DE69633278T2

DE69633278T2 - Vorrichtung zur abgabe eines vorgewählten moleküls in das kreislaufsystem

Info

Publication number: DE69633278T2
Application number: DE69633278T
Authority: DE
Inventors: David H. Humes
Original assignee: Nephros Therapeutics Inc
Current assignee: Renamed Biologics Inc (ndgesd Staates Delawa
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: US5704910A; EP1486182A2; EP1486182A3; US6716208B2; ATE274869T1; US20050019370A1; WO1996039098A1; CA2222613A1; CA2222613C; DE69633278D1; US5911704A; EP0831752A1; JPH11506954A; EP0831752B1; AU716897B2; US6572605B1; AU5974096A; US20010001817A1; JP3878672B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines vorher ausgewählten Moleküls in den systemischen Kreislauf bzw. Körperkreislauf. Die Erfindung betrifft insbesondere eine implantierbare Vorrichtung, die lebensfähige Zellen enthält. Wenn die Vorrichtung in ein Blutgefäß implantiert wird, erzeugen und sezernieren die Zellen das vorher ausgewählte Molekül in das Blut, das nach der Vorrichtung zirkuliert.
Ausgangspunkt der Erfindung
Die Entwicklung von Vorrichtungen zur Arzneistoffabgabe bzw. Transport zur Implantation in einen vorher ausgewählten Ort in einem Säugetier geht weiter. Bis heute wurde eine Vielzahl chirurgisch implantierbarer Arzneistoff-Abgabevorrichtungen entwickelt, die unten diskutiert werden.
US-Patent Nr. 4 378 016 beschreibt eine chirurgisch implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines aktiven Faktors, beispielsweise eines Hormons, an einen vorher ausgewählten Ort, beispielsweise die Peritonealhöhle eines Säugetiers. Die Vorrichtung umfasst einen Flüssigkeits durchlässigen membranösen Sack zur Implantation in das Säugetier und ein undurchlässiges Hohlrohr, bei dem ein Ende mit einer Öffnung im Sack verbunden ist und das andere Ende so vorgesehen ist, dass es außerhalb des Körpers des Tieres verbleibt. Das Rohr stellt einen Zugangsweg zum membranösen Sack bereit, so dass, nachdem der Sack chirurgisch in das Säugetier implantiert wurde, eine Zell, die eine Hülle enthält, in den Sack über das Rohr eingebracht werden kann. Nach Einfügung der Zelle, die die Hülle enthält, in den Sack, können Zellen einen aktiven Faktor erzeugen, der anschließend in das umgebende Gewebe oder Organ des Empfängers diffundieren kann.
US-Patent Nr. 5 182 111 beschreibt eine chirurgisch implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines aktiven Faktors an eine vorher ausgewählte Stelle, beispielsweise ein Gewebe oder Or gan, in einem Säugetier. Die Vorrichtung umfasst eine semipermeable Membran, die zumindest einen Zelltyp einschließt, der einen spezifischen aktiven Faktor produziert und einen zweiten Zelltyp, der einen Wachstumsfaktor erzeugt. Der durch den zweiten Zelltyp erzeugte Wachstumsfaktor induziert anschließend den ersten Zelltyp, so dass er den aktiven Faktor erzeugt.
US-Patent Nr. 4 479 796 beschreibt einen chirurgisch implantierbaren Dispensierer zum Infundieren eines vorher ausgewählten Arzneistoffes direkt in den Blutstrom. Kurz gesagt, wird das Dispensiergerät chirurgisch in einer Linie mit einem Blutgefäß verbunden. Das Dispensiergerät schließt eine ersetzbare Kartusche von Zellen, beispielsweise von Mikroorganismen, ein, die den Arzneistoff erzeugen und diesen in den Blutstrom nach der Kartusche sezernieren.
US-Patent Nr. 4 309 776 beschreibt eine intravaskuläre Arzneistoff-Abgabevorrichtung, die eine Kammer aufweist, die transplantierte Zellen enthält, zur chirurgischen Implantation in die Gefäßwand eines Blutgefäßes. Die Vorrichtung umfasst eine poröse Wand, die es einem Hormon, das von den transplantierenden Zellen erzeugt wurde, erlaubt aus der Kammer und in den Blutstrom zu diffundieren.
Es ist jedoch wünschenswert, eine Vorrichtung zu erzeugen, die in einem Säugetier entweder nicht chirurgisch oder durch minimal-invasive chirurgische Verfahren implantiert werden kann und die, wenn sie einmal implantiert ist, ein vorher ausgewähltes Molekül direkt in die Gefäße des Säugetieres sezerniert. Es ist zusätzlich wünschenswert, eine Vorrichtung zu erzeugen, die, wenn sie implantiert ist, das vorher ausgewählte Molekül in das Säugetier über eine verlängerte Zeitspanne verabreicht und bequem entfernt werden kann, wenn oder wann immer die Notwendigkeit dazu entsteht. Es ist demgemäß eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine leicht implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines vorher ausgewählten Moleküls über längere Zeitspannen in den Blutkreislauf eines Säugetiers bereitzustellen.
Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden klarer aus der Beschreibung, den Zeichnungen und Ansprüchen, die folgen, verständlich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine implantierbare Vorrichtung oder Kapsel gemäß der beigefügten Ansprüche zur Abgabe eines vorher ausgewählten Moleküls in den Körperkreislauf eines Säugetiers bereit. Die Vorrichtung der Erfindung kann unter Verwendung nicht invasiver oder minimal-invasiver chirurgischer Verfahren implantiert werden und, wenn sie einmal implantiert sind, gibt das vorher ausgewählte Molekül direkt in den Blutstrom ab. Zusätzlich ist die Vorrichtung der Erfindung zur Erzeugung und danach Sezernierung des vorher ausgewählten Moleküles in situ in den Blutstrom über eine verlängerte Zeitspanne in der Lage. Die Verwendung der folgenden Vorrichtung und Verfahren stellt ein einfaches und reproduzierbares System zur Abgabe therapeutisch wirksamer Mengen eines Genproduktes, beispielsweise eines Hormons, Wachstumsfaktors, Antikoagulanz, Immunmodulators, Zytokins oder dergleichen direkt in den Blutstrom des Empfängers bereit. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind, obwohl sie eine Vielzahl von Anwendbarkeiten aufweisen, insbesondere zur Verwendung in der Hormonersatztherapie von Nutzen.
In ihrem breitesten Aspekt umfasst die Vorrichtung ein Blut-permeables Element, das zur Verankerung an eine Innenoberfläche eines Blutgefäßes geeignet ist. Das Blut-permeable Element ist, wie hierin offenbart, so ausgestaltet, dass, wenn es an der Innenoberfläche des Blutgefäßes verankert ist, das Element Blut im Gefäß ermöglicht, dadurch hindurch zu treten. Die Vorrichtung umfasst weiterhin eine Kapsel, die durch In-Berührung-Bringen des Elementes, das im Gefäß angeordnet ist, positioniert und am Ort gehalten werden kann. Die Kapsel enthält lebensfähige Zellen, die das vorher ausgewählte Molekül produzieren und dieses in dem Blutstrom sezernieren.
Der Begriff „systemische Zirkulation" bzw. „systemischer Kreislauf" bzw. „Körperkreislauf", wie hierin verwendet, soll jedes Blutgefäß innerhalb eines Säugetiers umfassen, d. h. eine Arterie, eine Arteriole, eine Venula oder Vene, die eine Blutzufuhr für alle Gewebe außer für Lungengewebe bereitstellt, die durch den Lungenkreislauf eines Säugetiers perfundiert werden. Der Körperkreislauf wird in der Technik ebenfalls als größerer Kreislauf oder peripherer Kreislauf bezeichnet.
Der Begriff „blutpermeables Element", wie hierin verwendet, soll jede Struktur zum Einfügen in das Lumen eines Blutgefäßes im Körperkreislauf bedeuten, die, wenn sie einmal eingebaut ist, beispielsweise durch Haken oder Widerhaken an einer Innenoberfläche des Blutgefäßes verankert werden kann. Das Element ist weiter dahingehend gekennzeichnet, dass, wenn es an der Innenwand des Blutgefäßes verankert ist, das Element den Blutstrom durch das Blutgefäß nicht verlegt oder verhindert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Blut-permeable Element ein Embolismus-Antimigrationsfilter, beispielsweise ein Blutgerinsel-anti-Migrationsfilter. Eine Vielzahl von Blutgerinsel-anti-Migrationsfiltern, die in der Praxis der Erfindung von Nutzen sind, sind in der Technik bekannt. Das gegenwärtig bevorzugte Blut-permeable Element ist ein Anti-Migrationsfilter, der als „Greenfield^® Vena cava Filter" bekannt ist. Nützliche Greenfiel^® Vena cava Filter sind ausführlich in den US-Patenten Nr. 4 817 600 und 5 059 205 beschrieben.
Der Begriff „Kapsel", wie hierin verwendet, soll jede Hohlstruktur bedeuten, die so dimensioniert ist, dass sie in das Lumen eines Blutgefäßes passt, die, wenn sie in das Blutgefäß eingebracht wird, den Blutstrom durch das Gefäß nicht verlegt oder verhindert. Die Kapsel wird im Blutgefäß mittels des Blut-permeablen Elementes am Ort gehalten. Beispielsweise kann die Kapsel stromaufwärts des Blut-permeablen Elementes zurückgehalten werden, wenn die Kapsel eine Größe aufweist, dass sie nicht durch das Blut-permeable Element hindurchpassen kann. Alternativ kann die Kapsel stromabwärts des Blut-permeablen Elementes angeordnet werden, jedoch durch ein Befestigungsmittel, beispielsweise eine Haken oder Haltegurt am Ort gehalten werden, der sich aus dem Blut-permeablen Element zur Kapsel erstreckt. Es wird zusätzlich mit ins Auge gefasst, dass die Kapsel eine Keil-artige Form aufweisen kann, so dass das schmale Ende des Keils durch das Element hindurchpasst, jedoch das größere Ende das Element berührt, wodurch eine Passage der Kapsel durch das Element vermieden wird.
Die Kapsel kann entweder eine einzelne Hohlfaser oder ein Bündel von Hohlfasern umfassen, die aus einer semipermeablen Membran hergestellt sind. Die semipermeable Membran weist vorzugsweise Poren einer Größe auf, die ausreicht, um die Diffusion des vorher ausgewählten Moleküls dadurch hindurch zu ermöglichen, das jedoch klein genug ist, um die Passage von Zellen dadurch hindurch auszuschließen. Die Poren sind vorzugsweise so ausgelegt, dass sie ermöglichen, dass das durch die Zellen produzierte vorausgewählte Molekül direkt in den Blutstrom passiert, der die Hohlfaser passiert, während die Zellen daran gehindert werden, aus der Hohlfaser in den Blutkreislauf zu migrieren. Insbesondere sind die Poren vorzugswei se so dimensioniert, dass sie gelösten Stoffen mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 150 Kilodalton ermöglichen, dadurch hindurchzutreten, während sie Mittel im Blutstrom ausschließen, beispielsweise Proteine, insbesondere Antikörper und zytolytische Faktoren, die durch Lymphozyten sezerniert werden; oder Zellen, insbesondere Makrophagen und Lymphozyten, die, falls es ihnen ermöglicht wird, durch die Poren aus dem Blutstrom in die Hohlfaser hindurchzutreten, für die Lebensfähigkeit der darin eingeschlossenen Zellen nachteilig sein können. Es wird ins Auge gefasst, dass, wenn das vorher ausgewählte Molekül ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 150 Kilodalton aufweist, dann die Kapsel Poren aufweisen sollte, die so dimensioniert sind, dass sie das Hinausdiffundieren des vorher ausgewählten Moleküls aus der Kapsel in den Blutstrom ermöglichen. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass die lebensfähigen Kapseln, die zum Erzeugen und Sezernieren vorher ausgewählter Moleküle in der Lage sind, und die ein Molekulargewicht von mehr als 150 Kilodalton aufweisen, vorzugsweise eine autologe Natur aufweisen, wodurch die Immunreaktion des Wirtes (humoral und/oder zellulär) minimiert wird, die gegen die Zellen, die in der Kapsel abgelagert sind, gerichtet ist.
Polymere, die bei der Herstellung der biokompatiblen semipermeablen Membranen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyurethanisocyanat, Polyalginat, Celluloseacetat, Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Cellulosenitrat, Polysulfon, Polystyrol, Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polyacrylonitril, Polyamid, Polymethylmethacrylat, Polyethylenoxid und Polytetrafluorethylen. Es wird zusätzlich ins Auge gefasst, dass nützliche semipermeable Membranen aus einer Kombination solcher Polymere hergestellt werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die lebensfähigen Zellen, die in die semipermeable Hohlfaser der Kapsel eingeschlossen sind, vorzugsweise eukaryontische Zellen und am meisten bevorzugt Säugetierzellen. Obwohl die hierin beschriebene Vorrichtung Zellen enthalten kann, die das vorher ausgewählte Molekül natürlich produzieren und sezernieren, wird ebenfalls ins Auge gefasst, dass gentechnisch veränderte Zellen, d. h. Zellen, die mit einer Nukleinsäure transfiziert sind, die das vorher ausgewählte Molekül kodiert und dazu in der Lage ist, diese zu exprimieren, desgleichen in der Ausübung der Erfindung verwendet werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vorher ausgewählte Molekül vorzugsweise ein Protein und ist am meisten bevorzugt ein Hormon, beispielsweise Erythropoietin oder Insulin. Es wird jedoch ins Auge gefasst, dass die Vorrichtung dazu verwendet werden kann, irgendein Molekül in den Blutkreislauf zu transportieren bzw. zu liefern, das aus einer lebensfähigen Zelle erzeugt und sezerniert werden kann. Obwohl einzelne Zelltypen, die ein einzelnes vorher ausgewähltes Molekül erzeugen und sezernieren bzw. absondern, in der Erfindung verwendet werden können, sollte klar sein, dass Zellen, die zu einem speziellen Zelltyp gehören, und die eine Vielzahl vorher ausgewählter Moleküle produzieren und sezernieren, desgleichen in der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Es wird in ähnlicher Weise ins Auge gefasst, dass eine Vielzahl von Zelltypen, wobei die Zellen, die zu jedem Zelltyp gehören, unterschiedliche vorher ausgewählte Moleküle produzieren und sezernieren, in einer Kapsel kombiniert werden können, um dadurch eine Vorrichtung zu erzeugen, die eine erwünschte Kombination vorher ausgewählter Moleküle in den Blutkreislauf transportiert.
