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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein einen Rezeptorprotein-Tyrosin-Kinase(rPTK-) Liganden. Genauer
gesagt betrifft die Erfindung einen neuen Liganden mit der Bezeichnung "mit VEGF verwandtes
Protein" ("VEGF-related protein"; VRP) oder VH1,
der sich an den Flt4-Tyrosin-Kinase-Rezeptor (auch als Sal-S1-Rezeptor
bekannt) bindet und seine Phosphorylierung stimuliert, sowie die
Isolierung und rekombinante Produktion desselben.
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Beschreibung des Standes
der Technik
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Die Bildung neuer Blutgefäße entweder
aus differenzierenden Endothelzellen während der embryonalen Entwicklung
(Vaskulogenese) oder aus bereits bestehenden Gefäßen im Erwachsenenalter (Angiogenese) ist
ein wesentliches Merkmal der Organentwicklung, Reproduktion und
Wundheilung bei höheren
Organismen. Folkman und Shing, J. Biol. Chem. 267, 10931–10934 (1992);
Reynolds et al., FASEB J. 6, 886–892 (1992); Risau et al.,
Development 102, 471–478
(1988). Angiogenese ist auch für
bestimmte pathologische Prozesse erforderlich, darunter Tumorgenese
(Folkman, Nature Medicine 1, 27–31
(1995)) und Retinopathie (Millen et al., Am. J. Pathol. 145, 574–584 (1994)).
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Während
mehrere Wachstumsfaktoren die Angiogenese stimulieren können (Klagsbrun
und D'Amore, Ann.
Rev. Physiol. 53, 217–239
(1991); Folkman und Klagsbrun, Science 235, 442–447 (1987)), ist Gefäß-Endothel-Wachstumsfaktor
(VEGF) (Ferrara et al., Endo. Rev. 13, 18–32 (1992)) ein wirkungsvoller
angiogenetischer Faktor, der über
die Endothelzellen-spezifische Rezeptor-Thyrosin-Kinasen-fms-artige
Tyrosin-Kinase (Flt1) (Shibuy et al., Oncogene 5, 519–524 (1990);
deVries et al., Science 255, 989–991 (1992)) und fötale Leberkinase
(Flk1) (auch als KDR bezeichnet) wirkt. Quinn et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 7533–7537 (1993);
Millauer et al., Cell 72, 835–846
(1993); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9026–9030 (1991);
Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579–1586 (1992);
Terman et al., Oncogene 6, 1677–1683 (1991);
Oelrichs et al., Oncogene 8, 11–18
(1993). Diese beiden VEGF-Rezeptoren und ein dritter Orphan-Rezeptor,
Flt4 (Pajusola et al., Cancer Res. 52, 5738–5743 (1992); Galland et al.,
Oncogene 8, 1233–1240
(1993); Finnerty et al., Oncogene 8, 2293–2298 (1993)) bilden eine Unterfamilie
von Klasse III-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, die mehrere extrazalluläre Immunglobulin-artige
Domänen
und eine gespaltene intrazelluläre
Tyrosin-Kinase-Domäne
enthalten. Mustonen und Alitalo, J. Cell. Biol. 129, 895–898 (1995).
Sie auch die am 11. Mai 1994 veröffentlichte
WO 94/10202 und die am 22. Jänner
1993 eingereichte PCT/US93/00586 (Avraham et al.). Diese drei Rezeptoren
weisen 31 bis 36% Aminosäure-Identität in ihren
extrazellulären
Liganden-bindenden Domänen
auf.
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Mäuse
mit Flt1-Defizienz (Fong et. al., Nature 376, 66–70 (1995)) oder FIk1-Defizienz
(Shalaby et al., Nature 376, 62–66
(1995)) (erzeugt durch Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen)
weisen schwere Defekte in der Vaskulogenese auf und sterben in utero
am embryonalen Tag 8–9.
Der Phänotyp
der Rezeptor-defizienten Mäuse
ist jedoch sehr unterschiedlich. Mäuse, denen Flt1 fehlt, weisen
ein desorganisiertes Gefäß-Endothel
auf, das sich bis zu den Hauptgefäßen sowie bis zur Mikrovaskulatur
erstreckt, während
die Endothelzellen-Differenzierung normal zu sein scheint. Fong
et al., oben. Mäuse,
denen Flk1 fehlt, weisen einen beträchtlichen Defekt bei der Entwicklung
von reifen Endothelzellen sowie eine beträchtliche Reduktion der hämatopoetischen
Zell-Vorläufer
auf. Shalaby et al., oben. Somit kann VEGF in mehr als einem Stadium
der Vasculogenese auf Endothelzellen wirken.
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Flt4 wird ebenfalls spezifisch in
Endothelzellen exprimiert; es wird erstmals bei Mäuseembryos
im Alter von 8,5 Tagen in Endothelzellen-Vorläufern beobachtet. Kaipainen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3566–3570 (1995); Kaipainen et
al., J. Exp. Med. 178, 2077–2088
(1993). Siehe auch Hatva et al., Am. J. Pathol. 146, 368–378 (1995).
Mit fortschreitender Entwicklung wird die Flt4-Expression auf das
venöse
und lymphatische Endothel eingeschränkt und schließlich auf
die lymphatischen Gefäße beschränkt. Im
Einklang mit diesem Ergebnis weisen erwachsene humane Gewebe Flt4-Expression
in lym phatischen Endothelen auf, während Expression in Arterien,
Venen und Kapillaren fehlt. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci USA, oben. Klone, die für
humanes und Mäuse-Flt4 kodieren, sind
entweder durch PCR mit Primern für
konservierte Tyrosin-Kinase-Regionen (Finnery et al., oben, PCT/US93/00586,
oben; Aprelikova et al., Cancer Res. 52, 746–748 (1992)) oder durch Hybridisierung
unter erleichterten Bedingungen mit einer Flk2-Sonde isoliert worden.
Galland et al., Genomics, 13, 475–478 (1992). Alternatives Spleißen der
Flt4-mRNA erzeugt zwei Varianten des Proteins, die sich um 65 Aminosäuren am
C-Terminus unterscheiden. Pajusola et al., Oncogene 8, 2931–2937 (1993).
Diese Varianten wandern als Bande mit 170–190 kDa, die in der extrazellulären Domäne teilweise
proteolytisch gespalten werden, um eine Form mit etwa 25 kDa zu
erzeugen. Pajusola et al., Oncogene 8, oben; Pajusola et al., Oncogene
9, 3545–3555
(1994). Die Expression der längeren
gespleißten
Form von Flt4 als Chimäre
mit der extrazellulären
Domäne
des CSF-1-Rezeptors zeigt, dass die intrazelluläre Flt4-Domäne bei Nagetier-Fibroblasten
eine Liganden-abhängige
Wachstumsreaktion signalisieren kann. Pajusola et al., Oncogene
9, oben; Borg et al., Oncogene 10, 973–984 (1995). Flt4 ist am humanen
Chromosom 5q34–q35
lokalisiert worden (Aprelikova et al., oben; Galland et al., Genomics,
oben); Flt1 und Flk1 befinden sich an 13q12 (Imbert et al., Cytogenet.
Cell Genet. 67, 175–177
(1994)) und 4q12. Sait et al., Cytogenet. Cell Cenet. 70, 145–146 (1995);
Spritz et al., Genomics 22, 431–436
(1994).
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VEGF ist ein homodimeres, Cystein-reiches
Protein, das aufgrund von alternativem Spleißen seiner mRNA in zumindest
vier Formen auftreten kann. Ferrra et al., oben. Während VEGF
ist Ligand mit hoher Affinität
für Flt1
und Flk1 ist, wird Flt4 dadurch weder gebunden noch aktiviert. Pajusola
et al., Oncogene 9, oben. Das einzige andere eng verwandte Mitglied
der VEGF-Familie ist Placenta-Wachstumsfaktor (PIGF), der zu 47
Aminosäure-Identität mit VEGF
aufweist. Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 9267–9271 (1991). PIGF
tritt ebenfalls in zwei alternativen gespleißten Formen auf, die sich durch
das Vorhandensein oder Fehlen einer basischen Heparin-Bindungsdomäne mit 21
Aminosäuren
unterscheiden. Maglione et al., Oncogene 8, 925–931 (1993); Hauser und Weich,
Growth Factors, 9, 259–268
(1993). PIGF bindet sich an Flt1, nicht aber an Flk1 (Park et al.,
J. Biol. Chem. 269, 25646–25654
(1993); es wird angenommen, dass seine Bindung an Flt4 nicht bestimmt
worden ist. PIGF kann die Kapillar-Endothelzellen-Mitogenese oder
Gefäß-Permeabilitätsaktivitäten von
VEGF nicht duplizieren, was darauf hinweist, dass diese Aktivitäten durch
den Flk1-Rezeptor vermittelt werden. Parker et al., oben.
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Moleküle, die den Flk1-Rezeptor modulieren
oder die Aktivierung eines VEGF-Rezeptors neutralisieren, werden
in der Patentliteratur offenbart. Beispielsweise offenbart die am
17. August 1995 veröffentlichte WO
95/21613 Verbindungen, die die KDR/Flk1-Rezeptorsignaltransduktion
modulieren, so das die Vasculogenese und Angiogenese reguliert und/oder
moduliert wird, und offenbart die Verwendung von Flk1 zur Bewertung
und zum Screenen bezüglich
Arzneimitteln und Analogen von VEGF, die an der Flk1-Modulation durch Agonist-
oder Antagonist-Aktivitäten
beteiligt sind; die am 17. August 1995 veröffentlichte WO 95/21865 offenbart
Moleküle,
die mit Tier-Neuroepithel-Kinase (NYK)/Flk1 immunreaktiv sind, wobei
diese Moleküle
verwendet werden können,
um Mittel für
die Behandlung, Prophylaxe und Diagnose eines von Angiogenese abhängigen Phänotyps bereitzustellen;
und die am 17. August 1995 veröffentlichte
WO 95/21868 offenbart monoklonale Antikörper, die spezifisch an eine
extrazelluläre
Domäne
eines VEGF-Rezeptors binden und die Aktivierung des Rezeptors neutralisieren.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Nun sind cDNA-Klone identifiziert
worden, die für
ein neues Protein mit der Bezeichnung VRP kodieren, das sich an
die Rezeptor-Tyrosin-Kinase Flt4 bindet und deren Phosphorylierung
stimuliert. VRP ist, was seine Aminosäuresequenz betrifft, mit VEGF
verwandt, tritt aber nicht in nennenswerte Wechselwirkung mit den
VEGF-Rezeptoren Flt1 und Flk1.
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Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung
isoliertes biologisch aktives humanes VRP bereit, das zumindest
265 Aminosäuren
aus 1 enthält. Vorzugsweise
umfasst das iso lierte biologisch aktive humane mit VEGF verwandte
Protein (VRP) eine Aminosäuresequenz,
die zumindest die Reste + 1 bis einschließlich 29 aus 1 umfasst. Gemäß einem weiteren Aspekt liefert
die Erfindung isoliertes biologisch aktives humanes VRP, das eine
Aminosäuresequenz
umfasst, die als die Reste –20
bis einschließlich
399 oder die Reste + 1 bis einschließlich 399 aus 1 gezeigt wird.
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Die Erfindung betrifft auch Chimären, die
das VRP an ein anderes Polypeptid fusioniert umfassen. Beispielsweise
stellt die Erfindung ein chimäres
Polypeptid bereit, das das VRP an eine Marken-Polypeptidsequenz
fusioniert umfasst. Ein Beispiele für eine solche Chimäre ist VRP
mit Epitop-Marken.
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Gemäß einem weiteren Aspekt stellt
die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die biologisch aktives
VRP und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Gemäß einer
spezifischeren Ausführungsform
stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit,
die zur Förderung
von Gefäß- oder Lymphendothelzellwachstum
nützlich
ist und eine therapeutisch wirksame Menge des VRP in einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
umfasst. Gemäß einem
weiteren Aspekt umfasst die Zusammensetzung weiters einen weiteren
Zeltwachstumsfaktor, wie z. B. VEGF und/oder PDGF.
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Gemäß einem weiteren Aspekt sieht
die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins bei der Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung eines das Gefäßendothel betreffenden Traumas
vor, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der das VRP
enthaltenden Zusammensetzung an ein Säugetier, das an dem Trauma
leidet. Das Trauma besteht beispielsweise in diabetischen Geschwüren oder einer
Verletzung der Blutgefäße oder
des Herzens. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
sieht die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins
bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Dysfunktionalitätszustandes
bereit, der durch das Fehlen von Aktivierung oder das Fehlen von Hemmung
eines Rezeptors für
VRP bei einem Säugetier
gekennzeichnet ist, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge
der das VRP enthaltenden Zusammensetzung an das Säugetier.
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Die Erfindung stellt auch ein In-vitro-Verfahren
bereit, das das Kontaktieren des Flt4-Rezeptors mit dem VRP umfasst,
wodurch Phosphorylierung seiner Kinase-Domäne bewirkt wird. Beispielsweise
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Stimulieren der Phosphorylierung
einer Tyrosin-Kinase-Domäne
eines Flt4-Rezeptors bereit, das das Kontaktieren der extrazellulären Domäne des Flt4-Rezeptors
mit dem VRP umfasst.
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Die Erfindung stellt auch einen monoklonalen
Antikörper
bereit, der sich an das VRP bindet und vorzugsweise auch eine biologische
Aktivität
des Proteins neutralisiert, wobei ein biologische Aktivität als Förderung
der Neovaskularisation oder der Gefäßdurchlässigkeit oder des Gefäßendothel-Zeltwachstums
bei einem Säugetier
charakterisiert ist. Alternativ dazu oder in Verbindung damit stellt
die Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der sich an den
N-terminalen Abschnitt von den Resten –20 bis einschließlich 137
oder von den Resten + 1 bis einschließlich 137 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz
bindet. Der Antikörper
kann beispielsweise verwendet werden, um das Vorhandensein des VRP
in einer biologischen Probe zu detektieren, von der vermutet wird,
dass sie das Protein aufweist, oder um Patienten zu behandeln. Die
Erfindung betrifft eine pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen
solchen Antikörper
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
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Außerdem betrifft die Erfindung
ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz
besteht, die in Form der Reste –20
bis einschließlich –1 aus 1 gezeigt wird.
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Gemäß einer ersten Ausführungsform
stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das für VRP oder
eine VRP-Chimäre
kodiert. Gemäß einem
Aspekt ist das Nucleinsäuremoleküle RNA oder DNA,
die für
ein biologisch aktives VRP kodiert oder zu Nucleinsäuresequenz
komplementär
ist, die für
ein solches VRP kodiert und unter verschärften Bedingungen stabil dran
gebunden bleibt. Das Nucleinsäuremoleküle umfasst
gegebenenfalls die Regionen der Nucleinsäuresequenzen aus 1, die für Signalsequenzen
kodieren. Gemäß einer
Ausführungsform
ist die Nucleinsäuresequenz
aus Folgenden ausgewählt:
- (a) der Kodierungsregion der Nucleinsäuresequenz
aus 1, die für das Präprotein
von Rest –20
bis Rest 399 kodiert oder die für
reifes Protein von Rest 1 bis Rest 399 kodiert (d. h. die Nucleotide
372 bis einschließlich
1.628 oder die Nucleotide 432 bis einschließlich 1.628 der in 1 als Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz);
oder
- (b) einer Sequenz, die der Sequenz von (a) innerhalb des Bereichs
der Degeneration des genetischen Codes entspricht.
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Gemäß einem weiteren Aspekt kann
das Nucleinsäuremolekül in einem
replizierbaren Vektor bereitgestellt werden, der das Nucleinsäuremolekül operabel
an Kontrollsequenzen gebunden umfasst, die von einer mit dem Vektor
transfizierten oder transformierten Wirtszelle erkannt werden. Die
Erfindung stellt weiters eine Wirtszelle bereit, die den Vektor
oder das Nucleinsäuremoleküle umfasst.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung von VRP bereitgestellt,
das das Kultivieren einer Wirtszelle, die das Nucleinsäuremolekül umfasst, und
das Gewinnen des Proteins aus der Wirtszellenkultur umfasst.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A–1D zeigen die Nucleotid-Kodierungssequenz
(Seq.-ID Nr. 1), die Nucleotid-Komplementärsequenz
(Seq.-ID Nr. 2) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3)
des hierin beschriebenen humanen VRP.
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2 stellt
die Bindung von Flt4/IgG und von Rse/IgG (eines nicht verwandten
Rezeptorfusionsproteins) an die humane Gliom-Zelllinie G61 dar,
wobei diese Bindung durch FACS-Analyse bewertet wurde.
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Die 3A und 3B zeigen eine Karte von
cDNA-Klonen dar, die für
humanes VRP kodieren, bzw. eine Ausrichtung der Proteinsequenz VRP
(Seq.-ID Nr. 3) mit jener von VEGF121 (Seq.-ID
Nr. 4) und P1GF131 (Seq.-ID Nr. 5) dar. 3A zeigt das Ausmaß von vier
VRP-cDNA-Klonen; strichlierte Linien zeigen die fehlenden Abschnitte
von VH1.1 und VH1.3. Pfeile zeigen Restriktionsenzymstellen an;
das schattierte Kästchen markiert
die mutmaßliche
Sekretionssignalsequenz; das leere Kästchen markiert das reife Protein;
Y-Typ-Bezeichnungen innerhalb des offenen Kästchens zeigen die potentiellen
N-gebundenen Glykosylierungsstellen; und vertikale Linien zeigen
die Cysteinreste. Zum Vergleich wird ein Diagramm von VEGF121 gezeigt. Das Hydropathie-Diagramm (Kyle
und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982)) dient für VRP. In 3B zeigt ein Strich oberhalb
die Region, für
die eine exprimierte Sequenzmarkierung (EST) kodiert (Sequenz eines
Abschnitts eine cDNA-Klons) von GenBank mit der Bezeichnung HSC1-WF111.
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4 zeigt
eine Karte des cDNA-Klons für
humanen VRP voller Länge
gemäß vorliegender
Erfindung im Vergleich zu 11 bekannten ESTs. Die 11 partiellen EST-Aminosäuresequenzfragmente
sind H07991 und H07899 (5'-
bzw. 3'-Ende des
gleichen klonierten Fragments), HSC1WF112 und HSC1WF111 (3'- bzw. 5'-Ende des gleichen
klonierten Fragments), T81481 und T81690 (3'- bzw. 5'-Ende des gleichen klonierten Fragments), R77495
(ein 3'-Ende eines
klonierten Fragments) sowie T84377 und T89295 (5'- bzw. 3'-Ende des gleichen klonierten Fragments).
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5 stellt
die Bindung von125I-Flt4/IgG an gereinigtes
VRP dar. Die Bindung wurde in Abwesenheit (–) oder Gegenwart (+) von 100
nM Rezeptor-IgG-Fusionsprotein (5A)
oder mit zunehmenden Konzentrationen an Flt4/IgG (5B) vorgenommen.
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6 zeigt
einen Graph der Zeltzählung
von humanen Lungenmikrogefäß-Endothelzellen
als Funktion der Konzentration von VEGF oder VRP im Zellkulturmedium,
um die mitogene Aktivität
zu bewerten und zu vergleichen.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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1. Definitionen
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Bei der Beschreibung der vorliegenden
Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, und sie sind
wie nachstehend angeführt
definiert.
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"Humanes
VRP" ist hierin
als eine Polypeptidsequenz definiert, die zumindest die Reste –20 bis
einschließlich
399 oder die Reste +1 bis einschließlich 399 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz
enthält, einschließlich der
Reste –5
bis einschließlich
399 und der Reste –4
bis einschließlich
399 der in 1 gezeigten
Aminosäuresequenz,
sowie biologisch aktiver Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten
der obigen Sequenzen mit zumindest 265 Aminosäure und vorzugsweise zumindest
den Resten +1 bis einschließlich 29
aus 1. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
weist die Proteinsequenz zumindest die Reste +1 bis einschließlich 137
aus 1, mehr bevörzugt zumindest
die Reste –20
bis einschließlich
29 aus 1 und am meisten
bevorzugt zumindest die Reste –20
bis einschließlich
137 aus 1 auf. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
weisen die biologisch aktiven Varianten eine Länge von 265 bis etwa 450 Aminosäurereste,
mehr bevorzugt von etwa 300 bis 450, noch mehr bevorzugt von etwa
350 bis 450 und am meisten bevorzugt von etwa 399 bis 419 Aminosäureresten
auf. Bei einem weiteren bevorzugten Satz von Varianten handelt es
sich um Varianten, die Insertions- oder Substitutionsvarianten sind,
oder Deletionsvarianten, wenn die Deletion in der Signalsequenz
vorliegt und/oder nicht in der N-terminalen Region des Moleküls vorliegt
(d. h. die Reste 1–29,
vorzugsweise die Reste 1–137).
Die Definition von VRP schließt
alle bekannten EST-Sequenzen, wie beispielsweise H07991, H05134,
H05177, HSC1 WF112, HSC1 WF111, T81481, R77495, H07899, T84377,
T81690 und T89295 sowie alle Formen von VEGF und PIGF aus.
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"Biologisch
aktiv" bedeutet
für die
Zwecke der vorliegenden Beschreibung die Fähigkeit, sich an den Flt4-Rezeptor
zu binden und seine Phosphorylierung zu stimulieren. Im Allgemeinen
bindet sich das Protein an die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptors und aktiviert
oder hemmt dadurch sein intrazelluläre Tyrosin-Kinase-Domäne. Als
Folge kann die Bindung des Proteins an den Rezeptor zu einer Verstärkung oder Hemmung
der Vermehrung und/oder Differenzierung und/oder Aktivierung von
Zellen in vivo oder in vitro führen,
die den Flt4-Rezeptor für
das VRP aufweisen. Die Bindung des Proteins an den Flt4-Rezeptor
kann unter Einsatz herkömmlicher
Techniken bestimmt werden, einschließlich kompetitiver Bindungsverfahren,
wie RIAS, ELISAs und anderer kompetitiver Bindungstests. Liganden/Rezeptor-Komplexe
können
unter Einsatz von Trennungsverfahren wie Filtration, Zentrifugation,
Strömungszytometrie
(siehe beispielsweise Lyman et al., Cell 75, 1157–1167 (1993);
Urdal et al., J. Biol. Chem, 263, 2870-2877 (1988); und Gearing et al., EMBO
J. 8, 3667–3676
(1989)) und dergleichen identifiziert werden. Die Ergebnisse von
Bindungsuntersuchungen können unter
Einsatz jeder beliebigen herkömmlichen
graphischen Darstellung der Bindungsdaten analysiert werden, wie
Scatchard-Analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51, 660–672 (1949);
Goodwin et al., Cell, 73, 447–456 (1993))
und dergleichen. Da das VRP die Phosphorylierung des Flt4-Rezeptors
hervorruft, können
als Indikator für
die Bildung eines Flt4-RezeptorNRP-Komplexes auch herkömmliche
Tyrosinphosphorylierungstests, wie der in Beispiel 5 gemäß vorliegender
Erfindung beschriebene Test, eingesetzt werden.
