DE69535389T2

DE69535389T2 - Methode zur selektion hoch-exprimierender wirtszellen

Info

Publication number: DE69535389T2
Application number: DE69535389T
Authority: DE
Inventors: Craig W. Portola Valley CROWLEY
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2015-07-29
Also published as: PT770136E; CA2195303C; DE69535389D1; ES2282994T3; EP0770136B1; AU3204595A; JP2006296438A; JP4528940B2; JPH10503376A; MX9700852A; US5561053A; EP0770136A1; AU704408B2; ATE353970T1; IL114820A0; CA2195303A1; DK0770136T3; WO1996004391A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion stark exprimierender Wirtszellen, ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in hohen Ausbeuten und ein Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen Zellen mit mehreren Kopien einer für ein Protein von Interesse kodierenden Sequenz.
Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung und verwandter Gebiete
Die Entdeckung von Verfahren zur Einführung von DNA in lebende Wirtszellen in funktioneller Form stellte den Schlüssel zum Verständnis vieler fundamentaler biologischer Prozesse dar und machte die Produktion von wichtigen Proteinen und anderen Molekülen in kommerziell brauchbaren Mengen möglich.
Trotz des allgemeinen Erfolgs solcher Gentransferverfahren bestehen immer noch einige allgemeine Probleme, welche die Effizienz, mit der ein für ein gewünschtes Protein kodierendes Gen in eine Wirtszelle eingeführt und in dieser exprimiert werden kann, einschränken. Ein Problem besteht darin, zu erkennen, wann das Gen erfolgreich in die Rezipientenzellen transferiert wurde. Ein zweites Problem ist die Unterscheidung von Zellen, die das Gen enthalten, und solchen, welche die Transfervorgänge überlebt haben, das Gen aber nicht enthalten. Ein drittes Problem betrifft die Identifikation und Isolation von Zellen, die das Gen enthalten und das durch das Gen kodierte Protein in hohen Ausbeuten exprimieren.
Im Allgemeinen sind die bekannten Verfahren zur Einführung von Genen in eukaryotische Zellen äußerst ineffizient. Von den Zellen in einer gegebenen Kultur nimmt nur ein kleiner Teil exogen zugesetzte DNA auf und exprimiert diese, und ein noch kleinerer Teil behält diese DNA auf stabile Weise.
Die Identifikation jener Zellen, in die ein für ein gewünschtes Protein kodierendes Produktgen inkorporiert ist, wird typischerweise erreicht, indem in dieselben Zellen ein anderes Gen eingeführt wird, das im Allgemeinen als selektierbares Gen bezeichnet wird und für einen selektierbaren Marker kodiert. Ein selektierbarer Marker ist ein Protein, das für das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle unter den jeweils gewählten Kulturbedingungen erforderlich ist, wie beispielsweise ein Enzym, das Resistenz gegen ein Antibiotikum oder anderes Arzneimittel verleiht, oder ein Enzym, das einen metabolischen oder katabolischen Defekt in der Wirtszelle kompensiert. Selektierbare Gene, die häufig bei eukaryotischen Zellen eingesetzt werden, umfassen die Gene für Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH), Hygromycin-Phosphotransferase (hyg), Dihydrofolatreductase (DHFR), Thymidinkinase (tk), Neomycin, Puromycin, Glutaminsynthetase und Asparaginsynthetase.
Das Verfahren zur Identifikation einer Wirtszelle, in die ein Gen inkorporiert ist, auf Basis der Expression eines zweiten inkorporierten Gens, das für einen selektierbaren Marker kodiert, durch die Wirtszelle wird als Cotransfektion bezeichnet. Bei diesem Verfahren werden typischerweise ein Gen, das für ein gewünschtes Polypeptid kodiert, und ein Selektionsgen gleichzeitig in die Wirtszelle eingeführt, obwohl sie auch nacheinander eingeführt werden können. Im Falle einer gleichzeitigen Cotransfektion können das für das gewünschte Polypeptid kodierende Gen und das selektierbare Gen auf einem einzelnen DNA-Molekül oder auf separaten DNA-Molekülen vorhanden sein, bevor sie in die Wirtszellen eingeführt werden. Wigler et al., Cell 16, 777 (1979). Zellen, in die das für das gewünschte Polypeptid kodierende Gen inkorporiert ist, werden dann durch Züchten der Zellen unter Bedingungen identifiziert oder isoliert, die bevorzugt das Wachstum oder Überleben jener Zellen ermöglichen, die den selektierbaren Marker synthetisieren, für den das selektierbare Gen kodiert.
Das Expressionsausmaß eines Gens, das in eine eukaryotische Wirtszelle eingeführt ist, hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Genkopienzahl, Transkriptionseffizienz, Messenger-RNA- (mRNA-) Reifung, Stabilität und Translationseffizienz. Demgemäß umfasst eine starke Expression eines gewünschten Polypeptids typischerweise die Optimierung eines oder mehrerer dieser Faktoren.
Beispielsweise kann das Niveau der Proteinproduktion durch kovalente Bindung der kodierenden Sequenz des Gens an einen „starken" Promotor oder Enhancer, der zu hohen Transkriptionswerten führt, gesteigert werden. Promotoren und Enhancer sind Nucleotidsequenzen, die spezifisch mit Proteinen in einer Wirtszelle wechselwirken, die an der Transkription beteiligt sind. Kriegler, Meth. Enzymol. 185, 512 (1990); Maniatis et al., Science 236, 1237 (1987). Promotoren befinden sich stromauf von der kodierenden Sequenz eines Gens und erleichtern die Transkription des Gens durch RNA-Polymerase. Von den eukaryotischen Promotoren, die als starke Promotoren für eine starke Expression identifiziert wurden, sind der frühe SV40-Promotor, späte Adenovirus-Hauptpromotor, der Maus-Metallothionein-1-Promotor, die lange terminale Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus und der unmittelbare frühe menschliche Zytomegalievirus-Promotor (CMV).
Enhancer stimulieren die Transkription aus einem gebundenen Promotor. Anders als Promotoren sind Enhancer aktiv, wenn sie sich stromab von der Transkriptionsinitiationsstelle oder in einem deutlichen Abstand vom Promotor befinden, obwohl Enhancer sich in der Praxis physikalisch und funktionell mit Promotoren überschneiden können. Alle der oben angeführten starken Promotoren enthalten beispielsweise auch starke Enhancer. Bendig; Genetic Engineering 7, 91, Adademic Press (1988).
Das Niveau der Proteinproduktion kann auch durch eine Erhöhung der Genkopienzahl in der Wirtszelle gesteigert werden. Ein Verfahren zum Erhalt einer hohen Genkopienzahl besteht in der direkten Einführung von mehreren Kopien des Gens in die Wirtszelle, beispielsweise unter Einsatz eines großen molaren Überschusses des Produktgens in Bezug auf das selektierbare Gen während der Cotransfektion. Kaufman, Meth. Enzymol. 185, 537 (1990). Bei diesem Verfahren wird jedoch nur ein kleiner Teil der cotransfizierten Zellen das Produktgen mit hoher Kopienzahl enthalten. Außerdem sind, da es keine allgemein anwendbaren, praktischen Verfahren zur Unterscheidung solcher Zellen von dem Großteil von Zellen, die weniger Kopien des Produktgens enthalten, gibt, typischerweise arbeits- und zeitaufwändige Screening-Verfahren erforderlich, um die gewünschten Transfektanten mit hohen Kopienzahlen zu identifizieren.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalt einer hohen Genkopienzahl umfasst das Klonieren des Gens in einen Vektor, der zu einer autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist. Beispiele für solche Vektoren umfassen Säugetierexpressionsvektoren, die vom Epstein-Barr-Virus oder vom Rinder-Papillomavirus abgeleitet sind, und Hefe-2-μm-Plasmidvektoren. Stephens und Hentschel, Biochem. J. 248, 1 (1987); Yates et al., Nature 313, 812 (1985); Beggs, Genetic Engineering 2, 175, Academic Press (1981).
Ein weiteres Verfahren zum Erhalt einer hohen Genkopienzahl umfasst eine Genamplifikation in der Wirtszelle. Eine Genamplifikation findet in eukaryotischen Zellen von Natur aus mit einer relativ geringen Häufigkeit statt. Schimke, J. Biol. Chem. 263, 5989 (1988). Eine Genamplifikation kann aber auch induziert, oder zumindest ausgewählt, werden, indem Wirtszellen einem geeigneten Selektionsdruck ausgesetzt werden. In vielen Fällen ist es beispielsweise möglich, ein Produktgen zusammen mit einem amplifizierbaren Gen in eine Wirtszelle einzuführen und danach auf die Amplifikation des Markergens zu selektieren, indem die cotransfizierten Zellen schrittweise steigenden Konzentrationen eines Selektionsmittels ausgesetzt werden. Typischerweise wird das Produktgen zusammen mit dem Markergen unter solchen Bedingungen coamplifiziert.
Das am weitesten verbreitete amplifizierbare Gene für diesen Zweck ist ein DHFR-Gen, das für ein Dihydrofolatreductase-Enzym kodiert. Das Selektionsmittel, das zusammen mit dem DHFR-Gen eingesetzt wird, ist Methotrexat (Mtx). Eine Wirtszelle wird mit einem Produktgen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, und einem DHFR-Gen cotransfiziert, und die Transfektanten werden identifiziert, indem die Zellen zuerst in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Mtx enthält. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz eines Wildtyp-DHFR-Gens ist die Chinahamster-Ovarial-(CHO-) Zelllinie, die keine DHFR-Aktivität aufweist und wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Die transfizierten Zellen werden dann schrittweise erhöhten Mengen von Mtx ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von zahlreichen Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig zahlreichen Kopien des Produktgens. Schimke, J. Biol. Chem. 263, 5989 (1988); Axel et al., US-Patent Nr. 4.399.216; Axel et al., US-Patent Nr. 4.634.665. Weitere Schriften, die sich mit der Cotransfektion eines Gens gemeinsam mit einem genetischen Marker beschäftigen, der eine Selektion und darauf folgende Amplifikation ermöglicht, umfassen Kaufman in Genetic Engineering 9, Hrsg. J. Setlow, Plenum Press, New York (1987); Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601 (1982); Ringold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 165-175 (1981); Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5, 1750-1759 (1985); Kaetzel und Nilson, J. Biol. Chem. 263, 6244-6251 (1988); Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 261-264 (1986); Kaufman et al., EMBO J. 6, 87-93 (1987); Johnston und Kucey, Science 242, 1551-1554 (1988); Urlaub et al., Cell 33, 405-412 (1983).
Um das DHFR-Amplifikationsverfahren auf andere Zelltypen auszuweiten, kann eine DHFR-Genmutante, die für ein Protein mit verringerter Empfindlichkeit gegenüber Methotrexat kodiert, gemeinsam mit Wirtszellen eingesetzt werden, die normale Mengen eines endogenen Wildtyp-DHFR-Gens enthalten. Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2495 (1983); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 3567-3570 (1980); Haber und Schimke, Somatic Cell Genetics 8, 499-508 (1982).