In einigen Anwendungen, beispielsweise während der Hormonersatztherapie, wird bevorzugt Zellen zu verwenden, die das vorausgewählte Molekül in Reaktion auf einen äußeren Stimulus bzw. Reiz produzieren. Eine Vorrichtung, die solche regulierten Zellen enthält, produziert deswegen das vorher ausgewählte Molekül, wenn die Notwendigkeit hierzu entsteht, wodurch eine Überproduktion des vorher ausgewählten Moleküls vermieden wird, die, abhängig vom Molekül, für den Empfänger nachteilig sein kann. Es wird jedoch während anderen Anwendungen, beispielsweise während der Ersatztherapie für Faktor VIII in einer Faktor VIII defizienten Hämophilie; Faktor IX in der Faktor IX defizienten Hämophilie; oder α₁-Antitrypsin in α₁-Antitrypsin defizientem Emphysem ins Auge gefasst, das Zellen, die diese vorher ausgewählten Moleküle konstitutiv produzieren, in die Hohlfasern der Vorrichtung mit eingeschlossen sind.
Bestimmte Formen von Anämien, beispielsweise Erythropoietin defizienten Anämien, die durch eine Nierenkrankheit im Endstadium verursacht sind, ergeben sich aus dem Unvermögen des Wirtes, Erythropoietin in einer ausreichenden Menge zu erzeugen, um die Produktion einer ausreichenden Menge an roten Blutzellen zu induzieren. Als Resultat dieser Krankheit fällt die Masse der roten Blutzellen des Patienten ab, wodurch das Sauerstoff führende Potential des Blutes gesenkt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung deswegen eine Vorrichtung bereit, die Erythropoietin erzeugende Zellen umfasst, die Erythropoi etin in Reaktion auf eine reduzierte Sauerstofftransportkapazität des Empfängerblutes erzeugen. Die Erfindung ermöglicht, dass die Erythropoietin erzeugenden Zellen innig genug dem Blut gegenüber exponiert werden, so dass eine volle endokrine Funktion der Zellen effektiv realisiert werden kann. Es wird demgemäß in Erwägung gezogen, dass die implantierbare Erythropoietin produzierende und sezernierende Vorrichtung der Erfindung bei der Behandlung von Erythropoietin-Mangel-Anämien von Nutzen sein kann.
Zusätzlich ergeben sich bestimmte Formen der Diabetes, beispielsweise die Diabetes mellitus, aus einem Unvermögen des Wirtes, Insulin in einer Menge zu produzieren, die ausreicht, um den Spiegel an zirkulierender Glukose im Blutstrom zu modulieren. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die Insulin produzierende Zellen umfasst, die Insulin in Reaktion auf den Glukose-Spiegel im Blut produzieren. Es wird demgemäß in Betracht gezogen, dass die implantierbare, Insulin produzierende und sezernierende Vorrichtung der Erfindung in der Behandlung von Insulin-abhängigen Formen der Diabetes von Nutzen sein können.
Gemäß eines weiteren Aspektes kann die Erfindung in einem Verfahren zum perkutanen Einbringen in ein Blutgefäß eines Säugetiers zur Abgabe eines vorher ausgewählten Moleküls in den Blutkreislauf verwendet werden. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Verankern eines Blut-permeablen Elements an einer Innenwand eines intakten Blutgefäßes, das, wenn es verankert ist, es dem Blut im Gefäß ermöglicht, dadurch hindurch zu passieren; (b) Einbringen einer Kapsel in einen Ort stromaufwärts des verankerten Elementes, die lebensfähige Zellen enthält, die das vorher ausgewählte Molekül erzeugen und sezernieren; und (c) es der Kapsel Ermöglichen, das Element zu berühren.
In diesem Verfahren kann das Blut-permeable Element in das Blutgefäß mittels eines Katheters eingebracht werden. Weiterhin kann die Kapsel desgleichen in das Gefäß mittels desselben oder eines anderen Katheters eingebracht werden. Während solcher Verfahren kann das Blut-permeable Element und/oder die Kapsel durch einen Katheter in das Säugetier über die Oberschenkel- oder Jugularvene eingebracht und dann in einer natürlichen Vene verankert werden, beispielsweise in der unteren Hohlvene, in der oberen Hohlvene, in die Pfortader oder einer renalen Vene oder alternativ kann in einer synthetischen Vene verankert werden, beispielsweise einer Vene, die aus einer chirurgisch entwickelten arteriovenösen Fistel entwi ckelt wurde. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Auswahl geeigneter Orte zur Einbringung und Verankerung der Vorrichtung innerhalb der Fachkenntnisse des Fachmanns liegt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr speziell unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen zur Veranschaulichung beschrieben werden, in denen:
1 eine seitliche Schnittansicht einer Zell-enthaltenden Kapsel des Typs ist, die in der Ausübung der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist,
2 eine schematische seitliche Schnittansicht einer zweiten Zell-enthaltenden Kapsel des Typs ist, die in der Ausübung der vorliegenden von Nutzen ist,
3 eine Darstellung ist, die ein bevorzugtes Blut-permeables Element der Erfindung darstellt,
4 eine Draufsicht des Elementes von 3 ist,
5 eine schematische Schnittansicht der Vorrichtung der Erfindung ist, die in einem intakten Blutgefäß deponiert ist, und
6A–6E Darstellungen sind, die die bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtung der Erfindung zeigen.
In den Zeichnungen zeigen gleiche Bezugsziffern in den jeweiligen Zeichnungen entsprechende Teile an.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der allgemeinsten Anwendung sieht die vorliegende Erfindung eine implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines vorher ausgewählten Moleküls in den Blutkreislauf eines Säugetiers vor. Die Vorrichtung der Erfindung ist zur direkten Implantation in ein Blutgefäß vorgesehen, vorzugsweise unter Verwendung eines Katheters. Nach Implantation ermöglicht die Vorrichtung, dass das vorher ausgewählte Molekül aus der Vorrichtung und in den Blutstrom des Empfängers diffundiert, was gemäß bestimmter Grundgedanken in Reaktion auf Blutparameter funktioniert, beispielsweise Sauerstoffspannung im Falle Erythropoietin erzeugender Zellen.
Die Vorrichtung umfasst zwei Bestandteile, die miteinander in Wechselwirkung stehen, wenn sie dem Empfänger implantiert werden. Der erste Bestandteil ist ein Blut-permeables Element, vorzugsweise eine Käfig-artige filamentöse Struktur, die zur Einfügung in das Lumen eines intakten Blutgefäßes dimensioniert ist. Wenn es einmal an einen erwünschten Ort eingebracht wurde, wird das Element am Ort an der Innenwand des Blutgefäßes verankert, typischerweise mittels eines Hakens oder Widerhakens, der am Element angeordnet ist. Das Blutpermeable Element ist derart designed, dass, wenn es an der Wand des Blutgefäßes verankert ist, das Element es Blut im Gefäß ermöglicht, dadurch hindurch zu passieren. Der zweite Bestandteil ist eine Kapsel, die ebenfalls zur Einfügung in das Lumen des Blutgefäßes dimensioniert ist. Die Kapsel umfasst ein semipermeables Gehäuse, das lebensfähige Zellen umfasst, die das vorher ausgewählte Molekül produzieren und sezernieren. Die Kapsel wird in das Blutgefäß stromaufwärts des Elementes eingefügt. Wenn sie einmal eingefügt ist, kann die Kapsel sich entlang des Blutgefäßes mit dem Strom des Blutes bewegen, bis sie das verankerte Element erreicht, wonach die Kapsel eingefangen und durch das Element festgesetzt wird. Das vorher ausgewählte Molekül wird durch die Zellen, die in der Kapsel eingefangen sind, produziert und sezerniert, die nach dem Sezernieren aus den Zellen aus der Kapsel diffundieren und in das Blut diffundieren, das die Kapsel passiert. Nach Eintritt in den Blutstrom wird das vorher ausgewählte Molekül rasch durch das Gefäßsystem des Wirtes verteilt. Ein richtiger Betrieb der Vorrichtung erfordert, dass sie den Blutstrom nicht verlegt, d. h., die implantierte Vorrichtung verhindert die Passage von Blut durch das Blutgefäß nicht.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird nunmehr ausführlicher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, die zu Veranschaulichungszwecken vorgesehen sind und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen. Bezug nehmend auf die Figuren zeigen 1 und 2 schematisch Kapseln 10, die in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sind. In 1 umfasst die Kapsel 10 eine einzelne Hohlfaser, die aus einer semipermeablen Membran 12 hergestellt ist, die die lebensfähigen Zellen 14 einschließt. In 2 umfasst die Kapsel 10 eine semipermeable Membran 12, die eine Vielzahl semipermeabler Membranhohlfasern 16 einschließt, die die lebensfähigen Zellen 14 einschließen. Es wird in Erwägung gezogen, dass die semipermeable Membran 12 und 16 entweder durch dieselbe oder unterschiedliche Polymerzusammensetzungen definiert sein können. Verfahren und Materialien zur Herstellung solcher Membranen sind in der Technik bekannt und sind unten beschrieben. Die lebensfähigen Zellen 14 können oder können nicht an der Innenoberfläche einer Faser befestigt sein, jedoch hängt dieses Merkmal vom Zelltyp ab, der in die Vorrichtung mit eingeschlossen ist. Beispielsweise wachsen einige Zelltypen in einer Verankerungsabhängigen Weise auf einer festen Oberfläche, während andere Zelltypen keine Verankerungsabhängigkeit aufweisen und in Suspension wachsen. Die Auswahl des Zelltyps jedoch hängt von der sich ergebenden Anwendung ab.
Die 3 und 4 zeigen ein bevorzugtes Blut-permeables Element 20, das in der Ausübung der Erfindung von Nutzen ist. Das Element 20 umfasst einen Kopf 26 und eine Vielzahl von elastischen, typischerweise metallischen, Beinen 22, die sich davon weg erstrecken. Die Enden der Beine distal zum Kopf umfassen Haken oder Widerhaken 24, die nach außen angeordnet sind, um an der Innenwand des Zielblutgefäßes einzugreifen. Eine Vielzahl solcher Elemente auf Grundlage dieses Designs sind in der Technik wohl bekannt und sind ausführlicher unten beschrieben. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass andere Blut-permeable Elemente auf Grundlage anderer Designs, beispielsweise ein Vogelnestfilter, wie er hierin nachstehend beschrieben ist, ebenfalls in de Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
5 zeigt eine bevorzugte Designkonfiguration für die implantierbare Vorrichtung der Erfindung. Das Blut-permeable Element ist an einer Innenwand 32 eines intakten Blutgefäßes 30 verankert. Der Kopf 26 des Elements 20, der Beine 22 aufweist, die sich radial davon weg erstrecken, befindet sich im Gefäß stromabwärts von oder proximal bzw. nahe den Haken 24. Die nach außen angeordneten Beine 22 sind radial durch Federspannung vorgespannt und breiten sich Schirm-artig aus, um es dem Haken 24 zu ermöglichen, in die Wand des Blutgefäßes 30 einzugreifen, um die Bewegung des Elementes in Richtung des Blutstroms (durch den Pfeil dargestellt) zu verhindern. Stromaufwärts des Elementes 20 angeordnet ist eine Kapsel 10, die lebensfähige Zellen enthält. Die Kapsel ist aus einer semipermeablen Membran hergestellt, die es Sauerstoff, Glukose und/oder anderen Nährstoffen erlaubt, die für die Lebensfähigkeit der eingekapselten Zellen notwendig sind, aus dem Blutstrom in das Lumen der Kapsel zu diffundieren, während den Zellmetaboliten, beispielsweise dem vorher ausgewählten Molekül und zellulären Abfallprodukten ermöglicht wird, aus dem Lumen der Kapsel in den Blutstrom hinaus zu diffundieren. 6 zeigt eine Vielzahl von Konfigurationen, von denen angenommen wird, dass sie in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sind. 6A zeigt eine einzelne Kapsel 10, die ein Bündel Hohlfasern umfasst, die mittels Endkappen 40 zusammengehalten werden. Die einzelne Kapsel ist innerhalb eines einzigen Blut-permeablen Elementes 20 angeordnet. Unter der Annahme, dass die Haken und Widerhaken 24 in die Innenwand eines Blutgefäßes eingebettet sind, wird die Kapsel 10 in ihrer Position im Blutgefäß stromaufwärts des Blut-permeablen Elementes durch Kontakt mit dem Blut-permeablen Element 20 zurückgehalten. Die Konfiguration der in 6B dargestellten Vorrichtung ist im Wesentlichen dieselbe wie die Vorrichtung in 6A, außer dass die Kapseln 10 innerhalb und in Kontakt mit einem einzigen Blut-permeablen Element 20 angeordnet sind. 6C zeigt eine einzige Kapsel 10, die innerhalb und in Berührung mit einem Blut-permeablen Element 20 zurückgehalten wird. Ein Teil der Kapsel 10, die das Blut-permeable Element 20 zurückhält, ist innerhalb eines biokompatiblen Gels 50, beispielsweise eines autologen Blutgerinsels, angeordnet, wodurch ein optimales Einfangen der Kapsel 10 durch das Blutpermeable Element 20 erfolgt. 6D zeigt zwei Kapsel 10, die am Ort durch ein Blutpermeables Element 20 zurückgehalten werden. Die Kapseln 10 kontaktieren das Blutpermeable Element 20 mittels Haken oder Haltegurten 60. Unter der Annahme, dass die Widerhaken 24 des Blut-permeablen Elementes 20 in eine Innenwand eines Blutgefäßes eingebettet sind, würden die Kapseln 10 stromabwärts des Blut-permeablen Elementes angeordnet sein. 6E zeigt zwei Kapseln 10, die mittels zweier Blut-permeabler Elemente 20 am Ort gehalten werden. Diese Art einer Konfiguration kann insbesondere von Nutzen sein, wenn eine große Anzahl von Zellen erforderlich ist, um die bevorzugte Dosis eines vorher ausgewählten Moleküls zu erzeugen und deswegen sind lange Kapseln 10 erforderlich, um die große Anzahl lebensfähiger Zellen aufzunehmen.
Das Blut-permeable Element
Wie oben erwähnt, ist der Stand der Technik mit Blut-permeablen Elementen reichlich versehen, die in der Ausübung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind. Nützliche Blutpermeable Elemente sind durch ihre Fähigkeit charakterisiert, im Lumen eines Blutgefäßes verankert werden zu können, ohne den Blutstrom durch das Blutgefäß zu verlegen oder zu verhindern.
Blut-permeable Elemente, die in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sind, sind kommerziell erhältlich und werden als Embolismus- oder Blutgerinsel-Anti-Migrationsfilter vermarktet. Diese Anti-Migrationsfilter werden routinemäßig durch den medizinischen Fachmann verwendet, um die Migration potentiell lebensbedrohlicher Blutgerinsel innerhalb des Gefäßsystems zu vermeiden. Blutgerinsel-Anti-Migrationsfilter sind typischerweise so designed, dass sie im Lumen eines Blutgefäßes implantiert und verankert werden können. Wenn sie implantiert sind, ermöglichen die Anti-Migrationsfilter, dass Blut im Gefäß passieren kann, während gleichzeitig Blutgerinsel eingefangen werden.
