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Neutrophile
Elastase ist eine Breitbandprotease, von der bekannt ist, dass sie
Zugang zu den Geweben der Lunge hat. Diese Protease ist im Allgemeinen
dazu in der Lage, alle Hauptproteinkomponenten des alveolaren Interstitiums
abzubauen. Die uneingeschränkte
Wirkung dieser Protease mit ihren elastolytischen Eigenschaften
kann zur Zerstörung
des Lungenbindegewebes führen
und zur anatomischen und funktionellen Störung des Lungenemphysems. Smith
et al., J. Clin. Invest. 84:1145–1154 (1989).
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α1-Antitrypsin
("α1AT") ist ein Proteaseinhibitor
mit inhibitorischer Wirkung gegenüber neutrophiler Elastase.
Es wurde gefunden, dass ein Mangel an α1-Antitrypsin im unteren Atemwegstrakt
wesentlich ist für die
Pathogenese von Emphysema aufgrund der entscheidenden Rolle von α1AT zum Schutz
alveolarer Strukturen vor neutrophiler Elastase. Ein Mangel an α1AT ist eine
genetische Erkrankung, die durch niedrige Plasma- und Lungenwerte
des Inhibitors und die Entwicklung von Emphysema in der dritten
bis vierten Dekade charakterisiert ist.
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Es
wurde gefunden, dass zusätzlich
zu genetischem Mangel an α1AT
die Lungen von Zigarettenrauchern mit Neutrophilen belastet sind.
Insbesondere wurden entscheidend erhöhte Mengen an Neutrophilen
in Zellsuspensionen gefunden, die aus bronchoalveolarem Lavagefluid
und aus offenen Lungenbiopsien von sowohl normalen als auch sarkoiden
Zigarettenrauchern isoliert wurden verglichen mit Nichtrauchern.
Hunnighake und Crystal, Am. Rev. Respir. Dis. 128:833–838 (1983).
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Behandlungsverfahren
für α1AT-Mangel,
ob genetisch oder erworben, konzentrierten sich zunächst auf
eine Erhöhungstherapie
durch Bereitstellen einer exogenen Quelle von α1AT für Patienten, die an einem solchen
Mangel leiden. Die intravenöse
Verabreichung wurde bei dieser Erhöhungstherapie bisher eingesetzt, um
eine exogene Quelle an α1AT
bereitzustellen. Um jedoch wirksame Konzentrationen des Inhibitors
in den Geweben bereitzustellen, in denen er benötigt wird, z. B. im Lungengewebe,
ist bei intravenösen
Verfahren die Verabreichung von großen Mengen an α1AT, z. B.
4–5 g/Woche
erforderlich. Außerdem
muss diese intravenöse
Verabreichung im Allgemeinen stationär in einem Krankenhaus durchgeführt werden.
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Es
wurde von erfolgreichen Ergebnissen berichtet durch Verwendung einer
Verabreichung flüssiger α1AT-Formulierungen
in Aerosolform. Die Verabreichung in Aerosolform stellt eine lokale
Zufuhr des Inhibitors zu dem betroffenen Gewebe des unteren Atemwegtrakts
bereit, wodurch niedrigere Dosierungen erforderlich sind. Siehe
europäische Patentveröffentlichung
Nr. 0 289 336 , Smith et al., J. Clin. Invest. 84:1145–1154 (1989),
Hubbard et al., J. Clin. Invest. 84:1349–1354 (1989), Hubbard et al.,
Lung Suppl. 565–578
(1990). In dem Dokument
US 5
093 316 wird die Verabreichung von α1-Antitrypsin in Form von mikrokristallinem
Trockenpulver offenbart.
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Trotz
der Verbesserungen bei der α1AT-Erhöhungstherapie
bestehen noch immer Probleme. Insbesondere werden mit den Flüssigaerosolverfahren
von denen bisher berichtet wurde nur für kurze Zeiträume, z. B.
für mehrere
Stunden, wirksame Mengen an α1AT
im Lungengewebe bereitgestellt, wodurch häufig wiederholte Behandlungen
mit höheren
Dosierungen, z. B. >200
mg/Tag, erforderlich sind. Es besteht daher ein Bedarf an einem
Verfahren zur Verabreichung von α1AT
an Patienten, welches länger
andauernde Vorteile bei einer einzelnen Behandlung bereitstellt
und dadurch geringere und seltenere Dosen erfordert. Die vorliegende Erfindung
erfüllt
diese und andere Anforderungen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
werden Verfahren zur Verabreichung von α1AT-Trockenpulverzusammensetzungen über die
Lunge beschrieben. Die Verfahren stellen im Allgemeinen verbesserte
Persistenz von α1-Antitrypsin
in kritischen Geweben des unteren Atemwegstrakts gegenüber den
bisher beschriebenen Flüssigaerosolverfahren
bereit.
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Die
Verfahren umfassen im Allgemeinen die Bereitstellung von α1-Antitrypsin
als Trockenpulver. Das α1-Antitrypsin-Trockenpulver
wird zerstäubt
und dem Patienten über
die Lungen verabreicht. Speziell stellt die Erfindung gemäß einem
ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung einer α1-Antitrypsinzusammensetzung für pulmonale
Verabreichung bei einem Patienten bereit, umfassend Bereitstellen
von α1-Antitrypsin
als trockene und im Wesentlichen amorphe Pulverzusammensetzung,
die in einem Dosierungseinheitsbehälter untergebracht ist. Die
Verfahren sind generell nützlich
bei der Behandlung von Personen, die an einem genetischen oder erworbenen α1-Antitrypsin-Mangel
leiden und sind insbesondere nützlich
bei der Behandlung der funktionellen Störungen von Emphysema.
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Die
Aerosolisierung des Trockenpulvers α1AT für pulmonale Verabreichung wird
im Allgemeinen unter Verwendung einer Trockenpulverinhalationsvorrichtung
durchgeführt.
Somit wird ein Apparat zur Durchführung der pulmonalen Verabreichung
von α1-Antitrypsin-Trockenpulvern
beschrieben, wobei die Vorrichtung im Allgemeinen ein Gehäuse umfasst,
in dem eine Kammer angeordnet ist, wobei die Kammer eine wirksame Menge
einer trockenen und im Wesentlichen amorphen α1-Antitrypsin-Pulverzusammensetzung
enthält.
Die Vorrichtung beinhaltet weiter eine Gasdruckquelle, die fluid
mit der Kammer verbunden ist, um einen Gasstrom zu der Kammer zu
befördern,
um die Trockenpulverzusammensetzung zu aerosolisieren. In der Vorrichtung
ist außerdem
ein Zufuhrsystem für
die Zufuhr der aerosolisierten Trockenpulverzusammensetzung enthalten,
für die
Inhalation durch den Patienten, welches fluid mit der Kammer verbunden
ist.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
die Konzentration von α1-Antitrypsin
in Lymphgewebe im Zeitverlauf nach der Trockenpulveraerosolaussetzung.
Drei Schafe wurden mit unterschiedlichen Aussetzungsprotokollen
getestet.
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2 zeigt
die Konzentration von α1-Antitrypsin
in Lymphgewebe im Zeitverlauf nach Trockenpulveraerosolaussetzung.
Zwei Aussetzungen wurden zum Zeitpunkt 0 und nach 50 h durchgeführt.
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3 zeigt
die aus pulmonalem Lymphgewebe von Schafen gewonnenen α1AT-Werte
nach mehrfacher Verabreichung durch Inhalation. Aerosolverabreichungen
sind durch Pfeile markiert.
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4 zeigt
mittlere Lymph- und Plasmakonzentrationen von α1AT in Schafen (n = 3) nach
mehrfacher Verabreichung. Verabreichungen sind durch Pfeile markiert.
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5 veranschaulicht
ein Schema von alveolaren Strukturen, die an der Wanderung von α1AT vom alveolaren
Luftraum in das Plasma beteiligt sind.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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I. Allgemeines
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Die
vorliegende Erfindung stellt generell Verfahren bereit, um die Verabreichung
von α1-Antitrypsin
an einem Patienten zu ermöglichen.
Typischerweise ist eine solche Verabreichung nützlich zur Behandlung von Patienten,
die an einem Mangel an endogenem α1-Antitrypsin
leiden. Mit "Mangel
an endogenem α1AT" ist gemeint, dass
die endogenen Werte an α1AT
nicht ausreichend sind, um Schutz gegen die vorhandenen Mengen an
neutrophiler Elastase zu bieten. Dieser Mangel kann in den Zielgeweben
ausgeprägt
sein durch α1AT-Werte
unterhalb normaler Werte oder als überschüssige Mengen an neutrophiler
Elastase. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen die pulmonale Verabreichung
von α1-Antitrypsintrockenpulver
an dem Patienten und stellen im Allgemeinen eine verbesserte Beständigkeit
von α1-Antitrypsin
im Lungengewebe verglichen mit bisher beschriebenen Flüssigaerosolverabreichungsverfahren
bereit.
