DE69628688T2

DE69628688T2 - Alpha-substituierte 3-Benzyl-benzofurane

Info

Publication number: DE69628688T2
Application number: DE69628688T
Authority: DE
Inventors: Brian Stephen Indianapolis Muehl
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: CA2171399A1; ES2201151T3; EP0731098B1; JPH08283254A; ATE243206T1; US5705507A; DE69628688D1; EP0731098A1

Description

Die Erfindung betrifft die Gebiete der pharmazeutischen und organischen Chemie und liefert neue 3-Benrylbenzofurane, die mit Ether, Thioether, Amin, Hydrazino, Cyano oder Halogen α-substituiert sind, die zur Behandlung der verschiedenen medizinischen Indikationen brauchbar sind, die mit dem postmenopausalen Syndrom assoziiert sind, wie auch der von Östrogen abhängigen Erkrankungen, einschließlich Brust-, Uterus- und Gebärmutterhalskrebs. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Zwischenproduktverbindungen und Verfahren, die zur Herstellung der pharmazeutisch wirksamen Verbindungen der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen.
Das J. Med. Chem. Band 32, Nr. 8 vom 8. August 1989, Washington US, Seiten 1700-1707 (Durani et al.) beschreibt eine Strukturaktivitätsstudie von verschiedenen Antiöstrogenen, einschließlich 2-Phenyl-3-benzoylbenzofuranderivaten. Die Benzofuranderivate, die hierin diskutiert werden, haben eine atypische Bindung mit dem Östrogenrezeptor.
Die US 5 354 861 A beschreibt eine Gruppe an 2-(Benzyl)-3-(substituiertes Phenyl)-Benzofuranen als Antitumormittel und hypocholesterinämische Mittel.
"Postmenopausales Syndrom" ist ein zur Beschreibung der verschiedenen pathologischen Zustände verwendeter Ausdruck, die häufig Frauen betreffen, die in die als Menopause bekannte physiologische Umwandlung eingetreten sind oder diese vollzogen haben. Obwohl mehrere pathologische Zustände von der Verwendung dieses Ausdrucks umfaßt werden, sind drei Haupteffekte des postmenopausalen Syndroms der Anlaß für die anhaltenden medizinschen Hauptsorgen: Osteoporose, kardiovaskuläre Effekte, wie Hyperlipidämie, und östrogen-abhängiger Krebs, insbesondere Brust- und Uteruskrebs.
Osteoporose beschreibt eine Krankheitsgruppe, die aus unterschiedlichen Ätiologien hervorgeht, die aber durch den Nettoverlust an Knochenmasse und der resultierenden Knochenfraktur pro Volumeneinheit gekennzeichnet ist. Einer der häufigsten Typen der Osteoporose ist der, der mit der Menopause assoziiert ist. Die Folge dieses Verlusts an Knochenmasse ist das Versagen des Skeletts, eine angemessene Strukturunterstützung für den Körper bereitzustellen. Die meisten Frauen verlieren etwa 20% bis etwa 60% der Knochenmasse im Trabekelkompartiment des Knochens innerhalb von 3 bis 6 Jahren nach dem Einstellen der Menstruation. Dieser rapide Verlust geht im allgemeinen mit einer Erhöhung der Knochenresorption und Bildung einher. Jedoch ist der resorptive Zyklus dominanter und das Ergebnis ist ein Nettoverlust an Knochenmasse. Osteoporose ist eine bekannte und ernste Erkrankung bei postmenopausalen Frauen.
Es gibt alleine in den Vereinigten Staaten geschätzte 25 Millionen Frauen, die von dieser Erkrankung betroffen sind. Die Folgen von Osteoporose sind für die Person schwerwiegend und sind für einen großen ökonomischen Verlust aufgrund ihrer chronischen Erscheinung und dem Bedarf für eine ausgiebige und langanhaltende Versorgung (Krankenhausaufenthalt und Heimpflege) dieser Krankheitsfolgen verantwortlich. Dies trifft insbesondere für ältere Patienten zu. Dazu kommt, obwohl Osteooporose im allgemeinen nicht als lebenbedrohender Zustand angesehen wird, daß die Sterblichkeitsrate von 20% bis 30% mit Hüftfrakturen bei älteren Frauen zusammenhängt. Ein großer Prozentsatz dieser Sterblichkeitsrate kann direkt mit postmenopausaler Osteoporose zusammenhängen.
Das anfälligste Gewebe im Knochen für die Wirkungen der postmenopausalen Osteoporose ist der Trabekelknochen. Dieses Gewebe wird oft als spongiöser oder schwammiger Knochen bezeichnet und konzentriert sich insbesondere an den Enden des Knochens (nahe den Gelenken) und in der Wirbelsäule. Das Trabekelgewebe ist durch kleine Osteoidstrukturen gekennzeichnet, die miteinander verbunden sind, wie auch durch das festere und dichtere cortikale Gewebe, das die äußere Oberfläche und den zentralen Schaft des Knochens aufbaut. Dieses unter einander verbundene Netzwerk an Trabekeln vermittelt eine laterale Unterstützung für die äußere cortikale Struktur und ist für die biomechanische Stärke der Gesamtstruktur entscheidend. Bei der postmenopausalen Osteoporose ist es primär die Nettoresorption und der Verlust der Trabekel, die zum Versagen und zur Fraktur des Knochens führen. In Anbetracht des Verlusts der Trabekel bei postmenopausalen Frauen ist es nicht überraschend, daß die meisten herkömmlichen Frakturen die sind, die bei Knochen vorkommen, welche stark von der Trabekelunterstützung abhängen, beispielsweise die Wirbel, der Hals der gewichttragenden Knochen, wie der Oberschenkel und der Unterarm. Tatsächlich sind Hüftfraktur, Schenkelhalsfrakturen und Wirbelbruchfrakturen Merkmale der postmenopausalen Osteoporose.
Derzeit ist die einzige allgemein akzeptierte Methode zur Behandlung der postmenopausalen Osteoporose die Östrogenersatztherapie. Obwohl die Therapie allgemein erfolgreich ist, ist die Patientenakzeptanz der Therapie gering, da die Östrogenbehandlung häufig unerwünschte Nebenwirkungen hervorruft.
Vor der Menopause weisen die meisten Frauen eine geringere Häufigkeit für kardiovaskuläre Erkrankungen auf, als gleichaltrige Männer. Nach der Menopause erhöht sich jedoch langsam die Rate der kardiovaskulären Erkrankung bei Frauen, um die beim Mann beobachtete zu erreichen. Dieser Schutzverlust wurde dem Verlust an Östrogen und insbesondere dem Verlust der Fähigkeit des Östrogens zugeschrieben, die Serumlipidspiegel zu regulieren. Die Art der Fähigkeit des Östrogens, die Serumlipidspiegel zu regulieren, ist nicht gut verstanden, aber Erkenntnisse deuten darauf hin, daß Östrogen die Rezeptoren für Lipid niedriger Dichte (LDL) in der Leber hochregulieren kann, um überschüssiges Cholesterin zu entfernen. Zusätzlich scheint Östrogen eine Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin und andere nützliche Effekte auf die kardiovaskuläre Gesundheit zu haben.
Es wurde in der Literatur berichtet, daß postmenopausale Frauen, die sich einer Östrogenersatztherapie unterziehen, ein Zurückkehren der Serumlipidkonzentrationen auf die des prämenopausalen Zustands erleben. Daher scheint Östrogen eine sinnvolle Behandlung für diesen Zustand zu sein. Jedoch sind die Nebenwirkungen der Östrogenersatztherapie nicht für jede Frau akzeptabel, was die Verwendung dieser Therapie limitiert. Eine ideale Therapie für diesen Zustand wäre ein Mittel, das die Serumlipidspiegel reguliert, wie dies Östrogen tut, dem aber die Nebenwirkungen und Risiken fehlen, die mit einer Östrogentherapie zusammenhängen.
Der dritte pathologische Haupteffekt, der mit dem postmenopausalen Syndrom zusammenhängt, ist östrogenabhängiger Brustkrebs und in einem geringeren Ausmaß östrogenabhängige Krebsarten anderer Organe, insbesondere des Uterus. Obwohl solche Neoplasmen nicht nur auf eine postmenopausale Frau beschränkt sind, sind sie bei der älteren, postmenopausalen Population häufiger. Die derzeitige Chemotherapie dieser Krebsarten basiert stark auf der Verwendung von Antiöstrogenverbindungen, wie beispielsweise Tamoxifen. Obwohl solche gemischten Agonist-Antagonisten nützliche Wirkungen bei der Behandlung dieser Krebsarten haben und die östrogenen Nebenwirkungen in akut lebensbedrohenden Situationen tolerierbar sind, sind sie nicht ideal. Beispielsweise können diese Mittel stimulierende Wirkungen auf bestimmte Krebszellpopulationen im Uterus aufgrund ihrer östrogenen Wirkungen (Agonist) aufweisen und können daher in manchen Fällen kontraproduktiv sein. Eine bessere Therapie für die Behandlung dieser Krebsarten wäre ein Mittel, das eine Antiöstrogenverbindung ist, die vernachlässigbare oder keine Östrogenagonisteneigenschaften auf Reproduktionsgewebe aufweist.
Als Reaktion auf den klaren Bedarf für neue pharmazeutische Mittel, die zur Linderung der Symptome unter anderem des postmenopausalen Syndroms fähig sind, liefert die vorliegende Endung neue Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon und Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen zur Behand lung des postmenopausalen Syndroms und anderer mit Ösrogen zusammenhängender pathologischer Zustände, wie die später erwähnten.
Die Uterusfibrose (fibroide Uteruserkrankung) ist ein altes und allgegenwärtiges klinisches Problem, das unter einer Vielzahl an Namen bekannt ist, einschließlich fibroide Uteruserkrankung, Uterushypertrophie, Uterusleiomyomata, myometrische Hypertrophie, Fibrosis ureri und fibrotische Metritis. Im wesentlichen ist die Uterusfibrose ein Zustand, bei dem eine störende Ablagerung von fibroidem Gewebe auf der Wand des Uterus stattfindet.
Dieser Zustand ist eine Ursache für Dysmenorrhoe und Unfruchtbarkeit bei Frauen. Die exakte Ursache dieses Zustands ist wenig verstanden, aber Erkenntnisse legen nahe, daß eine gestörte Reaktion des fibroiden Gewebes auf Östrogen vorliegt. Ein solcher Zustand wurde in Kaninchen durch die tägliche Verabreichung von Östrogen für 3 Monate hervorgerufen. In Meerschweinchen wurde der Zustand durch eine tägliche Verabreichung von Östrogen für vier Monate hervorgerufen. Ferner verursacht Östrogen in Ratten eine ähnliche Hypertrophie.
Die häufigste herkömmliche Behandlung der Uterusfibrose umfaßt operative Verfahren die sowohl teuer als auch manchmal ein Anlaß für Komplikationen sind, wie die Bildung von abdominalen Adhäsionen und Infektionen. Bei manchen Patienten ist die anfängliche Operation nur eine vorübergehende Behandlung und die Fibroide wachsen wieder heran. In diesen Fällen wird eine Hysterektomie durchgeführt, die die Fibroide effektiv beendet aber auch das Reproduktionsleben des Patienten. Es werden auch Antagonisten für Gonadotropin-freisetzendes Hormon verabreicht, wobei aber ihre Verwendung durch die Tatsache beschränkt wird, daß sie zu Osteoporose führen können. Daher besteht ein Bedarf für neue Verfahren zur Behandlung der Uterusfibrose und die Verfahren der vorliegenden Erfindung befriedigen den Bedarf.
Endometriose ist ein Zustand schwerer Dysmenorrhoe, der von schweren Schmerzen, Blutung in die endometrischen Ansammlungen oder den Peritonealraum begleitet wird und oft zur Unfruchtbarkeit führt. Die Ursache der Symptome dieses Zustands scheint ektopisches endometriales Wachstum zu sein, das gegenüber einer normalen hormonalen Kontrolle gestört reagiert und in gestörten Geweben vorkommt. Aufgrund der gestörten Orte für endometriales Wachstum scheint das Gewebe lokale entzündungsähnliche Reaktionen hervorzurufen, die eine Makrophageninfiltration und eine Kaskade von Ereignissen verursachen, die zum Hervorrufen der schmerzhaften Reaktion führen. Die exakte Ätiologie dieser Erkrankung ist nicht gut verstanden und ihre Behandlung durch eine hormonale Therapie ist unterschiedlich, wenig definiert und durch mehrere unerwünschte und vielleicht gefährliche Nebenwirkungen gekennzeichnet.
Eine der Behandlungen für diese Erkrankung ist die Verwendung von gering dosiertem Östrogen, um das endometrische Wachstum über einen negativ zurückwirkenden Effekt auf die zentrale Gonadotropinfreisetzung und die anschließende Bildung von Östrogen im Ovar zu unterdrücken, wobei es manchmal notwendig ist, kontinuierlich Östrogen zu verwenden, um die Symptome zu kontrollieren. Diese Verwendung von Östrogen kann oft zu unerwünschten Nebenwirkungen und sogar zum Risiko für Endometriumkrebs führen.
Eine weitere Behandlung besteht aus der kontinuierlichen Verabreichung von Progestinen, die Amenorrhoe induzieren und durch die Unterdrückung der ovarialen Östrogenbildung eine Regression des endometrialen Wachstums verursachen können. Die Verwendung einer chronischen Progestintherapie wird oft von unerwünschten ZNS Nebenwirkungen der Progesine begleitet und führt oft zur Unfruchtbarkeit aufgrund der Unterdrückung der Ovarfunktion.
Eine dritte Behandlung besteht aus der Verabreichung von schwachen Androgenen, die bei der Kontrolle der Endometriose wirksam sind, jedoch rufen sie schwere maskulinisierende Wirkungen hervor. Einige der Behandlungen für Endometriose waren bei anhaltender Therapie auch in der Verursachung eines geringen Grades an Knochenverlust verwickelt. Daher sind neue Methoden zur Belandlung von Endometriose erwünscht.
Die Proliferation der glatten Muskelzellen spielt eine wichtige Rolle bei Erkrankungen, wie Atherosklerose und Restenose. Es wurde gezeigt, daß die vaskuläre Restenose nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA) eine Gewebereaktion ist, die durch eine frühe und eine späte Phase charakterisiert ist. Die frühe Phase, die Stunden bis Tage nach der PTCA auftritt, beruht auf einer Thrombose mit einigen Vasospasmen, während die späte Phase von einer exzessiven Proliferation und Migration der glatten Muskelzellen der Aorta dominiert wird. Bei dieser Erkrankung trägt die erhöhte Zellmotilität und Kolonialisierung durch solche Muskelzellen und Makrophagen signifikant zur Pathogenese dieser Erkrankung bei. Die exzessive Proliferation und Migration der vaskulären glatten Muskelzellen der Aorta kann der primäre Mechanismus für den erneuten Verschluß der Koronarartieren nach einer PTCA, Atherektomie, Laserangioplastie und arteriellen Bypasstransplantationsoperation sein. Siehe "Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis alter Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty", Austin et al., Journal of the American College of Cardiology 8: 369–375 (Aug. 1985).
Die vaskuläre Restenose bleibt eine langanhaltende Hauptkomplikation nach einem operativen Eingriff in blockierte Arterien durch eine perkutane, transluminale Koronarangioplastie (PTCA), Atherektomie, Laserangioplastie und arterielle Bypassttransplantationsoperation. Bei etwa 35% der Patienten, die sich einer PTCA unterziehen, tritt innerhalb von drei bis sechs Monaten nach dem Verfahren ein Wiederverschluß auf. Die derzeitigen Strategien zur Behandlung der vaskulären Restenose umfassen einen mechanischen Eingriff durch Vorrichtungen, wie Stents oder pharmakologische Therapien, einschließlich Heparin, niedermolekulares Heparin, Kumarin, Aspirin, Fischöl, Calciumantangonist, Stereoide und Prostacyclin. Diese Strategien konnten die Wiederverschlußrate nicht verringern und waren für die Behandlung und Verhinderung der vaskulären Restenose ineffektiv. Siehe "Prevention of Restenosis alter Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a 'Magic Bullet"', Hermans et al., American Heart Journal 122: 171–187 (Juli 1991).
Bei der Pathogenese der Restenose tritt die exzessive Zellproliferation und -migration als Folge von Wachstumsfaktoren auf, die von Zellbestandteilen im Blut und der beschädigten arteriellen Gefäßwand gebildet werden, wobei die Faktoren die Proliferation der glatten Muskelzellen bei der vaskulären Restenose vermitteln.
Mittel, die die Proliferation und/oder Migration von glatten Muskelzellen der Aorta hemmen, sind bei der Behandlung und Verhinderung der Restenose brauchbar. Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen und daher als Inhibitoren der Restenose.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I
worin R₁ für H, OH, OCO(C₁-C₆ Alkyl), OCO(Aryl), OSO₂(C₄-C₆ Alkyl), OCOO(C₁-C₆ Alkyl), OCOO(Aryl), OCONH(C₁-C₆ Alkyl) oder OCON(C₁-C₆ Alkyl)₂ steht,
R₂ für Aryl, C₁-C₆ Alkyl, C₃-C₆ Cycloalkyl oder 4-Cyclohexanol steht,
R₃ für O(CH₂)₂ oder O(CH₂)₃ steht,
R₄ und R₅ wahlweise für CO(CH₂)₃, CO(CH₂), oder C₁-C₆ Alkyl stehen oder R₄ und R₅ mit dem Stickstoff an den sie gebunden sind, unter Bildung von Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, 3-Methylpyrrolidin, 3,3-Dimethylpyrrolidin, 3,4-Dimethylpyrrolidin, Azepin oder Pipecolin kombinieren,
R₆ steht für O(C₁-C₆ Alkyl), O(Aryl), O(C₁-C₆ Alkyl)aryl, OCH₂CH₂-Cyano, O((C₁-C₆ Alkyl)-C₁-C₆-alkohol), OSO₂CH₃, OSO₂C₆H₄CH₃, SH, S(C₁-C₆ Alkyl), Cano, Halogen
worin jedes von R₇ und R₈ getrennt betrachtet wird und für H, C₁-C₆ Alkyl, 2-Hydroxyethyl oder 2-Fluorethyl steht oder sowohl R₇ als auch R₈ mit dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise substituiert sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, oder
worin jedes von R₁₀ und R₁₁ getrennt betrachtet wird und für H oder C₁-C₂ steht oder sowohl R₁₀ als auch R₁₁ mit dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise substituiert sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, und R₁₂ für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl steht, und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel I enthalten, wahlweise Östrogen oder Progestin enthalten und die Verwendung solcher Verbindungen alleine oder in Kombination mit Östrogen oder Progestin zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms, insbesondere Osteoporose, kardiovaskuläre pathologische Zustände und östrogenabhängiger Krebs. Wie hierin verwendet umfaßt der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17β-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen (Premarin®), Pferdeöstrogen, 17β-Ethinylöstradiol, und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit progestiner Akivität, wie beispielsweise Progesteron, Norethinodrel, Nongestrel, Megestrolacetat, Norethindron und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch zur Hemmung der fibroiden Uteruserkrankung und der Endometriose bei Frauen und der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta, insbesondere der Restenose, bei Menschen brauchbar.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel I
worin R₁ für H, OH, OCO(C₁-C₆ Alkyl), OCO(Aryl), OSO₂(C₄-C₆ Alkyl), OCOO(C₁-C₆ Alkyl), OCOO(Aryl), OCONH(C₁-C₆ Alkyl) oder OCON(C₁-C₆ Alkyl)₂ steht,
R₂ für Aryl, C₁-C₆ Alkyl, C₃-C₆ Cycloalkyl oder 4-Cyclohexanol steht,
R₃ für O(CH₂)₂ oder O(CH₂)₃ steht,
R₄ und R₅ wahlweise für CO(CH₂)₃, CO(CH₂)₄ oder C₁-C₆ Alkyl stehen oder R₄ und R₅ mit dem Stickstoff an den sie gebunden sind, unter Bildung von Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, 3-Methylpyrrolidin, 3,3-Dimethylpyrrolidin, 3,4-Dimethylpyrrolidin, Azepin oder Pipecolin kombinieren,
R₆ steht für O(C₁-C₆ Alkyl), O(Aryl), O(C₁-C₆ Alkyl)aryl, OCH₂CH₂-Cyano, O((C₁-C₆ Alkyl)-C₁-C₆-alkohol), OSO₂CH₃, OSO₂C₆H₄CH₃, SH, S(C₁-C₆ Alkyl), Halogen
worin jedes von R₇ und R₈ getrennt betrachtet wird und für H, C₁-C-₆ Alkyl, 2-Hydroxyethyl oder 2-Fluorethyl steht oder sowohl R₇ als auch R₈ mit dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise subsituiert sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, oder
worin jedes von R₁₀ und R₁₁ getrennt betrachtet wird und für H oder C₁-C₂ steht oder sowohl R₁₀ als auch R₁₁ mit dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise subsituiert sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, und R₁₂ für Wasserstoff Methyl oder Ethyl steht, und
pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Allgemeine Ausdrücke, die bei der Beschreibung der Verbindungen verwendet werden, haben die gewöhnlichen Bedeutungen. Beispielsweise bezieht sich "Alkyl" auf gerade oder verzweigte aliphatische Ketten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen einschließlich Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl, Isohexyl und dergleichen. Der Ausdruck "Aryl" bezieht sich auf Phenyl und Phenyl, das einmal oder zweimal mit Alkyl, C₁-C₆ Alkoxy, Hydroxy, Nitro oder Halogen substituiert ist. "Halogen" umfaßt Brom, Chlor, Iod und Fluor. Der Ausdruck "(C₁-C₆ Alkyl)aryl" bezieht sich auf eine Alkylkette, die mit Aryl substituiert ist. Der Ausdruck "(C₁-C₆ Alkyl)C₁-C₆-alkohol" bezieht sich auf eine Alkylkette, die mit einem C₁-C₆ Alkohol substituiert ist, wie Methanol, Ethanol, 1-Propanol und 1-Butanol.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß etablierter Verfahren hergestellt werden, wie denen, die in US 4 133 814 A und US 4 418 068 A beschrieben sind. Beispiele zur Herstellung von analogen Verbindungen werden in den oben diskutierten Patenten bereitgestellt.
In den Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist das Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel II
worin R für eine Hydroxyschutzgruppe steht, die gegenüber einer Reduktion durch ein Reduktionsmittel resistent ist, und R₃, R₄ und R₅ wie oben definiert sind, oder ein Salz hiervon.
Verbindungen der Formel II sind in der Technik bekannt.
Im allgemeinen wird ein Vorläufer der Formel III
durch bekannte Verfahren hergestellt. Typischerweise werden die zwei Hydroxygruppen durch bekannte Hydroxyschutzgruppen geschützt, die der Acylierung unter Friedel-Crafts Bedingungen (Bildung der R Schutzgruppen der Verbindungen der Formel II) und einer anschließenden Reduktion durch ein starkes Reduktionsmittel standhalten. Bevorzugte Hydroxyschutzgruppen sind C₁-C₄ Alkyl und Methyl ist besonders bevorzugt. Siehe beispielsweise die oben eingeführten US Patente, J. W. Barton "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie (Herausgeber), Plenum Press, New York, NY, 1973, Kapitel 2 und T. W. Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981, Kapitel 7.
Nach der Herstellung des gewünschten geschützten Vorläufers der Formel III wird der Vorläufer mittels Standard-Friedel-Crafts-Bedingungen mit einer Verbindung der Formel IV acyliert
worin
R₃, R₄ und R₅ wie oben definiert sind und
R für Chlor, Brom, Iod oder eine aktivierende Estergruppe steht. Die Herstellung der Verbindungen der Formel IV wie auch die bevorzugten Acylierungsmethoden sind in den oben erwähnten US Patenten beschrieben. Wenn R₄ und R₅ nicht kombiniert werden, sind C₁-C₄ Alkyl, Methyl und Ethyl bevorzugt. Wenn R₄ und R₅ kombiniert werden, sind 1-Piperidinyl und 1-Pyrrolidinyl bevorzugt. Von diesen ist der Piperidinorest speziell bevorzugt.
Nach der Acylierung und damit der Herstellung einer Verbindung der Formel II werden die Verbindungen mit einem α-Carbinol durch die Zugabe einer Verbindung der Formel II oder eines Salzes hiervon zu einem geeigneten Lösemittel und einer anschließenden Umsetzung der Verbindung der Formel II mit einem Reduktionsmittel, wie beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid (LAH) unter einem Inertgas, wie Stickstoff hergestellt.
Die Menge an Reduktionsmittel, die in dieser Reaktion verwendet wird, ist eine Menge, die zur Reduktion der Carbonylgruppe der Verbindung der Formel II unter Bildung einer Carbinolverbindung der Formel IIa ausreicht,
worin R₃, R₄ und R wie oben definiert sind, oder eines Salzes hiervon. Im allgemeinen wird ein beliebiger Überschuß des Reduktionsmittels pro Äquivalent des Substrats verwendet.
Geeignete Lösemittel umfassen jedes Lösemittel oder Lösemittelgemisch, das unter den Reduktionsbedingungen inert bleibt. Geeignete Lösemittel sind unter anderem Diethylether, Dioxan und Tetrahydrofuran (THF). Die wasserfreie Form der Lösemittel ist bevorzugt und wasserfreies THF ist besonders bevorzugt.
Die in diesem Schritt verwendete Temperatur ist die, die zur Vervollständigung der Reduktionsreaktion ausreichend ist. Umgebungstemperatur im Bereich von etwa 17°C bis etwa 25°C ist im allgemeinen passend.
Die Zeitspanne für diesen Schritt ist die Zeit, die zum Ablaufen der Reaktion erforderlich ist. Typischerweise dauert die Reaktion etwa 1 bis etwa 20 Stunden. Die optima1e Zeit kann durch den Fortschritt der Reaktion über herkömmliche chromatographische Techniken bestimmt werden.
Die α-Carbinolprodukte aus dieser Reaktion können im wesentlichen über das oben in Beispiel 1 beschriebene Verfahren extrahiert werden. Die folgenden Schemata erläutern die Herstellung der Verbindungen der Formel I.
Schema 1
Das in Schema 1 gezeigte Schema kann zur Herstellung der α-Ether- und α-Thioetherverbindungen verwendet werden. Im Fall der Ethersubstitutionen wird das α-Carbinol einer Säure, wie Trifluoressigsäure, in einem geeigneten Lösemittel, wie Methylenchlorid, etwa bei Raumtemperatur unterzogen. Danach wird ein Alkoholethervorläufer (R^6aH) zugegeben und die Hydroxyschutzgruppen werden durch eine bekannte Methodik entfernt. Im Alkoholethervorläufer steht R_6a für O(C₁-C₆ Alkyl), O(Aryl), O(C₁-C₆ Alkyl)aryl), OCH₂CH₂-Cayano oder O((C₁-C₆ Alkyl)C₁-C₆-alkohol).
Für die Thioethersubstitution wird erneut die α-Carbinolverbindung einer Säure, wie Trifluoressigsäure, in einem organischen Lösemittel bei Raumtemperatur unterzogen. Danach wird ein Thiolthioethervorläufer (R_6bH) zugegeben und die Hydroxyschutzgruppen werden durch eine bekannte Methodik entfernt. Im Thiolthioethervorläufer steht R_6bH für OSO₂CH₃, OSO₂C₆H₄CH₃, SH oder S(C₁-C₆ Alkyl).
Schema 2
Das obige Schema 2 kann zur Herstellung der Amino-, Hydrazino-, Cyano und Halogen-α-Substitutionen verwendet werden. Im Fall der Amino- und Hydrazinosubstitution wird das α-Carbinol einem oder mehreren Dehydratationsmitteln, wie Methansulfonylchlorid und Triethylamin in einem Lösemittel, wie Methylenchlorid bei etwa 0°C unterzogen. Danach wird ein Aminovorläufer oder Hydrazinovorläufer
bei Raumtemperatur zugegeben. Im Fall von Cyano werden erneut ein oder mehrere Dehydratationsmittel wie oben verwendet und ein Cyanovorläufer, wie Kaliumcyanid, wird zugegeben, wie auch ein Ligand, wie ein Kronenether, insbesondere 18-Kronen-6, um bei der Löslichkeit zu helfen. Für die Halogen-α-Substitution werden erneut ein oder mehrere Dehydratationsmittel verwendet und danach wird ein Halogenvorläufer, wie ein Halogen-enthaltendes Salz, wie LiF, zugegeben, wie auch ein Lösemittel, wie ein Kronenether, insbesondere 12-Kronen-4, um bei der Löslichkeit zu helfen.
Andere Verbindungen werden durch Ersetzen der 4'- und 6-Hydroxygruppen durch einen unterschiedlichen Rest, wie -O-CO-(C₁-C₆ Alkyl), -O-CO-Ar, worin Ar für wahlweise substituiertes Phenyl steht, oder -O-SO₂-(C₄-C₆ Alkyl) durch gut bekannte Verfahren hergestellt. Siehe beispielsweise obige US 4 358 593 A .
Wenn beispielsweise eine -O-CO-(C₁-C₆ Alkyl) oder -O-CO-Ar Gruppe erwünscht ist, wird die Dihydroxyverbindung der Formel I mit einem Mittel umgesetzt, wie Acylchlorid, -bromid, -cyanid oder -azid oder mit einem geeigneten Anhydrid oder gemischten Anhydrid. Die Umsetzungen werden bequemerweise in einem basischen Lösemttel ausgeführt, wie Pyridin, Lutidin, Chinolin oder Isochinolin oder in einem tertiären Aminlösemittel, wie Triethylamin, Tributylamin, Methylpiperidin und dergleichen. Die Umsetzung kann auch in einem inerten Lösemittel ausgeführt werden, wie Ethylacetat, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Dimethoxyethan, Acetonitril, Aceton, Methyletherketon und dergleichen, wozu mindestens ein Äquivalent eines Säurefängers, wie ein tertiäres Amin, zugegeben wurde. Falls erwünscht, können Acylierungskatalysatoren verwendet werden, wie 4-Dimethylaminopyridin oder 4-Pyrrolidinopyridin. Siehe beispielsweise Haslam et al., Tetrahedron, 36: 2409–2433 (1980).
Die Acylierungsreaktionen, die die vorhergenannten R₁ und R₂ Gruppen liefern, werden bei moderaten Temperaturen im Bereich von etwa –25°C bis etwa 100°C häufig unter einer inerten Atmosphäre, wie Stickstoffgas, ausgeführt. Jedoch ist Umgebungstemperatur gewöhnlich für die Durchführung der Reaktion ausreichend.
