DE69633432T2

DE69633432T2 - Schutzgruppen und ihre verwendung in einem verfahren zur oligonukleotid-synthese

Info

Publication number: DE69633432T2
Application number: DE69633432T
Authority: DE
Inventors: Stephen Scaringe; H. Marvin CARUTHERS
Original assignee: University of Colorado
Current assignee: University of Colorado
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: EP0775149A1; DK0775149T3; EP0775149A4; WO1996041809A1; ATE277067T1; US5889136A; JPH10511691A; JP2008138005A; DE69633432D1; PT775149E; JP4138000B2; US6008400A; ES2229271T3; EP0775149B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Schutzgruppen in organischer Synthese und im Speziellen die Verwendung dieser Verbindungen als Nukleosid schützende Gruppen. Noch spezieller werden die schützenden Gruppen verwendet in der ortsspezifischen schrittweisen Synthese von Oligonukleotiden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Desoxyribonucleinsäure ("DNA") und Ribonucleinsäure ("RNA") sind zentral für die Verarbeitung von Informationen in lebenden Zellen. DNA ist die permanente Informationsspeichereinheit, ähnlich zur Festplatte eines Computers. RNA ist das Mittel der Zellen zum Übertragen und Exprimieren dieser Information von der DNA, wenn es notwendig ist, wie der RAM in einem Computer. Beide Nucleinsäurestrukturen sind langkettige Moleküle, die aus Monomeruntereinheiten bestehen, wobei die Sequenz und Reihenfolge dieser das Mittel des Kodierens (A) darstellen, gerade so wie die Reihenfolge von Buchstaben in einem Satz eine spezielle Bedeutung aufweist. Es gibt vier monomerbildende Blöcke in DNA und RNA (Desoxyadenosin und Riboadenosin sind in B illustriert). Im Vergleich dazu verwendet die englische Sprache 26 Buchstaben oder bildende Blöcke, um einen Satz zu bilden. DNA muss in der Lage sein, diese Information permanent zu speichern und ist folglich relativ stabil. RNA soll die Information temporär übertragen und wird folglich relativ leicht durch Enzyme und extreme pH-Bedingungen oder andere extreme chemische Zustände abgebaut. Obwohl menschliche Zellen etwa 6 Billionen Basenpaaren an Desoxyribonucleinsäure ("DNA") enthalten, ist es sehr bedeutsam, Oligonukleotide sowie kurzkettige DNA-Stränge von 20–30 Basenlänge zu synthetisieren. Vor 1982 war die Synthese von Oligonukleotiden ein relativ zeitintensiver Prozess, der üblicherweise das Fachwissen von Chemikern benötigte. Das Verfahren zum Ausbilden einer Oligonukleotidkette benötigt eine Serie von Reaktionen, um die Kette um ein Monomer zu einer Zeit zu verlängern. Diese Serie von Reaktionen wird für jedes sequenzielle Monomer wiederholt, das zur wachsenden Oligonukleotidkette hinzugefügt werden muss.
Konventionelle Phosphoramiditchemie, so genannt nach einer funktionellen Gruppe auf den monomerbildenden Blöcken, wurde erstmals Anfang der 80er Jahre entwickelt, wie dies in US 4,415,732 offenbart ist. Diese funktionelle Gruppe stellte ein relativ effizientes Mittel zum Verbinden der die wachsende Kette aufbauenden Blockmonomere zur Verfügung. Die Festphasensynthese, wie von Caruthers et al. in US 4,458,066 offenbart, war eine weitere Verbesserung für die Oligonukleotidsynthese. In dieser Technik wird die wachsende DNA-Kette an eine unlösliche Matrix angeknüpft über einen langen organischen Linker, welcher das Wachstum der DNA-Kette im löslichen Zustand erlaubt, und zwar in einem Solvens, in welchem die Matrix platziert wird. Die aufgelöste, aber immer noch mobilisierte DNA-Kette kann dabei mit Reagenzien in dem umgebenden Lösungsmittel zur Reaktion gebracht werden, und erlaubt, das leichte Wegwaschen werden von Reagenzien von der festen Matrix, an welche das Oligonukleotid angebunden ist. Diese signifikanten Fortschritte in der Phosphoramiditchemie und in der Festphasensynthese öffneten den Weg, kommerzielle DNA-Synthese für das durchschnittliche Biologielabor realisierbar zu machen. Techniken, wie das Sanger-Sequenzieren, welches auf synthetischer DNA aufbaut, sind essenziell für das Human Genome Sequenzierungsprojekt. Andere neue Techniken, z. B. die polymerase Kettenreaktion ("PCR") wurden entwickelt, aufgrund der fertigen Verfügbarkeit von synthetischer DNA. PCR ist eine der prinzipiellen Techniken im forensischen Untersuchen und bei DNA-Fingerabdrücken.
Wie aus B ersichtlich ist, gibt es einige Stellen auf den Nukleosiden von ähnlicher chemischer Natur, beispielsweise – OH- oder Hydroxylgruppen. Wie aus A ersichtlich ist, müssen die Monomereinheiten in DNA- und RNA-Oligonukleotiden in einer ortsspezifischen Art und Weise angebunden sein. Dies verlangt das Funktionalisieren einer Stelle entweder auf der wachsenden Kette oder auf der dazukommenden Base für das Anknüpfen des dazukommenden monomerbildenden Blocks zur wachsenden Kette. Um das dazukommende Monomer davon abzuhalten, an der falschen Stelle anzubinden, müssen die falschen Stellen blockiert werden, wohingegen die korrekte Stelle frei für die Reaktion gehalten wird. Dies verlangt die Verwendung dessen, was als Schutzgruppe bezeichnet wird. Schutzgruppen sind Verbindungen, die zeitweise an eine po tenziell reaktive Stelle angebunden werden, um diese gegen eine Reaktion zu schützen. Die Schutzgruppe muss stabil während den besagten Reaktionen sein, muss auch eventuell entfernt werden, um die Originalstelle freizugeben. Die Synthese von Oligonukleotiden verlangt das Schützen mehrerer Stellen und spezielle Stellen müssen entschützt werden, wohingegen andere geschützt bleiben. Diese Schutzgruppen, gruppiert zusammen zu einem Satz, werden als orthogonale Schutzgruppen bezeichnet.
Phosphoramiditchemie und Festphasen-Oligonukleotidsynthese-Protokolle verwenden Dimethoxytrityl-Schutzgruppen für die 5'-Hydroxylgruppen von Nukleosiden (siehe B in Bezug auf die Nummerierung 1', 2', 3', 4' und 5'). Eine Phosphoramidfunktionalität wird verwendet an der 3'-Hydroxylposition. Die Phosphoramiditsynthese schreitet im Allgemeinen von der 3'-Stelle zur 5'-Stelle der Ribose- oder Deoxyribose-Zuckerkomponente des Phosphoramiditnukleosids (siehe C für eine schematische Repräsentation dieser Technologie). Das 5'-Ende der wachsenden Kette wird mit 3'-Phosphoramidit der dazukommenden Base gekoppelt, um ein Phosphittriesterintermediat auszubilden (das 5'-Hydroxyl der zugegebenen Base wird durch einen Dimethoxytritylgruppe geschützt, so dass nur eine neue Base zur wachsenden Kette zu einer Zeit hinzugefügt wird). Jegliche unreagierten 5'-Hydroxyle werden "gekappt", um die Synthese dieser Kette zu stoppen, welche um eine Base zu kurz am Ende der Synthese wäre. Das Triesterintermediat wird einer Iodoxidation unterzogen nach jeder Kopplungsreaktion, um ein stabileres Phosphotriesterintermediat auszubilden. Ohne Oxidation würde eine unstabile Phosphittriesterverknüpfung unter den Säurebedingungen der nachfolgenden Syntheseschritte abgeschnitten werden. Die Entfernung oder Entschützung der 5'-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe der neu hinzugegebenen Base wird typischerweise realisiert durch die Reaktion in saurer Lösung, um eine freie 5'-Hydroxylgruppe zu erzeugen, welche mit dem nächsten geschützten Nukleosidphosphoramidit gekoppelt werden kann. Dieser Prozess wird für jedes neu hinzugegebene Monomer wiederholt, bis die gewünschte Sequenz synthetisiert wird.
Die Phosphoramidittechnik war ein signifikanter Fortschritt auf dem Gebiet. Nichts desto trotz sind einige Probleme mit den Phosphoramiditprotokollen assoziiert. Diese Probleme sind die folgenden. Alle Chemikalien, die in der Oligonukleotidsynthese verwendet werden, müssen mit der Dimethoxytrityl-Schutzgruppe kompatibel sein, und diese Umstände schließen die Verwendung von inkompatiblen Reagenzien aus, wie auch von in kompatiblen Schutzgruppen zum Schützen der 2'-Position während der RNA-Synthese. Die Entfernung der Dimethoxytritylgruppe ist reversibel und konsequenterweise muss die abgeschnittene Dimethoxytritylgruppe sorgsam von der Reaktion entfernt werden oder gequentscht werden, um optimale Ausbeuten zu erhalten. Ein weiteres Problem sind verschiedene Produktverunreinigungen aufgrund der Vielzahl von Nebenreaktionen, die die saure Entschützung des 5'-Hydroxyls während eines jeden Zyklus der Basenzugabe begleiten. Die sauren Bedingungen des Entschützens führen zur Verunreinigung während der Synthese und insbesondere zur Verunreinigung von N-geschütztem Adenosin.
Versuche, andere Schutzgruppen und Reagenzien einzusetzen sind weitgehend gescheitert und zwar im Hinblick auf das Ausräumen des Verunreinigungsproblems. Aprotische Säurebedingungen, die nicht zu Verunreinigungen führen, arbeiten gut nur für Oligonukleotidsequenzen, die weniger als ungefähr 12 Einheiten lang sind. Die Verunreinigungsrate ist insbesondere sensitiv im Hinblick auf die Auswahl der Schutzgruppe für das N-6 des Adenosins. Phenoxyacetylamid-Schutzgruppen verlangsamen die Verunreinigungsrate im Vergleich zu Standardbenzoylgruppen, um einen Faktor von etwa zwei, jedoch bleibt die Verunreinigung ein Problem für lange Synthesen und Reaktionen von großer Dimension. Amidin-Schutzgruppen verlangsamen die Verunreinigung um einen signifikanten Faktor von 20, jedoch hat sich die Verwendung von Amidinen in der Oligonukleotidsynthese in der kommerziellen Weitverbreitung nicht durchgesetzt, obwohl sie bereits seit über 10 Jahren beschrieben wurde.
Ein signifikanter Nachteil der Verwendung von 5'-Dimethoxytritylgruppen für die Synthese von Oligonukleotiden ist, dass eine solche Verwendung die Synthese von Oligonukleotiden mit säurelabilen Rückgraden oder Funktionalitäten ausschließt. Modifizierte oder unnatürliche Rückgrade werden oft verwendet, um Stabilität auf Oligonukleotide zu übertragen, welche Enzymen ausgesetzt werden können, die Oligonukleotide abbauen. Beispielsweise können Antisense-Oligonukleotide, welche Diamidate, Boranophosphate oder säurelabile Basen inkorporieren, in pharmazeutischen Anwendungen ihr Versprechen halten, jedoch schließen Dimethoxytritylsynthesetechniken, welche Dimethoxytrityl-Schutzgruppen verwenden, die Herstellung dieser Materialien aus, dadurch, dass sie die Verwendung von sauren Entschützungsbedingungen während der Oligonukleotidsynthese benötigen.