Eine Vielzahl von Blutgerinnungs-Anti-Migrationsfilter, die in der Erfindung von Nutzen sind, sind in der Technik bekannt und sind kommerziell erhältlich. Beispielsweise sind gegenwärtig bevorzugte Blutgerinsel-Anti-Migrationsfilter solche, die in den US-Patenten Nr. 4 817 600 und 5 059 205 beschrieben werden, die in der Technik als Greenfield^® Filter bezeichnet werden und von Medi.Tech^®, Boston Scientific Corporation, Watertown, MA erhältlich sind, insbesondere zur Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignet. Die kegelförmigen Greenfield^® Vena cava Filter sind so entwickelt, dass sie eine maximale Einfangfläche zur Einfangung von Blutgerinseln bereitstellen, während die Durchgängigkei des Blutgefäßes nach Einfangen der Embolie erhalten bleibt. Beispielsweise erlaubt die Geometrie des Kegels die Befüllung von 80 % seiner Tiefe, bevor die Querschnittsfläche um 64 % reduziert wird, und dass zumindest 80 % der Tiefe des Filters ohne Entwicklung eines signifikanten Druckgradienten über den Filter hinweg befüllt werden können. Die Beabstandung der sechs Beine des Greenfield^® Vena cava Filters macht das Einfangen von Emboli sicher, die größer als 3 mm sind (Greenfield et al. (1989) „Venous Interruption", Kapitel 68, Seiten 929–939 in „Haimovici's Vascular Surgery Principles and Techniques, 3. Ausgabe", Appleton und Lange, Norwalk, Connecticut/San Mateos, Kalifornien). Demgemäß können die Filter dazu in der Lage sein, Kapseln einzufangen, die mehr als 3 mm Durchmesser aufweisen.
Weitere nützliche Blutgerinsel-Anti-Migrationsfilter, die in der Erfindung von Nutzen sind, werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4 791 177; 4 494 531; 4 793 348; 5 152 777; 5 350 398; und 5 383 887 beschrieben. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass andere Blutgerinsel-Anti-Migrationsfilter, beispielsweise solche, die in Greenfield (1991) in „Vascular Surgery, A Comprehensive Review", Moore, Hsg. W.B. Saunders Co., Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo, Seiten 669–679 beschrieben sind, einschließlich: Nitinol-Filter; Gunther-Filter; Venatech-Filter; Amplatz-Filter; und Vogelnest-Filter desglei chen können in der Ausübung der Erfindung verwendet werden. Wegen den den Blutgerinnungs-Anti-Migrationsfiltern eigenen Eigenschaften, nämlich Design zum Einbringen in und Verankerung innerhalb des Lumens eines Blutgefäßes und weiterhin, dass, wenn sie im Gefäß verankert sind, die Filter es dem Blutstrom im Gefäß ermöglichen, dadurch hindurch zu passieren, macht diese als Blut-permeable Elemente der Erfindung wünschenswert. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass andere Blut-permeable Elemente als die hierin beschriebenen, die jedoch die oben erwähnten Eigenschaften haben, ebenfalls in der Ausübung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein können.
Kapsel-Design
Die implantierte Arzneistoff-Abgabevorrichtung der Erfindung kann dazu in der Lage sein, einen vorher ausgewählten Arzneistoff über eine verlängerte Zeitspanne abzugeben, vorzugsweise in einem Bereich von Monaten bis Jahren. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass entleerte Zellkapseln, d. h. bei denen ein beträchtlicher Anteil von Zellen innerhalb der Kapsel nicht länger lebensfähig sind oder nicht mehr länger das vorher ausgewählte Molekül sezernieren, vom Empfänger wiedergewonnen und durch neue Kapseln ersetzt werden können, die frische Zellen enthalten, die das vorher ausgewählte Molekül erzeugen und sezernieren.
Die Kapsel kann entweder eine einzige Hohlfaser (in 1 dargestellt) oder ein Vielzahl von Hohlfasern (wie in 2 dargestellt) umfassen. Die Anzahl von Fasern hängt von einer Reihe von Variablen ab, die ohne unzulässigen experimentellen Aufwand bestimmt werden können. Eine Variable schließt beispielsweise die Produktivität der Zellen, die in die Vorrichtung eingebaut werden sollen, ein. Es wird in Erwägung gezogen, dass, wenn ein erster Zelltyp mehr vorher ausgewähltes Molekül produziert und sezerniert als ein zweiter Zelltyp, dann weniger Zellen des ersten Typs erforderlich sein werden, um dieselbe Menge eines vorher ausgewählten Moleküls zu erzeugen. Andere Variablen schließen Folgendes ein: Die Menge des vorher ausgewählten Moleküls, die notwendig ist, um den erwünschten therapeutischen Effekt im Empfänger zu erzeugen; die Ernährungserfordernisse der Zellen; die Zeit, über die die Zellen nach Implantation lebensfähig bleiben; und die Dichte, bis zu der die Zellen wachsen können, ohne ihre Lebensfähigkeit zu verlieren. Wenn diese Variablen einmal etabliert wurden, dann kann der praktizierende Fachmann durch vernünftige Auswahl des Zelltyps und der Hohlfasergeometrie den geeigneten Zelltyp auswählen, um im Wirt lebensfähig zu bleiben und die erwünschte Menge des vorher ausgewählten Moleküls für die längste Zeitspanne zu erzeugen.
Weil die Vorrichtung die Abgabe des vorher ausgewählten Moleküls über verlängerte Zeitspannen ermöglicht, ist deswegen eine bedeutende Erwägung die Entwicklung von Kapseln, die die Lebensfähigkeit der Zellen, die darin eingeschlossen sind, nach Implantation in den Wirt aufrechterhalten. Es ist verständlich, dass ein oder mehrere Faktoren, einschließlich beispielsweise: der Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen für die Zellen in der Kapsel; die Entfernung von Abfallprodukten aus den Zellen in der Kapsel; die Minimierung von Immunreaktionen des Wirtes, die gegen die Zellen in der Kapsel gerichtet sind; die proliferative Aktivität der Zellen; und ob die Zellen im Zentrum der Kapseln angeordnet sind, gegenüber einer Drucknekrose empfindlich sind, das Design und die Zubereitung einer Zell-enthaltenden Kapsel beeinflussen können.
Weil der Transport von Sauerstoff ein limitierender Faktor für die Lebensfähigkeit und Funktion implantierter Zellen sein kann, muss die Geometrie der Hohlfasern mit Sorgfalt ausgewählt werden, um eine adäquate Sauerstoffabgabe aufrechtzuerhalten. Es wird angenommen, dass der Transport von Sauerstoff aus dem Lumen des Blutgefäßes an die Zellen, die in der Kapsel eingeschlossen sind, fast ausschließlich durch Diffusion erfolgt. Studien haben gezeigt, dass, um die Lebensfähigkeit von Zellen aufrechtzuerhalten, die vom Blutstrom oder der Blutzufuhr ausgeschlossen sind, die Zellen vorzugsweise in einer entscheidenden Diffusionsdistanz von ungefähr 500 μm, besonders bevorzugt ungefähr 300 μm von der Blutzufuhr angeordnet sind. Beispielsweise zeigt eine direkte Messung der gelösten Sauerstoffkonzentrationen in Säugetier-Brusthauptschlagadern mit Sauerstoffelektroden, dass die Konzentration von aufgelöstem Sauerstoff in der Arterienwand einen Flusspunkt bzw. Nadir von 25 mm Hg ungefähr 300 μm vom Blutlumen entfernt erreicht (Buerk et al. (1982), Am. J. Physiol. 243: H948–H958). Um optimale Belüftungsbedingungen sicherzustellen, wird in Erwägung gezogen, dass die Hohlfasern, die die Zellen enthalten, einen Innendurchmesser von vorzugsweise weniger als ungefähr 1000 μm (1,0 mm) und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 500 μm (0,5 mm) aufweisen. Es sei erwähnt, dass Zellen, die eine niedrige metabolische Aktivität aufweisen und deswegen einen niedrigen Sauerstoffbedarf, beispielsweise Myoblasten, in Hohlfasern, die Innendurchmesser aufweisen, die ungefähr 500 μm überschreiten, lebensfähig bleiben können, dass jedoch Zelltypen, die eine hohe metabolische Aktivität aufweisen vorzugsweise in Hohlfasern eingefangen werden, die einen Innendurchmesser von ungefähr 200 μm aufweisen. Es wird in Erwägung gezogen, dass der optimale Kapseldurchmesser für einen vorher ausgewählten Zelltyp ohne unzulässigen experimentellen Aufwand unter Verwendung der hierin nachstehend beschriebenen Methodik bestimmt werden kann.
Zusätzlich zu einer angemessenen Belüftung bzw. Luftzufuhr ist es von Bedeutung, dass die eingekapselten Zellen ausreichende Mengen essentieller Nährstoffe aus der Blutzufuhr erhalten, um lebensfähig zu bleiben. Es wird angenommen, dass die Sauerstoffdiffusion der wichtigste Aspekt in der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit ist, und deswegen kann die Hohlfaser, wenn einmal die Geometrie einer Hohlfaser für den Sauerstofftransport optimiert wurde inhärent die Diffusion adäquater Mengen an Nährstoffe in das Lumen der Kapsel aus dem Blutstrom ermöglichen. In ähnlicher Weise wird eine solche Geometrie als eine Diffusion von Zellmetaboliten ermöglichend in Erwägung gezogen, einschließlich von Abfallprodukten und des vorher ausgewählten Proteins, aus der Hohlfaser hinaus und in den Blutstrom.
Die Hohlfasern werden vorzugsweise aus einer semipermeablen Membran erzeugt, die Poren aufweist, dimensioniert, um die Diffusion von Sauerstoff und von Nährstoffen in das Lumen der Hohlfaser zu ermöglichen, während der Ausfluss von zellulären Abfallprodukten und des vorher ausgewählten Moleküls aus der Hohlfaser ermöglicht wird. Zusätzlich sind die Poren vorzugsweise so dimensioniert, dass sie die Passage von Zellen dadurch hindurch ausschließen. Demgemäß sind die Poren so designed, dass sie eine Migration der lebensfähigen Zellen aus dem Lumen der Hohlfaser in den Blutstrom verhindern, wodurch die implantierten Zellen an einem einzigen Ort im Wirt gehalten werden, um ihre anschließende Entfernung zu erleichtern, wenn oder falls dies notwendig ist. Die Poren sind ebenfalls so designed, dass sie den Einstrom der Immunzellen der Wirte vermeiden, beispielsweise von Makrophagen und Lymphozyten, die, falls es ihnen möglich sein würde, das Lumen der Hohlfasern zu erreichen, für die Lebensfähigkeit der darin eingeschlossenen Zellen von Nachteil sein könnten. Die Membran stellt deswegen ein immunprivilegiertes Milieu bereit, das die darin eingeschlossenen Zellen vor einer Immunreaktion schützt. Dies kann eine bedeutende Erwägung sein, wenn die Zellen, die implantiert sind, ihrer Natur nach nicht autolog sind.
Es wird zusätzlich in Erwägung gezogen, dass, obwohl die Poren groß genug sein sollten, um das Heraustreten des vorher ausgewählten Moleküls zu ermöglichen, die Poren vorzugsweise Moleküle wie beispielsweise Antikörper oder zytotoxische Zytokine, die ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 150 kD aufweisen, ausschließen sollten. Es wird in Erwägung gezogen, dass der Ausschluss von Wirts-Antikörpern und Zytokinen die Langlebigkeit der lebensfähigen Zellen im Anschluss an eine Implantation der Vorrichtung in den Wirt vergrößern kann. Als Folge der bevorzugten Porenausschlussgröße wird erwogen, dass die Hohlfasern so angepasst sind, dass sie den Einstrom vorher ausgewählter Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 150 kD ermöglichen. Die Porengröße ist eine bedeutende Erwägung, wenn die Zellen, die in der Kapsel eingefangen sind, keine autologen Zellen sind. Es wird demgemäß bevorzugt, dass, wenn das vorher ausgewählte Molekül ein Molekulargewicht von mehr als 150 KiloDalton aufweist, beispielsweise Faktor VIII, der ein Molekulargewicht von ungefähr 330 KiloDalton aufweist, dann die Zellen, die in der Hohlfaser eingeschlossen sind, vorzugsweise autogene oder autologe Zellen sind. Es wird in Erwägung gezogen, dass die autogenen oder autologen Zellen eine schwächere Immunreaktion als Zellen aus anderen Quellen zeigen und als Folge hiervon eine verstärkte Lebensfähigkeit und Langlebigkeit aufweisen. Wenn jedoch das vorher ausgewählte Molekül ein Molekulargewicht bzw. eine Molekülmasse von weniger als 150 KiloDalton aufweist, beispielsweise Faktor IX (ungefähr 56 KiloDalton), α₁-Antitrypsin (ungefähr 52 KiloDalton) und Erythropoietin (ungefähr 36 KiloDalton), dann wird angenommen, dass jeder Zelltyp in die Hohlfaser eingeschlossen werden kann, obwohl autogene und autologe Zellen bevorzugt werden.
Die Hohlfasern, die die Kapsel umfassen oder die zum Einbau in die Kapsel vorgesehen sind, können aus biokompatiblen Polymeren hergestellt werden, die einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyurethanisocyanat, Polyalginat, Celluloseacetat, Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Cellulosenitrat, Polysulfon, Polystyrol, Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polyacrylonitril, Polyamid, Polymethylmethacrylat, Polyethylenoxid, Polytetrafluorethylen oder Copolymere hiervon. Eine Zusammenfassung gegenwärtig verfügbarer Hohlfasern, einschließlich der Verfahren zur Herstellung und der Namen kommerzieller Zulieferer ist in Radovich (1995), „Dialysis Membranes: Structure and Prediction", Contrib Nephrol., Basel, Karger: 113: 11–24, dargelegt. Zusätzlich sind nützliche Polytetrafluorethylenpolymer-Hohlfasern kommerziell von Impra, Inc., Tempe, AZ oder W.L. Gore and Associates, Flagstaff, AZ, erhältlich.
Wenn genug Zellen in eine einzige Hohlfaser implantiert werden können, um ein erwünschtes Niveau des vorher ausgewählten Moleküls im Blutstrom zu erzeugen, dann enthält die Kapsel der Erfindung vorzugsweise eine einzige Hohlfaser (s. beispielsweise 1). Wenn alternativ die übrige Anzahl der Zellen nicht in eine einzige Hohlfaser eingebaut werden kann, dann können die geeigneten Zellzahlen in einem Bündel von Hohlfasern eingeschlossen werden, wobei das Bündel von Fasern weiter innerhalb einer zweiten makroporösen äußeren Membran eingekapselt wird (s. beispielsweise 2). Die poröse äußere Membran definiert bzw. begrenzt vorzugsweise Poren, die die Diffusion von Nährstoffen und/oder Zellmetaboliten in und aus den Zell-enthaltenden Hohlfasern heraus nicht beeinträchtigen. Der Zweck der äußeren Membran besteht darin, das Faserbündel zusammenzuhalten und die Diffusion von Sauerstoff und von Nährstoffen in die Hohlfasern und die Diffusion von Abfallprodukten, d. h. Kohlendioxid, und des vorher ausgewählten Moleküls aus den Hohlfasern heraus nicht zu beschränken. In solchen Konfigurationen weisen die sich ergebenden Bündel an Hohlfasern üblicherweise einen Außendurchmesser auf, der ausreichend ist, um das Einfangen durch die Kapsel des Blut-permeablen Elementes zu ermöglichen. Zusätzlich kann das Bündel der Hohlfasern durch Endkappen zusammengehalten werden (s. beispielsweise die Endkappen 40 in 6A). Alternativ können die Hohlfasern in einem biokompatiblen Gel, beispielsweise einem autologen Blutgerinsel, enthalten sein, das aus Blut hergestellt wurde, extrahiert aus dem beabsichtigten Empfänger, wodurch ein Gerinsel bzw. Stöpsel erzeugt wird, der durch das Blut-permeable Element eingefangen werden kann (s. beispielsweise Plug 50 in 6C). Es wird zusätzlich erwogen, dass sogar dann, wenn die Kapseln zu klein sind, um von Blutpermeablen Element eingefangen zu werden, diese dann in Berührung mit dem Blutpermeablen Element mittels eines Hakens oder einer Haltevorrichtung gehalten werden können (s. beispielsweise die Haltevorrichtung bzw. den Haltegurt 60 in 6D). Es wird in Erwägung gezogen, dass die optimale Konfiguration für jedes Blut-permeable Element und Kapsel ohne unzulässigen experimentellen Aufwand vom praktizierenden Fachmann bestimmt werden kann.
Die Lebensfähigkeit und Leistung der Zellen innerhalb der Kapsel kann durch Reduzieren der Fibrin- und/oder Blutplättchenablagerung auf oder der Thrombenbildung um die Blutkontaktoberfläche der Kapsel herum und/oder die Hohlfasern herum gesteigert werden. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Fibrin- und die Blutplättchenablagerung auf oder die Thrombusbildung um die Blutkontaktoberfläche der Kapsel und/oder Hohlfasern herum zusätzliche Grenzflächen-Bedingungen erzeugen können, die eine größere Diffusionsdistanz für Sauerstoff erzeugen können, wodurch die Zelllebensfähigkeit eingeschränkt wird. Dieses Problem kann durch Verbesserung der Hämokompatibilität der Membran gelöst werden.
In dieser Hinsicht wurden mehrere Ansätze entwickelt, um die Hämokompatibilität von Biomaterialien zu verbessern, die innerhalb des Blutkreislaufes angeordnet sind. Der am meisten und umfassend entwickelte Ansatz schließt den Einbau von Heparin in das Biomaterial in, um eine lokale Antikoagulations-Aktivität auf der Oberfläche des Biomaterials zu erreichen. Beispielsweise umfassen Duraflo II-Heparin-Membranen (Bentley Labs, Baxter Healthcare Corporation, Irvine, Kalifornien) eine Heparin-Schicht auf der beschichteten Oberfläche einer Membran, die für zumindest mehrere Tage wirksam ist. Siehe beispielsweise Hsu (1991), Perfusion 6: 209–219; Tong et al. (1992), ASAIO Journal 38: M702–M706. Alternativ kann eine Polymerbeschichtung aus Polyethylenimin (PEI) auf die Oberfläche des Biomaterials abgelagert oder ionisch befestigt werden. Beispielsweise können Heparin-Fragmente, hergestellt aus dem Abbau von Heparin in salpetriger Säure kovalent durch Endpunktanlagerung des Heparins an PEI gebunden werden (Larm et al. (1983), Biomat., Med. Dev., Art Organs 11 (2&3)): 161–173; Larsson et al. (1987), Ann N.Y. Acad Sci 516: 102–115). Dieser Prozess zeigte eine effektive Antikoagulanz-Aktivität auf der Oberfläche des Biomaterials für mehrere Monate (Larsson et al. (s. oben)). Es wird in Erwägung gezogen, dass die Heparinisierung der Blutkontaktoberfläche der Kapsel und/oder der Hohlfasern die Fibrin- und Blutplättchenablagerung und/oder die Thrombusbildung minimieren kann.
Lebensfähige Zellen
Es wird in Erwägung gezogen, dass eine Vielzahl von Zelltypen in der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die Zellen sind vorzugsweise eukaryontische Zellen und besonders bevorzugt Säugetierzellen. Am meisten bevorzugt sind die implantierten Zellen autogen, d. h. in die implantierten Zellen sind vom beabsichtigten Empfänger gewonnen. Wie oben diskutiert wird in Erwägung gezogen, weil die Zellen der Erfindung in ein immunpriviligiertes Milieu innerhalb einer semipermeablen Membran eingeschlossen sein können, beispielsweise, wenn das vorher ausgewählte Molekül ein Molekulargewicht von weniger als 150 KiloDalton aufweist, dass allogene Zellen, d. h. Zellen, die von einem anderen Individuum innerhalb derselben Spezies wie der beabsichtigte Empfänger gewonnen wurden, oder alternativ xenogene Zellen, d. h. Zellen, die aus einer anderen Spezies als der Spezies des beabsichtigten Empfängers gewonnen wurden, in der Ausübung der Erfindung verwendet werden können.
Die in die Vorrichtung eingebauten Zellen sind vorzugsweise isolierte Zellen, etablierte Zellen oder Zelllinien, die das vorher ausgewählte Molekül von Interesse produzieren und sezernieren. Solche Zellen oder Zelllinien werden üblicherweise durch Standardzellkultur- und Screening-Verfahren, die wohl bekannt und in der Technik sorgfältig dokumentiert sind, isoliert. Ein Überblick, der derartige konventionelle Kultur- und Screening-Verfahren diskutiert, schließt beispielsweise „Tissue Culture, Methods and Applications" (1973) , Kruse und Paterson, Hsg., Academic Press, New York, San Francisco, London; „Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique", 2. Ausgabe (1987), Freshney, Hsg., Wiley-Liss, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapur; „Cell Biology. A Laboratory Handbook" (1994), Cells, Hsg., Academic Press; und „Control of Animal Cell Proliferation" (1985), Boyton und Leffert, Hsg., Academic Press, ein.
Obwohl die Zellen und Zelllinien von Interesse vorzugsweise vom Empfänger isoliert und durch Standardzellkultur-Methodik vor der Implantation expandiert werden, wird in Erwägung gezogen, dass nützliche Zellen oder Zelllinien aus anderen Individuen derselben Spezies als der beabsichtigte Empfänger isoliert werden können. Alternativ können nützliche Zellen oder Zelllinien aus Individuen isoliert werden, die zu anderen Spezies gehören, d. h. Schwein-, Maus-, Pferd-, Rind-, Affe-, Hund- oder Katzen-Ursprung aufweisen. Beispielsweise wurden isolierte fötale ventrale Mesenzephalonzellen vom Schwein, die Dopamin produzieren und sezernieren, in das menschliche Gehirn implantiert, um die mit der Parkinson-Krankheit verbundenen Symptome zu lindern ((Lindwall et al. (1990), Science 575–577).
Die Zellen produzieren und sezernieren vorzugsweise das vorher ausgewählte Molekül von Interesse entweder konstitutiv oder in Reaktion auf Umgebungsbedingungen. Der praktizierende Fachmann kann durch vernünftige Auswahl von Zellen und Zelllinien eine implantierbare Arzneistoffabgabevorrichtung zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen produzieren. Es ist jedoch verständlich, dass der Zelltyp von der Krankheit oder dem zu behandelnden Symptom abhängen wird. Um beispielsweise eine Vorrichtung, die zur Behandlung einer Erythropoietin-defizienten Anämie geeignet ist, zu erzeugen, kann der Fachmann Erythropoietin produzierende Zellen in die Vorrichtung der Erfindung mit einbauen. Obwohl jede Zelle, die Erythropoietin produziert, verwendet werden kann, wird angenommen, dass optimale Zelltypen Erythropoietin in Antwort auf ihre Umgebung bzw. Milieu produzieren und sezernieren, d. h. die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Blutstrom. Beispielsweise wurden Zelllinien, die Erythropoietin in Reaktion auf Variationen der Konzentration an gelöstem Sauerstoff produzieren und sezernieren, isoliert und charakterisiert. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 393 133 und Goldberg et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7972–7976.
Demgemäß kann der Einbau jeder Zelle oder Zelllinie, die Erythropoietin in Reaktion auf das Sauerstoff tragende Potential des Blutes erzeugt, in der Ausübung der Erfindung nützlich sein.
In ähnlicher Weise kann eine Vorrichtung, die Insulin produzierende Zellen enthält, in der Behandlung der Insulin-abhängigen Diabetes mellitus verwendet werden. Zellen, die eine Nützlichkeit in einer solchen Vorrichtung aufweisen, werden vorzugsweise aus entweder gesunden Individuen derselben Spezies wie der Empfänger oder von gesunden Mitgliedern anderer Spezies isoliert, d. h. von Säugetieren mit Schwein-, Rinder-, Pferd- oder Affen-Ursprung. Verfahren zum Isolieren, Screenen und Kultivieren von Insulin produzierenden Inselzellen und dispergierten Betazellen ebenso wie von Insulin produzierenden Zelllinien sind wohl bekannt und in der Technik sorgfältig diskutiert worden. Siehe beispielsweise Lacy et al. (1976), Diabetes 25: 585–594; Wollheim et al. (1990), Methods in Enzymology 192: 188–223; und Wollheim et al. (1990), Methods in Enzymology 192: 223–235.
Zusätzlich zur Verwendung natürlich vorkommender Zellen oder Zelllinien, die das Molekül von Interesse produzieren und sezernieren, wird in Erwägung gezogen, dass Zellen, die durch konventionelle DNA-Rekombinationsmethodologien „maßgeschneidert" sind, so gentechnisch verändert werden können, dass sie ein erwünschtes vorher ausgewähltes Molekül oder eine Kombination solcher Moleküle produzieren und sezernieren können. Die Prozesse zum Manipulieren, Amplifizieren und Rekombinieren von Nukleinsäuren, die ein vorher ausgewähltes Molekül von Interesse kodieren, sind im Allgemeinen in der Technik wohl bekannt und müssen deswegen hier nicht im Detail beschrieben werden. Verfahren zum Identifizieren und Isolieren von Genen, die ein vorher ausgewähltes Molekül kodieren, sind ebenfalls wohl bekannt und in der Patent- und auch in der weiteren Literatur beschrieben.
Kurz gesagt, wird die Produktion der DNAs, die vorher ausgewählte Moleküle von Interesse kodieren, unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt, die die Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme einschließen, die Sequenz-spezifische Schnitte in der DNA herstellen, um stumpfe Enden oder kohäsive Enden zu erzeugen, DNA-Ligasen, Techniken, die den enzymatischen Zusatz klebriger Enden an stumpfendige DNA ermöglichen, die Konstruktion synthetischer DNAs durch Zusammenbau kurzer oder mittellanger Oligonukleotide, cDNA-Synthesetechniken, Polymerasekettenreaktion(PCR)-Techniken zum Amplifizieren geeigneter Nukleinsäuresequenzen aus Bibliotheken und synthetische Sonden zum Isolieren von Genen, die das Molekül von Interesse kodieren. Verschiedene Promotorsequenzen aus Bakterien, Säugetieren oder Insekten, um nur einige zu nennen oder weitere regulatorische DNA-Sequenzen, die zum Erreichen einer Expression verwendet werden, und verschiedene Typen an Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und verfügbar. Konventionelle Transfektionstechniken und ähnliche konventionelle Techniken zum Klonieren und Subklonieren von DNA sind in der Ausübung dieser Erfindung von Nutzen und dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Verschiedene Typen von Vektoren können verwendet werden, beispielsweise Plasmide und Viren, die Tierviren und Bakteriophagen einschließen. Die Vektoren können verschiedene Marker-Gene verwenden, die einer erfolgreich transfizierten Zelle eine nachweisbare phänotypische Eigenschaft verleihen, die zum Identifizieren verwendet werden kann, welche einer Familie von Klonen erfolgreich die rekombinante DNA oder den Vektor einbaute.
Ein Verfahren zur Gewinnung von DNA, die das Molekül von Interesse kodiert, kann aus Bibliotheken von Nukleinsäuren isoliert werden, beispielsweise durch Kolonie-Hybridisierungsprozeduren wie solche, die in Sambrook et al., Hsg. (1989), „Molecular Cloning", Coldspring Harbor Laboratories Press, N.Y. beschrieben sind und/oder durch PCR-Amplifikationsmethoden, beispielsweise solche, die in Innis et al. (1990), „PCR Protocols, A guide to methods and applications", Academic Press, beschrieben sind.
Die Nukleinsäuren, die das Molekül von Interesse kodieren, können, wenn sie einmal isoliert sind, in einen Expressionsvektor integriert und in einer geeigneten Wirtszelle zur Proteinexpression transfiziert werden. Nützliche prokaryontische Wirtszellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf E. coli und B. subtilis. Nützliche eukaryontische Wirtszellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefezellen, Insektenzellen, Myeloma-Zellen, Fibroblasten 3T3-Zellen, Affennieren- oder COS-Zellen, chinesische Hamster-Ovar(CHO)-Zellen, Nerz-Lungenepithelzellen, humane Vorhautfibroblastenzellen, humane Glioblastomzellen und Teratokarzinomzellen.
Der Vektor kann zusätzlich verschiedene Sequenzen einschließen, um die korrekte Expression des rekombinanten Proteins zu fördern, einschließlich eines Transkriptionspromotors und von Terminationssquenzen, Enhancer-Sequenzen, bevorzugt Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenzen, bevorzugten mRNA-Leader-Sequenzen, bevorzugten Protein-Prozessierungssequenzen, bevorzugten Signalsequenzen zur Protein-Sezernierung und dergleichen. Die DNA-Sequenz, die das Gen von Interesse kodiert, kann ebenfalls manipuliert werden, so dass potentiell hemmende bzw. inhibierende Sequenzen entfernt und unerwünschte sekundäre Struktur-Bildung minimiert wird.
Eine Expression der gentechnisch veränderten Gene in eukaryontischen Zellen erfordert Zellen und Zelllinien, die einfach zu transfizieren sind und die dazu in der Lage sind, Fremd-DNA mit einer nicht umgeordneten Sequenz stabil aufrechtzuerhalten, und die die notwendigen zellulären Bestandteile zur effizienten Transkription, Translation, Post-Translationsmodifikation und Sekretion des Proteins aufweisen. Zusätzlich ist ein geeigneter Vektor, der das Gen von Interesse trägt, ebenfalls notwendig. Das DNA-Vektordesign zur Transfektion in Säugetierzellen sollte geeignete Sequenzen zur Förderung der Expression des Gens von Interesse wie hierin beschrieben einschließen, einschließlich von geeigneten Transkriptionsstart-, Terminations- und Enhancer-Sequenzen, ebenso wie Sequenzen, die Translationseffizienz steigern, wie beispielsweise die Kozak-Konsensus-Sequenz. Bevorzugte DNA-Vektoren schließen ebenfalls ein Marker-Gen und Mittel zum Amplifizieren der Kopienzahl des Gens von Interesse ein. Ein ausführlicher Überblick über den Stand der Technik der Produktion von Fremdproteinen in Säugetierzellen, einschließlich nützlicher Zellen, Proteinexpression-fördernder Sequenzen, Marker-Gene und Gen-Amplifikationsverfahren ist in Bendig (1988), Genetic Engineering 7: 91–127, offenbart.
Die verschiedenen Zellen, Zelllinien und DNA-Sequenzen, die zur Säugetierzellexpression des vorher ausgewählten Moleküls verwendet werden können, sind in der Technik wohl charakterisiert und leicht verfügbar. Andere Promotoren, selektierbare Marker und Gen-Amplifikationsverfahren und -zellen können ebenfalls dazu verwendet werden, die Proteine dieser Erfindung zu exprimieren. Spezielle Details der Transfektions- und Expressionsvorschriften sind in der Technik wohl dokumentiert und werden vom Fachmann auf dem Gebiet wohl verstanden. Weitere Details bezüglich verschiedener technischer Aspekt jedes der Schritte, die in der rekombinanten Produktion von Fremdgenen in Säugetierzellexpressions-Systemen verwendet wird, ist in vielen Texten und Laborhandbüchern in der Technik zu finden, wie beispielsweise F.M. Ausubel et al., Hsg., „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York (1989).
Es wird beispielsweise in Erwägung gezogen, dass nützliche Faktor-VIII-produzierende Zellen unter Verwendung herkömmlicher DNA-Rekombinations- und Zellkulturmethodik hergestellt werden kann und bei der Behandlung der Hämophilie A verwendet werden kann. Bei spielsweise haben Forscher das MFG-Retrovirus-Vektorsystem dazu verwendet, Faktor-VIII-cDNA in murine und humane Zellen zu transferieren (primäre und etablierte Zelllinien). Die sich ergebenden Zellen zeigen hohe Konzentrationen der Faktor-VIII-Produktion und dass die Faktor-VIII-sezernierenden Zellen nach Transfer in immundefiziente Mäuse beträchtliche Konzentrationen an Faktor VIII im Plasma erzeugen. Siehe beispielsweise Dwarki et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1023–1027. Desgleichen können Faktor-IX-produzierende Zellen hergestellt und in der Behandlung der Hämophilie-B verwendet werden. Forscher haben retrovirale Vektoren dazu verwendet, humane oder kanine Faktor-IX-cDNAs in kultivierte primäre murine Myoblasten, kanine Myoblasten und in eine etablierte murine Myoblasten-Zelllinie einzubringen. In allen Fällen erzeugen die sich ergebenden stabil transfizierten Zellen biologisch aktiven Faktor IX in Kultur und sezernieren nachweisbare Mengen in das Kulturmedium vor und nach der Differenzierung in Muskelschläuche. Siehe beispielsweise Roman et al. (1992), Somatic Cell and Molecular Genetics 18: 247–248; Yao et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3357–3361; und Yao et al. (1994), Gene Therapy 1: 99–107.
Zusätzlich können α₁-Antitrypsin-erzeugende Zellen in der Behandlung eines Emphysems hergestellt und verwendet werden. Beispielsweise wurde ein retroviraler Vektor zum Invertieren humaner α₁-Antitrypsin-cDNA in das Genom von Maus-Fibroblasten verwendet, wodurch eine klonale Population von Maus-Fibroblasten erzeugt wurde, die humanes α₁-Antitrypsin produzieren und sezernieren. Siehe beispielsweise Garver et a. (1987), Science 237: 762–764. In ähnlicher Weise wurden Leberzellen, die aus der Leber von experimentellen Tieren entfernt wurden, im Anschluss an die Transfektion mit einem retroviralen Vektor modifiziert, der α₁-Antitrypsin-DNA enthielt. Die sich ergebenden Hepatozyten bzw. Leberzellen produzieren und sezernieren nach Infusion in den Pfortaderkreislauf des Empfängers nachweisbare Konzentrationen von α₁-Antitrypsin für bis zu einen Monat. Siehe beispielsweise Crystel (1992), Am. J. Med. 91 (Ergänzungsband 6A) 6A 445–6A 525; und Kan et al. (1992), Proc. Natl, Acad. Sci. USA 89: 89–93.
Zusätzlich können rekombinante Erythropoietin-sezernierende Zelllinien in der Behandlung einer Erythropoietin-defizienten Anämie erzeugt und verwendet werden. Beispielsweise produzieren Myoblasten-Klone, die eine 1,34 Kilobasen Erythropoietin-cDNA vom Menschen tragen, stabil hohe Konzentrationen an funktionellem humanen Erythropoietin und sezernieren diese und es wurde nach Transfer in murine Modelle gezeigt, dass diese bei der Erhöhung des Hämatokritwertes für zumindest 12 Wochen wirksam sind. Siehe beispielsweise Hamamori et al. (1995), J. Clin. Invest. 95: 1808–1813.
Es wird weiterhin in Erwägung gezogen, dass Zellen, die zur Expression und zum Sezernieren von Aldolase B in der Lage sind, in der Behandlung der erblichen Fruktose-Intoleranz verwendet werden können; Glucose-6-phosphat produzierende Zellen in der Behandlung der Glycogen-Speicherkrankheit Typ I verwendet werden können; saure α-Glycosidase erzeugende Zellen in der Behandlung der Glycogen-Speicherkrankheit Typ II verwendet werden können, Amylo-1,6-glycosidase erzeugende Zellen in der Behandlung der Glycogen-Speicherkrankheit Typ III verwendet werden können, die Muskelphosphorylase in der Behandlung der Glycogen-Speicherkrankheit Typ IV verwendet werden kann; die Galactose-1-phosphaturidyltransferase erzeugenden Zellen bei der Behandlung der Galactosämie verwendet werden können, Phenylalaninhydroxylase erzeugende Zellen bei Behandlung der Phenylketonurie verwendet werden können, Tyrosinaminoaminotransferase erzeugende Zellen in der Behandlung der Tyrosinämie nützlich sein können; Adenosindesaminase erzeugende Zellen in der Behandlung einer kombinierten Immundefizientkrankheit von Nutzen sein können; die Phorphobilinogendesaminase und URO-Decarboxylase erzeugenden Zellen in der Behandlung der Porphyrie von Nutzen sein können; die α-Iduronidase und Induronatsulfatase produzierenden Zellen in der Behandlung der Mucopolysaccharidosen verwendet werden können; Sphingomyelinase produzierende Zellen in der Behandlung der Neimann-Pick-Krankheit verwendet werden können; Glucocerebrosidase erzeugende Zellen in der Behandlung des Gaucher-Syndroms verwendet werden können; α-Galaktosidase erzeugende Zellen in der Behandlung der Fabry-Krankheit verwendet werden können; Von-Willebrand-Faktor erzeugende Zellen in der Behandlung der Von-Willebrand-Krankheit verwendet werden können; und Antithrombin erzeugende Zellen in der Behandlung der Antithrombin-Defizienz verwendet werden können. Alle vorher erwähnten Zellen und Zelltypen können unter Verwendung konventioneller DNA-Rekombinations- und gleichermaßen konventioneller Zellkulturmethodologien erzeugt werden. Es ist verständlich, dass die vorher erwähnten Beispiele keinesfalls einschränkend sind, weil in Erwägung gezogen wird, dass jede Zelle oder Zelllinie, die ein vorher ausgewähltes Molekül erzeugt und sezerniert, bei der Linderung der Symptome, die mit einem speziellen Zustand in Verbindung stehen, nützlich ist, wenn sie einmal isoliert oder produziert sind, und dann in der Ausübung der Erfindung verwendet werden kann.
Die vorletzten Expressionsvehikel zur Expression des vorher ausgewählten Moleküls sind vorzugsweise Zellen eukaryontischen, am meisten bevorzugt Säugetierursprungs. Eukaryontische Zellen können besser zur Entwicklung regulierter Zellen geeignet sein, die das vorher ausgewählte Molekül in Reaktion auf einen äußeren Reiz produzieren und sezernieren. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass unter speziellen Umständen, beispielsweise wenn kein Regulationsmechanismus erforderlich ist und das vorher ausgewählte Molekül konstitutiv erzeugt werden kann, gentechnisch veränderte prokaryontische Zellen ebenfalls in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sein können.
Beispielsweise kann unter speziellen Umständen, beispielsweise während der Verwendung von Polysulfon-Hohlfasern, die Bildung oder das Einfangen von Thromben an oder um die Vorrichtung herum den Blutstrom um die Vorrichtung und/oder die Diffusion von Nährstoffen oder Metaboliten in die Hohlfasern oder aus diesen heraus beeinträchtigen. Unter diesen Umständen wird in Erwägung gezogen, dass alle Zelltypen, die ein Antikoagulanz konstitutiv erzeugen und in den Blutstrom sezernieren, beispielsweise Gewebspasminogenaktivator, Streptokinase, Urokinase, Hirudin und dergleichen, ebenfalls in einer Hohlfaser mit eingeschlossen werden können. Deswegen kann der Fachmann auf dem Gebiet eine Vorrichtung erzeugen, die Zellen enthält, die entweder für sich selbst oder in Kombination ein Antikoagulanz zusätzlich zu anderen therapeutischen Proteinen erzeugen.
Auf dem Weg eines Beispiels wird in Erwägung gezogen, dass ein Gen, das das Antikoagulanz-Protein Huridin enthält, in eine Wirtszelle durch konventionelle Gentransfermethodik eingebracht werden kann. Die lokale Produktion von Hirudin durch Endothelzellen kann sich insbesondere bei der Vorbeugung einer Thrombose an vaskulären Orten als attraktiv erweisen. Studien haben gezeigt, dass Hirudin ein wirksames Antikoagulanz in vivo ist und gegenüber Heparin in experimentellen Tiermodellen der Thrombose im Anschluss an eine arterielle Verletzung überlegen ist (Haskel et al. (1991), Circulation 1048–1056; Heras et al. (1990), Circulation 82: 1476–1484). Beispielsweise kann das Hirudin-kodierende Gen durch Standard-PCR-Vorschriften isoliert und in einen retroviralen Expressionsvektor, beispielsweise pMFG Moloney Murines Leukämietumorvirus (Dranoff et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539–3542) stromabwärts einer Nukleinsäuresequenz, die eine Signalsequenz für Von-Willebrand-Faktor (vWF) kodiert, ligiert werden. Der Vektor wird anschließend in einen φ-Crip verpackt, ein amphotropes, Replikations-defizientes rekombinantes Retrovirus (Danos et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464). Endothelzellen, d. h. Kaninchen- Endothelzellen oder humane Umbilikal- bzw. Bauchnabelvenenendothelzellen können anschließend mit dem rekombinanten Retrovirus infiziert werden, was den Transfer des Hirudin-Gens in das Genom der Endothelzelle zur Folge hat. Die transfizierten Endothelzellen erzeugen anschließend konstitutiv das rekombinante Hirudin-Genprodukt und sezernieren dieses.
Herstellung er Kapsel
Wenn die Zellen oder die Zelllinien, die das vorher ausgewählte Molekül produzieren und sezernieren, isoliert oder produziert wurden, werden die Zellen oder Zelllinien danach in Hohlfasern kultiviert, die zur Erzeugung der Kapsel verwendet werden. Das bevorzugte Verfahren zur Einbringung der Zellen in die, ebenso wie das Kultivieren der Zellen in den Hohlfasern, erfolgt mittels eines kommerziellen Bioreaktors. Eine Liste von Herstellern kommerziell erhältlicher Bioreaktoren ist in „Genetic Engineering News", 1. Februar 1995, dargelegt. Bevorzugte Bioreaktoren, die in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sind, schließen folgende ein: Tricentric^TM und MabMax^TM Bioreaktoren von Setec, Livermore, CA. CellPharm^TM MicroMouse^TM von Unisyn Technologies, Milford, MA; Cellmax^TM Quad von Cellco, Inc. Germantown, MD; und Vitafiber II Hollow Fiber Cell Culture System von Amicon, Inc., W.R. Grace und Co., Beverly, MA.
Typischerweise wird eine Suspension von Zellen, die das vorher ausgewählte Molekül in Zellkulturmedium produzieren und sezernieren, in einen Bioreaktor durch Infundieren von Zellen gesät, der Medium in den Hohlfasern des Bioreaktors enthält. Dieser Schritt hat das Einfangen der Zellen in den Hohlfasern zur Folge. Danach werden die Zellen unter den optimalen Kulturbedingungen für den speziellen Zelltyp gemäß den Instruktionen des Herstellers kultiviert.
Die sich ergebenden Hohlfasern können anschließend entweder alleine oder als Bündel von Hohlfasern in Kombination mit dem Blut-permeablen Element in das Gefäßsystem des Empfängers implantiert werden. Verfahren zum Implantieren werden unten diskutiert.
Implantation der Vorrichtung
Die Vorrichtung der Erfindung wird vorzugsweise in das Gefäßsystem des Wirtes durch ein nicht-chirurgisches oder minimal-invasives chirurgisches Verfahren eingebracht. Insbesondere wird in Erwägung gezogen, dass die Vorrichtungen der Erfindung durch eine Vielzahl von Katheter-basierten Vorrichtungen eingebracht werden können, die zum Implantieren von Blutgerinsel-Antimigrationsfiltern in das Gefäßsystem entwickelt wurden. Beispielsweise beschreiben die US-Patente Nr. 5 147 379 und 3 952 747 und die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US/92/08366 Katheter-basierte Vorrichtungen und Verfahren zum Implantieren von Blutgerinsel-Antimigrationsfiltern in das Gefäßsystem eines Empfängers. Typischerweise umfassen die Katheter-basierten Filter Insertionsinstrumente: einen Träger zum Tragen eines Blutgerinsel-Antimigrationsfilters in einem kollabierten, kompakten Zustand; einen Ejektor- bzw. Ausstoßmechanismus, üblicherweise innerhalb des Trägers angeordnet, zum Ausstoßen des Filters am vorher ausgewählten Ort; ein verlängertes, biegsames Rohr, das an den Träger angeschlossen ist, zum Verbringen des Trägers entlang des Blutgefäßes zum vorher ausgewählten Ort. Wenn der Filter einmal am bevorzugten Ort im Blutgefäß angeordnet ist, wird der Filter aus dem Träger ausgestoßen. Wenn selbstöffnende und implantierende Filter verwendet werden, wird der Filter einfach aus dem Träger ausgestoßen, wonach der Filter sich selbst an der Wand des Blutgefäßes verankert. Wenn jedoch der Filter manuell geöffnet und verwendet wird, dann kann ein Einfügungsgerät zusätzliche Mittel zur Bewirkung einer solcher Öffnungs- und Verankerungsschritte enthalten. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass der geschulte Praktiker die kommerziell erhältlichen Blutgerinsel-Antimigrationsfilter unter Verwendung von Filtereinfügungsgeräten und Verfahren einfügen kann, wie sie vom Hersteller des Filters empfohlen werden.
Beispielsweise umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Vorrichtung der Erfindung ein Filterelement, wie beispielsweise eines, das in den US-Patenten Nr. 4 817 600 und 5 059 205 beschrieben wird, die als Greenfield^® Vena cava Filter bekannt sind und von Medi-tech^® kommerziell erhältlich sind. Boston Scientific Corp., Watertown, MA. Die Greenfield-Filter werden vorbeladen in einen Einführkatheter gezogen. Es wird demgemäß in Erwägung gezogen, dass ein Arzt ein Filterelement derart implantieren kann, wie diejenigen, die in den US-Patenten Nr. 4 817 600 und 5 059 205 gemäß der „Instructions for Use" von Meti-tech^® beschrieben sind, die mit den Filtern geliefert werden. Demgemäß werden die „Instructions for Use" von Medi-tech^® unten beschrieben.
Kurz gesagt, werden die Filter typischerweise durch die Jugular- oder die Oberschenkelvene durch perkutane Punktur eingefügt. Während der perkutanen Insertion und nach einem konventionellen Cavogramm wird entweder die Jugular- oder die Oberschenkelvene mit einer Nadel punktiert und ein Führungsdraht wird in das Gefäß durch die Nadel eingefügt. Danach wird eine kombinierte Hüllen/Dilatator-Einheit über den Führungsdraht in die Vene gedrückt, bis das Ende der Hülle außerhalb der Implantationsstelle angeordnet ist. Während die Hülle am Ort gehalten wird, werden Dilatator und Führungsdraht entfernt und lassen die Hülle zurück. Die Hülle dient als Zugang, um die Einbringung des Einführkatheters zu ermöglichen, der einen Träger enthält, der den Filter mit sich trägt. Die Hülle wird mit steriler heparinisierter Salzlösung gespült, um eine potentielle Thrombusbildung innerhalb der Hülle zu vermeiden, die während der Einfügung des Einführkatheters auftreten kann. Der Einführkatheter wird in, jedoch nicht über das Ende der Hülle hinaus vorgeschoben, bis die Spitze der Filterträgerkapsel nahe des Implantationsorts angeordnet ist. Dann wird die Hülle vom Einführkatheter zurückgezogen, bis die Trägerkapsel vollständig exponiert ist. Danach wird der Filter aus der Trägerkapsel durch einen Drückmechanismus ausgestoßen, wonach die Füße des Filters nach außen springen und in der Innenwand des Blutgefäßes eingreifen, wodurch der Filter in dieser Position verankert wird. Wenn einmal der Filter ausgestoßen und im Blutgefäß verankert wurde, kann eine Kapsel oder Kapseln, die die lebensfähigen Zellen enthalten, in der gleichen Weise über denselben Katheder in das Blutgefäß in eine Position stromaufwärts des verankerten Filters eingebracht werden. Danach wird der Einführkatheter aus dem Gefäß durch die Hülle entfernt. Wenn einmal der Einführkatheter entfernt wurde, wird die Hülle ebenfalls entfernt und die Punkturstelle komprimiert, bis ein Blutungsstillstand erreicht wird.
Es ist verständlich, dass der bevorzugte Ort zur Implantation der Vorrichtung im Blutkreislauf jedoch von der beabsichtigten Verwendung der Vorrichtung abhängen kann. Beispielsweise wird in einigen Situationen in Erwägung gezogen, dass es wünschenswert ist, die Vorrichtung über die Oberschenkel- oder Jugularvenen einzubringen und danach das Blut-permeable Element am Ort innerhalb einer natürlichen Vene zu verankern, beispielsweise einer unteren Hohlvene, einer oberen Hohlvene, einer Portvene oder einer Nierenvene. Alternativ kann die Vorrichtung der Erfindung in einer synthetischen Vene verankert werden, beispielsweise einer Vene, die aus einer chirurgisch entwickelten arteriovenösen Fistel entwickelt wurde. Wenn die Vorrichtung jedoch in der Hormonersatztherapie verwendet werden soll, kann der Arzt sich entscheiden, die Vorrichtung an einem Ort stromabwärts des natürlichen Ortes der Produktion des vorher ausgewählten Moleküls zu implantieren. Beispielsweise wird α₁-Antitrypsin typischerweise durch Leberzellen produziert; es kann demgemäß wünschenswert sein, eine α₁-Antitrypsin erzeugende Vorrichtung der Erfindung stromaufwärts der Leber einzubringen und zu verankern, beispielsweise in der Lebervene. Zusätzlich wird, wie oben erwähnt, Insulin durch Betazellen des Pankreas erzeugt; es kann demgemäß wünschenswert sein, eine Insulin produzierende Vorrichtung der Erfindung innerhalb der Portvene stromabwärts des Pankreas zu verankern.
Es sollte jedoch verständlich sein, dass auf Grundlage der klinischen Umstände ein Arzt auf einer Fall-zu-Fall-Basis die optimale Art und Weise der Einbringung der Vorrichtung ebenso wie den optimalen Ort zum Verankern der Vorrichtung bestimmen kann. Solche Urteile liegen innerhalb des Umfangs des Fachwissens des durchschnittlichen Arztes.
Die Ausübung der Erfindung wird vollständiger aus den nachfolgenden Beispielen verständlich, die hierin zu Veranschaulichungszwecken dargelegt sind und den Umfang der Erfindung keineswegs einschränken sollen.
Beispiel 1: Wachstum Erythropoietin erzeugender Zellen in Kultur
Erythropoietin ist ein Hormon, das in spezialisieren Zellen in der Niere produziert wird und das in den Kreislauf freigesetzt wird, wenn die Sauerstoffzufuhr zu diesen spezialisierten Zellen abnimmt. Unter hypoxischen Bedingungen, die sich aus einer Abnahme der Masse der roten Blutzellen ergibt, tritt eine Abnahme der Sauerstoffzufuhr zu den Geweben auf. Anschließend induziert die Abnahme des gelösten Sauerstoffgehaltes spezialisierte Nierenzellen, um die Erythropoietin-Produktion zu erhöhen und um dadurch eine erhöhte Produktion roter Blutkörperchen zu stimulieren. Nach Zurückkehren zu einer normalen Sauerstoffabgabe mit Normoxie oder erhöhter Masse an roten Blutkörperchen wird die erhöhte Produktion an Erythropoietin unterdrückt, was die klassische Rückkopplungsschleife schließt. Erythropoietin fehlt, obwohl es für die Homöostase der Masse der roten Blutkörperchen essentiell ist, in vielen chronischen Krankheiten, einschließlich beispielsweise des chronischen Nierenversagens, der rheumatoiden Arthritis, bei Autoimmunkrankheiten, chronischen Infektionen, dem humanen erworbenen Immundeffizienzsyndrom und Krebs.
Erythropoietin ist ein 36 kD Glycoprotein, das eine Polypeptidkette von 165 Aminosäuren Länge umfasst (Miyake et al. (1977), J. Biol. Chem. 252: 5558–5564). Das Gen für Erythropoietin wurde kloniert, in chinesische Hamster-Ovarzellen transfiziert und zur Erzeugung des aktiven Erythropoietins exprimiert (Lin et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7580–7585). Forscher haben eine humane Hepatom-abgeleitete Zelllinie isoliert, die als Hep G2 bezeichnet wird, die anschließend Erythropoietin in Reaktion auf variierende Sauerstoffspannungen in Kulturmedien produzierten und sezernierten (Goldberg et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7972–7976). Die Hep-G2-Zellinie wird im US-Patent Nr. 4 393 133 beschrieben, die hierin oben miteinbezogen wurde und ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, unter der Zugangsnummer ATCC HB 8065 erhältlich.
Um eine Sauerstoffmangel-Erythropoietin-Produktion zu demonstrieren, wurden Hep-G3-Zellen in Zellkulturschalen ausgesät und in einem RPMI-1640-Medium, das mit 10 % fötalem Kalbsserum ergänzt war, in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 15 % CO₂ bei einer Temperatur von 37° C gezüchtet. Nach 3–5 Tagen Kultur wurde die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium durch Verändern des Sauerstoffgehaltes der Sauerstoffzufuhr eingestellt. Unter den grundlegenden, mit Sauerstoff gut versorgten Bedingungen, enthielt die Zusammensetzung der Luftzufuhr ungefähr 21 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und 74 % Stickstoff. Unter hypoxischen Bedingungen enthielt die Zusammensetzung der Luftzufuhr 1–2 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und 93–94 % Stickstoff.
Nach Inkubation für 3 Tage wurde die Produktion an Erythropoietin unter sowohl gut mit Sauerstoff versorgten als auch hypoxischen Bedingungen unter Verwendung eines Quantikine^TM IVD^TM Erythropoietin Immunassay-Kits von R&D Systems (Minneapolis, MN) gemessen. Die Assays wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Unter den grundlegenden gut mit Sauerstoff versorgten Bedingungen produzierten Hep-G2-Zellen ungefähr 20 mU Erythropoietin/10⁶ Zellen über eine Zeitspanne von 24 Stunden. Unter hypoxischen Bedingungen nahm die Konzentration der Erythropoietin-Produktion auf ungefähr 100–200 mU/10⁶ Zellen über dieselbe Zeitspanne hinweg zu.
Beispiel 2: Wachstum von Erythropoietin erzeugenden Zellen in Hohlfasern
Patienten, die unter einer Erythropoietin-Mangelanämie leiden, beispielsweise Patienten, die unter einer Nierenkrankheit im Endstadium leiden, brauchen ungefähr 10.000 Einheiten rekombinantes humanes Erythropoietin pro Woche („Proceedings from ESRD Patient Management: Strategies for Meeting the Clinical and Economic Challenges", Nissenso, Hsg. (1993), in Am. J. Kid. Diseases 22(1), Ergänzung). Demgemäß kann der durchschnittliche Patient schätzungsweise ungefähr 1.000 Einheiten Erythropoietin pro Tag erfordern. Weiterhin kann geschätzt werden, unter der Annahme, dass unter stimulierten Bedingungen Hep G2 mehr als 200 mU/10⁶ Zellen über eine 24-stündige Zeitspanne erzeugen, geschätzt werden, dass ungefähr 10⁹ Zellen ausreichend Erythropoietin erzeugen, um geeignete Hämatokrit-Spiegel in einem solchen Patienten aufrechtzuerhalten.
Weil die Zellen der Erfindung in Hohlfasern bereitgestellt werden, ist es eine Aufgabe dieses Experiments zu demonstrieren, dass Erythropoietin erzeugende Zellen innerhalb einer Hohlfaser gezüchtet werden können, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen und/oder die Erythropoietin-Erzeugung zu beeinträchtigen.
Erythropoietin erzeugende Hep-G2-Zellen (ungefähr 4,5 × 10⁷/ml) wurden in Hohlfasern eingesät, insbesondere in Polysulfon-Hohlfasern (W.R. Grace and Associates) und in Celluloseacetat-Hohlfasern (Cellco, Inc.), mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 50 KiloDalton und Innendurchmessern von 210, 350 oder 510 μm. Die Hohlfasern wurden vorher mit Laminin oder Kollagen Typ IV innenverkleidet. Die in diesen Experimenten verwendeten Membranen wiesen Porengrößen auf, die es gelösten Stoffen ermöglichten, die Molekulargewichte von weniger als 50 kD aufwiesen, aus den Hohlfasern auszutreten und in das Kulturmedium einzutreten. Die Porengröße ermöglicht deswegen, dass Erythropoietin (36 KiloDalton) aus der Hohlfaser heraus und in das umgebende Medium diffundiert, während zur selben Zeit die Migration der Hep-G2-Zellen aus der Hohlfaser heraus vermieden wird. Nach dem Säen wurden die Hohlfasern in RPMI 1640 Kulturmedium angeordnet, das mit 10 % fötalem Kalbsserum ergänzt war, und die Zellen wurden unter gut mit Sauerstoff versorgten Bedingungen (21 % Sauerstoff) bei 37° C für 2–3 Wochen gezüchtet.
Nach 2–3 Wochen in Kultur wurde die Menge an Erythropoietin, die in das Medium sezerniert wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, untersucht. Zusätzlich wurden die Hohlfasern aus dem Kulturmedium entfernt und zur histologischen Überprüfung fixiert, um das Vorhandensein einer Zellnekrose in den Hohlfasern ebenso wie die Verteilung der zellulären Messenger-RNA (mRNA) zu überprüfen, die das rekombinante Erythropoietin kodiert, innerhalb der Mikroumgebung der Hohlfaser. Die Histologie der Zellen wurde unter Verwendung von histologischen Standardtechniken analysiert und die zelluläre Erythropoietin-mRNA-Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standard-in-situ-Hybridisierungsvorschrift („In Situ Hybridization Histochemistry" (1990), Chesselet, Hsg., CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Boston) eingeschätzt.
Die Hep-G2-Zellen, die in den Hohlfasern mit einem Innendurchmesser von 210 μm gezüchtet wurden, verblieben offensichtlich lebensfähig, weil die kritische Distanz zur Sauerstoffdiffusion klein genug war, um es den Zellen zu ermöglichen, ausreichend Sauerstoff und Nährstoffe aus dem Medium zu gewinnen. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass Hep-G2-Zellen, die in Fasern mit Durchmessern von 350 μm wuchsen, eine Nekrose im Zentrum der Hohlfasern zeigten. Es erscheint demgemäß, dass die Zellen in der Mitte des Hohlrohres zu dicht wurden, um ausreichend Nährstoffe und Sauerstoff aus dem umgebenden Kulturmedium zu gewinnen. Die Hep-G2-Zellen, die in Fasern mit Innendurchmessern von 510 μm gezüchtet wurden, litten nicht unter einer Nekrose, jedoch war die Zellschicht, die an der Innenwand der Hohlfaser befestigt war, ungefähr 150 μm dick. Es erscheint, dass die Distanz mit der Distanz korrelierte, über die ausreichend Nährstoffe und Sauerstoffe diffundieren kann, um eine Lebensfähigkeit der Hep-G2-Zellen aufrechtzuerhalten. Es scheint demgemäß, dass Hohlfasern mit Innendurchmessern von 510 μm in der Entwicklung von Vorrichtungen nützlich sein können, die Hep-G2-Zellen enthalten, weil die Zellen proliferieren können, bis Sauerstoff- und Nährstoff-Konzentrationen limitierend werden.
Beispiel 3: Sauerstoffregulierung der Erythropoietin-Produktion von Hep-G2-Zellen in Hohlfasern
Das Ziel dieses Experiments besteht darin, zu demonstrieren, dass die Erythropoietin-Genexpression und Proteinproduktion durch die Sauerstoffspannung des Mediums, das die Hohlfasern umgibt, reguliert werden kann. Dieses Experiment kann entweder unter Verwendung einzelner Hohlfasern oder von Hohlfaserbündeln durchgeführt werden, um zu messen, wie die Rate bzw. Geschwindigkeit der Erythropoietin-Produktion bezüglich der Konzentration an Sauerstoff variiert, die im Kulturmedium gelöst ist.
Einzelne Hohlfasern und gebündelte Hohlfasern variierender Durchmesser, beispielsweise von 210 μm oder 510 μm Kollagen-behandelter Polysulfon-Hohlfasern (Fresenius, USA, Wallnut Creek, CA) weisen einen Molekulargewichts-Cut-off von ungefähr 50 KiloDalton auf) werden mit Hep-G2-Zellen besät und unter optimalen Bedingungen, wie in Beispiel 2 bestimmt, wachsen gelassen. Nachdem das maximale Zellwachstum erreicht wurde, wird die Sauerstoffkonzentration des umgebenden Wachstumgsmedium durch verändernde Sauerstoffanteile der Luftzufuhr eingestellt. Die Zusammensetzungen der Luftzufuhr werden auf Sauerstoffkonzentrationen von 21 %; 5 %; 3 %; 2 % oder 1 % Sauerstoff modifiziert. Nach 24 Stunden wird die Menge an humanem Erythropoietin, das in das Medium sezerniert wird, unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens gemessen.
Die Zellen in jeder Hohlfaser werden auf ihre Zelllebensfähigkeit hin überprüft, um zu bestimmen, ob die Zelllebensfähigkeit unter Sauerstoff-armen Bedingungen innerhalb des umgebenden Mediums aufrechterhalten werden kann. Weiterhin wird der Kern der Zellen innerhalb der Hohlfaser fixiert und die Erythropoietin-mRNA-Konzentrationen im Kern durch Standard-in-situ-Hybridisierungsverfahren, die in Beispiel 2 verwendet wurden, bestimmt.
Es wird angenommen, dass unter Verwendung dieses Experimenttyps die Lebensfähigkeit der Zellen und die Produktion von Erythropoietin gemessen werden kann, um zu bestimmen, wieviele Zellen in eine Hohlfaser eingebracht werden können und wieviele Hohlfasern in einer Vorrichtung der Erfindung verwendet werden müssen, um die erwünschte Menge an Erythropoietin zu erzeugen. Sowohl einzelne als auch Bündel-Hohlfaserkonstrukte können getestet werden, um zu bestimmen, ob die Veränderung des Maßstabs nach oben die Sauerstoffabhängige Erythropoietin-Produktion der Zellen beeinträchtigt.
Beispiel 4: Implantation von Erythropoietin erzeugenden Zellen in vivo
Das Ziel dieses Experiments besteht darin, die Lebensfähigkeit von Hep-G2-Zellen im Anschluss an eine Implantation von Hohlfasern, die Hep G2 enthalten, in den Blutkreislauf eines Tieres zu bestimmen.
Experimentelle Hunde wurden mit Ketamin anästhesiert. Während sie anästhesiert werden und mittels einer fluoroskopischen Führung wird ein Titan Greenfield^® Vena cava Filter, beispielsweise ein solcher, der im US-Patent Nr. 5 059 205 beschrieben wird, mittels eines Katheters in eine Oberschenkelvene eingebracht. Wenn der Filter korrekt in der unteren Hohlvene positioniert ist, wie durch Fluoroskopie bestimmt, wird der Filter aus der Einfügungsvorrichtung ausgestoßen. Wenn er einmal ausgestoßen ist, sichern die Beinhaken des Filters den Filter beständig an der Wand der Hohlvene.
Danach werden Hep-G2-enthaltende Hohlfasern gemäß optimaler Bedingungen hergestellt, die in Beispiel 3 zu finden sind, zur intravenösen Implantation stromaufwärts des verankerten Greenfield Vena cava Filters. Die Hohlfasern werden zur Injektion vorbereitet, indem diese in ein Fibrin-Blutgerinsel eingebaut werden, das aus Blut erzeugt wurde, das aus dem Wirtstier entfernt wurde. Zusätzlich werden konventionelle Radio-opak-Platinmarkierungen in die Hohlfasern eingebaut, um eine geeignete Anordnung der Fasern sicherzustellen und um eine Wiedergewinnung der Fasern nach der Tötung des Tieres zu unterstützen. Danach wird das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, durch einen intravenösen Katheter stromaufwärts des verankerten Greenfields^® Vena cava Filters verabreicht. Das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, wird eingefangen und am Ort innerhalb der Inferior Vena cava durch den Filter zurückgehalten.
Danach wird die Filtereinfügungsvorrichtung aus dem Tier entfernt und das Tier wird sich von der Anästhesie erholen gelassen. Die Tiere werden anschließend zu variierenden Zeitintervallen nach der Implantation beobachtet. Nach einer postoperativen Periode, die sich von ungefähr 2 Wochen bis ungefähr 6 Monaten bewegt, werden die Tiere getötet und die Hohlfasern für eine Analyse der Zelllebensfähigkeit entnommen. Zusätzlich werden die Konzentrationen an Erythropoietin-mRNA in verschiedenen Mikroumgebungen innerhalb der Hohlfaser durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt.
Es wird angenommen, dass die implantierten Zellen innerhalb der Kapsel lebensfähig bleiben und dass nachweisbare Konzentrationen an zellulärer Erythropoietin-mRNA innerhalb der implantierten Zellen produziert werden.
Beispiel 5: Implantation Erythropoietin erzeugender Zellen in Tieren, die unter einer Erythropoietin-Mangelanämie leiden
Das Ziel dieses Experiments besteht darin, zu bestimmen, ob eine Vorrichtung der Erfindung, die lebensfähige Hep-G2-Zellen umfasst, im Anschluss an eine Implantation in ein Säugetier die mit einer Erythropoietin-Mangelanämie verbundenen Symptome lindern kann.
Experimentelle Hunde (1 und 2/3 nephroektomisierte Hunde) wurden mit Ketamin anästhesiert. Während sie anästhesiert wurden und mittels einer fluoroskopischen Führung wird ein Titan Greenfield^® Vena cava Filter mittels eines Katheters über die Oberschenkelvene in die untere Hohlvene eingeführt. Wenn der Filter korrekt innerhalb der unteren Hohlvene positioniert ist, wie durch Fluoroskopie bestimmt, wird der Filter aus der Einfügungsvorrichtung ausgestoßen und an der Wand der unteren Hohlvene verankert.
Danach werden in Hep G2 enthaltene Hohlfasern, die gemäß optimaler Bedingungen, zu finden in Beispiel 4, präpariert wurden, zur intravenösen Implantation stromaufwärts des verankerten Greenfield^® Vena cava Filters vorbereitet. Die Hohlfasern werden zur Injektion durch Einfügen von diesen in ein Fibrin-Blutgerinsel vorbereitet, das aus Blut erzeugt wurde, das aus dem Wirtstier entfernt wurde. Zusätzlich werden konventionelle radio-opake Platinmarkierungen in die Hohlfasern eingebracht, um eine geeignete Anordnung der Fasern sicherzustellen und eine Wiedergewinnung der Fasern nach dem Töten des Tieres zu unterstützen. Danach wird die Fibrin-Gerinsel enthaltenden Hohlfasern durch den intravenösen Katheter stromaufwärts des verankerten Greenfield^® Vena cava Filters verabreicht. Das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, wird eingefangen und am Ort innerhalb der unteren Hohlvene durch den Filter zurückgehalten.
Die Filtereinfügungsvorrichtung wird aus dem Tier entfernt und das Tier darf sich von der Anästhesie erholen. Danach werden die Hämatokrit- und Erythropoietin-Konzentrationen bei variierenden Zeitintervallen nach Implantation gemessen. Nach einer postoperativen Zeitspanne im Bereich von ungefähr 2 Wochen bis 6 Monaten werden die Tiere getötet und die Hohlfasern für eine Analyse der Zelllebensfähigkeit wiedergewonnen. Zusätzlich werden die Konzentrationen an Erythropoietin-mRNA in verschiedenen Mikroumgebungen innerhalb der Hohlfaser durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt. Kontrollexperimente, bei denen eine nicht-Zell-enthaltende Vorrich tung in einen nephrektomisierten Hund implantiert werden und bei denen eine Zellenthaltende Vorrichtung in einen normalen Hund implantiert wird, wird ebenfalls durchgeführt werden.
Es wird angenommen, dass nephrektomisierte Hunde, denen eine Erythropoietin erzeugende Vorrichtung der Erfindung eingepflanzt werden wird, erhöhte Erythropoietin- und Hämatokrit-Spiegel aufweisen werden und eine Aufrechterhaltung der Homeostase bezüglich nephrektomisierter Hunde, die mit einer nicht-Zell-enthaltenden Vorrichtung behandelt wurden. Es wird zusätzlich in Erwägung gezogen, dass die zellulären Erythropoietin-mRNA-Konzentrationen in Zellen höher sein werden, die in nephrektomisierte Hunde implantiert wurden, als nicht-nephrektomisierte Hunde.
Beispiel 6: Isolierung und Kultur Insulin produzierender Zellen in Kultur
Insulin ist ein 5,8 KiloDalton Peptidhormon, das zwei Polypeptidketten umfasst, die durch Disulfid-Brücken verbunden sind. Insulin wird durch spezialisierte Zellen (Beta-Zellen der Langerhans'schen Inseln) erzeugt, die sich im Pankreas befinden, in Reaktion auf zirkulierende Konzentrationen der Glukose im Blutstrom. In Reaktion auf erhöhte Glukose-Konzentrationen wird Insulin produziert, wodurch die Glycogen-Synthese in der Leber und in den Muskeln stimuliert wird. Das Unvermögen eines Säugetiers, Insulin in einer Menge zu produzieren, die ausreicht, um eine Euglykämie aufrechtzuerhalten, hat den Zustand der Diabetes mellitus zur Folge, der bis heute durch parenterale Verabreichung exogen produzierten Insulins gesteuert wurde.
Verfahren zum Isolieren und Kultivieren von Inselzellen und Beta-Zellen sind in der Technik sorgfältig dokumentiert worden. Siehe beispielsweise Lace et al. (1976), Diabetes 25: 484–493; Wollheim et al. (1990), Methods in Enzymology 192: 188–223; und Wollheim et al. (1990), Methods in Enzymology 192: 223–235. Beispielsweise wird in einem Kollagenasebasierten Verfahren Kollagen-vorbehandeltes pankreatisches Gewebe aus dem Donor-Säugetier ausgeschnitten. Nach Kollagenase-Behandlung werden die Langerhans'schen Inseln durch einen Filter mit ungefähr 400 μm Mesh-Löchern filtriert und Pflaster bzw. Kissen, die durch den Filter passen, werden in einem Rohr gesammelt, das Hank's-HEPES-Rinderserumalbumin(BSA)-Puffer enthält. Danach werden die Kissen von anderen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation nach Histopaque 1077 enthaltendem Gradient aufge trennt. Die Inselzellen werden geerntet und in einen Zellkulturschal übertragen, die Hank's-HEPES-BSA-Lösung enthält. Nach Resuspension und mit Hilfe eines Seziermikroskops werden die Inselzellen durch eine silikonisierte Pasteur-Pipette aufgepickt und auf ein Zentrifugenreagenzglas übertragen, das Hank's-Lösung enthält. Die Inselzellen werden durch Zentrifugation geerntet, in RPMI 1640 Gewebskulturmedium, das durch Antibiotika und 10 % fötales Kalbsserum ergänzt ist, resuspendiert und bei 37° C in einer Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält, inkubiert.
Nach Inkubation für 5 Tage wird die Konzentration der Insulinsekretion in das Medium unter Verwendung eines Radioimmunassay-Verfahrens „Sigma Immuno-file" gemessen, bereitgestellt von Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO, zur Verwendung mit dem Sigma-Produkt Nr. 18510. Es wird angenommen, dass die isolierten Inselzellen nachweisbare Konzentrationen von Insulin in dem Zellkulturmedium erzeugen und sezernieren.
Beispiel 7: Wachstum Insulin erzeugender Zellen in Hohlfasern
Es wurde unter Verwendung von Inselzellen, die in pankreatisierte Hunde implantiert wurden, bestimmt, dass ungefähr 2 × 10⁵ Inselzellen eine Endokrinfunktion in einem 20 kg schweren Hund aufrechterhalten können. Unter Annahme von 10⁴ Inselzellen pro Kilo wird geschätzt, dass ein 50 kg schwerer Mensch wahrscheinlich ungefähr 10⁵ Inselzellen erfordern würde, um die Endokrinfunktion aufrechtzuerhalten. Unter der Annahme, dass Hohlfasern mit einem Innendurchmesser von ungefähr 250 μm in der Vorrichtung der Erfindung verwendet wurden, und weiterhin, dass Inselzellkissen mit einem Durchmesser von 200 μm isoliert wurden, wird geschätzt, dass ungefähr 250 Inselzellen in eine 50 cm Hohlfaser eingefügt werden können.
Weil die Zellen der Erfindung in Hohlfasern bereitgestellt werden, war eine Aufgabe dieses Experiments, zu bestimmen, ob die Insulin produzierenden Inselzellen innerhalb einer Hohlfaser gezüchtet werden können, ohne die Zelllebensfähigkeit und/oder Insulin-Produktion zu verschlechtern.
Ungefähr 200 Inselzellen, die in Beispiel 6 isoliert wurden, werden in Hohlfasern ausgesät, insbesondere in Polysulfon-Hohlfasern (W.R. Grace and Associates) und in Celluloseacetat-Hohlfasern (Cellco, Inc.) mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 50 KiloDalton und einem Innendurchmesser von 210, 350 oder 510 μm. Die in diesen Experimenten verwendeten Membranen weisen Porengrößen auf, die es gelösten Stoffen mit Molekulargewichten von weniger als 50 kD und deswegen auch Insulin ermöglichen, dadurch hindurchzupassieren, während zur selben Zeit die Migration der Inselzellen aus der Hohlfaser hinaus vermieden wird. Es sollte erwähnt werden, dass, um Inselzellen zu erzeugen, die klein genug sind, um in die 210 μm Hohlfasern eingebracht zu werden, die durch Kollagenase-Behandlung erzeugten Inselzellen durch einen Filter mit einer Porengröße von ungefähr 190 μm filtriert werden sollten. Nach dem Aussäen werden die Hohlfasern in RPMI 1640 Kulturmedium angeordnet, das mit 10 % fötalem Kalbsserum ergänzt ist, und werden für 2–3 Wochen bei 37° C gezüchtet.
Nach 2–3 Wochen in Kultur wird die Menge an Insulin, die in das Medium sezerniert ist, wie in Beispiel 6 beschrieben, untersucht. Zusätzlich werden die Hohlfasern aus dem Kulturmedium entfernt und zur histologischen Überprüfung fixiert, um die Zelllebensfähigkeit innerhalb der Hohlfaser, ebenso wie die Verteilung der zellulären Insulinprotein-Konzentrationen innerhalb jeder Mikroumgebung der Hohlfaser zu überprüfen. Die Histologie der Inselzellen wurde unter Verwendung von histologischen Standardmethoden analysiert und die zelluläre Insulinprotein-Konzentrationen wurden unter Verwendung histologischer Standardmethodik analysiert und die zellulären Insulinprotein-Konzentrationen unter Verwendung immunhistochemischer Standardverfahren bestimmt (s. beispielsweise „Immunocytochemistry, Practical Applications in Pathology and Biology", Polak und Van Noorden, Hsg. (1983), Wright PSG, Bristol, London, Boston, und „Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology", Mayer und Walker, Hsg. (1983), Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto).
