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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Prävention
oder Verringerung einer chirurgischen Adhäsion.
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Adhäsionen sind
eine häufige
Komplikation eines chirurgischen Eingriffs bzw. einer Operation. Sie
können
sich in einer Vielzahl von Bereichen im Körper entwickeln und sind dadurch
gekennzeichnet, dass Gewebe, die vor einer Operation getrennt waren,
im Heilungsprozess miteinander verbunden werden. Die Art und der
Grad einer durch Adhäsionen verursachten
Schädigung
sind variabel, wobei sie von lebensbedrohlich, wie aufgrund einer
Blockade im Darm, bis zu extremer Behinderung, wie bei Sehnen oder
Rückenmark,
bis zu chronischem Schmerz und Unfruchtbarkeit in der Beckenhöhle bis
zur Obstruktion einer weiteren Operation im Pericard reichen. Die
postoperative Bildung von Beckenadhäsionen bleibt ein ernsthaftes
Problem bei Patienten, die sich einer gynäkologischen Operation unterziehen, und
sie ist eine Hauptursache von Unfruchtbarkeit. Allgemein sind die
häufigsten
Ursachen von Beckenadhäsionen
bei Frauen eine frühere
Operation, Endometriose und eine entzündliche Beckenerkrankung.
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Die
Läsion
eines intakten Peritoneums infolge einer chirurgischen Verletzung
oder Infektion startet eine Kaskade pathophysiologischer Ereignisse. Innerhalb
von drei Stunden einer chirurgischen Verletzung oder Infektion erfolgt
eine Schädigung
des Gefäßsystems,
was zu erhöhter
Gefäßdurchlässigkeit
und einer entzündlichen
Reaktion führt,
die zu einer weiteren Gefäßschädigung aufgrund
von Ischämie
und einer Reperfusionsläsion
führen.
Das Exsudat aus serosanguinöser Flüssigkeit
und Fibrinmatrix führt
zu weiterer Ischämie,
was zum Fortbestehen von Fibrinmatrix und Collagenadhäsionen führt, sowie
zu Fibrinolyse unter Bildung von Fibrinspaltprodukten, Absorption
der Fibrinmatrix und normalen Reparaturvorgängen. Diese Kaskade umfasst
die mit einer Entzündung
verbundenen erwarteten Ereignisse, die sowohl Neutrophilen- als auch Makrophagenmigration
zum Ort der Entzündung
umfassen. Mit dieser Zellmigration ist ein rascher Respiratory Burst verbunden,
der zur Erzeugung von Sauerstoffradikalen am Ort der Entzündung führt. Bei
Fehlen ausreichender Fänger
freier Radikale können
hohe Konzentrationen von Sauerstoffradikalen die umgebenden intakten
Zellen einschließlich
für die
Unversehrtheit von Gefäßen verantwortlichen
schädigen.
Diese erhöhte
Durchlässigkeit
von Blutgefäßen kann
zur Exsudation proteinhaltiger serosanguinöser Flüssigkeit führen, die als Matrix für fibrinöse Adhäsionen dient.
Ferner führt
eine erhöhte
Gefäßdurchlässigkeit zu
lokaler Unterbrechung des Blutstroms und schließlich Zelltod in den die Gefäßversorgung
umfassenden Gefäßen. Die
Reperfusion von Geweben nach diesem ischämischen Ereignis führt zur
weiteren Erzeugung von Sauerstoffradikalen und verschlimmert schließlich den
Grad der Bildung fibrinöser
Adhäsionen
weiter.
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Unter
normalen Umständen
führt die
fibrinolytische Fähigkeit
der Plasminogenaktivatoraktivität (PAA)
zur Absorption derartiger fibrinöser
Ablagerungen und zur üblichen
Peritoniumheilung. Jedoch führt bei
Vorhandensein einer schweren Gewebeläsion (beispielsweise nach einem
chirurgischen Trauma) eine Verringerung der PAA zu anomal beständigen Fibrinablagerungen
und schließlich
reifen Collagenadhäsionen.
Eine sehr sorgfältige
Dissektion (d. h. Adhäsiolyse)
ist weiterhin die am breitesten akzeptierte Behandlung für bestehende
Adhäsionen.
Ein wesentlicher Bruchteil von Operationen erfordert daher eine
Nachoperation zur Reparatur der Wirkungen der Adhäsionen.
Dieses Verfahren wird allgemein als "Adhäsiolyse" bezeichnet, wobei
das Verfahren bei einigen Organ systemen spezielle Namen, wie "Tenolyse" bei der Lösung von
Sehnen, hat.
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Die
Liste potentieller therapeutischer Modalitäten, die bei der Prävention
der Bildung und Neubildung von Adhäsionen verwendet werden, ist
sehr groß und
sie umfasst die Infusion von Flüssigkeiten
in die Bauchhöhle
zum Zeitpunkt einer Operation, mechanische Barrieren zwischen zwei
gegenüberliegenden
Oberflächen
und intravenös
injizierte oder topisch applizierte pharmakologische Mittel (Tulandi, "Effects of Ringer's Lactate on Postsurgical
Adhesion. In: Diamon et al., Hrsg., Band 381, Progress in Clinical
and Biological Research (NY, Wiley-Liss 1993) 59–63; Schwartz, et al., Sem.