Die Verwendung der Dimethoxytritylgruppe verhindert des Weiteren die Verwendung anderer säurelabiler Schutzgruppen. Dies ist wichtig für die RNA-Synthese, da weitere Hydroxylgruppen an der 2'-Position (siehe B) geschützt werden müssen. Die Verwendung der Dimethoxytritylgruppe an der 5'-Position verhindert daher erfolgreich die Verwendung der säurelabilen Gruppen für das 2'-Schützen während der RNA-Synthese.
RNA ist schwieriger zu synthetisieren relativ gesehen zu DNA. Dies liegt nicht nur daran, dass zusätzliche orthogonale Schutzgruppen verwendet werden müssen, die kompatibel mit allen anderen Schutzgruppen sein müssen, sondern auch an der Instabilität der RNA, wie bereits zuvor erwähnt. Die Signifikanz dieses Sachverhalts in puncto RNA-Oligonukleotidsynthese ist, dass die 2'-Hydroxyl-Schutzgruppen vorzugsweise die Schutzgruppen sein sollten, die zuletzt entfernt werden, was unter milden, nicht degenerativen Bedingungen durchgeführt werden muss.
RNA ist insbesondere schwierig zu synthetisieren mit konventionellen 5'-Dimethoxytrityl-Schutzgruppen aufgrund der Schwierigkeit des Auffindens von passenden 2'-Schutzgruppen. Eine t-Butyldimethylsilylether-Schutzgruppe wird derzeit an der 2'-Position verwendet in Verbindung mit der 5'-Dimethoxytritylgruppe, jedoch fehlt es diesem Prozess an Verlässlichkeit. Die Kopplungsausbeuten sind schlecht und Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie (high pressure liquid chromatography, "HPLC")-Analyse von RNA-Produkten zeigt signifikante unerklärbare Verunreinigungen. Dieser Verunreinigungen vergrößern signifikant die Schwierigkeit des Isolierens des gewünschten Oligonukleotids. Die vollständige Entschützung der t-Butyldimethylsilylgruppe vom Oligonukleotid ist für lange Sequenzen fraglich. Das Entschützen wird in organischen Lösungsmitteln durchgeführt, was die Isolierung der wasserlöslichen RNA aus der Entschützungsreaktion weiter kompliziert. Die Synthese der geschützten Ribonukleotide verwendet für die Oligonukleotidsynthese ist auch ziemlich kostenintensiv und neigt dazu, Verunreinigungen zu erzeugen, welche die Synthese von natürlicher RNA erschweren. Als ein Ergebnis all dieser Komplikationen ist die Verwendung von 5'-Dimethoxytritylgruppen in Verknüpfung mit einer 2'-t-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe weder verlässlich noch effizient.
Eine weitere Wahl der 2'-Schützen ist die Acetalklasse von Schutzgruppen. Sie können unter milden wässrigen sauren Bedingungen entfernt werden. Dies ist gewünscht als ein schlussendlicher RNA-Entschützungsschritt, da die RNA in Wasser löslich ist, wird leicht gegen Wasser isoliert und ist nur leicht unstabil unter den Bedingungen des Entschützens für einige oder mehrere labile Acetale. Die Verwendung von Acetalen an der 2'-Hydroxylposition wurde in Verbindung mit einer 5'-Dimethoxytritylgruppe versucht, jedoch müssen sehr stabile Acetale verwendet werden mit der säurelabilen Dimethoxytritylgruppe. Die Entfernung von Acetalen, welche unter den Dimethoxytrityl-Entschützungsbedingungen stabil sind, benötigt stark saure Bedingungen, welche die RNA abbauen. Es wurde versucht, Acetale mit alternativen 5'-Schutzgruppen einzusetzen, welche unter nicht sauren Bedingungen entschützt werden, beispielsweise Leuvinyl, jedoch ohne signifikanten Erfolg.
Die Oligonukleotidsynthese, gemäß dem H-Phosphonat-Protokoll, wird einen einzelnen Oxidationsschritt am Schluss des Synthesezyklusses erlauben. Die Kopplungsausbeuten sind jedoch weniger effizient denn diejenigen für die Phosphoramiditchemie und die Oxidation benötigen längere Zeiten und härtere Reagenzien als die Amiditchemie.
Es bleibt ein Bedürfnis, eine alternative 5'-Schutzgruppe zu finden, welche die Verwendung von säurelabilen Verknüpfungsagenzien, Reagenzien und Schutzgruppen erlaubt, die inkompatibel mit Dimethoxytrityl sind, verbesserte Prozessverunreinigungen sowie Reduktion von Produktausbeuten ohne signifikante Vergrößerung in den Zykluszeiten. Eine alternative 5'-Schutzgruppe würde des Weiteren einen signifikanten Vorteil für die RNA-Synthese bieten, nämlich, dass die Verwendung von besser geeigneten 2'-Schutzgruppen erlaubt wird.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, geeignete geschützte Monomere und Verfahren für die verbesserte Synthese von RNA bereitzustellen.
Es ist des Weiteren eine Aufgabe dieser Erfindung, geeignete Schutzgruppen für die verbesserte Synthese von DNA bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung erreicht die oben genannten und weitere Aufgaben über die neuen Schutzgruppen. Diese Erfindung beschreibt auch Verfahren, die neuen Schutzgruppen auf RNA- und DNA-Synthese anwenden. Des Weiteren können diese Schutzgruppen noch allgemeiner in irgendeiner ortsspezifischen, schrittweisen Synthese von Polymeren zusätzlich zu Nukleotidpolymeren verwendet werden. Noch allgemeiner können diese Schutzgruppen in jeglicher Art organischer Synthese eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung in ihrem breitesten Sinne schließt Materialien und Verfahren zur Verwendung in ortsspezifischer schrittweiser Synthese ein, welche zu Polymerketten führen, beispielsweise wie in der Ausbildung von Oligonukleotiden und Oligosacchariden. Das Syntheseprotokoll beginnt mit der Herstellung einer ersten Kette einschließend zumindest ein substituiertes Monomer. Dieser Herstellungsschritt schließt vorzugsweise das Anbinden des substituierten Monomers an eine unlösliche Polystyrolmatrix ein. Das substituierte Monomer wird entschützt, falls notwendig um eine reaktive Stelle zu exponieren. Ein zweites geschütztes Monomer wird bereitgestellt, das eine Silyl-Schutzgruppe und/oder eine Orthoester-Schutzgruppe an speziellen Orten aufweist. Das zweite geschützte Monomer wird mit der entschützten Stelle der Kette umgesetzt, um eine verlängerte Monomerkette auszubilden. Die Schutzgruppe wird am Verlängerungspunkt dieser Kette entschützt, um eine reaktive Stelle zu exponieren, die fertig ist mit dem dritten substituierten Monomer mit Silyl- und/oder Orthoester-Schutzgruppen verknüpft zu werden. Das Syntheseverfahren, das oben offenbart wird, wird solange wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht wird.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist gerichtet auf ein geschütztes Monomer zur Anwendung in der schrittweisen Oligonukleotidsynthese, das eine Molekularformel aufweist, die folgendes umfasst:
wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Orthoester-Schutzgruppe, Ethern, Alkylethern, Estern, Halogenen, geschützten Aminen und geschützten Hydroxylgruppen; R'' umfasst eine Phosphoramiditgrupppe; R₁, R₂ und R₃ schließen zumindest einen Alkoxy- oder Siloxysubstituenten ein; und BASE ist eine Nucleinsäurebase.
Eine speziell bevorzugte Ausführungsform schließt die Verwendung einer 5'-Silyl-Schutzgruppe und einer 2'-Orthoester-Schutzgruppe in der Synthese mit fester Matrix von Ribooligonukleotiden via Phosphoramiditchemie ein. In dieser Ausführungsform schließt die erste Nukleotidkette eine erste Monomereinheit ein. Die Zugabe jedes weiteren Monomers in der Kette benötigt einen Zyklus von Reaktionen. Während jedes Zyklus wird das zweite geschützte Phosphoramiditmonomer an die exponierte reaktive Stelle der ersten Kette gekoppelt, um eine Phosphittrieesterverknüpfung über das 5'-Ende der Kette und das 3'-Ende des zugegebenen Monomers zu erzielen. Der Zyklus von Schritten, um das zweite geschützte Monomer bereitzustellen und an die Kette anzubinden, das zweite Monomer, das nun an die Kette angebunden ist, zu entschützen, und das dritte Monomer an die entschützte Stelle der Kette zu koppeln, werden für jedes weitere Monomer, das zur Kette hinzugegeben wird, wiederholt. Die Synthese kann verwendet werden, um spezifische Sequenzen von DNA oder RNA oder funktionelle Homologe davon zu konstruieren.
Die Bezeichnung "funktionelle Homologe" ist dabei definiert, so dass sie Polymere bezeichnet, die in gewisser Art und Weise von natürlichen vorkommenden Substanzen gemäß den Fachliteraturdefinitionen abweichen, sich aber für den Fachmann auf dem Gebiet als fungierend in einer verwandten Art und Weise verstehen. Diese nicht natürlichen Oligonukleotide können radiogelabelte Nukleotide, Nukleotide mit angebundenen Chromophoren, Zucker, welche von Ribose oder Desoxyribose verschieden sind, Oligomere mit alternativen Phosphatverknüpfungen, z. B. Methylphosphonate, Thiophosphate, Boranophosphate, fluoridierte Ribose (oder andere Halogene), Alkylether, substituierte Zucker, anders substituierte Zucker und basenartige Materialien mit Kohlenstoff und nicht-kohlenstoff-heterozyklischen Gruppen, beispielsweise 5'-Bromouridin, einschließen. Des Weiteren verstehen sich konventionelle Basen so, dass sie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil einschließen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur DNA- und RNA-Synthese durch ortsspezifische schrittweise Polymerisation, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer ersten Monomerkette einschließlich zumindest ein substituiertes Monomer, das eine erste Silyl-Schutzgruppe aufweist;
b) Beseitigen der Schutzgruppe von besagter substituierter Monomerkette durch Entfernen von besagter erster Silyl-Schutzgruppe, um eine Kette frei von Schutzgruppen zu erhalten;
c) Bereitstellen eines zweiten substituierten Monomers gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 9; und
d) Reagieren von besagtem zweiten substituiertem Monomer mit besagter von der Schutzgruppe befreiter Kette, um eine verlängerte Monomerkette zu erhalten.

