DE69534950T2

DE69534950T2 - Zusammensetzungen für den nachweis von proteasen in biologischen proben und verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE69534950T2
Application number: DE69534950T
Authority: DE
Inventors: Akira Rockville KOMORIYA; S. Beverly Rockville PACKARD
Original assignee: Oncoimmunin Inc
Current assignee: Oncoimmunin Inc
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: DE69534950D1; JP3771262B2; JPH10508471A; ATE323779T1; EP0873417A1; AU3897495A; US5714342A; CA2203758C; WO1996013607A1; CA2203758A1; EP0873417B1; EP0873417A4; US5605809A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine Klasse von neuen fluorogenen Zusammensetzungen, deren Fluoreszenzintensität in Gegenwart aktiver Proteasen steigt. Diese fluorogenen Proteaseindikatoren fluoreszieren typischerweise bei sichtbaren Wellenlängen und sind somit äußerst nützlich zur Detektion und Lokalisierung von Proteaseaktivität in biologischen Proben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteasen bilden zahlreiche Familien von proteolytischen Enzymen, die Peptidbindungen katalytisch hydrolysieren. Die Hauptgruppen von Proteasen umfassen Metalloproteasen, Serinproteasen, Cysteinproteasen und Asparaginproteasen. Proteasen, insbesondere Serinproteasen, sind in zahlreiche physiologische Prozesse wie Blutgerinnung, Befruchtung, Entzündung, Hormonproduktion, Immunantwort und Fibrinolyse eingebunden.
Zahlreiche Erkrankungszustände werden durch Veränderungen der Aktivität spezifischer Proteasen und ihrer Inhibitoren verursacht und können dadurch charakterisiert werden. Emphysem, Arthritis, Thrombose, Krebsmetastase und manche Formen von Hämophilie resultieren beispielsweise aus mangelhafter Regulation von Serinproteaseaktivitäten (siehe beispielsweise Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1993)). In ähnlicher Weise sind Proteasen in die Bildung von Krebsmetastasen eingebunden. Erhöhte Synthese der Protease Urokinase wurde mit einer erhöhten Fähigkeit in Verbindung gebracht, in zahlreichen Krebsarten zu metastasieren. Urokinase aktiviert Plasmin aus Plasminogen, das überall im extrazellulären Raum vorhanden ist, und dessen Aktivierung kann den Abbau der Proteine in der extrazellulären Matrix verursachen, durch die die metastasierenden Tumorzellen eindringen. Plasmin kann auch die Collagenasen aktivieren, wodurch es den Abbau von Collagen in der Basalmembran, die die Kapillaren und das Lymphsystem umgibt, fördert, wodurch Tumorzellen in die Targetgewebe eindringen können (Dann et al., Adv. Cancer. Res. 44, 139 (1985)).
Eindeutig sind Messungen von Veränderungen der Aktivität spezifischer Proteasen für die Behandlung der und den Umgang mit den diesen Symptomen zugrunde liegenden Erkrankungszustände(n) klinisch signifikant. Proteasen sind jedoch nicht leicht zu testen. Typische Ansätze umfassen ELISA unter Verwendung von Antikörpern, die die Protease binden, oder RIA unter Verwendung verschiedener markierter Substrate. Mit ihren natürlichen Substraten sind Tests schwierig durchzuführen und sind außerdem kostspielig. Mit zur Zeit erhältlichen synthetischen Substraten sind die Tests teuer, unempfindlich und nicht selektiv. Darüber hinaus erfordern zahlreiche "Indikator"-Substrate große Mengen an Protease, was teilweise zur Selbstzerstörung der Protease führt.
Jüngste Ansätze zur Proteasedetektion beruhen auf einer spaltungsinduzierten spektroskopischen Veränderung in einem abgehenden Chromogen oder Fluorogen, das an der P1'-Position (der Aminosäureposition an der Carboxylstelle der spaltbaren Peptidbindung) angeordnet ist (siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.557.862 und 4.648.893). Zahlreiche Proteasen erfordern jedoch zwei oder drei Aminosäurereste an jeder Seite der abspaltbaren Bindung zur Erkennung der Protease, und somit fehlt diesen Ansätzen Proteasespezifität.
Erst jüngst wurden jedoch fluorogene Indikatorzusammensetzungen entwickelt, in denen ein "Donor"-Fluorophor über eine kurze Brücke, die ein Peptid (7 Aminosäuren), das die Bindungsstelle für eine HIV-Protease ist, und Linker enthält, die den Fluorophor und Chromophor an das Peptid binden, an einen "Akzeptor"-Chromophor gebunden ist (Wang et al., Tetra. Letts. 45, 6493–6496 (1990)). Das Signal des Donor-Fluorophors wurde durch den Akzeptor-Chromophor durch ein Verfahren gequencht, von dem angenommen wird, dass es Resonanzenergietransfer (RET) einbindet. Spaltung des Peptids führte zur Trennung von Chromophor und Fluorophor, zur Entfernung des Quenches, und ein darauf folgendes Signal wurde aus dem Donor-Fluorophor gemessen.
Leider führte der Entwurf der Brücke zwischen dem Donor und dem Akzeptor zu relativ ineffizientem Quenching, was die Empfindlichkeit des Tests einschränkte. Darüber hinaus absorbierte der Chromophor Licht im ultravioletten Bereich, was die Empfindlichkeit für die Detektion in biologischen Proben, die typischerweise Moleküle enthalten, die im Ultraviolettlicht stark absorbieren, reduzierte.
Fluorogene Proteaseindikatoren, die ein hohes Signalniveau zeigen, wenn sie gespalten werden, und ein niederes Signalniveau, wenn sie intakt sind, die einen hohen Grad an Proteasespezifität aufweisen und die ausschließlich im sichtbaren Bereich wirken, was sie für die Verwendung in biologischen Proben geeignet macht, sind eindeutig wünschenswert. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen diese und andere Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Reagenzien bereit, deren Fluoreszenz in Gegenwart von bestimmten Proteasen steigt. Diese fluorogenen Proteaseindikatoren liefern ein sehr intensives Fluoreszenzsignal bei einer sichtbaren Wellenlänge, wenn sie von einer Protease verdaut werden. Aufgrund ihres starken Fluoreszenzsignals bei sichtbaren Wellenlängen sind diese Proteaseindikatoren besonders gut zur Detektion von Proteaseaktivität in biologischen Proben, insbesondere in gefrorenen Gewebeschnitten, geeignet.
Die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen, die zur Detektion der Aktivität einer Protease geeignet sind. Für diese Zusammensetzungen gilt die allgemeine Formel:
worin F¹ ein Fluorophor ist; C¹ ₅, C¹ ₄, C¹ ₃, P₂, P₁, P₁' und P₂' jeweils eine Aminosäure sind; S¹ ein 1 bis 50 Aminosäuren langer Peptid-Spacer ist; n = 0 oder 1 ist; und, wenn n = 1 ist, S¹ über eine Peptidbindung der α-Aminogruppe von C¹ ₅ an C¹ ₅ gebunden ist; und Y eine Zusammensetzung ist, die aus der aus Verbindungen der folgenden Formeln bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
worin C² ₃ und C² ₄ Aminosäuren sind; F² ein Fluorophor ist; S² ein 1 bis 50 Aminosäuren langer Peptid-Spacer ist; und k = 0 oder 1 ist; und, wenn k = 1 ist, S² über eine Peptidbindung der α-Carboxylgruppe von C² ₄ oder C² ₃ an C² ₄ oder C² ₃ gebunden ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' eine Protease-Spaltstelle ist, die zwischen P₁ und P₁' gespalten wird; und
wenn P₂' nicht Prolin ist, Y der Formel III entspricht, worin C² ₃-C² ₄ aus der aus Pro-Cys, Aib-Cys, Pro-Lys und Aib-Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
wenn P₂' Prolin ist, Y der Formel IV entspricht, worin C² ₃ aus der aus Cys und Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
wenn P₂ Prolin ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-C¹ ₄-C¹ ₃ oder Asp-C¹ ₄-Aib ist;
wenn P₂ nicht Prolin ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ aus der aus Asp-C¹ ₄-Pro, Asp-C¹ ₄-Aib, Asp-Aib-Pro, Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-Pro-Aib und Asp-Aib-Aib bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
wenn der C¹ ₃-Rest Pro ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-C¹ ₄-Pro oder Asp-Aib-Pro ist;
wenn der C¹ ₄-Rest Pro ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Pro-C¹ ₃ oder Asp-Pro-Aib ist; und
wenn P² und C¹ ₃ beide nicht Prolin sind, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ aus der aus Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-C¹ ₄-Aib und Asp-Pro-Aib bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei die Abkürzung Aib für α-Aminoisobuttersäure steht;
worin die Fluorophore F¹, F² benachbart sind und weniger als 100 Å voneinander entfernt sind.
Die konformationsbestimmenden Regionen (C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃, manchmal hierin als C¹ bezeichnet, und C² ₃-C²4 oder C² ₃, manchmal hierin als C² bezeichnet) führen jeweils ei ne Krümmung in die Zusammensetzung ein, wodurch sie eine im Allgemeinen U-förmige Konfiguration der Zusammensetzung entstehen lassen, in der die Fluorophore zueinander benachbart sind und weniger als 100 Å voneinander entfernt sind. Sind beide Spacer (S¹ und S²) vorhanden, so sind sie an die Proteasebindungsstelle über eine Peptidbindung an den α-Kohlenstoff der terminalen Aminosäure gebunden. Somit ist, wenn n = 1, S¹ über eine Peptidbindung einer terminalen α-Aminosäuregruppe von C¹ an C¹ gebunden, und, wenn k = 1, S² über eine Peptidbindung einer terminalen α-Carboxylgruppe von C² an C² gebunden.
Die eine Proteasebindungsstelle umfassenden Aminosäurereste sind, wie auf dem Gebiet der Erfindung üblich, in Bezug auf die Peptidbindung, die durch eine bestimmte Protease hydrolysiert ist, nummeriert. Somit ist der erste Aminosäurerest auf der Aminoseite der gespaltenen Peptidbindung als P₁ bezeichnet, während der erste Aminosäurerest auf der Carboxylseite der gespaltenen Peptidbindung als P₁' bezeichnet ist. Die Nummerierung der Reste steigt mit steigender Distanz von der hydrolysierten Peptidbindung an. Somit würde eine vier Aminosäuren lange Proteasebindungsregion Aminosäuren enthalten, die folgendermaßen bezeichnet sind: P₂-P₁-P₁'-P₂' und die Protease würde die Bindungsregion zwischen P₁ und P₁' spalten.
Tabelle 2 umfasst besonders bevorzugte Proteasebindungsstellen (P) und geeignete konformationsbestimmende Regionen (C¹ und C²). Somit umfasst diese Erfindung auch Zusammensetzungen der Formel II, in der P₂ Pro, Gly, Phe, Arg, Leu, Gln, Glu, His, Ile oder Ala ist; P₁ Cys, Met, Nle, Arg, Leu, Gly, His, Glu, Ala, Phe, Tyr oder Asn ist; P₁' Thr, Ser, Met, Nle, Leu, Ala, Ile, Phe, Val, Glu, His oder Tyr ist; und P₂' Ile, Gly, Met, Nle, Leu, Ala, Gln, Arg, Val, Ser, Tyr oder Asn ist. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen der Formel II, in der die P-Domäne (P₂-P₁-P₁'-P₂')
Dies Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen der Formel II, in der C¹ ₅ für Asp oder Lys steht; C¹ ₄ für Ala, Met, Nle, Aib, Pro, Ile, Gly, Asp, Arg, Thr, Lys, Phe, Gln oder Ser steht; und C¹ ₃ für Ile, Aib, Pro, Thr, Ser, Ala, Val, Gly, Phe oder Gln steht. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen, in denen die C¹-konformationsbestimmende Region (C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃) Asp-Ala-Ile, Asp-Ile-Pro, Asp-Aib-Pro, Asp-Gly-Pro, Asp-Asp-Pro, Asp-Arg-Pro, Asp-Ile-Aib, Asp-Aib-Aib, Asp-Gly-Aib, Asp-Asp-Aib or Asp-Arg-Aib ist.
Bevorzugte Proteaseindikatoren umfassen Zusammensetzungen der Formel II, in denen P₂' Pro ist, in welchem Fall C² eine einzelne Aminosäure ist. Somit entspricht Y Formel IV, in der C² ₃ vorzugsweise Cys oder Lys ist. In einer anderen Ausführungsform entspricht Y Formel III, und C² ₃ ist Pro und C² ₄ ist Cys oder Lys. In wiederum einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist S¹ Lys und/oder ist S² Gly-Tyr.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist F¹ ein Fluorophor mit einer Anregungswellenlänge im Bereich von 315 nm bis etwa 650 nm, F² ist ein Fluorophor mit einer Anregungswellenlänge im Bereich von 315 nm bis etwa 650 nm, oder sowohl F¹ und F² sind Fluorophore mit Anregungs- und Absorptionswellenlängen im Bereich von 315 nm bis etwa 650 nm. F¹ kann der Donor-Fluorophor mit F² als Akzeptor-Fluorophor sein, oder umgekehrt, F² kann der Donor-Fluorophor mit F¹ als Akzeptor-Fluorophor sein. F¹ kann 5- und/oder 6-Carboxytetramethylrhodamin oder 7-Hydroxy-4-methylcumarin-3-essigsäure sein, während F² Rhodamin-X-acetamid, 5- und/oder 6-Carboxy-X-rhodamin oder 7-Diethylamino-3-((4'-iodoacetyl)amino)phenyl)-4-methylcumarin sein kann. Die zwei Fluorophore, F¹ und F², in einem Proteaseindikator können gleich oder unterschiedlich sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind n und k = 0; C¹ ist Asp-Ala-Ile; P ist Pro-Nle-Ser-Ile; C² ist Pro-Cys; F¹ ist 5- und/oder 6-Carboxytetramethylrhodamin; und F² ist 5- und/oder 6-Carboxy-X-rhodamin. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform sind n und k = 0; C¹ ist Asp-Ala-Ile; P ist Pro-Met-Ser-Ile; C² ist Pro-Cys; F¹ ist 5-Carboxytetramethylrhodamin; und F² ist Rhodamin-X-acetamid.
