DE69634299T2

DE69634299T2 - Regulierung intrazellulärer Glucocorticoidkonzentrationen

Info

Publication number: DE69634299T2
Application number: DE69634299T
Authority: DE
Inventors: Robert Brian WALKER; Richard Christopher EDWARDS; Robert Jonathan SECKL
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 1996-08-28
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2016-08-29
Also published as: US6838253B2; EP0847275B1; US6368816B2; US6946487B2; DE69634299D1; WO1997007789A1; ATE288261T1; PT847275E; US7122531B2; US20020128245A1; US20010039294A1; US20030078244A1; ES2235194T3; US7087400B2; US20030069216A1; US20020128246A1; EP0847275A1; US7129231B2; US20020076781A1; AU6833796A

Description

Diese Erfindung betrifft die wechselseitige Umwandlung zwischen inaktiven 11-Ketosteroiden und ihren aktiven 11β-Hydroxy-Äquivalenten, Verfahren, durch die die Umwandlung der inaktiven in die aktive Form kontrolliert werden kann, sowie nützliche therapeutische Effekte, die als Ergebnis einer solchen Kontrolle erhalten werden können. Spezifischer, jedoch nicht ausschließlich, betrifft die Erfindung die wechselseitige Umwandlung zwischen Cortison und Cortisol beim Menschen.
Glucocorticoide, wie etwa Cortisol, weisen eine Anzahl verschiedener Wirkungen auf unterschiedliche Körpergewebe auf. So wurde beispielsweise die Verwendung von Cortisol als entzündungshemmendes Mittel in unserer internationalen Patentanmeldung WO 90/04399 beschrieben, die sich mit dem Problem beschäftigte, dass therapeutisch verabreichtes Cortisol dazu neigt, im Körper durch 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenaseenzyme in inaktives Cortison umgewandelt zu werden. Unsere frühere Erfindung stellte die Verstärkung von Cortisol durch die Verabreichung eines Inhibitors der 11β-Dehydrogenaseaktivität dieser Enzyme bereit.
Eine weitere, wesentliche physiologische Wirkung von Cortisol ist dessen Antagonismus gegenüber Insulin, wobei es z. B. bekannt ist, dass hohe Konzentrationen an Cortisol in der Leber die Insulin-Empfindlichkeit dieses Organs wesentlich vermindern, das dann dazu neigt, die Gluconeogenese zu verstärken und folglich den Blutzuckerspiegel anhebt [1]. Dieser Effekt ist besonders nachteilig für Patienten, die unter einer verminderten Glucosetoleranz oder unter Diabetes mellitus leiden, und bei denen die Wirkung des Cortisols dazu führen kann, dass die Insulinresistenz verschlimmert wird. Tatsächlich kann beim Cushing Syndrom, das durch exzessive Konzentrationen an zirkulierendem Cortisol verursacht wird, der Antagonismus gegen Insulin bei dafür empfindlichen Individuen Diabetes mellitus auslösen [2].
Wie oben erwähnt, ist es bekannt, dass Cortisol im Körper durch die 11β-Dehydrogenaseaktivität der 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenaseenzyme zu Cortison umgewandelt wird. Es ist auch bekannt, dass die umgekehrte Reaktion, die Umwandlung von inaktivem Cortison zu aktivem Cortisol, in bestimmten Organen durch die 11β-Reduktaseaktivität dieser Enzyme bewirkt wird. Diese Aktivität ist auch als Corticosteroid-11β-Reduktase, Cortison-11β-Reduktase oder als Corticosteroid-11β-Oxidoreduktase bekannt.
Es ist erst in jüngerer Zeit festgestellt worden, dass es mindestens zwei verschiedene Isoenzyme der 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase gibt (gemeinsam abgekürzt als 11β-HSD, wobei diese Bezeichnung – wo es passend ist – in dieser Schrift verwendet wird). Aldosteron-Zielorgane und die Plazenta exprimieren ein NAD^–-abhängiges Enzym hoher Affinität (11β-HSD2) [3]. Dieses Enzym ist in der Plazenta und der Niere charakterisiert worden [4, 5], und es wurden cDNA-Klone isoliert [6, 9]. 11β-HSD2 katalysiert ausschließlich 11β-Dehydrogenaseaktivität [4, 7]. Im Gegensatz dazu ist das zuvor gereinigte, aus der Leber erhaltene Isoenzym (11β-HSD1) ein NADP^–/NADPH-abhängiges Enzym geringerer Affinität [10, 11]. Die Expression von 11β-HSD1 in einer Reihe von Zelllinien codiert entweder ein bidirektionales Enzym [11, 12] oder eine vorherrschende 11β-Reduktase [13, 15], die, weit davon entfernt, Glucocorticoide zu inaktivieren, aktives 11β-Hydroxysteroid aus dem ansonsten inerten 11-Ketosteroid regeneriert. Die 11β-Reduktaseaktivität, am besten in intakten Zellen untersucht, aktiviert das 11-Ketosteroid, die Transkription von Zielgenen und die Funktion differenzierter Zellen zu verändern [13, 14]. 11β-HSD1 und 11β-HSD2 sind die Produkte verschiedener Gene und haben nur 20% Aminosäurehomologie gemeinsam [6, 7].
Stewart et al., J. steroid Biochem. Mol. Biol., Band 40, Nr. 4–6, S. 501 bis 509, offenbart einen Enzymkomplex, 11β-OHSD, der aus einer 11β-DH, die im Menschen Cortisol in Cortison umwandelt, und einer Ketoreduktase, die die umgekehrte Reaktion durchführt, besteht. Dieses Dokument zitiert Carboxelon, dessen Einnahme mit der Inhibition von 11β-DH assoziiert wird.
Soweit die Anmelder wissen, sind zuvor keine Anstrengungen unternommen worden, um die Wirkung von 11β-Reduktase zu modifizieren. Wir haben nun herausgefunden, dass es möglich ist, diese Aktivität in vivo zu inhibieren, und haben bei dieser Tätigkeit die Möglichkeit eines neuen Medikaments für die Verwendung zur Behandlung vieler der schädlichen Effekte des massiven Glucocorticoid-Überschusses geschaffen. Walker et al., Clin. Endocrinol., Band 39, Nr. 2, 1993, S. 221–227 bezieht sich auf die Hypothese, dass Carbenoxolon beim Menschen beide 11β-Dehydrogenaseaktivitäten hemmt und schlägt vor, dass die gleichzeitige Inhibierung beider Aktivitäten in einer verstärkten intra-renalen Cortisol-Konzentration, jedoch in einer verminderten intra-hepatischen Cortisol-Konzentration resultieren könnte, während die zirkulierenden Konzentrationen an Cortison und Cortisol unverändert bleiben.
Unsere Studien haben auch gezeigt, dass 11β-HSD1 im Fettgewebe von Ratten und in Fettzelllinien in Kultur exprimiert wird, wo es 11-Dehydrocorticosteron in Corticosteron (die Ratten-Äquivalente von humanem Cortison bzw. Cortisol) umsetzt. Dies legt nahe, dass in menschlichem Fettgewebe eine ähnliche 11β-Reduktaseaktivität zu beobachten sein wird, mit dem Ergebnis, dass die Inhibition des Enzyms eine Linderung der Auswirkungen der Insulinresistenz in menschlichem Fettgewebe bewirken wird. Dies würde zu einer besseren Gewebenutzung von Glucose und Fettsäuren führen und damit die zirkulierenden Spiegel senken. Die Erfindung stellt daher in einem weiteren Aspekt einen 11β-Reduktase-Inhibitor für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, ausgewählt unter Fettgewebeinsulinresistenz, neuronalem Verlust oder neuronaler Funktionsstörung aufgrund von durch Glucocorticoid verstärkter Neurotoxizität und einer Kombination dieser zwei Zustände, bereit.
Die Ergebnisse unserer Studien haben uns ermutigt, anzunehmen, dass die Inhibition der intrazellulären Cortisolproduktion auch zu einer verstärkten Insulin-Empfindlichkeit in anderen Geweben, auf die Insulin einwirkt, führen wird, z. B. der Skelettmuskulatur [21]. Die Inhibition der 11β-Reduktase verspricht daher eine Umkehr der Auswirkungen der Insulinresistenz im Muskelgewebe und eine Förderung der Aufnahme essentieller Moleküle wie etwa Glukose und freier Fettsäuren in die Muskelzellen, mit einem infolge verbesserten Muskelmetabolismus und einer Verminderung der zirkulierenden Spiegel an Glucose und Fettsäuren.
Es ist auch bekannt, dass ein Glucocorticoid-Überschuss die Wirkung bestimmter Neurotoxine verstärkt, was zu neuronaler Funktionsstörung und neuronalem Verlust führt. Wir haben die wechselseitige Umwandlung zwischen 11-Dehydrocorticosteron und Corticosteron in Kulturen aus dem Hippocampus der Ratte untersucht und haben (überraschender Weise angesichts der schädigenden Wirkungen der Glucocorticoide) herausgefunden, dass die 11β-Reduktaseaktivität in intakten Hippocampus-Zellen über die 11β-Dehydrogenaseaktivität dominiert [22]. Der Grund für diese Aktivität ist unbekannt, jedoch deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass der Glucocorticoid-Überschuss in Hippocampus-Zellen (bzw. in Ausweitung auf das Nervensystem im Allgemeinen bezogen) mittels Verwendung eines 11β-Reduktase-Inhibitors kontrolliert werden kann. Somit stellt die Erfindung einen alternativen Aspekt der Verwendung eines Inhibitors der 11β-Reduktase für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Minderung neuronaler Funktionsstörung und neuronalen Verlustes aufgrund einer durch Glucocorticoid verstärkten Neurotoxizität bereit. Es ist auch möglich, dass Glucocorticoide an Wahrnehmungsstörung im Alter mit oder ohne neuronalen Verlust und auch an dendritischer Abschwächung beteiligt sind [23–25]. Weiterhin sind Glucocorticoide in die neuronale Funktionsstörung bei schweren Depression einbezogen worden. Daher könnte ein Inhibitor der 11β-Reduktase auch bei diesen Zuständen wertvoll sein.
Es wird aus dem Vorstehenden ersichtlich werden, dass die potentiellen Nutzeffekte von Inhibitoren der 11β-Reduktase zahlreich und verschiedenartig sind, und es wird so eingeschätzt, dass in vielen Fällen eine kombinierte Aktivität gezeigt werden kann, die darauf abzielt, die Auswirkungen endogener Glucocorticoide bei Diabetes mellitus, Fettsucht (einschließlich Stammfettsucht), neuronalem Verlust und Wahrnehmungsstörung im Alter auszuschalten. Somit stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung eines Inhibitors der 11β-Reduktase für die Herstellung eines Medikaments zum Erzielen mehrerer therapeutischer Effekte bei einem Patienten, dem das Medikament verabreicht wird, bereit; diese therapeutischen Effekte beinhalten eine Zunahme der Insulinempfindlichkeit in Fettgewebe und die Vorbeugung oder Minderung von neuronalem Verlust/Wahrnehmungsstörung aufgrund von durch Glucocorticoid verstärkter Neurotoxizität oder neuronaler Funktionsstörung oder Schädigung.
Von einem alternativen Gesichtspunkt aus betrachtet, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Patienten bereit, der unter einem Zustand leidet, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leberinsulinresistenz, Fettgewebeinsulinresistenz, Muskelinsulinresistenz, neuronalem Verlust oder neuronaler Funktionsstörung aufgrund von durch Glucocorticoid verstärkter Neurotoxizität, sowie jedweder Kombination der vorstehend genannten Zustände, wobei das Verfahren den Schritt der Verabreichung eines Medikaments, enthaltend eine pharmazeutisch wirksame Menge eines 11β-Reduktase-Inhibitors, an den Patienten umfasst.
Wie zuvor erwähnt, sind die Faktoren, die die relativen Aktivitäten der 11β-Dehydrogenase und der 11β-Reduktase unter verschiedenen Bedingungen kontrollieren, insbesondere im Falle des 11β-HSD1-Isoenzyms, schlecht verstanden. Es ist wahrscheinlich, dass ein 11β-Reduktase-Inhibitor in vivo für das 11β-HSD1-Isoenzym selektiv sein wird. Wir haben beispielsweise herausgefunden, dass Glycyrrhetinsäure (ein bekannter Inhibitor der 11β-Dehydrogenase) in vivo keine Wirkung auf 11β-Reduktase zeigt [26]. Jedoch haben wir überraschend herausgefunden, dass Carbenoxolon, das als Inhibitor des 11β-Dehydrogenaseenzyms bekannt ist, in vivo auch die 11β-Reduktase hemmt [26, 27]. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Inhibitor daher Carbenoxolon (3β-(3-Carboxypropionyloxy)-11-oxo-olean-12-en-30-säure) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon. Die von uns in unseren Studien verwendete Dosis an Carbenoxolon betrug 100 mg alle 8 Stunden bei oraler Verabreichung.
Die Erfindung wird im Folgenden rein beispielhaft und unter Bezugnahme auf die folgenden Versuchsprozeduren, Ergebnisse und begleitenden Zeichnungen in größerem Detail beschrieben, wobei von den Figuren:
1 ein Graph ist, der die Dextrose-Infusionsraten (M-Werte) nach Verabreichung eines Placebos oder von Carbenoxolon in einer euglykämischen, hyperinsulinämischen Klemmstudie zeigt, die beim Menschen durchgeführt wurde;
2 ist ein Graph, der die Plasma-Glukosekonzentrationen im nüchternen Zustand bei Ratten nach Placebo-Behandlung oder Carbenoxolon-Behandlung bei den angegebenen täglichen Dosen zeigt;
3 ist ein Graph, der die Auswirkung der Verabreichung von Östradiol auf Ratten, denen die Gonaden oder die Gonaden und Nebennieren entfernt wurden, im Hinblick auf die hepatische 11β-HSD1-Aktivität sowie die mRNA-Expression für 11β-HSD1 und PEPCK darstellt;
4 beinhaltet Graphen von Daten, die von Mäusen erhalten wurden, die entweder homozygot für das wildtypische 11β-HSD1-Alle) oder homozygot für ein mutantes Knock out-Allel von 11β-HSD1 sind;
5 zeigt die 11β-HSD1-Enzymaktivitäten und die -mRNA-Expression in undifferenzierten und differenzierten 3T3-F442A-Zellen;
6 ist ein Graph, der die Wirkung einer Vorbehandlung mit Corticosteron und 11-Dehydrocorticosteron mit oder ohne Carbenoxolon auf das Überleben von Zellen aus dem Hippocampus der Ratte nach Exposition gegenüber Kainsäure zeigt.
VERSUCHSERGEBNISSE ZUR UNTERMAUERUNG DER ERFINDUNG
A. INSULINEMPFINDLICHKEIT
A.1 AUSWIRKUNG VON CARBENOXOLON AUF DIE INSULINEMPFINDLICHKEIT BEIM MENSCHEN
In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Beobachtungen an tierischen Geweben und kultivierten Zellen haben wir die relativen Aktivitäten der 11ß-Dehydrogenase und 11β-Reduktase in vivo bei verschiedenen Organen des Menschen etabliert, indem das Cortisol/Cortison-Verhältnis im Plasma aus selektiven venösen Kathetern gemessen wurde [28]. Bei den meisten Organen enthält der venöse Abfluss Cortisol und Cortison in einem Verhältnis von 10 : 1. Im renalen Venenplasma ist das Verhältnis jedoch 3 : 1, während es im hepatischen Venenplasma 55 : 1 ist, was mit der starken Aktivität von 11β-Dehydrogenase aufgrund der 11β-HSD2-Expression in der Niere und der starken 11β-Reduktaseaktivität, d. h. der starken 11β-HSD1-Aktivität in der Leber übereinstimmt. Darüber hinaus wird oral aufgenommenes und somit über die Pfortader zur Leber transportiertes Cortison begierig auf direktem Wege in Cortisol für den peripheren Kreislauf umgewandelt [26, 27]. Unter Verwendung dieses Index' der 11β-Reduktaseaktivität haben wir gezeigt, dass Carbenoxolon (aber nicht Glycyrrhetinsäure) [26, 27] zusätzlich zur Hemmung der renalen 11β-Dehydrogenaseaktivität auch die hepatische 11β-Reduktaseaktivität beim Menschen in vivo hemmt.
In der Leber werden Mineralcorticoid-Rezeptoren nicht in signifikanter Zahl exprimiert, während Glucocorticoid-Rezeptoren überreich vorhanden sind. Erstaunlicherweise ist die Affinität der Glucocorticoid-Rezeptoren für Cortisol 10–40mal niedriger als die Affinität der Mineralcorticoid-Rezeptoren [29]. Es könnte so sein, dass der Schutz der hohe Affinität besitzenden Mineralcorticoid-Rezeptoren des distalen Nephrons vor Cortisol die 11β-Dehydrogenaseaktivität erfordert, während die 11β-Reduktaseaktivität in der Leber dazu benötigt wird, sicherzustellen, dass die Glucocorticoid-Rezeptoren mit niedriger Affinität genügenden Mengen an Cortisol ausgesetzt werden. Die freien zirkulierenden Konzentrationen an Cortisol und Cortison sind etwa gleich, sodass ein großer Pool an Cortison für die Aktivierung in der Leber verfügbar ist. Ein derartiger Mechanismus wäre analog zu der intrazellulären Aktivierung der anderen Mitglieder der Thyroid-Steroidhormon-Familie, die in relativ inaktiven Formen zirkulieren [30], wie etwa Testosteron, das durch 5α-Reduktase in Dihydrotestosteron umgewandelt wird, und Thyroxin, das durch 5'-Monodeiodinase in Triiodthyronin umgewandelt wird.
Um diese Hypothese zu testen, haben wir Carbenoxolon verwendet, um die 11β-Reduktase der Leber zu inhibieren, und Veränderungen bei der hepatischen Glucocorticoid-Rezeptor-Aktivierung, die indirekt mit Veränderungen der Insulinempfindlichkeit zusammenhängen, überwacht. Sowohl bei pharmakologischen [31, 32] als auch bei physiologischen [33] Steigerungen des Glucocorticoid-Spiegels nimmt die Insulinempfindlichkeit der Leber ab, während die Glukoseproduktion der Leber zunimmt. Die Ergebnisse dieser Versuche wurden publiziert [16], nachdem unsere britische Patentanmeldung Nr. 9517623.8 am 29. August 1995 eingereicht worden war.
Verfahren
Sieben nicht fettleibige (Body Mass Index < 25), gesunde männliche kaukasische Freiwillige ohne Medikation und im Alter von 27–36 Jahren wurde in einer überkreuzten, zufälligen Doppelblindstudie Carbenoxolon für sieben Tage (100 mg alle 8 Stunden oral) oder in entsprechender Weise ein Placebo verabreicht, wobei die Versuchsphasen um mindestens 4 Wochen auseinander lagen. Am siebten Tag jeder Phase wurden euglykämische, hyperinsulinämische Klemmstudien unter Messung der Glukoseaufnahme am Unterarm durchgeführt, wie dies detailliert in Referenz 16 beschrieben ist, deren Inhalt hiermit durch Referenz einbezogen wird.
Ergebnisse
Die Carbenoxolon-Verabreichung war mit keiner Veränderung der Glukosekonzentration im Nüchternzustand, jedoch mit einem Abfall der Insulinkonzentration im Nüchternzustand assoziiert. Während der euglykämischen Klemme steigerte Carbenoxolon die Geschwindigkeitsrate der metabolischen Clearance von Glukose (M-Werte: 41,1 ± 2,4 μb 5 mol/kg/min für das Placebo gegenüber 44,6 ± 2,3 für Carbenoxolon; p < 0,03) (1). Es wurde kein Unterschied bei der peripheren Glukoseaufnahme festgestellt, wie dies anhand der Glukoseaufnahme im Unterarm gemessen wurde, jedoch war diese Messung aufgrund der durch Insulin induzierten Gefäßerweiterung [34] und des durch die Einschränkungen der Versuchsbedingungen verursachten mentalen Stresses weniger genau.
Diskussion
Diese Daten zeigen, dass Carbenoxolon die Insulinempfindlichkeit des gesamten Körpers steigert. Dies könnte das Ergebnis entweder einer verstärkten Hemmung der Glukoseproduktion der Leber infolge der gesteigerten Insulinempfindlichkeit der Leber, oder einer verstärkten peripheren Nutzung von Glukose infolge einer verstärkten peripheren Insulinempfindlichkeit sein. Das Fehlen einer Veränderung der Glukoseaufnahme im Unterarm bei Carbenoxolon deutet an, dass der erstgenannte Mechanismus vorherrscht. Jedoch lässt die Ungenauigkeit dieser Messung die Möglichkeit offen, dass es einen Beitrag aus einer verstärkten peripheren Insulinempfindlichkeit gibt, den wir nicht detektiert haben. Eine genauere Diskussion dieser Daten ist nun veröffentlicht worden [16].
Es ist unwahrscheinlich, dass Carbenoxolon die Insulinempfindlichkeit durch einen Mechanismus beeinflusst, der von dessen Wirkung auf die 11β-Reduktase unabhängig ist. Carbenoxolon hemmt auch andere Enzyme, die Cortisol umsetzen, wobei hier die 5β-Reduktase [35] zu nennen ist, jedoch würde dieser Effekt die intra-hepatischen Cortisol-Konzentrationen steigern und die Insulinempfindlichkeit herabsetzen. In Abwesenheit von Corticosteroiden besitzt Carbenoxolon bei dieser Dosis keine dokumentierten Effekte in vivo und eine niedrige Affinität für Corticosteroid-Rezeptoren in vitro [36], sodass eine direkte Wirkung von Carbenoxolon bei der Steigerung der Insulinempfindlichkeit unwahrscheinlich ist. Tatsächlich deuten vorherige Versuche darauf hin, dass Carbenoxolon bei höheren Konzentrationen (mmol/l) in Abwesenheit von Corticosteroid der Wirkung von Insulin in Fettzellen entgegenwirkt [37]. Der Blutdruck und der Blutfluss im Unterarm wurden bei dieser Studie nicht durch Carbenoxolon erhöht, und selbst wenn dies so wäre, könnte dies verminderter Insulinempfindlichkeit zugeschrieben werden [34]. Schließlich sind auch andere neurohumorale Veränderungen infolge der renalen Wirkungen von Carbenoxolon (verminderte(s) Plasma-Renin, Aldosteron- und Kaliumkonzentrationen) nicht dafür bekannt, dass sie einen direkten Einfluss auf die Insulinempfindlichkeit hätten, bzw. wurden im Kontext der oralen Natriumzufuhr mit einer verminderten Insulinempfindlichkeit assoziiert [38].
Aus diesen Beobachtungen schlussfolgern wir, dass die basale 11β-Reduktaseaktivität eine Rolle bei der Aufrechterhaltung einer angemessenen Exposition von Glucocorticoid-Rezeptoren gegenüber Cortisol in der menschlichen Leber spielt. Der zirkulierende Pool an Cortison ist daher als Quelle des aktiven Glucocorticoids an Orten, an denen die 11β-Reduktase exprimiert wird, von physiologischer Wichtigkeit.
A.2 AUSWIRKUNG VON CARBENOXOLON AUF DIE INSULINEMPFINDLICHKEIT BEI DER RATTE
Nach unseren Studien über die Wirkungen von Carbenoxolon im gesunden Menschen haben wir unveröffentlichte Studien der Wirkungen von Carbenoxolon bei lebenden, gesunden Ratten durchgeführt. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen beim Menschen haben wir gezeigt, dass Ratten-Leberzellen in Primärkultur 11β-HSD1 exprimieren, die vorherrschend 11β-Reduktaseaktivität besitzt [15]. Wir haben auch gezeigt, dass die zirkulierende Konzentration an 11-Dehydrocorticosteron (gemessen durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie) 40–50 nmol/l beträgt (Dr. R. Best, unveröffentlichte Beobachtung), sodass es einen wesentlichen Pool an inaktivem 11-Ketosteroid gibt, der für die Aktivierung zu Corticosteron an Orten, an denen 11β-Reduktase aktiv ist, zur Verfügung steht.
Verfahren
Intakte männliche Wistar Hans-Ratten mit einem Körpergewicht von 200–250 g wurden mit täglichen subkutanen Injektionen von 1 ml entweder von 0,9% Saline (Trägerlösung) oder Carbenoxolon (angesetzt mit 1, 3 oder 10 mg/ml in 0,9% Saline) für 14 Tage behandelt. Ab 4 Uhr nachmittags wurde den Tieren die Nahrung entzogen, und um 9 Uhr morgens am nächsten Tag wurde Blut durch Einritzen des Schwanzes erhalten. Die Plasmaglukose wurde durch ein Glukoseoxidase-Verfahren auf einem Beckmann CX-3-Autoanalysator gemessen.
Ergebnisse
Carbenoxolon erzeugte einen Dosis-abhängigen Abfall der Glukosekonzentrationen im Nüchternzustand (2).
Diskussion
Diese Versuche haben vorbereitenden Charakter, da es nun unser Ziel ist, die Insulinempfindlichkeit und Glukosetoleranz bei Ratten zu bestimmen, die mit Carbenoxolon behandelt wurden. Jedoch steht der Abfall der Plasmaglukose im Nüchternzustand in Übereinstimmung mit der Hemmung der hepatischen Gluconeogenese mit oder ohne gesteigerte periphere Glukoseaufnahme bei Ratten, die mit dem 11β-Reduktase-Inhibitor Carbenoxolon behandelt wurden.
A.3 WIRKUNG DER DURCH ÖSTRADIOL VERMITTELTEN HEMMUNG DER HEPATISCHEN 11β-HSD1-EXPRESSION AUF DIE INSULINEMPFINDLICHKEIT BEI DER RATTE
Nach der Feststellung der Wirkungen eines kompetitiven pharmakologischen Inhibitors der 11β-Reduktaseaktivität auf die Insulinempfindlichkeit und die Glukosespiegel beim Menschen und bei der Ratte, war es die Aufgabe dieser Studie, die Auswirkungen der Herunterregulierung der Transkription und Translation des 11β-HSD1-Enzyms zu prüfen. Die Ergebnisse dieser Studien sind bei wissenschaftlichen Treffen in 1996 vorgestellt, jedoch noch nicht veröffentlicht worden.
Die 11β-HSD1-Expression wird in vivo durch eine Vielzahl von Hormonen reguliert [26]. In der Leber der Ratte zeigt 11β-HSD1 einen ausgeprägten sexuellen Dimorphismus mit geringerer Aktivität bei den Weibchen. Tatsächlich unterdrückt eine anhaltende Verabreichung von Östradiol die 11β-HSD1-Expression der Leber sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Ratten nahezu vollständig [39–41]. Diese Regulation scheint Gewebe- und Isoenzym-spezifisch zu sein, da Östrogen die 11β-HSD1-Expression im Hippocampus oder die 11β-HSD2-Aktivität in der Niere nicht abschwächt [41]. Das Ziel dieser Studie war es daher, den Anteil zu prüfen, den die Reaktivierung der Glucocorticoide durch hepatische 11β-HSD1 auf die Expression der leberspezifischen, durch Glucocorticoid modulierten Gene der Ratte ausübt, indem die selektive Unterdrückung der hepatischen 11β-HSD1 durch Östradiol in vivo ausgenutzt wird.
Verfahren
In vivo-Studien
Männliche Han Wistar Ratten (200–250 g) wurden unter Halothan-Betäubung einer Entfernung der Gonaden und einer entweder beidseitigen Entfernung der Nebennieren oder einem Bauchwandschnitt unterzogen. Zur Östradiolverabreichung wurden Kapseln aus Silikonelastomer (1,95 mm Innendurchmesser, 3,125 mm Außendurchmesser) (Dow Corning Corporation, Midland, Michigan, USA), die 17β-Östradiol (Sigma, Poole, UK) enthielten, subkutan implantiert. Bei Tieren, die für 42 Tage mit Östradiol behandelt worden waren, wurden die Kapseln nach 21 Tagen entfernt und ersetzt. Den Kontrolltieren wurden leere Kapseln eingesetzt. Die Ratten, denen die Nebennieren entfernt worden waren, wurden mit 0,9%iger Saline am Leben gehalten. Die Ratten wurden an den Tagen 10, 21 oder 42 nach der Operation getötet. Leber und Hippocampus wurden entnommen und auf Eis geschnitten, um einen Test der 11β-HSD-Aktivität durchzuführen; weiterhin wurde ein Aliquot der Leber auf Trockeneis eingefroren und bei –80°C bis zur Extraktion der RNA gelagert.
Quantifizierung der 11β-HSD-Aktivität in in vivo-Versuchen
Die Gewebe wurden in Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer mit 0,2% Glukose, pH 7,4 homogenisiert und, wie zuvor beschrieben [40], getestet. Die Homogenate (6,25 μg an Leberprotein, 250 μg an Hippocampusprotein) wurden mit 200 μM NADP (Sigma Poole, UK) und 12 nM [³H]-Corticosteron (spezifische Aktivität 84 Ci/mmol; Amersham International, Aylesbury, UK) in einem Gesamtvolumen von 250 μl mit Krebs-Ringer-Puffer, supplementiert mit 0,2% Rinderserum-Albumin, für 10 min bei 37°C inkubiert. Die 11β-Dehydrogenaseaktivität wurde bei diesem Test als Maß für das aktive Enzym quantifiziert, da die 11β-Reduktase in Homogenaten instabil ist. Die Steroide wurden mit Ethylacetat extrahiert und durch HPLC mittels eines Online-β-Zählers aufgetrennt. Die 11β-HSD-Aktivität wurde (nach einer Korrektur um die scheinbare Umwandlung in Inkubaten ohne Enzym (< 3%)) als Umsatz des Corticosterons zu 11-Dehydrocorticosteron ausgedrückt.
Extraktion und Analyse von mRNA
Gesamt-RNA wurde mittels des Guanidinthiocyanat-Verfahrens gemäß Beschreibung in [40] aus Lebergewebe extrahiert und in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser resuspendiert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurde spektrophotometrisch bestimmt. 20 μg-Aliquots wurden auf einem 1,2% Agarosegel, enthaltend 2% Formaldehyd, aufgetrennt.
Die RNA wurde auf Nitrocellulosemembranen (Hybond-N, Amersham International, UK) geblottet, in 6 ml Phosphatpuffer (0,2 M NaH₂PO₄, 0,6 M NaH₂PO₄, 5 mM EDTA), 3 ml 20% SDS und 100 μg denaturierter Heringshoden-DNA (Sigma, Poole, UK) für 2 h bei 55°C prähybridisiert; die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 55°C in derselben Lösung, enthaltend cDNA von Ratten-11β-HSD1 oder -PEPCK, die unter Verwendung eines DNA-Markierungskits mit Zufallsprimern (Boehringer Mannheim UK Ltd., Lewes, UK) mit ³²P-dCTP markiert worden war. Drei 20 min-Waschschritte wurden bei Raumtemperatur in 1 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat), 0,1% SDS durchgeführt, gefolgt von einem stringenten Waschschritt bei 55°C für 30 min in 0,3 × SSC, 0,1% SDS. Die Filter wurden für 1–4 Tage zur Exposition gegenüber dem autoradiographischen Film gebracht (angepasst, um sicherzustellen, dass sich die Signaldichte im linearen Bereich befindet). Die Filter wurden mit einer entsprechend markierten 7S-cDNA-Sonde oder einer Transferrin RNA-cDNA-Sonde erneut hybridisiert, um, wie zuvor beschrieben [40], die Beladung zu testen (die Expression der Transferrin mRNA wird durch Östradiol oder Glucocorticoid nicht verändert). Die optische Dichte wurde unter Verwendung eines Computergesteuerten Bildanalysesystems (Seescan plc, Cambs, UK) bestimmt. Die Werte wurden als Prozentanteile der Kontrollniveaus ausgedrückt.
Statistik
Die Daten entsprechen den Mittelwerten ±SEM von 5–10 Wiederholungen (angezeigt in der Legende der Figur). Der Vergleich der Daten erfolgte, jeweils passend zur Situation, mittels ANOVA und Newman-Keuls Post-hoc Test oder durch ungepaarten Student t-Test. Die statistischen Tests wurden mit den absoluten Daten durchgeführt, während die Figuren zur Verbesserung der Klarheit die Daten als Prozentanteil der Werte für die Kontrolltiere wiedergeben.
Ergebnisse
Wirkung der anhaltenden Östradiol-Behandlung auf die 11βHSD1-Aktivität und -mRNA-Expression
Die Östradiolverabreichung für 10, 21 und 42 Tage bei den männlichen Ratten, denen die Gonaden entfernt worden waren, resultierten in merklichen Abnahmen der hepatischen 11β-HSD-Aktivität (3). Jedoch wurde die 11β-HSD-Aktivität nicht vollständig aufgehoben, da eine verlängerte Inkubation (60 min) der Leber-Homogenate der Ratten, die für 42 Tage Östradiol erhalten hatten, eine detektierbare (12,2 ± 14,7%) Umwandlung von Corticosteron zu 11-Dehydrocorticosteron zeigte. Die 11β-HSD1 mRNA-Expression fiel nach 21 und 42 Tagen der Östradiol-Behandlung auf nicht detektierbare Niveaus. Die 11β-HSD-Aktivität im Hippocampus wurde durch die Östradiol-Behandlung nach 21 oder 42 Tagen nicht verändert (Daten nicht gezeigt).
Wirkung von Östradiol auf die durch Glucocorticoid induzierbare Genexpression in der Leber
Um die Wirkung der abgeschwächten hepatischen 11β-HSD1-Aktivität auf die lokale Glucocorticoid-Wirkung zu untersuchen, wurde die Expression der leberspezifischen, durch Glucocorticoid induzierbaren Gene nach 42 Tagen der Östradiol-Behandlung gemessen. Die Expression der PEPCK-mRNA wurde durch die Östradiol-Behandlung signifikant vermindert (3).
Um zu prüfen, ob diese Wirkungen des Östradiols auf die Expression von Lebergenen direkt oder über Veränderungen der Glucocorticoid-Wirkung in der Leber vermittelt wurden, wurden die Wirkungen von Östradiol bei Tieren geprüft, denen man die Nebennieren entfernt oder bei den Kontrolltieren, bei denen man einen Bauchwandschnitt durchgeführt hatte. Die Tiere wurden nach 21 Tagen getötet. Die Werte für Plasma-Corticosteron bestätigten die Sinnhaftigkeit der Entfernung der Nebennieren (Daten nicht gezeigt). Die Entfernung der Nebennieren steigerte die hepatische 11β-HSD1-Genexpression und Aktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren, bei denen man die Bauchwand geöffnet hatte (3). Östradiol reduzierte die mRNA und Aktivität der Leber-11β-HSD1 in Ratten mit fehlenden Nebennieren, und, obwohl die mRNA-Expression höher war als bei mit Östradiol behandelten Ratten mit intakten Nebennieren, blieb sie im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen signifikant vermindert.
Die hepatische PEPCK-Genexpression war nach 21 Tagen der Behandlung mit Östradiol vermindert, allerdings in einem etwas geringeren Maße als nach 42 Tagen (3). Es war nicht überraschend, dass die Entfernung der Nebennieren auch die hepatische PEPCK-Genexpression abschwächte, jedoch führte Östradiol bei Ratten nach Nebennierenentfernung nicht länger zu einer Verminderung, sondern tatsächlich zu einer Zunahme der Spiegel an PEPCK-mRNA im Vergleich zur Nebennierenentfernung alleine.
Diskussion
Die Verabreichung von Östradiol führte sowohl bei 21 Tagen als auch bei 42 Tagen zu einer nicht mehr detektierbaren hepatischen 11β-HSD1 mRNA-Expression und zu einer deutlich verminderten 11β-HSD-Aktivität (obwohl diese klar messbar blieb), was vorherige Studien [41] bestätigt. Die Diskrepanz zwischen der mRNA-Expression und der Aktivität könnte auf die viel langsamere Umsatzrate des 11β-HSD1-Proteins, oder wahrscheinlicher, auf die Transkription und Translation verbleibender niedriger Spiegel an 11β-HSD1 mRNA, die in der Northern-Analyse nicht detektierbar sind, zurückgehen. Diese Wirkung der Geschlechtshormon-Steroide ist relativ spezifisch für die Leber, da die 11β-HSD1 des Hippocampus unbeeinflusst blieb, und vorherige Studien gezeigt haben, dass 11β-HSD2 nicht durch Östrogene abgeschwächt wird [22]. Der Vorteil der Verwendung von Östrogen zur Herunterregulierung der hepatischen 11β-HSD1 besteht – im Gegensatz zu konventionellem Carbenoxolon oder anderen Inhibitoren des Enzyms – darin, dass 11β-HSD2 unbeeinflusst bleibt.
Nach 42 Tagen der Östradiol-Behandlung war die hepatische Expression der für PEPCK codierenden mRNA deutlich vermindert. Prinzipiell kann dieser Effekt der anhaltenden Östrogen-Behandlung auf verschiedene Weise erklärt werden: (i) Östrogen kann direkt wirken, um die hepatische Genexpression zu unterdrücken; (ii) Östradiol kann den Corticosteroid-Metabolismus in der Leber verändern. Man nimmt an, dass eine verminderte hepatische, durch 11β-HSD1 vermittelte Reaktivierung des ansonsten inerten 11-Dehydrocorticosterons die Expression dieser Glucocorticoid-empfindlichen Transkripte vermindert; (iii) es könnte andere indirekte Wirkungen der anhaltenden Östradiolverabreichung geben.
Im Fall von PEPCK erscheint eine direkte Inhibition durch Östradiol unwahrscheinlich, da dieses Transkript in Ratten, denen die Nebennieren entfernt worden waren, durch Östrogen induziert wurde. Der Verlust der abschwächenden Wirkung von Östradiol auf die PEPCK-Expression in Ratten, denen die Nebennieren entfernt worden waren, deutet eher eine Notwendigkeit von Glucocorticoiden in diesem Prozess an als irgendeinen sonstigen, indirekten Effekt. Glucocorticoide steigern die Expression der PEPCK in der Leber [17], sodass dieses Muster der Änderungen zu der Glucocorticoid-Kontrolle der Expression dieses Gens passt. Die Wirkung von Östradiol bei der Abschwächung der PEPCK mRNA-Expression bei unversehrten Ratten war ebenso groß wie die Entfernung der Nebennieren alleine. Diese Daten stehen daher in Übereinstimmung damit, dass die Wirkungen von Östradiol indirekt über den deutlichen Verlust der 11β-HSD1 11β-Reduktaseaktivität vermittelt werden, was somit die intra-hepatische Glucocorticoid-Regeneration abschwächt. Somit kommt der 11β-Reduktaseaktivität der 11β-HSD1 wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung hinreichend hoher intra-hepatischer Corticosteron-Spiegel zu, um die PEPCK über die von basalen (nicht glucocorticoidischen) Faktoren erhaltenen Minimalspiegel hinaus anzuheben.
A.4 WIRKUNG DES TRANSGENEN KNOCK-OUTS DER 11β-HSD1 EXPRESSION
Obwohl die Wirkungen der von Carbenoxolon und Östrogen induzierten Herunterregulierung der 11β-HSD1 Expression eine starke Unterstützung für unsere Hypothese darstellen, dass die Inhibition der 11β-Reduktase die Insulinempfindlichkeit erhöhen und die hepatische Glucoseproduktion vermindern wird, so sind beide dieser Mittel potentiell in andere Aktionen verwickelt, einschließlich direkter Wirkungen auf die 11β-HSD2 (Carbenoxolon) und weiterer Wirkungen auf die Leber (Östrogen). Der am klarsten herausgestellte Beweis für die Wichtigkeit eines spezifischen Proteins kann nun am effektivsten unter Verwendung transgener Technik getestet werden. Wir haben nun eine transgene Maus hergestellt, die homozygot für ein mutantes Allel ist, das eine gezielte Unterbrechung des 11β-HSD1-Gens trägt. Einige dieser Ergebnisse sind auf wissenschaftlichen Treffen in 1996 vorgestellt, jedoch noch nicht veröffentlicht worden.
Verfahren
Eine genomische Mausbibliothek, hergestellt aus isogener OLA129 DNA im Lambda-Vektor GEM12, wurde einem Screen mit einer Ratten-11β-HSD1 cDNA-Sonde unterzogen. Ein Lambda-Phage, der ein 14 kb-Insert enthielt, das die Exons 2 bis 5 des Maus-11β-HSD1-Gens umfasste, wurde kloniert und einer ausführlichen Restriktionskartierung und Sequenzanalyse unterzogen. Unter Verwendung dieser Information wurde ein Austausch-Vektor, 16 KpnβA, konstruiert, wozu die pBS-KpnA-Kassette verwendet wurde. Der Vektor bestand aus dem Neomycinresistenz-Gen unter der Kontrolle des humanen β-Actinpromotors, gefolgt von dem SV40-Polyadenylierungssignal. Der 6,5 kb lange 3'-Homologie-Arm wurde aus dem Intron D subkloniert. Der 1,2 kb kurze Homologie-Arm wurde mittels PCR unter Verwendung von hochgenauer Ultma Taq-Polymerase, 129 genomischer Maus-DNA und Primern, die verschachtelte („nested") Sac I- und Spe I-Restriktionsstellen aufweisen und in Exon 1 und Intron B liegen, synthetisiert. Eine externe Sonde wurde mittels PCR synthetisiert. Bei Verwendung dieser Sonde ergibt sich über ein spezifisches Rekombinationsereignis ein 1,5 kb BamH I-Fragment anstelle eines 3 kb-Fragments, das für das wildtypische Gen zu erwarten wäre.
Nach der Transfektion des 16 Kpnβ A-Austausch-Konstrukts in „CGR 8" embryonale Stammzellen zeigte von 368 getesteten Neomycin-resistenten Kolonien nur eine Kolonie homologe Rekombination am 5'-Ende. Die Spezifität dieses Rekombinationsereignisses wurde nach BamH I-Verdau durch Southern Blot-Hybridisierung getestet. Die Spezifität der Restriktionsspaltung am 3'-Ende wurde ebenfalls, nach drei verschiedenen Restriktionsverdauen, durch Hybridisierung mit einer internen Sonde bestätigt.
Positive embryonale Stammzellen wurden in C57B1/6-Blastocysten injiziert, um chimäre Nachkommen zu erzeugen, die in Kreuzungen weitergezüchtet wurden, um eine Kolonie von Homozygoten für das Knock-out-Allel zu etablieren.
Ergebnisse
Homozygote für das mutante Allel sind morphologisch unversehrt und uneingeschränkt fruchtbar. Das mutante Allel bringt keine Einschränkung der Überlebensfähigkeit mit sich. Jedoch lassen sich in mutanten Homozygoten weder 11β-HSD1 mRNA noch Enzymaktivität (Techniken wie oben) nachweisen, und bei Heterozygoten wurde eine Verminderung der mRNA und der Aktivität detektiert. Die Plasma-Corticosteron-Spiegel sind bei den Mutanten nicht verändert, jedoch ist das Verhältnis von Corticosteron zu 11-Dehydrocorticosteron im Urin merklich reduziert. Homozygot mutante Mäuse sind auch unfähig, in vivo 11-Dehydrocorticosteron in Corticosteron umzuwandeln und sind daher resistent gegenüber der Thymus-Rückbildung, die mit 11-Dehydrocorticosteron in den wildtypischen Kontrollmäusen beobachtet wird.
Den Tieren wurde für 48 Stunden das Futter entzogen, bevor diese getötet und Blut am Rumpf abgenommen wurde. Die Plasmaglukose wurde mittels eines Glukoseoxidase-Verfahrens (siehe oben) gemessen. Bei den mutanten Tieren waren die Plasmaglukose-Konzentrationen im Nüchternzustand niedriger (4).
Die Messung der Enzyme, die für die hepatische Glykolyse/Gluconeogenese verantwortlich sind, zeigten im gefütterten Zustand keine Unterschiede zwischen den wildtypischen und den mutanten Tieren. Bei Nahrungsentzug zeigten die mutanten Tiere jedoch nicht die normale Induzierung von Glucose-6-Phosphatase und PEPCK (4). Die Glucokinase zeigte keine Veränderung.
Diskussion
Diese Daten zeigen die Wichtigkeit der 11β-HSD1 für den Glucosestoffwechsel und die Insulinempfindlichkeit der Leber. Glucose-6-Phosphatase und PEPCK sind zwei der Gluconeogenese dienende Enzyme, die durch Insulin herunterreguliert und durch Exposition gegenüber Glucocorticoid heraufreguliert werden [1]. In Gegenwart von Insulin (bei gefütterten Tieren) gibt es keine Veränderung hinsichtlich der Expression dieser Enzyme, was bestätigt, dass die Regulation durch Insulin dominiert. Bei Tieren unter Nahrungsentzug und mit geringen Insulinspiegeln, kommt es jedoch zu einem Ausbleiben der Induzierung dieser Enzyme, was mit einem Ausbleiben der Corticosteron-abhängigen Induktion übereinstimmt. Bei Tieren, bei denen der Mutationsvektor spezifisch rekombiniert hat, um nur 11β-HSD1 auszuschalten, und bei denen das Plasma-Corticosteron durch normale Rückkopplung zwischen Hypothalamus, Hypophyse und Nebennieren aufrechterhalten wird, können diese Veränderungen der beeinträchtigten intra-hepatischen Umwandlung von 11-Dehydrocorticosteron zu Corticosteron zugeschrieben werden.
A.5 ROLLE VON 11β-HSD1 BEI DER REIFUNG VON FETTZELLEN
Glucocorticoide sind daran beteiligt, die Differenzierung von Adipozyten aus nicht differenzierten Adipoblasten in sich differenzierende Präadipozyten anzutreiben. Ein Glucocorticoid-Überschuss beim Menschen verursacht tiefgreifende Veränderungen sowohl der Fettgewebeverteilung als auch des Fettgewebestoffwechsels [18]. Beim Cushing Syndrom zeigt das Fett des Bauchfellnetzes (Omentums) eine Hyperplasie der Fettzellen, die mit einer Steigerung der Aktivität der Lipoprotein-Lipase und der Glycerophosphat-Dehydrogenase assoziiert ist. In homogenisiertem Fettgewebe werden Cortisol und Corticosteron zu Cortison und 11-Dehydrocorticosteron oxidiert, was die Anwesenheit von 11β-HSD anzeigt [42], die die Glucocorticoid-Wirkung in einer orts- und entwicklungsspezifischen Weise modifizieren könnte. Wir haben (i) die Expression der 11β-HSD-Enzymaktivität und der 11β-HSD1-mRNA in isolierten primären Fettzellen der Ratte geprüft, und (ii) bestimmt, ob 11β-HSD1 in einer von Fibroblasten abgeleiteten, klonalen Zelllinie, 3T3-F442A, exprimiert wird, die in Gegenwart von fetalem Kälberserum und Insulin zu reifen Fettzellen (Adipozyten) induziert werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind nicht veröffentlicht worden.
Verfahren
Tiere
Adulten männlichen Wistar-Ratten wurde Fettgewebe des Nebenhodens entnommen. Das Fettgewebe wurde mehrere Male in Phosphat-gepufterter Saline gewaschen, von großen Blutgefäßen befreit und zerkleinert. Das Gewebe wurde in Krebs-Ringer-Puffer (KRB), enthaltend Collagenase II (2 mg/ml) (Sigma, UK), bei 37°C für 40 Minuten inkubiert und das aufgeschlossene Material dann durch einen 250 μm-Nylonfilter geleitet und kurz zentrifugiert. Die von einander getrennten Fraktionen der Fettzellen (schwimmend) und die Bindegewebe/Gefäß-Fraktion (Pellet) wurden gesammelt für (i) RNA-Extraktion und Northern Blot gemäß obiger Beschreibung und (ii) Bioaktivitätstest von 11β-Dehydrogenase gemäß obiger Beschreibung, wobei Endkonzentrationen von 500 μg Protein/ml, 200 μM Cofaktor (NADP oder NAD) und 12 nM 1,2,6,7-³H-Corticosteron in einem Gesamtvolumen von 250 μl Krebs-Ringer-Puffer für 15 min bei 37°C verwendet wurden.
Zellkultur
Die klonale Präadipozyten-Zelllinie 3T3-F442A (freundlicherweise zur Verfügung gestellt durch das Dr. Pairault Henri Modor Hospital, Creteil, Frankreich) wurden mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/100 mm Durchmesser-Schale in „Basismedium" (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), supplementiert mit 10% Neugeborenenkälber-Serum, Penizillin 200 U/ml und Streptomycin 50 μg/ml) ausplattiert. Um die Differenzierung der konfluenten 3T3-F442A-Zellen zu bewirken, wurde das Basismedium durch „Differenzierungsmedium" (DMEM, 10% fetales Kälberserum und Insulin, 5 μg/ml) ersetzt, und die Zellen wurden in diesem Medium für 11 Tage gehalten, wobei das Medium alle 48 Stunden gewechselt wurde.
Die Aktivitäten von 11β-Dehydrogenase und 11β-Reduktase wurden in intakten Zellen durch Zugabe von 25 nM Corticosteron mit markiertem ³H-Corticosteron oder von 25 nM 11-Dehydrocorticosteron mit markiertem ³H-11-Dehydrocorticosteron gemessen. Die wechselseitige Umwandlung von Corticosteron und 11-Dehydrocorticosteron wurde, wie oben, 3, 8 und 24 Stunden nach der Zugabe der Steroide gemessen.
Ergebnisse
Extrakte aus homogenisierten Fettzellen der Ratte zeigten 11β-HSD-Aktivität, wie durch die Umwandlung von Corticosteron zu 11-Dehydrocorticosteron gezeigt wurde. 11β-HSD1 wurde in ganzem weißem Fettgewebe und in isolierten Fettzellen als einzelne, etwa 1,6 kb große mRNA-Spezies transkribiert, die damit von ähnlicher Größe wie die hepatische Spezies ist, obwohl die Expression niedriger als in der Leber war. 11β-HSD1-Transkripte wurden auch in der Bindegewebe/Gefäß-Fraktion exprimiert (Daten nicht gezeigt).
3T3-F442A-Zellen wurden zur Differenzierung angeregt, wobei nach 10 Tagen > 90% der Zellen differenziert waren, wie anhand der sichtbaren Lipidanreicherung bestimmt wurde. Im Zusammenhang mit dieser Differenzierung gab es einen merklichen Anstieg der 11β-HSD1 mRNA-Expression und der 11β-Reduktaseaktivität, was jedoch spät (8 Tage nach Zugabe des Differenzierungsmediums) und in Zusammenhang mit der Induktion der GPDH-Expression erfolgte (5).
Diskussion
Bei dieser Studie haben wir die 11β-HSD1-Genexpression im Fettgewebe der Ratte und in isolierten Ratten-Fettzellen, und ebenso in der Bindegewebe/Gefäß/Präadipozyten-Fraktion nachgewiesen, was in Übereinstimmung mit Daten steht, die 11β-HSD-Aktivität in der Fettgewebekomponente der Brustdrüse nachweisen [42]. Im Gegensatz zu für homogenisiertes Gewebe erhaltene Daten und in Übereinstimmung mit Ergebnissen für andere Präparationen ganzer Zellen [15, 22] haben wir herausgefunden, dass 11β-HSD1 in ganzen Zellen eher als 11β-Reduktase denn als 11β-Dehydrogenase-Enzym wirkt. Zusätzlich haben wir in der Zelllinie 3T3-F442A gezeigt, dass die 11β-HSD1-Expression in einer von der Differenzierung abhängigen Weise reguliert wird. 11β-HSD1 hat somit Eigenschaften eines „späten" Gens der Differenzierung. Darüber hinaus entsprach die regulierte Expression von 11β-HSD1 derjenigen von GPDH, einem Glucocorticoid-empfindlichen späten Marker der Fettzellen-Differenzierung.
Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass 11β-Reduktase eine physiologische Rolle bei der Umwandlung von 11-Ketosteroiden in 11β-Hydroxysteroide spielt und somit die Glucocorticoidaktivität steigert. In den Fettzellen mag dies die Induktion von GPDH erklären. Obwohl man nicht erwarten würde, dass die Inhibition der 11β-Reduktase die frühe Differenzierung von Fettzellen beeinflusst, so könnte diese doch den biochemischen Phänotyp der differenzierten Zellen beeinflussen, insbesondere im Hinblick auf den Lipid-Metabolismus.
B NEURONALE WIRKUNGEN VON 11β-REDUKTASE-INHIBITOREN
Verschiedene Studien haben 11β-HSD-Aktivität, Immunreaktivität und mRNA-Expression in Neuronen des Hippocampus gezeigt [43, 45]. Die Verabreichung von 11β-HSD-Inhibitoren verändert die funktionelle Aktivität im Hippocampus in vivo [46], obwohl die Mechanismen, die diesem Effekt zugrunde liegen, nicht verstanden sind.
Vorherige Studien haben gezeigt, dass in Homogenaten des Hippocampus sowohl Dehydrogenierung als auch Reduktion stattfinden [44], aber die Reaktionsrichtung bei intakten Zellen war bislang unbekannt. Wir haben nun die 11β-HSD-Aktivität und deren Funktion in Primärkulturen fetaler Hippocampus-Zellen untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche wurden veröffentlicht [22], nachdem wir unsere Patentanmeldung Nr. 9517622.8 am 29. August 1995 eingereicht hatten. Weitere Details der Versuche sind in Referenz 22 zu finden, deren Inhalt hiermit durch Referenz einbezogen wird.
Verfahren und Ergebnisse
Hippocampi wurden Embryonen der Wistar-Ratte an Tag 18,5 der Schwangerschaft entnommen und, wie beschrieben [22], in DMEM mit Supplementen kultiviert. Diese Zellen exprimierten 11β-HSD1 mRNA, und homogenisierte Zellen zeigten entweder 11β-Dehydrogenase- oder 11β-Reduktaseaktivität. Bei ganzen Zellen in Kultur wurde jedoch nur 11β-Reduktaseaktivität gezeigt. Diese 11β-Reduktaseaktivität könnte durch die Zugabe von Carbenoxolon (10^–6 M) nahezu aufgehoben werden [22].
Um den Einfluss der 11β-Reduktaseaktivität auf die Neurotoxizität zu bestimmen, wurden Zellen Kainsäure ausgesetzt und das Zellüberleben bestimmt. Sowohl Corticosteron als auch 11-Dehydrocorticosteron verstärkten die Neurotoxizität der Kainsäure. Dabei veränderte Carbenoxolon die Wirkung von Corticosteron nicht, während es Zellen jedoch vor dem verstärkenden Effekt durch 11-Dehydrocorticosteron schützte (6).
Diskussion
Diese Daten zeigen, dass 11β-HSD1 im Hippocampus der Ratte ein 11β-Reduktase-Enzym ist, und dass die Umwandlung von 11-Ketosteroiden in 11-Hydroxysteroide die neurotoxische Wirkung der Glucocorticoide verstärkt. Wichtiger Weise zeigen diese Daten, dass die Inhibition der 11β-Reduktaseaktivität die Zellen vor dem Schaden schützen kann, der aufgrund der Reaktivierung von 11-Dehydrocorticosteron auftritt. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Inhibition von 11β-Reduktase im menschlichen Gehirn die Reaktivierung von Cortison zu Cortisol verhindern und vor schädlichen, durch Glucocorticoid vermittelten Effekten auf das neuronale Überleben und auf andere Aspekte der Nervenfunktion einschließlich Wahrnehmungsstörung, Depression und gesteigertem Appetit schützen wird.
LITERATURSTELLEN

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Claims

Verwendung eines Inhibitors von 11β-Reduktase bei der Herstellung eines Medikaments für die Vorbeugung oder Minderung von neuronaler Funktionsstörung oder neuronalem Verlust/Wahrnehmungsstörung aufgrund von durch Glucocorticoid verstärkte Neurotoxizität oder neurale Funktionsstörung oder Schädigung im Menschen in vivo in Fett- und Nervengewebe.
Verwendung eines 11β-Reduktase-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung mehrerer therapeutischer Wirkungen in einem Patienten, dem das Medikament verabreicht wird, wobei die therapeutischen Wirkungen eine Zunahme der Insulinempfindlichkeit in Fettgewebe, eine Vorbeugung oder Minderung von neuronaler Funktionsstörung oder Schädigung oder neuronalem Verlust aufgrund von durch Glucocorticoid verstärkter Neurotoxizität umfassen.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit Glucocorticoid in Verbindung stehender Wahrnehmungs- oder Affektstörung.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der 11β-Reduktase-Inhibitor Carbenoxolon (3β-(3-Carboxypropionyloxy)-11-oxo-olean-12-en-30-säure) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.
Verwendung eines 11β-Reduktase-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Zustands, ausgewählt unter Fettgewebeinsulinresistenz, neuronalem Verlust oder neuronaler Funktionsstörung aufgrund von durch Glucocorticoid verstärkter Neurotoxizität und eine Kombination dieser zwei Zustände.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die neuronale Funktionsstörung Depression ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die neuronale Funktionsstörung die Wahrnehmungsstörung in hohem Alter ist.
Verwendung eines 11β-Reduktase-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Minderung der Mengen an zirkulierenden Fettsäuren.
Verwendung eines 11β-Reduktase-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Fettsucht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei der 11β-Reduktase-Inhibitor Carbenoxolon (3β-(3-Carboxypropionyloxy)-11-oxo-olean-12-en-30-säure) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.