Alternativ dazu können Wirtszellen mit dem Produktgen, einem DHFR-Gen und einem dominanten selektierbaren Gen, wie z.B. einem neo-Gen, cotransfiziert werden. Kim und Wold, Cell 42, 129 (1985); Capon et al., US-Patent Nr. 4.965.199. Transfektanten werden identifiziert, indem zuerst die Zellen in einem Neomycin (oder das verwandte Arzneimittel G418) enthaltenden Kulturmedium gezüchtet werden, und die so identifizierten Transfektanten werden dann für eine Amplifikation des DHFR-Gens und des Produktgens selektiert, indem sie nacheinander steigenden Mengen Mtx ausgesetzt werden.
Wie aus dieser Erläuterung hervorgeht, ist die Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die große Mengen eines gewünschten Proteins exprimieren, im Allgemeinen ein Mehrschrittverfahren. Im ersten Schritt werden Anfangstransfektanten selektiert, in die das Produktgen und das selektierbare Gen inkorporiert sind. In nachfolgenden Schritten werden die Anfangstransfektanten einer weiteren Selektion für starke Expression des selektierbaren Gens und dann einem Zufalls-Screening auf hohe Expressionswerte des Produktgens unterzogen. Um Zellen zu identifizieren, die das gewünschte Protein stark exprimieren, muss üblicherweise eine große Anzahl an Transfektanten gescreent werden. Die meisten Transfektanten produzieren weniger als die Maximalwerte des gewünschten Proteins. Außerdem wird die Mtx-Resistenz in DHFR-Transformanten zumindest teilweise durch verschiedene Genamplifikationsgrade verliehen. Schimke, Cell 37, 705-713 (1984). Die Unzulänglichkeiten einer Coexpression des nicht selektierten Gens wurden von Wold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 5684-5688 (1979), beschrieben. Über die Instabilität der amplifizierten DNA wurde von Kaufman und Schimke, Mol. Cell Biol. 1, 1069-1076 (1981); Haber und Schimke, Cell 26, 355-362 (1981); und Fedespiel et al., J. Biol. Chem. 259, 9127-9140 (1984), berichtet.
Verschiedene Verfahren zur direkten Selektion solcher rekombinanter Wirtszellen in einem einzigen Schritt wurden beschrieben. Eine Strategie umfasst die Cotransfektion von Wirtszellen mit einem Produktgen und einem DHFR-Gen und die Selektion jener Zellen, die DHFR stark exprimieren, durch direkte Züchtung in einem Medium mit hoher Mtx-Konzentration: Viele der auf diese Weise selektierten Zellen exprimieren auch das cotransfizierte Produktgen stark. Page und Sydenham, Bio/Technology 9, 64 (1991). Dieses Verfahren für eine Einschrittselektion bringt jedoch Nachteile mit sich, die seine Zweckmäßigkeit einschränken. Stark exprimierende Zellen, die durch direkte Züchtung in einem Medium mit einem hohen Gehalt eines Selektionsmediums erhalten werden, können schlechte Wachstums- und Stabilitätseigenschaften aufweisen, was ihre Zweckdienlichkeit für langfristige Produktionsprozess einschränkt. Page und Sydenham, Bio/Technology 9, 64 (1991). Eine Einschrittselektion auf Basis einer starken Resistenz gegen Mtx kann Zellen mit einem veränderten, Mtx-resistenten DHFR-Enzym oder Zellen mit veränderten Mtx-Transporteigenschaften und nicht Zellen mit amplifizierten Genen ergeben. Haber et al., J. Biol. Chem. 256, 9501 (1981); Assaraf und Schimke, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7154 (1987).
Ein weiteres Verfahren umfasst die Verwendung von polycistronischen mRNA-Expressionsvektoren, die ein Produktgen am 5'-Ende der transkribierten Region und ein selektierbares Gen am 3'-Ende enthalten. Da die Translation des selektierbaren Gens am 3'-Ende der polycistronischen mRNA ineffizient ist, legen solche Vektoren eine bevorzugte Translation des Produktgens an den Tag und erfordern eine große Mengen von polycistronischer mRNA, um eine Selektion zu überleben. Kaufman, Meth. Enzymol. 185, 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185, 537 (1990); Kaufman et al., EMBO J. 6, 187 (1987). Demgemäß können Zellen, die das gewünschte Proteinprodukt stark exprimieren, in einem einzigen Schritt erhalten werden, indem die Anfangstransfektanten in einem Medium gezüchtet werden, das ein zur Verwendung mit dem jeweiligen selektierbaren Gen geeignetes Selektionsmittel enthält. Die Zweckdienlichkeit dieser Vektoren variiert jedoch aufgrund des unvorhersehbaren Einflusses des stromauf liegenden Produkt-Leserasters auf die Translation eines selektierbaren Markers und weil das stromauf liegende Leseraster manchmal während einer Methotrexat-Amplifikation deletiert wird (Kaufman et al., J. Mol. Biol. 150, 601-621 (1982); Levinson, Methods in Enzymology, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)). Spätere Vektoren inkorporierten eine von Mitgliedern der Picornavirenfamilie stammende interne Translationsinitiationsstelle, die sich zwischen dem Produktgen und dem selektierbaren Gen befindet (Pelletier et al., Nature 334, 320 (1988); Jang et al., J. Virol. 63, 1651 (1989)).
Ein drittes Verfahren für eine Einschrittselektion umfasst die Verwendung eines DNA-Konstrukts mit einem selektierbaren Gen, das ein Intron enthält, in dem sich ein für das Protein von Interesse kodierendes Gen befindet. Siehe US-Patent Nr. 5.043.270 und Abrams et al., J. Biol. Chem. 264(24), 14016-14021 (1989). In einem weiteren Einschrittselektionsverfahren werden Wirtszellen mit einem intronmodifizierten selektierbaren Gen und einem für das Protein von Interesse kodierenden Gen cotransfiziert. Siehe WO 92/17566, veröffentlicht am 15. Oktober 1992. Das intronmodifizierte Gen wird hergestellt, indem in die transkribierte Region eines selektierbaren Gens ein Intron mit einer Länge insertiert wird, dass das Intron mit geringer Effizienz korrekt vom entsprechenden mRNA-Vorläufer gespleißt wird, sodass die Menge des selektierbaren Markers, die vom intronmodifizierten selektierbaren Gen produziert wird, wesentlich geringer ist als jene, die vom selektierbaren Ausgangsgen produziert wird. Diese Vektoren tragen dazu bei, die Integrität des integrierten DNA-Konstrukts sicherzustellen, aber eine Transkriptionsbindung wird nicht erreicht, da das selektierbare Gen und das Proteingen durch unterschiedliche Promotoren gesteuert werden.
Andere Säugetier-Expressionsvektoren mit nur einer Transkriptionseinheit wurden beschrieben. Retrovirale Vektoren wurden konstruiert (Cepko et al., Cell 37, 1053-1062 (1984)), worin eine cDNA zwischen den endogenen Moloney-Maus-Leukämievirus-(M-MuLV-) Spleißdonor- und Spleißakzeptorstellen insertiert wird, auf die ein Neomycin-Resistenzgen folgt. Dieser Vektor wurde verwendet, um verschiedene Genprodukte zu exprimieren, nachdem unterschiedliche Zelltypen einer retroviralen Infektion unterzogen wurden.
Vor dem Hintergrund der obigen Nachteile besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Erhöhung des Homogenitätsgrads in Bezug auf die Expressionswerte von stabilen Klonen, die mit einem Produktgen von Interesse transfiziert sind, indem ein selektierbarer Marker (DHFR) und das Protein von Interesse von einem einzelnen Promotor exprimiert werden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Selektion von stabilen rekombinanten Wirtszellen, die ein gewünschtes Proteinprodukt stark exprimieren, wobei das Verfahren rasch und bequem durchführbar ist und die Anzahl an transfizierten Zellen verringert, die gescreent werden müssen. Außerdem besteht ein Ziel darin, eine rasche Bildung von vielen ein- oder zweiteiligen Polypeptiden aus Klonen oder Pools von stabilen Wirtszelltransfektanten zu erlauben.
Ein weiteres Ziel besteht in der Bereitstellung von Expressionsvektoren, die zu aktiven Integrationsvorgängen tendieren (d.h. eine erhöhte Neigung zur Bildung von Transformanten aufweisen, worin das DNA-Konstrukt in eine Region des Genoms der Wirtszelle insertiert ist, die zu einer starken Expression des Produktgens führt) und für verschiedene Produktgene geeignet sind, ohne dass sie modifiziert werden müssen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt (DNA-Molekül), umfassend eine 5'-Transkriptionsinitiationsstelle und eine Transkriptionsterminationsstelle, ein selektierbares Gen, das ein amplifizierbares Gen ist, und ein Produktgen, das 3' zum selektierbaren Gen liegt, eine Transkriptionsregulationsregion, die die Transkription sowohl des selektierbaren Gens als auch des Produktgens reguliert, wobei das selektierbare Gen innerhalb eines durch eine Spleißdonorstelle und eine Spleißakzeptorstelle definierten Introns liegt. Die Spleißdonorstelle umfasst vorzugsweise eine effektive Spleißdonorsequenz, wie sie hierin definiert ist, und reguliert so die Expression des Produktgens unter Nutzung der Transkriptionsregulationsregion.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts von Interesse bereit, umfassend das Züchten einer eukaryotischen Zelle, die mit dem oben beschriebenen DNA-Konstrukt transfiziert wurde, um das Produktgen zu exprimieren, und die Gewinnung des Produkts.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen Zellen bereit, die mehrere Kopien eines Produktgens aufweisen, umfassend das Transfizieren von eukaryotischen Zellen mit dem oben beschriebe nen DNA-Konstrukt (worin das selektierbare Gen ein amplifizierbares Gen ist), das Züchten der Zellen in einem selektiven Medium, das ein Amplifikationsmittel umfasst, für eine ausreichende Zeitspanne, um eine Amplifikation zu ermöglichen, und das Selektieren von Zellen, die mehrere Kopien des Produktgens aufweisen. Vorzugsweise erfolgt die Transfektion der Zellen mittels Elektroporation.
Nach der Transfektion der Wirtszellen weisen die meisten Transfektanten nicht die Eigenschaften eines selektierbaren Phänotyps des Proteins, für welches das selek tierbare Gen kodiert, auf, aber überraschenderweise weist ein kleiner Anteil der Transfektanten den selektierbaren Phänotypen auf, und von diesen Transfektanten exprimieren die meisten das gewünschte Produkt, für welches das Produktgen kodiert, stark. Somit stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Selektion von rekombinanten Wirtszellen bereit, die ein gewünschtes Produkt stark exprimieren, wobei das Verfahren für verschiedenste eukaryotische Wirtszellen geeignet ist und die Probleme vermeidet, die der vorhandenen Zellselektionstechnologie anhaften.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–1D sind schematische Darstellungen verschiedener DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung. Die großen Pfeile stellen das selektierbare Gen und das Produktgen bereit, das durch die strichlierten Linien gebildete V zeigt die Region der Vorläufer-RNA, die zwischen der 5'-Spleißdonorstelle (SD) und der 3'-Spleißakzeptorstelle (SA) liegt, die aus Vektoren mit einer funktionellen SD herausgeschnitten ist. Die Transkriptionsregulationsregion, das selektierbare Gen, das Produktgen und die Transkriptionsterminationsstelle sind in 1A dargestellt. 1B zeigt die DNA-Konstrukte aus Beispiel 1. Die unterschiedlichen Spleißdonorsequenzen sind dargestellt, d.h. die Wildtyp-ras-Spleißdonorsequenz (WT-ras), die mutierte ras-Spleißdonorsequenz (ras-MUTANTE) und die nichtfunktionelle Spleißdonorsequenz
Die für die Northern-Blot-Analyse von Beispiel 1 eingesetzten Sonden sind in 1B dargestellt. 1C zeigt die DNA-Konstrukte aus Beispiel 2, und 1D zeigt das DNA-Konstrukt aus Beispiel 3, das für die Expression von Anti-IgE-V_H eingesetzt wurde.