Diese Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, in denen C¹ Asp-Ala-Ile ist; P Pro-Met-Ser-Ile oder Pro-Nle-Ser-Ile ist; C² Pro-Cys ist; und entweder n oder k = 1 und entweder S¹ oder S² ein Spacer mit der Sequenz Asp-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys, Lys-Glu-Asp-Gly-Gly-Asp-Lys, Asp-Gly-Ser-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys, Asp-Gly-Gly-Gly-Lys-Lys, oder Lys-Glu-Asp-Glu-Gly-Ser-Gly-Asp-Lys ist.
In diesen Zusammensetzungen kann F¹ 5- und/oder 6-Carboxytetramethylrhodamin sein; und F² kann Rhodamin-X-acetamid sein. Diese Zusammensetzungen können an einen festen Träger oder an ein Lipid, einschließlich Membranlipide oder -liposome, konjugiert sein.
In einer anderen Ausführungsform kann jede beliebige der oben beschriebenen Zusammensetzungen in einem Verfahren zur Detektion von Proteaseaktivität in einer Probe verwendet werden. Die Probe kann eine Probe aus "Stamm"-Protease sein, wie sie in der Forschung oder Industrie verwendet wird, oder sie kann eine biologische Probe sein. Somit stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Proteaseaktivität in einer Probe durch Kontaktieren der Probe mit jeder beliebigen der oben beschriebenen Zusammensetzungen und anschließendes Detektieren einer Änderung der Fluoreszenz der fluorogenen Zusammensetzung bereit, worin eine Fluoreszenzsteigerung auf Proteaseaktivität hinweist. Die Probe ist vorzugsweise eine biologische Probe, die biologische Flüssigkeiten wie Sputum oder Blut, Gewebeproben, wie Biopsien oder Schnitte, und Zellproben entweder in Form von Biopsien oder in Kultur umfassen kann. Besonders bevorzugt sind Gewebeschnitte, kultivierte Zellen, kultivierte Gewebe und dergleichen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine HPLC-Analyse des D-NorFES-A-Proteaseindikators (F¹-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F²), worin F¹ ein Donor- (D-) Fluorophor (5'-Carboxytetramethylrhodamin (C2211)) und F² ein Akzeptor- (A-) Fluorophor (Rhodamin-X-acetamid (R492)) ist, vor und nach Zusatz von Elastase. (A) HPLC vor dem Zusatz von Elastase zeigt den späten Elutionspeak, der für das intakte Indikatormolekül steht. (B) HPLC nach dem Zusatz von Elastase mit Detektion bei 550 nm, wobei beide Fluorophore absorbieren. (C) HPLC nach der Zugabe von Elastase mit Detektion bei 580 nm, wobei F² maximal absorbiert.
2 zeigt die Emissionsspektren des fluorogenen D-NorFES-A-Proteaseindikators (a) vor und (b) nach dem Zusatz von Elastase.
3 zeigt den zeitabhängigen Anstieg des fluorogenen Proteaseindikators aus 1 als eine Funktion der Zeit nach dem Zusatz von 1 Einheit Elastase.
4 zeigt die Fluoreszenzintensität des Donor-Fluorophors als eine Funktion der Zeit nach dem Zusatz von 1 Einheit Elastase. (a) Der fluorogene Proteaseindikator aus 1. (b) Die Peptidhauptkette der fluorogenen Protease aus 1, einfach mit jedem der zwei Fluorophore markiert. D-NorFES-A ist der F¹-Asp-Ala-IIe-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F²-Proteaseindikator, worin F¹ ein Donor-Fluorophor (5'-Carboxytetramethylrhodamin (C2211)) und F² ein Akzeptor- (A-) Fluorophor (Rhodamin-X-acetamid (R492)) ist. D-NorFES und A-NorFES bezeichnen jeweils ein Molekül mit derselben Peptidhauptkette, das jedoch nur eines der zwei Fluorophore trägt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Definitionen
Außer anderes definiert, tragen alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Bezeichnungen dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise unter durchschnitt lichen Fachleuten auf dem Gebiet dieser Erfindung bekannt sind. Auch wenn jegliche Verfahren und Materialien, die jenen hierin beschriebenen ähnlich oder mit ihnen äquivalent sind, bei der praktischen Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Bezeichnungen nachstehend definiert.
Die Bezeichnung "Proteasebindungsstelle" wird hierin verwendet, um auf eine Aminosäuresequenz Bezug zu nehmen, die charakteristischerweise von einer Protease erkannt und gespalten wird. Die Proteasebindungsstelle enthält eine Peptidbindung, die durch Protease hydrolysiert wird, und von den Aminosäureresten, die durch diese Peptidbindung gebunden sind, wird gesagt, dass sie die Spaltungsstelle bilden. Diese Aminosäuren sind für die Reste an den Amino- und Carboxylseiten der hydrolysierten Bindung als P₁ bzw. P₁' bezeichnet.
Ein Fluorophor ist ein Molekül, das Licht bei einer charakteristischen Wellenlänge absorbiert und anschließend das Licht am typischsten bei einer anderen charakteristischen Wellenlänge reemittiert. Fluorophore sind Fachleuten bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Rhodamin und Rhodaminderivate, Fluorescein und Fluoresceinderivate, Cumarine und Chelatbildner mit der Lanthanoid-Ionenreihe. Ein Fluorophor unterscheidet sich von einem Chromophor, das Licht zwar absorbiert, jedoch nicht auf charakteristische Weise reemittiert.
"Peptide" und "Polypeptide" sind Ketten von Aminosäuren, deren α-Kohlenstoffe über Peptidbindungen gebunden sind, die durch eine Kondensationsreaktion zwischen der α-Kohlenstoffcarboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure gebildet werden. Die terminale Aminosäure an einem Ende der Kette (Amino-Terminus) weist daher eine freie Aminogruppe auf, während die terminale Aminosäure am anderen Ende der Kette (Carboxy-Terminus) eine freie Carboxylgruppe aufweist. Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Amino-Terminus" (abgekürzt als N-Terminus) auf die freie α-Aminogruppe an einer Amino säure am Amino-Terminus eines Peptids oder auf die α-Aminogruppe (Iminogruppe, wenn sie an einer Peptidbindung beteiligt ist) einer Aminosäure an jeder beliebigen anderen Position innerhalb des Peptids. In ähnlicher Weise bezieht sich die Bezeichnung "Carboxy-Terminus" auf die freie Carboxylgruppe am Carboxy-Terminus eines Peptids oder auf die Carboxylgruppe einer Aminosäure an jeder beliebigen anderen Position innerhalb des Peptids. Peptide umfassen auch Peptidmimetika wie Aminosäuren, die über eine Etherbindung, im Gegensatz zu einer Amidbindung, gebunden sind.
Die hierin beschriebenen Polypeptide sind mit dem Amino-Terminus auf der linken und dem Carboxyl-Terminus auf der rechten Seite dargestellt. Die Aminosäuren, die die Peptidkomponenten dieser Erfindung umfassen, sind in Bezug auf die Proteasespaltungsstelle nummeriert, wobei die Nummerierung mit steigender Distanz, sowohl in Carboxyl- als auch in Amino-Richtung, von der Spaltungsstelle ansteigt. Reste auf der Carboxylseite sind entweder mit einem
versehen, wie im Fall von P₁', oder mit einem Buchstaben und einer Fußnote dargestellt, der/die die Region bezeichnet, in der sie angeordnet sind. Das
weist darauf hin, dass Reste auf der Carboxylseite der Spaltungsstelle angeordnet sind.
Die Bezeichnung "Rest" oder "Aminosäure", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Aminosäure, die in ein Peptid inkorporiert ist. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein und kann, außer es wird spezifisch eingeschränkt, bekannte Analoga natürlicher Aminosäuren umfassen, die auf ähnliche Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren funktionieren können.
Die Bezeichnung "Domäne" oder "Region" bezieht sich auf eine charakteristische Region eines Polypeptids. Die Domäne kann durch eine bestimmte strukturelle Eigenschaft, wie eine β-Kehre, eine α-Helix oder ein β-Faltblatt, durch charakteristische, durch die Domäne bildenden Aminosäuren (z.B. vorwiegend hydrophobe oder hydrophile Aminosäuren oder Wiederholungs-Aminosäuresequenzen) oder durch ihre Anordnung in einer bestimmten Region des gefalteten dreidimensionalen Polypep tids charakterisiert sein. Wie hierin verwendet, setzt sich eine Region oder Domäne aus einer Reihe von zusammenhängenden Aminosäuren zusammen.
Die Bezeichnungen "Proteaseaktivität" oder "Aktivität einer Protease" beziehen sich auf die Spaltung eines Peptids durch eine Protease. Proteaseaktivität umfasst den "Verdau" eines oder mehrerer Peptide zu einer großen Anzahl an kleineren Peptidfragmenten. Proteaseaktivität bestimmter Proteasen kann zu Hydrolyse an bestimmten Peptidbindungsstellen führen, die charakteristischerweise durch eine bestimmte Protease erkannt werden. Die bestimmte Protease kann durch die Bildung von Peptidfragmenten, die bestimmte terminale Aminosäurereste aufweisen, charakterisiert werden.
Die Aminosäuren, auf die hierin Bezug genommen wird, werden durch die folgenden Abkürzungen beschrieben:
Tabelle 1. Nomenklatur für Aminosäuren.
Fluorogene Indikatoren von Proteaseaktivität
Diese Erfindung stellt neue fluorogene Moleküle bereit, die zur Detektion von Proteaseaktivität in einer Probe nützlich sind. Die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen einen Fluorophor (Donor), der über ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer bestimmten Protease erkannt und gespalten wird, an ein "Akzeptor"-Molekül gebunden ist. Der Donor-Fluorophor wird typischerweise durch auftreffende Strahlung mit einer bestimmten Wellenlänge angeregt, die er dann bei einer anderen (längeren) Wellenlänge reemittiert. Wird der Donor-Fluorophor in großer Nähe zum Akzeptormolekül gehalten, so absorbiert der Akzeptor das durch den Fluorophor reemittierte Licht und quencht dadurch das Fluoreszenzsignal des Donormoleküls. Der Quench tritt unabhängig davon auf, ob die zwei Fluorophore einer unterschiedlichen oder derselben Spezies angehören. Somit können, zusätzlich zu Peptiden, die mit zwei verschiedenen Fluorophoren doppelt markiert sind, wie in Beispiel 1 gezeigt, auch Peptide, die mit demselben Fluorophor doppelt markiert sind, als Proteaseindikatoren verwendet werden (siehe z.B. Beispiel 6). Spaltung eines gut entworfenen Peptids (d.h. eines Peptids dieser Erfindung), das den Donor-Fluorophor und den Akzeptor verbindet, führt zur Trennung der zwei Moleküle, zur Auslösung der Quenching-Wirkung und zur Steigerung der Fluoreszenz.
In einer grundlegenden Anwendung können die fluorogenen Moleküle dieser Erfindung verwendet werden, um die Aktivität von gereinigter Protease zu testen, die als Reagens (z.B. in einer Pufferlösung) zur experimentellen oder gewerblichen Verwendung hergestellt wurde. Wie zahlreiche andere Enzyme können Proteasen im Laufe der Zeit an Aktivität verlieren, insbesondere, wenn sie in ihren aktiven Formen gelagert werden. Darüber hinaus bestehen zahlreiche Proteasen in der Natur in einer inaktiven Vorläuferform (z.B. in Form eines Zymogens), die selbst vor Verwendung durch Hydrolyse einer bestimmten Peptidbindung aktiviert werden muss, um die akti ve Form des Enzyms hervorzubringen. Da der Aktivierungsgrad variiert und da Proteasen im Laufe der Zeit an Aktivität verlieren können, ist es häufig wünschenswert zu überprüfen, ob die Protease aktiv ist, und auch die Quantifizierung der Aktivität vor Verwendung einer bestimmten Protease in einer bestimmten Anwendung ist häufig wünschenswert.
Frühere Ansätze zur Überprüfung oder Quantifizierung von Proteaseaktivität umfassen das Kombinieren einer Aliquote der Protease mit ihrem Substrat, das Ermöglichen von Verdau über eine bestimmte Zeit hinweg und das anschließende Messen der Menge an verdautem Protein, am üblichsten mittels HPLC. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig, bringt teure Mittel zum Einsatz, erfordert zahlreiche Verfahrensschritte sowie großen Arbeitseinsatz. Dahingegen ermöglichen die fluorogenen Reagenzien der vorliegenden Erfindung rasche Bestimmung von Proteaseaktivität innerhalb von einigen wenigen Minuten in einem einen einzigen Schritt umfassenden Verfahren. Eine Aliquote der zu testenden Protease wird einfach zu den fluorogenen Reagenzien dieser Erfindung zugesetzt oder wird damit kontaktiert, und die daraus resultierende Änderung der Fluoreszenz wird beobachtet (z.B. unter Verwendung eines Fluorimeters).
Zusätzlich zur Bestimmung von Proteaseaktivität in "Reagenzien"-Lösungen können die fluorogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Proteaseaktivität in biologischen Proben nachzuweisen. Die Bezeichnung "biologische Probe", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Probe, die aus einem Organismus oder aus Komponenten (z.B. Zellen) eines Organismus gewonnen werden. Die Probe kann aus jedem/r beliebigen biologischen Gewebe oder Flüssigkeit stammen. Häufig ist die Probe eine "klinische Probe", d.h. sie ist eine von einem Patienten stammende Probe. Solche Proben umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Sputum, Blutzellen (z.B. Leukozyten), Gewebe- oder feine Nadelbiopsieproben, Urin, Peritonealflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit oder Zellen daraus. Biologische Proben können auch Gewebeschnitte wie gefrorene Schnitte, die zu histologischen Zwecken entnommen wurden, umfassen.
Früher beschriebene fluorogene Proteaseindikatoren absorbieren Licht typischerweise im ultravioletten Bereich (z.B. Wang et al., s.o.). Sie sind somit zur empfindlichen Detektion von Proteaseaktivität in biologischen Proben, die typischerweise Komponenten (z.B. Proteine) enthalten, die im ultravioletten Bereich absorbieren, ungeeignet. Dahingegen absorbieren und emittieren die Fluoreszenzindikatoren der vorliegenden Erfindung im sichtbaren Bereich (400 nm bis etwa 700 nm). Diese Signale werden daher durch Hintergrundmoleküle nicht leicht gequencht, und Aktivierung der Fluorophore, d.h. Absorption von Licht, wird nicht leicht durch diese gestört; daher werden sie in biologischen Proben leicht nachgewiesen.