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II. Trockenpulverformulierung
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Es
wurde bereits bei der Behandlung zahlreicher Erkrankungen von der
Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen in Aerosolform
berichtet. Z. B. wurde die respiratorische Zufuhr von Insulinlösungen in
Aerosolform sehr ausführlich
beschrieben. Siehe z. B. Laube, et al., J. Am. Med. Assoc. 269:2106–2109 (1993),
Elliott et al., Aust. Pediat. J. 23:293–297 (1987), Wiglet et al.,
Diabetes 20:552–556
(1971), Corthorpe et al., Pharm. Res. 9:764–768 (1992).
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Die
pulmonale Verabreichung von Trockenpulvermedikamenten wie beispielsweise
Insulin in einem Trägervehikel
für große Partikel
wird im
US-Patent Nr. 5,254,330 beschrieben.
Ein Inhalator für
eine abgemessene Dosis zur Verabreichung von kristallinem Insulin,
welches in einem Treibmittel suspendiert ist, wird in Lee et al.,
J. Pharm. Sci. 65:567–572
(1976) beschrieben.
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Die
pulmonale Verabreichung von Trockenpulver-⌷1AT kann generell
durch Trockenpulververabreichungsverfahren durchgeführt werden,
die im Stand der Technik bekannt sind. Z. B. werden in der US-Patentanmeldung
(
WO 96/32149 ), eingereicht
am 14. April 1995, Trockenpulververabreichungsverfahren beschrieben,
die für
die Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung besonders
geeignet sind.
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α1-Antitrypsin
("α1AT") zur Verwendung
in den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann generell aus zahlreichen
Quellen erhalten werden. Z. B. sind sowohl natürliche als auch rekombinante
Formen von α1AT
kommerziell erhältlich,
z. B. von Cutter Laboratories, Berkeley CA bzw. Cooper Labs, Mountain
View CA. Alternativ dazu kann α1AT
aus menschlichen Quellen isoliert werden, z. B. aus Cohn-Fraktion
IV-I von Humanplasma gewonnen werden, oder durch gut bekannte rekombinante
Verfahren hergestellt werden. Siehe
US-Patent
Nr. 4,599,311 .
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Die
Herstellung der Trockenpulver-α1AT-Formulierungen
kann generell unter Verwendung zahlreicher gut bekannter Verfahren
durchgeführt
werden einschließlich
Lyophilisation, Sprühtrocknen,
Agglomeration, Sprühbeschichten,
Extrusionsprozessen und deren Kombinationen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird die Trockenpulver-α1AT-Formulierung
unter Verwendung eines Sprühtrocknungs-/Agglomerationsprozesses hergestellt,
in dem ein im Wesentlichen amorphes Pulver mit homogener Zusammensetzung
hergestellt wird mit einer Partikelgröße, die leicht durch Atmung
aufgenommen werden kann, das einen geringen Feuchtigkeitsgehalt
aufweist und Fliesseigenschaften aufweist, die eine leichte Aerosolisierung
ermöglichen.
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Verfahren
zur Herstellung von sprühgetrockneten,
durch Atmung aufnehmbaren Pulverzusammensetzungen werden z. B. in
der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/423,515 (
WO 96/32149 ), eingereicht am 14.
April 1995, beschrieben. Typischerweise wird bei dem Sprühtrocknungsverfahren
eine homogene wässrige
Lösung von α1AT, die
einen geeigneten Träger
beinhalten kann oder nicht, über
eine Düse,
Spinnscheibe oder entsprechende Vorrichtung in einen heißen Gasstrom
eingebracht, um die Lösung
zu atomisieren, um feine Tröpfchen
zu bilden. Obwohl als eine Lösung
beschrieben, kann die wässrige
Form des α1AT
eine Lösung,
Suspension, Aufschlämmung
oder andere homogene flüssige
Form sein, bevorzugt jedoch eine Lösung. Das Lösungsmittel, in welchem das α1AT gelöst, suspendiert
oder aufgeschlämmt
ist, verdunstet leicht von den Tröpfchen, wodurch ein feines
Trockenpulver gebildet wird mit hauptsächlich Teilchen mit 1–5 μm Durchmesser.
Bevorzugt ist die Partikelgröße des resultierenden
Pulvers so, dass mehr als ungefähr
98% der Masse des Trockenpulvers von Partikeln gebildet wird, die
einen Durchmesser von ungefähr
10 μm oder
weniger aufweisen, wobei mehr als ungefähr 90% der Masse in Teilchen
vorhanden ist, die einen Durchmesser von weniger als ungefähr 5 μm aufweisen.
Alternativ werden ungefähr
95% der Masse von Teilchen mit weniger als ungefähr 10 μm gebildet, wobei ungefähr 80% der
Masse in Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als oder gleich
ungefähr
5 μm vorliegt.
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Sprühtrocknen
kann unter Verwendung von herkömmlicher,
kommerziell erhältlicher
Sprühtrocknungsausrüstung durchgeführt werden
wie der, die erhältlich
ist von Buchi, Niro, Yamato Chemical Co., Okawara Kakoki Co., und
dergleichen, wobei die Ausrüstung
im Allgemeinen geeignet ist, um ein amorphes Pulverprodukt herzustellen.
Typischerweise sind diese Maschinen geeignet, über einen weiten Bereich von
Parametern zu arbeiten. Beispielsweise kann ein Buchi-190-Sprühtrockner
verwendet werden, um die Trockenpulverzusammensetzungen herzustellen
durch Betrieb bei zwischen 5 und 20 ml/min mit einem Atomisierungsdruck
von 342,5 × 103 N/m2 bis 821,9 × 103 N/m2 (50 bis 120
psi), einer Atomisierungsluftzufuhrrate von 20–80 lpm und einer Trocknungstemperatur
von 50–200°C.
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Für das Sprühtrockenverfahren
können
solche Sprühverfahren
wie Rotationsatomisierung, Druckatomisierung und Zweifluidatomisierung
verwendet werden. Beispiele für
die in diesen Verfahren verwendeten Vorrichtungen beinhalten das
Parubisu Mini-Spray GA-32 und "Parubisu
Spray Drier DL-41",
hergestellt von Yamato Chemical Co., oder die Sprühtrocknermodelle
CL-8, L-8 FL-12, FL-16 oder FL-20, hergestellt von Okawara Kakoki
Co. Diese Ausstattung kann gut zum Sprühtrocknen der hierin beschriebenen
Zusammensetzungen verwendet werden, einschließlich Rotationsscheibenatomisierer-Sprühtrocknungsverfahren.
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Die
oben beschriebenen Trockenpulver sind in den hierin beschriebenen
Verfahren gut verwendbar. In mancher Hinsicht kann es jedoch wünschenswert
sein, die Trockenpulverformulierung in einer Form bereitzustellen,
die bessere Handhabungseigenschaften besitzt, z. B. Rieselfähigkeit,
geringe Anbackung u. ä.
Die Herstellung von Aggregat- oder Agglomerat-Zusammensetzungen
ist z. B. in der US-Anmeldung Nr. 08/483,467 (
US-A-5 654 007 ), eingereicht
am 7. Juni 1995, beschrieben. In einem speziellen Aspekt werden die
hierin beschriebenen Trockenpulverformulierungen als Aggregate oder
Agglomerate der oben beschriebenen Feinpulverzusammensetzungen bereitgestellt.
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Im
Allgemeinen wird die Agglomerierung der oben beschriebenen Feinpulverzusammensetzungen durchgeführt, indem
die Pulver von feinen Partikeln mit einer Bindemittelflüssigkeit
kombiniert werden, um eine feuchte Masse zu bilden. Die durchnässte Masse
wird dann in kleine Volumenteile aufgeteilt, welche getrocknet werden,
um die Bindemittelflüssigkeit
zu entfernen und um Trockenpulveragglomerateinheiten mit einer ersten
Größenverteilung
herzustellen. Dies wird üblicherweise
mit gut bekannten Verfahren durchgeführt, z. B. Extrusion. Extrusionsmethoden
beinhalten typischerweise die Extrusion der durchnässten Masse
oder Paste durch ein Sieb mit Löchern,
die im Bereich von 40 bis 650 μm
liegen und weiter bevorzugt im Bereich von ungefähr 150 bis 500 μm. Typischerweise
sind die Löcher
in dem Sieb rund, wodurch ein längliches
zylindrisches Extrudat produziert wird. Das Extrudat wird typischerweise
bei einer Temperatur von ungefähr
15°C bis
ungefähr
40°C getrocknet,
abhängig
von der Art des Materials, welches getrocknet wird. Typischerweise
werden zur Trocknung des Extrudats Zwangsluftkonvektions-trockner
oder Vakuumtrockner verwendet. Typischerweise setzen Vakuum-trockner
die Aggregatteilchen einem Druck von ungefähr 332,3 × 102 bis
ungefähr
866,6 × 102 N/m2 (250 bis ungefähr 650 mm
Hg) aus.
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Bindemittelflüssigkeiten
können
eine Vielzahl von Flüssigkeiten
enthalten, die mit den pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hergestellt
werden, kompatibel sind, z. B. Wasser, Kochsalzlösung u. ä. Zusätzlich kann in manchen Aspekten
die Bindemittelflüssigkeit
ein nicht wässriges
Lösungsmittel
sein, z. B. Fluorkohlenstoff, Toluol, Xylol, Benzol, Aceton, Hexan,
Oktan, Chloroform und Methylenchlorid. Die Verwendung von nicht
wässrigen
Lösungsmitteln
als Bindemittelflüssigkeiten
ist generell vorteilhaft, da Kohlenwasserstoffe und Proteine, die
im Allgemeinen in den hierin beschriebenen Agglomeratzusammensetzungen
enthalten sind, typischerweise in diesen Flüssigkeiten geringe Löslichkeit
besitzen, wodurch die Möglichkeit
der Bildung von kristallinen Brücken
zwischen den Feinpulverpartikeln in dem Agglomerat minimiert wird.
Außerdem
besitzen die meisten nicht wässrigen
Lösungsmittel
eine niedrige Oberflächenspannung,
was es erlaubt, dass die größeren Agglomeratpartikel,
wenn erforderlich, aufgebrochen werden.
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Beispiele
für bevorzugte
nicht wässrige
Lösungsmittel
beinhalten Fluorkohlenstoffflüssigkeiten
wie beispielsweise Perfluordecalin und Perfluoroktylbromid. Fluorkohlenstoffflüssigkeiten
werden typischerweise aufgrund ihrer hydrophoben und lipophoben
Natur bevorzugt, wodurch Proteine oder Kohlenwasserstoffe nicht gelöst werden
oder auf andere Weise damit wechselwirken. Der hohe Dampfdruck von
Fluorkohlenstoffflüssigkeiten ist
auch zur Entfernung der Flüssigkeit
aus dem Agglomeratteilchen nützlich.
Diese Fluorkohlenstoffflüssigkeiten
sind auch im Allgemeinen biokompatibel in den meisten pharmazeutischen
Zusammensetzungen und sind im Allgemeinen kommerziell erhältlich von
einer Vielzahl von gewerblichen Lieferanten, z. B. PCR, Inc. (Gainesville,
FL), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) and Aldrich Chemical Co.
(Milwaukee, WI).
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Die
Menge an Bindemittelflüssigkeit,
die zu der Trockenpulverzusammensetzung zugegeben wird, ist im Allgemeinen
bezogen auf die Oberfläche
der feinen Teilchen. Wenn z. B. eine Fluorkohlenstoffbindemittelflüssigkeit
verwendet wird mit den Feinpartikeln der ursprünglichen Trockenpulverzusammensetzungen,
z. B. denen mit einem Größenbereich
von 1–5 μm, so wird
die Flüssigkeit
zu dem Pulver in einer Menge von ungefähr 0,5 g bis 5,0 g Flüssigkeit
pro g Pulver zugegeben.
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Die
in dieser ersten Reihe von Schritten hergestellten Trockenpulveragglomerate
werden anschließend
an eine zweite Größenverteilung
angepasst, die durch einen Friabilitätsindex von ungefähr 10 bis
ungefähr
60 gekennzeichnet ist. Wenn sie angepasst sind sind die Aggregatpartikel
typischerweise stabil genug, um dem Auseinanderbrechen während normaler
Handhabung und Abmessvorgängen
zu widerstehen. Zum selben Zeitpunkt sind die Partikel typischerweise
ausreichend bröselig,
um das Auseinanderbrechen der Aggregate zu erlauben, wenn dies benötigt wird,
d. h. bei Verabreichung. Friabilitätsindices werden im Allgemeinen
berechnet, indem eine kleine Probe, z. B. 0,4 bis 0,5 g, der Aggregatzusammensetzung
auf einem 1000 μm-Sieb
platziert wird. Das Sieb wird mit einer Amplitude von ungefähr 1 cm
und einer Frequenz von ungefähr 5
Hz für
20 min vibrieren gelassen. Nach 20 min werden die auf dem 1000 μm-Sieb verbliebenen
Aggregate gewogen und dieses Gewicht wird anschließend durch
das Anfangsgewicht geteilt. Der Prozentsatz an Aggregaten, die nicht
durch das 1000 μm-Sieb
durchgebrochen sind, ist der Friabilitätsindex.
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Die
Anpassung der Aggregatpartikelzusammensetzung an die zweite Größenverteilung
wird im Allgemeinen durch Sieben der Agglomeratzusammensetzung durch
eine Reihe von Rastern oder Sieben mit einem gewünschten Siebgrößenbereich
durchgeführt.
Wenn z. B. eine Größenbereichsverteilung
von ungefähr 150–500 μm gewünscht wird,
werden die Aggregatpartikel auf einem Satz von gestapelten Sieben
platziert. Das obere Sieb wird eine Durchlässigkeit von ungefähr 500 μm aufweisen,
während
das untere Sieb eine Durchlässigkeit
von 150 μm
besitzt. Die Aggregatpartikel werden auf dem oberen Sieb platziert
und gesiebt, d. h. durch Vibration und/oder Klopfen. Alle Teilchen,
die das 500 μm-Größenlimit überschreiten,
werden auf dem oberen Sieb zurückgehalten,
von welchem sie entnommen werden können oder erneuter Verarbeitung unterzogen
werden können.
Kleinere Teilchen als 500 μm
werden zu dem unteren Sieb gelangen, wo größere Teilchen als 150 μm zurückgehalten
werden. Die Teilchen, die durch das zweite Sieb passieren, werden
gesammelt, d. h. in einem Tiegel unter dem zweiten Sieb, von wo
sie entnommen werden können
oder erneut verarbeitet werden.
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Typischerweise
wird die zweite Größenverteilung
eine mittlere Partikelgröße zwischen
ungefähr
50 μm und
ungefähr
600 μm aufweisen,
bevorzugt zwischen ungefähr
150 μm bis
ungefähr
500 μm und
am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 200 μm und 500 μm. Die Agglomerate werden typischerweise
geformt/ausgewählt,
wodurch mehr als 90% der Agglomeratzusammensetzung innerhalb eines
Größenbereichs
fällt,
der ±250 μm ist und
bevorzugt innerhalb einen Bereich von ±150 und weiter bevorzugt
innerhalb ungefähr ±100 μm.
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Die
Trockenpulveragglomerate können
auch zu Kugeln geformt werden, d. h. es kann ihnen durch gut bekannte
Verfahren, z. B. Rollverfahren wie solche, die üblicherweise bei Pfannenbeschichtungsvorgängen verwendet
werden, eine sphärische
Geometrie verliehen werden. Dies beinhaltet typischerweise das Rollen der
Partikel in einem Container, um dazu zu führen, dass ein sphärisches
Teilchen gebildet wird.
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Agglomeratzusammensetzungen
können
auch in Fliessbetttrocknungsapparaturen gebildet werden. Typischerweise
beinhaltet dies zunächst
Fluidisieren der Trockenpulverzusammensetzung in einem Strom von heißer Luft.
Die Bindemittelflüssigkeit
wird anschließend
durch eine Düse
in das fluidisierte Pulver gesprüht. Die
Benetzung der einzelnen Partikel ermöglicht die Agglomeration anderer
Partikel daran. Die gleichzeitige Trocknung in dem Heissluftstrom
verhindert die Bildung von Agglomeraten mit geringer Brüchigkeit.
Fliessbetttrockner sind ebenfalls kommerziell erhältlich von
z. B. Glatt Air Techniques, Inc.
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Trockenpulverzusammensetzungen
können
auch unter Verwendung anderer Trocknungsprozesse hergestellt werden
wie beispielsweise Agglomerationsprozessen, Extrusions-, Sprühbeschichtungs-
und Lyophilisations- und Jetmahlprozessen. Lyophilisations-/Jetmahlprozesse
zur Herstellung von Trockenpulverpolypeptidformulierungen werden
z. B. in der veröffentlichen
PCT-Anmeldung Nr.
WO 91/16038 beschrieben.
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In
bevorzugten Aspekten sind die Trockenpulver-α1AT-Zusammensetzungen zur Verwendung
in den hierin beschriebenen Verfahren im Wesentlichen rein. Mit
im Wesentlichen rein ist gemeint, dass α1AT innerhalb der Trockenpulverformulierung
auf einer Gewicht/Gewicht-Basis die überwiegende Komponente ausmacht.
