DE69628626T2

DE69628626T2 - Verfahren zur Reinigung und Übertragung von sequenzierten DNA-Proben nach Trenn-/Feststellungssystem und Platte dafür

Info

Publication number: DE69628626T2
Application number: DE69628626T
Authority: DE
Inventors: Yoshihide Tsukuba-shi Hayashizaki
Original assignee: INST OF PHYSICAL AND CEMICAL R; INSTITUTE OF PHYSICAL AND CEMICAL RESEARCH (RIKEN) WAKO
Current assignee: INST OF PHYSICAL AND CEMICAL R; INSTITUTE OF PHYSICAL AND CEMICAL RESEARCH (RIKEN) WAKO
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1996-12-07
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2016-12-08
Also published as: DE69628626D1; CA2192262A1; US5856100A; EP0776700A1; DE69628626T3; EP0776700B1; CA2192262C; EP0776700B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Platte zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem. Die Platte der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, zu einer Zeit (gleichzeitig) eine Vielzahl von in Bohrungen einer Mehrfach-Reaktionsplatte hergestellten Reaktionsprodukten zu einem Analysator zu überführen, der eine großen Anzahl von Kapillaren verwendet, wie beispielsweise ein auf Elektrophorese basierender Analysator.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben, welches von der oben erwähnten Platte Gebrauch macht, ein Verfahren zur Aufreinigung von DNA-Sequenzierungsproben, welches selbiges nutzt, und ein Verfahren zur Reinigung und Überführung von DNA-Sequenzierungsproben, welches selbige nutzt.
Durch jüngste ausgeprägte Entwicklungen von Verfahren zur DNA-Erkennung, welche von Laserfluoreszenz Gebrauch machen, fanden Laserfluoreszenz-Sequenzierer eine breite Verwendung als sehr nützliche Apparate. Die Entwicklungen derartiger Techniken ermöglichte auch die Analyse einer großen Anzahl von Proben in beispielsweise Genomforschungen und DNA-Diagnosen (ungefähr 100 Bahnen oder weniger/2 Arbeitsgänge/Tag/Apparat). Typische Beispiele solcher Laser-Sequenzierer sind diejenigen, die Plattengele oder Kapillargele verwenden.
Des Weiteren sind Apparate mit einer größeren Anzahl an Elektrophoresebahnen (z. B. 200 bis 1000 Bahnen/Arbeitsgang) in der Entwicklung, um Proben in einer weit größeren Anzahl zu analysieren, als dies mit den derzeitigen Techniken möglich ist. Als Beispiele für solche Apparate können Multikapillar-Sequenzierer genannt werden.
Jedoch wird, wenn die Anzahl der Bahnen steigt, der Arbeitsschritt des Überführens der Proben auf die Bahnen zeitaufwendiger und beschwerlicher. Das heißt, wenn eine große Anzahl von Proben auf jede der Kapillargele beladen wird, sollte jede Probe in jede Kapillare injiziert werden indem ein Ende der Kapillaren mit einem feinen Elektrodenkabel in Kontakt gebracht wird. Deswegen wird die Entwicklung einer Technik, die ein verkürztes und einfaches Überführen einer großen Anzahl von Proben ermöglicht, als dringendes Erfordernis angesehen.
Weiterhin erfordert das Einfüllen von Reaktionslösungen in die Bohrungen von Mikro-Titerplatten ebenfalls mehr Zeit, wenn die Anzahl der Bohrungen steigt. Daher, ist eine Methode zum Einfüllen von Reaktionslösungen in Bohrungen innerhalb kurzer Zeit ebenfalls erwünscht.
Des weiteren liegen in Reaktionsprodukten der DNA-Sequenzierung Fragmente verschiedener Längen, die mit fluoreszierenden Substanzen oder ähnlichem markiert sind, neben nicht reagiertem Markierungs-Reagens vor. Ein großer Teil dieses koexistierenden, nicht reagierten Markierungs-Reagens wurde nicht in der Reaktion genutzt und liegt in dem Reaktionsgemisch in freier Form vor. Wenn eine solche Reaktionslösung unverändert bei der Elektrophorese eingesetzt wird, so wandert der in hoher Konzentration vorliegende Fluoreszenz-Marker gleichzeitig mit und erzeugt ein Signal, das deutlich stärker ist, als das der Zielsequenzen. Daraus resultiert, dass es unmöglich wird, die erwünschte Analyse durchzuführen. Dementsprechend sollte der Fluoreszenz-Marker vor der Trennung entfernt werden. Jedoch erfordert das Abtrennen des nicht reagierten Markierungs-Reagens hinsichtlich Hunderter von Proben sehr viel Arbeit und Zeit. Somit läge, auch wenn die Effizienz des DNA-Sequenzierungsverfahrens selbst verbessert würde, ein geschwindigkeitsbestimmender Faktor vor dem eigentlichen Sequenzieren vor.
Daher besteht das erste Ziel der vorliegenden Erfindung darin, eine Methode zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, Reaktionsmischungen in eine große Anzahl von Bohrungen in kurzer Zeit einfach einzufüllen.
Das zweite Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur einfachen Entfernung nicht reagierten Markierungs-Substanzen und ähnlichem in kurzer Zeit aus einer Vielzahl von DNA-Sequenzierungsproben, welche die Markierungs-Substanzen enthalten, bereit zu stellen.
Das dritte Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Methode zur Verfügung zu stellen, welche imstande ist, eine große Anzahl von DNA-Sequenzierungsproben in kurzer Zeit einfach in Elektrophorese-Kapillaren zu überführen.
Das vierte Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur einfachen Entfernung nicht reagierter Markierungs-Substanzen und ähnlichem in kurzer Zeit aus einer Vielzahl von DNA-Sequenzierungsproben, welche die Markierungs-Substanzen enthalten, zur Verfügung zu stellen; und welches des weiteren in der Lage ist, in einfacher Weise in kurzer Zeit eine große Anzahl von DNA-Sequenzierungsproben zu elektrophoretischen Kapillaren zu überführen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Reaktionsgefäßen, enthaltend eine Reaktionslösung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil zum Zusammenbauen von Reaktionsgefäßen, umfassend eine Basisplatte mit durchgehenden Löchern, die durch besagte Platte in Richtung ihrer Stärke hindurchgehen, in eine Reaktionslösung eingetaucht wird, um die durchgehenden Löcher mit der Reaktionslösung zu befüllen, und dann, eine der Öffnungen eines jeden Loches der oben genannten durchgehenden Löcher mit einer Membran abgedichtet wird, um die genannten Reaktionsgefäße zu vervollständigen.