In Repro. Endocrin. 9:89–99
(1991); Pjilman, et al., Eur. J. Ost & Gyn. Repro. Biol. 53:155–163 (1994);
und Monk et al., Am. J. Obstet, Gynecol. 170:1396–1403 (1994)). Jedoch
ist das Auftreten der Bildung symptomatischer Adhäsionen immer
noch hoch und es besteht immer noch klinischer Bedarf an der Prävention
von Adhäsionen.
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Therapien
verschiedener Arten wurden zur Verhinderung der anfänglichen
Bildung von Adhäsionen
("primäre" Adhäsionen)
verwendet. Diese umfassen eine Lavage mit wasserlöslichen
Polymeren und/oder biologisch aktiven Molekülen ("Wirkstoffen"), die üblicherweise nicht sehr wirksam
sind. Jedoch verhinderte oder verminderte die Verwendung von Superoxiddismutase
(SOD) in Kombination mit Katalase endometrioseinduzierte Adhäsionen bei Kaninchen
in einer Untersuchung von Poretz et al. (Int. J. Fertil. 36: 39–42, 1991).
Permanente mechanische Barrieren, wie TeflonTM-Lagen,
können
wirksam sein, sind jedoch schwer zu entfernen; und abbaubare Barrieren,
wie oxidierte Cellulose (InterCeedTM, Johnson & Johnson) und
abbaubare Polymergele (Sawhney et al., 1993; Hill-West et al., 1994) können signifikanten
Nutzen bei der Prävention
primärer
Adhäsionen
haben. Tsimoyiannis et al. (Acta Chir. Scand. 155: 171–174, 1989)
berichteten Verringerungen von etwa 50 % im Hinblick auf das Auftreten
und von 50–70
% im Hinblick auf die Schwere der ischämiebedingten Induktion primärer Adhäsionen bei
Ratten nach der Verabreichung von SOD, Katalase, DMSO (Dimethylsulfoxid)
oder Allopurinol als intravenöser
Bolus vor einer Operation. Die PCT WO 93/16687 lehrt, dass wasserlösliche oder
im Wesentlichen wasserlösliche
Makromere (Polymere mit polymerisierbaren Gruppen, die eine weitere
Polymerisation ermöglichen)
als Barriere zur Minimierung der Interaktion von einer Zelle oder
einem Gewebe mit einer weiteren Zelle oder einem weiteren Gewebe
appliziert werden können.
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Es
wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Gemeinsamkeit dieser Wirkstoffe
in deren Hemmung des zu einer oxidativen Schädigung von Gewebe führenden
Pfades liegt. SOD, Katalase und DMSO zerstören jeweils direkt aktive Sauerstoffspezies,
wie ein Superoxid-, Peroxid- oder Hydroxylradikal; von Allopurinol
ist bekannt, das es das Enzym Xanthinoxidase, das Wasserstoffperoxid
produziert, hemmt. Diese Verbindungen, die direkt oder indirekt
die Wirkung einer aktiven Sauerstoffspezies auf Gewebe hemmen, werden
in dieser Beschreibung als "aktive
Sauerstoffinhibitoren" oder
AOIs bezeichnet.
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Superoxiddismutase
(SOD, Dimer-MW = 31,5 kDA, Tetramer = 67 kDA) war bei der Behandlung
von ischämischen/Reperfusionsereignissen
in einer breiten Vielzahl von Geweben, die Hirn, Niere und Herz
umfassen, wirksam (Schneider et al., Fr. Rad. Biol. & Med. 3:21–26 (1987);
Zimmerman et al., Am. J. Med. Sci. 307:284–292 (1994); Voogd et al., Fr.
Rad. Biol. & Med.
11:71–75
(1991); Fridovich, Arch. Bioch. & Biophys.
247:1–11
(1986); Kontos et al. CNS Trauma 3:257–263 (1986)). Es gibt auch
Beweisanzeichen, dass SOD bei der Prävention von Beckenadhäsionen wirksam
sein kann (Tsimoyiannis et al., Acta Chir. Scand. 155:171–174 (1989);
Portz et al., Int. J. Fert. 36:39–42 (1991); O'Leary et al., Ann. Surg.
June:693-698 (1987)).
Jedoch ist die Wirksamkeit bei der Verwendung von SOD aufgrund deren
rascher Eliminierung aus dem Blut strom beschränkt (Petkau et al., Res. Commun.
Chem. Pathol. Pharmacol. 15:641–654
(1976); Odlund et al., Pharmacol. Toxic 62:95–100 (1988)). Eine verbesserte
Wirksamkeit ergab sich durch Strategien zur Erhöhung des SOD-Gehalts im Blutstrom,
die eine chemische Modifikation zur Verringerung der Eliminierungsrate
(Pyatak et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 29:113–127 (1980);
Hill-West et al., Obstet. Gynecol. 83:59–64 (1994)) und häufig wiederholte
Injektionen umfassten (O'Leary
et al., 1987).
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Die
Entfernung von einmal gebildeten Adhäsionen ist wesentlich schwieriger
als die Verhinderung einer Adhäsionsbildung.
