren gemessen wird, z.B. das halbe Maximum der 260 nm-Absorption im Vergleich zur Temperatur, wie nachstehend ausführlicher beschrieben. Vorzugsweise bedeutet stabil, daß die Schmelztemperatur der Oligonucleotid-Klammer, die das (die) bestimmte(n) Paar(e) von Bindungseinheiten und deren Ziel-Polynucleotid einschließt, mindestens 50 Prozent über der Schmelztemperatur der Oligonucleotid-Einheiten der Klammer allein erhöht ist.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt Zusammensetzungen zum Sortieren von Molekülen, insbesondere Polynucleotiden, durch die Verwendung von Oligonucleotid-Markierungen bereit. Gemäß einem Gesichtspunkt umfassen die erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Markierungen eine Vielzahl von "Wörtern" oder Untereinheiten, die ausgewählt sind aus minimal kreuzhybridisierenden Sätzen von Untereinheiten. Untereinheiten solcher Sätzen können keinen Doppelstrang oder Dreifachstrang mit dem Komplement einer anderen Untereinheit des gleichen Satzes mit weniger als zwei falsch gepaarten Nucleotiden bilden. Folglich sind sich die Sequenzen von zwei beliebigen Oligonucleotid-Markierungen eines Vorrats, die Doppelstränge bilden, niemals „näher" als durch den Unterschied von zwei Nucleotiden. In bestimmten Ausführungsformen können sich die Sequenzen von zwei beliebigen Oligonucleotid-Markierungen eines Vorrats auch "weiter" unterscheiden, z.B. durch Konstruktion eines minimal kreuzhybridisierenden Satzes, so daß die Untereinheiten keinen Doppelstrang mit dem Komplement einer anderen Untereinheit des gleichen Satzes mit weniger als drei falsch gepaarten Nucleotiden bilden können, usw. Üblicherweise sind erfindungsgemäße Oligonucleotid-Markierungen und ihre Komplemente Oligomere der natürlichen Nucleotide, so daß sie in einfacher Weise durch Enzyme, wie Ligasen, Polymerase, terminale Transferasen etc., prozessiert werden können.
  • Gemäß einem anderen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt bestehen die Markierungskomplemente aus Monomeren, die hier als "Antisense"-Monomere bezeichnet werden. Dieser Begriff soll einen Bereich von Verbindungen einschließen, die üblicherweise für Antisense-Therapeutika entwickelt wurden, die eine größere Bindungsstärke und erhöhte Spezifität für Polynucleotid-Zielmoleküle aufweisen. Wie vorstehend unter der Definition von "Oligonucleotid" erwähnt, können die Verbindungen eine Vielzahl von unterschiedlichen Modifikationen der natürlichen Nucleotide einschließen, z.B. die Modifikation von Baseneinheiten, Zuckereinheiten und/oder Monomer-Monomer-Bindungen. Solche Verbindungen schließen auch Oligonucleotid-Schleifen, Oligonucleotid-"Klammern" und ähnliche Strukturen ein, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, die eine stärkere Bindung und eine erhöhte Spezifität fördern. Vorzugsweise bezeichnet der Begriff "Antisense-Monomer", so wie er hier verwendet wird, jegliches Monomer, das ein lineares Oligomer bilden kann, das (i) spezifisch an ein Ziel-Polynucleotid durch ein regelmäßiges Muster von Monomer-Monomer-Wechselwirkungen binden kann, (ii) eine mindestens 25 Prozent höhere Bindungsspezifität als die eines äquivalenten Oligomeren von natürlichen Nucleotiden aufweist, und (iii) eine Stabilität oder Bindungsenergie aufweist, die gleich oder größer als die eines äquivalenten Oligomeren von natürlichen Nucleotiden ist, z.B. wie sie durch die Schmelztemperatur eines Doppelstrangs eines Oligomeren von Antisense-Monomeren und eines komplementären Oligomeren von natürlichen Nucleotiden gemessen wird. Die "Bindungsspezifität" kann auf vielfältige Weise gemessen werden; vorzugsweise wird sie durch den Unterschied hinsichtlich der Bin dungsenergie zwischen einem perfekt passenden Doppelstrang und einem eine einzige Fehlpaarung enthaltenden Doppelstrang gemessen. Geeigneterweise kann die Schmelztemperatur als eine Maßeinheit der Bindungsenergie verwendet werden. Zweifelslos könnte die verwendete Maßeinheit der Spezifität ein Durchschnittswert der Schmelztemperaturunterschiede aller möglichen Fehlpaarungen des Test-Oligomeren sein, sie könnte ein Minimalwert oder Höchstwert oder eine ähnliche Funktion der Schmelztemperaturunterschiede sein. Vorzugsweise ist der minimale Schmelztemperaturunterschied zwischen einem perfekt passenden Doppelstrang eines Oligomeren von Antisense-Monomeren und seinem Komplement und einem Doppelstrang des gleichen Oligomeren von Antisense-Monomeren und einem Komplement mit einer einzigen Fehlpaarung mindestens 25 Prozent größer als der äquivalente Schmelztemperaturunterschied zwischen Doppelsträngen eines Oligomeren von natürlichen Nucleotiden und seinen perfekt passenden und eine falsch gepaarte Base aufweisenden Komplementen.
  • Durch die Verwendung solcher Verbindungen findet die Erfindung insbesondere Anwendung beim Markieren und Sortieren von Polynucleotiden für parallele Verfahren, wie Sequenzierung, Fingerprinting oder andere Analysearten.
  • Konstruktion von Oligonucleotid-Markierungen aus minimal kreuzhybridisierenden Gruppen von Untereinheiten.
  • Die Nucleotidsequenzen der Untereinheiten für jeglichen minimal kreuzhybridisierenden Satz werden geeigneterweise spezifiziert durch einfache Computerprogramme gemäß dem in 3 veranschaulichten allgemeinen Algorithmus und wie durch das Programm Minhx beispielhaft gezeigt ist, dessen Quellcode in Anhang I aufgeführt ist. Minhx berechnet alle minimal kreuzhybridisierenden Sätze mit Untereinheiten, die aus drei Arten von Nucleotiden bestehen und eine Länge von vier Nucleotiden aufweisen.
  • Der Algorithmus von 3 wird umgesetzt, indem zuerst die Eigenschaften der Untereinheiten des minimal kreuzhybridisierenden Satzes definiert werden, d.h. Länge, Zahl der Basenunterschiede zwischen den Vertretern und Zusammensetzung, z.B. bestehen sie aus zwei, drei oder vier Arten von Basen. Eine Tabelle Mn, n = 1, wird erzeugt (100), die aus allen möglichen Sequenzen einer bestimmten Länge und Zusammensetzung besteht. Eine erste Untereinheit S1 wird ausgewählt und mit aufeinanderfolgenden Untereinheiten Si für i = n + 1 bis zum Ende der Tabelle verglichen (120). Immer wenn eine aufeinanderfolgende Unterein heit die erforderliche Zahl von Fehlpaarungen aufweist, um ein Vertreter des minimal kreuzhybridisierenden Satzes zu sein, wird sie in einer neuen Tabelle Mn+1 (125) gespeichert, die auch Untereinheiten enthält, die bereits in vorherigen Durchgängen bis Schritt 120 ausgewählt wurden. Zum Beispiel enthält M2 in dem ersten Satz von Vergleichen S1; enthält M3 in dem zweiten Satz von Vergleichen S1 und S2; und enthält M4 in dem dritten Satz von Vergleichen S1, S2 und S3; usw. In ähnlicher Weise finden die Vergleiche in Tabelle Mj zwischen Sj und allen aufeinanderfolgenden Untereinheiten in Mj statt. Beachte, daß jede aufeinanderfolgende Tabelle Mn+1 kleiner ist als ihre Vorgänger, da Untereinheiten in aufeinanderfolgenden Durchgängen bis Schritt 130 ausgeschlossen werden. Nachdem jede Untereinheit von Tabelle Mn verglichen wurde (140), wird die alte Tabelle durch die neue Tabelle Mn+1 ersetzt und die nächste Runde von Vergleichen wird begonnen. Das Verfahren endet (160), wenn eine Tabelle Mn erreicht wird, die keine aufeinanderfolgenden Untereinheiten enthält, die mit der ausgewählten Untereinheit Si verglichen werden sollen, d.h. Mn = Mn+1
  • Wie vorstehend erwähnt, umfassen bevorzugte minimal kreuzhybridisierende Sätze Untereinheiten, die annähernd äquivalente Beiträge zur Doppelstrangstabilität wie jede andere Untereinheit in dem Satz liefert. Informationen zur Auswahl solcher Sätze werden durch veröffentlichte Verfahren zur Selektion optimaler PCR-Primer und Berechnung von Doppelstrangstabilitäten bereitgestellt, z.B. Rychlik et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 8543–8551 und 18 (1990), 6409–6412; Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (1986), 3746–3750; Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26 (1991), 227–259; etc.. Für kürzere Markierungen, z.B. etwa 30 Nucleotide oder weniger, wird der von Rychlik und Wetmur beschriebene Algorithmus bevorzugt, und für längere Markierungen, z.B. etwa 30–35 Nucleotide oder mehr, kann ein von Suggs et al., Seiten 683–693 in Brown, Herausgeber, ICN-UCLA Symp. Dev. Biol., Bd. 23 (Academic Press, New York, 1981) offengelegter Algorithmus geeigneterweise verwendet werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform von minimal kreuzhybridisierenden Sätzen ist jene, deren Untereinheiten aus drei der vier natürlichen Nucleotiden hergestellt sind. Wie nachstehend ausführlicher erörtert wird, erlaubt das Fehlen eines Nucleotidtyps in den Oligonucleotid-Markierungen, daß die Ziel-Polynucleotide durch die Verwendung der 3'→5'-Exonucleaseaktivität einer DNA-Polymerase auf Festphasenträger geladen werden können. Das Folgende ist ein beispielhafter minimal kreuzhybridisierender Satz von Untereinheiten, die jeweils vier Nucleotide umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A, G und T:
  • Tabelle I
    Figure 00110001
  • In diesem Satz würde jeder Vertreter einen Doppelstrang mit drei falsch gepaarten Basen mit dem Komplement jedes anderen Vertreters bilden.
  • Weitere beispielhafte minimal kreuzhybridisierende Sätze sind nachstehend in Tabelle II aufgeführt. Es ist offensichtlich, daß weitere Sätze durch Substitution unterschiedlicher Gruppen von Nucleotiden oder durch Verwendung von Untersätzen von bekannten minimal kreuzhybridisierenden Sätzen erzeugt werden können.
  • Tabelle II Beispielhafte minimal kreuzhybridisierende Sätze von 4-Mer-Untereinheiten
    Figure 00120001
  • Die erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Markierungen und ihre Komplemente werden in einfacher Weise mit einem automatischen DNA-Synthetisiergerät, z.B. einem Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Kalifornien)-Modell 392- oder 394-DNA/RNA-Synthetisiergerät, unter Anwendung von chemischen Standardverfahren wie dem chemischen Phosphoramiditverfahren synthetisiert, z.B. wie in den folgenden Veröffentlichungen offengelegt: Beaucage und Iyer, Tetrahedron 48 (1992), 2223–2311; Molko et al., US-Patent 4,980,460; Koster et al., US-Patent 4,725,677; Caruthers et al., US-Patent 4,415,732; 4,458,066; und 4,973,679; etc.. Alternative chemische Verfahren, die z.B. nicht-natürliche Gerüstgruppen ergeben, wie Phosphorothioat, Phosphoramidat etc., können ebenfalls angewendet werden, mit der Maßgabe, daß die so erhaltenen Oligonucleotide in der Lage sind, spezifisch zu hybridisieren. In einigen Ausführungsformen können die Markierungen natürlich auftretende Nucleotide umfassen, die die Prozessierung oder Manipulation durch Enzyme erlauben, während die entsprechenden Markierungskomplemente nicht-natürliche Nucleotidanaloge, wie Peptidnucleinsäuren, oder ähnliche Verbindungen umfassen können, die die Bildung von stabileren Doppelsträngen während der Sortierung begünstigen.
  • WO 95/23163 beschreibt die Synthese von Oligonucleotidpeptidnucleinsäuren (PNAs) durch Festphasen-Techniken. Diese internationale Patentanmeldung zeigt die Synthese dieser PNAs sowohl als Einzeleinheiten als auch als zusammengesetzte Mischungen.
  • Wenn Mikropartikel als Träger verwendet werden, werden Vorräte an Oligonucleotid-Markierungen und Markierungskomplementen vorzugsweise durch untereinheitenweise Synthese mit Hilfe von "Aufteilungs- und Misch"-Verfahren erzeugt, z.B. wie bei Shortle et al., Internationale Patentanmeldung WO 93/21203 offengelegt. Kurz zusammengefaßt ist die Basiseinheit der Synthese eine Untereinheit der Oligonucleotid-Markierung. Vorzugsweise wird das chemische Phosphoramiditverfahren angewendet und 3'-Phosphoramidit-Oligonucleotide werden für jede Untereinheit in einem minimal kreuzhybridisierenden Satz hergestellt, z.B. würde es für den vorstehend aufgeführten ersten Satz acht 4-Mer-3'-Phosphoramidite geben. Die Synthese schreitet fort, wie bei Shortle et al. offengelegt, oder in direkter Analogie mit den bei der Erzeugung diverser Oligonucleotid-Banken unter Verwendung von Nucleosidmonomeren angewendeten Verfahren, z.B. wie bei Telenius et al., Genomics 13 (1992), 718–725; Welsh et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 5275–5279; Grothues et al., Nucleic Acids Research 21 (1993), 1321–1322; Hartley, Europäische Patentanmeldung EP 0395398 ; Lam et al., Nature 354 (1991), 82–84; Zuckerman et al., Int. J. Pept. Protein Research 40 (1992), 498–507; etc. offengelegt. Im Allgemeinen erfordern diese Verfahren nur die Anwendung von Gemischen der aktivierten Monomeren auf das wachsende Oligonucleotid während der Kupplungsschritte.
  • Doppelsträngige Formen von Markierungen werden hergestellt durch getrenntes Synthetisieren der komplementären Stränge, gefolgt von Mischen unter Bedingungen, die die Doppelstrangbildung erlauben. Solche Doppelstrang-Markierungen können dann zusammen mit Ziel-Polynucleotiden zur erfindungsgemäßen Sortierung und Manipulation des Ziel-Polynucleotids in Clonierungsvektoren inseriert werden.
  • Wenn die spezifische Hybridisierung über eine Dreifachstrangbildung erfolgt, folgt die Codierung von Markierungssequenzen den gleichen Prinzipien wie für Doppelstrangbildende Markierungen; jedoch gibt es weitere Einschränkungen in Bezug auf die Auswahl von Untereinheitensequenzen. Im Allgemeinen ist die Drittstrangassoziation über eine Bindung vom Hoogsteen-Typ entlang Homopyrimidin-Homopurin-Ketten in einem doppelsträngigen Zielmolekül am stabilsten. Üblicherweise bilden Basentripletts T-A*T- oder C-G*C-Motive (worin "-" eine Watson-Crick-Paarung anzeigt und "*" eine Bindung vom Hoogsteen- Typ anzeigt); jedoch sind andere Motive ebenfalls möglich. Zum Beispiel erlaubt die Hoogsteen-Basenpaarung parallele und antiparallele Orientierungen zwischen dem dritten Strang (dem Hoogsteen-Strang) und dem Purin-reichen Strang des Doppelstrangs, an den der dritte Strang bindet, abhängig von den Bedingungen und der Zusammensetzung der Stränge. In der Literatur gibt es umfangreiche Informationen zur Auswahl geeigneter Sequenzen, Orientierungen, Bedingungen, Nucleosidtypen (z.B. ob Ribose- oder Desoxyribosenucleoside verwendet werden) und Basenmodifikationen (z.B. methyliertes Cytosin und ähnliches), um die Dreifachstrangstabilität zu maximieren oder anderweitig zu regulieren, wie es in bestimmten Ausführungsformen erwünscht ist, z.B. Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), 9397–9401; Roberts et al., Science 258 (1992), 1463–1466; Distefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993), 1179–1183; Mergny et al., Biochemistry 30 (1991); 9791–9798; Cheng et al., J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 4465–4474; Beal und Dervan, Nucleic Acids Research 20 (1992), 2773–2776; Beal und Dervan, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 4976–4982; Giovannangeli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 8631–8635; Moser und Dervan, Science 238 (1987), 645–650; McShan et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 5712–5721; Yoon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 3840–3844; Blume et al., Nucleic Acids Research 20 (1992), 1777–1784; Thuong und Helene, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32 (1993), 666–690; etc.. Bedingungen zur Anlagerung von Einzelstrang- oder Doppelstrang-Markierungen an ihre Einzelstrang- oder Doppelstrang-Komplemente sind gut bekannt, z.B. Ji et al., Anal. Chem. 65 (1993), 1323–1328.
  • Wenn oligomere Untereinheiten verwendet werden, können erfindungsgemäße Oligonucleotid-Markierungen und ihre Komplemente eine Länge im Bereich von 12 bis 60 Nucleotiden oder Basenpaaren aufweisen; stärker bevorzugt weisen sie eine Länge im Bereich von 18 bis 40 Nucleotiden oder Basenpaaren auf; und besonders bevorzugt weisen sie eine Länge im Bereich von 25 bis 40 Nucleotiden oder Basenpaaren auf. Bei der Konstruktion aus Antisense-Monomeren weisen Oligonucleotid-Markierungen und ihre Komplemente vorzugsweise eine Länge im Bereich von 10 bis 40 Monomeren auf, und stärker bevorzugt weisen sie eine Länge im Bereich von 12 bis 30 Monomeren auf.
  • Tabelle III Zahl der Untereinheiten in Markierung in bevorzugten Ausführungsformen
    Figure 00150001
  • Besonders bevorzugt sind Oligonucleotid-Markierungen einzelsträngig und die spezifische Hybridisierung erfolgt über eine Watson-Crick-Paarung mit einem Markierungskomplement.
  • Festphasenträger
  • Festphasenträger zur erfindungsgemäßen Verwendung können eine große Vielzahl von Formen einschließlich Mikropartikel, Kügelchen und Membranen, Objektträger, Platten, Mikrochips etc. aufweisen. In ähnlicher Weise können erfindungsgemäße Festphasenträger eine große Vielzahl von Zusammensetzungen einschließlich Glas, Kunststoff, Silicon, Alkanthiolat-derivatisiertes Gold, Cellulose, gering vernetztes und stark vernetztes Polystyrol, Silicagel, Polyamid etc. umfassen. Vorzugsweise wird entweder eine Population von einzelnen Partikeln verwendet, so daß jedes eine einheitliche Bedeckung oder eine Population von komplementären Sequenzen der gleichen Markierung (und keiner anderen) aufweist, oder es werden ein einziger oder einige wenige Träger mit räumlich getrennten Regionen verwendet, die jeweils eine einheitliche Bedeckung oder eine Population von komplementären Sequenzen zu der gleichen Markierung (und keiner anderen) enthalten. In der letzteren Ausführungsform kann die Fläche der Regionen gemäß den einzelnen Anwendungen variieren; üblicherweise weisen die Regionen eine Fläche im Bereich von mehreren μm2, z.B. 3–5, bis mehreren 100 μm2, z.B. 100–500, auf. Vorzugsweise sind solche Regionen räumlich getrennt, so daß Signale, die durch Ereignisse erzeugt werden, z.B. Fluoreszenzemissionen, in benachbarten Regionen durch das verwendete Nachweissystem aufgelöst werden können. Bei einigen Anwendungen kann es wünschenswert sein, Regionen mit einheitlichen Bedeckungen von mehr als einem Markierungskomplement zur Verfügung zu haben, z.B. zur gleichzeitigen Sequenzanalyse oder um unterschiedlich markierte Moleküle in unmittelbare Nachbarschaft, zu bringen.
  • Markierungskomplemente können zusammen mit dem Festphasenträger verwendet werden, auf dem sie synthetisiert worden sind, oder sie können getrennt synthetisiert und zur Verwendung an einen Festphasenträger gebunden werden, z.B. wie bei Lund et al., Nucleic Acids Research 16 (1988), 10861–10880; Albretsen et al., Anal. Biochem. 189 (1990), 40–50; Wolf et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 2911–2926; oder Gosh et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 5353–5372 offenbart. Vorzugsweise werden Markierungskomplemente auf dem gleichen Festphasenträger synthetisiert und mit diesem verwendet, der eine Vielzahl von Formen umfassen kann und eine Vielzahl von Verbindungseinheiten einschließen kann. Solche Träger können Mikropartikel oder Anordnungen oder Matrizen von Regionen umfassen, wenn einheitliche Populationen von Markierungskomplementen synthetisiert werden. Eine große Vielzahl von Mikropartikelträgern kann erfindungsgemäß verwendet werden, einschließlich Mikropartikeln, die aus Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG), stark vernetztem Polystyrol, Acrylsäurecopolymeren, Cellulose, Nylon, Dextran, Latex, Polyacrolein etc. hergestellt sind, wie in den folgenden beispielhaften Veröffentlichungen offenbart: Meth. Enzymol., Bd. 44, Abschnitt A, 11–147 (Academic Press, New York, 1976); US-Patente 4,678,814; 4,413,070; und 4,046,720; und Pon, Kapitel 19, bei Agrawal, Herausgeber, Methods in Molecular Biology, Bd. 20 (Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Mikropartikelträger schließen ferner im Handel erhältliches Nucleosid-derivatisiertes CPG und Polystyrolkügelchen (z.B. erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, CA); derivatisierte magnetische Kügelchen; Polyethylenglykol-gepfropftes Polystyrol (z.B. TentaGelTM, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland) etc. ein. Die Auswahl der Trägereigenschaften, wie Material, Porosität, Größe, Form etc., und des Typs der verwendeten Verbindungseinheit hängt von den Bedingungen ab, unter denen die Markierungen verwendet werden. Zum Beispiel werden bei Anwendungen, die die anschließende Prozessierung mit Enzymen einschließen, Träger und Linker bevorzugt, die die sterische Hinderung der Enzyme auf ein Minimum verringern und den Zugang zum Substrat erleichtern. Beispielhafte Verbindungseinheiten werden offenbart bei Pon et al., Biotechniques 6 (1988), 768–775; Webb, US-Patent 4,659,774; Barany et al., Internationale Patentanmeldung WO 92104384; Brown et al., J. Chem. Soc. Commun. 1989: 891–893; Damha et al., Nucleic Acids Research 18 (1990), 3813–3821; Beattie et al., Clinical Chemistry 39 (1993), 719–722; Maskos und Southern, Nucleic Acids Research 20 (1992), 1679–1684; etc..