Die zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem genutzte Platte, dadurch gekennzeichnet, dass die Platte eine Basisplatte mit durchgehenden Löchern umfasst, die durch die besagte Platte in Richtung ihrer Stärke hindurchgehen, und eine Membran zum Abdichten einer der Öffnungen eines jeden Loches der oben genannten durchgehenden Löcher.
Die dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung von nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, die in DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenzierungsproben in die durchgehenden Löcher der Platte entsprechend der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingefüllt sind; eine Druckdifferenz zwischen den verbleibenden Öffnungen der durchgehenden Löcher und der Außenseite der abdichtenden Membran aufgebaut wird, in einer derartigen Weise, dass die Membranseite einen Unterdruck aufweisen sollte, um die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben durch besagte Membran aus den Proben heraus zu transferieren.
Die vierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Entfernung von in DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen, nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass oben genannte DNA-Sequenzierungsproben in die durchgehenden Löcher der Platte gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingefüllt werden, und ein Potential zwischen besagten DNA-Sequenzierungsproben und der Außenseite der abdichtenden Membran angelegt wird, um besagte nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben durch diese Membran aus den Proben heraus zu transferieren.
Die fünfte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überführung von in die durchgehenden Löcher der Platte entsprechend der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingefüllten DNA-Sequenzierungsproben zu elektrophoretischen Kapillaren für ein Auftrennungs/Detektionssytem, in welchem eines der Enden einer jeden Kapillare der e lektrophoretischen Kapillaren in oben genannte DNA-Sequenzierungsproben eingeführt werden, und ein Potential zwischen den erwähnten elektrophoretischen Kapillaren und der Außenseite der abdichtenden Membran angelegt wird, um besagte DNA-Sequenzierungsproben zu den elektrophoretischen Kapillaren zu überführen.
Die sechste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenzierungsproben jeweils in die durchgehenden Löcher der Platte gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingefüllt werden, eines der Enden einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren in besagte DNA-Sequenzierungsproben, die in den durchgehenden Löchern enthalten sind, von den nicht abgedichteten Öffnungen aus eingetaucht wird, und die eingefüllten Inhalte von dem anderen Ende einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren aus in die elektrophoretische Kapillare hineingesaugt werden, um die in besagten DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen Zielsubstanzen zu den elektrophoretischen Kapillaren zu überführen.
Die siebte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von DNA-Sequenzierungsproben und Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem, wobei das Verfahren die Entfernung von nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, die in den DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, und anschließend die Überführung der Zielsubstanzen, die in den DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, zu elektrophoretischen Kapillaren für das Auftrennungs-/Detektionssytem umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenzierungsproben in die jeweiligen durchgehenden Löcher der Platte gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingefüllt werden, eines der Enden einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren in besagte DNA-Sequenzierungsproben eingeführt wird, ein Potential angelegt wird zwischen der Außenseite der besagten Membran, die die mit den DNA-Sequenzierungsproben gefüllten durchgehenden Löcher abdichtet, und dem anderen Ende einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren, um nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen, die in besagten DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, durch die Membran aus den Proben heraus zu transferieren, und dann ein Potential angelegt wird zwischen der Außenseite besagter Membran und dem anderen Ende einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren, um besagte Zielsubstanzen in den DNA-Sequenzierungsproben zu den elektrophoretischen Kapillaren zu überführen.
Die achte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von DNA-Sequenzierungsproben und zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem, umfassend die Entfernung von nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, die in den DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, und anschließend Überführung der Zielsubstanzen, die in den DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, zu elektrophoretischen Kapillaren für das Auftrennungs-/Detektionssystem, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenzierungsproben in die jeweiligen durchgehenden Löcher einer Platte gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingefüllt werden, ein Druckunterschied zwischen den verbliebenen Öffnungen der durchgehenden Löcher und der Außenseite der abdichtenden Membran herbeigeführt wird, dergestalt, dass die Membranseite einen Unterdruck aufweisen sollte, um besagte nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben durch besagte Membran aus den Proben heraus zu überführen, anschließend eines der Enden jeder Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren in besagten DNA-Sequenzierungsproben eingeführt wird, und ein Potential angelegt wird zwischen der Außenseite der besagten Membran, welche die mit den DNA-Sequenzierungsproben befüllten durchgehenden Löcher abdichtet, und dem anderen Ende jeder Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren, um besagte Zielsubstanzen, die in besagten DNA-Sequenzierungsproben enthalten sind, zu den elektrophoretischen Kapillaren zu überführen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt eine schematische Querschnittsansicht zur Veranschaulichung eines Teils des Zusammenbaus des Reaktionsgefäßes und des Verfahrens zur Herstellung der Gefäße der vorliegenden Erfindung, die eine Reaktionsmischung enthalten, dar.
2 stellt eine schematische Querschnittsansicht einer Platte zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem der vorliegenden Erfindung dar.
3 ist eine schematische Querschnittsansicht zur Veranschaulichung des Verfahrens zur Abtrennung von nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung (Druckdifferenz-Verfahren).
4 veranschaulicht in einer schematischen Querschnittsansicht das Verfahren zum Entfernen nicht reagierer niedermolekularer Verbindungen (elektrisches Verfahren), sowie das Verfahren zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem (elektrisches Verfahren) entsprechend der vorliegenden Erfindung.
5 ist eine schematische Querschnittsansicht, die das Verfahren zum Entfernen nicht reagierter niedermolekularer Verbindungen entsprechend der vorliegenden Erfindung verdeutlicht (elektrisches Verfahren).
