DE69535327T2

DE69535327T2 - Monocyten protein rezeptoren aus säugern, mit chemoattraktion auslösender wirkung

Info

Publication number: DE69535327T2
Application number: DE69535327T
Authority: DE
Inventors: Israel Lafayette CHARO; Shaun Tiburon COUGHLIN
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-11
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2015-01-12
Also published as: EP0740701A4; JP3532570B2; US6132987A; US7105641B2; AU1679395A; US6730301B1; ATE347594T1; EP0740701B1; EP0740701A1; DE69535327D1; US20040219644A1; US20090123938A1; US5707815A; US7803560B2; US20040223968A1; WO1995019436A1; JPH09508264A

Description

Diese Erfindung betrifft neue Cytokin-Rezeptoren, welche die Chemotaxis und Aktivierung von Monocyten vermitteln, die DNA-Sequenzen, welche die Rezeptoren codieren, und Verfahren zum Erhalt der Rezeptoren und zur Herstellung dieser durch rekombinante gentechnologische Techniken. Die neuen Rezeptoren scheinen vermittels eines alternativen Spleißens der DNA-Sequenzen zu entstehen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine zunehmende Familie von regulatorischen Proteinen, welche Signale zwischen Zellen des Immunsystems liefern, ist identifiziert worden. Als Cytokine bezeichnet, hat man bei diesen Proteinen herausgefunden, dass sie das Wachstum und die Entwicklung und Bioaktivitäten von Zellen des hämatopoetischen und Immunsystems kontrollieren bzw. steuern. Cytokine zeigen eien großen Bereich von biologischen Aktivitäten mit Zielzellen aus Knochenmark, peripherem Blut, fötaler Leber und anderen lymphoiden oder hämatopoetischen Organen. Beispielhafte Vertreter der Familie schließen die Kolonie-stimulierenden Faktoren (GM-CSF, M-CSF, G-CSF, Interleukiu-3), die Interleukine (IL-1, IL-2, IL-11), die Interferone (alpha, beta und gamma), die Tumor-Nekrose-Faktoren (alpha und beta) und Erythropoietin ein.
Innerhalb dieser Familie von Proteinen wurde eine hervorstrebende Gruppe von chemotaktischen Cytokinen, die auch als Chemokine oder Intercrine bezeichnet werden, identifiziert. Diese Chemokine sind basische, Heparin-bindende Proteine, welche entzündungsfördernde und instandsetzende Aktivitäten besitzen. Sie werden von anderen Cytokinen mit entzündungsfördernden und instandsetzenden Aktivitäten (wie Il-1 und Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor) durch ihre charakteristischen konservierten einzelnen offenen Leserahmen, typischen Signalsequenzen in der N-terminalen Region, AT-reichen Sequenzen in ihren C-terminalen nicht-translatierten Regionen und ihre schnell induzierbare mRNA-Expression unterschieden; siehe z. B. Wolpe, FASEB J. 3:2565-73(1989) und Oppenheim, Ann. Rev. Immunol. 9:617-48(1991). Typischerweise liegen die Chemokine in der Molekularmasse zwischen 8–10 kD; beim Menschen sind sie die Produkte von separaten Genen, die auf den Chromosomen 4 und 17 clusterartig vorliegen. Alle Chemokine besitzen vier Cysteinreste, welche zwei Disulfidbrücken bilden.
Zwei Unterfamilien von Chemokinen wurden auf der Grundlage der chromosomalen Lage und der Anordnung der Cysteinreste ausgemacht. Beim Menschen befinden sich die Gene der Mitglieder der α- oder C-X-C-Unterfamilie auf dem humanen Chromosom 4. In dieser Unterfamilie werden die ersten beiden Cysteine durch eine Aminosäure getrennt. Die Mitglieder dieser Unterfamilie, die humanen Proteine IL-8 (Interleukin-8), beta TG (beta-Thromboglobulin), PF-4 (Blutplättchenfaktor 4), IP-10, GRO (wachstumsstimulierender Faktor, auch bekannt als MGSF. Melanomwachstums-stimulierender Faktor) und murines MIP-2 (Makrophagen-inhibierendes Protein-2) weisen, neben dem Vorhandensein der C-X-C-Anordnung ihrer ersten beiden Cysteinreste, eine Homologie ihrer Aminosäuresequenzen im Bereich von 30–50% auf.
In der Beta-Unterfamilie befinden sich die ersten beiden Cysteinreste benachbart nebeneinander, eine C-C-Anordnung. Die humanen Gene, welche die Proteine der β-Unterfamilie kodieren, befinden sich auf Chromosom 17 (ihre Gegenstücke bei der Maus sind auf dem Mauschromosom 11, welches das Gegenstück des Chromosoms 17 beim Menschen ist, geclustert). Die Homologie der beta-Unterfamilie reicht innerhalb der Spezies von 28–45%, zwischen den Spezies von 25–55%. Exemplarische Mitglieder schließen die humanen Proteine MCP-1 (Monocyten-Chemoattraktives-Protein-1), LD-78α und β, ACT-2 und RANTES sowie die murinen Proteine JE-Faktor (das murine Homolog zu MCP-1), MIP-1α und β (Makrophagen-inhibierendes Protein-1) und TCA-3 ein. Humanes MCP-1 und der murine JE-Faktor üben mehrere Effekte speziell auf Monocyten aus. Beide Proteine sind starke Chemolockstoffe für humane Monocyten in vitro und können ein Ansteigen beim cytosolischen Calcium und einen respiratorischen Ausbruch in Monocyten hervorrufen. Es wurde berichtet, dass MCP-1 Monocyten-vermittelte tumorstatische Aktivität aktiviert sowie tumorizide Aktivität induziert; siehe z. B. Rollins, Mol. and Cell. Biol. 11: 3125-31(1991) und Walter, Int. J. Cancer 49: 431-35 (1991). MCP-1 wurde als ein wichtiger Faktor bei der Vermittlung der monocytischen Infiltration bei entzündlichen Gewebeprozessen wie rheumatoider Arthritis und Alveolitis in Zusammenhang gebracht; siehe z. B. Koch, J. Clin. Invest. 90:772-79(1992) und Jones, J. Immunol. 149:2147-54(1992). Der Faktor könnte auch eine fundamentale Rolle bei der Rekrutierung von Monocyten-Makrophagen bei der Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen spielen; siehe z. B. Nelken, J. Clin. Invest. 88:1121-27(1991), Yla-Herttuala, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:5252-56(1991) und Cushing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5134-38(1990).
Viele dieser Chemokine wurden molekular geklont, heterolog exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Von einigen wurden die Rezeptoren geklont. Zwei stark homologe Rezeptoren für das C-X-C-Chemokin IL-8 wurden geklont, und es konnte ihre Zugehörigkeit zur Überfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren, die sieben transmembran-überspannende Domänen enthalten, gezeigt werden; siehe Holmes, Science 253:1278-80(1991) und Murphy, Science 253:1280-83(1991). Erst vor kurzem wurde ein Rezeptor für die C-C-Chemokine MIP-1α und RANTES molekular geklont, und es wurde seine Zugehörigkeit zur selben Siebener-Transmembran-überspannenden Rezeptorenüberfamilie gezeigt; siehe Gao, J. Exp. Med. 177:1421-27(1993) und Neote, Cell 72:415-25(1993). Dieser Rezeptor, von dem man annimmt, dass er an der Leukozytenaktivierung und Chemotaxis beteiligt ist, zeigt abhängig vom Liganden, unterschiedliche Affinität und Signaleffizienz. Er bindet mit der höchsten Affinität und der besten Signaleffizienz an MIP-1α. Zu MCP-1 zeigt der Rezeptor eine hohe Bindungsaffinität relativ zu RANTES und huMIP-1β, aber er übermittelt das Signal mit geringerer Effizienz; siehe Neote, Id., auf 421-22. Obwohl pharmakologische Studien das Vorhandensein eines spezifischen MCP-1 Rezeptors voraussagten und die bisher geklonten Rezeptoren die robusten Ansprech-Antworten von Monocyten auf MCP-1 nicht bedingen konnten, wurde bis heute von keinem spezifischen Rezeptor für MCP-1 berichtet; siehe Wang, J. Exp. Med. 177:699-705(1993) und Van Riper, J. Exp. Med. 177:851-856(1993). Die Schwierigkeit kann zumindest teilweise durch die Tatsache hervorgerufen werden, dass in der Chemokinfamilie individuelle Rezeptoren an multiple Liganden binden können oder nicht, was funktionelles Sortieren, Aufspüren und Identifizieren unpraktisch macht. Es wurde auch spekuliert, dass die Rezeptormitglieder der Familie keine strukturellen Merkmale teilen – das erklärt, warum sich der MCP-1-Rezeptor bis heute den Forschern entzogen hat; siehe Edgington, Bio/Technology II:676-81(1993).
Im Fachgebiet verbleibt ein Bedarf für zusätzliche Rezeptoren für diese Chemokine. Es verbleibt auch ein Bedarf im Fachgebiet für Rezeptoren, die speziell für jedes der C-C-Proteine sind, besonders ein Rezeptor, der spezifisch für MCP-1 ist. Ohne einen spezifischen Rezeptor für MCP-1 gibt es keinen praktischen Weg um Assays der MCP-1-Bindung an seinen Rezeptor zu entwickeln. Die Verfügbarkeit solcher Assays bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Aufspürung von Antagonisten der MCP-1/MCP-1-Rezeptor-Interaktion. Solche Antagonisten wären hervorragende Kandidaten für Therapeutika für die Behandlung von Atherosklerose bei der Unterdrückung des Tumorwachstums und bei anderen Erkrankungen, die gekennzeichnet sind durch monocytische Infiltration, wie rheumatoide Arthritis und Alvocolitis.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt sieht die Erfindung neue humane Chemokinrezeptor-Proteine vor, MCP-1RA und MCP-1RB, die im Wesentlichen frei sind von anderen Säugerproteinen, mit denen sie in ihrem nativen Zustand typischerweise gefunden werden. MCP-1RA und MCP-1RB sind identisch in der Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 2 und SEQ ID NR.: 4) von der 5' untranslatierten Region bis hin zu der mutmaßlichen siebten transmembranen Domäne, aber sie besitzen unterschiedliche cytoplasmatische Enden. Daher scheinen sie eine alternativ gespleißte Version des MCP-1-Gens darzustellen. Die Proteine können durch rekombinante gentechnologische Techniken hergestellt werden. Sie können zusätzlich aus zellulären Quellen gereinigt werden, die den Faktor konstitutiv oder bei Induktion mit anderen Faktoren produzieren. Sie können auch durch chemische Techniken synthetisiert werden. Ein Fachmann könnte eine Kombination der oben aufgezeigten Verfahrenstechnologien anwenden, um den Faktor zu synthetisieren.
Aktives, ausgereiftes MCP-1RA ist ein annähernd 374 Aminosäuren langes Protein mit einem vorausgesagten Molekulargewicht für das ausgereifte Protein von etwa 42 000 Dalton. Seine alternativ gespleißte Version, MCP-1RB, ist ein etwa 360 Aminosäuren langes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 41 000 Dalton. Die MCP-1R-Proteine dieser Erfindung weisen eine hohe Spezifität für MCP-1 auf, wenn sie in Xenopus oocytes exprimiert werden.
Die Erfindung sieht ein isoliertes Polypeptid vor, welches die Aminosäuresequenz eines MCP-1R-Polypeptids umfasst, welches

(a) ein Polypeptid ist, welches eine Sequenz aufweist, die mindestens zu 90 % identisch mit der Sequenz von MCP-1RA, wie in der SEQ ID NR.: 2 gezeigt, ist,
(b) ein Polypeptid ist, welches eine Sequenz aufweist, die mindestens zu 90 % identisch mit der Sequenz von MCP-1RB, wie in der SEQ ID NR.: 4 gezeigt, ist, oder
(c) ein Fragment eines Polypeptids gemäß (a) oder (b) ist, welches spezifisch an MCP-1 bindet, wobei die Sequenz des Fragments mindestens zu 90 % identisch mit dem entsprechenden Abschnitt von SEQ ID NR.: 2 oder SEQ ID NR.: 4 ist;

4A

4B

Ein anderer Aspekt dieser Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen (SEQ ID NR.: 1 und SEQ ID NR.: 3), welche die Expression der MCP-IRA- und -1RB-Proteine kodieren. Diese Sequenzen können eine isolierte Nukleinsäuresequenz, welche die Expression der MCP-1R-Polypeptide, wie oben beschrieben, kodiert, einschließen. Wie hier verwendet, bedeutet „isoliert" im Wesentlichen Freisein von Säugernukleinsäure- oder -proteinsequenzen, mit denen die den Gegenstand bildende Nukleinsäure- oder Proteinsequenz in ihrem nativen, d. h. endogenen Zustand, typischerweise gefunden wird. Die Nukleinsäuresequenzen, die aktives MCP-1RA und -1RB kodieren, sind gekennzeichnet durch die Beinhaltung derselben oder im Wesentlichen derselben Nukleotidsequenz wie in den 1 bzw. 2 (SEQ ID NR.: 1 und 3), oder aktiven Fragmenten davon. Die Sequenzen können 5'- und 3'-nicht-kodierende Sequenzen einschließen, welche die kodierende Sequenz flankieren. Die Sequenzen können auch ein aminoterminales Signalpeptid kodieren. Die 1 und 2 zeigen die nicht-kodierenden 5'- und 3'-Flankierungssequenzen und eine Signalsequenz der MCP-IRA- bzw. -1RB-Sequenz, isoliert aus der humanen monocytischen Zelllinie MonoMac 6 und exprimiert in Xenopus oocytes.
Es versteht sich, dass die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung einige oder alle dieser Signal- und/oder Flankierungssequenzen ausschließen können. Darüber hinaus können die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, welche ein MCP-1R-Protein kodieren, ebenfalls folgendes umfassen:

(a) die Nukleotidsequenz einer MCP-1R-cDNA, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde hybridisiert, welche die Sequenz des Komplements der in der SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 3 gezeigten Kodiersequenz besitzt, wobei die cDNA ein MCP-1R-Polypeptid kodiert, welches spezifisch an MCP-1, jedoch nicht an MIP-1α, MIP-1β, RANTES oder IL-8 unter physiologischen Bedingungen bindet;
(b) die Nukleotidsequenz eines Fragments einer MCP-1R-cDNA gemäß (a), wobei ein Polypeptid mit der MCP-1R-Aminosäuresequenz, die durch das Fragment kodiert wird, spezifisch an MCP-1 bindet; oder
(c) eine Nukleotidsequenz, welche mit (a) oder (b) degeneriert ist.

Dementsprechend kann die Nukleinsäuresequenz dieser Erfindung Modifikationen in den nicht-kodierenden Sequenzen, den Signalsequenzen oder den kodierenden Sequenzen, basierend auf Allelvariation, Speziesvariation oder bewusster Modifikation beinhalten. Dementsprechend werden Analoge zu MCP-1R vorgesehen und schließen trunkierte bzw. gestutzte Polypeptide ein, z. B. Mutanten, in denen Variationen in der Aminosäuresequenz vorliegen, die biologische Aktivität beibehalten, wie im Folgendem definiert, und die eine Homologie von mindestens 90%, und vorzugsweise 95% mit der korrespondierenden Region von MCP-1R-Sequenzen der 1 oder der 2 (SEQ ID NR.: 2 und 4) haben. Beispiele schließen Polypeptide mit geringfügigeren Aminosäurevariationen von den nativen Aminosäuresequenzen von MCP-1R der 1 und 2 (SEQ ID NR.: 2 und 4), insbesondere konservative Aminosäurenaustausche, ein. Konservative Austausche sind diejenigen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die hinsichtlich ihrer Seitenketten verwandt sind. Genetisch kodierte Aminosäuren werden im Allgemeinen in vier Familien unterteilt:
(1) sauer = Aspartat, Gluatamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen-polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Beispielsweise ist es begründet anzunehmen, dass ein isolierter Austausch von einem Leucin gegen ein Isoleucin oder Valin, von einem Aspartat gegen ein Glutamat, von einem Threonin gegen ein Serin oder ein ähnlicher konservativer Austausch von einer Aminosäure gegen eine strukturell verwandte Aminosäure, keinen großen Effekt auf Aktivität oder Funktionalität haben wird.
Unter Verwendung der Sequenzen aus 1 und 2 (SEQ ID NR.: 1, 2, 3 und 4) sowie der angegebenen Charakteristika eines MCP-1R-Rezeptormoleküls im Allgemeinen, liegt es innerhalb der Kenntnis im Fachbereich, andere Polypeptide oder andere DNA-Sequenzen zu erhalten, die MCP-1R kodieren. Beispielsweise kann das strukturelle Gen durch die Variation individueller Nukleotide, während die korrekte(n) Aminosäure(n) beibehalten wird (werden), oder durch die Variation der Nukleotide, um die Aminosäuren zu modifizieren, ohne Aktivitätsverlust manipuliert werden. Nukleotide können anhand bekannter Techniken substituiert, eingefügt oder entfernt werden, einschließlich beispielsweise in vitro-Mutagenese und Primer-Reparatur. Das strukturelle Gen kann an seinem 3'- und/oder seinem 5'-Terminus trunkiert werden, während seine Aktivität beibehalten wird. Beispielsweise enthalten MCP-1RA und MCP-1RB, wie gemäß der 1 bzw. 2 (SEQ ID NR.: 1 und 2; SEQ ID NR.: 3 und 4) kodiert, N-terminale Regionen, von denen es erstrebenswert ist, sie zu entfernen. Es mag auch erstrebenswert sein, die Region, die die Signalsequenz kodiert, zu beseitigen und/oder sie durch eine heterologe Sequenz zu ersetzen. Es mag auch erstrebenswert sein, einen Teil der MCP-1R-Sequenzen (SEQ ID NR.: 1 und 3) zu ligieren, besonders denjenigen, welcher die aminoterminale Domäne einschließt, an eine heterologe Kodiersequenz u-nd folglich ein Fusions-Peptid mit der Rezeptor/Ligand-Spezifität von MCP-1RA oder MCP-1RB zu erzeugen.
Beim Entwerfen solcher Modifizierungen wird erwartet, dass Veränderungen in nichtkonservierten Regionen der MCP-1R-Sequenzen (SEQ ID NR.: 1, 2, 3 und 4) relativ geringere Effekte auf die Aktivität haben werden, wohingegen erwartet wird, dass Veränderungen innerhalb der konservierten Regionen, und besonders in oder nahe der aminoterminalen Domäne, größere Effekte erzielen. Der Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen von MCP-1RA und -1RB (SEQ ID NR.: 2 und 4), dem MIP-1α/RANTES-Rezeptor (SEQ ID NR.: 5), dem Orphan-Rezeptor HUMSTSR (SEQ ID NR.: 6) und den beiden IL-8-Rezeptoren (SEQ ID NR.: 7 und 8), wie in 4 veranschaulicht, liefert eine Anleitung für Aminosäuresubstitutionen, die mit der Rezeptoraktivität kompatibel sind. Von den Aminosäureresten, die unter den MCP-1R-Sequenzen (SEQ ID NR.: 2 und 4) und mindestens zwei der anderen Sequenzen (SEQ ID NR.: 5, 6, 7 und 8) konserviert sind, wird nicht erwartet, dass sie Substitutionskandidaten sind. Von einem Rest, welcher konservative Variationen unter den MCP-1R-Sequenzen und mindestens zwei der anderen Sequenzen zeigt, wird erwartet, dass er zu ähnlicher konservativer Substitution der MCP-1R-Sequenzen imstande ist. Ähnlich wird von einem Rest, welcher nichtkonservativ unter den MCP-1R-Sequenzen und mindestens drei der anderen Sequenzen variiert, erwartet, dass er entweder zu konservativer oder nichtkonservativer Substitution imstande ist. Beim Entwerfen von Substitutionen an den MCP-1R-Sequenzen wird der Austausch durch eine Aminosäure, welche in einer vergleichbar ausgerichteten Position von einer der anderen Sequenzen gefunden wird, besonders bevorzugt.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anderweitig angezeigt, konventionelle Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie, welche innerhalb des Kenntnisstandes im Fachgebietes liegen, einsetzen. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt; siehe z. B. Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (1989); DNA Cloning, Bände I und II (D. N. Glover, Hrsg. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg. 1984): Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Hrsg. 1986); Immobilized Cells and Enzyms (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Tranfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos, Hrsg. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology, Bände 154 und 155 (Wu und Grossman, bzw. Wu, Hrsg.), (Mayer und Walker, Hrsg) (1987); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes, (1987); Protein Purification: Principles and Practice, zweite Ausgabe (Springer-Verlag, N.Y.); und Handbook of Experimental Immunology, Bände I–IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg. 1986). Alle Patente, Patentanmeldungen und hier erwähnten Veröffentlichungen, sowohl supra als auch infra, sind hierin durch den Bezug darauf eingebracht.
Zusätzlich wird durch diese Erfindung ein Expressionsvektor vorgesehen, der eine Nukleinsäuresequenz von einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst. Der Vektor kann eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR.: 1 und 3) umfassen, die ein Säuger-MCP-1R-Polypeptid kodiert. Der Vektor sieht die MCP-1R-Nukleinsäure in funktionsfähiger Verbindung mit einer regulatorischen Sequenz vor, die in der Lage ist, die Replikation und Expression von einem MCP-1R-Protein in einer selektierten Wirtszelle zu lenken. Die Erfindung sieht weiterhin eine Säuger-, Insekten oder Hefezelle vor, die heterologe Nukleinsäure, welche die Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung besitzt, umfasst, wobei die Zelle in der Lage ist, Replikation und Expression der heterologen Nukleinsäure durchzuführen. Wirtszellen können mit Vektoren der Erfindung transformiert werden. Ebenso vorgesehen ist ein neues Verfahren für die Herstellung rekombinanter MCP-1R-Proteine oder aktiver Fragmente davon. Bei diesem Verfahren wird eine Zelle der Erfindung bei geeigneten Bedingungen kultiviert, die die Expression der heterologen Nukleinsäure ermöglichen. Das exprimierte Protein wird dann aus der Zelle oder dem Kulturmedium durch den Einsatz geeigneter konventioneller Methoden abgeerntet. Dieses neue Verfahren kann verschiedene bekannte Zellen als Wirtszelllinien für die Expression des Proteins einsetzen.
Zusammensetzungen für die Verwendung in der Therapie, der Diagnose, dem Assay von MCP-1R oder zum Erzeugen von Antikörpern gegen MCP-1R, einschließlich effektiver Mengen von MCP-1R-Proteinen, hergestellt gemäß den vorangehenden Verfahren, werden auch hierin beschrieben. Ein anderer Aspekt dieser Erfindung sieht eine Methode zur Identifizierung eines Antagonisten des MCP-1-Rezeptors vor, umfassend:

(a) das Kontaktieren einer Zelle der Erfindung mit MCP-1 in Anwesenheit und Abwesenheit einer organischen Kandidatenverbindung und
(b) den Vergleich der Bindung des MCP-1 an das MCP-1R-Polypeptid in Gegenwart der Verbindung mit der Bindung des MCP-1R an das MCP-1R-Polypeptid in seiner Abwesenheit;

Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz vor, die um die MCP-1-Rezeptorenbindung kompetitiert, umfassend das Kontaktieren eines Polypeptids der Erfindung mit einem Monocyten-Chemoattraktiven-Protein-1 (MCP-1) und einer Verbindung, das Ermitteln der spezifischen Bindung an dieses Polypeptid und das Bestimmen, ob diese Verbindung diese spezifische Bindung beeinflusst.
Die Erfindung sieht weiterhin einen Antikörper gegen die Polypeptide der Erfindung vor.
Die Verfügbarkeit solcher Verfahren, die bislang nicht verfügbar waren, erlaubt die Entwicklung von therapeutischen Antagonisten, die bei der Behandlung von Atherosclerose und anderen Erkrankungen, die durch monocytische Infiltrierung gekennzeichnet sind, brauchbar sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch effektive Menge von einem MCP-1-Antagonisten beinhalten, identifiziert durch den Gebrauch der Verfahren dieser Erfindung, sind auch hierin beschrieben. Solche MCP-1-Antagonist-Zusammensetzungen können bei den Therapien von Atherosklerose, Krebs und anderen Erkrankungen, die durch monocytische Infiltrate gekennzeichnet sind, eingesetzt werden. Eine Behandlung von diesen und/oder anderen Erkrankungen und pathologischen Zuständen durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge vom MCP-1-Antagonisten, oder eines aktiven Fragmentes davon an einen Patienten, in einem geeigneten pharmazeutischen Träger, wird deshalb beschrieben.
Andere Aspekte und Vorteile dieser Erfindung werden in der folgenden detaillierten Darstellung beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die humanen cDNA- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR.: 1 bzw. SEQ ID NR.: 2) von dem isolierten MCP-1-Rezeptorklon MCP-1RA.
2 veranschaulicht die humanen cDNA- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR.: 3 bzw. SEQ ID NR.4) von dem isolierten MCP-1-Rezeptorklon MCP-1RB.
3 veranschaulicht die Resultate der Northern-Blot-Analysen von hämatopoetischen Zelllinien, die hinsichtlich MCP-IRA- und MCP-1RB-mRNA untersucht wurden.
4 veranschaulicht die vorhergesagte Aminosäuresequenz von dem MCP-1-Rezeptor A (MCP-1RA) (SEQ ID NR.: 2), ausgerichtet mit der MIP-1α/RANTES-Rezeptorsequenz (SEQ ID NR.: 5), der Orphan-Rezeptorsequenz HUMSTSR (SEQ ID NR.: 6) und den zwei IL-8-Rezeptorsequenzen (SEQ ID NR.: 7 und 8). Identische Reste sind umrahmt dargestellt. Die sieben mutmaßlichen transmembranen Domänen sind durch die horizontalen Striche dargestellt. Lücken, die eingefügt wurden um die Ausrichtungen zu optimieren, sind durch Striche dargestellt. Die Aminosäureanzahlen für jede Sequenz sind auf der rechten Seite der Sequenzen platziert.
5 stellt die funktionale Expression des MCP-1R-Proteins in Xenopus oocytes grafisch dar, wie durch das Messen der Calciummobilisation in Gegenwart von MCP-1 ermittelt.
6 stellt die Ergebnisse des Calciumabflussassays grafisch dar, der verwendet wurde, um die Genexpression und das Ansprechverhalten auf MCP-1 zu bestätigen, wie in Beispiel 4 beschrieben.
7 stellt die Bindung von ¹²⁵I-MCP-1 an den rekombinanten MCP-IRB-Rezeptor grafisch dar, wie in Beispiel 5 ausführlich beschrieben.
8 stellt die Ergebnisse der MCP-IRB-Rezeptor-vermittelten Calciummobilisationsversuche grafisch dar, auch ausführlich beschrieben in Beispiel 5. 8A stellt intrazellulären Calciumdurchfluss als eine Funktion der MCP-1-Konzentration (nM) dar. Calciumdurchgänge gipfelten bei 4–8 Sek. nach Zugabe von MCP-1 und kehrten innerhalb von 90 Sek. nach der Aktivierung zur Grundlinie zurück. 8B stellt die MCP-1-stimulierte Calciummobilisation (EC₅₀ = 3,4 nM) und das Ausbleiben einer stimulierten Calciummobilisation durch andere Cytokine dar. 8C veranschaulicht, dass MCP-1 die Zellen unempfindlich gegenüber einer zweiten Zugabe von MCP-1 machte.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
I. Einführung
Diese Erfindung sieht biologisch aktive humane Chemokinrezeptoren vor, MCP-1RA und -1RB, die im Wesentlichen frei von Assoziation mit anderen Säugerproteinen und -proteinösem Material sind, mit denen (dem) sie in ihrem nativen Zustand normalerweise assoziiert sind. MCP-1R-Proteine können durch rekombinante Techniken hergestellt werden, um die Herstellung in großen Mengen zu ermöglichen, die brauchbar für die Überprüfung potentieller Antagonisten zur Identifizierung von Kandidaten für Therapeutika für die Behandlung von Atherosklerose und anderen monocytisch-assoziierten Erkrankungen, wie Krebs und rheumatoider Arthritis, sind. Alternativ können MCP-1R-Proteine als ein homogenes Protein erhalten werden, aufgereinigt aus einer Säugerzelllinie, die sie absondern oder exprimieren, oder sie können chemisch synthetisiert werden.
Humanes MCP-1RA wurde aus einem Derivat von einer humanen monocytischen Leukämiezelllinie, MonoMac 6 (MM6) isoliert. Weil Monocyten schwer in großen Mengen zu isolieren sind und weniger als 2000 Bindungsstellen mit hoher Affinität pro Zelle exprimieren, wurde eine Zelllinie, die gut auf MCP-1 anspricht, benötigt. Aufgrund ihrer Ansprechkonsistenz wurde die MM6-Zelllinie gewählt. Sie kann von der DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Deutschland) erhalten werden, siehe auch Ziegler-Heitbrock, Int. J. Cancer 41:456(1988). Zellen wurden in einem geeigneten Medium gezüchtet und dann auf Veränderungen im intrazellulären Calcium als Antwort auf MCP-1 und andere Chemokine getestet. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus MonoMac 6-mRNA erstellt, gemäß vorher beschriebenen Verfahren; siehe Vu, Cell 64:1057-68(1991). Eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)-basierte Strategie unter Verwendung degenerierter Oligonukleotidprimer, die konservierten Sequenzen in der zweiten und dritten transmembranen Domäne von den anderen Chemokinrezeptoren und in dem HUMSTSR-Orphan-Rezeptor entsprechen, wurde angewandt (siehe SEQ ID NR.: 5, 6, 7 und 8). Eine Amplifikation von cDNA, die von MM6-Zellen durch den Einsatz der Primer abgeleitet worden war, ergab eine Anzahl von PCR-Produkten, die größenmäßig zu denen korrespondieren, die für einen Sieben-Transmembran-Rezeptor erwartet werden. Die Analyse der subklonierten PCR-Produkte zeigte cDNAs, welche die vorausgesagten Anordnungen der Rezeptoren kodieren, auf denen die Primer entworfen wurden, zusammen mit einer cDNA, die einen neuen Rezeptor zu kodieren schien.
Um eine Version dieses Klons voller Länge zu erhalten, wurde eine MM6-cDNA-Bibliothek hergestellt und mit dem PCR-Produkt sondiert. Ein isolierter Klon von 2,1 kb wurde erhalten und MCP-1RA genannt. Die 1 veranschaulicht die cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 1) und die vorrausgesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 2) des Klons. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR.1) umfasst 2232 Basenpaare, einschließlich einer 5'-nicht-kodierenden Sequenz von 39 Basenpaaren und einer 3'-nicht-kodierenden Sequenz von 1071 Basenpaaren. Die MCP-IRA-Sequenz ist gekennzeichnet durch einen einzigen, langen, offenen Leserahmen, der eine 374-Aminosäure kodiert, anschließend an das Start-Methionin an Position 23.
Die Nukleotidsequenz von MCP-1RA-cDNA (SEQ ID NR.: 1) wurde mit den Nukleotidsequenzen, verzeichnet in Genbank, verglichen. Homologie wurde mit den Kodiersequenzen der Rezeptoren für MIP-1alpha/RANTES, dem HUMSTSR-Orphan-Rezeptor und IL-8 (SEQ ID NR.: 5, 6, 7 bzw. 8) gefunden. Keine signifikante Homologie wurde zwischen der Kodiersequenz von MCP-1RA und irgendeiner anderen veröffentlichten Polypeptidsequenz gefunden.
Die vorausgesagte Aminosäuresequenz von MCP-1RA (SEQ ID NR.: 2) zeigt sieben mutmaßliche transmembrane Domänen und einen extrazellulären Aminoterminus von 40 Resten. Die weitere Analyse der MCP-IRA-Aminoäuresequenz zeigt einige interessante Merkmale. Trotz seiner Homologie mit dem verwandten MIP-1-alpha/RANTES-Rezeptor und den IL-8-Rezeptoren, weist MCP-1RA eine signifkante Abweichung in seinen Amino- und Carboxyltermini auf; siehe 4 (SEQ ID NR.: 2, 5, 6, 7 und 8). Zusätzlich tritt eine auffällige Gleichheit zwischen MCP-1RA und dem MIP-1alpha/RANTES-Rezeptor in einer 31-Aminoäuresequenz auf, die mit dem Septat IFFILL am Ende der dritten transmembranen Domäne beginnt.
Eine vorläufige biologische Charakterisierung weist darauf hin, dass MCP-1RA robuste und bemerkenswert spezifische Ansprechreaktionen auf nanomolare Konzentrationen von MCP-1 überträgt. Überraschenderweise wurde von dem MIP-1α, MIP-1β, RANTES oder Il-8 selbst bei Konzentrationen von 500 Nanomol keine Ansprechreaktion ausgelöst.
Die Analyse von zusätzlichen Klonen in der MM6-cDNA-Bibliothek zeigte eine zweite Sequenz, die identisch ist zur MCP-IRA-Sequenz von der 5'-untranslatierten Region bis hin zur mutmaßlichen siebten transmembranen Domäne, aber ein anderes cytoplasmatisches Ende beinhaltet. Diese zweite Sequenz (SEQ ID NR.: 3 und 4), bezeichnet als MCP-1RB, scheint eine alternativ gespleißte Version von MCP-1RA zu sein. Sie wird nachstehend weiter charakterisiert.