Ein bevorzugter Verfahrensschritt der Oligonukleotidsynthese schließt die Zugabe eines Fluoridions, um die Silyl-Schutzgruppe zu entfernen, ein. Diese Alternative für die wiederholte 5'-Entschützungs-Bedingungen führte zu höheren Verfahrensausbeuten und geringeren Nebenprodukten. Als ein Ergebnis wird die Aufreinigung des Volllängenprodukts drastisch vereinfacht durch die substanzielle Abwesenheit von Nebenprodukten, welche sehr eng mit dem Volllängenprodukt verwandt sind. Das Koppeln eines geschützten Phosphoramiditmonomers mit dem entschützten Ende der wachsenden Oligonukleotidkette wird durch die Verwendung eines geeigneten Katalysators realisiert, beispielsweise Tetrazol, was zu einer Phosphittriesterbrücke führt, die stabil unter Fluorid-Entschützungsbedingungen ist. In Kontrast dazu benötigen konventionelle Phosphoramidit-Oligonukleotid-Synthesereaktionen saure Entschützungsbedingungen, welche die Phosphittriester-Verknüpfungen abbauen. Dieser Umstand des konventionellen Prozesses benötigt einen zusätzlichen Oxidationsschritt in jedem Zyklus, um einen unstabilen Phosphittriester in einen stabileren Phosphotriester überzuführen. Im vorliegenden Fall wird der Oxidationsschritt durch die Abwesenheit von säurelabilen Dimethoxytrityl-Schutzgruppen vermieden und die Oxidation der gesamten Kette der Oligonukleotidsequenz wird in einem Schritt am Abschluss der Synthese durchgeführt.
Die 5'-Silylgruppe schließt ein zentrales Siliziumatom mit vier angebundenen Substituenten ein. Diese Substituenten können unabhängig voneinander sein oder verknüpft miteinander, z. B., um einen Ring auszubilden. Einer dieser Substituenten ist das geschützte 5'-Nukleosidhydroxyl. Zumindest einer der drei anderen Substituenten muss eine Siloxy- oder eine Alkoxygruppe sein. Vorzugsweise sind alle drei Substituenten Si-loxy- oder Alkoxygruppen (jegliche Kombination von Siloxy- und Alkoxygruppen ist erlaubt).
Die RNA-Synthese benötigt eine zweite Schutzgruppe, lokalisiert an der 2'-Position des Riboserings, zusätzlich zu einer 5'-Schutzgruppe. Diese orthogonalen Schutzgruppen sind so beschaffen, dass die 5'-Schutzgruppe durch Fluoridionen entfernt wird, oder durch andere nicht saure Reagenzien und die 2'-Schutzgruppe unter sauren Bedingungen entfernt wird. Mehr speziell verwendet die vorliegende Erfindung zur RNA-Synthese eine Orthoester-Schutzgruppe an der 2'-Position und eine Silylgruppe an der 5'-Position. Die Silylgruppe ist so wie im vorigen Paragraph beschrieben. Der Orthoester ist vorzugsweise ein nicht-zyklischer Orthoester. Die Orthoestergruppe besteht aus drei Etherbrücken, wobei eine davon eine 2'-Hydroxylgruppe des geschützten Nukleosids ist. Die anderen zwei Substituenten des Orthoesters können irgendwelche organische Gruppen sein. Vorzugsweise sind diese beiden Substituenten identisch. Darüber hinaus weisen diese Substituenten gewisse elektronenziehende Fähigkeiten auf. Die Verwendung eines Orthoesters als eine 2'-Schutzgruppe erlaubt, dass die letztendlichen Ribooligonukleotid-Entschützungsbedingungen mild und essenziell nicht abbauend für das RNA-Produkt sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die beigefügten Zeichnungen, die enthalten sind und einen Teil der vorliegenden Beschreibung darstellen, illustrieren die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung, um die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
A stellt eine DNA-Kette und eine RNA-Kette dar, die jeweils fünf Monomeruntereinheiten lang sind und jedes der vier natürlich vorkommenden Desoxyribo nukleoside und der vier natürlich vorkommenden Ribonukleoside, wobei die 5'- und 3'-Enden gelabelt sind, einschließt;
B stellt die Strukturen von 2'-Desoxyadenosin und Riboadenosin dar und illustriert die Nummerierung des Zuckerrings;
C stellt eine schematische Repräsentierung des Zyklus der Reaktionen, verwendet in Standard-Oligonukleotid-Synthesestrategien dar;
1 stellt ein Nukleosid dar, das eine Silylether-Schutzgruppe gebunden an das 5'-Kohlenstoffatom aufweist. Daneben sind multiple Substituenten, die kombiniert werden können, um die Silylether-Schutzgruppe gemäß der vorliegenden Erfindung auszubilden, dargestellt;
2 stellt ein Flussdiagramm dar, welches die Synthese der Precursor-Verbindungen, dargestellt in 1, beschreibt, gefolgt von der Phosphoramiditumwandlung der Precursor-Verbindungen, dargestellt in 1;
3 stellt einen detaillierten Reaktionsprozess dar, welcher einen Abschnitt des Prozesses, dargestellt in 2, ausführt;
4 stellt ein verallgemeinertes Flussdiagramm zur Verwendung von Silyl-Schutzgruppen zur Polymersynthese dar;
5 stellt die chemischen Reaktionen, involviert in der Synthese eines Oligonukleotids gemäß der vorliegenden Erfindung dar;
6 stellt eine Figur dar, welche ein 2'-geschütztes Vorläufernukleosid repräsentiert zur Anwendung in der Synthese von RNA gemäß der vorliegenden Erfindung;
6A stellt verschiedene Substituenten zur Anwendung in Kombination mit dem Precursor von 6 dar;
7 stellt ein schematisches Prozessflussdiagramm für die Synthese von Orthoester geschützten Precursorn gemäß der vorliegenden Erfindung dar;
8 stellt einen Hochdruckflüssigkeitschromatographie ("HPLC")-Spur eines Polythymidin-Reaktionsprodukts, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung dar;
9 stellt eine HPLC-Spur ähnlich wie diejenige von 8 dar, repräsentiert aber Ergebnisse einer polyadenylierten Sequenz;
10 stellt eine Spur wie diejenige von 8 dar, repräsentiert aber Ergebnisse einer polyadenylierten Sequenz, hergestellt gemäß der Dimethoxytrityl-Schutzgruppenchemie;
11 stellt eine HPLC-Spur ähnlich zu derjenigen von 8 dar, repräsentiert aber Ergebnisse erhalten von (rU)₉T;
12 stellt eine HPLC-Spur ähnlich zu derjenigen von 8 dar, repräsentiert aber Ergebnisse erhalten von (rC)₉T; und
13 stellt eine HPLC-Spur ähnlich zu derjenigen von 8 dar, repräsentiert aber Ergebnisse erhalten von (rA)₉T.
BESTE ART UND WEISE ZUM AUSFÜHREN DER ERFINDUNG
Mit 5'-O-Silylether geschützte Nukleoside werden synthetisiert, die geeignet sind für die Synthese von Oligonukleotiden mit fester Matrix. Diese 5'-Silyl-Schutzgruppe wird in Verbindung mit säurelabilen Orthoestern an der 2'-Position von Ribonukleosiden verwendet, um Ribooligonukleotide via Phosphoramiditchemie zu synthetisieren. Bis-(2-butyn)orthoester werden für Uridin und N-Benzoyl-Cytidin verwendet. Bisphenoxyethylorthoester werden für N-Benzoyl-adenosin und N-Isobutyryl-guanosin verwendet. Diese Schutzgruppen und die assoziierten Syntheseverfahren benötigen weniger Zeit als vorliegende Verfahren zur Synthese von Ribooligonukleotiden. Die letztendlichen Entschüzungsbedingungen in dieser Synthese sind wässrige Puffer von niedrigem pH für eine hinreichende Periode an Zeit bei 5 bis 95°C. Diese Bedingungen bauen nicht signifikant das RNA-Produkt ab. Das letztendliche Produkt wird hergestellt mit besseren Ausbeuten und einer besseren Qualität, d. h. mit weniger Nebenprodukten im Vergleich zu den derzeitigen 5'-O-Dimethoxytritylnukleosid basierten RNA-Synthesemethoden. Wenn sie für die Synthese von DNA-Oligonukleotiden verwendet wird, ermöglicht die 5'-Silyl-Schutzgruppe die erfolgreiche Synthese von Oligonukleotiden ohne verunreinigende Nebenprodukte, assoziiert mit herkömmlichen 5'-O-Dimethoxytritylnukleosid basierten Synthesen. Alle Synthesen werden ohne Oxidation von Phosphittriester-Zwischenprodukten realisiert, bis zu einem letztendlichen Oxidationsschritt.
Eine 5'-OH-Nukleosid-Schutzgruppe realisiert vorzugsweise verschiedene Funktionen bei der Oligonukleotidsynthese. Die Gruppe reagiert selektiv mit dem 5'-OH und ermöglicht dabei eine Synthese von hoher Ausbeute des geschützten Nukleosidmonomers. Die Gruppe ist vorzugsweise stabil unter Amiditsynthesebedingungen, Lagerungbedingungen und Oligonukleotidsynthesebedingungen. Schnelle Entfernung, d. h. mit in weniger als 1 Minute, der Gruppe von einem Matrix gebundenen Oligonukleotid ist äußerst wünschenswert, um die Synthesezeiten zu beschleunigen und die verlängerte Exposition des wachsenden Oligonukleotids gegenüber Reagenzien zu vermindern. Die Oligonukleotidsynthese wird verbessert, falls die 5'-Schutzgruppe sichtbar während dem Entschützen ist, z. B. von der Addition eines Chromophorsilylsubstituenten. Des Weiteren dürfen die Kosten nicht hinderlich sein. Die essenziellen Charakteristika schließen Stabilität unter allen Synthese- und Lagerungsbedingungen ein sowie die schnelle Entfernung.
Die Auswahl von Schutzgruppen wird durch konkurrierende Anforderungen der essenziellen Charakteristika der Stabilität und des leichten Entfernens verkompliziert sowie durch das Bedürfnis, diese miteinander konkurrierenden Ziele auszugleichen. Die meisten Substituenten, welche die Stabilität verbessern, lassen auch die Zeit anwachsen, die benötigt wird, alle Gruppen zu entfernen, jedoch der Anstieg in der Stabilität und/oder 5'-Selektivität vergrößert korrespondierend den Grad der Schwierigkeiten in der Entfernung der Gruppen.
Die Zugabe von Alkoxy- und Siloxy-Substituenten zu den 5'-Silylether-Schutzgruppen vergrößert die Empfänglichkeit der Schutzgruppen für ein Fluorid-Kappen der Silyletherbindungen. Das Vergrößern der sterischen Hinderung des Substituenten konserviert die Stabilität, lässt aber nicht die Fluoridlabilität in gleichem Maße sinken. Eine geeignete Balance von Substituenten auf der Silylgruppe ermöglicht es, einen Silylether zu einer praktisch verwendbaren 5'-OH-Nukleosid-Schutzgruppe zu machen.