6 ist eine schematische Querschnittsansicht zur Veranschaulichung des Verfahrens zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben in ein Auftrennungs-/Detektionssytem entsprechend der vorliegenden Erfindung (Druckdifferenz-Verfahren).
7 ist eine schematische Ansicht zur Illustration des Verfahrens zur Auftren nung und Detektion mittels Elektrophorese.
8 ist eine schematische Ansicht zur Veranschaulichung des Verfahrens zum Entfernen nicht reagierter niedermolekularer Verbindungen (Druckdifferenz-Methode).
9 ist eine schematische Ansicht zur Veranschaulichung des Verfahrens zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben zu elektrophoretischen Kapillaren (elektrisches Verfahren).
10 zeigt die Sequenzierleiter eines Migrationsmusters, erhalten mittels eines Bildanalysegerätes.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Teil zum Zusammenbau von Reaktionsgefäßen und Verfahren zur Herstellung derselben (die erste Ausführungsform)
Das Teil zum Zusammenbau von Reaktionsgefäßen besteht aus einer Basisplatte mit durchgehenden Löchern, die durch diese Platte in Richtung ihrer Stärke hindurch gehen. Das Teil kann für die Herstellung von Reaktionsgefäßen, welche eine Reaktionslösung enthalten, verwendet werden. Es wird nachfolgend unter Bezugnahme auf 1 erklärt.
Das Teil zum Zusammenbau von Reaktionsgefäßen (20) besteht aus einer Basisplatte (22) mit durchgehenden Löchern (21), die durch die Platte in Richtung ihrer Stärke hindurch gehen. Die Basisplatte (22) kann beispielweise aus synthetischen Harzen, Glas oder ähnlichem hergestellt sein. Die Größe und die Stärke der Platte kann unter Berücksichtigung der Größe (Innendurchmesser und Tiefe) und der Anzahl der durchgehenden Löcher (21) geeignet ausgewählt werden. Die Größe (Innendurchmesser und Tiefe) und die Anzahl der durchgehenden Löcher (21) kann abhängig von der Verwendung der Platte genau definiert wer den. Der Innendurchmesser der durchgehenden Löcher (21) kann z. B. 0,05 bis 10 mm, vorzugsweise 0,5 bis 5 mm betragen. Die Tiefe der durchgehenden Löcher (21) kann beispielsweise 0,2 bis 200 mm betragen. Die Anzahl der durchgehenden Löcher (21) wird passend ausgewählt unter Berücksichtigung der Anzahl der elektrophoretischen Kapillaren, der Leistung und ähnlichen Eigenschaften des zu verwendenden Auftrennungs-/Detektionsapparates; obgleich je größer die Anzahl der Löcher ist, desto mehr Proben können gleichzeitig bearbeitet werden.
Gefäße, welche eine Reaktionslösung enthalten, können durch Eintauchen des oben genannten Teiles zum Zusammenbau von Reaktionsgefäßen (20) in eine Reaktionslösung (25) hergestellt werden, um die durchgehenden Löcher (21) mit der Lösung (25a) zu füllen, und nachfolgendem Abdichten einer der Öffnungen eines jeden durchgehenden Loches mit einer Membran (23), um das Reaktionsgefäß (24) zu erhalten.
Die Art der Reaktionslösung ist nicht besonders beschränkt und kann abhängig von der Zweckbestimmung ausgewählt werden. So kann es sich beispielsweise um eine Pufferlösung handeln, die verschiedene Arten von Enzymen enthält.
Platte zur Überführung in ein Auftrennungs-/Detektionssytem (die zweite Ausführungsform)
Die Platte zur Überführung in ein Auftrennungs-/Detektionssystem der vorliegenden Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf 2 erklärt.
Eine Platte zur Überführung in ein Auftrennungs-/Detektionssytem (1) besteht aus einer Basisplatte (3) mit durchgehenden Löchern (2), die durch die Platte in Richtung ihrer Stärke hindurchgehen, und einer Membran (5), welche zum Abdichten einer der Öffnungen (4) eines jeden durchgehenden Loches (2) vorgesehen ist.
Die Platte kann beispielsweise aus synthetischen Harzen, Glas oder ähnlichem hergestellt sein, und die Größe und die Stärke dieser Platte kann unter Berücksichtigung der Größe (Innendurchmesser und Tiefe) und der Anzahl der durchgehenden Löcher (2) geeignet ausgewählt werden.
Die Größe (Innendurchmesser und Tiefe) und die Anzahl der durchgehenden Löcher (2) kann ebenfalls unter Berücksichtigung der Verwendung der Platte geeignet gewählt werden. Der Innendurchmesser der durchgehenden Löcher (2) kann beispielsweise 0,1 bis 5 mm betragen, und die Tiefe der durchgehenden Löcher kann beispielsweise 0,2 bis 200 mm betragen. Die Anzahl der durchgehenden Löcher (2) wird passend ausgewählt in Abhängigkeit von der Anzahl der elektrophoretischen Kapillaren, der Leistung und ähnlichem eines zu verwendenden Auftrennungs-/Detektionsapparates; obgleich je größer die Anzahl der Löcher ist, desto mehr Proben können gleichzeitig bearbeitet werden.
Das Material der Membran (5) kann geeignet zur Verwendung der Platte ausgewählt werden. So kann z. B., wenn Zielsubstanzen in DNA-Sequenzierungsproben elektrisch zu den elektrophoretischen Kapillaren überführt werden, die Membran (5) aus einem Material bestehen, das bei Kontakt mit einem Elektrolyten zur elektrischen Leitung befähigt ist. Es kann z. B. eine als Separationsmembran bei der Molekularsiebung genutzte Membran sein, wie z. B. Ultrafiltrationsmembranen.
Wenn Zielsubstanzen in DNA-Sequenzierungsproben durch Nutzung einer Druckdifferenz zu den elektrophoretischen Kapillaren überführt werden, kann die Membran (5) ein flüssigkeitsdurchlässiges Material sein, wie beispielsweise eine Membran aus Cellophan, Polyethersulfon oder ähnlichem.
