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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum gleichzeitigen
Detektieren und Quantifizieren mehrerer Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen
Probe. Die vorliegende Erfindung umfasst besonders die Verwendung
von zwei oder mehreren verschiedenen chemilumineszierenden Verbindungen, die
mit einzelsträngigen
Nukleinsäurehybridisierungssonden
gekoppelt sind. Wenn jede Sonde mit seiner Ziel-Nukleinsäure selektiv
hybridisiert ist, kann die chemilumineszierende Verbindung oder
der "Marker", der daran gekoppelt
ist, vom Marker, der mit einer nicht hybridisierten Sonde gekoppelt
ist und von einem anderen Marker, der mit einer anderen Ziel-Nukleinsäure hybridisiert
ist, unterschieden werden. Nach dem Auslösen einer Chemilumineszenzreaktion
ist das emittierte Licht ein Hinweis auf das Vorhandensein oder
die Menge jeder hybridisierten Sonde und daher auch für das Vorhandensein
oder die Menge jeder Ziel-Nukleinsäure. Die vorliegende Erfindung
offenbart auch Verfahren zum separaten Detektieren und/oder Messen
des Lichtes, das von jedem Chemilumineszenzmarker in einem einzelnen
Röhrchen
als ein Hinweis auf das Vorhandensein und/oder die Menge von zwei
oder mehr Nukleinsäureanalyten
emittiert wird.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Lichtemission als Ergebnis einer chemischen Reaktion ist dem Fachmann
auf dem Gebiet der Chemie bekannt. Siehe Schuster und Schmidt, Chemiluminescence
of Organic Compounds, in Advances in Physical Organic Chemistry
18:187–238
(V. Gold & D.
Bethel Hrsg., Academic Press 1982). Zusätzlich hat man das Absorbieren
oder die Diffusion von Licht bei einer oder mehreren Wellenlängen zum
Quantifizieren von bakteriellen Zellen in Suspensionen (Siehe Manual
of Methods for General Bacteriology 191 (American Society for Microbiology
1981) für
das Messen der Nukleinsäure-
und Proteinkonzentration in Lösung
(id. bei 456 bzw. 359) und als ein Mittel zum Nachverfolgen der
Reinigung verschiedener Verbindungen durch Chromatographie und andere
Reinigungs- und Trennungstechniken angewendet. Jedoch sind diese
zuletzt genannten Techniken im Allgemeinen nicht spezifisch im Bezug
auf die Identifizierung einer bestimmten Verbindung, wie zum Beispiel
einer Protein- oder
Nukleinsäurespezies.
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Die
Verwendung von chemilumineszierenden Reagenzien als Markerreagenzien
in Analyt spezifischen Immunologischen Assays ist im Stand der Technik
bekannt. Siehe z.B., W. Rudolf Seitz, Immunoassay Labels based on
Chemiluminescence and Bioluminescence, Clin. Chem. 17:120–126 (1984).
Die Verwendung von Acridinium-Derivaten als spezifische Markerreagenzien
in solchen Assays ist beschrieben worden in Weeks et al., Acridinium
Esters as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem.
29:1474–1478 (1983).
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Assays,
die chemilumineszierende Marker oder "Reportergruppen" verwenden, verfahren gemäß einem
verallgemeinerten Mechanismus. Bei diesem Mechanismus reagiert die
Licht emittierende Verbindung mit einer zweiten Verbindung, was
dazu führt,
dass die Licht emittierende Verbindung in einen kurzlebigen hochenergenen
Status übergeht.
Wenn das angeregte Molekül
schrittweise in einen niedrigenergenen Status zurückkehrt,
wird ein Photon emittiert. Die Reaktion kann oder kann nicht zusätzliche
Co-Faktoren oder
Katalysatoren einschließen,
um die Reaktion zu fördern
oder zu beschleunigen. In einer Population solcher Moleküle kann
das emittierte Licht in einer lichtmessenden Vorrichtung, die Luminometer
genannt wird, gemessen werden. Die Menge des gemessenen Lichts ist
proportional zur Konzentration der reagierenden lumineszierenden Verbindungen
in der Testprobe.
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Wenn
daher die Verbindung physikalisch mit einem Analyten assoziiert
ist, ist die Menge des erzeugten Lichts ebenfalls proportional zur
Menge des Analyten in der Probe, so lange wie jeglicher Überschuss
oder nicht assoziiertes chemilumineszierendes Reagenz vor der Reaktion
und Messung aus der Probe entfernt worden ist. Die Verbindung kann
direkt an den Analyten gebunden sein oder kann an eine Verbindung
geknüpft oder
gebunden sein, die selber dazu in der Lage ist, mit dem Analyten
physikalisch zu assoziieren. Ein Beispiel für das Letztgenannte wäre, wenn
das chemilumineszierende Reagenz an einen Antikörper, der für den entsprechenden Analyten
spezifisch ist oder an eine einzelsträngige Nukleinsäure, die
mit einer Nukleinsäure,
deren Vorhandensein in der Testprobe vermutet wird, komplementär ist, gebunden
ist.
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Verschiedene
Assaysysteme für
das Messen von mehr als einem spezifischen Analyten in einer einzelnen
Testprobe sind beschrieben worden. In Gorski et al., J. Histochem.
and Cytochem. 25:881–887
(1977) wurde ein einzelner Marker, Acridinorange, als wesentlicher
fluoreszierender Farbstoff in gemischten Lymphozytenkulturen verwendet.
Nach dem Anfärben
wurden die Kulturen bei zwei verschiedenen Wellenlängen beobachtet.
Da der Farbstoff, der zwischen die Basen der Nukleinsäuren interkaliert,
Licht im grünen
Bereich emittiert, wenn er mit DNA assoziiert ist, und im roten
Bereich, wenn er mit RNA assoziiert ist, ist es möglich, gleichzeitig
die gesamte zelluläre
DNA und RNA durch Beobachten dieser beiden Wellenlängebereiche
zu messen.
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Verschiedene
Assaysysteme sind entworfen worden, die zwei oder mehrere Radioisotope
verwenden, von denen jedes in ein Bindungspaar, wie zum Beispiel
ein Mitglied eines Antikörper-Antigenpaares, eines
Rezeptor-Substratpaares oder einem von zwei komplementären Nukleinsäuresträngen, inkorporiert
ist. Durch das Verwenden von Radionukliden, die verschiedene Arten
von Energie emittieren (wie zum Beispiel γ-Strahlung und β-Partikelemission)
oder Energien verschiedener Intensitäten, ist es möglich, zwischen
den zwei Radionukliden zu unterscheiden und dadurch zwischen den
Verbindungen, in die sie eingebaut sind. Szintillation und Gammazähler sind
kommerziell erhältlich
und können
den radioaktiven Zerfall auf mehr als einen Kanal gleichzeitig messen.
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Daher
werden in einem Radioimmunoassay (RIA) mit mehreren konkurrierenden
Analyten zwei oder mehrere Populationen von Analytmolekülen mit
verschiedenen Radioisotopen einer bekannten spezifischen Aktivität (mCi Radioisotop/mmol
Analyt) markiert. Wenn eine Testprobe mit den markierten Analyten
vermischt wird, wird der unmarkierte Analyt in der Testprobe mit
dem markierten Analyten um die Bindung an einen unmarkierten spezifischen
Bindungspartner konkurrieren. Die Menge des unmarkierten Analyten
in der Testprobe ist im Vergleich zur Menge, die ohne die Zugabe
der Testprobe gemessen wird, proportional zur Abnahme des Signals.
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Radioaktive
Assays haben offensichtlich Nachteile. Nichtradioaktive Verfahren
zum Detektieren und Messen eines Analyten in der Testprobe sind
im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel sind enzymgebundene Immunoassays,
die Biotin und Avidin, Kohlenwasserstoffe und Lectine verwenden,
beschrieben worden, wie auch Assaysysteme, die Fluoreszenzreportergruppen,
wie zum Beispiel Fluoreszein und Rhodamin sowie chemilumineszierende
Reportergruppen verwenden. Einige dieser Systeme sind in der Sensitivität mit der
sie den entsprechenden Analyten detektieren können, aufgrund der inhärenten Empfindlichkeit
des Markers und/oder durch die spektralen oder kinetischen Charakteristika
der bestimmten oder chemilumineszierenden Verbindung inhärent begrenzt.
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Gleichzeitig
ablaufende Assays für
mehrere Analyten unter Verwendung von Fluoreszenzreportergruppen
mit hoher Quantenausbeute werden aufgrund des relativ breiten Spektrums
und der hohen Hintergründe,
die diese Reagenzien mit sich bringen, schwieriger.
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Nichtradioaktive
Mehrfachmarkersysteme für
das Messen von Proteinen sind beschrieben worden; Vuori et al.,
Clin. Chem. 37:2087–2092
(1991), und Nukleinsäuren;
Iitia et al., Mol. and Cell. Probes 6:505–512 (1992), in denen Chelate
von fluoreszierenden Lanthaniden (z.B. Europium, Samarium und Terbium)
mit einem spezifischen Bindungspaar gekoppelt sind. Die unbekannten
Komponenten werden entweder durch ein kompetetives Immunoassay oder
durch Nukleinsäurehybridisierung
untersucht, und es wird die Fluoreszenz gemessen. Die fluoreszierenden
Lanthanide weisen enge Emissionssignale auf und die Komponenten
der Paare Eu3+/Sm3+ und
Eu3+/Tb3+ weisen
Emissionsmaxima auf, die ausreichend voneinander entfernt liegen,
so dass sie voneinander unterschieden werden können. Darüber hinaus ist der Fluoreszenzzerfall
von Eu nach der Anregung relativ langlebig, während der von Sm und Tb sehr
kurz ist, was einen anderen Weg zur Unterscheidung der Signale ergibt:
Durch das Messen der Fluoreszenz jedes Chelats zu verschiedenen
Zeiten.
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Ein
verallgemeinertes Mehrfachanalyt-Assaysystem unter Verwendung von
Acridiniumesterderivaten als Reportergruppe wurde beschrieben von
Woodhead et al., PCT Anmeldung WO 91/00511, wobei sie nicht als
Stand der Technik anzusehen ist und gemeinsame Eigentümerschaft
mit der vorliegenden Anmeldung genießt. Khalil et al., PCT Anmeldung
WO 92/12255 beschreibt ein Festphasen-Dualanalyt-Immunoassaysystem,
das ein Acridinium- oder Phenanthridiniumderivat als erstes chemilumineszierendes
Reagenz und ein 1,2-Dioxethan, das durch die Alkaline Phosphatase
oder β-Galaktosidase
in ein Zwischenprodukt der Chemilumineszenzreaktion umgewandelt
wird, als ein zweites chemilumineszierendes Reagenz verwendet. Das Acridiniumderivat
ergibt ein kurzlebiges Photonensignal nach der Reaktion mit einer
Auslöser-Lösung, wie zum
Beispiel H2O2. Das
Dioxethan ergibt ein langlebigeres Signal, wenn es durch Zugabe
des geeigneten Enzyms ausgelöst
wird. Jedes dieser Reagenzien kann mit einem spezifischen Bindungspaar
verbunden werden und wird in einem Festphasen-Sandwich-Immunoassay
verwendet. Jedes Signal wird über
einen anderen Zeitraum gemessen.
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WO-A-89/02476
offenbart Marker, dessen Stabilität sich nachweisbar verändert, wenn
die Sonde, mit der sie verknüpft
sind, hybridisiert ist, vorausgesetzt, dass ein homogenes Assay
bereitgestellt wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt die gleichzeitige Detektion und
Quantifizierung von mehr als einer spezifischen Nukleinsäuresequenz
in einer Probe. Jedes der Markerreagenzien der vorliegenden Erfindung
wird speziell mit einer spezifischen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde
verknüpft,
die markierten Sonden werden vermischt und man lässt sie mit irgendeiner in
der Testprobe vorhandenen. Nukleinsäure, die eine Sequenz aufweist,
die im Wesentlichen komplementär
zur Sondensequenz ist, hybridisieren, um eine Hybridisierung unter
geeigneten selektiven Mitteln zu ermöglichen. Ein Reagenz kann dann
zur Lösung
zugegeben werden, das das Markerreagenz, das mit der unhybridisierten
markierten Sonde assoziiert ist, spezifisch verändert, während das Markerreagenz, das
mit den hybridisierten Sonden assoziiert ist, im Wesentlichen unverändert bleibt.
Dadurch wird jedem Markerreagenz eine unterschiedliche Resistenz
gegenüber
dem Verlust des Chemilumineszenzpotentials verliehen, abhängig davon
ob der Marker mit einer hybridisierten oder unhybridisierten Sonde
assoziiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der hybridisierte
mit der Sonde assoziierte Marker auf diese Weise geschützt.
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Für gewöhnlich jedoch
nicht notwendigerweise, wird die Reaktion von wenigstens zwei chemilumineszierenden
Reagenzien gleichzeitig ausgelöst
und das sich dabei ergebende Licht, das von jedem Chemilumineszenzreagenz
emittiert wird, wird im Wesentlichen gleichzeitig detektiert und
gemessen. Jedoch ist bei einigen Arten der vorliegenden Erfindung,
zum Beispiel im mehrfach pH-Modus, der weiter unten diskutiert wird, die
Detektion und Messung von einem oder mehreren chemilumineszierenden
Reagenzien ein separates zeitliches Ereignis zur Detektion und Messung
eines oder mehrerer anderer chemilumineszierender Reagenzien.
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Das
emittierte Licht kann abhängig
vom gewünschten
Mehrfachanalytdetektionsmodus unterschiedlich gemessen. werden.
Demnach kann das Licht detektiert und gemessen werden: 1) bei zwei
oder mehreren verschiedenen Wellenlängen, 2) während eines vorbestimmten Zeitraums,
3) bei mehr als einer Reaktionsbedingung (wie zum Beispiel verschiedene
Konzentrationen an Wasserstoffionen) oder 4) in einer Kombination dieser
Verfahren. Abhängig
vom Modus und den spezifischen ausgewählten Chemilumineszenzreagenzien
ermöglichen
die Daten, die von diesen Lichtmessungen erhalten werden, das getrennte
Detektieren und Messen jedes Chemilumineszenzmarkers in der Testprobe
als ein Hinweis auf die Menge jedes der darin vorhandenen Analyten.
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Ein
wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist daher das Design
und die Auswahl von Paaren oder chemilumineszierenden Reagenzien,
die Signale emittieren können,
die sich ausreichend voneinander unterscheiden oder unter ausreichend
verschiedenen Bedingungen separat detektiert werden können und nach
dem Auftreten eines oder mehrerer die Reaktion auslösender Ereignisse
gemessen werden können.
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Genauso
wichtig ist es, dass die Mitglieder jedes Paares oder Reagenzes
der vorliegenden Erfindung vergleichbar empfänglich gegenüber einem
Verlust ihrer Chemiluminsezenzreaktivität sind und vergleichbar resistent
gegenüber
diesem Verlust, abhängig
davon, ob sie mit einer hybridisierten oder unhybridisierten Sonde
gekoppelt sind. Aufgrund dieser zuletzt genannten Eigenschaften
sind die Markerreagenzien der vorliegenden Erfindung besonders gut,
obwohl sie darauf nicht begrenzt sind, in einem homogenen Assaysystem
verwendbar, in dem das Vorhandensein und die Quantifizierung der
entsprechenden Analyten, ohne die Notwendigkeit für den an
den Analyten gebundenen Marker physikalisch von dem ungebundenen
Marker vor der Detektion getrennt zu sein, detektiert und gemessen
werden kann.
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Der
Anmelder zieht jedoch in Betracht, dass die Zusammensetzungen und
Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in heterogenen Systemen
oder in Kombinationen von homogenen und heterogenen Assaysystemen
verwendet werden können.
Nur als Beispiel und nicht zur Begrenzung des Schutzumfangs der
vorliegenden Erfindung, kann solch ein System das Durchführen einer
anderen Hydrolyse einer unhybridisierten Sonde, die bevorzugt das
markierte Hybrid (eine markierte einzelsträngige Oligonukleotidsonde und
eine unmarkierte Ziel-Nukleinsäure
umfassend) und nicht die unhybridisierte markierte Oligonukleotidsonde
an einen festen Träger,
wie zum Beispiel eine polykationische Mikrosphäre, bindet, das Abtrennen einer
hybridisierten von einer unhybridisierten Sonde und dann das Messen
der Chemilumineszenz des mit dem Hybrid assoziierten Markers, entweder
während
dieser immer noch an den Träger
gebunden ist oder nach der Elution vom Träger, einschließen. Verfahren
zum differentiellen hydrolisieren von Acridiniumestermarkern, die
mit einer unhybridisierten Sonde gekoppelt sind, gegenüber der
gleichen Verbindung, die mit einer hybridisierten Sonde gekoppelt
ist, werden von Arnold et al., US Patent Nr. 5,283,174, die eine
gemeinsame Eigentümerschaft
mit der vorliegenden Erfindung genießt, beschrieben.
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Demnach
machen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
Verwendung von der Kombination der beiden oben genannten Eigenschaften:
die Fähigkeit
jedes Mitglieds eines Satzes von Markerverbindungen ein separat
unterscheidbares Signal (Unterscheidbarkeit) zu emittieren und die
Fähigkeit
jedes Mitglieds eines Satzes einem Verlust der Chemilumineszenzaktivität gegenüber empfänglich zu sein
oder vor dem Verlust geschützt
zu sein, abhängig
davon, ob der Marker mit einer hybridisierten oder unhybridisierten
Sonde (Selektivität)
gekoppelt ist. Diese beiden Eigenschaften hängen nicht nur von der Struktur der
Markerverbindungen selbst ab, sondern auch von der molekularen Umgebung
in der sie während
des Verlaufs des Assays angeordnet sind. Zusätzliche Faktoren können daher,
ohne Begrenzung, die Art und Anordnung der Anbindung des Markers
an die Nukleinsäuresonde,
die Zusammensetzung der Assaylösung,
die Natur und die Reaktivität
von nahe gelegenen chemischen Resten, die sterischen Eigenschaften
der markierenden Verbindung und jede Veränderung in der molekularen
Konfiguration oder Konformation des gebundenen Markers relativ zur
Nukleinsäuresonde
nach der Hybridisierung der Sonde mit seiner Ziel-Nukleinsäure, einschließen.
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Die
hierin beschriebenen beispielhaften Markerreagenzien sind Acridiniumderivate,
die Licht emittieren können,
wenn man sie mit einem auslösenden
Reagenz, zum Beispiel einer alkalischen Lösung oder Wasserstoffperoxid,
reagieren lässt.