  • Wie vorstehend erwähnt, können Markierungskomplemente auch auf einem einzigen (oder wenigen) Festphasenträger(n) synthetisiert werden, um eine Anordnung von Regionen zu bilden, die einheitlich mit Markierungskomplementen bedeckt sind. Das heißt, innerhalb jeder Region in einer solchen Anordnung wird das gleiche Markierungskomplement synthetisiert. Verfahren zur Synthese solcher Anordnungen sind offenbart bei McGall et al., Internationale Anmeldung WO 9322680; Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022–5026; Southern und Maskos, Internationale Anmeldung WO 9003382; Maskos und Southern (a.a.O.); Southern et al., Genomics 13 (1992), 1008–1017 (1992); und Maskos und Southern, Nucleic Acids Research 21 (1993), 4663–4669.
  • WO 93/17126 beschreibt Methoden zu Aufbau und Verwendung von binären Oligonucleotid-Anordnungen. Diese Anordnungen bestehen aus binären Oligonucleotiden, die aus einer konstanten und variablen Region bestehen, die an einer festen Oberfläche an vorgegebenen Stellen immobilisiert sind. Binäre Anordnungen sind so aufgeteilt, dass jede einzelne Fläche von sämtlichen anderen Flächen getrennt ist, wobei jede Fläche mehrfache Kopien eines anderen Oligonucleotids enthält.
  • Vorzugsweise wird die Erfindung mit Mikropartikeln oder Kügelchen ausgeführt, die mit Komplementen der gleichen Markierungssequenz einheitlich bedeckt sind. Mikropartikelträger und Verfahren zur kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung von Oligonucleotiden an ihre Oberflächen sind gut bekannt, wie durch die folgenden Veröffentlichungen veranschaulicht wird: Beaucage und Iyer (a.a.O.); Gait, Herausgeber, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); und die vorstehend erwähnten Veröffentlichungen. Im Allgemeinen ist die Größe und Form eines Mikropartikels nicht entscheidend; jedoch werden Mikropartikel im Größenbereich von wenigen, z.B. 1–2, bis mehreren 100, z.B. 200–1000, μm -Durchmesser bevorzugt, da sie die Konstruktion und Manipulation von großen Vorräten an Oligonucleotid-Markierungen bei minimalem Reagens- und Probenverbrauch erleichtern.
  • Vorzugsweise werden erfindungsgemäß im Handel erhältliche Träger aus Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG) oder aus Polystyrol als Festphasenträger verwendet. Solche Träger sind mit Basen-empfindlichen Linkern und ersten gebundenen Nucleosiden erhältlich, z.B. Applied Biosystems (Foster City, CA). Vorzugsweise werden Mikropartikel mit einer Porengröße zwischen 500 und 1000 Angström verwendet.
  • Bei anderen bevorzugten Anwendungen werden nicht-poröse Mikropartikel wegen ihrer optischen Eigenschaften verwendet, die vorteilhaft sein können, wenn große Mengen von Mikropartikeln auf planaren Trägern wie einem Objektträger untersucht werden. Besonders bevorzugte nicht-poröse Mikropartikel sind die Glycidalmethacrylat (GMA)-Kügelchen, die von Bangs Laboratories (Carmel, IN) erhältlich sind. Solche Mikropartikel sind in einer Vielzahl von Größen und derivatisiert mit einer Vielzahl von Verbindungsgruppen zur Synthese von Markierungen oder Markierungskomplementen nützlich. Vorzugsweise werden für massive Parallelmanipulationen von markierten Mikropartikeln GMA-Kügelchen mit 5 μm Durchmesser verwendet.
  • Synthese von Oligonucleotid-3'N→5'P-Phosphoramidaten
  • Oligonucleotid-3'N→5'P-Phosphoramidate umfassende Markierungskomplemente können auf einem festen Träger unter Anwendung des in 4 beschriebenen schrittweisen Verlängerungsverfahrens synthetisiert werden. Der Synthesezyklus zur Addition eines einzigen Aminonucleosids besteht im Wesentlichen aus den folgenden Arbeitsschritten: Detritylierung (Schritt a); Phosphitylierung der 5'-Hydroxylgruppe, um einen 5'-Hydrogenphosponatdiester zu erzeugen (Schritte b und c); und die Kupplung vom Atherton-Todd-Typ eines 5'-DMT-3-Aminonucleosids (z.B. wie von Glinski et al., Chem. Comm. (1970), 915–916 offenbart) mit dem 5'-Hydrogenphosphonat in Gegenwart von Tetrachlorkohlenstoff (Schritt d). Die Kupplungausbeuten liegen zwischen 94–96% pro Zyklus. Das so erhaltene Oligonucleotid-Phosphoramidat wird gespalten und die Schutzgruppen werden mit Ammoniak entfernt, und danach wird es durch Ionenaustauscher-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. Die folgenden Veröffentlichungen liefern Informationen zur Ausführung der vorstehenden Synthese: Atherton et al., J. Chem. Soc. (1945), 660–663; Gryaznov et al., Nucleic Acids Research 20 (1992), 3403–3409; Gryaznov et al., Vest. Mosk. Univ. Ser. 2: Khim 27 (1986), 421–424; und Gryaznov et al., Tetrahedron Lett. 31 (1990), 3205–3208. Fung und Gryaznov, Internationale Anmeldung WO 9 421 824, zeigen auch, daß 3'-Amino-Oligonucleotide enzymatisch mit 5'-phosphorylierten Oligonucleotiden in einer Matrizen-gesteuerten Ligierungsstandardreaktion ligiert werden können. Gryaznov und Chen (1994) beschreiben außerdem die Hybridisierungseigenschaften von Oligo nucleotidphosphoramidaten in Lösung. Sie zeigten eine erhöhte Stabilität der Doppelstrang-Bildung mit komplementären DNA- oder RNA-Strängen gegenüber natürlichen Oligonucleotidphosphodiester-Doppelsträngen und schrieben diese Eigenschaft der Substitution des 3'-Sauerstoffatoms durch ein Stickstoffatom zu, was zu einer günstigen Konformationsänderung führe, die die Wasserstoffbindung zwischen den Basen fördere.
  • Oligonucleotid-Klammern
  • Erfindungsgemäße Markierungskomplemente können eine Oligonucleotid-Klammer umfassen, die eine Verbindung ist, die einen kovalent geschlossenen Makrozyklus oder einen stabilen ringförmigen Komplex nach der spezifischen Bindung an ein Ziel-Polynucleotid bilden kann, das im Fall der vorliegenden Erfindung dessen entsprechende Oligonucleotid-Markierung ist. Im Allgemeinen umfassen Oligonucleotid-Klammern eine oder mehrere Oligonucleotid-Einheiten, die in der Lage sind, spezifisch an eine Markierung zu binden, und ein oder mehrere Paare von Bindungseinheiten, die kovalent an die Oligonucleotid-Einheiten gebunden sind. Nach der Anlagerung der Oligonucleotid-Einheiten an das Ziel-Polynucleotid werden die Bindungseinheiten eines Paars nebeneinander gebracht, so daß sie eine(n) stabile(n) kovalente(n) oder nicht-kovalente(n) Bindung oder Komplex bilden. Die Wechselwirkung der Bindungseinheiten des einen Paares oder mehrerer Paare klammern die spezifisch angelagerten Oligonucleotid-Einheiten an dem Ziel-Polynucleotid wirksam fest.
  • In einer bevorzugten Form umfassen Oligonucleotid-Klammern eine erste Bindungseinheit, eine erste Oligonucleotid-Einheit, einen Gelenkbereich, eine zweite Oligonucleotid-Einheit und eine zweite Bindungseinheit, zum Beispiel wie durch die spezielle Ausführungsform der folgenden Formel dargestellt ist: X-O1-G-O2-Y worin O1 und O2 die ersten und zweiten Oligonucleotid-Einheiten sind, G der Gelenkbereich ist, X die erste Bindungseinheit und Y die zweite Bindungseinheit ist, so daß X und Y eine(n) stabile(n) kovalente(n) oder nicht-kovalente(n) Bindung oder Komplex bilden, immer wenn sie durch die Anlagerung der Oligonucleotid-Einheiten an ein Ziel-Polynucleotid nebeneinander gebracht werden. In dieser Ausführungsform geht vorzugsweise eines von O1 und O2 eine Watson-Crick-Bindung mit dem Ziel-Polynucleotid ein, während das andere von O1 und O2 eine Hoogsteen-Bindung eingeht.
  • Vorzugsweise wird die Stabilität von Oligonucleotid-Klammer/Ziel-Polynucleotid-Komplexen durch Schmelz- oder Strangtrennungskurven bestimmt. Die Temperatur einer 50%igen Strangtrennung wird als die Schmelztemperatur Tm genommen, die wiederum eine geeignete Maßeinheit der Stabilität ist. Tm-Messungen werden üblicherweise in einer Salzlösung bei einem neutralen pH-Wert mit Zielmolekül- und Klammerkonzentrationen zwischen etwa 1,0–2,0 μM ausgeführt. Typische Bedingungen sind wie folgt: 150 mM NaCl und 10 mM MgCl2 in einem 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) oder in einem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0); oder ähnliche Bedingungen. Die Daten für Schmelzkurven werden durch Erhitzen einer Probe des Oligonucleotid-Klammer/Ziel-Polynucleotid-Komplexes von Raumtemperatur auf etwa 85–90°C akkumuliert. Wenn sich die Temperatur der Probe erhöht, wird die Absorption von 260 nm-Licht in 1°C-Intervallen überwacht, z.B. unter Verwendung eines Cary (Australien) Modell 1E- oder eines Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) Modell HP 8459-UV/VIS-Spektrophotometers und eines Modell HP 89100A-Temperaturreglers oder von ähnlichen Geräten.
  • Gelenkbereiche bestehen aus Nucleosid- oder Nicht-Nucleosidpolymeren, die vorzugsweise die spezifische Bindung der Monomeren der Oligonucleotid-Einheiten mit ihren komplementären Nucleotiden des Ziel-Polynucleotids erleichtern. Gelenkbereiche können auch Verknüpfungen mit Festphasenträger einschließen, z.B. über eine derivatisierte Base eines Nucleotids oder ähnliches. Im Allgemeinen können die Oligonucleotid-Einheiten mit den Gelenkbereichen und/oder Bindungseinheiten in entweder 5'→3'- oder 3'→5'-Orientierungen verknüpft sein. Zum Beispiel können in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform, umfassend eine erste Bindungseinheit, eine erste Oligonucleotid-Einheit, einen Gelenkbereich, eine zweite Oligonucleotid-Einheit und eine zweite Bindungseinheit, die Oligonucleotid-Einheiten eine der folgenden Orientierungen aufweisen:
    X-(5')N1N2N3-...-Nj(3')-G-(5')N1N2N3-...-Nk(3')-Y
    oder
    X-(5')N1N2N3-...-Nj(3')-G-(3')NkNk-1Nk-2-...-N1(5')-Y
    oder
    X-(3')NjNj-1Nj-2-...-Nj(5')-G-(5')N1N2N3-...-Nk(3')-Y
    oder
    X-(3')NjNj-1Nj-2-...-N1(5')-G-(3')NkNk-1Nk-2-...-N1(5')-Y
    worin N1N2N3-....-Nk und N1N2N3-....-Nj k-Mer- und j-Mer-Oligonucleotid-Einheiten in den angegebenen Orientierungen sind.
  • Vorzugsweise ist der Gelenkbereich ein lineares Oligomer von Monomeren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkenyl- und/oder Ethergruppen mit 2–3 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise variiert für Monomere mit Nucleosidgröße oder kleiner die Zahl der Monomeren zwischen etwa 3 und etwa 10, und stärker bevorzugt variiert sie zwischen etwa 4 und 8.
  • Eine Vielzahl von Bindungseinheiten sind zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Im Allgemeinen werden sie in Paaren verwendet, die hier der Einfachheit halber als X und Y bezeichnet werden. X und Y können gleich oder verschieden sein. Immer wenn die Wechselwirkung von X und Y auf der Bildung eines stabilen hydrophoben Komplexes basiert, sind X und Y lipophile Gruppen, einschließlich Alkylgruppen, Fettsäuren, Fettalkohole, Steroide, Wachse, fettlösliche Vitamine etc.. Weitere beispielhafte lipophile Bindungseinheiten schließen Glyceride, Glycerylether, Phospholipide, Sphingolipide, Terpene etc. ein. In solchen Ausführungsformen sind X und Y vorzugsweise ausgewählt aus der Steroidgruppe bestehend aus einem derivatisierten Perhydrocyclopentanophenanthrenkern mit 19 bis 30 Kohlenstoffatomen und 0 bis 6 Sauerstoffatomen; Alkylgruppen mit 6 bis 16 Kohlenstoffatomen; Vitamin E; und Glyceriden mit 20 bis 40 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise ist eine Perhydrocyclopentanophenanthreneinheit über die Hydroxylgruppe entweder als ein Ether oder ein Ester an deren C3-Position gebunden. Es ist selbstverständlich, daß X und Y eine Verbindungsgruppe einschließen können, die sie an eine Oligonucleotid-Einheit bindet. Zum Beispiel schließt das Glycerid Phosphoglycerid ein, z.B. wie von MacKellar et al., Nucleic Acids Research 20 (1992), 3411–3417, usw. beschrieben. Es wird besonders bevorzugt, daß lipophile Gruppen, wie Perhydrocyclopentanophenanthrenderivate, an das 5'-Kohlenstoffatom und/oder das 3'-Kohlenstoffatom einer Oligonucleotid-Einheit durch einen kurzen, aber flexiblen Linker gebunden ist, der erlaubt, daß die lipophile Gruppe mit den Basen des Oligonucleotid-Klammer/Ziel-Polynucleotid-Komplexes oder einer lipophilen Gruppe in der gleichen oder einer anderen Oligonucleotid-Einheit in Wechselwirkung tritt. Solche Linker schließen Phosphat (d.h. Phosphodiester)-, Phosphoramidat-, Hydroxyurethan-, Carboxyaminoalkyl- und Carboxyaminoalkylphosphat-Linker oder ähnliche ein. Vorzugsweise weisen solche Linker nicht mehr als 2 bis 8 Kohlenstoffatome auf.
  • Bindungsgruppen können an die Oligonucleotid-Einheit durch eine Reihe von zur Verfügung stehenden chemischen Verfahren angebracht werden. Im Allgemeinen wird bevorzugt, daß das Oligonucleotid erst an seinem 3'- und/oder 5'-Terminus mit einer reaktiven Funktionalität, wie einer Amino-, Phosphat-, Thiophosphat- oder Thiolgruppe derivatisiert wird. Nach der Derivatisierung wird eine hydrophile oder hydrophobe Gruppe an das Oligonucleotid über die reaktive Funktionalität gekuppelt. Beispielhafte Mittel zum Anbringen von 3'- oder 5'-reaktiven Funktionalitäten an Oligonucleotide sind veröffentlicht in Fung et al., US-Patent 5,212,304; Connolly, Nucleic Acids Research 13 (1985), 4485–4502; Tino, Internationale Anmeldung WO 9211388; Nelson et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 7187–7194; Stabinsky, US-Patent 4,739,044; Gupta et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 3019; Reed et al., Internationale Anmeldung WO 9203464; Zuckerman et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 5305; Eckstein, Herausgeber, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Clontech, Katalog 1992/1993 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA); und in ähnlichen Veröffentlichungen.
  • Vorzugsweise, immer wenn X und Y eine kovalente Bindung bilden, müssen X- und Y-Paare spezifisch miteinander reagieren, wenn sie nebeneinander gelagert werden. Gemäß diesem erfindungsgemäßen Gesichtspunkt sind X- und Y-Paare vorzugsweise ausgewählt aus der folgenden Gruppe: wenn eines von X oder Y Phosphorothioat oder Phosphorodithioat ist, ist das andere Haloacetyl, Haloacyl, Haloalkyl oder Alkylazid; wenn eines von X oder Y Thiol ist, ist das andere Alkyliodid, Haloacyl oder Haloacetyl; wenn eines von X oder Y Phenylazid ist, ist das andere Phenylazid. Stärker bevorzugt, wenn eines von X oder Y Phosphorothioat oder Phosphorodithioat ist, ist das andere Haloacetyl, Haloacyl oder Haloalkyl, wobei die Alkyl-, Acetyl- oder Acylgruppe ein bis acht Kohlenstoffatome enthält. Solche chemischen Verfahren werden in Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 3808–3809 offenbart.
  • In einigen Ausführungsformen können X und Y eine kovalente Bindung in Gegenwart eines Aktivierungsmittels bilden. Das heißt, eine oder beide der Bindungsgruppen werden für den anderen aktiviert oder reaktionsfähig gemacht, indem sie einem Aktivierungsmittel oder Kondensierungsmittel, wie Strahlung, einem Reduktionsmittel, einem Oxidationsmittel oder einem ähnlichen Mittel ausgesetzt werden. Beispielhafte Bindungsgruppen, die Aktivierungsmittel verwenden, schließen Thiophosphorylgruppen in Gegenwart von K3Fe(CN)6 oder Kl3, z.B. Gryaznov und Letsinger, Nucleic Acids Research 21 (1993), 1403–1408; Phosphoryl- und Hydroxylgruppen in Gegenwart von N-Cyanoimidazol, z.B. Luebke et al., J. Am. Chem. Soc. 113 (1991); 7447–7448; Phosphoryl- oder Aminogruppen und Hydroxylgruppen in Gegenwart von Cyanbromid, z.B. Sokolova et al., FEBS Letters 232 (1988), 153–155; Phosphoryl- und Hydroxylgruppen in Gegenwart von Spermin-5-(N-ethylimidazol)carboxamid und Cyanoimidazol, z.B. Zuber et al., J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 4939–4940; etc. ein.
  • Anbringen von Ziel-Polynucleotiden an Mikropartikeln
  • Ein wichtiger erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist das Sortieren von Populationen identischer Polynucleotide, z.B. aus einer cDNA-Bank, und ihre Bindung an Mikropartikel oder getrennte Regionen eines Festphasenträgers, so daß jedes Mikropartikel oder jede Region nur eine einzige Polynucleotidart aufweist. Diese letztere Bedingung kann im Wesentlichen durch Ligieren eines Vorrats an Markierungen mit einer Population von Polynucleotiden, gefolgt vom Clonieren und Zusammenstellen der ligierten Sequenzen erfüllt werden. Ein Vorrat an Oligonucleotid-Markierungen kann mit einer Population von Polynucleotiden auf verschiedene Weise ligiert werden, z.B. durch direkte enzymatische Ligierung, Amplifikation, z.B. mittels PCR, unter Verwendung von Primern, die die Markierungssequenzen enthalten, etc.. Der erste Ligierungsschritt erzeugt eine sehr große Population von Markierung-Polynucleotid-Konjugaten, so daß eine einzige Markierung im Allgemeinen an viele verschiedene Polynucleotide angebracht ist. Jedoch kann durch Entnahme einer ausreichend kleinen Probe der Konjugate die Wahrscheinlichkeit des Erhalts von "Doppelmarkierungen", d.h. die gleiche Markierung an zwei verschiedenen Polynucleotiden, vernachlässigbar gemacht werden. (Beachte, daß es auch möglich ist, verschiedene Markierungen mit dem gleichen Polynucleotid in einer Probe zu erhalten. Dieser Fall führt einfach dazu, daß ein Polynucleotid zweimal prozessiert, z.B. sequenziert, wird). Wie nachstehend ausführlicher beschrieben, kann die Wahrscheinlichkeit des Erhalts einer Doppelmarkierung in einer Probe durch eine Poisson-Verteilung abgeschätzt werden, da die Zahl der Konjugate in einer Probe groß ist, z.B. in der Größenordnung von Tausend oder mehr, und die Wahrscheinlichkeit der Auswahl einer bestimmten Markierung klein ist, da der Markierungsvorrat groß ist, z.B. in der Größenordnung von Zehntausend oder mehr. Allgemein gilt, je größer die Probe ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, daß eine Doppelmarkierung erhalten wird. Folglich muß zwischen der Auswahl einer großen Probe von Markierung-Polynucleotid-Konjugaten, die zum Beispiel eine hinreichende Abdeckung eines Ziel-Polynucleotids in einem Schrotschuß-Sequenzierungsverfahren sicherstellt, und der Auswahl einer kleiner Probe, die gewährleistet, daß eine minimale Zahl von Doppelmarkierungen vorhanden ist, abgewägt werden. In den meisten Ausführungsformen fügt das Vorhandensein von Doppelmarkierungen nur eine zusätzliche Geräuschquelle oder im Fall der Sequenzierung eine unbedeutende Komplikation bei der Sondierung und Signalverarbeitung hinzu, da Mikropartikel, die mehrere Fluoreszenzsignale ergeben, einfach ignoriert werden können. Der hier verwendete Begriff im Wesentlichen alle in Bezug auf das Anbringen von Markierungen an Moleküle, insbesondere Polynucleotide, soll die statistische Natur des Auswahlverfahrens widerspiegeln, das zum Erhalt einer Population von Markierung-Molekül-Konjugaten angewendet wird, die im Wesentlichen frei von Doppelmarkierungen ist. Die Bedeutung von im Wesentlichen alle im Hinblick auf den tatsächlichen Prozentsatz der Markierung-Molekül-Konjugate hängt davon ab, wie die Markierungen verwendet werden. Vorzugsweise bedeutet im Wesentlichen alle für die Nucleinsäuresequenzierung, daß mindestens 80 Prozent der Markierungen einzigartige Polynucleotide gebunden haben. Stärker bevorzugt bedeutet es, daß mindestens 90 Prozent der Markierungen einzigartige Polynucleotide gebunden haben. Noch stärker bevorzugt bedeutet es, daß mindestens 95 Prozent der Markierungen einzigartige Polynucleotide gebunden haben. Und am meisten bevorzugt bedeutet es, daß mindestens 99 Prozent der Markierungen einzigartige Polynucleotide gebunden haben.
  • Vorzugsweise, wenn die Population von Polynucleotiden Boten-RNA (mRNA) ist, werden Oligonucleotid-Markierungen durch reverse Transkription der mRNA mit einem Satz von Primern angebracht, die Komplemente von Markierungssequenzen enthalten. Ein beispielhafter Satz solcher Primer könnte die folgende Sequenz aufweisen:
    Figure 00240001
    worin "[W,W,W,C]9" die Sequenz einer Oligonucleotid-Markierung von neun Untereinheiten von jeweils vier Nucleotiden darstellt und "[W,W,W,C]" die vorstehend erwähnt Untereinheitensequenzen darstellt, d.h. "W" bedeutet T oder A. Die unterstrichenen Sequenzen weisen eine wahlweise Restriktionsendonucleasestelle aus, die verwendet werden kann, um das Polynucleotid aus der Bindung an einen Festphasenträger über das Biotin, wenn eines verwendet wird, freizusetzen. Für die vorstehenden Primer könnte das an ein Mikropartikel gebundene Komplement die folgende Form aufweisen:
  • Figure 00250001
  • Nach reverser Transkription wird die mRNA entfernt, z.B. durch RNase H-Verdau, und der Sekundärstrang der cDNA wird unter Verwendung von zum Beispiel einem Primer der folgenden Form:
    Figure 00250002
    synthetisiert, worin N irgendeines von A, T, G oder C ist; R ein Purin-enthaltendes Nucleotid ist und Y ein Pyrimidin-enthaltendes Nucleotid ist. Dieser spezielle Primer erzeugt eine BstY1-Restriktionsstelle in der so erhaltenen doppelsträngigen DNA, die zusammen mit der SalI-Stelle die Clonierung in einen Vektor mit zum Beispiel BamHI- und XhoI-Stellen erleichtert. Nach dem BstY1- und SalI-Verdau würde das beispielhafte Konjugat die folgende Form aufweisen:
  • Figure 00250003
  • Vorzugsweise, wenn das auf Ligasebasierende-Sequenzierungsverfahren angewendet wird, werden die BstY1- und SalI-gespaltenen Fragmente in einen BamHI/XhoI-gespaltenen Vektor mit den folgenden Einzelkopie-Restriktionsstellen cloniert:
  • Figure 00250004
  • Dies fügt die FokI- Stelle hinzu, die die Initiation des nachstehend ausführlicher erörterten Sequenzierungsverfahrens ermöglicht.
  • Ein allgemeines Verfahren zur Exposition der Einzelstrang-Markierung nach der Amplifikation schließt den Verdau eines Ziel-Polynucleotid-enthaltenden Konjugats mit der 3'→5'-Exonucleaseaktivität der T4-DNA-Polymerase oder einem ähnlichen Enzym ein. Bei der Verwendung in Gegenwart eines einzigen Nucleosidtriphosphats spaltet eine solche Polymerase Nucleotide von 3'-recessiven Enden ab, die in dem Nicht-Matrizenstrang eines doppelsträngigen Fragments vorhanden sind, bis ein Komplement des einzigen Nucleosidtriphosphats auf dem Matrizenstrang erreicht wird. Wenn ein solches Nucleotid erreicht wird, wird der 5'→3'-Verdau wirksam eingestellt, da die Verlängerungsaktivität der Polymerase Nucleotide in einer höheren Rate anhängt als die Exzisionsaktivität Nucleotide entfernt. Folglich können aus drei Nucleotiden konstruierte Markierungen ohne weiteres zum Beladen auf Festphasenträger hergestellt werden.
  • Das Verfahren kann auch angewendet werden, um vorzugsweise innere FokI-Stellen eines Ziel-Polynucleotids zu methylieren, während eine einzige FokI-Stelle am Terminus des Polynucleotids unmethyliert bleibt. Zuerst wird die terminale FokI-Stelle unter Verwendung einer Polymerase mit Desoxycytidintriphosphat in die Einzelstrangform umgewandelt. Der doppelsträngige Teil des Fragments wird dann methyliert, danach wird der einzelsträngige Terminus mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart von allen vier Nucleosidtriphosphaten aufgefüllt, wodurch die FokI-Stelle wiederhergestellt wird.
  • Nach der Vorbereitung der Oligonucleotid-Markierungen zur spezifischen Hybridisierung, z.B. indem sie in die Einzelstrangform umgewandelt worden sind, wie vorstehend beschrieben, werden die Polynucleotide mit Mikropartikeln, die die komplementären Sequenzen der Markierungen enthalten, unter Bedingungen gemischt, die die Bildung von perfekt passenden Doppelsträngen zwischen den Markierungen und ihren Komplementen begünstigen. In der Literatur gibt es umfangreiche Informationen zur Erzeugung dieser Bedingungen. Beispielhafte Veröffentlichungen, die solche Informationen liefern, schließen Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 26 (1991), 227–259; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); etc. ein. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen hinreichend stringent, so daß nur perfekt passende Sequenzen stabile Doppelstränge bilden. Unter solchen Bedingungen werden die über ihre Markierungen spezifisch hybridisierten Polynucleotide mit den an den Mikropartikeln angebrachten komplementären Sequenzen ligiert. Schließlich werden die Mikropartikel gewaschen, um nicht-ligierte Polynucleotide zu entfernen.
  • Wenn CPG-Mikropartikel üblicherweise als Syntheseträger verwendet werden, ist die Dichte der Markierungskomplemente auf der Mikropartikeloberfläche typischerweise größer als die, die für einige Sequenzierungsverfahren erforderlich ist. Das heißt, bei Sequenzierungsansätzen, die die aufeinanderfolgende Behandlung der gebundenen Polynucleotide mit einer Vielzahl von Enzymen erfordern, können dicht beieinanderliegende Polynucleotide dazu neigen, den Zugang der relativ voluminösen Enzyme zu den Polynucleotiden zu inhibieren. In solchen Fällen werden die Polynucleotide vorzugsweise mit den Mikropartikeln gemischt, so daß Markierungskomplemente in einem signifikanten Überschuß, z.B. von 10:1 bis 100:1 oder mehr, im Vergleich zu den Polynucleotiden vorhanden sind. Dies stellt sicher, daß die Dichte der Polynucleotide auf der Mikropartikeloberfläche nicht so hoch ist, daß der Enzymzugang inhibiert wird. Vorzugsweise liegt der durchschnittliche Abstand zwischen den Polynucleotiden auf der Mikropartikeloberfläche in der Größenordnung von 30–100 nm. Informationen über die Auswahl von Verhältnissen für Standard-CPG-Träger und Ballotini-Kügelchen (ein Typ eines Festglasträgers) findet man bei Maskos und Southern, Nucleic Acids Research, 20 (1992), 1679–1684. Vorzugsweise werden für Sequenzierungsanwendungen Standard-CPG-Kügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von 20–50 μm mit etwa 105 Polynucleotiden bedeckt.
  • Das vorstehend erwähnte Verfahren kann auf Fingerprint-mRNA-Populationen angewendet werden, wenn es mit der nachstehend beschriebenen Parallelsequenziermethode gekoppelt wird. Partielle Sequenzinformationen werden gleichzeitig aus einer großen Probe, z.B. zehn bis Hunderttausend, von cDNAs erhalten, die an verschiedene Mikropartikel gebunden worden sind, wie bei dem vorstehenden Verfahren beschrieben wurde. Die Häufigkeitsverteilung von partiellen Sequenzen kann mRNA-Populationen aus verschiedenen Zell- und Gewebetypen sowie aus erkrankten Geweben, wie Krebsgeweben, identifizieren. Solche mRNA-Fingerprints sind bei der Überwachung und Diagnose von Erkrankungszuständen nützlich, z.B. Internationale Anmeldung WO 95/21944, die die Verwendung von Express-Sequenz-Markierungen (ESTs) für den gleichen Zweck beschreibt.
  • Eine-Base-DNA-Sequenzierung
  • Die vorliegende Erfindung kann zusammen mit herkömmlichen Verfahren der DNA-Sequenzierung verwendet werden, z.B. wie bei Hultman et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 4937–4946 offenbart. Jedoch wird für die parallele oder gleichzeitige Sequenzierung von mehreren Polynucleotiden eine DNA-Sequenzierungs-Methode bevorzugt, die weder eine elektrophoretischen Trennung von DNA-Fragmenten mit ähnlicher Größe noch die Analyse von gespaltenen Nucleotiden durch ein anderes analytisches Verfahren erfordert, wie bei der Peptidsequenzierung. Vorzugsweise erlaubt die Methode die schrittweise Identifizierung von Nucleotiden, üblicherweise eines auf einmal, in einer Sequenz durch aufeinanderfolgende Behandlungs- und Nachweiszyklen. Solche Methoden werden hier als "Eine-Base"-Sequenzierungs-Methoden bezeichnet. Eine-Base-Ansätze werden in den folgenden Veröffentlichungen offenbart: Cheeseman, US-Patent 5,302,509; Tsien et al., Internationale Anmeldung WO 91/06678; Rosenthal et al., Internationale Anmeldung WO 93/21340; Canard et al., Gene 148 (1994), 1–6; und Metzker et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4259–4267.
  • Eine "Eine-Base"-Methode der DNA-Sequenzierung, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet ist und die keine elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten erforderlich macht, wird in der Internationalen Anmeldung WO 95/27080 beschrieben. Die Methode umfasst die folgenden Schritte: (a) Ligieren einer Sonde an ein Ende des Polynucleotids mit einem überhängenden Strang, um einen ligierten Komplex zu bilden, wobei die Sonde einen gegenüber dem Polynucleotid überhängenden, komplementären Strang und eine Nuclease-Erkennungsstelle aufweist; (b) Entfernen der nicht-ligierten Sonde aus dem ligierten Komplex; (c) Identifizieren eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide in dem überhängenden Strang des Polynucleotids durch die Identität der ligierten Sonde; (d) Spalten des ligierten Komplexes mit einer Nuclease; und (e) Wiederholen der Schritte (a) bis (d), bis die Nucleotidsequenz des Polynucleotids bestimmt ist. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben ist, kann die Identifizierung eines oder mehrere Nucleotide entweder vor oder nach der Abspaltung des ligierten Komplexes von dem Ziel-Polynucleotid ausgeführt werden. Vorzugsweise, immer wenn natürliche Proteinendonucleasen verwendet werden, schließt die Methode ferner einen Methylierungsschritt des Ziel-Polynucleotids zu Beginn eines Sequenzierungsverfahrens ein.
  • Ein wichtiges Merkmal der Methode ist die mit dem Ziel-Polynucleotid ligierte Sonde. Eine bevorzugte Form der Sonden ist in 2 veranschaulicht. Im Allgemeinen sind die Sonden doppelsträngige DNA-Moleküle mit einem überhängenden Strang an einem Ende 10. Die Sonden enthalten mindestens eine Nuclease-Erkennungsstelle 12 und eine Spacerregion 14 zwischen der Erkennungsstelle und dem überhängenden Ende 10. Vorzugsweise schließen Sonden auch einen Marker 16 ein, der in dieser speziellen Ausführungsform am Ende gegenüber dem überhängenden Strang veranschaulicht ist. Die Sonden können durch eine Vielzahl von Mitteln und an einer Vielzahl von Stellen markiert werden, mit der einzi gen Einschränkung, daß die ausgewählten Markierungsmittel den Ligierungsschritt oder die Erkennung der Sonde durch die Nuclease nicht stören.
  • Es ist nicht entscheidend, ob der überhängende Strang 10 der Sonde ein 5'- oder 3'-Ende ist. Jedoch ist es wichtig, daß die überhängenden Stränge des Ziel-Polynucleotids und der Sonden in der Lage sind, perfekt passende Doppelstränge zu bilden, um die spezifische Ligierung zu ermöglichen. Falls die überhängenden Stränge des Ziel-Polynucleotids und der Sonde unterschiedliche Längen aufweisen, kann die resultierende Lücke durch eine Polymerase vor der Ligierung aufgefüllt werden, z.B. wie bei der "Lücken-LCR", die bei Backman et al., Europäische Patentanmeldung 91100959.5 offenbart ist. Vorzugsweise ist die Zahl der Nucleotide in den jeweiligen überhängenden Strängen gleich, so daß beide Stränge der Sonde und des Ziel-Polynucleotids ohne einen Auffüllschritt ligiert werden können. Vorzugsweise ist der überhängende Strang der Sonde 2 bis 6 Nucleotide lang. Wie nachstehend angegeben, je größer die Länge des überhängenden Strangs ist, desto größer ist die Komplexität des Sondengemisches, das auf das Ziel-Polynucleotid während jedes Ligierungs- und Spaltzyklus angewendet wird.
  • Die komplementären Stränge der Sonde werden in einfacher Weise mit einem automatischen DNA-Synthetisiergerät, z.B. einem Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Kalifornien) Modell 392- oder 394-DNA/RNA-Synthetisiergerät, unter Anwendung von chemischen Standardverfahren synthetisiert. Nach der Synthese werden die komplementären Stränge kombiniert, um eine doppelsträngige Sonde zu bilden. Im Allgemeinen wird der überhängende Strang einer Sonde als ein Gemisch synthetisiert, so daß jede mögliche Sequenz in dem überhängenden Teil repräsentiert ist. Zum Beispiel, falls der überhängende Teil aus vier Nucleotiden besteht, werden in einer Ausführungsform wie folgt vier Gemische hergestellt:
    Figure 00290001
    worin die "NNNs" jedes mögliche 3-Mer darstellen und die "Xs" den Doppelstrang bildenden Teil des Strangs darstellen. Folglich enthält jede der vorstehend aufgeführten vier Sonden 43 oder 64 verschiedene Sequenzen; oder, anders ausgedrückt, weist jede der vier Sonden eine Degeneration von 64 auf. Zum Beispiel enthält X1X2...XiNNNA die folgenden Sequenzen:
  • Figure 00300001
  • Solche Gemische können unter Anwendung von gut bekannten Verfahren ohne weiteres synthetisiert werden, z.B. wie bei Telenius et al. (a.a.O.) offenbart. Im Allgemeinen erfordern diese Verfahren das Aufbringen von Gemischen der aktivierten Monomeren auf das wachsende Oligonucleotid während der Kupplungsschritte, wenn man wünscht, die Degeneration einzuführen. In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, die Degeneration der Sonden zu verringern. Dies kann unter Verwendung von die Degeneration verringernden Analogen wie Desoxyinosin, 2-Aminopurin oder ähnlichen erreicht werden, z.B. wie bei Kong Thoo Lin et al., Nucleic Acids Research 20, 5149–5152 oder im US-Patent 5,002,867 gelehrt wird.
  • Vorzugsweise ist für Oligonucleotide mit Phosphodiesterbindungen die den Doppelstrang bildende Region einer Sonde zwischen etwa 12 bis etwa 30 Basenpaare lang; stärker bevorzugt liegt ihre Länge zwischen etwa 15 bis etwa 25 Basenpaaren.
  • Wenn herkömmliche Ligasen erfindungsgemäß verwendet werden, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, kann das 5'-Ende der Sonde in einigen Ausführungsformen phosphoryliert sein. Ein 5'-Monophosphat kann an ein zweites Oligonucleotid entweder chemisch oder enzymatisch mit einer Kinase angebracht werden, z.B. Sambrook et al. (a.a.O.). Die chemische Phosphorylierung wird bei Horn und Ureda, Tetrahedron Lett. 27 (1986), 4705 beschrieben, und Reagenzien zur Ausführung der offengelegten Protokolle sind im Handel erhältlich, z.B. 5'-Phosphat-ONTM von Clontech Laboratories (Palo Alto, Kalifornien). So können die Sonden in einigen Ausführungsformen die folgende Form aufweisen:
    Figure 00310001
    worin die Y's die komplementären Nucleotide der X's sind und "p" eine Monophosphatgruppe ist.
  • Die vorstehenden Sonden können auf vielfältige Weise markiert werden, einschließlich der direkten oder indirekten Bindung von radioaktiven Gruppen, fluoreszierenden Gruppen, kolorimetrischen Gruppen, chemilumineszierenden Markern etc.. Viele umfassende Übersichten der Methoden zur Markierung von DNA und Konstruktion von DNA-Sonden liefern Informationen, die auf die Konstruktion der erfindungsgemäßen Sonden anwendbar sind. Solche Übersichten schließen Kricka, Herausgeber, Nonisotopic DNA Probe Techniques (Academic Press, San Diego, 1992); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, 1992); Keller und Manak, DNA Probes, 2. Auflage (Stockton Press, New York, 1993); und Eckstein, Herausgeber, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Kessler, Herausgeber, Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules (Springer-Verlag, Berlin, 1992); Wetmur (a.a.O.); etc. ein.
  • Vorzugsweise werden die Sonde mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert, z.B. wie bei Menchen et al., US-Patent 5,188,934; Begot et al., Internationale Anmeldung WO 91/05060 offenbart.
  • Gemäß dem Verfahren wird eine Sonde an ein Ende eines Ziel-Polynucleotids ligiert, um einen ligierten Komplex in jedem Ligierungs- und Spaltungszyklus zu bilden. Der ligierte Komplex ist die doppelsträngige Struktur, die sich nach der Anlagerung der überhängenden Stränge des Ziel-Polynucleotids an die Sonde bildet, und mindestens ein Paar der identisch orientierten Stränge der Sonde und des Zielmoleküls ist ligiert, d.h. veranlaßt, miteinander eine kovalente Bindung einzugehen. Die Ligierung kann entweder enzymatisch oder chemisch erreicht werden. Chemische Ligierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, z.B. Ferris et al., Nucleosides & Nucleotides 8 (1989), 407–414; Shabarova et al., Nuc leic Acids Research 19 (1991), 4247–4251; etc.. Vorzugsweise wird die Ligierung jedoch unter Verwendung einer Ligase in einem Standardprotokoll enzymatisch ausgeführt. Viele Ligasen sind bekannt und zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet, z.B. Lehman, Science 186 (1974), 790–797; Engler et al., DNA Ligases, in Boyer, Herausgeber, The Enzymes, Bd. 15B, 3–30 (Academic Press, New York, 1982); etc.. Bevorzugte Ligasen schließen T4-DNA-Ligase, T7-DNA-Ligase, E. coli-DNA-Ligase, Taq-Ligase, Pfu-Ligase und Tth-Ligase ein. Protokolle für ihre Verwendung sind gut bekannt, z.B. Sambrook et al. (a.a.O.); Barany, PCR Methods and Applications 1 (1991), 5–16; Marsh et al., Strategies 5 (1992), 73–76; etc.. Im Allgemeinen erfordern Ligasen, daß eine 5'-Phosphatgruppe zur Ligierung mit der 3'-Hydroxylgruppe eines angrenzenden Strangs vorhanden ist. Diese wird in einfacher Weise für mindestens einen Strang des Ziel-Polynucleotids durch das Auswählen einer Nuclease, die eine 5'-Phosphatgruppe zurückläßt, z.B. wie FokI, bereitgestellt.
  • In einer Ausführungsform des Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung von nichtphosphorylierten Sonden schließt der Ligierungsschritt (i) das Ligieren der Sonde an das Ziel-Polynucleotid mit einer Ligase, so daß ein ligierter Komplex mit einem Einzelstrangbruch in einem Strang gebildet wird, (ii) das Phosphorylieren der 5'-Hydroxylgruppe an dem Einzelstrangbruch mit einer Kinase unter Verwendung von herkömmlichen Protokollen, z.B. Sambrook et al. (a.a.O.), und (iii) das erneute Ligieren, um die Stränge an dem Einzelstrangbruch kovalent zu verknüpfen, d.h. den Einzelstrangbruch zu entfernen, ein.
  • Vorrichtung zur Beobachtung von enzymatischen Prozessen und/oder Bindungsereignissen auf Mikropartikeloberflächen
  • Ein erfindungsgemäßes Ziel ist die Sortierung identischer Moleküle, insbesondere Polynucleotide, auf den Oberflächen von Mikropartikeln durch die spezifische Hybridisierung von Markierungen und ihren Komplementen. Nachdem eine solche Sortierung stattgefunden hat, kann das Vorhandensein der Moleküle oder können die mit ihnen durchgeführten Behandlungen auf vielfältige Weise in Abhängigkeit von der Natur des markierten Moleküls nachgewiesen werden, sei es, daß Mikropartikel einzeln oder "chargenweise" nachgewiesen werden, daß wiederholte Messungen gewünscht werden, etc.. Üblicherweise werden die sortierten Moleküle zur Bindung Liganden ausgesetzt, z.B. bei der Arzneistoffentwicklung, oder chemischen oder enzymatischen Prozessen unterworfen, z.B. bei der Polynucleotidsequenzierung. Bei beiden Verwendungen ist es oft wünschenswert, gleichzeitig Signale, die solchen Ereignissen oder Prozessen auf einer großen Zahl von Mikropartikeln entsprechen, zu beobachten. Mikropartikel, die sortierte Moleküle tragen (hier als "beladene" Mikropartikel bezeichnet) bieten sich für solche Parallelverfahren im großen Maßstab an, z.B. wie von Lam et al. (a.a.O.) gezeigt.
  • Vorzugsweise, immer wenn Licht erzeugende Signale, z.B. Chemilumineszenz, Fluoreszenz oder ähnliches, verwendet werden, um Ereignisse oder Prozesse nachzuweisen, werden beladene Mikropartikel auf einem planaren Substrat, z.B. einem Objektträger, zur Untersuchung mit einem Sondierungssystem verteilt, wie in den Internationalen Patentanmeldungen WO 92/10587, WO 90/15070 und WO 95/22058 beschrieben. Das Sondierungssystem sollte in der Lage sein, das Substrat reproduzierbar abzutasten und die Positionen jedes Mikropartikels in einer vorherbestimmten Region durch ein Koordinatensystem zu definieren. Bei Polynucleotidsequenzierungsanwendungen ist es wichtig, daß die positionsmäßige Identifizierung von Mikropartikeln in aufeinanderfolgenden Abtastschritten wiederholbar ist.
  • Solche Sondierungssysteme können konstruiert werden aus im Handel erhältlichen Komponenten, z.B. einem durch einen Digitalrechner kontrollierten x-y-Kreuztisch, der zusammen mit einem Nachweissystem verwendet wird, umfassend einen oder mehrere Photomultiplier oder alternativ eine CCD-Zeile und eine geeignete Optik, z.B. zum Anregen, Einfangen und Sortieren von Fluoreszenzsignalen. In einigen Ausführungsformen kann ein konfokales optisches System wünschenswert sein. Ein beispielhaftes Sondierungssystem, das zur Verwendung bei der Vierfarben-Sequenzierung geeignet ist, ist in 5 schematisch veranschaulicht. Das Substrat 300, z.B. ein Mikroskop-Objektträger mit fixierten Mikropartikeln, wird auf den x-y-Kreuztisch 302 gelegt, der mit einem geeignet programmierten Digitalrechner 304 verbunden ist und dadurch kontrolliert wird, der ein beliebiger im Handel erhältlicher Personalcomputer sein kann, z.B. 486-Geräte oder das PowerPC-Modell 7100 oder 8100, erhältlich von Apple Computer (Cupertino, CA). Computersoftware für Kreuztisch- und Datensammelfunktionen kann bereitgestellt werden durch im Handel erhältliche Labor-Software, wie Lab Windows, erhältlich von National Instruments.