Ungünstigerweise
können
Formulierungen, die primäre
Adhäsionen
wirksam verhindern (beispielsweise Hill-West et al., 1994), bei
der Verhinderung einer Neuadhäsion
nach einer Adhäsiolyse
("sekundäre" Adhäsionen)
wesentlich weniger wirksam sein. Obwohl die genauen biologischen
Unterschiede zwischen primären
und sekundären
Adhäsionen
nicht bekannt sind, ist es möglich,
dass die Bildung primärer
Adhäsionen
vom Fortbestehen von Fibrinbrücken
zwischen den getrennten Teilen abhängt, die anschließend durch
andere Zellen besiedelt werden und sich zu permanentem vaskularisiertem
Gewebe entwickeln. Alles, was die Bildung oder Stabilisierung der
anfänglichen
Fibrinbrücke
unterbricht, könnte
dazu tendieren, die Bildung primärer
Adhäsionen
zu verhindern. Sekundäre Adhäsionen können jedoch
das Ergebnis des normalen Heilungsprozesses, der an verletztem,
vorher existierendem Gewebe erfolgt, d. h. der lysierten primären Adhäsion, sein.
Der Heilungsprozess ist zwar noch nicht im Detail verstanden, doch
umfasst er die Mobilisierung mehrerer Zellarten und die Bildung
von neuem Collagen und er weist typischerweise etwa zwei Wochen
dauernde Anfangsstufen und anschließend mehrere Monate der Reifung
für eine
vollständige
Reparatur auf. Wegen dieser Unterschiede ist es möglich, dass
Behandlungen, die zur Prävention primärer Adhäsionen wirksam
sind, eine Verstärkung erfordern,
um eine Neubildung von Adhäsionen
nach einer Adhäsiolyse
zu verhindern.
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Zusammenfassend
gesagt, gibt es keine Berichte von Zusammensetzungen, die zur Beseitigung von
Adhäsionen
insbesondere bei Patienten, bei denen die Läsion wiederholt erfolgt, wie
im Falle von Patienten mit mehreren Operationen, vollständig wirksam
sind.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung
eines Verfahrens und von Zusammensetzungen zur Prävention
von Adhäsionen
nach einer Operation oder Infektion.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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SOD
und andere Inhibitoren von aktivem Sauerstoff (namentlich Oxidasen,
Peroxidasen, Katalasen, Xanthinoxidaseinhibitoren und Verapamil) werden
in Kombination mit einem biologisch abbaubaren Barrierematerial
an lokalen Stellen einer Gewebeläsion
zur Verhinderung oder Verminderung der Bildung von Adhäsionen und
einer unerwünschten Proliferation
von Zellen direkt appliziert. Bevorzugte Barrierematerialien sind
polymere Hydrogele, die eine gesteuerte Freisetzung von AOI ergeben,
die direkt auf das betroffene Gewebe appliziert werden.
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Beispiele
belegen die Wirkungen von SOD auf Beckenadhäsionen bei der Ratte bei Verabreichung
durch einen intraperitonealen (I.P.) Bolus und durch lokalisierte
nachhaltige Freisetzung aus einem topisch applizierten Hydrogelsystem.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 ist
ein Balkendiagramm der prozentualen Wirksamkeit einer Behandlung
mit einem Hydrogel (⫼), SOD allein (≡) und lokal über das
Hydrogel zugeführter
SOD (leerer Balken) im Vergleich mit unbehandelten Tieren (voller
Balken) mit Dosierungen von 2000 U SOD/ml gegenüber 10000 U SOD/ml in einem
Modell primärer
Adhäsionen
des Cornu uteri bei Ratten.
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2 ist
ein Balkendiagramm der prozentualen Wirksamkeit einer Behandlung
mit einem Hydrogel (⫼), SOD allein (≡) und lokal über das
Hydrogel zugeführter
SOD (leerer Balken) im Vergleich mit unbehandelten Tieren (voller
Balken) mit Dosierungen von 2000 U SOD/ml, 5000 U SOD/ml und 10000
U SOD/ml in einem Modell primärer
Adhäsionen
des Cornu uteri bei Ratten.
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3 ist
ein Balkendiagramm der prozentualen Wirksamkeit von Hydrogel (⫼),
SOD allein (≡) und
lokal über
das Hydrogel zugeführter
SOD (leerer Balken) im Vergleich mit unbehandelten Tieren (voller
Balken) für
Modelle von sowohl primärer
(leere Balken) als auch sekundärer
(volle Balken) Adhäsion.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Beschreibung werden ein Verfahren und Zusammensetzungen, die die Prävention
oder Minimierung von Gewebeadhäsionen,
insbesondere sekundären
Gewebeadhäsionen, ergeben,
beschrieben, wobei die Inhibitoren von aktivem Sauerstoff SOD, Katalasen,
Oxidasen, Peroxidasen, Xanthinoxidaseinhibitoren oder Verapamil
lokal auf den verletzten Bereich in einer Hydrogelformulierung appliziert
werden. In der bevorzugten Ausführungsform
wird das Hydrogel in situ durch Photopolymerisation einer Lösung eines
biologisch kompatiblen, biologisch abbaubaren Makromers, wie Polyethylenglykoldilactiddiacrylat,
polymerisiert. Alternativ oder zusätzlich kann ein Barrierematerial
in Kombination mit dem Inhibitor von aktivem Sauerstoff sowie Mitteln
zur gesteuerten Freisetzung für
den Inhibitor von aktivem Sauerstoff ("AOI")
verwendet werden. Diese Materialien einschließlich der Hydrogele werden
allgemein, falls nicht anders angegeben, als "Barrierematerialien" bezeichnet.