2 ist eine schematische Darstellung des in Beispiel 1 eingesetzten Kontroll-DNA-Konstrukts.
3A–Q zeigen die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) des DHFR/Intron-(WT-ras-SD)-tPA-Expressionsvektors aus Beispiel 1.
4 ist ein Balkendiagramm, das die Anzahl an Kolonien zeigt, die sich nach einer Elektroporation einer linearisierten, doppelten Minipräparation aus DNAs, die parallel aus den drei in 1B dargestellten Vektoren (d.h. mit der Wildtyp-ras-Spleißdonorsequenz (WT-ras), der mutierten ras-Spleißdonorsequenz (ras-MUTANTE) und der nichtfunktionellen Spleißdonorsequenz (ΔGT)) und aus dem Kontrollvektor, der DHFR unter Kontrolle eines SV40-Promotors und tPA unter Kontrolle eines CMV-Promotors aufweist (siehe 2), hergestellt wurden, in einem selektiven Medium bilden. Die Zellen wurden in einem nucleosidfreien Medium selektiert und mit einem automatisierten Kolonienzähler gezählt.
5A–C sind Balkendiagramme, welche die Expression von tPA aus stabilen Pools und aus den in 1B gezeigten Vektoren erzeugten Klonen zeigen. In 5A wurden mehr als 100 Klone jeder Vektortransfektion vermischt, in 24-Well-Platten ausplattiert und durch tPA-ELISA bei „Sättigung" getestet. In 5B wurden zwanzig zufällig ausgewählte, von den einzelnen Vektoren stammende Klone durch tPA-ELISA bei „Sättigung" getestet. In 5C wurden die in 5A genannten Pools (mit Ausnahme des ΔGT-Pools) 200 nM Mtx ausgesetzt, um auf DHFR-Amplifikation zu selektieren, und dann gepoolt und auf tPA-Expression getestet.
6A–P zeigen die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2) des DHFR/Intron-(Wt-ras-SD)-TNFr-IgG-Expressionsvektors aus Beispiel 2.
7A–B sind Balkendiagramme, welche die Expression von TNFr-IgG unter Einsatz von dicistronischen oder Kontrollvektoren (siehe Beispiel 2) zeigen. Vektoren, die TNFr-IgG enthalten (aber sonst identisch sind mit den in Beispiel 1 für die tPA-Expression beschriebenen), wurden konstruiert (siehe 1C), durch Elektroporation in dp12.CHO-Zellen eingeführt, gepoolt und auf Produktexpression getestet, und zwar bevor (7A) und nachdem (7B) sie einer Amplifikation in 200 nM Mtx unterzogen wurden.
8 ist eine schematische Darstellung des DNA-Konstrukts, das zur Expression. der V_L von Anti-IgE in Beispiel 3 eingesetzt wurde.
9A–O zeigen die Nucleotidsequenz (Seq:-ID Nr. 3) des Anti-IgE-V_H-Expressionsvektors aus Beispiel 3.
10A–Q zeigen die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4) des Anti-IgE-V_L-Expressionsvektors aus Beispiel 3.
11 ist ein Balkendiagramm, das sie Anti-IgE-Expression aus Beispiel 3 zeigt. Schwer- (V_H-) und Leicht- (V_L-) Ketten-Expressionsvektoren wurden konstruiert, in CHO-Zellen coelektroporiert, Klone wurden selektiert und auf Antikörperexpression getestet. Außerdem wurden Pools hergestellt und auf die Expression vor und nach der Mtx-Selektion bei 200 nM und 1 μM getestet.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen:
Das hierin geoffenbarte „DNA-Konstrukt" umfasst ein nicht natürlich vorkommendes DNA-Molekül, das entweder als Isolat oder in ein anderes DNA-Molekül, z.B. in einen Expressionsvektor oder das Chromosom einer eukaryotischen Wirtszelle, integriert bereitgestellt sein kann.
Die Bezeichnung „selektierbares Gen" bezieht sich hierin auf eine DNA, die für einen selektierbaren Marker kodiert, der für das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle unter den jeweils gewählten Zellkulturbedingungen notwendig ist. Demgemäß ist eine Wirtszelle, die mit einem selektierbaren Gen transformiert ist, unter bestimmten Zellkulturbedingungen, unter denen eine nicht transfizierte Wirtszelle nicht wachsen oder überleben kann, in der Lage, zu wachsen oder zu überleben. Typischerweise verleiht ein selektierbares Gen Resistenz gegen ein Arzneimittel oder kompensiert einen metabolischen oder katabolischen Defekt in der Wirtszelle. Beispiele für selek tierbare Gene sind in der folgenden Tabelle angeführt. Siehe auch Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990), für einen Überblick. TABELLE 1 Selektierbare Gene und ihre Selektionsmittel
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das selektierbare Gen ein amplifizierbares Gen. Die Bezeichnung „amplifizierbares Gen" bezieht sich hierin auf ein Gen, das unter bestimmten Bedingungen amplifiziert wird (d.h. zusätzliche Kopien des Gens werden erzeugt, die in intrachromosomaler oder extrachromosomaler Form überleben). Das amplifizierbare Gen kodiert üblicherweise für ein Enzym (d.h. einen amplifizierbaren Marker), das für das Wachstum von eukaryotischen Zellen unter diesen Bedingungen erforderlich ist. Das Gen kann beispielsweise für DHFR kodieren, das amplifiziert wird, wenn eine damit transfizierte Wirtszelle in Mtx gezüchtet wird. Nach Kaufman können die selektierbaren Gene aus Tabelle 1 auch als amplifizierbare Gene betrachtet werden. Ein Beispiel für ein selektierbares Gen, das im Allgemeinen nicht als amplifizierbares Gen betrachtet wird, ist das Neomycin-Resistenzgen (Cepko et al., w.o.).
Die Bezeichnung „selektives Medium" bezieht sich hierin auf eine Nährlösung, die zur Züchtung von das selektierbare Gen enthaltenden eukaryotischen Zellen verwendet wird, und umfasst folglich ein „Selektionsmittel". Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((MDEM), Sigma), sind Beispiele für Nährlösungen. Außerdem kann jedes der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US-Patent Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; US-Patent Re. 30.985; oder US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenen Medien als Kulturmedium eingesetzt werden. Jedes dieser Medien kann je nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat); Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. dem Arzneimittel Gentamycin^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im Mikromolbereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt sein. Jede andere erforderliche Ergänzung kann ebenfalls in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die bevorzugte Nährlösung umfasst fötales Rinderserum.
Die Bezeichnung „Selektionsmittel" bezieht sich auf eine Substanz, die das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle beeinträchtigt, der ein bestimmtes selektierbares Gen fehlt. Beispiele für Selektionsmittel sind oben in Tabelle 1 angegeben. Das Selektionsmittel umfasst vorzugsweise ein „Amplifikationsmittel", das für die vorliegenden Zwecke als Mittel zur Amplifikation von Kopien des amplifizierbaren Gens, wie beispielsweise Mtx, wenn das amplifizierbare Gen DHFR ist, definiert ist. Siehe Tabelle 1 für Beispiele für Amplifikationsmittel.
Die Bezeichnung „Transkriptionsinitiationsstelle" bezieht sich hierin auf die Nucleinsäure im DNA-Konstrukt, die der ersten Nucleinsäure entspricht, die in das primäre Transkript inkorporiert wird, d.h. auf den mRNA-Vorläufer, wobei die Stelle im Allgemeinen am oder neben dem 5'-Ende des DNA-Konstrukts bereitgestellt ist.
Die Bezeichnung „Transkriptionsterminationsstelle" bezieht sich auf eine Sequenz einer DNA, die normalerweise am 3'-Ende des DNA-Konstrukts vorhanden ist und die RNA-Polymerase dazu veranlasst, die Transkription zu beenden.
Die Bezeichnung „Transkriptionsregulationsregion" bezieht sich auf eine Region des DNA-Konstrukts, welche die Transkription des selektierbaren Gens und des Produktgens reguliert. Die Transkriptionsregulationsequenz bezieht sich normalerweise auf eine Promotersequenz (d.h. eine Region von DNA, die an der Bindung von RNA-Polymerase zur initiation einer Transkription beteiligt ist), die konstitutiv oder induzierbar sein kann, und gegebenenfalls einen Enhancer (d.h. ein cis-aktives DNA-Element, üblicherweise 10-300 bp lang, das auf einen Promotor wirkt, um seine Transkription zu steigern).
„Produktgen" bezieht sich hierin auf DNA, die für ein gewünschtes Protein- oder Polypeptidprodukt kodiert. Jedes beliebige Produktgen, das in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, kann verwendet werden, obwohl die Verfahren der Erfindung besonders zum Erhalt einer starken Expression eines Produktgens geeignet sind, das nicht auch ein selektierbares oder amplifizierbares Gen ist. Demgemäß ist das Protein oder Polypeptid, für welches das Produktgen kodiert, typischerweise ein solches, das nicht für das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle unter den jeweils gewählten bestimmten Zellkulturbedingungen notwendig ist. Beispielsweise kodieren Produktgene am besten für ein Peptid, oder sie kodieren für eine Polypeptidsequenz aus Aminosäuren, deren Länge ausreicht, um größere Mengen einer Tertiär- und/oder Quartärstruktur zu erhalten.
Beispiele für bakterielle Polypeptide oder Proteine umfassen z.B. alkalische Phosphatase und β-Lactamase. Beispiele für Säugetierpolypeptide oder -proteine umfassen Moleküle wie beispielsweise Renin; Wachstumshormone, einschließlich des menschlichen Wachstumshormons und des Rinderwachstumshormons; den das Wachstumshormon freisetzenden Faktor; das Parathormon; das thyroidstimulierende Hormon; Lipoproteine; α-1-Antitrypsin; die Insulin-A-Kette; die Insulin-B-Kette; Proinsulin; das follikelstimulierende Hormon; Calcitonin; das luteinisierende Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren wie Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von-Willebrands-Faktor; gerinnungshemmende Faktoren wie Protein C; den atrialen natriuretischen Faktor; das Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie Urokinase oder menschlichen Urin- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; den hämopoetischen Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-α und -β; Enkephalinase; RANTES (regulationsaktiviert, normalerweise T-Zell-exprimiert und -sekretiert); das menschliche Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP-1-α); ein Serumalbumin wie menschliches Serumalbumin; die Müllersche Inhibitionssubstanz; die Relaxin-A-Kette; die Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; das Maus-Gonadotropinassoziierte Peptid; ein Mikrobenprotein, wie z.B. β-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; den Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; einen neurotrophen Faktor wie den aus Knochen gewonnenen neurotrophen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder einen Nervenwachstumsfaktor wie NGF-β; den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF); einen Fibroblastenwachstumsfaktor wie aFGF und bFGF; den Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF); einen transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) wie TGF-α und TGF-α, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; den insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), insulinähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsproteine; CD-Proteine wie CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxi-β und -γ; Koloniewachstum stimulierende Faktoren (CSFs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell- Rezeptoren, Oberflächenmembranproteine; einen den Zerfall beschleunigenden Faktor; ein virales Antigen wie beispielsweise einen Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine, homing-Rezeptoren; Addressine; Regulationsproteine; Antikörper; chimäre Proteine wie Immunoadhäsine und Fragmente von jedem beliebigen der oben aufgelisteten Polypeptide.