Wenn nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben auf elektrischem Wege durch die Membran (5) aus dem System entfernt werden, kann die Membran (5) ein Material sein, das die niedermolekularen Verbindungen, nicht jedoch Reaktionsprodukte, d. h. DNA-Fragmente, hindurch lässt. Beispielsweise kann eine Ultrafiltrationsmembran verwendet werden.
Des weiteren kann, wenn die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben, auf elektrischem Wege durch die Membran (5) aus dem System entfernt werden, und anschließend die Zielsubstanzen in den DNA-Sequenzierungsproben auf elektrischem Wege zu den elektrophoretischen Kapillaren überführt werden, die Membran (5) ein Material sein, das die niedermolekularen Verbindungen, nicht jedoch Reaktionsprodukte, d. h. DNA-Fragmente, hindurch lässt, und welches bei Kontakt mit einem Elektrolyten zur elektrischen Leitung befähigt ist. Als eine derartige Membran kann beispielsweise eine Ultrafiltrationsmembran angewandt werden.
Als Ultrafiltrationsmembran der Platte der vorliegenden Erfindung kann eine Polyethersulfon-Membran verwendet werden.
Verfahren zum Entfernen nicht reagierter niedermolekularer Verbindungen (Druckdifferenz-Verfahren) (die dritte Ausführungsform)
Das Verfahren wird nachfolgend unter Bezugnahme auf 3 erklärt.
Sobald die durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) der vorliegenden Erfindung mit DNA-Sequenzierungsproben (7) befällt sind, wird ein Druckunterschied zwischen den Öffnungen (2a) der durchgehenden Löcher und der Außenseite der Membran (5) bereitgestellt, so dass die Außenseite der Membran (5) einen Unterdruck aufweisen sollte. Insbesondere kann der Druckunterschied derart erzeugt werden, dass die Außenseite der Membran (5) einen Unterdruck aufweisen sollte, indem ein Vakuumbehälter (20) auf der Platte (1) an der Membranseite bereitgestellt wird und darin der Druck verringert wird. Die nicht reagierten nie dermolekularen Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben können zusammen mit anderen niedermolekularen Verbindungen wie Wasser, durch die Membran (5) aus den Proben heraus überführt werden.
Verfahren zum Entfernen nicht reagierer niedermolekularer Verbindungen (elektrisches Verfahren) (die vierte Ausführungsform)
Die vierte Ausführungsform kann beispielhaft durch die folgenden zwei Verfahren beschrieben werden.
In dem ersten Verfahren werden die Enden der elektrophoretischen Kapillaren in die jeweiligen DNA-Sequenzierungsproben eingeführt, wobei die anderen Enden der genannten Kapillaren mit einem Elektrolyten in Kontakt gebracht werden, der eine Elektrode (10) aufweist; die abdichtende Membran wird mit einem Elektrolyten in Kontakt gebracht, mit dem wiederum eine Elektrode (9) in Kontakt steht; und zwischen den Elektroden (9) und (10) wird ein Potential angelegt. Das Verfahren, bei welchem eine Elektrode in die DNA-Sequenzierungsprobe eingetaucht wird, ist in 4 gezeigt.
Sobald eines der Enden (6a) jeder elektrophoretischen Kapillare (6) in die DNA-Sequenzierungsprobe (7), die in jedes der durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) eingefüllt ist, eingetaucht ist, wird zwischen der Außenseite der Membran (5) und dem anderen Ende (6b) der Kapillare (6) ein Potential angelegt, so dass das andere Ende (6b) der Kapillare eine Kathode sein sollte. Das Potential kann angelegt werden, indem eine Elektrode (9) als Anode und eine Elektrode (10) als Kathode verwendet wird, und indem die Membran (5) in Kontakt gebracht wird mit einem Elektrolyten (8), in welchen die Elektrode (9) eingetaucht ist, und das andere Ende (6b) der elektrophoretischen Kapillare (6) wird mit einem Elektrolyten (11) in Kontakt gebracht, in welchen die Elektrode (10) eingetaucht wird.
Auf diese Weise können die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen innerhalb der DNA-Sequenzierungsprobe (7) durch die Membran (5) hindurch aus der Probe überführt werden. Obwohl 4 den oben beschriebenen Arbeitsgang für nur eines der durchgehenden Löcher (2) zeigt, kann der Arbeitsgang der Überführung der niedermolekularen Verbindungen für eine Vielzahl der durchgehenden Löcher oder alle durchgehenden Löcher (2) gleichzeitig ausgeführt werden.
In dem zweiten Verfahren werden Elektroden in die jeweiligen DNA-Sequenzierungsproben eingeführt; die abdichtende Membran wird in Kontakt gebracht mit einem Elektrolyten, mit welcher wiederum eine Elektrode in Verbindung steht; und ein Potential wird angelegt zwischen den in die DNA-Sequenzierungsproben eingeführten Elektroden und der Elektrode, die mit dem Elektrolyten in Verbindung steht. Dieses Verfahren wird unter Bezugnahme auf 5 erklärt.
Wenn eine Elektrode (12) eingetaucht wird in die DNA-Sequenzierungsprobe (7), die in die durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) eingefüllt ist, wird ein Potential zwischen der Außenseite der Membran (5) und einer Elektrode (12) angelegt, dergestalt, dass die Elektrode (12) eine Kathode darstellen sollte. Auf diese Weise können die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen in der DNA-Sequenzierungsprobe (7) ebenfalls durch die Membran (5) hindurch aus der Probe (7) transferiert werden. Obgleich 5 den oben beschriebenen Arbeitsgang für nur eines der durchgehenden Löcher (2) zeigt, kann der Arbeitsgang zum Transferieren der niedermolekularen Verbindungen für eine Vielzahl der durchgehenden Löcher oder alle durchgehenden Löcher (2) gleichzeitig durchgeführt werden.
In dem oben beschriebenen Verfahren werden nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben innerhalb einer Vielzahl von durchgehenden Löchern oder allen durchgehenden Löchern, gleichzeitig durch die Membran (5) aus der Probe transferiert, indem die gesamte Oberfläche der Membran (5) der Platte (1) mit dem Elektrolyten (8) in Kontakt gebracht wird, jede Elektrode (12) oder jede Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die Probe innerhalb jedes der durchgehenden Löcher eingetaucht und ein Potential angelegt wird.
Verfahren zum Transfer in ein Auftrennungs-/Detektionssytem (elektrisches Verfahren (die fünfte Ausführungsform)
Dieses Verfahren dient zur Überführung der DNA-Sequenzierungsproben, die in die durchgehenden Löcher der Platte der vorliegenden Erfindung eingefüllt sind, in jede der elektrophoretischen Kapillaren zur Auftrennung und Detektion. Das Verfahren wird unter Bezugnahme auf 4 erläutert.
Sobald eines der Enden (6a) jeder Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die DNA-Sequenzierungsprobe (7), die in die durchgehenden Löcher eingefüllt ist, eingetaucht wird, wird zwischen der Außenseite der Membran (5) und dem anderen Ende (6b) der Kapillare (6) ein Potential angelegt. Wie in 4 gezeigt, kann das Potential zwischen der als eine Kathode genutzten Elektrode (9) und der als eine Anode genutzten Elektrode (10) angelegt werden, während die Membran (5) mit einem Elektrolyten (8) in Kontakt gebracht wird, in welchen die Elektrode (9) eingetaucht ist, und das andere Ende (6b) der Kapillare (6) mit einem Elektrolyten (11) in Kontakt gebracht wird, in welchen die Elektrode (10) eingetaucht ist.
Dieses elektrische Injektionsverfahren kann in jedem Fall angewendet werden, ob nun der eingefüllte Inhalt der elektrophoretischen Kapillaren (Auftrennungssystem) aus einer Polymerlösung oder einem Acrylamid-Gel besteht. Eine elektrische Spannung von 1 bis 10 kV wird zwischen der Elektrode (9) und der Elektrode (10) für eine bis zu mehreren zehn Sekunden angelegt, um die Injektion elektrophoretisch durchzuführen.
Auf diese Weise können die Zielsubstanzen in den DNA-Sequenzierungsproben (7) zu jeder der elektrophoretischen Kapillaren (6) transferiert werden (um Ende (6a) herum).
Obgleich 4 den oben genannten Arbeitsgang für nur eines der durchgehenden Löcher (2) zeigt, werden die Zielsubstanzen in den DNA-Sequenzierungsproben innerhalb einer Vielzahl der durchgehenden Löcher oder aller durchgehenden Löcher, gleichzeitig in die Kapillaren transferiert, indem die gesamte Oberfläche der Membran (5) der Platte (1) mit einem Elektrolyten (8) in Kontakt gebracht und das andere Ende (6b) jeder elektrophoretischen Kapillare (6) an der Anodenseite platziert wird.
Verfahren zum Transfer zum Auftrennungs-/Detektionssytem (Druckdifferenzverfahren (die sechste Ausführungsform)
Dieses Verfahren dient zur Überführung der DNA-Sequenzierungsproben, welche in die durchgehenden Löcher der Platte der vorliegenden Endung eingefüllt sind, zu jeder der elektrophoretischen Kapillaren zur Auftrennung und Detektion. Das Verfahren wird durch Bezugnahme auf 6 erläutert.
Sobald die DNA-Sequenzierungsprobe (7) in die durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) eingefüllt wird, wird eines der Enden (6a) einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren (6) von der Öffnung des durchgehenden Loches (2) her in die DNA-Sequenzierungsprobe (7) in dem durchgehenden Loch (2) eingetaucht. Dann wird der eingefüllte Inhalt (6c) (z. B. eine Polymerlösung) in der elektrophoretischen Kapillare (6) von dem anderen Ende (6b) der elektrophoretischen Kapillare (6) her angesaugt. Auf diese Weise können die in der DNA-Sequenzierungsprobe (7) enthaltenen Zielsubstanzen in die elektrophoretische Kapillare (6) überführt werden.
Die Zielsubstanzen, die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) in jedem der durchgehenden Löcher (2) enthalten sind, können zu jeder der elektrophoretischen Kapillaren gleichzeitig transferiert werden, indem jede der elektrophoretischen Kapillaren (6) in jedes der jeweiligen durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) eingetaucht und sie angesaugt werden.
Verfahren zum Transfer zum Reinigungs-/Auftrennungs-/Detektionssytem (die siebte Ausführungsform)
Dieses Verfahren dient der Entfernung nicht reagierter niedermolekularer Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben und dem nachfolgenden Überführen der Zielsubstanzen in den DNA-Sequenzierungsproben zur Auftrennung und Detektion zu elektrophoretischen Kapillaren. In diesem Verfahren, werden eines der oben genannten Verfahren zur Entfernung von nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen in den DNA-Sequenzierungsproben sowie eines der oben genannten Verfahren zur Überführung der DNA-Sequenzierungsproben zu einem Auftrennungs-/Detektionssytem aufeinander folgend durchgeführt.
Beispielsweise wird das Verfahren der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Entfernen niedermolekularer Verbindungen verwendet.
Wie in 4 gezeigt, wird nämlich sobald eines der Enden (6a) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die DNA-Sequenzierungsprobe (7), welche in die durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) der vorliegenden Erfindung eingefüllt ist, eingetaucht wird ein Potential zwischen der Außenseite der Membran (5) und dem anderen Ende (6b) der Kapillare (6) angelegt, so dass das andere Ende (6b) eine Kathode darstellen sollte, um die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen in der DNA Sequenzierungsprobe (7) durch die Membran (5) hindurch aus den Proben zu transferieren.
Anschließend wird das Verfahren der fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angewendet, um die Proben zu überführen.
Das heißt, die Zielsubstanzen in der DNA-Sequenzierungsprobe (7) werden zu der elektrophoretischen Kapillare (6) überführt durch Anlegen eines Potentials zwischen der Außenseite der Membran (5) und dem anderen Ende (6b) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren, so dass das andere Ende (6b) eine Anode darstellen sollte.
Das Entfernen der niedermolekularen Verbindungen und der Transfer der Zielsubstanzen kann ohne Schwierigkeit durchgeführt werden, indem die Polarität der Elektroden (9) und (10) umgekehrt wird. Jedoch wird der Elektrolyt (8), welcher die durch die Membran (5) transferierten nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen enthält, vorzugsweise vor dem Transfer der Zielsubstanzen gewechselt, um die niedermolekularen Verbindungen an einer Rückkehr in die Probe (7) zu hindern.
Verfahren zum Transfer zu einem Reinigungs-/Auftrennungs-/Detektionssytem (die achte Ausführungsform)
Dieses Verfahren dient der Entfernung der in den DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen und der Überführung der in den DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen Zielsubstanzen zu elektrophoretischen Kapillaren zur, Auftrennung und Detektion. In diesem Verfahren, werden eines der oben genannten Verfahren zur Entfernung in den DNA-Sequenzierungsproben enthaltener nicht reagierter niedermolekularer Verbindungen sowie eines der oben genannten Verfahren zum Transfer der DNA-Sequenzierungsproben zu einem Auftrennungs-/Detektionssytem aufeinander folgend durchgeführt.
Beispielsweise wird das Verfahren der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Entfernen niedermolekularer Verbindungen eingesetzt.
Nämlich wird, wie in 3 veranschaulicht, sobald die durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) der vorliegenden Erfindung mit der DNA-Sequenzierungsprobe (7) befällt sind, eine Druckdifferenz zwischen den Öffnungen (2a) der durchgehenden Löcher und der Außenseite der Membran (5) bereitgestellt, so dass die Außenseite der Membran (5) einen Unterdruck aufweisen sollte. Insbesondere kann der Druckunterschied derart zur Verfügung gestellt werden, dass die Außenseite der Membran (5) einen Unterdruck aufweisen sollte, indem auf der Platte (1) an der Membranseite (5) ein Vakuumbehälter (20) bereitgestellt und der Druck darin reduziert wird. Die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen in der DNA-Sequenzierungsprobe können zusammen mit den anderen niedermolekularen Verbindungen wie z. B. Wasser durch die Membran (5) hindurch aus den Proben heraus transferiert werden.
Anschließend wird das Verfahren der fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Transfer der Probe verwendet.
Das heißt, dass, wie in 4 gezeigt, sobald eines der Enden (6a) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die DNA-Sequenzierungsprobe (7), die in die durchgehenden Löcher (2) der Platte (1) der vorliegenden Erfindung eingefüllt ist, eingetaucht wird, wird ein Potential zwischen der Außenseite der Membran (5) und dem anderen Ende (6b) der Kapillare (6) angelegt, um die in der DNA-Sequenzierungsprobe (7) enthaltenen Zielsubstanzen in das Innere der elektrophoretischen Kapillaren (6) zu überführen.
Die DNA-Sequenzierungsproben, der in der vorliegenden Erfindung zu behandelnde Gegenstand, können beispielsweise Produkte einer großen Anzahl von chemischen oder enzymatischen Reaktionen sein (96 oder mehr Reaktionen/Platte/Arbeitsgang), hergestellt in einer großen Anzahl von Räumen (Bohrungen, Löcher, etc.). Die Art, die Anzahl und ähnliches der Reaktionen sind nicht besonders beschränkt. Beispielsweise können die DNA- Sequenzierungsproben Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen sein, welche in den durchgehenden Löchern der Platte der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, oder Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen, welche in den Vertiefungen einer herkömmlichen Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Des weiteren können Sanger-Reaktionen unter Verwendung von Dideoxynucleotiden, DNA-Zyklus-Sequenzierung, durchgeführt unter Verwendung von PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) und ähnliche als Beispiele für die DNA-Sequenzierungsreaktionen angeführt werden.
Werden die DNA-Sequenzierungsreaktionen in den Räumen durchgeführt, die in den durchgehenden Löchern der Platte der vorliegenden Erfindung gebildet werden, so findet vorzugsweise die folgende Vorgehensweise Anwendung.
Zuerst werden Reagenzien und Enzyme, jedoch andere als jene, die für jedes durchgehende Loch von unterschiedlicher Art sein müssen (z. B. Templat-DNA und ähnliche), wie etwa Reaktionsenzym (thermostabile Polymerase und ähnliches), Reaktionspuffer und ähnliche zusammen in jedes durchgehende Loch des Teiles zum Zusammenbau des Reaktionsgefäßes eingefüllt, wie in der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutert.
Das heißt, eine gewisse vorbestimmte Menge einer Reagens- und/oder Enzym-Lösung kann in jedes der durchgehenden Löcher eingefüllt werden, indem das Teil zum Zusammenbau der Reaktionsgefäße einfach in die Reagens- und/oder Enzym-Lösung eingetaucht wird und das Teil danach wieder aus der Lösung herausgezogen wird. Ist die Platte mit zwei oder mehr Arten von Löchern unterschiedlicher Größen ausgerüstet, so können Reaktionsgefäße ausgebildet werden, die in der Lage sind, unterschiedliche Mengen an Reagens- und/oder Enzym-Lösung einzuschließen. Anschließend wird eine Membran mit geeigneter Permeabilität auf eine Oberfläche der Platte des Teiles aufgebracht, um eine Platte zu vervollständigen, welche die Reagens- und/oder Enzym-Lösung in ihren durchgehenden Löchern zurückhält.
Die erhaltene Platte kann nun für gewünschte Reaktionen, wie z. B. DNA-Sequenzierungsreaktionen oder ähnliche genutzt werden.
Als in den Gefäßen durchgeführte Reaktionen sind Sequenzierungsreaktionen, welche bei 37°C und unter Nutzung von DNA-Polymerase durchgeführt werden, vorteilhaft aufgrund der Eigenschaft der Membran, die Reaktionslösung zurückzuhalten. Diese Technik der vorliegenden Erfindung vereinfacht in extremer Weise das Verfahren des ersten Einfüllens der Reagens- und/oder Enzym-Lösung in multiple Reaktionsräume.
Anstatt diese Technik zu benutzen, kann jedoch die Reagens- und/oder Enzym-Lösung auch einzeln eingefüllt werden.
Die Zielsubstanzen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu elektrophoretischen Kapillaren überführt wurden, können mittels herkömmlicher Methoden aufgetrennt und detektiert werden. Als eine solche herkömmliche Methode kann die auf DNA-Kapillarelektrophorese basierende DNA-Sequenzierungstechnik erwähnt werden. Als ein für die DNA-Kapillarelektrophorese genutztes DNA-Auftrennungssystem können beispielsweise die in einer gitterartigen Anordnung bereitgestellten Kapillarbahnen (31) verwendet werden, in welchen die Kapillarbahnen regelmäßig dreidimensional (beispielsweise wie parallele Säulen) angeordnet sind, wie in 7 gezeigt wird. Die gitterartige Anordnung der Kapillaren kann der Anordnung der durchgehenden Löcher (33) der mit vielen durchgehenden Löchern versehenen Platte (32) der vorliegenden Erfindung entsprechen, so dass jede Kapillare korrekt in das jeweils entsprechende durchgehende Loch (33) der mit vielen durchgehenden Löchern versehenen Platte (32) eingeführt werden sollte.
Die (nicht gezeigte) Membran, welche an der unteren Oberfläche der mit den Kapillaren versehenen Multi-durchgehendes Loch-Platte (32) angebracht ist, wird mit der oberen Oberfläche eines in einem kathodischen elektrophoretischen Bad (34) enthaltenen Puffers in Kontakt gebracht. Zwischen dem kathodischen elektrophoretischen Bad (34) und einem anodischen elektrophoretischen Bad (35), in welches das andere Ende jeder Kapillare eintgetaucht wird, wird mittels einer Spannungsquelle (36) ein Potential angelegt. Auf diese Weise werden alle in der Multi-durchgehendes Loch-Platte (32) enthaltenen Zielsubstanzen elektrophoretisch in die Kapillaren injiziert. Daraufhin werden die Zielsubstanzen elektrophoretisch aufgetrennt und die abgetrennten Fragmente mittels eines Detektors (37) detektiert. Der Detektor wird in Abhängigkeit der Art des an den Fragmenten angelagerten Markers ausgewählt. Beispielsweise wird ein Fluoreszenzdetektor verwendet, wenn es sich bei dem Marker um einen Fluoreszenzmarker handelt, und ein Bildanalysegerät kann für einen RI-Marker verwendet werden.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, welches in der Lage ist, Reaktionslösungen in eine große Anzahl von Bohrungen in kurzer Zeit einfach einzufüllen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann auch ein Verfahren zum einfachen Entfernen von nicht reagierten niedermolekularen Marker-Substanzen und ähnlichem in kurzer Zeit aus einer Vielzahl von DNA-Sequenzierungsproben, die Marker-Substanzen und ähnliches enthalten, zur Verfügung gestellt werden.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann auch ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, welches fähig ist, eine großen Anzahl von DNA-Sequenzierungsproben in kurzer Zeit zu elektrophoretischen Kapillaren einfach zu überführen.
Des weiteren kann, entsprechend der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum einfachen Entfernen von nicht reagierten Marker-Substanzen und ähnlichem in kurzer Zeit aus einer Vielzahl von DNA-Sequenzierungsproben, die die Marker-Substanzen und ähnliches enthalten, und welches in der Lage ist, eine große Anzahl von DNA-Sequenzierungsproben in kurzer Zeit zu elektrophoretischen Kapillaren einfach zu überführen, zur Verfügung gestellt werden.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung von Reaktionsgefäßen, enthaltend eine Reaktionslösung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil, umfassend eine Basisplatte (20) mit durchgehenden Löchern (21), die durch diese Platte in Richtung ihrer Stärke hindurch gehen, in eine Reaktionslösung (25) eingetaucht wird, um die durchgehenden Löcher mit der Reaktionslösung (25a) zu füllen und dann eine der Öffnungen eines jeden Loches, der oben genannten durchgehenden Löcher (21), mit einer Membran, die eine geeignete Permeabilität aufweist, abgedichtet wird, um die Reaktionsgefäße (24) zu vervollständigen.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionslösung eine Pufferlösung ist, die ein Enzym enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Füllen der Reaktionsgefäße DNA-Sequenzierungsreaktionen durchgeführt werden und anschließend nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen, die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthalten sind, entfernt werden, wobei eine Druckdifferenz zwischen den verbliebenen Öffnungen (2a) der durchgehenden Löcher (2) und der Außenseite der abdichtenden Membran (5) so angelegt wird, dass an der Außenseite der Membran ein Unterdruck entsteht, um die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen aus den Proben durch die Membran (5) zu transferieren.
Das Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach Durchführung der DNA-Sequenzierungsreaktionen und nach Entfernung der nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, die DNA-Sequenzierungsproben (7) zu einem Auftrennungs-/Detektionssystem transferiert werden, wobei jeweils eines der Enden (6a) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die in den durchgehenden Löchern (2) enthaltenen DNA-Sequenzierungsproben (7) über die nicht verschlossenen Öffnungen eingeführt wird und der jeweilige Inhalt von dem anderen Ende (6b) einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren in die elektrophoretischen Kapillaren (6) angesaugt wird, um die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen Zielsubstanzen zu den elektrophoretischen Kapillaren zu transferieren.
Ein Verfahren zur Entfernung von in DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenzierungsproben eingefüllt werden in die durchgehenden Löcher (2) der Basisplatte (1), die durch diese Platte in Richtung ihrer Stärke hindurch gehen, und eine Membran (5) mit einer geeigneten Permeabilität zur Abdichtung einer Öffnung eines jeden Loches der durchgehenden Löcher (2) umfasst, und dass ein Potential zwischen den DNA-Sequenzierungsproben (7) und der Außenseite der abdichtenden Membran angelegt wird, um die in den DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen durch diese Membran (5) aus den Proben zu transferieren.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Enden (6a) der elektrophoretischen Kapillaren (6) in die jeweilige DNA-Sequenzierungsprobe (7) eingeführt werden, und wobei die anderen Enden (6b) der Kapillaren (6) mit einem Elektrolyten (11) in Kontakt gebracht wird, der in Verbindung mit einer Elektrode (10) steht; und wobei die abdichtende Membran (5) mit einem Elektrolyten (8) in Kontakt gebracht wird, der in Verbindung mit einer Elektrode (9) steht, und wobei ein Potential zwischen den Elektroden (10) und (9) angelegt wird; oder wobei Elektroden (12) in die jeweilige DNA-Sequenzierungsprobe (7) eingeführt werden; wobei die abdichtende Membran (5) mit einem Elektrolyten (8) in Kontakt gebracht wird, der in Kontakt mit einer Elektrode (10) steht; und ein Potential zwischen den Elektroden (12), die in die DNA-Sequenzierungsproben (7) eingeführt sind, und der Elektrode (10), die mit dem Elektrolyten (8) in Kontakt steht, angelegt wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 6, wobei die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen nicht reagierte Fluoreszenz markierte Verbindungen sind.
Ein Verfahren zum Überführen von DNA-Sequenzierungsproben (7), die jeweils in die durchgehenden Löcher (2) einer Basisplatte (1), die durch diese Platte in Richtung ihrer Stärke hindurch gehen, eingefüllt sind, und eine Membran (5) mit einer geeigneten Permeabilität zur Abdichtung einer der Öffnungen eines jeden Loches der durchgehenden Löcher (2) umfasst, zu den elektrophoretischen Kapillaren (6) eines Auftrennungs-/Detektionssystems, wobei eines der Enden (6a) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die DNA-Sequenzierungsproben (7) eingeführt werden und ein Potential zwischen den elektrophoretischen Kapillaren (6) und der Außenseite der abdichtenden Membran angelegt wird, um die DNA-Sequenzierungsproben (7) zu den elektrophoretischen Kapillaren (6) zu überführen.
Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die DNA-Sequenzierungsproben Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen sind, die durchgeführt wurden in den durchgehenden Löchern (2, 21) einer Basisplatte (1, 20), die durch die Platte in der Richtung ihrer Stärke hindurch gehen, umfassend eine Membran (5, 23) zum Abdichten einer der Öffnungen eines jeden Loches der durchgehenden Löcher (2, 21) oder Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen sind, die in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden.
Ein Verfahren zur Reinigung und zur Überführung von DNA-Sequenzierungsproben (7) zu einem Auftrennungs-/Detektionssystem, umfassend die Entfernung der in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen und anschließendes Überführen der in den DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen Zielsubstanzen zu den elektrophoretischen Kapillaren des Auftrennungs-/Detektionssystems, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenzierungsproben eingefüllt sind in die durchgehenden Löcher (2) einer Basisplatte (1), die durch diese Platte in der Richtung ihrer Stärke hindurch gehen, umfassend eine Membran (5) mit einer geeigneten Permeabilität zum Abdichten einer der Öffnungen eines jeden Loches der durchgehenden Löcher (2) und als ersten Schritt eines der Enden (6a) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren in die DNA-Sequenzierungsproben (7) eingeführt werden, ein Potential angelegt wird zwischen der Außenseite der Membran (5), die die durchgehenden Löcher (2) abdichtet, die mit den DNA-Sequenzierungsproben (7) befällt sind, und dem anderen Ende (6b) einer jeden Kapillare (6) der elektrophoretischen Kapillaren, um in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltene nicht reagierte niedermolekulare Verbindungen durch die Membran (5) aus den Proben zu transferieren, oder wobei eine Druckdifferenz zwischen den verbliebenen Öffnungen der durchgehenden Löcher (2) und der Außenseite der abdichtenden Membran (5) in solch einer Weise angelegt wird, dass auf der Membranaußenseite ein Unterdruck herrscht, um die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen durch die Membran (5) aus den Proben zu transferieren und als zweiten Schritt ein Potential zwischen der Außenseite der Membran und dem anderen Ende (6b) einer jeden Kapillare der elektrophoretischen Kapillaren ange legt wird, um die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen Zielsubstanzen in die elektrophoretischen Kapillaren (6) zu überführen.
Ein Verfahren zur Entfernung von in DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenzierungsproben eingefüllt werden in die durchgehenden Löcher (2) der Basisplatte (1), die durch diese Platte in Richtung ihrer Stärke hindurch gehen und eine Membran (5) mit einer geeigneten Permeabilität, zur Abdichtung einer Öffnung eines jeden Loches der durchgehenden Löcher (2) umfaßt, und dass eine Druckdifferenz zwischen den DNA-Sequenzierungsproben (7) und der Außenseite der abdichtenden Membran angelegt wird, um die in den DNA-Sequenzierungsproben enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen durch diese Membran (5) aus den Proben zu transferieren.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Sequenzierungsprobe eine Reaktionslösung darstellt, die eine ein Enzym enthaltende Pufferlösung ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei nach dem Befüllen der Proben DNA-Sequenzierungsreaktionen durchgeführt werden und dann die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen niedermolekularen Verbindungen entfernt werden, und wobei eine Druckdifferenz zwischen den verbliebenen Öffnungen (2a) der durchgehenden Löcher (2) und der Außenseite der abdichtenden Membran (5) in solch einer Weise angelegt wird, dass auf der Membranaußenseite ein Unterdruck herrscht, um die in den DNA-Sequenzierungsproben (7) enthaltenen nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen durch die Membran (5) aus den Proben zu überführen.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 13, wobei die DNA-Sequenzierungsproben (7) nach Entfernung der nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen zu einem Auftrennungs-/Detektions-system überführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei die nicht reagierten niedermolekularen Verbindungen nicht reagierte Fluoreszenz markierte Verbindungen sind.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei die DNA-Sequenzierungsproben Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen sind, die durchgeführt wurden in den durchgehenden Löchern (2, 21) einer Basisplatte (1, 20), die durch die Platte in der Richtung ihrer Stärke hindurch gehen, umfassend eine Membran (5, 23) zum Abdichten einer der Öffnungen eines jeden Loches der durchgehenden Löcher (2, 21), oder Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen sind, die in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden.