DE69535419T2

DE69535419T2 - Antikörper die einen Erythropoietinrezeptor aktivieren

Info

Publication number: DE69535419T2
Application number: DE69535419T
Authority: DE
Inventors: Steven G. Newbury Park ELLIOTT
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-07-26
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: ATE356148T1; DE69524102T2; CA2195868A1; ES2283355T3; NZ290689A; EP1146056B1; DK1146056T3; DE69535419D1; DK0773962T3; CN1158134A; EP1146056A1; US20070014793A1; EP0773962A1; ES2168376T3; JP2000095800A; JPH09508535A; SI0773962T1; US5885574A; AU3149995A; IL114717A0

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Antikörper und bivalente Fragmente davon, die einen Erythropoietinrezeptor erkennen und aktivieren und die Erythropoese stimulieren.
Hintergrund der Erfindung
Erythropoietin (EPO) ist ein Glycoproteinhormon, das am Wachstum und an der Reifung von erythrozytären Vorläuferzellen zu Erythrozyten beteiligt ist. EPO wird während der fötalen Lebensphase von der Leber und bei Erwachsenen von der Niere hergestellt und stimuliert die Produktion von roten Blutzellen aus Erythrozyten-Vorläufern. Eine verringerte Produktion von EPO, die bei Erwachsenen häufig als ein Ergebnis von Nierenversagen auftritt, führt zu Anämie. EPO wird mit Hilfe gentechnologischer Methoden hergestellt, zu denen die Expression und Sekretion des Proteins aus einer Wirtszelle, die mit dem für Erythropoietin kodierenden Gen transfiziert wurde, gehören. Die Verabreichung von rekombinantem EPO war bei der Behandlung von Anämie wirksam. Zum Beispiel beschreiben Eschbach et al. (N. Engl J Med 316, 73 (1987)) die Verwendung von EPO, um einer Anämie entgegenzuwirken, die die Folge von chronischem Nierenversagen war.
Die Aufreinigung von menschlichem EPO aus Urin wurde von Miyake et al (J. Biol. Chem 252, 5558 (1977)) beschrieben. Die Identifizierung, Klonierung und Expression von Genen, die für Erythropoietin kodieren, ist in dem US Patent 4,703,008 von Lin beschrieben. Eine Beschreibung eines Verfahrens zur Aufreinigung von rekombinantem EPO aus Zellmedium ist in dem US Patent 4,667,016 von Lai et al. enthalten.
Über den Mechanismus, mit dem EPO die Erythropoese stimuliert, ist wenig bekannt. Während es klar ist, dass EPO Zellen zum Wachsen und/oder Differenzieren aktiviert, indem es an spezifische Zelloberflächenrezeptoren bindet, sind der spezifische Aktivierungsmechanismus sowie die Struktur des Rezeptors und der assoziierten Proteine unvollständig verstanden. Man nimmt an, dass der Erythropoietinrezeptor (EPO-R in Form eines multimeren Komplexes vorliegt. Sedimentationsstudien deuteten darauf hin, dass sein Molekulargewicht 330 ± 48 kDa beträgt (Mayeux et al. Eur. J. Biochem. 194, 271 (1990)). Quervernetzungsstudien zeigten, dass der Rezeptorkomplex aus wenigstens zwei unterscheidbaren Polypeptiden besteht, einer 66-72 kDa großen Spezies und 85 kDa und 100 kDa grossen Spezies (Mayeux et al. J. Biol. Chem. 266, 23380 (1991)); McCaffery et al, J. Biol. Chem. 264, 10507 (1991)). Ein unterscheidbares 95 kDa-Protein wurde auch mittels Immunpräzipitation des EPO-Rezeptors nachgewiesen (Miura & Ihle Blood 81, 1739 (1993)). Eine andere Quervernetzungsstudie zeigte drei EPO umfassende Komplexe mit Molekulargewichten von 110, 130 und 145 kDa. Die Komplexe mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und 145 kDa umfassten den EPO-Rezeptor, da sie mit gegen den Rezeptor gerichteten Antikörpern immunpräzipitiert werden konnten (Miura & Ihle, wie oben). Die Expression eines am C-Terminus verkürzten EPO-Rezeptors führte zum Nachweis des 110 kDa-Komplexes, aber nicht des 145 kDa-Komplexes. Dies legt nahe, dass der Komplex mit dem höheren Molekulargewicht Polypeptide umfasst, die in dem 110 kDa-Komplex vorhanden sind, sowie ein zusätzliches 35 kDa-Protein.
Weitere Erkenntnisse hinsichtlich der Struktur und der Funktion des EPO-Rezeptorkomplexes wurden nach der Klonierung und Expression der Maus- und der menschlichen EPO-Rezeptoren erhalten (D'Andrea et al. Cell 57, 277 (1989); Jones et al. Blood 76, 31 (1990); Winkelmann et al. Blood 76, 24 (1990); PCT-Anmeldung WO 90/08822; US Patent 5,278,065 von D'Andrea et al.). Der menschliche Volllängen-EPO-Rezeptor ist ein Transmembranprotein mit 483 Aminosäuren mit einer ungefähr 224 Aminosäuren umfassenden extrazellulären Domäne und einem 25 Aminosäuren umfassenden Signalpeptid. Der menschliche Rezeptor zeigt eine ungefähr 82%ige Aminosäuresequenzhomologie mit dem Mausrezeptor. Es ist gezeigt worden, dass der klonierte und in Säugetierzellen exprimierte Vollängen-EPO-Rezeptor (66-72 kDa) EPO mit einer Affinität bindet (100-300 nM), die ähnlich derjenigen des nativen Rezeptors auf erythrozytären Vorläuferzellen ist. Daher glaubt man, dass diese Form die den für die EPO-Bindung maßgeblichen Faktor umfasst, und sie wird als der EPO-Rezeptor bezeichnet. Die als Teil eines quervemetzten Komplexes beobachteten 85 kDa- und 100 kDa-Proteine sind von dem EPO-Rezeptor unterscheidbar, müssen aber in grosser Nähe zu EPO vorliegen, weil EPO mit ihnen quervernetzt werden kann. Die 85 kDa- und 100 kDa-Proteine sind miteinander verwandt, und das 85 kDa-Protein ist möglicherweise ein proteolytisches Spaltprodukt der 100 kDa-Spezies (Sawyer J. Biol. Chem. 264, 13343 (1989)).
Es wurde eine lösliche (verkürzte) Form des EPO-Rezeptors, die nur die extrazelluläre Domäne umfasst, hergestellt, und man hat festgestellt, dass sie EPO mit einer Affinität von ungefähr 1 nM oder mit ungefähr 3-10-fach niedrigerer Affinität bindet als es der Volllängen-Rezeptor tut (Harris et al. J. Biol. Chem. 267, 15205 (1992); Yang & Jones Blood 82, 1713 (1993)). Der Grund für die im Vergleich zu dem Volllängen-Protein verringerte Affinität ist nicht bekannt. Es besteht die Möglichkeit, dass auch andere Proteinspezies Teil des EPOR-Komplexes sind und zur EPO-Bindung beitragen und somit die Affinität erhöhen. Diese Möglichkeit wird durch die Beobachtung von Dong & Goldwasser gestützt (Exp. Hematol. 21, 483 (1993)), dass die Fusion einer Zellinie mit einem EPO-Rezeptor geringer Affinität mit einer CHO-Zelle, die EPO nicht bindet, eine hybride Zellinie ergab, bei der der Rezeptor eine hohe Bindungsaffinität für EPO zeigte. Zusätzlich führte die Transfektion eines Vollängen-EPOR in CHO-Zellen zu einer Zellinie mit Rezeptoren von sowohl hoher als auch niedriger Affinität, wie mittels Scatchard-Analyse bestimmt wurde. Die Erhöhung der Zahl der EPOR-Kopien erhöhte die Bindung mit niedriger Affinität, nicht aber die mit hoher Affinität. Diese Ergebnisse sind mit dem Vorhandensein einer begrenzten Menge eines Proteins konsistent, das in CHO-Zellen vorhanden ist und den EPOR niedriger Affinität zu einem mit hoher Affinität umwandelt.
Die Aktivierung des EPO-Rezeptors hat mehrere biologische Wirkungen. Drei der Aktivitäten umfassen die Stimulierung der Proliferation, die Stimulierung der Differenzierung und die Inhibition von Apoptose (Liboi et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 11351 (1993); Koury Science 248, 378 (1990)). Die Signaltransduktionswege, die zu einer Stimulierung der Proliferation und der Differenzierung führen, können anscheinend getrennt werden (Noguchi et al. Mol. Cell. Biol. 8, 2604 (1988); Patel et al. J. Biol. Chem. 267, 21300 (1992); Liboi et al. wie oben). Einige Ergebnisse legen nahe, dass möglicherweise ein zusätzliches Protein zum Vermitteln des Differenzierungssignals notwendig ist (Chiba et al. Nature 362, 646 (1993); Chiba et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11593 (1993)). Die Rolle von zusätzlichen Proteinen hinsichtlich der Differenzierung ist jedoch umstritten, da eine konstitutiv aktivierte Form des Rezeptors sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung stimulieren kann (Pharr et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 938 (1993)).
Die Aktivierung des EPO-Rezeptors beruht möglicherweise auf seiner Dimerisierung. Das heißt, dass EPO als Quervemetzer zwischen zwei EPO-Rezeptormolekülen wirken kann. Es gibt Belege, die diesen Vorschlag stützen. Eine Mutation von Arginin zu Cystein an Position 129 des murinen EPO-Rezeptors führt zu einer konstitutiven Aktivierung des Rezeptors, vermutlich weil zwischen zwei Rezeptoruntereinheiten eine Disulfidbindung gebildet wird (Yoshimura et al. Nature 348, 647 (1990)). Zusätzlich wird EPOR in multimeren Komplexen in Zellen gefunden (Miura & Ihle Arch. Biochem. Biophys. 306, 200 (1993)). Eine Isolierung einer stabilen multimeren Form von aufgereinigtem, löslichem EPO-Rezeptor ist jedoch nicht berichtet worden. Zudem ist es möglich, dass eine Dimerisierung von EPOR erforderlich ist, sie selbst für eine vollständige Aktivierung von Zellen jedoch nicht ausreichend ist. Zum Beispiel könnte eine Dimerisierung zu einem proliferativen Signal, aber nicht zu einem Differenzierungssignal führen. Das heißt, dass zusätzliche Proteine erforderlich sein können, um das Differenzierungssignal zu senden.
Die mögliche Beziehung zwischen einer EPO-Rezeptordimerisierung und -aktivierung kann ausgenutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die von EPO verschieden sind, aber den Rezeptor aktivieren. Zum Beispiel besitzen Antikörper zwei identische Antigen-Bindungsstellen. Ein anti-EPOR-Antikörper kann zwei EPOR-Moleküle binden und könnte sie zueinander in große Nähe bringen, um eine Dimerisierung zu ermöglichen. Um in vivo zu funktionieren, müssen diese Antikörper den EPOR auf Zelloberflächen erkennen und auf eine Weise binden, die eine Aktivierung des Signaltransduktionswegs zulässt. Zudem ist es wünschenswert, dass die Aktivierung sowohl zu einer Proliferation als auch zu einer Differenzierung von erythrozytären Vorläufern führt. Über einen ähnlichen Ansatz mit dem Ziel, die Aktivierung des menschlichen Wachstumshormonrezeptors (Fuh et al. Science 256 1677 (1992)) und des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (Schreiber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7535 (1981)) zu verstehen, ist berichtet worden.
Es wäre wünschenswert, Moleküle zu identifizieren, die die Eigenschaft haben, den EPO-Rezeptor zu aktivieren und die Erythropoese zu stimulieren. Um dies zu tun, ist ein Verständnis des Mechanismus der EPO-Rezeptoraktivierung und der Signaltransduktion wichtig. Ein Ansatz mit dem Ziel, diesen Mechanismus aufzuklären, könnte sein, Antikörper zu identifizieren, die den EPO-Rezeptor in der Weise erkennen, dass der Rezeptor aktiviert und die Erythropoese stimuliert wird. Solche Antikörper sind bei therapeutischen und diagnostischen Anwendungen nützlich und wären ebenso nützlich, um die EPO-Rezeptorfunktion zu erforschen.