Typischerweise enthält
die Trockenpulverformulierung z. B. mehr als ungefähr 30% α1AT pro Gewicht. In
bevorzugten Aspekten ist die Trockenpulverformulierung zu mehr als
ungefähr
70% pro Gewicht α1AT,
weiter bevorzugt zu mehr als ungefähr 80% pro Gewicht α1AT. In noch
weiter bevorzugten Aspekten ist die Trockenpulverformulierung zu
mehr als ungefähr
90% pro Gewicht α1AT,
wobei Trockenpulverformulierungen von mehr als ungefähr 95% α1AT und mehr
als ungefähr
99% am meisten bevorzugt werden. Die Berechnung von Gewichtsprozent
an α1AT
kann mit einer Vielzahl von gut bekannten Verfahren durchgeführt werden,
z. B. mit Immunosorbtionsassays, Assays auf Aktivitätsbasis
und dergleichen.
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Wenn
die Trockenpulverzusammensetzung andere Elemente als α1AT enthält, kann
der verbleibende Anteil der Zusammensetzung im Allgemeinen eine
oder mehrere von zahlreichen anderen Elementen umfassen. Z. B. kann
die Trockenpulverzusammensetzung Produkte des Sprühtrocknungsvorgangs
enthalten, d. h. inaktive α1AT-Spezies
oder andere makromolekulare Komponenten, die von der Herstellung
des α1AT
herrühren.
In besonders bevorzugten Aspekten wird jedoch reines oder nahezu
reines α1AT
verwendet, um die Trockenpulverzusammensetzungen zu formulieren.
Insbesondere werden α1AT-Zusammensetzungen
verwendet, die zu mehr als 90% und weiter bevorzugt zu mehr als
95% rein sind, um die Trockenpulverzusammensetzungen zu formulieren.
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen zusätzlichen
Elementen kann eine Vielzahl von Zusätzen zu der Trockenpulverformulierung
zugegeben werden, entweder während
des Sprühtrocknungsvorgangs
oder nach dem Sprühtrocknungsvorgang,
durch Zugabe einer trockenen Komponente über Trockenpulvermischmethoden.
Z. B. kann es in manchen Aspekten wünschenswert sein, das α1AT mit einem
oder mehreren pharmazeutischen Trägern oder Hilfsstoffen zu kombinieren,
die für
respiratorische oder pulmonale Verabreichung geeignet sind. Solche
Träger
können
als Quellungsmittel dienen, z. B. wenn es wünschenswert ist, die Konzentration
an α1AT,
die dem Patienten in einer einzelnen Dosis verabreicht wird, zu
verringern, oder sie können dazu
dienen um die Effizienz der Formulierung zu steigern, entweder als
ein Stabilisierungsmittel für
die Trockenpulverzusammensetzung, ein Disperisonsmittel, um die
Handhabungseigenschaften der Formulierung zu verbessern, ein Hilfsstoff,
der die Aktivität
des α1AT
innerhalb des Gewebes der Lunge verbessert, z. B. Puffermittel
u. ä. Beispiele
für geeignete
pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe oder Quellmittel beinhalten
Kohlenwasserstoffe, Polypeptide, Aminosäuren oder Kombinationen davon.
Geeignete Kohlenwasserstoffe beinhalten z. B. Monosaccharide wie
beispielsweise Galactose, D-Mannose, Sorbose u. ä., Disaccharide wie beispielsweise
Lactose, Trehalose u. ä.,
Cyclodextrine wie beispielweise 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und Polysaccharide
wie beispielsweise Raffinose, Maltodextrine, Dextrane u. ä., Alditole
wie beispielsweise Mannitol, Xylitol u. ä. Bevorzugte Kohlenwasserstoffe
beinhalten Lactose, Trehalose, Raffinose, Maltodextrine und Mannitol.
Geeignete Polypeptide beinhalten z. B. Aspartam u. ä., während geeignete
Aminosäuren
z. B. Alanin und Glycin enthalten.
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Die
Trägermaterialien
können
mit dem α1AT
vor dem Sprühtrocknen
kombiniert werden, z. B. durch Zugeben des Trägers zu der α1AT-Lösung. Dadurch
wird sichergestellt, dass der Träger
gleichzeitig mit dem α1AT
getrocknet wird, um ein homogenes Trockenpulver zu bilden. Alternativ
können
die Träger
separat getrocknet werden oder als ein Trockenpulver erhalten werden
und mit dem α1AT-Pulver
gemischt werden. Trockenpulverträger
zum Mischen mit α1AT-Trockenpulvern
sind typischerweise kristallin (um Wasserabsorption zu verringern),
können
jedoch auch amorph sein. Die Größe des Trägers kann
im Allgemeinen so ausgewählt werden,
um die Fließfähigkeit
des α1AT-Pulvers
zu verbessern, typischerweise im Bereich von ungefähr 25 μm bis ungefähr 100 μm. Kristalline
Lactose ist ein besonders bevorzugter Trockenpulverträger.
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Während es
möglich
ist, den α1AT-Bestandteil
in reiner Form, d. h. ohne Zusatzbestandteil zu verabreichen, ist
es oft wünschenswert,
zusätzliche
Komponenten zu dem α1AT
zu beinhalten, z. B. das α1AT
als Teil einer pharmazeutischen Formulierung bereitzustellen. Diese
Formulierungen umfassen das α1AT
in einer therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Dosis zusammen
mit einem oder mehreren pharmazeutisch oder therapeutisch annehmbaren
Trägern
und ggf. anderen therapeutischen Inhaltsstoffen. Verschiedene Abwägungen werden
beschrieben, z. B. in Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological
Bases of Therapeutics, 8. Edition, Pergamon Press; Novel Drug Delivery
Systems, 2nd Edition, Norris (ed.) Marcel Dekker Inc. (1989), und
Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Edition (Mack Publishing Co. 1990). Spezielle Beispiele
an Zusatzkomponenten in den hierin beschriebenen α1AT-Formulierungen
beinhalten z. B. Quellmittel, Puffer und andere pharmazeutische
Mittel zur Co-Administration
mit dem α1AT
wie beispielsweise Kohlenwasserstoffträger und dergleichen.
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III. Verabreichung
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In
einem besonderen Aspekt wird ein Verfahren zur pulmonalen Verabreichung
von α1AT-Trockenpulver
an einen Patienten offenbart. Solche Verfahren sind besonders nützlich bei
der Behandlung von Patienten, die an Erkrankungen leiden, die durch
einen Mangel an α1AT
in den Lungengeweben gekennzeichnet sind. Diese Erkrankungen können ein
Ergebnis von genetischer Defizienz oder eine Folge von äußeren Einflüssen, z.
B. chronischem Rauchen, etc. sein. Durch pulmonale Verabreichung
von α1AT
als Trockenpulverzusammensetzung wird eine erhöhte Persistenz von α1AT in den
Lungengeweben erhalten.
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Mit "pulmonale Verabreichung" oder "Verabreichung über die
Lunge" ist ein Verabreichungsweg
gemeint, der eine wirksame Menge der so verabreichten Verbindung
zu den Geweben des unteren Atemwegstrakts transportiert. Eine solche
Verabreichung bedingt im Allgemeinen die Inhalation der entsprechenden Verbindung
durch den Patienten, wodurch die Verbindung in die tiefe Lunge gezogen
wird.
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Der
Transport von pulverförmigen
Medikamenten zu den Lungen wird üblicherweise
durch Verwendung einer Inhalationsvorrichtung durchgeführt, die
das pulverförmige
Medikament in einem Luftstrom fluidisiert, der anschließend von
dem Patienten inhaliert werden kann, um das Medikament zur Lunge
des Patienten zu transportieren. Durch Bereitstellen der aggregierten
Partikel mit einem gewünschten
Friabilitätsindex
wie vorhergehend beschrieben können
die aggregierten Partikel innerhalb des Inhalators zur Pulverform
aufgebrochen werden. Auf diese Weise können die pulverförmigen Medikamente
zur Messung und Handhabung in Agglomeratform verbleiben, bis sie
für pulmonale
Verabreichung durch den Inhalator benötigt werden.
-
Die
aggregierten Partikel werden im Allgemeinen in Dosierungseinheitsbehältern zu
dem Inhalator gebracht, die üblicherweise
als Blister-Packungen oder Kartuschen bezeichnet werden. Die Herstellung
von Blister-Packungen wird typischerweise durch Verfahren durchgeführt, die
in der Verpackungstechnik allgemein gut bekannt sind. Um die aggregierten
Partikel aus dem Behälter
zu entnehmen, wird eine Wand des Behälters durchstochen wenn der
Behälter
in den Inhalator eingesetzt wird oder während er sich innerhalb des
Inhalators befindet. Wenn der Behälter geöffnet ist, werden die aggregierten
Partikel in einen Gasstrom extrahiert, der ausreichend Durchbruchstärke, d.
h. Scherstärke,
besitzt, um die aggregierten Partikel in ihre Feinpulverelementbestandteile
aufzubrechen. Typischerweise werden angemessene Trennungskräfte durch
einen Gasstrom mit Schallgeschwindigkeit bereitgestellt. Unter anderen
Aspekten kann die Blister-Packung
oder Receptacle vor Durchstechen des Behälters Vibrationsenergie ausgesetzt
werden, um die Aggregatpartikel in das entsprechende Feinpulver
aufzubrechen.
-
Typischerweise
werden die Aggregatpartikel vor der Inhalierung im Wesentlichen
in ihre entsprechenden Feinpulverelemente aufgebrochen. Z. B. werden
typischerweise mehr als 30% der Aggregatpartikel, die den Aufbrechkräften des
Gasstroms ausgesetzt werden, aufgebrochgen. Bevorzugt werden mindestens
ungefähr
50% der Aggregatpartikel aufgebrochen und am meisten bevorzugt mehr
als ungefähr
70% der Aggregatpartikel werden aufgebrochen, wenn sie vor Inhalation
durch den Patienten dem Gasstrom, etc. ausgesetzt werden. Mit "Aufbrechen" ist das Zerbrechen
der oben beschriebenen größeren Aggregatpartikel
in die ebenfalls oben beschriebenen kleineren Feinpulverpartikel,
z. B. in die Feinpulverpartikel mit einem Durchmesser von ungefähr 1 μm bis ungefähr 5 μm, gemeint.
-
Wenn
die Aggregatpartikel innerhalb des gewünschten Größenbereichs von 200–500 μm liegen,
ist im Wesentlichen eine vollständige
Entfernung der Aggregatpartikel aus dem Behälter erreichbar, während größere Aggregate
hinter den durchstochenen Wänden
des Behälters
zurückgehalten
werden können.
Mit "im Wesentlichen
vollständige
Entfernung" ist
mehr als ungefähr
55%, bevorzugt mehr als ungefähr
70% und werter bevorzugt mehr als ungefähr 90% pro Gewicht gemeint.
-
Eine
Vielzahl von Inhalationsvorrichtungen für die Verabreichung in Aerosolform
wurde bereits beschrieben. Siehe z. B.
US-Patent Nr. 4,137,914 ;
4,174,712 ;
4,524,769 ;
4,667,688 und die veröffentlichten PCT-Anmeldungen
Nr.
PCT/SE93/00389 (
WO 93/21980 ),
PCT/SE93/01053 (
WO 94/13271 ),
PCT/DK90/00005 (
WO 90/07351 ) und US-Patentanmeldung
Seriennummer 08/309,691 (
US-A-5,785,049 ), eingereicht
am 21. September 1994. Ein besonders bevorzugter Trockenpulverinhalator
ist der in US-Patentanmeldung Seriennummer 08/487,184 (
US-A-5,740,794 ) beschriebene.
Im Allgemeinen ist diese Inhalatorvorrichtung insbesondere geeignet
für die
Abgabe von Trockenpulverzusammensetzungen, die aus diskreten Feinpulverpartikeln
mit einer Größe im Bereich
von 1–5 μm zusammengesetzt
sind. Die bevorzugte Vorrichtung gebraucht im Allgemeinen eine zweistufige
Dispersionstechnik, um eine optimale Dispersion der Trockenpulverzusammensetzung
zu erreichen. Typischerweise wird die Pulverzusammensetzung, z.
B. die Aggregat- oder Agglomeratzusammensetzung, innerhalb eines
Dosierungseinheitsbehälters
wie beispielsweise eines Blister-Packs fluidisiert. Die fluidisierten Agglomeratpartikel
werden dann in dem Hochgeschwindigkeitsgasstrom unter solchen Bedingungen
dispergiert, welche derart agglomerierte Partikel in ihre Pulverelementbestandteile
aufbrechen. Eine solche vollständige
Dispersion kann mit sehr geringen Volumina an Hochgeschwindigkeitsluft
mit relativ hohen Partikelkonzentrationen erzielt werden. Diese
Apparatur ist ebenfalls geeignet zur Verwendung mit Zusammensetzungen,
die größere Mengen
an Verdünnern,
z. B. Quellmitteln und dergleichen, enthalten.
-
Die
Vorrichtung beinhaltet im Allgemeinen eine Zugaberöhre mit
einem Pulvereinlassende, welches in den Behälter eingebracht wird, d. h.
durch Eindringen in den Deckel oder die Zugangsoberfläche des
Behälters.
Ein Hochgeschwindigkeitsluftstrom wird gegen das Ausgangsende der
Zugaberöhre
geströmt,
wodurch das Pulver aus dem Behälter
in den Luftstrom gezogen wird, um das gewünschte Aerosol zu bilden. Die
Geschwindigkeit des wie oben beschriebenen Luftstroms ist typischerweise
Schallgeschwindigkeit, um das Aufbrechen von Agglomeratpartikeln
zu ermöglichen.
Typischerweise wird in dem Behälter
auch eine zweite Eindringung ermöglicht,
um zu ermöglichen,
dass ein getrennter Strom an Fluidisierungsluft in den Behälter gelangt
und das aerosolisierte Pulver mitreisst, wodurch eine maximale Gewinnung
des Pulvers aus dem Behälter
sichergestellt wird.
-
Der
Hochdruckgasstrom wird typischerweise gebildet, indem schlagartig
eine Ladung an komprimiertem Gas durch eine Strombahn freigesetzt
wird, die sich mit dem Auslassende der Zugaberöhre in einem so gewählten Winkel
kreuzt, dass sowohl (1) ausreichend Fluidisierungsluftfluss durch
die Zugaberöhre
induziert wird, um das Pulver zu fluidisieren und in den Behälter zu
transportieren und (2) die Pulveragglomerate, welche zurückbleiben,
wenn das Pulver aus dem Austrittsende der Zugaberöhre austritt,
aufgebrochen werden. Der Gasdruck vor der Freisetzung wird üblicherweise
mindestens ungefähr
102,7 × 103 N/m2 (15 psig)
betragen (um Schallgeschwindigkeit zu erreichen), bevorzugt wird
er mindestens 137,0 × 103 N/m2 (20 psig)
betragen und üblicherweise
im Bereich von 274,0 × 103 N/m2 bis 548,0 × 103 N/m2 (40–80 psig)
liegen. Das expandierte Volumen an Gas (gemessen bei Standardtemperatur
und Druck ("STP") von 14,7 psig und
20°C) wird
daher üblicherweise
im Bereich von 2 ml bis 25 ml und bevorzugt 4 ml bis 15 ml liegen.
Die Freisetzung an Hochdruckgas kann durch einen manuellen Trigger
bewirkt werden oder ggf. durch den Einfluss von Unterdruck, der
durch die Inhalation eines Patienten verursacht wird (d. h. Atmungsaktivierung).
-
Das
aerosolisierte Pulver wird außerdem
typischerweise vor Inhalation durch den Patienten innerhalb einer
Dampfeinfangkammer eingefangen werden, um Schwierigkeiten im Zusammenhang
mit der Verabreichung einer Hochdruckdosis direkt an den Patienten
zu vermeiden. Das aerosolisierte Pulver innerhalb der Dampfkammer
wird dann gleichzeitig mit und/oder gefolgt von Einatmen von Umgebungsluft
von dem Patienten inhaliert, d. h. durch einen getrennten Einlass
in der Dampfkammer, welcher dazu beiträgt, die gesamte Dosis des Pulvers
aus der Dampfkammer mitzureissen und das Pulver in die tiefe Lunge
zu befördern.
-
IV. Therapeutische Anwendungen
-
Die
hierin beschriebenen Verfahren sind insbesondere in therapeutischen
Anwendungen zur Behandlung von Patienten anwendbar, die darin defizient
sind oder auf andere Weise von der Steigerung an erhöhten α1AT-Werten
in den Lungengeweben profitieren. Wie oben beschrieben, beinhalten
Beispiele von solchen Patienten genetische Erkrankungen, durch niedrige
Plasma- und Lungenwerte des α1AT-Inhibitors
gekennzeichnet sind und die funktionellen Störungen von pulmonalem Emphysema.
-
Mit "Patient" ist im Allgemeinen
ein Säugetierpatient
gemeint, für
den die Behandlung gedacht ist. Obwohl die hierin beschriebenen
Verfahren generell auf eine Vielzahl von Säugetierspezies anwendbar sind,
betrifft die hierin verwendete Bezeichnung Patient im Allgemeinen
menschliche Patienten.
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Mit 'Behandlung eines
Patienten" ist das
volle Spektrum an therapeutischen Behandlungen für eine bestimmte Erkrankung
gemeint, von einer teilweisen Linderung der Symptome bis zu einer
kompletten Heilung der bestimmten Erkrankung. Die Behandlung wird
typischerweise durch pulmonale Verabreichung einer therapeutisch
wirksamen Menge von Trockenpulver-α1AT bewirkt. Mit "therapeutisch wirksame
Menge" ist eine solche
Menge an α1AT
gemeint, die ausreichend ist, um die Behandlung der bestimmten Erkrankung
zu bewirken, für
die die Behandlung gedacht ist, d. h. ausreichend Steigerung der α1AT-Werte
in dem unterem Atemwegstrakt. Typischerweise werden solche therapeutisch
wirksamen Mengen ausreichend sein, um eine solche Menge an α1AT in den
Geweben des unteren Atemwegstrakts bereitzustellen, die der von
nicht defizienten Individuen gleicht.
-
Typischerweise
wird die Behandlung der oben beschriebenen Erkrankungen durch Verabreichung
von solchen Dosen an α1AT-Trockenpulver
bewirkt werden, die insgesamt im Bereich von ungefähr 1 bis
ungefähr 80
mg an α1-Antitrypsin täglich liegen.
Bevorzugt variert eine therapeutisch wirksame Menge von ungefähr 5 bis
ungefähr
25 mg α1-Antitrypsin
pro Tag und weiter bevorzugt von ungefähr 10 bis ungefähr 20 mg α1-Antitrypsin
täglich.
In insbesondere bevorzugten Aspekten können die oben beschriebenen
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Patienten
verwendet werden, die an pulmonalem Emphysema leiden. Um die gewünschte therapeutische
Menge zu erreichen kann es wünschenswert
sein, wiederholte Verabreichungen bereitzustellen, d. h. wiederholte
einzelne Inhalationen einer abgemessenen Dosis. Die einzelnen Verabreichungen
werden so lange wiederholt, bis die gewünschte Tagesdosis erreicht
ist.
-
Wie
oben beschrieben, beinhalten die Verfahren zur Verabreichung der
Trockenpulver-α1AT
an dem Patienten im Allgemeinen die Verabreichung von α1AT als Trockenpulver,
Aerosolisieren dieses Pulvers und dessen Darreichung zu einem Patienten
zur Inhalation. Dies wird üblicherweise
unter Verwendung von Verfahren und Apparaturen, die im Wesentlichen
oben beschrieben werden, durchgeführt.
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
veranschaulicht. Diese Beispiele dienen lediglich dazu, Aspekte
der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und sind nicht als
Begrenzungen dieser Erfindung gedacht.
-
V. Beispiele
-
Beispiel 1 – Sprühtrocknen von α1AT
-
Gereinigtes
Humanplasma-α1AT
wurde von Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL bereitgestellt. Das α1AT wurde
in Citratpuffer formuliert. Das gepufferte α1AT wurde zu einer feinen Trockenpulverzusammensetzung
sprühgetrocknet.
Das Sprühtrocknen
wurde durchgeführt
unter Verwendung eines Buchi-190-Sprühtrockners mit einer Zugaberate
von 5 ml/min, einem Atomisierungsdruck von 822 × 103 N/m2 (120 psi), einer Atomisierungszugaberate
von 80 lpm und einer Trocknungstemperatur von 80°C. Die Massenmehrheit der Zusammensetzung
besaß eine
atembare Teilchengröße (aerodynamischer
Durchmesser kleiner als 5 μm).
Die Trockenpulverzusammensetzung enthielt ungefähr 73% α1AT, 3,7% Feuchtigkeit und 16,9% Quellmittel.
Die spezifische inhibitorische Wirkung des Pulvers wurde durch Untersuchung
der inhibitorischen Wirkung des Pulvers gegen Trypsin ermittelt.
Das untersuchte Pulver besaß ungefähr dieselbe
spezifische Wirkung wie das Protein vor dem Trocknen.
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Blister-Packungen
wurden unter kontrollierten Bedingungen mit 5 mg der Pulverzusammensetzung gefüllt und
sie wurden in ausgetrockneten Beuteln bei Raumtemperatur bis zur
Verwendung gelagert. Eine Stabilitätsanalyse von α1AT in dem
Trockenpulveraerosol im Zeitverlauf der Experimente bestätigte, dass
es keinen nachweisbaren Aktivitätsverlust
gab, wie mit dem Trypsininhibitionsassay gemessen.
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Die
physikalische Stabilität
des α1AT-Trockenpulvers
wurde durch die folgenden Parameter charakterisiert: (1) massenmittlerer
aerodynamischer Durchmesser (MMAD), wie mit einem California Instrument-Kaskadenimpinger
ermittelt, der mit 12,5 lpm betrieben wurde; (2) atembare Fraktion
(Masse mit einer aerodynamischen Partikelgröße kleiner als 5 μm); und (3)
Dispergierbarkeit wie durch Filtersammlung am Mundstück der Aerosolisierungsvorrichtung
bei 30 lpm für
2,5 sek gemessen (siehe Tabelle I). Tabelle I
Zeit | Dispergierbarkeit
(STD) | MMA
D | Atembare
Fraktion % < 5 μm |
ursprünglich | 63,6
(3,5) | 1,3 | 90 |
vor
Studie
(3 Modelle) | 72,6
(9,3) | 1,3 | 90 |
nach
Studie
(6 Modelle) | 72,5
(6,3) | 1,2 | 92 |
-
Beispiel 2 – Bewertung der Aerosolaussetzung
von α1AT
in Schafmodellen
-
Es
wurden Mischlingsschafe (36 ± 3
kg) verwendet, um optimale Verabreichungsverfahren für die Trockenpulver-α1AT-Zusammensetzung
zu ermitteln. Jedes Schaf wurde einzeln untersucht. 2 Tage vor Aerosolaussetzung
wurden in den caudalen efferenten Lymphgang, die Halsschlagader
und die Jugularvene der Schafe unter Vollnarkose Kanülen eingeführt (Lymphgangkanüle: 030 × 050 Tygon-Röhre, Fisher
Scientific Co., Arterien- und Venenkanülen: Erweiterungsschlauch,
Baxter Pharmaceal, CAT- Nr.
K751L). Am Tag der Aussetzung wurden die zu untersuchenden Schafe
mit 500 mg Pentothal, welches intravenös verabreicht wurde, betäubt (Thiopentalnatrium,
Abbott Labs, IL) und mit einer endotrachealen Röhre der Größe 10 ID intubiert.
-
Drei
unterschiedliche Aussetzungstechniken wurden untersucht (siehe Tabelle
II), zwei Positivdruck-Ventilationstechniken und eine Spontanatmungstechnik.
In den Positivdruck-Inhalationsmodellen wurden zwei Ventilationsarten
in zwei separaten Schafen evaluiert (Schaf #1 und #3). Schaf #1
wurde mit 15 Atemzügen/min
bei 400 ml/Atemzug mit Sauerstoff mit Atemqualität ventiliert, der 1% Halothan
(Halocarbon, NJ) enthielt, der unter Verwendung eines Harvard-Ventilators
durch eine Trockenpulver-Inhalationsvorrichtung geleitet wurde.
Schaf #3 wurden intravenös
60 mg Succinylcholin, ein Muskelentspannungsmittel injiziert, und
es wurde mit 10 Atemzügen/min
bei 600 ml/Atemzug mit Sauerstoff ventiliert, der 1% Halothan enthielt.
In dem Spontanatmungsmodell wurde Schaf #2 25 mg/kg Ketamin intravenös injiziert,
(Ketaset, Fort Dodge Lab, Inc., IA), um für Anästhesie zu sorgen, und man
ließ es
durch die Trockenpulverinhalationsvorrichtung Umgebungsluft einatmen.
Die aerodynamische Größenverteilung
wurde unter Verwendung des California Measurements-Kaskadenimpingers
gemessen. Der massenmittlere aerodynamische Durchmesser des Aerosols
und der atembare Teil (Massenanteil mit weniger als 5 μm aerodynamischer
Partikelgröße) betrugen
1,3 ± 0,1 μm bzw. 90%.
Diese Formulierung besaß eine
Dispergierbarkeit von 63 ± 3%
in der verwendeten Vorrichtung.
-
Die
Bewertung der drei Aussetzungstechniken beinhaltete die Messung
von (1) dem Anteil an für
die Inhalation verfügbarem
Aerosol (% an Aerosol, welches am Mundstück der Inhalationsvorrichtung
verfügbar ist)
und (2) Lymph- und Plasmawerten an α1AT.
-
Die
Bewertung der Vorrichtungseffizienz, z. B. der Fähigkeit, Aerosol in die endotrachiale
Röhre zu
befördern,
wurde als 23 ± 1%,
32 ± 4%
und 31 ± 1%
gemessen für
das Positivdruck-Inhalationsmodell ohne den Muskelentspanner ("PPI") (15 Atemzüge/min,
400 ml/Atemzug), das Positivdruck-Inhalationsmodell mit Muskelentspanner
("PPIMR") (10 Atemzüge/min,
600 ml/Atemzug), bzw. das Spontanatmungs-Modell (100–200 ml/Atemzug).
-
Vor
der Aussetzung wurden Lymph- und Blutproben entnommen, um Hintergrundwerte
an α1AT
zu ermitteln. Jedes Tier wurde 100 mg gepacktem α1AT-Trockenpulveraerosol ausgesetzt.
Lymph- und Blutproben wurde alle 30–60 min über 6 h entnommen und anschließend nach
24–26
und 48–50
h nach Dosierung. Schaf #2, das Spontanatmungs-Tier, wurde nach
der ersten Aussetzung nach 50 h erneut dem Aerosol-α1AT ausgesetzt
und 5 h später
gespült.
-
Am
Ende jeder Studie wurde Blut entnommen, während die Lungen weiter ventiliert
wurden, um sie am Kollabieren zu hindern, anschließend wurde
jede Lunge komplett gespült.
Dies wurde durchgeführt,
indem der Nacken und die Brust chirurgisch freigelegt wurden und
jede Lunge einzeln gespült
wurde, indem die andere Lunge zugeklammert wurde und 6 × 200 ml
isotonische Kochsalzlösungwaschungen
durch einen Tygon-Schlauch injiziert wurden, der mit einer 50 ml-Spritze
verbunden war. Die gewonnenen Waschungen aus jeder Lunge wurden
zusammengefasst, um eine gesamte Lungenlavage-Probe zu ergeben.
Alle Proben, Lymph und Blut, wurden auf Eis gelegt, bis sie für 3 min
bei 3000 rpm zentrifugiert wurden. Sie wurden bei –70°C gefroren
gelassen, bis sie durch ELISA analysiert wurden.
-
Tabelle
II zeigt die Wirksamkeit der verwendeten Vorrichtungen für die Aerosolzufuhr
des α1AT
zu dem Eingang der endotrachealen Röhre (gezeigt als einatembare
%) für
die verschiedenen Zufuhrmethoden. Ebenfalls gezeigt ist der Spitzenlymphwert
an α1AT. Tabelle II
Schaf
# | Inhalationsmodell | Atembar
% | Spitzenlymphwert
an α1AT
(nM) |
1 | Positivdruck:
15
Atemzüge/min;
400
ml/Atemzug | 23 ± 1 | 5,8 |
2 | Spontanatmung:
100–200 ml/Atemzug | 32 ± 4 | 12,2 |
3 | Positivdruck:
10
Atemzüge/min;
600
ml/Atemzug;
paralysiertes Tier | 31 ± 1 | 29,4 |
-
α1AT-Trockenpulveraerosol,
welches Schafen wie oben beschrieben über die Lungen verabreicht
wurde, erhöhte
die Werte an α1AT
in den Lymphen von 0,3 nM (0,014 μg/ml)
auf 5,8 nM (0,29 μg/ml),
12 nM (0,61 μg/ml)
und 29,4 nM (1,47 μg/ml)
und erhöhte
die Blut-α1AT-Werte
von 0,6 nM (0,03 μg/ml)
auf 1,9 nM (0,093 μg/ml),
4,3 nM (0,217 μg/ml)
und 7,6 nM (0,38 μg/ml)
48 h nach Aussetzung bei Schaf #1, 2 bzw. 3. Siehe 1.
-
In
Schaf #2, welches anfänglich
dem α1AT-Aerosol
mit dem oben beschriebenen Spontanatmungs-Verfahren ausgesetzt wurde
und erneut nach 50 h durch Positivdruckinhalation (600 ml/Atemzug,
ohne Relaxans), stieg der Lymphwert an α1AT nach der zweiten Aussetzung
von 0,61 μg/ml
auf 0,92 μg/ml
innerhalb 5 h nach der zweiten Aussetzung.
-
Die α1AT-Werte
in dem Alveolarfilm der Lunge ("ELF") betrugen 0,4 μM in Schaf
#1 (50 h nach Aussetzung gespült)
und 1,3 μM
in Schaf #3 (72 h nach Aussetzung gespült). In Schaf #2, welches 50
h nach der anfänglichen Aussetzung
ein zweites Mal exponiert wurde, waren die α1AT-Werte in dem ELF 2,9 μM (5 h nach der
zweiten Aussetzung gespült).
Diese Werte wurden berechnet aus den Lavagewaschungen in der Annahme von
20 ml ELF.
-
Die
bei Schaf #3 verwendete PPIMR-Technik ergab die höchsten Lymphwerte
an α1AT
und wurde zur Verwendung in den folgenden Beispielen ausgewählt.
-
Beispiel 3 – Bestimmung der deponierten
Dosis in Schafen
-
Drei
Schafen wurde α1AT-Trockenpulver
gemäß dem oben
beschriebenen PPIMR-Verfahren pulmonal verabreicht. Die Lungen wurden
sofort nach Aerosolverabreichung gespült. Die durchschnittlich deponierte Dosis
wurde berechnet, indem die Konzentration an α1AT in der Lavage mit dem Lavagevolumen
multipliziert wurde. Die durchschnittlich abgelagerte Dosis wurde
als 7,2 ± 3,1
mg berechnet. Dies ergab umgerechnet eine Depositionseffizienz von
ungefähr
8% für
dieses Schafaussetzungssystem. Die Daten für jedes Schaf sind in Tabelle
III unten gezeigt. Tabelle III
Schaf
# | Gewonnene
Lavage (ml) | α1AT in Lavage
(μg/ml) | Deponierte
Dosis |
| Rechts | Links | Rechts | Links | |
5 | 850 | 825 | 1,53 | 12,8 | 10,6 |
8 | 950 | 930 | 0,10 | 4,83 | 4,6 |
9 | 925 | 950 | 2,80 | 3,85 | 6,3 |
| Durchschnitt ± STD | 7,2 ± 3,1 |
-
Die
pulmonale Absorption von über
die Lungen verabreichtem Trockenpulver-α1AT
wurde unter Verwendung der oben beschriebenen PPIMR-Technik getestet.
Erneut wurde drei Schafen α1AT-Trockenpulveraerosol
in drei Dosen jeweils zum Zeitpunkt 0, nach 24 h und nach 48 h verabreicht.
Die Werte an α1AT
wurden in den Lymphen, im Plasma und am Ende der Untersuchung in
dem Alveolarfilm der Lungen (ELF) gemessen.
-
In
den Lungen der Schafe abgelagertes α1AT-Trockenpulver erhöhte die
Lymphwerte an exogenem α1AT
auf einen durchschnittlichen Spitzenwert von 142 ± 73 nM
(7,4 ± 3,8 μg/ml). 3 zeigt
die Lymphprofile für
jedes der einzelnen Schafe, wobei das mittlere Profil in 4 (o)
gezeigt ist. Die Konzentration/Zeit-Kurven wiesen ein verlängertes
Absorptionsprofil auf (3 und 4). Die
Gesamtmenge an α1AT,
welches durch die Lymphen gecleart wird, wurde berechnet, indem
die Fläche
unter der Kurve (AUC) des Konzentrationsprofils mit der mittleren
Lymphflussrate (siehe Tabelle IV) multipliziert wurde.
-
Die
Werte an exogenem α1AT
im Plasma waren ebenfalls auf einen durchschnittlichen Wert von
36,2 nM (1,9 ± 0,1 μg/ml) erhöht. Die
mittleren Plasmawerte an α1AT
im Zeitverlauf sind in 4 gezeigt. (•). Die Menge an von den Lungen
in den Kreislauf absorbiertem α1AT
ist die Spitzenkonzentration multipliziert mit dem Volumen der Verteilung
im Plasma (stationäres
Volumen der Verteilung von Schafplasma ist 109 ± 16 ml/kg Körpergewicht
wie durch IV Injektionen von radiomarkiertem α1AT gemessen, Smith et al.,
J. Clin. Invest. 84:1145–1154
(1989)). Die Mengen an α1AT,
welche im Plasma gefunden wurden, sind ebenfalls in Tabelle IV gezeigt.
-
Die
Addition der Beiträge
von sowohl Plasma- als auch Lymphwerten ergibt die Gesamtmenge von 12,0 ± 2,9 mg,
welche 55 ± 13%
der abgelagerten Dosis entspricht (siehe Tabelle IV). Tabelle IV
Schaf # | AUC | Durchschn. Lymphflussrate (ml/h) | Menge (mg)
gecleart aus: | Gesamtclearance | Absorbierter Teil (%) |
Lymph | Plasma |
4 | 0,402 | 6,5 ± 2,6 | 2,6 | 6,1 | 8,7 | 40 |
6 | 0,712 | 9,2 ± 3,6 | 6,6 | 7,4 | 14,0 | 65 |
7 | 0,795 | 7,9 ± 3,2 | 6,3 | 6,6 | 13,2 | 61 |
Durchschn. | 0,636 ± 0,207 | 7,8 ± 3,2 | 5,2 ± 2,2 | 6,7 ± 0,6 | 12,0 ± 2,9 | 55 ± 13 |
-
Das
Volumen des Alveolarfilms der Lunge (ELF) wurde gemessen von Peterson
et al., Am. Rev. Respir. Dis. 141:314–320 (1990) als 11,4 ml in
einem 38 kg Schaf. Um die ELF-Werte von α1AT zu messen, wurden Schafe
mit einem durchschnittlichen Gewicht von 29 kg verwendet. In einem
29 kg schweren Schaf wurde das ELF-Volumen als ungefähr 10 ml
oder 5 ml/Lunge angenommen. Die α1AT-Werte
in ELF wurden bestimmt als die durch Lavage aus jeder Lunge gewonnenen
Mengen geteilt durch 5 ml. In Tabelle IV werden die Anzahl an Aerosoldosierungen,
Zeitpunkt der Spülung
nach der letzten Dosis und die berechneten ELF-Werte an α1AT in jeder
Lunge aufgelistet. Schützende
Werte an α1AT
in ELF (1,7 μM)
wurden in allen Schafen, die in den Absorptionsexperimenten untersucht
wurden, leicht erzielt, selbst wenn 3 Tage nach der letzten Dosis
gespült
wurde. Außerdem
wurden die in der Lavage der drei Schafe, die in der Absorptionsstudie
verwendet wurden (Schaf 4, 6 und 7) gewonnenen α1AT-Mengen als 13,4 ± 7,3 mg
oder ungefähr
62% der abgelagerten Dosis gemessen.
-
Obwohl
die Ablagerungseffizienz in diesen Modellen etwas gering ist (8%),
scheint dies der Ineffizienz der Aerosolisierungsvorrichtung zuzuschreiben
zu sein, wenn sie mit dem Ventilator verbunden ist. Insbesondere
machen Verluste aufgrund der Verplombung, welche zu der endotrachialen
Röhre führt und
des geringen Inhalationsvolumens bei Verwendung des Ventilators
einen großen
Teil des verlorenen Materials aus. Außerdem führt die Bildung von Schleim
rund um die endotrachiale Röhre
zu einer erhöhten
Ablagerung innerhalb der Verplombung und der Vorrichtung als ein
Ergebnis der verengten Luftröhre
und des gestörten
Luftflussverhaltens. Tabelle V
Schaf # | Anzahl an Dosierungen | Zeitpunkt der Lavage nach letzter Dosis (h) | α1AT-Werte
im ELF (mg) | durch Lavage gewonnene Menge (mg) |
Rechte
Lunge | Linke
Lunge |
1 | 1 | 52 | 1,5 | 2,7 | 1,1 |
2 | 2 | 51 | 10,0 | 9,4 | 5,0 |
3 | 1 | 52 | 5,0 | 2,5 | 2,0 |
4 | 3 | 72 | 6,1 | 11,8 | 13,2 |
5 | 3 | 96 | 24,4 | 55,8 | 20,8 |
6 | 3 | 72 | 12,3 | 9,3 | 6,2 |
7 | 1 | <1 | 5,4 | 45,8 | 10,6 |
8 | 1 | <1 | 0,4 | 17,3 | 4,6 |
9 | 1 | <1 | 10,0 | 14,1 | 6,3 |
-
Beispiel 4 – Beurteilung von interstitiellem α1AT
-
Die
oben beschriebenen Experimente veranschaulichen, dass ein als Aerosol
verabreichtes Trockenpulver-α1AT
von der alveolaren Oberfläche
in die Lunge absorbiert wird. Sobald es im Interstitium ist, kann α1AT entweder
direkt in das Blut absorbiert werden oder es kann in die Lymphbahnen
diffundieren (siehe 5).
-
In
den obigen Experimenten gelangt die Mehrheit des inhalierten α1AT direkt
durch das Interstitium in das Blut. Der Rest wurde in den Kreislauf
transportiert durch lymphatische Filtration. Staub et al., J. Surg.
Res. 19:315 (1975). In diesem Schafmodell war die mittlere Menge
an α1AT,
welches innerhalb 24 h durch die Lymphen gecleart wurde, nach einer
Aerosolverabreichung ungefähr
1/6 der Menge, die im Plasma gefunden wurde (siehe Tabelle VI).
In einem ähnlichen
Schafmodell berechnete Smith et al. (J. Clin. Invest. 84:1145–1154 (1989))
die Rate an Clearance von α1AT
aus den Lungen als 16,1 ± 10,4%
der Gesamtrate an α1AT,
welches aus der Lunge transportiert wurde. Dies stimmt mit den vorliegenden
Ergebnissen überein
(siehe Tabelle VI). Plasma- und Lymphwerte zeigten ein ähnliches
Profil (siehe
4). Somit kann angenommen werden,
dass für
jedes α1AT-Molekül, welches
von der Lunge gecleart wird, 6 Moleküle durch die endotheliale Schranke
in den Blutstrom transportiert werden. In Anbetracht der Nicht-Lymph-Clearance
sollte die Konzentration an α1AT in
dem interstitiellen Fluid ungefähr
7× die
in den Lymphen gemessene sein (siehe
5). Tabelle VI
Schaf
# | Lymph
(μg) | Plasma
(μg) | Plasma/Lymph |
1 | 32,4 | 239 | 7,4 |
2 | 73,2 | 631 | 8,6 |
3 | 144,6 | 752 | 5,2 |
4 | 278 | 2200 | 7,9 |
6 | 757 | 3100 | 4,1 |
7 | 489 | 1300 | 2,7 |
| Durchschn. | 6,0 ± 2,4 |
-
Zusätzlich zu
dem alveolaren interstitiellen Fluid enthalten die Lymphgefässe auch
eine erhebliche Menge an extraseptalen Filtraten aus Gefäßen außerhalb
der Alveolarwände.
Dies wurde veranschaulicht von Nicolaysen et al., Microvasc. Res.
9:29–37
(1975), der mit Evans blue markiertes Albumin injizierte und das Auftreten
des Farbstoffs im Lungeninterstitium verfolgte. Der Farbstoff erschien
innerhalb von 10 min in den Lymphgefäßen, während das Auftreten von Farbstoff
in dem Interstitium ungefähr
doppelt so lange dauerte, was auf das Vorliegen von nicht alveolarer
Filtration hindeutete. Von Gropper et al., Federation Proc. 43:1032 (1984)
wurde geschätzt,
dass ein Minimum von 40% der gesamten Lungenlymphfiltration nicht
alveolaren Ursprungs war. Um die nicht alveolare Verdünnung der
Lymphen zu berücksichtigen,
wird daher die Konzentration in dem interstitiellen Fluid mit 1,7
multipliziert. Tabelle 7 erfasst die berechneten interstitiellen
Werte an α1AT
unter Berücksichtigung
von 40% extraseptalem Beitrag und 84% Plasma-Clearance. Tabelle VII
Schaf
# | Berechneter
Peak
Interstitielle Werte |
4 | 1,3 |
6 | 1,5 |
7 | 3,2 |
Durchschn. | 2,0 ± 1,0 |
-
Beispiel 5 – Abschätzen der menschlichen Dosis
aus Schafdaten
-
Die
Ergebnisse der oben beschriebenen α1AT-Dosisablagerungsexperimente
und Absorptionsexperimente deuten darauf hin, dass ein schützender
Wert an α1AT
für Menschen
im interstitiellen Fluid (ungefähr
6 M, oder 324 g/ml) in Menschen erzielt werden kann unter Verwendung
von pulmonaler Verabreichung von Trockenpulver-α1AT. Insbesondere legt die Extrapolation
der Schafdaten auf Menschen nahe, dass, um interstitielle Werte
an α1AT
in defizienten Individuen auf einen schützenden Wert anzuheben (d.
h. auf ungefähr
6 M von 3,4 M in defizienten Individuen), ein 70 kg schwerer Mann
ungefähr
20–60
mg an α1AT
pro Tag über
3 Tage inhalieren müsste.
Nach der dreitägigen
Therapie wäre
der Patient dann in der Lage, 10–20 mg pro Tag zu inhalieren,
um das aus den Lungen heraus transportierte α1AT zu ersetzen und die schützenden
Werte zu erhalten. Dies wurde im Wesentlichen hochgerechnet von
schützenden
Dosen für
Flüssigaerosolformen
von 500 mg pro Tag (siehe Hubbard and Crystal, Lung Suppl: 565–578 (1990).
Diese abgeschätzten
Dosen sind auf Basis von Durchschnittsdaten angenähert. Entsprechende
Dosierungen variieren leicht von Individuum zu Individuum abhängig von
der Art der α1AT-Defizienz,
d. h. ob erworben oder genetisch, ebenso wie von dem Basiswert des
Individuums.