In dem Kontext der Phosphoramidit-Oligonukleotidsynthese jedoch scheitert das einfache Ersetzen einer 5'-O-Silylgruppe mit einer 5'-O-Dimethoxytritylgruppe und das Verändern der Entschützungsbedingungen dabei, eine praktisch realisierbare Oligonukleotidsynthese bereitzustellen. Mehrere nicht offensichtliche und neue Modifikationen sind für das Verfahren von Nöten. Die 5'-Silylgruppe wird am effizientesten via Fluoridionen entfernt. Fluoridionenquellen können jegliche Art von Fluoridionen einschließen, beispielsweise aus anorganischen Fluoridsalzen, wie z. B. Cäsiumfluorid und Kaliumfluorid bis hin zu organischen Salzen wie z. B. Tetrabutylammoniumfluorid. Ein Kronenetherkatalysator wird vorzugsweise eingesetzt in Kombination mit den anorganischen Fluoridsalzen, um ihren Effekt zu optimieren. Tetrabutylammoniumfluorid wird üblicherweise die bevorzugte Fluoridquelle sein. Jedoch ergab das Tetrabutylammoniumfluorid-Entschützen einer 5'-O-Silylgruppe während der Oligonukleotidsynthese inkonsistente Ergebnisse mit vergleichsweise niedrigeren Gesamtlängenausbeuten und mit Produkten, welche mit Verunreinigungen kontaminiert waren. Es wurde auch entdeckt, dass die am meisten bevorzugten Fluoridionenquellen für diese Erfindung Aminhydrofluoride waren. Die Wahl der Schutzgruppen zur Anwendung auf die Phosphittriester und Phosphotriester hat Auswirkungen auf die Stabilität des Triesters gegenüber Fluor. Methyl-schützen des Phosphotriesters oder Phosphittriesters hat sich als stabilisierend für die Verbrückung gegen Fluoridionen herausgestellt und als die Prozessausbeute verbessernd. Das Methyl-Schützen erlaubt auch die Synthese von Oligonukleotidsequenzen ohne jeden Zyklus zu oxidieren. Die Oxidation des Phosphittriesterprodukts in der Phosphoramiditchemie ist schneller und erzeugt weniger ungewünschte Nebenprodukte als dies die einschrittige Oxidation der H-Phosphonatchemie tut. Deshalb ermöglicht die Verwendung von fluorlabilen Schutzgruppen mit Phosphittriester-Verknüpfungen die Verwendung von milderen Oxidationsbedingungen und höheren Prozessausbeuten im Vergleich mit der H-Phosphonatchemie.
Darüber hinaus mussten noch weitere Modifikationen gemacht werden. Festphasige Synthesematrizen aus Standardkontrollporenglas können nicht in Zusammenhang mit Fluorid-labilen 5'-Silyl-Schutzgruppen eingesetzt werden, da das Glas durch Fluorid abgebaut wird mit einer signifikanten Reduktion in der Menge des Gesamtlängenprodukts. Fluorid-stabile Polystyrol basierte Matrizen sind bevorzugt.
Ribonukleoside weisen einen reaktiven 2'-Hydroxylsubstituenten auf. Im Gegensatz dazu weisen die Desoxynukleoside keinen reaktiven 2'-reaktiven Substituenten auf. Dementsprechend ist es gewünscht, die reaktive 2'-Position in RNA mit einer Schutzgruppe zu schützen, welche kompatibel mit einer 5'-O-Silyl-Schutzgruppe ist, z. B. eine die gegenüber Fluorid stabil ist. Orthoester wurden entwickelt hinsichtlich Stabilität unter allen Synthesebedingungen und Arbeitsreaktionen und diese Orthoester wurden erst endgültig in einem schlussendlichen Säureentschützungsschritt entfernt, was den RNA-Abbau minimierte.
Weitere Modifikationen mussten für die RNA-Synthese durchgeführt werden. Der Standard-Phosphoramidit-Kopplungskatalysator Tetrazol stellte sich als nicht adäquat für diese Erfindung heraus, da sich relativ geringere Prozessausbeuten bestimmten. Stärkere Reagenzien, beispielsweise S-Ethyltetrazol, p-Nitrophenyltetrazol, werden bevorzugt eingesetzt, um die Prozessausbeute zu vergrößern.
1 präsentiert das Nukleosidmonomer der Formel (I) und verschiedene Substituenten, die an diese Formel (I) angeheftet werden können. In Formel (I) ist R' vorzugsweise ein 2'-Orthoester-Schutzgruppe im Fall der RNA-Synthese (welche die 2'-Ribosehydroxygruppe schützt), H in dem Fall der DNA-Synthese, oder irgendeine kompatible Gruppe, beispielsweise ein Ether, Alkylether, Ester, Halogen, geschütztes Amin bzw. eine geschützte Hydroxylgruppe; R'' kann irgendeine Gruppe einschließen als einen Precursor für das letztendliche Monomer, jedoch ist R'' vorzugsweise eine Phosphoramiditbrücke und mehr bevorzugt ist R'' eine Phosphoramiditbrücke, wie sie in Formel (1A) gezeigt wird, wobei R₄ jegliche Art von kompatiblem organischen Liganden sein kann; R₁, R₂ und R₃ schließen zumindest einen Alkoxy- oder Siloxysubstituenten ein und können irgendeinen der Substituenten (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I) und (K) darstellen, oder Verbindungen von ähnlichem Molekulargewicht und sterischer Hinderung.; BASE ist eine Nucleinsäurebase, die enthalten kann Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, N-geschütztes Adenin, Guanin und Cytosin oder funktionelle Homologe davon. Die entsprechenden Abschnitte von Formel (I) schließen einen zentralen Ribosebasierten Zucker ein, der eine Nucleinbase verknüpft mit der 1'-Riboseposition aufweist, eine Hydroxygruppe, verbunden mit der 3'-Riboseposition und einen Silylether verknüpft mit der 5'-Riboseposition. Die unterbrochene Linie, angebunden an jeden der Substituenten (A) bis (K) gibt einen Ort für das Anbinden an die 5'-Siliziumgruppe an.
Wie oben angegeben repräsentiert Formel (I) einen Precursor für das Phosphoramiditnukleosid zur Anwendung in der Oligonukleotidsynthese, wenn R' keine Phosphoramiditgruppe darstellt. Eine Phosphoramiditgruppe ist vorzugsweise an den Precursor angebunden, wenn R'' eine Hydroxygruppe ist. Nachfolgend zur Synthese der 5'-O-Silyl-Schutzgruppe einschließend R₁, R₂ und R₃ wird die 3'-OH-Gruppe vorzugsweise in eine Phosphoramiditbrücke konvertiert und zwar durch konventionelle Protokolle unter Verwendung von Bisdiisopropylaminomethoxyphosphin, wie für die Fachleute auf dem Gebiet verständlich sein wird. Die vorliegende Synthesetechnik ist des Weiteren vollständig kompatibel mit anderen Typen der Phosphoramiditverbrückungen, wie z. B. diejenigen beschrieben in US 4,415,732 , die hier per Referenz im gleichen Ausmaß, als ob sie hier vollständig offenbart wäre, eingeschlossen ist. Formel (I) einschließend jegliche Kombination von R₁-, R₂- und R₃-Substituenten A–K, kann aus kommerziell verfügbaren Precursorn synthetisiert werden, oder synthetisiert werden wie unten beschrieben oder wie in der Literatur beschrieben.
2 stellt ein exemplarisches Flussdiagramm dar, das die Synthese des Precursors von Formel I darstellt (wobei R'' OH ist), gefolgt von der Phosphoramiditumwandlung des Precursors der Formel I. Schritt P20 schließt das Bereitstellen einer Verbindung R_x korrespondierend mit einer Silylgruppe ein mit einem oder mehreren der gewünschten Substituenten, R₁, R₂ und R₃. Diese Verbindung wird vorzugsweise über kommerzielle Quellen bereitgestellt, wobei beispielsweise R₁ eine Alkylgruppe wie mit den Substituenten A und D ist (siehe 1), oder durch Reaktion von SiCl₄ mit einem Alkohol, wie für die Substituenten B und K, oder durch Reagieren von SiCl₄ mit dem Natriumsalz von Si-lanol oder Alkohol, wie für den Substituenten E.
Schritt P22 schließt das Reagieren der Verbindung R_x mit einem geeigneten Alkohol oder Silanol ein. Das Produkt kann aufgereinigt werden oder verwendet werden wie es ist oder mit geringeren Aufreinigungen.
Schritt P24 schließt das Wiederholen der Schritte P20 und P22 ein bis hin zu noch einer Wiederholung für eine dreifache Substitution des Reaktions-Zwischenprodukts. Jeder wiederholte Zyklus von Schritt P20 kann ein neues R_x korrespondierend zu irgendeinem der Substituenten A–K von 1 bereitstellen oder R_x kann gleich bleiben. Es ist bevorzugt, dass es zumindest einen Alkoxy- oder Siloxysubstituenten, ausgewählt aus den Substituenten A–K einschließt, da diese Substituenten die Fluoridlabilität des 5'-Silylethers verstärken.
Schritt P26 schließt das Substituieren das Silylgruppe, abgeleitet von Schritt P24 anstelle des Wasserstoffs, verknüpft an das 5'-Sauerstoff des Nukleosids von Formel (I) ein. Die Substitutionsreaktion wird vorzugsweise durch die Zugabe des Imidazolkatalysators ermöglicht und ist ortsspezifisch für das 5'-Hydroxyl. Eine Nukleosidgruppe einschließend eine spezifische BASE wird vorzugsweise mit der Silylgruppe in der Gegenwart des Imidazolkatalysators kombiniert und reagiert bei Raumtemperatur über eine oder mehrere Stunden.
Schritt P28 schließt das Anbinden einer Phosphoramidit-funktionellen Gruppe an das 3'-Hydroxyl des Silyl-geschützten Produkts, abgeleitet aus Schritt 26, ein. Ein geeignetes Lösungsmittel, beispielsweise wasserfreies Dichlormethan wird mit dem Silylgruppenprodukt kombiniert und einer überschüssigen Menge von Bis-diisopropylmethoxyphosphin in der Gegenwart einer katalytischen Menge von Tetrazol. Die Phosphorylierungsreaktion führt zu einer ortsspezifischen Phosphoramiditsubstitution des Wasserstoffs, verknüpft an den 3'-Sauerstoff der Formel (I).
BEISPIEL 1
Synthese von 5'-O-Silyl-geschütztem 3'-O-Diisopropylmethoxyphosphinthymidin
3 stellt einen detaillierten Reaktionsprozess, einschließend die Schritte P30 bis P36 dar, welche auch die Schritte P20 bis P26 von 2 ausführen. In diesem Prozess werden Bis-trimethylsiloxy-dichlorsilan und Bis-tritylglycerin separat synthetisiert, kombiniert und anschließend verwendet, um das 5'-OH eines 2'-Dioxythymidinnukleosids zu schützen. Das verwendet Reagens in diesem Beispiel kann aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen erhalten werden, z. B. von Aldrich Chemical in Milwaukee, Wisconsin.
Schritt P30 schließt die Synthese von Bis-trimethoxy-dichlorsilan ein.
Trimethylsilanol ("TMSO-OH") wurde durch Zugabe von 10,4 mol an Hexamethylsilazan (84 ml) zu einer gerührten Lösung einschließend 0,4 mol an Eisessig (22,8 ml) in 400 ml an destilliertem Wasser bei 0°C ausgebildet. Die wässrige Phase wurde entfernt und zweimal mit 100 ml an Ether gewaschen. Die Waschungen mit Ether wurden mit der Silanolphase vereinigt und bei –20°C gelagert, um den Überschuss an Wasser auszufrieren. Die wässrige Lösung wurde abdekantiert und über Kaliumcarbonat für 75 min getrocknet, aufgenommen in 750 ml an Ether, durch einen 0,45 μm-Filter passiert und in der nächsten Synthese verwendet. NMR-Resonanzanalyse gab die Ausbildung von Disiloxan in einer Menge eines Bereichs von etwa 3 bis 4 mol% in Bezug auf das Produkt an.
Natriumtrimethylsilanat ("TMSO-Na⁺") wurde hergestellt durch Reagieren des Trimethylsilanols in einer Etherlösung mit 0,88 mol (21,1 g) an Natriumhydrid, suspendiert in 500 ml anhydritischem Tetrahydrofuran-Lösungsmittel unter Bedingungen energischen Rührens bei 0°C. Das Rühren wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt, nachdem die Trimethylsilanollösung per Kanüle zugegeben worden war. Die reagierte Lösung wurde durch Celite filtriert zur späteren Verwendung. Die Disiloxankonzentration in der Lösung wurde auf 17% durch eine NMR-Analyse bestimmt.
Trichlortrimethylsiloxysilan wurde hergestellt durch Reagieren eines Aliquots der Natriumtrimethylsilanlösung, enthaltend 0,663 mol an Natriumtrimethylsilanat mit 0,597 mol (68,5 ml) an Tetrachlorsilan. Die Trimethylsilanlösung wurde per Kanüle zu einer mechanisch gerührten Lösung an Tetrachlorsilan in einer Menge von 400 ml an Ether bei 0°C zugegeben. Das Salz wurde durch Zentrifugation (8000 rpm für 10 bis 15 min) ent fernt, und die Lösung wurde abdekantiert. Der Ether wurde im Vakuum abgezogen und das Produkt wurde bei Atmosphärendruck destilliert. Die Destillierung begann bei einer Öltemperatur von 122°C und schritt bis zu einer Öltemperatur von 185°C voran, um das Dichlor-bis-trimethylsiloxysilan einzusammeln. Das Produkt enthielt 87,91 mol% Trichlortrimethylsiloxysilan, 5,86% Dichlor-bis-trimethylsiloxysilan und 6,22% Disiloxan. Das Rohprodukt wurde keiner weiteren Aufreinigung unterzogen.
Bis-trimethylsiloxydichlorsilan wurde hergestellt durch Reagieren von 0,3681 mol an Trichlortrimethylsilan in dem rohen Reaktionsprodukt mit einem 1,1 molaren Äquivalent von Trimethylsilanol, hergestellt wie oben. Das Trimethylsilanol wurde per Kanüle zu einer mechanisch gerührten Lösung zugegeben, die das rohe Trichlortrimethylsilan-Reaktionsprodukt enthielt und 1,47 mol (205 ml) an Triethylamin in 1000 g an Ether bei 0°C. Die Lösung wurde filtriert unter Argon und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Produkt wurde fraktionell destilliert über Calciumhydrid bei 60°C und einem Druck von 4 mm HG, um das Bis-trimethylsiloxydichlorsilan-Reaktionsprodukt zu erhalten und Schritt P30 zu vervollständigen.
Schritt P32 enthielt die Synthese von 1,3-O-Bistrityletherglygerol.
Das 1,3-O-Bistrityletherglygerol wurde hergestellt durch Zugabe von 0,304 mol (28 g) an trockenem Glycerol zu 0,608 mol (169,52 g) an Triphenylmethylchlorid in 400 ml an Pyridinlösungsmittel bei 0°C. Die Reaktion schritt bis zur Vervollständigung über Nacht bei Raumtemperatur voran. Das Produkt wurde aufgereinigt auf Silicagel nach einer wässrigen Aufarbeitung und dann kristallisiert, um Schritt P32 zu vervollständigen.
Schritt P34 enthielt das Vereinigen der Produkte von Schritt P30 und P32.
Ein 12 mmol (6,919 g) Aliquot des 1,3-O-Bistrityletherglygerol-Reaktionsprodukts, gemischt mit 40 mmol (2,723 g) an Imidazol wurde mit Pyridin-Lösungsmittel vermischt und gemeinsam eingedampft. Eine 40 ml Menge an Pyridin wurde zugegeben und die Lösung wurde auf 0°C in einem Eisbad gekühlt. Die resultierende Lösung wurde schnell gerührt, während 10 mmol (2,772 g) an Bis(trimethylsiloxy)dichlorsilan tropfenweise über 1 Minute Zeitraum hinzugegeben wurden. Die Lösung wurde aus dem Eisbad entfernt und bei Raumtemperatur 15 min gerührt, um Schritt P34 zu vervollständigen.
Schritt P36 enthielt die Zugabe des Produktes von Schritt P34 zu einem Thymidinnukleosid.
Eine 12 mmol (2,904 g) Menge an 2'-Deoxythymidin wurde mit Pyridin zusammen eingedampft und dann in 24 ml Pyridin resuspendiert. Die Silyllösung von Schritt P34 wurde tropfenweise über 30 min zu der schnell gerührten Thymidinlösung bei 0°C zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde fortgesetzt. Dünnschichtchromatografie unter Verwendung eines Lösungsmittels, einschließend eine 40 : 60 Mischung an Hexan : Ethylacetat zeigte an, dass die Reaktion vollständig verlaufen war. Destilliertes Wasser (1 ml) wurde hinzugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Eine wässrige Aufarbeitung gefolgt von Säulenaufreinigung mit 600 ml Silica mit einem Eluierungslösungsmittel, umfassend eine 50 : 50 Mischung an Hexan : Ethylacetat führte zu 4,88 g eines Produkts mit 1023,05 g/mol Molekulargewicht, d. h. 4,77 mmol bei einer 47%ige Ausbeute. Das Produkt wurde aus einer Mischung von Ethylacetat und Pentan kristallisiert, um eine Spur von 3'-O-Silylnukleosid-Verunreinigung zu entfernen und Schritt P36 zu vervollständigen.
Das Produkt, erhalten von Schritt P36, wurde zur Reaktion gebracht, um ein 5'-O-Silylgeschütztes 3'-O-Diisopropylmethoxyphosphinthymidin auszubilden. Ein 1,783 mmol (1,824 g) Aliquot des 5'-O-Silylthymidin-Reaktionsprodukts des Schritts P36 wurde mit 654 μl an Bis-diisopropylmethoxyphosphin in 20 ml an wasserfreiem Dichlormethan aufgelöst, um eine Reaktionsmischung herzustellen. Eine Menge von 0,5 M an Tetrazol wurde mit 1,7 ml Acetonitril vermischt und zur Reaktionsmischung unter Rühren für 8 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben. Dünnschichtchromatografie unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung von 65 : 35 : 1 an Hexan : Ethylacetat : Triethylamin zeigte an, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Eine wässrige Aufarbeitung gefolgt von Silicagel-Aufreinigung stellte eine 67% Produktausbeute des 5'-Silylgeschützten phosphorilierten Nukleosids bereit.
Tabelle 1 stellt die Fluoridlabilität-Ergebnisse dar, die von verschiedenen Verbindungen erhalten wurden, welche gemäß Beispiel 1 aus den verschiedenen Substituenten von 1 erzeugt wurden. Tabelle 1 wird unmittelbar unter 1 dargestellt, um eine einfache Referenz zu selbiger herzustellen. So leitet sich beispielsweise die erste Formulie rung in Tabelle 1 von einer Kombination an Substituenten A, A und B als R₁, R₂ und R₃ ab. 1 und Tabelle 1 enthalten Substituenten, von denen aktuell herausgefunden wurde, dass sie im Labor funktionieren, sollen aber nicht als exklusive Liste aller Substituenten, die funktionieren werden, verstanden werden. Darüber hinaus kann jeglicher kompatible Alkoxy- oder Siloxy-Substituent verwendet werden, der ein Molekulargewicht und/oder eine sterische Ausdehnung aufweist, die den Substituenten von 1 und Tabelle 2 nahe kommen. Die Anzahl von bedeutsamen Substituenten ist sehr groß und wird das Einbringen eines Chromophors erlauben, beispielsweise einer Dansylgruppe, und zwar in eine Silylgruppe, die mit einer der R_x-Positionen von Formel 1 korrespondiert. Die zweite Spalte schließt einen Vergleich der Zeit bis zu einer Vervollständigung der Reaktion ein, die die Fluorid-labile Silylgruppe entfernte. Die Zeit für eine vollständige Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatografie aus einer Lösung bestimmt, die die entsprechenden Precursor von Formel (1) einschloss, und zwar in einem Tetrahydrofuran-Lösungsmittel, gemischt mit einer molaren Fraktion des Precursors und fünf äquimolaren Fraktionen an Tetrabutylammoniumfluorid. Die Precursor mit kürzeren Reaktionszeiten sind mehr bevorzugt, wobei der I-I'-E,E-Precursor am meisten bevorzugt ist.
4 stellt ein verallgemeinertes Diagramm des Prozesses zur Verwendung von Silyl-Schutzgruppen in der Synthese von Polymeren in Form eines schematischen Blocks dar. Dieser Prozess bietet sich für jegliche Art der Polymersynthese an, jedoch enthalten bevorzugte Ausführungsformen die Synthese von Zuckerketten, wie z. B. Oligosacchariden, Oligonukleotiden und dergleichen.
Schritt P38 schließt die Herstellung einer ersten Kette ein, die zumindest ein Monomer mit einer Silyl-Schutzgruppe enthält. Diese Kette ist vorzugsweise eine Nukleotidkette oder ein funktionelles Homolog davon. Der Herstellungsschritt enthält vorzugsweise das Anbinden der ersten Kette an eine unlösliche Matrix, wie z. B. eine Polystyrolmatrix. Die Verwendung einer Polystyrol-basierten Matrix ist am meisten bevorzugt aufgrund der Tendenz des Fluoridions, Glas anzugreifen und abzubauen. Die Reaktion kann auch in einer Lösung auftreten, ohne eine festphasige Matrix, jedoch verstärkt diese Art der Reaktion die Schwierigkeit im Aufreinigen des letztendlichen Produkts. In der Oligonukleotidsynthese ist die Matrix vorzugsweise an das 3'-Ende des ersten Nukleotids gebunden. Die Silyletherbindung wird dementsprechend an der 5'-Riboseposition für eine 3'- nach 5'-richtungsspezifische Synthese lokalisiert sein. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass eine rückwärts gerichtete Richtung (5' nach 3') in der Synthese möglich ist, jedoch die rückwärts gerichtete Synthese weniger bevorzugt ist aufgrund von erhöhten Kosten assoziiert mit kommerziell verfügbaren Reagenzien.
Schritt P40 schließt das Entschützten der ersten Kette durch Entfernen der Silyl-Schutzgruppe ein. Dieser Schritt schließt vorzugsweise das Fluorid assistierte Brechen der Silylether (Si-O)-Bindung ein.
Schritt P42 schließt das Bereitstellen eines Monomers ein, das eine Silyl-Schutzgruppe aufweist.
In der Oligonukleotidsynthese ist das Monomer vorzugsweise ein Phosphoramiditnukleosid mit einer 5'-Silyl-Schutzgruppe. In der RNA-Synthese weist das Nukleosid vorzugsweise eine zweite Schutzgruppe auf, die einen Orthoester an der 2'-Riboseposition aufweist. Diese Monomere, aie auch die Monomere verwendet, um die erste Kette von Schritt P38 herzustellen, können gemäß des verallgemeinerten Prozesses von 2 synthetisiert werden.
Schritt P44 schließt das Koppeln oder Reagieren des Monomers von Schritt P42 mit der entschützten Kette von Schritt P40 ein. Die Kopplungsreaktion folgt im Allgemeinen etablierten konventionellen Protokollen für Phosphoramiditkopplungsreaktionen mit der Ausnahme, dass substituierte Tetrazolkatalysatoren vergrößerte Ausbeuten in einigen RNA-Synthesen bereitstellen können und in vorteilhafter Art und Weise als ein Ersatz für den konventionellen Tetrazolkatalysator eingesetzt werden können. Die Kopplungsreaktion wird nicht vollständig in jedem Zyklus sein, da einige entschützte Ketten nicht mit dem Phosphoramiditnukleosid von Schritt 42 reagieren werden. Dementsprechend wird der Kopplungsschritt vorzugsweise durch Kappen der unreagierten Ketten vervollständigt, um die Herstellung der Quasi-Volllängenketten zu vermeiden, denen einige Nukleotide zur wahren Gesamtlängensequenz fehlen. Die gekürzten Ketten werden später leicht bei der Säulenaufreinigung entfernt. Das Kappen wird vorzugsweise durchgeführt durch Zugabe, kommerziell erhältliche Standardmischungen einschließend Acetanhydrid ("Ac₂O") und N-Methylimidazol oder Dimethylaminopyridin ("DMAP").
Schritt P46 schließt das Wiederholen der Schritte P38, P40, P42 und P44 ein, bis die Anzahl von Zyklen hinreichend ist, um eine Kette in einer gesamten Länge einschießend die gewünschte Nukleotidsequenz bereitzustellen. In der Oligonukleotidsynthese kann Schritt P42 für jeden entsprechenden Zyklus variieren durch Bereitstellen eines Nukleosids, das eine Base aufweist, die mit der gewünschten Sequenz korrespondiert.
Schritt P48 schließt die Oxidation der Phosphittriester-Kettenverbrückung ein, um eine Phosphotrieser-Verbrückung auszubilden. Die Oxidation wird vorzugsweise durch Zugabe von t-Butylperoxid in Toluol durchgeführt. Es versteht sich jedoch, dass die Oxidation nicht vollständig konventionell ist, da Schritt P48 durchgeführt wird, nachdem die Volllängensequenz konstruiert wurde. Es ist oft wünschenswert, Schritt P48 vor dem Schritt P50 durchzuführen, da die Entschützungsbedingungen, die in Schritt P50 existieren können, die Phosphittriester-Verbrückung abbauen werden.
Schritt P50 schließt die Entfernung von verbleibenden Schutzgruppen ein. Im Falle der RNA-Synthese schließt Schritt P50 vorzugsweise eine letztendliche Säureentschützung zum Entfernen der bevorzugten Orthoester ein.
BEISPIEL 2
Oligonukleotidsyntheseprotokolle
Oligonukleotidsynthese wurde durchgeführt auf einem Gene Assemble Plus-Syntheseautomaten von Pharmacia aus Milwaukee, Wisconsin. Die Protokolle können von den Fachleuten auf dem Gebiet für jegliche Art kommerziell verfügbarer Syntheseautomaten adaptiert werden. Eine feste Matrix wurde für alle Synthesen verwendet und schloss eine Thymidin-Polystyrol-Matrix mit einem Succinat-Linker von Pharmacia, gepackt in 0,2 oder 1,0 μmol-Säulen, vertrieben von Miligen aus Milford, Massachusetts, ein. Das Silyl-entschützende Reagens ist wie folgt: 0,5 M wässrige HF-Lösung, vertrieben von Mallinkrodt, und 3,5 M Triethylamin ("TEA")-Lösung in N-Methylpyrrolidon ("NMP"). Waschlösungen waren Acetonitril ("MeCN") und eine 1 : 1 Mischung von TEA : NMP. Die Amidite wurden zu 0,1 M in Acetonitril aufgelöst. Der Kopplungskatalysator war 0,45 M Tetrazol für die DNA-Synthese und 0,15 M S-Ethyltetrazol für RNA-Synthese. Die Kopplungszeit für die DNA-Synthese war 1 Minute und 4 Minuten für die RNA- Synthese. Die Kappungslösungen schlossen, kommerziell verfügbare Standards, Acetanhydrid und N-Methylimidazol oder Dimethylaminopyridin ein. Die letztendliche Oxidation der Volllängensequenz wurde durchgeführt unter Verwendung von 3 M-t-Butylperoxid in Toluol. Tabelle 2 schließt einen Überblick der Oligonukleotidsynthese-Zyklen-Bedingungen folgend dem verallgemeinerten Prozess, dargestellt in 4, ein.
TABELLE 2 Oligonukleotidsyntheseüberblick zum DNA-Synthesezyklus unter Verwendung einer 5'-O-Silylgruppe^*
Die Matrixsäule wird aus dem Syntheseautomaten entfernt nach Abschluss der Kettenverlängerungszyklen, die gemäß Tabelle 2 durchgeführt werden. Eine Entschützungsmischung wird hergestellt, so das sie 200 mg an Dinatrium-2-cobamoyl-2-cyanoethylen-1,1-dithiolattrihydrat ("Dithionatriumsalz") in 800 ml an Dimethylformamid ("DMF") enthält. Die Entschützungsmischung wird durch die Säule für 15 Minuten eingespritzt, um Methyl-Schutzgruppen auf dem Phosphotriestern zu entfernen. Die Säule wird anschließend gewaschen mit destilliertem Wasser und dann mit Aceton und an der Luft getrocknet. Die Matrix wird entfernt und in einer versiegelten Phiole platziert, enthaltend eine Mischung von 750 μl NH₄OH und 250 μl Ethanol für eine 60 minütige Inkubation bei 65°C (16 Stunden für N-Benzoyl-adenosin und N-Isobutyryl-guanosin), um basische Schutzgruppen zu entfernen und Oligonukleotide von der Matrix abzuspalten. Die Flüssigkeit wird aus der Phiole entfernt, sie wird heruntergetrocknet, resuspen diert in Wasser, quantifiziert und analysiert durch reverse Phasen- oder Ionenaustausch-Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie ("HPLC").
Die RNA-Synthese verlangt einige kleine Unterschiede im Hinblick auf die DNA-Syntheseprotokolle von Tabelle 2. Orthoester werden als 2'-OH-Schutzgruppen für die RNA-Synthese verwendet und Schritt P58 setzt 0,15 M S-Ethyltetrazol anstelle des Tetrazolkatalysators in Tabelle 2 ein. Auf die NH₄OH-Entschützung wird das Produkt heruntergetrocknet und erneut in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 3,0) aufgenommen und bei 65°C für 1 Stunde inkubiert. Saure Entschützung von Homopolymeren von rA und rC haben bei Raumtemperatur nicht funktioniert, arbeiten aber für Homopolymere von U. Dieses Nichtfunktionieren tritt vermutlich aufgrund der Sekundärstruktur auf, jedoch wird das Erhitzen der Proben in einer erfolgreichen Entschützung resultieren. Die Anmelder verfolgen die Theorie, dass die Zugabe von viel Salz (beispielsweise NaCl) zur Lösung die Sekundärstruktur vom hydrophilen Orthoestern zerstören wird und in einer Entschützung bei Raumtemperatur resultieren wird. Auf die saure Entschützung folgt vorzugsweise die Zugabe von 0,15 M Tris (pH 8,5) für 30 Minuten bei 65°C, um 2'-O-Formylgruppen, welche Nebenprodukte der sauren Entschützung sind, zu entfernen. 2'-O-Formylgruppen werden leicht oberhalb pH 7 entfernt. RNA-Produkte werden vorzugsweise durch HPLC ohne weiteres Aufarbeiten analysiert.
5 stellt die Reaktionen dar, die in die Synthese eines Oligonukleotids gemäß des Protokolls von Tabelle 2 involviert sind, mit Verweis auf die Schritte P52 und P58, was die repetitive Natur des Zyklus anzeigt. In 5 ist R' vorzugsweise eine 2'-Schutzgruppe, H oder irgendeine nicht reaktive Gruppe, und die verbleibenden Variablen sind wie in Referenz auf Formel (I) beschrieben.
6 stellt die Formel (II) dar, welche einen 2'-geschützten Nukleosid-Precursor zur Verwendung in der Synthese von RNA repräsentiert. In 2 ist R' eine 2'-Orthoestergruppe, korrespondierend zu R' von Formel (I) (siehe 1); BASE' schließt vorzugsweise eine Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil oder funktionellen Homologen davon ein und R₆ kann irgendein Substituent sein, ist vorzugsweise aber eine Silylethergruppe, Wasserstoff, Hydroxyl oder ein organischer Ligand. Formel (IIa) ist ein speziell bevorzugter nicht-zyklischer Orthoester zur Verwendung als R' in Formel (I) und Formel (II). In Formel (IIa) ist R vorzugsweise einer der Substituenten (AA), (BB), (CC), (DD) und (EE), wie dies in 6A gezeigt wird, wobei X₁, X₂, X₃, X₄ und X₅ jeden kompatiblen Liganden darstellen können, vorzugsweise einen Wasserstoff-, Halogen-, einen Alkylgruppen- oder einen Cyanosubstituenten darstellen; und R₅ jeglicher kompatible organische Ligand sein kann. R' umfasst noch mehr bevorzugt Formel (IIa), die als R einen der Substituenten (L), (M), (N), (O), (P), (Q), (S), (T), (U), (V) und (X) aufweist. Die verbleibenden Variablen sind wie in der Referenz aus Formel (I) beschrieben. Die unterbrochene Linie verbunden mit jedem der Substituenten (L) bis (X) zeigt eine Stelle für das Anbinden einer R-Gruppe an einen Sauerstoff des 2'-Orthoesters an.
Alle diese Substituenten wurden synthetisiert und getestet hinsichtlich der Verlässlichkeit als R-Substituenten. Das hauptsächliche Orthoester-Auswahlkriterium war die Stabilität des ultimativen Orthoesters, d. h. wie sie durch die Halbwertszeit des 2'-O-Orthoesteruridins in einer pH 2-Umgebung gemessen wird. Versuche mit mehreren Orthoestern legten nahe, dass die bevorzugten Orthoester eine minimale Halbwertszeit über 5 Minuten in einer pH 2-Umgebung bei einer Temperatur von 25°C benötigten. Die pH-Einstellung wurde durch Zugabe von Salzsäure zu Wasser eingestellt.
Tabelle 3 wird direkt unterhalb von 6 dargestellt zur einfachen Referenz dazu. Die erste Spalte von Tabelle 3 enthält eine Beschreibung der synthetisierten Verbindung, beispielsweise beschreibt der erste Eintrag eine Verbindung, wo alle R-Substituenten (L)-Gruppen darstellen. Die zweite Spalte der Tabelle 3 beschreibt die Halbwertszeit der Verbindung in einer pH 2-Umgebung, wie durch HPLC bestimmt wurde. Die Verbindungen von Tabelle 3 und die Substituenten von 6 stellen eine exemplarische Liste von Verbindungen dar, die geeignete Orthoester-Schutzgruppen ausbilden. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass verschiedene weitere geeignete Verbindungen existieren mit ähnlichem Effekt auf die Basizität des Sauerstoffs in dem Orthoester. Jedes Orthoester-geschützte Nukleosid weist unterschiedliche Säurelabilität auf. 4-N-Benzoyl-cytidin und -uridin sind kompatibel, wohingegen 6-N-Benzoyladenosin und 2-N-Isobutyryl-guanosin beide ungefähr dreimal stabiler sind. Folglich waren die am meisten bevorzugten Orthoester zur Verwendung in der Oligonukleotidsynthese Tri-2-butynorthoester für C- und U-Nukleoside und Triphenoxyethylorthoester für A- und G-Nukleoside.
7 stellt ein schematisches Flussdiagramm des Prozesses zur Synthese von Orthoester-geschützten Precursorn gemäß Formel (II) dar sowie die nachfolgende Verwendung dieser Precursor, um die Precursor von Formel (I) zur Anwendung in dem Verfahren von 2 zu erhalten.
Schritt P68 schließt die Synthese eines Orthoesterreagenzes ein. Dieser Schritt enthält vorzugsweise die Reaktion von Trimethylorthoformat und einem Alkohol, jedoch korrespondiert die Hydroxylgruppe des Alkohols korrespondiert mit den Substituenten (L) bis (X) in 6. Diese Reagenzien werden vorzugsweise zur Reaktion in der Gegenwart einer katalytischen Menge von p-Toluolsulfonsäure kombiniert. Methanol wird während der Reaktion durch Destillieren bei Atmosphärendruck und bei Temperaturen von größer als 100°C entfernt, um die Reaktion vorwärts zu treiben.
Schritt P70 schließt das Bereitstellen eines Ribonukleosids ein, das an den 5'- und 3'-Ribose-Sauerstoffen geschützt ist. Die bevorzugten geschützten Nukleoside sind 5'-,3'-O-Tetraisopropylsiloxylnukleoside, welche von Monomer Sciences of Huntsville, Alabama, gekauft werden können. Die Tetraisopropylsiloxyl-Gruppen werden im Folgenden als TIPS-Schutzgruppen bezeichnet.
Schritt P72 schließt das Reagieren der geschützten Nukleoside von Schritt P72 mit einem Orthoester-Reagens von Schritt P68 ein. Außer für Uridinnukleoside wird die Reaktion mit dem bevorzugten TIPS-Nukleosid durchgeführt in einem Dibutylphthalat-Lösungsmittel mit einer Destillation im Hochvakuum des Alkohol-Nebenprodukts, um die Ausbeute zu verbessern, die andernfalls typischerweise von 20% bis 60% reicht. Die Reaktion mit Uridinnukleosiden wird am besten realisiert durch Verwendung keines Lösungsmittels.
Schritt P74 schließt die Entfernung der 5'-,3'-TIPS-Schutzgruppen vom Reaktionsprodukt vom Schritt P72 ein. Die Entfernung der bevorzugten TIPS-Gruppen wird vorzugsweise durchgeführt durch Reaktion mit Triethylaminhydrofluorid in Acetonitril.
Schritt P76 schließt die Verwendung des Reaktionsprodukts von Schritt P74 in Schritt P26 von 2 ein, um ein 2'-Orthoester-geschütztes Phosphoramiditnukleosid in Schritt P42 des Prozesses, dargestellt in 4, zur Verfügung zu stellen.
BEISPIEL 3
Synthese von 2'-Orthoester-geschützten Nukleosidmonomeren, 2'-O-Butynorthoesteruridin, 2'-O-Butynorthoester-N-benzoylcytidin, 2'-O-Phenoxyethylorthoester-N-benzoyladenosin und 2'-O-Phenoxyethylorthoester-N-isobutyrylguanosin
Ein Orthoesterreagens wurde aus 2-Buten-1-ol synthetisiert. Eine Reaktionsmischung wurde hergestellt einschließend eine 2,90 mol Menge (203,3 g) von redestilliertem 2-Butyn-1-ol, eine 0,935 mol Menge (102,3 ml) an Trimethylorthoformat (0,935 mol, 102,3 ml) und eine katalytischen Menge (0,018 mol, 4,69 g) von p-Toluolsulfonsäure und wurde in 100 ml Dioxan aufgelöst. Das Dioxanlösungsmittel wurde abdestilliert unter vermindertem Druck. Vier Wiederholungszyklen wurden durchgeführt, wobei eine zusätzliche Menge von 150 ml an Dioxanlösungsmittel zur Reaktionsmischung hinzugegeben wurde, die nachfolgend durch Destillation entfernt wurde. Eine 5 ml Menge an Triethylamin wurde zur Mischung hinzugegeben, um die Reaktion zu quentschen. Das rohe Reaktionsprodukt wurde aus der Mischung bei 95°C und in einem Vakuum von 10 μm Hg destilliert, um ein aufgereinigtes Reaktionsprodukt, einschließend eine 54%ige Ausbeute an Tri(2-butyn)-orthoester zur Verfügung zu stellen.
Das resultierende Orthoesterprodukt wurde in der Synthese von 2'-O-Butynorthoesteruridin verwendet. Eine Reaktionsmischung wurde zusammengemischt, so dass sie eine 5,11 mmol Menge (2,973 g) an 5',3'-O-TIPS-uridin enthielt, eine 0,611 mmol Menge (153 mg) an p-Toluolsulfonsäure und eine 30,55 mmol Menge (6,73 g) an Tri(2-butyn)orthoester. Die Reaktionsmischung wurde unter Hochvakuum bei 65°C für 3 Stunden erhitzt. Eine 1 ml Menge Triethylamin wurde hinzugegeben um die Reaktion zu quentschen. Die 5',3'-TIPS-Gruppen wurden durch Zugabe von 5 ml 1,0 M HF, 2,0 M Triethylamin in Acetonitril abgespalten. Die Abspaltungsreaktion war nach 1 Stunde abgeschlossen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde auf Silicagel gereinigt, um 60,3% Ausbeute zu ergeben.
Das Orthoesterprodukt wurde in der Synthese von 2'-O-Butynorthoester-4-N-benzoylcytidin eingesetzt. Die Prozedur war identisch zu derjenigen, beschrieben im vo rangehenden Paragraphen, außer, dass 5',3'-O-TIPS-(N-benzoyl)cytidin substituiert war durch 5',3'-O-TIPS-uridin.
Ein Phenoxyethylorthoester wurde in der Synthese von 2'-O-Phenoxyethanolorthoester-N-benzoyladenosin eingesetzt. Eine Reaktionsmischung wurde hergestellt, so dass sie eine 15 ml mmol Menge (9,2 g) an 5',3'-O-TIPS-(N-benzoyl)adenosin, aufgelöst in 50 ml an Dioxanlösungsmittel mit 0,75 mmol Menge (188 mg) an p-Toluolsulfonsäure und 45 mmol Menge (19,1 g) an Triphenoxyethanolorthoester enthielt. Die Reaktionsmischung wurde auf 65°C aufgeheizt und blieb zur Inkubation über Nacht bei dieser Temperatur. Triethylamin wurde zugegeben, um die Reaktion zu quentschen, und die Lösung wurde über Silicagel passiert, um eine überschüssige Menge an Orthoesterreagens zu entfernen. Die gesammelten Fraktionen enthaltend das gewünschte Reaktionsprodukt wurden vereinigt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen. Die 5'- und 3'-TIPS-Schutzgruppen wurden durch Zugabe einer 30 ml Lösung, enthaltend 1,0 M HF und 2,0 M Triethylamin, in Acetonitril entfernt. Die Ausbeute des gewünschten Reaktionsprodukts betrug 19%. 2'-O-Phenoxyethylorthoester-N-isobutyrylguanosin wurde hergestellt durch eine ähnliche Prozedur.
BEISPIEL 4
Synthese eines DNA-Homopolymers dT-dT-dT-dT-dT (Sequenz ID Nr. 1)
Eine Synthese von 3'-O-Diisopropylmethoxyphosphin-thymidin-monomer wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet, um ein Thymidinhomopolymer gemäß der DNA-Syntheseprotokolle, dargestellt in Beispiel 2, zu synthetisieren.
8 stellt eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie ("HPLC")-Spur des Reaktionsprodukts dar. Die X-Achse repräsentiert die Zeit in 10 Minuten. Die Y-Achse repräsentiert eine relative spektrale Absorption der Wellenlänge von 260 nm. Jeder Peak ist mit einer Computer-erzeugten Fläche unterhalb des Peaks verbunden. Die "Flächenprozentzahl"-Säule identifiziert eine relative Menge des Reaktionsprodukts, assoziiert mit jedem Peak. Zwei signifikante Beobachtungen treten von diesen Resultaten, dargestellt in 8, auf. Zuerst ist eine 98%ige Ausbeute des Gesamtlängenreaktionsprodukts genauso gut wie verglichen zur konventionellen Ausbeute bei der DNA-Synthese mit mehr als 5 verknüpften Monomeren. Zum zweiten tritt eine verminderte relative Menge von länger gehaltenen Produkten zu Zeiten von mehr als 0,15 Minuten auf. Die essenzielle Abwesenheit dieser großen Produkte vereinfacht den Aufreinigungsprozess.
BEISPIEL 5
Synthese eines DNA-Homopolymers dA-dA-dA-dA-dA-dA-dA-dA-dA-T (Sequenz ID Nr. 2)
Die polyadenylierte Homopolymersequenz korrespondierend zu Sequenz ID Nr. 2 wurde synthetisiert durch die DNA-Protokolle, dargestellt in Beispiel 2. Vergleichende Ergebnisse wurden erhalten aus den konventionellen Dimethoxytritylprotokollen, dargestellt durch ABI aus Foster City, California.
Ein Silyl-geschütztes Phosphoramiditadenosinnukleosidmonomer wurde in einer identischen Art und Weise im Hinblick auf Beispiel 1 hergestellt, außer, dass N-Benzoyldeoxyadenosinnukleosid substituiert anstellen von Thymidinnukleosid war.
Synthese und Entschützung des Polymers setzt die Bedingungen ein, die identisch zu denjenigen dargestellt in Beispiel 2 waren. Ammoniumhydroxidbehandlung zum Abspalten von der Matrix benötigten eine 5 Stunden Reaktionszeit bei 65°C. Die rohen Oligonukleotidprodukte wurden durch Ionenaustausch HPLC analysiert.
9 stellt eine HPLC-Spur für die Oligonukleotidprodukte dar, die sich von den Silylgeschützten Monomeren ableiten und zeigt eine 92%ige relative Länge des Gesamtlängenprodukts an, und eine 0,68%ige relative Menge von länger gearteten Verunreinigungen. 10 stellt eine Vergleichs-HPLC-Spur von Oligonukleotidprodukten dar, die sich von konventionellen Dimethoxytritylprotokollen ableiten und zeigt eine 87%ige relative Menge des Gesamtlängenprodukts und eine 1,99%ige relative Menge von länger gearteten Verunreinigungen an.
BEISPIEL 6
Synthese von Homopolymeren von (rU)₉T, (rC)₉T, (rA)₉T
Eine Vielzahl von 2'-Orthoester-geschützten RNA-Nukleosidmonomer-Precursorn wurde wie in Beispiel 3 synthetisiert. Diese Precursor schlossen 2'-O-Butynorthoesteruridin, 2'-O-Butynorthoester-4-N-benzoylcytidin und 2'-O-Phenoxyethylorthoester-N-benzoyladenosin ein. Die 5'-O-Silyl-Schutzgruppe und eine 3'-O-Diisopropylmethoxyphosphin-Gruppe wurden zu den jeweiligen Precursorn, wie in Beispiel 1, zugegeben, um Monomere zur Synthese gemäß den Protokollen, dargestellt in Beispiel 2, bereitzustellen.
Oligonukleotide enthaltend (rA)₉T (Sequenz ID Nr. 3), (rC)₉T (Sequenz ID Nr. 4) und (rU)₉T (Sequenz ID Nr. 5) wurden synthetisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 0,15 M S-Ethyl-tetrazol in Acetonitril als Kopplungskatalysator verwendet wurde. Die Zeit, die für die Kopplungsreaktion benötigt wurde (Schritt P58), wurde dementsprechend auf 4 Minuten ausgedehnt. Das Entschützen war ähnlich wie bei Deoxynukleotidpolymeren mit der Ausnahme, dass die Thiosalz-Entschützungszeit auf 30 Minuten vergrößert war und die NH₄H-Kontaktzeit über Nacht ausgedehnt wurde. Die Proben wurden auf ein Pulver eingetrocknet und in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 3,0) resuspendiert, wo sie bei 65°C für 1 Stunde inkubiert wurden. Ein gleiches Volumen von 0,15 M Tris (pH 8,5) wurde hinzugegeben und die resultierende Mischung wurde erhitzt auf 65°C für 30 Minuten. Die Oligonukleotidprodukte wurden durch Ionenaustausch HPLC analysiert. 11 stellt die HPLC-Spur für (rU)₉T dar. 12 stellt die HPLC-Spur für (rC)₉T dar. 13 stellt die HPLC-Spur für (rA)₉T dar. Mit der Ausnahme von (rC)₉T zeigen diese Spuren exzellente Homopolymerausbeuten an.
BEISPIEL 7
Heteropolymersynthese mit Vergleichs-HPLC-Analyse und Ribozym-Abspaltungs-Assay
Synthese und Entschützen von Heteropoylmeren wurde in identischer Weise zu den RNA-Syntheseprotokollen, dargestellt in Beispiel 2, durchgeführt. Tabelle 4 dient dazu, die verschiedenen Heteropolymersequenzen, die synthetisiert wurden, zu identifizieren. Sequenz ID Nr. 6 ist ein Substrattemplat für das Ribozym-Schneiden. Sequenz ID Nr. 9 ist eine korrespondierende Ribozym-Sequenz. Sequenz ID Nr. 7 ist ein vermischtes Polymer. Sequenz ID Nr. 8 ist die gleiche Sequenz ID Nr. 7, wobei Cytidin durch Uridin ersetzt wird. TABELLE 4 Heteropolymersequenzen

Sequenz ID Nr. Sequenz

6 5'-GAAUCGAAACGCGAAAGCGUACUAGCG-T-3'

7 5'-CUUAGAGUAGUCAUCGC-T-3'

8 5'-UUUAGAGUAGUUAUUGU-T-3'

9 5'-CGCUACUGAUGAGAUUC-T-3'
Die #6 Sequenz und die korrespondierende Ribozymsequenz #9 wurden Synthetisiert durch Dimethoxytrityl-Chemie unter Verwendung von Standardprotokollen, dargestellt durch ABI aus Foster City, California. Sequenz #9 schließt die gleiche Länge und Basenzusammensetzung wie Sequenz #7 ein, jedoch angeordnet in unterschiedlicher sequenzieller Reihenfolge. Ionenaustausch-HPLC-Analysen von rohen Oligonukleotiden ergaben die folgenden Ergebnisse in Tabelle 5. Die Gesamtrohproduktausbeuten waren signifikant höher für die Oligonukleotide synthetisiert über diese Erfindung. Tabelle 5 erleichtert eine vergleichende Analyse der Volllängenproduktausbeuten, die sich aus der Silyl-Schutzgruppenchemie ableiten gegenüber von analogen Ausbeuten aus der konventionellen Dimethoxytrityl-Schutzgruppenchemie.
TABELLE 5 Vergleich von Oligonukleosidausbeuten zwischen Silyl-Schutzgruppenprotokollen und konventionellen Phosphoramiditprotokollen
Tabelle 5: Vergleich der Prozentausbeuten des Gesamtlängenprodukts in der Rohsynthese
Oligonukleotide korrespondieren zu Sequenzen Nr. 6 wurden synthetisiert in beiden Verfahren.
Die entsprechenden Oligonukleotidprodukte wurden durch HPLC aufgereinigt. Beide #6 Sequenzen wurden mit P³² gelabelt über Kinase-Reaktion gemäß konventionellen Protokollen und inkubiert mit der Nr. 9 Sequenz. Die Zeitpunkte wurden auf Polyacrylamidgel-Elektrophorese ("PAGE") erzeugt, um die Rate zu analysieren und das Ausmaß, in welchem die Nr. 6 Sequenzen gespalten wurden. Tabelle 6 schließt die PAGE-Ergebnisse ein.
TABELLE 6 Vergleich der kinetischen Daten der Abspaltung des Ribozymsubstrats
Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass die oben dargestellte Diskussion dazu dient, die bevorzugten Verfahren und Materialien zur Anwendung in der Erfindung zu identifizieren. Die bevorzugten Ausführungsformen, wie hier oben beschrieben, können offensichtlichen Modifizierungen unterzogen werden, ohne dass vom wahren Umfang und Geist der Erfindung abgewichen wird. Dementsprechend erklären die Erfinder hiermit ihre Intension, sich auf die Doktrin der Äquivalenz zu verlassen, um ihre vollen Rechte in der Erfindung zu schützen.

Claims

Ein geschütztes Monomer zur Verwendung in der schrittweisen Oligonucleotidsynthese, das die folgende molekulare Formel aufweist,
worin R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Orthoesterschutzgruppe, Ethern, Alkylethern, Estern, Halogenen, geschützten Aminen und geschützten Hydroxylgruppen; R'' eine Phosphoramiditgruppe umfasst; R₁, R₂ und R₃ zumindest einen Alkoxy- oder Siloxysubstituenten einschließen; und BASE eine Nucleinsäurebase ist.
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, wobei besagte Phosphoramiditgruppe die folgende Formel aufweist,
worin R₄ irgendein organischer Ligand ist.
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, worin besagte R₁, R₂ und R₃ umfassend ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, worin R₁, R₂ und R₃ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, wobei ein jedes von besagtem R₁, R₂ und R₃ jeweils ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Alkoxy- und Siloxygruppen.
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, wobei besagte Orthoesterschutzgruppe ein nichtzyklischer Orthoester ist.
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, wobei besagtes R' eine Formel für den Substituenten wie folgt aufweist:
worin besagte R₅ und R₆ aus der Orthosester-Schutzgruppen-Substituenten sind.
Das Monomer wie in Anspruch 7 dargestellt, worin besagte R₅ und R₆ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Das Monomer wie in Anspruch 1 dargestellt, wobei besagte BASE ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, N-geschütztem Adenin, Guanin und Cytosin und funktionellen Homologen davon.
Ein Verfahren zur DNA- und RNA Synthese durch ortsspezifische schrittweise Polymerisation umfassend die Schritte von: a) Herstellen einer ersten Monomerkette einschließend zumindest ein substituiertes Monomer, das eine erste Silylschutzgruppe aufweist; b) Beseitigen der Schutzgruppe von besagter substituierter Monomerkette durch Entfernen von besagter erster Silylschutzgruppe, um eine Kette frei von Schutzgruppen zu erhalten; c) Bereitstellen eines zweiten substituierten Monomers gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 9; und d) Reagieren von besagtem zweiten substituiertem Monomer mit besagter von der Schutzgruppe befreiter Kette, um eine verlängerte Monomerkette zu erhalten.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagter Schritt des Schutzgruppen-Entfernens einen Schritt der Zugabe eines Fluoridions enthält, um die erste Silylschutzgruppe zu entfernen.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagtes zweites Monomer einen Phosphoramiditsubstituenten einschließt und besagter Reaktionsschritt (c) die Konvertierung von besagtem Phosphoramiditsubstituenten in eine Phosphittriesterverknüpfung durch Reaktion von besagter von der Schutzgruppe befreiter Monomerkette mit besagtem Phosphoramiditsubstituenten zur Verlängerung von besagter erster Kette einschließt.
Ein Verfahren wie in Anspruch 12 dargestellt, worin besagtes erstes substituiertes Monomer und besagtes zweites substituiertes Monomer jeweils an korrespondierende Partner gekoppelt werden, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil und funktionellen Homologen davon.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagter Wiederholungsschritt durchgeführt wird ohne zuerst besagte Phosphittriesterverknüpfung zu oxidieren.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagtes zweites substituiertes Monomer eine Phosphoramiditgruppe ist.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagtes zweites substituiertes Monomer ein Monomer gemäß Anspruch 3 ist.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagtes zweites substituiertes Monomer ein Monomer gemäß Anspruch 4 ist.
Das Verfahren wie in Anspruch 10 dargestellt, worin besagtes zweites substituiertes Monomer ein Monomer gemäß Anspruch 7 ist, worin besagte Substituenten R₅ und R₆ vorzugsweise bis zu 20 Kohlenstoffatome aufweisen.
Das Verfahren wie in Anspruch 18 dargestellt, worin besagtes zweites substituiertes Monomer ein Monomer gemäß Anspruch 8 ist.
Das Verfahren wie in Anspruch 15 bis 19 dargestellt, mit anschließendem Wiederholen von besagtem Schutzgruppen-Entfernen, Bereitstellen und den Reaktionsschritten (a) bis (c) über eine Vielzahl von Zyklen ohne Oxidation, um die Phosphor (III)-Verknüpfungen in besagten Ketten zu stabilisieren.
Das Verfahren wie in Anspruch 20 dargestellt, worin besagte Vielzahl von Zyklen 5 Zyklen überschreiten.
Das Verfahren wie in Anspruch 15 dargestellt, worin besagter Reaktionsschritt ein Schritt des Schutzgruppen-Entfernens von besagtem geschützten Nucleosid durch die Zugabe einer Fluoridgruppe einschließt, um einen Silylether abzuschneiden und besagte Schutzgruppe zu entfernen.
Das Verfahren wie in Anspruch 15 dargestellt, worin besagter erster Schritt einen Schritt des Koppelns von besagtem einen Nucleotid an eine unlösliche Nicht-Glasunterlage einschließt.
Das Verfahren wie in Anspruch 23 dargestellt, worin besagte Nicht-Glasunterlage ein Polystyrol-Kügelchen ist.