Jedoch erwägt
der Anmelder, dass andere chemilumineszierende Marker oder Verfahren
(z.B. Elektrochemilumineszenz) und auslösende Reagenzien im Mehrfachanalytassay
der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, wobei solche Verbindungen
und Verfahren für
den Fachmann im Lichte der Offenbarung dieser Anmeldung offensichtlich
sein werden. Dementsprechend werden die folgenden Beispiele beigebracht,
um vollständig
und klar das beste Verfahren der vorliegenden Erfindung zu beschreiben,
das dem Anmelder zu diesem Zeitpunkt bekannt ist, und dienen nicht
dazu den Schutzumfang der Erfindung auf irgendeine Art und Weise
zu beschränken.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein schnelles kosteneffektives
und einfaches Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren zweier oder
mehrerer verschiedener Nukleinsäuresequenzen
in einer Testprobe bereit zu stellen, wobei das Assay in einem einzelnen
Assayröhrchen
durchgeführt
werden kann.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein schnelles,
nichtradioaktives Assay für
das gleichzeitige Quantifizieren von mehr als einer verschiedenen
Nukleinsäuresequenz
in einer Testprobe bereit zu stellen, wobei wenigstens zwei chemilumineszierende
Markerverbindungen an unterschiedliche Oligonukleotid-Hybridisierungssonden
gekoppelt sind, wobei jede mit wenigstens einer dieser Sequenzen
hybridisieren kann. Nach dem Hybridisieren reagieren die gebundenen
chemilumineszierenden Marker, was zum Emittieren von Licht führt, das
in einem Luminometer gemessen wird. Die Wellenlängen und Reaktionskinetiken
der Lichtemission für
jede Markerverbindung sind ausreichend einzigartig, um das getrennte
Messen der Menge jedes Markerreagenzes in der Testprobe zu erlauben.
Ein Luminometer kann emittiertes Licht über einen Bereich von Wellenlängen als
ein einzelnes Ereignis messen oder kann jeden der zahlreichen engen
Wellenlängenbereiche
gleichzeitig unabhängig
voneinander messen. Beispiele für
das zuletzt genannte sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel
kann man zwei oder mehrere Photomultiplierröhren (PMTs) verwenden, wobei
jede eine andere Wellenlänge
oder Bereich von Wellenlängen
misst, um gleichzeitig die gleiche Probe zu messen, oder einen Diodenarraydetektor,
der mehr als eine Wellenlänge
emittierten Lichts gleichzeitig messen kann.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum
Auswählen
von verschiedenen Markerverbindungen bereitzustellen, die mit Oligonukleotidsonden
gekoppelt werden können,
wobei jede Verbindung vergleichbar empfänglich gegenüber dem
Verlust des Chemiluminszenzpotentials ist, abhängig davon, ob sie mit einer
hybridisierten oder unhybridisierten Sonde assoziiert ist.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein schnelles Assayverfahren
bereitzustellen, um zu Detektieren ob mehr als eine Spezies eines
Organismus in einer Testprobe vorhanden ist.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein empfindliches
Assaysystem zum Detektieren oder Quantifizieren des Vorhandenseins
von mehr als einer Art einer Nukleinsäure in einer Probe, die eine
kleine Anzahl von jedem Typ des Nukleinsäuremoleküls enthält, bereitzustellen.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung chemilumineszierende
Markerreagenzien bereitzustellen, die für die Verwendung in einem Mehrfachanalyt-Nukleinsäurehybridisierungsassaysystem
geeignet sind, wobei jedes Reagenz bis zur Reaktion mit einem auslösenden Reagenz
ausreichend stabil ist, um in einem quantitativen Assay für das Vorhandensein
mehrerer Analyten verwendet werden zu können.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung chemilumineszierende
Markerreagenzien mit ausreichend verschiedenen Reaktionskinetiken
bereitzustellen, um die Differenzierung der Signale für jede Reaktion
und die separate Messung dieser Signale zu ermöglichen. Beispielsweise können die "Licht Aus" Eigenschaften eines
Mitglieds eines Satzes von zwei Mitgliedern dazu führen, dass
die gesamte Chemilumineszenz sehr schnell nach dem Vermischen des
auslösenden
Reagenzes mit dem gebundenen Marker emittiert wird. Das andere Mitglied
des Satzes kann "Licht
Aus" Eigenschaften
aufweisen, die einen relativ langen Zeitraum für die Lichtemission nach Zugabe
des auslösenden
Reagenzes einschließt.
Durch Messen der Chemilumineszenz zu verschiedenen Zeitpunkten nach
der Zugabe des auslösenden
Reagenzes und Durchführen
einer Analyse des Lichts, das während
dieses Zeitraums emittiert worden ist, können die Signale wirksam differenziert
und getrennt gemessen werden.
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Es
ist ein anderes Ziel des vorliegenden Erfindung chemilumineszierende
Markerreagenzien bereitzustellen, die nach einem "Licht Aus" Licht in ausreichend
engen und bei verschiedenen Wellenlängen emittieren, und durch
Auswählen
der geeigneten Wellenlängenbereiche
zur Messung können
die Signale ausreichend unterschieden werden, um ein gebundenes
Markerreagenz von einem oder mehreren anderen gebundenen Markerreagenzen,
sogar wenn sie gleichzeitig gemessen werden, zu unterscheiden.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung chemilumineszierende
Reagenzien bereitzustellen, die für die Verwendung als Reportergruppen
entworfen worden sind, wobei jedes dieser Reagenzien, das an eine
andere Oligonukleotid-Hybridisierungssonde
gebunden ist, spezifisch mit einer Ziel-Nukleinsäure mit einer Sequenz, die
ausreichend komplementär
dazu ist, hybridisieren kann, um die Detektion der Ziel-Nukleinsäure unter
Hybridisierungsbedingungen zu ermöglichen. Ein Merkmal der bevorzugten
chemilumineszierenden Reagenzien und des Assayverfahrens ist, das,
wenn die Oligonukleotid-Hybridisierungssonde,
an die jedes dieser Reagenze gebunden ist, mit seiner Ziel-Nukleinsäure hybridisiert,
jedes der Reagenzien der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen,
die diese Population der Reagenzien, die an die unhybridisierte
Oligonukleotidsonde gebunden ist, abbauen wird, auf vergleichbare
Weise vor dem Abbau geschützt
wird. Ein zusätzliches
Merkmal der chemilumineszierenden Reagenzien der vorliegenden Erfindung
ist, dass sie für
den Abbau vergleichbar empfänglich
sind, wenn sie mit unhybridisierten Sonden gekoppelt sind. Ein noch
anderes Merkmal des bevorzugten Verfahrens ist, dass, obwohl die
Marker vor dem Abbau geschützt
sind, wenn sie mit einem doppelsträngigen Nukleinsäurebereich
assoziiert sind, jeder dieser Marker vergleichbar empfänglich ist
für die
Reaktion mit einem geeigneten auslösenden Reagenz, das das Auslösen einer
Chemilumineszenzreaktion zur Folge hat.
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Es
ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum
Detektieren und Quantifizieren von mehr als einem Analyten in einer
Probe in einem einzelnen Analysegefäß durch Durchführen der
Chemilumineszenzreaktion bei verschiedenen pH-Werten durch Verwenden
von Acridiniumesterderivaten, die verschiedene pH-Optima für die Chemilumineszenzreaktion
aufweisen, bereitzustellen. Dies wird durch Markieren eines Mitglieds
eines Analyt:Sonden-Bindungspaares
mit einem ersten Acridiniumester und dem Markieren von Mitgliedern
von einem oder mehreren anderer Analyt:Sonden-Bindungspaaren mit
einem oder mehreren anderen Acridiniumestern bewerkstelligt. Nachdem
es den betreffenden Mitgliedern ermöglicht wurde, mit ihrem Analytpaar,
falls vorhanden, zu binden, werden die ungebundenen Marker selektiv
hydrolisiert, um das Chemilumineszenzpotential des daran gebundenen
Acridiniumesters zu zerstören.
Der verbleibende Acridiniumester, der mit den Sonden:Analyt-Komplexen
gekoppelt ist, wird dann bei einem ersten pH "ausgeschaltet" (lighted off) und die Lichtemissionscharakteristika
der sich daraus ergebenden Reaktion werden über die Zeit gemessen. Der
pH wird auf einen anderen pH-Wert eingestellt und die Lichtemissionscharakteristika
werden wiederum über
die Zeit gemessen. Dieses Verfahren ist nicht auf die Verwendung
von zwei pH-Werten begrenzt: Es wird ohne weiteres ersichtlich,
dass drei oder mehr chemilumineszierende Verbindungen verwendet
werden können,
die verschiedene pH-Optima für
die Chemilumineszenzreaktion aufweisen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren
in Kombination mit anderen Diskriminierungsverfahren, die hierin
beschrieben werden, wie zum Beispiel durch Messen des emittierten
Lichts bei verschiedenen Wellenlängen
oder Beobachten der Reaktionskinetiken, das Ausnutzen von Unterschieden
in den Wellenlängen
oder den Reaktionskinetiken, um das Vorhandensein von mehr als einen
Analyten bei jeder pH-Erhöhung
zu messen oder zu detektieren, verwendet werden.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeigt die Strukturen repräsentativer
Acridiniumesterderivate, die als bevorzugte Ausführungsformen der Markerreagenze
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Innerhalb der Struktur
von 1- oder 3-me-AE, 1- oder 3-me-o-F-AE und 1- oder 3-me-m-diF-AE
wird einer Methylgruppe nahe der 2 Position des Acridiniumrings
dargestellt; das zeigt, dass die Methylgruppe entweder in der 1
oder 3 Position angebunden sein kann.
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2 ist
ein Diagramm, das vorhergesagte Paare von Acridiniumesterderivaten
darstellt, die zusammen im Mehrfachanalytassay der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
Ein "Y" zeigt an, dass man
bei zwei Reagenzien vorhersagt, dass sie kompatible Paare in der
Erfindung sind, und ein "N" zeigt an, dass man
bei den zwei Verbindungen vorhersagt, dass sie in diesem Assay inkompatibel
sind. Die Nummern 1 bis 3 in der Säule auf der linken Seite des
Diagramms zeigen den Typ des Assaysystems an: 1 steht für ein homogenes
einzelphasiges Assaysystem, 2 steht für eine differentielle Hydrolyse
in der wässrigen
Phase und die physikalische Trennung von hybridisierten Oligonukleotidsonde:Ziel-Komplexen,
3 steht für
ein Assaysystem, in dem keine differentielle Hydrolyse stattfindet,
und in dem hybridisierte Sonde:Ziel-Komplexe physikalisch getrennt
werden. Die durch einen Schrägstrich
unter jedem genannten Acridiniumesterderivat voneinander getrennten
Nummern stehen für
die Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals beziehungsweise die Reaktionsdauer.
Die Nummern unterhalb dieser Linie stehen für die Halbwertszeit der Hydrolyse
jedes Markerreagenzes während
es an eine unhybridisierte Oligonukleotidsonde gekoppelt ist. Das
Auswahlkriterium, auf dem dieses Diagramm basiert, steht letztlich
am oberen Ende der Figur.
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3 ist
eine graphische Darstellung eines Beispiels, in dem zwei Markerreagenzien
in einem Mehrfach-pH-Modus der vorliegenden Erfindung verwendet
werden. In jeder der 3A–C wurde ein Reagenz zum Auslösen in etwa
5 Intervallen zur Lösung
gegeben und die Reaktionsmischungen wurden etwa beim Zeitintervall
90, was auf der X-Achse des Graphen dargestellt wird, von etwa pH
12,1 auf etwa pH 13,0 verschoben. 3A zeigt
das emittierte Licht einer solchen Reaktionsmischung, die nur Standard-AE
enthält. 3B
zeigt das emittierte Licht in einer Reaktion, die nur o-F-AE enthält. 3C
zeigt das emittierte Licht in einer Reaktionsmischung, die sowohl
Standard-AE als auch o-F-AE enthält.
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4 ist
eine graphische Darstellung der überlappenden
charakteristischen Lichtemissionsprofile von fünf verschiedenen Kombinationen
von chemilumineszierender Markerreagenzien über die Zeit. Ein Reagenz zum
Auslösen
wurde zum Zeitpunkt Null jeder Reaktionsmischung zugegeben. Die
in dieser Figur verwendeten Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE,
o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE.
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5 ist
eine graphische Darstellung der überlappenden
charakteristischen Lichtemissionsprofile von fünf verschiedenen Kombinationen
chemilumineszierender Markerreagenzien über die Zeit. Ein Reagenz zur Auslösung wurde
zum Zeitpunkt Null jeder Reaktionsmischung zugegeben. Die in dieser
Figur verwendeten Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, eine Mischung
aus 1- und 3-Me-AE, o-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE.
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6 ist
eine graphische Darstellung der überlappenden
charakteristischen Lichtemissionsprofile von sieben verschiedenen
chemilumineszierenden Markerreagenzien über die Zeit. Ein Reagenz zum
Auslösen wurde
zum Zeitpunkt Null jeder Reaktionsmischung zugegeben. Die in dieser
Figur verwendeten Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE,
eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE, o-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE,
und o-diMe-AE.
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7 zeigt
die überlagerten
charakteristischen Lichtemissionsprofile von vier chemilumineszierenden Markerreagenzien
in einem Mehrfach-pH-Assaymodus über
die Zeit. Die Figur demonstriert die Fähigkeit des vorliegenden Assays,
vier Analyten in einem Mehrfachmodus-Assaysystem zu detektieren.
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8A bis 8I verdeutlichen
graphisch die Korrelation zwischen den erwarteten Lichtemissionsprofilen
von kombinierten chemilumineszierenden Markerreagenzien gegenüber den
tatsächlichen
Lichtemissionsprofilen, die man erhalten hat. Die verwendeten chemilumineszierenden
Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, o-F-AE, Standard-AE und o-MeO-AE.
Die Chemilumineszenzenreaktionen wurden in einem Mehrfach-pH-Assaysystem unter
identischen Bedingungen durchgeführt.
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9A bis 9D sind
Chemiluminszenzspektren von zwei Acridiniumesterderivaten; 9A und 9B zeigen
die separaten Spektren von 2,7-o-diMe-AE beziehungsweise Standard-AE. 9C zeigt eine computergenerierte Überlagerung
von jedem Spektrum in einem einzelnen Diagramm. 9D zeigt die computergenerierte Simulation der
zwei Spektren.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform
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Die
vorliegende Erfindung umfasst Zusammensetzungen und Verfahren für die spezifische
Detektion von mehreren verschiedenen Analyten, bevorzugt Nukleinsäuren, in
einer einzelnen Testprobe. Daher kann in einer bevorzugten Ausführungsform
die Erfindung verwendet werden, um das Vorhandensein von mehr als
einer einzelnen Nukleinsäuresequenz
in einer Test- oder klinischen Probe zu detektieren. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
kann eine solche Nukleinsäuresequenz
auf einen bestimmten Erkrankungszustand oder eine Infektion hinweisen.
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Definition
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Soweit
es nicht explizit anders angegeben wird, haben die folgenden Begriffe
die folgende Bedeutung in der vorliegenden Anmeldung.
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Mit
einem "Nukleinsäureanalyten" ist wenigstens eine
Nukleinsäure
oder ein Nukleotidsequenzbereich gemeint, dessen Vorhandensein und/oder
Menge mit einem einzelnen Markerreagenz durch die Verfahren und Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung bestimmt werden soll, wenn sie/er in
der Probe vorhanden ist. Der Analyt kann ein einzelnes Nukleinsäuremolekül mit einem
oder mehreren bestimmten Ziel-Bereichen, oder
mehr als ein anderes Molekül,
von dem jedes einen oder mehrere bestimmte Ziel-Bereiche aufweist,
sein. Als Alternative dazu kann ein Analyt eine bestimmte Nukleotidsequenz
sein, die innerhalb einer einzelnen Nukleinsäure enthalten ist; demzufolge
kann eine einzelne Nukleinsäure
mehr als einen Nukleinsäureanalyten enthalten.
Jedoch erwägt
der Anmelder, dass es manchmal wünschenswert
sein kann, dass mehr als ein Ziel-Bereich, ob nun auf dem gleichen
oder verschiedenen Nukleinsäuremolekülen oder
beides, mittels des gleichen Sondenmarkers detektiert wird. Dies
würde es
zum Beispiel ermöglichen
sowohl chromosomale r-DNA als auch ribosomale RNA eines ersten Organismus
mit einer oder mehreren Sonden, die einen Marker tragen, anzusteuern,
und die chromosomale r-DNA und ribosomale RNA eines zweiten Organismus
mit einer oder mehreren Sonden, die einen anderen Marker tragen,
anzusteuern. In solch einem Fall besteht der erste Analyt aus allen
angesteuerten Nukleotidsequenzbereichen der Nukleinsäure(n) des
ersten Organismus und der zweite Analyt besteht aus allen angesteuerten
Nukleotidsequenzbereichen der Nukleinsäure(n) des zweiten Organismus.
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Mit "Ziel-Bereich" oder "Ziel-Nukleotidsequenz" ist der Abschnitt
eines Analytmoleküls
gemeint, der an eine vorgegebene Sonde oder Klasse von Sonden bindet.
Wenn der Analyt ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle ist, weist der Ziel-Bereich
eine Nukleotidsequenz in einem Bereich von wenigstens einer der
Nukleinsäuren,
die eine Oligonukleotid-Hybridisierungssonde
unter Hybridisierungsbedingungen, die die Hybridisierung der Sonden
mit nicht angesteuerten Nukleinsäuren
oder Nukleotidsequenzbereichen begünstigen, binden, auf. Ein bestimmter
Ziel-Bereich kann vollständig
abgetrennt von anderen Ziel-Bereichen sein, egal ob er auf den gleichen
oder verschiedenen Nukleinsäuremolekülen vorhanden
ist. Alternativ dazu kann ein gegebener Ziel-Bereich, ohne Begrenzung,
auf dem gleichen Nukleinsäuremolekül wie ein
anderer Ziel-Bereich enthalten sein und den anderen Ziel-Bereich durch ein
oder mehrere Nukleotide überlappen,
durch den anderen Ziel-Bereich durch ein oder mehrere Nukleotide überlappt
werden oder vollständig
innerhalb einer anderen Ziel-Nukleotidsequenz enthalten sein.
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Mit "Sonde", "Nukleinsäuresonde", "Hybridisierungssonde" oder "Oligonukleotidsonde" ist ein Oligonukleotid
mit einer Nukleotidsequenz gemeint, die ausreichend komplementär mit einer
Ziel-Nukleotidsequenz, die von einem Nukleisäureanalyten umfasst wird, ist,
damit es dem Oligonukleotid ermöglicht
wird unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen mit ihm zu
hybridisieren. Wenn das Wort "Sonde" verwendet wird,
wird für
den Durchschnittsfachmann deutlich werden, dass der Begriff auf
einen oder mehrere Oligonukleotidmoleküle Anwendung findet, entweder
identische oder nicht-identische, die entworfen, ausgewählt worden
sind und/oder ansonsten in der Lage sind, spezifisch mit einem Ziel-Nukleinsäurebereich
zu hybridisieren. Zusätzlich
kann eine Sonde, wie sie hierin definiert wird, eine Sammlung von
verschiedenen Oligonukleotidmolekülen umfassen, die gegen einen
oder mehrere Ziel-Bereiche des gleichen Nukleinsäureanalyten gerichtet sind.
Demnach kann der Begriff "Sonde", wie er hierin verwendet
wird, entweder den Singular oder Plural meinen, wobei die Bedeutung
durch den Kontext der Verwendung in der vorliegenden Beschreibung
deutlich wird. Per Definition ist dieser Begriff bevorzugt auf Oligonukleotide
zwischen 10 und 100 Nukleotiden in der Länge anwendbar.
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Mit "nicht angesteuerten
Nukleinsäuren" sind Nukleinsäuren gemeint,
die in einem vorgegebenen Assay mittels der Verfahren oder Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung nicht detektiert werden sollen.
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Mit "Probe" oder "Testprobe" ist jede wässrige oder
wassermischbare Lösung,
Suspension oder Emulsion gemeint, die vermutlich einen oder mehrere
Nukleinsäureanalyten
enthält.
Solch eine Probe kann enthalten, ohne Begrenzung, gereinigte oder
ungereinigte Nukleinsäuren,
Viruspartikel und/oder Pflanzen, Tiere, Protozen oder bakterielle
Zellen und kann abgeleitet werden, ohne Begrenzung, von Labor-,
Umwelt-, Agrikultur-, Lebensmittel-, menschlichen, tierischen, exkretorischen
oder sekretorischen Quellen. Eine Testprobe kann als Ergebnis einer
Vorbehandlung einer früheren
Probe, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, durch Homogenisieren,
Konzentrieren, Suspensieren, Extrahieren, Solubilisieren, Verdauen,
Lysieren, Verdünnen
oder Zermmahlen der früheren
Probe hergestellt werden, um den verdächtigen Nukleinsäureanalyten,
falls vorhanden, in eine Wasser enthaltende Umgebung zu bringen.
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Mit "Chemilumineszenzmarker" ist jede chemische
Entität
oder Verbindung gemeint, die an eine andere chemische Entität oder Verbindung
gekoppelt werden kann, die an einer chemisch vermittelten Reaktion teilnehmen
kann, die zur Emission von Licht aufgrund einer hochenergetischen
chemischen Zwischenstufe führt.
Die bevorzugten Chemilumineszenzmarker der vorliegenden Erfindung
sind Acridiniumderivate, am meisten bevorzugt Acridiniumesterderivate.
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Mit "gekoppelt" ist gemeint, dass
zwei oder mehr chemische Entitäten
oder Verbindungen über
eine chemische Bindung oder Assoziation miteinander verbunden werden.
Demnach bedeutet der Begriff, dass kovalente Bindungen als auch
starke nicht-kovalente
Bindungen, wie zum Beispiel solche, die zwischen Avidin und Biotin
oder einem chelatierenden Agens oder einem oder mehreren komplexierten
Ionen gebildet werden, umfasst werden.
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Mit "angesteuert" ist gemeint, dass
man versucht eine spezifische chemische, physikalische oder biologische
Entität
zu identifizieren. So definiert, kann eine chemische Entität ein Abschnitt
einer größeren Entität einschließen, wie
zum Beispiel eines Nukleotidsequenzbereiches einer Nukleinsäure. Eine
biologische Entität unter
dieser Definition kann eine Gruppe von Organismen, wie zum Beispiel
eine oder mehrere Spezies, Genus, Klasse, Familie und so weiter,
einschließen.
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Mit
einer "lichtemittierenden
Reaktion" ist eine
auslösbare
chemische Reaktion gemeint, die zur detektierbaren Erzeugung von
Licht durch einen oder mehrere Reaktanten führt. Auslösbar soll bedeuten, dass die chemische
Reaktion durch die Zugabe eines Reaktanten oder durch Energie (wie
zum Beispiel einer elektrischen Ladung) zur Reaktionsmischung initiiert
wird, oder das die Reaktionskinetiken durch Anpassen einer oder
mehrerer Reaktionsbedingungen, wie zum Beispiel der Temperatur oder
des pHs, begünstigt
werden.
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Mit "ausreichend verschieden" ist gemeint, dass
die Wellenlänge(n)
der Lichtemission, die Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals, die
Reaktionsdauer oder die Reaktionscharakteristika von zwei oder mehreren
verschiedenen chemilumineszierenden Markern unterschieden werden
können,
wenn sie in einer Reaktionsmischung kombiniert werden und dazu veranlasst
werden, Licht in einer auslösbaren
lichtemittierenden Reaktion zu emittieren.
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Mit "spezifisch hybridisiert" ist gemeint, dass
eine einzelsträngige
Nukleinsäure
eine stabile Wasserstoff gebundene Duplex mit einer Ziel-Nukleinsäure oder
einem Nukleotidsequenzbereich unter Hybridisierungsbedingungen bilden
kann, die nicht die Bildung von stabilen doppelsträngigen Duplexen
zwischen der gleichen einzelsträngigen
Nukleinsäure
und den nicht angesteuerten Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzbereichen
begünstigt.
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Mit "vergleichbar geschützt" ist gemeint, dass
die Verlustrate des Chemilumineszenzpotentials von verschiedenen
Chemilumineszenzmarkern, die mit Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind,
abhängig
davon, ob die Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure- oder einem Nukleotidsequenzbereich
hybridisiert ist, verringert sind, und dass die Verlustraten unter
den gleichen Bedingungen bevorzugt um einen Faktor von bis zu etwa
250 zueinader liegen.
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Mit "vergleichbar empfänglich" ist gemeint, dass
die Verlustraten des Chemilumineszenzpotentials verschiedener chemilumineszierender
Marker, die mit Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden
gekoppelt sind, beim Aussetzen gegenüber einem destabilisierenden
Agens unter identischen Bedingungen bei einem Faktor von etwa 50
zueinander liegen.
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Mit "Chemilumineszenzpotential" ist die Fähigkeit
eines vorgegebenen chemilumineszierenden Markers gemeint in einer
auslösbaren
lichtemittierenden Reaktion zu reagieren. Der Verlust des Chemilumineszenzpotentials
findet statt, wenn ein solcher chemilumineszierender Marker chemisch
abgebaut wird oder in eine nicht-chemilumineszierende Verbindung
umgewandelt wird.
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Mit "Reaktions-pH-Optimum" ist der pH-Wert
gemeint, bei dem eine Chemilumineszenzreaktion, bei der ein vorgegebener
chemilumineszierenden Marker beteiligt ist, unter definierten Bedingungen
mit der höchsten
Lichtemission ablaufen wird. Wenn mehr als eine chemilumineszierende
Verbindung in der gleichen Reaktionsmischung vorhanden ist, kann
es zwei oder mehr pH-Optima
für die
Chemilumineszenzreaktionsmischung geben. Die Lichtemissionsausbeute
(als eine Funktion des pH) kann schrittweise ansteigen, wenn das pH-Optimum
erreicht wird, so dass ein vorgegebener Chemilumineszenzmarker weniger
Licht bei einem ersten pH emittieren kann, während der gleiche Marker viel
mehr Licht bei einem pH-Wert emittiert, der sich um 1,0 bis 0,5
pH Einheiten vom ersten unterscheidet.
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Mit "Initiierer" ist die Zugabe von
Energie, eines Katalysators oder eines oder mehrerer Reaktanten
zu einer Reaktionsmischung gemeint, die chemilumineszierende Reagenzien
enthält,
die den Beginn einer lichtemittierenden Reaktion verursachen wird/werden.
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Mit "Acridiniumderivat" ist irgendeines
aus der Familie der chemilumineszierenden Verbindungen, die auf
dem Acridiniumring aufgebaut sind, gemeint.
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Mit "Acridiniumesterderivat" ist irgendeines
aus der Familie der chemilumineszierenden Verbindungen gemeint,
die auf dem Acridiniumring aufgebaut sind und eine Esterverknüpfung an
der C-9-Position aufweisen.
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Mit "Reaktionskinetiken" ist die Rate der
lichtemittierenden Reaktion gemeint, die durch die Menge des durch
die Chemilumineszenzverbindung oder Verbindungen, die daran in einem
vorgegebenen Zeitintervall teilnehmen, als eine Funktion der Zeit,
emittierten Lichtes bestimmt wird. Der Begriff "Reaktionskinetiken" soll demnach den Bezug zur Menge der
Zeit zwischen dem Auslösen
einer Chemilumineszenzreaktion und dem maximalen Ausmaß der Lichtemission
(Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals) als auch die Dauer der
Lichtemission nach dem Auslösen
in einer bestimmten Reaktionsmischung einschließen. Die Reaktionskinetiken einer
Reaktionsmischung, die einem bestimmten chemilumineszierenden Marker
enthalten, kann als die Menge von Licht, das in einem bestimmten
Zeitraum emittiert wird, gegen die Zeit dargestellt werden, und
die Kurve, die dabei erhalten wird, ist reproduzierbar und charakteristisch
für einen
bestimmten chemilumineszierenden Reaktanten unter den gleichen Reaktionsbedingungen.
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Die
in den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagenzien sind Acridiniumderivate,
bevorzugt Acridiniumphenylesterderivate. 1 zeigt Beispiele
von repräsentativen
Acridiniumphenylesterderivaten. Es versteht sich, das andere geeignete
chemilumineszierende Reagenzien und Acridiniumesterderivate, die
andere Acridiniumderivate einschließen als für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung im Lichte der vorliegenden Offenbarung durch Routineuntersuchungen
als geeignet erachtet werden können.
Acridiniumphenylesterverbindungen sind Derivate von Akridin, die
ein quarternäres
Stickstoffzentrum enthalten und in der 9-Position derivatisiert
werden, um einen Phenylesterrest zu bekommen. Acridiniumderivate,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, egal ob Phenylester
oder nicht, teilen die Eigenschaft, dass sie mit Wasserstoffperoxid
reagieren, um einen kurzlebigen Dioxetanring zu bilden, der den C-9
Kohlenstoff des Acridiniumrings einschließt, gefolgt von der Bildung
eines angeregten Akridons. Die Strahlungsrelaxation des angeregten
Akridons führt
zur Erzeugung von Licht. Die Synthese von Acridiniumestern als auch
eine allgemeine Beschreibung ihrer Verwendung als chemilumineszierende
Markerreagenzien wird beschrieben in Weeks et al., Acridinium Esters
as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem. 29:1474–1478 (1984),
wie zuvor bereits zitiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
Acridiniumester mittels standardchemischer Techniken an eine nicht-Nukleotid
monomere Einheit mit einem primären
Amin "linker Arm", der für die Bindung
mit dem Acridiniumesterrest verfügbar
ist, der zwischen benachbarten Sequenzen von Nukleotiden während der
chemischen Synthese der Oligonukleotide inseriert wird oder an einer
terminalen Position des Oligonukleotids angeordnet wird, gebunden.
Siehe, Arnold, et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide
Probes, EPO Veröffentlichungs
Nr. EPO 313219, die gemeinsame Eigentümreschaft mit der vorliegenden
Erfindung genießt. Demnach
wird der linker Arm-Rest, an dem der Marker angebunden wird, an
einer vorbestimmten Position innerhalb des Oligonukleotids angeordnet.
Er kann als Insertion zwischen oder als eine Substitution für ein oder mehrere
Nukleotide, die eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die ausreichend komplementär zu wenigstens einem Abschnitt
einer Ziel-Nukleinsäure ist,
um damit unter strengenden Hybridisierungsbedinungen hybridisieren
zu können,
angeordnet sein. Die Festphasensynthese von Oligonukleotiden ist
im Stand der Technik gut bekannt und wird beschrieben von Brown & Brown, Modern
Machine-Aided Methods of Oligodeoxyribonucleotide Synthesis in Oligonucleotides
and Analogues-A Practiced Approach (1991).
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Acridiniumesterderivate
können
an das Linker-Arm:Hybridisierungssondenkonjugat
mittels im Stand der Technik gut bekannter Techniken angebunden
werden. Bevorzugt verwendet der Anmelder die Verfahren, die von
Nelson et al., Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence
in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press 1992) und Arnold
et al., Non-Nucleotide
Linking Reagents for Nucleotide Probes, EPO Veröffentlichungs Nr. EPO 313219
beschrieben werden.
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Daher
wird in einem solchen bevorzugten Verfahren ein N-Hydroxysuccinimid
(NHS)-ester des Acridiniums (z.B. 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfonat)
synthetisiert, wie es von Weeks et al., siehe oben, beschrieben
wird. Die Reaktion des primären
Amins des Linker-Arm:Hybridisierungssondenkonjugates mit dem ausgewählten NHS-Acridiniumester
wird wie folgt durchgeführt.
Das Oligonukleotid-Hybridisierungssonde:Linker-Arm-Konjugat, das
wie weiter oben beschrieben hergestellt wird, wird in einem Savant
Speed-VacTMTrockenapparat vakuumgetrocknet,
dann in 8 μl
0,125 M HEPES-Puffer (pH 8,0) in 50% (v/v) DMSO aufgelöst. Zu dieser
Lösung
werden 2 μl
25 mM des gewünschten NHS-Acridiniumesters
gegeben. Die Lösung
wird gemischt und bei 37°C
für 20
Minuten inkubiert.
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Zusätzliche
3 μl 25
mM NHS-Acridiniumester in DMSO werden zur Lösung gegeben und langsam vermischt,
dann werden 2 μl 0,1
M HEPES-Puffer (pH 8,0) zugegeben, gemischt und dann lässt man
das Röhrchen
für zusätzliche
20 Minuten bei 37°C
inkubieren. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 μl 0,125 M
Lysin in 0,1 M HEPES-Puffer (pH 8,0) in DMSO, die langsam zur die
Lösung
gemischt wird, gestoppt.
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Das
markierte Oligonukleotid wird durch die Zugabe von 30 μl 3 M Natriumacetatpuffer
(pH 5,0), 245 μl
Wasser und 5 μl
40 mg/ml Glycogen aus der Lösung
zurückgewonnen.
Sechshundertvierzig Mikroliter eisgekühlten 100 Ethanols werden in
das Röhrchen
gegeben und das Röhrchen
wird für
5 bis 10 Minuten auf Trockeneis aufbewahrt. Die präzipitierten
markierten Nukleinsäuren
werden in einer gekühlten
Mikrozentrifuge bei 15000 rpm mittels eines Standardrotorkopfes
absedimentiert. Der Überstand
wird abgenommen und das Pellet in 20 μl 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0),
das 0,1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, wieder aufgelöst.
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Das
markierte Oligomer kann dann nach Bedarf und wie gewünscht gereinigt
werden; Verfahren zur Reinigung von markierten Oligonukleotiden
sind im Stand der Technik gut bekannt. In einem bevorzugten Verfahren,
dass von Arnold, et al., Acridinium Ester Labeling and Purification
of Nucleotide Probes, U.S. Patent Nr. 5,185,439 (das gemeinsame
Eigentümerschaft
mit der vorliegenden Erfindung genießt) beschrieben worden ist,
wird das Oligomer mittels Umkehrhochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC)
gereinigt. Die Probe wird auf eine Vydac C4 Umkehrphasen HPLC-Säule aufgebracht
und mit einem linearen Gradienten von 10 % bis 15 % Puffer B innerhalb
von 25 Minuten eluiert, wobei Puffer A aus 0,1 % (w/v) Triethylammoniumacetat (pH
7,0) in Wasser mit HPLC-Qualität
besteht und Puffer B aus 100 % Acetonitril besteht. Das Absorptionsvermögen der
sich ergebenden abfließenden
Lösung
wird bei 260 nm überwacht
und 0,5 ml Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen werden dann
auf ihre Chemilumineszenz hin untersucht, wobei die Fraktionen, die mit
dem aktiven Hauptsignal übereinstimmen,
mit Ethanol präzipitiert
werden, und die markierten Sonden werden dann in 0,1 M Natriumacetat
(pH 5,0), das 0,1 % SDS enthält,
resuspendiert.
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Die
Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden
bevorzugt in Verbindung mit dem Hybridisierungsschutzassay (HPA)
verwendet, das beschrieben wird von Nelson et al., Detection of Acridinium
Esters by Chemiluminescence in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic
Press 1992) und von Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174. In
diesem Assayformat sind die Acridiniumester Markerreagenzien für die Hydrolyse
empfänglich,
wenn sie an die unhybridisierte Sonde gebunden sind, sind jedoch
vor der Hydrolyse geschützt,
wenn sie an die hybridisierte Sonde gebunden sind. Die unterschiedlichen
Hydrolysecharakteristika dieses Systems ermöglichen ein homogenes einzelphasiges
Assay, wobei die Hybridisierung der Sonde mit dem Ziel, die Unterscheidung
zwischen hybridisierter und unhybridisierter Sonde und die Detektion und/oder
Quantifizierung der markierten hybridisierten Sonde in einem einzelnen
Teströhrchen
durchgeführt werden
kann. Jedoch ist die unterschiedliche Hydrolyse nicht das einzige
Verfahren durch das die hybridisierte von der unhybridisierten Sonde
unterschieden werden kann; andere chemische Modifikationen des chemilumineszierenden
Markers, wie zum Beispiel die Adduktbildung, können oder könnten dazu in der Lage sein
einen chemilumineszierenden Marker, der mit einer hybridisierten
Sonde gekoppelt ist, von einer nichthybridisierten Sonde zu unterscheiden.
Das hierin beschriebene Assayformat ist auch zugänglich für Assayformatmischelemente
eines homogenenen und eines heterogenen Assays.
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Die
folgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und begrenzen
auf keine Weise den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, die
durch die diese Beschreibung abschließenden Ansprüche definiert
ist.
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Beispiel 1: Anfängliches
Testen und Untersuchen verschiedener Acridiniumesterderivate
-
Synthese von
AE-Markerreagenzien
-
N-Hydroxysuccinimid
(NHS)-ester Markerreagenzien von Acridiniumester (AE)-derivaten
wurden so synthetisiert wie allgemein von Weeks et al., siehe oben,
beschrieben. Für
diese Synthesen wurden Materialien und Reagenzien von höchster Reinheit,
die kommerziell erhältlich
sind, bei Aldrich, Lancaster Synthesis und Fisher Scientific bezogen.