Die hierin vorgesehenen MCP-1R-Polypeptide schließen auch Polypeptide ein, die von Sequenzen kodiert werden, die ähnlich zu denen von MCP-1RA und -1RB (SEQ ID NR.: 1, 2, 3 und 4) in den 1 und 2 sind, aber in denen Modifikationen natürlicherweise bereitgestellt oder absichtlich technisch erzeugt werden. Diese Erfindung umfasst auch solche neuen DNA-Sequenzen, welche bei der Expression für MCP-1R-Polypeptide kodieren, die eine Spezifität für den MCP-1-Rezeptor besitzen. Diese DNA-Sequenzen schließen Sequenzen ein, die im Wesentlichen die gleichen sind wie die DNA-Sequenzen (SEQ ID NR.: 1 und 3) der 1 und 2 und biologisch aktive Fragmente davon, und solche Sequenzen, die unter stringenten Hybridisationsbedingungen an die DNA-Sequenzen (SEQ ID NR.: 1 und 3) der 1 und 2 hybridisieren; siehe Maniatis, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387–389. Ein Beispiel für solche stringenten Bedingungen ist die Hybridisierung in 4 X SSC bei 65°C, gefolgt von einem Waschen in 0,1 X SSC bei 65°C eine Stunde lang. Ein anderes beispielhaftes stringentes Hybridisierungsschema verwendet 50% Formamid, 4 X SSC bei 42 °C.
DNA-Sequenzen, die für MCP-1R-Polypeptide kodieren, aber sich aufgrund der Degenerationen, inhärent im genetischen Code, in der Kodonsequenz unterscheiden, werden auch von dieser Erfindung umfasst. Allelvariationen, d. h. natürlich vorkommende Interspezies-Basen-Abänderungen, die in Aminosäureveränderungen resultieren können oder nicht, in den MCP-1R-DNA-Sequenzen (SEQ ID NR.: 1 und 3) der 1 und 2, die MCP-1R-Polypeptide kodieren, die MCP-1R-Aktivität besitzen (zum Beispiel Spezifität für den MCP-1-Rezeptor) sind auch in dieser Erfindung eingeschlossen.
II. Wege zur Ausführung der Erfindung
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten gereiften Polypeptids können die folgenden Techniken einschließen. Zuerst kann ein Vektor, der für ein MCP-1R-Polypeptid kodiert, in eine Wirtszelle eingebracht werden, und die Wirtszelle kann unter geeigneten Kulturbedingungen, die die Herstellung des Polypeptids ermöglichen, kultiviert werden.
Die MCP-1R-Gene oder Fragmente davon können in einem Säuger-, Insekten- oder Mikroorganismenwirt exprimiert werden. Die Polynukleotide, die MCP-1R-Gene kodieren, werden in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der kompatibel mit dem verwendeten Wirtszellentyp ist und der funktionsfähig verbunden ist mit den Regulationselementen innerhalb dieses Vektors. Die Vektorkonstruktion verwendet Techniken, welche im Fachbereich bekannt sind. Orts- bzw. Sequenzspezifische DNA-Spaltung, die bei einer solchen Konstruktion herangezogen wird, wird durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen ausgeführt, welche im Allgemeinen durch den Hersteller dieser im Handel erhältlichen Enzyme beschrieben sind.
Ein geeigneter Expressionsvektor ist einer, der kompatibel mit der erwünschten Funktion ist (z. B. vorübergehende Expression, Langzeitexpression, Integration, Replikation, Amplifikation) und in welchem die Regulationselemente kompatibel mit der Wirtszelle sind.
A. Expression in Säugerzellen
Vektoren, die für die Replikation in Säugerzellen geeignet sind, sind im Fachbereich bekannt und können virale Replikone oder Sequenzen einschließen, welche die Integration der Sequenz gewährleisten, die MCP-1R in dem Wirtsgenom kodiert. Beispielhafte Vektoren schließen jene ein, die vom Simianvirus SV40, Retroviren, dem Rinder-Papilloma-Virus, dem Vaccinia-Virus und dem Adenovirus abgeleitet worden sind.
Wie im Fachbereich bekannt, wird die heterologe DNA, in diesem Fall MCP-1R-DNA, in dem viralen Genom inseriert, unter Verwendung, zum Beispiel, homologer Rekombinationstechniken. Die Insertion wird im Allgemeinen in einem Gen vorgenommen, welches in der Natur nicht essentiell ist, zum Beispiel das Thymidin-Kinase-Gen (tk), welches auch einen selektierbaren Marker vorsieht. Plasmid-Shuttle-Vektoren, die die Konstruktion von rekombinanten Viren sehr erleichtern, sind beschrieben worden (siehe zum Beispiel Mackett, et al. (1984); Chakrabarti, et al. (1985); Moss (1987)). Die Expression des heterologen Polypeptids tritt dann in Zellen oder Individuen auf, welche mit dem lebenden rekombinanten Virus immunisiert bzw. geimpft sind.
Solche geeigneten Säuger-Expressionsvektoren beinhalten gewöhnlich einen Promotor, um die Transkription von fremden DNA-Sequenzen zu vermitteln und optional, einen Enhancer. Geeignete Promotoren für Säugerzellen sind im Fachbereich bekannt und schließen virale Promotoren wie den vom Simianvirus 40 (SV40), Cytomegalovirus (CMV), Rous-Sarcoma-Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapillomavirus (BPV) ein.
Die optionale Anwesenheit eines Enhancers, der mit dem oben beschriebenen Promotor kombiniert ist, wird die Expressionsspiegel typischerweise erhöhen. Ein Enhancer ist irgendeine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription bis zum 1000-fachen stimulieren kann, wenn sie mit endogenen oder heterologen Promotoren verknüpft ist, wobei die Synthese an der normalen mRNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromauf- oder stromabwärts von der Transkiption-Initiations-Stelle platziert sind, entweder in normaler oder geflippter Orientie rung, oder in einer Distanz von mehr als 1000 Nukleotiden von dem Promotor; siehe Maniatis, Science 236:1237(1987), Alberts, Molecular Biology of the Cell, 2. Ausgabe (1989). Enhancerelemente, die von Viren abgeleitet worden sind, können besonders brauchbar sein, denn sie besitzen typischerweise einen breiteren Wirtsbereich. Beispiele, die in Säugerzellen brauchbar sind, schließen den Frühes-SV40-Gen-Enhancer (siehe Dijkema, EMBO J. 4:761(1985)) und die Enhancer/Promotoren ein, die von dem Langen-Terminal-Repeat (LTR) des RSV (siehe Gorman, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777(1982b)) und des humanen Cytomegalovirus (siehe Boshart, Cell 41:521(1985)) abgeleitet worden sind. Zusätzlich sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in der Gegenwart von einem Inducer aktiv, wie einem Hormon oder Metallion (siehe Sassone-Corsi und Borelli, Trends Genet. 2:215(1986)); Maniatis, Science 236:1237(1987)).
Darüber hinaus kann und wird der Expressionsvektor typischerweise auch eine Terminations-Sequenz und Poly(A)-Additions-Sequenzen einschließen, welche mit der MCP-1R-Kodiersequenz in funktionsfähiger Weise verknüpft sind.
Sequenzen, die eine Amplifikation des Gens verursachen, können auch in dem Expressionsvektor oder in einem anderen Vektor wünschenswert eingeschlossen sein, der mit dem Expressionsvektor co-translatiert wird, der eine MCP-1R-DNA-Sequenz enthält, wie es Sequenzen sind, die selektierbare Marker kodieren. Selektierbare Marker für Säugerzellen sind im Fachbereich bekannt und schließen zum Beispiel Thymidin-Kinase, Dihydrofolat-Reduktase (zusammen mit Methotraxat als ein DHFR-Amplifizierer), Aminoglycoside, Phosphotransferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase, Asparagin-Synthetase, Adenosin-Deaminase, Metallothionin und Antibiotika-Resistenz-Gene wie Neomycin ein.
Der Vektor, der ein MCP-1R-Polypeptid kodiert, kann für die Transformation einer geeigneten Säugerwirtszelle verwendet werden. Die Transformation kann durch irgendein bekanntes Verfahren zur Einführung von Polynukleotiden in eine Wirtszelle stattfinden, einschließlich, zum Beispiel, das Verpacken des Polynukleotids in einem Virus und das Transduzieren einer Wirtszelle mit dem Virus. Die verwendete Transformationsprozedur ist abhängig von dem zu transformierenden Wirt. Verfahren für das Einführen von heterologen Polynukleotiden in Säugerzellen sind im Fachbereich bekannt und schließen Dextran-vermittelte Transektion, Calcium-Phosphat-Präzipitation, Polybren-vermittelte Transektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einkapselung von dem Polynukleotid/den Polynukleotiden in Liposome und direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne ein.
Säugerzelllinien, die als Wirte für die Expression verfügbar sind, sind im Fachbereich bekannt und schließen viele immortalisierte Zellinien ein, die von der Amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (ATCC = American Type Culture Collection) erhältlich sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chinesische-Hamsterovarien(CHO)-Zellen, HeLa-Zellen, Babyhamsternieren(BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), humane hepatozelluläre Karzinomzellen (z. B. Hep G2), und eine Anzahl von anderen Zelllinien.
B. Expression in Insektenzellen
In dem Fall einer Expression in Insektenzellen schließen die Komponenten des Expressionssystems im Allgemeinen einen Transfervektor, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, welches sowohl ein Fragment von dem Baculovirus-Genom, als auch eine passende Restriktionsstelle für die Insertion von dem zu exprimierenden heterologen Gen oder den Genen enthält; ein Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz homolog zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment in dem Transfervektor (das ermöglicht die homologe Rekombination von dem heterologen Gen in das Baculovirusgenom); und geeignete Insektenwirtszellen und Wachstumsmedien ein.
Beispielhafte Transfervektoren für das Einführen fremder Gene in Insektenzellen schließen pAc373 und pVL985 ein; siehe Luckow und Summers, Virology 17:31(1989).
Das Plasmid beinhaltet üblicherweise auch das Polyhedron-Polyadenylierungssignal und ein prokaryotisches Ampicillin-Resistenz (amp)-Gen und den Replikationsursprung für die Selektion und Propagation in E. coli; siehe Miller, Ann. Rev. Microbiol. 42:177(1988).
Baculovirus-Transfervektoren beinhalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor, d. h., eine DNA-Sequenz, die für das Binden einer Baculovirus-RNA-Polymerase und für die Initiierung der stromabwärts (5' zu 3')-Transkription einer Kodiersequenz (z. B. eines strukturellen Gens) in mRNA befähigt ist. Ein Promotor wird eine Transkriptions-Initiationsregion besitzen, welche üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der Kodiersequenz platziert ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion schließt typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiations-Stelle ein. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch einen Enhancer besitzen, welcher, wenn anwesend, üblicherweise entfernt vom strukturellen Gen ist. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
C. Expression in Mikroorganismen – Hefe und Bakterien
Pilz-Expressionssysteme können sowohl Hefe- als auch Filamentpilz-Wirte anwenden. Beispiele von Filamentpilz-Expressionssystemen sind Aspergillus, wie in der EP Patent-Veröffentlichung Nr. 357 127 (veröffentlicht am 7. März 1990) beschrieben, und Acremonium Chrysogenum, beschrieben in der EP Patent-Veröffentlichung Nr. 376 266 (veröffentlicht am 4. Juli 1990).
Ein Hefe-Expressionssystem kann typischerweise eins oder mehrere von dem Folgenden einschließen: eine Promotorsequenz, eine Fusionspartner-Sequenz, eine Leitsequenz, eine Transkription-Terminationsequenz.
Ein Hefepromotor, der fähig ist, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts (3')-Transkription einer Kodiersequenz (z. B. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren, wird eine Transkriptions-Initiationsregion besitzen, die üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der Kodiersequenz platziert ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion schließt typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (eine "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiations-Stelle ein. Der Hefepromotor kann auch eine stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenz besitzen, die üblicherweise entfernt von dem strukturellen Gen ist. Die Aktivatorsequenz gestattet die induzierbare Expression der gewünschten heterologen DNA-Sequenz. Konstitutive Expression findet in der Abwesenheit von einer Aktivatorsequenz statt. Regulierte Expression kann sowohl positiv als auch negativ sein und dadurch entweder die Transkription erhöhen oder reduzieren.
Besonders brauchbare Hefe-Promotorsequenzen schließen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) (EP Patent-Veröffentlichung Nr. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phospat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvat-Kinase (PyK)(EP Patent-Veröffentlichung Nr. 329 203) ein. Das Hefe PHO5-Gen, das Suure-Phosphatase kodiert, sieht auch brauchbare Promotorsequenzen vor; siehe Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:1(1983).
Ein MCP-1R-Gen oder ein aktives Fragment davon kann intrazellulär in Hefe exprimieri werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit einem MCP-1R-Gen oder -Fragment verbunden sein, in welchem Fall die erste Aminosäure an dem N-Terminus von dem rekombinanten Protein immer ein Methionin sein wird, welches von dem ATG-Startkodon kodiert wird. Wenn gewünscht, kann das Methionin an dem N-Terminus von dem Protein durch in-vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid abgespalten werden.
Intrazellulär exprimierte Fusionsproteine sehen eine Alternative zur direkten Expression einer MCP-1R-Sequenz vor. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Anteil von einem stabilen Protein kodiert, ein Fusionspartner, an das 5'-Ende von heterologer DNA, die das gewünschte Polypeptid kodiert, fusioniert. Nach der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von den zwei Aminosäuresequenzen vorsehen. Zum Beispiel kann das Hefe- oder Human-Superoxid-Dismutase(SOD)-Gen mit dem 5'-Terminus von einer MCP-1R-Sequenz verknüpft werden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle von den zwei Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle kodieren oder nicht; siehe z. B. EP Patent-Veröffentlichung Nr. 196 056. Alternativ können MCP-1R-Polypeptide auch von der Zelle in die Wachstumsmedien durch das Erzeugen eines Fusionsproteins abgesondert werden, das aus einem Leitsequenzfragment zusammengesetzt ist, das die Sekretion von den MCP-1R-Polypeptiden in Hefe oder Bakterien vorsieht. Vorzugsweise sind dabei Prozessierstellen zwischen dem Leitfragment und der MCP-1R-Sequenz (SEQ ID Nr.: 1 und 3) kodiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leitsequenzfragment kodiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren aufgebaut ist, welche die Sekretion von dem Protein aus der Zelle lenken. Die DNA, die geeignete Signalsequenzen kodiert, kann von Genen für sekretierte Hefeproteine, wie die Hefe-Invertase-Gene (EP Patent-Veröffentlichung Nr. 12 873) und dem A-Faktor-Gen (U.S.-Patent Nr. 4 588 684), abgeleitet werden. Alternativ können Leader bzw. Leitsequenzen, die keinen Hefeursprung aufweisen, wie ein Interferonleader, verwendet werden, um die Sekretion in Hefe (EP Patent-Veröffentlichung Nr. 60057) vorzusehen. Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Hefe erkannt werden, sind regulatorische Regionen, die 3' zu dem Translations-Stop-Codon platziert sind. Zusammen mit dem Promotor flankieren sie die gewünschte heterologe Kodiersequenz. Diese flankierenden Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, welche in das MCP-1R-Polypeptid translatiert werden kann, das von der MCP-1R-DNA kodiert wird.
Typischerweise werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (wenn gewünscht), die Kodiersequenz von Interesse und die Transkriptions-Terminationssequenz umfassen, in Plasmiden vereinigt, die zu stabiler Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie Hefe oder Bakterien, im Stande sind. Das Plasmid kann zwei Replikationssysteme haben, so kann es wie ein Shuttlevektor aufrecht erhalten werden, zum Beispiel in Hefe für die Expression und in einem prokaryotischen Wirt für das Klonen und die Amplifikation. Beispiele von solchen Hefe-Bakterien-Shuttlevektoren schließen YEp24 (siehe Botstein, Gene 8:17-24 (1979)), pCl/1 (siehe Brake, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646(1984)) und YRp17 (siehe Stinchomb, J. Mol. Biol. 158:157(1982)) ein. Darüber hinaus kann das Plasmid entweder ein Plasmid mit ho her oder niedriger Kopie-Anzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopie-Anzahl wird im Allgemeinen eine Kopieanzahl haben, die sich von etwa 5 bis etwa 200 und typischerweise von etwa 10 bis etwa 150 erstreckt. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopie-Anzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 haben. Entweder kann ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopie-Anzahl selektiert werden, abhängig von dem Effekt auf den Vektorwirt und die MCP-1R-Polypeptide; siehe z. B. Brake, et al., supra.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Hefegenom integriert werden. Integrierende Vektoren beinhalten typischerweise mindestens eine zu einem Hefe-Chromosom homologe Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht zu integrieren, und sie beinhalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren; siehe Orr-Weaver, Methods in Enzymol. 101: 228-245(1983) und Rine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750(1983).
Typischerweise kömmen extrachromosomale und integrierende Expressionsvektoren selektierbare Marker beinlalten, um die Selektion von Hefestämmen, die transformiert worden sind, zu ermöglichen. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene einschließen, die in dem Hefewirt exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 und das G418-Resistenz-Gen, welches Resistenz in Hefezellen gegen Tunicamycin bzw. G418 verleiht. Darüber hinaus kann ein geeigneter selektierbarer Marker auch Hefe mit der Fähigkeit in der Anwesenheit von toxischen Verbindungen, wie Metall, zu wachsen, vorsehen. Zum Beispiel ermöglicht die Anwesenheit von CUP1 Hefe, in der Anwesenheit von Kupferionen zu wachsen; siehe Butt, Microbiol. Rev. 51:351(1987).
Alternativ können einige der oben beschriebenen Komponenten in Transformations-Vektoren vereinigt werden. Transformations-Vektoren bestehen typischerweise aus einem selektierbaren Marker, der entweder in einem Replikon gehalten wird oder zu einem Integrationsvektor entwickelt worden ist, wie oben beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomal oder integrierend, sind für die Transformation in vielen Hefen entwickelt worden. Beispielhafte Hefezelllinien sind Candida albicans (Kurtz, Mol. Cell. Biol. 6:142(1986), Candida maltosa (Kunze, J. Basic Microbiol. 25:141(1985), Hansenula polymorpha (Gleeson, J. Gen. Microbiol. 132:3459(1986) und Roggenkamp, Mol. Gen. Genet. 202:302(1986), Kluyveromyces fragilis (Das, J. Bacteriol. 158:1165(1984), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt, J. Bacteriol. 154:737(1983) und Van den Berg, Bio/Technology 8:135(1990), Pichia guillerimondii (Kunze, J. Basic Microbiol. 25:141(1985), Pichia pastoris (Cregg, Mol. Cell. Biol. 5:3376 (1985), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 75:1929(1978) und Ito, J. Bacteriol. 153:163(1983), Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 300:706(1981) und Yarrowia lipolytica (Davidow, Curr. Genet. 10:380471(1985) und Gaillardin, Curr. Genet. 10:49(1985).
Verfahren für das Einführen exogener DNA in Hefe-Wirte sind im Fachbereich gut bekannt und schließen typischerweise entweder die Transformation von Spheroplasten oder von intakten Hefezellen, die mit alkalischen Kationen behandelt werden, ein. Transformationsvorgehensweisen variieren üblicherweise mit den zu transformierenden Hefespezies; siehe die Veröffentlichungen, die in dem vorangehenden Absatz für die entsprechenden Transformationstechniken aufgelistet sind.
Darüber hinaus kann das MCP-1R-Gen oder Fragment davon in einem bakteriellen System exprimiert werden. In solch einem System ist ein bakterieller Promotor irgendeine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts (3')-gerichtete Transkription einer Kodiersequenz (z. B. eines gewünschten heterologen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptions-Initiationsregion besitzen, welche üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der Kodiersequenz platziert ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion schließt typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiationsstelle ein. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite Domäne, als Operator bezeichnet, besitzen, die mit einer angrenzenden RNA-Polymerase-Bindungsstelle, an welcher die RNA-Synthese beginnt, überlappen kann. Der Operator ermöglicht eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, indem ein Gen-Repressor-Protein an den Operator binden kann und dadurch die Transkription von einem spezifischen Gen inhibieren kann. Konstitutive Expression kann in der Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen, wie dem Operator, stattfinden. Darüber hinaus kann eine positive Regulation durch eine Gen-Aktivator-Protein-Bindungssequenz erreicht werden, welche, wenn anwesend, gewöhnlich proximal (5') zu der RNA-Polymerase-Bindungssequenz ist. Ein Beispiel von einem Gen-Aktivator-Protein ist das Katabolit-Aktivator-Protein (CAP), welches hilft, die Transkription des Lac-Operons in Escherichia coli E. coli zu initiieren; siehe Raibaud, Ann. Rev. Genet. 18:173(1984). Eine regulierte Expression kann deshalb entweder positiv oder negativ sein und dadurch entweder die Transkription steigern oder reduzieren.
Sequenzen, die Stoffwechselweg-Enzyme kodieren, sehen besonders brauchbare Promotorsequenzen vor. Beispiele schließen Promotorsequenzen ein, die von Enzymen abgeleitet worden sind, die Zucker metabolisieren, wie Galactose, Lactose (lac) (siehe Chang, Nature 198:1056(1977) und Maltose. Zusätzliche Beispiele schließen Promotorsequenzen ein, die von biosynthetischen Enzymen, wie Tryptophan (trp), abgeleitet worden sind (siehe Goeddel, NUC. ACIDS RES. 8:4057(1981), Yelverton, Nuc. Acids Res. 9:731(1981), US-Patent Nr. 4 738 921 und EP Patent-Veröffentlichungen Nr. 36 776 und 121 775). Das ❚-Lactamase (bla)-Promotorsystem (siehe Weissmann, Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser), das Bakteriophage-Lambda-PL-Promotorsystem (siehe Shimatake, Nature 292:128(128) und das T5-Promotorsystem (US-Patent Nr. 4 689 406) sehen auch brauchbare Promotorsequenzen vor.
Darüber hinaus funktionieren synthetische Promotoren, welche nicht in der Natur vorkomnmen, auch als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können Transkriptions-Aktivationssequenzen von einem Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotor mit den Operonsequenzen von einem anderen Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotor verbunden sein, wodurch ein synthetischer Hybridpromotor, wie der tac-Promotor (siehe US-Patent Nr. 4 551 433, Amann, Gene 25:167(1983) und de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21(1983)) erzeugt wird. Ein bakterieller Promotor kann natürlich vorkommende Promotoren von einem nicht-bakteriellen Ursprung einschließen, die die Fähigkeit besitzen, an bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlich vorkommender Promotor von einem nicht-bakteriellen Ursprung kann mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Spiegel der Expression von einigen Genen in Prokaryoten zu produzieren. Das T7 Bakteriophagen-RNA-Polymerase/Promotor-System ist beispielhaft; (siehe Studier, J. Mol. Biol. 189:113(1986) und Tabor, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074(1985)).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist auch eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle für die Expression des MCP-1R-Gens oder Fragments davon in Prokaryoten brauchbar. In E. coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle als die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet und schließt ein Initiationscodon (ATG) und eine 3–9 Nukleotide lange Sequenz ein, die 3–11 Nukleotide stromaufwärts von dem Initiationscodon platziert ist (siehe Shine, Nature 254:34(1975). Die SD-Sequenz soll vermutlich das Binden von mRNA an das Ribosom fördern, und zwar durch das Paaren von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende von E. coli 16S rRNA (siehe Steitz, Biological Regulation and Development; Gene Expression (Hrsg. R.F. Goldberger)(1979)).
Das MCP-1R-Protein kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit einem MCP-1R-Gen oder einem Fragment davon verbunden sein, in welchem Fall die erste Aminosäure an dem N-Terminus immer ein Methionin sein wird, welches von dem ATG-Startcodon kodiert wird. Wenn gewünscht, kann das Methionin an dem N-Terminus von dem Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid oder entweder durch in vivo- oder in vitro-Inkubation mit einer bakteriellen Methionin-N-terminal-Peptidase abgespalten werden; siehe EP-Patent-Veröffentlichung Nr. 219 237.
Fusionsproteine sehen eine Alternative zur direkten Expression vor. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Anteil eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins kodiert, an das 5'-Ende von heterologen MCP-1R-Kodiersequenzen fusioniert. Nach der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von den zwei Aminosäuresequenzen vorsehen. Zum Beispiel kann das Lambda-Bakteriophagen-Zellgen an den 5'-Terminus von einem MCP-1R-Gen oder Fragment davon gebunden sein und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierenzym (Faktor Xa) bei, um das Bakteriophagenprotein von dem MCP-1R-Gen oder Fragment davon abzuspalten (siehe Nagai, Nature 309:810(1984). Fusionsproteine können auch mit Sequenzen von dem lacZ-Gen (Jia, Gene 60:197(1987), dem trpE-Gen (Allen, J. Biotechnol. 5:93(1987) und Makoff, J. Gen. Microbiol. 135:11(1989), und dem Chey-Gen (EP Patent-Veröffentlichung Nr. 324 647)-Genen hergestellt sein. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle von den zwei Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle kodieren oder nicht. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Solch ein Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierenzym (z. B. Ubiquitin-spezifische Prozessier-Protease) beibehält, um das Ubiquitin von dem MCP-1R-Polypeptid abzuspalten. Durch dieses Verfahren können reife MCP-1R-Polypeptide isoliert werden; siehe Miller, Bio/Technology 7:698(1989).
Alternativ können MCP-1R-Polypeptide auch von der Zelle durch das Herstellen chimärer DNA-Moleküle abgesondert werden, die ein Fusionsprotein kodieren, mit einem Signal-Peptid-Sequenzfragment als Bestandteil, das die Sekretion der MCP-1R-Polypeptide in Bakterien vorsieht; (siehe zum Beispiel, US Patent Nr. 4 336 336). Das Signal-Sequenzfragment kodiert typischerweise ein Signal-Peptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion von dem Protein aus der Zelle lenken. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (gram-positive Bakterien) abgesondert oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und der äußeren Membran der Zelle (gram-negative Bakterien) lokalisiert ist. Vorzugs weise gibt es Prozessierstellen, welche entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können, die zwischen dem Signal-Peptidfragment und dem MCP-1R-Polypeptid kodiert sind.
DNA, die geeignete Signalsequenzen kodiert, kann von Genen für sekretierte bakterielle Proteine, wie das E. coli-Außenmembranprotein-Gen (ompA) (Masui, Experimental Manipulation of Gene Expression (1983) und Ghrayeb, EMBO J: 3:2437(1984)) und die Signalsequenz der Alkalischen Phosphatase von E. coli (phoA (siehe Oka, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212(1985), abgeleitet werden. Die Signalsequenz von dem Alpha-Amylase-Gen von verschiedenen Bacillus-Stämmen kann verwendet werden, um heterologe Proteine aus B. subtilis zu sekretieren (siehe Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:5582(1982) und EP Patent-Veröffentlichung Nr. 244 042).
Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Bakterien erkannt werden, sind regulatorische Regionen, die 3' zu dem Translations-Stop-Kodon lokalisiert sind. Zusammen mit dem Promotor flankieren sie die Kodiersequenz. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, welche in das MCP-1R-Polypeptid translatiert werden kann, das von der MCP-1R-DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 1 und 3) kodiert wird. Transkriptions-Terminationssequenzen schließen oft DNA-Sequenzen von etwa 50 Nukleotiden ein, die im Stande sind, Stamm-Loop-Strukturen zu formen, die beim Terminieren der Transkription helfen. Beispiele schließen Transkriptions-Terminationssequenzen ein, die von Genen mit starken Promotoren abgeleitet worden sind, wie das trp-Gen in E. coli und auch andere biosynthetische Gene.
Typischerweise werden der Promotor, die Signalsequenz (wenn gewünscht), die Kodiersequenz von Interesse und die Transkriptions-Terminationssequenz in einem extrachromosomalen Element (z. B. einem Plasmid) gehalten, das zu stabiler Aufrechterhaltung in dem bakteriellen Wirt im Stande ist. Das Plasmid wird ein Replikationssystem besitzen, wodurch es ihm möglich ist, in dem bakteriellen Wirt gehalten zu werden, entweder für die Expression oder für das Klonen und die Amplifikation. Darüber hinaus kann das Plasmid entweder ein Plasmid mit einer hohen oder einer niedrigen Kopieanzahl sein. Ein Plasmid mit einer hohen Kopieanzahl wird im Allgemeinen eine Kopieanzahl haben, die sich von etwa 5 bis etwa 200 und typischerweise von etwa 10 bis etwa 150 erstreckt. Ein Wirt, der ein Plasmid mit einer hohen Kopieanzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide beinhalten.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das bakterielle Genom integriert werden. Integrierende Vektoren beinhalten typischerweise mindestens eine zu dem bakteriellen Chromosom homologe Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht zu integrieren.
Integrationen scheinen aus Rekombinationen zwischen homologer DNA in dem Vektor und dem bakteriellen Chromosom zu resultieren; siehe z. B. EP Patent-Veröffentlichung Nr. 127 328.
Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker beinhalten, um die Selektion von bakteriellen Stämmen, die transformiert worden sind, zu ermöglichen. Selektierbare Marker können in dem bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene einschließen, welche Bakterien resistent gegenüber Arzneimitteln wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracycline machen (siehe Davies, Ann. Rev. Microbiol. 32:469(1978). Selektierbare Marker können auch biosynthetische Gene einschließen, wie jene in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-biosynthetischen Stoffwechselwegen.
Alternativ können einige der oben beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren vereinigt werden. Transformationsvektoren haben typischerweise einen selektierbaren Marker als Bestandteil, der entweder in einem extrachromosomalen Vektor oder in einem integrierenden Vektor, wie oben beschrieben, gehalten wird.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extra-chromosomal oder integrierend, sind für die Transformation in vielen Bakterien entwickelt worden. Beispielhaft sind die Expressionsvektoren beschrieben in Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:5582(1982), den EP-Patent-Veröffentlichungen Nr. 036 259 und 063 953 und der PCT-Patent-Veröffentlichung WO 84/04541 (für B.subtilis); in Shimatake, Nature 292:128(1981), Amann, Gene 40:183(1985), Studier; J. Mol. Biol. 189:113(1986) und den EP-Patent-Veröffentlichungen Nr. 036 776, 136 829 und 136 907 (für E. coli); in Powell, Appl. Environ. Microbiol. 54:655(1988) und US-Patent Nr. 4 745 056 (für Streptococcus).
Verfahren für das Einbringen exogener DNA in bakterielle Wirte sind im Fachbereich gut bekannt und schließen typischerweise entweder die Transformation von Bakterien, die mit CaCl₂ oder anderen Agentien, wie divalente Kationen und DMSO, behandelt werden, ein. DNA kann auch durch Elektroporation in bakterielle Zellen eingeführt werden. Beispielhafte Verfahrenstechnologien können in Masson, FEMS Microbiol. Let. 60:273(1989), Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:5582(1982), EP Patent-Veröffentlichungen Nr. 036 259 und 063 953 und PCT Patent-Veröffentlichung WO 84/04541 für Bacillus-Transformation gefunden werden. Für die Campylobacter-Transformation siehe z. B. Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856(1988) und Wang, J. Bacteriol. 172:949(1990). Für E. coli siehe z. B. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110(1973), Dower, Nuc. Acids Res. 16:6127(1988), Kushner, Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H.W. Boyer und S. Nicosia), Mandel, J. Mol. Biol. 53:159(1970) und Taketo, Biochem. Biophys. Acta 949:318(1988). Für Lactobacillus und Pseudomonas siehe z. B. Chassy, FEMS Microbiol. Let. 44:173(1987) bzw. Fiedler, Anal. Biochem. 170:38(1988). Für Streptococcus siehe z. B. Augustin, FEMS Microbiol. Let. 66:203(1990), Barany, J. Bacteriol. 144:698(1980), Harlander, Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Feretti und R. Curtiss III)(1987), Perry, Infec. Immun. 32:1295(1981), Powell, Appl. Environ. Microbiol. 54:655(1988) und Somkuti, Proc. 4. Evr. Cong. Biotechnology 1:412(1987).
III. Expression und Detektion von exprimierten MCP-1R-Proteinen
Um eine MCP-1R-Expression zu erhalten, werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten abgeleitet worden sind, unter Bedingungen inkubiert, welche die Expression der MCP-1R-Kodiersequenz (SEQ ID NR.: 1 und 3) ermöglichen. Diese Bedingungen werden abhängig von der selektierten Wirtszelle variieren. Dennoch sind die Bedingungen für den Durchschnittsfachmann im Fachbereich leicht ermittelbar, basierend auf dem, was im Fachbereich bekannt ist.
Die Detektion von einem MCP-1R-Protein, das in der transformierten Wirtszelle exprimiert wurde, kann durch mehrere Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Detektion über die enzymatische Aktivität (oder erhöhte enzymatische Aktivität oder erhöhte Langlebigkeit von enzymatischer Aktivität) erfolgen, unter Verwendung fluorogener Substrate, welche aus einer zweibasigen Spaltstelle bestehen, für welche ein MCP-1R-Protein spezifisch ist. Ein MCP-1R-Protein kann auch durch seine immunologische Reaktivität mit Anti-MCP-1R-Antikörpern detektiert werden.