Darüber hinaus können die Indikatoren der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zu früheren fluorogenen Proteaseindikatoren, die häufig einen Fluorophor und einen quenchenden Chromophor verwenden, zwei Fluorophore (d.h. Fluorophor sowohl als Donor als auch als Akzeptor) oder dieselben zwei Fluorophore, die wirksam ein Dimer im Grundzustand bilden, wenn sie durch die eine der Peptidhauptketten dieser Erfindung gebunden werden, verwenden. Es können Paare von Fluorophoren ausgewählt werden, die einen sehr viel höheren Quenching-Grad als früher beschriebene Chromophor/Fluorophor-Kombinationen aufweisen. Tatsächlich waren frühere Zusammensetzungen aufgrund des geringen Quenching-Grades, der mit dem dazupassenden Chromophor erhältlich war, auf relativ wenig effiziente Fluorophore eingeschränkt (Wang et al., s.o.). Dahingegen verwenden die fluorogenen Proteaseindikatoren dieser Erfindung hocheffiziente Fluorophore und sind in der Lage, einen hohen Grad an Quenching zu erreichen, wobei sie ein starkes Signal liefern, wenn der Quench durch Spaltung des Peptidsubstrats ausgelöst wird. Das starke Signal ermöglicht die Detektion von sehr geringen Intensitäten von Proteaseaktivität. Somit sind die fluorogenen Proteaseindikatoren dieser Erfindung besonders gut zur In-situ-Detektion von Proteaseaktivität geeignet.
Für die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung gilt die allgemeine Formel:
worin F¹ ein Fluorophor ist; C¹ ₅, C¹ ₄, C¹ ₃, P₂, P₁, P₁' und P₂' jeweils eine Aminosäure sind; S¹ ein 1 bis 50 Aminosäuren langer Peptid-Spacer ist; n = 0 oder 1 ist; und, wenn n = 1 ist, S¹ über eine Peptidbindung der α-Aminogruppe von C¹ ₅ an C¹ ₅ gebunden ist; und Y eine Zusammensetzung ist, die aus der aus Verbindungen der folgenden Formeln ausgewählt ist:
worin C² ₃ und C² ₄ Aminosäuren sind; F² ein Fluorophor ist; S² ein 1 bis 50 Aminosäuren langer Peptid-Spacer ist; und k = 0 oder 1 ist; und, wenn k = 1 ist, S² über eine Peptidbindung der α-Carboxylgruppe von C² ₄ oder C² ₃ an C² ₄ oder C² ₃ gebunden ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' eine Protease-Spaltstelle ist, die zwischen P₁ und P₁' gespalten wird; und
wenn P₂' nicht Prolin ist, Y der Formel III entspricht, worin C² ₃-C² ₄ aus der aus Pro-Cys, Aib-Cys, Pro-Lys und Aib-Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
wenn P₂' Prolin ist, Y der Formel IV entspricht, worin C² ₃ aus der aus Cys und Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
wenn P₂ Prolin ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-C¹ ₄-C¹ ₃ oder Asp-C¹ ₄-Aib ist;
wenn P₂ nicht Prolin ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ aus der aus Asp-C¹ ₄-Pro, Asp-C¹ ₄-Aib, Asp-Aib-Pro, Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-Pro-Aib und Asp-Aib-Aib bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
wenn der C¹ ₃-Rest Pro ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-C¹ ₄-Pro oder Asp-Aib-Pro ist;
wenn der C¹ ₄-Rest Pro ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Pro-C¹ ₃ oder Asp-Pro-Aib ist; und
wenn P² und C¹ ₃ beide nicht Prolin sind, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ aus der aus Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-C¹ ₄-Aib und Asp-Pro-Aib bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei die Abkürzung Aib für α-Aminoisobuttersäure steht;
worin die Fluorophore F¹, F² benachbart sind und weniger als 100 Å voneinander entfernt sind.
F¹ kann der Donor-Fluorophor sein, während F² der Akzeptor-Fluorophor ist, oder umgekehrt, F² kann der Donor-Fluorophor sein, während F¹ der Akzeptor-Fluorophor ist, oder F¹ und F² können identisch sein. Die Proteasebindungsstelle liefert eine Aminosäuresequenz (ein Peptid), das von der Protease erkannt und gespalten wird, deren Aktivität der Indikator aufzeigen soll.
Die konformationsbestimmende Region ist eine Aminosäuresequenz, die eine Krümmung in das Molekül einführt. Die kombinierte Wirkung der zwei konformationsbestimmenden Regionen ist es, zwei Krümmungen in die Peptidhauptkette der Zusammensetzung einzubringen, sodass diese eine im Wesentlichen U-förmige Konformation aufweist. Diese U-förmige Konformation führt die Fluorophore, die an die Amino- und Carboxyl-Termini der C¹-Reste bzw. des/der C²-Rests/e gebunden sind, näher zueinander. Die Fluorophore sind somit vorzugsweise nebeneinander mit einer Distanz von weniger als 100 Å angeordnet. Die Fluorophore (F¹ und F²) sind typischerweise direkt an die konformationsbestimmenden Regionen konjugiert, wobei sie auch über Linker gebunden sein können. Die optionalen Spacer (S¹ und S²) werden, sofern sie vorhanden sind, verwendet, um die Zusammensetzung an einen festen Träger zu binden oder um die Zusammensetzung an einer Komponente einer biologischen Probe (z.B. an einer Zellmembran) zu verankern.
Die im Wesentlichen U-förmige Konformation erhöht die Proteasespezifität der Zusammensetzung. Die Aminosäuresequenzen, die die konformationsbestimmenden Regionen (die Arme des U) bilden, sind für das Enzym aufgrund von gegenseitiger sterischer Hinderung und sterischer Hinderung durch die angebundenen Fluorophore weniger zugänglich. Die Proteasebindungsstelle (die im unteren Abschnitt des U vor handen sind) ist weder durch den Fluorophor noch durch die konformationsbestimmende Region wesentlich versperrt und ist somit für die Protease leicht erreichbar.
Proteasebindungsstelle und konformationsbestimmende Regionen
Die Proteasebindungsstelle und die konformationsbestimmende Regionen bilden eine zusammenhängende Aminosäuresequenz (Peptid). Die Proteasebindungsstelle ist eine Aminosäuresequenz, die von einer bestimmten Protease erkannt und gespalten wird. Es ist durchwegs bekannt, dass verschiedene Proteasen Peptidbindungen, die neben bestimmten Aminosäuren liegen, spalten. Somit spaltet Trypsin beispielsweise Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren wie Arginin und Lysin, und Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen nach großen hydrophoben Aminosäureresten wie Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin und Leucin. Die Serinprotease Elastase spaltet Peptidbindungen nach kleinen hydrophoben Resten wie Alanin.
Eine bestimmte Protease spaltet jedoch nicht jede Bindung in einem Protein, die die korrekte benachbarte Aminosäure aufweist. Proteasen sind viel eher für bestimmte Aminosäuresequenzen spezifisch, die als Erkennungsdomänen für jede bestimmte Protease dienen.
Jede beliebige Aminosäuresequenz, die eine Erkennungsdomäne umfasst und somit von einer Protease erkannt und gespalten werden kann, ist für die "Proteasebindungsstelle" der fluorogenen Proteaseindikator-Zusammensetzungen dieser Erfindung geeignet. Bekannte Proteasesubstratsequenzen und Peptidinhibitoren von Proteasen besitzen Aminosäuresequenzen, die von der spezifischen Protease erkannt werden, von der sie gespalten werden oder die sie inhibieren. Somit liefern bekannte Substrat- und Inhibitorsequenzen die grundlegenden Sequenzen, die zur Verwendung in der Proteaseerkennungsregion geeignet sind. Einige Proteasesubstrate und Inhibitorsequenzen, die zur Verwendung als Proteasebindungsdomänen in den Zusammensetzungen dieser Erfindung geeignet sind, sind in Tabelle 2 angegeben. Fachleute werden erkennen, dass dies keine vollständige Liste ist und dass auch andere Proteasesubstrate oder Inhibitorsequenzen verwendet werden können.
Die die Proteasebindungsstelle umfassenden Aminosäurereste sind, wie auf dem Gebiet der Erfindung üblich, in Bezug auf die durch eine bestimmte Protease hydrolysierte Peptidbindung nummeriert. Somit ist der erste Aminosäurerest auf der Aminoseite der gespaltenen Peptidbindung als P₁ bezeichnet, während der erste Aminosäurerest auf der Carboxylseite der gespaltenen Peptidbindung als P₁' bezeichnet ist. Die Nummerierung der Reste steigt mit steigender Distanz von der hydrolysierten Peptidbindung an. Somit würde eine vier Aminosäuren lange Proteasebindungsregion Aminosäuren enthalten, die folgendermaßen bezeichnet sind: P₂-P₁-P₁'-P₂' und die Protease würde die Bindungsregion zwischen P₁ und P₁' spalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Proteasebindungsregion der fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung so ausgewählt, dass sie rund um die Spaltungsstelle symmetrisch ist. Lautet beispielsweise eine Bindungsregion Ile-Pro-Met-Ser-Ile (z.B. α-1-Antitrypsin) und tritt die Spaltung zwischen Met und Ser auf, so würde eine 4 Aminosäurereste umfassende Bindungsregion basierend auf dieser Sequenz folgend lauten: P₂ P₁ P₁' P₂' -Pro-Met-Ser-Ile-
Andere Beispiele für Bindungsdomänen, die aus längeren Sequenzen ausgewählt werden, sind in Tabelle 2 angegeben. Die verbleibenden Amino- oder Carboxylreste, die nicht innerhalb der Proteasebindungsdomäne liegen, können als Teil der konformationsbestimmenden Regionen erhalten bleiben, für die, wie nachstehend noch näher erläutert wird, bestimmte Einschränkungen gelten. Somit kann im vorliegenden Beispiel das Amino-terminale Ile in die konformationsbestimmende C¹-Region inkorporiert sein.
Verschiedene Aminosäuresubstitutionen können an den die Proteasebindungsdomäne bildenden Aminosäuren vorgenommen werden, um Bindungsspezifität zu erhöhen, um reaktive Seitenketten zu eliminieren oder um die Konformationsentropie des Moleküls herabzusetzen (die Freiheitsgrade zu reduzieren). Somit ist es bei spielsweise häufig wünschenswert, Methionin- (Met-) Reste, die einen oxidierbaren Schwefel in sich tragen, durch Norleucin zu substituieren. Somit weist im gegebenen Beispiel eine bevorzugte Proteasebindungsregion die folgende Sequenz auf: P₂ P₁ P₁' P₂' -Pro-Nle-Ser-Ile-
Konformationsbestimmende Regionen
Konformationsbestimmende Regionen (C¹ und C²) sind Peptidregionen an beiden Enden der Proteasebindungsregion, die beide versteifen und Krümmungen in die Peptidhauptkette der fluorogenen Proteaseindikatormoleküle dieser Erfindung einführen. Die Kombination der zwei konformationsbestimmenden Regionen und der relativ geraden Proteasespaltungsregion ergibt ein ungefähr U-förmiges Molekül mit der Spaltungsstelle an der Basis (in der Mitte) des "U". Die Bezeichnung U-förmig ist natürlich nur eine Annäherung, wobei der zentrale Punkt ist, dass, wie nachstehend noch beschrieben, die Fluorophore relativ steif in enger Nebeneinanderstellung (z.B. weniger als 100 Å voneinander entfernt) gehalten werden.
Aminosäuren wie Prolin (Pro) und α-Aminoisobuttersäure (Aib) werden sowohl ausgewählt, um Krümmungen in das Peptidmolekül einzuführen, als auch, um die Steifheit der Peptidhauptkette zu erhöhen. Die C¹- und C²-Domänen werden so ausgewählt, dass die "Arme" des U steif sind und die angebunden Fluorophore benachbart zueinander bei einer Entfernung von weniger als 100 Å voneinander angeordnet sind. Um die erforderliche Steifheit der Peptidhauptkette und die Anordnung der Fluorophore aufrechtzuerhalten, weisen die konformationsbestimmenden Regionen vorzugsweise eine Länge von 4 Aminosäuren oder weniger auf oder sind alternativ dazu länger als etwa 18 Aminosäuren und bilden eine stabile α-Helixkonformation oder ein β-Faltblatt.
Die Peptidhauptkette der fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung umfasst eine Tripeptid-C¹-Region, eine Tetrapeptid-P-Region und eine einzelne Aminosäure- oder Dipeptid-C²-Region. Diese Verbindungen können durch die folgende Formel dargestellt werden:
In diesen Formeln ist die Peptidbindungsregion als -P₂-P₁-P₁'-P₂'- bezeichnet, während die Aminosäurereste der konformationsbestimmenden Regionen C¹ und C² als – C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃- bzw. -C² ₃-C² ₄ bezeichnet sind. Die C²-Region kann entweder eine Aminosäure oder ein Dipeptid sein. Unabhängig davon, ob die C²-Region ein Dipeptid oder eine Aminosäure ist, sind der F²-Fluorophor und der S²-Spacer, sofern vorhanden, stets an den Carboxyl-terminalen Rest von C² gebunden. Ist ein Spacer an der C²-Region vorhanden, so ist er an den Carboxyl-terminalen Rest von C² über eine Peptidbindung der α-Carboxylgruppe gebunden.
Wie oben angegeben enthalten die konformationsbestimmenden Regionen typischerweise Aminosäurereste wie ein Prolin (Pro), die eine Krümmung in das Molekül einführen und somit seine Steifheit erhöhen. Fachleuten wird jedoch bekannt sein, dass, wenn die terminalen Reste der Proteasebindungsregion (P) selbst krümmungsbildende Reste sind, wie beispielsweise Prolin, es nicht erforderlich ist, einen krümmungsbildenden Rest an der zu P am nächsten liegenden Position in der C-Region, die an diesen Terminus gebunden ist, anzuordnen. Die konformations bestimmenden Regionen werden somit zuerst durch Bestimmen der Proteasebindungsregion, wie zuvor beschrieben, dann durch Bestimmen der "übrigen" Reste, die im gegebenen Fall in den konformationsbestimmenden Regionen liegen, und, sofern erforderlich, durch Modifizieren dieser Reste gemäß den folgenden Vorgaben entworfen:

1. Ist die P₂'-Stelle kein Pro, so ist C² ein Dipeptid (Formel III) Pro-Cys, Aib-Cys, Pro-Lys oder Aib-Lys, während umgekehrt, wenn die P₂'-Stelle Pro ist, C² ein einzelner Aminosäurerest (Formel IV) Cys oder Lys ist.