9-Acridincarboxylsäure
(ACA) oder ein Methyl oder Dimethyl substituiertes Derivat, das,
wie weiter unten beschrieben, hergestellt wurde, wurde durch vierstündiges Refluxieren
in Thionylchlorid in die entsprechenden Acridinsäurechloride umgewandelt. Kommerziell
erhältliche
Hydroxyphenyl- oder Hydroxynaphthylsäuren – nämlich, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure, 3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propionsäure, 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure und
6-Hydroxy-2-naphtoesäure – wurden
durch Behandeln ihrer Kaliumsalze mit Benzylbromid in 95 % Ethanol
(EtOH) Lösung
unter refluxierenden Bedinungen für etwa 3 Stunden in Benzyl
(Bz)-ester umgewandelt. Die Benzylester ließ man dann mit den Acridinsäurechloriden
in wasserfreiem Pyridin für
etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, um die Acridinester
zu erhalten. Die Benzylesterschutzgruppen wurden durch Behandeln
der Acridinester mit 30 wt.% Wasserstoffbromid (HBr) in Essigsäure (HOAc)
für etwa
4 Stunden bei 60°C
hydrolysiert. Die sich daraus ergebende Säure wurde in das N-Hydroxysuccinimid
(NHS)-esterreagenz mittels der Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)-Katalyse
in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) umgewandelt. Schließlich wurde
die Umwandlung in das Methylacridinium-Markerreagenz durch Methylierung
des Acridins durch Behandlung mit einem Überschuss an Methyltrifluormethansulfonat
(Methyltriflat) in wasserfreiem Methylenchlorid für 5 bis
24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die NHS-Ester-Markerreagenzien,
die für
das Standard-AE, Naphthyl-AE, o-MeO-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE verwendet
wurden, wurden auf diese Weise hergestellt. Die NHS-Ester-Markerreagenzien,
die für 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE und
die Mischung aus 1- und 3-Me-AE verwendet wurden, erforderten die
Synthese von Methyl und die Methyl substituierten ACAs, wie weiter
unten beschrieben.
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Die
4,5- und 2,7-Dimethyl substiuierten Derivate der 9-Acridincarboxylsäure (ACA)
wurden durch die Reaktionen von Oxalylchlorid mit Dimethyl substituierten
Diphenylaminen hergestellt, um Isatin Zwischenprodukte bereitzustellen
und dann folgte die Neuordnung, um die entsprechend substituierten
Acridine zu erzeugen, wie es im Wesentlichen für die 4,5-Dimethylacridin-9-carboxylsäure von
M.S. Newman and und W.H. Powell, J.Org. Chem., 26 (1961):812–815 beschrieben
worden ist. Als erste wurden 2,2'-Dimethyldiphenylamin und
4,4'-Dimethyldiphenylamin
durch Reagieren von 2- oder 4-Methylformanilit
mit einem leichten Überschuss an
2- bzw. 4-Bromtoluen in Gegenwart von wasserfreiem Natriumcarbonat
und Spuren von Kupfer in Nitrobenzen bei 200°C für 24 Stunden hergestellt. Die
Hydrolyse der sich daraus ergebenden N,N-Diphenylformamide wurde
durch deren refluxieren in einer 1:1 (v/v) Mischung aus konzentrierter
HCl in Essigsäure
(HOAc) für
5 Stunden durchgeführt,
um die Dimethyldiphenylamine mit guter Ausbeute nach der Reinigung über Silica
bereitzustellen. Die Herstellung von Dimethyl substituierten Acridincarboxylsäuren über Isatine
wurde dann forstgesetzt durch die Reaktion mit dem oben hergestellten
2,2'-Dimethyldiphenylamin
oder 4,4'-Dimethyldiphenylamin,
die weiter oben mit Oxalylchlorid hergestellt wurden, in refluxierendem
Kohlenstoffdisulfid für
etwa 3 Stunden. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen Reagenzien
wurde der gelbe Rückstand
in frischem Kohlenstoffdisulfid aufgenommen und mit Aluminiumchlorid über einen
Zeitraum von etwa 30 Minuten behandelt, für 4 Stunden refluxiert und
bei Raumtemperatur über
Nacht stehen gelassen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand
auf Methylenchlorid und kalter 10 % (v/v) konzentrierter HCl aufgeteilt.
Die orangenen Isatine wurden in der organischen Schicht wiedergewonnen.
Am Ende führte
die Behandlung der Isatine mit 10 % (w/v) Kaliumhydroxid (KOH) für 12 Stunden
unter Refluxieren zur Bildung von 4,5-Dimethylacridin-9-carboxylsäure (4,5-diMe-ACA)
bzw. 2,7-Dimethylacridin-9-carboxylsäure (2,7-diMe-ACA).
Auf vergleichbare Weise wurde 3-Methyldiphenylamin mit Oxalylchlorid
und Aluminiumchlorid behandelt, um eine Mischung aus Methylphenylisatinen
zu erzeugen, die, nach Neuordnung durch Behandlung mit KOH, wie
weiter oben beschrieben, eine Mischung aus 1- und 3-Methylacridin-9-carboxylsäure (1-
und 3-Me-ACA) ergab. Die Veresterung von 4,5-diMe-ACA, 2,7-diMe-ACA
oder der Mischung aus 1- und 3-Me-ACA mit dem Benzylester von 3-(4-Hydroxylphenyl)propionat
und den nachfolgenden Reaktionen, die weiter oben beschrieben wurden,
ergaben die NHS-Markerreagenzien, die für 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE
oder der Mischung aus 1- bzw. 3-Me-AE verwendet wurden.
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Mehrere
substituierte Hydroxyphenylpropionsäurederivate, die nicht kommerziell
erhältlich
sind, wurden durch konventionelle Verfahren hergestellt. 3-(4-Hydroxy-3,5-dibromphenyl)-propionsäure wurde
durch Bromierung von 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure mit
Brom in Eisessigsäure
(HOAc) hergestellt. 3-(2-Hydroxyphenyl)propionsäure wurde durch Hydrierung
von 2-Hydroxyzimtsäure über Palladium-Kohle
in absolutem Ethanol (EtOH) hergestellt. Die Acridiniumester (AE)
Herstellung konnte dann durch Koppeln von ACR mit den Benzylestern
dieser Säuren,
wie weiter oben angegeben, fortgesetzt werden, um die NHS-Ester-Markerreagenzien
bereitzustellen, die für
o-diBr-AE bzw. ortho-AE verwendet wurden.
-
Zusätzlich wurden
die Propionitrilderivate verschiedener substituierter Phenole – nämlich 2-Methylphenol, 2,6-Dimethylphenol,
3,5-Dimethylphenol, 2-Fluorphenol und 3,5-Difluorphenol – durch
Cyanoethylierung mittels durch Aluminiumchlorid katalysierter Kondensation
von Acrylnitril mit dem Phenol und Isolieren des entsprechend substituierten
4-Hydroxyphenylpropionitrils hergestellt. Diese Hydroxyphenylpropionitrilderivate
ließ man
dann mit den Acridinsäurechloriden
reagieren und die sich daraus ergebenden Esterverbindungen wurden
mit Chlorwasserstoff behandelt, um die Nitrile zu den entsprechenden
Propionsäurederivaten
zu hydrolysieren, die, wie weiter oben beschrieben, weiter verarbeitet
werden konnten, um die entsprechenden AE-NHS-Ester-Markerreagenzien zu erhalten.
Alternativ dazu konnten die Propionnitrile als Erstes zu dem entsprechenden
Propionsäurederivat
hydrolysiert werden und die Synthese konnte dann über den
Benzylester fortgesetzt werden. Die letzten Schritte zum Herstellen
der AE-NHS-Reagenzien waren die gleichen, wie weiter oben angegeben.
Die NHS-Ester-Markerreagenzien,
die für
o-diMe-AE, m-diMe-AE, o-Me-AE, o-F-AE, 1- oder 3-Me-o-F-AE und 1-
oder 3-Me-m-diF-AE verwendet wurden, wurden auf die gleiche Art
und Weise hergestellt.
-
Dem
Durchschnittsfachmann wird klar sein, dass diese Syntheseschemata
allgemein verwendet werden können,
um zusätzliche
und verschiedene Acridiniumderivate für die Charakterisierung und
die Untersuchungen, wie weiter unten beschrieben, herzustellen.
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Charakterisierung und
Untersuchung von AE-Derivaten
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Die
Chemilumineszenz und Hydrolysecharakteristika dieser Derivate wurden
mit denen von Standard-AE (4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfonat)
verglichen.
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Beispielhafte
AE-Derivate, die zur Darstellung der vorliegenden Erfindung verwendet
wurden, waren Naphthyl-AE, o-diBr-AE,
eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7- diMe-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE,
m-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE (ein Acridiniumesterderivat
mit dem Nukleinsäure-Kopplungslinkerarm,
der mit dem Phenylring in der ortho-Position verbunden ist), o-F-AE,
eine Mischung aus 1- und
3-Me-o-F-AE, Standard-AE und einer Mischung aus 1- und 3-Me-m-diF-AE
(siehe 1). 1-Me-AE, 1-Me-o-F-AE und
1-Me-m-diF-AE waren
nur in einer Mischung mit ihren 3-Methylisomeren vorhanden; gemäß der Verwendung
in dieser Anmeldung wird diese Nomenklatur so verstanden, dass sie
eine Mischung der entsprechenden 1- und 3-Methylderivate kennzeichnen.
Wie in 1 dargestellt, wurden diese Verbindungen
verwendet, um verschiedene Oligonukleotide, die als Hybridisierungssonden
verwendet werden, zu markieren. Der Durchschnittsfachmann wird verstehen,
dass die vorliegende Erfindung nicht von der Verwendung einer bestimmten
Sonde-Ziel-Kombination
abhängt.
Demnach wäre
die Auswahl von zwei oder mehreren sich gegenseitig ausschließenden Sonde-Ziel-Kombinationen für die Verwendung
mit dem derzeit offenbarten Assay im Lichte der vorliegenden Offenbarung
reine Routine.
-
Die
Oligonukleotide wurden so synthetisiert, dass sie Phosphordiesterverbindungen
enthalten, wobei Standardfestphasenphosphoramididchemie unter Verwendung
von Biosearch 8750 oder ABI 380A DNA Synthetisierern verwendet wurde,
und unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt;
Oligonukleotidsynthese und Gelreinigungstechniken sind im Stand
der Technik gut bekannt. (siehe z.B., Sambrook et al., siehe oben).
Verschiedene nicht natürlich
auftretende Oligonukleotide, wie zum Beispiel solche mit modifizierten
Internukleotidverknüpfungen,
wie zum Beispiel Phosphorthioatverknüpfungen oder solche mit Zucker- oder
Basenmodifikationen, sind im Stand der Technik auch bekannt und
können
Vorteile haben, wie zum Beispiel die erhöhte Stabilität in bestimmten
Anwendungen; diese Nukleinsäureanaloga
werden auch für
die Verwendung als Teil der Erfindung der vorliegenden Anmeldung
umfasst.
-
Wie
zuvor bereits beschrieben, wurde ein Linker-Arm, der in einem primären Amin
endet, in jede Oligonukleotidstruktur an einer vorbestimmten Position
in der Nukleotidsequenz des Oligonukleotids eingebaut, wodurch eine
Insertion zwischen Nukleotiden in der Sequenz erzeugt wurde. Siehe
z.B., Arnold et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide
Probes, siehe oben. Die AE-Derivate waren mit dem Oligonukleotid über das
primäre
Amin des Linker-Arms, wie weiter oben detaillierter beschrieben,
verknüpft.
Die markierten Sonden wurden charakterisiert und im Bezug auf ihre
Chemilumineszenz, Hybridisation und differentiellen Hydrolyseeigenschaften
charakterisiert.
-
Zehn
Mikroliter Aliquots der markierten Sonden wurden in 12 × 75 Polysterenröhrchen übertragen
und die Chemilumineszenz wurde in einem LEADER® 50
Luminometer (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) durch die automatische
Injektion einer Lösung
aus 200 μl
0,1 % H2O2 und 0,4
N HCl, einer 0,1 bis 2 sekündigen Verzögerung,
automatischer Injektion von 200 μl
1 N NaOH und der Messung der Chemilumineszenz für 5 Sekunden gemessen. Der
pH liegt am Ende etwa bei 13.
-
Der
hierin beschriebene jeweilige Luminometer misst Licht zwischen den
Wellenlängen
300 bis 650 nm; es wird deutlich geworden sein, dass ein Luminometer
emittiertes Licht in diesen Wellenlängenbereichen detektieren muss,
um in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
nützlich
zu sein. Tatsächlich
kann es in bestimmten Modi der vorliegenden Erfindung zum Beispiel
in einem Mehrfachwellenlängenmodus
für einen
Luminometer nützlich
oder notwendig sein, das emittierte Licht über breitere oder engere Wellenlängenbereiche
zu messen, als es hierin beschrieben wird, oder über mehr als eine engere Wellenlänge unabhängig oder
gleichzeitig zu messen. Daher sollte der Umfang der Wellenlängen, die
im hierin beschriebenen Beispiel überwacht wurden, als exemplarisch
verstanden werden und keine Begrenzung für den Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung sein.
-
Die
Chemilumineszenzreaktionscharakteristika wurden durch das Messen
des Lichts, das durch die reagierenden Acridiniumesterderivate emittiert
wurde, bestimmt. Das emittierte Licht wurde durch den Luminometer
unter Verwendung von relativen Lichteinheiten (RLU), eine Maßeinheit,
die die relative Anzahl von Photonen angibt, die von der Probe bei
einer bestimmten Wellenlänge
oder einem Bereich von Wellenlängen emittiert
werden, quantifiziert. Das Licht wurde zu mehreren Zeitpunkten während der
5 sekündigen
Messperiode detektiert. Von diesen Daten ausgehend wurde der erforderliche
Zeitraum für
jedes markierte Oligonukleotid bis zum Erreichen des Scheitelpunkts
der Emission ("Zeit
bis zum Scheitelpunkt des Signals") und der Dauer der Lichtemission bestimmt.
Die "Dauer" wurde beliebig so
definiert, dass sie die Zeit meint, die für die RLU erforderlich ist,
um 10% der Grundlinie zu erreichen nachdem die Emission am Scheitelpunkt
aufgetreten ist. Diese Daten werden in Tabelle 1 weiter unten dargestellt.
-
-
Zusätzlich wurde
auch der pH, der für
jede markierte Sonde erforderlich ist, um die maximale Menge an
Licht zu emittieren, bestimmt und als "optimaler pH" definiert. Bei dieser Bestimmung wurde
die Reaktion initiiert, wie weiter oben beschrieben, mit der Ausnahme,
dass die erste Reaktionslösung
0,1 N HCl anstelle von 0,4 N HCl enthielt und anstatt NaOH zu verwenden,
enthielt die zweite Reaktionslösung
0,24 M Natriumboratpuffer, der für
verschiedene pH-Werte titriert wurde. Die "Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals" und die Dauer wurden
für jede
markierte Sonde beim optimalen pH berechnet. Diese Daten kann man
auch in Tabelle 1 finden.
-
Nach
dem Bestimmen der Chemilumineszenzreaktionskinetiken der markierten
Oligonukleotide wurden die Hybridisierungs- und Hydrolysecharakteristika
jedes Oligonukleotids untersucht. Die AE-Hydrolysecharakteristika
für jedes
hybridisierte und unhybridisierte markierte Oligonukleotid wurden
in einem Bereich von Temperaturen und pH-Werten bestimmt, wie es
in Nelson et al., siehe oben, beschrieben worden ist und in den
folgenden Beispielen hier kurz zusammengefasst wird.
-
Beispiel 2: Bestimmen
der Hydrolysecharakteristika von Acridiniumesterderivaten
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht ein bevorzugtes Verfahren zum Untersuchen
individueller chemilumineszierender Marker, um ihre Hydrolysecharakteristika,
wie zum Beispiel die Hydrolyserate, zu bestimmen wenn sie mit Hybridisierungsassaysonden
gekoppelt sind. Das Verfahren ist besonders gut verwendbar für eine vorläufige Bestimmung
der Eignung eines oder mehrer Acridiniumesterderivate für die Verwendung
in einem Mehrfachanalytassaysystem. Obwohl dieses Verfahren ein
bevorzugtes Verfahren zum chemischen Unterscheiden hybridisierter
von unhybridisierten markierte Oligonukleotidsonden darstellt, sind
andere Verfahren der chemischen oder physikalischen Trennung einzelsträngiger von
vollständig
oder teilweise doppelsträngigen
Nukleinsäuren,
wie z.B. die Hydroxyapatitadsorption, Gelfiltration oder die Umkehrchromatographie,
dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt.
-
Allgemeines Verfahren
zum Messen der Hydrolyse freier Sonden
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Im
Allgemeinen ist jeder geeignete Acridiniumester mit einer einzelsträngigen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde
und dem gereinigten Sonde:AE-Ester gekoppelt, wie weiter oben beschrieben.
Zehn Mikroliter jeder mit einem Acridiniumester markierten Sonde,
die in PSB (10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 0,1 % Lithiumlaurylsulfat)
gelöst
wurden, wurden in ein 12 × 75
mm Polysterenteströhrchen
gegeben. Mehrere Röhrchen
zur Wiederholung werden für
jede markierte Sonde, die getestet werden soll, erstellt; der Anmelder
verwendet für
gewöhnlich
13 Röhrchen
zur Wiederholung für
jedes markierte Röhrchen,
wovon drei als "Zeitpunkt" Null (T0)-Kontrollen
verwendet werden. Die T0-Kontrollen werden
in einem Teströhrchenhalter
bei Raumtemperatur aufbewahrt. Zu jedem dieser Röhrchen werden 200 μl 0,4 N HCl
und 0,1 % (v/v) H2O2 gegeben,
gefolgt von der Zugabe von 100 μl
Hydrolysepuffer (0,13–0,19
M Na2B4O7 (pH 7,6–9,5)) und 2–5 % (v/v) Polyoxyethylenether
(verkauft unter dem Handelsnamen TRITON® X-100 durch Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO). Die Anmelder haben herausgefunden, dass die
Reihenfolge bei diesem Schritt von Bedeutung ist. Reagenzienleerwerte
(Negativkontrolle) enthalten 10 μl
PSB alleine und werden dann so behandelt wie die T0-Kontrollen.
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Einhundert
Mikroliter des Hydrolysepuffers werden in jedes der 10 verbleibenden
Teströhrchen
für Wiederholungsversuche
im Teströhrchenhalter
gegeben und der Halter wird zum Mischen geschüttelt. Der Teströhrchenhalter
wird sofort in einem zirkulierenden Wasserbad bei 60°C (oder jeder
anderen gewünschten Testtemperatur)
angeordnet und die Zeitaufnahme wird gestartet.
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Zu
gewünschten
Zeitpunkten (zum Beispiel 1, 2, 4, 7, 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten)
werden 200 μl einer
Lösung
aus 0,4 N HCl 0,1 % (v/v) H2O2 zu
einem Röhrchen
aus jedem Set zugegeben und das Röhrchen wird sofort aus dem
Wasserbad bei Raumtemperatur entfernt und gemischt. Man lässt das
Röhrchen
für wenigstens
1 Minute bei Raumtemperatur stehen.
-
Die
Chemilumineszenz jeder Probe wird in einem Luminometer durch eine
einzelne Injektion einer Lösung,
die 1 N NaOH enthält,
und Messen der Chemilumineszenz für 5 Sekunden gemessen. Die
durchschnittlichen RLUs der Negativkontrollen werden von den experimentellen
RLUs abgezogen. Die Netto-RLUs für
jede Probe können
dann durch die durchschnittlichen T0-RLUs
geteilt werden und mit 100 multipliziert werden; dies ergibt die
%T0-werte; die Daten können mit log (%T0)
als γ-Achse
und der Zeit als x-Achse aufgetragen werden.
-
Differentielle Hydrolyse
(DH) Verhältnisbestimmung
-
Im
Folgenden wird ein allgemeines Verfahren zum Messen des Hydrolyseverhältnisses
des chemilumineszierenden Markers, der mit einer hybridisierten
Oligonukleotidsonde gekoppelt ist, im Vergleich zur Hydrolyse des
gleichen Markers, der auf die gleiche Weise mit der gleichen nicht
mit ihrer Ziel-Nukleinsäure hybridisierten
Sonde gekoppelt ist, dargestellt. Die Hybridisierung der markierten
einzelsträngigen
Oligonukleotidsonde wird wie folgt durchgeführt. Die folgenden Reagenzien
werden in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede mit einem Acridiniumester
markierte Sonde, die getestet werden soll, kombiniert: 15 μl einer Lösung aus
PSB, die 0,05–0,1
pmol der AE-markierten Sonde (ein errechnetes Gesamt RLU-Potential
von etwa 4–5 × 106), 0,5–1,0
pmol Äquivalente
der Ziel-Nukleotidsequenz (z.B., 0,25–0,5 pmol einer Nukleinsäure mit zwei
Kopien der Ziel-Nukleotidsequenz) und jeweils 5–10 pmol jeder gewünschten
Helfersonde enthält,
um die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-Nukleinsäure zu erleichtern.
Helfersonden, die auch Helfer-Oligonukleotide genannt werden, sind
unmarkierte Oligonukleotide, die zur Erhöhung der Hybridisierungsrate
durch Zerstören
der Sekundärstruktur
der Ziel-Nukleinsäure
im Bereich der Ziel-Nukleotidsequenz
verwendet werden, (siehe Hogan et al., U.S. Patent Nr. 5,030,557,
die gemeinsame Eigentümerschaft
mit der vorliegenden Anmeldung genießt). Jedoch ist die Verwendung
von Helfersonden nicht essentiell für die Durchführbarkeit
der vorliegenden Erfindung.
-
Dem
Mikrozentrifugenröhrchen
werden auch 15 μl
an 2 × Hybridisierungspuffer
(200 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat,
3 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 3 mM EGTA ([Ethylenbis(oxyethylennitrilo)]-tetraessigsäure)) zugesetzt.
Das Röhrchen
wird bei einer Temperatur von wenigstens etwa 5 °C unter dem Tm der Sonde:Zielduplex
für wenigstens
30 Minuten inkubiert und dann werden 270 μl 1 × Hybridisierungspuffer zugegeben.
Getrennte Röhrchen
sollten für
jede chemilumineszierende Markersondenkombination verwendet werden;
ein Röhrchen
aus jedem Satz (gekennzeichnet mit "Hybrid") sollte die markierte Sonde, die Ziel-Nukleinsäure und
die Reagenzien enthalten, ein anderes Röhrchen (gekennzeichnet mit "Kontrolle") sollte bei Verwendung
der gleichen Sonde und Reagenzien jedoch ohne die Ziel-Nukleinsäure verwendet
werden. Am Ende sollte für
jedes Experiment eine Reihe von identischen Röhrchen für den "Leerwert" unter Verwendung der Hybridisierungsreagenzien
ohne markierte Sonde oder Ziel-Nukleinsäure erstellt werden.
-
Zehn
Mikroliter Aliquots für
jedes Röhrchen
werden in 12 × 75
mm Polysterenröhrchen
pipettiert; die Anzahl dieser Röhrchen
ist gleich der Anzahl der zu analysierenden Zeitpunkte plus drei
Röhrchen
für die T0-Bestimmungen, wie weiter oben beschrieben.
-
In
die drei T0-Röhrchen für den Wiederholungsversuch
werden 200 μl
0,4 N HCl, 0,1 % (v/v) H2O2 gefolgt
von 100 μl
Hydrolysepuffer zugegeben. Die Röhrchen
werden dann in einem Luminometer mittels einer einzelnen Injektion
von 1 N NaOH über
einen Zeitraum von 5 Sekunden ausgelesen. Die Reagenzien "Leerwert"-Kontrollen, die
10 μl PSB
alleine enthalten, werden in einem Satz von 3–6 Röhrchen angesetzt und auf die
gleiche Weise behandelt wie die T0-Kontrollen.
-
Die "Hybrid"- und "Kontroll"-Röhrchen werden
mit 100 μl
Hydrolysepuffer versetzt, gemischt und in einem zirkulierenden Wasserbad
bei der gewünschten
Temperatur, z.B., 60°C,
angeordnet. Der Zeitnehmer wird gestartet.
-
Zu
den gewünschten
Zeitpunkten wird zu einem Röhrchen
aus jedem Satz 200 μl
0,4 N HCl, 0,1 % (v/v) H2O2 gegeben,
dann wird es aus dem Wasserbad entfernt und gemischt. Man lässt die
Röhrchen
bei Raumtemperatur für
wenigstens 1 Minute stehen.
-
Die
Chemilumineszenz der Zeitpunkt-Proben aus jedem Röhrchensatz
wird in einem Luminometer mittels einer Injektion von 1 N NaOH gemessen.
Das emittierte Licht wird für
5 Sekunden gemessen.
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Die
Daten werden, wie weiter oben beschrieben, analysiert. Die Hybrid-Hydrolyserate,
die als Habwertszeit (T1/2) in Minuten ausgedrückt wird, wird durch die Hydrolyserate
der Kontrollen geteilt, um das differentielle Hydrolyse (DH)-Verhältnis zu
erhalten. Diese Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle 2 zusammengefasst.
-
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Von
den in Tabelle 1 dargestellten Daten ausgehend, fand man, dass Sätze von
Verbindungen ausgewählt
werden konnten, dessen Mitglieder ausreichend unterschiedliche Chemilumineszenzeigenschaften
aufweisen, die als Markerreagenzien für das gleichzeitige Detektieren
von mehr als einem Analyten im gleichen Röhrchen verwendet werden können. Wie
in Tabelle 2 dargestellt, fanden die Anmelder überraschend heraus, dass einige
dieser Sätze
auch Verbindungsmitglieder mit vergleichbaren Hydrolysecharakteristika
enthielten; d.h., der hybridisierte AE-Marker war nicht nur bevorzugt
geschützt
vor der Hydrolyse im Vergleich zum unhybridisierten Marker, sondern
die Hydrolyseraten dieser Mitglieder innerhalb bestimmter potentieller
Sätze waren
im Wesentlichen ähnlich. 2 zeigt
eine Liste mit Beispielen von Sätzen,
die Paare solcher Verbindungsmitglieder auflisten. Die darin zitierten
Beispiele sollen die vorliegende Erfindung auf keinen Fall auf diese
Ausführungsformen
beschränken.
Auch wenn diese Figur die mögliche
Anwendbarkeit der AE-Derivate als kombinierte Paare von Markerreagenzien
darstellt, so sollte deutlich geworden sein, dass Sätze mit
mehr als zwei Verbindungsmitgliedern unter Verwendung der Auswahlkriterien,
die in dieser Figur und Offenbarung aufgelistet werden, entworfen
werden können.
Darüber
hinaus sollte die Tatsache, dass bestimmte Verbindungsmitglieder
zusammen in einer Gruppe zusammengefasst werden, auf keinen Fall
so verstanden werden, dass dieses die optimalen oder einzigen Gruppierungen
dieser bestimmten Verbindungen sind oder dass andere Verbindungen
nicht ebenfalls wie angegeben funktionieren würden. Die vorliegende Erfindung
wird lediglich durch die Ansprüche
definiert. Die in 2 aufgelisteten Acridiniumestersätze sind
Kandidaten für
die Verwendung in wenigstens einem Modus der vorliegenden Erfindung.
-
Beispiel 3: Modus 1: Konstanter
pH, gleichzeitige Reaktionsinitiierung
-
Es
gibt verschiedene Modi, in denen die chemilumineszierenden Signale
der Markerreagenzien verwendet werden können, um mehr als einen Nukleinsäureanalyten
in einem einzelnen Probenröhrchen
gemäß der vorliegenden
Erfindung zu verwenden. Dieses und die folgenden Beispiele sind
Illustrationen solcher Modi. Jedoch beabsichtigt der Anmelder durch
diese Beispiele nicht, die Anzahl oder Beschreibung von möglichen Assaymodi
oder der Zusammensetzung oder Kombination von Markerreagenzien für die Verwendung
in der vorliegenden Erfindung zu begrenzen.
-
Ein
erstes Experiment testete die Chemilumineszenzcharakteristika der
AE-Markerreagenzien, die an einzelsträngige Oligonukleotide in Abwesenheit
einer Ziel-Nukleinsäure gekoppelt
sind. Einzelsträngige
Oligonukleotide wurden entworfen, damit sie komplementär zu RNA-Zielen
sind, die von Escherichia coli oder Chlamydia trachomatis abstammen.
Die Oligonukleotide wurden, wie weiter oben beschrieben, gekennzeichnet: Das
o-diBr-Derivat war mit einem Oligonukleotid gekoppelt, das spezifisch
komplementär
zur E. coli Ziel-RNA war, während
eine Mischung der 1- und 3-Me- Derivate
verwendet wurde, um ein Oligonukleotid zu markieren, das spezifisch
komplementär
mit der C. trachomatis Ziel-RNA ist. Die markierten Oligonukleotide
wurden in 10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0) und 0,1 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat
verdünnt,
so dass 10 μl
der sich daraus ergebenden Lösung
etwa 200.000 RLU (etwa 0,002 pmol) jedes Oligonukleotides enthielt.
Zehn Mikroliter jedes Oligonukleotids wurden mit 10 μl des gleichen
Verdünnungspuffers
in getrennten Röhrchen
kombiniert; zusätzlich
wurden 10 μl
jedes markierten Oligonukleotids in einem einzelnen Röhrchen kombiniert.
Zweihundert Mikroliter einer Lösung
die 0,1 N HCl und 0,1 % H2O2 enthielten,
wurden in das Röhrchen
gegeben, gefolgt von 100 μl
einer Lösung,
die 0,19 M Na2B4O7 (pH 7, 6) und 5 % (v/v) TRITON® X-100
enthielt. Die sich daraus ergebende Lösung wurde in einem LEADER® 50
Luminometer angeordnet und die Chemilumineszenz wurde bei verschiedenen
Intervallen nach der Injektion von 200 μl 1 N NaOH in die Probenlösung gemessen.
Der Luminometer wurde im "Kinetikanalyse"-Modus während des
Experiments angeordnet; dies erlaubte das Sammeln von RLU-Datenpunkten
zu vorbestimmten Zeitintervallen nach der Initiation der Chemilumineszenzreaktion.
-
In
einem anderen Experiment wurden die gleichen markierten Oligonukleotide
jeweils mit einem Überschuss
ihrer entsprechenden Ziel-RNA hybridisiert, wie es in Nelson et
al., siehe oben, beschrieben worden ist. Die Hybridisierung wurde
in einem 50 μl
Reaktionsvolumen durchgeführt
und für
60 Minuten bei 55°C
inkubiert. Die letztendliche Lösung
für die
Hybridisierung enthielt 100 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 8,5 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat,
1,5 mM EDTA und 1,5 mM EGTA. Röhrchen,
die 50 μl
jeder individuellen Sonde:Ziel-Hybridisierungsmischung
alleine oder eine Kombination von beiden Hybridisierungsmischungen
enthielten, wurden 150 μl
0,19 M Natriumtetraborat (pH 7,6) in 5,0 % (v/v) TRITON® X-100
zugesetzt. Die letztendliche Menge jedes markierten Oligonukleotids
lag bei etwa 0,002 pmol für
jedes experimentelle Röhrchen.
Die Proben wurden in einem LEADER® 50
Luminometer eingesetzt und die Chemilumineszenz wurde mit der Zugabe
von 200 μl
0,1 % (v/v) H2O2 in
1 mM HNO3 und nach einer 0,1 bis 2 sekündigen Verzögerung einer
automatischen Injektion von 200 μl
1 N NaOH initiiert. Die Chemilumineszenz wurde zu verschiedenen
Zeiten gemessen. Der Luminometer wurde während des Experimentes wiederum
im "Kinetik-Analyse"-Modus gehalten;
dies erlaubte das Sammeln von RLU-Datenpunkten zu vorbestimmten
Zeitintervallen nach dem Initiieren der Chemilumineszenzreaktion.
-
Die
gesammelten Daten für
die unhybridisierten markierten Oligonukleotide werden weiter unten
in Tabelle 3 dargestellt.
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-
In
diesem Experiment wurde die Chemilumineszenz für insgesamt 2 Sekunden mit
Auslesungen in Intervallen von 0,04 Sekunden gemessen. Die Ergebnisse
zeigen, dass der o-diBr-AE-Marker
ein starkes Scheitelpunktsignal bei der Lichtemission aufweist,
das sehr schnell nach der Initiierung der Chemilumineszenzreaktion
auftritt. Das Scheitelpunktsignal der Lichtemission unter diesen
Bedingungen tritt im Intervall 4 auf; etwa 0,16 Sekunden nach der
Initiierung, und dann zerfällt
das Signal sehr schnell. Im Gegensatz dazu erreicht das Licht, das
bei der Mischung aus 1- und 3-Me-AE-Derivaten emittiert wird, seinen
Scheitelpunkt etwa beim Intervall 8 (0,32 Sekunden nach der Initiierung)
und zerfällt
danach sehr langsam. Darüber
hinaus liegt das Signal vom o-diBr-AE-Derivat in den späteren Intervallen
(Intervalle 14 bis 50 und besonders die Intervalle 41–50) bei
nahezu Null, während
das Signal aus der 1- und 3-Me-Mischung immer noch wesentlich größer ist
als der Hintergrund. Die Daten aus der Probe, die beide Marker enthält, nähert sich
der Summer der zwei individuellen Datensätze an jedem Punkt an.
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Die
Daten, die aus den Experimenten erhalten werden, die die hybridisierten
Proben der zwei markierten Oligonukleotide einschließen, werden
weiter unten in Tabelle 4 dargestellt.
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Die
Zeitintervalle waren die gleichen wie in Tabelle 3. In diesem Fall
war der Unterschied bei den Emissionscharakteristika der zwei Marker
noch deutlicher unterscheidbar als im vorherigen Experiment: Der
Scheitelpunkt des Signals von mit E. coli hybridisiertem o-diBr-AE
tritt wiederum etwa im Intervall 4 auf; jedoch tritt der Scheitelpunkt
des Signals für
mit C. trachomatis hybridisiertem 1-Me-AE etwa beim Intervall 14
auf. Wiederum geht während
der späteren
Intervalle (besonders den Intervallen 41–50) das vom o-diBr-AE-Derivat
erhaltene Signal fast verloren, während das Signal vom 1-Me-AE-Derivat
immer noch deutlich ist. Und wieder nähert sich das Profil der Probe,
die eine Mischung der zwei hybridisierten markierten Oligonukleotide
enthält, der
Summe der zwei individuellen Probenprofile an jedem Punkt an.
-
Diese
Daten verdeutlichen die Anwendbarkeit und Nutzbarkeit eines Modus
des Verfahrens und der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Das in einem einzelnen Teströhrchen
erhaltene Signal, das zwei verschiedene Oligonukleotide enthält, die
mit spezifischen AE-Derivaten, wie im vorliegenden Beispiel dargestellt
wird, markiert sind, setzt sich eindeutig aus zwei Komponenten zusammen,
eine steuert eine schnell reagierende, schnell zerfallende Spezies
(zum Beispiel das o-diBr-AE) bei und die andere eine Spezies, die
langsamer reagiert und zerfällt
(zum Beispiel die 1- und 3-Me-AE-Mischung). Durch das Entwerfen
von zwei Detektionszeiträumen
für die
Analyse, eine Früher
(zum Beispiel in den Intervallen 1–6; 0,04–0,24 Sekunden) für die Detektion
des Analyten, der mit der schnell reagierenden Spezies assoziiert
ist, und ein Später (zum
Beispiel für
die Intervalle 41–50;
1,64–2,0
Sekunden) für
die Detektion des Analyten, der mit der langsam reagierenden Spezies
assoziiert ist, ermöglichen
die Verfahren und Reagenzien der vorliegenden Erfindung die nahezu
gleichzeitige Detektion verschiedener Nukleinsäuresequenzen in einer einzelnen
Probe.
-
Die
aus diesem Experiment erhaltenen Rohdaten wurden weiterhin mittels
eines sich wiederholenden Datenanalyseverfahrens wie folgt behandelt.
Proben, die nur eine markierte Sonde enthielten, wurden als Standard
für die
Datenanalyse verwendet. Für
jeden Standard wurde das Verhältnis
zwischen der Summe der RLU-Werte, die in den Intervallen 1–10 erhalten
wurden, und die Summe der RLU-Werte, die in den Intervallen 41–50 erhalten
wurden, bestimmt (Σ RLU
41–50/Σ RLU 1–10); für o-diBr-AE
lag dieses Verhältnis
bei 0,00267 und für
1-Me-AE lag das Verhältnis
bei 0,645. Die Chemilumineszenzsignale, die in den Intervallen 41–50 (in RLU)
gemessen wurden, wurden zusammengerechnet und dann durch 0,645 geteilt,
das für
den 1- und 3-Me-Standard erhaltene Verhältnis. Die sich daraus ergebende
Figur zeigt die Menge an RLU, die in den Intervallen 1–10 durch
die 1- und 3-Me-AE-markierte
Sonde beigetragen werden. Diese Menge, subtrahiert von der Gesamt-RLU
in den Intervallen 1–10,
ergibt die Menge an RLU, die in diesen Intervallen durch o-diBr-AE beigetragen
wurden. Die zuletzt genannte Zahl, wenn man sie mit 0,00267 multipliziert
(das Verhältnis
für o-diBr-AE)
ergibt die RLU innerhalb der Intervalle 41–50, die durch die o-diBr-AE-markierte Sonde beigetragen wurden.