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Der Begriff "Epitop-markiert" bezieht sich, wenn er hierin verwendet
wird, auf ein chimäres
Polypeptid, das das gesamte VRP oder einen Abschnitt davon an ein "Marker-Polypeptid" fusioniert umfasst.
Das Marker-Polypeptid besitzt genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen,
gegen das ein dagegen gerichteter Antikörper hergestellt werden kann,
ist aber dennoch dahingehend ausreichend kurz, um die Aktivität des Antikörpers nicht
zu stören.
Das Marker-Polypeptid ist vorzugsweise auch ausreichend einmalig,
so dass der dagegen gerichtete Antikörper im Wesentlichen nicht
mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide
besitzen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und für gewöhnlich ungefähr 8 bis
50 Aminosäurereste
(vorzugsweise zwischen etwa 9 und 30 Resten).
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"Isoliert" bedeutet, wenn es
verwendet wird, um verschiedene hierin offenbarte Proteine zu beschreiben,
Protein, das aus einem Bestandteil seiner natürlichen Umgebung identifiziert
und getrennt und/oder rückgewonnen
worden ist. Kontaminierende Bestandteile seiner natürlichen
Umgebung sind Materialien, welche die diagnostischen oder therapeutischen
Verwendungen für
das Protein stören
würden
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nicht-proteinische,
gelöste
Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt,
und zwar (1) in einem Aus maß,
das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen
Aminosäuresequenz
durch Verwendung eines Drehbecher-Sequenzierers zu erhalten, oder
(2) bis zur Homogenität
mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen
unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes
Protein umfasst Protein in situ innerhalb rekombinanter Zellen,
da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des VRP nicht
vorhanden ist. Für
gewöhnlich
wird das isolierte Protein jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt
hergestellt.
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Mit "im Wesentlichen reines" Protein ist eine
Zusammensetzung gemeint, die zumindest etwa 90 Gew.-% des Proteins,
bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise
zumindest etwa 95 Gew.-%, umfasst. Mit "im Wesentlichen homogenes" Protein ist eine
Zusammensetzung gemeint, die zumindest etwa 99 Gew.-% Protein, bezogen
auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, umfasst.
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Ein "isoliertes" VRP-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert
und von zumindest einem kontaminierenden Nucleinsäuremolekül getrennt
worden ist, mit dem es in der natürlichen Quelle der VRP-Nucleinsäure üblicherweise
assoziiert ist. Ein isoliertes VRP-Nucleinsäuremolekül liegt anders als in der Form
oder Anordnung vor, in der es in der Natur zu finden ist. Isolierte
VRP-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden
sich daher vom VRP-Nucleinsäuremolekül, wie es
in natürlichen
Zellen vorliegt. Der Begriff "isoliertes VRP-Nucleinsäuremolekül" umfasst jedoch VRP-Nucleinsäuremoleküle, die
in Zellen enthalten sind, die üblicherweise
VRP exprimieren, worin sich das Nucleinsäuremolekül beispielsweise an einer anderen
chromosomalen Position findet als bei natürlichen Zellen.
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Das isolierte VRP-Polypeptid, die
isolierte VRP-Nucleinsäure
oder der isolierte VRP-Antikörper
können
für Diagnose-
und Sondenzwecke unter Einsatz einer Markierung markiert werden,
wie nachstehend in der Erörterung
bezüglich
der Verwendung von VRP-Antikörpern beschrieben
und definiert.
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Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" bezeichnet DNA-Sequenzen, die für die Expression
einer operabel gebundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten
Wirtsorganismus notwendig sind. Zu den Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten
geeignet sind, gehören
beispielsweise ein Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz,
eine Ribosom-Bindungsstelle und möglicherweise anderes bisher
noch kaum erforschte Sequenzen. Es ist bekannt, dass eukaryotische
Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer einsetzen.
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Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung
mit einer anderen Nucleinsäuresequenz
gebracht ist. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader
operabel an DNA für
ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das
an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder
Enhancer ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn er
die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle
ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn sie so positioniert
ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die verbundenen
DNA-Sequenzen zusammenhängend
sind und im Fall eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind
und sich in Lesephase befinden. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein.
Die Bindung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen erreicht. Wenn
derartige Stellen nicht vorliegen, werden die synthetischen Oligonucleotidgadaptoren
oder-linker gemäß herkömmlicher
Praxis verwendet.
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Der Begriff "Antikörper" wird im Allgemeinsten Sinn verwendet
und umfasst spezifisch einzelne monoklonale Anti-VRP-Antikörper (einschließlich Agonisten-
und Antagonisten-Antikörper)
sowie Anti-VRP-Antikörperzusammensetzungen
mit polyepitopischer Spezifität.
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Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der
aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten
wird, d. h., dass die einzelnen die Population umfassenden Antikörper bis
auf mögliche
natürlich
vor kommende Mutationen identisch sind, die in geringem Ausmaß auftreten
können.
Monoklonale Antikörper
sind hochspezifisch und gegen eine einzelne Antigen-Stelle gerichtet.
Außerdem
ist im Gegensatz zu herkömmlichen
(polyklonalen) Antikörperpräparaten,
die typischerweise unterschiedliche, gegen verschiedene Determinanten
(Epitope) gerichtete Antikörper
enthalten, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante
auf dem Antigen gerichtet.
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Die monoklonalen Antikörper umfassen
hierin Hybrid- und rekombinanten Antikörper, die durch Spleißen einer
variablen (einschließlich
hypervariablen) Domäne
eines Anti-VRP-Antikörpers mit
einer konstanten Domäne
erzeugt werden, (z. B. "humanisierte" Antikörper), oder
einer leichten Kette mit einer schweren Kette, oder einer Kette
von einer Spezies mit einer Kette von einer anderen Spezies, oder
Fusionen mit heterologen Proteinen, unabhängig von der Ursprungsspezies
oder der Immunglobulinklassen- oder -unterklassenbezeichnung, sowie
Antikörperfragmente
(z. B. Fab, F(ab')2 und Fv), solange sie die gewünschte biologische
Aktivität aufweisen.
Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.816.567 und Mage und Lamoyi,
in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S.
79–97
(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
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Das Adjektiv "monoklonal" gibt an, dass der Antikörper das
Merkmal aufweist, von einer im Wesentlichen homogenen Population
von Antikörpern
erhalten worden zu sein, und ist nicht so zu verstehen, dass die Produktion
des Antikörpers
durch ein bestimmtes Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise
können
die monoklonalen Antikörper
zur Verwendung gemäß vorliegender
Erfindung durch das Hybridom-Verfahren hergestellt werden, das erstmals
von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben worden
ist, oder sie können
durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 4.816.567). Die "monoklonalen
Antikörper" können auch
von Phagenbibliotheken isoliert sein, die unter Einsatz von Techniken
erzeugt werden, die beispielsweise in McCafferty et al., Nature
348, 552–553
(1990), beschrieben werden.
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"Humanisierte" Formen nichtmenschlicher
(z. B. Mäuse-)
Antikörper
sind spezifische chimäre
Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie zb
Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder
andere Antigen-Bindungs-Subsequenzen von Antikörpern), die einen minimalen
Anteil an Sequenzen aus nichtmenschlichem Immunglobulin enthalten.
Zumeist sind humanisierte Antikörper
Human-Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste von einer
Komplementärbestimmungsreaktion
(CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht menschlichen
Spezies (Donor-Antikörper),
wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens mit der
gewünschten
Spezifität,
Affinität
und Kapazität
ersetzt sind. In einigen Fällen
sind Fv-Rahmenregion- (FR-) Reste des Human-Immunglobulins durch
entsprechende nicht menschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte
Antikörper
Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in den importierten
CDR- oder Rahmensequenzen zu finden sind. Diese Modifizierungen
werden vorgenommen, um die Antikörperleistungsfähigkeit
weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der
humanisierte Antikörper
im Wesentlichen alles von zumindest einer und typischerweise zwei
variablen Domänen,
in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen aus einem
nichtmenschlichen Immunglobulin entsprechen und alle oder im Wesentlichen
alle FR-Regionen jene einer Human-Immunglobulin-Sequenz sind. Der
humanisierte Antikörper
umfasst im Optimalfall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten
Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines Human-Immunglobulins.
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Wie hierin verwendet, bezeichnet "Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor" oder "VEGF" einen Säugetier-Wachstumsfaktor,
der ursprünglich
von Rinder-Hirnanhangdrüsen-Follikelzellen
mit der Aminosäuresequenz
aus 2 der WO90/13649
stammt und die humane Aminosäuresequenz
aus 10 der WO 90/13649 hat. Siehe
auch US-Patent Nr. 5.194.596, das Rinder-VEGF mit 120 Aminosäuren und
humanen VEGF mit 121 Aminosäuren
offenbart. Die biologische Aktivität von nativem VEGF kann das
selektive Wachstum von Gefäßendothelzellen,
nicht aber von Rinder-Hornhaut-Endothelzellen, Linsen-Epithelzellen, Nebennierenrindenzellen,
VHK-21-Fibroblasten oder Keratinozyten fördern.
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Der Ausdruck "das Gefäßendothel betreffendes Trauma" bezieht sich auf
ein Trauma, wie etwa Verletzungen an Blutgefäßen oder am Herzen, einschließlich des
Gefäßnetzwerks
von Organen, die eine Tier oder ein Mensch, vorzugsweise ein Säugetier,
und am meisten bevorzugt ein Mensch, erlitten hat. Beispiele für derartige
Traumata sind Wunden, Schnitte und Geschwüre, am meisten bevorzugt Diabetes-Geschwüre und Wunden
oder Risswunden der Blutgefäße oder
des Herzens. Traumata umfassen sowohl Zustände, die durch Ereignisse im
Inneren verursacht werden, als auch jene, die durch ein äußerliches
Agens, wie z. B. ein Pathogen, verursacht werden, und die durch
die Förderung
des Gefäßendothelzellenwachstums
verbessert werden können.
Es betrifft auch die Behandlung von Wunden, bei denen Neovaskularisation
oder Re-Endothelisation für
die Heilung erforderlich ist.
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"Förderung
des Gefäß- oder
Lymphendothelzellenwachstums" bezeichnet
das Herbeiführen
oder Verstärken
des Wachstums von Gefäß- oder
Lymphendothelzellen, einschließlich
humaner Lungen-Mikrogefäßendothelzellen.
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"Mit
Vaskulogenese und Angiogenese verbundene Störungen" sind Krebs, Diabetes, Hämangiom
und Kaposi-Sarkom.
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"Erkrankungen
oder Störungen,
die durch unerwünschte übermäßige Gefäßneubildung
oder Gefäß-Durchlässigkeit
gekennzeichnet sind" bezieht
sich auf Erkrankungen oder Störungen,
zu denen beispielsweise übermäßige Gefäßneubildung,
Tumoren und insbesondere massive bösartige Tumoren, primärchronische
Polyarthritis, Psoriasis, Atherosklerose, Diabetes und andere Retinopathien,
retrolental Fibroplasie, altersbedingte Makula-Degeneration, neovaskuläres Glaukom,
Hämangiome,
Schilddrüsen-Hyperplasien
(einschließlich
Grave-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebstransplantation sowie
chronische Entzündung
gehören.
Beispiele für
Erkrankungen oder Störungen,
die durch gewünschte übermäßige Gefäß-Durchlässigkeit gekennzeichnet
sind, sind mit Gehirntumoren verbundene Ödeme, mit Malignität verbundene
Aszites, Meigs-Syndrom, Lun genentzündung, nephrotisches Syndrom,
Perikarderguss (wie der mit Pericarditis verbundene) und Pleuraleffusion.
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"Dysfunktionalitätszustände, die
durch übermäßige Aktivierung
oder Hemmung eines Rezeptors für VRP
gekennzeichnet sind" (wie
Rezeptor, der Flt4 einschließt)
bezeichnet Störungen
oder Erkrankungen, die vorteilhaft behandelt werden können, indem
einem Säugetier
mit einem solchen pathologischen Zustand ein Antagonist für Flt4 verabreicht
wird, wie eine F14-Chimäre
oder ihre extrazellulare Domäne
(z. B. eine IgG-Fusion mit Flt4) oder ein Antikörper für VRP.
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"Dysfunktionalitätszustände, die
durch das Fehlen von Aktivierung oder das Fehlen von Hemmung eines
Rezeptors für
VRP gekennzeichnet sind" (wie
Flt4 umfassender Rezeptor) bezieht sich auf Störungen oder Erkrankungen, die
vorteilhaft behandelt werden können,
indem VRP oder ein VRP-Rezeptoragonist für ein Säugetier mit einem derartigen
pathologischen Zustand bereitgestellt wird.
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"Behandlung" umfasst sowohl therapeutische
Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die Behandlung
benötigen,
sind sowohl jene, die die Störung
bereits aufweisen, als auch jene, die für die Störung anfällig sind, oder jene, bei denen
die Störung
zu verhindern ist.
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"Säugetier" umfasst für die Zwecke
der Behandlung jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist,
einschließlich
Menschen, Haus- oder Nutztiere, sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere,
wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe usw. Vorzugsweise ist das
Säugetier
hier der Mensch.
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"Wirksame
Menge" oder "therapeutisch wirksame
Menge" des VRP,
der VRP-Zusammensetzung, des Antikörpers oder der Antikörperzusammensetzung
ist eine Menge, mit der sich der behandelte Zustand entweder wirksam
verhindern, eindämmen,
erleichtern oder heilen lässt.
Beispielsweise umfasst die wirksame VRP-Menge jene Menge, die aus reicht,
um das Wachstum von Gefäß-Endothel
in vivo zu verstärken
oder Trauma zu behandeln, und eine "wirksame Menge" an VRP-Antikörper umfasst die Menge, die
ausreicht, um übermäßige Gefäßneubildung
und Angiogenese zu verringern.
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II. Arten der Durchführung der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung basiert
auf der Entdeckung eines neuen VRP, der sich an den Flt4-Rezeptor bindet
und seine Phosphorylierung stimuliert.
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Es wurden drei Ansätze eingesetzt,
um Protein zu identifizieren, das sich an den Flt4-Rezeptor bindet und
seine Phosphorylierung stimuliert. Zunächst wurde Rezeptor voller
Länge stabil
in 293 Zellen exprimiert, um einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Phosphorylierungstest
der Flt4-Aktivierung einzurichten. Dieser Test wurde eingesetzt,
um etwa 400 Zellüberstände und
Gewebeextrakte zu screenen, ohne positive Ergebnisse.
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Zweitens wurde die extrazelluläre Domäne des Rezeptors
als Fusionsprotein mit einer Immunglobulin-Fc-Domäne exprimiert.
Durch den Einsatz dieses Fusionsproteins (Flt4/ IgG) zum Screenen
von Zelllinien für
Membran-gebundene Liganden durch FACS-Analyse wurde eine positive
Zelllinie identifiziert. Die humane Gliom-Linie, G61, ergab etwa
eine 10fache Verschiebung der Peak-Fluoreszenzintensität, die für Flt4/IgG
spezifisch war (2).
Versuche der Expressionsklonierung dieses mutmaßlichen Membrangebundenen Liganden
durch die Transfektion von Pools von cDNA-Klonen in COS-Zellen,
gefolgt von Screenen mit markiertes Flt4/IgG ergab keine Positiva
von 640 Pools von jeweils 1.000 bis 5.000 Klonen. Flt4/IgG wurde
auch verwendet, um polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper zu
erzeugen, die Agonisten-Aktivität
aufwiesen und die verwendet wurden, um den Flt4-Tyrosin-Phosphorylierungstest
zu entwickeln, wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
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Dritten wurden Kandidaten-Ligadenproteine
auf ihre Fähigkeit
getestet, sich an Flt4/IgG zu binden oder den Flt4-Phosphorylierungstest
zu aktivieren. Markierte VEGF band sich nicht an Flt4/IgG, obwohl
die erwartete Bindung von VEGF an Flt1/IgG oder Flk1/IgG routinemäßig detektiert
wurde. Das Versagen von VEGF, sich an Flt4 zu binden oder seine
Phosphorylierung zu stimulieren, ist von Pajusola et al., Oncogene
9, oben, berichtet worden. Durch die Verwendung von Klonierungstechiken
wurde ein weiteres Kandidaten-Ligandenprotein gefunden, und Details
davon sind dem nachstehenden Beispiel 3 zu entnehmen. Die humane
VRP-cDNA-Sequenz ist in 1A–1D dargestellt. Das vorhergesagte
Molekulargewicht des Proteins ist 44,8 kDa.
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Nun folgt eine Beschreibung, wie
das biologisch aktive humane VRP hergestellt werden kann.
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1. Herstellung von VRP
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Ein Großteil der nachstehenden Erörterung
betrifft die Produktion von VRP durch das Kultivieren von Zellen,
die mit einem Vektor transformiert sind, der die VRP-Nucleinsäure enthält, und
das Gewinnen des Polypeptids aus der Zeltkultur. Weiters ist daran
gedacht, dass das VRP gemäß vorliegender
Erfindung durch homogene Rekombination hergestellt werden kann,
wie in der am 16. Mai 1991 veröffentlichten
WO 91106667 vorgesehen.
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Kurz zusammengefasst umfasst dieses
Verfahren die Transformation primärer menschlicher Zellen, die
ein humanes VRP-Kodierungsgen enthalten, mit einem Konstrukt (z.
B. einem Vektor), das ein amplifizierbares Gen [wie Diyhdrofolatreduktase
(DHFR) oder andere, wie nachstehend erörtert] und zumindest eine Flankierungsregion
mit einer Länge
von zumindest etwa 150 bp umfasst, die mit einer DNA-Sequenz am
Ort der Kodierungsregion des VRP-Gens homolog ist, um für die Amplifizierung
des VRP-Gens zu sorgen. Das amplifizierbare Gen muss sich an einer
Stelle befinden, die die Expression des VRP-Gens nicht stört. Die Transformation
wird so durchgeführt,
dass das Konstrukt homolog in das Genom der primären Zelle integriert wird,
um eine amplifizierbare Region zu definieren.
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Selektion bezüglich primärer Zellen, die das Konstrukt
umfassen, erfolgt dann durch das amplifizierbare Gen oder einer
anderen Markierung, die im Konstrukt vorliegt. Das Vorhandensein
des Markierungsgens ermittelt das Vorhandensein und die Integration
des Konstrukts in das Wirtsgenom. Es muss keine weitere Selektion
der primären
Zellen durchgeführt
werden, da die Selektion im zweiten Wirt erfolgt. Falls gewünscht, kann
das Auftreten des homologen Rekombinationsereignisses bestimmt werden,
indem PCR eingesetzt wird und entweder die resultierenden amplifizierten
DNA-Sequenzen sequenziert werden oder die angemessene Länge des
PCR-Fragments bestimmt wird, wenn DNA von korrekten homologen Integranten
vorhanden ist und nur jene Zellen expandiert werden, die derartige
Fragmente enthalten. Auch können,
falls gewünscht,
die ausgewählten
Zellen an diesem Punkt amplifiziert werden, indem die Zellen mit
dem angemessenen Amplifzierungsmittel (wie Methotrexat, wenn das
amplifizierbare Gen DHFR ist) belastet werden, so dass mehrere Kopien
des Zielgens erhalten werden. Vorzugsweise jedoch wird der Amplifizierungsschritt
erst nach der zweiten nachstehend beschriebenen Transformation durchgeführt.
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Nach dem Selektionsschritt werden
DNA-Abschnitte des Genoms, die ausreichend groß sind, um die gesamte amplifizierbare
Region zu umfassen, von den ausgewählten primären Zellen isoliert. Sekundäre Säugetier-Expressionswirtszellen
werden dann mit diesen genomischen DNA-Abschnitten transformiert
und kloniert, und es werden Klone ausgewählt, die die ampflizierbare
Region enthalten. Die amplifizierbare Region wird dann durch ein
Amplifizierungsgen amplifiziert, wenn sie nicht bereits in den primären Zellen
amplifiziert wurde. Schließlich
werden die sekundären
Expressionswirtszellen gezüchtet,
die nun mehrere Kopien der amplifizierbaren Region umfassen, die
VRP enthält,
um das Gen zu exprimieren und das Protein zu erzeugen.
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A. Isolierung von für VRP kodierender
DNA
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Die für VRP kodierende DNA kann aus
jeder cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt
wird, von dem angenommen wird, dass es die VRP-mRNA aufweist, und
dass sie sie in einer detektierbaren Menge exprimiert. Demgemäß kann humane VRP-DNA
zweckmäßig aus
einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus humanem Gehirngewebe,
beispielsweise einer Gliazellenlinie, erhalten wird. Das für VRP kodierende
Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotid-Synthese
erhalten werden.
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Bibliotheken werden mit Sonden (wie
Antikörpern
gegen das VRP oder Oligonucleotide mit etwa 20 bis 80 Basen) gescreent,
die dazu bestimmt sind, das Gen von Interesse oder das Protein zu
identifizieren, für das
es kodiert. Das Screenen der cDNA oder der genomischen Bibliothek
mit der ausgewählten
Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren durchgeführt werden,
wie in Kapitel 10 bis 12 von Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989) beschrieben. Ein alternatives Mittel zum isolieren das für VRP kodierenden
Gens besteht darin, PCR-Methodik einzusetzen, wie in Abschnitt 14
von Sambrook et al., oben, beschrieben.
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Ein bevorzugtes Verfahren zur praktischen
Umsetzung der vorliegenden Erfindung besteht darin, sorgfältig ausgewählte Oligonucleotidsegenzen
zu verwenden, um cDNA-Bibliotheken
von verschiedenen humanen Geweben, vorzugsweise Gehirnzelllinien,
zu screenen. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen
sauten eine ausreichende Länge
aufweisen und ausreichend eindeutig sein, um falsche positive Ergebnisse
zu minimieren.
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Das Oligonucleotid muss so markiert
sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek
detektiert werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren besteht
darin, 32P-markiertes ATP mit Palynucleotidkinase
zu verwenden, wie nach dem Stand der Technik wohlbekannt, um das
Oligonucleotid Radiomarkierung zu unterziehen. Es können jedoch
auch andere Verfahren eingesetzt werden, um das Oligonucleotid zu
markieren, darunter, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotinylierung
oder Enzymmarkierung.