2. Ist die P₂-Stelle kein Pro, so ist C¹ ein Tripeptid bestehend aus Asp-C¹ ₄-Pro, Asp-C¹ ₄-Aib, Asp-Aib-Pro, Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-Pro-Aib oder Asp-Aib-Aib, während, wenn die P₂-Stelle ein Pro-Rest ist, die Gruppe C¹ ein Tripeptid bestehend aus Asp-C¹ ₄-C¹ ₃ oder Asp-C¹ ₄-Aib ist.
3. Ist der P₃- (C¹ ₃-) Rest Pro, dann ist C¹ ein aus der aus Asp-C¹ ₄-Pro und Asp-Aib-Pro bestehenden Gruppe ausgewähltes Tripeptid.
4. Ist der P₄- (C¹ ₄-) Rest Pro, dann ist C¹ ein aus der aus Asp-Pro-C¹ ₃ und Asp-Pro-Aib bestehenden Gruppe ausgewähltes Tripeptid.
5. Sind P₂ und C¹ ₃ beide nicht Prolin, so ist C¹ ein aus der aus Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-C¹ ₄-Aib, Asp-Pro-Aib und Asp-Aib-Pro bestehenden Gruppe ausgewähltes Tripeptid.

Wie oben angegeben kann jedes beliebige Methionin (Met) durch ein Norleucin (Nle) ersetzt werden. In Tabelle 2 sind zahlreiche geeignete Peptidhauptketten, die sich aus C¹, P und C² zusammensetzen, angegeben.
Tabelle 2: Veranschaulichung des Entwurfs der konformationsbestimmenden Regionen und Proteasebindungsstelle basierend auf bekannten Proteasesubstrat- und – inhibitorsequenzen. Reste in Kursivschrift werden hinzugefügt, um eine Krümmung zu schaffen und um die Steifheit der konformationsbestimmenden Regionen zu erhöhen. Reste in Normalschrift sind Reste des Substrats oder Inhibitors, die die Proteasebindungsstelle bilden. Die dicken Linien geben die Position an, an der die Proteasebindungsstelle gespalten wird.

^1. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Sequenz ein S₂-Spacer von Gly-Tyr folgen. Somit steht beispielsweise, wenn C² ₄ Lys ist, C² ₄-S₂ für Lys-Gly-Tyr.

"Donor"- und "Akzeptor"-Fluorophore
Ein durch die einfallende Strahlung angeregter Fluorophor absorbiert Licht und reemittiert daraufhin dieses Licht bei einer anderen (längeren) Wellenlänge. In der Gegenwart einer zweiten Klasse von Molekülen jedoch, die als "Akzeptoren" bekannt sind, wird das Licht, das durch einen so genannten Donor-Fluorophor emittiert wird, vom Akzeptor absorbiert, wodurch das Fluoreszenzsignal des Donors gequencht wird. Somit ermöglicht die Verwendung von zwei Fluorophoren, im Gegensatz zu einem Fluorophor/Chromophor-Paar, eine eindeutigere Bewertung der Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Donors und dem Anregungsspektrum des Akzeptors. Dies erleichtert den Entwurf einer Peptidhauptkette, die eine Optimierung des Quenching zulässt. Das führt wiederum zu einem hocheffizienten Donor/Akzeptor-Paar, was die Detektion von geringen Intensitäten von Proteaseaktivität erleichtert. Somit umfassen, auch wenn eine Fluorophor/Chromophor-Kombination geeignet sein kann, in einer bevorzugten Ausführungsform die fluorogenen Proteaseinhibitoren zwei Fluorophore.
Die "Donor"- und "Akzeptor"-Moleküle werden typischerweise als ein aufeinander abgestimmtes Paar ausgewählt, sodass das Absorptionsspektrum des Akzeptormoleküls mit dem Emissionsspektrum des Donormoleküls so weit wie möglich überlappt. Weiters werden die Donor- und Akzeptor-Fluorophore vorzugsweise so ausgewählt, dass sowohl das Absorptions- als auch das Emissionsspektrum des Donormoleküls im sichtbaren Bereich (400 nm bis etwa 700 nm) liegen. Die Fluorophore liefern somit ein Signal, das in einer biologischen Probe nachweisbar ist, was die Detektion von Proteaseaktivität in biologischen Flüssigkeiten, Gewebehomogenaten, in situ in Gewebeschnitten und dergleichen erleichtert. Die Emissionsspektren, Absorptionsspektren und die chemische Zusammensetzung zahlreicher Fluorophore sind Fachleuten durchwegs bekannt (siehe beispielsweise das Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, R.P. Haugland (Hrsg.)).
Bevorzugte Fluorophorpaare umfassen Rhodaminderivate. Somit ist beispielsweise 5-Carboxytetramethylrhodamin oder der Succinimidylester von 5- und/oder 6- Carboxytetramethylrhodamin (C211 bzw. C1171, erhältlich bei Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) (Formel V) ein besonders bevorzugtes Donormolekül
und Rhodamin-X-acetamid (R492 von Molecular Probes) (Formel VI) oder der Succinimidylester von 5- und/oder 6-Carboxy-X-rhodamin (C1309 von Molecular Probes) ist ein besonders bevorzugtes Rezeptormolekül.
Diese Fluorgphore sind besonders bevorzugt, da die Anregung und Emission beider Elemente dieses Donor/Akzeptor-Paars im sichtbaren Wellenlängenbereich liegen, die Moleküle hohe Extinktionskoeffizienten aufweisen und die Moleküle hohe Fluoreszenzergebnisse in Lösung zeigen. Der Extinktionskoeffizient ist ein Maß für die Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge durch den Chromophor und hängt daher mit seiner Fähigkeit zusammen, ein Signal zu quenchen, während das Fluoreszenzergebnis das Verhältnis von absorbiertem Licht zu reemittiertem Licht ist und ein Maß für die Effizienz des Fluorophors darstellt und somit die Empfindlichkeit des Proteaseindikators beeinflusst.
Natürlich können auch, wenn diese auch nicht am meisten bevorzugt sind, Fluorophore, die im Ultraviolettbereich absorbieren und emittieren, in den Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes ultraviolett absorbierendes Paar an Fluorophoren besteht aus 7-Hydroxy-4-methylcumarin-3-essigsäure als Donormolekül (Formel VII)
und 7-Diethylamino-3-((4'-iodacetyl)amino)phenyl)-4-methylcumarin (Formel VIII) als Akzeptormolekül.
Diese und andere Fluorophore sind im Handel bei zahlreichen Herstellern, wie z.B. bei Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA), erhältlich.
Es war überraschend festzustellen, dass Fluorophore, die aufeinander abgestimmte Absorptions- und Emissionsspektren aufweisen, bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich sind. Tatsächlich ist eine einzelne Art von Fluorophor, wenn sie an die Polypeptidhauptketten von dieser Erfindung an den von F¹ und F² eingenommenen Positionen gebunden wird, in der Lage, sich selbst zu quenchen. Darüber hinaus wird dieses Quenching vollständig ausgelöst, wenn die Peptidhauptkette gespalten wird.
Ohne hier eine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie zu beabsichtigen, wird angenommen, dass Quenching durch die Bildung von Dimeren im Grundzustand verursacht wird, worin die Elektronenorbitale der zwei Fluorophore wechselwirken, was zu wechselseitigem Quenching führt. Es ist die eingeschränkte Konformationsentropie der Peptidhauptketten dieser Erfindung, die Fluorophore zu ausreichend großer Nähe zueinander zwingt, um auf wirksame Weise ein Dimer im Grundzustand zu bilden.
Somit umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform die Proteaseindikatoren dieser Erfindung nur eine einzelne Art von Fluorophor. In dieser Ausführungsform gibt es keinen Bedarf, Emissions- oder Absorptionsspektren aufeinander abzustimmen, da nur ein einzelner Fluorophor verwendet wird. So können zahlreiche verschiedene Fluorophore auf wirksame Weise verwendet werden. Darüber hinaus vereinfacht die Verwendung eines einzelnen Fluorophors die chemischen Syntheseverfahren um vieles.
Herstellung fluorogener Proteaseindikatoren
Die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise zuerst durch Synthetisieren der Peptidhauptkette, d.h. der Proteasespaltungsstelle (P), der zwei konformationsbestimmenden Regionen (C¹ und C²) und der Spacer (S¹ und S²), sofern vorhanden, hergestellt. Die Fluorophore werden dann chemisch an das Peptid konjugiert. Die Fluorophore werden vorzugsweise direkt an das Peptid konjugiert, sie können jedoch auch über einen Linker an das Peptid gebunden werden. Schließlich wird der fluorogene Proteaseindikator, sofern er an einen festen Träger zu binden ist, anschließend über den Spacer (S¹ oder S²), entweder direkt oder über einen Linker, chemisch an den festen Träger konjugiert.
a) Herstellung der Peptidhauptkette
Festphasenpeptidsynthese, bei der die C-terminale Aminosäure der Sequenz an einen unlöslichen Träger gebunden wird, gefolgt von sequenziellem Zusatz der verbleibenden Aminosäuren in der Sequenz ist das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Peptidhauptkette der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Verfahren zur Festphasensynthese werden von Barany & Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, S. 3–284, in: The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Teil A., Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2156 (1963), und Gross & Meienhofer (Hrsg.), Academic Press, N.Y. (1980), und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chem. Co., Rockford III. (1984), beschrieben. Festphasensynthese erfolgt am leichtesten mit im Handel erhältlichen Peptidsynthesegeräten unter Verwendung von FMOC- oder TBOC-Chemieverfahren. Die chemische Synthese der Peptidkomponente eines fluorogenen Proteaseindikators wird im Detail in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt Peptidsynthese unter Verwendung von Fmoc-Synthesechemie. Die Seitenketten von Asp, Ser, Thr und Tyr werden vorzugsweise unter Verwendung von S-Trityl und S-t-Butylthio geschützt, und Lys-Reste werden vorzugsweise unter Verwendung von t-Boc, Fmoc und 4-Methyltrityl für Lysinreste geschützt. Geeignet geschützte Aminosäurenreagenzien sind im Handel erhältlich. Die Verwendung von Mehrfachschutzgruppen ermöglicht selektives Entblockieren und Binden eines Fluorophors an jegliche bestimmte erwünschte Seitenkette. Somit erfolgt beispielsweise t-Boc-Schutzaufhebung unter Verwendung von TFA in Dichlormethan, Fmoc-Schutzaufhebung erfolgt unter Verwendung von 20 Vol.-% Piperidin in DMF oder N-Methylpyrrolidon, und 4-Methyltrityl-Schutzaufhebung erfolgt unter Verwendung von 1 bis 5 Vol.-% TFA in Wasser oder 1 % TFA und 5 % Triisopropylsilan in DCM, S-t-Butylthio-Schutzaufhebung erfolgt in wässrigem Mercaptoethanol (10 %), t-Butyl- und t-Boc- und S-Trityl-Schutzaufhebung erfolgt unter Verwendung von TFA:Phenol:Wasser:Thioanisol Ethandithiol (85:5:5:2,5:2,5), und t-Butyl- und t-Boc-Schutzaufhebung erfolgt unter Verwendung von TFA:Phenol:Wasser (95:5:5). Detaillierte Arbeitsvorschriften zu Synthese, Schutzaufhebung und Fluorophorbindung sind in den Beispielen 1 und 2 bereitgestellt.
Alternativ dazu können die Peptidkomponenten der fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren synthetisiert werden. Kurz zusammengefasst wird ein DNA-Molekül, das für die erwünschte Aminosäuresequenz kodiert, chemisch mittels zahlreicher verschiedener Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, einschließlich des Festphasen-Phosphoramiditverfahrens, das von Beaucage & Carruthers, Tetra. Letts. 22, 1859–1862 (1981), beschrieben wurde, des Triesterverfahrens nach Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981), oder mittels jeglichen anderen Verfahrens, das Fachleuten bekannt ist, synthetisiert. Es wird bevorzugt, dass die DNA unter Verwendung von Standard-β-Cyanoethylphosphoramiditen an einem handelsüblichen DNA-Synthesegeräts unter Verwendung von Standard-Arbeitsvorschriften synthetisiert wird.
Die Oligonucleotide können, sofern erforderlich, durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, gereinigt werden. Typische Reinigungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Gelelektrophorese, Anionenaustauschchromatographie (z.B. Mono-Q-Säule, Pharmacia-LKB, Piscataway, New Jersey, USA) oder Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Verfahren zur Protein- und Peptidreinigung sind Fachleuten durchwegs bekannt. Ein Bericht über Standardverfahren ist in Methods in Enzymology, Bd. 182: Guide to Protein Purification, M. Deutscher (Hrsg.), 619–626 (1990), zu finden.
Die Oligonucleotide können zu doppelsträngiger DNA umgesetzt werden, entweder durch Anellieren mit einem komplementären Oligonucleotid oder durch Polymerisierung mit einer DNA-Polymerase. Die DNA kann in einen Vektor unter der Steuerung eines Promotors insertiert und verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transformieren, sodass die Zelle die kodierte Peptidsequenz exprimiert. Verfahren zum Klonieren und zur Expression von Peptiden sind Fachleuten bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)); Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (Berget & Kimmel (Hrsg.), San Diego: Academic Press, Inc. (1987)); oder Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. (Hrsg.), Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)).
b) Bindung der Fluorophore an die Peptidhauptkette
Die Fluorophore werden durch jedes beliebige Mittel, ausgewählt aus zahlreichen verschiedenen Mitteln, die Fachleuten bekannt sind, an die Peptidhauptkette gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Fluorophor direkt ausgehend von einer reaktiven Stelle am Fluorophor an eine reaktive Gruppe am Peptid, wie beispielsweise eine terminale Amino- oder Carboxylgruppe, oder an eine reaktive Gruppe an einer Aminosäureseitenkette, wie einer Schwefel-, einer Amino-, einer Hydroxyl- oder einer Carboxylgruppierung, gebunden. Zahlreiche Fluorophore enthalten normalerweise geeignete reaktive Stellen. Alternativ dazu können die Fluorophore derivatisiert werden, um reaktive Stellen für die Bindung an andere Moleküle bereitzustellen. Fluorophore, die mit funktionellen Gruppen zur Bindung an ein zweites Molekül derivatisiert sind, sind im Handel bei zahlreichen Herstellern erhältlich. Die Derivatisierung kann durch eine einfache Substitution einer Gruppe am Fluorophor selbst erfolgen, oder auch durch Konjugation an einen Linker. Verschiedene Linker sind Fachleuten durchwegs bekannt und werden nachstehend erläutert.