Wenn diese Zahl von der Gesamt-RLU in den Intervallen 41–50 abgezogen
wird, ergibt sich ein korrigierter Wert für die RLU, die durch 1-Me-AE
in diesem Intervall beigetragen wurden. Diese Zahl wurde verwendet,
um die oben beschriebene Berechnung zu wiederholen, bis der RLU-Beitrag
durch o-diBr-AE in den Intervallen 41–50 sich innerhalb der ausgewählten Zahlen
der wichtigen Figuren nicht veränderte.
Eine Illustration des Verfahrens, so wie es auf die Rohdaten der
Tabelle 5 angewendet wurde, wird weiter unten wiedergegeben.
-
-
Ein
Personalcomputer wurde programmiert, um diese Berechnungen durchzuführen. Die
Rohdaten wurden direkt vom Luminometer mittels der maschinellen
RS-232-Schnittstelle in den Computer eingespeist und die Daten verarbeitet,
so wie es weiter oben beschrieben worden ist. Die Intervalle, die
in der obigen Analyse verwendet wurden, können sich abhängig vom
ausgewählten
Markerreagenz unterscheiden und es ist nicht notwendig, dass die
spezifischen Intervalle, die weiter oben oder in den folgenden Beispielen
dargestellt wurden, verwendet werden. Darüber hinaus wird, während das
Datenanalyseverfahren, das in diesem Beispiel offenbart wurde, mittels
Daten durchgeführt
wurde, die in Experimenten erhalten wurden, die zwei chemilumineszierende
Verbindungen enthalten, dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein,
dass die gleichen Verfahren verwendet werden können, um Daten zu verarbeiten, die
von mehr als zwei solcher Verbindungen erhalten wurden, vorausgesetzt,
dass die Reaktionscharakteristika jeder Verbindung ausreichend unterschiedlich
von den anderen sind.
-
Beispiel 4: Modus 2: Sequenzielle
Reaktion bei verschiedenen pH-Werten
-
In
einem anderen Modus können
die Reagenzien und das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, um mehr als einen Analyten in einer Probe durch Initiieren
der Chemilumineszenzreaktion bei verschiedenen pH-Werten zu detektieren
und zu messen. Beim ersten pH kann die Chemilumineszenzreaktion initiiert
werden, zum Beispiel durch die Zugabe von Natriumperoxid und einer
Base in einem geeigneten Puffer, was dazu führt, dass ein oder mehrere
Markerreagenzien messbares Licht emittieren während ein oder mehrere zusätzliche
Markerreagenzien nicht in einem nennenswerten Ausmaß bei dem
pH reagieren werden. Die beim ersten pH emittierte Lichtmenge kann
in einem Luminometer gemessen werden. Zusätzlich kann das emittierte
Licht über
einen Zeitraum gemessen werden und der Zeitraum kann in Intervalle
aufgeteilt werden, die weiter oben für eine kinetische Analyse der
Reaktion genau beschrieben worden ist. Nach dem Messen bei einem
bestimmte pH kann der pH der Testlösung auf einen Wert eingestellt
werden, bei dem ein oder mehrere andere chemilumineszierende Markerreagenzien
reagieren können.
-
Während die
hierin vorgestellten Daten diesen Modus der Erfindung, der zwei
AE-Derivate verwendet, darstellen, wird dem Fachmann auf diesem
Gebiet im Lichte dieser Offenbarung klar sein, dass mehr als zwei pH-Werte
im Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können. Darüber hinaus wird im Lichte dieser
Offenbarung für
einen Fachmann auch klar sein, dass Aspekte der hierin beschriebenen
verschiedenen Modi in einem einzelnen Assaysystem kombiniert werden
können.
Zum Beispiel kann bei jedem pH-Wert des "Mehrfach"-Modus, der in diesem Beispiel beschrieben
wird, ein Satz von kinetisch unterschiedlichen Markern auf eine
dem vorherigen Beispiel entsprechende Art und Weise detektiert werden.
Ein solches System würde
daher die Detektion von drei oder mehr Analyten in dem gleichen
Probenröhrchen
erlauben. Andere nicht ausdrücklich
erwähnte
Kombinationen werden dem Fachmann auf diesem Gebiet ebenfalls deutlich
werden. Alle derartigen Kombinationen, egal ob ausdrücklich hierin
erwähnt
oder nicht, sollen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden
Erfindung liegen.
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Zwei
Oligonukleotide, jedes markiert mit einem AE-Derivat mit einem anderen
pH-Optimum für
die Chemilumineszenzreaktion, wurden jeweils einzeln in einer Lösung verdünnt, die
10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0) und 0,1 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat
enthält.
Das erste Oligonukleotid, das für
die Chlamydia trachomatis 16 S-rRNA spezifisch ist, wurde über einen
Linker-Arm an Standard-AE
gekoppelt. Das zweite Oligonukleotid, das für die Chlamydia trachomatis
23 S-rRNA spezifisch ist, wurde über
einen Linker Arm mit o-F-AE gekoppelt. Zehn Mikroliter (etwa 0,002
pmol) jedes Oligonukleotids wurden mit 10 μl des gleichen Verdünnungspuffers
in separaten Röhrchen
kombiniert; zusätzlich
wurden 10 μl
jedes markierten Oligonukleotids in einem einzelnen Röhrchen kombiniert.
Zu jedem Röhrchen
wurden 40 μl
0,4 N HCl, 60 μl
Wasser und 200 μl
einer Lösung,
die 1 mM HNO3 und 0,1 % H2O2 enthält,
gegeben. Die Röhrchen
wurden in einem LEADER® 50 Luminometer (Gen-Probe
Incorporated, San Diego, CA) angeordnet und die Chemilumineszenz
wurde mit der automatischen Injektion von 200 μl 0,24 M Borsäure (mit
NaOH auf den pH 12,9 eingestellt) gemessen. Der ungefähre pH der
Lösung
an diesem Punkt lag bei 12,1. Die Chemilumineszenz wurde für 8 Sekunden
gemessen, gefolgt von einer anderen automatischen Injektion von
200 μl 0,75
N NaOH bis zu einem ungefähren End-pH
von 13,0. Die sich daraus ergebende Chemilumineszenz wurde für 10 Sekunden
gemessen. Während der
Messung der Chemilumineszenz wurden Daten in 0,1 Sekundenintervallen
gesammelt und sofort in einen IBM-kompatiblen PC-Computer geladen. Die
Daten wurden dann als RLU gegen die Zeit (Intervallnummer) aufgetragen.
-
Die
Ergebnisse werden in 3 dargestellt. Diese Daten
zeigen, dass mehr als ein Chemilumineszenzmarkerreagenz, das mit
einem Oligonukleotid gekoppelt ist, als ein Mitglied eines Satzes
solcher Markerreagenzien, die auf Basis ihres optimalen pH für die Reaktion
ausgewählt
wurden, detektiert werden kann.
-
Beispiel 5: Gleichzeitige
Detektion von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren in einem
homogenen Assayformat
-
Das
Verfahren und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wurden
verwendet, um das Vorhandensein der Nukleinsäuren, die von Chlamydia trachomatis
(Ctr) und Neisseria gonorrhoeae (Ngo) abstammen, in einem einzelnen
Teströhrchen,
das mit bekannten Mengen der Zielnukleinsäuren versehen ist, zu detektieren.
In diesem Beispiel wurde die Bildung, Auswahl und Detektion von
markierten Analyt/Sondenkonjugaten nur in der flüssigen Phase durchgeführt.
-
Der
Einfachheit halber waren die Ctr- und Ngo-spezifischen Sonden die,
die im PACE® 2
Assay (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA), dass bei Gen-Probe
kommerziell erhältlich
ist, verwendet wurden. Im kommerziell erhältlichen Assay sind die Ctr-
und Ngo-Sonden jeweils mit Standard-AE (siehe 1)
markiert und werden getrennt untersucht. Im Gegensatz dazu wurden
im hierin beschriebenen Beispiel die kommerziell erhältlichen
Ctr-Sonden durch die identischen Sonden, die mit 1- und 3-Me-AE
markiert sind, ersetzt und die Standard Ngo-Sonden wurden durch die identischen
Sonden, die mit einer Mischung aus 1- und 3-Me-m-diF-AE markiert
sind, ersetzt. Darüber
hinaus wurden im kommerziell erhältlichen
PACE® 2
Assay die markierten Sonden zusammen in einer "Probenmischung" mit anderen nicht markierten Helfersonden,
die entworfen worden sind, um die Hybridisierungsrate und die Stabilisierung
der gebildeten Hybridnukleinsäure
zu verbessern, verwendet. Die Verwendung von Helfersonden wird weiter
oben und im U.S. Patent Nr. 5,030,557 beschrieben. Wie weiter oben
dargelegt, sind Helfersonden für
das Ausführen
der vorliegenden Erfindung nicht notwendig, auch wenn Helfersonden
in Verbindung mit der Verwendung von bestimmten markierten Hybridisierungssonden
notwendig sein können.
Wie ebenfalls weiter oben erwähnt,
hängt die
vorliegende Erfindung auch nicht von bestimmten Nukleotidsequenzen
des Nukleinsäureanalyten
oder der Hybridisierungsassaysonde ab; demnach sind die in diesen
Beispielen verwendeten spezifischen Oligonukleotidsonden kein wesentliches
Merkmal für
die vorliegende Erfindung. Die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen
können
mit irgendeinem Satz von zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten/Hybridisierungssondenpaaren,
die sich gegenseitig ausschließende
stabile doppelsträngige
Hybride bilden, verwendet werden.
-
Die
Proben wurden für
das Assay durch das Hinzufügen
verschiedener Mengen ribosomaler RNA-Ziele von Ctr und Ngo in einer
Lösung,
die 3 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 30 mM Natriumphosphatpuffer (pH
6,8), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA bis auf ein Endvolumen von 50 μl enthält, hergestellt.
Das Sondenreagenz wurde durch Kombinieren der 1-Me-AE-markierten
Ctr-Sonde mit der 1-Me-m-diF-AE-markierten Ngo-Sonde in einer Lösung, die
200 mM Lithiumsuccinat (pH 5,1), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat,
3 mM EDTA und 3 mM EGTA enthält,
hergestellt. Die Gesamtmenge der Sonden, die mit jedem der AE-Derivate markiert
waren, lag bei 0,2 pmol.
-
Jede
Hybridisierungsreaktionsmischung enthielt 50 μl der Ziel-Nukleinsäuren (oder
in Kontrollexperimenten, kein Ziel) und 50 μl des Sondenreagenzes. Jede
Reaktionsmischung wurde bei 55°C
für eine
Stunde inkubiert. Dreihundert Mikroliter 0,15 M Tetraborat (pH 8,5)
und 2 % (v/v) TRITON® X-100 wurden zu jeder
Probe zugegeben und die Proben für
20 Minuten bei 55°C
inkubiert. Die Chemilumineszenz jeder Probe wurde in einem LEADER® 50
Luminometer mit der automatischen Injektion von 200 μl einer Lösung, die
0,1 % H2O2 und 1
mM HNO3 enthält, nach einer 2 sekündigen Verzögerung gefolgt
von einer anderen Injektion von 1 N NaOH, 2 % (w/v) Zwittergent® 3-14(N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
gemessen; Zwittergent® ist eine registrierte
Marke von CalBiochem, La Jolla, CA). Die Chemilumineszenz jeder
Probe wurde für
2 Sekunden mittels des kinetischen Modus des Luminometers und in
Intervallen von 0,04 Sekunden beobachtet. Die Daten wurden direkt
vom Luminometer in einen Personalcomputer übertragen und mittels Rechenverfahren,
die denen im weiter oben beschriebenen Beispiel 3 ähneln, analysiert.
Die für
diese Berechnungen verwendeten Zeitintervalle waren die Intervalle
1–6 und
41–50.
Zwei Standards für
jeden unterschiedlichen Marker wurden gemittelt, genau wie zwei
Leerproben, die keine Sonde oder Ziel-Nukleinsäuren enthielten. Der in jedem
Zeitintervall erhaltene RLU-Wert für die gemittelten Leerwert-Standards wurde von
den RLU-Werten für das
entsprechende Intervall für
alle anderen Proben vor der Berechnung subtrahiert. Jede Probe wurde
zweimal wiederholt; die dargestellten Werte stellen das Mittel der
doppelt durchgeführten
Reaktionsmischungen dar. Die Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle
6 dargestellt.
-
-
Diese
Daten zeigen, dass wenigstens zwei Analyten (Ctr- und Ngo-ribosomale RNA in diesem Beispiel)
entweder allein oder in einer Probe zusammen mittels des Mehrfachanalytverfahrens
und der Reagenzien der vorliegenden Erfindung identifiziert werden
können.
-
Beispiel 6: Gleichzeitige
Detektion von Chlamydia trachomatis- und Neisseria gonorrhoeae-Nukleinsäuren in einem
gemischten homogenen/heterogenen Assayformat
-
Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde wiederum verwendet, um
das Vorhandensein von Ctr und Ngo in einem "reinen System" (d.h. es war keine klinische Probe
vorhanden) gleichzeitig zu detektieren; dieses Mal in einem homogenen/heterogenen
Assaysystem. Das für
dieses Beispiel verwendete Assay war das PACE® 2
Format (kommerziell erhältlich
von Gen-Probe Incorporated,
San Diego, CA), das, wie hierin beschrieben, modifiziert worden
ist. Die in diesem Assay verwendeten Sonden waren identisch mit
denen, die im Beispiel 5 verwendet wurden, und wurden in einer Sondenmischung
mit Helfersonden verwendet.
-
Für das Assay
wurden verschiedene Mengen entweder von der Ngo- oder Ctr-ribosomalen
RNA oder beides in jedem Röhrchen
kombiniert; die Mengen des Ziels variierten zwischen 0 und 12,5
fmol. Das Endvolumen jeder Ziel-Nukleinsäureverdünnung lag bei 100 μl; der Unterschied
im Volumen wurde mit einer Lösung aus
30 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 3 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1
mM EDTA und 1 mM EGTR ausgeglichen. Das Sondenreagenz wurde durch
Mischen der 1-Me-AE-Sondenmischung und der 1-Me-m-diF-AE-Sondenmischung
in gleichen Volumina hergestellt; wie im vorherigen Experiment enthielten
die Sondenreagenze auch Helfersonden. Die Sondenmischung enthielt
190 mM Lithiumsuccinat (pH 5,1), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat,
3 mM EDTA, 3 mM EGTA und die Sonden; einhundert Mikroliter davon
wurden zu den Ziel-Nukleinsäureverdünnungen
gegeben, um ein Endvolumen von 200 μl zu erzielen. Die Röhrchen wurden
geschüttelt,
um sie zu mischen, und für
90 Minuten bei 60°C
inkubiert. Die Röhrchen
wurden aus dem Wasserbad entfernt und es wurden 1 ml einer Lösung aus
190 mM Natriumtetraborat (pH 7,6), 6,89 % (w/v) TRITON® X-102
und 0,01 % (w/v) Gelantine, die 50 μl einer 1,25 % (w/v) Suspension
von BiomagTM4100 magnetischen Partikeln
(PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) in 0,02 % (w/v) Natriumazid
und 1 mM EDTA enthielt, zugegeben. Die Röhrchen wurden weiter für 10 Minuten
bei 60°C
inkubiert, und dann aus dem Wasserbad entfernt und der Halter wurde
sofort in einer Station zur magnetischen Abtrennung angeordnet und
für 5 Minuten
bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurde die ungebundene Sonde
von den mit magnetischen Kügelchen
gebundenen hybridisierten Sonde durch Dekantieren der Lösung abgetrennt.
Siehe Arnold, et al., Europäische
Veröffentlichungsnr.
EPO 281390, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden
Erfindung genießt.
Die Kügelchen
und die absorbierte hybridisierte Sonde wurden einmal in einer Lösung aus
20 mM Natriumtetraborat (pH 10,4), 0,1 % (w/v) Zwittergent® 3–14 gewaschen,
dann in 300 μl
5 % (v/v) TRITION® X-100 resuspendiert.
-
Jede
Probe wurde dann in einen LEADER® 50
Luminometer eingestellt. Die Chemilumineszenzreaktion wurde durch
die automatische Injektion von 200 μl einer Lösung, die 0,1 % (v/v) H2O2 und 1 mM HNO3 enthält,
nach einer 2 sekündigen
Verzögerung
gefolgt von einer anderen Injektion von 200 μl einer Lösung, die 0,7 N NaOH und 0,5
% (v/v) Zwittergent® 3–14 enthält, initiiert. Die Chemilumineszenz
jeder Probe wurde für 2
Sekunden mittels des kinetischen Modus des Luminometers und Intervallen
von 0,04 Sekunden überwacht. Die
Daten wurden direkt vom Luminometer in einen Arbeitsplatzrechner übertragen
und mittels Berechnungsverfahren, die denen im weiter oben beschriebenen
Beispiel 3 ähneln,
analysiert. Die für
diese Berechnungen verwendeten Zeitfenster stammen von den Intervallen
1–7 und
34–50.
Zwei Standards für
jeden unterschiedlichen Marker wurden gemittelt (unter Verwendung
von 5 fmol ribosomaler RNA für
die Ngo-Kontrolle und 1,5 fmol ribosomaler RNA für die Ctr-Kontrolle) sowie
zwei Leerwertproben, die keine Sonde oder Ziel-Nukleinsäuren enthielten.
Der RLU-Wert, der für
die gemittelten Leerwertstandards in jedem Zeitintervall erhalten
wurde, wurde von den RLU-Werten für alle anderen Proben für das entsprechende
Intervall vor der Berechnung substrahiert. Jede Probe wurde zweifach
durchgeführt;
die dargestellten Werte stellen das Mittel der doppelt vorhandenen
Reaktionsmischungen dar. Die Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle
7 dargestellt.
-
-
Diese
Daten zeigen, dass durch die Verwendung der Zusammensetzungen und
Verfahren der vorliegenden Erfindung mehr als ein Analyt (in diesem
Fall Ctr- und Ngo-ribosomale RNA) alleine oder in Kombination im
gleichen Probenröhrchen eindeutig
identifiziert werden können.
Wenn darüber
hinaus die Sonden, die die Markerreagenzien der vorliegenden Erfindung
enthalten, im gleichen Probenröhrchen
kombiniert werden, ist das gleiche Probenvolumen für die nahezu
gleichzeitige Identifikation von mehr als einem Analyten mittels der
vorliegenden Erfindung ausreichend. Dies erlaubt das Zurückhalten
irgendwelcher verbleibenden Proben für andere Zwecke (wie zum Beispiel
andere Assays), wodurch die Anzahl von Assays, die unter Verwendung von
Proben eines vorgegebenen Volumens durchgeführt werden können, erhöht wird.
-
Zusätzlich zeigen
die oben aufgelisteten Daten, dass ein Assay, das in Übereinstimmung
mit dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden ist, eine hohe Empfindlichkeit
aufweist, mit einer Empfindlichkeitsgrenze in diesem Experiment
von wenigstens 0,125 fmol für
Ngo und 0,035 fmol für
Ctr. Durch das Darstellen der Daten in diesem Beispiel beabsichtigt
der Anmelder jedoch nicht zu implizieren, dass dies die untere Grenze
der Empfindlichkeit ist, die bei irgendeinem Satz von experimentellen
Bedingungen erhältlich
ist.
-
Beispiel 7: Gleichzeitiges
Detektieren ribosomaler RNA von Chlamydia trachomatis und Neisseria
gonorrhoeae in einer klinischen Probe
-
Das
Verfahren und die Reagenzien der vorliegenden Erfindung wurden verwendet,
um das Vorhandensein ribosomaler RNA von Ctr und Ngo in einer klinischen
Probe gleichzeitig zu detektieren. Das Assayformat war das gleiche,
wie es im Beispiel 6 verwendet worden ist, jedoch mit den folgenden
Unterschieden.
-
Jede
Probe wurde durch Zugabe der gewünschten
Menge an ribosomaler RNA zu 100 μl
eines Pools endocervikaler Abstriche klinischer Proben hergestellt;
jeder Abstrich wurde ursprünglich
in einem Volumen von 1 ml des Gen-Probe PACE® 2
Transportmediums (erhältlich
als eine Komponente des STD Transportkits von Gen-Probe Incorporated,
San Diego, CA) suspendiert. Diese Proben sind zuvor auf Ctr und
Ngo negativ getestet worden. Hätten
die ursprünglichen
klinischen Proben Ctr- oder Ngo-Zellen enthalten, wären diese
Zellen lysiert worden und ihre Nukleinsäuren (einschließlich der
ribosomalen RNA) durch die Wirkung von Komponenten des Transportmediums
in Lösung
freigesetzt worden.
-
Die
Hybridisierung wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt, wurde jedoch auf 2,5 Stunden
verlängert. Nach
der Hybridisierung wurde die Chemilumineszenz, wie in Beispiel 6
beschrieben, gemessen, mit der Ausnahme bezüglich der folgenden Änderungen.
Eine Lösung
aus 0,5 N NaOH und 0,5 % Zwittergent® wurde
ersetzt durch 0,7 N NaOH und 0,5 % Zwittergent®; die
Ngo- und Ctr-ribosomalen RNA-Standards lagen bei 1,25 fmol bzw.
0,35 fmol; und die ausgewählten
Intervalle für
die Zeitfenster waren die Intervalle 1–5 und 41–50. Die Assayergebnisse werden
weiter unten in Tabelle 8 dargstellt.
-
-
Diese
Daten zeigen, dass die Fähigkeit
des Verfahrens und der Reagenzien der vorliegenden Erfindung die
Detektion und Quantifizierung von mehr als einem Analyten in einer
einzelnen Probe zu ermöglichen durch
Substanzen, die in einem Pool aus klinischen Proben vorhanden sind,
nicht beeinträchtigt
wird.
-
Beispiel 8: Detektion
der gag- und pol-Bereiche von HIV-DNA
-
Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um gleichzeitig
die gag- und pol-Bereiche des Humanen Immunodefizienzvirus (HIV)-Genoms
zu detektieren. Ein Vorteil des Mehrfachanalytdetektionsmerkmals
der vorliegenden Erfindung für
die Identifikation von HIV ist, dass die Detektion des Vorhandenseins
des zweiten Bereiches (entweder gag oder pol) des HIV-Genoms verwendet
werden kann, um das Vorhandensein des Virus in einem diagnostischen
Assay aufgrund der verringerten Wahrscheinlichkeit von zwei gleichzeitig
falsch positiven Assayindikationen im gleichen Assay zu bestätigen. Darüber hinaus
kann die Detektion von mehr als einer bestimmten Nukleotidsequenz
des gleichen Nukleinsäureanalyten
helfen, die Detektion eines Virus oder einer Zelle in Fällen in
denen eine Ziel-Nukleinsäure
sich geändert
hat oder mutiert ist, zu gewährleisten.
-
Im
vorliegenden Beispiel wurde ein Bereich des HIV-Genoms, das sowohl
die gag- als auch die pol-Bereiche enthält, als erstes, wie weiter
unten beschrieben, amplifiziert. Die gag- und pol-Nukleotidsequenzbereiche wurden
dann gleichzeitig mittels des Verfahrens und der Reagenzien der
vorliegenden Erfindung in einem Hybridisierungsschutzassay (HPA)-format
detektiert.
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Sonden,
die mit den gag- und pol-Bereichen des HIV-1-Genoms komplementär sind, wurden synthetisiert.
Die gag-spezifische
Sonde (SEQ ID NO: 11) wurde mit einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE
markiert und die pol-spezifische Sonde (SEQ ID NO: 5) wurde mit
o-diBr-AE markiert, wie ebenfalls weiter oben beschrieben wurde,
unter Verwendung eines Nicht-Nukleotid Linker-Arms, der als Teil
des Oligonukleotids während
der Synthese eingebaut wurde, um den Marker mit der Sonde zu verbinden.
Ein geklontes HIV-1-DNA-Fragment, das beide Ziel-Sequenzbereiche enthält, wurde in einem 100 μl Volumen
amplifiziert, wie es von Kacian, et al., PCT Veröffentlichungsnr. WO 91/01384,
die gemeinsame Eigentümerschaft
mit der vorliegenden Anmeldung genießt, beschrieben wurde. Die
Amplifikationsprimer, die zum Amplifizieren des pol-Bereiches verwendet
wurden, wiesen die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 1 bis 4 auf.
Sonden und Primer, die zum Amplifizieren des gag-Bereichs verwendet
wurden, wiesen die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 5 bis 10 auf.
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Nach
der Amplifikation der HIV-1-DNA wurden die Sonden mit den gag- und
pol-Ziel-Nukleinsäurebereichen
durch Zugabe von 100 μl
einer Lösung,
die 5,5 fmol der 1-Me-AE-markierten gag-Sonde und 16 fmol der o-diBr-AE-markierten
pol-Sonde in 0,2 M Lithiumsuccinat (pH 5,0), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat,
3 mM EDTA und 3 mM EGTA enthält,
zur Amlifikationsreaktionsmischung hybridisiert. Ein unmarkiertes
Helfer-Oligonukleotid der SEQ ID NO: 6 wurde ebenfalls verwendet,
um bei der Amplifikation des pol-Zielbereichs zu helfen. Die Reaktionsmischung
wurde dann für
30 Minuten bei 60°C
inkubiert. Die Hydrolyse der Acridiniumderivate an der unhybridisierten
Sonde wurde durch Zugabe von 300 μl
einer Lösung
aus 0,13 M Na2B4O7 (pH 9,3), 2 % (v/v) TRITON® X-100
und 13 mM Iodessigsäure
und Inkubieren der Mischung für
20 Minuten bei 60°C durchgeführt. Bei
diesem pH wird die Iodessigsäure
zur Reaktionsmischung gegeben, um die Bildung des Acridiniumesteradduktes,
die im Chemilumineszenzassay nicht reaktiv sind, zu verhindern.
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Die
Chemilumineszenz wurde in einem LEADER® 50
Luminometer gemessen. Jede Probe wurde im Luminometer angeordnet
und die Chemilumineszenzreaktion durch die automatische Injektion
von 200 μl
0,1 % (v/v) H2O2 in
1 mM HNO3, gefolgt von einer 2 sekündigen Verzögerung und
automatischen Injektion von 1,5 N NaOH, initiiert. Die Chemilumineszenz
wurde für
2 Sekunden unter Verwendung des Kinetikmodus des Luminometers und
Intervallen von 0,04 Sekunden gemessen. Die Daten wurden mittels
eines Arbeitsplatzrechners gesammelt und die Rohdaten wurden mittels
der in Beispiel 3 beschriebenen Berechnungsverfahren analysiert.
Die für
die Berechnungen verwendeten Zeitfenster entsprachen den Intervallen
1–10 und
41–50.
In diesem Fall wurden sowohl 2 Standards für jeden Marker (diese bestanden
aus gereinigten Nukleinsäuren,
die Nukleotidsequenz jedes Ziels enthielten; entweder gag allein oder
pol alleine) als auch 2 Negativkontrollen, die genauso behandelt
worden sind wie die anderen Proben, jedoch keine Ziel-Nukleinsäuren oder
Sonde enthielten, verwendet. Die Daten, die von Doppelstandardproben
erhalten wurden, wurden gemittelt und alle Proben wurden wie weiter
oben beschrieben um den Hintergrund korrigiert. Die Ergebnisse werden
weiter unten in Tabelle 9 dargestellt. In diesem Experiment ergibt
ein negatives Assayergebnis einen RLU-Wert von weniger als 10.000.
In allen Experimenten, in denen gag- und pol-Ziel-Nukleinsäuresequenzen
(mit Ausnahme der oben erwähnten
Kontrollen) verwendet wurden, waren die gag- und pol-Ziele einmal
in jedem Ziel-Nukleinsäuremolekül enthalten.
-
-
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Die
Daten zeigen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung das
Vorhandensein der Nukleinsäuren
mit Sequenzen, die den gag- und pol- Bereichen von HIV-1 entsprechen,
gleichzeitig detektiert werden kann. Die aufgelistete Anzahl von
Kopien der Matrizen-Nukleinsäuren
ist eine Durchschnittszahl; die Zahl der Input-Kopien der Matrize
sind offensichtlich ganzzahlig und kein Anteil. Tatsächlich weisen
die Daten darauf hin, dass einige Proben keine Kopien der Matrize
enthielten, wie man anhand der RLU-Werte unter 10.000 erkennen kann,
die sowohl in Reaktionsansätzen,
die 2,5 als auch denen die 1,25 Kopien der Matrize entsprechen,
auftreten. Die Empfindlichkeit dieses Assays, das die Nukleinsäureamplifikation
mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung
kombiniert, liegt bei etwa 1 bis 2 Kopien für jede Ziel-Nukleinsäuresequenz.
-
Beispiel 9: Detektion
der gag- und pol-Bereiche von HIV-DNA in einer Probe, die ein klinisches
Probenstück enthält.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um sowohl
die gag- als auch die pol-Bereiche des Humanen Immunodefizienz Virus
(HIV) in einem menschlichen Blutlysat zu detektieren. Gesamtblut,
das zuvor negativ auf HIV getestet wurde, wurde lysiert und die
weißen
Blutzellen wurden gesammelt, gewaschen und lysiert, wie es von Ryder,
in PCT Veröffentlichungsnr.
WO 93/25710, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden
Anmeldung genießt,
beschrieben worden ist. Fünfzig
Mikroliter des Leukozytenlysats wurden für jedes experimentelle Röhrchen verwendet.
Eine Plasmid-DNA, die die gag- und pol-Bereiche von HIV enthält (siehe
Beispiel 8 weiter oben) wurde zum Lysat hinzugegeben und die zugegebene
Nukleinsäure
wurde amplifiziert, hybridisiert und einer differenziellen Hydrolyse,
wie im Beispiel 8 beschrieben, unterzogen. Die Ergebnisse werden
weiter unten in Tabelle 10 dargestellt.
-
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Diese
Daten zeigen, dass die gag- und pol-Ziele gleichzeitig detektiert
werden können,
wenn die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart
eines Zelllysates aus mononukleären Zellen
aus dem Blut amplifiziert wird. In einem solchen Detektionssystem
ist das Mehrfachanalytassay in der Lage weniger als 2,5 Kopien von
mehr als einer unterschiedlichen Ziel-Nukleinsäure, die eine vorgegebene Nukleinsäuresequenz
trägt,
zu detektieren.
-
Beispiel 10: Polymerasekettenreaktion
(PCR)
-
Die
PCR ist eine Nukleinsäureamplifikationstechnik,
die vom Fachmann auf diesem Gebiet regelmäßig verwendet wird und gut
bekannt ist (siehe z.B., American Society for Microbiology, Diagnostic
Molecular Microbiology: Principles and Applications 56–70 (1993))
und sie stellt eine patentierte Technologie dar, die in Besitz ist
und lizensiert wird durch Hoffman-LaRoche, Inc., Nutley, NJ.
-
Ein
allgemeines Verfahren zur PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren wird
von Sambrook et al., siehe oben auf den Seiten 14.18, gelehrt. In
dem so bereitgestellten Verfahren werden die folgenden Bestandteile
in einem sterilen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Reaktion gemischt: 30 μl steriles
Wasser, 10 μl
eines 10X Amplifikationspuffers (10X Amplifikationspuffer = 500
mM KCl, 100 mM TRIS-Cl (pH 8,3), 15 mM MgCl und 0,1 % (w/v) Gelantine),
1,25 mM von jedem dNTP, 100 pmol von jedem Primer, und bis zu 2 μg Matrizen-DNA
und Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 μl. Die Reaktionsmischung wird
für 5 Minuten
auf 94°C
erhitzt. 5 μl
einer 5 Einheiten/μl
Zubereitung der Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk,
CT) werden zur Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung
wird dann mit 100 μl
leichtem Mineralöl
versetzt und die Reaktionsmischung für 5 Minuten bei 94°C inkubiert,
um über
Wasserstoffbrücken gebundene
Nukleinsäuren
zu denaturieren, dann wird sie für
2 Minuten bei 50°C
inkubiert, um das Anbinden der Primer an die einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäuren zu
ermöglichen,
und dann 3 Minuten bei 72°C,
um die Primerverlängerung
zu ermöglichen.
Die Reaktionsmischung wird dann sequenziell für eine Minute bei 94°C, 2 Minuten
bei 50°C
und 3 Minuten bei 72°C
in dieser Reihenfolge über
20 Zyklen inkubiert. Die Probe wird für 10 Minuten bei 72°C im letzten
Schritt des letzten Zyklus inkubiert, und dann bei –20°C für die Verwendung gelagert.
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Beispiel 11: Detektion
der gag- und pol-Bereiche der HIV-DNA nach der PCR-Amplifikation
-
Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um das Vorhandensein
sowohl der gag- als auch der pol-Bereiche der HIV-DNA gleichzeitig
zu detektieren. In diesem Experiment wurde die virale DNA mittels
der Polymerasekettenreaktion (PCR) vor der Detektion amplifiziert.
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Die
verwendeten Sonden waren die gleichen wie die, die im Beispiel 8
verwendet wurden. Die HIV-1-DNA wurde mittels PCR amplifiziert;
die Primerpaare, die zum Amplifizieren des pol-Bereichs durch PCR verwendet wurden,
wiesen Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 2 und 4 auf, und die Primer,
die zum Amplifizieren des gag-Bereichs verwendet wurden, wiesen
Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 7 und 10 auf.
-
Nach
der Amplifikation wurde die Nukleinsäurehybridisierung durch Mischen
von 20 μl
der PCR-Reaktionsmischung
mit 80 μl
Wasser und anschließender
Zugabe von 100 μl
der Sondenmischung, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die
Sonden- und Ziel-Nukleinsäuren
wurden zusammen für
30 Minuten bei 60°C
inkubiert. Die differenzielle Hydrolyse, die Messung der Chemilumineszenz
und die Berechnung der Ergebnisse wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben,
durchgeführt.
Die Assayergebnisse werden weiter unten in Tabelle 11 dargestellt.
-
-
Diese
Daten zeigen, dass das Mehrfachanalytassayverfahren der vorliegenden
Erfindung das Vorhandensein verschiedener Nukleinsäuremoleküle, die
Sequenzen aufweisen, die den gag- und
pol- Bereichen von HIV-1 entsprechen, gleichzeitig detektieren kann,
wenn die HIV-1-Sequenzen mittels der Polymerasekettenreaktion amplifiziert
worden sind.
-
Beispiel 12: Gleichzeitiges
Detektieren von mehr als zwei Analyten in einer einzelnen Testprobe
-
Als
ein Beispiel für
die Ausführbarkeit
der Detektion von mehr als zwei Analyten in einer einzelnen Probe
sind die folgenden Experimente durchgeführt worden.
-
Die
folgenden AE-Derivate wurden individuell an getrennte Oligonukleotidsonden
gekoppelt, wie weiter oben offenbart: diBr-AE; 2,7-diME-AE; o-MeO-(cinnamyl)-AE,
o-Me-AE, und o-diMe-AE. Etwa 0,003 pmol jedes angegebenen gekoppelten
Chemilumineszenzmarkers in einem Volumen von 1,5 μl pro Marker
wurden zu einem Röhrchen
gegeben, wie es weiter unten in Tabelle 12 angegeben wird, dann
wurden 200 μl
einer Lösung
zugegeben, die 0,4 N HCl und 0,1 % H2O2 enthielt. Jedes Röhrchen wurde in einen LEADER® 50
Luminometer eingesetzt, eine automatische Injektion von 1 N NaOH
wurde zugesetzt und das sich daraus ergebende emittierte Licht über einen
Zeitraum von 10 Sekunden in Intervallen von 0,1 Sekunden gemessen.
-
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Diagramme,
die die sich ergebenden Lichtemissionsprofile, die aus diesen Experimenten
erhalten worden sind, darstellen, werden in 4 dargestellt.
Die Einheiten der X-Achse werden in Intervallnummern angegeben und
die Einheiten der Y-Achse
werden in RLU angegeben; die Emissionsprofile werden in einem einzelnen Überlagerungsdiagramm
dargestellt. Dieses Diagramm zeigt deutlich, dass sich der Zerfall
jeder reagierenden Chemilumineszenzverbindung in den Proben von
jeder anderen reagierenden chemilumineszierenden Verbindung hinreichend
unterscheiden lässt
und dass jede Verbindung von den anderen unterschieden werden kann.
Zum Beispiel erreicht die Lichtemission im Röhrchen 1 (o-diBr-AE und 2,7-diME-AE)
die Grundlinie etwa beim Intervall 50 (5,0 Sekunden). Demnach kann
bei dem Licht, das in den Intervallen 46 – 100 emittiert worden ist,
davon ausgegangen werden, dass es die Summe des durch die Röhrchen 2,
3 und 4 emittierten ist. (Röhrchen
1 enthielt sowohl o-diBr-AE als auch 2,7-diME-AE; der Fachmann wird
erkennen, dass o-diBr-AE deutlich von den anderen AE-Derivaten, die in
diesem Experiment verwendet wurden, unterschieden werden kann und
von 2,7-diMe-AE insbesondere in einer Mischung, die alle diese Verbindungen
enthielt, da seine Lichtemission die Grundlinie etwa beim Intervall
10 erreicht). Ebenso erreicht das Licht, das durch die chemilumineszierenden
Verbindungen, die in Röhrchen
2 enthalten sind (o-diBr-AE, 2,7-diME-AE und o-MeO-(cinnamyl)-AE),
die Grundlinie etwa beim Intervall 80 (8,0 Sekunden); bei dem Licht,
das in den Intervallen 69 bis 100 emittiert worden ist, kann davon
ausgegangen werden, dass es die Summe des Lichtes ist, das durch
die chemilumineszierenden Verbindungen, die in den Röhrchen 3
und 4 enthalten sind, emittiert wird. Letztendlich erreicht das
Licht, das durch die Verbindungen im Röhrchen 3 (o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE
und o-Me-AE) emittiert worden ist, die Grundlinien an einem Punkt
nach dem Intervall 100. Auch wenn es in der Figur nicht dargestellt
wird, werden zu diesem letztgenannten Zeitpunkt die Komponenten
aus Röhrchen
4 immer noch messbares Licht emittieren.
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Daher
kann man durch Auswählen
der Zeiträume,
während
derer das durch die Verbindungen in jedem Röhrchen emittierte Licht gemessen
wird, zwischen dem Licht unterscheiden, das durch jede Verbindung mittels
eines sich ständig
wiederholenden Mittelungsverfahren, ähnlich dem in Beispiel 3 weiter
oben verwendeten für
die Unterscheidung zweier verschiedener chemilumineszierender Marker,
emittiert wird. Unter Verwendung der Offenbarung des vorliegenden
Beispiels als Richtlinie würde
der Fachmann vernünftigerweise erwarten,
dass o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE,
die an Oligonukleotidsonden gekoppelt sind, unter diesen Reaktionsbedingungen
unterschieden werden können.
Darüber
hinaus würde
der Fachmann vernünftigerweise
auch erwarten, dass diese Fähigkeit
nicht beeinträchtigt
würde,
wenn die Sonden mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert sind.
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Beispiel 13: Evaluieren
von zusätzlichen
chemilumineszierenden Reagenzien für die Verwendung in einem Mehrfachanalytassay
-
Die
Evaluierung der folgenden sondengekoppelten, chemilumineszierenden
Reagenzien wurde, wie im vorherigen Beispiel beschrieben, durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass das emittierte Licht für insgesamt 10 Sekunden in
Zeitintervallen von 0,1 Sekunden gemessen wurde und dass jedes chemilumineszierende
Reagenz eher getrennt evaluiert wurde als in einer Mischung wie
in Beispiel 12. 5 zeigt ein Überlagerungsdiagramm
der getrennt untersuchten Lichtemissionen von 1) einer Kombination
aus o-diBr-AE und einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE, 2) genauso
wie 1) plus ortho-AE, 3) genauso wie 2) plus o-Me-AE, und 4) genauso
wie 3) plus o-diMe-AE. Wie anhand des Diagramms zu sehen ist, reagiert
die o-diBr-AE/1- und 3-Me-AE-Mischung schnell und emittiert Licht
etwa nach dem Intervall 40, wobei zu diesem Zeitpunkt die anderen
AE-Derivate immer noch Licht emittieren. Die ortho-AE emittieren
wenig Licht nach etwa dem Intervall 80. Auch wenn diese Figur nicht
die Grundlinienauflösung
des o-Me-AE-Derivates zeigt, haben zusätzliche Experimente bestätigt, dass
der Lichtemissionszerfall dieser Derivate gleich bleibend und schneller
voranschreitet als die Reaktion des verbleibenden AE-Derivates o-diMe-AE.
Die Extrapolation der Geraden für
diese letztgenannten zwei Verbindungen zeigt, dass die kinetischen
Profile dieser Derivate zu späteren
Zeitintervallen als den in dieser Figur gezeigten, unterscheidbar
wären.
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Obwohl
die gekoppelten o-diBr-AE und 1- und 3-Me-AE-Marker in diesem Experiment
kombiniert wurden, ist bereits gezeigt worden, dass o-diBr-AE und
eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE auf der Basis ihrer charakteristischen
Reaktionskinetiken (siehe z.B. Beispiel 3) unterschieden werden
können.
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Diese
Daten zeigen, dass bei Verwendung des gleichen, sich ständig wiederholenden
Mittelungsverfahrens, das in Beispiel 3 weiter oben zum Unterscheiden
zweier chemilumineszierender Marker verwendet wurde, die Signale
für jedes
Verbindungsmitglied in diesem Satz von gekoppelten chemilumineszierenden Markern
in einer einzelnen Probe unterschieden werden können, wenn eine Licht emittierende
Reaktion, die alle Verbindungsmitglieder einschließt, gleichzeitig
ausgelöst
wird und das emittierte Licht über
einen geeigneten Zeitraum detektiert wird.
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Beispiel 14: Evaluierung
von sieben chemilumineszierenden Markern für die gleichzeitige Verwendung
in einem Mehrfachanalytassay
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Die
Reaktionskinetiken von sieben verschiedenen chemilumineszierenden
Markern (o-diBr-AE, 2,7-diMe, eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE,
o-Linker-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE) wurden durch
getrenntes Messen des Lichts, das dem Auslösen der Chemilumineszenzreaktion
folgt, evaluiert. Jeder chemilumineszierende Marker war mit einem
anderen Oligonukleotid gekoppelt. Die experimentellen Bedingungen
waren die gleichen wie im Beispiel 12, mit den hierin beschriebenen
Ausnahmen. Das emittierte Licht wurde über eine Gesamtzeit von sieben
Sekunden in 0,1 Sekundenintervallen gemessen, und detektiert und
mittels eines Luminometers gemessen.
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6 zeigt
die sich ergebenden Lichtemissionscharakteristika dieser Verbindungen
als eine computererzeugte einzelne Darstellung, die die überlagerten
einzelnen Diagramme für
jede chemilumineszierende Verbindung umfasst. Wie diese Figur eindeutig
zeigt, ist der Zerfall des emittierten Lichts durch jede reagierende
Verbindung ausreichend verschieden und deutlich von der jeder anderen
chemilumineszierenden Verbindung; jede kann getrennt detektiert
werden und in einer einzelnen Testprobe gemessen werden, wenn die
Reaktion gleichzeitig initiiert wird. Der Fachmann wird im Lichte
der vorliegenden Offenbarung erkennen, dass, obwohl dieses Beispiel
Daten darstellt, die getrennt für
jedes Verbindungsmitglied gesammelt wurden, sich die Reaktionskinetiken
und der Zerfall des emittierten Lichts nicht wesentlich unterscheiden
würden,
wenn diese Verbindungen in einer einzelnen Probe kombiniert würden. Demnach
würde der
Fachmann feststellen, dass das vorliegende Beispiel einen Satz von
sieben chemilumineszierenden Reagenzien bereitstellt, die gleichzeitig
in einem einzelnen Assay für
die Detektion von sieben Nukleinsäureanalyten in Übereinstimmung
mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können.
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Beispiel 15: Evaluation
von chemilumineszierenden Reagenzien für Mehrfachmodus und Mehrfachanalytassaysystem
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Die
folgenden chemilumineszierenden Reagenzien wurden für die Verwendung
in einem vier Analyten-, zwei pHs-Assaysystem evaluiert: o-diBr-AE,
o-F-AE, Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE. Wie im vorherigen Beispiel wurde
jedes chemilumineszierende Reagenz mit einem anderen Oligonukleotid
gekoppelt. Die experimentellen Bedingungen waren die gleichen wie
im Beispiel 4, mit der Ausnahme, dass den Oligonukleotiden 74 μl 0,1 N HCl
+ 26 μl
H2O vor der Zugabe von H2O2 zugegeben wurden. Jedes chemilumineszierende
Reagenz wurde getrennt evaluiert.
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7 zeigt
die Ergebnisse dieses Experiments in einem computergenerierten einzelnen
Diagramm zusammengefasst, wobei die für jede Chemilumineszenzreaktion
erhaltenen Daten zur besseren Darstellung überlagert wurden. Wie man sehen
kann, nehmen o-diBr-AE und o-F-AE an einer Chemilumineszenzreaktion beim
ersten pH teil. Darüber
hinaus sind diese zwei Reagenzien eindeutig voneinander unterscheidbar,
wobei das Licht, das durch o-diBr-AE emittiert wird, etwa beim Intervall
25 bis auf die Grundlinie zerfallen ist. Das Licht, das zwischen
den Intervallen 25 und 75 emittiert wird, repräsentiert den Beitrag des o-F-AE-Reagenzes. Man
kann auch sehen, dass Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE relativ
resistent gegenüber
Reaktionen bei diesem pH sind, wobei nur eine kleine Lichtmenge
durch jede Verbindung zwischen den Intervall 0 und etwa 85 emittiert
wird.
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Der
pH der Reaktionsmischungen wurde zu einem Zeitpunkt, der etwa dem
Intervall 85 entspricht, auf 13 eingestellt. Wie man sehen kann,
ermöglicht
diese pH-Veränderung
es dem bisher noch nicht reagierten Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE
Licht zu einem Zeitpunkt zu emittieren, zu dem nahezu alle der o-diBr- und
o-F-AE-Derivate beim vorherigen pH reagiert hatten. Die zwei Reagenzien,
die beim neuen pH-Wert reagieren, können auf Grundlage der Zeit,
die für
jede Verbindung bis zur vollständigen
Reaktion erforderlich ist, eindeutig unterschieden werden; Standard-AE
hat beim Intervall 120 fast vollständig reagiert, während o-MeO(cinnamyl)-AE
zwischen den Intervallen 120 und etwa 175 immer noch Licht emittiert.
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Dieses
Beispiel zeigt die Vielseitigkeit der Zusammensetzungen und Verfahren
der vorliegenden Erfindung. Wie hierin dargestellt, kann mehr als
ein Modus der vorliegenden Erfindung kombiniert werden, um die Detektion
von zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten
zu ermöglichen.
Dem Fachmann auf dem Gebiet wird deutlich werden, dass, obwohl die
hierin dargestellten Daten von Verbindungen gesammelt wurden, die
in separaten Reaktionsmischungen evaluiert wurden, man von diesen
Verbindungen vernünftigerweise
erwarten kann, dass sie im Wesentlichen ähnliche Reaktionscharakteristika
aufweisen, wenn sie in einer einzelnen Reaktionsmischung miteinander
kombiniert werden; siehe z.B., Beispiel 16. Solch eine Person würde auch
verstehen, dass die Reaktionscharakteristika dieser Verbindungen
nicht grundlegend verändert
würden,
wenn das Oligonukleotid, an das sie gekoppelt sind, mit einem komplementären Nukleinsäurestrang
hybdridisiert ist.
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Beispiel 16: Korrelation
zwischen vorher gesagtem und tatsächlichen Reaktionscharakteristika
von kombinierten chemilumineszierenden Reagenzien
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Um
zu demonstrieren, dass die Reaktionscharakteristika der bevorzugten
Acridiniumesterderivate, die in den vorherigen Beispielen exemplarisch
dargestellt worden sind, durch eine computergenerierte überlagerte Darstellung,
die von individuell untersuchten chemilumineszierenden Reagenzien
erhalten wurde, vorhergesagt worden sind, wurden die folgenden Experimente
durchgeführt.
Individuelle Reaktionsmischungen wurden gemäß dem Protokoll des Beispiels
15 hergestellt. Jedes Röhrchen
enthielt einen der folgenden Acridiniumester: o-diBr-AE, Standard-AE,
und o-MeO(cinnamyl)-AE. Zusätzlich
wurden individuelle Röhrchen
hergestellt, die die gleichen Mengen jeder Verbindung kombiniert
in einem einzelnen Röhrchen,
wie folgt, verwendeten: o-diBr und o-F-AE, Standard-AE und o-MeO-AE, und o-diBr-AE,
o-F-AE, Standard-AE, und o-MeO-AE. Alle chemilumineszierenden Reagenzien
wurden mit separaten Oligonukleotiden gekoppelt, wie in den vorherigen Beispielen.
Die Reaktion wurde wie in Beispiel 15 ausgelöst und gemessen. Die Ergebnisse
werden in der 8(A–I) dargestellt.
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8A zeigt ein computergeneriertes überlagertes
Diagramm des Lichts, das durch o-diBr-AE und o-F-AE, das separat
untersucht worden ist, emittiert wurde. 8B zeigt
ein computergeneriertes Diagramm des kombinierten Lichts, das durch
beide Reagenzien emittiert wurde; dieses Diagramm ist die Summe
der individuellen Diagramme aus 8A und
repräsentiert
eine Vorhersage der Reaktionscharakteristika einer einzelnen Reaktionsmischung,
die beide Reagenzien enthält. 8C zeigt die tatsächlichen Reaktionscharakteristika
einer Mischung dieser zwei Verbindungen ein einem einzelnen Röhrchen.
Diese Daten zeigen eindeutig, dass nicht nur der Zerfall der Lichtemission
der gleiche ist wie für 8B (vorhergesagte Kurve) und 8C (tatsächliche
Kurve), sondern das auch die kinetischen kurven im Wesentlichen
identisch sind.
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8D zeigt vergleichsweise ein computergeneriertes überlagertes
Diagramm des Lichts, das durch Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE,
das separat untersucht worden ist, emittiert wurde. 8E stellt die computergenerierte Summierung dieser überlagerten
Diagramme dar und 8F zeigt das tatsächliche
Licht, das durch eine Mischung dieser zwei Verbindungen nach dem
Initiieren einer Chemilumineszenzreaktion emittiert wurde. Ein Vergleich
zwischen den Figuren E und F zeigt, dass die Reaktionscharakteristika
einer Mischung aus Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE durch Hinzufügen der
Kurven, die von den zwei individuell untersuchten AE-Derivaten erhalten
wurden, korrekt vorher gesagt wurden.
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Letztlich
zeigt 8G überlagerte Diagramme des Lichts,
das von allen vier dieser individuell untersuchten Acridiniumesterderivate
emittiert wurde. 8H ist eine computergenerierte
Summierung dieser Darstellungen aus 8G,
und 8I zeigt die Lichtemissionscharakteristika
einer Mischung von allen vier dieser Verbindungen über die
Zeit. Daher zeigt 8H die vorhergesagten Lichtemissionscharakteristika
der vier Verbindungen, und 8I die
tatsächlichen
Ergebnisse. Wiederum zeigt sich eine nahezu exakte Korrelation zwischen
dem "vorhergesagten" Diagramm der 8H und dem "tatsächlichen" Diagramm der 8I.
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Dieses
Experiment verdeutlicht, dass die charakteristischen Reaktionskinetiken
jedes AE-Markers nicht signifikant unterschiedlich sind, wenn sie
mit anderen AE-Markern
in einer einzelnen Reaktionsmischung gemischt werden. Demnach sind
die AE-Marker, die für
die Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung offenbart werden, nachweislich in einem Mehrfachanalytassaysystem
geeignet.
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Beispiel 17: Modus Drei:
Mehrere Wellenlängen,
gleichzeitiges Auslösen
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In
einer zusätzlichen
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
mehrere Analyten gleichzeitig in einer einzelnen Probe durch Verwendung
verschiedener Oligonukleotidsonden, die mit einem anderen Chemilumineszenzmarker
markiert sind, der Licht bei einer anderen Wellenlänge als
jeder andere Marker emittiert, detektiert werden.
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Als
Beispiel für
diesen Modus der Erfindung könnte
das Assay im Wesentlichen wie in Beispiel 6 mit den folgenden Modifikationen
durchgeführt
werden. Nach der Hybridisierung wird jedem Röhrchen 1 ml einer Lösung aus
60 mM Natriumtetraborat (pH 8,9), 6,89 % (v/v) TRITON® X-102
und 0,1 % (w/v) Gelatine, die 50 μl
einer 1,25 % (w/v) Suspension von BIOMAGTM 4100
magnetischen Partikeln in 0,02 % (w/v) Natriumazid und 1 mM EDTA
enthält,
zugegeben. Die Inkubations- und
Waschschritte entsprechen denen im Beispiel 6.
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Ein
Luminometer ist mit 4 Fotovervielfacherröhrchen (PMT's) ausgestattet, einer überwacht
das emittierte Licht bei der Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis
700 nm, einer hat einen 375 bis 415 nm Sperrfilter, einer hat einen
400 nm bis 435 nm Sperrfilter und einer hat einen 500 nm bis 575
nm Sperrfilter. Die Standards für
jeden Marker werden in den Luminometer eingebracht, zur Lichtemission
angeregt und das emittierte Licht durch jeden PMT überwacht.
Die Verhältnisse
der Chemilumineszenz in jedem Wellenlängenfenster werden für jeden
Marker, wie im Berechnungsverfahren aus Beispiel 3 illustriert,
bestimmt. 9A und 9B zeigen das
Chemilumineszenzspektrum von 2,7-di-Me-AE und Standard-AE; die schattierten
Abschnitte dieses Spektrums repräsentieren
die Wellenlängenfenster,
auf die oben Bezug genommen wird. 9C ist
eine computergenerierte Überlagerung
des Spektrums von 9A und 9B.
Wie man sehen kann, unterscheidet sich die Maximalwellenlängenemission
für jeden
Marker und jeder Marker kann in einer Mischung der zwei voneinander
unterschieden werden. 9D ist eine computergenerierte
Summierung der zwei individuellen Wellenlängenemissionsprofile.
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Nach
Bestimmen der Standardverhältnisse
der Wellenlängenemission
für die
zu verwendenden spezifischen chemilumineszierenden Marker wird jede
experimentelle Probe in den Luminometer eingebracht, eine Licht
emittierende Reaktion wird ausgelöst und das sich daraus ergebende
emittierte Licht wird auf exakt die gleiche Weise wie für die Standards überwacht.
Die Ergebnisse können
dann mittels des sich ständig
wiederholenden (reiterativen) Berechnungsverfahrens bestimmt werden.
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