DE69627942T2

DE69627942T2 - Polypeptide und Reagenzien zur Messung von Komponenten eines Lebenskörpers durch deren Gebrauch

Info

Publication number: DE69627942T2
Application number: DE69627942T
Authority: DE
Inventors: Nobuko Imajo; Yukari Yamagata; Hideo Katoh; Shinji Satomura; Kenji Nakamura
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2016-07-18
Also published as: DE69632357T2; ES2194080T3; ES2215956T3; US6300079B1; US6828417B2; EP0755941B1; DE69632357D1; EP0755941A3; EP1273591B1; EP1273591A1; CA2181109A1; EP0755941A2; US20020045189A1; DE69627942D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Polypeptid mit Säureresten, die deriviert sind von einer starken Säure, und betrifft dieses Polypeptid aufweisende Reagenzien zur Messung von Analyten, die in Proben gemessen werden sollen, die von Lebendkörpern abgenommen sind, wie beispielsweise Körperflüssigkeiten (z. B. Serum, Blut, Plasma, Urin, usw.), Lymphozyten, Hämozyten und verschiedenen Zellen.
Es ist bekannt, dass bestimmte Substanzen untereinander unter Bildung eines stabilen Komplexes in starker Wechselwirkung stehen (d. h. weil sie zueinander eine hohe Affinität besitzen). Die speziellen Substanzen schließen beispielsweise die folgenden Kombinationen ein: Antigen und Antikörper; Protease und ihr Inhibitor; Zuckerkette und Lektin; Enzym und Substrat dafür; oder Coenzym; physiologisch wirksame Substanz, wie beispielsweise ein Hormon, und ein Rezeptor oder Transportprotein für diese wirksame Substanz; und ein Paar von Polynukleotidketten der Duplex-DNA.
Als eine Methode zum Messen eines Analyten, der in einer Probe gemessen werden soll, indem die vorgenannten Wechselwirkung zum Einsatz gelangt, lassen sich die Folgenden exemplifizieren: eine Methode der Erzeugung eines Komplexes auf einer festen Phase durch die Reaktion von Substanzen in der vorstehend exemplifizierten Kombination und anschließendem Ausführen einer sogenannten "Bound/Free (B/F)"-Trennung unter Anwendung dieser festen Phase, wie beispielsweise ein Enzymimmunoassay (EIA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluorimmunoassay (FIA) (wie beispielsweise die in der JP-A-1 22706 (EP-A-326 100), JP-A-3-44399) offenbarten Verfahren; und eine Methode, die von einigen der Anmelder der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde, z. B. eine Methode zur Ausführung der Trennung eines Komplexes von einem zu messenden freien Analyten, d. h. die sogenannte B/F-Trennung, indem eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) angewendet wird (Verfahren, wie sei beispielsweise in den JP-A-2-28557 (EP-A-357 869), JP-A-3-206964, JP-A-3 221865, JP-A-6 66800) offenbart wurden.
In einer solchen Messmethode werden die Genauigkeit der Messung und die für die Analyse erforderliche Zeit zu einem gewissen Maß durch den Wirkungsgrad der B/F-Trennung beeinflusst. An der B/F-Trennung sind daher zahlreiche Forschungsarbeiten ausgeführt worden.
Beispielsweise ist die B/F-Trennung in den Verfahren, die in der JP-A-1-227061 (EP-A-326 100), JP-A-3-44399, in der die B/F-Trennung unter Anwendung einer festen Phase ausgeführt worden ist, und in den Verfahren, die in der JP-A-6-66800 offenbart wurden, in denen die B/F-Trennung unter Anwendung der HPLC ausgeführt worden ist, wie folgt vorgenommen worden: es wurde eine anionische Substanz zuvor beispielsweise in einen Antikörper im Bezug auf einen Analyten eingeführt, der in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden soll, und die sogenannte B/F-Trennung ausgeführt, indem die anionischen Eigenschaften der anionischen Substanz in einem Komplex des Analyten und des Antikörpers genutzt wurden.
Durch eine solche Methode ist es möglich, die B/F-Trennung wirksamer als zuvor auszuführen. Allerdings handelte es sich in allen diesen Prozessen bei der verwendeten anionischen Substanz, um eine solche, die von einer Polyaminosäure deriviert ist, und die B/F-Trennung wird unter Nutzung der anionischen Eigenschaften ausgeführt, die durch die Carboxyl-Gruppen der Polyaminosäure vermittelt werden, weshalb man auf solche Nachteile stößt, wie sie vorstehend im Fall der B/F-Trennung unter Anwendung der HPLC angetroffen werden.
In der Methode unter Anwendung der HPLC muss der Komplex nämlich beispielsweise von freiem Antikörper und Substanzen abgetrennt werden, die in der Probe vorhanden sind und dazu neigen, die Messung zu beeinflussen, um gleichzeitig mit der B/F-Trennung abgetrennt zu werden. Um eine solche Trennung zufriedenstellend unter Nutzung der anionischen Eigenschaften von Carboxyl-Gruppen auszuführen, die von der Polyaminosäure deriviert sind, müssen mindestens 200 Carboxyl-Gruppen (etwa 200 Aminosäure-Reste) in das Molekül der anionischen Substanz eingeführt werden. Dementsprechend ist es zu den folgenden Problemen gekommen. Erstens, erfordert die Herstellung der anionischen Substanz einen großen Arbeitsaufwand. Darüber hinaus ist die Herstellung der anionischen Substanz im großen Maßstab und mit einer gleichförmigen relativen Molekülmasse schwierig, so dass, wenn die B/F-Trennung mit Hilfe der HPLC unter Einsatz einer solchen anionischen Substanz ausgeführt wird, tritt ein Nacheilen oder Vorlaufen eines Peaks auf, um in einigen Fällen die Genauigkeit der Messung herabzusetzen. Wenn darüber hinaus eine Polyaminosäure mit Carboxyl-Gruppe, wie beispielsweise Polyglutaminsäure, für die Trennung verwendet wird, findet eine nichtspezifische Reaktion statt, um ein solches Phänomen auszulösen, wie beispielsweise eine Zunahme des Blindwertes und in einigen Fällen der gemessenen Werte. Um dieses Phänomen zu umgehen, ist es erforderlich, ein geeignetes anionisches Polymer zuzusetzen, wie beispielsweise γ-Polyglutaminsäure.
Es besteht daher der Wunsch nach einer weiteren Verbesserung.
In Chemical Abstracts, Bd. 121, Nr. 11, 1994; Ref. Nr. 134778 wird ein Polypeptid offenbart, in das 3 Tyrosin-Gruppen mit Sulfat-Resten einbezogen sind. Es gibt keinerlei Vorstellung darüber, dass es mehr als 3 Reste gibt, die von einer starken Säure deriviert sind.
In der WO9217194 wird ein Polypeptid zur Hemmung von Mineralabscheidung offenbart, in der Serin-Gruppen durch Phosphorsäure substituiert sind. Es gibt keinen Hinweis auf den Vorteil von Schwefelsäure-Resten in den Messungen der Analyten in den Proben, die von Lebendkörpern abgenommen sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf diese Bedingungen ausgeführt und soll ein neuartiges Polypeptid und ein dieses Polypeptid aufweisendes Reagenz zum Messen eines Analyten gewähren, der in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden soll. Wenn ein Komplex, der durch die Wechselwirkung zwischen einem Analyten, der in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden soll, und einer Substanz erzeugt wird, die über eine Affinität zu dem Analyten verfügt (nachfolgend abgekürzt als „Affinitätssubstanz"), die von dieser Affinitätssubstanz abgetrennt ist, d. h. eine nicht umgesetzte Affinitätssubstanz, sowie Substanzen, die in der Probe vorhanden sind und dazu neigen, den Nachweis des Komplexes mit Hilfe einer Methode zu beeinflussen, bei der eine negative Ladung angelegt wird, z. B. eine Methode unter Verwendung eines Anionentauschers, so kann dieses Polypeptid zur Abtrennung des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz und der gleichen wirksamer angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Polypeptid mit 4 bis 20 Tyrosinsulfat-Resten.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein kombiniertes Produkt aus einem Polypeptid und einer Affinitätssubstanz für einen in einer Probe zu messenden Analyten, der von einem Lebendkörper abgenommen wird.
Die vorliegende Erfindung gewährt ferner eine Verbindung, in der eine Maleinimido-Gruppe über einen Spacer an dem N-Terminus des Polypeptids gebunden ist, und ein kombiniertes Produkt dieser Verbindung und einer Substanz, die eine SH-Gruppe aufweist und eine Affinität für einen in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird.
Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Reagens zum Messen eines in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, wobei das Reagens ein kombiniertes Produkt des Polypeptids und einer Affinitätssubstanz für den Analyten aufweist oder das kombinierte vorstehend erwähnte Produkt eine Maleinimidio-Gruppe-Spacer-Polypeptid-Bindung hat.
Außerdem wird hierin ein Verfahren zum Messen einer Lebendkörperkomponente beschrieben, welches Verfahren umfasst: Umsetzen einer Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen ist, mit einem Reagens, das ein kombiniertes Produkt des Polypeptids und einer Affinitätssubstanz für einen Analyten aufweist, der in der Probe gemessen werden soll, oder ein kombiniertes Produkt der Verbindung mit einer Maleinimido-Gruppe-Spacer-Polypeptid-Bindung und einer Affinitätssubstanz mit einer SH-Gruppe und einer Affinität zu einem Analyten; Abtrennen des resultierenden Komplexes; und Bestimmen der Menge der Lebendkörperkomponente in der Probe auf der Grundlage der Menge des Komplexes.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 Elutionspositionen anionischer Polypeptide anhand einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Anionenaustauschersäule, erhalten in Beispiel 8;
2 Elutionspositionen kombinierter Produkte von Fab'-Fragment als Antikörper und eines anionischen Polypeptids anhand der HPLC unter Verwendung einer Anionenaustauschersäule, erhalten in Beispiel 11;
3 Daten über die Speicherstabilität eines Polypeptids mit sulfatierten Serin-Resten, nicht als Beispiel der vorliegenden Erfindung, in Lösungen, die sich im pH-Wert unterscheiden, erhalten in Beispiel 12;
4 Daten über die Speicherstabilität eines Polypeptids mit sulfatierten Tyrosin-Resten in Lösungen, die sich im pH-Wert unterscheiden, erhalten in Beispiel 12;
5 Elutionspositionen verschiedener Antigen-Antikörper-Komplexe anhand der HPLC unter Verwendung einer Anionenaustauschersäule, erhalten in Beispiel 14;
6 Elutionsprofile zur Analyse von Proben mit Hilfe der HPLC, erhalten in Beispiel 15;
7 Elutionspositionen verschiedener Antigen-Antikörper-Komplexe anhand der HPLC unter Verwendung einer Anionaustauschersäule, erhalten in Beispiel 16.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben eine Methode zum Trennen eines Komplexes untersucht, der durch die Wechselwirkung zwischen einem in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe zu messenden Analyten und einer Affinitätssubstanz von Substanzen gebildet wird, die gemeinsam mit dem Komplex vorliegen und die Neigung haben, den Nachweis des Komplexes zu beeinflussen, beispielsweise eine freie Affinitätsstubstanz (oder freier Analyt; der Analyt kann mit einer Substanz markiert sein, die mit irgendeiner Methode nachweisbar ist (nachfolgend abgekürzt als "detektierbare Substanz")) mit Hilfe eines Anionenaustauschers. Das bedeutet, die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehend die Entwicklung einer Methode untersucht, mit der es möglich ist den Komplex von der freien Affinitätssubstanz und dergleichen mit größerer Sicherheit abzutrennen. Im Verlaufe dieser Untersuchung haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass, wenn eine Substanz mit einer geeigneten Fähigkeit zur Änderung der Eigenschaften des Komplexes (nachfolgend abgekürzt als "Trennung-verbessernde Substanz") in den Komplex eingeführt wird und der Komplex von den gemeinsam mit dem Komplex vorhandenen Substanzen abgetrennt wird, die die Neigung haben, den Nachweis des Komplexes zu beeinflussen, beispielsweise die freie Affinitätssubstanz (oder der freie Analyt) auf der Grundlage der Fähigkeit der die Trennung verbessernden Substanz, so kann die Elutionsposition des Komplexes durch geeignete Auswahl der die Trennung verbessernden Substanz beliebig eingestellt werden. Mit anderen Worten haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Einführung einer geeigneten die Trennung verbessernden Substanz in dem Komplex eine Abtrennung des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz und dergleichen mit größerer Sicherheit ermöglicht. Dieses Ergebnis wurde für ein Patent angemeldet (JP-A-6-66800). Wenn der Komplex jedoch nach dieser Methode durch Einführung einer anionischen die Trennung verbessernden Substanz in den Komplex abgetrennt wird, werden in einigen Fällen die vorgenannten Probleme hervorgerufen. In dem Bemühen, eine anionische, die Trennung verbessernde Substanz zu finden, die derartige Probleme nicht hervorruft, haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung weitere eingehende Untersuchungen ausgeführt und dabei entdeckt, dass die vorgenannten Probleme behoben werden können, wenn als die anionische, die Trennung verbessernde Substanz ein Polypeptid verwendet wird, das 4 bis 20 Tyrosinsulfat-Reste hat.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Polypeptid sein, so lange es 4 bis 20 Tyrosinsulfat-Reste hat. Das Polypeptid kann beispielsweise außerdem Aminosäure-Reste aufweisen, die keine Säurereste haben, die von einer starken Säure deriviert sind. Die Art und die Zahl der Aminosäure-Reste, die das Polypeptid aufbauen, sind nicht speziell beschränkt. Berücksichtigt man jedoch die leichte Durchführbarkeit der Synthese und dergleichen, so erfolgt die geeignete Wahl der Gesamtzahl der Aminosäure-Reste im Bereich von 4 bis 20 und bevorzugt 5 bis 15. Als ein Säurerest, der von einer starken Säure abgeleitet wird, lassen sich Reste exemplifizieren, die sich von einer starken Säure mit einem pKa-Wert von 3 oder kleiner ableiten, wie beispielsweise starke anorganische Säuren, z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, usw.
Der Begriff "Säurerest" bedeutet den nach Entfernung eines Wasserstoffatoms zurückbleibenden Teil einer Säure, z. B. NSO₄ ^–.
Ferner bedeutet der Begriff "Aminosäure-Rest" einen nach Entfernung eines Wasserstoffatoms von dem N-Terminus (-NH₂) und einer Hydroxyl-Gruppe von dem C-Terminus(-COOH) zurückbleibenden Teil einer Aminosäure.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung hat den vorstehend exemplifizierten Schwefelsäure-Rest, der in die reaktionsfähigen Gruppen der Tyrosin-Reste eingeführt ist, die das Polypeptid aufbauen. In die reaktionsfähigen Gruppen eines Tyrosin-Restes einbezogen ist eine freie Hydroxyl-Gruppe oder eine Amino-Gruppe. Die Amino-Gruppe der Hauptkette des Polypeptids, d. h. die N-terminale Amino-Gruppe des Polypeptids, kann auch als die reaktionsfähige Gruppe verwendet werden. Bevorzugt ist der Säurerest jedoch in andere reaktionsfähige Gruppen eingeführt als die N-terminale Amino-Gruppe, da die freie N-terminate Amino-Gruppe des Polypeptids beim Verbinden des Polypeptids mit einer Affinitätssubstanz wirksam werden kann, so dass bis zu einem bestimmten Umfang eine festgelegte Art der Verbindung des Polypeptids und der Affinitätssubstanz erhalten wird, der die Genauigkeit der Messung eines Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe höher macht.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann dargestellt werden durch die Formel: A-(R)_m-B (I) worin m eine ganze Zahl von 4 bis 20 unter der Voraussetzung ist, dass 4 bis 20 R Tyrosinsulfat-Reste sind und die übrigen R gleich oder verschieden sind und wobei ein Aminosäure-Rest keinen starken Säurerest aufweist, jede Seitenkette des Aminosäure-Rest eine reaktionsfähige Gruppe hat, die ausgewählt ist aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Amino-Gruppe, einer Imino-Gruppe und einer Thiol-Gruppe, und wobei die reaktionsfähige Gruppe geschützt werden kann; A ist ein Wasserstoffatom, eine schützende Gruppe vom N-Terminus oder ein Säurerest, der von einer starken Säure mit einem pKa-Wert von 3 oder kleiner deriviert ist, und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine schützende Gruppe vom C-Terminus.
In der vorgenannten Formel (I) ist m eine ganze Zahl von 4 bis 20 und bevorzugt 5 bis 15. Unter einer Vielzahl von R in der Zahl von m sollten mindestens 4 und bis zu m R unabhängig ein Tyrosinsulfat-Rest sein. Der Schwefelsäure-Rest wird in den Tyrosin-Rest eingeführt, indem er mit der reaktionsfähigen Gruppe des Tyrosin-Rests verbunden wird. Sofern keines der R in der Zahl von m Tyrosinsulfat-Reste ist, so ist der Rest der R unabhängig ein Aminosäure-Rest, der keinen starken Säurerest hat, wobei in diesem Fall die reaktionsfähige Gruppe der Seitenkette des Aminosäure-Restes durch eine konventionelle Gruppe vom N-Terminus als Amino-Gruppe geschützt werden kann. A ist ein Wasserstoffatom in dem N-Terminus einer Amino-Gruppe, wobei dieses Wasserstoffatom auch ersetzt sein kann durch eine konventionelle Schutzgruppe für eine N-Terminus-Amino-Gruppe und wobei der Säurerest, der von einer starken Säure deriviert ist, auch anstelle dieses Wasserstoffatoms eingeführt sein kann, wenn sie nicht geschützt ist. B ist eine Hydroxyl-Gruppe an der C-Terminus-Carboxyl-Gruppe, wobei diese Hydroxy-Gruppe durch eine konventionelle Schutzgruppe für die C-Terminus-Carboxyl-Gruppe ersetzt sein kann. In den vorgenannten können Art und Reihenfolge der m R-Aminosäure-Reste beliebig sein.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise auch in die folgenden 2 Gruppen eingeteilt werden:
(1) Polypeptid, das dargestellt wird durch die Formel: A-(R¹)_m'-B (II) worin die R¹ gleich oder verschieden sind, unabhängig ein Aminosäure-Rest, der einen starken Säurerest einführt, deriviert von einer starken Säure mit einem pKa-Wert von 3 oder kleiner, und zwar durch Binden an einer reaktionsfähigen Gruppe, die ausgewählt ist aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Amino-Gruppe, einer Imino-Gruppe und einer Thiol-Gruppe unter der Voraussetzung, dass mindestens 4 von R¹ Tyrosinsulfat-Reste sind; m' ist eine ganze Zahl von 4 bis 20 und A und B sind wie vorstehend festgelegt.
In der vorgenannten Formel (II) ist m' eine ganze Zahl von 4 bis 20 und bevorzugt 5 bis 15.
(2) Polypeptid, das dargestellt wird durch die Formel: A-(R¹)m'-(R²)_n-B (III) worin m' eine ganze Zahl von 4 oder größer ist; R¹ ist ein Tyrosinsulfat-Rest, jedes R² ist ein Aminosäure-Rest der keinen Rest einer starken Säure hat, jede reaktionsfähige Gruppe in jeder Seitenkette des Aminosäure-Restes kann geschützt werden; n ist eine ganze Zahl von 1 bis 16 und A und B sind wie vorstehend festgelegt.
In der vorgenannten Formel (III) ist R² ein Aminosäure-Rest, der keinen Säurerest hat, der von einer starken Säure deriviert ist; (m' + n) ist eine ganze Zahl von 5 bis 20 und mehr bevorzugt 6 bis 15; n ist eine ganze Zahl von 1 bis 16 und bevorzugt 1 bis 10; und die anderen Symbole haben die gleiche Bedeutung, wie vorstehend festgelegt wurde. Die Art und Reihenfolge der R2-Aminosäure-Reste in der Zahl von n sind beliebig. In diesem Fall ist ein Polypeptid zusammengesetzt aus einem Block, der Aminosäure-Reste enthält, von denen alle einen Säurerest aufweisen, der deriviert ist von einer starken Säure, d. h. die Tyrosinsulfat-Reste, und einen Block, der keinen solchen Rest einer starken Säure aufweist, wie er gerade vorstehend erwähnt wurde.
Von einer starken Säure derivierten Säurereste in dem Polypeptid sind Säurereste, die von der mehrwertigen starken Säure deriviert sind, Schwefelsäure. Der Rest ist gegenüber dem Phosphorsäure-Rest vorteilhaft und speziell dann, wenn das Polypeptid als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, da Phosphatase in dem Analyten vorhanden sein wird, der in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden soll. Wenn die Zahl der Reste einer starken Säure groß ist, ist das Polypeptid als die Trennung verbessernde Substanz schwer anzuwenden, wie beispielsweise in der Trennung mit Hilfe eines Ionenaustauschers, wo die Trennung und die Eluierung aus einer Säule oder dergleichen schwierig sind. Wenn daher das Polypeptid als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet werden soll, wird die Zahl der Säurereste geeigneterweise im Bereich von 4 bis 20 und bevorzugt 5 bis 15 gewählt. Unter Berücksichtigung einer leicht durchführbaren Synthese und dergleichen wird die Gesamtzahl der Aminosäure-Reste geeigneterweise im Bereich von gewöhnlich 4 bis 20 und bevorzugt 5 bis 15 ausgewählt. Wenn die Zahl der Säurereste kleiner ist als 3 überlappen sich ein Peak der Trennung mit Hilfe der die Trennung verbessernden Substanz und ein Elutionspeak, der auf eine Serumkomponente zurückzuführen ist, so dass die Genauigkeit der Messung (Analyse) herabgesetzt wird. Um das Überlappen des Peaks der Trennung mit Hilfe der die Trennung verbessernden Substanz und des auf eine Komponente in einer von einem Lebendkörper abgenommen Probe, wie beispielsweise Serum, Elutionspeak zu vermeiden und die Genauigkeit der Messung weiter zu verbessern, beträgt die Zahl der Reste einer starken Säure nach der vorliegenden Erfindung 4 oder mehr und bevorzugt 5 oder mehr. Bei Einführung der Schwefelsäure-Reste wird darüber hinaus die bevorzugt unter Nutzung der phenolischen Hydroxyl-Gruppen der Tyrosin-Reste vom Standpunkt der Stabilität der Schwefelsäure-Reste in einer wässrigen Lösung nach ihrer Einführung. Andere Aminosäure-Reste, die in dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung vorliegen können, sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie von konventionellen Aminosäuren auf dem Gebiet der Peptidchemie abgeleitet sind. Bevorzugte Beispiele dafür sind Reste von Aminosäuren, wie beispielsweise Alanin, Glycin, β-Alanin, usw.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann nach einer der zwei folgenden Methoden oder dergleichen synthetisch dargestellt werden: (i) eine Methode zur Einführung eines Säurerestes, deriviert von einer starken Säure in die freien reaktionsfähigen Gruppen eines Polypeptids, das über die geeignete Zahl freier reaktionsfähiger Gruppen verfügt (J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, (1990), 1739–1744, usw.), (ii) eine Methode zur synthetischen Darstellung eines gewünschten Polypeptids, indem als Synthesematerial von Aminosäuren ausgegangen wird, deren Säurerest von der starken Säure deriviert ist (Chem. Pharm. Bull., 41(2), (1993), 376–380, usw.). Bezieht man die Ausbeute des gewünschten Polypeptids, usw. in Betracht, so ist die Methode (i) gegenüber der Methode (ii) bevorzugt (und speziell dann, wenn die Zahl der Aminosäure-Reste groß ist). Die vorgenannte Methode (ii) hat jedoch den folgenden Vorteil: da ein Sulfat-Ion nicht erforderlich ist, lässt sich eine funktionelle Gruppe, die sich mit einer Affinitätssubstanz (z. B. Antikörper) verbinden kann, wie beispielsweise ein Maleinimidocapronsäure-Rest, direkt in den N-Terminus des resultierenden Polypeptids einführen, so dass das Polypeptid unmittelbar mit der Affinitätssubstanz verbunden werden kann.
Eine Methode zum Einführen eines Schwefelsäure-Restes in die freie reaktionsfähige Gruppe eines Tyrosin-Restes ist so lange speziell nicht beschränkt, wie sie die Einführung des Säurerestes in die freie reaktionsfähige Gruppe erlaubt, d. h. eine Hydroxyl-Gruppe, Amino-Gruppe).