Solche Acylierungen der Hydroxygruppe können auch durch die säurekatalysierten Umsetzungen der geeigneten Carbonsäuren in inerten organischen-Lösemitteln oder Hitze ausgeführt werden. Säurekatalysatoren, wie Schwefelsäure, Polyphosphorsäure, Methansulfonsäure und dergleichen, werden verwendet.
Die Gruppen R₁ und R₂ können auch durch die Bildung eines aktiven Esters der geeigneten Säure bereitgestellt werden, wie die Ester, die durch die bekannten Reagenzien gebildet werden, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Acylimidazole, Nitrophenole, Pentachlorphenol, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Siehe beispielsweise Bull. Chem. Soc. Japan, 38: 1979 (1965) und Chem. Ber., 788 und 2024 (1970).
Jede der obigen Techniken, die R₁ und R₂ Gruppen liefert, wird in Lösemitteln ausgeführt, wie sie oben beschrieben sind. Diese Techniken, die kein Säureprodukt im Verlauf der Reaktion bilden, erfordern natürlich keine Verwendung eines Säurefängers im Reaktionsgemisch.
Wenn eine Verbindung der Formel I gewünscht wird, worin R₁ und R₂ für -O-SO₂-(C₄-C₆ Alkyl) stehen, wird die Dihydroxyverbindung der Formel I beispielsweise mit einem Derivat der geeigneten Sulfonsäure umgesetzt, wie einem Sulfonylchlorid, -bromid oder Sulfonylammoniumsalz, wie dies von King und Monoir, J. Am. Chem. Soc., 97: 2566–2567 (1975) beschrieben ist. Die Dihydroxyverbindung kann auch mit dem geeigneten Sulfonsäureanhydrid umgesetzt werden. Solche Reaktionen werden unter Bedingungen ausgeführt, wie sie oben in der Diskussion der Umsetzung mit Säurehalogeniden und dergleichen erklärt sind.
Ferner können dann die Verbindungen der Formel I wie gewünscht gebildet werden. Bestimmte Herstellungen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind später beschrieben. Es können Modifikationen der obigen Verfahren erforderlich sein, um reaktive Funktionalitäten von bestimmten Substituenten zu erhalten. Solche Modifikationen sind dem Fachmann bekannt oder können leicht von diesem nachvollzogen werden.
Obwohl die Verbindungen der Formel I in Form der freien Base in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können ist es bevorzugt, eine pharmazeutisch annehmbare Salzform herzustellen und zu verwenden. So bilden die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen primär pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze mit einer großen Vielzahl an organischen und anorganischen Säuren und umfassen die physiologisch annehmbaren Salze, die oft in der pharmazeutischen Chemie verwendet werden. Solche Salze sind auch Teil der Erfindung. Typische anorganische Säuren, die zur Bildung von Salzen verwendet werden, umfassen Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff , Iodwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor-, Hypophosphorsäure und dergleichen. Salze, die von organischen Säuren stammen, wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, phenylsubstituierten Alkansäuren, Hydroxyalkan- und Hydroxyalkandisäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäuren, können ebenfalls verwendet werden. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind daher unter anderem Acetat, Phenylacetat, Trifluoracetat, Acrylat, Ascorbat, Benzoat, Chlorbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Methylbenzoat, o-Acetoxybenzoat, Naphthalin-2-benzoat, Bromid, Isobutyrat, Phenylbutyrat, β-Hydroxybutyrat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,4-dioat, Caprat, Caprylat, Chlorid, Cinnamat, Citrat, Formiat, Fumarat, Glycollat, Heptanoat, Hippurat, Lactat, Malat, Maleat, Hydroxymaleat, Malonat, Mandelat, Mesylat, Nicotinat, Isonicotinat, Nitrat, Oxalat, Phthalat, Terephthalat, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Propiolat, Propionat, Phenylpropionat, Salicylat, Sebacat, Succinat, Suberat, Sulfat, Bisulfat, Pyrosulfat, Sulfit, Bisulfit, Sulfonat, Benzolsulfonat, p-Brombenzolsulfonat, Chlorbenzolsulfonat, Ethansulfonat, 2-Hydroxyethansulfonat, Methansulfonat, Naphthalin-1-sulonat, Naphthalin-2-sulfonat, p-Toluolsulfonat, Xylolsulfonat, Tartrat und dergleichen. Ein bevorzugtes Salz ist das Hydrochloridsalz.
Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze werden typischerweise durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einer äquimolaren oder überschüssigen Menge einer Säure gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen Lösemittel vereinigt, wie Diethylether oder Ethylacetat. Das Salz fällt normalerweise innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel kann durch herkömmliche Verfahren abgezogen werden.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze weisen im allgemeinen erhöhte Löslichkeitseigenschaften verglichen mit der Verbindung, von der sie stammen, auf, und sind daher bei der Formulierung als Flüssigkeiten oder Emulsionen oft beliebter.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen weiter zu erläutern.
Präparation 1
Zu einer Aufschlämmung aus Lithiumaluminiumhydrid (1,1 g, 29,0 mmol) in Tetrahydrofuran (175 ml) wird bei 0°C tropfenweise eine Lösung des Ketons (8,00 g, 11,6 mmol) in Tetrahydrofuran (500 ml) gegeben. Das Gemisch wird für 1 Stunde bei 0°C gerührt und dann tropfenweise mit Wasser (1,1 ml), 15% (G/G) NaOH (4,4 ml) und Wasser (1,1 ml) gestoppt. Die Aufschlämmung wird durch Celite filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts als weißer Schaum (5,2 g, 65%) zur Trockne eingedampft (Silicagel, MeOH/CHCl₃ Gradient). ¹H NMR stimmt mit der Struktur überein, FD (MS) 687 (M^-), Elementaranalyse für C₄₀H₅₇NO₅Si₂ Berechnet/Gefunden: C 69,82/70,00, H 8,35/8,36, N 2,04/2,02.
Beispiel 1
Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 2,9 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) wird bei RT Trifluoressigsäure (0,34 ml, 4,35 mmol) gegeben. Zu dieser gerührten Lösung wird MeOH (0,17 ml, 4,35 mmol) gegeben. Die entstehende Lösung wird über Nacht gerührt und dann zweimal mit NaHCO₃ und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende braune Öl wird in Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und HF/NaF (12,0 ml eines pH = 5 Puffers, der aus 7,0 g NaF, 0,21 ml 48% HF (wäßrig) und 50 ml Wasser besteht) wird bei Umgebungstemperatur zugegeben. Dieses Gemisch wird über Nacht bei Rückfluß gerührt. Die organische Lösung wird zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Der entstehende weiße Schaum wird durch Radialchromatographie (MeOH/ CHCl₃ Gradient) unter Bildung des gewünschten Produkts als brauner Feststoff (1,3 g, 80%) gereinigt. Die ¹H NMR stimmt mit der Struktur überein, FD (MS) 490 (M⁺), Elementaranalyse für C₂₉H₃₁NO₄S Berechnet/Gefunden: C 71,14/71,21, H 6,38/6,43, N 2,86/3,12.
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,26 ml, 3,15 mmol), EtOH (0,19 ml, 2,13 mmol), CH₂Cl₂ (40 ml), Bu₄NF (3,6 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 3,6 mmol) und Tetrahydrofuran (50 ml) verwendet. Das Gemisch wird viermal mit Kochsalzlösung (300 ml Portionen) gewaschen und durch Radialchromatographie (MeOH, CHCl₃/Hexan-Gradient) gewaschen.
Beispiel 3
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,0 g, 0,98 mmol), Trifluoressigsäure (0,12 ml, 1,5 mmol), n-PrOH (0,055 ml, 1,5 mmol), CH₂Cl₂ (60 ml), Bu₄NF (2,4 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 2,4 mmol) und CH₂Cl₂ (20 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan-Gradient) gereinigt.
Beispiel 4
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), i-PrOH (0,24 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (40 ml), Bu₄NF (3,8 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 3,8 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan-Gradient) gereinigt.
Beispiel 5
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), n-BuOH (0,29 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (40 ml), Bu₄NF (3,8 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 3,8 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan-Gradient) gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 6
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), BzOH (0,32 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (40 ml), Bu₄NF (4,0 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 4,0 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan-Gradient) gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 7
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), 3-Hydroxypropionitril (0,22 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (40 ml), Bu₄NF (3,6 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 3,6 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan) gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 8
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), Ethylenglycol (0,18 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (100 ml), Bu₄NF (4,0 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 4,0 mmol) und Tetrahydrofuran (100 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan) gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 9
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (40 ml), MeSH (Gas für 10 Minuten durchgeblasen) Bu₄NF (4,2 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 4,2 mmol) und Tetrahydrofuran (50 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan) gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 10
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mittels der Verbindung von Präparation 1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), CH₂Cl₂ (50 ml), EtSH (Gas für 10 Minuten durchgeblasen) Bu₄NF (3,6 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 3,6 mmol) und Tetrahydrofuran (50 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan) gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 11
Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation 1 (1,93 g, 2,8 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) werden bei 0°C Et₃N (1,6 ml, 11,4 mmol) und Mesylchlorid (0,26 ml, 1,23 mmol) gegeben. Diese Lösung wird bei 0°C für 15 Minuten gerührt und dann wird Me₂HN Gas für 10 Minuten durchgeblasen und das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit NaHCO₃ und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende Material wird in Tetrahydrofuran (40 ml) gelöst und Bu₄NF (5,8 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 5,8 mmol) wird bei 0°C zugegeben. Die organische Lösung wird zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende gelbe Öl wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan-Gradient) gereinigt, eingedampft und in Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst, zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
Beispiel 12
Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 2,9 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) werden bei 0°C Et₃N (1,6 ml, 11,4 mmol) und Mesylchlorid (0,26 ml, 3,5 mmol) gegeben. Diese Lösung wird bei 0°C für 15 Minuten gerührt und dann wird MeH₂N Gas für 10 Minuten durchgeblasen und das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit NaHCO₃ und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende braune Öl wird in Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5 hergestellt aus 7,0 g NaF, 0,21 ml 48% HF (wäßrig) und 50 ml Wasser) wird bei Umgebungstemperatur zugegeben. Dieses Gemisch wird über Nacht bei Rückfluß gerührt. Die organische Lösung zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Der entstehende weiße Schaum wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃-Gradient) gereinigt, in EtOAc (50 ml) gelöst und es wird HCl Gas durchgeblasen. Der entstehende weilte Niederschlag wird unter Bildung des gewünschten Produkts als weißer Feststoff filtriert (1,04 g, 65%). Die ¹H NMR stimmt mit der Struktur überein, hochauflösende Massenspektrometrie berechnet für C₃₀H₃₅N₂O₃S = 503,2368, Gefunden = 503,2331.
Beispiel 13
Das Verfahren von Beispiel 11 wird unter Verwendung der Verbindung von Präparation 1 (0,5 g, 0,7 mol), Et₃N (0,5 ml, 3,5 mmol), Mesylchlorid (0,07 ml, 0,8 mmol) und Tetrahydrofuran (25 ml) verwendet. Zu dieser Lösung werden bei 0°C eine Aufschlämmung von KCN (0,46 g, 7,9 mmol) und 18-Kronen-6 (0,93 g, 2,5 mmol) in Tetrahydrofuran (75 ml) gegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird für 20 Stunden am Rückfluß erhitzt, zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/Hexan als Gradient) gereinigt.
Beispiel 14
Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 3,0 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) bei 0°C werden Et₃N (1,6 ml, 11,6 mmol) und Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol) gegeben. Diese Lösung wird bei 0°C für 15 Minuten gerührt und dann wird Pyrolidin (1,21 ml, 14,5 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit NaHCO₃ und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Die entstehende rohe Verbindung wird in Tetrahydrofaran (100 ml) gelöst und HF/NaF (12,0 ml eines pH = 5 Puffers, hergestellt aus 7,0 g NaF, 0,21 ml 48% HF (wäßrig) und 50 ml Wasser) wird bei Umgebungstemperatur zugegeben. Dieses Gemisch wird am Rückfluß über Nacht gerührt. Die organische Lösung wird zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃ als Gradient) gereinigt und zur Trockne eingedampft. Die entstehende Verbindung wird in EtOAc (125 ml) gelöst und HCl Gas wird für 10 min durchgeblasen und der entstehende Niederschlag wird filtriert und im Vakuumofen getrocknet.
Beispiel 15
Die Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et₃N (1,6 ml, 11,6 mmol), Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol), Hexamethylenimin (1,6 ml, 14,5 mmol), CH₂Cl₂ (100 ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF (7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und Wasser (50 ml)) werden verwendet. Es wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/NH₃ Gradient) gereinigt.
Beispiel 16
Die Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et₃N (1,6 ml, 11,6 mmol), Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol), 2-Ethanolamin (0,9 ml, 14,5 mmol), CH₂Cl₂ (100 ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF (7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und Wasser (50 ml)) und Tetrahydrofuran (50 ml) werden verwendet. Es wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃ Gradient) gereinigt.
Beispiel 17
Die Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et₃N (1,6 ml, 11,6 mmol), Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol), 2-Fluorethylaminhydrochlorid (1,15 ml, 11,6 mmol), CH₂Cl₂ (100 ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF (7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und Wasser (50 ml)) und Tetrahydrofuran (150 ml) werden verwendet. Es wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/NH₃ Gradient) gereinigt.
Beispiel 18
Die Verbindung von Präparation 1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et₃N (1,6 ml, 11,6 mmol), Mesylchlorid (0,29 ml, 3,5 mmol), N-Aminopiperidin (1,6 ml, 14,5 mmol), CH₂Cl₂ (100 ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF (7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und Wasser (50 ml)) und Tetrahydrofuran (50 ml) werden verwendet. Es wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl₃/NH₃ Gradient) gereinigt.
Testverfahren
Allgemeines Präparationsverfahren
In den Beispielen, die die Verfahren erläutern, wird ein postmenopausales Modell verwendet, worin die Wirkungen der unterschiedlichen Behandlungen auf die zirkulierenden Lipide bestimmt werden.
Fünfundsiebzig Tage alte weibliche Sprague Dawley Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig gehalten und haben für eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5%) und Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen Luftfeuchte von 40% gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
Dosierungsplan zur Gewebeentnahme
Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit der Testverbindung begonnen. 17α-Ethinylöstradiol oder die Testverbindung werden als Suspension 1% Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20% Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin (2 : 1, V : V) betäubt und es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen. Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO₂ getötet, der Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht des Uterus wird bestimmt.
Cholesterinanalyse
Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das Cholesterin zu Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels einer Biomek Automated Workstation automatisiert.
Uteruseosinophilenperoxidasetest (EPO)
Die Uteri werden bis zur enzymatischen Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005% Triton-X 100 enthalten sind. Nach der Zugabe von 0,01% Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme für eine Minute bei 450 mn verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im Uterus ist ein Zeichen für die östrogene Aktivität einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden langen Intervalls wird über den anfänglichen, linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
Quelle der Verbindung
17α-Ethinylöstradiol erhält man von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Einfluß der Verbindungen der Formel I auf das Serumcholesterin
Die in der folgenden Tabelle 1 präsentierten Daten zeigen die Ergebnisse, wenn Ratten mit bestimmten Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Tabelle 1
Osteoporosetestverfahren
Durch Befolgen des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden die Ratten täglich für 35 Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Erstickung mit Kohlendioxid am 36. Tag getötet. Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Reduktion der Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und der Flüssigkeitsinhalt wird vor der Bestimmung des Naßgewichts entleert, um die mit der vollständigen Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz zu bestätigen. Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion auf die Ovarektomie um etwa 75% verringert. Die Uteri werden dann in neutral gepufferte 10% Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische Untersuchung zu ermöglichen.
Die rechten Femuren werden entnommen und digitalisierte Röntgenstrahlen werden an der distalen Metaphyse erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm (NIH image) analysiert. Der proximale Bereich der Tibia aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt.
Gemäß den obigen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oral an Testtiere verabreicht. Ein positiver Einfluß im obigen Test wird durch eine Hemmung des Knochenverlusts gezeigt, die durch die Verbindungen der Formel I bewirkt wird.
MCF-7 Proliferationstest
MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei, Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (V/V), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10 mM}, nicht essentiellen Aminosäuren und Rinderinsulin (1 μg/ml) supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10% mit dextranbeschichteter Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserm (DCC-FBS) anstelle von 10% FBS supplementiert ist, um die internen Steroidvorräte abzubauen. Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmedium entfernt (Ca²⁺/Mg²⁺ freies HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf 80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 μl (8000 Zellen) werden in Flachbodenmikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ für 48 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Transfer zu ermöglichen. Es werden serielle Verdünnungen der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium hergestellt und 50 μl werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 μl Testmedium auf ein Endvolumen von 200 μl überführt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ werden die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden markiert (1 μCi/Vertiefung). Die Kulturen werden durch Einfrieren bei –70°C für 24 Stunden gefolgt von einem Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic Cell Harvester beendet. Die Proben werden durch Flüssigscintillation mittels eines Wallac BetaPlace β-Zählgeräts gemessen. Die Wirkung der Verbindungen der Formel I zeigt sich durch ihre Auswirkung in diesem Test. Die im folgenden in der Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse zeigen die ED₅₀ für bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen.
Tabelle 2
DMBA-induzierte Brusttumorhemmung
Es werden östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis, Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenzo[a]anthrazen (DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten Durchmesser jedes Tumors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, daß die Tumoren der mittleren Größe zwischen den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und die Testgruppen für jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
Die Verbindungen der Formel I werden entweder über intraperitoneale Injektionen in 2% Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder in 0,2 ml Maisöl suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen mit Akaziengummi und Maisöl, wird einmal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede Woche durch das oben erwähnte Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden für 3 bis 5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt werden. Für jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung der mittleren Tumorfläche berechnet.
Uterusfibrosetestverfahren
Test 1
Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man eine erfindungsgemäße Verbindung. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum beträgt 3 Monate.
Die Frauen werden während des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
Test 2
Es wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
Test 3
Es wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
Test 4
A. Induktion von fibroiden Tumoren in Meerschweinchen
Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol 3–5 mal pro Woche durch Injektion für 2–4 Monate dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger bestehen, werden täglich für 3–16 Wochen verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen und auf Tumorregression untersucht.
B. Implantierung von humanem fibroidem Uterusgewebe in Nacktmäuse
Gewebe von humanen Leiomyomen wird in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In einigen Fällen werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung kultiviert. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des Organs zu untersuchen.
Test 5
A. Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5–25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen potentiell zur Behandlung der Uterusfibrose geeignet sind.
Endometriosetestverfahren
Im Test 1 und 2 können die Wirkungen einer 14 Tage und 21 Tage dauernden Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf das Wachstum des explantierten endometrialen Gewebes untersucht werden.
Test 1
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei Gruppen mir gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenält. Zusätzlich werden den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt.
Am Tag nach der Operation erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen für 14 Tage, während die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrialen Emplantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert. Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.
Test 2
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht.
Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrialen Explantate und Nebennieren werden entfernt und gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen werden aufgezeichnet.
Test 3
A. Operative Induktion der Endometriose
Autographien von endometrialem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt, um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen. Autologes endometriales Gewebe wird im Peritoneum von 5–150 Tieren implantiert und Östrogen wird zur Wachstumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Endometriums zu bestimmen.
B. Implantierung von humanem endometrialem Gewebe in Nacktmäuse
Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In manchen Fällen werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus einer erfindungsgemäßen Verbindung, die durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.
Test 4
A. Das Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Belandlung mit Progestinen, GnRH einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5–25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der Endometriose geeignet sind.
Testverfahren zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen /Restenose
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ein Potential zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen. Dies kann durch Verwendung der kultivierten glatten Zellen gezeigt werden, die von der Kaninchenaorta stammen, wobei die Proliferation durch die Messung der DNA Synthese bestimmt wird. Die Zellen werden durch das Explantationsverfahren erhalten, das in Ross, J. of Cell. Bio. 50: 172 (1971) beschrieben ist. Die Zellen werden für 5 Tage in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen werden konfluent und das Wachstum stoppt. Die Zellen werden dann in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) überführt, das 0,5–2% Blutplättchen-armes Plasma, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 1 mCi/ml ³H-Thymidin, 20 ng/ml aus Blutplättchen-stammender Wachstumsfaktor und verschiedene Konzentrationen der vorliegenden Verbindungen enthält. Die Stammlösung der Verbindungen wird in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann auf eine geeignete Konzentration (0,01–30 mM) im obigen Testmedium verdünnt. Die Zellen werden dann bei 37°C für 24 Stunden unter 5% CO₂/95% Luft inkubiert. Am Ende der 24 Stunden werden die Zellen in Methanol fixiert. Der ³H Thymidineinbau in die DNA wird dann durch Scintillationszählung bestimmt, wie dies in Bonin et al, Exp. Cell. Res. 181: 475–482 (1989) beschrieben ist.
Die Hemmung der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen wird ferner durch Bestimmung ihrer Wirkungen auf die exponentiell wachsenden Zellen gezeigt. Es werden glatte Muskelzellen aus Kaninchenaorten in Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen in DMEM geimpft, das 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Nach 24 Stunden haften die Zellen und das Medium wird durch DMEM ersetzt, das 10% Serum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und gewünschte Konzentrationen der Verbindungen enthält. Die Zellen läßt man für vier Tage wachsen. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt und die Anzahl an Zellen in jeder Kultur wird durch Zählen mittels eines ZM-Coultercounters bestimmt.
Die Aktivität in den obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen ein Potential bei der Behandlung der Restenose aufweisen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Linderung des postmenopausalen Syndroms bei Frauen, das gekennzeichnet ist durch das oben erwähnte Verfahren mittels Verbindungen der Formel I und umfaßt ferner die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Östrogens oder Progestins an eine Frau. Diese Behandlungen sind besonders bei der Behandlung der Osteoporose und der Verringerung des Serumcholesterins brauchbar, da der Patient die Vorteile jedes pharmazeutischen Mittels erhält, während die erfindungsgemäßen Verbindungen die unerwünschen Nebenwirkungen von Östrogen und Progestin verhindern würden. Die Wirkung dieser Kombinationsbehandlungen in einem der obigen postmenopausalen Tests zeigt, daß die Kombinationsbehandlungen für die Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms bei Frauen brauchbar sind.
Es sind verschiedene Formen von Östrogen und Progestin im Handel erhältlich. Auf Östrogen basierende Mittel umfassen beispielsweise Ethinylöstrogen (0,01–0,03 mg/Tag), Mestranol (0,05–0,15 mg/Tag) und konjugierte Östrogenhormone, wie Premarin® (Wyeth-Ayerst, 0,3–2,5 mg/Tag). Auf Progestin basierende Mittel umfassen beispielsweise Medroxyprogesteron, wie Provera® (Upjohn, 2,5–10 mg/Tag), Norethylnodrel (1,0–10,0 mg/Tag) und Norethindron (0,5–2,0 mg/Tag). Eine bevorzugte auf Östrogen basierende Verbindung ist Premarin und Norethylnodrel und Norethindron sind bevorzugte auf Progestin basierende Mittel.
Das Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen und Progestin basierenden Mittels stimmt mit dem überein, was in der Technik bekannt ist. Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verbindungen der Formel I kontinuierlich 1 bis 3 mal täglich verabreicht. Jedoch kann die zyklische Therapie insbesondere bei der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die Therapie auf kurze Intervalle (1–6 Monate) nach medizinischen Verfahren beschränkt werden, wie der Angioplastie.
Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "effektive Menge" eine Menge einer Verbindung der Formel I, die zur Linderung der Symptome von verschiedenen pathologischen Zuständen fähig ist, wie sie hierin beschrieben sind. Die spezifische Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung wird natürlich von den besonderen den Fall umgebenden Umständen bestimmt, wie beispielsweise der verabreichten Verbindung, des Verabreichungswegs, des Zustands des Patienten und des zu behandelnden pathologischen Zustands. Eine typische Tagesdosis enthält eine nicht-toxische Dosismenge von etwa 5 mg bis etwa 600 mg/Tag einer erfindungsgemäßen Verbindung und bevorzugter etwa 15 mg bis etwa 80 mg/Tag.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Diese Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert, wobei die Auswahl hiervon durch den behandelnden Arzt entschieden wird. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und wahlweise eine wirksame Menge Östrogen oder Progestin und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff hierfür enthält.
Die gesamten Wirkstoffe umfassen in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, daß der Träger, das Verdünnungsmittel, die Hilfsstoffe und das Salz mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sind.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen können durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannten und leicht verfügbaren Inhaltsstoffen hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen der Formel I mit oder ohne einer Östrogen- oder Progestinverbindung mit herkömmlichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen geformt werden. Beispiele für Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und Träger, die für solche Formulierungen geeignet sind, beinhalten die folgenden: Füllstoffe und Streckmittel, wie Stärke, Zuckerarten, Mannit und Kieselsäurederivate, Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon, Netzmittel, wie Glycerin, Desintegrationsmittel, wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat, Mittel zur Verzögerung der Auflösung, wie Paraffin, Resorptionsbeschleuniger, wie quarternäre Ammoniumverbindungen, oberflächenaktive Mittel, wie Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, adsorptive Träger, wie Kaolin und Bentonit und Gleitmittel, wie Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglycole.
Die Verbindungen können auch formuliert werden als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung oder als Lösungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beispielsweise auf inframuskulärem, subkutanem oder intravenösem Weg. Zusätzlich sind die Verbindungen gut geeignet zur Formulierung als verzögert freisetzende Dosierungsformen und dergleichen. Die Formulierungen können so gestaltet werden, daß sie den Wirkstoff nur oder vorzugsweise an einem bestimmten physiologischen Ort möglicherweise über eine bestimmte Zeitspanne freisetzen. Die Beschichtungen, Umhüllungen und Schutzmatrizes können beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt werden.
Verbindungen der Formel I werden alleine oder in Kombination mit einem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel in einer bequemen Formulierung verabreicht. Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd.
Formulierungen
In den folgenden Formulierungen meint "Wirkstoff' eine Verbindung der Formel I oder ein Salz oder Solvat hiervon.
Formulierung 1: Gelatinekapseln Hartgelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt:
Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung mit den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
Eine Tablettenformulierung wird mittels der folgenden Bestandteile hergestellt:
Formulierung 2: Tabletten
Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt.
Alternativ dazu werden Tabletten, die jeweils 2,5–1000 mg Wirkstoff enthalten, folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 3: Tabletten
Der Wirkstoff die Stärke und die Cellulose werden durch ein Sieb mit 4 × 10^–4 in großen Öffnungen (Nr. 45 Mesh US) gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt, die dann durch ein Sieb mit 1,25 × 10^–3 m großen Öffnungen (Nr. 14 Mesh US) gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C–60°C getrocknet und durch ein Sieb mit 10^–3 m großen Öffnungen (Nr. 18 Mesh US) gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein Sieb mit 2,5 × 10^–4 m großen Öffnungen (Nr. 60 Mesh US) gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben, die nach dem Mischen in einer Tablettemnaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt werden.
Suspensionen, die jeweils 0,1–1000 mg Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 4: Suspensionen
Das Arzneimittel wird durch ein Sieb mit 4 × 10 m großen Öffnungen (Nr. 45 Mesh US) gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rühren zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, im das erforderliche Volumen herzustellen.
Eine Aerosollösung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:
Formulierung 5: Aerosol
Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf –30°C abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschleßend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.
Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 6: Zäpfchen
Der Wirkstoff wird durch ein Sieb mit 2,5 × 10^–4 in großen Öffnungen (Nr. 60 Mesh US) gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.
Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 7: Intravenöse Lösung
Die Lösung der obigen Bestandteile wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.
Formulierung 8: Kombinationskapsel I
Formulierung 9: Kombinationskapsel II
Formulierung 10: Kombinationstablette

Claims

Verbindung der Formel I
worin R₁ für H, OH, OCO(C₁-C₆ Alkyl), OCO(Aryl), OSO₂(C₄-C₆ Alkyl), OCOO(C₁-C₆ Alkyl), OCOO(Aryl), OCONH(C₁-C₆ Alkyl) oder OCON(C₁-C₆ Alkyl)₂ steht, R₂ für Aryl, C₁-C₆ Alkyl, C₃-C₆ Cycloalkyl oder 4-Cyclohexanol steht, R₃ für O(CH₂)₂ oder O(CH₂)₃ steht, R₄ und R₅ wahlweise für CO(CH₂)₂CH₃, CO(CH₂)₃CH₃ oder C₁-C₆ Alkyl stehen oder R₄ und R₅ mit dem Stickstoff an den sie gebunden sind, unter Bildung von Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, 3-Methylpyrrolidin, 3,3-Dimethylpyrrolidin, 3,4-Dimethylpyrrolidin, Azepin oder Pipecolin kombinieren, R₆ steht für -OH, O(C₁-C₆ Alkyl), O(Aryl), O(C₁-C₆ Alkyl)aryl, OCH₂CH₂-Cano, O((C₁-C₆ Alkyl)-C₁-C₆-alkohol), OSO₂CH₃, OSO₂CCH₃, SH, S(C₁-C₆ Alkyl), Cyano, Halogen
worin jedes von R₇ und R₈ getrennt betrachtet wird und für H, C₁-C₆ Alkyl, 2-Hydroxyethyl oder 2-Fluorethyl steht oder sowohl R₇ als auch R₈ mit dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise substituiert sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, oder
worin jedes von R₁₀ und R₁₁ getrennt betrachtet wird und für H oder C₁-C₂ steht oder sowohl R₁₀ als auch R₁₁ mit dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise substituiert sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, und R₁ ₂ für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl steht, und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₅ steht für -OH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -O(CH₂)₂CH₃, -O(CH₂)₃CH₃, -O-CH₂-Phenyl, -O(CH₂)₂OH, -SCH₃, -SCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -NHCH₃ oder Cyano.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 1 und wahlweise eine wirksame Menge an Östrogen oder Progestin in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält.
Serienartikel, der Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Mittel umfaßt, das in diesem Verpackungsmaterial enthalten ist, worin das pharmazeutische Mittel zur Behandlung einer Erkrankung geeignet ist, ausgewählt aus 1) verschiedenen medizinischen Indikationen, die mit dem postmenopausalen Syndrom zusammenhängen, und 2) Östrogen-abhängigen Erkrankungen und worin das Verpackungsmaterial eine Aufschrift aufweist, die anzeigt, daß das pharmazeutische Mittel zur Belandlung einer dieser Erkrankungen verwendet werden kann und worin das pharmazeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 besteht.
Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung bei der Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms.
Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung bei dem postmenopausalen Syndrom des pathologischen Zustands der Osteoporose.
Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung bei dem postmenopausalen Syndrom des pathologischen Zustands, der mit einer kardiovaskulären Erkrankung zasammenhängt.
Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung bei der Hemmung der fibroiden Uteruserkrankung.
Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung bei der Hemmung der Endometriose.
Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung bei der Hemmung der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta.