DE69634013T2

DE69634013T2 - Verfahren und implantierbarer gegenstand zur förderung der endothelialisierung

Info

Publication number: DE69634013T2
Application number: DE69634013T
Authority: DE
Inventors: L. David CLAPPER
Original assignee: Surmodics Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2016-05-25
Also published as: AU5876996A; US5744515A; AU720963B2; JP2001502187A; EP1018977B1; DE69634013D1; CA2222136A1; WO1996037165A1; JP3318578B2; EP1018977A4; EP1018977A1; CA2222136C; MX9709120A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft den Bereich der Biomaterialien, der implantierbaren medizinischen Vorrichtungen und der Zellbiologe. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren für die Verbesserung der Leistungsfähigkeit medizinischer Vorrichtungen, wenn sie in biologischer Umgebung implantiert sind. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Vorrichtungen, wie implantierbare vaskuläre Transplantate.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biomaterialien sind seit langen in der wiederherstellenden Chirurgie verwendet worden, um erkrankte oder verletzte Organe zu ersetzen. Die meisten Biomaterialien, die gegenwärtig für die Herstellung von implantierten Vorrichtungen verwendet werden, wurden ursprünglich für nicht medizinische Anwendungen entwickelt. Solche Materialien wurden anfänglich als für die Herstellung von implantierbaren Vorrichtungen geeignet angesehen, wenn sie nicht toxisch waren und physische Eigenschaften aufwiesen, die die Herstellung der gewünschten Vorrichtungen erlauben würden. Es erscheint jedoch, daß die meisten, wenn nicht alle, üblicherweise verwendeten implantierten Biomaterialien ein gewisses Potential aufweisen, unerwünschte Antworten an der Material-Gewebeschnittstelle zu erzeugen. Siehe z. B. Hanker, J. S. und B. L. Giammara, „Biomaterials and Biomedical Devices", Science 242: 885–892 (1988).
Derzeit werden implantierte Vorrichtungen als erfolgreich in Situationen angesehen, in denen beliebige unerwünschte Oberflächenantworten, die auftreten können, nicht unangemessen den Wirt betreffen oder wesentlich mit der Hauptfunktion der Vorrichtung interferieren. Beispielsweise beeinflußt die Bildung einer Thrombusschicht auf der luminalen Oberfläche typischerweise nicht Funktion eines vaskulären Transplantats großen Durchmessers, wobei sie ein Transplantat kleineren Durchmessers verschließen könnte.
Die anfängliche Untersuchung im Hinblick auf die der Entwicklung von Materialien, die eine verbesserte Biokompatibilität aufweisen, richtete sich im wesentlichen auf die Erzeugung von Materialien, die eine minimale Reaktion mit Gewebe zeigten. Obwohl dieser Ansatz die Funktion vieler Vorrichtungen verbessert hat, sind weitere Verbesserungen in der Kompatibilität und Leistungsfähigkeit der implantierten Vorrichtungen wünschenswert.
Solche Verbesserungen können die Erzeugung von Biomaterialoberflächen beinhalten, die tatsächlich die gewünschten Gewebewechselwirkung, beispielsweise Adhäsion und Infil tration durch bestimmte wünschenswerte Gewebezellen (Hanker et al.), fördern. Eine Sorte der wünschenswerten Gewebeinfiltration beinhaltet den als „Endothelialisierung" bekannten Prozeß der im Falle eines vaskulären Transplantats die Wanderung von Endothelzellen aus angrenzendem Gewebe auf die luminale Oberfläche (d. h. die Oberfläche, die das Lumen auskleidet) und in das Lumen des Transplantats hinein beinhalten.
Auf ein vaskuläres Transplantat angewandt könnte eine solche Endothelialisierung beispielsweise über zwei verschiedenen Mechanismen auftreten (Greisler, H. P. New Biologic and Synthetic Vascular Prostheses, R. G. Landes, Co., Austin, Texas (1991)). Ein Mechanismus, der als „transanatomotische" Endothelialisierung bezeichnet wird, beinhaltet die Förderung des Einwachsens von Pannus längs in das Transplantat aus dem Lumen des Blutgefäßes, in das das Transplantat eingefügt wurde. Die Endothialisierung über dieses Verfahren führt zu Endothelzellen, die das Lumen des Transplantats ausfüllen, mit wenigen, wenn überhaupt Endothelzellen in der Porosität des Transplantats.
Der andere Mechanismus, der als „transmurale" oder „transinterstitiale" Endothelialisierung bezeichnet wird, beinhaltet die Förderung des Einwachsens von Kapillaren und/oder kapillaren Endothelzellen durch die Transplantatwand und die Porosität. Solche Endothelzellen stammen aus der Mikrovaskulatur angrenzenden Gewebes, außerhalb des vaskulären Transplantats und wachsen durch die Wand des vaskulären Transplantats zum Teil aufgrund seiner Porosität hindurch. Unter geeigneten Bedingungen sind die Endothelzellen dazu in der Lage, durch die Transplantatwand hindurch zu wachsen und das Transplantatlumen zu besiedeln.
Die eingewachsenen Endothelzellen sind häufig dazu in der Lage Kapillaren innerhalb und durch die Poren des Materials zu bilden, die das vaskuläre Transplantat bilden. Für solche Kapillarbildung ist es jedoch nicht bestätigt worden, daß sie ein wesentlicher Bestandteil des Prozesses selbst ist. Da die Endothelzellen selbst aus Kapillaren abstammen und Kapillaren häufig innerhalb der Transplantatporosität beobachtet werden, wird die transmurale Endothelialisierung manchmal auch als „kapillare Endothelialisierung" bezeichnet. Der Vorgang der kapillaren Endothelialisierung kann durch seine aufeinanderfolgenden zellulären Schritte unterschieden werden, die die anfängliche Anheftung von Endothelzellen an das Transplantatmaterial, gefolgt von der Ausbreitung, die Einwanderung nach innen und, gegebenfalls, die Proliferation umfassen.
Die physischen Ansätze für die Verbesserung der Endothelialisierung tendierten dazu, sich auf die Oberfläche selbst zu konzentrieren, beispielsweise auf die Porosität oder die Rauheitqualitäten der Oberfläche. Goldon et al. berichteten beispielsweise, daß Transplantate aus expandierten Polytetrafluorethylen („ePTFE") mit einem Abstand zwischen den Knoten von 60 μm eine optimale Porosität zur Verfügung stellte, um die transmurale Endothelialisierung in Pavianen zu erlauben. (Siehe Golden, M. A., S. R. Hanson, T. R. Kirkman, P. A. Schneider und A. W. Clowes, „Healing of Polytetrafluoroethylene Arterial Grafts is Influenced by Graft Porosity", J. Vasc. Surg. 11: 838–845 (1990)).
Eine ähnliche Sorte des ePTFE-Transplantats mit dem selben Abstand zwischen den Knoten von 60 μm wurde in Patienten implantiert, erlaubte jedoch keine Endothelialisierung. (Siehe Kohler, T. R., J. R. Stratton, T. R. Kirkman, K. H. Johansen, B. K. Zierler und A. W. Clowes, „Convential Versus High-Porosity Polytetrafluoroethylene Grafts: Clinical Evaluation", Surgery 112: 901–907 (1992)). Die Anmelder haben ermittelt, daß sich die ePTFE-Transplantate, die in Patienten implantiert wurden, von denen, die in Pavianen implantiert wurden dadurch unterschieden, daß die ePTFE-Transplantate, die bei Patienten verwendet wurden, einem modifizierten Typ angehörten, der eine äußere Ummantelung aus einem Verstärkungsfilm verwendete.
Das als „Gore-Tex Vascular Graft" bekannte Produkt wird dadurch beschrieben, daß es eine durchschnittliche Fibrillenlänge von 25 Mikron aufweist, um die Aufnahme umliegenden Gewebes in das Transplantatimplantat zu erlauben. Dieses bestimmte Produkt stellt jedoch auch einen Verstärkungsfilm zur Verfügung, der fest eingebauter Bestandteil der äußeren Transplantatoberfläche ist, für den gesagt wird, daß er dem Transplantat eine äußere Unterstützung zur Verfügung stellt, um eine Aneurysma-ähnliche Aufblähung zu verhindern, den Nahtrückhalt zu verbessern und einen problematischen „Reißverschluß"-Effekt zu verhindern. In anderen Experimenten wurde die transmurale Endothelialisierung in Hunden durch ein ePTFE-Transplantat hergestellt, in dem 800 μm Poren mit einer Nadel erzeugt wurden; die Porosität war jedoch so groß, daß eine Vorverklumpung erforderlich war, um übermäßige Blutungen zu verhindern (Kusaba, A., C. R. Fischer, III, T. J. Matulewski und T. Matsumoto, „Experimental Study of the Influence of Porosity on Development of Neointima in Gore-Tex^® Grafts: A Method to Increase Long-term Patency Rate", Amer. Surg. 47: 347–354 (1981)).
Wachstumsfaktoren
Neben physischen Ansätzen für das Erreichen der Endothelialisierung sind auch bestimmte chemische Ansätze versucht worden. Diese haben dazu tendiert, sich auf die Verwendung verschiedener Proteine zu konzentrieren, die Wachstumsfaktoren und zelluläre Adhäsionsproteine oder die Form der Proteinanheftung an die Oberfläche umfassen.
Wachstumsfaktoren (WF) sind lösliche Polypeptide (mit Molekulargewichten, die typischerweise von 5 bis 50 Kilodalton reichen), die dazu in der Lage sind durch den Körper zu diffundieren und Zellteilung (Proliferation) zu stimulieren. Zur Zeit scheint es, daß nur für eine WF-Sorte, insbesondere FGF-1 berichtet wurde, das es die kapillare Endothelialisierung in ein vaskuläres Transplantat hinein fördert. (Greisler, H. P. New Biologic and Synthetic Vascular Prostheses, R. G. Landes, Co. Austin, Texas (1991)). In diesem Bericht wurde der WF nicht auf der Vorrichtung immobilisiert und wurde jedoch tatsächlich in einer Form zur Verfügung gestellt, die es ihm erlauben würde löslich zu werden. Genauer gesagt wurde ein Gemisch aus einem Fibrinkleber, Heparin und FGF-1 verwendet, um die Zwischenräume des Abstands zwischen den Knoten von 60 μm des ePTFE-vaskulären Transplantats zu füllen. Das Transplantat wurde anschließend in Kaninchen und Hunde implantiert und führte zu einer verbesserten transmuralen Endothelialisierung.
Es erscheint, daß der Fibrinklebstoff langsam abgebaut wird, um lösliches FGF-1 freizusetzen, das wiederum die Proliferation und die Wanderung von Endothelzellen fördern kann, um eine kapillare Endothelialisierung zu bilden. Zusätzlich dazu, daß es löslich ist, hat FGF-1 die unerwünschte zweite Wirkung der Förderung der Proliferation von glatten Muskelzellen. Diese Zellen dringen auch in die Transplantatporosität ein und werden im Transplantatlumen hyperplastisch, ein Ergebnis, daß für die medizinische Verwendung nicht als geeignet angesehen werden würde. Kang, S. S., D. Ren und H. P. Greisler, „Vascular Smooth Muscle Cell Growth on Fibrin Glue Containing Fibroblast Growth Factor-1 and Heparin", Trans. Soc. Biomat. 17: 33 (1994).
Adhäsionsmoleküle
Adhäsionsmoleküle sind üblicherweise große Proteine, Kohlenhydrate oder Glycoproteine (typischerweise 100 bis 1000 Kilodalton), die dazu dienen spezifisch an Zelloberflächenrezeptoren zu binden. Sie verbinden wiederum Zellen mit einem anderen Substrat („Oberflächenadhäsionsmolekül" oder „SAM" = „surface adhesion molecule") oder mit angrenzenden Zellen („Zelladhäsionsmolekül" oder „CAM" = cell adhesion molecule"). Es erscheint nicht, daß CAMs für die Verbesserung der kapillaren Endothelialisierungscharakteristika von Implantatvorrichtungen vorgeschlagen oder verwendet wurden.
Obwohl für eine Vielzahl von SAM-Proteinen gezeigt wurde, daß sie die Gewebeintegration bei implantierten Vorrichtungen verbessern (z. B. ein erhöhtes Fibroblastenwachstum zeigen, eine erhöhte Bindung an subkutanes Gewebe, eine verringerte Inflammation und Nekrose des angrenzenden Gewebes und eine verringerte Bildung von fibrösen Kapseln um die implantierten Vorrichtungen) scheint es, daß für keines gezeigt worden ist, die kapillare Endothelialisierung zu verbessern. Siehe beispielsweise Okada, T. und Y. Ikada, „Tissue Reactions to Subcutaneously Implanted, Surface-Modified Silicones", J. Biomed. Mater. Res. 27: 1509–1518 (1993); Kirkham, S. M, und M. E. Dangel, "The Keratoprosthesis: Improved Biocompatability Through Design and Surface Modification", Ophth. Surg. 22: 455–461 (1991); Clapper, D. L., S. M. Kirkham und P. E. Guire, "ECM Proteins Coupled to Device Surfaces Improve in vivo Tissue Integration", J. Cell. Biochem. 18C: 283 (1994); und Kito, H., N. Nakajima und T. Matsuda, "Differentiated Biocompatible Design of Luminal and Outer Graft Surfaces. Photocurable Extracellular Matrices, Fabrication, and Cellular Response", ASAIO Journal 39: M506–M511 (1993).
Williams et al. zeigten, daß die Adsorption mehrerer verschiedener SAM-Proteine (umfassend Fibronectin und eine Kombination aus Typ I- und III-Kollagen) auf vaskulären Transplantaten, die in vitro Anheftung von Endothelzellen verbesserte. Die Proteine wurden zum Zwecke der Evaluierung der Zellansiedlung hinzugefügt, es gab keinen Hinweis auf eine Wirkung auf die kapillare Endothelialisierung.
Gleichermaßen wurde für adsorbiertes Fibronectin durch Seeger et al. berichtet, daß es eine leichte (d. h. zweifache) Erhöhung des Rückhalts von Endothelzellen erzeugte, die vor der Implantation von vaskulären Transplantaten in Hunden hinzugefügt wurden. (Siehe Williams S. K., et al., „Adult Human Endothelial Cell Compatibility with Prosthetic Graft Material", J. Surg. Res. 38: 618–629 (1985) bzw. Seeger, J. M. und N. Klingman, "Improved In Vivo Endothelialization of Prosthetic Grafts by Surface Modification with Fibronectin", J. Vasc. Surg. 8: 476–482 (1988)).
Kovalentes Binden
Chemische Faktoren sind an Trägeroberflächen in einer Vielzahl von Wegen befestigt worden umfassend die passive Adsorption, wie sie in einer Vielzahl der obigen Referenzen beschrieben wurde. Die U.S.-Patent Nr. 4,979,959 und 5,263,992 betreffen die Vorbereitung und Verwendung biokompatibler Vorrichtungen, bei denen das biokompatible Mittel kovalent über eine photoreaktive Gruppe mit einer chemischen Verknüpfungsgruppe an ein Biomaterialsubstrat gebunden ist.
Im Hinblick auf SAM verwenden Kito et al. (oben zitiert) Photochemie, um die äußere Oberfläche zu beschichten und um die Porosität von vaskulären Dacron-Transplantaten mit Gelatine zu füllen. Die luminale Oberfläche wurde dann mit Chondroitinsulfat beschichtet. Nach der Implantation in Hunden für eine Woche zeigten die Transplantate ein erhöhtes Einwachsen von Fibroblasten von der äußeren Oberfläche in die Transplantatporosität und keine Endothelzellen auf der luminalen Oberfläche. Es wurde über keine kapillare Endothelialisierung berichtet.
In einer weiteren Studie wurden Adhäsionsproteine unter Verwendung von „Photochemie" an der Oberfläche von Transplantaten immobilisiert, die entweder aus Polyurethan oder aus ePTFE gebildet waren (Clapper, D. L., K. M. Hagen, N. M. Hupfer, J. M. Anderson und P. E. Guire, „Covalently Immobilized ECM Proteins Improve Patency and Endothelialization of 4 MM Grafts Implanted in Dogs", Trans. Soc. Biomat. 16: 42 (1993)). Die Anmelder haben seitdem nachgewiesen, daß das spezifische ePTFE Transplantatmaterial wie in einer oben beschriebenen Form zur Verfügung gestellt wurde, d. h. daß es ganzheitlich mit der äußeren Transplantatoberfläche eine äußere Ummantelung mit einem äußeren Verstärkungsfilms aufwies, die dazu dienen sollte die Wandporosität deutlich zu verringern. Das Polyurethan wiederum hatte wenige, wenn überhaupt, Poren, die sich vollständig durch die Transplantatwände erstreckten. Unter Verwendung des Hundemodells zeigten beide Transplantate verschiedene Grade einer verbesserten Endothelzellenbedeckung, wenn sie entweder mit Fibronectin oder Typ IV-Kollagen oder mit beiden beschichtet wurden. Die auf dem Transplantatlumen vorhandenen Endothelzellen wanderten in jedem Fall wahrscheinlich aus dem Lumen der angrenzenden Arterie durch den Prozeß der transanastomischen Endothelialisierung ein. Jede Transplantatsorte war im wesentlichen nicht porös und alle auf den luminalen Oberflächen des Transplantats beobachteten Endothelzellen waren Teile der durchgehenden Endothelzellschicht, die sich aus dem Lumen der angrenzenden Arterien erstreckten. Ein solches Zellwachstumsmuster steht in Übereinstimmung mit einer transanastomotischer im Gegensatz zu einer transmuralen Endothelialisierung.
Es sind Beispiele berichtet worden, in denen kovalent immobilisierte Proteine eine verbesserte Gewebeintegration bei Implantatvorrichtungen zur Verfügung stellen. Beispielsweise wenn mit Silikongummi gekoppelt (über eine Kombination aus Glimmentladung, Pfropfpolymerisation und Carbodiimidkupplung) war Typ I-Kollagen dazu in der Lage, die Dicke der fibrösen Kapseln zu verringern, die sich nach subkutaner Implantation für 16 Wochen in Ratten bildeten (Okada, T. und Y. Ikada, „Tissue Reactions to Subcutaneously Implanted, Surface-Modified Silicones", J. Biomed. Mater. Res. 27: 1509–1518 (1993)). Typ I-Kollagen ist thrombogen, würde jedoch nicht für die Verwendung in Implantaten, wie in vaskulären Implantaten geeignet sein.
In einem anderen Experiment wurde eine Beschichtung aus Typ IV-Kollagen auf Silikongummibrustimplantaten photoimmobilisiert und subkutan für 16 Wochen in Schweine implantiert. Die beschichteten Implantate zeigten eine starke Gewebebindung an die Vorrichtungsoberfläche und dünnere fibröse Kapseln (Clapper, (1994), siehe oben). Die Implantate wurden jedoch nicht als porös beschrieben und es wurde keine kapillare Endothelialisierung beschrieben.
In noch einer weiteren Situation wurde eine Beschichtung aus Typ I-Kollagen auf eine feste intracorneale Polymethylmethacrylat-Linse aufgetragen und für 15 Monate in Kaninchen cornea implantiert. Das Implantat förderte die Bindung von Stromalgewebe, verringerte die Inflammation angrenzend an die Vorrichtung und verringerte deutlich die Nekrose von Cornealgewebe über der Vorrichtung (Kirkham et al., siehe oben). Wiederum war das Implantat nicht porös und es wurde keine kapillare Endothelialisierung beschrieben.
Schließlich beschrieben Kinoshita, Y., T. Kuzuhara, M. Kirigakubo, M. Kobayashi, K. Shimura, Y. Okada, „Soft tissue reaction to collagen-immobilized porous polyethylene: subcutaneous implantation in rats for 20 wk", Biomaterials, Vol. 14, Nr. 3, 209–215 (1993) ein Polyethylenprobenmaterial, das eine große Porosität aufwies (Poren mit 400 Mikron) und kovalent mit Kollagen I durch Pfropfpolymerisation gekoppelt war. Für das Material wurde gefunden, daß es das Einwachsen in das Gewebe, nach subkutaner Implantationen in ein Rattenmodell verbesserte. Für das Probenmaterial wurde nicht beschrieben, das es ausreichende Eigenschaften (z. B. eine ununterstützte Festigkeit) für die Herstellung eines vaskularen Grafts aufwies, noch wurde es beschrieben, daß es eine für diesen Zweck ausreichende Porosität aufwies. Auch, und wie oben beschrieben, würde für Kollagen I tatsächlich angenommen, daß es für die Verwendung in einem vaskulären Graft im Hinblick auf seine thrombogene Eigenschaft ungeeignet wäre.
Zur Zeit erscheint es, daß der Stand der Technik immer noch Materialien und entsprechende Verfahren für die zur Verfügungstellung einer Implantatsoberfläche bedarf, die dazu in der Lage sind wirksam, vorhersagbar und reproduzierbar die transmurale oder kapillare Endothelialisierung zu fördern. Es erscheint, daß bisher nichts im Stand der Technik die kovalente Befestigung eines geeigneten Adhäsionsfaktors an eine steife (z. B. ununterstützte) poröse Trägeroberfläche einer implantierbaren Vorrichtung in einer Weise, die dazu in der Lage ist, die Endothelialisierung in oder durch die Wände der Vorrichtung zu fördern oder zu verbessern, nahelegt, versucht, geschweige denn erreicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine implantierbare medizinische Vorrichtung nach Anspruch 1 und ein Verfahren für die Zubereitung einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung nach Anspruch 8 zur Verfügung.
Die Anmelder haben gefunden, daß unter Berücksichtigung der vorliegenden Erfindung Biomaterialien zur Verfügung gestellt werden können, die die Steifigkeit aufweisen, die für die Verwendung als Implantat in vivo notwendig ist, während sie zur selben Zeit die Porosität aufweisen, die notwendig ist, um das Wachstum der Kapillaren durch die Poren des Biomaterials zu erlauben. Die Ausführung der vorliegenden Erfindung erlaubt es dadurch, die übliche Notwendigkeit zu vermeiden, sich auf Produkte, wie poröses ePTFE zu verlassen, das einen äußeren Verstärkungsfilm für die Verwendung in vaskulären Transplantaten aufweist. Stattdessen erlaubt die Erfindung die Verwendung von porösen ePTFE an sich nur modifiziert durch die Immobilisierung von den hierin beschriebenen Adhäsionsmolekülen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt der Artikel in Form eines vaskulären Transplantats vor und das Biomaterial ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetrafluorethylenpolymeren (wie ePTFE), aromatischen/aliphatischen Polyesterharzen (wie Polyethylenterephthalat („PET") und Poly(butylenterephthalat) („PBT"), Polyurethan und Silikongummis (wie Hitze-gereifte Gummis und die, die durch „Raumtemperaturvulkanisierung" (RTV) von Silikonelastomere gebildet werden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Adhäsionsmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibronectin, Laminin und Kollagen. Vaskuläre Transplantate der Erfindung zeigen Leistungscharakteristika, die denen natürlicher Gefäße nahe kommen, z. B. im Hinblick auf die Integrität, Stärke und Endothelzellbedeckung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das vaskuläre Transplantat aus ePTFE gebildet, das Poren aufweist, die sich durch die Transplantatwand erstrecken und einen Abstand zwischen den Knoten im Bereich von 10 bis 300 μm aufweisen, wie durch Rasterelektronenmikroskopie bestimmt. In solch einer Ausführungsform werden die Adhäsionsmoleküle kovalent an der Oberfläche, umfassend die Porenoberflächen des Implantats mittels Photochemie, immobilisiert.
Für die vaskulären Implantate der vorliegenden Erfindung ist es gefunden worden, daß sie eine verbesserte Endothelialisierung deutlich fördern, wenn sie in vivo bewertet werden. Eine solche Verbesserung kann im Hinblick auf entweder die Zahl der Zellen, für die gefunden wurde, daß sie Porenoberflächen und die innere Oberfläche des Biomaterials kolonisieren und/oder im Hinblick auf die Geschwindigkeit der Endothelialisierung nach Kontakt mit dem Körper ausgedrückt werden. Bevorzugte Transplante zeigen eine Verbesserung in der Größenornung von etwa dem dreifachen oder mehr in einer oder beiderlei Hinsicht im Vergleich zu unbeschichteten Kontrollen und vorzugsweise vierfach oder mehr. Im Vergleich zu anderen bekannten Verfahren stellen die Ergebnisse eine bedeutende Verbesserung dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen Artikel zur Verfügung, der eine implantierbare medizinische Vorrichtung umfaßt, die aus einem porösen, steifen Biomaterial gebildet wurde, das eine Oberfläche zur Verfügung stellt, die ein immobililiertes Adhäsionsmolekül in einer Menge und eines Typs zur Verfügung stellt, die/der geeignet ist die kapillare Endothelialisierung durch die Oberfläche hindurch und in die Vorrichtung zu fördern, wenn sie in vivo verwendet wird.
Wie hierin verwendet, sollen die folgenden Begriffe und Wörter die folgenden zugeschriebenen Bedeutungen haben:
„implantierbare medizinische Vorrichtung", welche aus Gründen der Kürze als „Vorrichtung" oder „medizinische Vorrichtung" bezeichnet wird, wird einen Gegenstand bezeichnen, der zumindest zum Teil aus einem Biomaterial hergestellt ist und für die Verwendung in Kontakt mit Körpergeweben umfassend Körperflüssigkeiten gedacht ist;
„Biomaterial" soll die chemische Zusammensetzung eines Materials bezeichnen, das verwendet wird, um eine Vorrichtung herzustellen und das ein oder mehrere seiner Gewebe-Kontaktoberflächen zur Verfügung stellt;
„Porosität" und Flexionen davon (wie „Poren" und „porös") soll ein Biomaterial bezeichnen, das kleine Kanäle oder Durchlässe aufweist, die auf einer äußeren (z. B. einer ersten Hauptoberfläche des Biomaterials beginnen und sich im wesentlichen durch das Biomaterial hindurch bis zu einer inneren (z. B. einer zweiten Hauptoberfläche erstrecken;
„steif" und Flexionen davon wird die Fähigkeit eines bestimmten Biomaterials bezeichnen, wenn es in der Form einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung hergestellt wird, den Drucken zu widerstehen, denen es im Laufe seiner Verwendung ausgesetzt wird und wobei es in der Lage ist die Durchgängigkeit und die Porenstruktur in vivo zu bewahren;
„Oberfläche" soll die Grenzfläche zwischen dem Biomaterial und seiner Umgebung bezeichnen. Es ist für den Begriff beabsichtigt, daß er die Verwendung des Wortes sowohl im makroskopischen Sinne (z. B. die zwei Hauptflächen eines Bogen eines Biomaterials) sowie in seinem mikroskopischen Sinne (z. B. die Auskleidung von Poren, die das Material durchdringen) umfaßt. Die Oberfläche ist dazu in der Lage, als Immobilisierungsstelle für die Zelladhäsionsmoleküle zu dienen, sowohl für die Anheftung als auch für die Wanderung von Endothelzellen;
„Adhäsionsmoleküle" sollen Peptide, Proteine und Glycoproteine bezeichnen, die dazu in der Lage sind, an ein Substrat und/oder Zellen zu binden, um Zellen an dem Substrat oder an angrenzenden Zellen zu befestigen;
„Endothelialisierung" wird, wenn nicht anders angegeben, austauschbar mit dem Begriff „kapillare Endothelialisierung" verwendet, um das Wachstum von Endothelzellen auf im wesentlichen allen Gewebe berührenden Oberflächen eines Biomaterials, das dazu verwendet wird, eine poröse, steife Vorrichtung zu bilden, zu bezeichnen.
VORRICHTUNGEN
Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung umfassen medizinische Vorrichtungen, die für den fortgesetzten Kontakt mit Körperflüssigkeiten oder Geweben vorgesehen sind, und insbesondere solche Vorrichtungen, die von der kapillaren Endothelialisierung profitieren können, wenn sie entweder in in vivo oder in in vitro Anwendungen verwendet werden. Bevorzugte Vorrichtungen sind im Körper implantierbar und umfassen vaskuläre Transplantate und künstliche Organe, wie Bauchspeicheldrüse, Leber und Niere. Andere geeignete Implantatvorrichtungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Vorrichtungen, die verwendet werden, um genetisch modifizierte Zellen zu implantieren, die rekombinante Proteine für die therapeutische Verwendung verabreichen und künstliche Gewebe- und Organimplantate, wie Ersatzhaut, Gelenke und Ohren.
Die Bedeutung der kapillaren Endothelialisierung wird bei jeder speziellen Vorrich tung abhängig von der Sorte und dem Zweck der Vorrichtung variieren. Eingewachsene Kapillaren können für das zur Verfügung stellen der Perfusion der Vorrichtung, z. B. um Nährstoffe zu Zellen in der Vorrichtung zu bringen, und um Abbauprodukte wegzubringen, nützlich sein. Eingewachsenen Kapillaren können auch für das zur Verfügung stellen von Endothelzellen nützlich sein, um die Oberflächen der vaskulären Transplantate auszukleiden, um die Blutkompatibilität zu verbessern.
Andere geeignete Vorrichtungen sind zu der in vitro Verwendung in der Lage, wie die, die für die Erzeugung von gewebekonstruierten Organen verwendet werden. Im Verlauf des Gewebekonstruktionsprozesses kann beispielsweise eine äußere Vorrichtung als Gerüststruktur für die Kultivierung von Zellen dienen, die wiederum wandern, proliferieren und differenzieren werden, um Gewebe oder Organe zu bilden, die anschließend im Patienten implantiert werden.
BIOMATERIALIEN
Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können aus einer Vielzahl steifer Biomaterlialien hergestellt werden, die dazu in der Lage sind eine Oberfläche für die Adhäsion und für die Wanderung von Endothelzellen zur Verfügung zu stellen. Eine Vielzahl geeigneter Materialien können als Träger eingesetzt werden, wobei die primären Erwägungen die sind, daß sie eine optimale Kombination solcher Eigenschaften, wie der Stärke, der Oberflächenfläche, der Einfachheit des Eindringens und der Verwendung und der Kosten zur Verfügung stellen.
Bevorzugte Trägermaterialien sind synthetische Polymere, umfassend Oligomere, Homopolymere und Copolymere, die sich entweder aus Additions- oder Kondensationspolymerisationen ergeben. Beispiele geeigneter Additionspolymere umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Acryle, wie die, die aus Methylacrylat, Methylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Methacrylamid und Ethacrylamid polimerisiert sind; Vinyle, wie Styrol, Vinylchlorid, Vinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und Vinylacetat; Polymere, die aus Ethylen, Propylen gebildet sind und Tetrafluorethylen. Beispiele von Kondensationspolymere umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Nylon, wie Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid und auch Polyurethane, Polycarbonate, Polyamide, Polysulfone, Poly(ethylenterephthalat), Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polydimethylsiloxane und Polyetherketon.
Andere geeignete Materialien umfassen Metalle und Keramiken. Die Metalle umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Titan, rostfreien Stahl, Kobaltchrom. Die Keramiken umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Silikonnitrid, Silikoncarbid, Zirkon und Tonerde sowie Glas und Kieselerde. ePTFE ist ein bevorzugtes Biomaterial für die Verwendung in der Herstellung implantierbarer Vorrichtungen in der vorliegenden Erfindung und insbesondere für die Herstellung von vaskulären Transplantaten. Geeignetes ePTFE ist in der Form vaskulärer Transplantate von solchen Quellen, wie IMPRA, Inc., Tempe, AZ, erhältlich. Die kommerziell erhältlichen Transplantate werden aus ePTFE hergestellt und in steriler Form in einer Vielzahl von Anordnungen, umfassend gerade, konisch zulaufende und stufenförmige Konfigurationen zur Verfügung gestellt.
Es ist für solche Produkte bekannt, daß sie biologisch inert sind und daß sie dazu in der Lage sind, eine deutliche inflammatorische Reaktion zu verhindern und so hergestellt werden können, daß sie eine kontrollierte mikroporöse Struktur aufweisen. Solche Biomaterialien können in einer Vielzahl von Weisen charakterisiert werden, umfassend die Fibrillenlänge. Die Kontrolle der Fibrillenlänge wiederum kann verwendet werden, um Mikrostrukturen herzustellen, die dazu in der Lage sind, Gewebeeinwachsungen auszuschließen oder anzunehmen.
STEIFIGKEIT UND POROSITÄT
Biomaterialien sind die, die eine ausreichende Steifigkeit für die für sie gewünschten Zwecke aufweisen, unabhängig davon ob sie in vivo oder in vitro verwendet werden. Für die Verwendung bei der Bildung eines vaskulären Transplantats wird ein Biomaterial beispielsweise eine ausreichende Steifigkeit aufweisen, um es dem Transplantat zu erlauben die Transplantatdurchgängigkeit und die Porenstruktur im Laufe seiner beabsichtigten Verwendung zu bewahren.
Die Steifigkeit des Biomaterials kann durch jedes geeignete Mittel bewertet werden. Die Knotenbereiche des ePTFE sind aus nicht porösen PTFE zusammengesetzt, das dazu dient Reißfestigkeit (z. B. für Nähte und Festigkeit gegenüber aneurysmalen Ausdehnungen) zur Verfügung zu stellen. Die internodalen Bereiche sind aus PTFE-Fasern zusammengesetzt, die dazu dienen die Knoten zu verbinden, wobei die Freiräume zwischen den Fasern die hierin bezeichnete Porosität zur Verfügung stellen. Die Knotengröße kann als Prozentsatz der Gewebekontaktfläche ausgedrückt werden, die aus Knoten-PTFE zusammengesetzt ist.
Der Abstand zwischen den Knoten kann als durchschnittliche Fibrillenlänge ausgedrückt werden. Die Porosität wiederum wird im allgemeinen als der Abstand zwischen den Knoten ausgedrückt (d. h. der durchschnittliche Abstand von der Mitte eines Knotens zur Mitte des benachbarten Knotens). Bevorzugte ePTFE-Materialien haben Knoten ausreichender Größe und Häufigkeit, um eine angemessene Stärke (z. B. im Hinblick auf aneurysmale Aufblähung) zur Verfügung zu stellen und Zwischenknotenbereiche von ausreichender Häufigkeit und Faserlänge, um eine angemessene Porosität zur Verfügung zu stellen (um die kapillare Endothelialisierung zu erlauben). Ein solches ePTFE-Material ist eins, das Knoten zur Verfügung stellt, die in der Größenordnung von 30% oder mehr und vorzugsweise 40% sind oder mehr der Gewebekontaktoberfläche umfassen.
Solche Materialien werden weniger, jedoch dickere Knoten zur Verfügung stellen, die wiederum eine deutlich größere Stärke in vivo zur Verfügung stellen. Im Hinblick auf die vorliegende Beschreibung wird der Fachmann dazu in der Lage sein, Vorrichtungen unter Verwendung von Biomaterialien, die eine geeignete Kombination von Porosität und Rigidität aufweisen, zu identifizieren und herzustellen.
Biomaterialien sind porös, um die Anheftung und Wanderung von Zellen zu erlauben, auf die die Bildung und das Wachstum von Kapillaren in die Oberfläche folgen kann. Geeignete Poren können in der Form kleiner Kanäle oder Durchlässe vorliegen, die an einer äußeren Oberfläche beginnen und sich zum Teil oder vollständig durch das Biomaterial erstrecken. In solchen Fällen sind die Querschnittsdimensionen der Poren größer als der Durchmesser einer Kapillare (5 μm) und typischerweise kleiner als 1 mm. Untereinander verbundene Poren sind vorzugsweise zu Vertiefungen verbunden (nicht verbundene Poren). Vorzugsweise reicht der durchschnittliche Durchmesser solcher Poren von etwa 5 μm bis zu etwa 1 mm. Die Porosität muß ausreichend groß sein, um die kapillare Endothelialisierung zu erlauben; daher sollte der durchschnittliche Durchmesser der einzelnen Poren größer als etwa 5 μm sein. Der obere Porengrößenwert ist nicht kritisch, solange das Biomaterial eine ausreichende Steifigkeit aufweist, es ist jedoch unwahrscheinlich, daß eine nützliche Vorrichtung eine durchschnittliche Porengröße von größer als etwa 1 mm aufweisen würde. Solche Porengrößen können durch mikroskopische Untersuchungen quantifiziert werden.
Mit einem bevorzugten Biomaterial, wie einem ePTFE-Material, kann die Porosität durch die Zwischenknotenbereiche des Materials bestimmt werden. Der Abstand zwischen den Knoten und die Knotenbreite sind nützliche Faktoren nicht nur um die Gesamtporosität zu bestimmen, sondern gleichermaßen auch zur Bestimmung der Stärke des Materials.
ADHÄSIONSMOLEKÜLE
Geeignete Adhäsionsmoleküle sind üblicherweise große, natürlich auftretende Proteine oder Kohlenhydrate mit Molekulargewichten über 100.000 Dalton. Adhäsionsmoleküle sind in vivo typischerweise dazu in der Lage an spezifische Zelloberflächenrezeptoren zu binden und mechanisch Zellen mit dem Substrat oder mit angrenzenden Zellen zu verbinden. Zusätzlich zu der Förderung der Zellanheftung können geeignete Adhäsionsmoleküle andere Zellantworten, umfassend die Zellwanderung und die Zelldifferenzierung fördern (die wiederum die Bildung von Kapillarröhren durch Endothelzellen umfassen kann). Bevorzugte Adhäsionsmoleküle für die Verwendung der vorliegenden Erfindung umfassen Substratadhäsionsmoleküle (SAM), wie die Proteine Laminin, Fibronectin, Kollagen, Vitronectin und Tenascin und Adhäsionspeptide oder funktionelle synthetische Analoge, die von SAM's abgeleitet sind. Andere geeignete Adhäsionsmoleküle umfassen Zell-zu-Zell Adhäsionsmoleküle (CAM), wie N-Cadherin und P-Cadherin.
Die Ausgangsadhäsionsproteine (d. h. die nativen) weisen üblicherweise eine oder mehrere aktive Peptidedomänen auf, die an Zelloberflächenrezeptoren binden und die die Zellanheftung, Wanderung und Differenzierungsaktivitäten der Ausgangsadhäsionsproteine erzeugen. Diese Domänen bestehen aus spezifischen Aminosäuresequenzen, von denen mehrere synthetisiert worden sind und von denen berichtet wurde, daß sie die Adhäsion von Endothelzellen fördern. Diese Domänen und funktionelle Analoge dieser Domänen werden als Adhäsionspeptide bezeichnet. Wünschenswerterweise weisen Adhäsionspeptide, die in dieser Erfindung verwendet werden, in ihrer Aminosäuresequenz zwischen 3 und etwa 30 Aminosäurereste auf.
Die Adhäsionspeptide aus Fibronectin umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, RGD (Arg-Gly-Asp), REDV (Arg-Glu-Asp-Val) und C/HV (WQPPRARI oder Trp-Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-Ile). Die Adhäsionspeptide aus Laminin umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) und SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) und F-9 (RYVVLPRPVCFEKGMNYTVR oder Arg-Tyr-Val-Val-Leu-Pro-Arg-Pro-Val-Cys-Phe-Glu-Lys-Gly-Met-Asn-Tyr-Thr-Val-Arg). Adhäsionspeptide aus Typ IV-Kollagen umfassen, sind aber nicht aufgeschränkt auf, Hep-III (GEFYFDLRLKGDK oder Gly-Glu-Phe-Tyr-Phe-Asp-Leu-Arg-Leu-Lys-Gly-Asp-Lys).
Siehe beispielsweise die folgenden Offenbarungen: Kleinmann, H. K., B. S. Weeks, H. W. Schnaper, M. C. Kibbey, K. Yamamura und D. S. Grant, „The Laminins: A Family of Basement Membrane Glycoproteins Important in Cell Differentiation and Tumor Metastases", Vitamins and Hormones 47: 161–186 (1993); Hubbell, J. A., S. P. Massia und P. D. Drumheller, „Surface-grafted Cell-binding Peptides in Tissue Engineering of the Vascular Graft", Am. N. Y. Acad. Sci. 665: 253–258 (1992); Mooradian, D. L., J. B. McCarthy, A. P. N. Skubitz, J. D. Cameron und L. T. Furcht, „Characterization of FN-C/H-V, a Novel Synthetic Peptide from Fibronectin that Promotes Rabbit Corneal Epithelial Cell Adhesion, Spreading, and Motility", Invest. Ophth. & Vis. Sci. 34: 153–164 (1993); Charonis, A. S., A. P. N. Skubitz, G. G. Koliakos, L. A. Reger, J. Dege, A. M. Vogel, R. Wohlhueter und L. T. Furcht, "A Novel Synthetic Peptide from the B1 Chain of Laminin with Heparin-binding and Cell Adhesion-promoting Activities, J. Cell Biol. 107: 1253–1260 (1988); und Koliakos, G. G., K. Kouzi-Koliakos, L. T. Furcht, L. A. Reger und E. C. Tsilibary, "The Binding of Heparin to Type IV Collagen: Domain Specificity with Identification of Peptide Sequences from the α1(IV) and α2(IV) Which Preferentially Bind Heparin", J. Biol. Chem. 264: 2313–2323 (1989).
Die Dichte der Adhäsionsmoleküle, die durch die tragende Oberfläche der Vorrichtung getragen wird, sollte ausreichend sein, um die Endothelzelladhäsion und die Wanderung zu fördern. Diese Dichte kann in der Form eine Vielzahl verschiedener Molekültypen und/oder einer Vielzahl von Molekülen eines bestimmten Typs zur Verfügung gestellt werden. Beispielsweise ist RGD dazu in der Lage, die Endothelzellanheftung und -verteilung zu fördern, wenn es mit 0,001 Femtomolen (10^–18 Mole) pro Quadratzentimeter immobilisiert ist. Dies ist die geringste wünschenswerte Dichte der Adhäsionsmoleküle (siehe z. B. Massia, S. P. und J. A. Hubbell, „An RGD Spacing of 440 nm Is Sufficient for Integrin α_vβ₃-mediated Fibroblast Spreading and 140 nm for Focal Contact and Streß Fiber Formation", J. Cell Biol. 114: 1089–1100 (1991)). Es sind auch viel höhere Dichten erforderlich, um Beschichtung zu erzeugen, die durch die Quervernetzung benachbarter Adhäsionsmoleküle erzeugt werden. Dieser Ansatz erfordert 1 bis 10 Monoschichten Adhäsionsmoleküle auf der Trägeroberfläche, was ungefähr 10^–10 bis 10^–9 Molen Peptid oder 10^–12 bis 10^–11 Molen Protein pro Quadratzentimeter entspricht. Daher wird die Dichte der Adhäsionsmoleküle wünschenswerterweise von etwa 10^–8 bis zu etwa 10^–9 Mole Adhäsionsmoleküle pro Quadratzentimeter der Biomaterialoberfläche reichen.
IMMOBILISIERUNG
Die Adhäsionsmoleküle werden kovalent an die poröse Vorrichtung durch einen von zwei Ansätzen gebunden. In einer Ausführungsform werden die Adhäsionsmoleküle kovalent an die Biomaterialoberfläche gebunden. In einer alternativen Ausführungsform werden die Adhäsionsmoleküle kovalent an angrenzende Adhäsionsmoleküle in einer Weise gebunden, die ein quervernetztes Adhäsionsmolekülenetzwerk erzeugen, wobei das Netzwerk physisch in der untereinander verbundenen Porosität des Biomaterials eingeschlossen ist. Bevorzugte Vorrichtungen stellen befestigte Adhäsionsmoleküle in einer Weise zur Verfügung, die eine wirksame Aktivität nach der Implantation oder unter den oben beschriebenen Zellkulturbedingungen zur Verfügung stellen.
Die kovalente Bindung bei jedem der Ansätze wird mit latent reaktiven Gruppen erreicht.
In der Ausführungsform, in der die Adhäsionsmoleküle kovalent an die Biomaterialoberfläche gebunden sind, sind die Moleküle wünschenswerterweise kovalent mit der Oberfläche durch eine Verknüpfungsgruppe verknüpft, wobei die Verknüpfungsgruppe einen Rest einer latent reaktiven Gruppe, die auf eine kovalente Bindung an die Oberfläche angewendet wird, umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Beschichtung des Adhäsionsmoleküls durch kovalente Verknüpfung der angrenzenden Adhäsionsmoleküle erzeugt, was zu einem Netzwerk quervernetzter Adhäsionsmoleküle führt, die physisch in der Porosität des Biomaterials eingeschlossen sind.
Vorzugsweise ist eine angemessenen Dichte der Adhäsionsmoleküle gleichmäßig und homogen auf den Materialoberflächen verteilt, um eine durchgängige Adhäsionsmoleküloberfläche zur Verfügung zu stellen, auf der die Endothelzellen anheften und wandern können.
Der Begriff „latent reaktive Gruppe", wie hierin verwendet, bezeichnet eine chemische Gruppe, die auf eine spezifisch angewendete äußere Energiequelle dadurch reagiert, daß sie eine aktive Spezies erzeugt, was zu einer kovalenten Bindung an angrenzende Moleküle oder eine Biomaterialoberfläche führt. Bevorzugte Gruppen sind ausreichend stabil, um unter Bedingungen gelagert zu werden, unter denen sie diese Eigenschaften bewahren. Siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,002,582.
Latent reaktive Gruppen, die auf verschiedene Teile des elektromagnetischen Spektrums reagieren, können ausgewählt werden, wobei die, die auf ultraviolette und sichtbare Teile des Spektrums reagieren (hierin als „photoreaktiv" bezeichnet) besonders bevorzugt sind. Latent reaktive Gruppen reagieren auf spezifisch angewendete externe Stimuli, um die Erzeugung aktiver Spezies hervorzurufen mit sich ergebenden kovalenten Bindung an angrenzende chemische Strukturen, z. B. wie durch dieselben oder durch ein anderes Molekül zur Verfügung gestellt. Latent reaktive Gruppen sind die Atomgruppen in einem Molekül, die ihre kovalenten Bindungen unter Lagerungsbedingungen unverändert bewahren, aber auf Aktivierung durch eine externe Energiequelle hin kovalente Bindungen mit anderen Molekülen bilden. Die latent reaktiven Gruppen erzeugen aktive Spezies, wie freie Radikale und insbesondere Nitrene, Carbene und angeregte Stadien von Ketonen nach Absorption externer elektrischer, elektromagnetischer oder kinetischer (thermischer) Energie. Latent reaktive Gruppen können ausgewählt werden, um auf verschiedene Teile des elektromagnetischen Spektrums hin zu reagieren und latent reaktive Gruppen, die z. B. auf die ultravioletten und sichtbaren Teile des Spektrums antworten, sind bevorzugt und werden hierin gelegentlich als „photochemische" Gruppen bezeichnet.
Photoreaktive Arylketone, wie Acetophenon und Benzophenon oder ihre Derivate, sind bevorzugt, da diese funktionellen Gruppen typischerweise ohne weiteres dazu in der Lage sind, die hierin beschriebenen Aktivierungs-/Inaktivierungs-/Reaktivierungszyklen zu durchlaufen. Das Benzophenon ist eine besonders bevorzugte photoreaktive Gruppe, da es zu der photochemischen Anregung unter anfänglicher Bildung eines angeregten Singletzustandes in der Lage ist, der einem Intersystemübergang zum Tripletstadium unterzogen wird. Das angeregte Tripletstadium kann sich zwischen Kohlenstoff-Wasserstoffbindung durch die Abspaltung eines Wasserstoffatoms (beispielsweise von einer Trägeroberfläche) einschieben, wodurch ein Radikalenpaar erzeugt wird. Der anschließende Zusammenbruch des Radikalenpaars führt zu der Bildung einer neuen Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung. Wenn eine reaktive Bindung (z. B. eine Kohlenstoff-Wasserstoffbindung) für die Bindung nicht verfügbar ist, ist die durch das ultraviolet-induzierte Anregung der Benzophenongruppe reversibel und das Molekül kehrt nach Entfernung der Energiequelle zum Energieniveau des Grundstadiums zurück. Photoaktivierbare Arylketone, wie Benzophenon und Acetophenon sind von besonderer Bedeutung, da sie im Wasser einer mehrfachen Reaktivierung unterzogen werden und da her eine erhöhte Beschichtungseffizienz zur Verfügung stellen. Somit sind photoreaktive Arylketone besonders bevorzugt.
Die Azide stellen eine weitere bevorzugte Klasse der latent reaktiven Gruppen dar und umfassen Arylazide (C₆R₅N₃), wie Phenylazid und insbesondere 4-Fluor-3-nitrophenylazid, Acylazide (-CO-N₃), wie Benzoylazid und p-Methylbenzoylazid, Azidoformate (-O-CO-N₃), wie Ethylazidoformat, Phenylazidoformat, Sulfonylazide (-SO₂N₃), wie Benzolsulfonylazid und Phosphorylazide (RO)₂PON₃, wie Diphenylphosphorylazid und Diethylphosphorylazid. Diazoverbindungen stellen eine weitere Klasse latentreaktiver Gruppen dar und umfassen Diazoalkane (-CHN₂), wie Diazomethan und Diphenyldiazomethan, Diazoketone (-CO-CHN₂), wie Diazoacetophenon und 1-Trifluormethyl-1-diazo-2-pentanon, Diazoacetate (-O-CO-CHN₂), wie t-Butyldiazoacetat und Phenyldiazoacetat und beta-keto-alpha-Diazoacetate (-CO-CN₂-CO-O-), wie t-Butylalphadiazoacetat.
Andere latentreaktive Gruppen umfassen die alephatischen Azoverbindungen, wie Azobisisobutyronitril, die Diazirine (-CHN₂), wie 3-Trifluormethyl-3-phenyldiazirin, die Ketene (-CH=C=O), wie Keten und Diphenylketen. Peroxyverbindungen werden als eine weitere Klasse der latent reaktiven Gruppen erwogen und umfassen Dialkylperoxide, wie di-t-Butylperoxide und Dicyclohexylperoxid und Diacylperoxide, wie Dibenzoylperoxid und Diacetylperoxid und Peroxyester, wie Ethylperoxybenzoat.

Nach der Aktivierung der latent reaktiven Gruppen, werden die Beschichtungsadhäsionsmoleküle kovalent aneinander und/oder an das Oberflächenmaterial durch kovalente Bindungen über Reste der latent reaktiven Gruppen gebunden. Beispielhafte latent reaktive Gruppen und ihre Reste nach Aktivierung werden wie folgt aufgezeigt.

Latent reaktive Gruppe	Seitenrestfunktionalität
Arylazide	Amin R-NH-R'
Acylazide	Amid R-CO-NH-R'
Azidoformate	Carbamat R-O-CO-NH-R'
Sulfonylazide	Sulfonamid R-SO₂-NH-R'
Phosphorylazide	Phosphoramid (RO)₂PO-NH-R'
Diazoalkane	neue C-C-Bindung
Diazoketone	neue C-C-Bindung und Keton

Diazoacetate	neue C-C-Bindung und Ester
beta-keto-alpha-Diazoacetate	neue C-C-Bindung und beta-Ketoester
aliphatische Azo	neue C-C-Bindung
Diazarine	neue C-C-Bindung
Ketene	neue C-C-Bindung
photoaktivierte Ketone	neue C-C-Bindung und Alkohol
Dialkylperoxide	Ether
Diacylperoxide	Ester und neue C-C-Bindungen
Peroxyester	Ether, Ester und neue C-C-Bindungen

Adhäsionsmoleküle, die in der Erfindung nützlich sind, weisen wünschenswerterweise im Durchschnitt mindestens zwei und vorzugsweise drei oder mehr latent reaktive Gruppen pro Adhäsionsmolekül auf. Die Quervernetzung zwischen angrenzenden Molekülen kann durch die Verwendung von Adhäsionsmolekülen gebildet werden, wobei jedes zwei oder mehr latent reaktive Gruppen aufweist. Eine solche Quervernetzung hilft bei dem Rückhalt der Adhäsionsmoleküle innerhalb der Porosität der Vorrichtungen.
ENDOTHELIALISIERUNG
Die Fähigkeit einer Oberfläche eine kapillare Endothelialisierung zu fördern kann in einer geeigneten Weise entweder in vivo oder in vitro bestimmt werden. Eine bevorzugte Bestimmung wird durch das Ausführen eines Tests der als Ratten-„Fettpolster"-Testverfahren bekannt ist, wie hierin beschrieben, erreicht. Unter Verwendung eines in vivo Testverfahrens wird die Endothelialisierung typischerweise für ein bestimmtes Biomaterial und eine Vorrichtung bewertet – sowohl mit als auch ohne immobilisiertes Adhäsionsmolekül. Es ist gefunden worden, daß implantierbare Vorrichtungen ohne eine Beschichtung der vorliegenden Erfindung nur geringe oder keine kapillare Endothelialisierung zeigen wird. Im Vergleich dazu zeigen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung typischerweise eine zweifache oder größere und vorzugsweise dreifache oder größere Anzahl an Endothelzellen oder Kapillaren, die an der Gewebekontaktoberfläche (umfassend Poren) des Biomaterials vorhandenen sind, im Vergleich zu einer unbeschichteten Kontrolle.
Die vorliegende Erfindung verbessert die Endothelialisierung in Vorrichtungen durch die Beschichtung der Materialoberfläche mit einer Vielzahl von Adhäsionsmolekülen. Wie oben beschrieben beinhaltet die kapillare Endothelialisierung in eine poröse Vorrichtung hinein Bedingungen, für die beabsichtigt wird, daß sie die Wanderung von Endothelzellen in die Porosität, die Proliferation der Endothelzellen mit oder ohne Ausbildung der tubularen Struktur von Kapillaren fördern.
Die Erfindung wird des weiteren durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele verdeutlicht.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Immobilisierung der Adhäsionsmoleküle
Wie hierin im größeren Detail unten beschrieben, wurden drei Adhäsionsmoleküle (Fibronectin, Laiminin und Typ IV-Kollagen) von kommerziellen Quellen erhalten und durch die kovalente Befestigung einer photoaktivierbaren latent reaktiven Gruppe photoderivatisiert. Die Proteine wurden dann zu einer porösen vaskulären Transplantatvorrichtung hinzugefügt, die aus expandierten Polytetrafluorethylen (ePTFE) gebildet war. Die Proteine wurden bestraht, um die photoaktivierbaren latent reaktiven Gruppen zu aktivieren und um eine kovalente Immobilisierung an der ePTFE-Vorrichtung zu erzeugen.
Das ePTFE hat einen niedrigen Gehalt abspaltbarer Wasserstoffe, so daß für den Mechanismus der Photoimmobilisierung der Adhäsionsmoleküle an ePTFE vermutet wird, daß er in erster Linie durch Quervernetzung aneinandergrenzende Adhäsionsmoleküle stattfindet. Wiederum wird das kovalent quervernetzte Netzwerk der Adhäsionsmoleküle über physischen Einschluß innerhalb der Porosität des ePTFE immobilisiert.
Materialien. Menschliches Serumfibronectin wurde von Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles, CA erhalten. Laminin, das von der Engelbreth-Holm-Swarm-Mäuse-Tumorzellinie hergestellt wurde, wurde von Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, erhalten. Menschliches Plazenta Typ IV-Kollagen wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten. ePTFE vaskuläre Transplantate mit einem Innendurchmesser von 6 mm oder 10 mm, einer Wanddicke von etwa 0,3 mm bis etwa 0,4 mm, einen Zwischenknotenabstand von 30 μm und ohne äußere Einhüllung wurden von IMPRA, Inc., Tempe, AZ, erhalten. Ein Transplantatmaterial, das als Produkt „80S10TW" identifiziert wurde (80 cm Länge, 10 mm innerer Durchmesser, gerade, dünne Wand) wurde verwendet, um beschichtete Scheiben, wie unten beschrieben, herzustellen und zu evaluieren.
Synthese eines heterobifunktionalen Quervernetzungsmittels. Ein heterobifunktionales Quervernetzungsmittel (BBA-EAC-NOS) wurde synthetisiert und verwendet, um jedes Protein zu photoderivatisieren. Das BBA-EAC-NOS hat an einem Ende eine photoaktivierbare Benzophenongruppe (Benzoylbenzosäure, BBA), einen Abstandshalter in der Mitte (Epsilo naminocapronsäure, EAC) und eine reaktive thermochemische Aminkopplungsgruppe am anderen Ende (N-Oxysuccinimid, „NOS"). BBA-EAC wurde aus 4-Benzoylbenzoylchlorid und 6-Aminocapronsäure synthetisiert. Dann wurde NOS-Ester des BBA-EAC durch die Esterifizierung der Carboxygruppe des BBA-EAC durch Carbodiimidaktivierung mit N-Hydroxysuccimid verestert, um BBA-EAC-NOS zu ergeben.
Photoderivatisierung und Radiomarkierung der Adhäsionsmoleküle Fibronectin, Laminin und Typ IV-Kollagen wurden jeweils durch die kovalente Kopplung primärer Amine an die Proteine über den NOS-Ester des BBA-EAC-NOS photoderivatisiert. Das BBA-EAC-NOS wurde in einem Verhältnis von 10–15 Molen BBA-EAC-NOS pro Mol Protein hinzugefügt.
Nach der Photoderivatisierung wurde ein Teil des photoderivatisierten Proteins zur Verwendung für die Quantifizierung der Proteinmenge, die auf dem ePTFE photoimmobilisiert wurde, mit Tritium radiomarkiert. Das Markierungsverfahren bestand zuerst aus dem Hinzufügen eines Mols Formaldehyd pro 5 Mole Amin auf jedem Protein. Die sich ergebende Schiffsche-Base wurde dann mit einem Mol Natriumborhydrid (4–20 Curie pro Millimol) pro 20 Mole Amin des Proteins reduziert. Überschüssige Radiomarkierung wurde durch Dialyse entfernt.
Kovalente Bindung der photoderivatisierten Adhäsionsmoleküle an ePTFE. Lösungen der photoderivatisierten Proteine wurden zu ePTFE hinzugefügt, so wurde ihnen erlaubt für 2 Stunden bei Raumtemperatur zu adsorbieren und wurden bei 320 bis 340 nm bestrahlt, um die BBA-Reste zu aktivieren und eine kovalente Kopplung zu erzeugen. Das Laminin und das Fibronectin wurde mit 25 μg Protein pro Quadratzentimeter des ePTFEs hinzugefügt und das Typ IV-Kollagen wurde mit 100 μg Protein pro Quadratzentimeter des ePTFEs hinzugefügt. Nach der Beleuchtung wurde ungekoppeltes Protein durch das Waschen der Probe über Nacht in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 1% Tween 20 enthielt, gewaschen. Nach der PBS/Tween 20-Waschung wurden die Proben durch das Eintauchen in 70%igen Ethanol für 20 Minuten sterilisiert. Das verbleibende Tween 20 und Ethanol wurde dann durch das Waschen im sterilen PBS entfernt.
Immobilisierte Proteinmengen auf dem ePTFE. Tritiummarkierte Proteine wurden verwendet, um die Mengen jedes immobilisierten Proteins auf ePTFE zu quantifizieren, wobei jedes tritierte Protein entweder nach dem es photoderivatisiert wurde (um die Menge des über die Photoimmobilisierung immobilisierten Proteins zu quantifizieren) oder bevor es photoderivatisiert wurde (um die Menge des Proteins, das über Adsorption immobilisiert wurde, zu quantifizieren) angewendet. Wie in der Tabelle 1 gezeigt, wurden größere Mengen jedes Proteins über Photochemie immobilisiert als über Adsorption, wobei der jeweilige Unterschied bei Laminin 2,5-fach höher, bei Typ IV-Kollagen 14-fach höher und bei Fibronectin 1,6-fach höher war. Unter diesen Bedingungen reicht der Prozentsatz jedes hinzugefügten Photoproteins, das photoimmobilisiert war (% Kopplungseffizienz) von 2,0 bis 9,4.
Tabelle 1
Mengen der tritierten Adhäsionsmoleküle, die auf ePTFE immobilisiert wurden. Immobilisierte Proteinmengen werden als Mittelwert von 3 Wiederholungen gezeigt; S. E. M. deutet den Standardfehler des Mittelwerts an.
BEISPIEL 2
Zellkulturbewertungen
In vitro biologische Aktivität der immobilisierten Adhäsionsmoleküle. ePTFE-Scheiben mit 1,4 cm Durchmesser wurden mit nicht tritierten photoderivatisierten Proteinen unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens photoderivatisiert. Sie wurden dann auf ihre biologische, in vitro Aktivität in einem Testverfahren bewertet, um die Fähigkeit zu bestimmen, die Proliferation vaskulärer Endothelzellen zu unterstützen. Unbeschichtete ePTFE-Scheiben wurden als Kontrolle bewertet und die verbleibenden Scheiben wurden entweder mit Laminin, Typ IV-Kollagen oder Fibronectin beschichtet. Jede der vier Scheibensorten wurde in einzelne Vertiefungen von 24-Vertiefungszellkulturplatten eingebracht, wurden mit 1500 Zellen pro Vertiefung Kalbslungenendothelzellen angeimpft (CPAE-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhalten wurden), und unter Standardzellkulturbedingungen, die von der American Type Culture Collection vorgeschrieben waren, kultiviert.
Nach sechs Tagen in Kultur wurden die relativen Zellzahlen in jeder Vertiefung unter Verwendung eines metabolischen Tetrazoliumfarbstoffs bestimmt. Wenn der Tetrazoliumfarbstoff (MTT) zu den Zellen hinzugefügt wird, wandelt die metabolische Aktivität der lebenden Zellen das hinzugefügte MTT zu einem gefärbten Produkt um, wobei die Menge der Farberzeugung zu der Anzahl der vorhandenen lebensfähigen Zellen proportional ist. Da das gefärbte Produkt des MTT-Metabolismus das Licht bei 570 mm absorbiert, konnte die relative Zahl der wachsenden Zellen auf jeder ePTFE-Scheibe durch die Löslichmachung der Zellen auf jeder Scheibe und das Messen der Absorption der sich ergebenden Lösung in einem Spektrophotometer bei 570 nm wie durch Mosmann, T., „Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays", J. Immunol. Method. 65: 55–63 (1983) beschrieben, quantifiziert werden.
Die Tabelle 2 zeigt das ePTFE, das mit jeder Proteinsorte beschichtet ist, Endothelzellzahlen im Vergleich zu der unbeschichteten Kontrolle in der Größenordnung von dem 19-fach oder mehr unterstützt. Es kann bemerkt werden, daß jedes photoimmobilisierte Protein eine ähnliche Menge des Endothelzellwachstums fördert, was in Übereinstimmung mit den von anderen berichteten Ergebnissen, wie sie oben beschrieben wurden, steht.
Tabelle 2
Wachstum der Endothelzellen auf ePTFE, das vorher mit photoimmobilisierten Proteinen beschichtet wurde. Die relativen Zellzahlen werden mittels der Absorption eines Tetrazoliumfarbstoffs (MTT) bei 570 nm gemessen ausgedrückt, wobei der Mittelwert aus vier Wiederholungen und dem Standardfehler des Mittelwerts (S. E. M.) gezeigt wird.
Ähnliche Experimente wurden durchgeführt, um das Wachstum von CPAE-Zellen auf ePTFE, das zuvor mit absorbierten oder photoimmobilisierten Protein beschichtet war, zu vergleichen. Die immobilisierten Mengen des Fibronectins und Kollagens waren zu denen in Tabelle 1 berichteten ähnlich und die beschichteten ePTFE-Proben wurden auf das Wachstum von CPAE-Zellen, wie in Tabelle 2 beschrieben, bewertet. Die Zellwachstumsergebnisse zeigten überraschenderweise, daß die Mengen des Zellwachstums, die mit absorbierten Proteinen gefunden wurden, statistisch nicht anders waren als die, die für unbeschichtete Proben beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu förderten photoimmobilisierte Proteine einheitlich ein CPAE-Wachstum, das größer als das der unbeschichteten Kontrollen war und vergleichbar mit dem, das für photoimmobilisierte Proteine in der Tabelle 2 beobachtet wurde. Während es nicht beabsichtigt ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, erscheint es, daß die adsorbierten Proteine von dem ePTFE durch die CPAE-Zellen entfernt wurden, wodurch eine Oberfläche erzeugt wurde, die mit der von unbeschichteten ePTFE vergleichbar war. Im Gegensatz dazu wurden kovalent immobilisierte (photoimmobilisierte) Proteine nicht durch die CPAE-Zellen entfernt und stellten eine stabile Oberfläche für das Zellwachstum zur Verfügung. Darüber hinaus wird für die verbesserte Stabilität solcher kovalent immobilisierter Proteine erwartet, daß sie die Stabilität solcher Beschichtungen gleichermaßen nach der Aussetzung gegenüber der Belastung der in vivo Umgebung verbessern.
BEISPIEL 3
Kapillare Endothelialisierung in beschichtetes ePTFE im Rattenmodell
Das Rattenepidymale-Fettpfotenimplantatsystem. Die Anmelder haben gefunden, daß die Adhäsionsmoleküle der vorliegenden Erfindung stark, z. B. kovalent an ein Substrat gebunden sein sollten, um die Endothelialisierung in poröse Implantatvorrichtungen zu fördern. Um sich der Menge der Endothelialisierung weiter zu nähren, die für menschliche Anwendungen notwendig sind und um andererseits die Leistungsfähigkeit verschiedener Ausführungsformen vorherzusagen, kann ein geeignetes Tierimplantationssystem verwendet werden. Die meisten Vorrichtungen, für die die Erfindung wahrscheinlich im Patienten verwendet wird (z. B. vaskuläre Transplantate) werden subkutan oder an ähnliche Stellen implantiert. Solche Stellen weisen üblicherweise große Mengen Fettgewebe auf. Andererseits sind häufig 90% oder mehr der in solchen Fettgewebe vorhandenen Zellen mikrovaskuläre Endothelzellen, wobei der Großteil der verbleibenden Zellen Fettzellen sind (siehe z. B. Williams, S. K., T. F. Wang, R. Castrillo und B. E. Jarrell, „Liposuction-derived Human Fat Used for Vascular Graft Sodding Contains Endothelial Cells and Not Mesothelial Cells as the Major Cell Type", J. Vasc. Surg. 19: 916–923 (1994).
Im Gegensatz zu Menschen enthalten subkutane Stellen in Tieren häufig wenig Fettgewebe, wenig mikrovaskuläre Endothelzellen und eine Vielzahl von Fibroblasten (Williams, S. K. und L. B. Kleinert, „Differential Healing of ePTFE Implants in Subcutaneous Versus Adipose Tissue", Seiten 74–75 in Symposium Notebook for Surfaces in Biomaterials Symposium abgehalten in Scottsdale, AZ (7.–10. September 1994). Ratten-epididymales Fett hat jedoch eine Morphologie, das dem menschlichen subkutanen Fett im zellulären Gehalt stark ähnelt. Darüber hinaus können mikrovaskuläre Endothelzellen aus Ratten-epididymalen Fettpolstern unter Verwendung von Verfahren, die dem ähnlich sind, die für mikrovaskuläre Endothelzellen aus menschlichen subkutanen Fettgewebe verwendet werden, isoliert und kultiviert werden. Es folgt ein Protokoll, das durch Dr. Stuart Williams der Universität Arizona at Tucson entwickelt wurde und hierin für die Bewertung der beschichteten Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in ein Tiermodell aufgenommen wurde.
Implantationsprotokolle. 18 Erwachsene Sprague-Dawley-Ratten wurden mit ePTFE-Scheiben mit einem 1 cm Durchmesser, die in der für Tabelle 2 beschriebenen Weise beschichtet wurden, implantiert. Es wurden auch vier Probentypen, wie in der Tabelle 2 beschrieben, bewertet, nämlich unbeschichtete Kontrollen und jedes der drei photoimmobilisierten Proteine (Laminin, Typ IV-Kollagen und Fibronectin). Für die Implantatchirurgie wurde jede Ratte mit 50 mg/kg Nembutal^® anästhesiert, ein abdominaler Mittellinieneinschnitt wurde gemacht und der distale Teil jedes epididymalen Fettpolsters wurde chirurgisch dargestellt. Die serosale Schicht jedes Fettpolsters wurde eingeschnitten und eine ePTFE-Scheibe wurde in jedes Fettpolster eingeführt; somit erhielt jede Ratte zwei ePTFE-Scheiben. Die ePTFE-Scheiben wurden durch das Nähen des Fetts um jede Scheibe immobilisiert und die abdominalen Einschnitte wurden geschlossen.
Jede der vier Beschichtungsvariationen wurde in neun verschiedene Ratten implantiert, wobei zwei Variationen, die in jede Ratte implantiert wurden, randomisiert waren. Sechs Ratten (die drei Scheiben mit jeder Beschichtungsvariante enthielten) wurden nach einer, drei bzw. fünf Wochen getötet. Die Scheiben und umgebendes epididymales Gewebe wurden entnommen und für Histologie und Immuncytochemie vorbereitet.
Histologie. Jede Probe des ePTFE und umgebendes Gewebe wurde mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4) fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten, deparaffiniert und gefärbt, um die Visualisierung der Zellen, die in der Porosität des ePTFE wachsen, zu ermöglichen. Die mit Hematoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Schnitte zeigten große Kapillarzahlen in ePTFE-Scheiben, die mit Fibronectin oder Laminin beschichtet waren; es wurden jedoch weniger Kapillaren in Scheiben beobachtet, die mit Typ IV-Kollagen beschichtet waren oder bei unbeschichteten Kontrollscheiben.
Da H&E nicht verwendet werden kann, um zwischen Endothelzellen und mehreren anderen Zelltypen zu unterscheiden, wurde ein immuncytochemischer Farbstoff, der für vaskuläre Endothelzellen spezifisch ist, verwendet, um zu bestätigen, daß die Strukturen, die (beruhend auf der H&E-Färbung) Kapillaren zu sein schienen, tatsächlich aus Endothelzellen zusammengesetzt waren. Ein immuncytochemisches Verfahren wurde eingesetzt, das auf der Gegenwart eines einzigartigen Zelloberflächenkohlenhydrats innerhalb von vaskulären Endothelzellen beruhte, das durch das Lectin Griffonia gefärbt werden kann (siehe z. B. Christy, J. P., F. M. Lupinetti, A. H. Mardan und S. A. Thompson, „Endothelial Cell Viability in the Rat Aortic Wall", Ann. Thorac. Surg. 51: 204–207 (1991).
Das Färbeverfahren beinhaltete das Reagieren der Gewebfschnitte mit Fluorescin-markierten Griffonia unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, um Zellen zu identifizieren, die ein Fluoreszenz zeigten. Für diese Studie war die fluoreszente Gruppe des Griffonias das Fluorescinisothiocyanat (FITC). Das Färben mit Fluorescin-markierten Griffonia erzeugte zwei bedeutende Ergebnisse. Zuerst bestätigte der Test, daß die röhrenförmigen Strukturen, die bei Bewertung durch H&E-Färbung Kapillaren zu sein schienen, tatsächlich aus Endothelzellen zusammengesetzt waren. Die relative Zahl der in unbeschichteten Scheiben im Vergleich zu jeder Proteinbeschichtung vorhandenen Kapillaren werden in der Tabelle 3 gezeigt und sie zeigen, daß drei- bis viermal so viele Kapillaren in mit Fibronectin oder Laminin beschichteten ePTFE wuchsen als in unbeschichteten Scheiben oder mit Typ IV-Kollagen beschichteten Scheiben.
Zweitens bestätigte der Test die Gegenwart von zusätzlichen Endothelzellen, die keine Kapillaren gebildet hatten sowie auch die Gegenwart vieler Endothelzellen, die in der Porosität der mit Typ IV-Kollagen beschichteten Scheiben, aber nicht in den Kontrollscheiben (unbeschichtet) oder in mit Fibronectin oder Laminin beschichteten Scheiben vorhanden waren.
Die Daten unterstützen den Schluß, daß: 1) unbeschichtete ePTFE-Scheiben das Einwachsen weniger Endothelzellen und weniger Kapillaren fördern, 2) daß ePTFE-Scheiben, die mit Typ IV-Kollagen beschichtet sind, das Einwachsen von Endothelzellen fördern, aber die meisten dieser Endothelzellen bilden keine Kapillaren und 3) daß ePTFE-Scheiben, die mit Fibronectin oder Laminin beschichtet sind, das Einwachsen von Endothelzellen mit einer deutlichen Menge der Kapillarbildung fördern.
Tabelle 3
Einwachsen von Kapillaren in beschichtete ePTFE-Proben, die 5 Wochen in Rattenfettpolster implantiert wurden. Kapillarröhren wurden im Mikroskopsichtfeld von 400 × 400 Mikron (0,16 cm²) gezählt und von der Anzahl pro 0,16 mm² zur Anzahl pro 1 mm² umge wandelt. Mittelwerte sind der Durchschnitt von 5–9 Bestimmungen. Der S. E. M. ist der Standardfehler des Mittelwerts.
Da die kapillare Endothelialisierung in die Wände eines Transplantats hinein ein Schlüsselbestandteil im Prozeß der transmuralen in vivo Endothelialisierung ist, kann für Beschichtungen, die dazu in der Lage sind die kapillare Endothelialisierung in ePTFE-Scheiben, die in Ratten-epididymale Fettpolster implantiert sind, zu fördern, erwartet werden, daß sie die transmurale Endothelialisierung von interpositionalen Transplantaten, die in Arterien implantiert sind fördern.
Die Beispiele zeigen, daß Adhäsionsproteine kovalent an ePTFE in Mengen gebunden werden können, die deutlich höher sind als die, die mit einfacher Adsorption beobachtet werden. Sie zeigen auch, daß jedes photoimmobilisierte Protein eine ähnliche 19-fache Verstärkung des Endothelzellwachstums in vitro erzeugte. Schließlich zeigen die Beispiele, daß Fibronectin und Laminin aber nicht Typ IV-Kollagen eine deutlich verstärkte kapillare Endothelialisierung in vivo erzeugt.

Claims

Implantierbare medizinische Vorrichtung, umfassend ein festes, d. h. in der Lage, die Durchgängigkeit und Porenstruktur in vivo beizubehalten, poröses Biomaterial eines nicht-löslichen Polymers, ein Metall oder eine Keramik, das eine Oberfläche aufweist, die immobilisierte Adhäsionsmoleküle von Fibronektin, Laminin, Kollagen oder aktiven Peptiddomänen davon trägt, wobei die Adhäsionsmoleküle aneinander oder an die Oberfläche des Biomaterials durch die Aktivierung von mindestens einer photoreaktiven Gruppe, die kovalent an die Adhäsionsmoleküle gebunden wurde, gebunden wurden, wobei die photoreaktive Gruppe ein photoreaktives Arylketon, ein Azid, ein Diazirin, ein Keten oder eine Diazoverbindung ist, wobei das Adhäsionsmolekül in der Lage ist, an die Oberfläche einer Zelle zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomaterial zur Verwendung in der transmuralen Endothelisierung der Vorrichtung in vivo durch das Wachstum von Kapillaren durch Kanäle oder Passagen, die sich durch das Biomaterial hindurch erstrecken, porös ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung in Form eines vaskulären Grafts vorliegt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Biomaterial ein Tetrafluorethylenpolymer, ein aromatisches/aliphatisches Polyesterharz, ein Polyuretan oder ein Silikongummi ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Tetrafluorethylenpolymer expandiertes Polytetrafluorethylen umfaßt, das aromatische/aliphatische Polyersterharz Polyethylenterifterat („PET") oder Poly(butylenterephthalat) („PBT") umfaßt und das Silikongummi ein hitzegehärtetes Gummi oder Silikonelastomer umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Biomaterial expandiertes Polytetrafluorethylen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, wobei das expandierte Polytetrafluorethylen 10 bis 300 Mikron internodalen Abstand aufweist.
Artikel nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das Biomaterial Poren zur Verfügung stellt, die einen durchschnittlichen Durchmesser von 5 Mikron bis 1 Millimeter aufweisen.
Verfahren zur Herstellung einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend die Schritte von: a) zur Verfügung stellen einer implantierbaren Vorrichtung, die ein festes poröses Biomaterial umfaßt, das eine Oberfläche aufweist, wobei das Biomaterial porös ist, um so Kanäle oder Passagen zur Verfügung zu stellen, die sich durch das Biomaterial hindurch erstrecken, von ausreichenden Dimensionen, um das Wachstum von Kapillaren hindurch zu ermöglichen; b) in Kontakt bringen der Oberfläche mit Adhäsionsmolekülen von Fibronektin, Laminin, Kollagen oder aktiven Peptiddomänen davon, wobei die Adhäsionsmoleküle mindestens eine latent photoreaktive Gruppe eines photoreaktiven Arylketons, eines Azids, eines Diazirins, eines Ketens oder einer Diazoverbindung tragen; und c) Aktivieren der mindestens einen photoreaktiven Gruppe, um die Adhäsionsmoleküle durch Bindung der Adhäsionsmoleküle aneinander oder die Oberfläche zu immobilisieren, in einer Menge, die geeignet ist, um die kapillare Endothelisierung der Vorrichtung in vivo zu unterstützen.