  • Das Substrat 300 und der Tisch 302 sind funktionell mit dem Mikroskop 306 mit einer oder mehreren Objektivlinsen 308 verbunden, die Licht von den an das Substrat 300 fixierten Mikropartikeln sammeln bzw. an diese übertragen können. Der Anregungsstrahl 310 von der Lichtquelle 312, die vorzugsweise ein Laser ist, wird auf einen Strahlteiler 314 geleitet, z.B. einen dichromatischen Spiegel, der den Strahl wieder durch das Mikroskop 306 und die Objektivlinse 308 umleitet, die wiederum den Strahl auf das Substrat 300 fokussiert. Die Linse 308 sammelt die von den Mikropartikeln emitterte Fluoreszenz 316 und leitet sie über den Strahlleiter 314 zu einer Signalverteilungsoptik 318, die wiederum die Fluoreszenz zu einer oder mehreren geeigneten optoelektronischen Vorrichtungen zur Umwandlung einiger Fluoreszenzeigenschaften, z.B. Intensität, Lebensdauer oder ähnliche, in ein elektrisches Signal leitet. Die Signalverteilungsoptik 318 kann eine Vielzahl von Komponenten umfassen, die auf dem Fachgebiet Standard sind, wie Bandfilter, Faseroptik, Drehspiegel, unbewegliche Spiegel und Linsen, Beugungsgitter etc.. Wie in 5 veranschaulicht, leitet die Signalverteilungsoptik 318 die Fluoreszenz 316 zu vier verschiedenen Photomultipliern 330, 332, 334 und 336, deren Ausgangssignal dann zu Vorverstärkern und Photonenzählgeräten 350, 352, 354 und 356 geleitet wird. Das Ausgangssignal der Photonenzählgeräte wird durch den Computer 304 gesammelt, wo es gespeichert, analysiert und auf dem Videogerät 360 betrachtet wird. Alternativ könnte die Signalverteilungsoptik 318 ein Beugungsgitter sein, das das Fluoreszenzsignal 318 zu einer CCD-Zeile leitet.
  • Die Stabilität und Reproduzierbarkeit der positionsmäßigen Lokalisierung bei der Sondierung bestimmt in hohem Grade das Auflösungsvermögen zur Trennung von nahe beieinander liegenden Mikropartikeln. Vorzugsweise sollten die Sondierungssysteme in der Lage sein, nahe beieinander liegende Mikropartikel, z.B. getrennt durch einen Partikeldurchmesser oder weniger, aufzulösen. So sollte für die meisten Anwendungen, z.B. unter Verwendung von CPG-Mikropartikeln, das Sondierungssystem zumindest die Fähigkeit besitzen, Objekte in der Größenordnung von 10–100 μm aufzulösen. Eine noch höhere Auflösung kann bei einigen Ausführungsformen wünschenswert sein, aber mit zunehmender Auflösung nimmt die zur vollständigen Sondierung eines Substrats erforderliche Zeit zu; folglich muß bei einigen Ausführungsformen ein Kompromiß zwischen Geschwindigkeit und Auflösung gemacht werden. Zunahmen der Sondierungsdauer können durch ein System erreicht werden, das nur Positionen sondiert, an denen sich bekanntermaßen Mikropartikel befinden, z.B. aus einer ersten vollständigen Sondierung. Vorzugsweise werden die Mikropartikelgröße und die Sondierungssystemauflösung so gewählt, daß die Auflösung von fluoreszenzmarkierten Mikropartikeln ermöglicht wird, die auf einer Ebene in einer Dichte zwischen etwa zehntausend bis einhunderttausend Mikropartikeln pro cm2 zufällig verteilt sind.
  • Bei Sequenzierungsanwendungen können beladene Mikropartikel auf der Oberfläche eines Substrats auf vielfältige Weise fixiert werden. Die Fixierung sollte stark genug sein, um zu ermöglichen, daß die Mikropartikel aufeinanderfolgende Reagensexpositions- und Waschzyklen ohne einen signifikanten Verlust durchmachen können. Wenn das Substrat Glas ist, kann die Oberfläche mit einem Alkylamino-Linker unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien, z.B. Pierce Chemical, die wiederum mit Avidin vernetzt werden können, wieder unter Anwendung herkömmlicher chemischer Verfahren, um eine mit Avidin bedeckte Oberfläche zu erzeugen, derivatisiert werden. Biotineinheiten können in die beladenen Mikropartikel auf vielfältige Weise eingebracht werden. Zum Beispiel wird eine Fraktion, z.B. 10–15 Prozent, der zum Anbringen von Markierungen an Polynucleotide verwendeten Clonierungsvektoren verändert, so daß sie eine einzige Restriktionsstelle (die beim Verdau überhängende Enden bereitstellt) unmittelbar neben der Polynucleotidinsertion am Ende des Polynucleotids gegenüber der Markierung enthält. Die Stelle wird mit dem Polynucleotid und der Markierung zum Beladen auf Mikropartikel ausgeschnitten. Nach dem Beladen besitzen etwa 10–15 Prozent der beladenen Polynucleotide die einzigartige Restriktionsstelle distal von der Mikropartikeloberfläche. Nach dem Verdau mit der assoziierten Restriktionsendonuclease wird ein geeigneter Doppelstrang-Adaptor, der eine Biotineinheit enthält, mit dem überhängenden Ende ligiert. Die so erhaltenen Mikropartikel werden dann auf der mit Avidin bedeckten Glasoberfläche verteilt, wo sie mit Hilfe der Biotin-Avidin-Bindungen fixiert werden.
  • Alternativ bzw. vorzugsweise, wenn eine Sequenzierung durch Ligierung angewendet wird, wird im ersten Ligierungsschritt ein Gemisch von Sonden für die beladenen Mikropartikel verwendet: eine Fraktion der Sonden enthält eine Typ IIs-Restriktionserkennungsstelle, wie sie für das Sequenzierungsverfahren erforderlich ist, und eine Fraktion der Sonden weist keine solche Erkennungsstelle auf, aber enthält stattdessen eine Biotineinheit an deren Nicht-Ligierungsende. Vorzugsweise macht das Gemisch etwa 10–15 Prozent der biotinylierten Sonde aus.
  • In einer anderen Ausführungsform, wenn DNA-beladene Mikropartikel auf ein Glassubstrat aufgetragen werden, kann die DNA unspezifisch an die Glasoberfläche nach mehrstündiger, z.B. 24 Stunden, Inkubation adsorbiert werden, um eine Bindung zu erzeugen, die ausreichend stark ist, um wiederholte Expositionen gegen Reagenzien und Waschschritte ohne einen signifikanten Verlust der Mikropartikel zu ermöglichen. Vorzugsweise ist ein solches Glassubstrat eine Durchflußzelle, die einen in einen Objektträger geätzten Kanal umfassen kann. Vorzugsweise ist ein solcher Kanal geschlossen, so daß Flüssigkeiten hindurch gepumpt werden können, und besitzt eine ausreichende Tiefe nahe dem Durchmesser der Mikropartikel, so daß eine einlagige Schicht von Mikropartikeln innerhalb eines definierten Beobachtungsbereichs festgehalten wird.
  • Parallelsequenzierung
  • Das erfindungsgemäße Markierungssystem kann zusammen mit Eine-Base-Sequenzierungs-Methoden verwendet werden, um Polynucleotide mit einer Länge bis zu mehreren Kilobasen zu sequenzieren. Das Markierungssystem ermöglicht, daß viele Tausend Fragmente eines Ziel-Polynucleotids auf einem oder mehreren Festphasenträgern gleichzeitig sortiert und sequenziert werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführung der Methode wird ein Teil von jedem sortierten Fragment schrittweise auf jedem der vielen Tausend beladenen Mikropartikel sequenziert, die auf einem gemeinsamen Substrat fixiert sind, wie einem Mikroskop-Objektträger, das mit einem Sondierungssystem oder einem Bildanalysesystem verbunden ist, wie vorstehend beschrieben. Die Größe des sequenzierten Teils der Fragmente hängt von mehreren Faktoren ab, wie der Zahl der erzeugten und sortierten Fragmente, der Länge des Ziel-Polynucleotids, der Geschwindigkeit und Genauigkeit der verwendeten Eine-Base-Methode, der Zahl der Mikropartikel und/oder separaten Regionen, die gleichzeitig überprüft werden können; etc.. Vorzugsweise werden 12–50 Basen auf jedem Mikropartikel oder in jeder Region identifiziert; und stärker bevorzugt werden 18–30 Basen auf jedem Mikropartikel oder in jeder Region identifiziert. Mit dieser Information wird die Sequenz des Ziel-Polynucleotids durch Zusammenstellen der 12–50 Basen-Fragmente mit Hilfe ihrer überlappenden Regionen bestimmt, z.B. wie in US-Patent 5,002,867 beschrieben. Die folgenden Veröffentlichungen liefern weitere Informationen zur Bestimmung des Teils der Fragmente, der für eine erfolgreiche Rekonstruktion eines Ziel-Polynucleotids einer bestimmten Länge sequenziert werden muß: Lander und Waterman, Genomics 2 (1988), 231–239; Drmanac et al., Genomics 4 (1989), 114–128; Bains, DNA Sequencing and Mapping 4 (1993), 143–150; Bains, Genomics 11 (1991), 294–301; Drmanac et al., J. Biomolecular Structure and Dynamics 8 (1991), 1085–1102; und Pevzner, J. Biomolecular Structure and Dynamics 7 (1989), 63–73. Vorzugsweise liegt die Länge des Ziel-Polynucleotids zwischen 1 Kilobase und 50 Kilobasen. Stärker bevorzugt liegt die Länge zwischen 10 Kilobasen und 40 Kilobasen. Lander und Waterman (a.a.O.) liefern Informationen, die die Beziehung zwischen der Zahl der Fragmente, die sequenziert werden (d.h. der Probengröße), der Menge der von jedem Frag ment erhaltenen Sequenzinformation und der Wahrscheinlichkeit, daß das Ziel-Polynucleotid aus den Teilsequenzen ohne Lücken oder "Inseln" rekonstruiert werden kann, betreffen. Für die vorliegende Erfindung sind die maximalen Polynucleotidgrößen, die für bestimmte Probengrößen und Größen von Fragmentsequenzen erhalten werden können, nachstehend gezeigt:
  • Figure 00370001
  • Fragmente können aus einem Ziel-Polynucleotid auf vielfältige Weise erzeugt werden, einschließlich durch sogenannte "direkte" Ansätze, wo man versucht, Sätze von Fragmenten zu erzeugen, die das Ziel-Polynucleotid mit minimaler Überlappung abdecken, und durch sogenannte "Schrotschuß"-Ansätze, wo zufällig überlappende Fragmente erzeugt werden. Vorzugsweise werden "Schrotschuß"-Ansätze zur Fragmenterzeugung wegen ihrer Einfachheit und inhärenten Redundanz verwendet. Zum Beispiel werden zufällig überlappende Fragmente, die ein Ziel-Polynucleotid abdecken, in dem folgenden herkömmlichen "Schrotschuß"-Sequenzierungsprotokoll erzeugt, z.B. wie bei Sambrook et al. (a.a.O.) offenbart. Wie hier verwendet, bedeutet "abdecken" in diesem Zusammenhang, daß jeder Teil der Ziel-Polynucleotidsequenz in jedem Größenbereich der erzeugten Fragmente repräsentiert ist, z.B. alle Fragmente mit einer Länge zwischen 100 und 200 Basenpaaren. Kurz zusammengefaßt wird ausgehend von einem Ziel-Polynucleotid als eine Insertion in einem geeigneten Clonierungsvektor, z.B. dem λ-Phagen, der Vektor vermehrt, gereinigt und mit den geeigneten Restriktionsenzymen umgesetzt, um etwa 10–15 μg gereinigte Insertion zu erhalten. Üblicherweise ergibt das Protokoll etwa 500–1000 Subclone pro Mikrogramm Ausgangs-DNA. Die Insertion wird von den Vektorfragmenten durch präparative Gelelektrophorese getrennt, aus dem Gel durch herkömmliche Verfahren entfernt und in einem Standardpuffer, wie TE (Tris- EDTA), resuspendiert. Die zum Ausschneiden der Insertion aus dem Vektor ausgewählten Restriktionsenzyme hinterlassen vorzugsweise kompatible überhängende Enden in der Insertion, so daß die Insertion zur Vorbereitung der Erzeugung von zufällig überlappenden Fragmenten mit sich selbst ligiert werden kann. Wie bei Sambrook et al. (a.a.O.) erläutert, ergibt die zirkularisierte DNA eine bessere zufällige Verteilung von Fragmenten als lineare DNA bei den nachstehend angewendeten Fragmentierungsverfahren. Nach der Selbstligierung der Insertion, z.B. mit T4-Ligase unter Verwendung herkömmlicher Protokolle wird die gereinigte, ligierte Insertion durch ein Standardprotokoll, z.B. Ultraschall-Behandlung oder DNase I-Verdau in Gegenwart von Mn++, fragmentiert. Nach der Fragmentierung werden die Enden der Fragmente wiederhergestellt, z.B. wie bei Sambrook et al. (a.a.O.) beschrieben, und die wiederhergestellten Fragmente werden unter Verwendung der Gelelektrophorese nach Größen getrennt. Fragmente im Bereich von 300–500 Basenpaaren werden ausgewählt und aus dem Gel durch herkömmliche Mittel eluiert und in einen eine Markierung tragenden Vektor ligiert, wie vorstehend beschrieben, um eine Bank von Markierung-Fragment-Konjugaten zu bilden.
  • Wie vorstehend beschrieben, wird eine Probe, die mehrere Tausend Markierung-Fragment-Konjugate enthält, aus der Bank entnommen und vermehrt, danach werden die Markierung-Fragment-Insertionen aus dem Vektor ausgeschnitten und zur spezifischen Hybridisierung mit den Markierungskomplementen auf Mikropartikeln vorbereitet, wie vorstehend beschrieben. In Abhängigkeit von der Größe des Ziel-Polynucleotids können mehrere Proben aus der Markierung-Fragment-Bank entnommen und getrennt vermehrt, auf die Mikropartikel geladen und sequenziert werden. Die Zahl der ausgewählten Doppelmarkierungen hängt von der Fraktion des in einer Probe vorhanden Markierungsvorrats ab. (Die Wahrscheinlichkeit des Erhalts von Dreifachmarkierungen – drei verschiedene Polynucleotide mit der gleichen Markierung- oder mehr kann sicher vernachlässigt werden). Wie vorstehend erwähnt, kann die Wahrscheinlichkeit von Doppelmarkierungen in einer Probe aus der Poisson-Verteilung p(doppelt) = m2e–m/2 abgeschätzt werden, worin m die Fraktion des Markierungsvorrats in der Probe ist. Die nachstehende Tabelle V führt Wahrscheinlichkeiten für den Erhalt von Doppelmarkierungen in einer Probe für eine bestimmte Markierungsgröße, Probengröße und Vorratdiversität auf.
  • Tabelle V
    Figure 00390001
  • In jedem Fall werden die beladenen Mikropartikel dann auf einem Glasobjektträger verteilt und fixiert, vorzugsweise mit Hilfe einer Avidin-Biotin-Kupplung. Vorzugsweise werden mindestens 15–20 Nucleotide eines jeden der zufälligen Fragmente mit einer Eine-Base-Methode gleichzeitig sequenziert. Die Sequenz des Ziel-Polynucleotids wird dann durch Zusammentragen der partiellen Sequenzen der zufälligen Fragmente über ihre überlappenden Teile unter Verwendung von Algorithmen rekonstruiert, die mit denen vergleichbar sind, die zur Zusammenstellung von Contigs verwendet werden, oder wie sie zur Sequenzierung durch Hybridisierung entwickelt wurden, wie in den vorstehenden Veröffentlichungen offenbart.
  • Kits zur Sortierung von Polynucleotiden
  • Die Erfindung schließt Kits zur Sortierung von Polynucleotiden aus einem Polynucleotidgemisch ein. Vorzugsweise schließen die erfindungsgemäßen Kits einen Vorrat an Markierungskomplementen gebunden an einen Festphasenträger ein. Außerdem können erfindungsgemäße Kits den entsprechenden Vorrat an Markierungen einschließen, z.B. als Primer zum Amplifizieren der zu sortierenden Polynucleotide oder als Elemente von Clonierungsvektoren, die auch zum Amplifizieren der zu sortierenden Polynucleotide verwendet werden können. Vorzugsweise ist der Vorrat an Markierungskomplementen an Mikropartikel gebunden. Kits können auch geeignete Puffer für die enzymatische Prozessierung, für chemische Nachweisverfahren, z.B. fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierungen etc., Gebrauchsanweisungen, Prozessierungsenzyme, wie Ligasen, Polymerasen, Transferasen, usw. enthalten.
  • Identifizierung neuer Polynucleotide in cDNA-Banken
  • Neue Polynucleotide in einer cDNA-Bank können durch Konstruieren einer Bank von cDNA-Molekülen, gebunden an Mikropartikel, identifiziert werden, wie vorstehend beschrieben. Eine große Fraktion der Bank oder auch die ganze Bank kann dann teilweise parallel sequenziert werden. Nach der Isolierung von mRNA und ggf. Normalisierung der Population, wie bei Soares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 9228–9232 oder in ähnlichen Veröffentlichungen gelehrt, kann der folgende Primer mit den Poly A-Schwänzen zur Primärstrangsynthese mit einer reversen Transkriptase unter Verwendung herkömmlicher Protokolle hybridisiert werden:
    Figure 00400001
    worin [W,W,W,C]9 eine Markierung bedeutet, wie vorstehend beschrieben, "ACCAGCTG-ATC" eine fakultative Sequenz ist, die eine Restriktionsstelle in doppelsträngiger Form bildet, und "Primerstelle" eine Sequenz ist, die alle Vertreter der Bank gemeinsam haben und die später als eine Primerbindungsstelle zum Amplifizieren von interessierenden Polynucleotiden durch PCR verwendet wird.
  • Nach reverser Transkription und Sekundärstrangsynthese durch herkömmliche Verfahren werden die doppelsträngigen Fragmente in einen Clonierungsvektor inseriert, wie vorstehend beschrieben, und amplifiziert. Von der amplifizierten Bank wird dann eine Probe entnommen und die Probe amplifiziert. Die Clonierungsvektoren aus der amplifizierten Probe werden isoliert und die markierten cDNA-Fragmente ausgeschnitten und gereinigt. Nach Umwandeln der Markierung in eine Einzelstrangform mit einer Polymerase, wie vorstehend beschrieben, werden die Fragmente methyliert und auf Mikropartikeln erfindungsgemäß sortiert. Vorzugsweise wird, wie vorstehend beschrieben, der Clonierungsvektor so konstruiert, daß die markierten cDNAs mit einer Endonuclease, wie FokI, ausgeschnitten werden können, dies erlaubt die unmittelbare Sequenzierung durch die bevorzugte Eine-Base-Methode nach der Sortierung und Ligierung an Mikropartikel.
  • Die schrittweise Sequenzierung wird dann gleichzeitig mit der ganzen Bank oder einer oder mehreren großen Fraktionen der Bank erfindungsgemäß ausgeführt, bis eine ausreichende Zahl von Nucleotiden auf jeder cDNA zur einmaligen Repräsentation im Genom des Organismus, von dem die Bank abstammt, identifiziert ist. Zum Beispiel, wenn die Bank von Säuger-mRNA abstammt, wird von einer zufällig ausgewählten, 14–15 Nucleotide langen Sequenz erwartet, daß sie einmal unter den 2000–3000 Megabasen des typischen Säugergenoms vertreten ist. Natürlich wäre die Identifizierung von weit weniger Nucleotiden zur einmaligen Repräsentation in einer von Bakterien oder anderen niederen Organismen abstammenden Bank ausreichend. Vorzugsweise werden mindestens 20–30 Nucleotide identifiziert, um eine einmalige Repräsentation sicherzustellen und um die Konstruktion eines geeigneten Primers zu ermöglichen, wie nachstehend beschrieben. Die in Tabellen aufgeführten Sequenzen können dann mit bekannten Sequenzen verglichen werden, um einzigartige cDNAs zu identifizieren.
  • Einzigartige cDNAs werden dann durch herkömmliche Verfahren isoliert, z.B. durch Konstruieren einer Sonde aus dem PCR-Amplicon-Produkt mit Primern, die gegen die Primerstelle und den Teil der cDNA, deren Sequenz bestimmt wurde, gerichtet sind. Die Sonde kann dann verwendet werden, um die cDNA in einer Bank unter Verwendung eines herkömmlichen Durchmusterungsprotokolls zu identifizieren.
  • Zyklische Sequenzierung auf mit sortierten Polynucleotiden beladenen Mikropartikeln
  • Die Parallelsequenzierung kann auch erfindungsgemäß mit herkömmlichen Sequenzierungsverfahren ausgeführt werden, die die Erzeugung und Trennung von markierten DNA-Fragmenten erforderlich machen. Insbesondere können isolierte Mikropartikel, die mit einer einheitlichen Population von Matrizen beladen sind, verwendet werden, um markierte Verlängerungsprodukte durch zyklische Sequenzierung zu erzeugen. Die zyklische Sequenzierung ist eine gut bekannte Variante des elementaren Ansatzes von Sanger zur DNA-Sequenzierung, die in den folgenden Veröffentlichungen ausführlich beschrieben wird: Craxton, Methods, Bd. 2 (Februar 1991); Wozny, Europäische Patentveröffentlichung 0 409 078 A2 (23. Januar 1991); Fuller, Internationale Anmeldung WO 93/06243; und Fuller, Internationale Anmeldung WO 94/23055. Kurz zusammengefasst wird in einem Standardsequenzierungsreaktionsgemisch eine thermostabile Polymerase verwendet, so daß wiederholte Verlängerungsreaktionen mit der gleichen Matrize ausgefürt werden können. Dies ermöglicht, daß kleine Mengen einer Matrize hinreichende Mengen eines Verlängerungsprodukts zum Nachweis nach der Trennung durch Elektrophorese erzeugen können. Typischerweise umfaßt die zyklische Sequenzierung die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen eines Sequenzierungs reaktionsgemisches mit einer Matrize, einem Primer, Nucleosidtriphosphaten, Kettenterminationsnucleosidtriphosphaten und einer thermostabilen DNA-Polymerase, (b) Denaturieren der Matrize, (c) Anlagern des Primers an die denaturierte Matrize, (d) Verlängern des Primers, um Verlängerungsprodukte zu bilden, und (e) Wiederholen der Schritte (b)–(d), bis sich hinreichende Mengen von Verlängerungsprodukten angereichert haben, so daß sie nach der Trennung nachgewiesen werden können. Wie oft der Zyklus wiederholt wird, hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Menge und Qualität der Ausgangsmatrize, dem verwendeten Nachweissystem, dem verwendeten Trennsystem etc.. Wie herkömmlicherweise ausgeführt, wird der Verlängerungszyklus üblicherweise 10- bis 100-mal wiederholt; die Matrizenmenge reicht von nur wenigen 10 FemtoMol bis mehreren 10 PicoMol, der Denaturierungsschritt wird durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur im Bereich von 92–95°C ausgeführt; der Anlagerungsschritt erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 35–75°C; und der Verlängerungsschritt erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 65–85°C mit einer thermostabilen DNA-Polymerase, wie Taq oder Vent (erhältlich von Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT bzw. New England Biolabs).
  • Markierungskomplemente können auf magnetischen Mikropartikeln hergestellt werden, wie bei Albretsen et al., Anal. Biochem. 189 (1990), 40–50 beschrieben, was Beladungen von mehreren Femtomolen von Markierungskomplementen auf magnetische Kügelchen mit einem Durchmesser von 4,5 μm ermöglicht. Markierungskomplemente können an die Mikropartikel entweder über ihre 5'- oder 3'-Enden gebunden werden. Wenn sie über 5'-Enden gebunden sind, dann können die Matrizen durch spezifische Hybridisierung von Markierungen an ihren 3'-Enden sortiert werden. In dieser Ausführungsform weist die Matrize ein Primerkomplement an ihrem 5'-Ende auf, wie nachstehend gezeigt:
    3'-[Oligonucleotid-Markierung]-[Matrize]-[Primerkomplement]-5'.
  • Das Markierungskomplement wird dann über die Länge der Matrize verlängert, so daß ein Komplement der Matrize erhalten wird, das kovalent an das Mikropartikel gebunden ist. Die Matrize wird durch Erhitzen entfernt und die Mikropartikel werden gewaschen. Nach der Trennung der Mikropartikel, z.B. durch Durchflußsortierung, werden wiederholte Zyklen der Primeranlagerung, Verlängerung und Denaturierung ausgeführt.
  • Wenn Markierungskomplemente an die Mikropartikel über ihre 3'-Enden gebunden sind, was die einfache Synthese direkt auf den Mikropartikeln ermöglicht, ist die Reihenfolge der Oligonucleotid-Markierung und des Primerkomplements umgekehrt, wie nachstehend gezeigt:
    5'-[Oligonucleotid-Markierung]-[Matrize]-[Primerkomplement]-3'.
  • Auch wird das 5'-Ende des Markierungskomplements phosphoryliert, z.B. unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien. Nach der spezifischen Hybridisierung mittels der Oligonucleotid-Markierung wird ein Primer an das Primerkomplement am 3'-Ende der Matrize angelagert und mit einer DNA-Polymerase verlängert, die keine 3'→5'-Exonucleaseaktivität besitzt. Der durch diese Verlängerungsreaktion zurückbleibende Einzelstrangbruch wird dann ligiert und die ursprüngliche Matrize wird durch Erhitzen entfernt. Nach der Trennung der Mikropartikel kann die zyklische Sequenzierung wie vorstehend ausgeführt werden.
  • Die Trennung beladener Mikropartikel kann durch Durchflußsortierung ausgeführt werden, wobei suspendierte Mikropartikel mitgeführt werden, so daß sie nacheinander eine Düse passieren und in einem Flüssigkeitsstrahl fließen, der in eine regelmäßige Abfolge von geladenen Tröpfchen zerteilt wird, die in vorherbestimmte Zielgefäße, Vertiefungen oder andere Reaktionsorte auf einem Substrat geleitet werden. Die Mikropartikel werden geeigneterweise in dem Strahl durch Lichtstreuung nachgewiesen und das Ausmaß der Streuung wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein Tröpfchen kein, ein oder mehrere Mikropartikel enthält. Eine besonders nützliche Vorrichtung für eine solche Durchflußsortierung und zur Abgabe von Sequenzierungsreagens wird bei Brennan, Internationale Anmeldung WO 94/27719 offenbart. Nachdem die einzelnen beladenen Mikropartikel auf mehrere Reaktionsstellen oder Vertiefungen mit den geeigneten Sequenzierungsreagenzien verteilt worden sind, können die gesamten Reaktionsgemische zusammen Temperaturzyklen unterzogen werden, um Verlängerungsprodukte zu erzeugen. Nach Beendigung des Zyklus werden die Verlängerungsprodukte durch Elektrophorese getrennt. Vorzugsweise wird die elektrophoretische Trennung durch Kapillarelektrophorese in einem gelfreien Trennmedium ausgeführt, das die bequeme Beladung und schnelle Trennung der Verlängerungsfragmente ermöglicht. Auch steht eine Vorrichtung zur Verfügung, die den Nachweis durch Vierfarbenfluoreszenz einer großen Zahl von Proben im Wesentlichen gleichzeitig erlaubt, z.B. der von Mathies und Huang, Nature 359 (1992), 167–169; Huang et al., Anal. Chem. 64 (1992), 2149–2154; Huang et al., Anal. Chem. 64 (1992), 967–972; oder ähnlichen offenbarte Typ. Vorzugsweise werden mehrere Tausend zyklische Sequenzierungsreaktionen gleichzeitig ausgeführt. Stärker bevorzugt wer den Gemische von Matrizen auf einer Population von Mikropartikeln mit einem Vorrat an Oligonucleotid-Markierungen zwischen 1000 und 10.000 verschiedenen Typen sortiert.
  • Beispiel 1
  • Synthese einer Oligonucleotid-Klammer mit 3'- und 5'-Cholesterin-Bindungseinheiten
  • Die in Tabelle 1 aufgeführte Reihe von Oligonucleotid-Klammern wurde synthetisiert, die Cholesterin-Einheiten aufweist, die entweder an ein 5'-Ende, ein 3'-Ende oder an sowohl ein 3'-Ende als auch ein 5'-Ende gebunden sind. Das 3'-Cholesterin wurde angebracht, indem zuerst ein Cholesterin-derivatisierter Festphasenträger konstruiert wurde, gefolgt von einer routinemäßigen Oligonucleotid-Kettenverlängerung mit Hilfe von Phosphoramiditmonomeren mit einem herkömmlichen automatischen DNA-Synthetisiergerät (Applied Biosystems Modell 394). Das 5'-Cholesterin wurde im letzten Kupplungsschritt der Synthese durch Umsetzen von Cholesterinchlorformiat mit dem terminalen Nucleotid mit einer 5'-Aminogruppe oder durch Kuppeln eines Cholesterin-Phosphoramidits an eine terminale Hydroxylgruppe angebracht, wobei das erstere Verfahren üblicherweise höhere Ausbeuten ergibt. Eine solche Klammer wird ohne weiters an andere polymere Einheiten angebracht durch Einführung einer freien Amingruppe, z.B. mit Hilfe von AminoModifier II (Clontech), während der Synthese, gefolgt von einer Bromacetylierung und Kupplung über eine Phosphorothioatgruppe, wie vorstehend diskutiert.
    • (1) Ein Polymer-getragenes Oligonucleotid, 1 μMol-Maßstab, mit einer terminalen 5'-Aminogruppe wurde mit 2 ml einer 10%igen Lösung von Cholesterylformiat in Chloroform/Diisopropylethylamin (9:1, Vol.:Vol.) für 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Der Polymerträger wurde dann mit Chloroform und Acetonitril gewaschen und abgespalten, Schutzgruppen wurden mit konzentriertem Ammonium entfernt (5 Stunden bei 55°C) und das Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
    • (2) Ein Polymer-getragenes Oligonucleotid, 1 μMol-Maßstab, mit einer terminalen Hydroxylgruppe wurde mit 250 μl einer 0,1 M Lösung von Cholesterin-Phosphoramidit in Chloroform und 250 μl einer 0,45 M Lösung von Tetrazol in Acetonitril für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Der Polymerträger wurde dann mit Acetonitril gewaschen und abgespalten, Schutzgruppen wurden mit konzentriertem Ammonium (5 Stunden bei 55°C) entfernt und das Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
  • Die in Tabelle I aufgeführten Oligonucleotide und Oligonucleotid-Klammern wurden entworfen, so daß sie spezifisch an die folgenden einzelsträngigen oder doppelsträngigen Ziel-Polynucleotide binden:
  • Figure 00450001
  • Tabelle V
    Figure 00450002
    • * "Chol" bedeutet Cholesterin und CMe bedeutet 5-methyliertes Cytidin.
  • Die Schmelztemperatur der folgenden Verbindungen wurde durch Berechnen des halben Maximums der 260 nm-Absorption im Vergleich zur Temperaturkurve bestimmt, wie vorstehend beschrieben: DL015: 39,0°C; DL014: 58°C; DL013: 68,0°C; DL021: 67,5°C; DL022: 67,5°C; und Kontrolle (zwei nicht verbundene Oligonucleotide ohne Bindungsein heiten mit den Sequenzen: 3'-TTTTCTTTTCCCCCCT-5' und 5'-TTTTCMeTTTT(CMe)6-3'): 32,0°C.
  • Beispiel 2
  • Synthese einer Oligonucleotid-Klammer mit Cholesterin-Bindungseinheiten, einem Polyethyllenglykol-Gelenkbereich und einem freien Amin
  • Die folgende Oligonucleotid-Klammer mit einem Nicht-Nucleosid-Gelenkbereich wird synthetisiert, wie vorstehend beschrieben. Im Gelenkbereich werden geschützte Polyethylglykol-Phosphoramidite, offenbart bei Durand et al., Nucleic Acids Research 18 (1990), 6353–6359; und Rumney und Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31 (1992), 1617, zusammen mit AminoModifier II von Clontech (Palo Alto, CA) verwendet:
    Figure 00460001
    worin "p" das Vorhandensein einer Phosphodiesterbindung anzeigt.
  • Beispiel 3
  • Synthese einer Oligonucleotid-Klammer, die ein Oligonucleotid trägt, das an den Gelenkbereich gebunden ist
  • Die Oligonucleotid-Klammer von Beispiel 2 wird mit dem freien primären Amin in deren Gelenkbereich synthetisiert. Das Amin wird mit Bromacetyl derivatisiert, wie vorstehend beschrieben. Getrennt davon wird gegebenenfalls ein Oligonucleotid mit entweder einer 3'- oder 5'-Monophosphorothioatgruppe hergestellt. Das Oligonucleotid kann an seinem Syntheseträger gebunden bleiben. Die bromacetylierte Klammer und das Oligonucleotid werden in einer wäßrigen Lösung kombiniert und eingefroren, wie vorstehend beschrieben.
  • Beispiel 4
  • Sortierung einer Vielzahl von pUC19 abstammenden Ziel-Polynucleotiden mit Markierungen mit oligomeren Untereinheiten
  • Ein Gemisch von drei Ziel-Polynucleotid-Markierung-Konjugaten wird wie folgt erhalten: Zuerst werden die folgenden sechs Oligonucleotide synthetisiert und paarweise kombiniert, um Markierung 1, Markierung 2 und Markierung 3 zu bilden:
    Figure 00470001
    Markierung 1
    Figure 00470002
    Markierung 2
    Figure 00470003
    Markierung 3 worin "p" eine Monophosphatgruppe anzeigt, die wi's die in Tabelle I definierten Untereinheiten darstellen und die Ausdrücke "(**)" ihre jeweiligen Komplemente darstellen. Ein pUC19-Vektor wird mit SalI und HindIII gespalten, das große Fragment wird gereinigt und getrennt mit den Markierungen 1, 2 und 3 ligiert, um pUC19-1, pUC19-2 bzw. pUC19-3 zu bilden. Die drei Rekombinanten werden getrennt amplifiziert und isoliert, danach wird pUC19-1 mit HindIII und AatI gespalten, pUC19-2 wird mit HindIII und SspI gespalten und pUC19-3 wird mit HindIII und XmnI gespalten. Die kleinen Fragmente werden unter Verwendung von herkömmlichen Protokollen isoliert, um drei doppelsträngige Fragmente mit einer Länge von etwa 250, 375 bzw. 575 Basenpaaren zu erhalten, und jedes weist einen recessiven 3'-Strang neben der Markierung und einen glatten oder 3'-überhängenden Strang am entgegensetzten Ende auf. Etwa 12 nMol eines jeden Fragments werden mit 5 Einheiten T4- DNA-Polymerase in dem vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffer, enthaltend 33 μM Desoxycytosintriphosphat, gemischt. Man inkubiert das Reaktionsgemisch bei 37°C für 30 Minuten, danach wird die Reaktion gestoppt, indem das Gemisch auf Eis gestellt wird. Die Fragmente werden dann durch herkömmliche Mittel gereinigt.
  • CPG-Mikropartikel (37–74 mm-Partikelgröße, 500 Angström-Porengröße, Pierce Chemical) werden mit dem von Maskos und Southern, Nucleic Acids Research 20 (1992), 1679–1684 beschriebenen Linker derivatisiert. Nach Auftrennung in drei Aliquote werden die Komplemente der Markierungen 1, 2 und 3 auf den Mikropartikeln unter Verwendung eines herkömmlichen automatischen DNA-Synthetisiergeräts, z.B. ein Modell 392-DNA-Synthetisiergerät (Applied Biosystems, Foster City, CA), synthetisiert. Etwa 1 mg eines jeden der unterschiedlich derivatisierten Mikropartikel wird in verschiedene Gefäße eingebracht.
  • Die aus pUC19-1, -2 und -3 ausgeschnittenen, T4-DNA-Polymerase-behandelten Fragmente werden in 50 μl des vom Hersteller empfohlenen Puffers für Taq-DNA-Ligase (New England Biolabs) resuspendiert. Das Gemisch wird dann zwischen den drei Gefäßen, enthaltend 1 mg eines jeden der derivatisierten CPG-Mikropartikel, gleichmäßig aufgeteilt. 5 Einheiten Taq-DNA-Ligase werden zu jedem Gefäß zugegeben, danach werden sie bei 55°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt, indem das Gemisch auf Eis gestellt wird, und die Mikropartikel werden mehrmals durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension in TE gewaschen. Schließlich werden die Mikropartikel in NdeI-Reaktionspuffer (New England Biolabs) resuspendiert, wo die gebundenen Polynucleotide abgespalten werden. Nach der Trennung von den Mikropartikeln werden die durch den NdeI-Verdau freigesetzten Polynucleotidfragmente durch Inkubieren mit Sequenase-DNA-Polymerase und Fluorescein-markiertem Thymidintriphosphat (Applied Biosystems, Foster City, CA) fluoreszenzmarkiert. Die Fragmente werden dann getrennt auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 373-DNA-Synthetisiergeräts analysiert.
  • Beispiel 5
  • Sortierung einer Vielzahl von pUC19 abstammenden Ziel-Polynucleotiden mit Markierungskomplementen bestehend aus Oligonucleotid-3'N→5'P-Phosphoramidaten
  • Ein Gemisch von drei Ziel-Polynucleotid-Markierung-Konjugaten wird wie folgt erhalten: Zuerst werden die folgenden sechs Oligonucleotide synthetisiert und paarweise kombiniert, um Markierung 1, Markierung 2 und Markierung 3 zu bilden.
    Figure 00490001
    Markierung 1
    Figure 00490002
    Markierung 2
  • Figure 00490003
    Markierung 3
  • Drei 20-Mer-Oligonucleotid-3'N→5'P-Phosphoramidat-Markierungskomplemente werden auf CPG-Mikropartikel getrennt synthetisiert, wie vorstehend beschrieben, wobei die Markierungskomplemente die folgenden Sequenzen (in 3'→5'-Orientierung) aufweisen: CTAACTAAACTAACTATACA, CATTTTTCATCTAAACTCAT und ACTAACTATACATACACATT. Die Polynucleotid-Markierung-Konjugate werden hergestellt und sortiert, wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Beispiel 6
  • Parallelsequenzierung von SV40-Fragmenten
  • Ein Vorrat an 36-Mer-Markierungen, bestehend aus neun 4-Nucleotid-Untereinheiten, ausgewählt aus Tabelle I, wird hergestellt durch getrenntes Synthetisieren von Markierungen und Markierungskomplementen durch einen Aufteilungs- und Mischansatz, wie vorstehend beschrieben. Der Vorrat wird synthetisiert, um die Ligierung in einen SmaI/HindIII-gespaltenen M13mp19-Vektor zu erlauben. Auf diese Weise beginnt wie in Beispiel 1 ein Satz von Oligonucleotiden mit der Addition von A, gefolgt von neun Runden einer Aufteilungs- und Mischsynthese, wobei das Oligonucleotid untereinheitenweise durch 3'-Phosphoramidit-derivatisierte 4-Mere, die den Untereinheiten von Tabelle I entsprechen, verlängert wird. Die Synthese wird dann durch die nucleotidweise Addition von einer Hälfte der SmaI-Erkennungsstelle (GGG), zwei C's und einem 5'-Monophosphat, z.B. mit Hilfe des von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) erhältlichen Phosphat-ON-Reagens, beendet. Der andere Satz von Oligonucleotiden beginnt mit der Addition von drei C's (Teil der SmaI-Erkennungsstelle) und zwei G's, gefolgt von neun Runden einer Aufteilungs- und Mischsynthese, wobei das Oligonucleotid durch 3'-Phosphoramidit-derivatisierte 4-Mere entsprechend den Komplementen der Untereinheiten von Tabelle I verlängert wird. Die Synthese wird durch die nucleotidweise Addition der HindIII-Erkennungsstelle und eines 5'-Monophosphats beendet. Nach der Trennung von den Syntheseträgern werden die Oligonucleotide unter Bedingungen gemischt, die die Bildung der folgenden Doppelstränge zulassen:
  • Figure 00500001
  • Das Gemisch von Doppelsträngen wird dann in einen SmaI/HindIII-gespaltenen M13mp19-Vektor ligiert. Ein Vorrat an Markierungskomplementen wird auf CPG-Mikropartikeln synthetisiert, wie vorstehend beschrieben.
  • Anschließend wird der folgende Adapter hergestellt, der eine FokI-Stelle und Teile von EcoRI- und SmaI-Stellen enthält:
  • Figure 00510001
  • Der Adapter wird in den vorstehend beschriebenen, EcoRI/SmaI-gespaltenen M13-Vektor ligiert.
  • Getrennt davon wird SV40-DNA mittels Ultraschall-Behandlung gemäß dem bei Sambrook et al. (a.a.O.) angegebenen Protokoll fragmentiert. Die so erhaltenen Fragmente werden unter Verwendung von Standardprotokollen wiederhergestellt und nach Größen getrennt. Fragmente im Bereich von 300–500 Basenpaaren werden ausgewählt und in den vorstehend beschriebenen, SmaI-gespaltenen M13-Vektor ligiert, um eine Bank von Fragment-Markierung-Konjugaten zu bilden, die dann amplifiziert wird. Eine mehrere Tausend verschiedene Fragment-Markierung-Konjugate enthaltende Probe wird aus der Bank entnommen, weiter amplifiziert und die Fragment-Markierung-Insertionen werden durch Verdau mit EcoRI und HindIII ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Fragment-Markierung-Konjugate werden mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxycytidintriphosphat behandelt, wie in Beispiel 1 beschrieben, um die Oligonucleotid-Markierungen für eine spezifische Hybridisierung den CPG-Mikropartikeln zu exponieren.
  • Nach der Hybridisierung und Ligierung, wie in Beispiel I beschrieben, werden die beladenen Mikropartikel mit FokI behandelt, um einen 4-Nucleotid-überhängenden Strang einer vorherbestimmten Sequenz herzustellen. Ein 10:1-Gemisch (Sonde 1:Sonde 2) der folgenden Sonden wird mit den Polynucleotiden auf den Mikropartikeln ligiert:
  • Figure 00510002
  • FAM bedeutet einen Fluorescein-Farbstoff gebunden an die 5'-Hydroxylgruppe des oberen Strangs von Sonde 1 über einen von Applied Biosystems erhältlichen Aminophosphat-Linker (Aminolinker). Das Biotin kann auch über eine Aminolinker-Einheit gebunden sein und kann gegebenenfalls mit Hilfe von Polyethylenoxid-Linkern weiter verlängert werden, z.B. Jaschke et al. (a.a.O.).
  • Die beladenen Mikropartikel werden dann auf der Oberfläche eines mit Avidin bedeckten Glasobjektträgers verteilt, an den Reagenzien und Waschlösungen abgegeben bzw. von dem sie entfernt werden können. Der mit Avidin bedeckte Objektträger mit den gebundenen Mikropartikeln wird mit einem Scanningsfluoreszenzmikroskop (z.B. Zeiss Axioskop, ausgestattet mit einem Newport Modell PM500-C-Bewegungssteuergerät, einem Spectra-Physics Modell 2020-Argon-Ionenlaser, der einen 488 nm-Anregungsstrahl erzeugt, und einem 520 nm-Langpaß-Emissionsfilter oder eine ähnliche Vorrichtung) untersucht. Der Anregungsstrahl und die Fluoreszenzemissionen werden durch die gleichen Objektivlinsen übertragen bzw. gesammelt. Der Anregungsstrahl und die gesammelte Fluoreszenz werden durch einen dichromatischen Spiegel getrennt, der die gesammelte Fluoreszenz über eine Reihe von Bandfiltern und zu Photonenzählvorrichtungen, die den überwachten Fluorophoren entsprechen, leitet, z.B. umfassend Hamamatsu Modell 9403-03-Photomultiplier, einen Stanford Research Systems Modell SR445-Amplifier und ein Modell SR430-Mehrkanalzählgerät und einen Digitalrechner, z.B. einen 486-Computer. Der Computer erzeugt eine zweidimensionale Karte des Objektträgers, die die Positionen der Mikropartikel erfasst.
  • Nach Spaltung mit FokI, um die erste Sonde zu entfernen, durchlaufen die Polynucleotide auf den gebundenen Mikropartikeln 20 Sondenligierungs-, Wasch-, Nachweis-, Spaltungs- und Waschzyklen gemäß der bevorzugten, nachstehend beschriebenen Eine-Base-Sequenzierungs-Methode. Bei jedem Nachweisschritt zeichnet das Sondierungssystem die Fluoreszenzemission auf, die der auf jedem Mikropartikel identifizierten Base entspricht. Die nachstehenden Reaktionen und Waschschritte werden mit vom Hersteller (New England Biolabs) empfohlenen Puffern für die verwendeten Enzyme ausgeführt, wenn nicht anders angegeben. Standardpuffer werden auch bei Sambrook et al. (a.a.O.) beschrieben.
  • Die folgenden vier Sätze von gemischten Sonden werden zur Addition an die Ziel-Polynucleotide bereitgestellt:
    Figure 00530001
    worin TAMRA, FAM, ROX und JOE im Spektralbereich auflösbare fluoreszierende Markierungen gebunden durch Aminolinker II sind (alle sind von Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien, erhältlich); die fett gedruckten Nucleotide die Erkennungsstelle für die FokI-Endonuclease sind und "N" eines der vier Nucleotide A, C, G, T darstellt. TAMRA (Tetramethylrhodamin), FAM (Fluorescein), ROX (Rhodamin X) und JOE (2',T-Dimethoxy-4',5'-dichlorfluorescein) und ihre Bindung an Oligonucleotide wird auch bei Fung et al., US-Patent 4,855,225 beschrieben.
  • Die vorstehenden Sonden werden bei einem etwa 5 molaren Überschuß der Ziel-Polynucleotidenden wie folgt inkubiert: Die Sonden werden für 60 Minuten bei 16°C mit 200 Einheiten T4-DNA-Ligase und dem verankerten Ziel-Polynucleotid in T4-DNA-Ligase-Puffer inkubiert, nach dem Waschen wird das Ziel-Polynucleotid dann mit 100 Einheiten T4-Polynucleotidkinase in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, gewaschen und wieder für 30 Minuten bei 16°C mit 200 Einheiten T4-DNA-Ligase und dem verankerten Ziel-Polynucleotid in T4-DNA-Ligase-Puffer inkubiert. Der Waschschritt wird ausgeführt, indem man aufeinanderfolgend Volumina des Waschpuffers über den Objektträger fließen läßt, z.B. TE, beschrieben von Sambrook et al. (a.a.O.). Nach dem Ligierungs-Phosphorylierungs-Ligierungs-Zyklus und einem letzten Waschschritt werden die gebundenen Mikropartikel auf das Vorhandensein eines Fluoreszenzmarkers sondiert, dessen Positionen und Eigenschaften durch das Sondierungssystem aufgezeichnet werden. Das markierte Ziel-Polynucleotid, d.h. der ligierte Komplex, wird dann mit 10 Einheiten FokI in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von einem Waschschritt in TE. Als Ergebnis wird das Ziel-Polynucleotid um ein Nucleotid in jedem Strang verkürzt und ist für den nächsten Ligierungs- und Spaltungszyklus bereit. Das Verfahren wird fortgesetzt, bis 20 Nucleotide identifiziert sind.

Claims (10)

  1. Stoffzusammensetzung, umfassend: (a) einen Festphasenträger, der einen oder mehrere räumlich-separate Bereiche hat; und (b) eine einheitliche Population von Markierungskomplementen, die in zumindest einem des einen oder der mehreren räumlich separaten Bereiche kovalent mit dem Festphasenträger verbunden ist, wobei die Markierungskomplemente aus einem Vorrat ausgewählt werden, der aus einem minimal kreuzhybridisierenden Satz von Oligonucleotid-N3'?P5'-Phosphoramidaten oder Peptidnucleinsäuren besteht, die eine Länge im Bereich von 10 bis 60 Nucleotiden oder Basen haben, wobei jedes Markierungskomplement aus dem Vorrat eine Vielzahl von Untereinheiten umfasst und jede Untereinheit dieser Vielzahl aus einem Oligonucleotid-N3'?P5'-Phosphoramidat oder einer Peptidnucleinsäure besteht, das/die eine Länge von drei bis sechs Nucleotiden oder Basen hat, wobei die Untereinheiten aus einem minimal kreuz-hybridisierenden Satz ausgewählt werden.
  2. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Festphasenträger ein Mikropartikel ist, der einen einzelnen räumlich separaten Bereich hat.
  3. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Mikropartikel aus einem Material aus der Gruppe bestehend aus Glas, Polystyrol, Nylon, Cellulose, Dextran, Latex, Polyacrolein, Glycidalmethacrylat, und Acrylcopolymer gemacht ist.
  4. Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Festphasenträger ein einzelner Träger mit einer Anordnung der räumlich separaten Bereiche ist, wobei jeder der Bereiche eine Fläche im Bereich von 3 bis 500 μm2 hat.
  5. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Anordnung mehr als 10 000 der räumlich separaten Bereiche hat.
  6. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, wobei jeder der räumlich-separaten Bereiche eine Fläche im Bereich von 3 bis 5 μm2 hat.
  7. Kit zum Sortieren von Polynucleotiden aus einem Gemisch von Polynucleotiden, wobei jedes Polynucleotid aus dem Gemisch eine Oligonucleotidmarkierung enthält, das Kit enthaltend: (a) einen oder mehrere Festphasenträger, von denen jeder einen oder mehrere räumlich separate Bereiche hat; und (b) eine einheitliche Population von Markierungskomplementen, die in zumindest einem des einen oder der mehreren räumlich separaten Bereiche kovalent mit dem Festphasenträger verbunden ist, wobei die Markierungskomplemente aus einem Vorrat ausgewählt werden, der aus einem minimal kreuzhybridisierenden Satz von Oligonucleotid-N3'?P5'-Phosphoramidaten oder Peptidnucleinsäuren besteht, die eine Länge im Bereich von 10 bis 60 Nucleotiden oder Basen haben, wobei jedes Markierungskomplement aus dem Vorrat eine Vielzahl von Untereinheiten umfasst und jede Untereinheit dieser Vielzahl aus einem Oligonucleotid-N3'?P5'-Phosphoramidat oder einer Peptidnucleinsäure besteht, das/die eine Länge von drei bis sechs Nucleotiden oder Basen hat, wobei die Untereinheiten aus einem minimal kreuzhybridisierenden Satz ausgewählt werden.
  8. Kit nach Anspruch 7, wobei der eine oder die mehreren Festphasenträger eine Population von Mikropartikeln ist.
  9. Kit nach Anspruch 7 oder 8, wobei der eine oder die mehreren Festphasenträger ein einzelner Träger ist, der eine Anordnung der räumlich separaten Bereiche hat.
  10. Kit nach Anspruch 9, wobei jeder der räumlich separaten Bereiche eine Fläche im Bereich von 3 bis 500 μm2 hat.
DE69534389T 1994-10-13 1995-10-12 Mit PNA- und Amidat-Etiketten bestückte Festphasenträger Expired - Lifetime DE69534389T2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32234894A 1994-10-13 1994-10-13
US322348 1994-10-13
US08/359,295 US5695934A (en) 1994-10-13 1994-12-19 Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US359295 1994-12-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69534389D1 DE69534389D1 (de) 2005-09-22
DE69534389T2 true DE69534389T2 (de) 2006-06-29

Family

ID=26983371

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69513997T Expired - Lifetime DE69513997T2 (de) 1994-10-13 1995-10-12 Massive parallelsequenzierung an sortierten polynucleotiden
DE69534389T Expired - Lifetime DE69534389T2 (de) 1994-10-13 1995-10-12 Mit PNA- und Amidat-Etiketten bestückte Festphasenträger

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69513997T Expired - Lifetime DE69513997T2 (de) 1994-10-13 1995-10-12 Massive parallelsequenzierung an sortierten polynucleotiden

Country Status (5)

Country Link
US (3) US5695934A (de)
EP (2) EP0952216B8 (de)
AU (1) AU3946195A (de)
DE (2) DE69513997T2 (de)
WO (1) WO1996012039A1 (de)

Families Citing this family (421)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
DE69132843T2 (de) * 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
USRE43097E1 (en) * 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
HUP9900910A2 (hu) * 1995-06-07 1999-07-28 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonukleotid jelzések osztályozáshoz és azonosításhoz
ATE466109T1 (de) * 1995-06-07 2010-05-15 Solexa Inc Verfahren zur verbesserung der effizienz der polynukleotidsequenzierung
US5780231A (en) * 1995-11-17 1998-07-14 Lynx Therapeutics, Inc. DNA extension and analysis with rolling primers
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US6613508B1 (en) * 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US20020150921A1 (en) * 1996-02-09 2002-10-17 Francis Barany Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP0912761A4 (de) * 1996-05-29 2004-06-09 Cornell Res Foundation Inc Bestimmung von unterschieden in der nukleisäuresequenz mittels einer kombination von ligasebestimmung und polymerase-kettenreaktion
GB9618544D0 (en) * 1996-09-05 1996-10-16 Brax Genomics Ltd Characterising DNA
US7094609B2 (en) 1996-09-20 2006-08-22 Burstein Technologies, Inc. Spatially addressable combinatorial chemical arrays in encoded optical disk format
WO1998015644A2 (en) * 1996-09-27 1998-04-16 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
GB9620769D0 (en) * 1996-10-04 1996-11-20 Brax Genomics Ltd Nucleic acid sequencing
US5858671A (en) * 1996-11-01 1999-01-12 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
US6258533B1 (en) * 1996-11-01 2001-07-10 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
US6060240A (en) * 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
DE69825601T2 (de) 1997-02-12 2005-04-28 Chan, Eugene Y, Brookline Verfahren zur analyse von polymeren
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) * 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
AU736321B2 (en) 1997-05-23 2001-07-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
AU739963B2 (en) 1997-06-27 2001-10-25 Lynx Therapeutics, Inc. Method of mapping restriction sites in polynucleotides
US6833242B2 (en) * 1997-09-23 2004-12-21 California Institute Of Technology Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size
US6607878B2 (en) * 1997-10-06 2003-08-19 Stratagene Collections of uniquely tagged molecules
US6265163B1 (en) * 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
EP2045334A1 (de) 1998-06-24 2009-04-08 Illumina, Inc. Dekodierung von Arraysensoren mit Mikrosphären
US6489096B1 (en) * 1998-10-15 2002-12-03 Princeton University Quantitative analysis of hybridization patterns and intensities in oligonucleotide arrays
US6607888B2 (en) 1998-10-20 2003-08-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for analyzing nucleic acid reactions
US6221592B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Wisconsin Alumi Research Foundation Computer-based methods and systems for sequencing of individual nucleic acid molecules
NO986133D0 (no) 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
US6429027B1 (en) 1998-12-28 2002-08-06 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres
US7510841B2 (en) 1998-12-28 2009-03-31 Illumina, Inc. Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
US8131053B2 (en) 1999-01-25 2012-03-06 Amnis Corporation Detection of circulating tumor cells using imaging flow cytometry
US7450229B2 (en) * 1999-01-25 2008-11-11 Amnis Corporation Methods for analyzing inter-cellular phenomena
US7057732B2 (en) * 1999-01-25 2006-06-06 Amnis Corporation Imaging platform for nanoparticle detection applied to SPR biomolecular interaction analysis
US6671044B2 (en) 1999-01-25 2003-12-30 Amnis Corporation Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells in broad flat flow
US8885913B2 (en) 1999-01-25 2014-11-11 Amnis Corporation Detection of circulating tumor cells using imaging flow cytometry
US6975400B2 (en) * 1999-01-25 2005-12-13 Amnis Corporation Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells
US6707551B2 (en) * 2000-01-24 2004-03-16 Amnis Corporation Multipass cavity for illumination and excitation of moving objects
US6608682B2 (en) 1999-01-25 2003-08-19 Amnis Corporation Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells
US8406498B2 (en) 1999-01-25 2013-03-26 Amnis Corporation Blood and cell analysis using an imaging flow cytometer
US8005314B2 (en) 2005-12-09 2011-08-23 Amnis Corporation Extended depth of field imaging for high speed object analysis
WO2000050632A2 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Lynx Therapeutics, Inc. Polymorphic dna fragments and uses thereof
US7014994B1 (en) 1999-03-19 2006-03-21 Cornell Research Foundation,Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process
US6506594B1 (en) * 1999-03-19 2003-01-14 Cornell Res Foundation Inc Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP1165839A2 (de) * 1999-03-26 2002-01-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Universal arrays
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) * 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
WO2001016352A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Phylos, Inc. Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins
US20010031467A1 (en) * 1999-12-10 2001-10-18 Johannes Dapprich Method for selectively isolating a nucleic acid
KR20020070328A (ko) * 1999-12-21 2002-09-05 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드 핵산의 검출법
US20030186256A1 (en) * 1999-12-23 2003-10-02 Achim Fischer Method for carrying out the parallel sequencing of a nucleic acid mixture on a surface
AU2001236491A1 (en) * 2000-01-18 2003-09-16 Quantom Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US20020039728A1 (en) * 2000-02-10 2002-04-04 Robert Kain Alternative substrates and formats for bead-based array of arrays
US6770441B2 (en) * 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
US6783985B1 (en) 2000-02-18 2004-08-31 Elitra Pharmaceuticals Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
US6468749B1 (en) 2000-03-30 2002-10-22 Quark Biotech, Inc. Sequence-dependent gene sorting techniques
US7157564B1 (en) 2000-04-06 2007-01-02 Affymetrix, Inc. Tag nucleic acids and probe arrays
JP5508654B2 (ja) 2000-04-14 2014-06-04 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド リガーゼ検出反応を用いた核酸配列の違いの検出のための位置特定可能なアレイの設計方法
US6778263B2 (en) * 2000-08-25 2004-08-17 Amnis Corporation Methods of calibrating an imaging system using calibration beads
US6583865B2 (en) 2000-08-25 2003-06-24 Amnis Corporation Alternative detector configuration and mode of operation of a time delay integration particle analyzer
US6934408B2 (en) * 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
US6875973B2 (en) * 2000-08-25 2005-04-05 Amnis Corporation Auto focus for a flow imaging system
AU2001292959A1 (en) * 2000-09-22 2002-04-02 Clontech Laboratories, Inc. Highly sensitive proteomic analysis methods and kits and systems for practicing the same
EP1330650B1 (de) * 2000-10-12 2011-12-28 Amnis Corporation Verfahren zum lesen von mit reportermolekülen markierten beads
WO2002031583A1 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Amnis Corporation System and method for high numeric aperture imaging systems
US7378280B2 (en) * 2000-11-16 2008-05-27 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
WO2002044425A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20030180953A1 (en) * 2000-12-29 2003-09-25 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
US6958217B2 (en) * 2001-01-24 2005-10-25 Genomic Expression Aps Single-stranded polynucleotide tags
US7226737B2 (en) 2001-01-25 2007-06-05 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
EP1364065B1 (de) * 2001-01-25 2012-02-22 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Polynukleotide zur verwendung als tags und tag komplemente, herstellung und verwendung derselben
US20040266021A9 (en) * 2001-01-26 2004-12-30 Andras Guttman Multicapillary fraction collection system and method
CA2445960A1 (en) * 2001-02-21 2002-12-19 Amnis Corporation Method and apparatus for labeling and analyzing cellular components
US7297518B2 (en) * 2001-03-12 2007-11-20 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension
US6960437B2 (en) * 2001-04-06 2005-11-01 California Institute Of Technology Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices
US20030119013A1 (en) * 2001-04-23 2003-06-26 Bo Jiang Identification of essential genes of Aspergillus fumigatus and methods of use
CA2445044C (en) * 2001-04-25 2011-02-15 Amnis Corporation Method and apparatus for correcting crosstalk and spatial resolution for multichannel imaging
US20070184436A1 (en) * 2001-06-07 2007-08-09 Joel Myerson Generic capture probe arrays
US20060234231A1 (en) * 2001-06-20 2006-10-19 Nuevolution A/S Microarrays displaying encoded molecules
US7727713B2 (en) 2001-06-20 2010-06-01 Nuevolution A/S Templated molecules and methods for using such molecules
US7668697B2 (en) 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US7190832B2 (en) 2001-07-17 2007-03-13 Amnis Corporation Computational methods for the segmentation of images of objects from background in a flow imaging instrument
US7118910B2 (en) 2001-11-30 2006-10-10 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US20030170700A1 (en) * 2002-01-09 2003-09-11 Lynx Therapeutics, Inc. Secreted and cell surface polypeptides affected by cholesterol and uses thereof
US20030166026A1 (en) * 2002-01-09 2003-09-04 Lynx Therapeutics, Inc. Identification of specific biomarkers for breast cancer cells
US20030180764A1 (en) * 2002-01-09 2003-09-25 Lynx Therapeutics, Inc. Genes affected by cholesterol treatment and during adipogenesis
CA2478985A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-25 Syngenta Participations Ag Nucleic acid detection method
NZ535144A (en) 2002-03-15 2006-03-31 Nuevolution As An improved method for synthesising templated molecules
JP2005521425A (ja) * 2002-04-01 2005-07-21 フルイディグム コーポレイション 微小流体粒子分析システム
US7312085B2 (en) * 2002-04-01 2007-12-25 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
AU2003249681A1 (en) 2002-05-31 2003-12-19 Diversa Corporation Multiplexed systems for nucleic acid sequencing
EP1523554A2 (de) * 2002-06-12 2005-04-20 Riken Verfahren zur nutzung von 5' enden transkribierter nukleinsäureregionen für die klonierung oder zur analyse
JP2005531001A (ja) * 2002-06-24 2005-10-13 フルイディグム コーポレイション 再循環流体ネットワークおよびその使用法
DE10231684A1 (de) * 2002-07-12 2004-02-12 Micronas Holding Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Zahl von Rezeptoren auf einem Träger sowie Biosensor herstellbar nach diesem Verfahren
EP1539980B1 (de) 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S MEHRSTUFENSYNTHESE VON MIT MATRIZEN ASSOZIIERTE MOLEKüLEN
US7143785B2 (en) * 2002-09-25 2006-12-05 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
US8791053B2 (en) * 2002-09-27 2014-07-29 Mpm-Holding Aps Spatially encoded polymer matrix
EP1546412B1 (de) 2002-10-02 2014-05-21 California Institute Of Technology MIKROFLUIDISCHE NUKLEINSûUREANALYSE
DK3299463T3 (da) 2002-10-30 2020-12-07 Nuevolution As Enzymatisk kodning
US20040086892A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Universal tag assay
US9121110B2 (en) 2002-12-19 2015-09-01 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
WO2004065000A1 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Illumina Inc. Chemical reaction monitor
WO2005003375A2 (en) * 2003-01-29 2005-01-13 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US7575865B2 (en) * 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
EP1597395A2 (de) 2003-02-21 2005-11-23 Nuevolution A/S Methode zur herstellung einer bibliothek der zweiten generation
US20060269920A1 (en) * 2003-02-21 2006-11-30 Nuevolution A/S Method for obtaining structural information about an encoded molecule
US10533998B2 (en) 2008-07-18 2020-01-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
US7195875B2 (en) * 2003-04-18 2007-03-27 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide pairs for multiplexed binding assays
US20050170367A1 (en) * 2003-06-10 2005-08-04 Quake Stephen R. Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids
ATE447626T1 (de) 2003-09-18 2009-11-15 Nuevolution As Methode zur gewinnung struktureller informationen kodierter moleküle und zur selektion von verbindungen
US20050094807A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-05 John Silzel Accuracy array assay system and method
ATE456678T1 (de) * 2003-11-10 2010-02-15 Geneohm Sciences Inc Nukleinsäurenachweisverfahren mit erhöhter empfindlichkeit
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20060172408A1 (en) * 2003-12-01 2006-08-03 Quake Steven R Device for immobilizing chemical and biochemical species and methods of using same
WO2005080604A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Compass Genetics, Llc Genetic analysis by sequence-specific sorting
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US8953866B2 (en) 2004-03-16 2015-02-10 Amnis Corporation Method for imaging and differential analysis of cells
ATE538138T1 (de) 2004-03-16 2012-01-15 Amnis Corp Auf bildlicher darstellung beruhende quantifizierung molekularer translokation
US8103080B2 (en) 2004-03-16 2012-01-24 Amnis Corporation Method for imaging and differential analysis of cells
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US20050239085A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Buzby Philip R Methods for nucleic acid sequence determination
US20050260609A1 (en) * 2004-05-24 2005-11-24 Lapidus Stanley N Methods and devices for sequencing nucleic acids
US20070117104A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US7476734B2 (en) * 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US20070117103A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20060030037A1 (en) 2004-05-28 2006-02-09 Victor Joseph Thermo-controllable high-density chips for multiplex analyses
US20060019304A1 (en) * 2004-07-26 2006-01-26 Paul Hardenbol Simultaneous analysis of multiple genomes
US20060024678A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US20060040300A1 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Generation Biotech, Llc Method for nucleic acid isolation and amplification
US7170050B2 (en) * 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
US7476503B2 (en) * 2004-09-17 2009-01-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for performing nucleic acid analysis
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US20060118754A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-08 Lapen Daniel C Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
US7220549B2 (en) * 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20060172328A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-03 Buzby Philip R Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction
US9002652B1 (en) 2005-01-27 2015-04-07 Institute For Systems Biology Methods for identifying and using organ-specific proteins in blood
US7482120B2 (en) * 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
JP2008528040A (ja) 2005-02-01 2008-07-31 アジェンコート バイオサイエンス コーポレイション ビーズベースの配列決定のための試薬、方法およびライブラリー
US7393665B2 (en) * 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US7407757B2 (en) * 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US20060204971A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Varde Shobha A Oligonucleotides for multiplexed binding assays
US20060211030A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Sydney Brenner Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
US20060246576A1 (en) * 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
US20060263790A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Timothy Harris Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7805081B2 (en) * 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US20070117102A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
ATE490318T1 (de) * 2005-12-01 2010-12-15 Nuevolution As Enzymvermittelnde kodierungsmethoden für eine effiziente synthese von grossen bibliotheken
US20070128610A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Buzby Philip R Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing
EP2364774A3 (de) 2006-01-11 2014-06-04 Raindance Technologies, Inc. Mikrofluidische Vorrichtungen Und Verfahren Zur Verwendung Bei Der Bildung Und Kontrolle Von Nanoreaktoren
WO2007087312A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Molecular counting
US20070172839A1 (en) * 2006-01-24 2007-07-26 Smith Douglas R Asymmetrical adapters and methods of use thereof
DK2385143T3 (en) * 2006-02-02 2016-09-19 Univ Leland Stanford Junior Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
US7995202B2 (en) 2006-02-13 2011-08-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources
US7715001B2 (en) 2006-02-13 2010-05-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources
US7692783B2 (en) * 2006-02-13 2010-04-06 Pacific Biosciences Of California Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources
US20070224613A1 (en) * 2006-02-18 2007-09-27 Strathmann Michael P Massively Multiplexed Sequencing
US7815868B1 (en) * 2006-02-28 2010-10-19 Fluidigm Corporation Microfluidic reaction apparatus for high throughput screening
US20080309926A1 (en) * 2006-03-08 2008-12-18 Aaron Weber Systems and methods for reducing detected intensity non uniformity in a laser beam
US7397546B2 (en) * 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam
US20090062129A1 (en) * 2006-04-19 2009-03-05 Agencourt Personal Genomics, Inc. Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US20080014589A1 (en) 2006-05-11 2008-01-17 Link Darren R Microfluidic devices and methods of use thereof
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
US20080070792A1 (en) 2006-06-14 2008-03-20 Roland Stoughton Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis
EP2589668A1 (de) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Analyse seltener Zellen mittels Probentrennung und DNA-Etiketten
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2077912B1 (de) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorkohlenstoffemulsionsstabilisierende tenside
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
US8207509B2 (en) 2006-09-01 2012-06-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
EP4220138A1 (de) * 2006-09-01 2023-08-02 Pacific Biosciences of California, Inc. Substrate, systeme und verfahren zur analyse von materialien
US20080080059A1 (en) * 2006-09-28 2008-04-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modular optical components and systems incorporating same
US8603749B2 (en) * 2006-11-15 2013-12-10 Biospherex, LLC Multitag sequencing ecogenomics analysis-US
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080277595A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Highly multiplexed confocal detection systems and methods of using same
US20100167413A1 (en) * 2007-05-10 2010-07-01 Paul Lundquist Methods and systems for analyzing fluorescent materials with reduced autofluorescence
US7635566B2 (en) * 2007-06-29 2009-12-22 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US8222040B2 (en) * 2007-08-28 2012-07-17 Lightspeed Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles
US8759077B2 (en) 2007-08-28 2014-06-24 Lightspeed Genomics, Inc. Apparatus for selective excitation of microparticles
US8124336B2 (en) * 2007-09-26 2012-02-28 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for reducing the complexity of a nucleic acid sample
WO2009046149A1 (en) * 2007-10-01 2009-04-09 Applied Biosystems Inc. Chase ligation sequencing
MX2010010600A (es) 2008-03-28 2011-03-30 Pacific Biosciences California Inc Composiciones y metodos para secuenciacion de acidos nucleicos.
EP2315629B1 (de) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Tröpfchenbibliotheken
US20100062946A1 (en) * 2008-09-08 2010-03-11 Lis John T Genome-wide method for mapping of engaged rna polymerases quantitatively and at high resolution
CA2974241C (en) 2008-09-16 2020-01-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates and optical systems and methods of use thereof
BRPI1008429A2 (pt) 2009-02-13 2020-08-25 X-Chem, Inc. métodos de criação e de triagem de bibliotecas de dna codificado.
EP2411148B1 (de) 2009-03-23 2018-02-21 Raindance Technologies, Inc. Manipulation von mikrofluidiktröpfchen
CA2760439A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US8451524B2 (en) 2009-09-29 2013-05-28 Amnis Corporation Modifying the output of a laser to achieve a flat top in the laser's Gaussian beam intensity profile
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
WO2011079176A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
CA2789425C (en) 2010-02-12 2020-04-28 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis with polymerase error correction
US8994946B2 (en) 2010-02-19 2015-03-31 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated analytical system and method
US8467061B2 (en) 2010-02-19 2013-06-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated analytical system and method
US9465228B2 (en) 2010-03-19 2016-10-11 Optical Biosystems, Inc. Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns
US8502867B2 (en) 2010-03-19 2013-08-06 Lightspeed Genomics, Inc. Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns
CA2832672A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US8817115B1 (en) 2010-05-05 2014-08-26 Amnis Corporation Spatial alignment of image data from a multichannel detector using a reference image
EP2623613B8 (de) 2010-09-21 2016-09-07 Population Genetics Technologies Ltd. Erhöhung der Verlässlichkeit von Allel-Aufrufen mit Molekülzählung
EP3447155A1 (de) 2010-09-30 2019-02-27 Raindance Technologies, Inc. Sandwichassays in tröpfchen
US10233501B2 (en) 2010-10-19 2019-03-19 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US20150225792A1 (en) 2014-01-17 2015-08-13 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US10093981B2 (en) 2010-10-19 2018-10-09 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US20150218639A1 (en) 2014-01-17 2015-08-06 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
WO2012109600A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP3736281A1 (de) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Zusammensetzungen und verfahren für molekulare etikettierung
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US8798936B2 (en) 2011-06-21 2014-08-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data analysis using the Burrows Wheeler transform
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9670538B2 (en) 2011-08-05 2017-06-06 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing by electrochemical detection
EP3828271A1 (de) 2011-09-07 2021-06-02 X-Chem, Inc. Verfahren zur markierung dna-codierter bibliotheken
PL3623481T3 (pl) 2011-09-23 2022-01-17 Illumina, Inc. Kompozycje do sekwencjonowania kwasów nukleinowych
US9228233B2 (en) 2011-10-17 2016-01-05 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
US20130189679A1 (en) 2011-12-20 2013-07-25 The Regents Of The University Of Michigan Pseudogenes and uses thereof
WO2013096799A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples
US9803188B2 (en) 2011-12-22 2017-10-31 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
US10150993B2 (en) 2011-12-22 2018-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule positioning by electrical potential
WO2013102091A1 (en) 2011-12-28 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid ligation systems and methods
WO2013102081A2 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule delivery to nanowells
CA2863121A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbott Molecular Inc. Microorganism nucleic acid purification from host samples
US9822417B2 (en) 2012-01-09 2017-11-21 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
WO2013106737A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Data2Bio Genotyping by next-generation sequencing
ES2855130T3 (es) 2012-02-17 2021-09-23 Hutchinson Fred Cancer Res Composiciones y métodos para identificar mutaciones de manera precisa
WO2013124738A2 (en) 2012-02-21 2013-08-29 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
WO2013126741A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
EP2820174B1 (de) 2012-02-27 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Verfahren und verwendung für molekulare tags
EP3321378B1 (de) 2012-02-27 2021-11-10 Becton, Dickinson and Company Zusammensetzungen für molekularen zählung
WO2013128281A1 (en) 2012-02-28 2013-09-06 Population Genetics Technologies Ltd Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample
AU2013229151A1 (en) 2012-03-06 2014-09-25 Aarhus University Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
ES2716995T3 (es) 2012-04-03 2019-06-18 Univ Michigan Regents Biomarcadores asociados con el síndrome del intestino irritable y la enfermedad de Crohn
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
WO2013165748A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Raindance Technologies, Inc Digital analyte analysis
EP2844767A4 (de) 2012-05-02 2015-11-18 Ibis Biosciences Inc Systeme und verfahren für nukleinsäuresequenzierung
EP2844774B1 (de) 2012-05-02 2018-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Dna-sequenzierung
ES2833524T3 (es) 2012-05-02 2021-06-15 Ibis Biosciences Inc Secuenciación de ADN
US10202642B2 (en) 2012-05-02 2019-02-12 Ibis Biosciences, Inc. DNA sequencing
US9372308B1 (en) 2012-06-17 2016-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analytical devices and methods for production
WO2014005076A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods and biomarkers for detection of kidney disorders
ES2675167T3 (es) 2012-07-13 2018-07-09 X-Chem, Inc. Bibliotecas codificadas por ADN que tienen enlaces oligonucleotídicos codificantes no legibles por polimerasas
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
MX367963B (es) 2012-09-04 2019-09-11 Guardant Health Inc Métodos para detectar mutaciones raras y variación en el número de copias.
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9223084B2 (en) 2012-12-18 2015-12-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Illumination of optical analytical devices
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
WO2014130900A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated illumination of optical analytical devices
WO2014160233A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
EP2971159B1 (de) 2013-03-14 2019-05-08 Molecular Loop Biosolutions, LLC Verfahren zur analyse von nukleinsäuren
EP2971171A4 (de) 2013-03-14 2016-11-02 Abbott Molecular Inc Multiplex-methylierungs-spezifische verstärkersysteme und -verfahren
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
US20140287946A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid control panels
WO2014151511A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for detection of genomic copy number changes
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
WO2014150910A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequences to assess contamination in dna sequencing
WO2014172288A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US8847799B1 (en) 2013-06-03 2014-09-30 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
EP3036359B1 (de) 2013-08-19 2019-10-23 Abbott Molecular Inc. Sequenzierungsbibliotheken der nächsten generation
CN105722850B (zh) 2013-08-19 2020-03-06 雅培分子公司 核苷酸类似物
KR102536833B1 (ko) 2013-08-28 2023-05-26 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
CN105745528A (zh) 2013-10-07 2016-07-06 赛卢拉研究公司 用于以数字方式对阵列上的特征进行计数的方法和系统
HUE045954T2 (hu) 2013-10-17 2020-01-28 Illumina Inc Eljárások és készítmények nukleinsavkönyvtárak elõállítására
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
US11041203B2 (en) 2013-10-18 2021-06-22 Molecular Loop Biosolutions, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
CA2930693A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Unversity Methods of treating heart failure with agonists of hypocretin receptor 2
AU2014364180B2 (en) 2013-12-09 2021-03-04 Illumina, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
WO2015095355A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Detection of an antibody against a pathogen
EP3087204B1 (de) 2013-12-28 2018-02-14 Guardant Health, Inc. Verfahren und systeme für den nachweis genetischer varianten
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
US9896686B2 (en) 2014-01-09 2018-02-20 AgBiome, Inc. High throughput discovery of new genes from complex mixtures of environmental microbes
WO2015107430A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
WO2015175530A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Gore Athurva Methods for detecting aneuploidy
EP3151733B1 (de) 2014-06-06 2020-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Zusammensetzungen und verfahren zur charakterisierung und diagnose von parodontaler erkrankung
US11155809B2 (en) 2014-06-24 2021-10-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital PCR barcoding
JP2017521654A (ja) 2014-06-27 2017-08-03 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ヒトペギウイルス２（ＨＰｇＶ−２）を検出するための組成物および方法
ES2752761T3 (es) 2014-07-24 2020-04-06 Abbott Molecular Inc Composiciones para la detección y análisis de mycobacterium tuberculosis
US10093967B2 (en) 2014-08-12 2018-10-09 The Regents Of The University Of Michigan Detection of nucleic acids
US9606068B2 (en) 2014-08-27 2017-03-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analytical devices
US11408024B2 (en) 2014-09-10 2022-08-09 Molecular Loop Biosciences, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
EP3194643B1 (de) 2014-09-17 2020-02-19 Ibis Biosciences, Inc. Sequenzierung durch synthese unter verwendung von impulsleseoptik
EP3224595A4 (de) 2014-09-24 2018-06-13 Good Start Genetics, Inc. Prozesssteuerung für erhöhte robustheit von genetischen assays
CA3002133A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Good Start Genetics, Inc. Pre-implantation genetic screening and aneuploidy detection
US10000799B2 (en) 2014-11-04 2018-06-19 Boreal Genomics, Inc. Methods of sequencing with linked fragments
CA3010579A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
WO2016134078A1 (en) 2015-02-19 2016-08-25 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US10208339B2 (en) 2015-02-19 2019-02-19 Takara Bio Usa, Inc. Systems and methods for whole genome amplification
EP3822361A1 (de) 2015-02-20 2021-05-19 Takara Bio USA, Inc. Verfahren zur schnellen präzisen abgabe, visualisierung und analyse von einzelzellen
CN107208158B (zh) 2015-02-27 2022-01-28 贝克顿迪金森公司 空间上可寻址的分子条形编码
CN113064236B (zh) 2015-03-16 2022-11-01 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于自由空间光耦合的集成装置及系统
EP4180535A1 (de) 2015-03-30 2023-05-17 Becton, Dickinson and Company Verfahren und zusammensetzungen für kombinatorische barcodierung
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
JP6698708B2 (ja) 2015-06-09 2020-05-27 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体
CN107924027B (zh) 2015-06-12 2024-01-23 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于光耦合的集成靶点波导器件和系统
WO2017011565A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis
CA2992449A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Abbott Molecular Inc. Purification of nucleic acids using copper-titanium oxides
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
CN108026524A (zh) 2015-09-11 2018-05-11 赛卢拉研究公司 用于核酸文库标准化的方法和组合物
CA3008651A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Guardant Health, Inc. Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna
WO2017120531A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
US11312991B2 (en) 2016-01-27 2022-04-26 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for decoding base sequence of nucleic acid corresponding to end region of RNA and method for analyzing DNA element
CN108779442B (zh) 2016-02-08 2022-07-12 瑞尔基因公司 多种连接酶的组合物、系统以及方法
US20190062827A1 (en) 2016-03-14 2019-02-28 RGENE, Inc. HYPER-THERMOSTABLE LYSINE-MUTANT ssDNA/RNA LIGASES
US10961573B2 (en) 2016-03-28 2021-03-30 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex target capture
WO2017168331A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex fragment sequencing
AU2017261189B2 (en) 2016-05-02 2023-02-09 Becton, Dickinson And Company Accurate molecular barcoding
WO2017201302A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 The University Of Chicago Btk mutation and ibrutinib resistance
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US11397882B2 (en) 2016-05-26 2022-07-26 Becton, Dickinson And Company Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
AU2017285496B2 (en) 2016-06-16 2023-02-23 The Johns Hopkins University Methods and system for epigenetic analysis
US11091795B2 (en) 2016-07-11 2021-08-17 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
JP7075394B2 (ja) 2016-07-21 2022-05-25 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド マルチウェルデバイスを用いたマルチｚ撮像及び分注
US11460468B2 (en) 2016-09-26 2022-10-04 Becton, Dickinson And Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
CA3041645C (en) 2016-10-24 2021-11-02 Geneinfosec, Inc. Concealing information present within nucleic acids
EP3538672A1 (de) 2016-11-08 2019-09-18 Cellular Research, Inc. Verfahren zur klassifizierung von zellmarkern
KR20190077062A (ko) 2016-11-08 2019-07-02 셀룰러 리서치, 인크. 발현 프로파일 분류 방법
EP3551769A4 (de) 2016-12-09 2020-10-28 Boreal Genomics, Inc. Verbundene ligation
WO2018118971A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
CN110573253B (zh) 2017-01-13 2021-11-02 赛卢拉研究公司 流体通道的亲水涂层
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
CN110446787A (zh) 2017-03-24 2019-11-12 生物辐射实验室股份有限公司 通用发夹引物
WO2018183942A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification
WO2018187013A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
EP3634992B1 (de) 2017-06-08 2024-03-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur identifizierung von epitopen
CN110770356A (zh) 2017-06-20 2020-02-07 生物辐射实验室股份有限公司 使用珠寡核苷酸的mda
CA3072136A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Omniome, Inc. Scanning apparatus and methods useful for detection of chemical and biological analytes
CA3077085A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Oncotherapy Science, Inc. Screening of t lymphocytes for cancer-specific antigens
EP4180534A1 (de) 2017-11-02 2023-05-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Auf transposase basierende genomanalyse
AU2018372906A1 (en) 2017-11-22 2020-06-11 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating cancer
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
JP2021509024A (ja) 2018-01-02 2021-03-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 多数の液滴の捕捉
EP3747189A4 (de) 2018-01-30 2021-11-10 Rebus Biosystems, Inc. Verfahren zur detektion von teilchen mit strukturierter beleuchtung
CN111699253A (zh) 2018-01-31 2020-09-22 生物辐射实验室股份有限公司 用于解卷积分区条码的方法和组合物
WO2019195379A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Lifeedit, Inc. Methods and compositions to identify novel crispr systems
WO2019203986A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
WO2019213237A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
WO2019213619A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
US11479816B2 (en) 2018-08-20 2022-10-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
JP2022511398A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ５’転写物配列の決定
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CN113166805A (zh) 2018-12-04 2021-07-23 欧姆尼欧美公司 用于核酸测序和其他分析测定的混合相流体
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
CN113227348A (zh) 2018-12-20 2021-08-06 欧姆尼欧美公司 用于分析核酸和其他分析物的温度控制
WO2020141464A1 (en) 2019-01-03 2020-07-09 Boreal Genomics, Inc. Linked target capture
WO2020142768A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Northwestern University Storing temporal data into dna
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
WO2020154247A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Cellular Research, Inc. Oligonucleotides associated with antibodies
EP3924513B1 (de) 2019-02-14 2023-04-12 Pacific Biosciences of California, Inc. Verminderung von negativen auswirkungen von detektionssystemen auf nukleinsäuren und anderen biologischen analyten
CN113613787B (zh) 2019-02-20 2023-06-13 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
US11644406B2 (en) 2019-06-11 2023-05-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Calibrated focus sensing
CN114051534A (zh) 2019-07-22 2022-02-15 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
TW202124406A (zh) 2019-09-10 2021-07-01 美商歐姆尼歐美公司 核苷酸之可逆修飾
US20210139867A1 (en) 2019-11-08 2021-05-13 Omniome, Inc. Engineered polymerases for improved sequencing by binding
EP4055160B1 (de) 2019-11-08 2024-04-10 Becton Dickinson and Company Verwendung von random-rpiming zur gewinnung von v(d)j-informationen in voller länge für immunrepertoiresequenzierung
DE202019106694U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
WO2021152586A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
CN115243792A (zh) 2020-02-04 2022-10-25 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 流通池及其制造和使用方法
WO2021163637A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Zymergen Inc. Metagenomic library and natural product discovery platform
WO2021214766A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto
US20230203592A1 (en) 2020-05-05 2023-06-29 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
CN116134152A (zh) 2020-05-27 2023-05-16 基因技术有限公司 评估对冠状病毒感染产生严重反应的风险的方法
EP4165549A1 (de) 2020-06-11 2023-04-19 Nautilus Biotechnology, Inc. Verfahren und systeme zur rechnerischen decodierung biologischer, chemischer und physikalischer einheiten
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
KR20230118570A (ko) 2020-11-11 2023-08-11 노틸러스 서브시디어리, 인크. 강화된 결합 및 검출 특성을 갖는 친화성 시약
EP4247967A1 (de) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profilierung von stark exprimierten und schwach exprimierten proteinen
CA3203535A1 (en) 2021-01-21 2022-07-28 Gregory KAPP Systems and methods for biomolecule preparation
US20240043915A1 (en) 2021-02-13 2024-02-08 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
KR20230169143A (ko) 2021-03-11 2023-12-15 노틸러스 서브시디어리, 인크. 생체분자 보유를 위한 시스템 및 방법
US20230070896A1 (en) 2021-09-09 2023-03-09 Nautilus Biotechnology, Inc. Characterization and localization of protein modifications
AU2022352593A1 (en) 2021-09-22 2024-02-15 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods and systems for determining polypeptide interactions
US20230149883A1 (en) 2021-11-03 2023-05-18 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for surface structuring
WO2023135485A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof
WO2023152568A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing lung cancer
WO2023192917A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
WO2023250364A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Nautilus Subsidiary, Inc. Method for detecting analytes at sites of optically non-resolvable distances

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149625A (en) * 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US4942124A (en) * 1987-08-11 1990-07-17 President And Fellows Of Harvard College Multiplex sequencing
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
JPH02299598A (ja) * 1989-04-14 1990-12-11 Ro Inst For Molecular Genetics & Geneteic Res 微視的サイズの別個の粒子と結合している核酸試料中のごく短い配列の全部または一部のオリゴヌクレチドプローブとのハイブリダイゼーションによる決定法
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5302509A (en) * 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
DE69130647T2 (de) * 1990-08-24 1999-05-06 Ixsys Inc Verfahren zur herstellung von oligonukleotiden mit regellosen codonen
DE69132843T2 (de) * 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
US5312157A (en) * 1991-02-20 1994-05-17 Logan Jr Emanuel Lift seat
DE69217497T2 (de) * 1991-09-18 1997-06-12 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
NZ246203A (en) * 1991-12-24 1996-09-25 Tepnel Medical Ltd Copying of a nucleic acid sequence using a solid support system, apparatus therefor
EP1382386A3 (de) * 1992-02-19 2004-12-01 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Neue Ordnungen für Oligonukleotide und ihr Nutzen zum Sortieren, Isolieren, Sequenzierung und Manipulieren von Nukleinsäuren
EP0638089B2 (de) * 1992-04-15 2008-03-05 The Johns Hopkins University Synthese von verschiedenen und nützlichen oligonukleotidsammlungen
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
IL107166A (en) * 1992-10-01 2000-10-31 Univ Columbia Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5482836A (en) * 1993-01-14 1996-01-09 The Regents Of The University Of California DNA purification by triplex-affinity capture and affinity capture electrophoresis
US5593826A (en) * 1993-03-22 1997-01-14 Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides
US5473060A (en) * 1993-07-02 1995-12-05 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide clamps having diagnostic applications
GB9401200D0 (en) * 1994-01-21 1994-03-16 Medical Res Council Sequencing of nucleic acids
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5552278A (en) * 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage

Also Published As

Publication number Publication date
EP0786014A1 (de) 1997-07-30
WO1996012039A1 (en) 1996-04-25
EP0952216A3 (de) 2000-01-19
US6140489A (en) 2000-10-31
US5863722A (en) 1999-01-26
EP0952216B8 (de) 2005-10-19
DE69513997D1 (de) 2000-01-20
US5695934A (en) 1997-12-09
DE69513997T2 (de) 2000-07-27
DE69534389D1 (de) 2005-09-22
EP0786014B1 (de) 1999-12-15
EP0952216A2 (de) 1999-10-27
EP0952216B1 (de) 2005-08-17
AU3946195A (en) 1996-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69534389T2 (de) Mit PNA- und Amidat-Etiketten bestückte Festphasenträger
DE69637285T2 (de) Oligonukleotid-tags zur sortierung und identifizierung
DE69534930T2 (de) Molekulares markierungssystem
DE69433487T2 (de) Methoden und zusammensetzungen zur effizienten nukleinsaeuresequenzierung
DE69836809T2 (de) Verbesserungen bei der auf Adaptoren basierenden Sequenzanalyse
DE69737450T2 (de) Sequenzierung durch ligation kodierter adapter
DE60220578T2 (de) Methode und Reagenzien zur Analyse der Nukleotidsequenz von Nukleinsäuren
DE69926797T2 (de) Sequenzierungsverfahren mit Verstärkungsmarkierungen
DE10015797B4 (de) Multiplex-Analyse von DNA-Gemischen mittels photolytisch ablesbarer DNA-Chips
EP0705349B1 (de) NUKLEINSäURE-SEQUENZANALYSE DURCH DIE METHODE DER PARALLELEN PRIMEREXTENSION
JP5180845B2 (ja) Ｄｎａアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
DE69930379T2 (de) Oligonukleotide mit pyrazolä3,4-dü pyrimidin zur hybridisierung und unterscheidung von fehlpaarungen
DE69927343T2 (de) Verfahren und mittel zur analyse der nukleotidsequenz von nukleinsäuren
DE69636895T2 (de) Die Verwendung der 3'-wesentlichen Bearbeitungswirksamkeit von DNS-Polymerase
US6153379A (en) Parallel primer extension approach to nucleic acid sequence analysis
DE69924140T2 (de) Bestimmung der länge von repetitiven nukleinsäure-sequenzen durch eine diskontinuierliche primerverlängerung
CA2477611A1 (en) Rapid analysis of variations in a genome
KR20010085860A (ko) 핵산 증폭과 서열분석 방법
US5470707A (en) Hydrogen bond labeling and base sequence determination methods for DNA or RNA
DE60038109T2 (de) Verfahren zur Analyse von AFLP Reaktionsmischungen unter Verwendung von Primer Verlängerungstechniken
JP4669614B2 (ja) 多型ｄｎａフラグメントおよびその使用
JP2001521398A (ja) 性状検査用ｄｎａ
DE69929708T2 (de) Methode zur herstellung von sätzen komplementärer oligonucleotide
US20020045182A1 (en) Multiplexed differential displacement for nucleic acid determinations
EP1458892B1 (de) Evaneszenz-basierendes multiplex-sequenzierungsverfahren

Legal Events

Date Code Title Description
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: SOLEXA, INC., HAYWARD, CALIF., US

8364 No opposition during term of opposition