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Barrierematerialien
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Primäre Barrierematerialien
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Barrierematerialien
können
als Flüssigkeiten,
Pasten oder andere fließende
Formen verabreicht und lokal im Körper unter Bildung passender Barrieren
am oder nahe dem Applikationsort verändert werden, oder als feste
Barrieren verabreicht werden. Die Barrierematerialien sollten biologisch
gutartig sein und insbesondere keine schwere lokale Entzündungsantwort
induzieren. Im Wesentlichen alle Implantate verursachen nach der
Implantation eine vorübergehende
lokale Reaktion. Ein gutartiges oder biologisch kompatibles Material
ruft keine längere oder
eskalierende Entzündungsantwort
hervor. Bevorzugte Barrierematerialien sollten abbaubar sein oder
innerhalb einer vernünftigen
Zeit durch die Einwirkung natürlicher
Körperflüssigkeiten
verschwinden. Bevorzugte Barrierematerialien sollten auch als Depot
zur gesteuerten Freisetzung von AOIs über einen Zeitraum von Stunden
bis Wochen dienen, um eine direkte lokale Zufuhr zu verletzten Geweben
zu ermöglichen.
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Ein
bevorzugtes Barrierematerial ist ein Gel, noch besser ein Gelmaterial,
das in vivo, entweder durch allmähliches
Verschwinden in eine Lösung, spontane
Hydrolyse, enzymatischen Abbau oder eine Kombination von diesen
absorbiert wird. Beispiele für
geeignete Gele sind die Pluronic®-Poloxamergelsysteme,
die Polyalkylenoxide sind, von denen einige Mitglieder bei Körpertemperatur
Gele bilden, jedoch bei Raumtemperatur flüssig sind; und die photopolymerisierbaren
Gele gemäß der Beschreibung
bei Hubbel et al. (WO 93/17669) und Sawhney et al., J. Biomed. Mats.
Res. 28, 831–838
(1994). Pluronic-Gelsysteme sind als Antiadhäsionsbarrieren bekannt (US-Patent
4 911 926 und 5 135 751 von Henry et al., US-Patent 5 366 735 von
Henry) und als Wirkstoffzufuhrvehikel bekannt (US-Patent 5 292 516 von
Viegas et al.), wie auch die angegebenen Materialien von Hubbell.
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Zahlreiche
andere Formulierungen sind potentiell fähig, als Barrieren mit Wirkstoffzufuhrfähigkeit
zu dienen. Diese umfassen die Polymere des US-Patent 4 938 763 von
Dunn et al., US-Patent 5 108 755 von Daniels et al., US-Patent 4
913 903 von Sudmann et al., US-Patent 5 100 992 und 4 826 945 von
Cohn et al., US-Patent 5 219 564 von Zalipsky et al., US-Patent
4 741 872 und 5 160 745 von De Luca et al., US-Patent 4 526 938
und 4 942 035 von Churchill et al., US-Patent 4 888 413 von Domb, US-Patent
4 511 478 von Nowinski et al., US-Patent 4 957 744 von della Vallee
et al., US-Patent
4 925 677 von Feigen, US-Patent 4 994 277 von Hingham et al., US-Patent
5 364 622 von Franz et al. und US-Patent 4 804 691 von English et al.
Hyaluronsäurematerialien
einschließlich
von Hyaluronsäuregelen und
-membranen sind ebenfalls zur lokalen Zufuhr von AOIs zu verletztem
Gewebe geeignet.
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Oxidierte
Cellulose, die als Gewebe verabreicht wird, bildet in Körperflüssigkeiten
ein Gel und kann Wirkstoffe zuführen
(US-Patent 4 889 722 von Sheffield et al.). Es wird jedoch angenommen,
dass sie etwas inflammatorisch ist, und sie ist daher nicht bevorzugt.
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Die
Konzentration des gelbildenden Polymers in einem Hydrogel ist bekanntermaßen variabel.
Geeignete Polymerkonzentrationen sind diejenigen, die ein Gel ergeben,
das adäquate
mechanische Eigenschaften aufweist, um am Ort der Applikation über mindestens
den gewünschten
Behandlungszeitraum, der typischerweise Tage bis Wochen beträgt, fortzubestehen.
Minimale wirksame Gelbildungskonzentrationen verschiedener Polymere
reichen von dem niedrigen Wert von 0,1 % (Gew/Gew) für ultrareine
Agarose zu zwischen 3 und 5 % für
die Polymere von Hubbell et al. zu über 10 % für einige Poloxamere, wie Pluronics®.
Obergrenzen werden durch die Löslichkeit,
durch die Viskosität,
durch das Einsetzen von Sprödigkeit
des Gels, durch übermäßiges Anschwellen
nach der Bildung, durch osmotische Wirkungen der verwendeten Monomere
auf Gewebe und durch den Wunsch zur Minimierung der bei einer Behandlung
verwendeten Polymermenge bedingt. Diese Faktoren und deren Manipulation
sind einschlägig
bekannt und sie variieren mit dem Polymer. Konzentrationsobergrenzen
können
von dem niedrigen Wert von 2 % für
Agarose bis zwischen 25 und 30 % für die Polymere von Hubbell
bis 50 % oder mehr für
Poloxamere variieren.
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Bevorzugte
Materialien für
Barrieren und Zufuhrmittel sind durch bestimmte kritische Eigenschaften
gekennzeichnet, die umfassen: die Biokompatibilität, die Zufuhrzeiten,
die von einem Tag bis zu Wochen reichen, die Kompatibilität mit dem
zuzuführenden
AOI und in allen Ausführungsformen
die biologische Abbaubarkeit. Bevorzugte Materialien enthalten mindestens
etwas Wasser, das ferner physiologisch akzeptable Salze und Puffer
enthält;
höhere
Wassermengen sind bevorzugt, wenn sie ansonsten mit mechanischen
und Diffusionseigenschaften der Materialien kompatibel sind. Vorzugsweise
wird die Barrierefunktion mit der Funktion der gesteuerten Freisetzung
in einem einzigen Material kombiniert; von derartigen Materialien
sind Hydrogele bevorzugt.
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Wie
in den folgenden Beispielen angegeben ist, ist ein bevorzugter Modus
das Einarbeiten eines AOI, vorzugsweise von SOD, in eine Lösung, die
ferner ein biologisch kompatibles, biologisch abbaubares, gelbildendes
photopolymerisierbares Monomer und geeignete Photoinitiatoren, Puffer
und Stabilisierungsmittel enthält;
die Zufuhr der kombinierten Lösung
an einem Ort, wo eine Adhäsiolyse
durchgeführt
wurde, und das Bedecken der betroffenen Flächen; und die Photopolymerisation
der Zusammensetzung zur Erzeugung eines Barrieregels, das den AOI über einen
Zeitraum von Tagen bis über
eine Woche langsam freisetzt.
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Wie
oben angegeben ist die Konzentration des polymerisierbaren Materials
variabel. Für
das in den Beispielen verwendete spezielle Material liegt die bevorzugte
Monomerkonzentration im Bereich von 10 bis etwa 25 % (Gew/Gew) in
gepufferter isotonischer Kochsalzlösung. Bei höheren Konzentrationen besteht
die Neigung zu einer langsameren und länger dauernden Freisetzung
des AOI und zu einer längeren
Wirkung als Barrieren, doch sind sie entsprechend stärker viskos,
was die Applikation schwieriger machen kann, wenn sie über ein
Laparoskop oder einen Katheter erfolgt. Andere Materialien besitzen
unterschiedliche bevorzugte Konzentrationen, wie im Vorhergehenden
angegeben.
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Arzneimittelzufuhrmittel
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Mittel
für gesteuerte
Zufuhr können
zusätzlich
zu einem Gel oder anstelle eines Gels verwendet werden. Es gibt
eine große
Zahl einschlägig
bekannter physiologisch akzeptabler Arzneimittelzufuhrmaterialien,
die die folgenden Eigenschaften aufweisen:
- 1.
Das Zufuhrmittel muss lokalisierbar oder zumindest potentiell lokalisierbar
sein, um die Zufuhr der Inhalte primär zu einem speziellen Zielorgan oder
einem speziellen Zielbereich zu ermöglichen. Ein geeignetes Mittel,
obwohl nicht vorzugsweise für
den menschlichen Gebrauch, ist eine osmotische Pumpe, wie eine Alzet®-Pumpe
(Alza Co.).
- 2. Das Zufuhrmittel muss biologisch kompatibel sein und sollte
insbesondere im Körper
nicht wesentlich inflammatorisch sein. Beispiele für Mittel zur
gesteuerten Zufuhr umfassen kleine Arzneimittelteilchen, die in
einem biologisch erodierbaren Polymer, wie einem Polyglykolid, Polylactid oder
Polyanhydrid eingefangen sind, beispielsweise nach US-Patent 4 898
734 von Mathiowitz et al.; US-Patent 5 175 235 von Domb; US-Patent 5
286 763 von Gerhart et al.; und US-Patent 4 745 161 von Saudek et
al., die optional mit einer die Freisetzung verzögernden Hülle überzogen sind, die wiederum
dem Ort, an dem Adhäsionen
verhindert werden sollen, vorzugsweise mit weiteren Mitteln, um
diese nahe an dem Ort zu halten, wie einer Barrieremembran oder
einem Gel, zugeführt werden.
Mittel einer gesteuerten Zufuhr sind insbesondere wichtig, wenn
das zuzuführende
Arzneimittel hohe Wasserlöslichkeit
und ein niedriges Molekulargewicht aufweist.
- 3. Vorzugsweise wird das Zufuhrmittel im Körper gleichzeitig mit der Zufuhr
von Arzneimitteln oder anschließend
abgebaut. Die meisten der oben als potentielle Hydrogelmaterialien
angegebenen Polymere sind biologisch abbaubar wie auch die im vorhergehenden
Absatz aufgelisteten Polymere. Klassische erodierbare Polymere,
wie Poly(hydroxysäuren)
(beispielsweise Polyglykolid, Polylactid und Polycaprolacton) sind
in vielen Situationen geeignet, obwohl sie etwas stärker inflammatorisch
als einige neuere Polymere sind.
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Pharmazeutisch aktive
Verbindungen
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Inhibitoren von aktivem
Sauerstoff
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Die
hier verwendeten AOIs sind als Verbindungen definiert, die aktive
Sauerstoffspezies zerstören
oder die Bildung derselben verhindern. Aktive Sauerstoffspezies
umfassen Superoxide, Peroxide allgemein, Wasserstoffperoxid und
das Hydroxylradikal (OH). Andere aktive Spezies, die von aktiven Sauerstoffen
abgeleitet sind, wie das Hypochlorition (OCl–),
freie Hydroxylradikale an Kohlehydraten, "Singulettsauerstoff" oder Ozon werden ebenfalls umfasst.
Die aktiven Sauerstoffspezies schädigen Gewebe direkt. Darüber hinaus
können
sie eine indirekte Schädigung
durch das Anziehen von Zellen zum Verletzungsort oder eine andere
Stimulation einer Entzündungsantwort
verursachen.
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Ein
bevorzugter Antioxidationswirkstoff ist Superoxiddismutase (SOD).
Es wird angenommen, dass SOD eine Gewebeschädigung und Entzündung durch
Zerstörung
der Superoxidradikals verhindert. Jede der Formen von SOD ist geeignet.
Quellen umfassen den Menschen, was zur Minimierung der Immunogenität bevorzugt
ist, und auch andere bekannte Quellen, die Rinder und Bakterien
umfassen; SOD von verschiedenen Geweben, wie Leber, rote Blutkörperchen
und andere; SOD mit einem funktionalen Metallion, wie Mangan, Eisen,
Kupfer und Zink. Eine Form (Mangan) einer rekombinanten humanen
SOD ist in US-Patent
5 260 204 von Heckl et al., das auf EP-A 138111 von Chiron verweist,
als Quelle von rekombinanter humaner Kupfer/Zink-SOD beschrieben.
Ferner werden eine SOD, die mit hängenden Polymeren, wie Polyethylenglykol
oder Polyvinylalkohol, modifiziert ist; natürliche SOD, die durch rekombinante
oder transgene Verfahren produziert wurde; und variante Formen von
SOD, die durch Mutation oder Protein Engineering produziert wurden,
umfasst. Alle diese Verfahren sind einschlägig bekannt.
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Alternative
Verfahren zur Zufuhr von SOD oder anderen Wirkstoffen der Antioxidationsklasse auf
Proteinbasis zu dem Ort umfassen die Expression durch an dem Ort
eingeführte
transformierte Zellen und die transiente Transformation von Zellen
am Ort durch rekombinante DNA einschließlich eines Säugerpromotors,
beispielsweise ein Plasmid, eine Expressionskassette oder einen
viralen Vektor. Diese können
lokal durch jedes geeignete Mittel, die Liposome, polymere Verbundstoffe
umfassen, in Lösung über Katheter
und andere ähnliche
Vorrichtungen, durch Elektroporation oder Iontophorese und durch andere
einschlägig
bekannte Verfahren zugeführt werden.
Andere Wirkstoffe mit Antioxidationsaktivität (d. h., die den aktiven Sauerstoff
zerstören
oder die Bildung desselben verhindern) können bei der Prävention
von Adhäsionen entweder
in Kombination mit SOD, in Kombination miteinander oder allein verwendet
werden. Proteinwirkstoffe umfassen Peroxidasen und allgemein Oxidasen
oder oxidative Enzyme, wie Cytochrom P450, Glutathionperoxidase
und andere native oder denaturierte Hämoproteine. Die meisten derartigen
Moleküle
weisen detektierbare Peroxidaseaktivität auf. Andere Wirkstoffe bzw.
Arzneimittel wirken durch eine Veränderung der Enzymaktivität und diese
können
sehr wirksam sein. Allopurinol, das das Enzym Xanthinoxidase hemmt,
verhindert wesentlich die Erzeugung eines Superoxids und es wurde
als hoch wirksam ermittelt. Von anderen Xanthinoxidaseinhibitoren
wird ebenfalls erwartet, dass sie wirksam sind. Verapamil ist als
Calciumkanalblocker bekannt und wird als Vasodilatator verwendet.
Es ist zur Prävention
primärer
Adhäsionen
in den in den Beispielen beschriebenen Modellen hoch wirksam. Dessen
Wirkmechanismus ist unbekannt, es kann jedoch die Stimulation von
Zellen wie Makrophagen, von denen angenommen wird, dass sie bei
Stimulation aktiven Sauerstoff sezernieren, verhindern. Gemäß dieser
Definition ist Verapamil ein Inhibitor von aktivem Sauerstoff.
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Nicht
alle zur Prävention
einer Adhäsionsbildung
wirksamen Materialien wirken gegen aktiven Sauerstoff. Andere Materialien,
beispielsweise Fibrinolytika, können
verwendet werden, die Urokinase, Gewebeplasminogenaktivator und
Ancrod umfassen. Diese Materialien, die allein, beispielsweise gemäß der Beschreibung
durch Dunn et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 164:1327–1330 (1991),
wirksam sein können,
werden bei einer Kombination mit AOIs verstärkt.
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Formulierungen
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Die
Menge des einem Ort verabreichten AOI wird auf den speziellen Ort
und die Natur des verwendeten Mittels zur gesteuerten Freisetzung
eingestellt. Eine geeignete Ausgangsmenge ist eine Einzeldosis; diese
kann dann zur Optimierung der Menge nach oben oder unten eingestellt
werden. Die in den folgenden Beispielen angegebenen Ergebnisse zeigen, dass
für SOD
ein breites Optimum oder Plateau existiert; viele geeignete AOIs
in anderen Studien zeigen ebenfalls breite Wirksamkeitsbereiche.