Wie zuvor angegeben, werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Fluorophore direkt an die Peptidhauptkette des Proteaseindikators gebunden. Somit kann beispielsweise das 5'-Carboxytetramethylrhodamin- (C2211) Fluorophor über die α-Aminogruppe der Aminosäure, wie in Formel V gezeigt, an Asparaginsäure gebunden werden. Die Iodacetamidgruppe von Rhodamin-X-acetamid (R492) kann durch Umsetzung mit der Sulfhydrylgruppe eines Cysteins, wie in Formel VI gezeigt, gebunden werden. Mittel zur Durchführung solcher Bindungen sind Fachleuten bekannt, und Details zu einer solcher Bindung werden in Beispiel 1 bereitgestellt.
Fachleuten wird bekannt sein, dass, wenn die Peptid-Spacer (S¹ oder S²) vorhanden sind (wie nachstehend erläutert), die Fluorophore vorzugsweise über eine reaktive Gruppe an der Seitenkette der terminalen Aminosäure von C¹ oder C² an die konformationsbestimmenden Regionen gebunden werden, da die Spacer selbst eine Peptidbindung mit den terminalen Amino- und Carboxylgruppen von C¹ bzw. C² bilden.
c) Selektion von Spacer-Peptiden und Bindung an einen festen Träger
Die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung können in Lösung erhalten werden oder an einen festen Träger gebunden sein. Ein "fester Träger" bezieht sich auf jegliches feste Material, das sich in den Lösungen, die zum Testen auf Proteaseaktivität unter Verwendung der fluorogenen Proteasemoleküle der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht auflöst oder mit darin enthaltenen Komponenten nicht reagiert und das eine funktionelle Gruppe zur Anbindung an das fluorogene Molekül bereitstellt. Feste Trägermaterialien sind Fachleuten bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Siliciumdioxid, Controlled Pore Glass (CPG), Polystyrol, Polystyrol/Latex, Carboxyl-modifiziertes Teflon, Dextran, derivatisierte Polysaccharide wie Amino- Carboxyl- oder Sulfhydrylgruppen aufweisendes Agar, verschiedene Kunststoffe wie Polyethylen, Acryl und dergleichen. Auch nützlich sind "halbfeste" Träger wie Lipidmembranen, wie sie in Zellen und in Liposomen zu finden sind. Fachleuten wird bekannt sein, dass die festen Träger mit funktionellen Gruppen (z.B. Hydroxylen, Aminen, Carboxylen, Estern und Sulfhydrylen) derivatisiert werden können, um reaktive Stellen für die Anbindung von Linkern oder die direkte Anbindung des Peptids bereitzustellen.
Die fluorogenen Proteaseindikatoren können an einen festen Träger direkt über die Fluorophore oder über die Peptidhauptkette, die den Indikator umfasst, gebunden werden. Bindung über die Peptidhauptkette wird am meisten bevorzugt.
Wird erwünscht, den Indikator über die Peptidhauptkette an einen festen Träger zu binden, so kann die Peptidhauptkette einen zusätzlichen Peptid-Spacer (in Formel I als S¹ oder S² bezeichnet) umfassen. Der Spacer kann entweder am Amino- oder am Carboxylterminus der Peptidhauptkette vorhanden sein und kann in seiner Länge von etwa 1 bis etwa 50 Aminosäuren, noch bevorzugter von 1 bis etwa 20, und am meisten bevorzugt von 1 bis etwa 10 Aminosäuren, variieren. Besonders bevorzugte Spacer umfassen Asp-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys, Lys-Glu-Asp-Gly-Gly-Asp-Lys, Asp-Gly-Ser-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys und Lys-Glu-Asp-Glu-Gly-Ser-Gly-Asp-Lys.
Die Aminosäurezusammensetzung des Peptid-Spacers ist nicht maßgeblich, da der Spacer nur dazu dient, die aktiven Komponenten des Moleküls aus dem Substrat abzutrennen und dadurch unerwünschte Wechselwirkungen zu unterbinden. Die Aminosäurezusammensetzung des Spacers kann jedoch so ausgewählt werden, dass Aminosäuren (z.B. ein Cystein oder ein Lysin) bereitgestellt werden, die Seitenketten aufweisen, an die ein Linker oder der feste Träger selbst leicht gebunden werden kann. Alternativ dazu kann der Linker oder der feste Träger selbst an den Amino-Terminus von S¹ oder den Carboxyl-Terminus von S² gebunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Peptid-Spacer tatsächlich über einen Linker an den festen Träger gebunden. Die Bezeichnung "Linker", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das verwendet werden kann, um ein Peptid an ein anderes Molekül (z.B. einen festen Träger, einen Fluorophor und dergleichen) zu binden. Ein Linker ist ein hetero- oder homobifunktionelles Molekül, das eine erste reaktive Stelle, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit dem Peptid zu bilden, und eine zweite reaktive Stelle, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe am festen Träger zu bilden, bereitstellt. Die kovalente Bindung mit dem Peptid (Spacer) kann entweder über die terminate Carobxyl- oder die terminale Amino-Gruppe oder mit reaktiven Gruppen an der Aminosäureseitenkette (z.B. über eine Disulfidbindung an ein Cystein) ausgebildet sein.
Geeignete Linker sind Fachleuten bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Kohlenstofflinker mit unverzweigter oder verzweigter Kette, heterozyklische Kohlenstofflinker oder Peptidlinker. Wie oben angegeben, können die Linker entweder an die Carboxyl- oder Amino-terminalen Aminosäuren über ihre terminalen Carboxyl- oder Aminogruppen oder über ihre reaktiven Seitenkettengruppen gebunden werden.
Besonders bevorzugte Linker sind in der Lage, kovalente Bindungen an Aminogruppen, Carboxylgruppen oder Sulfhydryl zu bilden. Aminobindungslinker umfassen reaktive Gruppen wie Carboxylgruppen, Isocyanate, Isothiocyanate, Ester, Halogenalkyle und dergleichen. Carboxylbindungslinker, die zur Bildung von Bindungen in der Lage sind, umfassen reaktive Gruppen wie verschiedene Amine, Hydroxyle und dergleichen. Schließlich umfassen Sulfhydrylbindungslinker reaktive Gruppen wie Sulfhydrylgruppen, Acrylate, Isothiocyanate, Isocyanate und dergleichen. Besonders bevorzugte Linker umfassen sulfoMBS (m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester) zur Bindung von Aminogruppen (z.B. einer Aminogruppe, die an einem Lysinrest im Peptid zu finden ist) an Sulfhydrylgruppen, die am festen Träger zu finden sind, oder umgekehrt, zur Bindung von Sulfhydrylgruppen (z.B. jenen, die an einem Cysteinrest des Peptids zu finden sind) an Aminogruppen, die am festen Träger zu finden sind. Andere, besonders bevorzugte Linker umfassen EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) und Bis(sulfosuccinimidylsuberat). Andere geeignete Linker sind Fachleuten durchwegs bekannt.
Die fluorogenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können an den festen Träger entweder über den S¹- oder den S²-Spacer so gebunden werden, dass der Donor-Fluorophor entweder nach Spaltung des Moleküls durch eine Protease am festen Träger zurückgehalten wird, oder so, dass der Donor-Fluorophor nach Spaltung in Lösung geht. Im ersten Fall wird anschließend das Substrat auf Fluoreszenz getestet, um Proteaseaktivität nachzuweisen, während im letzteren Fall die Lösung auf Fluoreszenz getestet wird, um Proteaseaktivität nachzuweisen.
Detektion von Proteaseaktivität
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung der fluorogenen Proteaseindikatoren zur Detektion von Proteaseaktivität in zahlreichen verschiede nen Zusammenhängen bereit. So stellt in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem die fluorogenen Indikatoren verwendet werden, um die Proteaseaktivität einer Stammlösung einer Protease, die zu experimentellen oder industriellen Zwecken verwendet wird, zu überprüfen oder zu quantifizieren. Die Überprüfung von Proteaseaktivität von Stammproteaselösungen vor der Verwendung wird allgemein empfohlen, da Proteasen häufig zu Verlust von Aktivität im Laufe der Zeit (z.B. durch Selbsthydrolyse) oder zu verschiedenen Graden an Aktivierung neigen, wenn sie ausgehend von Zymogenvorläufern aktiviert werden.
Das Testen einer Stammlösung auf Proteaseaktivität erfordert einfach den Zusatz einer Menge an Stammlösung zu einem fluorogenen Proteaseindikator der vorliegenden Erfindung und das Messen der daraus resultierenden Fluoreszenzsteigerung. Die Stammlösung und der fluorogene Indikator können auch kombiniert und in einem "Verdauungspuffer" getestet werden, der die Aktivität der Protease optimiert. Puffer, die zum Testen von Proteaseaktivität geeignet sind, sind Fachleuten durchwegs bekannt. Im Allgemeinen wird ein Puffer ausgewählt, dessen pH dem pH entspricht, der für die bestimme Protease optimal ist. Ein Puffer, der zum Testen von Elastaseaktivität besonders geeignet ist, besteht beispielsweise aus 50 mM Natriumphosphat und 1 mM EDTA bei pH 8,9. Die Messung erfolgt ganz einfach in einem Fluorometer, einem Instrument, das eine "Anregungs"-Lichtquelle für den Fluorophor bereitstellt und anschließend das daraufhin bei einer bestimmten Wellenlänge emittierte Licht misst. Ein Vergleich mit einer Kontrollindikatorlösung, in der keine Protease vorhanden ist, liefert ein Maß für die Proteaseaktivität. Der Aktivitätsgrad kann präzise durch Bilden einer Standardkurve für die Protease/Indikator-Kombination quantifiziert werden, in der die Rate der Fluoreszenzänderung, die von Proteaselösungen mit bekannter Aktivität hervorgerufen wird, bestimmt wird.
Während die Detektion der fluorogenen Verbindungen vorzugsweise unter Verwendung eines Fluorometers erfolgt, kann Detektion mittels zahlreicher anderer Verfahren, die Fachleuten durchwegs bekannt sind, durchgeführt werden. Somit kann beispielsweise, da die Fluorophore der vorliegenden Erfindung im Bereich sichtbarer Wellenlängen emittieren, Detektion einfach durch Sichtprüfung der Fluoreszenz als Reaktion auf Anregung durch eine Lichtquelle erfolgen. Detektion kann auch mittels eines Bildanalysesystems unter Verwendung einer Videokamera erfolgen, die über eine Schnittstelle mit einem Digitalisierungs- oder anderen Bildgebungssystem verbunden ist. Detektion kann auch über Sichtbarmachung durch ein Filter, wie beispielsweise unter einem Fluoreszenzmikroskop, erfolgen. Das Mikroskop kann lediglich ein Signal bereitstellen, das durch den Betreiber betrachtet wird. Das Signal kann jedoch auch an einem Photofilm oder unter Verwendung eines Videoanalysesystems aufgezeichnet werden. Das Signal kann auch einfach in Echtzeit unter Verwendung entweder eines Bildanalysesystems oder einfach eines Photometers quantifiziert werden.
Somit umfasst beispielsweise ein grundlegender Test zur Bewertung von Proteaseaktivität einer Probe das Suspendieren oder Auflösen der Probe in einem Puffer (bei den optimalen pH-Werten für die bestimmte, zu testende Protease), das Zusetzen von einem der fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung zum Puffer und das Beobachten der resultierenden Veränderung der Fluoreszenz unter Verwendung eines Spektralfluorometers. Das Spektralfluorometer wird so eingestellt, dass es den Donor-Fluorophor bei der Anregungswellenlänge des Donor-Fluorophors anregt und die resultierende Fluoreszenz bei der Emissionswellenlänge des Donor-Fluorophors nachweist.
In einer anderen Ausführungsform können die Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung zur Detektion von Proteaseaktivität in biologischen Proben verwendet werden. Somit liefert in einer bevorzugten Ausführungsform diese Erfindung Verfahren zur Detektion von Proteaseaktivität in isolierten biologischen Proben, wie Sputum, Blut, Blutzellen, Tumorbiopsien und dergleichen, oder in situ, in Zellen oder Geweben in Kultur, oder in Gewebeschnitten, worin die Schnitte nicht eingebettet und nicht fixiert sind.
a) Ex-vivo-Tests von isolierten biologischen Proben
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion von Proteaseaktivität in einer isolierten biologischen Probe bereit. Dies kann durch einfaches Kontaktieren der Probe mit einem fluorogenen Proteaseindikator der vorliegenden Erfindung und Beobachten der Veränderung von Fluoreszenz des Indikators im Laufe der Zeit bestimmt werden. Die Probe kann in einem "Verdauungspuffer" wie zuvor beschrieben suspendiert werden. Die Probe kann auch von Zelltrümmern, z.B. durch Zentrifugation vor der Analyse, geklärt werden.
Ist der fluorogene Proteaseindikator an einen festen Träger gebunden, so kann der Test das Kontaktieren des festen Trägers, der den Indikator trägt, mit der Probenlösung umfassen. Ist der Indikator an den festen Träger über die Seite des Moleküls gebunden, die den Donor-Fluorophor trägt, so wird die Fluoreszenz des Trägers, die aus Verdau des Indikators resultiert, dann im Laufe der Zeit durch jedes beliebige der zuvor beschriebenen Mittel beobachtet. Umgekehrt kann, wenn das Akzeptormolekül-Fluorophor an einen festen Träger gebunden ist, die Testlösung über den festen Träger geführt werden, und anschließend wird die resultierende Lumineszenz der Testlösung (ausgelöst durch das gespaltene Fluorophor) gemessen. Dieser letzte Ansatz kann für automatisierte Tests mit hohem Durchsatz besonders geeignet sein.
b) In-situ-Tests an histologischen Gewebeschnitten
In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Proteaseaktivität in situ in histologischen Gewebeschnitten bereit. Dieses Verfahren zur Detektion von Proteaseaktivität in Geweben bietet signifikante Vorteile gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik (z.B. spezifische Färbungen, Antikörpermarkierungen und dergleichen), da, im Gegensatz zu einfachen Markierungsverfahren, In-situ-Tests unter Verwendung der Proteaseindikatoren tatsächliche Aktivität angeben, und nicht nur einfach die Gegenwart oder Abwesenheit der Protease. Proteasen sind in Geweben häufig in ihren inaktiven Vorläufer- (Zymogen-) Formen vorhanden, die in der Lage sind, Proteasemarkierungen zu binden. Somit lie fern herkömmliche Markierungsansätze keine Information bezüglich des physiologischen Zustandes in Bezug auf die Proteaseaktivität des Gewebes.
Das In-situ-Testverfahren umfasst im Allgemeinen das Bereitstellen eines Gewebeschnitts (vorzugsweise eines gefrorenen Gewebeschnitts), das Kontaktieren des Schnitts mit einem der fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung und das Sichtbarmachen der resultierenden Fluoreszenz. Sichtbarmachung erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Das Fluoreszenzmikroskop stellt eine "Anregungs"-Lichtquelle bereit, um Fluoreszenz des "Donor"-Fluorophors zu induzieren. Das Mikroskop ist typischerweise mit Filtern ausgestattet, um die Detektion der resultierenden Fluoreszenz zu optimieren. Somit würde beispielsweise für die in Beispiel 1 beschriebenen fluorogenen Proteaseindikatoren ein typischer Filterwürfel für ein Nikon-Mikroskop einen Anregungsfilter (λ = 550 ± 12 nm), einen Zweifarbenspiegel (λ = 580 nm) und einen Interferenzemissionsfilter (λ = 580 ± 10 nm) enthalten. Wie oben angegeben, kann das Mikroskop mit einer Kamera, einem Photometer oder einem Bildgebungssystem ausgestattet sein.
Die Gewebeschnitte werden vorzugsweise als gefrorene Schnitte geschnitten, da Fixierung oder Einbettung Proteaseaktivität in der Probe zerstören würde.
Der fluorogene Indikator kann auf verschiedene Wege in die Schnitte eingeführt werden. Der fluorogene Proteaseindikator kann beispielsweise in einer Pufferlösung, wie zuvor beschrieben, bereitgestellt werden, die auf den Gewebeschnitt aufgetragen wird. Alternativ dazu kann der fluorogene Proteaseindikator in Form eines halbfesten Mediums wie eines Gels oder Agars bereitgestellt werden, das über die Gewebeprobe verteilt wird. Das Gel hilft, Feuchtigkeit in der Probe zurückzuhalten, während ein Signal als Reaktion auf Proteaseaktivität abgegeben wird. Der fluorogene Proteaseindikator kann auch konjugiert an ein Polymer wie beispielsweise einen Kunststofffilm bereitgestellt werden, der in Verfahren verwendet werden kann, die der Entwicklung von Western-Blots ähnlich sind. Der Kunststofffilm wird über der Gewebeprobe am Objektträger platziert, und die aus gespaltenen Indikatormolekülen resultierende Fluoreszenz wird im Probengewebe unter einem Mikroskop betrachtet.
Typischerweise muss die Gewebeprobe eine bestimmte Zeit lang inkubiert werden, um die Spaltung endogener Proteasen zu den fluorogenen Proteaseindikatoren zu ermöglichen. Inkubationszeiten liegen im Bereich von 10 bis 60 Minuten, bei Temperaturen von bis zu und einschließlich 37 °C.
c) In-situ-Tests von Zellen in Kultur
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Detektion von In-situ-Proteaseaktivität von Zellen in Kultur bereit. Die kultivierten Zellen werden entweder auf Kammerobjektträgern oder in Suspension gezüchtet und anschließend auf Histologie-Objektträger durch Zytozentrifugation übertragen. Der Objektträger wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit einem halbfesten Polymer oder einer Lösung, die den fluorogenen Proteaseindikator enthält, beschichtet. Der Objektträger wird bei 37 °C über jenen Zeitraum hinweg inkubiert, der für die endogenen Proteasen erforderlich ist, um den Proteaseindikator zu spalten. Der Objektträger wird dann unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit den geeigneten Filtern, wie zuvor beschrieben, ausgestattet ist, untersucht.
Set zur Detektion von Proteaseaktivität
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set zur Detektion von Proteaseaktivität in Proben bereit. Die Sets umfassen ein oder mehrere Behältnisse, die die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Indikatoren können in Lösung oder gebunden an einen festen Träger bereitgestellt werden. Somit können die Sets Indikatorlösungen oder Indikator-"Messstäbchen", Blotter, Kulturmedien und dergleichen enthalten. Die Sets können auch Indikatorpatronen (wenn der fluorogene Indikator über die "Akzeptor"-Fluorophorseite an den festen Träger gebunden ist) zur Verwendung in automatisierten Proteaseaktivitäts-Detektoren enthalten.
Die Sets können darüber hinaus Anweisungsmaterial umfassen, das das Verfahren erläutert und die Verwendung der Komponenten des Sets beschreibt. Weiters können die Sets auch andere Reagenzien, Puffer, verschiedene Konzentrationen an Proteaseinhibitoren, Stammproteasen (zur Bildung von Standardkurven und dergleichen), Kulturmedien, Wegwerfküvetten und dergleichen umfassen, um die Detektion von Proteaseaktivität unter Verwendung der fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung zu unterstützen.
BEISPIELE
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele werden als Veranschaulichung, aber nicht als Einschränkung, bereitgestellt.
Beispiel 1
Synthese von fluorogenem Molekül zur Detektion von Proteaseaktivität
a) Synthese der Peptidhauptkette
Die Aminosäuresequenzen Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys (worin C¹ Asp-Ala-Ile ist, P Pro-Nle-Ser-Ile ist und C² Pro-Cys ist) und Asp-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Cys (worin C¹ Asp-Ala-Ile ist, P Pro-Met-Ser-Ile ist und C² Pro-Cys ist) wurden manuell unter Verwendung eines t-Boc-Cys-Pam-Harzes und von t-Boc-Chemie unter Einsatz der Arbeitsvorschrift für einen Bindungszyklus, der in Tabelle 3 unten angegeben ist, synthetisiert. Der Schutz der synthetisierten Peptide wurde durch Behandlung mit Flusssäure 60 min lang unter nichtwässrigen Bedingungen bei einer Temperatur von 4 °C aufgehoben.
Tabelle 3. Reaktionsschritte für einen Bindungszyklus (Zusatz einer Aminosäure) für die Synthese der Peptidhauptkette der fluorogenen Proteaseindikatoren.
Rohe, nach HF entschützte und gespaltene Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer präparativen C₁₈-Säule (YMC, Inc., Charlestown, North Carolina, USA) gereinigt. Das verwendete Lösungsmittelsystem war Wasser und Acetonitril, das 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt. HPLC wurde unter Verwendung des folgenden Gradienten bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/min durchgeführt:
Tabelle 4. HPLC-Gradient zur Reinigung der Peptidhauptkette.
Die Reinigung von Methionin-hältigen Peptiden erforderte das Aussetzen des Peptids gegenüber Reduktionsbedingungen, z.B. Dithiothreit (DTT) und Hitze, um Methioninoxid zu Methionin zu reduzieren. Diese Reduktionsbehandlung erfolgte durch Auflösen des Peptids in 150 mM Natriumphosphatpuffer mit 1 mM DTT, pH 7,5, 30 min lang bei 60 bis 80 °C. Die Reduktion hätte auch unter einem schwach sauren pH mit 0,03 N HCl durchgeführt werden können, dies hätte jedoch eine längere Erwärmungszeit benötigt. Für die daraufhin HPLC-gereinigten, Methionin-hältigen Peptide wurde erkannt, dass sie bei Lagerung in wässriger Lösung oder in lyophilisierter Form oxidierten. Die oxidierten Peptide wurden bei Wiederholung der oben genannten Reduktionsbedingungen als reduzierbar erkannt.
b) Derivatisierung der Peptidhauptkette mit den Fluorophor-Molekülen.
Die Peptide wurden nacheinander mit Donor- und Akzeptor-Fluorophoren derivatisiert. Insbesondere der Donor-Fluorophor (5'-Carboxytetramethylrhodamin (C2211), erhältlich bei Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon, USA) wurde zuerst kovalent an den Amino-Terminus des Peptids gebunden. Das Peptid und die Sonde wurden, bei einem Molverhältnis von 3:1 Peptid:Sonde, in einer minimalen Menge an Lösungsmittel NMP (N-Methylpyrrolidon), üblicherweise 20 bis 60 μl, aufgelöst. Ein molares Äquivalent von DIEA (Diisopropylethylamin) wurde ebenfalls zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Reaktion wurde dann bei 37 °C inkubiert, wobei die Inkubationszeiten im Bereich zwischen 12 Stunden und 3 Tagen lagen. Nach zwei Tagen wurde gelegentlich ein zusätzliches 1-molares Äquivalent an Farbstoffmolekül zugesetzt. Die Derivatisierung erreichte nach 3 Tagen beinahe ein maximales Ergebnis.
Das das einzelne C2211-Fluorophor tragende Peptid wurde anschließend wie nachstehend beschrieben HPLC-gereinigt.
Das zweite (Akzeptor-) Fluorophor (Rhodamin-X-acetamid (R492)) wurde dann an das Carboxylcystein des Peptids über eine Bindung zwischen der Iodacetamidgruppe des Fluorophors und der Sulfhydrylgruppe des terminalen Cysteins gebunden. Diese Bindung wurde dann wie oben für den ersten Fluorophor beschrieben abgeschlossen.
Der vollständige fluorogene Proteaseindikator wurde anschließend mittels HPLC unter Verwendung einer analytischen Umkehrphasen-C₃-Säule (2 ml Leervolumen) von Waters Associates Inc. (Milford, Massachusetts, USA) unter Verwendung des in Tabelle 4 gezeigten Gradienten, laufen gelassen bei 1 ml/min, gereinigt.
Tabelle 5. HPLC-Gradient zur Reinigung der Fluorophor-tragenden Peptide.
Die langsame Reaktivität sowohl der Amino- als auch der Sulfhydrylgruppen bei der Bindung der Fluorophore schien eine Folge der gefalteten Struktur der Peptidhauptkette zu sein, die den Zugang zu den reaktiven Gruppen des Peptids sterisch behinderte. Kontrollversuche unter Verwendung irrelevanter unverzweigter Peptide zeigten beträchtlich raschere Bindung. Die gefaltete Struktur wird auch durch die in den Beispielen 2 und 3 erhaltenen Resultate erhärtet. Ein Computer-Energieminimierungsmodell des Peptids wies auch auf mögliche Präferenz des Peptids hin, eine gefaltete und keine geöffnete, verlängerte Struktur anzunehmen. Dies ist größtenteils der Gegenwart der konformationsbestimmenden Regionen zuzuschreiben, die die zwei Prolinreste enthalten.
Beispiel 2
Alternative Synthese von Proteaseaktivitätsindikatoren
a. Fmoc-geschützte Peptidhauptkettensynthese
Die in Tabelle 6 aufgelisteten Aminosäuresequenzen wurden manuell unter Verwendung von Fmoc-Chemieverfahren und 2-Chlortritylchloridharz unter Einsatz der Arbeitsvorschrift für einen Bindungszyklus, die in Tabelle 7 unten dargestellt ist, synthetisiert. Tabelle 6. Proteaseindikator-Peptidhauptketten.
Die synthetisierten Peptide wurden aus dem 2-Chlortritylchloridharz mit milder Säurebehandlung (Vol./Vol.-Verhältnis von 2:7:1 Essigsäure:Dichlormethan:Trifluorethanol) bei Raumtemperatur 30 min lang gespalten. Eine 10-ml-Aliquote von dieser Peptidharz-Spaltungslösung wurde zu 0,1 mg getrocknetem Peptidharz zugesetzt. Die folgenden Seitenkettenschutzgruppen wurden in der Synthese verwendet: t-Butyl für Asp-, Ser-, Thr- und Tyr-Reste, S-Trityl und S-t-Butylthio für Cys-Reste, und t-Boc, Fmoc und 4-Methyltrityl für Lysinreste.
Die Seitenkettenschutzgruppen sowie die Fmoc-Gruppe an der α-Aminogruppe des synthetisierten Peptids wurden nicht mit diesem mild sauren Peptidharz-Spaltungsreagens gespalten. Die das geschützte Peptid enthaltende Lösung wurde lyophilisiert. Die lyophilisierten geschützten Peptide wurden weiter entweder durch 30 Vol.% TFA in Dichlormethan für t-Boc-Schutzaufhebung, 20 Vol.-% Piperidin in DMF oder N-Methylpyrrolidon für Fmoc-Schutzaufhebung, 1 bis 5 Vol.-% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser oder 1 % TFA/5 % Triisopropylsilan in DCM für 4-Methyltrityl- Schutzaufhebung, wässriges Mercaptoethanol (10 %) für S-t-Butylthio-Schutzaufhebung, TFA:Phenol:Wasser:Thioanisol:Ethandithiol = 85:5:5:2,5:2,5 für t-Butyl-, t-Boc- und S-Trityl-Schutzaufhebung und TFA:Phenol:Wasser = 90:5:5 für t-Butyl- und t-Boc-Schutzaufgebung behandelt.
Peptide mit vollständig oder teilweise ungeschützten Seitenketten wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule mit einem Wasser/Acetonitril-Gradienten, der 0,075 Vol.-% TFA in jedem Lösungsmittel enthielt, gereinigt.
b. Derivatisierung der geschützten Peptidhauptkette mit Fluorophoren
Das vollständig gereinigte, geschützte Peptid wurde weiter mit den geeigneten Reagenzien zur selektiven Schutzaufhebung der Seitenketten von Cys- oder Lys-Resten behandelt. Die Verwendung von drei verschiedenen Schutzgruppen, d.h. der t-Boc-, Fmoc- und 4-Methyltritylgruppe, zum epsilon- (ε-) Aminogruppenschutz von Lysin ermöglichte selektive Schutzaufhebung und somit selektive Derivatisierung eines spezifischen Lysinrests.
Etwa 1 mg geschütztes Peptid wurde in einer minimalen Menge an N-Methylpyrrolidon aufgelöst. Der geeignete Fluorophor, derivatisiert mit einer reaktiven funktionellen Succinimidylester-Gruppe, wurde zur Peptidlösung bei einem 1,2- bis 2fachen molaren Überschuss an reaktivem Fluorophor gegenüber dem Peptid zugesetzt. Ein zehnfacher molarer Überschuss an Diisopropylethylamin (DIEA) wurde ebenfalls zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2 bis 4 h lang laufen gelassen. Die derivatisierten Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C18- oder C4-Säule und einem 0,075 Vol.-% TFA-hältigen Wasser/Acetonitril-Lösungsmittelsystem gereinigt.