Das Produktgen besteht vorzugsweise nicht aus einer Antisense-Sequenz, um die Expression eines Gens, das im Wirt vorhanden ist, zu hemmen. Bevorzugte Proteine hierin sind therapeutische Proteine, wie z.B. TGF-β, TGF-α, PDGF, EGF, FGF, IGF-I, DNase, Plasminogenaktivatoren, wie z.B. t-PA, Blutgerinnungsfaktoren, wie z.B. der Gewebefaktor und Faktor VIII, Hormone, wie z.B. Relaxin und Insulin, Cytokine, wie z.B. IFN-γ, chimäre Proteine, wie z.B. TNF-Rezeptor-IgG-Immunoadhäsin (TNFr-IgG), oder Antikörper, wie z.B. Anti-IgE.
Die Bezeichnung „Intron" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die innerhalb der transkribierten Region eines Gens oder innerhalb eines Messenger-RNA-Vorläufers vorhanden ist, wobei die Nucleotidsequenz vor der Translation durch eine Wirtszelle aus dem Messenger-RNA-Vorläufer herausgeschnitten oder gespleißt werden kann. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Introns werden am besten durch eines der auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Reinigung aus einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure oder durch De-novo-Synthese. Die in vielen natürlich vorkommenden eukaryotischen Genen vorhandenen Introns wurden identifiziert und charakterisiert. Mount, Nuc. Acids Res. 10, 459 (1982). Künstliche Introns, die funktionelle Spleißstellen umfassen, wurden ebenfalls beschrieben. Winey et al., Mol. Cell Biol. 9, 329 (1989); Gatermann et al., Mol. Cell Biol. 9, 1526 (1989). Introns können aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren erhalten werden, beispielsweise durch den Verdau einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease oder durch PCR-Klonierung unter Einsatz von Primern, die zu Sequenzen am 5'- und 3'-Ende des Introns komplementär sind. Alternativ dazu können Introns mit einer definierten Sequenz und Länge unter Einsatz verschiedener Verfahren der organischen Chemie synthetisch hergestellt werden. Narang et al., Meth. Enzymol. 68, 90 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154, 287 (1985); Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986).
Die Bezeichnung „Spleißdonorstelle" oder „SD" bezieht sich hierin auf die DNA-Sequenz, welche die Exon-Intron-Grenze am 5'-Ende des Introns direkt umgibt; worin „Exon" die Nucleinsäure 5' zum Intron umfasst. Viele Spleißdonorstellen wurden charakterisiert, und Ohshima et al., J. Mol. Biol. 195, 247-259 (1987), stellt einen Überblick darüber bereit. Eine „effiziente Spleißdonorsequenz" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die für eine Spleißdonorstelle kodiert, worin die Effizienz der Spleißung von Messenger-RNA-Vorläufern mit der Spleißdonorsequenz zwischen etwa 80 bis 99 % und vorzugsweise 90 bis 95 % liegt, wie durch quantitative PCR bestimmt wird. Beispiele für effiziente Spleißdonorsequenzen umfassen die Wildtyp (WT-) ras-Spleißdonorsequenz und die GAC:GTAAGT-Sequenz aus Beispiel 3. Andere effiziente Spleißdonorsequenzen können leicht unter Einsatz der hierin beschriebenen Verfahren zur Messung der Effizienz der Spleißung selektiert werden.
Die Bezeichnungen „PCR" und „Polymerasekettenreaktion" beziehen sich hierin auf das In-vitro-Amplifikationsverfahren, das im US-Patent Nr. 4.683.195 (ausgegeben am 28. Juli 1987) beschrieben wurde. Im Allgemeinen umfasst das PCR-Verfahren wiederholte Durchgänge einer Primerextensionssynthese, wobei zwei DNA-Primer eingesetzt werden, die zur präferentiellen Hybridisierung an eine Matrizen-Nucleinsäure in der Lage sind, welche die zu amplifizierende Nucleotidsequenz umfasst. Das PCR-Verfahren kann eingesetzt werden, um spezifische DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA, aus zellulärer RNA transkribierter cDNA, Virus- oder Plasmid-DNA zu transkribieren. Wang und Mark, in: PCR Protocols, 70-75, Academic Press (1990); Schart, in: PCR Protocols, 84-98; Kawasaki und Wang, in: PCR Technology, 89-97, Stockton Press (1989). Eine Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) kann eingesetzt werden, um RNA-Proben zu analysieren, die Gemische aus gespleißten und ungespleißten mRNA-Transkripten enthalten. Fluoreszenzmarkierte Primer, die entworfen sind, um das Intron zu umspannen, werden zur Amplifikation von sowohl gespleißten als auch ungespleißten Targets eingesetzt. Die resultierenden Amplifikationsprodukte werden dann durch Gelelektrophorese getrennt und durch Messung der Fluoreszenzemission der geeigneten Bande(n) quantifiziert. Ein Vergleich wird durchgeführt, um die Menge an gespleißten und ungespleißten Transkripten zu bestimmen, die in der RNA-Probe vorhanden ist.
Eine bevorzugte Spleißdonorsequenz ist eine „Consensus-Spleißdonorsequenz". Die Nucleotidsequenzen, die Intron-Spleißstellen umgeben, wobei die Sequenzen evolutionsbedingt hochkonserviert sind, werden als „Consensus-Spleißdonorsequenzen" bezeichnet. In den mRNAs von höheren Eukaryoten kommt die 5'-Spleißstelle innerhalb der Consensus-Sequenz AG:GUAAGU (worin der Doppelpunkt die Spalt- und Ligationsstelle bezeichnet) vor. In den mRNAs von Hefe ist die 5'-Spleißstelle von der Consensus-Sequenz:GUAUGU begrenzt. Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55, 1119 (1986).
Der Ausdruck „Spleißakzeptorstelle" oder „SA" bezieht sich auf die Sequenz, die die Intron-Exon-Grenze am 3'-Ende des Introns unmittelbar umgibt, wobei das „Exon" die Nucleinsäure 3' vom Intron umfasst. Viele Spleißakzeptorstellen wurden charakterisiert, und Ohshima et al., J. Mol. Biol. 195, 247-259 (1987), stellen einen Überblick darüber bereit. Die bevorzugte Spleißakzeptorstelle ist eine wirksame Spleißakzeptorstelle, die sich auf eine Nucleinsäuresequenz bezieht, die für eine Spleißakzeptorstelle kodiert, worin die Wirksamkeit des Spleißens von Messenger-RNA-Vorläufern mit der Spleißakzeptorstelle zwischen etwa 80 % bis 99 % und vorzugsweise 90 bis 95 % liegt, wie durch quantitative PCR bestimmt wurde. Die Spleißakzeptorstelle kann eine Consensussequenz umfassen. In den mRNAs von höheren Eukaryoten tritt die 3'-Spleißakzeptorstelle innerhalb der Consensussequenz (U/C)₁₁NCAG:G auf. In den mRNAs von Hefe ist die 3'-Spleißakzeptorstelle durch die Consensussequenz (C/U)AG: gebunden. Padgett et al., s.o.
„Züchten für eine ausreichende Zeitspanne, um Amplifikation zu ermöglichen", bezieht sich hierin auf den Vorgang einer physikalischen Züchtung der eukaryotischen Wirtszellen, die mit dem DNA-Konstrukt transformiert wurden, in einem Zellkulturmedium, welches das Amplifikationsmittel enthält, bis die Kopienzahl des amplifizierba ren Gens (und vorzugsweise auch die Kopienzahl des Produktgens) in den Wirtszellen in Bezug zu den transformierten Zellen vor dieser Züchtung zugenommen hat.
Die Bezeichnung „Expression" bezieht sich hierin auf die Transkription oder Translation, die innerhalb einer Wirtszelle auftritt. Das Expressionsausmaß eines Produktgens in einer Wirtszelle kann auf Grundlage von entweder der Menge an entsprechender mRNA, die in der Zelle vorhanden ist, oder der Menge des Proteins, für welches das von der Zelle produzierte Produktgen kodiert, bestimmt werden. mRNA, die beispielsweise aus einem Produktgen transkribiert wird, wird wünschenswerterweise durch Northern-Hybridisierung quantifiziert. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 7.3-7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ein Protein, für das ein Produktgen kodiert, kann entweder durch Testen auf die biologische Aktivität des Proteins oder unter Einsatz von Tests, die von solcher Aktivität unabhängig sind, wie beispielsweise Western-Blotting oder Radioimmuntest, unter Verwendung von Antikörpern, die zur Reaktion mit dem Protein in der Lage sind, quantifiziert werden. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Arten der Durchführung der Erfindung
Bereitgestellt werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Erhöhung der Stabilität und/oder Kopienzahl einer transkribierten Sequenz, um höhere Werte einer RNA-Sequenz von Interesse zu ermöglichen. Im Allgemeinen umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Transfektion einer eukaryotischen Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der sowohl ein Produktgen, das für ein gewünschtes Polypeptid kodiert, als auch ein selektierbares Gen (vorzugsweise ein amplifizierbares Gen) umfasst.
Selektierbare Gene und Produktgene können aus genomischer DNA, aus zellulärer RNA transkribierter cDNA oder durch In-vitro-Synthese erhalten werden. Beispielsweise können Bibliotheken mit Sonden (wie z.B. Antikörpern oder Oligonucleotiden aus etwa 20-80 Basen) gescreent werden, die für die Identifikation des selektierba ren Gens oder des Produktgens (oder des Proteins/der Proteine, für welche dieses kodiert) entworfen sind. Das Screenen der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren, wie sie in den Kapiteln 10-12 bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben sind, durchgeführt werden. Ein alternatives Mittel zur Isolation des selektierbaren Gens oder Produktgens basiert auf dem Einsatz der PCR-Methode, wie in Abschnitt 14 bei Sambrook et al., w.o., beschrieben.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung dieser Erfindung besteht im Einsatz von sorgfältig ausgewählten Oligonucleotidsequenzen zum Screenen von cDNA-Bibliotheken von unterschiedlichen Geweben, von denen bekannt ist, dass sie das selektierbare Gen oder Produktgen enthalten. Die Oligonucleotidsequenzen, die als Sonden ausgewählt werden, sollten ausreichend lange und ausreichend unzweideutig sein, dass falsche positive Resultate minimiert werden.
Das Oligonucleotid wird im Allgemeinen so markiert, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek detektiert werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren basiert auf dem Einsatz von ³²P-markiertem ATP mit Polynucleotidkinase, wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist, um das Oligonucleotid radioaktiv zu markieren. Aber auch andere Verfahren können eingesetzt werden, um das Oligonucleotid zu markieren, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Biotinylierung oder Enzymmarkierung.
Manchmal geht der DNA, die für das selektierbare Gen und das Produktgen kodiert, eine DNA voraus, die für eine Signalsequenz mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids kodiert, voraus. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Expressionsvektors sein, oder es handelt sich um einen Abschnitt des selektierbaren Gens oder Produktgens, das in den Expressionsvektor insertiert wird. Wenn eine heterologe Signalsequenz verwendet wird, ist dies vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und verarbeitet (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Für eine Hefesekretion kann die native Signal sequenz substituiert werden, beispielsweise durch den Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist, das am 23. April 1991 ausgegeben wurde) oder C.-albicans-Glucoaniylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal. Bei der Säugetierzellexpression reicht die native Signalsequenz des Proteins von Interesse aus, obwohl auch andere Säugetier-SignaÍsequenzen geeignet sein können, wie beispielsweise die Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden der gleichen oder einer verwandten Spezies, sowie virale sekretorische Leader, beispielsweise das Herpex-simplex-gD-Signal. Die DNA für solch eine Vorläuferregion ist im Leseraster an das selektierbare Gen oder Produktgen ligiert.
Wie in 1A dargestellt wird das selektierbare Gen im Allgemeinen am 5'-Ende des DNA-Konstrukts bereitgestellt, und auf dieses selektierbare Gen folgt das Produktgen. Folglich enthält die Volllängen- (nicht gespleißte) Nachricht DHFR als erstes offenes Leseraster und erzeugt so ein DHFR-Protein, um die Selektion von stabilen Transfektanten zu ermöglichen. Es ist nicht zu erwarten, dass die Volllängen-Nachricht nennenswerte Mengen des Proteins von Interesse erzeugt, da das zweite AUG in einer dicistronischen Nachricht ein ineffizienter Translationsinitiator in Säugetierzellen ist (Kozak, J. Cell Biol. 115, 887-903 (1991)).
Das selektierbare Gen befindet sich innerhalb eines Introns. Introns sind nichtkodierende Nucleotidsequenzen, die normalerweise in vielen eukaryotischen Genen vorhanden sind und in einem Mehrschrittverfahren, das kollektiv als Spleißen bezeichnet wird, aus neu transkribierten mRNA-Vorläufern entfernt werden.
Es wird angenommen, dass ein einziger Mechanismus für die Spleißung von mRNA-Vorläufern in Säugetier-, Pflanzen- und Hefezellen verantwortlich ist. Im Allgemeinen erfordert der Spleißvorgang, dass das 5'- und das 3'-Ende des Introns korrekt gespalten und die resultierenden Enden der mRNA exakt verbunden werden, sodass eine reife mRNA mit dem richtigen Leseraster für eine Proteinsynthese produziert wird. Eine Analyse verschiedener natürlich vorkommender und synthetisch konstruierter Genmutanten hat gezeigt, dass Nucleotidänderungen an zahlreichen Positionen in den Consensus-Sequenzen an der 5'- und 3'-Spleißsstelle die Wirkung haben, dass sie die Synthese von reifer mRNA verringern oder aufheben. Sharp, Science 235, 766 (1987); Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55, 1119 (1986); Green, Ann. Rev. Genet. 20, 671 (1986). Mutationsstudien haben ebenfalls gezeigt, dass sich RNA-Sekundärstrukturen, die Spleißstellen involvieren, auf die Spleißeffizienz auswirken können. Solnick, Cell 43, 667 (1985); Konarska et al., Cell 42, 165 (1985).
Die Länge des Introns kann sich ebenfalls auf die Spleißeffizienz auswirken. Durch die Herstellung von Deletionsmutationen unterschiedlicher Größen innerhalb des großen Introns des Kaninchen-β-Globin-Gens bestimmten Wieringa et al., dass die minimale Intronlänge, die für eine korrekte Spleißung erforderlich ist, etwa 69 Nucleotide beträgt. Cell. 37, 916 (1984). Ähnliche Untersuchungen am Intron der Adenovirus-E1A-Region haben gezeigt, dass eine Intronlänge von etwa 78 Nucleotiden zwar eine korrekte Spleißung ermöglicht, aber mit geringerer Effizienz. Eine Steigerung der Länge des Introns auf 91 Nucleotide stellt die normale Spleißeffizienz wieder her, während eine Trunkierung des Introns auf 63 Nucleotide die korrekte Spleißung aufhebt. Ulfendahl et al., Nuc. Acids Res. 13, 6299 (1985).
Um für die Erfindung von Nutzen zu sein, muss das Intron eine Länge aufweisen, die ausreicht, damit die Spleißung des Introns von der mRNA effizient ist. Die Herstellung von Introns mit unterschiedlichen Längen ist ein Routinevorgang und erfolgt durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren, wie beispielsweise Denovo-Synthese oder In-vitro-Deletionsmutagenese eines existierenden Introns. Typischerweise weist das Intron eine Länge von zumindest 150 Nucleotiden auf, da Introns, die kürzer sind, dazu neigen, weniger effizient zu spleißen. Die Obergrenze für die Länge des Introns kann 30 kb oder mehr betragen. Als allgemeine Richtlinie sollte das Intron jedoch weniger als etwa 10 kb lang sein.
Das Intron wird unter Einsatz eines beliebigen der verschiedenen zur Modifikation einer Nucleinsäure in vitro bekannten Verfahren modifiziert, sodass es das selektierbare Gen enthält, das normalerweise nicht im Intron vorhanden ist. Typischerweise wird ein selektierbares Gen in ein Intron eingeführt, indem zuerst das Intron mit einer Restriktionsendonuclease gespalten und dann die resultierenden Restriktionsfragmente mit der korrekten Orientierung für eine Wirtszellexpression kovalent an das selektierbare Gen gebunden werden, beispielsweise durch Ligation mit einem DNA-Ligaseenzym.
Das DNA-Konstrukt ist dicistronisch, d.h. das selektierbare Gen und das Produktgen unterliegen beide der Transkriptionskontrolle einer einzigen Transkriptionsregulationsregion. Wie oben erwähnt umfasst die Transkriptionsregulationsregion einen Promotor. Geeignete Promotorsequenzen zum Einsatz mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Weiterer Hefepromotoren, bei denen es sich um induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil handelt, dass die Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert werden kann, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Verwertbarkeit verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zum Einsatz bei der Hefe-Expression sind bei Hitzeman et al., EP 73.657 A , genauer beschrieben. Hefe-Enhancer können ebenfalls vorteilhaft mit Hefe-Promotoren eingesetzt werden.
Expressionskontrollsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle auf, an der die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstartpunkt vieler Gene befindet, ist eine CXCAAT-Region, wobei X jedes beliebige Nucleotid sein kann.
Eine Produktgen-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, wie z.B. dem Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkom-Virus, Zytomegalievirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere dem Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschockpromotoren und aus dem Promotor, der normalerweise mit dem Produktgen assoziiert ist, erhalten werden, unter der Voraussetzung, dass solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden am besten als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsstartpunkt enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Zytomegalievirus (CMV) wird am besten als HindIII-E-Restriktionsfragment gewonnen. Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Einsatz des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist in US 4.419.446 geoffenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist in US 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982), zur Expression von für Immun-Interferon kodierender cDNA in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982), zur Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors vom Herpes-Simplex-Virus, Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982), zur Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in gezüchteten Maus- und Kaninchenzellen und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982), zur Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, Chinahamster-Ovarialzellen, He- La-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Einsatz der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus als Promotor.
Die Transkriptionsregulationssequenz in höheren Eukaryoten umfasst vorzugsweise eine Enhancer-Sequenz. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Lainins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)) gefunden. Viele Enhancer-Sequenzen sind von Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer von einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100-270), den frühen Zytomegalievirus-Promotor-Enhancer (CMV), den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982), zu Verstärkungselementen zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Die Enhancer können in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zum Produktgen gespleißt werden, vorzugsweise befindet er sich jedoch an einer Stelle 5' vom Promotor.
Das DNA-Konstrukt weist eine Transkriptionsinitiationsstelle auf, die auf eine Transkriptionsregulationsregion folgt, und eine Transkriptionsterminationsregion, die auf das Produktgen folgt (siehe 1A). Diese Sequenzen werden unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren im DNA-Konstrukt bereitgestellt.
Das DNA-Konstrukt stellt normalerweise einen Teil eines Expressionsvektors dar, der auch andere Komponente umfassen kann, wie beispielsweise einen Replikationsstartpunkt (d.h. eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, ein einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren), und, falls erwünscht, ein oder mehrere weitere selektierbare Gene. Die Konstruktion von geeignete Vekto ren, welche die gewünschten Kodier- und Kontrollsequenzen enthalten, erfolgt mittels herkömmlicher Ligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
Im Allgemeinen ist in Klonierungsvektoren der Replikationsstartpunkt einer, der es dem Vektor erlaubt, unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und er umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Seguenzen. Solche Sequenzen sind allgemein bekannt. Der 2-μ-Plasmid-Replikationsstartpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen zweckdienlich. Im Allgemeinen ist die Replikationsstartpunktkomponente bei Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Startpunkt wird typischerweise nur eingesetzt, weil er den frühen Promotor enthält).
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind zu einer Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen in der Lage, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Ein Vektor wird beispielsweise in E. coli kloniert; und dann wird derselbe Vektor zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht in der Lage ist, unabhängig vom Wirtszellchromosom zu replizieren.
Für eine Analyse zur Bestätigung von korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden Plasmide aus den Transformanten hergestellt, durch Restriktion analysiert und/oder gemäß dem Verfahren nach Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 308 (1981), oder dem Verfahren nach Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Der Expressionsvektor mit dem DNA-Konstrukt, wie oben beschrieben hergestellt, wird in eine eukaryotische Wirtszelle transformiert. Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der Vektoren hierin sind Hefe oder höhere Eukaryotenzellen.
Eukaryotische Mikroben, wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe, sind geeignete Wirte für Vektoren, die das Produktgen enthalten. Saccharomyces cerevisiae, oder herkömmliche Backhefe, wird von den niederen eukaryotischen Wirtsorganismen am häufigsten eingesetzt. Eine Reihe von anderen Gattungen, Spezies und Stämmen sind jedoch ebenfalls allgemein erhältlich und hierin zweckdienlich, wie beispielsweise S. pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), Yarrowia ( EP 402.226 ), Pichia pastoris ( EP 183.070 ), Trichoderma reesia ( EP 244,234 ), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 5259-5263 (1979)) und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)).
Zur Expression des Produktgens geeignete Wirtszellen stammen von mehrzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind zur komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur einsetzbar, egal ob aus einer Vertebraten- oder Invertebratenkultur. Beispiele für Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten sowie entsprechende permissive Insekten-Wirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Mücke), Aedes albopictus (Mücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx-mori-Wirtszellen wurden identifiziert. Siehe Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering 8, 277-279, J. K. Setlow et al., Hrsg., Plenum Publishing (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985). Eine Reihe solcher Virusstämme sind öffentlich zugänglich, z.B. die L-1-Variante von Autographa-californica-NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx-mori-NPV, und solche Viren können hierin als Virus gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdäpfeln (Kartoffeln), Soja, Petunien, Paradeisern (Tomaten) und Tabak können als Wirte eingesetzt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das vorher manipuliert wurde, sodass es das Produktgen enthält. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird das Produktgen in den Pflanzenzellwirt transferiert, sodass dieser transfiziert wird und dann unter geeigneten Bedingungen das Produktgen exprimiert. Außerdem stehen Regulations- und Signalsequenzen zur Verfügung, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie beispielsweise der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem sind DNA-Segmente, die aus der Stromaufregion des T-DNA-780-Gens isoliert sind, in der Lage, die Transkription von pflanzenexprimierbaren Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu verstärken. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Das größte Interesse bestand jedoch an Vertebratenzellen, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in einer Kultur (Gewebekultur) hat sich in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren entwickelt (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973)). Beispiele für zweckdienliche Säugetier-Wirtszelllinien sind die mit SV40 transformierte Affennierenlinie CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche embryonale Nierenzelllinie (293-Zellen oder zum Wachstum in einer Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Baby-Hamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen des chinesischen Hamsters/-DNFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216 (1980)); dp12.CHO-Zellen ( EP 307.247 veröffentlicht am 15. März 1989); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen der Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51 ); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die auf geeignete Weise zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert wurden.
Eine Infektion mit Agrobakterium tumefaciens wird zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen eingesetzt, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wurde. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Fällungsverfahren nach Graham und Van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), eingesetzt werden. Allgemeine Aspekte der Transformation von Säugetierzell-Wirtssystemen wurden von Axel in der US 4.399.216 , ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren nach Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Aber auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, beispielsweise durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion, können eingesetzt werden.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die DNA mittels Elektroporation in die Wirtszellen eingeführt. Siehe Andreason, J. Tiss. Cult. Meth. 15, 56-62 (1993), für einen Überblick über Elektroporationsverfahren, die zur Umsetzung der hierin beanspruchten Erfindung geeignet sind. Es wurde herausgefunden, dass Elektroporationsverfahren zur Einführung des DNA-Konstrukts in die Wirtszellen gegenüber Calciumphosphat-Fällungsverfahren zu bevorzugen ist, da Letzteres dazu führen kann, dass die DNA zerbricht und Concatemere bildet.
Die Säugetier-Wirtszellen, die zur Expression des Produktgens hierin eingesetzt werden, können in verschiedenen Medien gezüchtet werden, wie im Abschnitt Definitionen oben erläutert wurde. Die Medien enthalten das Selektionsmittel, das zur Selektion von transformierten Wirtszellen eingesetzt wird, die das DNA-Konstrukt aufgenommen haben (entweder als intra- oder als extrachromosomales Element). Um eine Selektion der transformierten eukaryotischen Zellen zu erreichen, können die Wirtszellen in Zellkulturplatten gezüchtet werden, und einzelne Kolonien, die das selektierbare Gen (und somit das Produktgen) exprimieren, können isoliert und in einem Wachstumsmedium gezüchtet werden, bis die Nährstoffe verbraucht sind. Dann werden die Wirtszellen wie nachstehend erläutert auf Transkription und/oder Transformation analysiert. Die Kulturbedingungen, wie beispielsweise Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die vorher bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden, und sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung somit offensichtlich.
Eine Genamplifikation und/oder -expression kann direkt in einer Probe gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Einsatz einer auf geeignete Weise markierten Sonde, und zwar auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Verschiedene Markierungen können eingesetzt werden, meistens Radioisotope, insbesondere ³²P. Aber auch andere Verfahren können eingesetzt werden, wie beispielsweise die Verwendung von biotinmodifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient in diesem Fall als Stelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit verschiedensten Markierungen markiert sein können, wie beispielsweise Radionucliden, fluoreszierenden Stoffen, Enzymen oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexen, RNA-Duplexen und DNA-RNA-Hybridduplexen oder DNA-Proteinduplexen. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann durchgeführt, während der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung eines Duplex auf der Oberfläche die Gegenwart eines Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, detektiert werden kann.
Alternativ dazu kann die Genexpression durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie beispielsweise durch immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Tests an einer Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Expression eines Genprodukts direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbeverfahren wird eine Zellprobe vorbereitet, typischerweise durch Dehydratation und Fixierung, gefolgt von einer Umsetzung mit markierten Antikörpern, die für das gebundene Genprodukt spezifisch sind, wobei die Markierungen üblicherweise visuell detektierbar sind, wie z.B. enzymatische Markierungen, fluoreszierende Markierungen, lumineszierende Markierungen und dergleichen. Ein besonders empfindliches Färbeverfahren, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, wurde von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734-738 (1980), beschrieben.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die mRNA durch quantitative PCR analysiert (um die Spleißeffizienz zu bestimmen), und die Proteinexpression wird mittels ELISA wie in Beispiel 1 hierin beschrieben gemessen.
Das Produkt von Interesse wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne Sekretionssignal exprimiert wird. Wenn das Produktgen in einer anderen rekombinanten Zelle exprimiert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, dann ist das Produkt von Interesse vollkommen frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch erforderlich, das Produkt von Interesse von rekombinanten Zellproteinen oder -Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen in Bezug auf das Produkt von Interesse sind. Im ersten Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend wird das Produkt von Interesse von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, beispielsweise durch Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselsäure oder auf einem Kationenaustauschharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Präzipitation; Gelelektrophorese unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Chromatographie auf Plasminogensäulen, um das Produkt von Interesse zu binden, und Protein-A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen, wie z.B. IgG, zu entfernen.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen die Erfindung in keinster Weise einschränken.
BEISPIEL 1
tPa-Produktion unter Einsatz der dicistronischen Expressionsvektoren
Es wurde versucht, den Grad der Homogenität in Bezug auf die Expressionswerte von stabilen Klonen durch Expression eines selektierbaren Markers (wie z.B. DHFR) und des Proteins von Interesse aus einem einzelnen Promotor zu erhöhen. Diese Vektoren drängen den Großteil des Transkripts zur Produktexpression, während sie durch differentielle Spleißung ein fixes Verhältnis zur DHFR-Expression bereitstellen.
Vektoren wurden hergestellt, die vom Vektor pRK abgeleitet waren (Suva et al., Science 237, 893-896 (1987)), der ein Intron zwischen dem unmittelbaren frühen Promotor des menschlichen Zytomegalievirus (CMV) und der cDNA enthält, die für das Polypeptid von Interesse kodiert. Das Intron von pRK ist 139 Nucleotide lang, weist eine Spleißdonorstelle auf, die vom unmittelbaren frühen Zytomegalievirus-Gen (CMVIE) stammt, und eine Spleißakzeptorstelle aus einem Gen einer variablen IgG-Schwerkettenregion (V_H)^-(Eaton et al., Biochem. 25, 8343 (1986)).
DHFR/Intron-Vektoren wurden konstruiert, indem ein EvoRV-Linker in die BSTX1-Stelle eingeführt wurde, die im Intron von pRK7 vorhanden war. Ein 830 Basenpaare großes Fragment mit einem Maus-DHFR-Kodierfragment wurde insertiert, um DHFR-Intron-Expressionsvektoren zu erhalten, die sich nur in der Sequenz unterschieden, welche die Spleißdonorstelle enthielt. Diese Sequenzen wurden durch überlappende PCR-Mutagenese verändert, um Sequenzen zu erhalten, welche die gleichen Spleißdonorstellen aufwiesen wie jene, die zwischen Exon 3 und 4 von normalen und mutierten Ras-Gene gefunden wurden. Eine PCR wurde auch eingesetzt, um die Spleißdonorstelle zu zerstören.
Ein Maus-DHFR-cDNA-Fragment (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495-2499 (1983)) wurde 59 Nucleotide stromab von der Spleißdonorstelle in das Intron dieses Vektors insertiert. Die Spleißdonorstelle dieses Vektors wurde durch Mutagenese verändert, um das Verhältnis zwischen gespleißter und nicht gespleißter Nachricht in transfizierten Zellen zu verändern. Es wurde schon vorher gezeigt, dass eine einzige Nucleotidänderung (G in A) eine relativ effiziente Spleißdonorstelle, die sich im normalen ras-Gen befand, in eine ineffiziente Spleißstelle verwandelt (Cohen et al., Nature 334, 119-124 (1988)). Diese Wirkung wurde im Zusammenhang mit dem ras-Gen aufgezeigt und bestätigt, als diese Sequenzen in menschliche Wachstumshormonkonstrukte transferiert wurden (Cohen et al., Cell 58, 461-472 (1989)). Außerdem wurde eine nichtfunktionelle 5'-Spleißstelle (GT in CA) als Kontrolle (ΔGT) konstruiert. Ein Polylinker wurde 35 Nucleotide stromab der 3'-Spleißstelle insertiert, um die cDNA von Interesse aufzunehmen. Ein Vektor, der tPA enthielt (Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983)), wurde stromab von der Polyadenylierungsstelle linearisiert, bevor er in CHO-Zellen eingeführt wurde (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161 (1984)).
Plasmid-DNAs, die DHFR/Intron, tPA und (a) Wildtyp-ras (WT-ras), d.h. 3 (Seq.-ID Nr. 1), (b) eine ras-Mutante oder (c) eine nichtfunktionelle Spleißdonorstelle (ΔGT) enthielten, wurden mittels Elektroporation in CHO-DHFR-minus-Zellen eingeführt. Die Intron-Vektoren wurden jeweils stromab von der Polyadenylierungsstelle durch Restriktionsendonucleasenbehandlung linearisiert. Der Kontrollvektor wurde stromab von der zweiten Polyadenylierungsstelle linearisiert. Die DNAs wurden nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion ethanolgefällt und in 20 μl 1/10 Tris-EDTA resuspendiert. Dann wurden 10 μg DNA mit 10⁷ CHO.dp12-Zellen ( EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) in 1 ml PBS 10 min lang auf Eis inkubiert, bevor eine Elektroporation bei 400 Volt und 330 μf unter Verwendung eines „BRL Cell Porator" durchgeführt wurde.
Die Zellen wurden wieder 10 min lang auf Eis gegeben, bevor sie in ein nichtselektives Medium plattiert wurden. Nach 24 Stunden wurden den Zellen nucleosidfreies Medium zugegeben, um auf stabile DHFR⁺-Klone zu selektieren, die gepoolt wurden. Die gepoolten DHFR⁺-Klone wurden lysiert, und mRNAs wurden hergestellt.
Um die mRNA herzustellen, wurde RNA aus 5 × 10⁷ Zellen extrahiert, die aus Pools aus mehr als 200 Klonen gezüchtet worden waren, die von der stabilen Transfektion der drei Vektoren, deren wesentliche Konstruktion in 1B dargestellt ist, und von nichttransfizierten CHO-Zellen stammten. RNA wurde über Oligo-DT-Cellulase (Collaborative Biomedical Products) gereinigt. 10 μg mRNA wurde dann einem Northern-Blotting unterzogen, bei dem die mRNA auf einem 1,2-%-Agarose-, 6,6-%-Formaldehydgel laufen gelassen wurde, und in einen Nylonfilter (Strategene-Duralon-UV-Membran) transferiert, prähybridisiert, sondiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen.
Der Filter wurde nacheinander unter Einsatz von Sonden sondiert (dargestellt in 1B), die (a) die Vollängen-Nachricht, (b) sowohl die Vollängen- als auch die gespleißte Nachricht oder (c) β-Actin detektieren würden. Eine Sondierung mit der langen Sonde zeigte, dass der Vektor, der die effiziente Spleißdonorstelle (d.h. WT-ras) enthielt, überwiegend eine mRNA mit der für das gespleißte Produkte vorhergesagten Größe erzeugt, während die anderen beiden Vektoren vorwiegend eine mRNA ergaben, deren Größe einer nichtgespleißten Nachricht entsprach. Die DHFR-Sonde detektierte nur Vollängen-Nachrichten und zeigte, dass der vom WT-ras-Spleißdonor stammende Vektor sehr wenig Volllängen-Nachrichten erzeugt, mit denen ein DHFR-positiver Phänotyp verliehen werden kann.
4 zeigt die Anzahl an DHFR-positiven Kolonien, die nach doppelt durchgeführten Elektroporationen mit den drei oben beschriebenen Intron-Vektoren und aus einem herkömmlichen Vektor, der einen tPA antreibenden CMV-Promotor und einen DHFR antreibenden SV-Promotor aufwies, erhalten wurden (siehe 2). Die Steigerung der Kolonienzahl verläuft parallel zur Steigerung der Vollängen-Nachrichten, die mit der Modifikation der Spleißdonorstellen akkumulierten. Der herkömmliche Vektor erzeugt effizient Kolonien und unterscheidet sich nicht signifikant vom ΔGT-Konstrukt.
Der Grad der tPA-Expression wurde bestimmt, indem Zellen in 1 ml F12-DMEM (50:50, mit 5 % FBS) in 24-Well-Schalen fast bis zur Konfluenz ausgesät wurden.
Das Wachstum der Zellen wurde fortgesetzt, bis das Medium verbraucht war. Dann wurde das Medium durch ELISA auf tPA-Produktion getestet. Kurz gesagt wurde ein Anti-tPa-Antikörper auf die Wells einer ELISA-Mikrotititerplatte aufgetragen, und Medienproben wurden zu den Wells zugesetzt, gefolgt von einem Waschvorgang. Die Bindung des Antigens (tPA) wurde dann unter Einsatz von mit Meerrettichperoxidase (HRPO) markiertem Anti-tPA-Antikörper quantifiziert.
5A zeigt die Titer eines sekretierten tPA-Proteins nach dem Poolen der Klone der in 4 gezeigten einzelnen Gruppen. Während die Anzahl an Kolonien bei einer Abschwächung der Spleißdonorfunktion zunahm, trat bei tPA-Expression das Gegenteil auf. Die Expressionswerte stimmten mit den beobachteten RNA-Produkten überein; wenn mehr der dicistronischen Nachricht gespleißt wird, enthält eine größere Menge der Nachricht tPA als erstes offenes Leseraster, was in einer erhöhten tPA-Expression resultiert. Eine Mutation von GT in CA an der Spleißdonorstelle resultiert in einem Überfluss an DHFR-positiven Kolonien, die undetektierbare Werte von tPA exprimieren, was möglicherweise auf eine ineffiziente Nutzung des zweiten AUG zurückzuführen ist. Wichtig ist, dass 5A auch zeigt, dass die Expressionswerte, die durch einen der dicistronischen Vektoren (mit WT-ras-SD) erhalten wurden, etwa dreimal höher waren als die eines Kontrollvektors mit einem tPA antreibenden CMV-Promotor/Enhancer, einem DHFR kontrollierenden SV40-Promotor/Enhancer und SV40-Polyadenylierungssignalen, welche die Expression von tPA und DHFR kontrollieren.
Weiters wurde die Homogenität der Expression in den Pools untersucht. 5B zeigt, dass alle 20 Klone, die durch die von einer WT-ras-Spleißdonorstelle abgeleiteten dicistronischen Vektoren erzeugt wurden, detektierbare Werte an tPA exprimieren, während nur 4 von 20 Klonen, die durch den Kontrollvektor erzeugt wurden, tPA exprimieren. Keiner der mit dem nichtspleißenden (ΔGT) Vektor transfizierten Klone exprimierte durch ELISA detektierbare tPA-Werte. Diese Erkenntnis stimmt mit früheren Beobachtungen überein, dass relativ wenig Klone, die mit herkömmlichen Vektoren erzeugt werden, brauchbare Proteinwerte ergeben.
Die Expression von tPA wurde nach einer Methotrexat-Amplifikation von Pools gesteigert. 5C zeigt, dass 2 der aus einem dicistronischen Vektor gebildeten Pools (d.h. mit WT-ras- und ras-MUTANTE-SD-Stellen) eine deutliche Expressionssteigerung aufwiesen (8,4- und 7,7fach), während- der durch den herkömmlichen Vektor gebildete Pool nur eine leichte Steigerung (2,8fach) aufwies, wenn diese 200 nM Mtx ausgesetzt wurden. Eine Gesamtsteigerung auf das 9fache wurde erreicht, wenn der beste dicistronische (WT-ras-SD) im Gegensatz zum herkömmlichen Vektor nach einer Amplifikation eingesetzt wurde. Das Wachstum des am stärksten exprimierenden Pools in einem nährstoffreichen Produktionsmedium ergab Titer von 4,2 μg/ml tPA.
Es wurde gezeigt, dass die Manipulation der Spleißdonorsequenz das Verhältnis zwischen gespleißter und Volllängen-Nachricht und die Anzahl an Kolonien, die sich im selektiven Medium bildet, verändert. Außerdem wurde gezeigt, dass dicistronische Expressionsvektoren Klone erzeugen, die hohe Werte an rekombinanten Proteinen erzeugen. Überraschenderweise war es möglich, starke Expressoren, welche die effiziente WT-ras-Spleißdonorstelle aufwiesen, durch Selektion auf DHFR⁺-Zellen zu isolieren, trotz der Effizienz, mit der das DHFR-Gen von den in diesen Zellen gebildeten RNA-Vorläufern gespleißt wurde.
BEISPIEL 2
TNFr-IgG-Produktion unter Einsatz der dicistronischen Expressionsvektoren
Um die allgemeine Anwendbarkeit dieses Ansatzes zu beweisen, wurde ein zweites Produkt im dicistronischen Vektorsystem evaluiert, das als DNA von Interesse ein Immunadhäsin (TNFr-IgG) enthielt, das zur Bindung des Tumornekrosefaktors (TNF) in der Lage war (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991)). Die im obigen Beispiel 1 beschriebenen Versuche wurden im Wesentlichen wiederholt, mit der Ausnahme, dass das Produktgen für das Immunadhäsin TNFr-IgG kodierte. Plasmid-DNAs, die eine TNFr-IgG-cDNA und (a) WT-ras, d.h. 6 (Seq.-ID Nr. 2), (b) eine ras-Mutante oder (c) eine nichtfunktionelle Spleißdonorstelle (ΔGT) enthielten, wurden in die in Beispiel 1 erläuterten dp12.CHO-Zellen eingeführt. Siehe 1C für eine Veranschaulichung der DNA-Konstrukte.
Es wurde entdeckt, dass die Anzahl an DHFR-positiven Kolonien, die durch drei dieser Vektoren erzeugt wurden, ähnlich war wie bei den tPA-Konstrukten. Die Expression von TNFr-IgG verlief ebenfalls parallel mit den tPA-Konstrukten (7A). Eine Amplifikation von Pools aus zwei der Konstrukte ergab eine deutliche Steigerung der Expression von Immunadhäsin (9,6- und 6,8fach) (7B). Die besten dieser amplifizierten Pools exprimierten 9,5 μg/ml, wenn sie in einem nährstoffreichen Produktionsmedium gezüchtet wurden.
Somit wurde erneut gezeigt, dass dicistronische Expressionsvektoren Klone erzeugen, die hohe Werte an rekombinanten Proteinen exprimieren. Außerdem wurde entgegen der Erwartungen entdeckt, dass die Isolation von stark produktexprimierenden DHFR⁺-Wirtszellen unter Einsatz einer effizienten Spleißdonorstelle (d.h. der WT-ras-Spleißdonorstelle) möglich war.
BEISPIEL 3
Antikörperproduktion unter Einsatz eines dicistronischen Expressionsvektors
Die Zweckdienlichkeit dieses System zur Antikörperexpression wurde beurteilt, indem die Produktion eines gegen IgE gerichteten Antikörpers getestet wurde (Presta et al., Journal of Immunology 151, 2623-2632 (1993)). Weiters wurde die Flexibilität des Systems in Bezug auf die Transkriptionsinitiation getestet, indem der CMV-Promotor/Enhancer in den vorangehenden Vektoren durch den Promotor/Enhancer ersetzt wurde, der von der frühen Region des SV40-Virus stammte (B. Griffin, Structure and Genomic Organization of SV40 and Polyoma Virus, in: J. Tooze, Hrsg., DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Die Schwerkette des Antikörpers wurde stromab von DHFR insertiert, wie in den vorangegangenen tPA- und TNFr-IgG-Konstrukten beschrieben. Außerdem wurde eine neue Spleißdonorstellensequenz (GAC:GTAAGT) in den Vektor eingebaut, die mehr mit der Consensus-Spleißdonorstelle übereinstimmte als die Spleißdonorstellen in den in Beispiel 1 und 2 getesteten Vektoren. Der resultierende Expressionsvektor ist in 1D und 9 dargestellt.
Es wurde herausgefunden, dass dieser Vektor weniger Kolonien erzeugt als die vorher getesteten Vektoren und vorwiegend ein gespleißtes RNA-Produkt produzierte. Ein zweiter Vektor wurde konstruiert, der die Leichtkette des Antikörpers unter Kontrolle des SV40-Promotors/Enhancers und Poly-A und das Hygromycin-B-Resistenzgen unter Kontrolle des CMV-Promotors/Enhancers und SV40-Poly-A aufwies. Diese Vektoren wurden an einzigartigen HpaI-Stellen stromab vom Poly-A-Signal linearisiert, in einem Verhältnis zwischen Leichtkettenvektor und Schwerkettenvektor von 10:3 vermischt und unter Einsatz eines optimierten Protokolls (wie in Beispielen 1 und 2 erläutert) in CHO-Zellen elektroporiert.
11 zeigt die Werte der Antikörperexpression durch Klone und Pools nach einer Selektion in Hygromycin B, gefolgt von einer Selektion auf DHFR-Expression. Alle 20 der analysierten Klone exprimierten hohe Werte eines Antikörpers, wenn sie in einem reichen Medium gezüchtet wurden, und unterschieden sich voneinander nur um einen Faktor 4. Ein Pool von antikörperproduzierenden Klonen wurde hergestellt und kurz nach seiner Herstellung analysiert. Dieser Pool wurde 6 Wochen lang kontinuierlich gezüchtet, ohne dass ein signifikanter Produktionsabfall auftrat, was zeigt, dass seine Stabilität ausreichte, um Gramm-Mengen eines Proteins aus seiner Massenkultur zu gewinnen.
Der Pool wurde einer Methotrexat-Amplifikation bei 200 nM und 1 μM unterzogen und ergab eine mehr als 2fache Erhöhung des Antikörpertiters. Der 1-μM-Mtxresistente Pool ergab einen Titer von 41 mg/l, wenn er unter optimalen Bedingungen in einer Suspensionskultur gezüchtet wurde.
Die Struktur des exprimierten Antikörpers wurde untersucht. Proteine, die durch den 200-nM-Methotrexat-resistenten Pool und durch einen gut charakterisierte Expressionsklon, der durch herkömmliche Vektoren erzeugt worden war (Presta et al., w.o. (1993)), exprimiert wurden, wurden metabolisch mit S³⁵-Cystein und Methionin markiert. Im Speziellen wurden konfluente 35-mm-Platten von Zellen metabolisch mit 50 μCi von jeweils S-35-Methionin und S-35-Cystein (Amersham) in serumfreiem Cystein und methioninfreiem F12:DMEM markiert. Nach einer Stunde wurde ein nährstoffreiches Produktionsmedium zugesetzt, und markierte Proteine wurden weitere sechs Stunden lang in das Medium „verdrängen" gelassen. Die Proteine wurden auf einem 12 % SDS/PAGE-Gel (NOVEX) laufen gelassen, entweder nicht reduziert oder nach einer Reduktion mit B-Mercaptoethanol. Getrocknete Gele wurden 16 Stunden lang einem Film ausgesetzt. CHO-Kontrollzellen wurden ebenfalls markiert.
Der Großteil des Antikörperproteins wird mit einem Molekulargewicht von etwa 155 Kilodalton sekretiert, was mit einem passend disulfidgebundenen Antikörpermolekül mit 2 leichten und 2 schweren Ketten übereinstimmt. Bei einer Reduktion verschiebt sich das Molekulargewicht zu 2 etwa gleich zahlreichen Proteinen mit 22,5 und 55 Kilodalton. Das aus dem Pool erzeugte Protein ist nicht vom Antikörper unterscheidbar, der durch den gut charakterisierten Expressionsklon erzeugt wird, ohne scheinbare Steigerung der freien Schwer- oder Leichtkette, die vom Pool exprimiert wird.
SCHLUSSFOLGERUNG
Das hierin beschriebene effiziente Expressionssystem nutzt Vektoren, die aus Promotor/Enhancer-Elementen gefolgt von einem Intron, das die für den selektierbaren Marker kodierende Sequenz enthält, gefolgt von cDNA von Interesse und einem Polyadenylierungssignal bestehen.
Mehrere Spleißdonorstellensequenzen wurden auf ihre Auswirkung auf die Kolonienzahl und Expression der cDNA von Interesse getestet. Eine nichtfunktionelle Spleißdonorstelle, Spleißdonorstellen, die sich in einem Intron zwischen Exon 3 und 4 von mutierten (ras-Mutante-) und normalen (WT-ras-) Formen des Harvey-Ras-Gens befinden, und eine weitere effiziente SD-Stelle (siehe Beispiel 3) wurden verwendet. Die Vektoren wurden so entworfen, dass sie die Expression von dicistronischen primären Transkripten steuerten. Innerhalb einer transfizierten Zelle bleiben einige der Transkripte in voller Länge erhalten, während der Rest gespleißt wurde, um die für DHFR kodierende Sequenz herauszuscheiden. Wenn die Spleißdonorstelle geschwächt oder zerstört wird, ist eine Steigerung der Kolonienzahl zu beobachten.
Die Homogenität der Expression von Klonen, die durch die ras-Spleißdonorstelle-Intron-DHFR-Vektoren hergestellt wurden, wurde mit Klonen verglichen, die aus einem herkömmlichen Vektor mit einem separaten Promotor/Enhancer und Polyadenylierungssignal für DHFR bzw. tPA hergestellt wurden. Der DHFR-Intron-Vektor ergibt Kolonien, die in Bezug auf die Expression viel homogener sind als jene, die aus dem herkömmlichen Vektor hergestellt werden. Nichtexprimierende Klone, die vom herkömmlichen Vektor abstammen, können das Ergebnis von Brüchen in der tPA- oder TNHFr-IgG-Domäne des Plasmids während der Integration in das Genom oder das Ergebnis der Methylierung von Promotorelementen sein (Busslinger et al., Cell 34, 197-206 (1983); Watt et al., Genes and Development 2, 1136-1143 (1988)), welche die tPA- oder TNFr-IgG-Expression antreiben. Das Verstummen eines Promotors durch Methylierung oder Brüche in den DHFR-Intron-Vektoren würde sie wahrscheinlich unfähig machen, einen DHFR-positiven Phänotypen zu verleihen.
Es wurde herausgefunden, dass durch die DHFR-Intron-Vektoren hergestellte Pools in Methotrexat amplifiziert werden könnten, und ihre Expression würde um einen Faktor von 8,4 (tPA) oder 9,8 (TNFr-IgG) steigen. Pools aus herkömmlichen Vektoren stiegen nur um das 2,8- und 3,0fache für tPA und TNFr-IgG, wenn sie auf ähnliche Weise amplifiziert wurden. Amplifizierte Pools ergaben 9fach höhere tPA-Werte und 15fach höhere TNFr-IgG-Werte, wenn sie mit den mit einem herkömmlichen Vektor amplifizierten Pools verglichen wurden.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie einzuschränken, sei erwähnt, dass die Steigerung der Expression von methotrexatresistenten Pools, die von den dicistronischen Vektoren abgeleitet sind, wahrscheinlich auf die Transkriptionsbindung von DHFR und dem Produkt zurückzuführen ist; wenn Zellen für eine erhöhte DHFR-Expression ausgewählt werden, tritt durchwegs eine Überexpression des Produkts auf. Her kömmlichen Ansätzen fehlt ein selektierbarer Marker und eine cDNA-Expressionsbindung, sodass eine Methothrexat-Amplifikation oft eine DHFR-Überexpression erzeugt, ohne dass eine begleitende Steigerung der Produktexpression zu beobachten wäre.
Eine weitere Steigerung der Expression um das 4- und 6,3fache wurde erreicht, wenn amplifizierte tPA- und TNFr-IgG-Pools aus dem Medium, das für die Selektionen und Amplifikationen eingesetzt wurde, in ein nährstoffreiches Produktionsmedium transferiert wurden.
In Beispiel 3 wies der Expressionsvektor eine Spleißdonorstelle auf, die stärker mit der Consensus-Spleißdonorstelle übereinstimmte und die Schwerkette eines humanisierten Anti-IgE-Antikörpers stromab insertiert hatte. Dieser Vektor wurde linearisiert und mit einem zweiten linearisierten Vektor coelektroporiert, der das Hygromycin-Resistenzgen und die leichte Kette des Antikörpers jeweils unter Kontrolle seines eigenen Promotors/Enhancers und seiner Poly-A-Signale exprimierte. Ein Überschuss eines Leichtketten-Expressionsvektors über den dicistronischen Schwerketten-Expressionsvektor wurde verwendet, um eine Beeinflussung zugunsten einer Leichtkettenexpression vorzunehmen. Klone und ein Pool wurden nach einer Hygromycin-B- und DHFR-Selektion hergestellt. Es zeigte sich, dass die Klone relativ gleichmäßige, hohe Antikörperwerte exprimierten, genauso wie der Pool. Der 1-μM-Pool ergab einen Titer von 41 mg/l, wenn er unter optimalen Bedingungen in einer Suspensionskultur gezüchtet wurde.
Der Anti-IgE-Antikörper wurde durch metabolische Markierung, gefolgt von einer SDS/PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen bewertet, und es zeigte sich, dass er vom Protein, das durch eine hochcharakterisierte klonale Zelllinie exprimiert wurde, nicht unterscheidbar war. Von spezieller Bedeutung ist die Erkenntnis, dass in Bezug auf den Klon keine freie Leichtkette im Pool vorhanden ist.
Ein stabiles Expressionssystem für CHO-Zellen wurde entwickelt, das rasch und mit geringerem Aufwand als bei anderen Expressionssystemen hohe Werte von rekom binanten Proteinen ergibt. Das Vektorsystem erzeugt stabile Klone, die gleichmäßig hohe Werte exprimieren, wodurch die Anzahl an Klonen verringert wird, die gescreent werden muss, um eine hochproduktive klonale Linie zu erhalten. Alternativ dazu wurden Pools eingesetzt, um mäßige bis- hohe Proteinwerte zu erhalten. Dieser Ansatz kann von speziellem Nutzen sein, wenn eine Reihe von verwandten Proteinen exprimiert und verglichen werden soll.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, ist es möglich, dass die Vektoren, die sehr effiziente Spleißdonorstellen aufweisen, äußerst produktive Klone erzeugen, da so wenige Transkripte ungespleißt bleiben, dass nur Integrationsvorgänge, die zur Bildung von hohen RNA-Werten führen, genug DHFR-Protein erzeugen, um Kolonien in einem selektiven Medium zu ermöglichen. Die hohen Werte einer gespleißten Nachricht von solchen Klonen wird dann in große Mengen des Proteins von Interesse translatiert. Pools von Klonen, die gleichzeitig durch Einführung von herkömmlichen Vektoren hergestellt wurden, exprimierten geringere Werte eines Proteins und waren instabil in Bezug auf eine langfristige Expression, und außerdem konnte die Expression nicht merklich gesteigert werden, wenn die Zellen einer Methotrexat-Amplifikation unterzogen wurden.
Das hierin entwickelte System ist vielseitig in dem Sinne, dass es eine rasche Erzeugung von ein- oder mehrteiligen Polypeptiden aus Klonen oder Pools von stabilen Transfektanten ermöglicht. Dieses Expressionssystem vereinigt die Vorteile von vorübergehenden Expressionssystemen (rasche und nicht arbeitsintensive Erzeugung von für Forschungszwecke ausreichenden Mengen eines Proteins) mit der gleichzeitigen Entwicklung von stabilen Produktionszelllinien mit höherer Produktivität.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Konstrukt, umfassend eine Transkriptionsinitiationsstelle, eine Transkriptionsterminationsstelle, ein selektierbares Gen, ein Produktgen, das 3' zum selektierbaren Gen liegt, eine Transkriptionsregulationsregion, die sowohl die Transkription des selektierbaren Gens als auch des Produktgens reguliert, wobei das selektierbare Gen innerhalb eines Introns mit einer Spleißdonorstelle 5' zum Intron liegt, worin die Spleißdonorsequenzstelle unter Nutzung der Transkriptionsregulationsregion die Expression des Produktgens reguliert und das selektierbare Gen ein amplifizierbares Gen ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin die Spleißdonorstelle eine Consensus-Spleißdonorsequenz umfasst.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin die Spleißdonorstelle die Sequenz GACGTAAGT umfasst.
DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das amplifizierbare Gen DHFR ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin die Transkriptionsregulationsregion einen Promotor und einen Enhancer umfasst.
Vektor, der ein DNA-Konstrukt nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.
Vektor nach Anspruch 6, der zur Replikation in einem eukaryotischen Wirt fähig ist.
Eukaryotische Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 umfasst.
Eukaryotische Wirtszelle, die ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Eukaryotische Wirtszelle, die ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, integriert in ein Chromosom der Wirtszelle umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Säugetierzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts von Interesse, umfassend das Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 8 bis 11, um das Produktgen zu exprimieren, und das Gewinnen des Produkts aus der Wirtszellenkultur.
Verfahren nach Anspruch 12, umfassend die Gewinnung des Produkts aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts von Interesse, umfassend das Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Expression des Produktgens in einem selektiven Medium, das ein Amplifikationsmittel umfasst, für eine ausreichende Zeitspanne, um Amplifikation zu ermöglichen, und das Gewinnen des Produkts.
Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen Zellen, die mehrfache Kopien eines Produktgens aufweisen, umfassend das Transformieren von eukaryotischen Zellen mit einem DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das Züchten der Zellen in einem selektiven Medium, das ein Amplifikationsmittel umfasst, für eine ausreichende Zeitspanne, um Amplifikation zu ermöglichen, und das Selektieren von Zellen, die mehrere Kopien des Produktgens aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 15, worin das DNA-Konstrukt mittels Elektroporation in die eukaryotischen Zellen eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, das weiters das Züchten der selektierten Zellen zur Expression des Produktgens sowie das Gewinnen des Produkts von Interesse aus den selektierten Zellen umfasst.