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Bei manchen bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die Nucleinsäuresequenz
die native VRP-Signalsequenz. Nucleinsäure, die die gesamte Proteinkodierungssequenz
aufweist, wird durch das Screenen von ausgewählter cDNA oder genomischer
Bibliotheken erhalten, wobei erstmals die hierin offenbarte abgeleitete
Aminosäuresequenz
verwendet wird und, falls erforderlich, herkömmliche Primerverlängerungsverfahren
eingesetzt werden, wie in Abschnitt 7.79 von Sambrook et al., oben,
beschrieben, um Vorläufer
zu detektieren und mRNA-Zwischenprodukte zu verarbeiten, die nicht
reverse Transkription in cDNA erfahren haben.
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Aminosäuresequenzvarianten für VRP werden
hergestellt, indem geeignete Nucleotid-Veränderungen in
die VRP-DNA eingebracht werden, oder durch die Synthese des erwünschten
VRP-Polypeptids. Derartige Varianten stellen Insertionen, Substitutionen
und/oder Deletionen von Resten innerhalb von oder an einem oder
beiden der Enden der Aminosäuresequenz
dar, die für
das VRP in 1 gezeigt
wird. Vorzugsweise stellen diese Varianten Insertionen und/oder
Substitutionen innerhalb von oder an einem oder beiden Enden der reifen
Sequenz und/oder Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen
innerhalb oder an einem oder beiden der Enden der Signalsequenz
für VRP
dar, wie in 1 gezeigt.
Jede beliebige Kombination aus Insertion, Substitution und/ oder
Deletion wird vorgenommen, um das Endkonstrukt zu erreichen, mit
der Maßgabe,
dass das Endkonstrukt die gewünschte
biologische Aktivität
wie hierin definiert aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch die posttranslationalen
Prozesse des VRP verändern,
wie die Anzahl oder Position der Glykoslierungsstellen ändern, die
Membran-Verankerungseigenschaften ändern und/oder die intrazellulare
Position des VRP ändern,
indem die Leadersequenz des VRP insertiert, gelöscht oder auf andere Weise
beeinflusst wird.
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Variationen in der nativen Sequenz
wie oben beschrieben können
vorgenommen werden, indem eine beliebige der Techniken und Richtlinien
für konservative
und nicht konservative Mutationen eingesetzt werden, wie in US-Patent
Nr. 5.364.934 dargelegt. Dazu gehören Oligonucleotid-vermittelte
(ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese.
Sie auch beispielsweise Tabelle 1 der vorliegenden Beschreibung und
die Erörterung
zu dieser Tabelle für
eine Anleitung zur Auswahl von Aminosäuren zum Ändern, Hinzufügen oder
Löschen.
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B. Insertion von Nucleinsäure in replizierbaren
Vektor
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Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische
DNA), die für
nativen oder varianten VRP kodiert, wird für weiters Klonieren (Amplifizierung
der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert.
Es stehen viele Vektoren zu Verfügung.
Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, ohne darauf beschränkt zu sein,
eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung,
ein oder mehrere Markengene, ein Enhancerelement, einen Promotor
und eine Transkriptionsterminationssequenz.
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(i) Signalsequenzkomponente
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Die VRPs gemäß vorliegender Erfindung können rekombinant
nicht nur direkt sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen
Polypeptid hergestellt werden, bei dem es vorzugsweise um eine Signalsequenz
oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle
am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids handelt. Im Allgemeinen
kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie
kann ein Teil der VRP-DNA sein, der in den Vektor insertiert wird.
Bei der ausgewählten
heterologen Signalsequenz handelt es sich vorzugsweise um eine,
die von der Wirtszelle erkannt und verarbeitet wird (d. h. Spaltung
durch eine Signalpeptidase). Bei prokaryotischen Wirtszellen, die
das native VRP-Signal nicht erkennen und verarbeiten, wird die Signalsequenz
durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert, die beispielsweise
aus der Gruppe der Alkaliphosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen
Enterotoxin II-Leadern ausgewählt
wird. Für
die Hefe-Sekretion kann die native Signalsequenz beispielsweise
durch den Hefe-Invertaseleader, α-Faktorleader
(einschließlich
Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader,
wobei Letzterer in dem am 23. April 1991 ausgegebenen US-Patent
Nr. 5.010.182 beschrieben wird), oder Saure-Phosphatase-Leader,
den C.albicans-Glucoamylaseleader (
EP
362.179 , veröffentlicht
am 4. April 1990) oder das Signal, das in der am 15. November 1990
veröffentlichten
WO 90/13646 beschrieben wird, substituiert werden. Bei Säugetier-Zeltexpression
ist die native Signalsequenz (z. B. die VRP-Präsequenz, die normalerweise
die Sekretion von VRP von menschlichen Zellen in vivo lenkt) zufriedenstellend,
es können
jedoch auch andere Signalsequenzen geeignet sein, wie Signalsequenzen
von anderen Tier-VRPs, und Signalsequenzen von sekretierten Polypeptiden
derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader,
beispielsweise das Herpes simplex-gD-Signal.
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Die DNA für eine solche Vorläuferregion
wird in Leserahmen an DNA ligiert, die für das reife VRP kodiert.
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(ii) Replikatikonsursprung-Komponente
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Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren
enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die es dem Vektor ermöglicht,
in einer oder mehreren ausgewählten
Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in
Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von
der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und sie umfasst Replikationsursprünge oder
autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl
von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsursprung
vom Plasmid pBR322 ist für
die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist
für Hefe
geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus,
VSV oder BPV) sind für
Klonierungsvektoren in Säugetierzellen
nützlich.
Im Allgemeinen ist die Replikationsursprungkomponente für Säugetier-Expressionsvektoren
nicht erforderlich (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden,
weil er den frühen
Promotor enthält).
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Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle"-Vektoren, d. h.
sie sind zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen
fähig,
können
aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden.
Beispielsweise wird in Vektor in E.coli kloniert, und dann wird
der gleiche Vektor zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen
transfiziert, obwohl er nicht unabhängig vom Wirtszellenchromosom
replizieren kann.
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DNA kann auch durch Insertion in
das Wirtsgenom amplifiziert werden. Das lässt sich leicht unter Verwendung
von Bacillus-Spezies als Wirte erreichen, beispielsweise indem in
den Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer Sequenz
komplementär
ist, die genomischer Bacillus-DNA zu finden ist. Die Transfektion
von Bacillus mit diesem Vektor führt
zu homogener Rekombination mit dem Genom und Insertion von VRP-DNA.
Die Gewinnung von genomischer DNA, die für VRP kodiert, ist jedoch komplexer
als jene eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzym-Verdau
erforderlich ist, um die VRP-DNA auszuschneiden.
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(iii) Selektionsgenkomponente
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Expressions- und Klonierungsvektoren
sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer
Marken bezeichnet wird. Diese Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben
oder Züchten
transformierter Wirtszellen erforderlich ist, die in einem selektiven
Kulturmedium gezüchtet
werden. Nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transfomierte
Wirtszellen überleben
im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine,
die (a) Resistenz gegenüber
Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin,
Methotrcat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren
oder (c) entscheidende Nährstoffe
zuführen,
die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z. B. das Gen,
das für D-Analin-Racemase
für Bacilli
kodiert.
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Bei einem Beispiel für ein Selektionsschema
wird ein Arzneimittel eingesetzt, um das Wachstum einer Wirtszelle
anzuhalten. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen
transformiert werden, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz
verleiht, und überleben
so die Selektionsbedingungen. Bei Beispielen für eine solche dominante Selektion
werden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl.
Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science
209, 1422 (1980)) oder Hygromycin verwendet. Sugden et al., Mol.
Cell. Biol. 5, 410–413
(1985). Bei den drei oben angeführten
Beispielen werden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle eingesetzt,
um Resistenz gegen das entsprechende Arzneimittel G418 oder Neomycin
(Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure)
bzw. Hygromycin zu verleihen.
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Ein weiteres Beispiel für geeignete
selektierbare Marker für
Säugetierzellen
sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der
VRP-Nucleinsäure
kompetent sind, wie DHFR oder Thymidin-Kinase. Die Säugetier-Zelltransformanten
werden Selektionsdruck ausgesetzt, den allein nur die Transformanten
aufgrund dessen überleben
können,
dass sie den Marker aufgenommen haben. Selektionsdruck wird ausgeübt, indem
die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen
die Selektionsmittel-Konzentration im Medium daraufhin verändert wird,
was sowohl zur Amplifizierung des Selektionsgens als auch der DNA
führt,
die für
VRP kodiert. Amplifizierung ist das Verfahren, durch das Gene, bei
denen ein größerer Bedarf
für die
Produktion eines für
Wachstum entscheidenden Proteins besteht, im Tandem innerhalb der
Chromosome nachfolgender Generationen rekombinanter Zellen wiederholt
werden. Aus der amplifizierten DNA werden erhöhte Mengen an VRP synthetisiert.
Andere Beispiele für
amplizierbare Gene sind Metallothionein-I- und -II-, vorzugsweise
Primaten-Metallothionein-Gene,
Adenosin-Desaminase, Ornithin-Decarboxylase usw.
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Beispielsweise werden Zellen, die
mit dem DHFR-Selektionsgen transfomiert werden, zunächst durch Kultivieren
all der Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das
Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven DHFR-Antagonisten, enthält. Eine
geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die
China-Hamster-Eierstock (CHO-) Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt,
hergestellt und verbreitet, wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben. Die transformierten
Zellen werden dann erhöhten
Methotrexat-Mengen ausgesetzt. Das führt zur Synthese mehrerer Kopien
des DHFR-Gens und damit einhergehend mehrerer Kopien anderer DNA,
die die Expressionsvektoren umfasst, wie für VRP kodierender DNA. Diese
Amplifizierungstechniken können
bei jedem ansonsten geeigneten Wirt eingesetzt werden, z. B. ATCC
Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet des Vorhandenseins von endogenem DHFR, wenn
beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen eingesetzt wird, das in hohem
Maße resistent
gegen Mtx ist (
EP 117.060 ).
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Alternativ dazu können Wirtszellen [insbesondere
Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten], die mit DNA-Sequenzen
transformiert oder co-transformiert sind, die für VRP, DHFR-Protein der Wildform und
einen anderen selektierbaren Marker wie Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase
(APH) kodieren, durch Zeltwachstum in Medium selektiert werden,
das ein Selektionsmittel für
den selektierbaren Marken enthält,
wie Aminoglykosidin-Antibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder
G418. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
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Ein geeignetes Selektionsgen zur
Verwendung bei Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden
ist. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al.,
Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980). Das trp1-Gen
stellt einen Selektionsmarker für
einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan
zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder Peptid4-1. Jones,
Genetics 85, 12 (1977). Das Vorhandensein der trp1-Läsion im
Hefe-Wirtszellengenom liefert dann eine wirksame Umgebung für die Detektion
der Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Auf ähnliche
Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626)
durch bekannte Plasmide ergänzt,
die das Leu2-Gen
aufweisen.
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Außerdem können Vektoren, die vom zurkulären 1,6 μm-Plasmid
pKD1 abgeleitet sind, für
die Transformation von Gluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi
et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). In jüngerer Vergangenheit wurde
ein Expressionssystem für
die Produktion von rekombinantem Kälber-Chymosin in großem Maßstab für K. lactis
berichtet. Van den Berg, Bio/Technology, 8, 135 (1990). Stabile
Mehrfachkopie-Expressionsvektoren für die Sekretion von reinem
rekombinantem humanem Serumalbumin durch industrielle Kluyveromyces-Stämme wurde
ebenfalls offenbart. Fleer et al., Bio/ Technology 9, 968–975 (1991).
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(iv) Promotor-Komponente
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Expressions- und Klonierungsvektoren
enthalten üblicherweise
einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel
an die VRP-Nucleinsäure
gebunden ist. Promotoren sind stromauf (5') vom Startcodon eines strukturellen
Gens (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1.000 bp) angeordnete
untranslatierte Sequenzen, die die Transkription und Translation
bestimmter Nucleinsäuresequenz,
wie der VRP-Nucleinsäuresequenz,
steuern, an die sie operabel gebunden sind. Derartiger Promotoren
fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive.
Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf eine
gewisse Änderung
der Kulturbedingungen, z. B. Vorhandensein oder Fehlen eines Nährstoffs
oder Veränderung
der Temperatur, erhöhte
Mengen an Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle in Gang setzen.
Zur Zeit ist eine große
Anzahl von Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl potentieller Wirtszellen
erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an für VRP kodierende
DNA gebunden, indem der Promotor von der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau
entfernt wird und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert
wird. Sowohl die native VRP-Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren
können
verwendet werden, um die Amplifizierung und/oder Expression der
VRP-DNA zu lenken. Es
werden jedoch heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im Allgemeinen
im Vergleich zum nativen VRP-Promotor eine größere Transkription und höhere Ausbeuten
an VRP zulassen.
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Promotoren, die zur Verendung bei
prokaryotischen Wirten geeignet sind, sind die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme
(Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281,
544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem
(Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980);
EP 36.776 ) und Hybrid-Promotoren, wie
der tac-Promotor. DeBoer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983).
Es eignen sich jedoch auch andere bekannte bakterielle Promotoren.
Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht
worden, wodurch es einem Fachmann ermöglicht wird, sie operabel an
DNA zu ligieren, die für VRP
kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), indem Linker oder
Adaptoren verwendet werden, um erforderliche Restrik tionsstellen
bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen
enthalten üblicherweise
auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel an die für VRP kodierende
DNA gebunden ist.
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Promotorsequenzen für Eukaroyten
sind bekannt. So gut wie alle eurkaryotischen Gene weisen eine AT-reiche
Region auf, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle
befindet, wo die Transkription in Gang gesetzt wird. Eine weitere
Sequenz, die 70 bis 80 Basenpaare stromauf vom Transkriptionsstar
vieler Gene zu finden ist, ist eine CXCAAT-REgion, worin X ein beliebiges
Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende
der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz,
die das Signal für
die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodierungssequenz sein kann.
Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische
Expressionsvektoren insertiert.
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Beispiele für geeignete Promotorsequenzen
zur Verwendung bei Hefe-Wirten sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase
(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische
Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland,
Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase,
3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase
und Glucokinase.
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Andere Hefe-Promotoren, die induzierbare
Promotoren sind, die den zusätzlichen
Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription
aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkohol-Dehydrogenase 2,
Iscytochrom C, Saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoff-Stoffwechsel
in Zusammenhang stehen, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
sowie Enzyme, die für
Maltose- und Galactose-Nutzung
verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung
bei der Hefe-Expression werden näher
in der EP-A-73.657 beschrieben. Hefe-Enhancer werden bei Hefe-Promotoren
ebenfalls vorteilhaft verwendet.
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Die VRP-Transkription von Vektoren
in Säugetier-Wirtszellen
wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die von den Genomen
von Viren wie Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus (UK 2.211.504,
veröffentlicht
am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus,
Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus
und am meisten bevorzugt Simian Virus 40 (SV40), von heterologen
Säugetierpromotoren,
z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulin-Promotor, von Hitzeschock-Promotoren
und von dem Promotor erhalten wird, der normalerweise mit der VRP-Sequenz
assoziiert ist, mit der Maßgabe,
dass derartige Promotoren mit den Wirtszellensystemen verträglich sind.
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Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus
werden zweckmäßig als
SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung
enthält.
Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science
209, 1422–1427
(1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Aad. Sci. USA 78, 2398–7402 (1981).
Der unmittelbar frühe
Promotor des Human-Cytomegalovirus wird zweckmäßig als Hindlll-E-Restriktionsfragment
erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zum
Exprimieren von DNA in Säugetier-Wirten
unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor wird in US-Patent
Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems wird in
US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature
295, 503-508 (1982)
bezüglich
der Expression von cDNA, die für
Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297,
598–601
(1982) bezüglich
der Expression von Human-β-Interferon-cDNA
in Mäusezellen
unter der Kontrolle eines Thymidin-Kinase-Promotors von Herpes simplex-Virus;
Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982)
bezüglich
der Expression des Human-Interferon β1-Gens in kultivierten Mäuse- und Kaninchenzellen;
sowie Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982)
bezüglich
der Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen,
Hühnerembryo-Fibroblasten,
China-Hamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter Einsatz der langen
terminalen Wiederholung von Rous-Sarcomavirus als Promotor.
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(v) Enhancerelementkomponente
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Die Transkription einer DNA, die
für das
VRP gemäß vorliegender
Erfindung durch höhere
Eukaryoten kodiert, wird häufig
durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer
sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise
etwa von 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine
Transkription zu erhöhen.
Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und
sind 5' (Laimins
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol.
Cell. Bio. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit gefunden worden,
innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) ebenso
wie innerhalb der Kodierungssequenz selbst. Osborne et al., Mol.
Cell Bio. 4, 1293 (1984). Heute sind viele Enhancersequenzen von
Säugetier-Genen
bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise
jedoch wird ein Enhancer von einem eukaryotischen Zellvirus eingesetzt.
Beispiele sind der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikatikonsursprungs
(bp 100-270), der
frühe Promotor-Enhancer
von Cytomegalovirus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite
des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv,
Nature 297, 17–18
(1982) bezüglich
Verstärkungselemente
für die
Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann einer Position
5' oder 3' zur VRP-Kodierungssequenz
in den Vektor gespleißt
werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
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(vi) Transkriptionsterminationskomponente
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Expressionsvektoren, die in eukaryotischen
Wirtszellen verwendet werden (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-,
Tier-, Menschen- oder kernhältigen
Zellen von anderen mehrzelligen Organismen) enthalten auch Sequenzen,
die für
die Beendigung der Transkription und zur Stabilisation der mRNA
notwendig sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise von den untranslatierten
5'- und gegebenenfalls
3'-Regionen eukaryotischer oder
viraler DNAs oder cDNAs verfügbar.
Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte
Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für VRP kodierenden mRNA transkribiert
werden.
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(vii) Konstruktion und
Analyse von Vektoren
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Für
die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der
oben angeführten
Komponenten enthalten, werden Standard-Ligationstechniken eingesetzt.
Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten
und in der Form wieder ligiert, mit der die erforderlichen Plasmide
erzeugt werden sollen.
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Zur Analyse zur Bestätigung korrekter
Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische
verwendet, um E.coli-K12-Stamm 294 (ATCC 3.446) zu transformieren,
und erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls durch Ampicillin-
oder Tetracyclinresistenz ausgewählt.
Plasmide von den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleasedigestion
analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic
Acids Res. 9, 309(1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al.,
Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
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(vii) Vorübergehende
Expressionsvektoren
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sBesonders nützlich in der praktischen Umsetzung
der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende
Expression in Säugetierzellen
von für
VRP kodierender DNA sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende
Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der effizient
in einer Wirtszelle replizieren kann, so dass die Wirtszelle viele
Kopien des Expressionsvektors ansammelt und wiederum hohe Mengen
eines gewünschten
Polypeptids synthetisiert, für
das der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., oben, S. 16.17–16.22.
Vorübergehende
Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine
Wirtszelle umfassen, ermöglichen
die zweckmäßige positive
Identifizierung von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren,
sowie das rasche Screenen derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische
oder physiologische Eigenschaften. So sind vorübergehende Expressionssysteme
gemäß vorliegender
Erfindung besonders nützlich,
um Analoge und Varianten von VRP zu identifizieren, die biologisch
aktiver VRP sind.
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(ix) Geeignete exemplarische
Wirbeltierzellvektoren
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Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen,
die für
die Anpassung an die Synthese von VRP in rekombinierter Wirbeltierzellkultur
geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981);
Mantei et al., Nature 281, 40–46
(1979); der
EP 117.060 ;
und der
EP 117.058 beschrieben.
Ein besonders nützliches Plasmid
für die
Säugetier-Zellkulturexpression
von VRP ist pRK5 (
EP 307.247 )
oder pSV16B. WO 91/02891, Veröffentlichungsdatum
13. Juni 1991.
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C. Selektion und Transformation
von Wirtszellen
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Geeignete Wirtszellen für die Klonierung
oder Expression der DNA in den Vektoren gemäß vorliegender Erfindung sind
die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren eukaryotischen
Zellen. Geeignete Prokaryoten für
diesen Zweck sind Eubakterien, wie z. B. Gram-negative oder Gram-positive
Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.
B. E.coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella,
z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans,
und Shigella, sowie Bacilli wie B. subtilis und B. licheniformis
(z. B. B. licheniformis 41 P, offenbart in der DD 266.710, veröffentlicht
am 12. April 1989). Pseudomonas, wie P. aeruginosa und Streptomyces.
Ein bevorzugter E.coli-Klonierungswirt ist E.coli 294 (ATCC 41.446),
es eignen sich jedoch auch andere Stämme, wie z. B. E.coli B, E.coli
X1776 (QTCC41.537) und E.coli W3110 (ATCC27.235). Diese Beispiele
dienen der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung. Stamm
W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da es
sich um einen üblichen
Wirtsstamm für
rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen handelt. Vorzugsweise sollte
die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen ausscheiden.
Beispielsweise kann Stamm 3110 modifiziert werden, um eine genetische
Mutation in den Genen zu bewirken, die für Proteine kodieren, wobei
Beispiele für derartige
Wirte E.coli W3110-Stamm 27C7 umfassen. Der vollständige Genotyp
von 27C7 ist tonAΔptr3 phoAΔE15 (argF-lac)169
ompTΔ deg
P41 kan. Stamm 27C7 wurde am 30 Oktober 1991 in der American Type Culture
Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann
der Stamm von E. coli mit mutierten periplasmatischer Protease eingesetzt
werden, der im am 7. August 1990 ausgegebenen US- Patent Nr. 4.946.783 offenbart wird.
Als weitere Alternative dazu eignen sich Klonierungsverfahren, beispielsweise
PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen.
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Neben Prokaryoten eignen sich auch
eukaryotische Mikrobe, wie Fadenpilze oder Hefe als Klonierungs-
oder Expressionswirte für
für VRP
kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Backhefe
ist der am häufigsten
verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Es sind jedoch
auch eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme leicht erhältlich und
gemäß vorliegender
Erfindung nützlich, wie
Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature 290, 140 (1981);
EP 139,383 , veröffentlicht
am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer
et al., oben), wie beispielsweise K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574;
Louvencourt et al., ]. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC
12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178),
K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den
Berg et al., oben), K. thermotoleans und K. marxianus; Yarowia [
EP 402.22 ]; Pichia pastoris (
EP 183.070 ; Sreekrishna et
al., ]. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma
reesia (
EP 244.234 );
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979));
Schwanniomyces, wie Schwanniomyces occidentalis (
EP 394,538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990);
und Fadenpilze, wie beispielsweise Neurospora, Penicillium, Tolypocladium
(WO 91/00357, veröffentlicht
am 10. Jänner
1991), sowie Aspergillus-Wirte wie A. nidulans (Ballance et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al.,
Gene 26, 205–221
(1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984))
und A. niger, Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985).