Das längere Vorhandensein
von niedrigen Inhibitorkonzentrationen an der verletzten Stelle
ergibt nicht nur Schutz bei den unmittelbaren Folgen einer Operation,
sondern es minimiert auch eine Schädigung und Entzündung während mindestens
der frühen
Stufen des Heilungsprozesses und es ermöglicht allgemein die Verwendung
niedrigerer wirksamer Dosen.
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Die
Formulierung von AOI und Barrierematerialien sollte AOI dem verletzten
Gewebe direkt über einen
Zeitraum von Tagen von etwa 0,5 Tagen bis zu etwa 20 Tagen unter
in-vivo-Bedingungen
zuführen. Dies
wird vorzugsweise durch das Gel, das den AOI enthält, gesteuert,
kann jedoch auch durch eine mechanische Barriere, wie eine Membran
oder ein Gewebe, bereitgestellt werden. Die Formulierung kann ferner
weitere Mittel zur Regelung der Freisetzung des Inhibitors, wie
Mikrokügelchen,
Mikrokapseln, Mikroteilchen oder Liposome, (die hier gemeinsam als "Mikrokügelchen" bezeichnet werden)
enthalten, insbesondere wenn der AOI ein kleines Molekül von weniger
als etwa 20000 Dalton ist, wobei der AOI aus den Mikrokügelchen
in das Gel freigesetzt wird, von wo es in das Gewebe allein oder
in Kombination mit einer Freisetzung von AOI aus dem Gel diffundiert. Andere
Mittel zur gesteuerten Freisetzung umfassen intakte oder fein zerteilte
Gele, Polymere mit freisetzbar daran gebundenen AOIs und sich langsam
auflösende
Teilchen der AOIs oder eines Komplexes derselben mit einem inerten
Salz oder organischen Molekül.
Beispielsweise ist Verapamil als die freie Base in Wasser praktisch
unlöslich,
während
dessen Hydrochlorid sehr löslich
ist. Das Einschließen
der flüssigen
Form der freien Base in herkömmlichen
Mikrokapseln mit zeitgesteuerter Freisetzung kann zur Bereitstellung
längerer
Zufuhrperioden durch Einarbeiten der Mikrokapseln in die Polymerbarriere
verwendet werden.
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Die
Formulierungen können
ferner Streckmittel, Puffer, Stabilisierungsmittel und andere übliche Additive,
die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung bekannt sind,
enthalten. Die Formulierungen können
auch Bestandteile enthalten, die zur Bildung der Barriere notwendig
sind, wie eine Polymerisation induzierende oder eine Polymerisation ermöglichende
Materialien. Diese können
Photoinitiatoren, Kettenübertragungsreagenzien
und Comonomere umfassen.
-
Die
Formulierung kann in mehr als einem Behälter zum Mischen unmittelbar
vor der Verwendung zubereitet sein und durch Lyophilisieren, Gefriertrocknen,
Trocknen, Kühlen
oder andere üblicherweise
verwendete Mittel stabilisiert sein. Die Formulierung muss steril
sein; wenn Bestandteile der Formulierung instabil sind, sind eine
Filtersterilisation und aseptisches Einfüllen bevorzugt.
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Behandlungsverfahren
-
Applikation von Formulierungen
auf Gewebe
-
Die
Formulierung kann auf die betroffenen Gewebe durch jedes geeignete
Mittel appliziert werden. Diese umfassen Aufsprühen, Waschen mit einer die
Medikation enthaltenden Flüssigkeit,
Verteilen mit einem Instrument oder per Hand und die direkte Implantation
einer vorgeformten, Inhibitor enthaltenden Barriere. Wenn die Barriere
ein Gel oder eine andere feste Form ist, kann das Gel implantiert
werden; vorzugsweise wird jedoch eine Lösung des Gemischs aus einem
Gelvorläufer
und einem zuzuführenden
Inhibitor am Applikationsort zugeführt und durch geeignete Mittel
direkt auf dem Gewebe geliert. Bevorzugte Geliermittel sind wegen
ihrer Einfachheit physikalische Gelierung aufgrund einer Änderung
der Temperatur oder der Beendigung einer Scherkraft und Photopolymerisation
eines photoreaktiven gelierenden Monomers. Chemische Redoxreaktionen,
ionische Vernetzung und andere Verfahren einer Gelbildung können ebenfalls
verwendet werden.
-
Instrumente
zur Durchführung
von Zufuhr und Gelierfunktionen werden für die spezielle Anwendung unter
Verwendung von einschlägig
bekannten Prinzipien und Instrumenten ausgewählt. Diese umfassen typischerweise
Katheter oder Laparoskope zum minimal invasiven Zugang zu inneren
Stellen des Körpers;
Spritzen für
Oberflächen-
oder operativ freigelegte Stellen, wie bei Sehnen- oder Wundenreparatur;
und passende Lichtquellen, wenn eine Polymerisationsreaktion erforderlich
ist. Einige geeignete Instrumente sind detailliert in US-Patent
5 328 471, US-Patent 5 213 580 und US Aktenzeichen 08/054 385 (WO
94/24962), 08/036 128 (WO 94/21324) und 08/265 448, die hierdurch
als Bezug aufgenommen sind, beschrieben.