Speziellere Beispiele für die Methode werden nachfolgend ausgeführt. Eine Methode umfasst das Umsetzen eines Mittels zum Sulfatieren (z. B. HSO₃·Cl, HSO₃·Dimethylformamid oder HSO₃·Pyridin), Tyrosin, Polypeptid, das Reste einer solchen Aminosäure in einer Menge von 1 bis 20 val pro val freie Hydroxyl-Gruppen in der Aminosäure hat (oder die freien Hydroxyl-Gruppen der Aminosäurenreste), bei Null bis 40°C für 1 bis 24 Stunden in einem wasserfreien Lösemittel (z. B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO)) unter Verwendung einer alkalischen Suibstanz (z. B. Pyridin, Triethylamin oder NaH) als einen Katalysator und dadurch Einführen eines Säure (Schwefelsäure) derivierten Säurerestes in die Hydroxyl-Gruppe des Aminosäure-Restes (oder jede der Hydroxyl-Gruppen der Aminosäure-Reste). Eine Methode, umfassend das Umsetzen eines Mittels zum Sulfatieren (z. B. HSO₃·Cl, HSO₃·Dimethylformamid oder HSO₃·Pyridin) mit Tyrosin, das eine freie Amino- Gruppe (z. B. Lysin oder Arginin) (oder ein Polypeptid mit einem oder mehreren Resten einer solchen Aminosäure) in einer Menge von 1 bis 20val pro val der freien Amino-Gruppe der Aminosäure (oder der freien Amino-Gruppe(n) der Aminosäure-Reste) bei 0° bis 40°C für 1 bis 24 Stunden in einem Lösemittel (wasserfrei) (z. B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO)) unter Verwendung einer alkalischen Substanz (z. B. Pyridin, Triethylamin oder NaH) als ein Katalysator und dadurch Einführen eines von der starken Säure (Schwefelsäure) derivierten Säurerestes in die Amino-Gruppe des Aminosäure-Restes (oder jede der Amino-Gruppe(n) der Aminosäure-Reste). Berücksichtigt man die leichte Durchführbarkeit der Synthese, wobei die Stabilität des eingeführten Säurerestes in einer wässrigen Lösung, dessen Stabilität gegenüber Enzyme, die in einer von einem Lebendkörper (z. B. Phosphatase) abgenommenen Probe vorhanden ist usw., so hat sich ein Schwefelsäure-Rest als der Säurerest der von einer starken Säure deriviert ist, als bevorzugt erwiesen als ein Phosphorsäure-Rest. Dementsprechend wird in der vorliegenden Erfindung ein Schwefelsäure-Rest verwendet.
Als das Polypeptid, das über freie reaktionsfähige Gruppen verfügt, wie beispielsweise Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen, Imino-Gruppen, Thiol-Gruppen usw., das als Ausgangsmaterial für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann entweder ein kommerziell verfügbares Polypeptid verwendet werden oder ein Poylpeptid, das nach einer konventionellen Methode synthetisch dargestellt wird, die allgemein auf dem Gebiet der Peptidchemie zum Einsatz gelangt, wie beispielsweise die Methode mit aktivem Ester, die Methode mit gemischtem Säureanhydrid oder die Azid-Methode (Nobuo Izumiya et al. „Peptide Gosei no Kiso to Jikken" (Basis and Practice of Peptide Synthesis), S. 89–142, 20. Jan., 1985 Maruzen Co., Ltd.). Für die synthetische Darstellung eines solchen Polypeptids, ist eine Schutzgruppe, die in dem nachfolgenden Schritt der Sulfatierung stabil ist, als eine Schutzgruppe für die N-terminale Amino-Gruppe bevorzugt. Bevorzugte Beispiele für die Schutzgruppen sind Schutzgruppen vom Urethan-Typ, wie beispielsweise 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe, die unter alkalischen Bedingungen entfernbar sind. Für die reaktionsfähigen Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren oder Aminosäure-Reste lassen sich in geeigneter Weise unter Berücksichtigung beispielsweise der Synthesebedingungen des Polypeptids und der Bedingungen der Einführung der Säurereste, die von Schwefelsäure deriviert sind, auswählen. Bevorzugte Beispiele für diese Schutzgruppen sind die tert-Butyl-Gruppe und Benzyl-Gruppe.
Als die Affinitätssubstanz, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangt, kann ohne besondere Einschränkung jede beliebige Substanz so lange verwendet werden, die Affinität zu einem Analyten verfügt, der in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll. Spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz sind Antikörper, Antigene und Lektine (z. B. Concanavalin A, Lens Culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.), die über Affinität zum Analyten verfügen; Inhibitoren für Enzyme (z. B. Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT)); Polynukleotid-Ketten, die komplementär zu einsträngigen Polynukleotiden von Nukleinsäuren sind, bei denen es sich um zu messende Analyten handelt, sowie Rezeptoren für Thyroid-stimulierendes Hormon, Acetylcholin, Glutaminsäure, usw.
Als eine Methode für die Herstellung eines kombinierten Produktes der Affinitätssubstanz und des Polypeptids nach der vorliegenden Erfindung (nachfolgend abgekürzt als "das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung") lässt sich eine Methode des Verknüpfens der speziellen reaktionsfähigen Gruppe der Affinitätssubstanz mit der speziellen reaktionsfähigen Gruppe des Polypeptids exemplifizieren; eine Methode zum Verknüpfen der speziellen reaktionsfähigen Gruppe der Affinitätssubstanz durch das Polypeptid; eine Methode zum Kombinieren der Affinitätssubstanz und des Polypeptids durch eine Substanz, die in Bezug auf die Affinitätssubstanz (z. B. Antikörper, Lektin, Antigen, Inhibitor, DNA, usw.) über Affinität verfügen. Speziell können alle folgenden Methoden exemplifiziert werden, wobei die Herstellung nach einer beliebigen von ihnen ausgeführt werden kann. 1) Konventionelle Methoden zum Anbringen einer markierenden Substanz an einen Antikörper, die allgemein zum Einsatz gelangen, wie beispielsweise im konventionellen Enzymimmunoassay (EIA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluorimmunoassy (FIA) (z. B. Yuichi Yamamura "Igaku Jikken Koza Bd. 8" 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971; Akira Kawano "Zusetsu Keikokotai" 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983; und Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai und Kiyoshi Miyai "Koso Men-eki Sokuteiho" 2. Ausg., IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). 2) Konventionelle Methoden zur Modifikation und Einführung von Substanzen (z. B. Ikuzo Uritani, Kensuke Shimura, Michinori Nakamura und Masaru Funazu „Tanpakushitsu-no Kagakushushoku <Jo> <Ge>" 1. Ausg., GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd., 1981; Yuji Inada et al. "Poly(ethylenglykol) Shushoku Tanpakushitsu" Seikagaku Bd. 62, Nr. 11, S. 1351–1362, Japanese Biochemical Association, 1990; und George N. K. und Mark M. M. "DNA PROBES" STOCKTON PRESS, 1989).
Spezielle Beispiele der Methode zum Verknüpfen der speziellen reaktionsfähigen Gruppe der Affinitätssubstanz mit der speziellen reaktionsfähigen Gruppe des Polypeptids sind nachfolgend ausgeführt. Es kann eine Methode exemplifiziert werden, die das Umsetzen einer Verbindung umfasst, in der eine Maleinimid-Gruppe über einen Spacer an den N-Terminus des Polypeptids der vorlie genden Erfindung gebunden wird (die Verbindung wird nachfolgend abgekürzt als "Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung"), wobei mit der SH-Gruppe ein Antikörper Fab' nach einer konventionellen Methode hergestellt wird und dadurch ein kombiniertes Produkt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und der Affinitätssubstanz (Antikörper) hergestellt wird.
Die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung, d. h. eine Verbindung, die eine Maleinimid-Gruppe aufweist, die über ein Spacer an dem N-Terminus des Polypeptids der Formel (I) gebunden ist, kann allgemein dargestellt werden durch die Formel: D-E-(R)_mB (IV) worin D eine Maleinimido-Gruppe ist; E ist ein Spacer und R, m und B sind wie vorstehend festgelegt.
Die Maleinimid-Verbindung der Formel (IV) lässt sich beispielsweise in die folgenden 2 Gruppen einteilen:
(1) eine Maleinimid-Verbindung, dargestellt durch die Formel: D-E-(R¹)_m'-B (V) worin D, E, R¹, m' und B wie vorstehend festgelegt sind.
(2) eine Maleinimid-Verbindung, dargestellt durch die Formel: D-E-(R^l)_m'-(R²)_n-B (VI) worin D, E, R¹, R², m', n und B wie vorstehend festgelegt sind und (m' + n) eine ganze Zahl von 5 bis 20 ist.
Der in diesen Formeln durch E dargestellte Spacer ist nicht speziell beschränkt. Es kann jeder beliebige Spacer so lange verwendet werden, wie er die Anbringung des N-Terminus des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bzw. einer einer Maleinimid-Gruppe an den Enden des Spacers erlaubt und die Einführung (oder das Binden) der Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung an der Affinitätssubstanz, wie beispielsweise Antikörper, der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht behindert. Beispiele für den Spacer sind Gruppe, die dargestellt werden durch -R⁴CO-, worin R⁴ eine zweiwertige Kohlenwasserstoff-Gruppe ist. Speziellere Beispiele sind Gruppen, die dargestellt werden durch die folgenden Formeln (VII) bis (IX): -(CH₂)_p-CO- (VII) worin p eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, -(CH₂)_p-CO- [VII]
worin jedes q und r Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist,
worin q und r wie vorstehend festgelegt sind.
Die Alkylen-Gruppen, die Phenylen-Gruppe und die Cyclohexylen-Gruppe in den Formeln (VII) bis (IX) können einen oder mehrere Substituenten haben. In die Substituenten einbezogen sind beispielsweise lineare oder verzweigte niedere Alkyl-Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, etc., und hydrophile Gruppen; wie beispielsweise Hydroxyl, Carboxyl, Sulfo, Amino, usw.
Die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung kann mühelos beispielsweise nach der folgenden Methode erhalten werden.
Es werden das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, ein zweiwertiges vernetzendes Mittel, einschließlich eine Verbindung mit einer Maleinimido-Gruppe an dem einen Ende und einer mit einer Amino-Gruppe reaktionsfähigen Gruppe am anderen Ende in einer Menge von 1 bis 100, vorzugsweise 1 bis 50 und mehr bevorzugt 1,2 bis 10 Mol pro Mol der N-terminalen Amino-Gruppe des Polypeptids und wahlweise ein Reaktionsbeschleuniger in einer Mengen von 2 bis 5 Mol pro Mol der Amino-Gruppe umgesetzt bei 4° bis 37°C für 0,2 bis 10 Stunden in einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 9 oder eine geeigneten organischen Lösemittel. Danach wird die Reaktionslösung mit Hilfe einer geeigneten Säulenchromatographie gereinigt, wodurch die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.
Das zweiwertige vernetzende Mittel, das in der vorstehend beschriebenen Reaktion verwendet wird, ist nicht speziell beschränkt, so lange es die Maleinimid-Gruppe in den N-Terminus des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zum Schluss einführen kann. Beispiele dafür sind Vernetzungsmittel, die über eine Maleinimid-Gruppe und eine Succinimid-Gruppe verfügen. Speziellere Beispiele sind: Succinimidyl-N-4-maleinimidobutyrat, Succinimidyl-N-6-maleinimidocaproylat, Succinimidyl-N-8-maleinimidocaprylat, Succinimidyl-N-11-maleinimidoundecanoat, Succinimidyl-N-4-(2-maleinimidoethoxy)succinylat, Sulfosuccinimidyl-N-4-maleinimidobutyrat, Sulfosuccinimidyl-N-6-maleinimidocaproylat, Sulfosuccinimidyl-N-8-maleinimidocaprylat, Succinimidyl-N-11-maleinimidoundecanoat, Succin imidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, Sulfosuccinimidyl-4-(N- maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, Succinimidyl-m-maleinimidobenzoat, Sulfosuccinimidyl-m-maleinimidobenzoat, Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat, usw.
Als den Reaktionsbeschleuniger kann man Basen exemplifizieren, wie beispielsweise Triethylamin, Pyridin, usw.
Als die Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 9, die für die Reaktion als ein Lösemittel verwendet wird, kann ein Phosphatpuffer exemplifiziert werden, ein Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, Goods-Puffer (z. B. N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin (Bicin)-Puffer,2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (NEPES)-Puffer, 3-Morpholinpropansulfonsäure (MOPS)-Puffer, usw.). Das organische Lösemittel schließt beispielsweise Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO) ein.
Die Chromatographie, die zum Reinigen der Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung nach Beendigung der Reaktion angewendet wird, schließt beispielsweise eine Gel-Säulenchromatographie ein, Silicagel-Säulenchromatographie und Octadecyl-Silicagel(ODS)-Säulenflüssigchromatographie.
Das organische Lösemittel ist vorzugsweise ein Lösemittel für die Reaktion. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass die ???? der Maleinimid-Gruppe in dem organischen Lösemittel leichter ist, so dass die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung mit höherer Ausbeute erhalten werden kann.
Die Reinigung wird vorzugsweise mit Hilfe der ODS-Säulenflüssigchromatographie ausgeführt, da das überschüssige zweiwertige Vernetzungsmittel und die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Verbindung voneinander mit größerer Sicherheit getrennt werden können.
Die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten wird, lässt sich stabil durch Behandlung lagern, wie beispielsweise Einengung bis zur Trockene, Gefriertrocknen, usw., und ist damit als ein Intermediat zum Anbringen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung an der geeigneten Affinitätssubstanz, wie beispielsweise ein Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, besonders nützlich.
Eine Methode zum Kombinieren der Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung und der Affinitätssubstanz, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um das kombinierte Produkt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und der Affinitätssubstanz zu erhalten, läuft beispielsweise folgendermaßen ab.
Es wird eine Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung umgesetzt mit der SH-Gruppe eines Antikörpers Fab', hergestellt nach einer konventionellen Methode, und zwar bei 4° bis 37°C für 1 bis 16 Stunden in einer Lösung, die dem Antikörper nicht seine Eigenschaften nimmt (z. B. eine Pufferlösung, die in der Regel auf dem Gebiet des Immunoassays verwendet wird), wodurch das kombinierte Produkt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und der Affinitätssubstanz (Antikörper) hergestellt werden kann.
Als eine Methode zum Verknüpfen der Amino-Gruppe des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit der Amino-Gruppe der Affinitätssubstanz kann eine konventionelle Glutaraldehydmethode exemplifiziert werden. Als eine Methode zum Verknüpfen der Amino-Gruppe des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit der Zuckerkette der Affinitätssubstanz kann eine konventionelle Methode mit Periodsäure exemplifiziert werden, die das Behandeln der Zuckerkette mit Periodsäure unter Erzeugung einer Aldehyd-Gruppe umfasst und Verknüpfen der Aldehyd-Gruppe mit der Amino-Gruppe des Polypeptids der vorliegenden Erfindung.
Obgleich das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in die Affinitätssubstanz unter Nutzung der reaktionsfähigen Gruppe in der Seitenkette des Polypeptids eingeführt werden kann, wird es bevorzugt unter Nutzung seiner N- terminalen Amino-Gruppe daran gebunden (oder darin eingeführt).
Der Grund dafür ist folgender. Da die N-terminale Amino-Gruppe in der Regel einzeln ist, führt die Anbringung der Affinitätssubstanz unter Verwendung der N-terminalen Amino-Gruppe zu einer Kombination des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und der Affinitätssubstanz in einem Molverhältnis von 1 : 1. Wenn daher ein zu messender Analyt unter Verwendung des resultierenden kombinierten Produktes abgetrennt wird, so wird der Analyt als ein Einzelpeak separiert, so dass die Genauigkeit einer gewünschten Messung weiter verbessert werden kann. Die Maleinimid-Verbindung der vorliegenden Erfindung ist eine zur Herstellung eines solchen kombinierten Produktes verwendbare Substanz.
Wenn das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung unter Nutzung der N-terminalen Amino-Gruppe hergestellt wird, wird vorzugsweise kein Säurerest, der von einer starken Säure deriviert ist, in den N-terminalen Aminosäure-Rest des Polypeptids der vorliegenden Erfindung eingeführt. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass die Ausbeute des gewünschten kombinierten Produkts höher ist, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das keinen in den N-terminalen Aminosäure-Rest eingeführten Säurerest hat, kombiniert ist mit der Affinitätssubstanz.
Ein Verfahren zum Messen einer Lebendkörper-Komponente unter Verwendung des kombinierten Produktes der vorliegenden Erfindung (nachfolgend abgekürzt als "das Messverfahren") ist so lange nicht speziell beschränkt, wie das Verfahren die Ausführung einer gewünschten Messung unter Verwendung des kombinierten Produktes der vorliegenden Erfindung möglich macht. Spezielle Beispiele dafür sind die folgenden Verfahren.
(1) Ein Verfahren zum Messen der Menge eines in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe zu messenden Analyten, bei dem eine nicht kompetitive Reaktion (Messverfahren (1)) genutzt wird
Erstens, wird eine von einem Lebendkörper kommende Probe, die einen zu messenden Analyten enthält, eine Affinitätssubstanz, die mit einer detektierbaren Substanz markiert ist (nachfolgend abgekürzt als "markierte Affinitätssubstanz") und das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung (die Bindungsstellen für die markierte Affinitätssubstanz bzw. für das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung in dem Analyten sind verschieden) durch Mischen umgesetzt und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung, um durch Kombination des Analyten, der markierten Affinitätssubstanz und des kombinierten Produkts der vorliegenden Erfindung einen Komplex zu erzeugen. Danach wird der Komplex von der freien markierten Affinitätssubstanz mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung abgetrennt, beispielsweise einer Maschine oder einem Instrument, die über eine Anionenaustauschwirkung verfügen, einschließlich ein HPLC-Apparat, der ausgestattet ist mit einer Säule, die mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach wird die Menge der in dem abgetrennten Komplex enthaltenden detektierbaren Substanz mit Hilfe einer Messmethode ermittelt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat davon wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, und zwar unter Verwendung der Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, und eine Eichkurve erhalten, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplex darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplex entspricht, bestimmt, womit die Menge des Analyten in der Probe gemessen werden kann.
In der vorstehend beschriebenen Reaktion werden die Konzentrationen der markierten Affinitätssubstanz und des kombinierten Produkts der vorlie genden Erfindung, die für die Erzeugung des Komplexes verwendet werden, in Abhängigkeit von einem Wert variiert, bei dem Messgrenze des Analyten in der Probe angesetzt ist. In der Regel sind die markierte Affinitätssubstanz und das kombinierte Produkt in der Reaktionslösung vorzugsweise in Konzentrationen enthalten, die nicht kleiner sind als die Konzentration, bei der sie an dem gesamten Analyten einer Konzentration binden können, die der Messgrenze entspricht und vorzugsweise das 2-fache oder mehr und mehr bevorzugt das 5- fache oder mehr und am meisten bevorzugt das 10-fache oder mehr so hoch sind wie die Konzentration.
Wenn es sich bei dem Analyten selbst um eine Substanz handelt, die mit irgendeiner Methode messbar oder detektierbar ist, lässt sich die Menge des Analyten in der Probe in ähnlicher Weise messen, indem die vorgenannte Reaktion ohne die markierte Affinitätssubstanz ausgeführt und die Menge des Analyten in den resultierenden Komplex mit Hilfe einer Methode gemessen wird, die für die Eigenschaften des Analyten geeignet ist.
(2) Ein Verfahren zum Messen der Menge eines Analyten, der in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll, bei dem eine kompetitive Reaktion (Messverfahren (2)) genutzt wird
Zunächst werden eine Probe, die von einem Lebendkörper kommt und einen zu messenden Analyten enthält, ein Analyt, der mit einer detektierbaren Substanz markiert ist (nachfolgend abgekürzt als "markierter Analyt") und das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung umgesetzt durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung, um einen Komplex des Analyten und des kombinierten Produkts der vorliegenden Erfindung und einen Komplex des markierten Analyten und des kombinierten Produkt der vorliegenden Erfindung (nachfolgend abgekürzt als "markierter Komplex") zu erzeugen. Sodann wird der markierte Komplex abgetrennt von dem freien markierten Analyten mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung, beispielsweise einer Maschine oder einem Instrument, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich ein HPLC-Apparat, der ausgestattet ist mit einer mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackten Säule, einer Anionenaustauschmembran oder einem Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem markierten und somit abgetrennten Komplex enthalten ist, mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat wird in der gleichen Weise eine Messung ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, indem Proben verwendet werden, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, und eine Eichkurve erhalten, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz in dem markierten Komplex darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem markierten Komplex entspricht, bestimmt, wodurch die Menge des Analyten in der Probe gemessen werden kann.
In der vorgenannten Reaktion sind die Konzentrationen des kombinierten Produkts der vorliegenden Erfindung und des markierten Analyten, die zur Erzeugung des markierten Komplexes verwendet werden, nicht speziell beschränkt und können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Werten ermittelt werden, bei denen die Messgrenze des Analyten bzw. die Messempfindlichkeit für den Analyten angesetzt wurden. Allerdings sollte die Konzentration des markierten Analyten, der zur Verwendung gelangt, nicht kleiner sein als eine Konzentration, bei der der markierte Analyt an dem gesamten kombinierten Produkt der vorliegenden Erfindung binden kann, das in der Reaktionslösung vorliegt.
(3) Ein Messverfahren, bei dem es sich bei den Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, um 2 oder mehrere Substanzen mit der gleichen Wirkung und den gleichen nachweisbaren chemischen Eigenschaften handelt (Messverfahren (3))
Zunächst wird eine von einem Lebendkörper kommende Probe, die die zu messenden Analyten enthält, mit einer Substanz, die spezifisch an mindestens einem der Analyten bindet, nicht jedoch an mindestens einem der anderen Analyten bindet und die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung daran gebunden hat (oder darin eingeführt aufweist) (Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt A der vorliegenden Erfindung") umgesetzt durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung. Damit wird ein Komplex aus spezifischem Analyt/spezifischen Analyten in der Probe und dem kombinierten Produkt A der vorliegenden Erfindung gebildet. Anschließend wird der Komplex von freiem Analyt/freien Analyten mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung, beispielsweise einer Maschine oder einem Instrument abgetrennt, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich einem HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gefüllt ist, einer Anionenaustauschmembran oder einem Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach wird/werden der Analyt/die Analyten, der/die in dem abgetrennten Komplex enthalten ist/sind oder die Menge an freiem Analyt/freien Analyten oder beide mit Hilfe einer Messmethode ermittelt, die für die für die Eigenschaften der Analyten geeignet ist. Separat wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, und eine Eichkurve erhalten, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und dem gemessenen Wert der tatsächlich erhaltenen Eigenschaft des Analyten in dem Komplex darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten ermittelt, die dem Messwert entspricht, wodurch die Menge von beliebigen Analyten in der Probe gemessen werden kann.
In der vorgenannten Reaktion ist die Konzentration des kombinierten Produkts A der vorliegenden Erfindung, die zur Erzeugung des Komplexes verwendet wird, nicht speziell beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Werten bestimmt werden, bei denen die Messgrenze des Analyten bzw. die Messempfindlichkeit für den Analyten angesetzt ist.
(4) Ein Messverfahren, bei dem es sich bei den Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, um 2 oder mehrere Substanzen mit der gleichen Wirkung handelt oder die unterschiedliche Wirkungen trotz ihrer ähnlichen Strukturen haben (Messprozess (4))
Zunächst wird eine Probe, die von einem Lebendkörper kommt und die zu messenden Analyten enthält, umgesetzt mit einer Substanz, die über Affinität zu allen Analyten verfügt (hierin abgekürzt als "Affinitätssubstanz A") , die mit einer detektierbaren Substanz markiert worden ist (nachfolgend abgekürzt als "markierte Affinitätssubstanz A"), und mit einer Substanz, die über eine Affinität zu mindestens einem speziellen Analyten unter den Analyten verfügt und darin das Polypeptid der vorliegenden Erfindung eingeführt aufweist (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt B der vorliegenden Erfindung"), wobei das Umsetzen durch Mischen erfolgt und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung. Damit wird ein Komplex von Analyten) und der markierten Affinitätssubstanz von A (nachfolgend abgekürzt als "Komplex A") und ein Komplex des speziellen Analyten/der speziellen Analyten, der markierten Affinitätssubstanz A und des kombinierten Produkts B der vorliegenden Erfindung gebildet (nachfolgend abgekürzt als "Komplex B"). Danach werden der Komplex A, der Komplex B und die freie markierte Affinitätssubstanz A voneinander mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung voneinander getrennt, beispielsweise eine Maschine oder ein Instrument, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich ein HPLC-Apparat, der ausgestattet ist mit einer Säule, die mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, einer Anionenaustauschmembran oder einem Reaktions rohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Anschließend wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex A enthalten ist, oder die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex B enthalten ist, oder beide mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat davon wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, und eine Eichkurve erhalten, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex A enthalten ist, und/oder die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex B enthalten ist, darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplex/den Komplexen entspricht, bestimmt, wodurch die Menge von beliebigen Analyten in der Probe gemessen werden kann.
Wenn die Affinitätssubstanz A selbst mit Hilfe einer bestimmten Methode messbar oder detektierbar ist, kann die Menge des Analyten in der Probe in ähnlicher Weise gemessen werden, indem die vorstehend ausgeführte Reaktion unter Verwendung der Affinitätssubstanz A, die nicht mit der detektierbaren Substanz markiert ist ausgeführt und die Menge der Affinitätssubstanz A in dem resultierenden Komplex mit Hilfe einer Methode gemessen wird, die für die Eigenschaften der Affinitätssubstanz A geeignet ist.
(5) Ein Messverfahren, bei dem die Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, 2 Substanzen sind, die die gleiche Wirkung haben oder unterschiedliche Wirkungen trotz ihrer ähnlichen Strukturen haben (Messprozess (5))
Zunächst wird eine von einem Lebendkörper kommende Probe, die die zu messenden Analyten enthält, umgesetzt mit einer markierten Affinitätssubstanz A, einer Substanz, die eine Affinität zum Analyten 1 in der Probe besitzt und darin ein Polypeptid 1 der vorliegenden Erfindung eingeführt aufweist (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt C der vorliegenden Erfindung") und einer Substanz, die über Affinität zum Analyten 2 in der Probe verfügt und darin ein Polypeptid 2 der vorliegenden Erfindung eingeführt aufweist (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt D der vorliegenden Erfindung"), wobei die Umsetzung durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung erfolgt. Damit werden ein Komplex des Analyten 1, des kombinierten Produkts C der vorliegenden Erfindung und der markierten Affinitätssubstanz A (nachfolgend abgekürzt als "Komplex C") und ein Komplex des Analyten 2, des kombinierten Produkts D der vorliegenden Erfindung und der markierten Affinitätssubstanz A (nachfolgend abgekürzt als „Komplex D") erzeugt. Sodann werden der Komplex C, der Komplex D und die freie markierte Affinitätssubstanz A voneinander auf der Grundlage der Verschiedenheit der Eigenschaften zwischen den Polypeptiden 1 und 2 mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung voneinander getrennt, beispielsweise einer Maschine oder einem Instrument, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich ein HPLC-Apparat, der ausgestattet ist mit einer Säule, die mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, einer Anionenaustauschmembran oder einem Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach werden die Menge der detektierbaren . Substanz, die in dem abgetrennten Komplex C enthalten ist, oder die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex D enthalten ist, oder beide mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat davon wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise durch Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, und eine Eichkurve erhalten, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten 1 (oder 2) und der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex C enthalten ist, und/oder der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex D enthalten ist, dargestellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplex/den Komplexen entspricht, bestimmt, wodurch die Menge beider Analyte in der Probe gemessen werden kann.
Wenn die Affinitätssubstanz A mit irgendeiner Methode selbst messbar oder detektierbar ist, kann die Menge des Analyten in der Probe in ähnlicher Weise unter Ausführung der vorstehend ausgeführten Reaktion gemessen werden, indem die Affinitätssubstanz A, die nicht markiert ist mit der detektierbaren Substanz verwendet wird und die Menge der Affinitätssubstanz A in dem resultierenden Komplex mit Hilfe einer Methode gemessen wird, die für die Eigenschaften der Affinitätssubstanz A geeignet ist.
(6) Eine Messmethode, bei der es sich um die Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, um 2 oder mehrere Formen von Glykoproteinen handelt, die in ihrer Zuckerkettenstruktur verschieden sind, jedoch weitgehend über die gleiche Proteinstruktur verfügen (Messprozess (6)).
Zunächst wird eine Probe, die von einem Lebendkörper kommt und 2 oder mehrere Formen von Glykoproteinen enthält, die gemessen werden sollen, umgesetzt mit einem Lektin, das in der Lage ist, die Zuckerkettenstruktur von mindestens einem dieser Glykoprotein-Analyten zu erkennen, die gemessen werden sollen, und mit einem kombinierten Produkt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und einem Antikörper, der über eine Eigenschaft verfügt, sich mit allen Glykoprotein-Analyten zu binden, jedoch davon abgehalten wird, sich an Glykoprotein-Analyten) zu binden, der/die darin das Lektin eingeführt aufweisen (das kombinierte Produkt wird nachfolgend abgekürzt als "Polypeptidkombinierter Antikörper"), und einem Antikörper, der sich an allen Glykoprotein- Analyten binden kann, einschließlich der/die Glykoprotein-Analyt(en), der/die darin das Lektin eingeführt aufweisen, und darin eingeführt eine detektierbare Substanz aufweist (dieser Antikörper wird nachfolgend abgekürzt als "markierter Antiglykoprotein-Antikörper"). Damit werden ein Komplex von Glykoprotein(en), dem Lektin und dem markierten Antiglykoprotein-Antikörper und ein Komplex von Glykoprotein(en), dem Polypeptid-kombinierten Antikörper und dem markierten Antiglykoprotein-Antikörper erzeugt. Anschließend werden diese Komplexe von freiem markierten Antiglykoprotein-Antikörper mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung abgetrennt, beispielsweise einer Maschine oder einem Instrument, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich ein HPLC-Apparat, der ausgestattet ist mit einer Säule, die mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, einer Anionenaustauschmembran oder einem Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in jedem oder einem der separierten Komplexe enthalten ist, mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat davon wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Glykoprotein-Analyten enthalten, und damit eine Eichkurve erhalten, die die Beziehung zwischen der Menge des Glykoprotein-Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz darstellt, die in jedem oder einem der Komplexe enthalten ist. Unter Verwendung dieser Eichkurve wird die Menge des Glykoprotein-Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplexen den Komplexen entspricht, bestimmt, wodurch die Menge beliebiger Glykoprotein-Analyten in der Probe gemessen werden kann.
Wenn der Glykoprotein-Analyt selbst mit irgendeiner Methode messbar (detektierbar) ist, lässt sich die vorstehend ausgeführte Messung selbstverständlich ohne den markierten Antiglykoprotein-Antikörper ausführen.
Ein Analyt in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe, der mit Hilfe eines der Messverfahren (1) und (2), wie sie vorstehend beschrieben wurden, gemessen werden kann, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie er der folgenden Bedingung i) oder ii) genügt. i) Eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit dem Analyten mit Hilfe einer hohen Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten erzeugen kann, und die Substanz kann selbst mit irgendeiner Methode gemessen (detektiert) werden oder kann mit irgendeiner detektierbaren Substanz markiert werden ii) Der Analyt selbst kann mit irgendeiner detektierbaren Substanz markiert werden und es gibt eine Substanz, die einen stabilen markierten Komplex mit dem Analyten durch eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten erzeugen kann. Typische Beispiele für den Analyten sind Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Zuckerketten, Lipide, Hormone, Arzneimittel, usw., die in Proben enthalten sind, die von Lebendkörpern kommen, beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen, Lymphozyten, Hämozyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele des Analyten sind Tumormarker, wie beispielsweise α-Fetoprotein (AFP), CA19-9, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), karzinoembryonales Antigen (CEA), Substanzen mit speziellen Zuckerketten, die durch kanzerogene Zellen erzeugt werden und dergleichen; Serumproteine, wie beispielsweise Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin E (IgE), Immunoglobulin G (IgG), β₂-Mikroglobulin, Albumin, Ferritin; und dergleichen; Peptide, wie beispielsweise C-Peptid, Angiotensin I, und dergleichen; Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP) und dergleichen; antivirale Antikörper gegen klinisch bekannte Viren, wie beispielsweise Rötelnvirus, Herpesvirus, Hepatitisvirus, ATL-Virus, AIDS-Virus, und dergleichen; Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) von Pathogenen, wie beispielsweise Viren und dergleichen; oder einsträngige Polynukleotide, die Nukleinsäuren aufbauen, wie sie vorstehend beschrieben wurden; antigene Substanzen, die von Pathogenen deriviert sind, wie beispielsweise Virus und dergleichen; Antikörper, die mit Allergenen reaktionsfähig sind, wie beispielsweise Pollen von Bäumen und Pflanzen (z. B. Sicheltanne), Hausstaub und dergleichen; Lipide, wie beispielsweise Lipoproteine und dergleichen; Proteasen, wie beispielsweise Trypsin, Plasmin, Serinprotease und dergleichen; Hormone, wie beispielsweise Insulin, humanes Choriongonadotropin (hCG), Thyroxin (T4), Triiodthyronin (T3), Prolactin, thyreotropes Hormon (TSH), und dergleichen; Arzneimittel, wie beispielsweise Digoxin, Phenytoin, Morphin, Nikotin und dergleichen; sowie Rezeptoren für thyreotropes Hormon, Acetylcholin, Glutaminsäure, usw.
Die Affinitätssubstanz für einen Analyten, der in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll, die für die Herstellung einer markierten Affinitätssubstanz in dem Messverfahren (1) verwendet wird, wie es vorstehend beschrieben wurde, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie es einen stabilen Komplex mit dem Analyten durch hohe Affinität zwischen der Affinitätssubstanz und dem Analyten erzeugt und die Affinitätssubstanz nach Erfordernis selbst mit irgendeiner Methode gemessen oder detektiert werden kann oder mit irgendeiner messbaren oder detektierbaren Substanz markiert werden kann. In die Affinitätssubstanz einbezogen sind beispielsweise: Antikörper gegen Substanzen mit Antigenität, einschließlich Haptene; Antigene gegen Antikörper; Lektine mit Affinität zu Zuckerketten, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin und dergleichen; Inhibitoren für spezielle Enzyme, wie beispielsweise α₁-Antitrypsin für Trypsin, α₂-Makroglobulin für Plasmin, α₂-Makroglobulin und α₁-Antichymotrypsin für Serinprotease, und dergleichen; Polynukleotid-Ketten, die komplementär zu einsträngigen Polynukleotiden sind, bei denen es sich um Analyte handelt, die in Proben gemessen werden sollen, die von Lebendkörpern kommen; sowie Rezeptoren für Hormone.
Die Affinitätssubstanz für einen Analyten, der in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll, die zur Herstellung des kombinierten Produkts der vorliegenden Erfindung in den Messverfahren (1) und (2) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie einen stabilen Komplex mit dem Analyten oder markierten Analyten oder einen Komplex des Analyten und der markierten Affinitätssubstanz durch hohe Affinität zwischen der Affinitätssubstanz und dem Analyten oder dem markierten Analyten oder dem Komplex erzeugt. In die Affinitätssubstanz einbezogen sind beispielsweise: Antikörper gegen Substanzen mit Antigenität, einschließlich Haptene; Antigene gegen Antikörper; Lektine mit Affinität zu Zuckerketten, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin und dergleichen; Inhibitoren für spezielle Enzyme, wie beispielsweise α₁-Antitrypsin für Trypsin, α₂-Makroglobulin für Plasmin, α₂-Makroglobulin für Serinprotease und dergleichen; und Polynukleotid-Ketten, die komplementär zu einsträngigen Polynukleotiden sind, bei denen es sich um Analyte handelt, die in Proben gemessen werden sollen, die von Lebendkörpern kommen (die bindende Stelle für diese Substanzen ist von derjenigen für die Affinitätssubstanz verschieden, die für die Herstellung der markierten Affinitätssubstanz verwendet wird).
Analyten in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe, die mit dem Messverfahren (3) entsprechend der vorstehenden Beschreibung gemessen werden können sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie an sich mit irgendeiner Methode gemessen oder detektiert werden können und es eine Substanz gibt, die einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyten durch eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten/den Analyten erzeugen kann, die sich jedoch mindestens an einem der anderen Analyten nicht bindet. Typische Beispiele für die Analyten sind Enzyme und dergleichen, die in von Lebendkörpern kommenden Proben enthalten sind, beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen, Lymphozyten, Hämozyten und verschiedene Zellen: Speziellere Beispiele der Analyten sind Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinase (PK), Tyrosinkinase, usw.
Die Affinitätssubstanz für spezielle Analyte, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll/sollen und die zum Herstellen des kombinierten Produkts A der vorliegenden Erfindung in dem Messverfahren (3) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet werden soll ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie einen stabilen Komplex mit mindestens einem der in der Probe zu messenden Analyten durch eine hohe Affinität zwischen der Affinitätssubstanz und dem Analyten/den Analyten erzeugen kann, sich jedoch mindestens an einem der anderen Analyten nicht bindet. In die Affinitätssubstanz einbezogen sind beispielsweise Antikörper gegen spezielle Partialstrukturen oder antigene Determinanten von Substanzen mit Antigenität (einschließlich Haptene); Lektine mit Affinität zu Zuckerketten mit spezieller Struktur, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Aleuria aurantia-Lektin, Ricinus communis-Lektin, Arachis hypogaea-Lektin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.; und Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), usw.
Analyte in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe, die mit dem Messverfahren (4) entsprechend der vorstehenden Beschreibung gemessen werden können, sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) genügen. i) Es gibt eine Substanz, die sich mit allen Analyten in der Probe bindet und die selbst eine mit irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft hat oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. ii) Es gibt eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit mindestens einer der Analyten durch eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten/den Analyten erzeugen kann, die sich jedoch mit mindestens einem der anderen Analyten nicht bindet. Typische Beispiele der Analyte sind Enzyme, physiologisch wirksame Substanzen, Tumor-Antigene, Substanzen mit einer Zuckerkette, usw., die in den von den Lebendkörpern kommenden Proben enthalten sind, beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen, Lymphozyten, Hämozyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele der Analyten sind vorzugsweise Enzyme, wie beispielsweise beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen (PK), Tyrosinkinase, usw.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise Steroidhormone, humanes Choriogonadotropin (hCG), Prolaktin, thyreotropes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), usw.; und Tumor-Antigen, wie beispielsweise prostatisch spezifisches Antigen (PSA), α₂-Makroglobulin, karzinoembryonales Antigen (CEA), α-Fetoprotein, usw.
Die Affinitätssubstanz für Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen und die zur Herstellung der markierten Affinitätssubstanz A in dem Messverfahren (4) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet werden soll ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie sich mit allen Analyten in der Probe binden kann und selbst über eine mit irgendeiner Methode detektierbaren Eigenschaft verfügt oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. Spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz sind Antikörper gegen spezielle Partialstrukturen oder antigene Determinanten von Substanzen mit Antigenität, einschließend Haptene; Lektine mit Affinität zu Zuckerketten mit spezieller Struktur, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Aleuria aurantia-Lektin, Ricinus communis-Lektin, Arachis hypogaea-Lektin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.; und Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), usw.
Die Substanz, die eine Affinität zu einem/mehreren speziellen Analyten über Affinität verfügt, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll/sollen und zur Herstellung des kombinierten Produkts B der vorliegenden Erfindung in dem Messverfahren (4) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet werden soll/sollen, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) oder iii) genügt. i) Sie hemmt eine Reaktion zur Erzeugung eines Komplexes aus dem Analyten/den Analyten und der freien markierten Affinitätssubstanz A und keine Reaktion zum Detektieren einer detektierbaren Substanz (oder Affinitätssubstanz A) in dem Komplex ii) Sie verfügt über Affinität zu einemlmehreren Analyten in der Probe iii) Wenn die markierte Affinitätssubstanz A eine in ihr detektierbare Substanz eingeführt aufweist, hat die Affinitätssubstanz für einenlmehrere spezielle Analyten in der Probe Affinität zu dieser detektierbaren Substanz. Bevorzugte spezielle Beispiele der Affinitätssubstanz für einen/mehrere spezielle Analyten in der Probe sind Antikörper und Lektine (z. B. Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.) (wobei die Bindungsstelle für diese Substanzen von derjenigen der Affinitätssubstanz A verschieden ist), die über Affinität für einen/mehrere spezielle Analyten verfügen; sowie Antikörper und Lektine (z. B. Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.), die über Affinität zur Affinitätssubstanz A oder der detektierbaren Substanz verfügen.
Analyten in einer Probe, die von einem Lebendkörper kommt, die mit Hilfe des Messverfahrens (5) entsprechend der vorstehenden Beschreibung gemessen werden können sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie die folgenden Bedingungen i) und ii) oder iii) erfüllen. i) Es gibt eine Substanz, die sich mit allen Analyten in der Probe bindet und die selbst eine nach irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft hat oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. ii) Es gibt eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit einem Analyten 1 in der Probe durch eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten 1 erzeugen kann, die sich jedoch nicht mit einem Analyten 2 in der Probe bindet. iii) Es gibt eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit dem Analyten 2 durch eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten 2 erzeugen kann, die sich jedoch nicht mit dem Analyten 1 bindet. Typische Beispiele für die Analyten sind Enzyme, physiologisch wirksame Substanzen, Tumor-Antigene, Substanzen mit einer Zuckerkette, usw., die in den von Lebendkörpern kommenden Proben enthalten sind, wie beispielsweise Körperflüssigkeiten, z. B. Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen, Lymphozyten, Hämozyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele der Analyten sind vorzugsweise Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (β₂-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen (PK), Tyrosinkinase, usw.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise Steroidhormone, humanes Choriogonadotropin (hCG), Prolaktin, thyreotropes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), usw.; und Tumor-Antigen, wie beispielsweise prostatisch spezifisches Antigen (PSA), β₂-Makroglobulin, karzinoembryonales Antigen (CEA), α-Fetoprotein, usw.
Die Affinitätssubstanz für Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, die für die Herstellung der markierten Affinitätssubstanz A in dem Messverfahren (5) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet wird so lange nicht speziell beschränkt, wie sie sich mit allen Analyten in der Probe binden kann und selbst über eine mit irgendeiner Methode detektierbaren Eigenschaft verfügt oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. Spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz sind Antikörper gegen spezielle Partialstrukturen oder antigene Determinanten von Substanzen mit Antigenität (einschließlich Haptene); Lektine mit Affinität für Zuckerketten, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Aleuria aurantia-Lektin, Ricinus communis-Lektin, Arachis hypogaea-Lektin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.; und Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), usw.
Die Substanz, die Affinität zu den speziellen Analyten 1 oder 2 hat, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, die zur Herstellung des kombinierten Produkts C bzw. D der vorliegenden Erfindung in dem Messverfahren (5) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) genügt. i) Sie hemmt keine Reaktion zur Erzeugung eines Komplexes des Analyten 1 oder 2 und der freien markierten Affinitätssubstanz A und keine Reaktion zum Detektieren einer detektierbaren Substanz (oder Affinitätssubstanz A) in dem Komplex. ii) Sie hat Affinität für den speziellen Analyten 1 oder 2. Bevorzugte spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz zu dem speziellen Analyten 1 oder 2 sind folgende: Antikörper und Lektine (z. B. Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.) (wobei die bindende Stelle für diese Substanzen von derjenigen für die Affinitätssubstanz A verschieden ist), die eine Affinität für den speziellen Analyten 1 oder 2 haben; sowie Antikörper und Lektine (z. B. Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.), die eine Affinität zur Affinitätssubstanz A oder der detektierbaren Substanz haben.
Das in dem Messverfahren (6) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendete Lektin ist so lange nicht speziell beschränkt, und es kann ein Lektin mit der Fähigkeit zum Erkennen einer objektiven Zuckerkettenstruktur in geeigneter Weise aus zahlreichen Lektinen ausgewählt werden, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.
Als die Antikörper, die zum Herstellen des Polypeptid-kombinierten Antikörpers bzw. des markierten Antiglykoprotein-Antikörpers in dem Messverfahren (6) entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendet werden können, lassen sich jeder der folgenden polyklonalen Antikörper und monoklonalen Antikörper so lange verwenden, wie sie die vorstehend beschriebenen Eigenschaften haben: z. B. polyklonale Antikörper, die hergestellt werden durch Immunisieren von Tieren, wie beispielsweise Pferd, Rind, Schaf, Kaninchen, Ziege, Ratte, Maus, usw. mit einem/mehreren zu messenden Analyten entsprechend einer konventionellen Methode, wie beispielsweise die Methode, die beschrieben wurde in Tadashi Matsuhashi et al. "Men-ekigaku Jikken Nyumon" 2. Ausg., GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd., 1981, usw., sowie monoklonale Antikörper, die erzeugt werden durch Hybridomas, die durch Verschmelzen von Zellen aus einer Tumorlinie der Maus zusammen mit Maus-Rückenmarkszellen erhalten werden, die zuvor mit einem/mehreren zu messenden Analyten immunisiert worden, und zwar nach der konventionellen Methode d. h. der Methode der Zellverschmelzung, die von G. Kohler und C. Milstein (Nature, 256, 495, 1975) aufgestellt wurde. Diese polyklonalen und monoklonalen Antikörper können einzeln oder in geeigneter Kombination von 2 oder mehreren davon verwendet werden.
Als das Glykoprotein, das mit Hilfe des Messverfahrens (6) entsprechend der vorstehenden Beschreibung abgetrennt und gemessen werden kann, kann jedes beliebige Glykoprotein ohne spezielle Einschränkung so lange exemplifiziert werden, wie es den folgenden Bedingungen genügt: es ist in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe enthalten, wie beispielsweise einer Körperflüssigkeit (z. B. Serum, Blut, Plasma oder Urin), Lymphozyte, Hämozyte oder eine von verschiedenen Zellen; es kann Formen annehmen, die in einer Zuckerkettenstruktur verschieden sind, die jedoch weitgehend die gleiche Proteinstruktur haben; und es gibt ein Lektin, das die spezielle Zuckerkettenstruktur von mindestens einer der Formen des zu messenden Glykoproteins und eines Antikörpers erkennen kann, von dem der Polypeptid-kombinierte Antikörper hergestellt werden kann. Bevorzugte Beispiele des Glykoproteins sind Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen (PK), Tyrosinkinase, usw.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise humanes Choriogonadotropin (hCG), thyreotropes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), usw.; Tumor-Antigen, wie beispielsweise Prostata-spezifisches Antigen (PSA), α₂-Makroglobulin, karzinoembryonales Antigen (CEA), α-Fetoprotein, usw.; sowie glykogene Kanzer-Antigene, wie beispielsweise CA 19-9, CA125, usw.
Die Konzentration der Reagenzien, die in dem Messverfahren (6) verwendet werden, werden nachfolgend erläutert.
Zunächst wird die Konzentration des verwendeten Lektins in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Lektins, von den Eigenschaften der zu messenden Glykoprotein-Analyten usw. variiert. Bevorzugt ist das Lektin mit den Glykoprotein-Analyten in einer Konzentration normalerweise 10-fach oder mehr, bevorzugt 100-fach oder mehr und mehr bevorzugt 1.000-fach oder mehr angesetzte Nachweisgrenze der Konzentration der Glykoprotein-Analyten vorhanden.
Die Konzentration des Polypeptid-kombinierten Antikörpers, d. h. eines kombinierten Produkts der vorliegenden Erfindung, das zur Anwendung gelangt, wird in Abhängigkeit von einem Wert variiert, bei dem die Nachweisgrenze des gemessenen Glykoprotein-Analyten angesetzt ist. Die Konzentration wird vorzugsweise im Bezug auf die Differenz zwischen dem Lektin und dem Polypeptid-kombinierten Antikörper hinsichtlich der Assoziationskonstante für die Glykoprotein-Analyten bestimmt. Obgleich die Konzentration beispielsweise von der Art und den Eigenschaften der Glykoprotein-Analyten und dem Lektin und den Eigenschaften des Polypeptid-kombinierten Antikörpers abhängt, wird die Konzentration bevorzugt unter Nutzung beispielsweise der allgemeinen Formel bestimmt:
Konzentration des Polypeptid-kombinierten Antikörpers ≤ (Assoziationskonstante des Lektins)/(Assoziationskonstante des Polypeptid-kombinierten Antikörpers) × (Konzentration des Lektins)
Die Assoziationskonstante in der vorgenannten Formel bezieht sich auf eine Assoziationskonstante, die in der Gleichgewichtsreaktion erhalten wird, die durch die Formel (1) dargestellt und nachfolgend beschrieben wird und mit Hilfe der Gleichung (2) entsprechend der nachfolgenden Beschreibung berechnet wird: [A] + [B] ⇔ [A·B] (1) Assoziationskonstante = [A·B]/([A] × [B]) (2) worin sind:
[A]: die Konzentration (M) des Lecithins oder des Polypeptid-kombinierten Antikörpers im Gleichgewichtszustand,
[B]: die Konzentration (M) der zu messenden freien Glykoprotein-Analyte in einem Gleichgewichtszustand,
[A·B]: die Konzentration (M) eines Komplexes des Lecithins (oder des Polypeptid-kombinierten Antikörpers) und der Glykoprotein-Analyten.
Wenn noch spezieller beispielsweise die Assoziationskonstante des Lektins für die Glykoprotein-Analyten 1 × 10⁶ M^–1 beträgt und die Assoziationskonstante des Polypeptid-kombinierten Antikörpers für die Glykoprotein-Analyten 1 × 10⁸ M^–1 beträgt, beträgt die Konzentration des Polypeptid-kombinierten Antikörpers ein Hundertstel oder weniger und vorzugsweise ein Tausendstel oder weniger der Lektinkonzentration. Obgleich die Konzentration des verwendeten Polypeptid-kombinierten Antikörpers vorzugsweise nicht kleiner ist als die Konzentration, bei der der Polypeptid-kombinierte Antikörper die Gesamtheit der zu messenden Glykoprotein-Analyten einer Konzentration binden kann, die einer angesetzten Nachweisgrenze entspricht, kann sie kleiner sein als die vorgenannte Konzentration (beispielsweise etwa ein Zehntel).
Die Konzentration des markierten Antiglykoprotein-Antikörpers, der verwendet wird, hängt von einer Konzentration ab, bei der die Nachweisgrenze der Glykoprotein-Analyten angesetzt ist. Bevorzugt wird die Konzentration des markierten Antiglykoprotein-Antikörpers in der Reaktionslösung auf eine Konzentration eingestellt, die nicht kleiner ist als eine Konzentration, bei der der markierte Antiglykoprotein-Antikörper die Gesamtheit der Glykoprotein-Analyten in einer Konzentration binden kann, die der Nachweisgrenze entspricht, vorzugsweise 2 Mal so hoch oder höher, mehr bevorzugt 5 Mal so hoch oder höher und am meisten bevorzugt 10 Mal so hoch oder höher als die Konzentration.
Bei der Ausführung einer der vorstehend beschriebenen Messverfahren (1) bis (6) kann jede der folgenden Methoden der Aufbringung einer negativen Ladung anstelle der vorgenannten HPLC zum Abtrennen des Komplexes/der Komplexe von der freien Affinitätssubstanz einschließlich der freien markierten Affinitätssubstanz, des/der zu messenden Analyten, einschließlich des/der markierten Analyten, usw. zum Einsatz gelangen: Methoden zur elektrischen Trennung von Substanzen auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen elektrischen Ladung, die auf dem Gebiet gewöhnlich zum Einsatz gelangen, wie beispielsweise die elektrokinetische Trennung, bei der kein Träger für die Trennung verwendet wird (JP-B-7-111398, usw.), die Elektrophorese unter Verwendung eines Trägers zur Trennung, die Kapillarelektrophorese, eine Methode, die das Beschleunigen einer Nukleinsäure-Hybridisierung, Antigen-Antikörper-Reaktion oder dergleichen umfasst, indem die unterschiedliche elektrische Ladung genutzt wird, und anschließend Trennen der freien Polynukleotidkette, des freien Antikörpers oder dergleichen (Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/12808, usw.). In der Elektrophorese unter Verwendung eines Trägers zur Trennung kann unter diesen Methoden jeder beliebige Träger so lange ohne jede Einschränkung verwendet werden, wie es sich um einen üblicherweise auf dem Gebiet zur Anwendung gelangenden Träger handelt, wie beispielsweise Filter papier, Gel (z. B. Agargel, Agarosegel, Polyarylamidgel oder Stärkegel) oder eine Celluloseacetat-Membran.
Die detektierbare Substanz, die für das Markieren der Affinitätssubstanz oder des Analyten in den Messverfahren verwendet wird, wie sie vorstehend beschrieben wurden, schließt beispielsweise ein: Enyme, wie beispielsweise alkalische Phosphatasen, β-Galaktosidase, Peroxidase, Mikroperoxidase, Glucose-Oxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Acetylcholinesterase, Maleatdehydrogenase, Luciferase, usw., die beispielsweise im Enzymimmunoassay (EIA) verwendet werden; Radioisotope, wie beispielsweise ^99mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H, usw., die beispielsweise im Radioimmunoassay (RIA) verwendet werden; Substanzen, die Fluoreszens emittieren können, wie beispielsweise Fluorescein, Dansyl-Rest, Fluorescamin, Coumarin, Naphthylamin, Derivate davon, usw., die beispielsweise im Fluorimmunoassay (FIA) verwendet werden; lumineszente Substanzen, wie beispielsweise Luciferin, Isoluminol, Luminol, Bis(2,4,5-trifluorphenyl)oxalat, usw.; Substanzen die UV absorbieren können, wie beispielsweise Phenol, Naphthol, Anthracen, Derivate davon, usw.; sowie Substanzen mit Eigenschaften wie Spinmarkierungssubstanzen, die durch Verbindungen dargestellt werden, die eine Oxyl-Gruppe aufweisen, wie beispielsweise 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-Amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl, 2,6-Di-tert butyl-α-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxy, usw. Es muss nicht betont werden, dass die detektierbare Substanz auf diese Substanzen nicht beschränkt ist.
Als eine Methode zum Markieren der Affinitätssubstanz mit der vorstehend exemplifizierten detektierbaren Substanz können alle konventionellen Methoden zum Markieren exemplifiziert werden, die allgemein eingesetzt werden, wie beispielsweise in der konventionellen EIA, RIA und FIA (z. B. Yuichi Yamamura "Ikagaku Jikken Koza Bd. 8" 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971, Akira Kawano "Zusetsu Keikokotai" 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983; und Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai und Kiyoshi Miyai "Koso Men-eki Sokuteiho" 2. Ausg., IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). Das Markieren kann nach diesen Methoden zur Ausführung gelangen. Es muss nicht darauf hingewiesen werden, dass eine konventionelle Methode unter Nutzung der Reaktion von Avidin (oder Streptoavidin) mit Biotin als eine Methode zum Markieren eingesetzt werden kann.
Als die mit Hilfe irgendeiner Methode an sich messbare oder detektierbare Affinitätssubstanz, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangt, können die folgenden Substanzen exemplifiziert werden, die von sich aus über die vorgenannte Eigenschaft als detektierbare Substanz verfügen; beispielsweise sind dies Enzyme, Substanzen, die Fluoreszens emittieren können, lumineszente Substanzen, Substanzen, die UV absorbieren können, usw.
In dem Messverfahren kann die Elutionszeit des Komplexes frei durch die Wahl der Art des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kontrolliert werden (die Zahl der eingeführten Säurereste, die von Schwefelsäure abgeleitet sind, die Art der aufbauenden Aminosäure-Reste, usw.). Daher lässt sich das Trennen und Messen der zu messenden Analyten erzielen, indem der Vorteil dieser Charakteristik des Verfahrens genutzt wird.
Das bedeutet, dass die gleichzeitige Messung (Trennung und Messung) einer Vielzahl von zu messenden Analyten möglich wird, wenn 2 oder mehrer Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die in der Zahl der Säurereste, die von Schwefelsäure abgeleitet sind, verschieden sind, bzw. die Arten der Affinitätssubstanzen in geeigneter Weise gewählt werden, in die die Polypeptide eingeführt werden.
Selbst wenn eine Probe eine Vielzahl von Serumkomponenten enthält, die die Messung beeinflussen, ist es wirksam, die Ionenstärke des Komplexes größer als die der Serumkomponenten zu machen, indem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um einen Einfluss auf die Messung zu vermeiden, der von den Serumkomponenten ausgeübt wird. In diesem Fall kann die für die Analyse benötigte Zeit unter Einsatz eines schrittweisen Gradienten verringert werden.
Da darüber hinaus ein Material für die Chromatographie (z. B. ein Gelmaterial, ein Membranmaterial, ein Glasmaterial, usw.), das in einer Anionenaustauschmethode verwendet wird, im Allgemeinen über eine hohe Austauschleistung verfügt (absolute Adsorptionskapazität für ionogene Substanzen), kann die Gesamtheit des Komplexes, an dem das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung gebunden ist, auf dem Träger selbst in einer Analyse einer Probe adsorbiert werden, die eine große absolute Menge an ionogenen Substanzen gemeinsam mit den zu messenden Analyten enthält, wie beispielsweise eine Probe, die von einem Lebendkörper kommt, z. B. ein Serum. Daher kann der Komplex an einer Position eluiert werden, bei der der Einfluss der vorhandenden Substanzen zusammen mit den Analyten weitgehend vermieden werden kann. Da darüber hinaus das in dem Messverfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid eine hohe Wasserlöslichkeit besitzt, ist die Wasserlöslichkeit des Komplexes, an dem das Polypeptid gebunden ist, größer als vor dem Binden. Daher kommt es in dem Messverfahren kaum zu einer Denaturierung und Deaktivierung der zu messenden Analyten während der Erzeugung des Komplexes, der die Trennung verbessernde Substanz (das Polypeptid) darin eingeführt aufweist.
Als das Material, das in einer Anionenaustauschmethode zum Trennen einer Zielsubstanz von anderen gemeinsam damit vorhandenen Substanzen verwendet wird, indem die anionischen Eigenschaften des Polypeptids der vorliegenden Erfindung genutzt werden, kann jedes Material ohne spezielle Einschränkung so lange exemplifiziert werden, wie es über ein Anionenaustauschvermögen verfügt. Die Träger schließen beispielsweise Träger ein, die eine Anionenaustauschgruppe haben, wie beispielsweise eine Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppe, eine quaternäre Ammonium-Gruppe (z. B. eine Q-Gruppe, QAE-Gruppe, usw.) oder dergleichen. Speziellere Beispiele für das Material sind Füllstoffe für die Anionenaustauschchromatographie, wie beispielsweise DEAE-MCl-Gel (ein Warenzeichen der Mitsubishi Kasei Corp.), QAE MCl-Gel (ein Warenzeichen der Mitsubishi Kasei Corp.), Wakobeads DEAE-Gel (ein Warenzeichen der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), usw.; sowie Materialien unter Verwendung einer Membran, wie beispielsweise MemSep DEAE (ein Warenzeichen der Japan Millipore Ltd.). Es muss nicht darauf hingewiesen werden, dass für die Chromatographie; verfügbare Materialien zur Anwendung gelangen können sowie Materialien, die man selbst herstellt, indem die vorstehend exemplifizierte Anionenaustauschgruppe an der Oberfläche eines Harz- oder Glasbehälters mit Hilfe einer konventionellen Methode angebracht wird.
Das Verfahren zum Messe einer Lebendkörperkomponente unter Verwendung des kombinierten Produkts der vorliegenden Erfindung ist deshalb so hervorragend, weil es einen Anionenaustauscher einsetzt.
Beispielsweise sollte bei der Ausführung des Messverfahrens für eine Lebendkörperkomponente unter Nutzung einer Gelfiltrationsmethode eine Säule mit geeigneter Länge verwendet werden. Der Einsatz einer Gelfiltrationsmethode ist daher insofern von Nachteil, dass sie zu einer längeren Trennzeit führt, als das bei Einsatz eines Ionenaustauschers der Fall ist. Wenn es daher darauf ankommt, die Trennzeit zu verringern, wird bevorzugt eine Methode unter Anwendung eines Anionenaustauschers eingesetzt, wie beispielsweise ein HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Füllmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran und ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Darüber hinaus sind die Gelfiltrationsmethoden auch insofern von Nachteil, dass sie für das Trennen der zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe nicht geeignet sind, die über eine sehr hohe relative Molekülmasse verfügen (Molekülgröße etwa 1.000 Å oder mehr).
Eine hydrophobe Trennmethode führt in einigen Fällen zu dem folgenden Problem: Wenn es sich bei den in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe zu messenden Analyten um physiologisch wirksame Substanzen handelt, die über eine Struktur höherer Ordnung verfügt, wie beispielsweise Proteine, geht die Aktivität des/der Analyten in dem Komplex aufgrund der Zerstörung der Struktur höherer Ordnung des/der Analyten durch ein organisches Lösemittel verloren, das in der Trennung zur Anwendung gelangt.
Andererseits erlaubt die Methode unter Anwendung eines Anionentauschers eine wirksamere Trennung der zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe auf der Grundlage der empfindlichen Differenz der Ionenstärke. Wenn darüber hinaus eine Methode unter Anwendung eines Anionentauschers zum Einsatz gelangt, kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung aus Polypeptiden verschiedener Ionenstärke gewählt werden, so dass die zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe bei einem optimalen pH-Wert abgetrennt werden können. Da darüber hinaus das Polypeptid der vorliegenden Erfindung von sich aus über eine höhere Wasserlöslichkeit verfügt, besteht kaum eine Gefahr, dass die Einführung des Polypeptids in die zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe die Analyten ausfällen kann. Die Trennung kann daher in stabiler Weise ausgeführt werden.
Wenn die zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Messverfahrens gemessen werden, kann ein objektiver Peak, der auf den/die Analyten zurückzuführen ist, zu einer Position verschoben werden, bei der es keinen Einfluss von Komponenten des Serums, Harnstoffes, usw. gibt. Darüber hinaus lässt sich auch der folgende Effekt erhalten: da die Elutionspositionen von Komplexen, die verschiedene zu messende Analyten enthalten, gleich gemacht werden, indem das kombinierte Produkt der vorliegenden Erfindung, das über geeignete Eigenschaften verfügt, in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Analyten gewählt wird, die verschiedenen Analyten gemessen werden können, indem die Methode unter Anwendung eines Ionentauschers (z. B. HPLC) unter den gleichen Analysebedingungen zur Anwendung gelangt.
In dem hierin beschriebenen Messverfahren wird die Menge der detektierbaren Substanz, der Affinitätssubstanz, der Affinitätssubstanz A oder des/der Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen und in dem Komplex oder in dem markierten Komplex enthalten sind, der mit Hilfe der Methode unter Anwendung eines Anionentauschers abgetrennt werden, mit Hilfe einer vorbestimmten Methode auf der Grundlage der Eigenschaft bestimmt, die mit Hilfe irgendeiner Methode der detektierbaren Substanz detektierbar ist (die Affinitätssubstanz, die Affinitätssubstanz A oder der Analyt/die Analyten). Wenn die Eigenschaft beispielsweise eine Enzymaktivität ist, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode der EIA ausgeführt, z. B. nach der Methode, die beschrieben wird in Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Meneki Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 51–63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987, usw. Wenn es sich bei der detektierbaren Substanz um ein Radioisotop handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode der RIA ausgeführt, indem in geeigneter Weise ein Messinstrument gewählt und verwendet wird, wie beispielsweise ein GM-Zähler, ein Flüssigszintillationszähler; Zähler mit Probenkanal, Zähler für HPLC, oder dergleichen, was von der Art und Intensität der Strahlung abhängt, die von dem Radioisotop emittiert wird (siehe hierzu beispielsweise Yuichi Yamamura, "Ikagaku Jikken Koza Bd. 8" 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971). Wenn es sich bei der Eigenschaft um Fluoreszens-emittierende Eigenschaften handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode der FIA unter Verwendung eines Messinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem Fluorometer, z. B. nach der Methode, die in Akira Kawano "Zusetsu Keiko-kotai", 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983, usw. beschrieben wurde. Wenn es sich bei der Eigenschaft um Lumineszens-emittierende Eigenschaften handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode unter Verwendung eines Messinstruments ausgeführt, wie beispielsweise ein Photonzähler, z. B. nach der Methode, die beschrieben wurde in Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 252–263, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987, usw. Wenn es sich bei der Eigenschaft um die Absorption von UV handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode unter Verwendung eines Messinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem Spektrophotometer. Wenn die detektierbare Substanz eine Substanz ist, die über Eigenschaften von Spinmarkern verfügt, wo die Bestimmung nach einer konventionellen Methode unter Anwendung. eines Elektronenspinresonanz-Apparates ausgeführt wird, z. B. nach der Methode, die beschrieben wurde in Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho" eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 264–271, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987, usw.
In dem hierin beschriebenen Messverfahren sind die Reaktionsbedingungen für das Erzeugen eines Komplexes durch Umsetzen eines/mehrerer Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, mit dem kombinierten Produkt (einschließlich den kombinierten Produkten A, B, C und D, usw.) der vorliegenden Erfindung und wahlweise der markierten oder nicht markierten Affinitätssubstanz (einschließlich die Affinitäts substanz A), oder die Reaktionsbedingungen für das Erzeugen eines markierten Komplexes durch Umsetzen eines/mehrerer Analyten, die in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden sollen, mit markiertem Analyten und dem kombinierten Produkt der vorliegenden Erfindung so lange nicht speziell beschränkt, wie sie die Erzeugung des Komplexes nicht hemmen (oder des markieren Komplexes). Die Reaktion kann unter Reaktionsbedingungen ausgeführt werden, wie sei bei der Erzeugung eines Komplexes oder dergleichen in einer konventionellen Methode zum Einsatz gelangen, wie beispielsweise EIA, RIA, FIA oder Affinitätschromatographie. Wenn beispielsweise in der Reaktion eine Pufferlösung verwendet wird, lassen sich als Puffer und andere Reagenzien solche in geeigneter Weise wählen, wie sie in den vorgenannten konventionellen Methoden zur Anwendung gelangen. Obgleich der pH-Wert bei der Reaktion so lange nicht speziell beschränkt ist, wie er die Erzeugung des Komplexes nicht hemmt (oder des markierten Komplexes), beträgt er in der Regel 2 bis 10 und bevorzugt 5 bis 9. Obgleich die Temperatur bei der Reaktion ebenfalls so lange nicht speziell beschränkt ist, wie sie die Erzeugung des Komplexes (oder des markierten Komplexes) nicht hemmt, beträgt sie in der Regel 0° bis 50°C und bevorzugt 20° bis 40°C. Was die Reaktionsdauer betrifft, lässt sich die Reaktion in geeigneter Weise über mehrere Sekunden bis zu mehreren Stunden in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Komponenten ausführen, da die für die Erzeugung des Komplexes (oder des markierten Komplexes) erforderliche Zeit von dem Reaktionsvermögen des/der Analyten mit dem kombinierten Produkt der vorliegenden Erfindung und der markierten Affinitätssubstanz oder dergleichen oder von dem kombinierten Produkt der vorliegenden Erfindung und dem markierten Analyten abhängt.
Hinsichtlich der bei der Ausführung des Verfahrens unter Anwendung eines Ionenaustauschers im Messverfahren entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendeten HPLC kann jeder Apparat ohne irgendein spezielles Problem so lange verwendet werden, wie er in der Regel auf dem Gebiet der Analyse zur Anwendung gelangt und eine konstante Durchflussrate hat. In dem Messverfahren, wie es hierin unter Anwendung der HPLC beschrieben ist, wird die Peakfläche oder Peakhöhe zur Ermittlung der Menge des/der Analyten verwendet.
Ein Lösemittel (Eluierungsmittel), das zum Abtrennen des Komplexes (oder des markierten Komplexes) von der freien Affinitätssubstanz, usw. mit Hilfe des Verfahrens unter Anwendung eines Anionenaustauschers und spezieller der HPLC verwendet wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie es weder den erzeugten Komplex (oder den erzeugten markierten Komplex) und dergleichen zu dem/den Analyten, der markierten Affinitätssubstanz, usw. zerlegt, noch der Affinitätssubstanz, der detektierbaren Substanz oder dergleichen mit irgendeiner anderen Methode die detektierbare Eigenschaft wegnimmt, die in dem Komplex (oder dem markierten Komplex) enthalten ist. In der Regel wird als das Lösemittel vorzugsweise jede beliebige Pufferlösung verwendet, die in konventionellen Methoden zur Anwendung gelangt, wie beispielsweise EIA, RIA, FIA, Affinitätschromatographie, usw. Bevorzugte spezielle Beispiele des Lösemittels sind Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 2 bis 10, die durch geeignete Auswahl der nachfolgend beschriebenen Materialien in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Komplexes (oder des markierten Komplexes) der freien markierten Affinitätssubstanz und dergleichen gefolgt von einem Zusatz und Mischen angesetzt werden: z. B. Puffer, wie beispielsweise Phosphate, Acetate, Citrate, Good'd-Puffer, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, usw.; Salz, wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, usw.; polare organische Lösemittel, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran, usw.; sowie Tenside.
Durch den richtigen Zusatz eines geeigneten Tensids zu dem Eluierungsmittel wird die Vermeidung der Schweifbildung eines Peaks aufgrund des Komplexes (oder des markierten Komplexes) und der freieren Einstellung der Elutionspositionen des Komplexes (oder des markierten Komplexes), der freien markierten Affinitätssubstanz und dergleichen möglich. Das für diese Zwecke verwendbare Tensid ist hinsichtlich der Art nicht speziell beschränkt und lässt sich in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Komplexes (oder des markierten Komplexes), der freien markierten Affinitätssubstanz und dergleichen auswählen. Bevorzugte Beispiele für das Tensid sind Kationtenside, wie beispielsweise n-Dodecyltrimethylammoniumbromid, 1-Laurylpyrimidiumchlorid, usw.; und Amphotenside, wie beispielsweise Laurylbetain, Lauramidpropylbetain, Kokosnussöl-Fettsäureamid-Propylbetain, 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolium-Betain2-Undecyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolium-Betain, N-Lauroyl-N-methyl-β-alanin-Natrium, usw. Wenn das Tensid dem Eluierungsmittel für die vorgenannten Aufgaben zugesetzt wird, ist die Konzentration des zugesetzten Tensids so lange nicht speziell beschränkt, wie es die gewünschte Wirkung hervorbringt. Obgleich die Konzentration zum Teil von der Art des Tensids abhängt, wird sie geeigneterweise im Bereich von normalerweise 0,01% bis 2% und bevorzugt 0,05% bis 1% gewählt.
In dem Messverfahren, das hierin beschrieben wird, wird als Messverfahren nach der Trennung durch HPLC vorzugsweise die Methode eingesetzt, die das Einführen eines Abganges von einer HPLC-Säule in eine Detektionssektion in unveränderter Form einführt und direkt die Menge der detektierbaren Substanz (oder der Affinitätssubstanz oder des/der Analyten, die gemessen werden sollen) misst, die in dem Komplex (oder dem markierten Komplex) in dem Abgang enthalten sind, wobei die Methode beispielsweise beschrieben wurde in Shoji Hara und Akio Tsuji "Newest Liquid Chromatography", 1. Ausg., S. 92–104, NANZANDO Ltd., veröffentlicht am 1. Februar 1978. Der Grund dafür besteht darin, dass diese Methode eine rasche Messung erlaubt. Wenn in diesem Fall die mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft der Affinitätssubstanz (oder des/der Analyten) oder die der detektierbaren Substanz in der markierten Affinitätssubstanz oder dergleichen (oder dem/den markierten Analyten) beispielsweise die Enzymaktivität ist, sollte selbstverständlich eine Reaktionssektion der sogenannten säulennachgeschalteten Methode, in der ein Reagens zum Messen der Enzymaktivität dem Abgang zur Reaktion mit ihm zugesetzt wird, zwischen der Säule der HPLC und der Detektionssektion vorgesehen werden. Als das Reagens zum Messen der Enzymaktivität, das in der Reaktionsektion verwendet wird, wenn die Eigenschaft der detektierbaren Substanz (oder der Affinitätssubstanz oder des/den Analyten) die Enzymaktivität ist, kann ein Reagens verwendet werden, das mit Hilfe einer konventionellen Methode hergestellt wird, beispielsweise einer Methode auf der Grundlage des Inhaltes von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 51–63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987, usw. Alternativ kann ein Reagens eines kommerziell verfügbaren Gerätesatzes für die klinische Untersuchung in geeigneter Weise gewählt und verwendet werden. Auch wenn die Eigenschaft der detektierbaren Substanz, der Affinitätssubstanz oder des/der Analyten eine andere als die Enzymaktivität ist, kann zwischen der HPLC-Säule und der Detektionssektion eine geeignete Reaktionssektion vorgesehen werden, um ein vorbestimmtes Reagens zum Zwecke der Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektion zuzusetzen und reagieren zu lassen.
Wenn eine Mehrzahl von Eluierungsmitteln, die sich von den Komponenten unterscheiden, in dem Messverfahren entsprechend der vorstehenden Beschreibung verwendeten HPLC verwendet werden, kann die Eluierung entweder nach einer Methode des Konzentrationsgradienten (eine lineare Gradientenmethode) oder mit einer schrittweisen Methode ausgeführt werden. Bevorzugt ist jedoch die schrittweise Methode, da sie insofern vorteilhaft ist, dass sie beispielsweise durch leichte Operationen ausgeführt werden kann, die tatsächliche Analysendauer verkürzt und einen scharfen objektiven Peak liefert.
Das Reagens zum Messen des Analyten nach der vorliegenden Erfindung weist als die entscheidende Komponente ein kombiniertes Produkt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung auf und eine Substanz mit einer Affinität zu dem Analyten oder einem kombinierten Produkt der Maleinimid-Verbindung und eine Substanz, die eine SH-Gruppe aufweist und eine Affinität zu dem Analyten hat. Erforderlichenfalls kann das Reagens in geeigneter Weise beispielsweise einen markierten Analyten, eine markierte Affinitätssubstanz, einen Puffer, ein Tensid, usw. zusätzlich zu dem kombinierten Produkt enthalten. Die bevorzugten Eigenschaften, spezielle Beispiele und dergleichen dieser Komponenten wurden vorstehend beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird konkreter nachfolgend unter Bezugnahme auf die "Beispiele" beschrieben, die in keiner Weise einschränkend sind und lediglich der Veranschaulichung dienen. Die in den "Beispielen" verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: Ala: Alanin; β-Ala: β-Alanin; Ser: Serin; Tyr: Tyrosin; Asp: Asparaginsäure; Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe; Alko: p-Alkoxybenzylalkohol; tBu: tert-Butyl-Gruppe; TFA: Trifluoressigsäure; BOP: Benzothiazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat; HOBt: 1-Hydroxy-1H-benzotriazol; DMF: N,N-Dimethylformamid, DIEA: N,N-Diisopropylethylamin.
Beispiel 1 (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche)
Synthese von Ala-(Ser(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 3)
(1) Synthese von Fmoc-Ala-(Ser)₅-β-Ala
Unter Verwendung von 2,3 g (1,5 mMol in Form von β-Ala) Fmoc-βAla-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.) als Ausgangsmaterial wurde Fmoc-Ala-(Ser)₅-β-Ala synthetisch mit Hilfe einer Festphasenmethode nach der Methode (BOP/HOBt-Methode) hergestellt, die in der Fundstelle (J. Org. Chem., 53, 617–624 (1988)) beschrieben wurde.
Im Einzelnen wurde Fmoc-β-Ala-Alko-Harz zuerst mit Piperidin behandelt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Zu dem auf diese Weise behandelten Harz wurde eine DMF-Lösung zugesetzt, die eine vorbestimmte Aminosäure in einer Menge von 3 val pro val β-Ala auf dem Harz enthielt, sowie BOP, HOBt und DIEA in Mengen von 3 val, 3 val bzw. 5,3 val pro val β-Ala auf dem Harz. Die vorbestimmte Aminosäure wurde durch Kupplungsreaktion (2-fach) bei Raumtemperatur für 2 Stunden eingeführt. Die Aminosäuren wurden eine nach der anderen durch Wiederholung der vorgenannten Prozedur eingeführt. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Ser(tBu) (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries. Ltd.), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ala (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries. Ltd.).
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit McOH gewaschen, gefolgt von einer Zugabe von 20 ml eines TFA-Anisols (95 : 5) als gemischte Lösung und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt, um das gewünschte Polypeptid von dem Harz abzulösen und die tBu-Gruppen (Schutzgruppen für die Hydroxyl-Gruppe des Ser) zu entfernen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde zum Ausfällen der gewünschten Verbindung Ether zugesetzt. Der Niederschlag wurde aufge- nommen und anschließend in einem Exsikkator getrocknet, um 0,84 g Fmoc-Ala-( Ser)₅-β-Ala zu erhalten.
(2) Synthese von Ala-(Ser(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 3)
Es wurden in 40 ml DMF 547 mg (0,67 mMol) des unter (1) synthetisch dargestellten Fmoc-Ala-(Ser)₅-β-Ala aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 30 ml einer DMF·SO₃-Lösung (eine Lösung von 2,57 g DMF·SO₃ (hergestellt von Fluka Chemia-Biochemica) in 30 ml eines DMF-Pyridins als gemischte Lösung (4 : 1)) zugesetzt und die Reaktion über Nacht bei 4°C ausgeführt. Zu der Reaktionslösung wurden 30 ml einer DMF·SO₃-Lösung zugegeben und die resultierende Lösung über Nacht bei 4°C umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung zu 400 ml Aceton gegeben und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen und in 40 ml DMF aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden 8 ml Piperidin zugesetzt und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 40 min ausgeführt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Die Reaktionslösung wurde zu 500 ml Aceton gegeben und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen, mit Aceton und Ether gewaschen und anschließend in einem Exsikkator getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen und anschließend einer Gelfiltration, um 210 mg Ala-(Ser(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 3) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionen-Chromatographie dieser angestrebten Verbindung.
Die Aminosäure-Analyse wurde mit Hilfe des Wako PTC-Aminosäure-Analysesystems ausgeführt (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries. Ltd.) (was auch nachfolgend gilt).
Beispiel 2 (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche)
Synthese von Ala-Tyr(SO₃H))₃-β-Ala (Polypeptid 11)
Unter Verwendung von 0,77 g (0,5 mMol) Fmoc-β-Ala-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden die vorbestimmten Aminosäuren mit den gleichen Reagenzien und nach der gleichen Prozedur eingeführt, wie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurde. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(SO₃Na) (hergestellt von der Bachem Feinchemikalien AG), Fmoc-Tyr(SO₃Na), Fmoc-Tyr(SO₃Na), Fmoc-Ala.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit McOH gewaschen, gefolgt von einer Zugabe von 50 ml DMF-Piperidin (4 : 1) als gemischte Lösung und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Das Lösemittel wurde durch Filtration entfernt, wonach das Harz mit McOH gewaschen wurde und eine Mischung von TFA, H₂O und m-Kresol (45 : 5 : 2) zugesetzt wurde. Danach wurde die Reaktion unter einem Stickstoff-Gasstrom bei 4°C für 16 Stunden ausgeführt, um das angestrebte Polypeptid von dem Harz abzulösen. Das Harz wurde aus der Reaktionslösung durch Filtration entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt, wonach die angestrebte Verbindung mit Ether ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde einer Anionenaustauschchromatographie unterworfen und danach einer Gelfiltration, um 180 mg Ala-Tyr(SO₃H)₃-β-Ala (Polypeptid 11) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionen-Chromatographie dieser angestrebten Verbindung.
Beispiel 3
Synthese von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 14)
(1) Synthese von Fmoc-Ala-(Tyr)₅-β-Ala
Unter Verwendung von 2,3 g (1,5 mMol) Fmoc-β-Ala-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden die vorbestimmten Aminosäuren mit den gleichen Reagenzien und mit Hilfe der gleichen Prozedur eingeführt, wie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurde. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(tBu) (hergestellt von der Watanabe Chemical Industries, Ltd.), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ala.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit McOH gewaschen, gefolgt von einer Zugabe einer gemischten Lösung von TFA, Thioanisol und 1,2-Ethandiol (95 : 5 : 1), wonach die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt wurde, um das Polypeptid von dem Harz abzulösen und die tBu-Gruppen (Schutzgruppen für die Hydroxyl-Gruppen von Tyr) zu entfernen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Ether zugesetzt, um die angestrebte Verbindung auszufällen. Der Niederschlag wurde aufgenommen und anschließend in einem Exsikkator getrocknet, um 1,71 g Fmoc-Ala-(Tyr)₅-β-Ala zu erhalten.
(2) Synthese von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 14)
Zu einer Mischung von 0,5 g Fmoc-Ala-(Tyr)₅-β-Ala, die in (1) erhalten wurde, und 3 ml DMF wurden 15 ml einer DMF·SO₃-Lösung zugesetzt (eine Lösung von 3,2 g DMF·SO₃ in 15 ml einer gemischten Lösung von DMF-Pyridin (4 : 1)) und die Reaktion über Nacht bei 4°C ausgeführt, wonach Ether der Reaktionslösung zugesetzt wurde, um das Reaktionsprodukt auszufällen. Der Niederschlag wurde in 10 ml DMF aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 2,5 ml Piperidin, und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt. Zu der Reaktionslösung wurden 150 ml Ether zugesetzt und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen. Der Niederschlag wurde in 4 ml Wasser aufgelöst und die angestrebte Verbindung mit Hilfe der ODS-Säulen-Flüssigchromatographie isoliert (Säule: Wakosil ₁₀C₁₈ (2,0 × 25 cm) (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); Elutionsbedingungen: 10 mM AcONa (pH 6,0), 2 → 60% Acetonitril). Die auf diese Weise erhaltene Fraktion enthielt die angestrebte Verbindung und wurde mit Hilfe der Gelfiltration behandelt, um 203 mg Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 1–4) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionen-Chromatographie dieser angestrebten Verbindung.
Beispiel 4
Synthese von sulfatierten Polypeptiden (Polypeptide 1, 2, 4 bis 9, 18 und 20 bis 22
Die Polypeptide 1, 2, 4 bis 9, 18 und 20 bis 22, die in Tabelle 1 zusammengestellt sind, wurden mit den gleichen Reagenzien und der gleichen Prozedur synthetisch dargestellt, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden. Das in Tabelle 1 angegebene Polypeptid 10 wurde mit den gleichen Reagenzien und nach der gleichen Prozedur synthetisch dargestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben wurde.
Als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung des Polypeptids 6 wurde Fmoc-Ser(tBu)-O-Polymer (hergestellt von Kokusan Chemical Works, Ltd.) verwendet und Fmoc-Tyr(tBu)-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.) als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung der Polypeptide 21 und 22 verwendet.
Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionen-Chromatographie der auf diese Weise erhaltenen verschiedenen Polypeptide.
Beispiel 5
Synthese von sulfatierten Polypeptiden (Polypeptide 12, 13, 15 bis 17 und 19)
Die Polypeptide 12, 13, 15 bis 17 und 19, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, wurden synthetisch nach der mit den gleichen Reagenzien und mit Hilfe der gleichen Prozedur dargestellt, wie sie in Beispiel 3 beschrieben wurden. Fmoc-β-Ala-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von der Watanabe Chemical Industries, Ltd.) wurde als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung der Polypeptide 12 und 16 verwendet und Fmoc-Tyr(tBu)-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von der Watanabe Chemical Industries, Ltd.) wurde als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung der Polypeptide 13, 15, 17 und 19 verwendet.
Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionen-Chromatographie der angestrebten Verbindungen.
Beispiel 6 (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche)
Synthese von Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-β-Ala (Polypeptid 23)
Unter Verwendung von 780 ml (0,5 mMol) Fmoc-β-Ala-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden die vorbestimmten Aminosäuren mit den gleichen Reagenzien und mit Hilfe der gleichen Prozedur eingeführt, wie sie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurden. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(PO₃H₂) (hergestellt von der Novabiochem Corp.), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc- Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Ala.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit McOH gewaschen, gefolgt von einer Zugabe von 50 ml einer gemischten Lösung von DMF-Piperidin (4 : 1) und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz durch Filtration aufgenommen und mit McOH gewaschen und anschließend 20 ml einer gemischten Lösung von TFA, Phenol, H₂O, Thioanisol und Ethandiol (33 : 2 : 2 : 2 : 1) zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde einer Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter worfen, um das Polypeptid von dem Harz abzulösen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz abfiltriert und dem Filtrat Ether zugesetzt, um die angestrebte Verbindung auszufällen. Der so erhaltene Niederschlag wurde einer Anionenaustauschchromatographie und anschließend einer Gelfiltration unterworfen, um 760 mg Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-β-Ala (Polypeptid 23) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse unter Ionenchromatographie der angestrebten Verbindung.
Beispiel 7 (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche)
Synthese von 4-Maleinimidobutyryl-Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-β-Ala (Polypeptid
Unter Verwendung von 780 mg (0,5 mMol) Fmoc-β-Ala-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden die vorbestimmten Aminosäuren mit den gleichen Reagenzien und mit Hilfe der gleichen Prozedur eingeführt, wie sie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurden. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc- Tyr(PO₃H₂) (hergestellt von der Novabiochem Corp.), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc- Tyr(PO₃H₂), Fmoc- Tyr(PO₃H₂), Fmoc- Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Ala, Maleinimidobutansäure.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit McOH gewaschen und mit einer gemischten Lösung von TFA-Anisol (95 : 5) behandelt, um das Polypeptid von dem Harz abzulösen. Das Harz wurde abfiltriert und dem Filtrat Ether zugesetzt, um einen Niederschlag zu erzeugen. Der Niederschlag wurde einer ODS-Säulenflüssigchromatographie unterworfen (Säule: Wakosil ₅C₁₈ (2,0 × 25 cm) (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); Elutionsbedingungen: 0,1% TFA, 0 → 10% Acetonitril) und einer Gelfiltration unterworfen, um 820 mg 4-Maleinimidobutyryl-Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-β-Ala (Polypeptid 24) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der angestrebten Verbindung.
Beispiel 8
Untersuchung der Elutionspositionen von anionischen Polypeptiden im Fall einer Ionenaustauschsäule
[Proben]
Es wurden wässrige Lösungen mit einem Gehalt von 5 mg/ml der Polypeptide 1 bis 24 als Proben verwendet, die in den Beispielen 1 bis 7 erhalten wurden.
Es wurden außerdem als Proben wässrige Lösungen angesetzt, die als Bezugsstandard-Verbindung 5 in mg/ml (Asp)₉-β-Ala (nachfolgend abgekürzt als "Asp 9"; selbst hergestellt nach der BOP/HOBt-Methode) enthielten, eine Poly(asparaginsäure) mit einer relativen Molekülmasse von 6.000 (nachfolgend abgekürzt als "Asp6K"; hergestellt von der Sigma Chemical Co.) oder eine Poly(asparaginsäure) mit einer relativen Molekülmasse von 50.000 (nachfolgend abgekürzt als "pAsp"; hergestellt von der Sigma Chemical Co.).

[Analysebedingungen]

Säule:	POROS-DEAE (4,6Ø × 10 mm, hergestellt von der Perseptive Biosystems)
Eluent A:	50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,6)
Eluent B:	50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,6, mit einem Gehalt von 5 M NaCl)
Durchflussgeschwindigkeit:	1 ml/min
Detektion:	für die Polypeptide, die ein oder mehrere sulfatierte Serin-Reste enthielten: UV 220 nm, für die Polypeptide, die ein oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste enthielten: UV 260 nm, für die Polypeptide, die phosphatierte Tyrosin-Reste enthielten: UV 260 nm.
Gradientenbedingung:	0 → 5 min A = 100% 5 › 30 min B = 0 › 100% 30 → 35 min C = 100%

[Messverfahren]
Es wurden 20 μl jeder Probe mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen analysiert.
[Ergebnisse]
1 zeigt die für die Elution der einzelnen Polypeptide erforderlichen Salzkonzentrationen (nachfolgend abgekürzt als "eluierende Salzkonzentration"). In 1 zeigt der ausgefüllte Kreis eine Salzkonzentration an der Spitze des Elutionspeaks, die ausgezogene Linie zeigt einen Bereich der Salzkonzentration zwischen dem Start und dem Ende der Elution, d. h. eine Peakbreite. Die Nummern und Einteilungen auf der Abszisse zeigt die Art der Polypeptide (Polypeptid-Nummern und Abkürzungen in Tabelle 1).
Aus den in 1 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen:

(i) Erhöhung der Zahl der Säurereste (Sulfonsäure-Gruppen oder Phosphonsäure-Gruppen), die zu einer erhöhten eluierenden Salzkonzentration führt.
(ii) Polypeptid 3 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 5) und Polypeptid 11 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 3) sind gleich Asp 9 hinsichtlich der eluierenden Salzkonzentration. Polypeptid 6 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 10), Polypeptid 8 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 9), Polypeptid 9 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 10), Polypeptide 12 und 13 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 4) und Polypeptide 14 und 15 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 5) sind hinsichtlich der eluierenden Salzkonzentration gleich Asp6K und pAsp. Mit anderen Worten bringen die Polypeptide einschließlich derjenigen der vorliegenden Erfindung eine gleiche Wirkung zustande wie die der konventionellen Polypeptide, die Carbonsäure-Reste aufweisen (sie sind den konventionellen Polypeptiden hinsichtlich der Stärke des Haltens durch eine Anionenaustauschsäule gleich), und selbst dann, wenn sie eine kürzere Kettenlänge haben (eine kleinere Zahl von Aminosäure-Resten), als das bei den konventionellen Polypeptiden der Fall ist.
(iii) Die Stärke des Haltens durch eine Anionenaustauschsäule hängt von der Art der Säurereste ab, die von einer starken Säure deriviert sind, von der Art der Aminosäure-Reste, in die die Säurereste eingeführt worden sind, von den Eigenschaften einer Packung einer Säule, usw: Beispielsweise zeigt der Vergleich zwischen den Ergebnissen für Polypeptide 2 bis 9, die sulfatierte Serin-Reste enthalten, und den Ergebnissen für Polypeptide 10 bis 20, die einen oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste enthalten, dass, wenn die Zahl der Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, in den ersteren und letzteren Polypeptiden gleich ist, die Polypeptide, die einen oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste enthalten, eine höhere eluierende Salzkonzentration haben. Der Grund dafür wird wie folgt vermutet: da ein Ausgangsmaterial für die Packung, die in dem vorliegenden Beispiel verwendet wird, in gewissem Maße hydrophob ist, werden die Polypeptide, die Tyrosin-Reste mit einem Benzolring enthalten, leichter von der Säule gehalten, so dass ihre scheinbare eluierende Salzkonzentration höher ist. Ein Vergleich zwischen den Ergebnissen für Polypeptide 3 und 14, die 5 Schwefelsäure-Reste enthalten, und den Ergebnissen für Polypeptide 23 und 24, die 5 Phosphorsäure-Reste enthalten, zeigt, dass die Polypeptide, die Schwefelsäure-Reste enthalten, eine höhere eluierende Salzkonzentration haben. Aus den vorgenannten Ergebnissen kann entnommen werden, dass ein Polypeptid, das eine beliebige eluierende Salzkonzentration hat, durch geeignete Wahl der Art und der Zahl der Säurereste gewählt werden kann, die eingeführt werden soll, durch die Art der aufbauenden Aminosäure-Reste, durch die Art der Packung für die Säule, usw.
(iv) Selbst wenn die Art und die Zahl der Aminosäure-Reste, in die Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, eingeführt worden sind, gleich sind und die Art und Zahl der Säurereste gleich ist, hängt die Stärke des Haltens derartiger Polypeptide durch eine Ionenaustauschsäule von dem Vorhandensein anderer Aminosäure-Reste in den Polypeptiden ab. Beispielsweise kann aus den Ergebnissen für die Polypeptide 12 bis 19, die sulfatierte Tyrosin-Reste enthalten, entnommen werden, dass die eluierende Salzkonzentration von dem Vorhandensein eines β-Alanin-Restes (die Einführung eines β-Alanin-Restes senkt die eluierende Salzkonzentration) selbst dann abhängt, wenn die Zahl der sulfatierten Tyrosin-Reste gleich ist. Daraus kann entnommen werden, dass ein Polypeptid, das eine beliebige eluierende Salzkonzentration enthält, durch Einführen eines geeigneten Aminosäure-Restes zusätzlich zu den Aminosäure-Resten hergestellt werden kann, die den Säurerest darin eingeführt aufweisen.
(v) Aus den Ergebnissen für pAsp-1 und pAsp-2 (pAsp's in unterschiedlichen Produktionschargen) als Vergleichsbeispiele lässt sich folgendes entnehmen: in Abhängigkeit von der Herstellungscharge variieren die konventionellen Polypeptide mit Carbonsäure-Resten hinsichtlich der eluierenden Salzkonzentration, mit anderen Worten, die Schweifbildung eines objektiven Peaks variiert, somit es ist schwierig, ein Polypeptid zu erhalten, das eine gleichförmige Molmasse hat. Im Gegensatz dazu tritt ein derartiges Problem in pAsp bei dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht auf, da es mühelos als ein Polypeptid mit einer gleichförmigen Molmasse mit Hilfe der Peptidsynthese erhalten werden kann.

Beispiel 9
Herstellung eines Antikörper-sulfatierten Polytyrosin-kombinierten Produktes
(1) Herstellung von 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala
Es wurden in 500 μl von 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) 1 mg des in Beispiel 4 hergestellten Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 1,2 mg Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat (hergestellt von der Pierce Chemical Co.) und die Reaktion für 3 Stunden bei 37°C ausgeführt. Die Reaktionslösung wurde mit einer Superdex-Peptidsäule (16 mm ID × 30 cm, hergestellt von der Pharmacia AB) behandelt, um die überschüssigen Reaktionsmittel zu entfernen, wodurch eine wässrige Lösung von 0,84 mg 4-(p- Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala erhalten wurde (Ausbeute: 75%).
(2) Herstellung von Fab'-Fragment
Mit Hilfe einer konventionellen Methode wurden 10 mg Anti-AFP-monoklonaler Antikörper A4-4 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-A4-4"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) eingeführt in F(ab')₂-Fragment (5 mg, Ausbeute 80%). Danach wurde das F(ab')₂-Fragment eingeführt in Fab'-Fragment (nachfolgend abgekürzt als "AFP-A4-4·Fab') (3,1 mg, Ausbeute 62%) mit Hilfe einer konventionellen Methode.
(3) Herstellung eines kombinierten Produkts von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala und AFP-A4-4·Fab'
In einen 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) wurden 3,1 mg des 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala, erhalten vorstehend unter (1), und 3,1 mg des AFP-A4-4·Fab', erhalten vorstehend in (2), für 16 Stunden bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde in eine Superdex 200 pg-Säule (26 mm ID × 60 cm, hergestellt von der Pharmacia AB) beladen, um das überschüssige 4-(p- Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala zu entfernen. Danach wurde der Rückstand mit einer DEAE TOYOPEARL-Säule (10 mm ID × 2 cm, hergestellt von der Tosoh Ltd.) behandelt und die adsorbierte Fraktion gewonnen, um 1 mg eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala und AFP-A4-4·Fab' (Ausbeute: 15%) zu erhalten.
Beispiel 10
Herstellung eines Antikörper-sulfatierten Polytyrosin-kombinierten Produkts
(1) Herstellung von 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈
In 3 ml DMF wurden 25 mg Ala-(Tyr(SO₃H))₈ (Polypeptid 19), hergestellt in Beispiel 4, aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 10 mg Sulfosuccinimidyl-4-(p- maleinimidophenyl)butyrat (hergestellt von der Pierce Chemical Co.) und die Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer ODS-Säule behandelt (Säule: Wakosil ₅C₁₈ (2,0 ø × 25 cm) (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); Elutionsbedingungen: 50 mM Ammoniumacetat, pH 6,2 → 60% Acetonitril). Die so behandelte Fraktion enthielt die angestrebte Verbindung und wurde bis zur Trockene eingeengt, um 26,5 mg 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ (Ausbeute: 95%) zu erhalten.
Nachfolgend sind die NMR-Daten des erhaltenen 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ angegeben:
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δppm: 7,16 (s, 2H, Maleimid-Proton).
Ein Vergleich mit den in Beispiel 9 (1) erhaltenen Ergebnissen zeigt, dass nach der vorstehend beschriebenen Methode ein Polypeptid mit einer in den N-Terminus eingeführten Maleinimid-Gruppe mit höherer Ausbeute erhalten werden kann.
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass bei Lagerung bei 15°C oder niedriger, das nach der vorstehend beschriebenene Methode erhaltene 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ stabil ohne Abbau gelagert werden kann. Damit erwies sich diese Verbindung als leichter verwendbar als die Verbindung, die mit der in Beispiel 9 (1) beschriebenen Methode erhalten wurde, die in Form einer wässrigen Lösung vorlag und in etwa 24 Stunden fast vollständig abgebaut war.
(2) Herstellung von Fab'-Fragment
Mit Hilfe einer konventionellen Methode wurden 30 mg anti-AFP- monoklonaler Antikörper A4-4 (nachfolgend abgekürzt als „AFP-A4-4"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in F(ab')₂-Fragment eingeführt (16 mg, Ausbeute 80%). Sodann wurde das F(ab')₂-Fragment in Fab'-Fragment (nachfolgend abgekürzt als „AFP-A4-4·Fab'") mit Hilfe einer konventionellen Methode eingeführt (11,1 mg, Ausbeute 70%).
(3) Herstellung eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab'
In 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) wurden 1 mg der vorstehend unter (1) erhaltenen 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und 11,1 mg der vorstehend unter (2) erhaltenen AFP-A4-4·Fab' für 16 Stunden bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde unter Anwendung einer POROS DEAE-Säule (6 mm ID × 1 cm, hergestellt von der Perseptive Biosystems) fraktioniert, um 6 mg eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab' (Ausbeute: 60%) zu erhalten.
Aus einem Vergleich zwischen diesem Ergebnis mit dem in Beispiel 9 (3) erhaltenen Ergebnis ist ersichtlich, dass durch Verwendung des Polypeptids, das eine Maleinimid-Gruppe in dem N-Terminus eingeführt aufweist, die in Beispiel 10 (1) erhalten wird, ein kombiniertes Produkt des Polypeptid der vorliegenden Erfindung und Fab' wirksam erhalten werden kann.
Obgleich nicht offensichtlich, wird der Grund dafür wie folgt vermutet: in Beispiel 9 (1) wurde unter Verwendung der Superdex-Peptid-Säule freies Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat entfernt, während in Beispiel 10 (1) die Entfernung unter Anwendung der ODS-Säule ausgeführt wurde. Im Detail wurde die folgende Vermutung angestellt: da die Differenz in der Molmasse zwischen dem Polypeptid, das eine darin eingeführte Maleinimid-Gruppe der vorliegenden Erfindung aufweist, und freiem Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat gering ist, ließen sie sich nicht zufriedenstellend voneinander unter Anwendung der Superdex-Peptid-Säule trennen, so dass das freie Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat mit Fab' reagierte, was zu einer geringen Ausbeute am kombinierten Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala und AFP-A4-4·Fab' führt.
Beispiel 11
Untersuchung der Elutionspositionen von kombinierten Produkten eines anionischen Polypeptids und eines Antikörpers in der Anionenaustauschchromatographie.
[Proben]
Es wurden kombinierte Produkte jedes der verschiedenen anionischen Polypeptide, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, und von AFP-A4-4·Fab' mit den gleichen Reagenzien und nach der gleichen Prozedur hergestellt, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurden. Als Proben wurde wässrige Lösungen verwendet, die 1 mg/ml jedes kombinierten Produktes enthielten. Da das Polypeptid 24 eine Maleinimido-Gruppe an dem N-Terminus angebracht hatte, wurde es mit AFP-AFP-A4-4·Fab', so wie es war ohne Modifikation mit 4-(p-Maleinimidophenyl)butyrat kombiniert.
Als Bezugsstandard-Verbindung wurde jedes der kommerziell verfügbaren pAsp (in zwei Chargen) in ein kombiniertes Produkt mit AFP-A4-4·Fab' überführt, indem die gleichen Reagenzien und die gleiche Prozedur angewendet wurden, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurden. Als Proben wurden wässrige Lösungen hergestellt, die 1 mg/ml der so erhaltenen kombinierten Produkte enthielten.
Es konnte kein angestrebtes kombiniertes Produkt von Polypeptid 22 und AFP-A4-4·Fab' erhalten werden. Die Ursache wird wie folgt vermutet: wenn ein anionischer Aminosäure-Rest an dem N-Terminus eines Polypeptids vorhanden ist, wird die Wirksamkeit der Kombination des Polypeptids mit einem Antikörper (exakter die Kombination des Polypeptids mit einem Vernetzungsmittel) durch eine Ursache verringert, die mit der elektrischen Ladung im Zusammenhang steht.
[Analysebedingungen und Messprozedur]
Die Anaylse und Messung wurden in der gleichen Weise ausgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben wurde mit der Ausnahme, dass die Detektion in allen Fällen bei UV 280 nm ausgeführt wurde.
[Ergebnisse]
2 zeigt die eluierenden Salzkonzentrationen und die Peakbreiten der kombinierten Produkte jedes der verschiedenen Polypeptide und AFP-A4-4·Fab'. In 2 zeigt der ausgefüllte Kreis eine Salzkonzentration an der Spitze des Elutionspeaks, die ausgezogene Linie zeigt einen Bereich der Salzkonzentration zwischen Start und Ende der Elution, d. h. eine Peakbreite. Die Zahlen und Unterteilungen der Abszisse zeigen die Art der Polypeptide (die Polypeptid-Nummern und Abkürzungen in Tabelle 1).
Aus den in 2 gezeigten Ergebnissen kann das Folgende entnommen werden.

(i) Aufgrund der Kombination mit dem Antikörper ist die eluierende Salzkonzentration etwas geringer als die des Polypeptids allein, allerdings sind die Wechselbeziehungen unter den eluierenden Salzkonzentrationen der verschiedenen Polypeptide und die Wechselbeziehung zwischen den eluierenden Salzkonzentrationen der Polypeptide und derjenigen der pAsp's die gleichen wie die Wechselbeziehungen, die in Beispiel 8 ermittelt wurden.
(ii) Wenn die Analyse einer Serumkomponente unter den in Beispiel 8 beschriebenen Analysebedingungen unter Verwendung eines POROS-DEAE (4,6 Ø × 10 mm, Anionenaustauschsäule) ausgeführt wurden, betrug die Salzkonzentration an der Spitze eines Elutionspeaks in Folge einer Substanz, die in dem Serum zusammen mit der Serumkomponente vorhanden war, näherungsweise 0,3 M (in 2 nicht gezeigt). Aus dieser Tatsache kann man feststellen, dass, wenn das kombinierte Produkt des Polypeptids 1 (die Zahl der Schwefelsäure-Reste: 1) und der Antikörper als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet werden, ein objektiver Peak von dem Peak überlappt wird, der auf die in dem Serum vorhandene Substanz zurückzuführen ist, was zu einer verringerten Genauigkeit der Messung (Analyse) führt. Die in 2 gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass auch wenn das kombinierte Produkt des Antikörpers und des Polypeptids 2 (die Zahl der Schwefelsäure-Reste: 3), Polypeptid 10 (die Zahl der Schwefelsäure-Reste: 1) oder Polypeptid 11 (die Zahl der Schwefelsäure-Reste: 3) als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, die Genauigkeit der Messung (Analyse) durch den Einfluss der in dem Serum vorhandenen Substanz etwas herabgesetzt wird, wenngleich die Abnahme nicht so groß ist, wie sie im Fall von Polypeptid 1 hervorgerufen wird.

Da das Ausgangsmaterial für POROS-DEAE, d. h. die in dem vorliegenden Beispiel verwendete Packung, etwas hydrophob ist, haben die kombinierten Produkte des Antikörpers und jedes der Polypeptide 10 bis 20, die ein oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste aufweisen, eine höhere scheinbare eluierende Salzkonzentration, als das bei den kombinierten Produkten des Antikörpers der Fall ist, wobei jedes der Polypeptide ein oder mehrere sulfatierte Serin-Reste aufweist. Dementsprechend ist die scheinbare eluierende Salzkonzentration des kombinierten Produkts des Antikörpers und des Polypeptids 10, das lediglich einen Schwefelsäure-Rest aufweist, jedoch einen Tyrosin-Rest enthält, weitgehend die gleiche wie die des kombinierten Produkts des Antikörpers und Polypeptids 2, das 3 sulfatierte Serin-Reste aufweist.
Wenn man jedoch den gleichen Versuch wie vorstehend mit der Ausnahme der Verwendung einer Packung ausführt, die von einem hydrophilen Ausgangsmaterial erhalten wird anstelle der Packung, die in dem vorangegangenen Versuch verwendet wurde, so ist das Folgende zu erwarten: die scheinbare eluierende Salzkonzentration des kombinierten Produkts des Antikörpers und Polypeptids 10, das lediglich einen sulfatierten Tyrosin-Rest aufweist, ist weitgehend das gleiche wie die des kombinierten Produkts des Antikörpers und Polypeptids 1, das lediglich einen sulfatierten Serin-Rest aufweist, so dass ein objektiver Peak von einem Peak überlappt wird, der auf die in dem Serum vorhandene Substanz zurückzuführen ist, was zu einer verminderten Genauigkeit der Messung (Analyse) führt.
Aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen kann man entnehmen, dass ein Polypeptid mit mindestens 3, bevorzugt 4 oder mehr und mehr bevorzugt 5 oder mehr Säureresten, die von einer starken Säure deriviert sind, als eine die Trennung verbessernde Substanz bevorzugt ist.
Beispiel 12
Untersuchung der Stabilität eines Polypeptids, das sulfatierte Serin-Reste enthält, und eines Polypeptids, das sulfatierte Tyrosin-Reste in einer wässrigen Lösung enthält Jedes der Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala (Polypeptid 4) (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche) und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 14) wurden bei 40°C in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 10 gelagert und auf diese Weise ihre Stabilität untersucht.
[Proben]
Als Proben wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen jedes der Polypeptide 4 und 14 in jeder der folgenden Pufferlösungen bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml angesetzt wurden:

Pufferlösungen:

pH 6,0	2-Morpholinoethansulfonsäure (MES)
pH 7,0	3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)
pH 8,0	N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure
	(TAPS)
pH 9,0	TAPS
pH 10,0	N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropansulfonsäure
	(CAPSO).

Die Konzentrationen aller dieser Pufferlösungen wurden auf 50 mM eingestellt.
[Aufbewahrungsmethode]
Jede Probe wurde bei 40°C für eine vorbestimmte Zahl von Tagen gelagert.
[Ergebnisse]
Der zurückbleibende Polypeptidanteil (%) in jeder Probe wurde am 6. Tag und 19. Tag der Lagerung auf der Grundlage des Wertes für die Peakfläche des Polypeptids in der Probe unmittelbar nach der Herstellung und derjenige nach der vorbestimmten Zahl von Tagen der Lagerung ermittelt, wobei die Ermittlung unter den in Beispiel 8 beschriebenen Analysebedingungen und mit Hilfe des hierin beschriebenen Verfahrens erfolgte.
3 und 4 zeigen die Messergebnisse, die für Polypeptid 4 bzw. solche, die für Polypeptid 14 erhalten wurden. In 3 und 4 zeigen die ausgefüllten Säulen und die leeren Säulen die Ergebnisse von der jeweiligen Probe am 6. Tag bzw. 19. Tag der Lagerung erhalten wurden.
Die in 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass der Abbau von Polypeptid 4 mit einer Erhöhung des pH-Werts bei der Lagerung beschleunigt ist und dass 10% oder mehr an Polypeptid 4 nach 16 Tagen der Lagerung selbst bei pH 6 abgebaut sind, bei dem das Polypeptid 4 am stabilsten ist.
Andererseits zeigen die in 4 dargestellten Ergebnisse, dass Polypeptid 14 bei allen pH-Werten stabil ist.
Aus den vorgenannten Ergebnissen kann entnommen werden, dass die Sulfonsäure-Gruppen, die in die Tyrosin-Reste eingeführt werden, gegenüber dem Einfluss des pH-Wertes weniger anfällig sind und dadurch stabiler sind als die Sulfonsäure-Gruppen, die in die Serin-Reste eingeführt sind, so dass die Ersteren gegenüber den Letzteren bei Verwendung in einer die Trennung verbessernden Substanz über eine vorzuziehende Eigenschaft verfügen.
Beispiel 13
Messung von thyreotropem Hormon (TSH)
Herstellung von Peroxidase-markierten Anti-TSH-Antikörper-Fab'-Fragment
Anti-TSH-Antikörper (nachfolgend abgekürzt als "TSH-1"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurde in Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode eingeführt. Peroxidase (verfügbar bei der TOYOBO, Co., Ltd.) wurde in das Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode eingeführt, um Peroxidase-markiertes Anti-TSH-Antikörper-Fab'-Fragment herzustellen (nachfolgend abgekürzt als "TSH-1·Fab'-POD").
[Antikörper-Lösung 1]
Als Antikörper-Lösung 1 wurden 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt von 5 nm TSH-1·Fab'-POD angesetzt.
[Antikörper-Lösungen 2]
Es wurde Anti-TSH-monoklonaler Antikörper, von dem festgestellt wurde, dass er im Epitop von TSH-1 verschieden ist, (nachfolgend abgekürzt als "TSH-2"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in Fab'-Fragment eingeführt (nachfolgend abgekürzt als "TSH-2·Fab'").
Es wurden kombinierte Produkte von TSH-2·Fab' und jedem Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 14) und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 3) (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche) nach der gleichen Prozedur hergestellt, wie in Beispiel 9 (3) beschrieben wurde.
Als Antikörper-Lösungen 2 wurden 50 mM MOPS-Puffer-Lösungen mit einem Gehalt von 50 nM jedes der kombinierten Produkte angesetzt.
[Probe]
Als eine Probe wurde eine Lösung verwendet, die durch Zusetzen von kommerziell verfügbaren TSH (verfügbar bei Genzyme Diagnostics) zu 50 mM MOPS-Puffer hergestellt (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,5% Rinderserumalbumin), und zwar bis zu einer Konzentration von 70 pM.

[Anwendungsbedingungen der HPLC]

Säule:	0,46 Ø × 1,0 cm
Packung:	POROS-DEAE-Gel (Warenzeichen der Perseptive Biosystems)
Eluierungsmittel A:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5)
Eluierungsmittel B:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl)
Substratlösung:	eine 25 mM wässrige Lösung von 4-N-Acetylamino-phenol (hergestellt von DOJINDO LABORATORIES)
Durchflussgeschwindigkeit:	Eluierungsmittel A + Eluierungsmittel B; 1,0 ml/min, die Substratlösung; 0,1 ml/min
Reaktionssektion:	0,025 Ø × 1,000cm (bei 60°C gehalten)
Detektion: Fluoreszens wurde bei einer Anregungswellenlänge	von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von
432 nm gemessen.	Gradient: 0 → 10 min B = 0 → 100%.

[Messverfahren]
Es wurden mit 100 μl Antikörper-Lösung 100 μl der Probe und 50 μl jeder Antikörper-Lösung 2 gemischt und die resultierende Mischung bei 25°C für 30 min stehen gelassen, wonach 10 μl der Mischung für die Messung (Analyse) mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen verwendet wurden.
[Ergebnisse]
Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurden folgende Salzkonzentrationen (Konzentrationen von Natriumchlorid) für die Elution verschiedener Substanzen ermittelt:

– TSH-1·Fab'-POD und ein Komplex von TSH-1·Fab'-POD und TSH: 0 bis 0,1 M
– ein Komplex von TSH-1·Fab'-POD, TSH und des kombinierten Produkts von TSH-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 14): 0,5 bis 1,2 M
– ein Komplex von TSH-1·Fab'-POD, TSH und des kombinierten Produkts von TSH-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 3): 0,25 bis 0,45 M.

Aus den vorgenannten Ergebnissen kann entnommen werden, dass die Komplexe, die den zu messenden Analyten enthalten, mit größerer Sicherheit von dem damit vorhandenen freien POD-markierten Antikörper unter Verwendung eines beliebigen der kombinierten Produkte des sulfatierten Polypeptids und des Antikörpers abgetrennt werden kann und dass die Elutionsposition eines objektiven Komplexes durch geeignete Wahl der Art des sulfatierten Polypeptids frei eingestellt werden kann.
Es ist ebenfalls festgestellt worden, dass unter Nutzung eines Peaks aufgrund des Komplexes, der daran angebrachtes sulfatiertes Polypeptid aufweist, eine zufriedenstellende Eichkurve für TSH in der Probe erhalten werden kann, und damit die Menge an TSH bestimmt werden kann.
Beispiel 14
Messung von AFP unter Verwendung eines kombinierten Produkts von Fab' und eines anionischen Polypeptids
(Herstellung von Peroxidase-markiertem Anti-AFP-Antikörper-Fab'-Fragment
Es wurde Anti-AFP-Antikörper-WA-1 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-WA-1"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), der im Epitop von AFP-A4-4 verschieden ist, in Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode eingeführt. Es wurde Peroxidase (verfügbar bei TOYOBO Co., Ltd.) an das Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode angebracht, um Peroxidase-markiertes Anti-AFP-Antikörper-Fab'-Fragment (nachfolgend abgekürzt als "AFP-Wa-1·Fab'-POD") herzustellen.
[Reagenzien]
Als Reagenzien wurden MOPS-Puffer-Lösungen (pH 7,5) mit einem Gehalt von 200 nM eines vorbestimmten kombinierten Produkts unter den kombinierten Produkten hergestellt, die in Beispiel 11 hergestellt wurden, d. h. die kombinierten Produkte von AFP-A4-4·Fab' und jedes der in Tabelle 1 aufgeführten anionischen Polypeptide, 100 nM von AFP-WA-1·Fab'-POD und 0,2 (Gewicht/Volumen) eines Poly(vinylalkohols) (hergestellt von der Aldrich Chemical Co.).
[Probe]
Als eine Probe wurde eine Lösung verwendet, die durch Auflösen von kommerziell verfügbarem AFP in 50 mM MOPS-Puffer hergestellt wurde (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,2% (Gewicht/Volumen) Poly(vinylalkohol)) und zwar bis zu einer Konzentration von 100 ng/ml.

[HPLC-Bedingungen]

Säule:	POROS-DEAE (4,6 Ø × 10 mm)
Eluierungsmittel A:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5)
Eluierungsmittel B:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 3M NaCl)
Substrat-Lösung:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 90 mM 4-N-(4-Carbobutyryl)aminophenol und 20 mM H₂O₂)
Durchflussgeschwindigkeit:	Eluierungsmittel A + Eluierungsmittel B; 1 ml/min, die Substratlösung; 0,1 ml/min
Reaktionssektion:	0,025 Ø × 1,000cm
Temperatur:	60°C
Detektion:	Fluoreszens wurde bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm gemessen
Gradient:	der gleiche wie in Beispiel B.

[Messverfahren]
Mit 100 μl jedes Reagens wurden 10 μl der Probe gemischt und die Reaktion für 10 min bei 8°C ausgeführt, wonach 20 μl der Reaktionsmischung mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen analysiert wurden.
[Ergebnisse]
5 zeigt die eluierenden Salzkonzentrationen und die Peakbreiten von Komplexen des kombinierten Produktes jedes der verschiedenen Polypeptide und AFP-A4-4·Fab',AFP-WA-1·Fab'-POD und AFP (Antigen-Antikörper-Komplexe). In 5 zeigt der ausgefüllte Kreis eine Salzkonzentration an der Spitze des Elutionspeaks, die durchgezogene Linie zeigt einen Bereich der Salzkonzentration zwischen dem Start und dem Ende der Elution, d. h. eine Peakbreite. Die Zahlen und Einteilungen an der Abszisse zeigen die Art der Polypeptide (die Polypeptidnummern und Abkürzungen in Tabelle 1).
Aus den in 5 gezeigten Ergebnissen kann das Folgende entnommen werden.

(i) Die eluierenden Salzkonzentrationen (die Elutionspositionen) der Antigen-Antikörper-Komplexe hängen von der Art der an dem AFP-A4-4·Fab' angebrachten Polypeptids ab. Die Reihenfolge der Elution der Antigen-Antikörper-Komplexe war die gleiche wie die Elution der kombinierten Produkte von AFP-A4-4·Fab' und dem jeweiligen Polypeptid (siehe Beispiel 11 und 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die eluierende Salzkonzentration eines objektiven Antigen-Antikörper-Komplexes in geeigneter Weise durch geeignete Wahl der Art des Polypeptids ermittelt werden kann.
(ii) Da die eluierende Salzkonzentration von freiem AFP-WA-1·Fab'-POD 0 bis 0,1 M betrug, ließen sich das freie AFP-WA-1·Fab'-POD und der Antigen- Antikörper-Komplex vollständig voneinander unter Anwendung eines beliebigen der Polypeptide trennen. Speziell ließ sich, wenn eines der Polypeptide 4 bis 9 und Polypeptide 11 bis 21 verwendet wurde, die eluierende Salzkonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes auf 0,3 M oder darüber einstellen, so dass der Einfluss der in dem Serum zusammen mit dem AFP vorhandenen Substanz durch Verwendung eines dieser Polypeptide als eine die Trennung verbessernde Substanz mit Sicherheit vermieden werden konnte.

Wie bereits beschrieben, ist das Ausgangsmaterial für POROS-DEAE, der in dem vorliegenden Beispiel verwendeten Packung, etwas hydrophob, so dass die Antigen-Antikörper-Komplexe, die aus den kombinierten Produkten des Antikörper und jedes der Polypeptide 10 bis 20 erzeugt werden, die ein oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste haben, über eine höhere scheinbare eluierende Salzkonzentration verfügen als solche, die aus den kombinierten Produkten des Antikörpers und jedes der Polypeptide erzeugt werden, die einen oder mehrere sulfatierte Serin-Reste haben. Dementsprechend ist die scheinbare eluierende Salzkonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und Polypeptid 10 erzeugt wird, das lediglich einen Schwefelsäure-Rest hat, jedoch einen Tyrosin-Rest hat, weitgehend die gleiche wie die des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und des Polypeptids 2 erzeugt wird, das 3 sulfatierte Serin-Reste hat.
Wenn jedoch der gleiche Versuch wie vorstehend mit Ausnahme der Verwendung einer von einem hydrophilen Ausgangsmaterial erhaltenen Packung ???? der Packung ausgeführt wird, die in dem vorstehenden Versuch verwendet wurde, so ist folgendes zu erwarten: die scheinbare eluierende Salzkonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und des Polypeptids 10 erzeugt wird, das lediglich einen sulfatierten Tyrosin-Rest hat, ist weitgehend die gleiche wie die des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und des Polypeptids 1 erzeugt wird, das lediglich einen sulfatierten Serin-Rest enthält, so dass sich ein objektiver Peak mit einem Peak überlappt, der auf die zusammen mit AFP vorhandene Substanz im Serum zurückzuführen ist, was zu einer herabgesetzten Genauigkeit der Messung (Analyse) führt.

(iii) Aus den vorgenannten Ergebnissen wurde in Betracht gezogen, dass, wenn ein Polypeptid als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, die Zahl der von einer starken Säure derivierten Säurereste in dem Polypeptid 3 bis 20, bevorzugt 4 bis 30 und mehr bevorzugt 5 bis 15 beträgt (das Vorhandensein einer großen Zahl der Säurereste wird für die Messung nicht bevorzugt, weil die eluierende Salzkonzentration in der Elution aus einer Säule zu hoch wird).
(iv) Es können 2 oder mehrere Substanzen mit ähnlichen Strukturen (z. B. 2 oder mehrere Substanzen, die lediglich in einem Teil einer Struktur verschieden sind, wie beispielsweise einer Zuckerkettenstruktur, Isozyme, 2 oder mehrere Antikörper, die in der Lage sind, verschiedene Epitope eines Antigens zu erkennen) getrennt und gemessen werden, indem eine Kombination von 2 oder mehreren Polypeptiden gewählt wird, die hinsichtlich der eluierenden Salzkonzentration verschieden sind (z. B. eine Kombination eines der Polypeptide 4 bis 7, 8, 9, 11 bis 14 sowie eines der Polypeptide 7 und 16 bis 21) und indem kombinierte Produkte verwendet werden, die durch Anbringen jedes der 2 oder mehreren Polypeptide an eine geeignete Affinitätssubstanz erhalten werden.
(v) Die unter Verwendung des jeweiligen pAsp-1 und pAsp-2 (pAsp's in unterschiedlichen Produktionschargen) als ein Polypeptid erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass bei den konventionellen Polypeptiden, die Carbonsäure-Reste haben, die folgenden Probleme. auftreten: in Abhängigkeit von den Produktionschargen variieren die konventionellen Polypeptide hinsichtlich der eluierenden Salzkonzentration, so dass die Schweifbildung eines objektiven Peaks variiert, was bedeutet, dass es schwierig ist, ein Polypeptid mit einer gleichförmigen Molmasse zu erhalten. Im Gegensatz dazu tritt bei dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein solches Problem beim pAsp nicht auf, da es als ein Polypeptid mit gleichförmiger Molmasse mit Hilfe der Peptidsynthese leicht erhalten werden kann.

Es wurden 100 μl der Antikörper-Lösung 1 mit 50 μl der Probe und 50 μl der Antikörper-Lösung 2 gemischt (mit einem Gehalt eines kombinierten Produkts (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche) von TSH-2·Fab' und Ala-(Ser(SO₃H))₅-β-Ala (Polypeptid 3)), das in Beispiel 13 hergestellt wurde. Nach dem Stehenlassen für 30 min bei 25°C wurden 20 μl der resultierenden Mischung für die Messung (Analyse) mit Hilfe der HPLC unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen verwendet. Als Ergebnis wurde ein objektiver Antigen-Antikörper-Komplex bei der eluierenden Salzkonzentration eines erzeugten Antigen-Antikörper-Komplexes eluiert, wenn die Messung (Analyse) von AFP unter Verwendung von Polypeptid 3 (nicht im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche) ausgeführt wurde (die Daten der eluierenden Salzkonzentration sind ebenfalls an einer Stelle dargestellt, die der Abkürzung TSH auf der Abszisse in 5 entspricht). Aus diesem Ergebnis kann entnommen werden, dass selbst im Fall eines unterschiedlichen zu messenden Analyten der Einsatz des Polypeptids als eine die Trennung verbessernde Substanz die Ausführung einer gewünschten Messung (Analyse) unter Verwendung der HPLC unter bestimmten Analysebedingungen möglich macht.
Beispiel 15
Verfahren zum Trennen und Messen von AFP's unterschiedlicher Zuckerkettenstruktur durch Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung
[Flüssiges Reagens 1]
Mit Ausnahme der Verwendung von anti-AFP-monoklonalem Antikörper WA-2 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-Wa-2"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; von AFP-WA-1 und AFP-A4-4 im Epitop verschieden) als ein Antikörper und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala als ein Polypeptid, wurde ein kombiniertes Produkt von AFP-WA-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala mit den gleichen Reagenzien und der gleichen Prozedur hergestellt, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurden. Als flüssiges Reagens 1 wurde ein 50 mM MES-Puffer (pH 6,5) eingesetzt, der 139 nM des kombinierten Produktes enthielt, 1 mg/ml Lens culinaris-Lektin (nachfolgend abgekürzt als "LCA"; verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Calciumchlorid.
[Flüssiges Reagens 2]
Als flüssiges Reagens 2 wurde 50 nM MES-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt von 147 nM des in Beispiel 12 hergestellten AFP-WA-1·Fab'-POD, 156 nM des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-A4-4·Fab' verwendet, das in Beispiel 9 hergestellt wurde, sowie 0,2% (Gewicht/Volumen) eines Poly(vinylalkohols).
[Proben]
Unter Verwendung einer Säule, die mit LCA-immobilisiertem Füllmaterial gepackt war, wurde AFP, das von einem Human-Hepatom entnommen wurde, in LCA-ungebundene AFP und LCA-gebundene AFP fraktioniert. Jedes von ihnen wurde einem Human-Serum zugegeben, das kein AFP enthielt, und zwar bis zu einer Konzentration von 100 ng/ml, wodurch Probe 1 (die das LCA-ungebundene AFP enthielt) und Probe 2 (die das LCA-gebundene AFP enthielt) angesetzt wurden.

[HPLC-Bedingungen]

Säule:	POROS-DEAE (4,6mm ID × 10mm)
Puffer-Lösung A:	50 mM TAPS-Puffer (pH 8,5, mit einem Gehalt von 0,25M NaCl)
Puffer-Lösung B:	50 mM TAPS-Puffer (pH 8,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl)
Substrat-Lösung:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 90 mM 4-N-(4-Carbobutyryl)aminophenol und 20 mM H₂O₂
Gradient:	Puffer-Lösungen A + B, Durchflussgeschwindigkeit; 2 ml/min 0 → 2 min B = 0% 2 → 4,5 min B = 13% 4,5 → 8 min B = 100% 8 → 8,5 min B = 0%
säulennachgeschaltet:	Zugabe von POD-Substrat (eine Substrat-Lösung, 0,1 ml/min), Reaktion bei 60°C für 30 Sekunden
Detektion:	Fluoreszens, gemessen bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm.

[Messverfahren]
Es wurden mit 100 μl des flüssigen Reagens 10 μ von Probe 1 oder Probe 2 gemischt und die Reaktion für 10 min bei 8°C ausgeführt. Danach wurden der Reaktionslösung 10 μl flüssiges Reagens 2 zugesetzt und die resultierende Mischung einer Reaktion für weitere 20 min unterworfen. Durch HPLC unter den vorgenannten Bedingungen wurden 80 μl der Reaktionsmischung für die Messung (Analyse) verwendet.
[Ergebnisse]
6 zeigt die Messergebnisse. In 6 zeigt die durchgezogene Linie die aus Probe 1 erhaltenen Daten und die gestrichelte Linie die aus Probe 2 erhaltenen Daten.
Aus den in 6 dargestellten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen: es wurde ein Antigen-Antikörper-Komplex (Komplex 1) von AFP, das kombinierte Produkt von AFP-WA-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-WA-1·Fab'-POD an einer Position von 2,9 min eluiert; ein Antigen-Antikörper-Komplex (Komplex 2), der durch Einführung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-A4-4·Fab' in den Komplex 1 eingeführt wurde, wurde bei einer Position von 5,8 min eluiert, wobei diese Komplexe mit Sicherheit voneinander separiert waren.
Aus den in 6 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen: im Fall von Probe 1, die LCA-ungebundenes AFP enthielt, wird Komplex 2, der durch Anbringung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-A4-4·Fab' erzeugt wird, hauptsächlich als Antigen-Antikörper-Komplex erzeugt; und im Fall von Probe 2, die LCA-anbringbares AFP enthielt, Komplex 1 hauptsächlich als Antigen-Antikörper-Komplex erzeugt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das kombinierte Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-A4-4·Fab' an der Reaktion mit AFP durch ihre Kompetition mit LCA gehemmt wird.
Der prozentuale Anteil der Menge des erzeugten Komplexes 1 bezogen auf die Gesamtmengen der 2 erzeugten Komplexe (Prozentanteil von Komplex 1) wurde berechnet (siehe Tabelle 2), um festzustellen, dass dieser Prozentanteil den Anteil von LCA-gebundenem AFP in jeder Probe wiederspiegelt, so dass der Anteil von LCA-gebundenem AFP in jeder Probe unter Nutzung dieses Prozentanteils gemessen werden kann.
Vergleichsbeispiel
Es wurde der gleiche Versuch wie in Beispiel 15 mit der Ausnahme der Verwendung eines kombinierten Produktes von AFP-WA-2·Fab' und eines Asparaginsäure-Polymers mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 6.000 anstelle des kombinierten Produktes von AFP-WA-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala ausgeführt sowie unter Verwendung eines kombinierten Produktes von AFP-A4-4·Fab' und eines Asparaginsäure-Polymers mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 28.800 anstelle des kombinierten Produks von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-A4-4·Fab'. Sodann wurde der Prozentanteil von Komplex 1 berechnet.
Zusätzlich wurde der gleiche Versuch, wie er vorstehend beschrieben wurde, mit der Ausnahme ausgeführt, dass anstelle des vorstehend verwendeten flüssigen Reagens 1 ein flüssiges Reagens verwendet wurde, das angesetzt wurde durch Zusetzen einer β-Polyglutaminsäure mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 550.000 zu dem flüssigen Reagens 1 bis zu einer Konzentration von 100 μg/ml.
Die erhaltenen Ergebnisse werden ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Aus den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen: wenn das Verfahren mit den Vergleichsbeispielen zum Einsatz gelangt (das Verfahren unter Verwendung von Polyasparaginsäure) kann es dazu kommen, dass der Prozentanteil von Komplex 1 im Fall von Probe 1 relativ hoch wird, was bedeutet, dass eine kompetitive Reaktion stattfinden könnte und ein anionisches Additiv, wie beispielsweise γPGA, zur Unterdrückung dieses Phänomens zugesetzt werden sollte.
Wenn im Gegensatz dazu das Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein solches Additiv nicht erforderlich. Daher ist das Messverfahren unter Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung als eine die Trennung verbessernde Substanz auch in dieser Hinsicht dem Messverfahren unter Verwendung eines Polymers überlegen, das Carboxyl-Gruppen (z. B. Polyasparaginsäure) aufweist, die als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet wurden.
Obgleich nicht ersichtlich, wird die Ursache für das vorgenannte Phänomen wie folgt vermutet.
Da ein anionisches Polymer, wie beispielsweise Polyasparaginsäure, relativ große Moleküle hat, wird die Antigen-Antikörper-Reaktion durch elektrische Ladungen, sterische Hinderung usw. gehemmt, was die Ursache für das vorgenannte Phänomen hervorbringt. Andererseits kann man annehmen, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kleine Moleküle hat und damit die Antigen-Antikörper-Reaktion kaum beeinflusst.
Beispiel 16
Untersuchung des Einflusses der Zugabe eines Tensids zu einem Eluierungsmittel
[Reagens]
Als ein Reagens wurde ein 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt von 200 nM des kombinierten Produkts des Polypeptids 18 und von AFP-A4-4·Fab' verwendet, das in Beispiel 9 hergestellt wurde, sowie 100 nM des AFP-WA-1·Fab'-POD.
[Probe]
Die gleiche wie in Beispiel 14.

[HPLC-Bedingungen]

Säule:	POROS-DEAE (4,6 mm ID × 10mm)
Puffer-Lösung A:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,1% (Gewicht/Volumen) eines bestimmten Tensids)
Puffer-Lösung B:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl und 0,1% (Gewicht/Volumen) eines bestimmten Tensids)
Substrat-Lösung:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 90 mM 4-N-(4-Carbobutyryl)aminophenol und 20 mM H₂O₂
Gradient:	Puffer-Lösungen A + B, Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min 0 → 5 min A = 100% 5 → 30 min B = 0 → 100% 30 → 35 min B = 100%
Säulennachgeschaltet:	Zugabe von POD-Substrat (eine Substrat-Lösung, 0,1 ml/min), Reaktion bei 60°C für 30 Sekunden
Detektion:	Fluoreszens, gemessen bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm.

Tabelle 3 zeigt die Tenside, die als Tensid zu den Eluierungsmitteln zugesetzt wurden.
Tabelle 3
[Messverfahren]
Es wurden mit 100 μl des Reagens 10 μl der Probe gemischt und die Reaktion für 10 min bei 8°C ausgeführt. Sodann wurden 2Oμ1 der Reaktionsmischung für die Messung (Analyse) durch HPLC unter den vorgenannten Bedingungen verwendet.
[Ergebnisse]
7 zeigt die eluierende Salzkonzentration und die Peakbreite eines Antigen-Antikörper-Komplexes von AFP, der unter Verwendung des Eluierungsmittels bestimmt wurde, das die jeweiligen verschiedenen Tenside enthielt. In 7 zeigt ein ausgefüllter Kreis eine Salzkonzentration an der Spitze des Elutionspeaks, ein durchgezogener Strich zeigt einen Bereich der Salzkonzentration zwischen dem Start und dem Ende der Elution, d. h. eine Peakbreite. Die Nummern an der Abszisse zeigen die Art der Tenside (die Tensidnummern in Tabelle 3).
Aus den in 7 dargestellten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen.

(i) Durch Zusetzen des Tensids lässt sich die Peakbreite schmaler machen, d. h. mit anderen Worten kann eine Schweifbildung des Peaks während der Elution verhindert werden, was bedeutet, dass die Genauigkeit der Messung verbessert werden kann. Dieser Einfluss ist im Fall der Kation-Tenside und der Ampho-Tenside bemerkenswert.
(ii) Die eluierende Salzkonzentration (die Elutionsposition) wird durch Zusatz des Tensids variiert, was bedeutet, dass die eluierende Salzkonzentration eines objektiven Antigen-Antikörper-Komplexes durch Auswahl eines geeigneten Tensids in geeigneter Weise eingestellt werden kann.

Beispiel 17
Trennung durch Elektrophorese
[Proben]
Es wurden Proben angesetzt, indem mit 50 mM MOPS-Puffer-Lösung (pH 7,5) das in Beispiel 10 erzeugte AFP-A4-4·Fab', ein kombiniertes Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala und AFP-A4-4·Fab', wobei das AFP-WA2·Fab' in Beispiel 15 erzeugt wurde, oder ein kombiniertes Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala bzw. AFP-WA2·Fab' verdünnt wurden, so dass der Gehalt 1 mg/ml betrug.
[Messverfahren]
Es wurde jede Probe in einer Menge von 4 μl in die Probeaufnahmemulden an einer Seite eines 1%-Agarosegels gegeben. Die mit dem Auftrag versehene Seite wurde zur Kathode gemacht und eine Elektrolyse bei einer Spannung von 200 V für 30 min ausgeführt, gefolgt von einer Färbung des Proteins unter Verwendung von Quick-CBB (ein Warenzeichen, hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), um einen Rf-Wert der jeweiligen Probe zu messen.
[Ergebnisse]
Die Rf-Werte der Prob en waren Folgende:

Probe Rf-Wert

AFP-A4-4·Fab' 0,38

[Ala-(Tyr(SOsH))₈]-[AFP-A4-4·Fab'] 0,66

AFP-WA2·Fab' 0,06

[Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala]-[AFP-WA2·Fab'] 0,22
Wie vorstehend gezeigt, wird durch Vereinigen des sulfatierten Peptids die negative Ladung erhöht und die Beweglichkeit vergrößert. Je größer außerdem die Zahl des Schwefelsäure-Restes in dem sulfatierten Peptid wird, um so größer wird die Beweglichkeit.
Beispiel 18
Trennung der Reaktionsprodukte von sulfatiertem Peptid-kombiniertem Antikörper und Antigen
[Proben]
Es wurden Proben hergestellt, indem 50 μl AFP-Lösung, eingestellt mit 50 mM MOPS-Puffer-Lösung (pH 7,5), um den Gehalt von AFP auf 0,5 mg/ml zu bringen, zu 50 μl einer Lösung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab', erhalten in Beispiel 17 (1 mg/ml) in MOPS-Puffer-Lösung (pH 7,5), 50 μl einer Lösung des kombinierten Produkts von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala und AFP-WA2·Fab', erhalten in Beispiel 17 (1 mg/ml) in MOPS-Puffer-Lösung (pH 7,5) oder 50 μl MOPS-Puffer-Lösung (pH 7,5), gefolgt von einer Reaktion bei 37°C für 30 min.
[Messverfahren]
Es wurde jede Probe in einer Menge von 4 μl in die Probeaufnahmemulden an einer Seite eines 1 %-Agarosegels gegeben. Die mit dem Auftrag versehene Seite wurde zur Kathode gemacht und eine Elektrolyse bei einer Spannung von 200 V für 30 min ausgeführt, gefolgt von einer Antikörper-Affinitätsmetastase (Blotting) bei Raumtemperatur für 30 min unter Verwendung einer mit Anti-AFP-Antikörper-beschichteten Nitrocellulosemembran. Diese Membran wurde mit einer Waschlösung 2 Mal gewaschen (0,9% NaCl). Nach dem Eintauchen dieser Membran in eine Anti-AFP-Antikörper-Lösung bei 37°C für 30 min wurde diese Membran 2 Mal unter Verwendung der Waschlösung gewaschen. Danach wurde diese Membran in eine POD-markierte Anti-IgG-Antikörper-Lösung bei 37°C für 30 min getaucht, gefolgt von einem 2-maligen Waschen mit der Waschlösung. Danach wurde diese Membran in einer Farbentwicklungs-Lösung (50 mM Phosphat-Puffer-Lösung (pH 7,5) mit einem Gehalt von 0,37 mM Nitrotetrazoliumblau, 2,6 mM β-Nicotinamid-Adenindinukleotid, reduzierte Form, und 0,01 Wasserstoffperoxid) entwickelt, gefolgt von einer Messung des Rf-Wertes des Antigen-Antikörper-Reaktionsproduktes.
[Ergebnisse]

Die Rf-Werte der Proben waren Folgende:

Probe	Rf-Wert
Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt von [Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP-A4-4·Fab'] mit AFP	0,63
Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt von [Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala]-[AFP-WA2·Fab'] mit
AFP	0,20
AFP	0,85

Wie vorstehend gezeigt, ist es eindeutig, dass Rf-Werte von Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt von [Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP-A4-4·Fab'] mit AFP bzw. [Ala-(Tyr(SO₃H))₈-β-Ala]-[AFP-WA2·Fab'] mit AFP überwiegend die gleichen sind wie die von [Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP-A4-4·Fab'] und [Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala]-[AFP-WA2·Fab']. Damit wurde festgestellt, dass die negative Ladung von AFP die Rf-Werte des Antigen-Antikörper-Reaktionsproduktes von [Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP-A4-4·Fab'] mit AFP und [Ala-(Tyr(SO₃H))₅-β-Ala]-[AFP-WA2·Fab'] mit AFP nicht beeinflusst.
Wie vorstehend beschrieben, liefert die vorliegenden Erfindung ein neuartiges Polypeptid und ein Reagens zum Messen eines Analyten, der in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll, wobei in das Reagens das Polypeptid einbezogen ist. Wenn ein Komplex, der erzeugt wird durch die Wechselwirkung zwischen einem Analyten, der in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe gemessen werden soll, und einer Affinitätssubstanz von einer freien Affinitätssubstanz und Substanzen, die in der Probe vorhanden sind und die die Detektion des Komplexes zu beeinflussen versuchen, mit Hilfe einer Anionenaustauschmethode getrennt werden, so lässt sich dieses Polypeptid zum Abtrennen des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz und dergleichen wirksamer verwenden. Die vorliegende Erfindung ist besonders wirksam insofern, dass das hierin beschriebene Messverfahren unter Einsatz der Produkte der vorliegenden Erfindung die Messung einer Spur einer Komponente in einer von einem Lebendkörper kommenden Probe, wie beispielsweise Serum, in einer sehr viel kürzeren Zeit leichter und mit höherer Genauigkeit im Vergleich beispielsweise zu konventionellen Messverfahren der EIA, RIA oder dergleichen möglich macht, sowie im Vergleich zu Verfahren, bei denen ein Polymer als die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, das Carboxyl-Gruppen hat.
Damit liefert die vorliegende Erfindung einen großen Beitrag zum Stand der Technik.

Claims

Polypeptid mit 4 bis 20 Tyrosinsulfat-Resten.
Polypeptid nach Anspruch 1, bei welchem jeder Tyrosinsulfat-Rest einen Schwefelsäure-Rest hat, der an einer reaktionsfähigen Gruppe gebunden ist, die ausgewählt ist aus einer Hydroxyl-Gruppe oder einer Amino-Gruppe in einem Tyrosin-Rest, der das Polypeptid aufbaut.
Polypeptid, dargestellt durch die Formel: A-(R)_m-B (I) worin m eine ganze Zahl von 4 bis 20 ist unter der Voraussetzung, dass 4 bis 20 R's Tyrosinsulfat-Reste sind und der Rest der R's gleich oder verschieden ist; ein Aminosäure-Rest, der keinen starken Säure-Rest hat, wobei jede Seitenkette des Aminosäure-Restes eine reaktionsfähige Gruppe aufweist, ausgewählt aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Amino-Gruppe, einer Imino-Gruppe und einer Thiol-Gruppe, wobei die reaktionsfähige Gruppe geschützt werden kann; A ist ein Wasserstoffatom, eine Schutzgruppe vom N-Terminus oder ein Säurerest, deriviert von einer starken Säure mit einem pKa-Wert von 3 oder kleiner; und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Schutzgruppe vom C-Terminus.
Polypeptid nach Anspruch 1, das dargestellt wird durch die Formel: A-(R¹)_m'-B (II) worin die R' gleich oder verschieden sind, unabhängig ein Aminosäure-Rest, der darin einen starken Säure-Rest einführt, deriviert von einer starken Säure mit einem pKa-Wert von 3 oder kleiner, durch Binden an eine reaktionsfähige Gruppe des Aminosäure-Restes, wobei die reaktionsfähige Gruppe ausgewählt ist aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Amino-Gruppe, einer Imino-Gruppe und einer Thiol-Gruppe unter der Voraussetzung, dass mindestens 4 R¹ Tyrosinsulfat-Reste sind; m' ist eine ganze Zahl von 4 bis 20; A ist ein Wasserstoffatom, eine Schutzgruppe vom N-Terminus oder ein Säure-Rest, deriviert von einer starken Säure; und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Schutzgruppe vom C-Terminus.
Polypeptid nach Anspruch 3, das dargestellt wird durch die Formel: A-(R¹)_m'-(R²)_n-B (III) worin (m' + n) eine ganze Zahl von 5 bis 20 ist; R¹ ist ein Tyrosinsulfat-Rest; jedes R² ist ein Aminosäure-Rest, der keinen starken Säure-Rest aufweist, jede Seitenkette des Aminosäure-Restes hat eine reaktionsfähige Gruppe, wie sie in Anspruch 3 festgelegt wurde, wobei die reaktionsfähige Gruppe geschützt werden kann; n ist eine ganze Zahl von 1 bis 16, und A und B sind wie in Anspruch 3 festgelegt.
Kombiniertes Produkt aus einem Polypeptid nach Anspruch 1 und einer Substanz mit einer Affinität für einen in einer Probe zu messenden Analyten, der von einem Lebendkörper abgenommen wird.
Verbindung, aufweisend ein Polypeptid nach Anspruch 1, dessen N-Terminus über einen Spacer an einer Maleinimido-Gruppe gebunden ist.
Kombiniertes Produkt der Verbindung nach Anspruch 7 und einer Substanz, die eine SH-Gruppe aufweist und eine Affinität für einen in einer Probe zu messenden Analyten hat, die von einem Lebendkörper abgenommen wird.
Verbindung nach Anspruch 7, die dargestellt wird durch die Formel: D-E-(R)_m-B (IV) worin D eine Maleinimido-Gruppe ist; E ist ein Spacer; m ist eine ganze Zahl von 4 bis 20 unter der Voraussetzung, dass 4 bis 20 R's Tyrosinsulfat-Reste sind und der Rest der R's gleich oder verschieden ist; ein Aminosäure-Rest, der keinen starken Säure-Rest aufweist, wobei jede Seitenkette des Aminosäure-Restes eine reaktionsfähige Gruppe hat, ausgewählt aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Amino-Gruppe, einer Imino-Gruppe und einer Thiol-Gruppe, wobei die reaktionsfähige Gruppe geschützt werden kann; und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Schutzgruppe vom C-Terminus.
Verbindung nach Anspruch 7, die dargestellt wird durch die Formel: D-E-(R¹)_m'-B (V) worin D eine Maleinimido-Gruppe ist; E ist ein Spacer; die R¹ sind Tyrosinsulfat-Reste; m' ist eine ganze Zahl von 4 bis 20; und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Schutzgruppe vom C-Terminus.
Verbindung nach Anspruch 7, die dargestellt wird durch die Formel: D-E-(R')_m'-(R²)_n-B (VI) worin D eine Maleinimido-Gruppe ist; E ist ein Spacer; (m' + n) ist eine ganze Zahl von 5 bis 20; R¹ ist ein Tyrosinsulfat-Rest; jedes R² ist ein Aminosäure-Rest, der keinen starken Säure-Rest aufweist, wobei jede Seitenkette des Aminosäure-Restes eine reaktionsfähige Gruppe aufweist, ausgewählt aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Amino-Gruppe, einer Imino-Gruppe und einer Thiol-Gruppe, wobei die reaktionsfähige Gruppe geschützt werden kann; n ist eine ganze Zahl von 1 bis 16; und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Schutzgruppe vom C-Terminus.
Reagens zum Messen eines in einer Probe zu messenden Analyten, der von einem Lebendkörper abgenommen wird, wobei das Reagens ein kombiniertes Produkt nach Anspruch 6 aufweist.
Reagens zum Messen eines in einer Probe zu messenden Analyten, der von einem Lebendkörper abgenommen wird, wobei das Reagens ein kombiniertes Produkt nach Anspruch 8 aufweist.