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Geeignete Wirtszellen für die Expression
von glykosyliertem VRP werden von mehrzelligen Organismen abgeleitet.
Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im
Prinzip ist jede höhere
eukaryotische Zeltkultur einsetzbar, gleichgültig, ob sie aus Wirbeltier-
oder Wirbellosen-Kultur stammt. Beispiele für Wirbellosen-Zellen sind Pflanzen-
und Insektenzellen. Es sind zahlreiche baculovirale Stämme und
Varianten sowie entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten
wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes
albopictus (Moskito), Drosophila meanogaster (Obstfliege) und Bonbyx
mori identifiziert worden. Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology
6, 47–55 (1988);
Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow et al. (Hrsg.), Bd.
8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279; sowie Maeda et al., Nature
315, 592–594
(1985). Eine Vielzahl viraler Stämme
für die
Transfektion sind allgemein erhältlich,
beispielsweise die L-1-Variante von Autographa californica NPV und
der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können hierin
als Virus gemäß vorliegender
Erfindung eingesetzt werden, insbesondere für die Transfektion von Spodoptera
frugiperda-Zellen.
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Pflanzenzellkulturen aus Baumwolle,
Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als
Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch
Inkubation mit bestimmten Stämmen
des Bacteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das zuvor
manipuliert worden ist, um die für
VRP kodierende DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellenkultur
mit A. tumefaciens wird die für das
VRP kodierende DNA auf den Pflanzenzellenwirt übertragen, so dass sie transfiziert
wird und unter angemessenen Bedingungen die für VRP kodierende DNA exprimiert.
Außerdem
sind Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen
kompatibel sind, wie die Nopalinsynthasepromotor- und Polyadenylierungssignalsequenzen.
Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem können DNA-Segmente, die von
der stromauf befindlichen Region des T-DNA 780-Gens isoliert werden,
die Transkriptionsmengen der Pflanzen-exprimierbaren Gene in rekombinante
DNA enthaltendem Pflanzengewebe aktivieren oder erhöhen.
EP 321.196 , veröffentlicht
am 21. Juni 1989.
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Jedoch war das Interesse an Wirbeltierzellen
am größten, und
die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist
heute ein Routineverfahren. Siehe z. B. Tissue Culture, Academic
Press, Kruse und Patterson (Hrsg.) (1973). Beispiele für nützliche
Säugetier-Wirtszellenlinien
sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651);
humane embryonale Nierenlinie (293 oder 2983-Zellen, subklo niert
für das
Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36,
59 (1977)); Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10);China-Hamster-Eierstockzellen(-DHFR
(CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980));
Mäuse-Sertolizellen
(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)), Affennierenzellen
(CV1 ATCC CCL 70); Afrikanische Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76,
ATCC CRL-1587);
humane Zervikalkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen
(MDCK, ATCC CCL 34), Büffetratten-Leberzellen
(BRL 3A, ATCC CRL 1442); Menschen-Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), Menschen-Leberzellen
(Hep G2, HB 8065); Mäuse-Milchdrüsentumor
(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y.
Acad. Sci. 383; 44–68
(1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; und eine humane Hepatomlinie
(Hep G2).
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Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen
Expressions- oder Klonierungsvektoren für die VRP-Produktion transfiziert
und vorzugsweise transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die
auf angemessene Weise modifiziert waren, um Promotoren zu induzieren,
Transfomanten auszuwählen oder
die für
die gewünschten
Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren.
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Transfektion bezeichnet die Aufnahme
eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon,
ob tatsächlich
irgendwelche Kodierungssequenzen exprimiert werden. Fachleuten auf
dem Gebiet der Erfindung sind zahlreiche Verfahren zur Transfektion
bekannt, beispielsweise CaPO4 und Elektroporation.
Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen festgestellt, wenn
irgendein Hinweise für
die Tätigkeit
dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
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Transformation bedeutet das Einführen von
DNA in einem Organismus, so dass die DNA entweder als extrachromosomales
Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. In
Abhängigkeit
von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter
Einsatz von Standardtechniken, die derartigen Zellen zu eigen sind.
Die Kalziumbehandlung unter Einsatz von Kalziumchlorid, wie in Abschnitt
1.82 von Sam brook et al., oben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen
für Prokaryoten
oder andere Zellen eingesetzt, die wesentliche Zellwandbarrieren
enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transformation
bestimmter Pflanzenzellen eingesetzt, wie von Shaw et al., Gene
23, 315 (1983), und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben.
Außerdem
können
Pflanzen unter Einsatz von Ultraschallbehandlung transfiziert werden,
wie in der am 10. Jänner
1991 veröffentlichten
WO 91/00358 beschrieben.
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Für
Säugetierzellen
ohne derartige Zellwände
wird das Kalziumphosphat-Fällungsverfahren
von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine
Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen
sind im am 16. August 1983 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.399.216
beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise
nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977),
und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es
können
jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen eingesetzt
werden, etwa durch Nucleus-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle
Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, beispielsweise
Polybren, Polyornithin usw. Verschiedene Techniken zur Transformation
von Säugetierzellen
sind Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990),
und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988), zu entnehmen.
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D. Kultivieren der Wirtszellen
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Prokaryotische Zellen, die verwendet
werden, um das VRP-Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung zu
erzeugen, werden in geeigneten Medien kultiviert, wie von Sambrook
et al., oben, beschrieben.
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Die Säugetier-Wirtszellen, die verwendet
werden, um das VRP gemäß vorliegender
Erfindung zu erzeugen, können
in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche
Medien, wie Ham's
F10 (Sigma); Minimal Essential Medium ([Membran], Sigma). RPMI-1640
(Sigma) und Dulbecco's
Modified Eagle's Medium
([DMEM], Sigma) eignen sich zum Kultivieren der Wirtszellen. Außerdem können beliebige
der Medien, die in Ham und Wallace Meth. Enz. 58, 44 (1979), Bannes
und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); den US-Patenten Nr. 4.767.704;
Nr. 4.657.866; Nr. 4.927.762; Nr. 4.560.655; oder Nr. 5.122.469;
WO 90/03430; WO 87/00195; oder US-Patent Re. 30.985 beschrieben
werden, können
als Kulturmedien für
die Wirtszellen verwendet werden. Alle diese Medien können nach
Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin,
Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid,
Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. HEPES), Nucleosiden
(wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. GentamycinTM-Arzneimittel),
Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise
in Endkonzentrationen im mikromolekularen Bereich vorliegen) und
Glucose- oder einer äquivalenten
Energiequelle ergänzt
werden. Alle anderen erforderlichen Ergänzungen können in geeigneten Konzentrationen
enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH und dergleichen,
sind jene, die zuvor bei der für
die Expression gewählten
Wirtszelle eingesetzt wurden, und sind Fachleuten auf dem Gebiet
der Erfindung klar.
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Im Allgemeinen sind Prinzipien, Protokolle
und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Säugetier-Zellkulturen
in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler
(Hrsg.) (IRL Press, 1991) zu finden.
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Die Wirtszellen, auf die in der vorliegenden
Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie
Zellen, die innerhalb eines Wirtstieres vorliegen.
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E. Detektion von Genamplifizierung/Expression
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Genamplifizierung und/oder Expression
kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch
herkömmliches
Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription
von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting
(DNA-Analyse) oder Hybridisierung in situ, wobei eine angemessen
markierte Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen
eingesetzt wird.
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Es können verschiedene Markierungen
eingesetzt werden, am häufigsten
Radioisotope, insbesondere 32P. Es können jedoch
auch andere Techniken eingesetzt werden, wie die Verwendung von
Biotin-modifizierten Nucleotiden zum Einbringen in ein Polynucleotid.
Das Biotin dient dann als Stelle für die Bindung an Avidin oder
Antikörper,
die mit einer großen
Vielzahl von Markierungen markiert sein können, wie Radionuclide, Fluoreszenzmittel,
Enzyme oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die
spezifische Duplexe erkennen können,
einschließlich
DNA-Duplexe, RNA-Duplexe
und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können wiederum
markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an
eine Oberfläche
gebunden ist, so dass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche das
Vorhandensein von an den Duplex gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
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Genexpression kann alternativ dazu
durch immunologische Verfahren gemessen werden, beispielsweise immunhistochemisches
Färben
von Gewebeabschnitten und Test von Zeltkultur- oder Körperflüssigkeiten,
um die Genprodukt-Expression direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen
Färbungstechniken wird
eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratation und
Fixierung, gefolgt von Umsetzung mit markierten Antikörpern, die
für das
gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Markierungen üblicherweise
visuell detektierbar sind, wie enzymatische Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen,
Lumineszenzmarkierungen und dergleichen. Eine besonders empfindliche
Färbungstechnik,
die sich zur Verwendung gemäß vorliegender
Erfindung eignet, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980),
beschrieben.
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Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder
den Test von Probenfluids nützlich
sind, können
entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem Säugetier
hergestellt werden. Zweckmäßigerweise
können
die Antikörper
gegen ein natives VRP-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf
Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen hergestellt werden,
wie im nachstehenden Abschnitt 4 detail-lierter beschrieben.
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F. Reinigung von VRP-Polypeptid
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VRP wird aus dem Kulturmedium vorzugsweise
als sekretiertes Polypeptid gewonnen, es kann jedoch auch aus Wirtszellen-Lysaten
gewonnen werden, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal erzeugt
wird. Wenn das VRP Membran-gebunden ist, kann es aus der Membran
unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z. B. Triton-X 100) freigesetzt
werden.
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Wenn VRP in einer rekombinanten Zelle
erzeugt wird, die nicht humanen Ursprungs ist, ist das VRP vollständig frei
von Proteinen oder Polypeptiden humanen Ursprungs. Es ist jedoch
notwendig, VRP aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden
zu reinigen, um Präparate
zu erhalten, die im Wesentlichen homogen sind, was VRP betrifft.
Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert,
um teilchenförmige
Zelltrümmer
zu entfernen. VRP wird daraufhin von verunreinigenden löslichen
Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren
für geeignete
Reinigungsverfahren exemplarisch sind: durch Fraktionierung auf
einer lonenaustauschsäule;
Ethanol-Fällung;
Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselsäure oder einem Kationen-Austauschharz
wie DEAE; Chromatofokusssierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration
beispielsweise unter Einsatz von Sephade G-75; sowie Protein A-Sepharose-Säulen, um
Verunreinigungen wie IG zu entfernen.
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Bei der bevorzugten Ausführungsform
ist die Flt4-Rezeptor-IgG-Fusion auf einer Affinitätschromatographiesäule immobilisiert,
und das VRP kann durch Affinitätsreinigung
unter Einsatz dieser Säule
isoliert werden. Alternativ dazu wird das VRP an seinem N-Terminus
an eine Glykoprotein D-Sequenz gebunden und wird über eine
Affinitätschromatographiesäule geschickt,
auf der ein monoklonaler Anti-gD-Antikörper wie 5B6 immobilisiert
ist, der für
eine Glykoprotein D-Sequenz spezifisch ist.
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VRP-Varianten, in denen Reste deletiert,
insertiert oder substituiert worden sind, werden auf die gleiche
Weise wie natives VRP gewonnen, wobei jegliche wesentliche Änderungen
der Eigenschaften berücksichtigt
werden, für
die die Variation Anlass gibt. Beispiels weise erleichtert die Herstellung
einer VRP-Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, beispielsweise
einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Immunaffinitätssäule, die
Antikörper
gegen das Antigen enthält,
kann eingesetzt werden, um das Fusionspolypeptid zu adsorbieren.
Immunaffinitätssäulen, wie
eine polyklonale Kaninchen-Anti-VRP-Säule, kann eingesetzt werden,
um die VRP-Variante zu absorbieren, indem sie an zumindest ein verbleibendes
Immunepitop gebunden wird.
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Ein Protease-Inhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF), kann ebenfalls nützlich
sei, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen,
und Antibiotika können
enthalten sein, um das Wachstum zufälliger Verunreinigungen zu
verhindern, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird klar sein, dass
Reinigungsverfahren, die für
native VRP geeignet sind, eine Modifikation erfordern können, um
Veränderungen
im Charakter von VRP oder seiner Varianten bei der Expression in
rekombinanter Zeltkultur zu berücksichtigen.
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G. Kovalente Modifikationen
von VRP-Polypeptiden
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Kovalente Modifikationen von VRP-Polypeptiden
fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Sowohl natives
VRP als auch Aminosäuresequenzvarianten
des VRP können
kovalent modifiziert werden. Ein Typ kovalenter Modifikation des
VRP wird in das Molekül
eingeführt,
indem Target-Aminosäurereste des
VRP mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden,
das fähig
ist, mit ausgewählten
Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des VRP zu reagieren.
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Cysteinylreste werden am häufigsten
mit α-Halogenacetaten
(und entsprechenden Aminen) umgesetzt, wie z. B. Chloressigsäure oder
Chloracetamid, was Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate ergibt.
Cysteinylreste werden ebenfalls durch die Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat
N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat,
2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
derivatisiert. Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat
mit pH 5,5 bis 7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidyl-Seitenkette
relativ spezifisch ist. p-Bromphenacylbromid
ist ebenfalls nützlich;
die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH
6,0 durchgeführt.
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Lysinyl und aminoterminale Reste
werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die
Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der
Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung
von α-aminohältigen Resten
sind Imidoester, wie Methylpicolinimidat, Pyrodoxalphosphat, Pyridoxal,
Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminase-katalysierte
Reaktion mit Glyoxylat.
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Arginylreste werden durch Umsetzung
mit einem oder mehreren herkömmlichen
Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion
und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten macht es aufgrund
des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe
erforderlich, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt werden.
Weiters können
diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Arginin-ε-Aminogruppe
reagieren.
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Die spezifische Modifikation von
Tyrosylresten kann durchgeführt
werden, wobei besonderes Interesse daran besteht, durch Umsetzung
mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan Spektralmarkierungen
in Tyrosylreste einzubringen. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol
und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitro-Derivate
zu bilden. Tyrosylreste werden unter Einsatz von 1251
oder 131I iodiert, um markierte Proteine
zur Verwendung bei Radioimmuntest herzustellen, wobei das Chloramin-T-Verfahren
geeignet ist.
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Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl
oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, wobei
R und R' unterschiedliche
Alyklgruppen sind, wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid
oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid.
Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen
in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
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Derivatisierung mit bifunktionellen
Mitteln ist nützlich,
um VRP zur Verwendung beim Verfahren zur Reinigung von Anti-VRP-Antikörpern mit
einer wasserunlöslichen
Trägermatrix
oder Oberfläche
zu vernetzen und umgekehrt. Üblicherweise
verwendete Vernetzungsmittel sind beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit
4-Azidosalicylsäure,
homobifunktionelle Imidoester, darunter Disuccinimidylester, wie
3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat),
und bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel
wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben lichtaktivierbare
Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht Vernetzungen bilden
können.
Alternativ dazu werden reaktive Wasser-unlösliche Matrizen, wie Bromcyan-aktivierte
Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten
Nr. 3.969.287; Nr. 3.691.128; Nr. 4.247.642; Nr. 4.229.537; und
Nr. 4.330.440 beschrieben werden, zur Protein-Immobilisierung eingesetzt.
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Glutaminyl- und Asparaginylreste
werden häufig
zu den entsprechenden Glutamyl- bzw.
Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder
basischen Bedingungen desamidiert. Die desamidierte Form dieser
Reste fällt
in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
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Andere Modifikationen sind die Hydroxylierung
von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von
Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen
von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton,
Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman Co.,
San Francisco, S. 79–86
(1983)), die Acetylierung von N-terminalem Amin und die Amidierung
einer C-terminalen Carboxylgruppe.
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Ein weiterer Typ kovalenter Modifikation
des VRP-Polypeptids, der in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung
fällt,
umfasst das Abändern
des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Mit Abänderung
ist die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydrat-Gruppierungen,
die im nativen VRP zu finden sind, und/oder die Addition einer oder
mehrerer Glykosylierungsstellen gemeint, die im nativen VRP nicht
vorhanden sind.
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Die Glykosylierung von Polypeptiden
ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezeichnet die
Bindung der Kohlenhydrat-Gruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die
Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin
X eine beliebige Aminosäure
mit Ausnahme von Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische
Bindung der Kohlenhydrat-Gruppierung an die Asparagin-Seitenkette.
Somit schafft das Vorhandensein einer dieser Tripeptidsequenzen
in einem Polypeptid eine potentielle Glykosylierungsstelle. 0-gebundene
Glykosylierung bezeichnet die Bindung eines der Zucker N-Acetylgalactosamin,
Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin,
es können
jedoch auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden.
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Die Addition von Glykosylierungsstellen
zum VRP-Polypeptid wird zweckmäßig erreicht,
indem die Aminosäuresequenz
so abgeändert
wird, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen
(für N-gebundene
Glykosylierungsstellen) enthält.
Die Änderung
kann auch durch die Addition von oder Substitution durch einen oder
mehrere Serin- oder Threoninreste an der nativen VRP-Sequenz (für O-gebundene
Glykosylierungsstellen) vorgenommen werden. Zur Erleichterung wird
die VRP-Aminosäuresequenz vorzugsweise
durch Veränderungen
auf DNA-Ebene geändert,
insbesondere durch Mutieren der für das VRP-Polypeptid kodierenden
DNA an vorgewählten
Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten
Aminosäuren
translatieren. Die DNA-Mutation(en) kann bzw. können unter Einsatz von Verfahren vorgenommen
werden, die oben und im oben genannten US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben
werden.
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Ein weiteres Mittel zum Erhöhen der
Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen auf dem VRP-Polypeptid ist jenes
durch chemisches oder enzymatisches Koppeln von Glykosiden an das
Polypeptid. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als sie nicht
die Produktion des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die
Glykosylierungsfähigkeiten
für N-
oder O-gebundene Glykosylierung aufweist. In Abhängigkeit von der verwendeten Kopplungsart,
kann/können
der bzw. die Zucker an (a) Arginin und Hidistin, (b) freie Carboxylgruppen,
(c) freie Sulfhydrylgruppen wie jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen
wie jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische
Reste wie jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f)
die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren werden
in der am 11. September 1987 veröffentlichten
WO 87/05330 und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, S.
259–306
(1981) beschrieben.
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Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen,
die auf dem VRP-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch
erreicht werden. Chemische Deglykosylierung erfordert das Einwirken
der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten
Verbindung auf das Polypeptid. Diese Behandlung führt zur
Spaltung eines Großteils
der oder aller Zucker mit Ausnahme des Bindungszuckers (N-Acetylglucosamin
oder N-Acetylgalactosamin),
während
das Polypeptid intakt belassen wird. Chemische Deglykosylierung wird
von Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys, 259, 52 (1987) und
von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische
Spaltung der Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch
die Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht
werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987),
beschrieben.
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Die Glykosylierung an potentiellen
Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin
verhindert werden, wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 25705 (1982)
beschrieben. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glykosid-Bindungen.
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Ein weiterer Typ kovalenter Modifikation
von VRP umfasst das Binden des VRP-Polypeptids an eines aus einer
Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, beispielsweise Polyethylenglykol,
Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, auf die Weise, wie in
den US-Patenten Nr. 4.640.835, Nr. 4.496.689; Nr. 4.301.144; Nr. 4.670.417,
Nr. 4.791.192 oder Nr. 4.179.337 dargelegt.
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Da es häufig schwierig ist, im Voraus
die Eigenschaften eines varianten VRP vorherzusagen, ist festzustellen,
dass ein gewisses Screenen der gewonnenen Variante erforderlich
ist, um die optimale Variante auszuwählen. Eine Veränderung
der immunologischen Charakters des VRP-Moleküls, wie Affinität für einen
bestimmten Antikörper,
kann auch durch einen kompetitiven Immuntest gemessen werden. Die
Variante wird durch Vergleich mit der Aktivität, die bei nativem VRP im gleichen
Test beobachtet wird, auf Änderungen
in der Unterdrückung
oder Verstärkung
ihrer mitogenen Aktivität
getestet. Beispielsweise kann bezüglich der Fähigkeit des varianten VRP gescreent
werden, Protein-Kinase-Aktivität des Flt4-Rezeptors
wie im Beispiel 5 der vorliegenden Beschreibung beschrieben zu stimulieren.
Andere potentielle Modifikationen von Protein- oder Polypeptid-Eigenschaften,
wie Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit
für proteolytischen Abbau
oder die Tendenz zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden
nach Verfahren getestet, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt
sind.
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H. Epitop-markiertes VRP
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Die vorliegende Erfindung umfasst
chimäre
Polypeptide, die an ein anderes Polypeptid fusioniertes VRP umfassen.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das chimäre
Polypeptid eine Fusion des VRP mit einem Marker-Polypeptid, das
ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Marker-Antikörper selektiv binden
kann. Der Epitop-Marker wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyl-Terminus
des VRP angeordnet. Derartige Epitop-Marker-Formen des VRP sind
wünschenswert,
da ihr Vorhandensein unter Einsatz eines markierten Antikörpers gegen
das Marker-Polypeptid detektiert werden kann. Ebenso ermöglicht es
das Bereitstellen des Epitop-Markers, dass das VRP leicht durch
Affinitätsreinigung
unter Einsatz des Anti-Marker-Antikörpers gereinigt wird. Affinitätsreinigungstechniken
und Diagnosetests, an denen Antikörper beteiligt sind, werden
weiter unten beschrieben.
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Marker-Polypeptide und ihre jeweiligen
Antikörper
sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele sind das
fluHA-Marker-Polypeptid und sein Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol.
Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988));
der c-myc-Marker und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dafür (Evan
et al., Molecular und Cellular Biology, 5; 3610–3616 (1985)); und der Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein
D- (gD-) Macker und sein Antikörper.
Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6), 547–553 (1990). Andere Marker-Polypeptide sind
offenbart worden. Beispiele sind das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology,
6, 1204–1210
(1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992));
ein α-Tubulin-Epitop-Peptid
(Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und der T7-Gen-10-Proteinpeptid-Marker.
Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87-6393-6397
(1990). Sobald das Marker-Polypeptid ausgewählt worden ist, kann ein Antikörper dagegen
unter Einsatz von hierin offenbarten Techniken erzeugt werden.