Die folgenden Literaturstellen beschreiben Antikörper, die an den Maus- oder an den menschlichen EPO-Rezeptor binden:
D'Andrea et al. in The Biology of Hemtaopoiesis, Wiley-Liss, Inc. (1990) S. 153-159, erzeugten polyklonale anti-Peptid-Antikörper gegen ein N-terminales und ein C-terminales Peptid des murinen EPO-Rezeptors. Es wurde gezeigt, dass die Antikörper in einem Western-Blot mit dem Maus-EPO-Rezeptor reagieren.
Bailey et al. Exp. Hematol, 21, 1535-1543 (1993) erzeugten polyklonale anti-Peptid-Antikörper gegen synthetische Peptide, die zu den extrazellulären und cytoplasmatischen Domänen des Maus-EPO-Rezeptors homolog waren. Eine Aktivierung des Rezeptors durch diese Antikörper, die mittels 3H-Thymidinaufnahme in Milzzellen von mit Phenylhydrazin behandelten Mäusen gemessen wurde, wurde nicht festgestellt.
Baynes et al. Blood 82, 2088-2095 (1993) erzeugten einen polyklonalen Antikörper gegen ein N-terminales Peptid des menschlichen EPO-Rezeptor. Es wurde gezeigt, dass der Antikörper mit einer löslichen Form des in menschlichem Serum vorhandenen Rezeptors reagiert.
D'Andrea et al. Blood 82, 46-52 (1993) erzeugten monoklonale Antikörper gegen den menschlichen EPO-Rezeptor. Die Antikörper binden an Ba/F3-Zellen, die mit dem menschlichen EPO-cDNA-Klon transfiziert worden waren, und einige inhibieren die EPO-Bindung und neutralisieren EPO-abhängiges Wachstum.
Fischer et. al. Blood 82, 197A (1993) verwendeten die gleichen monoklonalen Antikörper, wie sie in D'Andrea, oben, beschrieben wurden, um erythrozytäre Vorläuferzellen mit EPO-abhängigem Wachstum und ihre Reifung von denjenigen zu unterscheiden, bei denen Wachstum und Reifung von EPO unabhängig sind.
Von keinem der in den zuvor genannten Literaturstellen beschriebenen Antikörpern wurde berichtet, dass er den EPO-Rezeptor aktivieren oder das Wachstum und/oder die Reifung von erythrozytären Vorläuferzellen stimulieren würde.
Deshalb ist es ein Zweck der Erfindung, Antikörper und bivalente Fragmente davon herzustellen, die einen EPO-Rezeptor erkennen und zwischen den Aminosäureresten 49-78 derart daran binden, dass der Rezeptor aktiviert wird. Es ist ein weiterer Zweck der Erfindung, Antikörper und bivalente Fragmente davon zu produzieren, die an einen EPO-Rezeptor zwischen den Aminosäureresten 49-78 binden und die Erythropoese durch das Stimulieren der Proliferation und/oder der Differenzierung von Erythrozyten-Vorläuferzellen zu Erythrozyten zu stimulieren. Solche Antikörper und bivalenten Fragmente davon sind bei der Behandlung von Anämie oder bei der Diagnose von Krankheiten nützlich, die durch einen funktionsgestörten EPO-Rezeptor gekennzeichnet sind. Weiterhin können solche Antikörper und bivalente Fragmente davon zur Identifizierung von therapeutischen Mitteln zur Behandlung von Anämie führen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Antikörper oder bivalente Fragmente davon, wie sie in Anspruch 1 definiert sind. Das Screenen von Antikörpern, die den menschlichen EPO-Rezeptor erkennen, hat gezeigt, dass zwei Antikörper, die als Mab 71 und Mab 73 bezeichnet wurden, die Proliferation von UT7-EPO-Zellen stimulierten, einer EPO-abhängigen Zellinie, die bei Abwesenheit von hinzugegebenem EPO nicht proliferiert. Darüber hinaus stimulierte Mab 71 die Erythrozyten-Koloniebildung aus Erythrozyten-Vorläufern in menschlichem Blut. Die Antikörper sind bevorzugterweise monoklonale Antikörper und können humanisierte oder menschliche Antikörper sein. Ebenso sind Hybridom-Zellinien, die die Antikörper der Erfindung produzieren, umfasst.
Es werden auch Verfahren und Kits zum Nachweisen von EPO-Rezeptoren in biologischen Proben bereitgestellt, wobei die Verfahren und Kits EPO-Rezeptor-Antikörper oder bivalente Fragmente davon gemäß der Erfindung umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die EPO-Rezeptor-Antikörper oder bivalente Fragmente davon und pharmazeutisch akzeptable Adjuvantien umfassen, sind ebenso von der Erfindung umfasst. Solche Zusammensetzungen können verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die Störungen aufweisen, die durch niedrige Konzentrationen an Erythrozyten gekennzeichnet sind.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Ergebnisse eines ELISA-Tests, mit dem die Bindung von Mab 71 an die angegebenen Konzentrationen von synthetischen Peptiden gemessen wurde. Die Peptide entsprechen den angegebenen Aminosäureresten des menschlichen EPO-Rezeptors. Rest 1 ist das N-terminale Prolin, das bei sekretiertem EPOR nach der Abspaltung der Leader-Sequenz gefunden wird.
2 zeigt die Wirkung von verschiedenen Mengen des rHuEPO-Proteins und von aufgereinigtem Mab 71 und Mab 73 auf die ³H-Thymidinaufahme durch UT7-EPO-Zellen.
3 zeigt die Wirkung von verschiedenen Mengen des rHuEPO-Proteins, Mab 71, Mab 73 oder einem nicht-neutralisierenden gegen EPO gerichteten Kontroll-Mab (Mab F12) auf die Inhibition der ¹²⁵I-EPO-Bindung an die EPO-Rezeptoren auf der Oberfläche von OCIM1-Zellen.
4 zeigt ein Coomassie-gefärbtes SDS-Gel von aufgereinigten Zubereitungen der monoklonalen Antikörper 71 und 73 sowie von monoklonalen Antikörperfragmenten (Fabs), die von Mab 71 und Mab 73 abgeleitet sind. Die Proben wurden entweder unter reduzierenden (mit 2-Mercaptoethanol) oder nicht-reduzierenden (ohne 2-Mercaptoethanol) Bedingungen laufen gelassen.
5 zeigt die Wirkung von verschiedenen Mengen des aufgereinigten rHuEPO-Protein, von Mab 71 oder Fab 71 auf die ³H-Thymidinaufhahme durch UT7-EPO-Zellen.
6 zeigt die Wirkung von verschiedenen Mengen von aufgereinigtem Mab 71 oder Fab 71 auf die ³H-Thymidinaufnahme durch UT7-EPO-Zellen, zu denen auch 30 mEinheiten/ml rekombinantes menschliches EPO (rHuEPO) hinzugegeben wurden.
7 zeigt ein Foto von aufgereinigten CD 34⁺-Zellen aus dem peripheren Blut, die 21 Tage lang in Methylcellulose bei Anwesenheit von EPO oder Mab 71 unter serumfreien Wachstumsbedingungen wachsen gelassen wurden. Die Fotos stammen von Zellen, die mit 500 mEinheiten/ml EPO (A), 25 mEinheiten/ml EPO (B) oder 2,1 Mikrogramm/ml Mab 71(C) inkubiert wurden.
8 zeigt die Wirkung von verschiedenen Mengen rHuEPO, Mab 71 und von einem monoklonalen Kontrollantikörper, der gegen Her2/neu hergestellt wurde, auf die Bildung von Erythrozyten-Kolonien aus Erythrozyten-Vorläufern, wenn man diese unter serumfreien Wachstumsbedingungen in Weichagar angezogen hat.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Monoklonale Antikörper (Mabs), die den Erythropoietinrezeptor erkennen, wurden durch das Immunisieren von Mäusen mit aufgereinigtem löslichen menschlichen EPO-Rezeptor erzeugt. Der lösliche menschliche EPO-Rezeptor wurde wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben exprimiert und aufgereinigt. Von denjenigen Mabs, die mit dem löslichen menschlichen EPO-Rezeptor in Enzym-gekoppelten Immunosorbens-Tests (ELISAs) reagierten, wurden 96 Mabs für ein weiteres Screenen ausgewählt. Diese Mabs wurden mittels BIAcore-Analyse auf EPO-Rezeptorbindung (Beispiel 4A) und mittels FACS auf Bindung an den EPO-Rezeptor auf der Oberfläche von transfizierten CHO-Zellen (Beispiel 4C) untersucht. Die Ergebnisse dieser Screenings sind in Tabelle 1 gezeigt. Während eine Reihe von Antikörpern an den EPO-Rezeptor banden, wie durch B1Acore-Analyse bestimmt wurde, banden nur fünf der 96 untersuchten Antikörper an den EPO-Rezeptor, der auf der Oberfläche von transfizierten CHO-Zellen gezeigt wurde, wie durch FACS-Scanning bestimmt wurde. 24 Antikörper, die bei ELISA-Tests positiv waren (einschließlich der fünf, die beim FACS-Scanning positiv waren), wurden auf eine Stimulierung der UT7-EPO-Zellproliferation untersucht. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass zwei der Antikörper, die als Mab 71 und Mab 73 bezeichnet wurden, die Aufnahme von 3H-Thymidin durch eine UT7-EPO-Zellinie (Komatsu et al. Blood 82 456 (1993)) bei Abwesenheit von EPO stimulierten (Beispiel 8A). Die UT7-EPO-Zellinie benötigt zum Wachsen die Anwesenheit von EPO in ihrem Medium. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass die Stimulierung des UT7-EPO-Zellwachstums auf der Aktivierung des EPO-Rezeptors durch Mab 71 und Mab 73 beruht. Wie in 2 gezeigt, war die Reaktion der UT7-EPO-Zellen bei Anwesenheit von Mab 71 stärker als bei Anwesenheit von Mab 73. Es wurde weiterhin festgestellt, dass Mab 71 die Erythrozyten-Koloniebildung aus menschlichen Erythrozyten-Vorläufern (siehe Beispiel 9) stimulierte. Dies ist der erste Fall, bei dem ein Antikörper die Bildung von Erythrozynte-Kolonien aus Erythrozyten-Vorläufern stimuliert.
Die Erfindung stellt einen Antikörper oder ein Fragment davon bereit, der/das einen Erythropoietinrezeptor aktiviert und an ein Peptid aus den Aminosäureresten 49-78 bindet. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Aktivierung eines EPO-Rezeptors" einen oder mehrere molekulare Prozesse, die ein EPO-Rezeptor durchläuft, die zu einer Übertragung eines Signals an das Innere einer rezeptortragenden Zelle führen, wobei das Signal letztendlich eine oder mehrere Veränderungen bezüglich der die zellulären Physiologie herbeiführt. Die zellulären Antworten auf die EPO-Rezeptoraktivierung sind typischerweise Veränderungen hinsichtlich der Proliferation oder der Differenzierung von rezeptortragenden Zellen. Rezeptortragende Zellen sind typischerweise Erythrozyten-Vorläuferzellen. Gegenwärtig sind die molekularen Ereignisse, die zu einer Signalübertragung durch den EPO-Rezeptor führen, kaum verstanden. Jedoch legen einige Belege, wie im Hintergrundteil angedeutet, nahe, dass zumindest die EPO-Rezeptor-Dimerisierung ein Ereignis ist, das für die Aktivierung wahrscheinlich erforderlich ist. Die vorliegende Offenbarung stützt diese Vorstellung ebenfalls. Wie in 5 gezeigt wird, wird die Stimulierung der ³H-Thymidinaufnahme durch UT7-EPO-Zellen durch Mab 71 beendet, wenn er durch das als Fab 71 bezeichnete entsprechende Fab-Fragment ersetzt wird. Deshalb beseitigt das Ersetzen des intakten, bivalenten Antikörpers durch ein entsprechendes monovalentes Fragment die proliferative Antwort. Zudem inhibiert Mab 71 bei hohen Konzentrationen die Aktivierung des EPO-Rezeptors. Diese beiden Beobachtungen stützen das Dimerisierungsmodell der Aktivierung für den den EPO-Rezeptor. Von Mab 71 wurde gezeigt, dass er mit einem synthetischen Peptid aus den Resten 49 bis 78 des menschlichen EPO-R wechselwirkt (siehe Beispiel 6). Somit kann diese Region von EPO-R eine Aktivierung von EPO-R bewirken, wenn sie durch einen Quervernetzer wie Mab 71 gebunden ist. Moleküle, die zwei EPO-R-Moleküle durch das Binden an die Reste 49 bis 78 quervernetzen, stellen die Erfindung dar. Diese Moleküle sind Antikörper oder bivalente Fragmente davon, die die Eigenschaft besitzen, zwei EPO-Rezeptoren durch das Binden an Reste querzuvernetzen, die von der Region zwischen den Resten 49 und 78 umfasst sind, was zu einer Dimerisierung und einer Aktivierung des EPO-Rezeptors führt.
EPO-Rezeptoren, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, werden bevorzugterweise EPO-Rezeptoren von Säugetieren und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der menschliche EPO-Rezeptor sein. Es wird verstanden, dass Analoga der menschlichen EPO-Rezeptoren ebenfalls von der Erfindung umfasst sind. Solche Analoga werden durch Insertionen, Deletionen, Erweiterungen oder Substitutionen von Aminosäuren in der menschlichen EPO-Rezeptorsequenz hergestellt. Beispiele für EPO-R-Analoga sind in US Patent 5,292,654 von Yoshimura et al. beschrieben worden, wobei die Substitution eines Cysteinrests an Position 129 der EPOR-Aminosäuresequenz zu einem konstitutiv aktivierten EPOR führte. Im allgemeinen können EPO-R-Analoga die Aminosäureänderungen in Regionen aufweisen, die verschieden sind von den Antikörperbindungsdomänen, die für die Aktivierung erfoderlich sind, wobei die Analoga die Sekundär- und Tertiärstruktur des menschlichen EPO-Rezeptors beibehalten, durch die Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannt werden. Es wurde gezeigt, dass Mab 71 mit einem synthetischen Peptid aus den Resten 49 bis 78 des menschlichen EPO-R wechselwirkt (siehe Beispiel 6). Deshalb ist es wahrscheinlich, dass EPO-R-Analoga die Änderungen der Aminosäurereste aufweisen, die verschieden von denjenigen an den Positionen 49 bis 78 sind, und die die Sekundär- und Tertiärstruktur des menschlichen EPO-Rezeptors beibehalten, von Mab 71 erkannt werden. Die Numerierung der Aminosäurereste des menschlichen EPOR-Polypeptides, wie sie hierin verwendet wird, beginnt mit dem Prolin an Position 1, das nach Abspaltung des 25 Aminosäuren umfassenden Signalpeptids der N-terminale Rest ist.
Antikörper der Erfindung binden an ein Epitop auf einem EPO-Rezeptor, das die Aminosäurereste 49 bis 78 im menschlichen EPO-R überspannt. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass Mab 71 ein Epitop auf dem EPO-R erkennt, das ganz oder teilweise durch diese Sequenz definiert ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Epitop" die Region eines EPO-R, die durch einen Antikörper gebunden wird, wobei das Binden die Assoziation eines zweiten Antikörpers mit dem EPO-R verhindert.
Die Erfindung stellt auch polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper und bivalente Fragmente davon bereit. Antikörperfragmente umfassen diejenigen Fragmente, die einen EPO-Rezeptor aktivieren, indem sie an ein Epitop auf einem Peptid binden, das die Aminosäurereste 49-78 des EPO-R umfasst. Es sind auch humanisierte Antikörper umfasst, die typischerweise durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, wobei menschliche Sequenzen einen Teil von oder einen ganzen Antikörper der Erfindung umfassen. Beispiele für humanisierte Antikörpern umfassen chimäre oder CDR-Implantat-Antikörper (US Patente 4,816,567 und 5,225,539). Die Antikörper der Erfindung können auch eine an ihnen angebrachte nachweisbare Markierung aufweisen. Eine solche Markierung kann eine fluoreszierende (z. B. Fluoresceinisothiocyanat, FITC), enzymatische (z. B. Meerrettichperoxidase), Affinitäts-(z. B. Biotin) oder Isotopenmarkierung (z. B. ¹²⁵1) sein.
Von der Erfindung sind auch Hybridom-Zellinien umfasst, die einen monoklonalen Antikörper der Erfindung herstellen. Die Erzeugung von Hybridom-Zellinien, die monoklonale Antikörper gegen menschlichen EPO-R herstellen, wird in Beispiel 3 beschrieben. Die Hybridom-Zellinie, die Mab 71 produziert, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD am 26. Juli 1994 unter der Zugangsnr. HB11689 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie, die Mab 73 herstellt, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MI) am 26. Juli 1994 unter der Zugangsnr. HB 11690 hinterlegt.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind beim Diagnostizieren von Anämie und von anderen Krankheiten nützlich, die durch einen funktionsgestörten EPO-R gekennzeichnet sind. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Nachweisen eines EPO-Rezeptors in einer biologischen Probe, der in der Lage ist, aktiviert zu werden, die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper, der einen EPO-Rezeptor aktiviert; und (b) Nachweisen der Aktivierung des Rezeptors durch den Antikörper. Die biologischen Proben umfassen Gewebeproben, intakte Zellen oder Extrakte davon. Antikörper können als ein Teil eines diagnostischen Kits verwendet werden, um die Anwesenheit von EPO-Rezeptoren in einer biologischen Probe nachzuweisen. Solche Kits verwenden Antikörper mit einer angebrachten Markierung, um einen Nachweis zu ermöglichen. Die Antikörper sind beim Identifizieren von normalen oder abnormalen Rezeptoren nützlich. Die Anwesenheit von abnormalen Rezeptoren in einer biologischen Probe kann Störungen wie die Diamond-Blackfan-Anämie anzeigen, bei denen geglaubt wird, dass der EPO-Rezeptor funktionsgestört ist.
Antikörper der Erfindung sind beim Behandeln von Störungen nützlich, die durch niedrige Konzentrationen der Erythrozyten gekennzeichnet sind. Verfahren zum Modulieren der endogenen Aktivität eines EPO-Rezeptors in einem Säugetier, bevorzugterweise Verfahren zum Erhöhen der Aktivität eines EPO-Rezeptors, sind von der Erfindung umfasst. Im allgemeinen kann jeder durch Erythropoietin behandelbare Zustand, wie beispielsweise Anämie, ebenfalls durch die Antikörper der Erfindung behandelt werden. Therapeutische Antikörper werden in einer Menge und über einen Verabreichungsweg verabreicht, der mit Blick auf die Natur und Schwere des zu behandelnden Zustandes geeignet ist und der durch einen Fachmann festgelegt werden kann. Bevorzugterweise erfolgt die Verabreichung über eine Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös.
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers umfasst, der einen EPO-R aktiviert zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans, wobei als das Adjuvans eines oder mehr als eines der folgenden ausgewählt werden kann: ein Verdünnungsmittel, Träger, Konservierungsstoff, Emulgator, Antioxidans und/oder Stabilisator. Eine "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet, wie hierin verwendet, die Menge Antikörper, die eine therapeutische Wirkung im Hinblick auf einen gegebenen Zustand und ein gegebenes Verabreichungsschema bereitstellt. Bei der vorliegenden Erfindung ist die therapeutische Wirkung die Stimulierung der Produktion von Erythrozyten, wie durch einen Anstieg des Hämatokrit bei dem behandelten Patienten belegt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper humanisierte oder menschliche Antikörper, die unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Vorgehensweisen hergestellt werden können. Pharmazeutisch akzeptable Adjuvantien sind den Fachleuten bekannt und werden umfassend in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl. A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1990) im Überblick dargestellt.
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, werden aber nicht als deren Umfang beschränkend aufgefasst.
BEISPIEL 1
Herstellung von löslichem menschlichem Erythropoietinrezeptor
A. Isolierung von Klonen zur Expression von löslichem menschlichem Erythropoietinrezeptor
Unter Verwendung eines Klons, der den menschlichen Erythropoietinrezeptor wie von Jones et al, oben, beschrieben umfasst, wurde die PCR-Technik verwendet, um einen Klon zur Expression von löslichem menschlichem Erythropoietimezeptor (sHuEPOR) zu erhalten. Die Primer für die PCR-Amplifizierung von menschlichem Erythropoietinrezeptor waren:
5'-Primer:
CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT (SEQ. ID NO:1); und
3'-Primer:
CAG GTC TAG ATT ACT AGG GAT CCA GGT CGC TAG GC (SEQ. ID NO:2)
Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 2,5 ng eines den menschlichen EPOR enthaltenden Plasmides, von 5 pMol von jedem der obigen Oligonukleotidprimer, 10 mM TrisHCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM von jedem dNTP und 1 Einheit TagPolymerase durchgeführt. Die Amplifizierung lief über 5 Zyklen aus 30 s bei 94°C, 1 min bei 50°C, 1 min bei 72°C, gefolgt von 20 Zyklen aus 30 s bei 94°C, 1 min bei 55°C, 1 min bei 72°C. Die DNA wurde durch das Hindurchführen durch eine G-50-Größenausschluß-Säule (Boehringer Mannheim Corp.) aufgereinigt, dann mit HindIII und XbaI verdaut und in den Expressionsvektor pDSRα2 (DeClerck et al. J. Biol. Chem. 266 3893 (1991)) ligiert, der ebenso mit HindIII und XbaI verdaut worden war. Klone, die das erwünschte Insert enthielten, wurden durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert.
Der d40EPOR-Klon wurde mittels PCR aus einem menschlichen Volllängen-EPOR-Klon (siehe oben) hergestellt. Der C-Terminus von d40EPOR ist Tyr467, das Ergebnis des Hinzufügens eines Stopcodons innerhalb des Primer. Die Primer für die PCR-Amplifizierung waren:
5'-Primer:
5'-CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT-3 (SEQ. ID NO:1); und
3'-Primer:
5'-AGG TCG ACT ACT AGT AGT CAG TTG AGA-3' (SEQ. ID NO:3)
Für die PCR-Amplifizierung wurde pfu-Polymerase in pfu-Puffer 2 (Stratagene, La Jolla, CA) verwendet. Die Reaktionsbedingungen waren: 1 Zyklus aus 30 s bei 96°, 1 min bei 45°, 1 min bei 72°; 25 Zyklen aus 1 min bei 96°, 1 min bei 55°, 2 min bei 72°. Eine fünfminütige 72°- Schlußinkubation wurde anschließend durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Agarosegelelektrophorese getrennt, und die Bande bei etwa 1,3 kb wurde unter Verwendung eines Gene Clean Kits (BIO 101, Vista, CA.) isoliert. Das aufgereinigte Fragment wurde in PCR II ligiert (TA Klonierungskit, Invitrogen, San Diego, CA). Die Rekombinanten wurden mittels Restriktionsanalyse identifiziert und sequenziert, um zu bestätigen, dass die erwünschten Inserts vorhanden waren. Ein HindIII-SalI-Fragment wurde wie oben beschrieben isoliert und in einen isolierten pDSRc2-Vektor ligiert, der zuvor mit HindIII und SalI geschnitten worden war. Der sich dabei ergebende Vektor, pDSRαEPORd40 wurde zur Expression in CHO-Zellen verwendet.
B. Expression von löslichem menschlichem EPOR und d40-EPOR in CHO-Zellen
Das Expressionsplasmid pDSRα2-EPOR-X enthält Sequenzen, die für die menschlichen EPOR-Aminosäuren Met1-Pro249 kodieren, wie in Jones et al., oben gezeigt wird. Das Plasmid pDSRαEPORd40 enthält Sequenzen, die für Met1-Tyr467 kodieren. Zehn Mikrogramm jedes Plasmids wurden unabhängig durch Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al. Cell 11 233 (1977)) in CHO-Zellen eingeführt. Einzelne Kolonien wurden auf der Grundlage der Expression des Dihydrofolatreduktasegens aus dem Vektor selektioniert. Die Expression von menschlichem EPOR wurde mit Hilfe von RNA-Hybridisierung (Hunt et al, Exp. Hematol, 19: 779 (1991)) und durch Western-Immunoblotting unter Verwendung eines affinitätsgereinigten Antikörpers verfolgt. Die Zelllinien, die bei diesem Test positiv waren, wurden für eine weitere Expansion selektioniert. Die Zellinien wurden an 30 nM Methotrexat (Mtx) gewöhnt, um die Vervielfachung der EPO-R-Expression zu stimulieren.
Die Erzeugung von konditionierten Medien, die löslichen menschlichen EPOR umfassten, wurde sowohl in Rollerflaschen als auch in einem Hohlfaser-Bioreaktor durchgeführt. Die Rollerflaschen wurden mit 2 × 10⁷ Zellen in 200 ml Wachstumsmedium angeimpft (DMEM: Ham's F12 (1:1), supplementiert mit nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 30 nM Mtx und 5% fötalem Rinderserum (FBS) (Reagentien von GIBCO, Grand Island, NY)). Nach dem Erreichen von Konfluenz nach 3-4 Tagen wurden die Medien durch 200 ml DMBM: Ham's F12, NEAA, 30 nM Mtx ohne Serum ersetzt. Konditioniertes Medium wurde nach 6-7 Tagen geerntet und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Die zweiten und dritten Ernten wurden gesammelt.
Eine Cell Pharm-Bioreaktorpatrone wurde mit 5 × 10⁸ Zellen in Wachstumsmedium (wie oben) angeimpft, das mit 5 g/ml Gentamicin supplementiert war. Der pH wurde bei 7,3 gehalten. Von Tag 12 nach dem Animpfen an wurden die Zellen von Serum entwöhnt, um serumfreie konditionierte Medien zu erzeugen. Das Ernten der konditionierten Medien begann am Tag 17.
BEISPIEL 2
Aufreinigung von löslichem menschlichem Erythropoietin-Rezeptor
Es wurden vier verschiedene Zubereitungen von löslichem rekombinanten menschlichen EPOR hergestellt. Bei der ersten Zubereitung wird epoxyaktivierte Sepharose 6 B (Pharmacia, Piscataway, NJ) im Wesentlichen gemäß den Anweisungen des Herstellers an rekombinantes menschliches Erythropoietin (rHuEPO) gekoppelt. 218 mg rHuEPO in 4,5 ml 32 mM ZnCl₂ wird zu 7,2 g epoxyaktivierter Sepharose 6 B, die zuvor hydratisiert und mit H₂O gewaschen wurde, hinzugegeben. Dieser Schlamm wird auf pH 10,8 titriert und dann über Nacht bei Zimmertemperatur gemischt. Alle verbleibenden reaktiven Gruppen werden anschließend durch Zugabe von Ethanolamin zu einer Endkonzentration von 1 M blockiert und 4 Stunden lang bei Zimmertemperatur gemischt. Die darauf folgenden Schritte werden bei 8° ± 2°C durchgeführt. Das gekoppelte Harz (Epoxy-EPO) wird in eine Säule gepackt und mit abwechselnden Zyklen aus 0,5 M NaCl/0,1 M HOAc pH 4 und 0,5 M NaCl/0,1 M Borat pH 8 gewaschen. Die Säule wird mit 140 mM NaCl/10 mM Tris pH 7,6 (TBS) äquilibriert. Sie wird mit 1560 ml in Rollerflaschen-hergestelltem konditionierten Medium von CHO-Zellen, die löslichen EPO-R (sHuEPO-R) exprimieren, beladen. Nachdem das Beladen abgeschlossen ist, wird die Säule mit 300 mM NaCl/10 mM Tris pH 7,6 gewaschen, dann wird der gebundene sHuEPOR mit 1 M NaCl/3 M Harnstoff/10 mM Tris pH 7,6 eluiert. Zwei UV₂₈₀-absorbierende Peaks eluieren mit diesem Puffer. Der zweite eluierende Peak, der den sHuEPOR enthält, wird gesammelt und 20-fach mit H₂O verdünnt. Der verdünnte gesammelte Peak wird dann auf eine vorgepackte 1 ml-Mono Q-Säule (Pharmacia) geladen und mit einem NaCl-Gradienten in 10 mM Tris pH 7,6 eluiert. Ein einzelner Peak eluiert, der vereinigt, in Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gefroren gelagert wird.
Bei der zweiten Zubereitung wird eine größere Epoxy-EPO-Säule hergestellt. 20,4 g epoxyaktivierte Sepharose 6 B werden hydratisiert und mit H₂O, dann mit Aceton und schließlich mit 50% Formamid in H₂O pH 10,6 gewaschen. 729 mg rHuEPO in 15 ml H₂O werden auf pH 10,6 titriert, zu dem Harz hinzugegeben und über Nacht bei Zimmertemperatur gemischt. Alle verbleibenden reaktiven Gruppen werden dann durch Zugabe von Ethanolamin auf eine Endkonzentration von 1 M blockiert und 140 Minuten lang bei Zimmertemperatur gemischt. Die darauf folgenden Schritte werden bei 8° ± 2°C durchgeführt. Das Epoxy-EPO wird in eine Säule gepackt und mit 3 M Harnstoff/750 mM NaCl/10 mM Tris pH 7,6 gewaschen; die Säule wird dann mit TBS äquilibriert. 100 ml von im Bioreaktor produzierten konditionierten Medien aus CHO-Zellen, die sHuEPOR exprimieren, werden mit 2 ml Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gemischt. Es folgte eine dreißigminütige Inkubation bei 8° ± 2°C unter häufigem Mischen, dann wird durch einen 0,45 μm Cellulosenitrat-Bottle-Top-Filter (Corning) filtriert. Das Filtrat wird auf die Epoxy-EPO-Säule geladen, mit 250 mM NaCl/10 mM Tris pH 7,6 gewaschen, dann mit 3 M Harnstoff 750 mM NaCl/10 mM Tris pH 7,6 eluiert. Der eluierte Peak wird gesammelt und 20-fach mit H₂O verdünnt. Der verdünnte gesammelte Peak wird dann auf eine 15 ml Q Sepharose Fast Flow-Säule geladen und mit einem NaCl-Gradienten in 10 mM Tris pH 7,6 eluiert. Der einzelne Peak, der eluiert, wird vereinigt, in Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gefroren gelagert.
Bei der dritten Zubereitung wird die gleiche Epoxy-EPO-Säule verwendet, die bei der Zubereitung 2 verwendet wird. 850 ml in Rollerflaschen produziertes, konditioniertes Medium aus CHO-Zellen, die sEPOR exprimieren, werden mit 1,7 ml Q Sepharose Fast Flow gemischt. Es wird auf die gleiche Weise wie bei Zubereitung 2 verarbeitet.
Bei der vierten Zubereitung werden 7,25 1 im Bioreaktor produziertes, konditioniertes Medium aus CHO-Zellen, die sHuEPOR exprimieren, mit 110 ml Q Sepharose Fast Flow gemischt. Es wird 1 Stunde lang bei 8 ± 2°C unter häufigem Mischen inkubiert, dann durch einen 0,45 μm Cellulosenitrat-Bottle-Top-Filter filtriert. Das Filtrat wird dann mit 7,25 1 H₂O verdünnt und auf eine 770 ml Q Sepharose Fast Flow-Säule, die in 20 mM Tris PH 7,6 äquilibriert ist, geladen. Die Säule wird mit einem NaCl-Gradienten in 20 mM Tris pH 7,6 eluiert. Fraktionen, die, wie auf der Grundlage einer SDS-PAGE-Analyse beurteilt, signifikante Mengen sHuEPOR enthalten, werden vereinigt. Festes (NH₄)₂SO₄ wird den vereinigten Fraktionen zu einer Endkonzentration von 1,2 M hinzugegeben, die dann durch einen 0,45 μm Cellulosenitrat-Bottle-Top-Filter filtriert werden. Das Filtrat wird auf eine 60 ml-Phenylsepharose 6-Säule (low sub, Pharmacia) geladen und mit einem abnehmenden Gradienten von 1,2 M auf 0 M (NH₄)₂SO₄ in 20 mM Tris pH 7,6 eluiert. Der Hauptelutionspeak wird gesammelt und bezüglich (NH₄)₂SO₄ auf 2,4 M eingestellt, um den sHuEPORt auszufüllen. Der ausgefällte sHuEPOR wird mittels Zentrifugation geerntet, in H₂O resuspendiert und mit Tris-HCl auf pH 7,9 titriert. Die sich dabei ergebende Lösung wird durch einen 0,45 μm Cellulosenitrat-Filter gefiltert, in Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gefroren gelagert.
BEISPIEL 3
Zubereitung und Screening von Hybridoma-Zellinien
A. Enzym-gekoppelter Immunosorbens-Test (EIA)
EIAs wurden anfangs durchgeführt, um die Serum-Antikörper (Ab)-Titer von einzelnen Tieren zu bestimmen und später zum Screenen auf potentielle Hybridome. Mikrotitrations-EIA/RIA-Platten mit flachem Boden, hoher Bindung und 96 Reaktionsnäpfen (Costar Corporation, Cambridge, MA) wurden mit aufgereinigtem sHuEPOR bei 5 μg pro ml Carbonat-Hydrogencarbonatpuffer, pH 9,2 (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃) beschichtet. Fünfzig μl des Ab wurden zu jedem Reaktionsnapf hinzugegeben. Die Platten wurden dann mit einem Acetatfilm (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) abgedeckt und wurden bei Zimmertemperatur (RT) 2 Stunden lang oder über Nacht auf einer schwenkenden Plattform bei 4°C inkubiert. Die sHuEPOR-Charge #1 wurde nach der ersten und zweiten Auffrischung verwendet, die Charge #2 wurde nach der dritten Auffrischung verwendet. Die sHuEPOR-Chargen #3 und 4 wurden zum Screenen von Hybridomen verwendet. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei RT mit 250 μl 5% BSA-Lösung pro Reaktionsnapf blockiert, die durch das Mischen von 1 Teil BSA-Verdünnungsmittel/Blockierlösungskonzentrat (Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc.) mit 1 Teil entionisiertem Wasser (H₂O) hergestellt wurde. Nachdem die Blockierlösung verworfen war, wurden 50 μl 2-fach-Verdünnungen des Serums (1:400 bis 1:51.200) oder Hybridoma-Gewebekulturüberstände zu jedem Reaktionsnapf hinzugegeben. Als Serumverdünnungsmittel wurde 1% BSA (10% BSA-Verdünnungsmittel/Blockierlösungskonzentrat, 1:10 verdünnt in Dulbecco's Phosphatgepufferter Salzlösung, D-PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY) verwendet, während die Hybridoma-Überstände unverdünnt untersucht wurden. Zur Untersuchtung von Hybridomen wurde ein Reaktionsnapf als Konjugat-Kontrolle behalten, und ein zweiter Napf als eine positive Ab-Kontrolle. Die Platten wurden wieder 1 Stunde lang unter Schwenken bei RT inkubiert, dann 4-mal unter Verwendung einer 1 x-Zubereitung eines 20x-Waschlösungs- Konzentrats (Kirkegaard und Perrry Laboratories, Inc.) in dH₂O gewaschen. Ziegen-anti-Maus-IgG Antikörper gegen die schwere und die leichte Kette, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) und 1:1000 in 1% BSA verdünnt war, wurde dann in jedem Napf 30 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen, trocken getupft, und es wurde ABTS-Peroxidase-Einkomponentensubstrat (Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc.) hinzugegeben. Die Extinktion wurde bei 405 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-EL310-Lesegerätes bei jedem Reaktionsnapf abgelesen (Bio-tek Instruments, Inc., Winooski, VT). Der halbmaximale Titer an Serumantikörper wurde durch das Auftragen des log₁₀ der Serumverdünnung gegen die optische Dichte bei 405 nm und anschließendem Extrapolieren am 50%-Punkt der maximalen optischen Dichte, die bei diesem Serum erhalten wurde, berechnet. Die Hybridome wurden als positiv selektioniert, wenn die optische Dichte einen größeren Wert als das 5-fache über dem Hintergrund aufwies.
B. Immunisierung
Zehn 4,5 Wochen alten Balb/c-Mäusen (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) wurden 50 μg sHuEPOR subkutan injiziert (SQ1) (Charge 1; Antigen), das in vollständigem Freundschen Adjuvans (CFA; 50% Vol/Vol; Difco Laboratories, Detroit, MI) emulgiert war. Diese Tiere erhielten 4 Wochen später eine Auffrischung (SQI) mit 25 μg Antigen (Ag; Charge 1), das auf eine ähnliche Weise unter Verwendung von unvollständigem Freundschem Adjuvans (ICFA; Difco Laboratories, Detroit, MI) hergestellt war. Den Mäusen wurde 9 Tage später über den Schwanz Blut abgenommen, und die Serumantikörper(Ab)-Titer wurden mittels Enzym-gekoppelten Immunosorbens-Tests (EIA) bestimmt. Wenn der 1/2-maximale Titer für jede Maus über 5000 stieg, wurden einzelne Tiere für die Hybridoma-Herstellung ausgewählt. Die drei Tiere (#7, 8 und 9), die verwendet wurden, um die interessierenden Hybride (#71A und 73A) zu erzeugen, benötigten nach 5 Wochen und wieder nach 29 Wochen zusätzliche Auffrischungen unter Verwendung von 12,5 μg Ag (Charge 1) bzw. 25 μg Ag (Charge 2). Diese Auffrischungen wurden auf die gleiche Weise wie die anfängliche Auffrischung durchgeführt; das heißt in Form einer Emulsion in 50% Vol/Vol ICFA. Die Serum-Ak-Titer wurden 9 Tage nach jeder Auffrischung weiter verfolgt. Die Endtiter dieser Mäuse vor der Fusion betrugen 5026, 6842 und 12945 bei den Tieren 7, 8 bzw. 9.
C. Zellfusion
Den Tieren 7, 8 und 9 wurden 8 Wochen nach der letzten Auffrischung 25 μg sHuEPOR (Charge #3) intravenös injiziert. Vier Tage später wurden die Mäuse durch Kohlendioxid getötet und die Milz unter sterilen Bedingungen in 25 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium, das 200 U/ml Penicillin G, 200 μg/ml Streptomycinsulfat und 4 mM Glutamin (2 × P/S/G DMEM) enthielt, gewonnen. Die Milzen wurden von überschüssigem Fettgewebe befreit, dann mit 3 Schalen mit sauberem 2 × P/S/G DMEM gespült. Als nächstes wurden sie in eine sterile Stomacher-Tasche (Tekmar, Cincinnati, OH) überführt, die 10 ml 2 × P/S/G DMEM enthielt, und mit dem Stomacher Lab-Blender 80 (Seward Laboratory UAC House; London, England) zu einer Einzelzellsuspension aufgebrochen. Wenn die Zellen aus der Milzkapsel in die Medien freigesetzt wurden, wurden sie aus der Tasche entfernt und durch ein 70 um Nylon-Mesh-Zellsieb (Becton Dickinson and Company; Lincoln Park, NJ) hindurchgeführt. Es wurde frisches Medium in die Tasche eingebracht und der Vorgang fortgesetzt, bis der gesamte Zellgehalt der Milzen freigesetzt war. Diese Splenocyten wurden 3-mal 10 Minuten lang durch Zentrifugation bei 225 × g gewaschen. Für die erste Fusion wurden die Splenocyten von Tier #9 verwendet; für die zweite Fusion wurden die Splenocyten von den Tieren #7 und 8 vereinigt.
Gleichzeitig wurden Log-Phasen-Kulturen von SP2/0-Ag14-Maus-Myelomzellen (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter der Zugangsnr. CRL 1581), die man in vollständigem Medium (DMEM, 10% fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 10 mM Hepes-Puffer, Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY) angezogen hatte, auf ähnliche Weise gewaschen. Aus dieser Myelom-Population wurden 4 × 10⁷ Zellen (Fusion 1) oder 8 × 10⁷ Zellen (Fusion 2) entnommen, mit der Suspension der Splenozyten gemischt und noch einmal pelletiert. Das Medium wurden von dem Zellpellet abgesaugt, und 2 ml Polyethylenglycol (PEG 1500 Molekulargewicht; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) für Fusion 1 und 3,5 ml PEG für Fusion 2 wurden bei 37°C über eine Minute langsam in das Medium eingemischt. Danach wurde ein gleiches Volumen 2 × P/S/G DMEM langsam hinzugegeben. Den Zellen wurde gestattet, bei 37°C 2 Minuten lang zu ruhen, dann wurden weitere 9 ml 2 × P/S/G DMEM hinzugegeben. Die Zellen wurden wieder 4 Minuten lang bei 37°C gehalten. Schließlich wurden 30 ml 2 × P/S/G DMEM der Zellsuspension hinzugegeben, und die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert. Das Medium wurde von dem Pellet abgesaugt und die Zellen langsam in etwa 56 ml (Fusion 1) oder 74 ml (Fusion 2) vollständiges Medium, das 100 U/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycinsulfat enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden durch einzelne Tropfen aus einer 5 ml-Pipette auf zehn Gewebekulturplatten mit 96 Reaktionsnäpfen mit flachen Boden (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) verteilt. Die Platten wurden unter feuchten Bedingungen bei 37°C, 5% CO₂, über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde ein gleiches Volumen Selektionsmedium zu jedem Reaktionsapf hinzugegeben. Das Selektionsmedium bestand aus 0,1 mM Hypoxanthin, 4 × 10^–4 mM Aminopterin und 1,6 × 10^–2 mM Thymidin in vollständigem Medium. Die Fusionsplatten wurden 7 bis 10 Tage lang mit zweifachem Wechsel des Mediums während dieser Zeit inkubiert; nach jedem Flüssigkeitswechsel wurde HAT-Selektionsmedium verwendet. Gewebekulturüberstände wurden von jedem Hybrid enthaltenden Reaktionsnapf entnommen und durch EIA auf spezifische Antikörperreaktivität gegenüber sHuEPOR untersucht. 96 Reaktionsnäpfe, die beim EIA positiv waren, wurden einem weiteren Sereening unterzogen.
D. Dot-Blots
Dot-Blots von reduziertem sHuEPOR (Charge #4) wurden als ein sekundäres Sereening-Verfahren für EIA-positive Hybridome verwendet. Der Dot-Blot SF Mikrotitrationsapparat (Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) wurde gemäß der Gebrauchsanweisung aufgebaut; es wurden Nitrocellulosemembranen (9 × 12 cm; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) verwendet. Das Antigen wurde zunächst durch 5-minütiges Kochen unter reduzierenden Bedingungen mit 2-Mercaptoethanol (5% vol/vol; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS; 10 mM Tris pH 7,5; 154 mM NaCl, 0,01% Gew./Vol Na-Azid) vorbereitet. In jeden Reaktionsnapf wurden fünfundzwanzig ng sHuEPOR (Charge #4) gegeben und zur Bindung durch die Nitrocellulosemembran gesaugt. Die Reaktionsnäpfe wurden mit 250 μl Blotto-Tween-Lösung gefüllt (Blockierlösung; 2% Gew/Vol fettfreie Trockenmilch, 50 mM Tris pH 7,5, 25 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,09% Vol/Vol Tween 20, 0,01% Vol/Vol Anti-Schaum A) und 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Die Blockierlösung wurde aus den Näpfen abgesaugt und der Vorgang ein zweites Mal wiederholt, um ein vollständiges Blockieren von nicht-spezifischen Stellen auf der Membran sicherzustellen. Es folgten 3 Waschgänge durch die Membran mit D-PBS, das 0,1% Vol/Vol Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween-20; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) enthielt. Als nächstes wurden zu jedem Reaktionsnapf fünfundneunzig μl des EIA-positiven Hybridom-konditionierten Mediums hinzugegeben und 45 Minuten lang bei RT inkubiert. Die Reaktionsnäpfe wurden 3× mit TBS-Tween (20 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,02% Vol/Vol Tween 20) und 2× mit 250 μl pro Waschgang TBS-Tween (20 mM Tris, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,09% vol/vol Tween 20) gewaschen, wobei nach jeder Zugabe durch die Membran abgesaut wurde. In jedem Napf wurden einhundert μl des sekundären Ziegen-Anti-Maus-IgG Antikörpers gegen die schwere und leichte Kette, der mit HRP konjugierten war, (1:1000 verdünnt in TBS-Tween; Boehringer Mannheim Biochemicals; Indianapolis, IN) 45 Minuten lang bei RT inkubiert. Die Membranen wurden wie zuvor gewaschen, dem Blot-Apparat entnommen, in vorbereitetes verstärkt Chemiluminescent Reagent (ECL-Reagenz; Amersham Life Sciences, Corporation; Arlington Heights, IL) eingetaucht und gegenüber einem X-OMAT AR-Film (Kodak Scientific Imaging, Rochester, New York) exponiert. Fünfzehn Sekunden später wurde der Film aus den Filmkassetten entnommen und entwickelt. Jeder Napf wurde auf der Grundlage der Intensität der Punkte für die einzelnen Hybridom-Überstände mit einem Wert zwischen 3+ bis 0 versehen.
BEISPIEL 4
Bindung von anti-EPOR-Antikörper an EPOR
A. Antikörper-Bindung an EPOR durch BIAcore-Analyse
Eine Echtzeitanalyse biospezifischer Wechselwirkungen (BIA, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden) wurde auf der Grundlage von Oberflächenplasmonresonanz (SPR) (Fiagerstam et al. J. Mol. Recognition 3, 208 (1990); Malmbory et al. Scand. J. Immunol. 35, 643 (1992)) verwendet, um die beim ELISA positiven monoklonalen Antikörper zu screenen.
Löslicher HuEPOR, der wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben hergestellt wurde, wurde über die primäre Amingruppe kovalent an den Sensorchip CM5 gekoppelt. Die Immobilisierung wurde bei einer Fliessgeschwindigkeit von 5 μl/min in HBS (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,05% BIAcore-oberflächenaktives Mittel P-20) durchgeführt. Die carboxylierte Matrix des Sensorchips wurde zunächst mit einer 40 μl-Injektion einer 1:1-Mischung von EDC (400 mM N-Ethyl-N(dimethylaminpropyl)carbodiimid in Wasser, Pharmacia Biosensor AB) und NHS (100 mM N-Hydroxysuccinimid in Wasser, Pharmacia Biosensor AB) aktiviert. 65 μl löslicher EPO-R (50 μg/ml in 10 mM Na-Acetat pH 4,0) wurden zur Immobilisierung auf dem Sensorchip injiziert. Die überschüssigen reaktiven Gruppen des Sensorchip wurden mit einer Injektion von 50 μl Ethanolamin (Pharmacia Biosensor AB) deaktiviert.
Jeder Analysezyklus umfasste eine Injektion von 20 μl Hybridomüberstand, dem eine Injektion von 10 μl 10 mM HCl zur Regenerierung des Chips folgte. Die SPR-Reaktion wird in Resonanzeinheiten (RU) gemessen. Bei den meisten Proteinen entsprechen 1000 RU einer Oberflächenkonzentration von ungefähr 1 ng/mm². Die Ergebnisse des Screening von 96 Reaktionsnäpfen, die bei den EIAs positiv waren, sind in Tabelle 1 gezeigt. Bei diesen Experimenten beträgt der Hintergrund typischerweise ungefähr 20 RU. Das Binden an EPOR ist bei 50 RU und mehr signifikant. TABELLE 1 Monoklonale EPO-R-Antikörper
TABELLE 1 (Forts.)
TABELLE 1 (Forts.)

Gewebekulturmedium, das durch Hybridome konditioniert wurde, die die angegebenen Antikörper sekretierten, wurde mit den angegebenen Tests untersucht. Die Überstände, die alle die gezeigten Antikörper enthielten, ergaben bei ELISA-Tests ein positives Signal. +++, ++, + zeigen eine positive Antwort an, wobei +++ diejenigen anzeigt, die die größte Wirkung aufwiesen.
– zeigt eine Antwort an, die niedriger als oder gleich hoch wie die Antwort des Kontrollmediums war. NT zeigt nicht untersuchte Proben an.? zeigt Proben an, denen keine Antwort zugeordnet werden konnte.
(1) Die Antikörper 1-61 stammen von den Mäusen mit der Nummer 7 und 8. Die Antikörper 62-96 stammen von Mäusen mit der Nummer 9.
(2) Antworteinheiten von Mabs unter Verwendung eines Biacore-Chip mit gebundenem sHuEPOR.
(3) Die Kompetition auf dem BIACORE fand gegen anti-sHuEPOR-Mab-1G2 statt. Auf einen Sensorchip gebundener sHuEPOR wurde mit IG2 inkubiert, dann wurde die Wirkung auf die Mab-Bindung im Vergleich zur Bindung an EPOR, der nicht mit 1G2 vorinkubiert wurde, bestimmt. Antikörper, deren Bindung vollständig blockiert wurde (80-100%), wurden als A klassifiziert, Antikörper, deren Bindung zu 50-80% blockiert wurde, als C. Antikörper, deren Bindung zu weniger als 50% blockiert wurde, sind B.
(4) Es werden Werte für Antikörper gezeigt, die bei Zellen eine mittlere Fluoreszenz berwirkten, die größer als die der Kontrolle (12,73) war.
"–" zeigt Antikörper mit einer mittleren Fluoreszenz an, die niedriger als oder genau so hoch wie die der Kontrolle war.
(5) Die Inhibition der 3H-Aufnahme durch UT7-EPO-Zellen. 30 mEinheiten EPO und verschiedene Mengen Antikörper wurden mit Zellen inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit 3H-Thymidin pulsmarkiert, und die aufgenommene Menge an gezählten Zerfällen wurde bestimmt. Eine positive Antwort wurde als eine solche definiert, die eine fortschreitende Abnahme bei zunehmenden Mengen an Antikörper zeigte.
(6) Stimulierung der 3H-Aufnahme durch UT7-EPO-Zellen. Verschiedene Mengen des Antikörpers wurden mit Zellen inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit 3H-Thymidin pulsmarkiert, und die Menge an aufgenommenen gezählten Zerfällen wurde bestimmt. Eine positive Antwort wurde als eine solche definiert, die einen fortschreitenden Anstieg hinsichtlich des Einbaus bei zunehmenden Mengen an Antikörper zeigte.
(7) Die Inhibition fand bei Konzentrationen statt, die höher als die zum Aktivieren erforderlichen waren.

B. Epitop-Kompetitionsanalyse
Der Sensorchip, auf dem sHuEPOR immobilisiert wurde, konnte durch eine Injektion von 65 μl Hybridom-Überstand 1G2 gesättigt werden. 1G2 ist ein monoklonaler Antikörper, der unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehensweisen gegen sHuEPOR gerichtet wurde. Jeder Analysezyklus umfasste 20 μl-Injektionen des Hybridomüberstands mit oder ohne Sättigung eines Epitops durch die Injektion von 65 μl 1G2. Die Blockierung durch 1G2 in % wird als das Verhältnis des Bindungssignals einer 20 μl-Injektion nach 1G2-Sättigung in RU und des alleinigen Bindungssignals einer 20 μl-Injektion in RU definiert. Diejenigen Antikörper, bei denen 80-100% Blockierung vorliegt, werden der Gruppe A zugeordnet, diejenigen mit weniger als 50% Blockierung der Gruppe B und diejenigen mit 50-80% Blockierung der Gruppe C. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
C. Antikörper-Bindung an d40EPOR auf transfizierten CHO-Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierungs(FACSI-Analyse
Hybridom-Überstände, die gegen EPOR gerichtet waren, wurden mittels FACS-Analyse auf Bindung an den EPO-Rezeptor auf der Oberfläche von mit pDSRαEPORd40 transfizierten CHO-Zellen untersucht. CHO-Zellen, die mit DNA transfiziert wurden, die für den d40 EPO-Rezeptor kodiert, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt. CHO/EPOR-Zellen wurden aus Gewebekulturschalen gekratzt, als Einzelzellen in einer Lösung von PBS/0,5% BSA resuspendiert und anschließend bei einer Konzentration von ungefähr 3 × 10⁵/Reaktionsnapf auf eine Platte mit 96 Näpfen mit Rundboden verteilt. Die Platte wurde dann 5 min lang bei 1000 × g in die Zentrifuge gestellt. Nach der Zentrifugation wurde der PBS/BSA-Überstand entfernt, und alle pelletierten Zellen wurden entweder in einem Kontrollmedium oder in einem der EPOR-Hybridom-Überstände resuspendiert. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS/BSA gewaschen und dann in einer Lösung von mit Fluorescinisothiocyanat (FITC) markiertem monoklonalen Ziegen-anti-Maus-Antikörper resuspendiert (Southern Biotech, Birmingham Ala.). Die Zellen wurden wieder 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert, gewaschen und mittels FACS analysiert. Von den 96 untersuchten Überständen wiesen 5 eine höhere mittlere Zellfluoreszenz als das Kontrollmedium auf (siehe Tabelle 1). Mab 71 zeigte das höchste Fluoreszenzsignal, gefolgt von Mabs 74, 58, 73 und 87. Keiner der anderen untersuchten Überstände wiesen eine Fluoreszenz auf, die über den Kontrollwerten lag.
BEISPIEL 5
Aufreinigung von anti-EPOR-Antikörpern und Fab-Fragmenten
A. Ascites-Produktion
Balb/c-Mäuse (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), die älter als 5 Wochen waren, wurden 7 bis 10 Tage vor der Injektion von Zellinien immunologisch aktiviert mit 2,4,10,14-Tetramethyl-pentadecan (Pristane; Sigma, St. Louise, MO). Jede Maus erhielt eine einzelne intraperitoneale Injektion mit einem Volumen von 0,5 ml; für jede Zellinie, mit der Ascites-Flüssigkeit hergestellt werden sollte, erhielten 10 bis 20 Tieren eine Injektion.
Hybridoma-Linien, die in vollständigem Medium angezogen wurden, bis Konfluenz erreicht war, wurden einmal mit D-PBS gewaschen und anschließend unter Verwendung eines Neubauer-Hämocytometers gezählt. Jeder Maus wurden dann intraperitoneal 10⁷ Zellen injiziert, und sie wurden bei Rodent Lab Chow und einer beliebigen Menge Wasser gehalten, bis sich Ascites-Flüssigkeit entwickelte. Die Mäuse wurden im Hinblick auf die maximale Ascites-Bildung überwacht, unter CO₂ getötet und unter Verwendung einer 18G-Nadel, die in die flüssigkeitgefüllte Kavität eingeführt wurde, zur Flüssigkeitentnahme angezapft. Die Flüssigkeit wurde durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 225 × g oder eine 3 Minuten lange Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (Eppendorf) geklärt. Vier ml-Aliquots wurden dann bei –20°C gelagert, bis sie mittels Protein-A-Säulenchromatographie aufgereinigt wurden.
B. Protein-A-Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern:
Immunglobulin wurde mittels Protein-A-Säulenchromatographie aus 4 ml Ascites-Flüssigkeit oder 10 ml Hybridom-konditioniertem Medium aufgereinigt. Das monoklonale-Antikörper-Aufreinigungssystem II von Bio-Rad (MAPS II; Bio-Rad Laboratories; Richmond, CA) wurde verwendet. Kurz gesagt wurden 5 ml einer Affi-Gel-Protein-A-Suspension in einer 1 × 10 cm Wegwerf-Glassäule zum Absetzen stehengelassen. Das Protein-A-Gel wurde mit ungefähr 30 ml D-PBS gewaschen, dann durch das Durchlaufenlassen von 20 ml Bindungspuffer (MAPS II-Bindungspuffer; Bio-Rad) durch die Säule vorbereitet. Oben auf die Säule wurde dann Ascites-Flüssigkeit oder konditioniertes Medium, das 1:1 mit Bindungspuffer verdünnt war, gegeben und durchlaufen gelassen. Nach dem Binden des Immunglobulins an Protein-A wurde die nichtgebundene Fraktion verworfen. Die Säule wurde als nächstes mit 30 ml Bindungspuffer von nichtgebundenem Protein freigespült, um bei 280 nm eine Extinktion von weniger als 0,01 zu erhalten. Die immunglobulinenthaltende Fraktion wurde dann mit ungefähr 30 ml Bio-Rad-Elutionspuffer eluiert. Der Puffer dieser Fraktion wurde über Nacht bei 4°C mittels Dialyse gegen 4 Liter D-PBS ausgetauscht. Das dabei erhaltene, in PBS äquilibrierte Immunglobulin wurde mittels Zentrifugation bei 1700 × g in Centricon Concentrator-Einheiten (Amicon Inc., Beverly, MA) konzentriert.
C. Fraktionierung der Antikörper-Bindungsdomäne
Über Protein A aufgereinigtes Immunglobulin wurde unter Verwendung von einem Pierce ImmunoPure Fab Herstellungs-Kit (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) weiter in seine 2 Bestandteile fraktioniert, die kristallisierbare Fraktion (Fc) und die antikörperbindende Fraktion (Fab). Das über Protein A aufgereinigte Immunglobulin wurde in 20 mM Phosphat/10 mM EDTA-Puffer bei pH 7,0 dialysiert, dann auf ungefähr 20 mg/ml konzentriert. 10 mg Immunglobulin wurden fraktioniert. Ein Gel mit immobilisiertem Papain wurde zweimal mit Verdauungspuffer, der 42 mg Cystein in 12 ml wie geliefert verwendetem Phosphatpuffer enthielt, gespült. Die Immunglobulinprobe wurde dann zu dem Gel hinzugegeben und über Nacht bei 37°C auf einem Rotiationsschüttler inkubiert. Das solubilisierte Fab wurde von dem Fc und dem nicht verdauten Immunglobulin mittels Protein-A-Aufreinigung getrennt; die nicht gebundene Fraktion wurde hier als die Fab-Probe gesammelt. Dieser nicht gebundene Teil wurde über Nacht bei 4°C gegen 4 Liter D-PBS dialysiert und wie zuvor konzentriert.
BEISPIEL 6
Kartierung des Mab 71-Epitops auf EPOR
Es wurden überlappende synthetische, 17 bis 30 Aminosäuren lange Peptide hergestellt, die die Reste 1 bis 224 des menschlichen EPO-Rezeptors umfassten, wobei Rest 1 Prolin und Rest 224 Asparaginsäure ist. Die zehn verschiedenen Peptide überlappten an beiden Enden über sechs Aminosäuren. Die Sequenzen der Peptide und ihre Lage innerhalb der menschlichen EPO-R-Aminosäuresequenz sind wie folgt:
Polystyrolreaktionsnäpfe (Costar, Cambridge, MA) wurden mit den obigen EPO-R-Peptiden in Carbonat-Hydrogencarbonat-Puffer (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃, pH 9,2) bei Konzentrationen von 100 μg/ml, 20 μg/ml bzw. 0,8 μg/ml beschichtet. Die Platte wurde bei Raumtemperatur (RT) 2 Stunden lang, dann bei 4°C über Nacht inkubiert. Löslicher HuEPOR wurde bei Konzentrationen von 10 μg/ml, 2 μg/ml, 0,4 μg/ml und 0,08 ug/ml zum Bereitstellen von Positivkontrollen unter denselben Bedingungen zur Beschichtung verwendet. Nach dem 30 Minuten langen Blockieren mit 5% BSA in PBS bei RT wurde die Platte mit Mab 71, das wie in Beispiel 5 beschrieben aufgereinigt wurde, bei einer Konzentration von 5 μg/ml in 1% BSA 2 Stunden lang bei RT inkubiert. Nach dem Waschen mit Waschpuffcr (Kirkegard and Perry Labs, Inc.) wurde die Platte mit einer 1:1 000-Verdünnung von Ziegen-anti-Maus-IgG, das mit Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim) konjugiert war, 1 Stunde lang bei RT inkubiert. Die Platte wurde gewaschen und mit ABTS (Kirkegard and Perry Labs, Inc.)-Substratlösung entwickelt. Eine Kolorimetriemessung wurde bei 405 nm durchgeführt. Die Ergebnisse im Hinblick auf die Mab-Bindung an die synthetischen Peptide sind in 1 gezeigt und deuten daraufhin, dass Mab 71 im Vergleich zu den anderen untersuchten Peptiden erhebliche Mengen des Peptides SE-3 bindet (Aminosäurereste 49 bis einschließlich 78 des menschlichen EPO-R). Dies zeigt an, dass Mab 71 an eine Region des menschlichen EPO-R bindet, der die Reste 49 bis 78 enthält oder diese überlappt.
BEISPIEL 7
Aktivität von anti-EPOR-Antikörpern in Zellproliferationsassays
Antikörper in konditioniertem Medium, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Aufnahme von 3H-Thymidin durch UT7-EPO-Zellen zu stimulieren (Komatsu et al, wie oben). UT7-EPO-Zellen reagieren auf EPO und exprimieren menschliche EPO-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche. UT7-EPO-Zellen wurden in Wachstumsmedium (1 × Isocove's Modified Dulbecco's Medium mit L-Glutamin, 25 mM HEPES-Puffer und 3024 mg/L Natriumhydrogencarbonat, aber ohne alpha-Thioglycerol oder beta-Mercaptoethanol (GIBCO)/10% Vol/Vol fötales Rinderserum/1% Vol/Vol L-Glutamin-Penicillin-Streptomycin-Lösung (Irvine Scientific)/1 Einheit/ml rHuEPO) bis zu einer Konzentration von 3 × 10⁵ Zellen/ml wachsen gelassen. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (ungefähr 500 × g) gesammelt, zweimal mit Phosphat-gepufferter Saline gewaschen und bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/ml in Test-Medium (1 × RPMI Medium 1640 ohne L-Glutamin (Gibco)/1% L-Glutamin/4% fötales Rinderserum) resuspendiert. Testproben oder EPO-Standard (rHuEPO), wurden in einem Volumen von 100 μl und wenigstens 5-fach in Test-Medium verdünnt zu Näpfen in einer Mikrotiterplatte mit 96 Näpfen hinzugegeben. 50 μl Zellen wurden dann hinzugegeben (5000 Zellen/Reaktionsnapf) und die Platten wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach 72 Stunden wurden 50 μl Methyl-³H-Thymidin (1 mCi/ml; 20 Ci/mMol), die 1:100 in Test-Medium verdünnt waren, hinzugegeben. Die Zellen wurden weitere 4 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Markierte Zellen wurden auf Glasfaser-Filtermatten unter Verwendung eines PHD-Zell-Erntegerätes (Cambridge Technology Inc.) und deionisiertem Wasser als Waschlösung geerntet. Die Filter wurden ein letztes Mal mit 2-Propanol gespült, dann getrocknet und mit einem Beckman Szintillationszähler des Models LS6000 IC gezählt.
Konditioniertes Medium aus Gewebekulturplatten, die anti-EPOR-Mabs enthielten, wurden wie oben beschrieben auf ihre Fähigkeit getestet, die Proliferation zu stimulieren. Die Proben wurden bei mehreren Verdünnungen untersucht. Als positive Antworten wurden diejenigen definiert, die die Thymidinaufnahme auf wenigstens das 2-fache über dem Hintergrundniveau stimulierten und auch zur Abnahme der Stimulierung führten, wenn die Proben verdünnt wurden. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten zwei von 24 untersuchten Proben eine positive Antwort (Mabs 71 und 73). Vier Proben zeigten möglicherweise eine schwache stimulierende Aktivität (? in Tabelle 1). Die verbleibenden Proben ergaben keine signifikante Erhöhung gegenüber dem Hintergrund. Ein polyklonales Serum von der Maus, die verwendet wurde, um die monoklonalen Antikörper zu erzeugen, stimulierte die Thymidinaufnahme ebenfalls. Dies legt nahe, dass der polyklonale Antikörper in diesem Serum ebenfalls in der Lage war, die Proliferation von UT7-EPO-Zellen zu stimulieren.
Die Überstände wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, die EPO-induzierte Stimulation der Thymidinaufnahme durch UT7-EPO-Zellen zu inhibieren. Die Zellen wurden mit 25 mEinheiten/ml rHuEPO und verschiedenen Mengen konditioniertem Medium, das Antikörper enthielt, inkubiert. Die Thymidinaufnahme wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die meisten Antikörper unterschieden sich nicht signifikant von dem Kontrollmedium. Von den Antikörpern, die eine Inhibition der Thymidinaufnahme zeigten, zeigten zwei Proben (Mabs 58 und 73) eine deutliche Inhibition, während 3 Proben (Mabs 65, 88 und 89) eine mögliche Inhibition zeigten. Mab 73 inhibierte bei den höchsten Dosen, aber bei niedrigeren Dosen stimulierte es die Thymidinaufnahme über die Kontrollwerte.
BEISPIEL 8
Aktivierung von EPOR durch anti-EPOR-Antikörper und -Fragmente
A. UT7-EPO Proliferationsassay
Mabs 71 und 73 wurden wie in Beispiel 5 beschrieben aufgereinigt. Die Proliferationsaktivität wurde durch die in Beispiel 7 beschriebenen UT7-EPO-Thymidinaufnahme-Tests bestimmt. Sowohl Mab 71 als auch Mab 73 und rHuEPO stimulierten die Aufnahme durch UT7-EPO-Zellen in einer dosisabhängigen Weise (siehe 2). Die Aktivität wurde bei hohen Dosen von Mab 71 verringert. Die Peaks bei der stimulierenden Aktivität wurden bei den Dosen von 1-2 μg/ml bei Mab 71 und > 100 μg/ml bei Mab 73 beobachtet. Ein nicht-neutralisierender Kontrollantikörper (Anti-EPO Mab F 12) stimulierte nicht, was nahelegt, dass die Stimulierung im Hinblick auf den EPO-Rezeptor-Antikörper spezifisch ist.
B. Verdrängungstests mit kaltem EPO
Antikörper gegen den EPO-Rezeptor binden möglicherweise an die gleiche Region, an die auch EPO bindet. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Verdrängungstests ohne radioaktive Markierung unter Verwendung von OCIM1-Zellen durchgeführt. OCIM1-Zellen sind menschlichen Ursprungs und man weiß, dass sie auf ihrer Zelloberfläche EPO-Rezeptoren enthalten (Broudy et al. Proc, Nat. Acad. Sei. USA 85, 6517 (1988)). Man ließ die Zellen in OCIM1-Wachstumsmedium (Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM)/10% fötales Rinderserum/1% Pen-Strep-Fungison) bis zu einer Konzentration von ungefähr 2-5 × 10⁵ Zellen/ml wachsen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in Bindungspuffer (RPMI 1640/1% BSA/25 mM HEPES pH 7,3) gewaschen und dann in Bindungspuffer resuspendiert, der 0,1% Azid und 10 μg/ml Cytochalisin B bei 1-2 × 10⁷ Zellen/ml enthielt. Die Zellen (100 μl) in Gewebekulturplatten mit 96 Näpfen wurden dann mit 10 μl Probe und 10 μl ¹²⁵I-EPO (Amersham hochspezifische Aktivität; 3000 Ci/mMo 1, 2 μCi/ml) in einem 37°C warmen, befeuchteten Gewebekulturinkubator inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die Zellen durch Phthalatöl (60:40 (Vol/Vol) Dibutyl/Dinonyl-Phthalat) in Titerröhrchen zentrifugiert. Die Röhrchen, die Zellen enthielten, wurden in einem Trockeneis-Ethanolbad schnellgefroren, und das Zellpellet wurde abgeschnitten und dann in einem automatischen LKB 1277 Gammamaster-Gammazähler gezählt.
3 zeigt die Ergebnisse des Experimentes mit Verdrängung ohne radioaktive Markierung. Steigende Mengen an ¹²⁵I-EPO wurden von den EPO-Rezeptoren auf den Zellen verdrängt, wenn die Menge an hinzugegebenem, nicht markiertem rHuEPO erhöht wurde. Auf eine ähnliche Weise verdrängte auch wie in Beispiel 5 beschrieben aufgereinigter Mab 71 steigende Mengen an ¹²⁵I-EPO bei steigenden Mengen des Antikörpers. In diesem Fall wurde ungefähr 4000 mal mehr Mab 71 als rHuEPO benötigt, um äquivalente Mengen an ¹²⁵I-EPO zu verdrängen. Im Gegensatz dazu zeigte Mab 73 bei den höchsten Dosen Anzeichen einer Verdrängung, aber ein nicht neutralisierender anti-rHuEPO Mab (F 12) verdrängte nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mab F12 das Binden von EPO an seinen Rezeptor nicht störte, aber dass Mab 71 und 73 dies tun. Dieses Ergebnis zeigt ebenfalls, dass Mab 71 an den EPO-Rezeptor bindet und ihn durch Bindung an oder nahe an der EPO-Bindungsstelle aktiviert.
C. Vergleich der Aktivitäten von Mab 71 und Fab 71
EPO-Rezeptorfragmente von Mab 71 wurden wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt. Die Zubereitungen wurden durch SDS-Gelelektrophorese (Laemmli et al. Nature 227, 680 (1970) charakterisiert, wie in 4 gezeigt ist. Die Proben wurden in Probenpuffer, der 2% SDS enthielt, mit oder ohne 0,7 M 2-Mercaptoethanol aufgekocht, um reduzierte (2-Mercaptoethanol) von nicht-reduzierten (ohne 2-Mercaptoethanol) Proteinen zu unterscheiden, und anschließend auf 12,5% Acrylamid-SDS-Gelen laufen gelassen. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen. Die Größen der Proteine wurden durch Vergleich ihrer Mobilitäten mit den Mobilitäten von Standardproteinen abgeschätzt. Mabs 71 und 73 trennten sich in leichte und schwere Ketten auf, man wenn sie unter reduzierenden Bedingungen laufen ließ. Die schweren Ketten wiesen ein Gewicht von ungefähr 52 KDa auf. Die leichte Kette von 73 war geringfügig kleiner (28 KDa) als die von Mab 71 (28,5 KDa). Die Fab-Fragmente wiesen ebenfalls zwei Ketten auf 28,3 und 27,3 KDa bei Fab 71 und 27,5 und 26,5 KDa bei Fab 73. Wenn man diese Fab-Fragmente unter nicht reduzierenden Bedingungen laufen lies, betrugen die Größen der Fabs 71 und 73 ungefähr 48 bzw. 47 KDa. Dies zeigt, dass die Fab-Fragmente monovalent sind und dass der Komplex jeweils eine leichte und schwere Kette aufweist. Im Gegensatz dazu zeigten die Mobilitäten von Mabs 71 und 73 auf nicht-reduzierenden SDS-Gelen an, dass ihre Größen ungefähr 200 KDa betrugen. Dies deutet daraufhin, dass diese Mabs bivalent sind und jeweils zwei der schweren und leichten Ketten aufweisen.
Um zu untersuchen, ob monovalente Fab 71-Fragmente den EPO-Rezeptor aktivieren würden, wurden Mab 71 und das Fab 71-Fragement mit UT7-EPO-Zellen inkubiert, und die Thymidinaufnahme wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gemessen. Wie in 5 gezeigt ist, stimulierte sowohl rHuEPO als auch Mab 71 die Thymidinaufnahme. Jedoch tat das monovalente Fab 71-Fragment dies nicht. Ein monoklonaler Kontrollantikörper, der gegen einen nicht-verwandten Rezeptor (Her2/neu) gerichtet war, stimulierte die Thymidinauthahme ebenfalls nicht. Dies deutet darauf hin, dass die Antikörper bivalent sein müssen, um den Rezeptor zu aktivieren.
D. Stimulierung der Thymidinaufnahme durch Mab 71 und Fab 71 bei Anwesenheit von rHuEPO
Die Tatsache, dass Mab 71 das Binden von EPO an die EPO-Rezeptoren inhibiert, legte nahe, daß der Antikörper den EPO-Rezeptor bei Anwesenheit von EPO möglicherweise nicht aktiviert. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden UT7-EPO-Zellen mit 30 mEinheiten/ml rHuEPO und verschiedenen Mengen von aufgereinigtem Mab 71, Fab 71 oder Mab-Kontrolle (gegen Her2/neu gerichtet) inkubiert. Die Thymidinaufnahme wurde wie oben beschrieben gemessen. Wie in 6 gezeigt ist, inhibierten sowohl Mab 71 als auch Fab 71 bei hohen Dosen die Thymidinaufnahme. Jedoch stimulierte Mab 71 die Thymidinaufnahme bei Dosen zwischen ungefähr 30 und 3000 μg/ml über diejenigen Bereiche hinaus, die durch Stimulierung ausschließlich mit rHuEPO erreicht werden. Fab 71 und die Kontrollantikörper hatten diese Wirkung nicht. Dies zeigt, dass Mab 71 und rHuEPO eine additive Wirkung bei der EPO-Rezeptoraktivierung haben können.
BEISPIEL 9
Stimulierung von Erythrozyten-Koloniebildung durch anti-EPOR-Antikörper
Um zu sehen, ob der aufgereinigte Mab 71 die Bildung von Erythrozyten aus Vorläufern in peripherem Blut stimulieren würde, wurde ein BFUe-Test durchgeführt. Um Erythrozytenvorläufer aufzureinigen, wurden normale menschliche Spender gemäß einem Standardprotokoll lymphopherisiert. Die lymphopherisierten Zellen (250 ml) wurden mit 250 ml Hank's Balanced Salzlösung (HBSS) gewaschen. Die Zellen wurden in HBSS resuspendiert und durch Dichtezentrifugation über einen Gradienten (Ficoll-paque) für 30 min bei 500 × g getrennt. Die Zellen niedriger Dichte (LD) wurden aus dem Gradienten gesammelt und mit 500 ml HBSS gewaschen und in PBS, das mit 0,5% Rinderserumalbumin und 5 mM EDTA supplementiert war, bei einer Konzentration von 5 × 10⁸ Zellen/ml resuspendiert. Die LD-Zellen wurden dann unter Verwendung eines CD34 Progenitor Cell Isolation Kit (QBend/10), das von Miltenyi Biotech GmbH hergestellt war, weiter aufgereinigt. Kurz gesagt wurden die Zellen mit einem monoklonalen anti-CD34 Antikörper versehen, dann wurden sie gemäß Protokoll an magnetische Mikrokugeln angebunden. Die mit einem Antikörper versehenen Zellen wurden anschließend durch vorgefüllte MiniMacs-Trennsäulen laufen gelassen, die Säulen wurden gewaschen, und die CD34+-Zellen wurden dann von der Säule eluiert. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt, um eine höhere Reinheit an CD34+-Zellen zu erreichen. Der in vitro-Test wurde wie von Iscove et. al. (J. Cell. Physiol 83, 309(1974)) beschrieben an den aufgereinigten CD34+-Zellen mit den folgenden Modifizierungen durchgeführt. Das Kulturmedium wurde von Gibco BRL (Human bone marrow stem cell proliferation kit; Grand Island, NY) erhalten. Um 1 ml-Proben in zweifacher Ausführung auf 35 × 100 mm Gewebekulturplatten auszuplattieren, wurde ein Überschuss von 3 ml in 17 × 100 sterilen Polystyrolröhrchen hergestellt. In jedes der Röhrchen wurden 2,5 ml Stammzellwachstumsmedium, 0,1 ml CD34+-Zellen (bei 90000 Zellen/ml resuspendiert), 0,015 ml Stammzellfaktor (20 μg/ml) und eine Kombination aus Probe und Stammzellverdünnungsmedium gefüllt, was 0,385 ml ergab. Die Röhrchen wurden mit einem Vortex gemischt und ruhen gelassen, um Blasen aufsteigen zu lassen. Der Inhalt wurde dann unter Verwendung einer 3 ml-Spritze mit einer 17 × 1-1/2-Nadel aliquotiert. Die Platten wurden bei 37°C und 10% CO₂ in einem befeuchteten Gewebekulturinkubator inkubiert. Erythrozytenkolonien (orange- bis rotfarbig) wurden nach 21 Tagen bewertet. Auf den Platten, denen EPO oder Mab 71 fehlte, wurden keine Erythrozytenkolonien gefunden. rHuEPO (30 mEinheiten/Platte) ergab ein Überschuss von 400 Kolonien pro Platte. Mab 71 lieferte ebenfalls erythrozytäre Kolonien. Bei 2-6 μg/ml wurde ein Aktivitätspeak festgestellt. Dieses Ergebnis zeigt an, dass Mab 71 die Bildung von Erythrozytenkolonien stimuliert.
Die Aktivität von aufgereinigtem Mab 71 wurde ebenso auf die Fähigkeit untersucht, Erythrozytenkolonien unter Verwendung von serumfreien Wachstumsbedingungen in Methylcellulose zu bilden. CD34+-Zellen wurden wie oben beschrieben isoliert und unter Verwendung des serumfreien Wachstumsmedium, wie es in der parallel anhängigen ebenfalls besessenen U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 08/079,179, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben ist, mit den folgenden Modifizierungen inkubiert. Die Die Teströhrchen wurden angesetzt, ohne dass extrazelluläre Matrixmoleküle, Hydrocortison und die Wachstumsfaktoren EGF, FGF und PDGF verwendet wurden. Wie oben beschrieben, wurden 3 ml-Proben hergestellt, um 1 ml-Proben doppelt auf den Platten auszuplattieren. In jedes Röhrchen wurden jeweils 0,030 ml von jeder der 100 × Stammlösungen (2-Mercaptoethanol, Nucleoside, Cholesterin, Natriumpyruvat, Hu-Transferrin, Lipide, HuInsulin), 0,4 ml entionisiertes BSA (15%), 0,015 ml SCF (20 μg/ml), 0,1 ml CD34+-Zellen (zu 300.000 Zellen/ml resuspendiert), 1,080 ml Methylcellulose (2,3%) und eine Kombination aus Probe und IMDM gefüllt, was 1,195 ml ergab, wenn die Probe nicht ein Volumen von 150 μl überschritt. Die Platten wurden dann wie oben beschrieben inkubiert und die Kolonien nach 21 Tagen bewertet. Erythrozytenkolonien wurden beobachtet, wenn das Wachstum bei Anwesenheit von EPO oder Mab 71 stattfand, aber nicht unter Bedingungen, bei denen diese beiden Faktoren fehlten. Ein Beispiel der beobachteten Erythrozyten-Kolonietypen ist in 7 gezeigt. Kolonien, die mit 25 mEinheiten rHuEPO inkubiert wurden, sahen ähnlich aus wie jene, die mit 2,1 μ/ml des aufgereinigten Mab 71 angezogen wurden. Höhere Dosen von rHuEPO ergaben größere Kolonien. Eine Dosis-Antwort-Kurve ist in 8 gezeigt. Mab 71 zeigte hinsichtlich der Aktivität bei Dosen zwischen 1 und 5 μg/ml einen Peak. Niedrigere und höhere Dosen führten zu weniger Erythrozytenkolonien. Ein monoklonaler Kontrollantikörper, der gegen Her2/Neu gerichtet war, ergab bei diesem Dosisbereich keine Kolonien. Dieses Ergebnis zeigt an, dass der Mab 71 die Bildung von Erythrozytenkolonien aus Erythrozytenvorläufern stimulieren wird, und dass es kein zusätzliches Erfordernis für Serum gibt. Somit kann Mab 71 die Differenzierung von Erythrozytenvorläufern zu Erythrozyten stimulieren.
Während die vorliegende Erfindung hinsichtlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird verstanden, dass den Fachleuten Variationen und Modifizierungen einfallen werden. Deshalb ist es beabsichtigt, dass die angefügten Ansprüche alle solchen äquivalenten Abwandelungen abdecken, die in den Umfang der beanspruchten Erfindung fallen. SEQUENZPROTOKOLL

(ANNEX) SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antikörper oder bivalentes Fragment davon, der/das einen Erythropoietin-Rezeptor aktiviert, wobei der Antikörper oder das bivalente Fragment davon an ein Peptid aus den Aminosäureresten 49 bis einschließlich 78 eines menschlichen Erythropoietin-Rezeptors bindet.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach Anspruch 1, der/das ein monoklonaler Antikörper oder ein bivalentes Fragment davon ist.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach Anspruch 1, der/das ein humanisierter Antikörper oder ein bivalentes Fragment davon ist.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach Anspruch 1, der/das ein menschlicher Antikörper oder ein bivalentes Fragment davon ist.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach Anspruch 1, der/das eine nachweisbare Markierung aufweist.
Verfahren zum Nachweisen eines aktivierbaren Erythropoietin-Rezeptors in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: a) Kontaktieren der Probe mit dem Antikörper oder dem bivalenten Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5; b) Nachweisen der Aktivierung des Rezeptors durch den Antikörper oder das bivalente Fragment davon, wodurch das Vorhandensein eines aktivierbaren Erythropoietin-Rezeptors bestimmt wird.
Kit zum Nachweisen eines aktivierbaren Erythropoietin-Rezeptors in einer biologischen Probe, umfassend den Antikörper oder das bivalente Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung beim Modulieren der endogenen Aktivität eines Erythropoietin-Rezeptors in einem Säugetier.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach Anspruch 8, wobei das Modulieren das Regulieren der Proliferation oder der Differenzierung von Erythrozyten-Vorläuferzellen ist.
Antikörper oder bivalentes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei der Behandlung von Anämie bei einem Patienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers oder des bivalenten Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Antikörper oder das bivalente Fragment davon ein monoklonaler Antikörper oder ein bivalentes Fragment davon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Antikörper oder das bivalente Fragment davon ein humanisierter Antikörper oder ein bivalentes Fragment davon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Antikörper oder das bivalente Fragment davon ein menschlicher Antikörper oder ein bivalentes Fragment davon ist.
Verwendung des Antikörpers oder des bivalenten Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikamentes zum Modulieren der endogenen Aktivität eines Erythropoietin-Rezeptors bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Modulieren ein Regulieren der Proliferation oder Differenzierung von Erythrozyten-Vorläuferzellen ist.
Verwendung des Antikörpers oder des bivalenten Fragmentes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Anämie bei einem Patienten.
In vitro Verfahren zum Modulieren der endogenen Aktivität eines Erythropoietin-Rezeptors in einer Zelle, umfassend das Verabreichen einer Menge des Antikörpers oder des bivalenten Fragmentes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die dahingehend wirksam ist, dass die Aktivität des Rezeptors moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Modulieren der Aktivität des Erythropoietin-Rezeptors ein Regulieren der Proliferation oder der Differenzierung der Zelle ist.