IV. Identifkation von MCP-1R-Rezeptor-Antagonisten
Verschiedene Liganden von einem zellulären Rezeptor sind auf der Grundlage ihrer Kapazität, biologische Antworten zu induzieren, klassifiziert worden. Substanzen, die sowohl zum Binden an den Rezeptor als auch zum Auslösen einer Antwort im Stande sind, sind als Agonisten klassifiziert worden. Im Gegensatz dazu sind Liganden, die zum Binden an den Rezeptor im Stande sind, die aber nicht zum Auslösen einer Antwort im Stande sind, als Antagonisten klassifiziert worden. Antagonisten konkurrieren, manchmal äußerst effektiv, mit dem natürlichen Liganden oder seinen Agonisten, was zu funktioneller Rezeptor-Inaktivierung (Rezeptor-Antagonismus) führt.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten des MCP-1R-Rezeptors wird bereit gestellt. Das Verfahren kann mit einer Säugerzelllinie durchgeführt werden, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurde, der Nukleinsäuresequenzen umfasst, die die N-terminale Domäne des MCP-1-Rezeptors (siehe SEQ ID NR.: 1 und 3) kodieren. Die N-terminale Domäne des MCP-1-Rezeptors kann alleine oder in Kombination mit anderen Domänen des MCP-1-Rezeptors exprimiert werden. Die anderen Domänen können extrazelluläre, intrazelluläre oder transmembrane Domänen sein. Außerdem kann ein chimäres Protein exprimiert werden, worin die anderen Domänen die korrespondierenden Domänen von verwandten Proteinen sind, wie diejenigen in 4 (SEQ ID NR.: 5, 6, 7 und 8). Die N-terminale Domäne kann auch als ein Teil von dem nativen MCP-1-Rezeptor exprimiert werden. Die Expression von extrazellulären Domänen wird bevorzugt, falls lösliches Protein für Fest-Phasen-Assays benötigt wird.
Der Antagonist kann durch das Hinzufügen einer effektiven Menge einer organischen Verbindung zu dem Kulturmedium, das verwendet wird, um die Zellen zu vermehren, die die N-terminale Domäne vom MCP-1-Rezeptor exprimieren, identifiziert werden. Eine effektive Menge ist eine Konzentration, die ausreichend ist, um das Binden von MCP-1 an die Rezeptor-Domäne zu blockieren. Die Abnahme der Bindung von MCP-1 an den Rezeptor kann durch die Verwendung verschiedener Techniken ermittelt werden, und zwar unter Verwendung intakter Zellen oder in Fest-Phasen-Assays.
Zum Beispiel können Bindungsassays, ähnlich zu denen, die für IL-7 in dem US-Patent Nr. 5 194 375 beschrieben worden sind, verwendet werden. Dieser Typ von Assay würde das Markieren von MCP-1 und die Quantifizierung der Markierungsmittelmenge, gebunden durch MCP-1-Rezeptoren in der Anwesenheit und Abwesenheit von der getesteten Verbindung, einbeziehen. Die verwendete Markierung kann zum Beispiel eine Radiomarkierung, z. B. ¹²⁵I, oder eine fluorogene Markierung sein.
Alternativ kann ein Immunoassay eingesetzt werden, um MCP-1-Bindung an seinen Rezeptor zu detektieren, durch den Nachweis der immunologischen Reaktivität von MCP-1 mit Anti-MCP-1-Antikörpern in der Anwesenheit und Abwesenheit von der Verbindung, die getestet wird. Der Immunoassay kann zum Beispiel einen Antikörper-Sandwich-Assay oder einen Enzymgekoppelten Immunoassay involvieren. Solche Verfahren sind im Fachbereich gut bekannt und sind in Methods in Enzymology beschrieben, Bände 154 und 155 (Wu und Grossman bzw. Wu, Hrsg.), (Mayer und Walker, Hrsg.) (1987); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London).
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die den MCP-1-Rezeptor-Antagonisten umfassen, können für die Behandlung von durch monocytische Infiltrate charakterisierte Krankheiten, wie rheumatoide Arthritis und Alvcolitis, verwendet werden. Der Antagonist wird als eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die eine therapeutisch wirksame Menge des Antagonisten und ein annehmbares bzw. akzeptables Vehikel umfasst. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch pharmazeutisch akzeptable Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren und/oder andere im Fachbereich gut bekannte Materialien beinhalten. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet ein Material, das nicht mit der Effektivität der biologischen Aktivität von dem aktiven Inhaltsstoff/den aktiven Inhaltsstoffen interferiert, und das nicht toxisch für den Wirt ist, an welchen es verabreicht wird. Die Merkmale des Trägers oder des anderen Materials werden von der Verabreichungsart abhängig sein.
Die Verabreichung kann in einer Vielfalt von konventionellen Arten ausgeführt werden. Die parenterale Verabreichung wird gegenwärtig bevorzugt. In derartigen Fällen kam die Antagonist-Zusammensetzung in der Form von nicht-pyrogener, steriler, parental akzeptabler wässriger Lösung vorliegen. Das Erstellen von derartigen parenteral akzeptablen Lösungen, die bzgl. des pH-Wertes, der Isotonie, der Stabilität und dergleichen angemessen sind, ist innerhalb der Fertigkeiten im Fachbereich. Auf lange Sicht allerdings wird die orale Verabreichung vorteilhafter sein, da es erwartet wird, dass die aktiven Antagonist-Zusammensetzungen über eine lange Zeitperiode verwendet werden, um chronische Zustände zu behandeln.
Der Menge an aktivem Inhaltsstoff wird von der Schwere des Zustands, dem Weg der Verabreichung, der Aktivität des Antagonisten abhängen, und wird letztendlich von dem behandelnden Arzt entschieden werden. Es wird gegenwärtig allerdings in Betracht gezogen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 1 Milligramm pro Milliliter vom Antagonisten beinhalten sollten.
Beim Ausführen eines Behandlungsverfahrens wird eine therapeutisch effektive Menge von der Antagonist-Zusammensetzung an einen humanen Patienten verabreicht, der eine solche Behandlung aufgrund des Vorliegens eines Zustandes, der durch monocytische Infiltrate gekennzeichnet ist, benötigt. Der Begriff „therapeutisch effektive Menge" bedeutet die Gesamtmenge der aktiven Komponente von dem Verfahren oder der Zusammensetzung, die ausreicht, um einen aussagekräftigen Patientennutzen, d. h., das Heilen von chronischen Zuständen oder den Anstieg in der Heilungsrate, zu zeigen. Es wird in Betracht gezogen, dass eine therapeutisch effektive Dosis von einer Antagonisten-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung in einem Bereich von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 1 Milligramm pro Milliliter pro verabreichter Dosis liegt. Die Anzahl der verabreichten Dosen kann variieren, abhängig von dem individuellen Patienten und der Schwere des Zustands.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, welche dazu gedacht sind, die Erfindung ohne Einschränkung ihres Umfangs zu veranschaulichen.
V. Beispiele
Die Standardverfahren für die Isolation und die Manipulation von DNA wurden von Sambrook et al. (1989) übernommen. Die Plasmid-DNA wurde in den E.Coli-Stämmen HB101, D1210 oder XL-1 Blue (Stratagene) vervielfältigt. Die DNA-Sequenzierung wurde mittels der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode (Sauger, 1977) unter Verwendung von sowohl M13-Primern als auch spezifischen internen Primern durchgeführt.
Beispiel 1
PCR-Identifizierung von cDNA-Klonen
Um neue Mitglieder der Chemokin-Rezeptor-Genfamilie zu identifizieren und zu klonen, wurden entsprechend zu den konservierten Sequenzen NLAISDL (SEQ ID NR.: 11) in der zweiten und DRYLAIV (SEQ ID NR.: 12) in der dritten transmembranen Domäne des MIP-1α/RANTES-Rezeptors, der IL-8 Rezeptoren und des HUMSTSR Orphan-Rezeptors (GenBank Zugangs #M99293) degenerierte Oligonukleotid-Primer entworfen und synthetisiert. Die Amplifizierung von aus MM6 Zellen gewonnener cDNA mit den Primern ergab eine Anzahl von PCR-Produkten, die in der Größe jenen entsprachen, die für einen Sieben-Transmembran-Rezeptor erwartet wurden. Die Analyse der subklonierten PCR-Produkte enthüllte sowohl cDNAs, welche die vorhergesagten Fragmente der Rezeptoren, von denen aus die Primer entworfen wurden, kodierten, als auch eine cDNA, die augenscheinlich ein neues Protein kodierte. Um eine Voll-Längen-Version dieses Klons zu erhalten, wurde eine MM6-cDNA-Bibliothek in pFROG angelegt und durch Hybridisierung mit dem PCR Produkt untersucht. Ein 2,1 kb großer cDNA Klon wurde erhalten. Die Analyse von zusätzlichen Klonen in der MM6-cDNA-Bibliothek enthüllte eine zweite Sequenz, die identisch mit der 2,1-kb-cDNA-Sequenz war, die zuerst von der nicht-translatierten 5'-Region bis hin zur mutmaßlichen siebten transmembranen Domäne erhalten wurde, die aber einen zytoplasmatischen Schwanz enthielt, der sich von dem der zuerst erhalte nen 2,1-kb-cDNA-Sequenz unterschied. Für zwei voneinander unabhängige Klone in der Bibliothek wurde festgestellt, dass sie die zweite Sequenz enthielten, was anscheinend ein alternatives Spleißen des Carboxyl-Terminus-Schwanzes des MCP-1R Proteins darstellt. Die zwei Sequenzen werden als MCP-1RA und MCP-1RB, die Monozyten-Chemoattraktives-Protein-1-Rezeptoren A und B, bezeichnet, was für die erste bzw. die zweite isolierte Sequenz (SEQ ID NR.: 1, 2, 3 und 4) steht. Die Details der verwendeten Materialien und Methoden folgen.
1. Oligonukleotid-Synthese
Oligonukleotid-Adapter, -Sonden und Primer wurden gemäß Herstellerangaben mit einem Applied Biosystems (Foster City, CA) -Instrument gemäß Herstellerangaben synthetisiert. Die degenerierten Oligonukleotid-Primer, die den wie oben beschriebenen konservierten Sequenzen in der zweiten und dritten transmembranen Domäne entsprachen und die EcoRI- und XhoI-Restriktionsstellen in ihren 5'-Enden eingebunden haben, die benutzt wurden, um MCP-1R zu identifizieren, waren ein 27-mer, 5' CGC TCG AGA CCT (G oder A)(G oder T)C (C oder A)(A, T oder G)T (T oder G)(T oder G)C (T oder C)GA CCT 3' (SEQ ID NR.: 9) und ein 31-mer 5' GC GAA TTC TGG AC(G oder A) ATG GCC AGG TA(C, A oder G) C(T oder G)G TC 3' (SEQ ID NR.: 10).
2. Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)
MM6-Zellen, welche aus einer menschlichen monozytischen Leukämie (siehe Weber, Eur. J. Immunol. 23:852-59(1993)) abgeleitet sind, wurden bezogen von der DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, MascheroderWeg 1b, 3300 Braunschweig, Deutschland. Die Zellen wurden in RPMI-1640 (GIBCO BRL, Grand Island, N.Y.) gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum, 25mM Hepes und Antibiotika ergänzt wurde. Die Gesamt-RNA wurde aus den MM6-Zellen nach der Methode von Chomczynski und Sacchi isoliert; siehe Chomczynski, Anal. Biochem. 162: 156-59(1987). Poly A⁺-RNA wurde mittels Affinitätschromatographie auf Oligo dT-Cellulose-Säulen (Pharmacia, Piscataway, N.J.) erhalten. Die Erststrang-cDNA-Synthese wurde beginnend mit 5 μg MM6 Poly A⁺-RNA gemäß den Herstellerangaben (Pharmacia) durchgeführt.
PCR-Reaktionen wurden über 30 Zyklen ausgeführt, beginnend mit einer 1-minütigen Inkubation bei 94°C, 2 Minuten bei 50°C, 1,5 Minuten bei 72°C und einem finalen Verlängerungsschritt bei 72°C während 4 Minuten unter Verwendung der oben beschriebenen PCR-Primer (SEQ ID NR.: 9 und 10) bei einer endgültigen Konzentration von 1 μM und MM6-cDNA von etwa 10 ng/ml. PCR-Produkte, die zwischen 200–300 Basenpaaren auf einem 1,5% Agarose-Gel migrierten, wurden ausgeschnitten, in pBluescript (sk^–) subkloniert und unter Verwendung von fluoreszierend markierten Dideoxyribonukleotiden sequenziert, wie beschrieben von Sanger, Proc. Natl Acad SciUSA 74: 5463-67(1977). Die Sequenzanalyse entdeckte cDNAs, welche die vorhergesagten Fragmente der Rezeptoren, anhand welcher die Primer entworfen wurden, kodierten, und eine cDNA, die augenscheinlich ein neues Protein kodierte. Um eine Voll-Längen-Version dieses Klons zu erhalten, wurde eine geeignete Zell-Linie ausgewählt, und eine cDNA Bibliothek wurde in pFROG angelegt und mit diesem PCR-Produkt als Sonde untersucht, wie unten ausführlich in den Unterabschnitten 3 und 4 beschrieben.
3. Identifikation der MM6-Zell-Linie
Weil Monozyten schwierig in brauchbarer Menge zu isolieren sind und weniger als 2000 MCP-1-Bindungsstellen mit hoher Affinität pro Zelle exprimieren, musste eine kultivierte Zell-Linie identifiziert werden, die gut auf MCP-1 ansprach. Unter Verwendung des Calcium-Ausfluß-Assays, wie beschrieben in Vu, Cell 64: 1057-68(1991), wurden MCP-1-induzierte Calcium-Flüsse in verschiedenen Zell-Linien gemessen. Kein Calcium-Fluss wurde in undifferenzierten menschlichen HL-60-Zellen und in menschlichen Erythroleukämie- (HEL) Zellen festgestellt. Dagegen wurde ein dosis-abhängiger Calcium-Fluss in MM6-Zellen festgestellt, mit halbmaximaler Stimulation bei 4nM MCP-1. Das Ansprechen von MM6-Zellen auf MCP-1 konnte nicht durch vorherige Exposition an RANTES abgemindert werden, wohingegen das Ansprechen auf RANTES durch vorherige Exposition mit MCP-1 teilweise blockiert wurde. Ähnliche Resultate wurden erhalten, wenn MIP-1α anstelle von RANTES verwendet wurde.
4. Expressions-Klonierung des MCP-1-Rezeptors
Die allgemeine Strategie für die Klonierung des MCP-1-Rezeptors war es, MCP-1-Ansprechvermögen auf Xenopus-Oozyten zu übertragen, denen RNA, die den Rezeptor kodiert, mikroinjiziert wurde. Diese Verfahrenstechnologie wurde erfolgreich eingesetzt, um die 5-HT-, Thrombin-, IL8RA- und MIP-1α/RANTES-Rezeptoren zu klonieren. Oozyten wurden aus trächtigen Fröschen geerntet und mit Collagenase behandelt, um die follikulären Zellen zu entfernen. Die cDNA-Bibliothek wurde in bakterielle Wirtszellen elektroporiert, welche dann in Pools von 5 000 bis 50 000 Kolonien/Petrischale unterteilt wurden. Die DNA wurde von jedem Pool von Bakterien aufbereitet und linearisiert. Ein Tag nach dem Ernten wurde den Oozyten mit Poly A⁺-RNA oder cRNA mikroinjiziert, transkribiert von den linearisierten cDNAs, und für zwei Tage inkubiert, um die Proteinexpression zu ermöglichen. Am Tag des Experiments wurden die Oozy ten mit ⁴⁵Ca geladen, gewaschen, um ungebundenes ⁴⁵Ca zu entfernen und dann mit potentiellen Liganden inkubiert. In Anwesenheit des geeigneten Liganden wurde ein signifikanter Abfluss von ⁴⁵Ca festgestellt. Nicht injizierte Oozyten wurden als Kontrollen benutzt. Ein Minimum von 1 000 000 Kolonien wurde gescreent (d. h. 20 bis 200 Pools), und wenn ein positiver Pool gefunden wurde, wurde dieser in kleinere Pools unterteilt (in 2er-Schritten), welche dann individuell überprüft wurden. Das Verfahren wird wiederholt, bis ein einzelner Klon erhalten wird.
Als ein Auftakt, um diesen sehr arbeitsintensiven Ansatz auszuführen, wurde Poly A⁺-RNA von groß angelegten Präparationen von THP-1- und MM6-Zellen in Oozyten injiziert, versagte aber darin, eine MCP-1-abhängige Signalgebung zu übertragen. Außerdem wurden größere mRNA-Arten durch Größenfraktionierung von 200–300 μg Poly A⁺-THP-1- und -MM6-RNA auf Zuckergradienten angereichert, bevor individuelle Fraktionen in die Oozyten injiziert wurden. Nochmals wurde eine MCP-1-abhängige Signalgebung in Oozyten nicht nachgewiesen. Zusätzlich scheiterte die Injektion einer begrenzten Anzahl von cRNAs, die von Bibliothekspools transkribiert wurden, auch, eine Signalgebung zu übertragen. Diese Experimente wiesen darauf hin, dass die MCP-1-Rezeptor-Boten-RNA höchstwahrscheinlich ein geringes Häufigkeitsvorkommen aufweist und in einer Poolgröße, die groß genug war, um Expressions-Klonierung mittels 2-Schritt-Ausverdünnungs-Selektion ausführbar zu machen nicht nachweisbar war. Aus diesem Grund wurde die Polymerase-Kettenreaktion- (PCR) basierte Strategie verfolgt.
5. Konstruktion und Screening der MM6-cDNA-Bibliothek
Eine cDNA-Bibliothek wurde in dem Vektor pFROG angelegt, einer modifizierten Version von pCDM6, die annähernd 100 Basen der 5'-nicht translatierten Xenopus-Globin-Sequenz und genau 3' des SP6-Promoters einschließt, wie beschrieben von Vu, Cell 64:1057-68 (1991).
Nachdem die Erststrang- und Zweitstrang-Synthese von der MM6-Poly A^–-RNA durchgeführt worden waren (siehe oben Unterabschnitt 2), wurde die cDNA von 2 kb oder größer durch Agarose-Gel-Elektrophorese Größen-selektioniert. BstXI-Linker wurden hinzugefügt für die Einbringung in den pFROG-Vektor. Nach der Ligation wurde pFROG in kompetente MC1061p3-Zellen elektroporiert. Insgesamt 1 000 000 Kolonien wurden durch Hybridisierung unter Bedingungen von hoher Stringenz (50% Foramid, 6x SSC, 0,1% SDS, 42°C, 16 Std.) gescreent, wie beschrieben in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989), unter Verwendung des neuen PCR-Produkts, das isoliert wurde wie oben in Unterabschnitt 2 beschrieben. Positive wurden sequenziert unter Verwendung von fluoreszierend markierten Dideoxyribonukleotiden, wie beschrieben von Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463(1977). Zwei cDNA-Klone, die die A-Form des Rezeptors enthielten, und zwei Klone, die die B-Form enthielten, wurden isoliert.
Beispiel 2
Von der cDNA-Sequenz abgeleitete Struktur von MCP-1R
Die vollständige Sequenz von MCP-1RA-cDNA (SEQ ID NR.: 1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 2) werden in 1 gezeigt. Die kodierte Proteinsequenz wird unter der der cDNA-Sequenz gezeigt. Die cDNA-Sequenz (SEQ ID NR.: 3) und die kodierte Aminosäurensequenz (SEQ ID NR.: 4) von MCP-1RB werden in 2 gezeigt. Die konventionelle Nummerierung wird verwendet.
Die Translation von beiden MCP-1R-DNAs wird höchstwahrscheinlich am ATG-Start-Kodon initiiert. Dies ist das einzige In-Frame-MET-Kodon in der 5'-Region der cDNA. Folgend auf das initiierende Methionin (MET) ist ein offener Leserahmen, der ein Protein von 374 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 42 000 Daltons kodiert. Durch den direkten Vergleich mit den bekannten transmembranen Domänen für den MIP-1α/RANTES-Rezeptor, den Orphan-Rezeptor HUMSTSR und die IL-8-Rezeptoren 8RA und 8RB wurde ein extrazellulärer Amino-Terminus von 48 Resten enthüllt. Die transmembranen Domänen sind höchstwahrscheinlich an den Aminosäuren 49 bis 70, 80 bis 700, 115 bis 136, 154 bis 178, 204 bis 231, 244 bis 268 und 295 bis 313 lokalisiert. Sie sind angedeutet in 4 durch die horizontalen Linien über den Sequenz-Gruppierungen (SEQ ID NR.: 2, 5, 6, 7 und 8). Der Carboxyl-Schwanz von 61 Aminosäuren beginnt mit Serin an Position 314 (siehe 4).
Die MCP-1RB-cDNA kodier eine Aminosäuresequenz, die identisch ist mit der von MCP-1RA von dem MET an Position 1 bis zu dem Arginin an Position 313 und 30 nichttranslatierte Nukleotide unmittelbar 5' von dem initiierenden MET einschließt (siehe 2). Die mutmaßliche Aminosäuren-sequenz von MCP-1RB (SEQ ID NR.: 4) jedoch enthüllt einen völlig unterschiedlichen zytoplasmatischen Schwanz als den 61 Aminosäuren aufweisenden zytoplasmatischen Schwanz von MCP-1RA (SEQ ID NR.: 2). MCP-1RB hat einen zytoplasmatischen Schwanz von 47 Aminosäuren beginnend mit Arginin an der Aminosäureposition 314 und endend mit Leucin an Position 360. Dass alternatives Spleißen an Position 313 stattfand, kann von der Sequenz-Identität der beiden Klone einschließlich der 5'-untranslatierten Sequenz abgeleitet werden, und von der charakteristischen AG-Sequenz, die an der mutmaßlichen Donor-Verbindungsstelle zwischen den Aminosäure-Positionen 313–314 lokalisiert ist. Zusätzlich hybridisierte eine cDNA, die sowohl der A- als auch der B-Form von MCP-1R gemeinsam ist, an einer einzigen Bande auf Southern-Blots von menschlicher genomischer DNA unter hoch stringenten Bedingungen, und ein cDNA-Klon aus der MM6-Bibliothek wurde erhalten, der im Tandem beide Carboxyl-terminalen zytoplasmatischen Schwänze enthielt, die in MCP-1RA und -1RB festgestellt wurden, was auf eine Ableitung von unvollständig prozessierter RNA hindeutet. Der MCP-1-Rezeptor MCP-1R ist erst das zweite bekannte Beispiel von alternativem Spleißen der Carboxyl-Schwänze von Rezeptoren in der Sieben-Transmembran-Rezeptor-Familie. Namba, Nature 365: 166-70(1993) hat berichtet, dass der Prostaglandin-(PG)E2-Rezeptor vier alternativ gespleißte Carboxyl-terminale Schwänze mit geringer Sequenz-Homologie zwischen den vieren aufweist. Von den verwandten MIP-1α/RANTES- und IL-8-Rezeptoren wird angenommen, dass sie ohne Introns vorliegen; siehe Holmes, Science 253: 1278-80(1991); Murphy, Science 253: 1280-83(1991) und Neote, Cell 72: 415-25(1993). Der Abgleich der zytoplasmatischen Schwänze von MCP-1RA und -1RB mit anderen Chemokin-Rezeptoren enthüllte, dass einer der Rezeptoren, MCP-1RB, homolog zu der entsprechenden Region in dem MIP-1α/RANTES-Rezeptor war. Der Carboxyl-Schwanz von MCP-1RA brachte keine signifikante Gleichheit mit anderen bekannten Proteinen hervor.
Northern-Blots von hämatopoetischen Zell-Linien wurden durchgeführt, wie beschrieben in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989), und für jeden der MCP-1R-Klone sondiert, was enthüllte, dass beide mRNA-Arten als eine einzige 3,5-kb-Bande migrierten; siehe 3. Beide mRNAs wurden in annähernd gleichen Spiegeln in den auf MCP-1 ansprechenden Zell-Linien MM6 und in THP-1-Zellen exprimiert. Keine wurde in den nicht-reagierenden Zell-Linien HEL und HL-60 exprimiert. Eine Expression von jeder der mRNAs wurde auch in frisch isolierten menschlichen Monozyten durch Reverse-Transkriptions-PCR nachgewiesen.
Beispiel 3
Ähnlichkeit von MCP-1RA und -1RB mit anderen siebengliedrigen Transmembran-Rezeptoren
Der Vergleich der Sequenzen von MCP-1RA (SEQ ID NR.: 2) mit den IL-8-Rezeptoren RA und RB, dem MIP-1α/RANTES-Rezeptor und dem Orphan-Rezeptor HUMSTSR (SEQ ID NR: 7, 8, 5 bzw. 6) ist in 4 dargestellt. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des neuen MCP-1A-Rezeptors mit anderen Sieben-Transmembran-Proteinen enthüllte, dass er am engsten mit dem MIP-1α/RANTES-Rezeptor verwandt ist, mit 51% Übereinstimmung auf der Aminosäure-Ebene. Die IL-8-Rezeptoren RA und RB wiesen 30% Übereinstimmung auf der Aminosäure-Ebene auf, und der HUMSTSR Orphan-Rezeptor wies 31% Übereinstimmung auf der A minosäure-Ebene auf. Eine Analyse enthüllte, dass der MCP-1-Rezeptor von dem verwandten MIP-1α/RANTES-Rezeptor und den IL-8-Rezeptoren in seinen Amino-terminalen und Carboxyl-terminalen Domänen abwich. Eine auffallende Identität zwischen dem MCP-1A-Rezeptor und dem MIP-1α/RANTES-Rezeptor wird gefunden in der Sequenz IFFIILLTI DRYLAIV HAVFAL (K/R) ARTVTFGV (SEQ ID NR.: 13 und 14), welche am Ende der dritten transmembranen Domäne auftritt (siehe 4). Die entsprechende Region von Rhodopsin ist dafür bekannt, an der G-Protein-Bindung teilzunehmen (Franke et al., Science 250: 123 (1990)), was darauf hinweist, dass diese Domäne Aspekte der G-Protein-Aktivierung vermitteln kann, die Rezeptoren für C-C-Chemokine gemeinsam sind.
Beispiel 4
Bestätigung der Rezeptor-Aktivität
Der Calcium-Ausfluss-Assay wurde durchgeführt, um die Expression von funktionsfähigem MCP-1R-Protein zu bestätigen und um zu entscheiden, ob die MCP-1-Rezeptoren A und B Ansprechvermögen auf MCP-1 oder andere Chemokine übertrugen. In diesem Assay wurde MCP-1RA- und -1RB-cRNA in Xenopus-Oozyten mikroinjiziert und Rezeptor-Signalgebungs-Aktivitäten wurden durch die Ermittlung von Agonist-induzierter Calcium-Mobilisierung gemessen. Die Signalgebungs-Aktivität des MIP-1α/RANTES-Rezeptors und des IL-8-Rezeptors RA wurden parallel untersucht.
Wie beschrieben in Vu, Cell 64: 1057-68(1991), wurde die cRNA durch SP6-RNA-Polymerase-Transkription von einem NotI-linearisierten Vektor präpariert und auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, um eine einzelne Bande der erwarteten Größe zu bestätigen. Einen Tag nach dem Ernten wurde den Oozyten 20 ng cRNA in einem Gesamtvolumen von 50 nl pro Oozyte injiziert. Nach der Inkubation in modifiziertem Barth's Puffer während 2 Tagen bei 16°C wurden die Oozyten mit ⁴⁵Ca (50 μCi/ml, Amersham, Arlington Heights, Virginia) während 3 Stunden beladen, während einer Stunde gewaschen und in die Mulden einer 24-Mulden-Schale in Gruppen von sieben gegeben; in einem Volumen von 0,5 ml wurde der ⁴⁵Ca-Ausfluss durch das Sammeln der Medien in 10-Minuten-Intervallen und das Zählen von Beta-Emissionen in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler bestimmt. Nachdem eine stabile Grundlinie erreicht war, wurden die Cytokin-Agonisten MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 und MCP-1 in dem Barth's-Medium zu den Oozyten während 10 Minuten hinzugefügt. Nicht injizierte Oozyten wurden als Kontrollen verwendet. Die Cytokine, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 und MCP-1 wurden von R&D Inc., Minneapolis, Minnesota, erhalten. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt.
Sowohl MCP-1RA als auch -1RB verliehen robustes und außergewöhnlich spezifisches Ansprechen auf nanomolekulare Konzentrationen von MCP-1. Keine Antwort wurde durch die Chemokine MIP-1α, MIP-1β, RANTES oder IL-8 ausgelöst, sogar wenn diese Liganden zu 500 nM vorhanden waren. Im Gegensatz dazu signalisierte der MIP-1α/RANTES-Rezeptor als Antwort auf MIP-1α und RANTES, aber nicht auf MCP-1, was konsistent ist mit veröffentlichten Ergebnissen. Der EC₅₀-Wert für MCP-1 war 15 nM.
Beispiel 5
MCP-1R-Liganden-Spezifität und -Signaltransduktion
A. Liganden-Spezifität
Eine Zell-Linie, die einen MCP-1R-Rezeptor stabil exprimierte, wurde durch die Transfektion von MCP-1RB-cDNA in HEK-293-Zellen produziert.
Menschliche Embryo-Nieren (HEK)-293 (CRL 1573)-Zellen wurden von der Amerikanischen Typen-Kultur-Sammlung (Bethesda, MD) erhalten und wurden in Minimal-Essentiellem-Medium mit Earle's ausgewogener Salzlösung (MEM-EBSS; GIBCO/BRL, Grand Island, N. Y.), das mit 10% fötalem Kälberserum ("FCS") (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) und 1% Penicillin/Streptomycin ergänzt wurde, bei 37°C in einer befeuchteten 5%-igen CO₂-Atmosphäre gezüchtet. cDNAs für den MCP-1-Rezeptor, MCP-1RB und den MIP-1α/RANTES-Rezeptor wurden in den Polylinker des Säugetier-Zell-Expressions-Vektors pcDNA3 (Invitrogen Inc., San Diego, CA) kloniert und in 293-Zellen (50–80% konfluent) mit einer DNA/Lipofectamin (GIB-CO/BRL)-Mischung gemäß Herstellerangaben transfiziert. Nach Selektion während 2–3 Wochen in der Gegenwart von G418 (0.8 mg/ml) (GIBCO/BRL) wurden Kolonien gepickt, und stabile Zell-Linien wurden durch Northern-Blot-Analyse auf Rezeptor-Expression gescreent. Im Allgemeinen gab es eine starke Korrelation zwischen dem Spiegel der Rezeptor-Expression, wie beurteilt durch Northern-Blot-Analyse, und der Stärke der Rezeptor-Signale, die in den untenstehend beschriebenen funktionalen Assays erhalten wurden. Transfizierte Zellen, die versagten, den Rezeptor auf Northern-Blots zu exprimieren, wurden als negative Kontrollen in den Bindungs- und Signalgebungs-Experimenten verwendet.
Gleichgewichts-Bindungsassays wurden dann unter Verwendung der Methode von Ernst, J. Immunol. 152: 3541-49 (1994) durchgeführt. Unterschiedliche Mengen von ¹²⁵I-markiertem MCP- 1 (Dupont-NEN, Boston, MA) wurden inkubiert mit 6 × 10⁶ MCP-1RB exprimierenden HEK-293-Zellen, die in Bindungs-Puffer (50 mM Hepes, pH 7,2, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% BSA (Rinder-Serum-Albumin, Fraktion V, Sigma)) in Gegenwart oder in Abwesenheit von 100-fachem Überschuss der nicht markierten C-C-Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES und des C-X-C-Chemokins IL-8 (Chemokine wurden erhalten von R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) resuspendiert wurden. Konkurrenz-Experimente wurden durchgeführt unter Verwendung von 500 pM ¹²⁵I-markiertem MCP-1 und den Konzentrationen von nicht markierten Chemokinen, wie angezeigt in 7.
Gleichgewichts-Bindungs-Daten wurden analysiert gemäß der Methode von Scatchard unter Verwendung des Programms „LIGAND" (Biosoft, Ferguson, MO) auf einem Macintosh-Computer; siehe Munson, Anal. Biochem. 107: 220-39 (1980). Die eng verwandten C-C-Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES wie auch das C-X-C-Chemokin IL-8 konkurrierten nicht um Bindung. Auch wurde keine spezifische Bindung in Transfektanten nachgewiesen, die wenig oder kein MCP-1RB auf Northern-Blots exprimierten. Die Analyse der Gleichgewichts-Bindungs-Daten, gezeigt in 7, deutet auf eine Dissoziationskonstante (K_d) von 260 pM (7B) hin. Diese K_d ist in guter Übereinstimmung mit derjenigen, die für die Bindung von MCP-1 an Monozyten (Yoshimura, J. Iminunol. 145:292-97 (1990); Zhang, J. Biol. Chem. 269: 15918-24 (1994)) und THP-1-Zellen (Van Riper, J. Exp. Med. 177:851-56 (1933) berichtet wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass ¹²⁵I-MCP-1 spezifisch und mit hoher Affinität an den in 293-Zellen exprimierten MCP-IRB-Rezeptor band.
B. Signal-Transduktion
Die Calcium-Mobilisierung in 293-Zellen wurde dann untersucht. Transfizierte HEK-293-Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, kurz trypsinisiert, gewaschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 1 mg/ml BSA (PBS-BSA) enthielt, und in serumfreiem MEM-EBSS, ergänzt mit 1 mg/ml BSA und 10 mM HEPES (pH 7,0) bei einer Dichte von 2 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden im Dunklen bei 37°C während 20 Minuten in Anwesenheit von 5–10 μg/ml Indo-1-AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) inkubiert. Neun Volumina von PGS-BSA wurden hinzugefügt, und die Zellen wurden während zusätzlicher 10 Minuten bei 37°C inkubiert, durch Zentrifugieren pelletiert und zweimal mit 50 ml der PBS-BSA-Lösung gewaschen. Gewaschene, indo-1-beladene Zellen wurden dann in Hank's ausgewogener Salzlösung (1,3 mM Ca²⁺), ergänzt mit 1 mg/ml BSA (HBS-BSA) bei einer Dichte von ungefähr 0,5 × 10⁶ Zellen/ml bei Raumtemperatur resuspendiert. Um intrazelluläres Calcium ([Ca²⁺]_i) zu messen, wurden 0,5 ml der Zell-Suspension in einer Quartz-Küvette in einem Hitachi F-2000-Fluoreszenz-Spektrophotometer platziert. In HBS-BSA gelöste Chemokine (MCP-1, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, Gro-α und IL-8) wurden direkt in die Küvette in 5 μl-Volumina injiziert. Intrazelluläres Calcium wurde durch Anregung bei 350 nm und Fluoreszenz-Emissions-Detektion bei den Wellenlängen 490 nm (F1) und 410 nm (F2) gemessen. Das [Ca²⁺]_i wurde bewertet durch Vergleichen des 490/410 Fluoreszenz-Verhältnisses nach Agonist-Anwendung (R) mit den des Kalibrierungs-Verhältnissen am Ende jedes Durchgangs, gemäß der Gleichung: [Ca2+]i = Kd × [(R – Rmin)/(Rmax – R)] × (Sf2/Sb2)worin R_max und R_min das Fluoreszenz-Verhältnis unter sättigenden (1,3 mM Ca²⁺) und nominal freien (10 mM EGTA, Sigma Chemical Co.) Calcium-Bedingungen darstellen, K_d die Dissoziationskonstante von Calcium für indo-1 ist, R das Fluoreszenz-Verhältnis ist, und Sf2/Sb2 das Fluoreszenz-Verhältnis von freiem und gebundenem indo-1-Farbstoff bei 410 nm ist; siehe Thomas, AP und Delaville, F (1991) in Cellular Calcium, a Practical Approach, Oxford Univ. Press, Seiten 1–54.
Um Calcium-Antworten zu quantifizieren, wurden MCP-1-Dosis-Ansprech-Kurven in jedem Experiment erzeugt, und die Resultate wurden als Prozentsatz des maximalen Calcium-Signals (bei 300 nM MCP-1), gemessen in diesem Experiment, ausgedrückt. Die Veränderungen von [Ca²⁺]_i-Spiegeln als Antwort auf jede Agonisten-Konzentration wurden bestimmt durch Subtraktion der Grundlinie von den Spitzen-[Ca²⁺]_i-Spiegeln, die festgestellt wurden, indem 5 Sekunden lang Datenwerte vor der Agonist-Zugabe gemittelt wurden, beziehungsweise in der Umgebung der Spitzenantwort. In Experimenten, die zur Bestimmung der Rolle von extrazellulärem Calcium ausgeführt wurden, wurden 3 mM EGTA 60–90 Sekunden vor MCP-1 hinzugefügt. Die anschließende Lyse der Zellen mit Triton X-100 (Sigma) verursachte keine Veränderung der Indo-1-Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass EGTA die extrazelluläre Calcium-Konzentration unter die der intrazellulären Grundniveaus (ungefähr 70–100 nM) verringert hat. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
MCP-1 stimulierte robuste Calcium-Mobilisierung in den stabil transfizierten MCP-1RB/293-Zellen in einer spezifischen und dosisabhängigen Weise. Kleine, aber reproduzierbare Signale wurden mit so wenig wie 100 pM MCP-1 beobachtet, und der durchschnittliche EC₅₀-Wert von vier vollständigen Dosis-Ansprech-Kurven auf MCP-1 lag bei 3,4 nM (2,7–4,4 nM; 8, 8A und 8B).
Der MCP-IRB-Rezeptor wurde selektiv durch MCP-1 aktiviert. RANTES, MIP-1α, MIP-1β, Gro-α und IL-8 versagten darin, signifikante Calcium-Signale in diesen selben Zellen zu stimulieren, sogar, wenn sie in hohen Konzentrationen (8B) präsent waren. Außerdem versagten diese Chemokine darin, die Stimulation der Zellen durch MCP-1 zu blockieren, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich nicht als endogene Antagonisten des MCP-IRB-Rezeptors agieren. Die MCP-1-abhängigen intrazellulären Calcium-Flüsse waren charakterisiert durch kurze Verzögerungszeiten, gefolgt von einem schnellen Anstieg von [Ca²⁺]_i, der innerhalb von 80–90 Sekunden nach der Zugabe von MCP-1 (8A) nahezu zu Ausgangsniveaus zurückging. Die Zellen zeigten homologe Desensibilisierung, da sie unempfänglich für eine Aktivierung durch eine zweite Anregung mit MCP-1 (8C) waren.
Um die Quelle des intrazellulären Calcium-Flusses zu bestimmen, wurden die MCP-1RB/293-Zellen mit MCP-1 in Anwesenheit oder Abwesenheit von extrazellulärem Calcium angeregt. Der Anstieg in zytoplasmatischem Calcium war größtenteils unverändert infolge der Chelatisierung von extrazellulärem Calcium mit 3 mM EGTA. Ähnliche Resultate wurden beobachtet, wenn die Zellen gewaschen und in Calcium-freien PBS, ergänzt mit 1 mM EGTA resuspendiert wurden, oder wenn 5 mM Ni²⁺ zu der Küvette hinzugefügt wurden, um den Zufluss von extrazellulärem Calcium zu blockieren; Sozani, J. Immunol. 147:2215-21 (1991); Saga, J. Biol. Chem. 262: 16364-69 (1987). Der Abfall in cytoplasmatischem Calcium auf die Grundlinie war etwas verlängert in der Anwesenheit von extrazellulärem Calcium, darauf hindeutend, dass Calcium-Zufluss dazu beitragen könnte, die Antwort auf MCP-1 aufrecht zu erhalten, nachdem intrazelluläre Speicher erschöpft sind. Diese Daten deuten darauf hin, dass das primäre Mittel der Calcium-Mobilisierung in diesen transfizierten 293-Zellen die Freisetzung von intrazellulärem Calcium ist.
Inositol (1,4,5)-Triphosphat (IP₃) mobilisiert intrazelluläres Calcium in Antwort auf Aktivierung eines breiten Spektrums von Rezeptoren, einschließlich vieler Sieben-Transmembran-Domänen-Rezeptoren; Hung, J. Cell. Biol. 116:827-32 (1992); Putney, Trends Endocrinol. Metab. 5: 256-60 (1994). Um diese Mobilisierung zu untersuchen, wurde die gesamte Inositolphosphat-Akkumulation bestimmt, wie beschrieben in Hung, J. Cell. Biol. 116:827-32 (1992). HEK-293-Zellen wurden in 24-Mulden-Gewebekultur-Schalen bis zur Konfluenz gezüchtet, und über Nacht mit 2 μCi/ml [³H]myo-inositol (23 Ci/mmol) (New England Nuclear, Boston, MA) in Inositol-freiem MEM-EBSS, ergänzt mit 10% dialysiertem FCS, markiert. Auf das Markieren folgend, wurden die Medien entfernt, und die Zellen wurden bei Raumtemperatur während 5–10 Minuten in 0,5 ml serumfreiem MEM-EBSS-Medium, ergänzt mit 10 mM HEPES, 1 mg/ml BSA, und 10 mM LiCl, inkubiert. Die gewaschenen Zellen wurden dann mit den Chemokinen MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 und Gro-α während 1–30 Minuten bei Raumtemperatur in der Anwesenheit von mM LiCl inkubiert. Die Inkubation wurde durch das Entfernen des Inkubationsmediums und Hinzufügen von 1 ml eiskalter 20 mM Ameisensäure beendet. Die Platten wurden bei 4°C für 30 Minuten inkubiert, bevor die Uberstände auf 1-ml Dowex AGl-X8 (100–200 mesh, Formiat-Form, von Sigma) Chromatographie-Säulen gegeben wurden. Die Säulen wurden mit 8 ml Wasser gewaschen, gefolgt von 5 ml 40 mM Natriumformiat. Gesamt-[³H]-Inositolphosphate wurden mit 5 ml 2 M Ammoniumformat/0,1 M Ameisensäure eluiert und durch Flüssigkeits-Szintillations-Spektroskopie quantifiziert. Die Aktivierung des MCP-1-Rezeptors in transfizierten 293-Zellen induzierte wenig oder keine Hydrolyse von Phosphatidyl-Inositol. In Kontrollexperimenten führte die Aktivierung des Muskarin-(Lameh, J. Biol. Chem. 267: 13406-412 (1992)) oder des Oxytocin-Rezeptors, Kimura, Nature 356:526-29 (1992), kotransfiziert in die selben 293-Zellen, zu einem 5- bis 9-fachen Anstieg im PI-Umsatz.
Um die Hemmung von Adenylyl-Zyklase-Aktivität zu untersuchen, wurden HEK-293-Zellen, die stabil mit dem MCP-IRB-Rezeptor und dem MIP-1α/RANTES-Rezeptor transfiziert waren, in 24-Mulden-Gewebekultur-Schalen bis zur Konfluenz gezüchtet und über Nacht mit 2 μCi/ml [³H]-Adenin (25–30 Ci/mmol) (New England Nuclear, Boston, MA) in MEM-EBSS, ergänzt mit 10% FCS, markiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Inkubation bei Raumtemperatur mit 0,5 ml serumfreiem MEM-EBSS-Medium, ergänzt mit 10 mM HEPES, 1 mg/ml BSA, und 1 mM IBMX (3-Isobutyl-1-Methylxanthin), während 5 Minuten gewaschen. Nach der Entfernung des Waschmediums wurden die Zellen durch Zugabe von frischem Medium stimuliert, das entweder Chemokin (MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 and Gro-α) allein, Forskolin allein (10 μM, Sigma Chemical, St. Louis, MO), oder Ckemokine plus Forskolin enthielt, alles in der Anwesenheit von 1 mM IBMX, während 20 Minuten bei Raumtemperatur. Die Inkubation wurde durch das Ersetzen des Mediums durch 1 ml eiskalte 5%-ige TCA (Trichloressigsäure), 1mM cAMP, und 1mM ATP (Sigma) beendet. Auf die Inkubation bei 4°C während 30 Minuten folgend wurden die markierten [³H]ATP- und [3H]cAMP-Pools getrennt und durch Chromatographie auf Dowex 50W (200–400 mesh, Wasserstoff-Form, von Sigma) und neutrale Aluminiumoxid-Säulen (auch von Sigma), wie beschrieben in Hung, J. Biol. Chem. 267: 20831-34 (1992) und Wong, Nature 351: 63–65 (1991) quantifiziert. Der 1 ml Säureüberstand wurde auf eine 1-ml Dowex 50W-Säule geladen, und der ATP-Pool wurde mit 3 ml H₂O eluiert. Die Dowex SOW-Säulen wurden dann über 1-ml Aluminiumoxid -Säulen platziert, und 10 ml H₂O wur den zum Dowex Harz hinzugegeben, und der Eluent wurde direkt auf das neutrale Aluminiumoxid tropfen gelassen. Der cAMP-Pool wurde dann direkt von den Aluminiumoxiden mit 5 ml 0,1 M Imidazol/0,01 mM Natriumazid eluiert. Die [³H]ATP- und [³H]cAMP-Fraktionen wurden mittels Flüssigkeits-Szintillations-Spektroskopie gezählt. Der cAMP-Pool für jede Probe wurde auf seinen eigenen ATP-Pool normalisiert und ausgedrückt als ein Verhältnis durch die Gleichung (cAMP cpm/ATP cpm) × 100. In jedem Experiment wurden vollständige Dosis-Ansprech-Kurven erzeugt und als ein Prozentsatz der Forskolin-Kontrolle ausgedrückt.
Aktivierung des MCP-1-Rezeptors resultierte in einer starken und dosis-abhängigen Hemmung von Adenylyl-Zyklase-Aktivität. MCP-1 reduzierte die basale cAMP-Akkumulation in diesen Zellen deutlich um 55% (p < 0,01, Student's t-Test). Forskolin-Aktivierung von Adenylyl-Zyklase steigerte die cAMP-Spiegel 16-fach und Ko-Addition von MCP-1 blockierte diesen Anstieg um 78% mit einem IC₅₀-Wert von 90 mM (70–140 pM). Die Größenordnung und Stärke der MCP-1-Hemmung von Adenylyl-Zyklase-Aktivität war unabhängig von der Forskolin-Konzentration (3–30 μM). MCP-1 stimulierte weder noch hemmte es cAMP-Bildung in nicht transfizierten oder pcDNA3-transfizierten 293-Zellkontrollen.
Zusammen demonstrieren diese Resultate, dass Hemmung von Adenylyl-Zyklase-Aktivität einen empfindlichen und quantitativen Assay für MCP-IRB-Rezeptor-Aktivierung in 293-Zellen bereit stellt. Nahezu keine Aktivierung des MCP-1-Rezeptors konnte in diesem Assay als Antwort auf hohe Konzentrationen von RANTES,MIP-1α, MIP-1β, IL-8 oder Gro-α entdeckt werden, was in Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen im Calcium-fluorimetrischen Assay und in Xenopus Oozyten ist (Beispiel 5).
In ähnlichen Experimenten wurde der MIP-1α/RANTES-Rezeptor stabil in 293-Zellen transfiziert, und es wurde ebenfalls festgestellt, dass er eine starke und dosis-abhängige Hemmung von Adenylyl-Zyklase-Aktivität vermittelte. Ungleich dem MCP-IRB-Rezeptor jedoch wurde der MIP-1α/RANTES-Rezeptor von mannigfaltigen Chemokinen mit variierenden Ausmaßen von Stärke aktiviert. MIP-1α und RANTES waren nahezu gleich stark im Hemmen von Adenylyl-Zyklase-Aktivität mit IC₅₀-Werten von 110 pM bzw. 140 pM. MIP-1β (IC₅₀ = 820 nM) hemmte auch Adenylyl-Zyklase-Aktivität, doch nur in viel höheren Konzentrationen, und keines blockierte cAMP-Akkumulation im gleichen Ausmaß wie MIP-1α und RANTES. Die C-X-C-Chemokine IL-8 und Gro-α aktivierten den MIP-1α/RANTES-Rezeptor bis hin zu 1 μM nicht.
Die Tabelle 1 unten vergleicht die Aktivierung des MCP-1-Rezeptors und des MIP-1α/RANTES-Rezeptors durch eine Vielzahl von Chemokinen und demonstriert die Spezifität des MCP-IRB-Rezeptors für MCP-1 und die des MIP-1α/RANTES-Rezeptors für MIP-1α und RANTES. Keins der C-X-C-Chemokine war aktiv an beiden der zwei klonierten C-C-Chemokin-Rezeptoren. TABELLE I Spezifität der MCP-1- und MIP-1α/RANTES-Rezeptoren Hemmung von Adenylyl-Zyklase
In allen Experimenten war die maximale Hemmung von Adenylyl-Zyklase vermittelt durch den MCP-1RB- oder MIP-1α/RANTES-Rezeptor ~80% bzw. ~55%. Qualitativ ähnliche Signalgebung, manifestiert durch den schnellen Anstieg in zytoplasmatischem Calcium und starke Hemmung von Adenylyl-Zyklase, wurde in 293-Zellen beobachtet, die den MCP-1RA-Rezeptor exprimierten.
C. Hemmung von MCP-1R-Aktivierung
Die Hemmung von MCP-IRB-Rezeptor-Aktivierung durch Bordetella-Pertussis-Toxin wurde untersucht. Pertussis-Toxin (List Biological Labs, Inc., Campbell, CA) wurde in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,0, 0,05 M Natriumchlorid gelöst und in normalen, Serum enthaltenden Medien zu terminalen Konzentrationen von 0,1 ng/ml bis 100ng/ml verdünnt, und mit Zellen über Nacht (14–16 Stunden) bei 37°C inkubiert. Die Bedingungen der Pertussis-Toxin-Behandlung der 293-Zellen waren identisch für Calcium-fluorimetrische und Adenylyl-Zyklase-Experimente. Für die Adenylyl-Zyklase-Experimente wurde das Pertussis-Toxin zur gleichen Zeit wie [³H]Adenin hinzugefügt.
Die MCP-1-induzierte Mobilisierung von intrazellulärem Calcium sowie die Hemmung von Adenylyl-Zyklase wurden wesentlich durch die Vorbehandlung der Zellen mit Bordatella Pertus sis-Toxin blockiert. Dosis-Ansprech-Studien deuteten auf ein ähnliches Ausmaß von Hemmung dieser zwei Pfade durch Pertussis-Toxin hin, wie auch auf eine Komponente (~20%), die resistent gegen Hemmung bis zu 100 ng/ml PT war. Der Effekt der Pertussis-Toxin-Behandlung war es, das Ausmaß der MCP-1-Hemmung von cAMP-Akkumulation zu reduzieren, ohne den MCP-1 IC₅₀-Wert signifikant zu verschieben, ein Resultat, das konsistent mit der Hypothese ist, dass Pertussis-Toxin-Behandlung funktionsmäßig den MCP-IRB-Rezeptor von Gαi entkoppelt. Diese Resultate suggerieren auch, dass sowohl die Hemmung von Adenylyl-Zyklase-Aktivität als auch die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium durch die Aktivierung des selben G-Proteins in den 293-Zellen vermittelt werden kann.
D. Diskussion der Ergebnisse
MCP-1 induzierte einen schnellen Anstieg in intrazellulärem Calcium in Indo-beladenen 293-Zellen, die stabil mit MCP-1RB transfiziert waren. Die stabile Zell-Linie demonstrierte auch eine dosis-abhängige homologe Desensibilisierung von Calcium-Mobilisierung in Antwort auf MCP-1. Die relativen Beiträge von extrazellulären und intrazellulären Calcium-Speichern zu diesem Calcium-Fluss sind kontrovers gewesen. Die obenstehenden Ergebnisse unterstützen die Aussage, dass der anfängliche Anstieg in zytoplasmatischem Calcium nach Aktivierung des MCP-1-Rezeptors in 293-Zellen fast ausschließlich durch die Freisetzung von intrazellulären Calcium-Speichern verursacht ist. Erstens hatte die Chelatisierung von extrazellulärem Calcium mit EGTA (2 mM bis 10 mM) wenig Einfluss auf den Anstieg und Spitzenspiegel der Calcium-Durchgänge, beschleunigte aber die Rückkehr zu Ausgangs-Calcium-Spiegeln. Zweitens wurde das selbe Ergebnis erhalten, wenn die transfizierten Zellen in Calcium-freien Medien, ergänzt mit 1 mM EGTA, inkubiert wurden. Schließlich wurden nahezu identische Ergebnisse in der Anwesenheit von 5 mM Ni²⁺ erhalten, welches den Zufluss von extrazellulärem Calcium blockiert.
Aktivierung des MCP-IRB-Rezeptors führte zu profunder Hemmung von Adenylyl-Zyklase, was Kopplung über eine der Isoformen von Gαi suggeriert. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, indem der klonierte MIP-1α/RANTES-Rezeptor benutzt wurde, was darauf hindeutet, dass mindestens zwei der Rezeptoren für C-C-Chemokine Gαi activieren. Überdies blockierte Pertussis-Toxin sowohl die Calcium-Mobilisierung als auch die Hemmung von Adenylyl-Zyklase, induziert durch MCP-1. Die Ähnlichkeit in den Pertussis-Toxin-Dosis-Ansprech-Kurven für Calcium-Mobilisierung und Hemmung von Adenylyl-Zyklase suggeriert, dass beide nachgelagerte Konsequenzen von Kopplung an Gαi sein könnten. Diese Studien sind die erste Demonstration von Adenylyl-Zyklase-Hemmung durch Chemokin-Rezeptoren, und sind konsistent mit Berichten, dass Leukozyten-Chemotaxis zu IL-8, fMLP und MCP-1 empfindlich gegen Hemmung durch Pertussis-Toxin ist; Oppenheim, Ann. Rev. Immunol. 9: 617-48 (1991), Spangrude, J. Immunol. 135:4135-43 (1985); Sozzini, J. Immunol. 147: 2215-21 (1991).
Obwohl Hemmung von Adenylyl-Zyklase die am sorgfältigsten charakterisierte nachgelagerte Auswirkung der Aktivierung von Gαi in Leukozyten ist, wurde Gαi auch mit der Aktivierung von Kalium-Kanälen, mit der Induktion von Mitose und mit der Aktivierung von Ras und Mikrotubulus-Assoziierter-Protein (MAP)-Kinase in fMLP-stimulierten neutrophilen Granulozyten in Verbindung gebracht; Yatani, Nature 336: 680-82 (1988), Seuwan, J. Biol. Chem. 265: 22292-99 (1990); Worthen, J. Clin. Invest. 94:815-23 (1994). Daher kann die Aktivierung von Gαi eine komplexe Anordnung von intrazellulären Signalen aktivieren, die letztendlich zu Leukozyten-Aktivierung und Chemotaxis führt.
Ein Pertussis-Toxin- empfindlicher Signaltransduktions-Pfad, in welchem βγ-Dimere, freigesetzt in Verbindung mit Gαi, welche die β₂-Isoform der Phospholipase C (PLCβ₂) aktivieren, um IP₃ zu erzeugen, wurde beschrieben; Wu, Science 261: 101-031. Es würde erwartet, dass zelluläre Aktivierung über diesen Pfad in einer Pertussis-Toxin-empfindlichen Mobilisierung von intrazellulärem Calcium resultiert. Jedoch 293-Zellen, die den rekombinanten MCP-1-Rezeptor stabil exprimieren, hydrolysieren, wenn überhaupt, wenig PI (Phosphatidylinositol), wenn sie mit MCP-1 angeregt werden. In Kontrollexperimenten steigerten Gq-gekoppelte Rezeptoren, kotransfiziert in diese Zell-Linie, Gesamt-Inositol-Phosphate 5- bis 9-fach infolge der Aktivierung. Das Versagen darin, PI-Umsatz in den MCP-1RB-transfizierten Zellen zu entdecken, suggeriert, dass der MCP-1-Rezeptor intrazelluläres Calcium über einen neuen Mechanismus, unabhängig von IP₃ mobilisiert.
MCP-1RB war bemerkenswert spezifisch für MCP-1. Im Zyklase-Assay war der IC₅₀-Wert für Hemmung durch MCP-1 90 pM, wohingegen verwandte Chemokine unwirksam bis hin zu 1 μM waren. Im Gegensatz dazu hatte der MCP-1-α/RANTES-Rezeptor einen IC₅₀-Wert von ungefähr 100 pM für MIP-1α und RANTES, und 10 nM und 820 nM für MIP-1β bzw. MCP-1. Daher hatte MCP-1 eine Selektivität von mindestens 9000-fach für den MCP-1-Rezeptor, wohingegen MIP-1α und RANTES eine ähnliche Präferenz für den MCP-1-α/RANTES-Rezeptor hatte, beim Vergleich mit MCP-1RB. Es ist daher wahrscheinlich, dass unter physiologischen Bedingungen MCP-1, MIP-1α und RANTES als spezifische Agonisten des MCP-1RB bzw. des MCP-1-α/RANTES-Rezeptors wirken.
Der IC₅₀-Wert für MCP-1-vermittelte Hemmung von Adenylyl-Zyklase war ungefähr 90 pM, deutlich unterhalb der Dissoziationskonstante für Bindung (K_d = 260 pM), was suggeriert, dass relativ wenige Rezeptoren für effiziente Kopplung an Gα besetzt sein müssen i. Im Gegensatz dazu war eine sehr hohe Rezeptorbesetzung benötigt, um intrazelluläre Spitzen-Calcium-Flüsse auszulösen (EC₅₀ = 2–4 nM). Es ist interessant, in diesem Zusammenhang zu bemerken, dass der EC₅₀-Wert für Monozyten-Chemotaxis zu MCP-1 subnanomolar ist; Yoshimura, J. Immunol. 145: 292-97 (1990). Daher ist die Induktion von Chemotaxis, welche die Markenzeichen-Funktion von MCP-1 ist, optimal bei MCP-1-Konzentrationen, die für effiziente Kopplung/Signalgebung durch Gαi sorgen, die aber ungenügend sind, um maximale intrazelluläre Calcium-Flüsse und nachfolgende Rezeptor-Desensibilisierung auszulösen, was darauf hindeutet, dass moderate Steigerungen in intrazellulärem Calcium ausreichen, um Monozyten-Chemotaxis zu initiieren und zu unterstützen. Die hohen Spiegel von intrazellulärem Calcium, nachgewiesen bei nanomolaren Konzentrationen von MCP-1, können dazu dienen, Monozyten-Migration durch Desensibilisierung des Rezeptors und Entregulation von Adhäsionsmolekülen zu stoppen.
MCP-1 wird in vitro durch eine Anzahl von verschiedenen Zellen als Antwortreaktion auf eine Vielzahl von verschiedenen Cytokinen oder oxidativ modifizierten Lipoproteinen sythetisiert und sekretiert.
Die Spezifität des klonierten Rezeptors, zusammengenommen mit der Tatsache, dass lediglich Monozyten, Basophile und ein Subset von T-Zellen auf MCP-1 ansprechen, sorgt für ein wirksames Mittel zur Begrenzung des Spektrums infiltrierender Leukozyten in Bereichen, in denen MCP-1 reichlich vorhanden ist. Frühe atherosklerotische Läsionen weisen ein überwiegend monozytisches Infiltrat auf, und in diesen Läsionen ist MCP-1 reichlich vorhanden. Im Gegensatz dazu bindet der MCP-1-α/RANTES-Rezeptor und überträgt Signale als Ansprechreaktion auf zahlreiche Cytokine und kann dazu dienen, komplexere entzündliche Reaktionen zu vermittetn. Allerdings scheint der MCP-1-α/RANTES-Rezeptor, sobald er einmal aktiviert ist, ähnliche Signaltransduktions-Pfade zu verwenden.
Die im Zuge der fluorometrischen Calcium- und Adenylyl-Cyclase-Inhibitions-Assays erzeugten Dosis-Ansprechkurven wurden mithilfe eines nichtlinearen Minimalquadrate-Programms an die logarithmische Gleichung Effekt = max. Effekt/[1 + (EC50/(Agonist)n)]angepasst, worin n und EC₅₀ den Hill-Koeffizienten bzw. diejenige Agonistenkonzentration, die eine halbmaximale Ansprechreaktion hervorrief, repräsentieren und von der angepassten Kurve abgeleitet wurden. Die Kurvenanpassung wurde mithilfe des Computerprogramms "Prism" (von Graph Pad, San Diego, CA) vorgenommen. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD dar. Die 95%-Konfidenzintervalle (CI) der EC₅₀- und IC₅₀-Werte, sofern angegeben, wurden aus den log EC₅₀- bzw. IC₅₀-Werten berechnet.
Sämtliche in dieser Beschreibung erwähnten Publikationen und Patentapplikationen sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, und zwar im selben Ausmaß, als ob für jede individuelle Publikation oder Patentapplikation spezifisch und individuell angegeben würde, dass sie durch Bezugnahme eingeschlossen ist. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz eines MCP-1R-Polypeptids, welches (a) ein Polypeptid ist, welches eine Sequenz aufweist, die mindestens zu 90 % identisch zu der Sequenz von MCP-1RA, wie gezeigt in der SEQ ID NR.: 2, ist, (b) ein Polypeptid ist, welches eine Sequenz aufweist, die mindestens zu 90 % identisch zu der Sequenz von MCP-1RB, wie gezeigt in der SEQ ID NR.: 4, ist, oder (c) ein Fragment eines Polypeptids gemäß (a) oder (b) ist, welches spezifisch an MCP-1 bindet, wobei die Sequenz des Fragmentes mindestens zu 90 % identisch zu dem entsprechenden Abschnitt von SEQ ID NR.: 2 oder SEQ ID NR.: 4 ist; wobei das MCP-1R-Polypeptid spezifisch an MCP-1, jedoch nicht an MIP-1α, MIP-1β, RANTES oder IL-8 unter physiologischen Bedingungen bindet.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei die Polypeptide (a) und (b) und das Fragment (c) mindestens zu 95 % identisch zu SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4 bzw. dem entsprechenden Abschnitt von SEQ ID NR.: 2 oder SEQ ID NR.: 4 sind.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, welches frei von einer Assoziation mit anderen Polypeptiden ist.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, welches frei von einer Assoziation mit anderen Polypeptiden ist, wobei das Polypeptid die in der SEQ ID NR.: 2 oder SEQ ID NR.: 4 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 2 (1) oder SEQ ID NR.: 4 (2) umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz eines MCP-1R-Polypeptids gemäß Anspruch 1 kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz eines MCP-1R-Polypeptids gemäß Anspruch 2 kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche die in der SEQ ID NR.: 2 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8, umfassend die als Reste 40 bis 1161 der SEQ ID NR.: 1 gezeigten Nukleotidsequenz.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, umfassend die gesamte in der SEQ ID NR.: 1 gezeigten Nukleotidsequenz.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die in der SEQ ID NR.: 4 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 11, umfassend die Nukleotidsequenz, welche als die Reste 81 bis 1160 der SEQ ID NR.: 3 gezeigt ist.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12, umfassend die gesamte Nukleotidsequenz, welche in der SEQ ID NR.: 3 gezeigt ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein MCP-1R-Polypeptid kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül Folgendes umfasst: (a) die Nukleotidsequenz einer MCP-1R-cDNA, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde hybridisiert, welche die Sequenz des Komplements der in der SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 3 gezeigten Kodiersequenz besitzt, wobei die cDNA ein MCP-1R-Polypeptid kodiert, welches spezifisch an MCP-1, jedoch nicht an MIP-1α, MIP-1β, RANTES oder IL-8 unter physiologischen Bedingungen bindet; (b) die Nukleotidsequenz eines Fragmentes einer MCP-1R-cDNA gemäß (a), wobei ein Polypeptid mit der MCP-1R-Aminosäuresequenz, die durch das Fragment kodiert wird, spezifsch an MCP-1 bindet; oder (c) eine Nukleotidsequenz, welche mit (a) oder (b) degeneriert ist.
Expressionsvektor, welcher die Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 14 umfasst.
Säuger-, Insekten- oder Hefezelle, umfassend heterologe Nukleinsäure mit der Sequenz eines Moleküls gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 14, wobei die Zelle in der Lage ist, die Replikation und Expression der heterologen Nukleinsäure auszuführen.
Zelle gemäß Anspruch 16, wobei das MCP-1R-Polypeptid, welches durch die heterologe Nukleinsäure kodiert wird, in stabiler Weise auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines MCP-1R-Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Zelle gemäß Anspruch 16 unter Bedingungen, die geeignet sind, um eine Expression der heterologen Nukleinsäure zu bewirken.
Verfahren gemäß Anspruch 18, ferner den Schritt des Isolierens des exprimierten MCP-1R-Polypeptids aus der Zelle umfassend.
Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten von MCP-1R, umfassend: (a) das Kontaktieren einer Zelle gemäß Anspruch 17 mit MCP-1 in Gegenwart und Abwesenheit einer organischen Kandidatenverbindung; und (b) Vergleichen des Bindens vom MCP-1 an dem MCP-1R-Polypeptid in Gegenwart der Verbindung zum Binden vom MCP-1 an das MCP-1R-Polypeptid in seiner Abwesenheit; wobei eine Verbindung, welche eine Abnahme bezüglich der Bindung von MCP-1 an das MCP-1R-Polypeptid verursacht, als ein Antagonist vom MCP-1R identifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das MCP-1 in detektierbarer Weise markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das Binden von MCP-1 an das MCP-1R-Polypeptid in einem Immunoassay bestimmt wird.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz der extrazellulären aminoterminalen Domäne eines Säuger-MCP-1-Rezeptors, wobei der Rezeptor durch eine cDNA kodiert wird, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde hybridisiert, welche die Nukleotidsequenz des Komplements der in der SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 3 gezeigten Kodiersequenz besitzt.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 23, wobei der MCP-1-Rezeptor ein humaner Rezeptor ist.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 23, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR.: 2 besteht.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 23, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR.: 4 besteht.
Isoliertes immunogenes Polypeptid, umfassend ein Fragment der SEQ ID NR.: 2 oder SEQ ID NR.: 4, wobei das Fragment die Aminosäuresequenz einer extrazellulären Domäne von MCP-1RA besitzt, wie in den 4A und 4B gezeigt.
Verfahren zum Identifzieren einer Substanz, welche um die MCP-1-Rezeptorbindung kompetitiert, umfassend: das Kontaktieren des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 und 23 bis 26 „Monocyte chemoattractant"-Protein-1 (MCP-1) und einer Verbindung; Auswerten der spezifischen Bindung an dem Polypeptid; und Bestimmen, ob die Verbindung die spezifische Bindung beeinflusst.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das MCP-1 ferner eine Markierung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Markierung ¹²⁵I ist.
Antikörper gegen das Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2.