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Die allgemeinen Verfahren, die sich
für die
Konstruktion und Produktion von VRP mit Epitop-Marker eignen, sind
die gleichen wie oben in Bezug auf (natives oder variantes) VRP
offenbart. VRP-Marker-Polypeptidfusionen werden am zweckmäßigsten
konstruiert, indem die cDNA-Sequenz, die für den VRP-Abschnitt kodiert,
im Rahmen an die Marker-Polypeptid-DNA-Sequenz fusioniert wird und
das resultierende DNA-Fusionskonstrukt in geeigneten Wirtszellen
exprimiert wird. Üblicherweise
wird, wenn die VRP-Marker-Polypeptid-Chimären gemäß vorliegender
Erfindung hergestellt werden, Nucleinsäure, die für das VRP kodiert, an ihrem 3'-Ende an Nucleinsäure fusioniert,
die für
den N-Terminus des Marker-Polypeptids kodiert, es sind jedoch auch
5'-Fusionen möglich.
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VRP mit Epitop-Marker kann zweckmäßig durch
Affinitätschromatographie
unter Einsatz des Anti-Marker-Antikörpers gereinigt werden. Die
Matrix, an die der Affinitätsantikörper gebunden
ist, ist am häufigsten Agarose,
es stehen jedoch auch andere Matrizen zur Verfügung (z. B. Glas mit kontrollierten
Poren oder Poly(styroldivinyl)benzol). Das VRP mit Epitop-Marker
kann von der Affinitätssäule eluiert
werden, indem beispielsweise der Puffer-pN oder die lonenstärke variiert
wird oder chaotrope Mittel zugegeben werden.
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2. Therapeutische Verwendungen,
Zusammensetzungen und Verabreichung von VRP
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sEs wird angenommen, das VRP therapeutische
Anwendung bei der Behandlung von Säugetieren über die Stimulation oder Hemmung
des Wachstums und/oder der Differenzierung und/oder Aktivierung
von Zellen findet, die den Flt4-Rezeptor oder einen oder mehrere
andere VRP-Rezeptoren aufweisen. Exogenes VRP kann einem Patienten
unter diesen Umständen
verabreicht werden. Das humane VRP ist klar insofern nützlich,
als es einem Menschen mit verringertem Spiegel an endogenem VRP
verabreicht werden kann, vorzugsweise in der Situation, wo ein derartige
verringerte Mengen zu einer pathologischen Störung führen oder wo keine Aktivierung
oder Hemmung des Flt4-Rezeptors in einem oder mehreren anderen VRP-Rezeptoren vorliegt.
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Verschiedene potentielle therapeutische
Verwendungen für
VRP sind jene, bei denen VEGF nützlich ist.
Beispiele dafür
sind Verwendungen, die mit dem Gefäß-Endothel verbunden sind,
wie die Behandlung von Traumata am Gefäßnetzwerk, in Anbetracht der
gezeigten raschen Förderung
der Vermehrung von die Traumata umgebenden Gefäß-Endothelzellen durch VEGF
und in Anbetracht der Beziehung zwischen VEGF und dem VRP, wie hierin
ermittelt. Beispiele für
derartige Traumata, die so behandelt werden können, sind, ohne darauf beschränkt zu sein,
chirurgische Einschnitte, insbesondere jene, die das Herz betreffen,
Wunden, einschließlich
Risswunden, Einschnitte und Penetration von Blutgefäßen, sowie
oberflächliche
Geschwüre,
die das Gefäßendothel
betreffen, wie Diabetes-, Haemophilie- und Krampfadern-Geschwüre. Andere
physiologische Zustände,
die auf Basis des selektiven mitogenen Charakters des VRP verbessert
werden können,
fallen ebenfalls in diesen Bereich.
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Für
die oben angeführten
traumatischen Indikationen wird das VRP-Molekül in einer Weise formuliert und
dosiert, die mit der guten medizinischen Praxis in Einklang steht,
wobei die spezifische zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen
Patienten, die Stelle dar Abgabe des VRP, das Verabreichungsverfahren und
andere Faktoren berücksichtigt
werden, die Praktikern bekannt sind.
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Weitere Indikationen für das VRP
finden sich bei der Behandlung von Wunden voller Dicke, wie Hautgeschwüre, einschließlich der
Kategorien der Druckgeschwüre,
Venengeschwüre
und Diabetesgeschwüre, sowie
Verbrennungen und Verletzungen voller Dicke, wo Angiogenese erforderlich
ist, um die verbrannte oder verletzte Stelle für Hauttransplantation oder
-lappen vorzubereiten. In diesem Fall wird das VRP entweder direkt
an der Stelle angewandt oder verwendet, um die Haut der den Lappen,
die transplantiert werden, vor der Transplantation einzuweichen.
Auf ähnliche
Weise kann das VRP bei plastischer Chirurgie, wenn Rekonstruktion
nach einer Verbrennung oder einem anderen Trauma erforderlich ist,
oder für
kosmetische Zwecke verwendet werden.
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Angiogenese ist auch wichtig, um
Wunden sauber und infektionsfrei zu halten. Das VRP kann daher in
Verbindung mit Allgemeinchirurgie und nach der Wiederherstellung
von Schnitten und Risswunden verwendet werden. Es ist besonders
nützlich
bei der Behandlung von Bauchwunden mit einem hohen Infektionsrisiko. Gefäßneubildung
ist auch ein Schlüssel
für die
Wiederherstellung von Brüchen,
da sich Blutgefäße an der
Stelle der Knochenverletzung entwickeln. Die Verabreichung des VRP
an die Stelle eines Bruchs ist daher ein weiteres Einsatzgebiet.
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In Fällen, wo das VPR für topische
Wundheilung eingesetzt wird, kann es auf dem nachstehend beschriebenen
Wege für
die Re-Endothelisierung von Gefäßgewebe
oder mehr bevorzugt durch topische Mittel verabreicht werden. In
diesen Fällen
wird es entweder als Lösung,
Spray, Gel, Creme, Salbe oder trockenes Pulver direkt an die Verletzungsstelle
verabreicht. Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung, die das VRP
auf die verletzte Stelle lenken, werden ebenfalls verwendet. Bei
topischen Anwendungen wird das VRP in einer Konzentration, die in
einem Bereich von etwa 50 bis 1.000 μg/ml liegt, entweder in einer
einzelnen Anwendung oder in Dosis-Verabreichungen angewandt, die
täglich
oder im Abstand weniger Tage für
einen Zeitraum von 1 Woche bis mehreren Wochen liegen. Im Allgemeinen
ist die Menge der verabreichten topischen Formulierung jene, die
ausreicht, um von etwa 0,1 bis 100 μg/cm2 des
VRP, bezogen auf die Oberfläche
der Wunde, aufzutragen.
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Das VRP kann als post-operatives
Wundheilungsmittel bei Ballon-Angioplastie eingesetzt werden, ein Verfahren,
bei dem Gefäßendothelzellen
entfernt oder beschädigt
werden, gemeinsam mit dem Zusammenpressen atherosklerotischer Plaques.
Das VRP kann durch systemische oder lokale intravenöse Anwendung entweder
als intravenöse
Bolusinjektion oder Infusionen auf Gefäßinnenflächen aufgebracht werden. Falls
erwünscht,
kann das VRP im Lauf der Zeit unter Einsatz einer Mikrometerpumpe
verabreicht werden. Geeignete Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung
umfassen das VRP in einer Menge, die wirksam Endothelzellenwachstum
fördert,
und ein parenterales Trägermaterial.
Das VRP kann in der Zusammensetzung über einen weiten Bereich von
Konzentrationen vorhanden sein, beispielsweise von etwa 50 μg/ml bis
etwa 1.000 μg/ml,
wobei Injektionen mit 3 bis 10 ml pro Patient verabreicht werden,
die einmal oder in Dosis-Verabreichungen verabreicht werden, die
mehrere Anwendungen ermöglichen.
Es können
alle bekannten parenteralen Trägervehikel
verwendet werden, wie normale Kochsalzlösung oder 5 bis 10% Dextrose.
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Das VRP kann auch eingesetzt werden,
um Endothelisierung bei Gefäßtransplantationschirurgie
zu fördern.
Im Fall von Gefäßtransplantationen,
bei denen entweder transplantierte Gefäße oder synthetisches Material
verwendet wird, kann das VRP beispielsweise auf die Oberflächen des
Transplantats und/oder an den Verbindungsstellen des Transplantats
mit der bestehenden Vaskulatur aufgetragen werden, um das Wachstum von
Gefäßendothelzellen
zu fördern.
Für solche
Anwendungen kann das VRP intravenös wie oben für Ballon-Angioplastie
beschrieben angewandt werden, oder es kann entweder vor dem oder
während
des chirurgischen Eingriffs direkt auf die Oberflächen des Transplantats
und/oder die bestehende Vaskulatur aufgetragen werden. In solchen
Fällen
kann es wünschenswert
sein, das VRP in einem verdickten Trägermaterial anzuwenden, so
dass es an der betroffenen Oberfläche haftet. Geeignete Trägermaterialien
umfassen beispielsweise 1–5%
Carbopol. Das VRP kann im Träger über einen
weiten Konzentrationsbereich enthalten sein, beispielsweise von
etwa 50 μg/mg
bis etwa 1.000 μg/
mg. Alternativ dazu kann das VRP durch eine Mikromesspumpe als parenterale
Lösung
an die Stelle abgegeben werden.
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Das VRP kann auch eingesetzt werden,
um Gefäßschädigung nach
Myocardinfarkt zu reparieren und um die Notwendigkeit für einen
Koronar-Bypass-Eingriff zu umgehen, indem das Wachstum eines kollateralen Kreislaufs
stimuliert wird. Das VRP wird für
diesen Zweck intravenös
verabreicht, entweder in einzelnen Injektionen oder durch Mikromesspumpe über einen
Zeitraum, wie oben beschrieben, oder durch direkte Infusion oder
Injektion in die Stelle des geschädigten Herzmuskels.
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Therapeutische VRP-Formulierungen
werden zur Lagerung hergestellt, indem VRP mit dem gewünschten
Reinheitsgrad mit gegebenenfalls physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten
oder Stabilisatoren (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Hrsg. A. Osol, (1980)) in Form
von lyophilisiertem Kuchen oder wässrigen Lösungen gemischt wird. Annehmbare
Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten in den verwendeten
Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer,
wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Oxidationshemmer wie
Ascorbinsäure;
Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10
Reste); Polypeptide; Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobulin;
hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie
Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide,
Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder
Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder
Sorbit; Salz-bildende Gegenionen, wie Natrium; und/oder nicht-ionische
Tenside, wie Tween, Puronics oder Polyethylenglykol (PEG).
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Das VRP kann auch in Mikrokapseln
eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervationstechniken
oder durch Grenzflächenpolymerisation
hergestellt werden (beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder
Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]mikrokapseln)
in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen (beispielsweise Liposomen,
Alumbin-Mikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nano-Teilchen und Nanokapseln), oder in Makroemulsionen.
Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, oben, offenbart.
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VRP zur Verwendung bei der Verabreichung
in vivo muss steril sein. Das lässt
sich leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen vor
oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution erreichen. VRP
wird normalerweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
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Therapeutische VRP-Zusammensetzungen
werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise
einen Beutel oder eine Phiole für
intravenöse
Lösung
mit einem Stöpsel,
der mit einer Hyperdermalinjektionsnadel durchstochen werden kann.
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Der Weg der VRP-Verabreichung entspricht
bekannten Verfahren, beispielsweise jenen Wegen, die oben für spezifische
Indikationen angeführt
sind, sowie den allgemeinen Wegen zur Injektion oder Infusion durch
intravenöse,
intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intraarterielle
oder intraläsionale
Mittel, oder Retard-Systeme wie nachstehend angeführt. VRP
wird kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolusinjektion verabreicht.
Im Allgemeinen sollte das VRP, wenn es die Störung zulässt, für ortsspezifische Abgabe formuliert
und dosiert sein. Das ist im Fall von Wunden und Geschwüren zweckmäßig.
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Geeignete Beispiele für Retard-Präparate sind
halbdurchlässige
Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten,
wobei die Matrizen in Form von Formteilen vorliegen, z. B. Filme
oder Mikrokapseln. Beispiele für
Retard-Matrizen sind Polyester, Hydrogele [z. B. Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat), wie
von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981)
und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105
(1982) beschrieben, oder Poly(vinylalkohol)], Polylactide (US-Patent
Nr. 3.773.919,
EP 58.481 ),
Copolymere aus L-Glutaminsäure
und γ-Ethyl-L-glutamat
(Sidman et al., Biopolymers, 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat
(Langer et al., oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie Lupron
Depot
TM (injizierbare Mikrokügelchen,
die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat bestehen) sowie Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure (
EP 133.988 ).
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Während
Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100
Tage ermöglichen,
setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte
Proteine für
längere
Zeit im Körper
verbleiben, können
sie als Ergebnis des Einwirkens von Feuchtigkeit bei 37°C denaturiert
werden oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen
Veränderungen
der Immunogenität
führt.
In Abhängigkeit
vom beteiligten Mechanismus können
zweckmäßige Strategien
für die
Proteinstabilisierung entwickelt werden. Wenn beispielsweise entdeckt
wird, dass der Aggregationsmechanismus intermolekulare S-S-Bindungsbildung
durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann Stabilisierung erreicht
werden, indem Sulfhydrylreste modifiziert werden, aus sauren Lösungen lyophilisiert wird,
der Feuchtigkeitsgehalt reguliert wird, wobei geeignete Additive
eingesetzt und spezifische Polymermatrixzusammensetzungen entwickelt
werden.
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Retard-VRP-Zusammensetzung umfassen
auch liposomal festgehaltenes VRP. Liposome, die VRP enthalten,
werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt:
DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692
(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980);
EP 52.322 ;
EP 36.676 ;
EP
88.046 ;
EP 143.949 ;
EP 142.641 ; japanische Patentanmeldung
Nr. 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und
EP 102.324 . Üblicherweise
gehören
die Liposome dem kleinen (etwa 200 bis 800 Angstrom) unilamellaren
Typ an, bei dem der Lipidgehalt über
etwa 30 Mol-% Cholesterol liegt, wobei das gewählte Verhältnis für die optimale VRP-Therapie
eingestellt wird.
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Bei topischer Verabreichung wird
das VRP geeigneterweise mit anderen Komponenten kombiniert, wie
Trägern
und/oder Adjuvanzien. Es gibt keine Beschränkungen für die Art derartiger anderer
Ingredienzen, außer
jener, dass sie pharmazeutisch annehmbar und für ihre beabsichtigte Verabreichung
wirksam sein müssen
und die Aktivität
der aktiven Komponenten der Zusammensetzung nicht beeinträchtigen
können.
Beispiele für
geeignete Vehikel sind Salben, Cremes, Gele oder Suspensionen, mit
oder ohne gereinigtes Collagen. Es können auch Hautbinden, -pflaster
und -bandagen mit den Zusammensetzungen imprägniert werden, vorzugsweise
in flüssiger
oder halbflüssiger
Form.
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Um eine Gelformulierung zu erhalten,
kann das in einer flüssigen
Zusammensetzung formulierte VRP mit einer wirksamen Menge eines
wasserlöslichen
Polysaccharids oder synthetischen Polymers wie PEG gemischt werden,
um ein Gel mit einer angemessenen Viskosität zur topischen Anwendung zu
bilden. Das Polysaccharid, das verwendet werden kann, umfasst beispielsweise
Cellulosederivate, wie veretherte Cellulosederivate, einschließlich Alkylcellulosen,
Hydroxyalkylcellulosen und Alkylhydroxyalkylcellulosen, beispielsweise
Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose; Stärke und
fraktionierte Stärke;
Agar; Algininsäure
und Alginate; Gummi Arabicum; Pullullan; Agarose; Carrageenan; Dextrane;
Dextrine; Fructane; Insulin, Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glykogene;
Glucane; sowie synthetische Biopolymere; sowie Kautschuke, wie Xanthanlösung; Guar
Gum; Johannisbrotgummi; Gummi Arabicum; Traganthgummi; und Karayagummi,
sowie Derivate und Gemische davon. Das bevorzugte Gelierungsmittel
gemäß vorliegender
Erfindung ist eines, das für
biologische Systeme inert, nicht toxisch, einfach herzustellen und
nicht zu verlaufend oder viskos ist und das darin gehalten VRP nicht
destabilisiert.
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Vorzugsweise ist das Polysaccharid
eine verethertes Cellulosederivat, mehr bevorzugt eines, das gut definiert,
gereinigt und in der USP angeführt
ist, beispielsweise Methylcellulose und Hydroxyalkylcellulosederivate,
wie Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose.
Am meisten bevorzugt wird gemäß vorliegender
Erfindung Methylcellulose.
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Das für die Gelierung nützliche
Polyethylenglykol ist typischerweise ein Gemisch aus PEGs mit niedrigem
und hohem Molekulargewicht, um die entsprechende Viskosität zu erzielen.
Beispielsweise ist ein Gemisch aus einem PEG mit einem Molekulargewicht
von 400 bis 600 und einem mit einem Molekulargewicht von 1.500 für diesen
Zweck wirksam, wenn es im geeigneten Verhältnis gemischt ist, um eine
Paste zu erhalten.
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Der Begriff "wasserlöslich" in Bezug auf die Polysaccharide und
PEGs ist so zu verstehen, dass damit kolloidale Lösungen und
Dispersionen gemeint sind. Im Allgemeinen wird die Löslichkeit
der Cellulosederivate durch den Grad der Substitution von Ethergruppen
bestimmt, und die gemäß vorliegender
Erfindung nützlichen stabilisierenden
Derivate sollten eine ausreichende Menge derartiger Ethergruppen
pro Anhydroglucoseeinheit in der Cellulosekette aufweisen, um die
Derivate wasserlöslich
zu machen. Ein Grad der Ethersubstitution von zumindest 0,35 Ethergruppen
pro Anhydroglucloseinheit ist im Allgemeinen ausreichend. Außerdem können die
Cellulosederivate in Form von Alkalimetallsalzen, beispielsweise
der Li-, Na-, K- oder Cs-Salze, vorliegen.
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Wenn Methylcellulose im Gel eingesetzt
wird, umfasst es vorzugsweise etwa 2 bis 5%, mehr bevorzugt etwa
3% des Gels, und das VRP ist in einer Menge von etwa 300 bis 1.000
mg pro ml Gel vorhanden.
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Eine wirksame Menge an VRP zum therapeutischen
Einsatz hängt
beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg
und dem Zustand des Patienten ab. Demgemäß ist es notwendig, dass der
Therapeut die Dosis titriert und den Verabreichungsweg nach Bedarf
modifiziert, um die optimale therpeutische Wirkung zu erzie len.
Typischerweise verabreicht der Kliniker das VRP, bis eine Dosis
erreicht ist, die die gewünschte
Wirkung erzielt. Eine typische Tagesdosis für die systemische Behandlung
kann im Bereich von etwa 1 μg/kg
bis zu 10 mg/kg oder mehr betragen, in Abhängigkeit von den oben genannten
Faktoren. Als alternativer allgemeiner Vorschlag wird das VRP in
einer Dosis formuliert und an den Zielort abgegeben, mit der im
Gewebe eine VRP-Menge über etwa
0,1 ng/cm3 bis zu einer maximalen Dosis
erzielt werden kann, die wirksam aber nicht übermäßig toxisch ist. Diese Konzentration
innerhalb des Gewebes sollte falls möglich durch kontinuierliche
Infusion, nachhaltige Freisetzung, topische Anwendung oder Injektion
in empirisch ermittelten Häufigkeiten
beibehalten werden. Der Fortschritt dieser Therapie lässt sich
durch herkömmliche
Tests leicht überwachen.
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Es liegt im Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung, die VRP-Therapie mit anderen neuen oder herkömmlichen
Therapien (z. B. Wachstumsfaktoren, wie VEGF, saurem oder basischem
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF bzw. bFGF), von Blutplättchen abgeleitetem
Wachstumfaktor (PDGF), Insulin-artigem Wachstumsfaktor (IGF-I oder
IGF-II), Nervenwachstumsfaktor
(NGF), anabolischen Steroiden, EGF oder TGF-α) zu kombinieren, um die Aktivität eines
der Wachstumsfaktoren, einschließlich des VRP, bei der Förderung
von Zellvermehrung und -reparatur zu verstärken. Es ist nicht notwendig,
dass solche Cobehandlungsarzneimittel an sich in der Zusammensetzung
gemäß vorliegender
Erfindung enthalten sind, obwohl das zweckmäßig ist, wenn derartige Arzneimittel
proteinhältig
sind. Derartige Gemische werden geeigneterweise auf die gleiche
Weise und für
die gleichen Zwecke verabreicht wie das allein verwendete VRP. Das
sinnvolle Molverhältnis
zwischen VRP und solchen sekundären
Wachstumsfaktoren beträgt
typischerweise 1 : 0,1 bis 10, wobei etwa äquimolare Mengen bevorzugt
werden.
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3. Nicht therapeutische
diagnostische Verwendungen für
VRP
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Die für das VRP kodierende Nucleinsäure kann
als Diagnostikum für
gewebespezifische Typisierung verwendet werden. Beispielsweise können Verfahren
wie Hybridisierung in situ, Northern- und Southern-Blotting und
PCR-Analyse eingesetzt werden, um zu bestimmen, ob DNA und/oder
RNA, die für
VRP kodiert, in der bzw. den bewerteten Zell type(n) vorhanden ist.
VRP-Nucleinsäure
oder Polypeptid können
ebenfalls als diagnostische Marker verwendet werden. Beispielsweise
kann das VRP markiert werden, indem die hierin beschriebenen Techniken
eingesetzt werden, und die Expression von Nucleinsäuremolekülen, die
für einen Flt4-Rezeptor
oder einen anderen VRP-Rezeptor kodieren, können unter Einsatz des markierten
VRP quantifiziert werden.
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Wenn die humane, für VRP kodierende
Nucleinsäure
an einem humanen Chromosom lokalisiert ist, kann die Nucleinsäure für humanes
VRP als Marken für
dieses humane Chromosom verwendet werden.
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VRP-Nucleinsäure ist auch für die Herstellung
von VRP-Polypeptid durch rekombinante Techniken nützlich,
wie hierin beispielhaft angeführt.
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Isoliertes VRP-Polypeptid kann in
quantitativen Diagnosetests als Standard oder Kontrolle verwendet werden,
denen gegenüber
Proben, die unbekannte Mengen ans VRP enthalten, hergestellt werden
können.
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VRP-Präparate sind auch nützlich bei
der Erzeugung von Antikörpern
als Standards in Tests für
VRP (z. B. durch Markierung von VRP zur Verwendung als Standard
in Radioimmuntests, Radiorezeptortests oder Enzym-gebundenem Immuntest),
um das Vorhandensein des Flt4-Rezeptors oder eines oder mehrerer
anderer VRP-Rezeptoren in einer biologischen Probe zu detektieren
(z. B. unter Verwendung eines markierten VRP), in Affinitätsreinigungstechniken
und in Rezeptorbindungstests vom kompetitiven Typ, wenn sie mit
Radioiod, Enzymen, Fluorphoren, Spinmarkierungen oder dergleichen
markiert werden.
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Das VRP ist auch nützlich als
Diagnosewerkzeug. Beispielsweise kann das VRP in prokaryotischen Zellen
unter Einsatz der hierin ausgeführten
Techniken hergestellt werden, und das so hergestellte unglykosylierte
Protein kann als Molekulargewichtsmarker verwendet werden. Das abgeleitete
Molekulargewicht (mw) des VRP beträgt etwa 44,8 kDa. Um das VRP
als Molekulargewichtsmarker zu verwenden, wird beispielsweise Gelfiltrationschromatographie
oder SDS-PAGE eingesetzt, um Proteine) abzutrennen, für das/die
das Molekulargewicht im Wesentlichen auf normale Weise bestimmt
werden soll. Das VRP und andere Molekulargewichtsmarker werden als
Standards verwendet, um einen Molekulargewichtsbereich bereitzustellen.
Beispielsweise können
als MG-Marker Phosphorylase b (MG = 97.400), Rinderserumalbumin
(MG = 68.000), Ovalbumin (MG = 46.000), VRP (MG = 44.800), Trypsininhibitor
(MG = 20.100) und Lysozym (MG = 14.400) verwendet werden. Die anderen
hier genannten Molekulargewichtsmarker sind im Handel beispielsweise
von Amersham Corporation, Arlington Heights, IL, USA erhältlich.
Häufig
werden die Molekulargewichtsmarker markiert, um die einfache Detektion
nach der Trennung zu ermöglichen.
Techniken zum Markieren von Antikörpern und Proteinen werden
hierin erörtert
und sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispielsweise
können
die Molekulargewichtsmarker biotinyliert werden, und nach der Trennung
auf SDS-PAGE kann beispielsweise das Blot mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase
inkubiert werden. Die Banden können
dann durch Lichtdetektion detektiert werden.
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Es kann auch nützlich sein, bestimmte Zellen,
die den Flt4-Rezeptor oder einen oder mehrere andere VRP-Rezeptoren
aufweisen, ex vivo unter Einsatz des VRP als angiogener Faktor oder
Wachstumsfaktor zu züchten.
So kann beispielsweise das VRP als Wachstumsfaktor bei der In-vitro-Kultivierung
von Endothelzellen verwendet werden. Für solche Verwendungen kann
das VRP dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von etwa 10
pg/ml bis etwa 10 ng/ml zugegeben werden.
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Diese Zellen, die ex vivo zu züchten sind,
können
gleichzeitig anderen bekannten Wachstumsfaktoren oder Zytokinen
ausgesetzt werden. Beispiele für
Zytokine sind die Interleukine (z. B. IL-3), Granulozytenmakrophagen-Kolonie-stimulierender
Faktor (GM-CSF),
VEGF, Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierender
Faktor (G-CSF), Granulozytenmakrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
(GM-CSF), Erythropoietin (Epo), Lymphotoxin, Stahlfaktor (SLF),
Tumornekrose faktor (TNF) und γ-Interferon.
Das führt
zur Vermehrung und/oder Differenzierung der Zellen, die den Flt4-Rezeptor
oder einen oder mehrere andere VRP-Rezeptoren aufweisen.
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Gemäß wieder einem anderen Aspekt
der Erfindung kann das VRP für
die Affinitätsreinigung
des Flt4-Rezeptors oder eines oder mehrerer anderer VRP-Rezeptoren
verwendet werden. Kurz zusammengefasst umfasst diese Technik die
kovalente Bindung des VRP an einer inerten und porösen Matrix
(z. B. mit Bromcyan umgesetzter Agarose). Eine Lösung, die den Flt4-Rezeptor
oder (einen) andere(n) VRP-Rezeptor(en) enthält, kann durch das chromatographische
Material hindurchgeschickt werden und kann daraufhin freigesetzt
werden, indem die Elutionsbedingungen verändert werden (beispielsweise
durch Änderung
des pH oder der lonenstärke).
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Das gereinigte VRP und die dafür kodierende
Nucleinsäure
kann auch als Reagens für
Mechanismus-Untersuchungen von VRP und seiner verwandten Rezeptoren
verkauft werden, um die Rolle des VRP und des Flt4-Rezeptors oder
anderer VRP-Rezeptoren bei normalem Wachstum und normaler Entwicklung
sowie bei anormalem Wachstum und abnormaler Entwicklung, beispielsweise
bei malignen Erscheinungen, zu untersuchen.
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Das VRP kann für das kompetitive Screenen
potentieller Agonisten oder Antagonisten für die Bindung an den Flt4-Rezeptor
oder andere VRP-Rezeptoren verwendet werden. VRP-Varianten sind
nützlich
als Standards oder Kontrollen in Tests für das VRP, mit der Maßgabe, dass
sie vom verwendeten analytischen System, z. B. einem Anti-VRP-Antikörper, erkannt
werden.
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4. VRP-Antikörperherstellung
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Nachstehend folgt eine Beschreibung
der Herstellung exemplarischer Antikörper wie hierin definiert. Diese
beispielhaften Antikörper
sind polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische oder
Heterokonjugat-Antikörper.
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A. Polyklonale Antikörper
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Polyklonale Antikörper gegen das VRP werden im
Allgemeinen in Tieren durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale
(ip) Injektionen des VRP und eines Adjuvans hervorgerufen. Es kann
nützlich
sein, das VRP an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden
Spezies immunogenisch ist, beispielsweise Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin,
Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor,
wobei ein bifunktionelles oder derivatisierendes Mittel eingesetzt
wird, beispielsweise Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation
durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid
(durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder
R1N=C=NR, worin R und R1 unterschiedliche
Alkylgruppen sind.
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Tiere werden gegen die immunogenen
Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg 1 μg Konjugat
(fr Kaninchen bzw. Mäuse)
mit 3 Volumina Freud's
Complete Adjuvant kombiniert werden und die Lösung intradermal an mehreren
Stellen injiziert wird. Ein Monat später erhalten die Tiere einen
Booster mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Konjugat
in Freud's Complete
Adjuvant durch subkutane Injektion an mehreren Stellen. 7 bis 14
Tage später
werden die Tiere ausgeblutet, und das Serum wird auf Anti-VRP-Antikörper-Titer
getestet. Tiere erhalten Booster, bis der Titer ein Plateau erreicht.
Vorzugsweise erhält
das Tier einen Booster mit einem Konjugat aus dem gleichen VRP mit
einem anderen Protein und/oder die Konjugation erfolgt durch ein
anderes Vernetzungsreagens. Konjugate können auch in rekombinanter
Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Es werden auch
Aggregierungsmittel wie Alum verwendet, um die Immunreaktion zu verstärken.
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B. Monoklonale Antikörper
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Monoklonale Antikörper werden aus einer Population
im Wesentlichen homogener Antikörper
erhalten, d. h. die einzelnen Antikörper, die die Population umfasst,
sind mit Ausnahme möglicher
natürlich
vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch.
Somit weist die Ergänzung "monoklonal" auf den Charakter
des Antikörper
hin, kein Gemisch aus diskreten Antikörpern zu sein.
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Beispielsweise können die monoklonalen Anti-VRP-Antikörper gemäß vorliegender
Erfindung unter Einsatz des Hybridom-Verfahrens hergestellt werden,
das erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) beschrieben
wurde, oder kann durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden.
US-Patent Nr. 4.816.567.
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Beim Hybridom-Verfahren wird eine
Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie ein Hamster, wie oben
beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper erzeugen
oder erzeugen können,
die sich spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein
binden. Alternativ dazu können
die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden
dann mit unter Einsatz eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie
PEG, mit Myelomzellen fusioniert, wodurch eine Hybridom-Zelle gebildet
wird. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S.
59–103
(Academic Press, 1986).
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Die so hergestellten Hybridom-Zellen
werden in ein geeignetes Kulturmedium eingesät und darin gezüchtet, das
vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben
der unfusionierten, parentalen Myelomzellen hemmen. Wenn den parentalen
Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
(HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome
typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium),
Substanzen, die die Vermehrung von Zellen mit HGPRT-Defizienz verhindern.
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Bevorzugte Myelomzellen sind jene,
die wirksam fusioniert werden, die stabile Expression von Antikörper in
hoher Menge durch die ausgewählten
Antikörper
produzierenden Zellen unterstützen
und für
ein Medium wie HAT-Medium empfindlich sind. Von diesen sind bevorzugte
Myelom-Zelllinien Mäuse-Myelomlinien, wie
jene, die vom MOPC-21 und MPC-11-Mäusetumoren abgeleitet sind,
die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien,
USA, erhältlich
sind, und SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA, erhältlich
sind. Human-Myelom- und Mäuse-Human-Heteromyelom-Zelllinien
sind ebenfalls für
die Erzeu gung von monoklonalen Human-Antikörpern beschrieben worden. Kozbor,
J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoconal Antibody
Production Techniques and Applications, S. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New
York, 1987). Seihe auch Boerner et al., J. Immunol. 147, 86–95 (1991)
und WO 91/17769, veröffentlicht
am 28. November 1991, bezüglich
Techniken für
die Erzeugung von monoklonalen Human-Antikörpern.
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Kulturmedium, in dem Hybridomzellen
wachsen, wird bezüglich
der Produktion monoklonalen Antikörper getestet, die gegen VRP
gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler
Antikörper, die
durch Hybridomzellen erzeugt werden, durch Immunfällung oder
durch einen Bindungstest in vitro bestimmt, wie Radioimmuntest (RIA)
oder Enzym-gebundenen Immunabsorbenstest (ELISA).
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Die Bindungsaffinität des monoklonalen
Antikörpers
kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard,
Anal. Biochem. 107, 220 (1980) bestimmt werden.
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Nachdem Hybridomzellen identifiziert
worden sind, die Antikörper
mit der gewünschten
Spezifität,
Affinität
und/oder Aktivität
erzeugen, können
die Klone subkloniert werden, indem Verdünnungsverfahren begrenzt werden,
und durch Standardtechniken gezüchtet
werden. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
S. 59–104
(Academic Press, 1986). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck sind beispielsweise
Dulbecco's Modified
Eagle's Medium oder
RPMI-16040-Medium. Außerdem
können
die Hybridomzellen in vivo als Aszites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
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Die durch die Subklone ausgeschiedenen
monoklonalen Antikörper
werden vom Kulturmedium, Aszitesfluid oder Serum auf geeignete Weise
durch herkömmliche
Immunglobulin-Reinigungsverfahren abgetrennt, wie beispielsweise
Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese,
Dialyse oder Affinitätschromatographie.
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Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene
Tiere (beispielsweise Mäuse)
zu erzeugen, die bei Immunisierung fähig ist, ein volles Repertoire
humaner Antikörper
zu erzeugen, ohne dass endogenes Immunglobulin erzeugt wird. Beispielsweise
wird beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-
(JH) Gens bei chimären und Keimlinien-mutierten
Mäusen
zur vollständigen
Hemmung der endogenen Antikörperproduktion
führt.
Der Transfer der Human-Keimlinien-Immunglobulin-Genaordnung bei
derartigen Keimlinien-mutierten Mäusen führt bei Antigen-Challenge zur
Produktion humaner Antikörper.
Siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad: Sci. USA
90;2551-255 (1993); Kaobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
können
Antikörper
oder Antikörperfragmente
von Antikörper-Phagenbibliotheken
isoliert werden, die unter Einsatz der Techniken erzeugt werden,
die in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschrieben werden,
wobei das VRP eingesetzt wird, um bezüglich eines geeigneten Antikörpers oder
Antikörperfragments
zu selektionieren. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991) und
Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991) beschreiben die
Isolierung von Mäuse- bzw. Human-Antikörpern unter
Einsatz von Phagen-Bibliotheken. Spätere Veröffentlichungen beschreiben
die Produktion von Hochaffinitäts-
(nM-Bereich) Human-Antikörpern
durch Kettenumordnung (Mark et al., Bio/Technol. 10, 779–783 (1992)),
sowie die kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als
Strategie für
die Konstruktion sehr großer
Phagen-Bibliotheken. Waterhouse et al., Nucleotid. Acids Res. 21,
2265-2266 (1993). Somit
sind diese Techniken denkbare Alternativen für tranditionelle monoklonale
Antikörper-Hybridom-Techniken
zur Isolierung "monoklonaler" Antikörper (insbesondere
menschlicher Antikörper),
die die vorliegende Erfindung umfasst.
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DNA, die für die monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender
Erfindung kodiert, lässt
sich unter Einsatz herkömmlicher
Verfahren (z. B. unter Einsatz von Oligonucleotidsonden, die in
der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für Schwer-
und Leichtketten von Mäuse-Antikörpern kodieren)
leicht isolieren und sequenzieren. Die Hybridomzellen gemäß vorliegender
Erfindung dienen als bevorzugte Quelle für derarti ge DNA. Sobald sie
isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren angeordnet werden,
die dann in Wirtszellen, wie Affen-COS-Zellen, China-Hamster-Eierstock-
(CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten
kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler
Antikörper
in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Die DNA kann beispielsweise
auch modifiziert werden, indem die Kodierungssequenz für Human-Schwer-
und Leichtketten-Konstantdomänen
anstelle der homologen Mäuse-Sequenzen
verwendet wird (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851
(1984)), oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils
der Kodierungssequenz für
ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodierungssequenz.
Auf diese Weise werden "chimäre" oder "Hybrid-"Antikörper hergestellt, die
die Bindungsspezifität
eines monoklonalen Anti-VRP-Antikörpers gemäß vorliegender Erfindung aufweisen.
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Typischerweise ersetzen derartige
Nicht-Immunglobulin-Poylpeptide die konstanten Domänen eines Antikörpers gemäß vorliegender
Erfindung, oder sie ersetzen die variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle
eines Antikörpers
gemäß vorliegender
Erfindung, um einen chimären
zweiwertigen Antikörper
zu schaffen, der eine Antigen-Kombinationsstelle, die Spezifität für ein VRP
aufweist, und eine weitere Antigen-Kombinationsstelle umfasst, die
Spezifität
für ein
anderes Antigen aufweist.
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Chimäre oder Hybrid-Antikörper können auch
in vitro unter Einsatz bekannter Verfahren in der synthetischen
Proteinchemie hergestellt werden, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel
umfassen. Beispielsweise können
Immuntoxine unter Einsatz einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung
einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete
Reagenzien für
diesen Zweck sind Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
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Für
Diagnoseanwendungen werden die Antikörper gemäß vorliegender Erfindung typischerweise
mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Bei der detektierbaren
Gruppierung kann es sich um eine handeln, die fähig ist, entweder direkt oder
indirekt ein detektierbares Signal zu erzeugen. Beispielsweise kann
die detektierbare Gruppierung ein Radioisotop sein, wie 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I; eine Fluoreszenz- der Chemolumineszenzverbindung,
wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; oder ein
Enzym, wie alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.
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Es kann jedes Verfahren eingesetzt
werden, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, um den Antikörper getrennt
an die detektierbare Gruppierung zu konjugieren, einschließlich jener
Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David
et al., Biochemistry 13.1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40.219
(1981); sowie Hygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)
beschrieben werden.
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Die Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können bei
jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie kompetitiven
Bindungstests, direkten oder indirekten Sandwich-Tests und Immunfällungstests. Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147–158 (CRC
Press., Inc., 1987).
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Kompetitive Bindungstests basieren
auf der Fähigkeit
eines markierten Standards (der ein VRP oder ein immunologisch reaktiver
Abschnitt davon sein kann), mit dem Testprobenanalyten (VRP) um
die Bindung mit einer begrenzten Antikörpermenge zu konkurrieren.
Die Menge an VRP in der Testprobe ist invers proportional zur Menge
an Standard, die an die Antikörper
gebunden wird. Um das Bestimmen der Menge an Standard zu erleichtern,
die gebunden wird, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder
nach der Konkurrenz insolubilisiert, so dass der Standard und der
Analyt, die an die Antikörper
gebunden werden, auf zweckmäßige Weise
von dem Standard und Analyten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
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Sandwich-Tests umfassen die Verwendung
von zwei Antikörpern,
die jeweils fähig
sind, sich an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein Epitop
des zu detektierenden Proteins (VRP) zu binden. Bei einem Sandwich-Test
wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der auf einem
festen Träger immobilisiert
ist, und daraufhin bindet sich ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch
ein unlöslicher
dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe beispielsweise US-Patent
Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper
kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden
(direkte Sandwich-Tests) oder kann unter Einsatz eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen
werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter
Sandwich-Test). Eine Art von Sandwich-Test ist beispielsweise ein
ELISA-Test, bei dem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
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C. Humanisierte Antikörper
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Verfahren zum Humanisieren nicht-menschlicher
Antikörper
sind nach dem Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen weist ein
humanisierter Antikörper
einen oder mehrere Aminosäurereste
auf, die aus nicht-menschlicher Quelle in ihn eingebracht werden.
Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste
werden oft als variable "Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise die Form einer variablen "Import"-Domäne
haben. Humanisierung kann leicht nach dem Verfahren von Winter et
al. (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al.,
Nature 332, 323–327
(1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), durch Ersetzen
der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch
Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen durchgeführt werden. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent
Nr. 4.816.567, oben), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte
menschliche variable Domäne
durch die entsprechende Sequenz einer nicht-menschlichen Spezies
ersetzt ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise
menschliche Antikörper,
bei denen einige CDR-Reste und möglicherweise
einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt
sind.
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Es ist wichtig, dass Antikörper mit
Beibehaltung hoher Affinität
für das
Antigen und anderen günstigen biologischen
Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden
nach einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper nach
einem Analyseverfahren für
die parentalen Sequenzen und verschiedene konzeptuelle humanisierte
Produkte unter Einsatz dreidimensionaler Modelle der parentalen
und hu manisierten Sequenzen hergestellt werden. Dreidimensionale
Immunglobulin-Modelle sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung
vertraut. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen
ausgewählter
Immunglobulinsequenz-Kandidaten veranschaulichen und anzeigen. Die
Untersuchung dieser Displays ermöglicht
es, zu analysieren, welche Rolle der Reste bei der Funktionsweise
der Immunglobulinsequenz-Kandidaten spielen, d. h. die Analyse von
Resten, welche die Fähigkeit
des Immunglobulin-Kandidaten zur Bindung seines Antigens beeinflussen.
Auf diese Weise können
FR-Reste der Konsens- und Import-Sequenz ausgewählt und so kombiniert werden,
daß die
gewünschte
Antikörper-Eigenschaft,
wie z. B. erhöhte
Affinität
für das/die
Zielantigen(e), erreicht wird. Im allgemeinen sind die CDR-Reste direkt
und wesentlich an der Beeinflussung der Antigen-Bindung beteiligt.
Weitere Details sind der am 23. Dezember 1992 veröffentlichten
WO92/22653 zu entnehmen.
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D. Bispezifische Antikörper
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Bispezifische Antikörper sind
monoklonale, vorzugsweise humane oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest
zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine
der Bindungsspezifitäten
für ein
VRP, die andere für
ein anderes Antigen und vorzugsweise für einen Rezeptor oder eine
Rezeptor-Untereinheit. Beispielsweise fallen bispezifische Antikörper, die
sich spezifisch an den Flt4-Rezeptor und das VRP binden, in den
Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
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Verfahren zur Herstellung bispezifischer
Antikörper
sind fachbekannt. Herkömmlicherweise
basiert die rekombinante Herstellung bispezifischer Antikörper auf
der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren,
wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen.
Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983). Wegen der statistischen
Verteilung von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten, erzeugen
diese Hybridomen (Quadromen) ein mögliches Gemisch von 10 verschiedenen
Antikörpermolekülen, von
denen nur eine die richtige bispezifische Struktur aufweist. Die
Reinigung des richtigen Moleküls,
die für
gewöhnlich
durch affinitätschromatographische
Schritte durchgeführt
wird, ist eher aufwändig,
und die Pro duktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in der
WO 93/08829, veröffentlicht
am 13. Mai 1993 und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991),
offenbart.
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Gemäß einem anderen und bevorzugteren
Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit
den geeigneten Bindungsspezifitäten
(Antikörper-Antigen-kombinierende
Stellen) mit Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen fusioniert.
Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerketten-Konstantdomäne, die
zumindest einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen umfasst.
Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1),
welche die für
die Immunglobulin-Leichtketten-Bindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest
einer der Fusionen vorhanden ist. Die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und,
falls gewünscht,
Immunglobulin-Leichtkette
kodierenden DNAs werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert
und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfektiert. Dies stellt
eine größere Flexibilität beim Einstellen
der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen
bereit, wenn ungleiche Verhältnisse
der drei Polypeptidketten bei der Konstruktion verwendet werden,
um optimale Ausbeuten zu erhalten. Es ist jedoch möglich, die
kodierenden Sequenzen für
zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor
zu insertieren, wenn die Herstellung von zumindest zwei Polypeptidketten
in gleichen Verhältnissen
eine hohe Ausbeute liefert oder wenn die Verhältnisse von keiner speziellen
Signifikanz sind. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes
sind die bispezifischen Antikörper
aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem
Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (die
zweite Bindungsspezifität
bereitstellend) im anderen Arm zusammengesetzt. Es hat sich erwiesen,
dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten
bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulin-Kettenkombinationen
erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in
nur einer Hälfte
des bispezifischen Moleküls
eine einfache Art der Trennung bereitstellt. Dieser Ansatz wird
in der am 3. März
1994 veröffentlichten
WO 94/04690 offenbart. Für
weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe
beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210(1986).
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E. Heterokonjugat-Antikörper
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Heterokonjugat-Antikörper liegen
ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind
aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Solche
Antikörper
sind beispielsweise für
das Targeting von Immunsystemzellen gegen unerwünschte Zellen (US-Patent Nr. 4.676.980)
und zur Behandlung der HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/00373;
und
EP 03089 ) vorgeschlagen
worden. Heterokonjugat-Antikörper
können
unter Anwendung irgendwelcher dienlichen Vernetzungsverfahren hergestellt
werden. Geeignete Vernetzungsagenzien sind nach dem Stand der Technik
bekannt und beispielsweise im US-Patent 4.676.980 gemeinsam mit
einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
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5. Verwendungen von VRP-Antikörpern
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i. Therapeutische Verwendungen
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VRP-Antikörper können bei verschiedenen therapeutischen
Indikationen nützlich
sein, um die Aktivität des
VRP zu blockieren (beispielsweise die übermäßige Aktivierung oder Hemmung
des Flt4-Rezeptors oder eines anderen Rezeptors zu blockieren, der
sich an VRP bindet, und Gefäßneubildung,
Re-Endothelisierung und Angiogenese zu blockieren). Spezifisch sind
die VRP-Antikörper
bei der Behandlung verschiedener neoplastischer und nicht neoplastischer
Erkrankungen und Störungen
nützlich.
Neoplasmen und verwandte Affektionen, die der Behandlung zugeführt werden
können,
sind Brustkarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Esophagealkarzinome,
Kolorektalkarzinome, Leberkarzinome, Eierstockkarzinome, Theocome,
Arhenoblastome, Gebärmutterkarzinome,
endometriale Karzinome, endometriale Hyperplasien, Endometriosis,
Fibrosarkome, Choriokarzinome, Kopf- und Halskrebs, Nasopharyngealkarzinome,
Kehlkopfkarzinome, Hepatoblastome, Karposi-Sarkom, Melanom, Hautkarzinom,
Hemangiom, kavernöses
Hämangiom,
Hämangioblastom,
Bauchspeicheldrüsenkarzinom,
Reti noblastom, Astrozytom, Glioblastom, Schwannoma, Oligodendrogliom,
Medulloblastom, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, osteogenes Sarkom,
Leiomyosarkom, Harntrakt-Karzinome, Schilddrüsenkarzinom, Wilm's-Tumor, Nierenzellenkarzinom,
Prostatakarzinom, mit Phakomatosen verbundene anormale Gefäßvermehrung, Ödem (wie
z. B. das mit Gehirntumoren verbundene) sowie Meigs-Syndrom.
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Nicht neoplastische Affektionen,
die der Behandlung zugeführt
werden können,
sind primärchronische Polyarthritis,
Psoriasis, Atherosklerose, diabetische und andere Retinopathien,
retronentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, altersbedingte
Makula-Degeneration, Schilddrüsen-Hyperplasien
(einschließlich
Grave-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebetransplantation, chronische
Entzündung,
Lungenentzündung, nephrotisches
Syndrom, Präeklampsie,
Aszites, Perikardialeffusion (wie die mit Pericarditis verbundene)
sowie Pleuraerguss.
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Altersbedingte Makula-Degeneration
(AMD) ist eine der Hauptursachen für schweren Verlust des Sehvermögens in
der älteren
Bevölkerung.
Die exsudative Form von AMD ist durch choroidale Gefäßneubildung und
Retinapigment-Epithelzellablösung
gekennzeichnet. Da choroidale Gefäßneubildung mit einer dramatischen
Verschlechterung der Prognose verbunden ist, wird von den VRP-Antikörpern gemäß vorliegender
Erfindung erwartet, dass sie für
die Verringerung der Schwere von AMD besonders nützlich sind.
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Für
therapeutische Anwendungen werden die VRP-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung einem Säugetier,
vorzugsweise einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren
Dosierungsform verabreicht, einschließlich jener, die einem Menschen
intravenös
als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen bestimmten Zeitraum
durch intramuskuläre,
intraperitoneale, intra-cerobrospinale, subkutane, intraartikuläre, intrasynoviale,
intrathekale, orale topische oder Inhalations-Weg verabreicht werden
können.
Die VRP-Antikörper
werden auch geeigneterweise durch intratumorale, peritumorale, intraläsionale
oder periläsionale
Wege an die Lymphe verabreicht, um lokale sowie systemische therapeutische
Wirkungen auszuüben. Es
wird erwartet, dass der intraperitonale Weg beispielsweise bei der
Behandlung von Eierstocktumoren besonders nützlich ist.
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Derartige Dosierungsformen umfassen
pharmazeutisch annehmbare Träger,
die an sich nicht toxisch und nicht therapeutisch sind. Beispiele
für derartige
Träger
sind lonenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin,
Serumproteine, wie z. B. Humanserumalbumin, Puffersubstanzen, wie
Phosphate, Glycin, Sorbinsäure,
Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische aus gesättigten Pflanzenfettsäuren, Wasser,
Salzen oder Elektrolyten, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat,
Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidale Kieselsäure, Magnesiumtrisilikat,
Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulose-Basis und PEG. Träger für topische
oder auf Gel basierende Formen von VRP-Antikörpern sind Polysaccharide,
wie Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon,
Polyacnlate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere, PEG
und Holzwachsalkohole. Für
alle Verabreichungen werden geeigneterweise herkömmliche Depotformen verwendet.
Derartige Formen sind beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposome,
Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, Sublingualtabletten und
Retard-Präparate.
Der VRP-Antikörper
wird typischerweise in derartigen Vehikeln in einer Konzentration
von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
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Geeignete Beispiele für Retard-Präparate sind
halbdurchlässige
Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die den VRP-Antikörper enthalten,
wobei derartige Matrizen in Gestalt von Formteilen vorliegen, z.
B. als Filme oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen sind Polyester,
Hydrogele (beispielsweise Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) wie von
langer et al., oben, und Langer, oben, beschrieben, oder Poly(vinylalkohol),
Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere aus L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-Lglutamat
(Sidman et al., oben), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer
et al., oben) abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere,
wie das Lupron DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen,
die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat bestehen) sowie Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere
wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100
Tage ermöglichen,
setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte
VRP-Antikörper
für eine
lange Zeit im Körper
verbleiben, können
sie als Ergebnis des Einwirkens von Feuchtigkeit bei 37°C denaturiert
werden oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen
Veränderungen
der Immunogenität
führt.
In Abhängigkeit
vom beteiligten Mechanismus können
zweckmäßige Strategien
für die
Proteinstabilisierung entwickelt werden. Wenn beispielsweise entdeckt
wird, dass der Aggregationsmechanismus intermolekulare S-S-Bindungsbildung
durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann Stabilisierung erreicht
werden, indem Sulfhydrylreste modifiziert werden, aus sauren Lösungen lyophilisiert
wird, der Feuchtigkeitsgehalt reguliert wird, wobei geeignete Additive
eingesetzt und spezifische Polymermatrixzusammensetzungen entwickelt
werden.
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Retard-VRP-Zusammensetzung umfassen
auch liposomal festgehaltenes VRP. Liposome, die die VRP-Antikörper enthalten,
werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt, wie in Epstein
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,4030-4034 (1980) und den US-Patenten
Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben. Üblicherweise gehören die
Liposome dem kleinen (etwa 200 bis 800 Angstrom) unilamellaren Typ
an, bei dem der Lipidgehalt über
etwa 30 Mol-% Cholesterol liegt, wobei das gewählte Verhältnis für die optimale VRP-Antikörper-Therapie
eingestellt wird. Liposome mit erhöhter Zirkulationszeit werden
in US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
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Eine weitere Verwendung der vorliegenden
Erfindung umfasst die Aufnahme von VRP-Antikörpern in Formteile. Derartige
Produkte können
bei der Modulation von Endothelzellenwachstum und Angiogenese eingesetzt
werden. Außerdem
kann mit diesen Produkten die Tumorinvasion und Metastasenbildung
moduliert werden.
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Zur Vorbeugung gegen oder Behandlung
von Erkrankung hängt
die geeignete Dosis des VRP-Antikörpers von der Art der zu behandelnden
Erkrankung, wie oben definiert, der Schwere und dem Verlauf der
Erkrankung ab, davon, ob die Antikörper zu präventiven oder therapeutischen
Zwecken eingesetzt werden, von der vorherigen Therapie, der Krankengeschichte
des Patienten und der Reaktion auf VRP-Antikörper sowie dem Ermessen des
behandelnden Arztes. Der VRP-Antikörper wird dem Patienten geeigneterweise
einmalig oder über
eine Reihe von Behandlungen verabreicht.
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Je nach der Art und Schwere der Krankheit
stellen etwa 1 μg/kg
bis 15 mg/kg VRP-Antikörper
eine anfängliche
Kandidatendosis zur Verabreichung an einen Patienten dar, gleichgültig, ob
beispielsweise durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen
oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische tägliche Dosis kann
im Bereich von etwa 1 μg/kg
bis 100 mg/kg oder mehr liegen, je nach den oben genannten Faktoren.
Für wiederholte
Verabreichungen über
mehrere Tage oder länger
wird die Behandlung in Abhängigkeit
vom Zustand fortgesetzt, bis eine gewünschte Unterdrückung der
Krankheitssymptome auftritt. Es können jedoch auch andere Dosisschemata
nützlich
sein. Das Fortschreiten dieser Therapie lässt sich leicht durch herkömmliche
Techniken und Tests überwachen,
einschließlich
z. B. radiographischer Tumorabbildung.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann die Wirksamkeit, mit der der VRP-Antikörper eine
Krankheit verhindert oder behandelt, verbessert werden, indem der
VRP-Antikörper
seriell oder in Kombination mit einem anderen proteinartigen Mittel
verabreicht wird, das für
diese Zwecke wirksam ist, wie die nachstehend angeführten, oder
ein oder mehrere herkömmliche
Therapiemittel, wie beispielsweise Alkylierungsmittel, Folsäureantagonisten,
Anti-Metaboliten des Nucleinsäurestoffwechsels,
Antibiotika, Pyrimidinanaloge, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Purinnucleoside,
Amine, Aminosäuren,
Triazolnucleoside oder Corticosteroide. Derartige andere Mittel
können
in der verabreichten Zusammensetzung vorhanden sein oder können getrennt
verabreicht werden. Auch wird der VRP-Antikörper auf geeignete Weise seriell
oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht,
unabhängig
davon, ob Bestrahlung oder Verabreichung radioaktiver Substanzen
beteiligt ist.
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Gemäß einer Ausführungsform
wird die Gefäßbildung
von Tumoren mit Kombinationstherapie angegriffen. Ein oder mehrere
VRP-Antikörper
werden Tumor aufweisenden Patienten in therapeutisch wirksamen Dosen
verabreicht, wie beispielsweise durch Beobachtung von Necrose des
Tumors oder seiner metastatischen Foci, falls vorhanden, bestimmt.
Diese Therapie wird bis zu dem Zeitpunkt fortgesetzt, wo keine weitere vorteilhafte
Wirkung beobachtet wird oder klinische Untersuchung keine Spur des
Tumors oder irgendwelcher metastatischen Foci zeigt. Dann wird das
proteinartige Hilfsmittel allein oder in Kombination mit einem anderen Hilfsmittel
verabreicht. Derartige Mittel sind beispielsweise TNF, ein Antikörper, der
zur Hemmung oder Neutralisierung der angiogenen Aktivität von aFGF
oder bFGF oder Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), eines rhVEGF-Antagonisten,
wie in der WO 94/10202, oben, beschrieben, α-, β- oder γ- Interferon, Anti-HER2-Antikörper, Heregulin,
Anti-Heregulin-Antikörper,
D-Faktor, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2),GM-CSF oder Mittel,
die die mikrovaskuläre
Koagulation bei Tumoren fördern,
wie Anti-Protein C-Antikörper,
Anti-Protein S-Antikörper
oder C4b-Bindungsprotein (WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991),
oder Wärme
oder Strahlung.
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Da die Wirksamkeit der Hilfsmittel
variiert, ist es wünschenswert
ihren Einfluss auf den Tumor durch Matrix-Screening auf herkömmliche
Weise zu vergleichen. Die Verabreichung von VRP-Antikörper und
TNF und/oder eines anderes Hilfsmittels wird wiederholt, bis die
gewünschte
klinische Wirkung erzielt ist. Alternativ dazu werden der oder die
VRP-Antikörper
gemeinsam mit TNF und gegebenenfalls (einem) anderen Hilfsmittel(n)
verabreicht. In Fällen,
wo feste Tumore in den Gliedmaßen
oder an anderen Stellen zu finden sind, bei denen die Gefahr der
Isolierung vom allgemeinen Kreislauf besteht, werden die hierin
beschriebenen Therapiemittel dem isolierten Tumor oder Organ verabreicht.
Gemäß anderer
Ausführungsformen
wird ein FGF oder von Blutplättchen
abgeleiteter Wachstumsfaktor- (PDGF-) Antagonist, wie ein Anti-FGF
oder ein Anti-PDGF-Neutralisierungsantikörper dem
Patienten in Verbindung mit dem VRP-Antikörper verabreicht. Die Behandlung
mit VRP-Antikörpern
wird in Zeiträumen
der Wundheilung oder wünschenswerter
Gefäßneubildung optimalerweise
ausgesetzt.
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ii. Andere Verwendungen
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Die VRP-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung sind
auch als Affinitätsreinigungsmittel
nützlich. Bei
diesem Verfahren werden die Antikörper gegen VRP auf einem geeigneten
Träger
immobilisiert, wie einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, wobei
nach dem Stand der Technik wohlbekannte Verfahren eingesetzt werden.
Der immobilisierte Antikörper
wird dann mit einer Probe in Kontakt gebracht, die das zu reinigende
VRP enthält,
und daraufhin wird der Träger
mit einem geeigneten Lösungsmittel
gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe
mit Ausnahme des VRP entfernt, das an den immobilisierten Antikörper gebunden
ist. Schließlich
wird der Träger
mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel,
wie Glycinpuffer, pH 5,0, gewaschen, der das VRP vom Antikörper freisetzt.
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VRP-Antikörper können auch in Diagnosetests
für VRP
nützlich
sein, beispielsweise zur Detektion seiner Expression in spezifischen
Zellen, Geweben oder Serum. Die Antikörper werden auf die gleiche
Weise markiert wie VRP, wie oben beschrieben und/oder werden auf
einer unlöslichen
Matrix immobilisiert. Die VRP-Antikörper sind auch für die Affinitätsreinigung
des VRP von rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich.
VRP-Antikörper,
die nicht detektierbar mit anderen Proteinen kreuzreagieren, können verwendet
werden, um VRP frei von diesen anderen bekannten Proteinen zu reinigen.
Geeignete Diagnosetests für
VRP und seine Antikörper
werden oben beschrieben.
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III. Experimenteller Teil
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Nachstehend folgenden Beispiele für spezifische
Ausführungsformen
zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung
und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.
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Alle hierin sowohl oben als auch
nachstehend zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen
sind in ihrer Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen.
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BEISPIEL 1
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Isolierung von cDNA-Klonen,
die für
Human-Flt4-Rezeptor kodieren
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cDNA, die aus mRNA synthetisiert
ist, die von der humanen Megakaryozyten-Leukämie-Zelllinie CMK11-5 synthetisiert ist,
wurde mit redundanten PCR-Primern auf Basis der konservierten Regionen
von Thyrosin-Kinase-Rezeptoren amplifiziert. Wilks, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86, 1603–1607
(1989). Ein amplifizierte Fragment mit etwa 180 bp mit einer einzigartigen
DNA-Sequenz (mit der Bezeichnung SAL-S1 oder tk1; PCT/US 93/00586,
oben) wurde verwendet um cDNA-Bibliotheken von CMK11-5 und DAMI-Zellen zu screenen
(Janssen et al., oben), um überlappende
Klone zu erhalten, die für
die Kurzform voller Länge
von Flt4-Rezeptor (1.298 Aminosäuren)
kodiert. Die Sequenz der zusammengebauten Flt4-Kodierungsklonie passte
zu jener, die von einer Anerythroleukämie-Zelllinie berichtet wurde
(Pajusola et al., Cancer Res. oben); sie kodiert für 8 Aminosäure-Unterschiede
von einer anderen berichteten Flt4-Sequenz. Galland et al., Oncogene,
oben. Klone, die für
die lange Form von Flt4 (1.363 Aminosäuren) kodieren, wurden konstruiert,
indem die differierende 3'-DNA-Sequenz
mit etwa 200 bp auf Basis der veröffentlichten Sequenz synthetisiert
wurde. Pajusola et al., Oncogene, 8, oben.
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BEISPIEL 2
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Rezeptor-IgG-Fusionsproteine,
Flt4/IgG-Antiserum und G61-FACS-Analyse
-
Flt1/IgG (Park et al., oben), Flk1/IgG
(Park et al., oben), Rse/IgG (Godowski et al., Cell 82, 355–358 (1995))
und Htk/IgG (Bennett et al., J. Bio. Chem. 269, 14211–14218 (1994))
wurden wie in diesen Literaturstellen beschrieben erzeugt. Für Flt4/IgG
wurde DNA, die für
die extrazelluläre
Domäne
des Flt4-Rezeptors (Aminosäuren
1–775)
kodiert, an die Fc-Region einer humanen IgG-Schwerkette an der einzigartigen BstEII-Stelle
im Plasmid pBSSK-Fc (pBSSK-CH2CH3) gespleißt. Bennett et al., J. Bio.
Chem. 266, 23060–23067
(1991). Der offene Leserahmen, der für Flt4/IgG kodiert, wurde in
den Säugetier-Expressionsvektor
pRKS kloniert (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987)), was das Plasmid
pRKS.tkligl.1 ergab. Dieses Plasmid wurde durch Elektroporation
(Jannsen et al., oben) in 293 Zellen (ATCC CRL 1651) transfiziert,
und nach 3 bis 4 Ta gen wurde Flt4/IgG aus dem serumfreien konditionierten
Medium mit Protein A-Agarose (Calbiochem) gereinigt. Flt4-Antiserum
wurde durch Injektion von gereinigtem Flt4/IgG in Kaninchen erzeugt.
-
Unter Verwendung dieses Fusionsproteins,
um Zelllinien für
Membran-gebundenes VRP- durch FACS-Analyse zu screenen, wurde eine
positive Zelllinie identifiziert, G61, wie nachstehend beschrieben.
-
Die humane Gliomzelllinie, G61 (Hamel
et al., J. Neurosci. Res. 34, 147–157 (1993)) wurde in F12-DMEM
(50 : 50) (glucosereich) kultiviert, die 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin
und Antibiotika enthielt. Für
die FACS-Analyse von Flt4/IgG, das sich an G61-Zellen bindet, wurde
1 Million Zellen mit 70 nM Rezeptor-IgG-Fusionsprotein in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS), 5% Ziegenserum, 2% Kaninchenserum 60 min lang bei 4°C inkubiert
und dann mit 10 μg/ml
Biotin-SP-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-Fc-Antikörper und
10 μg/ml
R-Phykoerythrin-konjugiertem Streptavidin (Jackson Immuno Research)
gefärbt.
G61 verursachte im Vergleich zu Rse/IgG, einem nicht verwandten
Tyrosin-Kinase-Rezeptorkomplex, einen etwa 10fachen Anstieg der
Peak-Fluoreszenzintensität,
die für
Flt4/IgG spezifisch war (2).
Versuche der Expressionsklonierung dieses mutmaßlichen Membran-gebundenen
VRP durch Transfektion von Pools von cDNA-Klonen in COS-Zellen,
gefolgt vom Screenen mit markiertem Flt4/ IgG ergaben keine positiven
Ergebnisse von 640 Pools mit jeweils 1.000 bis 5.000 Klonen.
-
BEISPIEL 3
-
Isolierung von cDNA-Klonen,
die für
Human-VRP kodieren
-
Eine cDNA-Bibliothek wurde aus polyA
+ RNA hergestellt, die wie in Cathala et al., DNA 2, 329–335 (1983),
und Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408–1412 (1972),
beschrieben von der Human-Gliomzelllinie, G61, Hamel et al., oben,
isoliert wurde. cDNA wurde aus dieser RNA mit Reagenzien von GIBCO/BRL
(SuperScript) her gestellt und in das mit Xhol und Notl verdaute
Plasmid pRKSB (Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) kloniert. Für VRP kodierende
Klone wurden isoliert, indem die cDNA-Bibliothek mit synthetischen
Oligonucleotidsonden auf Basis einer EST-Sequenz gescreent wurden
(GenBank-Lotus HSC1WF111), was ziemliche Übereinstimmung mit VEGF zeigte.
Die EST-Sequenz von HSC1WF111 ist 299 bp lang und ist über 50 Reste
zu 36% identisch mit VEGEF, einschließlich einer 11-von-l3-Übereinstimmung,
beginnend mit der VEGF-Aminosäure
56. Die Sequenz ist folgende:
-
-
Die Sequenzen der eingesetzten Oligonucleotidsonden
ovh 1.4 und ovh 1.5 sind nachstehend angeführt:
-
-
Diese beiden Sonden wurden 32P-markiert und in 20% Formamid bei 42°C hybridisiert,
mit einer abschließenden
Wäsche
in 30 mM NaCl/3 mM Trinatriumcitrat bei 55 °C. C. Janssen, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons
(1995). Aus 650.000 gescreenten Klonen wurden sieben positive identifiziert und
charakterisiert. Die Positiven fielen nach Restriktionskartierung
und DNA-Sequenzierung in drei Gruppen.
-
Die Klone VH1.4 (pRK.vh1.4.1) und
VH1.6 umfassten die volle Kodierungsregion ( 3A) und wurden vollständig sequenziert.
Sie unterscheiden sich nur in der Länge und durch das Fehlen von
zwei T's vor der
3'-Poly A-Sequenz
in VH1.6. Klon VH1.2 ist kollinear mit VH1.4. Die Klone VH1.3, VH1.5
und VH1.7 sind identisch und weisen im Vergleich zu VH1.4 eine 557-bp-Deletion
auf (eine Deletion von bp 519–1075),
und Klon VH1.1 weist im Vergleich zu VH1.4 eine 152-bp-Deletion
(eine Deletion von bp 924–1075)
auf. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von VH1.4 werden
in 1 gezeigt.
-
Die Sequenz enthielt einen offenen
Leserahmen aus 419 Aminosäuren
beginnend mit einem ATG-Codon, dem ein Purinrest an Position –3 vorangeht,
wie für
eine Translationsinitiationsstelle erwartet. Kozak, Nucl. Acids
Res. 12, 857–872
(1984). Etwa 250 bp 5' von
diesem ATG befinden sich zwei ATG-Codons im Rahmen, kurz (4 oder
10 Aminosäuren)
gefolgt von einem Stop-Codon. Beide dieser ATGs weisen ein Pyrimidin an
Position –3
auf, und es ist nicht zu erwarten, dass sie als starke Translationsinitiationsstelle
fungieren. Kozak, oben. Die kodierte Aminosäuresequenz unmittelbar nach
dem Start des 419-Aminosäure-Leserahmens
ist hydrophob, was eine aminoterminale Sekretionssignalsequenz anzeigt.
Perlman und Halvorson, J. Mol. Biol. 167, 391–409 (1983). Siehe 3A. Die wahrscheinlichste
Spaltungsstelle für
diese Sequenz befindet sich nach Aminosäure 20, obwohl Spaltung nach
den Resten 15 oder 16 nicht ausgeschlossen werden kann (von Heijne,
Nuc. Acids Res. 14, 4683–4690
(1986)). Dem offenen Leserahmen geht eine GC-reiche untranslatierte 5'-Region mit etwa
380 bp voraus und folgt eine untranslatierte 3'-Region mit etwa 400 bp.
-
Die vorhergesagte reife Aminosäuresequenz
von Human-VRP enthält
399 Aminosäurereste
(translatiert Mr = 44,8 kDa), wovon 37 (9,3%)
Cysteinreste sind: es gibt drei potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen
(3A). Eine Ausrichtung
der Aminosäuresequenz
von VRP mit den sechs Formen von VEGF und PIGF zeigt, das es die
größte Ähnlichkeit
mit VEGF121 (32% identisch) und PIGF131 (27% identisch) aufweist (3B); die Positionen von
8 der 9 Cysteinreste werden konserviert. Während VRP die Regionen von
Basis-Aminosäuren,
die in einigen Formen von VEGF und PIGF zu finden sind, nicht enthält, ist
es wesentlich größer als
VEGF und enthält
eine Cystein-reiche C terminate Hälfte
des Moleküls,
die in VEGF nicht zu finden ist. Diese Cystein-reiche Domäne weist
vier Kopien des Musters Cys gefolgt von 10 Nicht-Cys-Resten, gefolgt von
Cys-X gefolgt von Cys-X und dann von Cys auf (3B), eine Wiederholung, die mehr als
50-mal in einem Diptran-Balbiani-Ring 3-Protein zu finden ist. Paulsson
et al., J. Mol. Biol. 211, 331–349
(1990). Ohne sich an eine Theorie zu binden, reagiert VRP möglicherweise über die
Cystein-Reste mit anderen Membran-gebundenen Proteinen auf diesen
Zellen; eine derartige intermolekulare Wechselwirkung ist für Balbiani-Protein
vorgeschlagen worden. Paulsson et al., oben.
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Zwei der cDNA-Klone (VH1.1 und VH1.3)
enthielten eine 152- oder 557-bp-Deletion, wenn sie mit VH1.4 vergleichen
wurden (3A). Beide
Deletionen enden am selben Nucleotid, und es wird angenommen, dass
sie das Ergebnis von alternativem Spleißen sind. Von beiden Deletionen
ist zu erwarten, dass sie für
das gleiche Rahmenverschobene Protein 3' von der Deletion kodieren, das an einem
Stop-Codon innerhalb von 15 Aminosäuren endet. Das Protein, für das VH1.3
kodiert, enthält ähnliche
wie VEGF nichts von der Kern-Cysteinregion. VH1.1 enthält einen
Großteil
der Region, die VEGF ähnlich
ist; seine Deletion ist jedoch analog u den verschiedenen bekannten
Formen von VEGF oder PIGF. Ferrara et al., oben; Maglione et al.,
oben; Hauser und Weich, oben.
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4 offenbart
eine Ausrichtung von VH1.4 (oben) mit 11 EST cDNA-Sequenzen von
GenBank. Es ist anzumerken, dass sich die 3' ESTs am PolyA-Ende befinden und dass
die ESTs nur wenig mehr als die Hälfte der Sequenz voller Länge von
VH1.4 abdecken.
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BEISPIEL 4
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Rezeptor-IgG-Fällung von 35S-markiertem VRP
-
Um zu bestimmen, ob VRP ein Ligand
für Flt4
ist, wurden Expressionsplasmide, die den VH1.4 cDNA-Klon enthielten,
sowie Kontroll-Plasmide (der Expressionsvektor allein oder mit VEGF
oder PIGF DNA) in COS7-Zellen transfiziert und die Protein mit 35S-Aml nosäuren markiert. Konditioniertes
Medium von diesen Zellen wurde mit Flt4/IgG und Flk1/IgG gefällt. Spezifisch
wurde das VRP-Expressionsplasmid, pRK.vh1.4.2 konstruiert, indem
etwa 360 bp 5' untranslatierte
Sequenz (5' von
der Agel-Stelle (3A)
von VH1.4) deletiert wurden. Diese DNA und Kontrollplasmide, die
für VEGF165 kodieren (Houck et al., Mol. Endocrinol.
5, 1806–1814
(1991)), PIGF152 (Park et al., oben) oder
der Vektor allein (pRK5; Suva et al., oben) wurden in COS7-Zellen
mit DEAE-Dextran transfiziert. Janssen et al., oben. Zwei Tage nach
der Transfektion wurden die Zellen in 10-cm-Näpfen 5 h lang mit 5 ml Methionin-
und Cystein-freiem DMEM, ergänzt
mit 100 μCi/ml 35S-Aminosäuren (Pro-MixTM Marke:
Amersham Nr. SJQ0079) bei 37°C
Impulsmarkiert und dann 7 h lang mit DMEM verfolgt. Das markierte
konditionierte Medium wurde durch Spin-Konzentration (Centricon-10TM Marke: Amicaon Nr.4203) 10fach eingeengt.
50 μl des
konzentrierten Mediums wurden mit 3 μg Rezeptor-IgG und 80 μl 50%iger
Aufschlämmung
von Protein A-Agarose (Calbiochem) über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Präzipitate wurden
mit PBS/0,1% Triton X-100 gewaschen, in SDS-Probenpuffer gekocht
und auf 12% SDS-Polyacrylamidgelen (Novex Nr. EC60052) elektrophoresiert.
Die Gele wurden mit Autoradiographieverstärker (DuPont Nr. NEF974) behandelt
und über
Nacht bei –70°C belichtet.
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Zwei spezifische Banden mit 53 kDa
und 33 kDa wurden aus der VRP-Transfektion durch Flt4/IgG gefällt; diese
Banden fehlten bei der Vektortransfektion. Geringe oder keine spezifische
Fällung
dieser beiden Banden wurde bei Flt1/igG oder Flk1/IgG festgestellt.
Manchmal wurde gewisse VRP-Fällung
bei Flk1/IgG festgestellt, was darauf hinweist, dass VRP eine Wechselwirkung
mit geringer Affinität
mit Flk1 aufweist. Transfektion mit einem für VEGF exprimierenden Plasmid
zeigte die erwartete Fällung
einer starken Bande mit etwa 22 kDa mit Flt1/IgG und Flk1/IgG (DeVries
et al., oben; Quinn et al., oben; Millauer et al., oben; Terman
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., oben) aber keine Fällung mit
Flt4/IgG. Ähnliche
Versuche mit markiertem PIGF zeigten keine Fällung durch Flt4/IgG, ergaben
aber die erwartete Fällung
durch Flt1/IgG, aber nicht durch Flk1/IgG, Parker et al., oben.
Diese Daten weisen darauf hin, dass sich VRP an die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptor
bindet, aber nicht mit den VEGF-Rezep toren Flt1 und Flk1 in Wechselwirkung
tritt (oder dies viel schwächer
tut). Sie bestätigen
auch das Fehlen von Wechselwirkung von VEGF mit Flt4 (Pajusola et
al., Oncogene, 9, oben) und weisen darauf hin, dass PIGF ebenfalls
kein Ligand für
diesen Rezeptor ist.
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BEISPIEL 5
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Tyrosin-Phosphorylierung
von Flt4-Rezeptor
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Um Flt4-Tyrosin-Phosphorylierung
zu testen (auch in der PCT/UD93/00586, oben, beschrieben) wurde
Flt4 in 293 Zellen exprimiert und die Flt4-Phosporylierung durch
Phosphotyrosin-Immunblot überwacht. Spezifisch
wurde DNA, die für
die lange Form von Human-Flt4 kodiert, in den Säugetier-Expressionsvektor pRK5
(Suva et al., oben) kloniert, was das Plasmid pRK.tk1-3.1 ergab.
Dieses Plasmid wurde mit einem Plasmid, das eine Mikroglykosidphosphotransferase-
(neo-) Transkriptionseinheit enthielt, durch Kalziumphosphat-Fällung in
293-Zellen co-transfiziert Uanssen et al., oben), und stabil transfizierte
Linien wurden durch das Wachstum auf G418 (Gibco) ausgewählt. Eine
klonale Zelllinie, die für
Flt4 (Klon 31) exprimiert, wie durch FACS-Analyse mit Flt54/ IgG-Antiserum
bestimmt, und untransfizierte 293-Zellen wurden in den Flt4-Tyrosin-Phosphorylierungstests
verwendet. 1 Million Zellen in 100 μl PBS/0,1% Rinderserumalbumin
(BSA) wurden mit 100 μl
Probe gemischt und bei 37°C
15 min lang inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt
und in 250 μl
0,15 M NaCl, l0% Glycero, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES pH 7,3, 4 μg/ml PMSF, 0,02 μ/ml Aprotinin
(Sigma A6279) und 20 mM Natriumorthovanadat lysiert. Flt4 wurde
durch Zugabe von 8 μl Kaninchen-Flt4/IgG-Antiserum
und 30 μl
Protein A-Agarose immungefällt.
Gewaschene Präzipitate
wurden in SDS-Probenpuffer gefällt,
auf Polyarcylamidgelen (Novex) elektrophoresiert, zu Nitrocellulose
(Janssen et al., oben) transfiziert und mit einem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Upstate
Biotechnology) und einem Alkalische-Phosphatase-Detektionssystem
(Promega) sondiert.
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Proben, die VRP oder VEGF enthielten,
wurden durch die Elektroporation von Expressionsplasmiden, die für VH1.4
(pRK.vh1.4.2) oder VEGF (Houck et al., oben) kodieren, in 293-Zellen
und eine 20fache Konzentration (Centricon-10, Amicon) des 3-Tageserumfreien
konditionierten Mediums hergestellt. In den Rezeptor-IgG-Konkurrenzversuchen
wurden die konzentrierten konditionierten Medien 1 h lang bei 4°C mit Rezeptor-IgG vorinkubiert.
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Ohne Stimulierung wiesen 293-Zellen,
die Flt4 exprimieren oder nicht exprimieren, geringe oder keine Flt4-Tyrosinphosphorylierung
auf. Stimulierung der Flt4-exprimierenden Zellen durch Flt4/IgG-Antiserum
zeigte die Tyrosin-Phosphorylierung von zwei Banden mit 180 und
120 kDa. Mit Präimmunserum
wurde keine Zunahme über
die Basis-Phosphorylierung
beobachtet, und keine Bande wurden bei Flt4/IgG-Antiserum-Stimulierung
nicht exprimierender Zellen festgestellt. Es ist berichtet worden,
dass zwei Flt4-Banden
mit etwa dieser Größe von DAMI-
und HEL-Zellen exprimiert werden. Pajusola et al., Oncogene 8, oben.
Außerdem
zeigt SDS-Gel-Analyse von gereinigtem Flt4/IgG, dass es aus Peptiden
mit 150, 80 und 70 kDa besteht. Die N-terminale Aminosäuresequenz
der Flt4/IG-Peptide zeigt, dass die 150 und 70 kDa-Banden die Aminosäuresequenz
YSMTPPTL (Seq.-ID Nr. 9) aufweisen (die zur Flt4-Sequenz passt,
die an Rest 25 beginnt) und dass die 80 kDa-Bande die Sequenz SLRRRQQQD
(Seq.-ID Nr. 10) aufweist (die zur Flt4-Sequenz passt, die an Rest
473 beginnt). So scheinen sowohl Flt4/ IgG als auch Flt4 voller
Länge teilweise
in der extrazellulären
Domäne
gespalten zu werden, und die Tyrosin-phosphorylierten Banden mit
180 und 120 kDa, die in den Flt4-Phosphorylierungstets zu beobachten
sind, entsprechen den 150- und 80-kDa-Peptiden von Flt4/IgG. Die Zugabe
eines polyklonalen Antiserums zu den Flt4 exprimierenden Zellen
zeigte die Tyrosin-Phosphorylierung von zwei Flt4-Banden mit 180
und 120 kDa; in nicht exprimierenden Zellen wurden keine Bande beobachtet. Diese
Daten zeigten, dass polyklonale Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des Flt4-Rezeptors
erzeugt wurden, fähig
sind, Flt4-Tyrosin-Phosporylierung zu aktivieren.
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Um zu bestimmen, ob VRP die Tyrosin-Phosporylierung
von Flt4 aktivieren kann, werden konditionierte Medien von Säugetier-Zellen
getestet, die mit dem VRP-Expressionsplasmid transfiziert worden
waren. Dieses konditionierte Medium stimulierte die Tyro sin-Phosphorylierung
der gleichen 180- und 120-kDa-Banden, wie sie bei den polyklonalen
Agonisten-Antikörpern
zu finden sind, was zeigt, dass VRP die Phosphorylierung von Flt4
stimulieren kann und sich auch daran binden kann. Konditioniertes
Medium von den für
VEGF exprimierenden Zellen war nicht in der Lage, Flt4-Tyrosin-Phosphorylierung
zu aktivieren.
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Um die Spezifität von VRP zu bestätigen, dass
sich an die Rezeptoren der VEGF-Familie bindet, wurden Flt4/IgG,
Flt1/IgG, Flk1/IgG und Htk/IgG auf ihre Fähigkeit getestet, um die VRP-stimulierte
Flt4-Phosphorylierung zu konkurrieren. Wenn VRP ein Ligand für Flt4 ist,
verhinderte Flt4/IgG wie erwartet die VRP-stimulierte Phosphorylierung,
während
Flt1/IgG, Flk1/IgG und Htk/IgG, ein Fusionsprotein von einem nicht
verwandten Tyrosin-Kinase-Rezeptor, wenig oder keine Wirkung hatten.
Diese Daten zeigen, dass VRP die Tyrosin-Phosphorylierung von Flt4
induzieren kann.
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BEISPIEL 6
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Reinigung von VRP und
Bindung an markiertes Flt4/IgG
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Der Leserahmen, der für die N-terminale
Sekretionssignalsequenz und etwa 30 Aminosäuren des Herpes-Glykoproteins
D kodiert (Lasky und Bowbenko, DNA 3, 23–29 (1984); Pennica et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1142–1146 (1995)) wurden mit einer
kurzen Linkersequenz an die mutmaßliche reife Sequenz von VRP
fusioniert. Nach der Sekretion aus Säugetierzellen wird erwartet,
dass dieses Konstrukt die N-terminale Glykoprotein D-Sequenz:
KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLLEGGAAHYALLP
(Seq.-ID Nr. 11) gefolgt von der reifen VRP-Sequenz GPREAPAAAAAFE
(Seq.-ID Nr. 12) ergibt. DNA, die für dieses Fusionsprotein kodiert,
wurde in den Vektor pRK5 kloniert, was das Plasmid pRK.vh1.4.5 ergibt.
Dieses Plasmid wurde durch Elektroporation (Jaussen et al., oben)
in 293-Zellen transfiziert und VRP durch monoklonale Antikörper- (5B6-)
Affinitätschromatographie
aus dem 3 bis 4 Tage serumfreien konditionierten Medium gereinigt
und durch Kolorimetrietest (Bio-Rad) quantifiziert. Dieser Antikörper ist
für die
an den N-Terminus von VRP fusionierte Glykoprotein D-Sequenz spezifisch.
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Flt4/IgG wurde mit iodierten Perlen
der Marke IodobeadsTM (Pierce) auf eine
spezifische Aktivität
von 1.000 bis 1.500 Ci/mMol iodiert. Bindung wurde mit ∼20.000 cpm 125I-Flt4/IgG
und 12 ng VH1.4 gD-Fusionsprotein in PBS, 0,5% BSA, 0,02% Tween-20TM-Tensid,
1 μg/ml
Heparin (Bindungspuffer), der 20 μl
einer 50%igen Aufschlämmung
von Glasperlen, konjugiert an monoklonalen ∼30 μg Anti-gD-Antikörper (5B6)
enthielt, in einem Endvolumen von 100 μl 4 bis 6 h lang bei 22°C durchgeführt. Die
Perlen wurden abfiltriert (Millipore Multiscreen-HV), fünfmal mit
200 μl Bindungspuffer
gewaschen und gezählt.
Zur Bindung mit zunehmenden Konzentrationen an Flt4/IgG ( 5B) war der Bindungspuffer
DMEM (glucosearm):F12 (50 : 50), 20 mM Natrium-HEPES, pH 7,2, 10%
Rinderfötenserum,
0,2% Gelatine und 1 μg/ml
Heparin.
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Das gereinigte VRP band sich spezifisch
an 1251-Flt4/IgG, und die Bindung wurde
von unmarkiertem Flt1/IgG oder Flk1/IgG (5A) nicht konkurriert. Bindungskonkurrenz
mit zunehmenden Konzentrationen an unmarkiertem Flt4/IgG (5B) ergab eine EC50 für
diese Wechselwirkung von ∼0,7
nM, was darauf hinweist, dass die Bindung von VRP an Flt4 hohe Affinität aufweist
und zu erwarten ist, wenn VRP ein biologisch relevanter Ligand für Flt4 ist.
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RNA-Blots
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Blots, die Poly(A)+-Human-RA
enthielten, stammten von Clontech. Für die G61-Gliomzelllinie wurden 5 μg Poly(A)+ und Poly(A)–-RNA
in einem 1% Agarose/2,2 M-Formaldehyd-Gel elektrophoresiert und
auf Nitrocellulose (Janssen et al., oben) übertragen. Blots wurden mit
den 32P-markierten Sonden ovh 1.4 und ovh
1.5 hybridisiert und in 30 mM NaCl/3 mM Trinatriumcitrat bei 55°C gewaschen.
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Die G6-Gliom-Zelllinie bei der Klonierung
von VRP exprimiert eine Haupt-VRP-RNA-Bande mit etwa 2,5 kb. Eine Neben-Bande
mit etwa 2,2 kb kann ebenfalls vorhanden sein. Eine 2,4-kb-Bande
wurde in erwachsenen humanen Geweben von Herz, Plazenta, Eierstöcken und
Eingeweide exprimiert; eine schwächere
Bande wurde in Lunge, Skelettmuskel, Milz, Prostata, Hoden und Darm
gefunden. Die Expression einer mRNA mit 2,4 kb wurde auch in fötaler Lunge
und Niere festgestellt.
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BEISPIEL 7
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Mitogene Aktivität von VRP
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Um zu testen, ob VRP mitogene Aktivität aufweist,
wie sie für
VEGF festzustellen ist, wurde das Wachstum von humanen Lungen-Endothelzellen
bei zunehmenden Konzentrationen an VRP oder VEGF (6) getestet. Spezifisch wurden humane
mikrovaskuläre
Lungen-Endothelzellen (HMVEC-L, Clonetics, San Diego, CA, USA) im
empfohlenen Wachstumsmedium (EGM-MV mit 5% Kalbsfötenserum)
gehalten. Zum Testen der Mitogenese wurden langsam ( < 6) passierende
Zellen mit 6.500 Zellen/Napf in 48 Napf-Platten (Costar) gesät und über Nacht
im empfohlenen Wachstumsmedium gehalten. Das Medium wurde entfernt,
und die Zellen wurden im Wachstumsmedium (2 Kalbsfötenserum)
ohne Rindergehirnextrakt und ergänzt
mit VEGF oder VRP gehalten. Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit Trypsin
entfernt und mit einem Coulter-Zähler (Hialea,
FL) gezählt.
-
VRP förderte das Wachstum dieser
Endothelzellen (siehe 6)
und hat somit seine mitogene Aktivität mit VEGF gemeinsam. Das steht
im Gegensatz zu PIGF, von dem berichtet worden ist, dass ihm derartige mitogene
Aktivität
(bei ≤ 35
nM) fehlt (Park et al., oben). Hingegen war in diesem Test ein wirksames
mitogenes Mittel, VRP, etwa 100-mal
weniger stark war als VEGF.
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Als Schlussfolgerung ist nun ein
neues ausgeschiedenes Protein, VRP, identifiziert worden, das ein Flt4-Ligand
ist und die Tyrosin-Phosphorylierung des Rezeptor-Tyrosin-Kinase Flt4 stimuliert.
VRP ist ein drittes Mitglied der VEGF-Proteinfamilie und weist et wa
30% Aminosäure-Identität mit VEGF
und PIGF auf. Zusätzlich
zur VEGF-artigen Domäne
enthält
VRP eine C-terminale, Cystein-reiche Domäne mit 180 Aminosäuren, die
in anderen Elementen der VEGF-Familie nicht zu finden ist. VRP tritt
nicht wesentlich mit den VEGF-Rezeptoren Flt1 und Flk1 in Wechselwirkung.
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Materialhinterlegung
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Das folgende Plasmid ist bei der
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD,
USA (ATCC) hinterlegt worden:
-
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Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen
des Budapester Abkommens über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für den
Zweck von Patentverfahren und dessen Vorschriften (Budapester Vertrag).
Das gewährleistet
die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung
für 30
Jahre ab dem Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von der
ATCC gemäß den Bedingungen
des Budapester Abkommens und entsprechend einer Vereinbarung zwischen
Genentech, Inc. und ATCC zur Verfügung gestellt, wodurch permanente
und uneingeschränkte
Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit
bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung einer
US- oder ausländischen
Patentanmeldung, was auch immer davon zuerst erfolgt, gewährleistet
und die Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft für
jene gewährleistet,
die vom U.S. Commissioner of Patents and Trademarks als gemäß 35 USC § 122 und
den betreffenden Regeln des Commissioners (einschließlich 37
CFR § 1.14
unter spezieller Bezugnahme auf 886 OG 638) dazu berechtigt ausgewiesen
sind.
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Der Zessionär der vorliegenden Anmeldung
hat zugestimmt, dass, wenn eine Kultur des Plasmids oder der Hinterlegung
absterben oder verloren gehen sollte, wenn sie unter ge eigneten
Bedingungen kultiviert wird, das Plasmid umgehend bei Benachrichtigung
durch eine andere des gleichen Plasmids ersetzt wird. Die Verfügbarkeit
des hinterlegten Plasmids ist nicht als Lizenz zur praktischen Umsetzung
der Erfindung entgegen der Rechte, die gemäß der Genehmigung einer Regierung
in Übereinstimmung
mit ihren Patentgesetzen erteilt werden, zu verstehen.
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Die obige schriftliche Beschreibung
wird als ausreichend erachtet, um einem Fachmann auf dem Gebiet
der Erfindung die praktische Umsetzung der Erfindung zu ermöglichen.
Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist durch das hinterlegte
Konstrukt nicht eingeschränkt,
da die hinterlegte Ausführungsform
als einzige Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung gedacht
ist und alle Konstrukte, die funktionell damit äquivalent sind, in den Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung fallen. Die Hinterlegung von Material gemäß vorliegender
Erfindung stellt kein Eingeständnis
dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend
ist, um die praktische Umsetzung eines Aspekts der Erfindung, einschließlich der
besten Art ihrer Umsetzung, zu ermöglichen, und ist auch nicht
so zu verstehen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf
die spezifischen Darstellungen beschränkt, die sie darstellt. Tatsächlich werden
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung aufgrund der vorangegangenen
Beschreibung verschiedene Modifikationen der Erfindung neben den
hierin gezeigten und beschriebenen klar sein, und diese fallen in
den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.
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