Es wird in Erwägung gezogen, dass die Inselzellen, die in den Hohlfasern eingeschlossen sind, lebensfähig bleiben und nachweisbare Konzentrationen an Insulin erzeugen.
Beispiel 8: Glukose-Regulation der Insulin-Produktion durch Inselzellen in Hohlfasern
Das Ziel dieses Experiments besteht darin, zu demonstrieren, dass die Insulin-Produktion durch die Konzentration an Glukose im Medium, das die Hohlfasern umgibt, reguliert werden kann. Dieses Experiment kann entweder unter Verwendung einzelner Hohlfasern oder Hohlfaserbündel durchgeführt werden, um zu messen, wie die Insulin-Geschwindigkeitsproduktion bezüglich der Glukosekonzentration des Kulturmediums variiert.
Einzelne Hohlfasern und gebündelte Hohlfasern mit variierenden Durchmessern, beispielsweise 210 μm oder 510 μm (Kollagen-behandelte Polysulfon-Hohlfasern (W.R. Grace and Associates) und Celluloseacetat-Hohlfasern (Cellco, Inc.), mit Molekulargewicht-Cut-off von ungefähr 20–50 KiloDalton) werden mit Inselzellen besät werden und unter optimalen Bedingungen wie in Beispiel 7 bestimmt wachsen gelassen. Nach 7 Tagen in Kultur wird das Kulturmedium durch frisches Kulturmedium ersetzt, das mit Glukose ergänzt ist, die sich im Bereich von ungefähr 100–500 mg/dl bewegt. Nach 24 Stunden wird die Menge an Insulin, die in das Medium sezerniert wird, gemessen, unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens.
Die Inseln in jeder Hohlfaser werden bezüglich ihrer Zelllebensfähigkeit überprüft, um zu bestimmen, ob die Zelllebensfähigkeit unter den Bedingungen aufrechterhalten werden kann, die In-vivo-Bedingungen simulieren. Weiterhin wird der Kern der Zellen innerhalb der Hohlfasern fixiert und die Insulinprotein-Konzentrationen im gesamten Kern werden durch immunhistochemische Standardverfahren bestimmt, beispielsweise des Typs, der in Beispiel 7 beschrieben ist.
Es wird angenommen, dass unter Verwendung dieses Typs an Experiment die Lebensfähigkeit der Zellen und die Produktion von Insulin gemessen werden kann, um zu bestimmen, wieviele Inselzellen in eine Hohlfaser eingebracht werden können, und wieviele Hohlfasern in einer Vorrichtung der Erfindung verwendet werden müssen, um die erwünschte Menge an Insulin zu erzeugen. Sowohl einzelne als auch gebündelte Hohlfaserkonstrukte können getestet werden, um zu bestimmen, ob die Änderung der Größenordnung die Glukose-abhängige Insulinproduktion in den Inselzellen beeinträchtigt.
Beispiel 9: Implantation von Insulin erzeugenden Inselzellen in vivo
Das Ziel dieses Experiments besteht darin, die Lebensfähigkeit von Inselzellen im Anschluss an die Implantation von Hohlfasern, die derartige Zellen enthalten, im Blutkreislauf eines Tieres zu bestimmen.
Experimentelle Hunde wurden durch Ketamin anästhesiert. Während des Anästhesierens und mittels eines fluoroskopischen Führung wird ein Titan Greenfield^® Vena cava Filter mittels eines Katheters in eine Oberschenkelvene eingebracht. Wenn der Filter korrekt innerhalb der unteren Hohlvene positioniert ist, wie durch Fluoroskopie demonstriert, wird der Filter aus der Einfugungsvorrichtung ausgestoßen. Einmal ausgestoßen, sichern die Beinhaken des Filters den Filter an der Hohlvenenwand sicher.
Dann werden Inselzell-enthaltende Hohlfasern, die gemäß optimaler Bedingungen hergestellt werden, die in Beispiel 8 zu finden sind, zur intravenösen Verabreichung hergestellt, und es erfolgt eine Implantation in den verankerten Greenfield^® Vena cava Filter. Die Hohlfasern werden zur Injektion vorbereitet, indem diese innerhalb eines Fibrin-Blutgerinsels eingebaut werden, das aus Blut hergestellt wurde, das aus dem Wirtstier entfernt wurde. Zusätzlich werden konventionelle radio-opake Platinmarkierungen in die Hohlfasern eingebaut, um eine geeignete Anordnung der Fasern sicherzustellen und um die Wiedergewinnung der Fasern nach dem Töten des Tieres zu unterstützen. Danach wird das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, durch den intravenösen Katheter stromabwärts des verankerten Greenfield^® Vena cava Filters verabreicht. Das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, wird eingefangen und am Ort innerhalb der unteren Hohlvene durch den Filter zurückgehalten.
Die Filtereinfügungsvorrichtung wird aus dem Tier entfernt und es wird dem Tier ermöglicht, sich von der Anästhesie zu erholen. Anschließend werden die Tiere zu variierenden Zeitintervallen nach der Implantation beobachtet. Nach einer postoperativen Periode im Bereich von ungefähr 2 Wochen bis ungefähr 6 Monaten werden die Tiere getötet und die Hohlfasern für eine Analyse der Zelllebensfähigkeit wiedergewonnen. Zusätzlich werden die Konzentrationen der Insulinprotein-Produktion in verschiedenen Mikroumgebungen innerhalb der Hohlfaser durch ein immunhistochemisches Verfahren bestimmt.
Es wird angenommen, dass die implantierten Inselzellen, die in der Kapsel eingekapselt sind, lebensfähig bleiben, und dass diese nachweisbare Konzentrationen einer zellulären Insulinproduktion innerhalb der implantierten Zellen zeigen.
Beispiel 10: Implantation Insulin erzeugender Zellen in Tiere, die unter einer Insulindefizienz bzw. -Mangeldiabetes leiden
Das Ziel dieses Experiments besteht darin, zu bestimmen, ob eine Vorrichtung der Erfindung, die lebensfähige Inselzellen umfasst, im Anschluss an die Implantation in ein Säugetier die mit einer Insulin-defizienten Diabetes mellitus verbundenen Symptome lindern kann.
Experimentelle (pankreatektomisierte) Hunde werden mit Ketamin anästhesiert. Während sie anästhesiert werden und mittels einer fluoroskopischen Führung mit einem Titan Greenfield^® Vena cava Filter mittels eines Katheters in eine Oberschenkelvene durch perkutane Punktur eingebracht. Wenn der Filter korrekt innerhalb der unteren Hohlvene positioniert wird, wie durch Fluoroskopie bestimmt, wird der Filter aus der Einfügungsvorrichtung ausgestoßen und an der Wand der unteren Hohlvene verankert.
Danach werden die Inselzell enthaltenden Hohlfasern, die gemäß optimaler Bedingungen, zu finden in Beispiel 9, hergestellt wurden, zur intravenösen Verabreichung und Implantation innerhalb des verankerten Greenfield Vena cava Filters präpariert. Die Hohlfasern werden zur Injektion durch deren Einbau in ein Fibrin-Blutgerinsel präpariert, das aus Blut produziert wurde, das aus dem Wirtstier entfernt wurde. Zusätzlich werden konventionelle radio-opake Platinmarkierungen in die Hohlfasern eingebaut, um eine geeignete Anordnung der Fasern sicherzustellen und um die Wiedergewinnung der Fasern nach dem Töten des Tieres zu unterstützen. Danach wird das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, durch den intravenösen Katheter stromaufwärts des verankerten Greenfield^® Vena cava Filters verabreicht. Das Fibrin-Gerinsel, das die Hohlfasern enthält, wird am Ort innerhalb der unteren Hohlvene durch den Filter eingefangen und zurückgehalten.
Die Filterinsertionsvorrichtung wird aus dem Tier entfernt und man lässt das Tier sich von der Anästhesie erholen. Danach werden Insulin- und Glukose-Konzentrationen zu variierenden Zeitintervallen nach der Implantation gemessen. Nach einer postoperativen Zeitspanne im Bereich von ungefähr 2 Wochen bis 6 Monaten werden die Tiere getötet und die Hohlfasern für eine Analyse der Zelllebensfähigkeit wiedergewonnen. Zusätzlich werden die Konzentrationen der Insulinprotein-Produktion in verschiedenen Mikroumgebungen innerhalb der Hohlfaser durch Immunhistochemie bestimmt. Pankreactomisierte Kontrollhunde wurden exakt in derselben Weise behandelt, außer dass die Insulin produzierenden Zellen aus der Vorrichtung entfernt wurden.
Es wird angenommen, dass experimentelle Hunde, denen die Insulin produzierenden Vorrichtungen implantiert wurden, eine aufrechterhaltende Euglykämie zeigen und geeignete Plasmainsulin-Konzentrationen aufweisen. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass die Kontrollhunde, denen eine Vorrichtung ohne Insulin produzierende Zellen implantiert wurden, keine Euglykämie zeigen und die geeigneten Plasmasinsulin-Konzentrationen nicht aufweisen.

Claims

Implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines vorgewählten Moleküls in den systemischen Kreislauf, das Folgendes in Kombination umfasst: (a) ein blutdurchlässiges Element (20), verankerbar an einer Innenwand (32) eines Blutgefäßes (30), wobei das blutdurchlässige Element (20) eine Vielzahl von Filamenten (22) umfasst, die, wenn sie an der Innenwand (32) des Blutgefäßes (30) verankert sind, es Blut im Gefäß ermöglichen, dadurch hindurchzutreten; und (b) eine Kapsel (10), in der lebensfähige Zellen (14) angeordnet sind, die das vorgewählte Molekül erzeugen und sezernieren, wobei die Kapsel (10), wenn sie in das Blutgefäß (30) eingebracht wird, im Blutgefäß (30) durch das blutdurchlässige Element zurückgehalten wird und die darin angeordneten Zellen (14) das vorgewählte Molekül erzeugen und in das Blut sezernieren, das durch die Kapsel (10) hindurchtritt.
Implantierbare Vorrichtung zur Abgabe eines vorgewählten Moleküls in den systemischen Kreislauf, wobei die Vorrichtung Folgendes in Kombination umfasst: (a) ein blutdurchlässiges Element (20), verankerbar an einer Innenwand (32) eines Blutgefäßes (30), wobei das blutdurchlässige Element (20) eine Vielzahl von Filamenten (22) umfasst, die, wenn sie an der Innenwand (32) des Blutgefäßes (30) verankert sind, das Hindurchtreten von Blut im Gefäß ermöglichen; und (b) eine Kapsel (10), die zumindest eine Hohlfaser mit darin angeordneten lebensfähigen Zellen (14) umfasst, wobei die zumindest eine Hohlfaser aus einer semipermeablen Membran hergestellt ist, die Poren aufweist und wobei die Poren ermöglichen, dass Nährstoffe in die Kapsel (10) eindringen, um die Lebensfähigkeit der Zellen (14), die darin angeordnet sind, aufrechtzuerhalten, jedoch eine nicht-ausreichende Größe aufweisen, um die Passage der Zellen aus der Kapsel heraus zu ermöglichen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das blutdurchlässige Element (20) einen Kopfteil (26) und eine Vielzahl von elastischen Beinteilen (22) umfasst, die sich daraus verankerbar an der Innenwand (32) des Blutgefäßes (30) erstrecken.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei: (a) das blutdurchlässige Element (20) ein anti-Migrationsfilter für Blutgerinsel ist; und/oder (b) die Kapsel (10) dazu geeignet ist, stromaufwärts des blutdurchlässigen Elementes (20) angeordnet zu werden.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die semipermeable Membran (12) Poren aufweist, die: (a) eine ausreichende Größe aufweisen, um das Austreten des vorgewählten Moleküls dadurch hindurch zu ermöglichen, jedoch nicht ausreichend sind, um das Hindurchtreten von Zellen (14) dadurch hindurch zu ermöglichen; oder (b) es gelösten Stoffen von weniger als 150 kD ermöglichen, dadurch hindurchzutreten, wobei wahlweise die Poren so dimensioniert sind, dass ein Mittel im Blut ausgeschlossen wird, das für die Lebensfähigkeit der Zelle (14) nachteilig ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Poren so dimensioniert sind, dass das Hindurchtreten von Antikörpern dadurch hindurch vermieden wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5–6, wobei die semipermeable Membran ein Material umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyurethanisocyanat, Polyalginat, Celluloseacetat, Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Cellulosenitrat, Polysulfon, Polystyrol, Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polyacrylonitril, Polyamid, Polymethylmethacrylat, Polyethylenoxid, Polytetrafluorethylen und Gemischen hiervon besteht.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen (14) eukaryotische Zellen oder gentechnisch veränderte Zellen sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das vorgewählte Molekül ein Protein ist, beispielsweise ein Hormon, beispielsweise Erythropoietin oder Insulin.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapsel eine Vielzahl vorgewählter Moleküle enthält.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das vorgewählte Molekül aus der Kapsel (10) in Reaktion auf einen Reiz im Blut freigesetzt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das vorgewählte Molekül aus der Kapsel (10) kontinuierlich freigesetzt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die Zellen: (a) eine Vielzahl vorgewählter Moleküle produzieren; oder b) das vorgewählte Molekül in Reaktion auf einen Reiz im Blut produzieren; oder (c) das vorgewählte Molekül konstitutiv produzieren; oder (d) Erythropoietin in Reaktion auf einen Reiz (beispielsweise in Reaktion auf eine verringerte Sauerstoffbeförderungskapazität des Blutes) erzeugen; oder (e) Insulin in Reaktion auf einen Reiz erzeugen (beispielsweise in Reaktion auf den Glukose-Spiegel im Blut).
Kapsel (10) zur Verwendung in einem Blutgefäß (30), wobei die Kapsel dazu geeignet ist, durch ein blutdurchlässiges Element am Ort gehalten zu werden, das eine Vielzahl von an einer Innenwand des Blutgefäßes (30) verankerten Filamenten umfasst, wobei die Kapsel (10) Folgendes umfasst: (a) eine Vielzahl semipermeabler Hohlfasern (16), die Zellen (14) enthält, die ein vorgewähltes Molekül erzeugen und sezernieren, wobei die Fasern (16) Poren einer Größe definieren, die ausreicht, um die Passage des vorgewählten Moleküls dadurch hindurch zu ermöglichen, jedoch nicht ausreichend ist, um eine Passage der Zellen dadurch hindurch zu ermöglichen und wobei die Fasern zur Bildung eines Bündels verbunden sind.
Kapsel nach Anspruch 14, wobei: (a) die Hohlfasern (16) durch zwei Endabdeckungen (40) gebündelt sind; oder (b) die Hohlfasern (16) einen Innendurchmesser von weniger als ungefähr 1000 μm aufweisen (beispielsweise einen Innendurchmesser von weniger als ungefähr 500 μm); oder (c) die Zellen (14) eukaryotische Zellen sind (beispielsweise Säugetierzellen); oder (d) das vorgewählte Molekül ein Protein ist (beispielsweise ein Hormon, beispielsweise Insulin oder Erythropoietin).