Die Derivatisierung des Peptids mit dem ersten Fluorophor wurde durch die Gegenwart von zumindest einer stark hydrophoben Gruppe wie Fmoc erleichtert. Die Gegenwart solch einer hydrophoben Gruppe am Peptid ermöglichte die Elution (z.B. das Abtrennen) des derivatisierten Peptids weg von Fluorophorverunreinigungen und Reaktionsnebenprodukten und Abbauprodukten, die sich während des Ablaufs der Derivatisierungsreaktion ansammeln.
Die Schutzaufhebung der Fmoc-Gruppe wurde dann durchgeführt, nachdem eine Aminogruppe oder Sulfhydrylgruppe mit dem erwünschten Fluorophor derivatisiert worden war. Die für die Aminogruppenkonjugation verwendeten Fluorophore waren C1171, 5- (und 6-) Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester, C1309, 5- (und 6-) Carboxy-X-rhodaminsuccinimidylester und Fluoresceinisothiocyanat. Nach Schutzaufhebung wurde ein zweiter Fluorophor auf identische Weise wie beim Zusatz des ersten hinzugefügt.
Tabelle 7. Reaktionsschritte für einen Bindungszyklus (Hinzufügen einer Aminosäure) zur Synthese der Peptidhauptkette der fluorogenen Proteasesubstrate.
c. Charakterisierung des Molekulargewichts der derivatisierten Peptide
Da während oder nach der Derivatisierung der geschützten Peptide manchmal ein stark sauerer Schutzaufhebungsschritt verwendet wurde, um die verbleibenden t-Butylgruppen aus den verschiedenen Aminosäureseitenketten zu entfernen, bestand die Möglichkeit, dass entweder aromatische Aminosäuren oder Fluorophore che misch modifiziert worden waren. Die Molekulargewichte der derivatisierten und gereinigten Peptide wurden daher bestimmt.
Molekulargewichte wurden unter Verwendung eines matrixbasierten Laser-Desorptions-Flugzeitmassenspektrometers, Kompact MALDI I von Kratos Analytical, gemessen. Das Massenspektrometer wurde mit Leucin-Enkephalin (556,6 amu), Bradykinin (1.016,2 amu) und Mellitin (2.847,5 amu) kalibriert. Die verwendete Probenmatrix war α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure. Proben wurden auf das Target aufgetragen, und 1 ml 0,1 % TFA in Ethanollösung wurde zum Target zugesetzt und dann getrocknet. Daten aus kumulativen Massenspektren aus 50 Laserschüssen wurden gesammelt, und ein Peak, der dem Ausgangs-Massenpeak + 1 für jede Probe entsprach, wurden bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Die gute Übereinstimmung zwischen den berechneten und den experimentell bestimmten Massenwerten weist auf die Abwesenheit jeglicher Nebenreaktionsprodukte in den gereinigten, Fluorophor-konjugierten Endpeptiden hin.
Tabelle 8. Berechnete und bestimmte Molekularmasse der derivatisierten Peptidproteasesubstrate. Die vertikale und horizontale Linie geben die Fluorophor-Anbindung an die epsilon-Aminogruppe von Lysin an. Die Symbole Fl, C1171 und C1309 stehen für die Fluorophore Fluoresceinisothionat, 5- (und 6-) Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester bzw. 5- (und 6-) Carboxy-X-rhodaminsuccinimidylester. ND steht für nicht bestimmt.
Beispiel 3
Die fluorogenen Proteaseindikatoren liefern ein starkes Signal, wenn sie verdaut werden
Um zu zeigen, dass die fluorogenen Proteaseindikatoren dieser Erfindung leicht durch eine Protease verdaut werden, wurde der Grad der Spaltung durch Testen auf das Auftreten von Indikator-Spaltungsprodukten in Gegenwart einer Protease bestimmt.
Etwa 1 μg Proteaseindikator mit der Formel F¹-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F², worin F¹ ein Donor-Fluorophor (5'-Carboxyltetramethylrhodamin (C2211)) ist, gebunden an Asparaginsäure über die α-Aminogruppe, und F² ein Akzeptor-Fluorophor (Rhodamin-X-acetamid (R492)) ist, gebunden über die Sulfhydrylgruppe des Cysteins, wurde in einem Puffer, der aus 50 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA bei pH 8,9 bestand, aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde 1 Einheit Elastase zugesetzt. Die Lösung wurde vor und etwa 30 min nach dem Zusatz von Elastase mittels HPLC analysiert. Der Verdau wurde bei 37 °C ausgeführt. Die mittels HPLC getrennten Komponenten wurden bei einer Wellenlänge von 550 nm beobachtet, was die Detektion sowohl des C2211-Fluorophors als auch des R492-Fluorophors ermöglichte, und bei 580 nm, was die Detektion des R492-Fluorophors ermöglichte.
Die Resultate sind in 1 angegeben, die die HPLC-Profile der fluorogenen Proteaseindikatorlösung vor und nach dem Zusatz der Protease Elastase zeigt. 1(a) zeigt die HPLC vor Zusatz der Elastase, die einen einzelnen Peak aufweist, der für den intakten fluorogenen Proteaseinhibitor steht. Nach Zusatz der Elastase (1(b) und 1(c)) gab es keine Spur des späten Elutionspeaks (1(a)), was auf vollständigen Verdau des fluorogenen Proteaseindikators hinweist. Darüber hinaus weisen die vorherrschenden Peaks in 1(b) und 1(c) darauf hin, dass der Verdau primär an einer einzelnen Stelle auftrat. Es gibt ein paar kleinere Peaks, die auf ein geringes Maß an Verdau an anderen Stellen innerhalb der Peptidsequenz hinweisen, wobei jedoch die auffallende Überlegenheit von nur zwei Verdauungspeaks schließen lässt, dass diese sekundären Stellen für die Elastase nicht leicht zugänglich waren.
Veränderungen im Emissionsspektrum des fluorogenen Proteaseindikators nach dem Zusatz einer Elastaseprotease wurden unter Verwendung eines SLM-Spektralfluorometers des Modells 48000 mit Spaltbreiten von 4 nm sowohl auf den Anregungs- als auch Emissionsseiten beobachtet. Alle Messungen erfolgten bei 37 °C.
Die Spektren in 2 zeigen Emission des fluorogenen Proteaseindikators (a) vor und (b) nach dem Zusatz von Elastase, während der zeitabhängige Anstieg der Emissionsintensität des Donor-Fluorophors des Indikators nach dem Zusatz von Elastase im Diagramm in 3 dargestellt ist. Der fluorogene Proteaseinhibitor zeigte mehr als einen 10fachen Anstieg der Fluoreszenz bei 589 nm nach der Behandlung mit der Elastaseprotease (2(a), verglichen mit 2(b)), mit mehr als einem 5fachen Anstieg der Fluoreszenz, der innerhalb der ersten 1.000 Sekunden der Aussetzung gegenüber der Protease eintrat. Die Veränderungen der Intensität zwischen behandelten und unbehandelten Indikatoren sind zu einem gewissen Maß eine Funk tion der verwendeten Spaltbreiten, da sie das über die gesamte bestimmte Spaltbreite integrierte Signal repräsentieren. Somit wurde, wenn breitere Spaltbreiten verwendet wurden (z.B. 8 oder 16 nm breite Spalte), ein sogar noch größeres Signal als Reaktion auf Verdau bereitgestellt.
Beispiel 4
Das Fluoreszenzsignal war auf intramolekulares Energie-Dequenching zurückzuführen
Um zu zeigen, dass der beobachtete Fluoreszenzanstieg nach Proteasebehandlung auf intramolekulares Energie-Dequenching zurückzuführen war, wurde das durch Elastase-Verdau des fluorogenen Proteaseindikators produzierte Signal mit dem Signal verglichen, das durch Elastasebehandlung derselben Peptidhauptkette, entweder an F¹ (C2211) oder an F² (R492) gebunden, produziert wurde. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität des Donor-Fluorophors nach Zusatz von 1 Einheit Elastase zu gleichen Konzentrationen des Doppel-Fluorophormoleküls und der zwei Einzel-Fluorophormoleküle.
Die Resultate sind in 4 veranschaulicht. Das Doppel-Fluorophormolekül zeigte anfänglich beinahe komplettes Quenching, gefolgt von einem drastischen Anstieg der Fluoreszenz nach Zusatz der Elastase, der einen konstanten Wert etwa 30 min nach Zusatz der Elastase erreichte (4(a)). Dahingegen zeigten die zwei Einzel-Fluorophormoleküle praktisch kein anfängliches Quenching und keine signifikante Veränderung der Fluoreszenz nach Zusatz der Elastase. Tatsächlich war das Fluoreszenzniveau mit dem Fluoreszenzniveau des vollständig verdauten Doppel-Fluorophorindikatormoleküls vergleichbar (4(b)).
Diese Resultate weisen darauf hin, dass der Anstieg der Fluoreszenzintensität des fluorogenen Proteaseindikators auf eine Unterbrechung der Resonanzenergie, die intramolekular vom Donor-Fluorophor zum Akzeptor-Fluorophor übertragen wird, und nicht auf eine Wechselwirkung zwischen dem Fluorophor und der Peptidhauptkette zurückzuführen ist. Dies ist bedeutend, da bekannt ist, dass bei Bindung an ein gro ßes Protein oder ein hydrophobes Peptid die Fluoreszenz zahlreicher hydrophober Fluorophore gequencht wird.
Beispiel 5
Ohne hier eine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie vorzunehmen, wird angenommen, dass die fluorogenen Proteaseindikatoren der vorliegenden Erfindung aufgrund ihrer gefalteten Struktur, insbesondere aufgrund ihrer relativ steifen, U-förmigen Konformation, einen hohen Grad an Proteasespezifität erreichen. Die aus dem Molekül gewonnene Fluoreszenz spiegelt die durchschnittliche Trennung von zwei Fluorophoren wider. Somit wurde vorhergesagt, dass, wenn die Proteaseindikatoren in einem relativ ungefalteten oder flexiblen Zustand existierten, Bedingungen, die dazu neigen, Auffaltung (Denaturierung) zu verursachen, wenig oder keine Wirkung auf die Fluoreszenz des Moleküls in Abwesenheit einer Protease zeigen würden. Umgekehrt würde erwartet werden, dass, wenn das Molekül relativ steif ist, denaturierende Bedingungen das Fluoreszenzsignal steigern würden, da erwartet werden würde, dass die durchschnittliche Trennung der Fluorophore ansteigen und dadurch die Quenchingwirkung reduzieren würde.
Somit wurde die Wirkung von denaturierenden Bedingungen auf die Fluoreszenz des fluorogenen Proteaseindikators in Abwesenheit einer Protease bestimmt. Zuerst wurde die Veränderung von Fluoreszenz des Indikators aus Beispiel 1 als eine Funktion der Temperatur gemessen. Relative Fluoreszenzintensität (des Donor-Fluorophors) stieg etwa linear ausgehend von einem Wert von etwa 0,6 (relative Fluoreszenzeinheiten (RUs)) bei 25 °C auf einen Wert von etwa 1,2 RUs bei 50 bis 55 °C an und erreichte hiernach einen Höchstwert.
In ähnlicher Weise steigt, wenn mit einem chaotropen Mittel (2 M oder 8 M Harnstoff) denaturiert wird, die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit und erreicht zu dem Zeitpunkt einen Höchstwert, zu dem das Molekül denaturiert (aufgefaltet) ist.
Diese Daten weisen darauf hin, dass der fluorogene Proteaseindikator normalerweise in einer stabilen gefalteten Konformation vorliegt, die durch die konformationsbestimmenden Regionen geschaffen wird, wie anhand eines Modells basierend auf einem Energieminimierungsalgorithmus vorhergesagt wurde. Der Höchstwert der Fluoreszenz weist verbleibendes Quenching der Fluorophore auf, die stets durch die vollständig denaturierte Peptidhauptkette gebunden sind. Verdau des verlängerten (denaturierten) Peptids führt zu mehr als einem 2fachen Anstieg der Fluoreszenz, da die Fluorophore in der Lage sind, sich weiter auseinander zu bewegen.
Beispiel 6
Quenching und Freisetzung eines Peptids, das mit einem Fluorophor doppelt markiert ist
Eine überraschende Entdeckung dieser Erfindung war, dass die Peptidhauptketten dieser Erfindung, die mit einem Fluorophor doppelt markiert waren, stets Fluoreszenz-Quenching erreichen, was auf eine Art von Quenching durch einen anderen Mechanismus als Resonanzenergietransfer hinweist.
Um das Ausmaß von Dimerisierung im Grundzustand und von Stoß-Quenching als Beitrag zum gesamten beobachteten Quenching zu bewerten, wurden die in Tabelle 9 aufgelisteten, doppelt-markierten Peptide synthetisiert.
Zusätzlich zu einem Vergleich von Absorptionsspektren der Farbstoffe alleine mit den NorFes-Peptiden, die einfach mit jedem Farbstoff markiert waren, wurden die Emissionsspektren vor und nach der Spaltung verglichen, um den Prozentsatz an Quenching und die Existenz von Fluoreszenzsignalquenching durch andere Mittel als durch Resonanzenergietransfer (RET) zu bestimmen.
Fluorophore wurden an den Amino-Terminus über die α-Aminogruppe von Asparaginsäurerest (D) und die ε-Aminogruppe von Lysin (K) gebunden. Markierung erfolgte durch die Ersetzung einer Succinimidylgruppe, die an C1171 oder C1309 gebunden war. Die Struktur des Peptids, bezeichnet als NorFES-KGY, lautet:
Wie mittels Absorptionsspektroskopie bestimmt wurde, zeigten alle doppeltmarkierten Peptide, mit Ausnahme von Fluorescein-NorFES-Fluorescein, die Existenz von so genannten Dimeren im Grundzustand. Dies wurde durch eine Verschiebung der Absorptionsmaxima zu kürzeren Wellenlängen sowie durch eine Veränderung der Form der Absorptionsspektren im Vergleich mit den Spektren für die Enzymverdauten, doppelt-markierten Proben angezeigt. Bei Spaltung mit Elastase wurden die Dimere im Grundzustand zerstört, und die resultierenden Spektren waren dieselben wie die einer Lösung, die gleiche Konzentrationen der jeweiligen einfach markierten Peptide enthielt.
Ohne hier eine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie zu beabsichtigen, wird angenommen, dass die Bildung von Dimeren im Grundzustand, die in den gemäß der vorliegenden Erfindung entworfenen und synthetisierten Verbindungen beobachtet wurde, aufzeigt, dass die U-förmige Konformation der Peptidhauptkette die Fluorophore in große räumliche Nähe zueinander bringt, wodurch eine Überlappung der Elektronenorbitale der zwei Fluorophore ermöglicht wird, was zu gegenseitigem Quenching durch Dimerisierung im Grundzustand führt. Es war eine überraschende Entdeckung, dass die Polypeptide dieser Erfindung die Bildung von Dimeren im Grundzustand bei einer signifikant geringeren Farbstoffkonzentration ermöglichten, als bisher beobachtet wurde. Dimerisierung im Grundzustand von freiem Fluoresceinfarbstoff in Lösung beispielsweise wurde nur bei Konzentrationen von über 0,74 M beobachtet, Dimerisierung im Grundzustand von freiem Eosinfarbstoff in Lösung wurde nur bei Konzentrationen von über 2,8 × 10^–2 M beobachtet (siehe Forster & König, Zeitschrift für Elektrochemie 61, 344 (1957)), und Dimerisierung im Grundzustand von Rhodamin-B-Farbstoff in Lösung wurde nur bei Konzentrationen über 6 × 10^–4 M beobachtet (siehe Arbeloa & Ojeda, Chemical Physics Letters 87, × 10^–4 M beobachtet (siehe Arbeloa & Ojeda, Chemical Physics Letters 87, 556 (1982)). Dahingegen wurden in der vorliegenden Erfindung die Wirkungen bei 4,0 × 10–7 M oder bei etwa einer 1.000fach niedrigeren Konzentration im Vergleich zu den berichteten Werten beobachtet.
Die Beobachtung des Dimers im Grundzustand für die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisierten Verbindungen sagte ein signifikantes Niveau von Fluoreszenzquenching für doppelt-markiertes Peptid mit demselben Fluorophor wie für jene Verbindungen aus Tabelle 9 voraus. Diese Vorhersage wurde tatsächlich bestätigt; ein Vergleich von C1171-NorFES-KGY-C1309 mit C1171-NorFES-KGY-C1171, d.h. der hetero-doppelt-markierten mit den homo-doppelt-markierten Peptiden, zeigt, dass das Quenchingniveau in den Heteropeptiden leicht höher als in den Homopeptiden ist (94 vs. 90 %). Das Fluoresceinderivat zeigte jedoch nur 55 % Quenching. Die Symbole |0 und |c für den Prozentsatz von Fluoreszenzquenching (% Q) beziehen sich auf die Fluoreszenzintensität für das intakte markierte Peptid bzw. die Enzym-verdaute, markierte Peptidlösung.
Tabelle 9. Spaltungsrate (T_1/2) und Prozentsatz an Quenching (% Q) von hetero- und homo-markierten Peptiden. T_1/2 ist die Zeit in Sekunden nach dem Zusatz einer Protease (z.B. Elastase), nach der das Fluoreszenzsignal 1/2 des Maximalwertes erreicht hatte. Die Symbole I_o und I_c beziehen sich auf die Fluoreszenzintensität (I) für das intakte markierte Peptid bzw. die Enzym-verdaute, markierte Peptidlösung.
Die Substratsequenz könnte durch einen Aminosäurerest verlängert werden, und der Fluorophor könnte über die ε-Aminogruppe an die Seitenkette des Lysinrests gebunden werden, ohne die Menge an beobachtetem Quenching bedeutend zu stören. Insbesondere führte dieser Zusatz (Peptide bezeichnet als K-NorFES-KGY) zu einem leichten Rückgang der Spaltbarkeitsrate und einem sehr geringen Anstieg des Prozentsatzes an Quenching sowohl für das hetero- als auch das homo-doppeltmarkierte Peptid (in den K-NorFES-KGY-Peptiden erfolgte N-terminale Markierung über die ε-Aminogruppe von Lysin, und nicht über den α-Amino-Terminus).
Die Spaltungsraten (T_1/2) dieser Substrate durch Elastase wurden auch durch Aufzeichnen des Zeitpunktes nach Zusatz der Protease, zu dem das Signal die Hälfte des Maximalwertes erreicht hatte, gemessen (siehe Tabelle 9). Ein Vergleich von drei homo-doppelt-markierten Peptiden, d.h. NorFES-KGY, markiert mit zwei Molekülen von C1171, C1309 und Fluorescein (F1), zeigt die folgende Reihung nach Spaltbarkeit: F1-NorFES-KGY-F1 > C1171-NorFES-KGY-C1171 > C1309-NorFES-KGY-C1309.
Beispiel 7
Verwendung von homo-doppelt-markierten Proteaseindikatoren
Um die Wirkung der Proteaseindikatoren dieser Erfindung in vitro zu demonstrieren, wurden Zellen der epidermalen Karzinomzelllinie, A431, bis zu unvollständiger Konfluenz in einem Permanox-Gewebekultur-Kammerobjektträger (Nunc, Inc., Naperville, Illinois, USA) in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DME), das 5 % fötales Rinderserum (FCS) enthielt, gezüchtet. Nach Entfernung des Mediums wurden 200 μl einer Lösung, die 70 % Ethanol enthielt, zu jeder Kammer zugesetzt, und Inkubation erfolgte 2 min lang. Das Ethanolmedium wurde dann entfernt, und die Monolayer wurden zweimal mit DME (ohne FCS) gewaschen.
Eine DME-Lösung, die C1171-NorFES-C1171 in einer Konzentration von 1 × 10^–7 M enthielt, wurde dann mit der Monolayer 10 min lang inkubiert. Die Zellen wurden dann mit einem Nikon-Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Rhodamin-Filterwürfels auf Fluoreszenz untersucht. (Ein Vorteil der Verwendung von Peptiden, die mit einem einzelnen Fluorophor homo-doppelt-markiert sind, im Vergleich zu jenen, die mit zwei verschiedenen Fluorophoren (hetero-doppelt-) markiert sind, ist, dass Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von homo-doppelt-markierten Peptiden nur einen Cutoff-Filter [d.h. einen Filter, der das gesamte Licht über einer definierten Wellenlänge durchlässt] auf der Emissionsseite des Zweifarbenspiegels benötigt, während Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von hetero-doppelt-markierten Peptiden vorzugsweise einen Interferenzfilter [d.h. einen Filter, der Licht in einem definierten Wellenlängenbereich (x ± y nm) durchlässt] verwendet.) Jede Zelle wurde durch eine diffuse rote Fluoreszenz (die vom durch Elastase gespalteten Proteaseindikator produziert wurde), die das gesamte Zytoplasma ausfüllte, eindeutig definiert. Im Fall von Zellen am Rand eines konfluenten Flecks unterschieden sich die schwarzen Ränder des Flecks eindeutig von der roten Fluoreszenz im Zytoplasma der Zellen, was darauf hinwies, dass die Fluoreszenz nicht auf Hintergrundfluoreszenz oder auf die Spaltung des Proteaseindikators durch das Medium zurückzuführen war.
Die obigen Beispiele wurden bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht, um ihren Schutzumfang einzuschränken. Andere Varianten der Erfindung werden durchschnittlichen Fachleuten klar ersichtlich sein und sind von den beiliegenden Ansprüchen umfasst.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fluorogene Zusammensetzung zur Detektion der Aktivität einer Protease, wobei die Zusammensetzung die folgende Formel aufweist:
worin F¹ ein Fluorophor ist; C¹ ₅, C¹ ₄, C¹ ₃, P₂, P₁, P₁' und P₂' jeweils eine Aminosäure sind; S¹ ein 1 bis 50 Aminosäuren langer Peptid-Spacer ist; n = 0 oder 1 ist; und, wenn n = 1 ist, S¹ über eine Peptidbindung der α-Aminogruppe von C¹ ₅ an C¹ ₅ gebunden ist; und Y eine Zusammensetzung ist, die aus der aus Verbindungen der folgenden Formeln bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
worin C² ₃ und C² ₄ Aminosäuren sind; F² ein Fluorophor ist; S² ein 1 bis 50 Aminosäuren langer Peptid-Spacer ist; und k = 0 oder 1 ist; und, wenn k = 1 ist, S² über eine Peptidbindung der α-Carboxylgruppe von C² ₄ oder C² ₃ an C² ₄ oder C² ₃ gebunden ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' eine Proteasen-Spaltstelle ist, die zwischen P₁ und P₁' gespalten wird; und wenn P₂' nicht Prolin ist, Y der Formel III entspricht, worin C² ₃-C² ₄ aus der aus Pro-Cys, Aib-Cys, Pro-Lys und Aib-Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wenn P₂' Prolin ist, Y der Formel IV entspricht, worin C² ₃ aus der aus Cys und Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wenn P₂ Prolin ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-C¹ ₄-C¹ ₃ oder Asp-C¹ ₄-Aib ist; wenn P₂ nicht Prolin ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ aus der aus Asp-C¹ ₄-Pro, Asp-C¹ ₄-Aib, Asp-Aib-Pro, Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃; Asp-Pro-Aib und Asp-Aib-Aib bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wenn der C¹ ₃-Rest Pro ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-C¹ ₄-Pro oder Asp-Aib-Pro ist; wenn der C¹ ₄-Rest Pro ist, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Pro-C¹ ₃ oder Asp-Pro-Aib ist; und wenn P² und C¹ ₃ beide nicht Prolin sind, C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ aus der aus Asp-Pro-C¹ ₃, Asp-Aib-C¹ ₃, Asp-C¹ ₄-Aib und Asp-Pro-Aib bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei die Abkürzung Aib für α-Aminoisobuttersäure steht; worin die Fluorophore F¹, F² benachbart sind und weniger als 100 Å voneinander entfernt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin P₂ aus der aus Pro, Gly, Phe, Arg, Leu, Gln, Glu, Ile, His und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; P₁ aus der aus Cys, Met, Nle, Arg, Leu, Gly, His, Glu, Ala, Phe, Tyr und Asn bestehenden Gruppe ausgewählt ist; P₁' aus der aus Thr, Ser, Met, Nle, Leu, Ala, Ile, Phe, Val, Glu, His und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählt ist; P₂' aus der aus Ile, Gly, Met, Nle, Leu, Ala, Gln, Arg, Val, Ser, Tyr und Asn bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin C¹ ₅ aus der aus Asp und Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist; C¹ ₄ aus der aus Ala, Met, Nle, Aib, Pro, Ile, Gly, Asp, Arg, Thr, Phe, Lys, Gln und Ser bestehenden Gruppe ausgewählt ist; C¹ ₃ aus der aus Ile, Aib, Pro, Thr, Ser, Ala, Val, Gly, Phe und Gln bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin P₂ Pro ist; Y Formel IV ist; C² ₃ aus der aus Cys und Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin Y der Formel III entspricht; und C² ₃-C² ₄ aus der aus Pro-Cys und Pro-Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin k = 1 ist; und S² Gly-Tyr ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin F¹ ein Fluorophor mit einer Anregungswellenlänge im Bereich von 315 nm bis 650 nm ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin F² ein Fluorophor mit einer Anregungswellenlänge im Bereich von 315 nm bis 650 nm ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin F¹ aus der aus 5-Carboxytetramethylrhodamin und 7-Hydroxy-4-methylcumarin-3-essigsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin F² aus der aus Rhodamin-X-acetamid und 7-Diethylamino-3-((4'-iodacetyl)amino)phenyl)-4-methylcumarin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin F¹ und F² gleich sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin F¹ und F² aus der aus Fluoresceinisothionat, 5- (und 6-) Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester und 5- (und 6-) Carboxy-X-rhodaminsuccinimidylester bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin n und k = 0 sind; C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Ala-Ile ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' Pro-Nle-Ser-Ile ist; C² ₃-C² ₄ Pro-Cys ist; F¹ 5-Carboxytetramethylrhodamin ist; und F² Rhodamin-X-acetamid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin n und k = 0 sind; C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Ala-Ile ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' Pro-Met-Ser-Ile ist; C² ₃-C² ₄ Pro-Cys ist; F¹ 5-Carboxytetramethylrhodamin ist; und F² Rhodamin-X-acetamid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin n = 0 ist; k = 1 ist; C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Ala-Ile ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' Pro-Nle-Ser-Ile ist; C² ₃-C² ₄ aus der aus Pro-Cys und Pro-Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und S² Gly-Tyr ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin n = 1 ist; k = 1 ist; C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Ala-Ile ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' Pro-Nle-Ser-Ile ist; C² ₃-C² ₄ aus der aus Pro-Cys und Pro-Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist; S¹ Lys ist; und S² Gly-Tyr ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
worin die Symbole Fl, C1171 und C1309 für Fluorophore stehen: Fluoresceinisothionat, 5- (und 6-) Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester bzw. 5- (und 6-) Carboxy-X-rhodaminsuccinimidylester, und worin die beiden vertikalen Striche und der horizontale Strich zwischen einem Lysin und einem Fluorophor anzeigen, dass der Fluorophor an die ε-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin n = 1 ist; k = 0 ist; C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Ala-Ile ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' Pro-Nle-Ser-Ile ist; C² ₃-C² ₄ Pro-Cys ist; und S¹ Lys-Lys-Gly-Gly-Gly ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin S¹ an einen festen Träger gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin C¹ ₅-C¹ ₄-C¹ ₃ Asp-Ala-Ile ist; P₂-P₁-P₁'-P₂' Pro-Nle-Ser-Ile ist; C² ₃-C² ₄ Pro-Cys ist; n = 0 ist; k = 1 ist; und S² Asp-Gly-Gly-Gly-Lys-Lys ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin S² an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren zur Detektion der Aktivität einer Protease in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: das Kontaktieren der biologischen Probe mit einer fluorogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 21 und Detektieren einer Änderung der Fluoreszenz der fluorogenen Zusammensetzung, worin eine Zunahme der Fluoreszenz Proteaseaktivität anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die biologische Probe aus der aus histologischen Schnitten, kultivierten Zellen, biologischen Flüssigkeiten und Gewebe bestehenden Gruppe ausgewählt ist.