-
Medizinische
Indikationen
-
Eine
Behandlung mit den hier beschriebenen Zusammensetzungen, Medikationen
und Verfahren ist für
jeden Ort geplant, an dem Adhäsionen
gebildet werden und potentielle oder tatsächliche schädliche Wirkungen zeigen. Diese
umfassen primäre
und insbesondere sekundäre
Adhäsionen
im Folgenden: in der Bauchhöhle,
einschließlich
von Darm zu Darm und Darm zu Peritoneum; in der Beckenhöhle einschließlich einer
Adhäsion
des Uterus, der Ovarien oder der Eileiter mit anderen Strukturen
einschließlich
miteinander und der Beckenwand; bei Sehnen und deren Trägerstrukturen
einschließlich
von Sehne zu Ringband oder zu Synovium; bei der Reparatur von Nervenscheiden;
bei der Reparatur der Wirbelsäule
oder der Bandscheiben; im Pericard; bei der Behandlung von Gelenken
wegen Entzündung
und zur Verhinderung einer Pannusbildung; und in jeder Situation,
in der Adhäsionen
gebildet werden, die eine Funktion beeinträchtigen oder Schmerz verursachen.
Ferner können
die Zusammensetzungen bei anderen Zuständen verwendet werden, bei
denen eine unerwünschte
Gewebeproliferation er folgt. Diese können die Restenose von Arterien,
die Reparatur eines Keloids oder von hypertrophen Narben, eine Hypertrophie,
die Gänge
verschließt,
wie benigne Prostatahypertrophie, und Endometriose umfassen.
-
Die
vorliegende Erfindung wird ferner durch Bezugnahme auf die folgenden
nicht beschränkenden
Beispiele verständlich.
Die im Folgenden angegebenen Untersuchungen wurden gestaltet, um
(1) das Potential der Verwendung von lokal zugeführter Superoxiddismutase zu
belegen und (2) die Wirksamkeit von durch Hydrogel zugeführter SOD
mit Hydrogel allein oder SOD allein bei der Prävention postoperativer Adhäsionen zu
vergleichen.
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Beispiel 1: Freisetzung
von Modellverbindungen
-
Die
Kompatibilität
des SOD-Proteins mit den Komponenten des FocalGel-Systems wurde
in vitro getestet. Die Kompatibilität von SOD mit jeder Komponente
des Hydrogelsystems wurde stufenweise getestet, wobei auf jede Wirkung
auf SOD durch Gelelektrophorese, Umkehrphasen-HPLC, Kapillarelektrophorese
und einen Test der enzymatischen Aktivität (Cytochrom C) getestet wurde.
Da die Photopolymerisation des Gels UV-Licht erfordert, wurde die Wirkung
einer UV-Einwirkung (340–400
nm) auf die SOD-Stabilität
ebenfalls bewertet.
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Hydrogelmakromer(Vorpolymer)-Herstellung
-
In
allen Vorentwicklungsuntersuchungen wurde ein Hydrogel auf die gleiche
Weise unter Verwendung des im Folgenden angegebenen Verfahrens hergestellt:
Pluronic® F127
wurde zu einer Lösung
von monobasischem Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 6,8 gegeben. Photoinitiator
(Irgacure® 651)
wurde in tert-Butanol gelöst
und zu der Pluronic®/Puffer-Lösung gegeben.
Makromonomer und Polyethylenglykol (PEG) 8000 wurden dann zugegeben.
Nach einer Sterilfiltration wurden Ampullen gefüllt und das Wasser und tert-Butanol
durch Lyophi lisierung entfernt. Vor der Verwendung bei diesen Untersuchungen
wurde jede Hydrogelampulle mit normaler Kochsalzlösung rekonstituiert,
um eine Makromonomer/PEG 8000-Konzentration
von 10 % (Gew/Gew), 3 % (Gew/Gew) Pluronic® und
1200 ppm Irgacure® 651 zu erhalten.
-
A. Formulierungskompatibilitätsuntersuchungen
-
Die
SOD-Kompatibilität
in der Hydrogelformulierung wurde unter Verwendung eines stufenweisen
Untersuchungsplans bewertet. Die SOD-Stabilität in jeder Formulierungskomponente
wurde in Gegenwart und bei Abwesenheit einer Einwirkung von ultraviolettem
Licht (365 nm) getestet. Bei diesen Untersuchungen wurde die Proteinstabilität durch
Gelelektrophorese (SDS-PAGE und native PAGE), HPLC, Kapillarelektrophorese
und enzymatische Aktivität durch
Reduktion von Cytochrom C bewertet.
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Kontrollproben
wurden durch Verdünnen
von einer Ampulle von SOD (15000 U, 5 mg) mit 1,5 ml PBS zur Bildung
einer Endkonzentration [SOD] = 10 kU/ml hergestellt. Ferner wurden
400 μl dieser
Lösung
mit PBS auf 1 ml verdünnt,
wobei eine Endkonzentration [SOD] = 4 kU/ml erhalten wurde.
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Irgacure®/F127-behandelte
Proben wurden durch Zugabe von 1,5 ml Irgacure®/F127
(1200 ppm bzw. 3 % (Gew/Gew)) zu einer Ampulle von SOD (Endkonzentration
[SOD] = 10 kU/ml) hergestellt. Für alle
UV-behandelten Proben wurden 300 μl
Probenlösung
entweder 20 oder 60 s bestrahlt. Hydrogelbehandelte Proben wurden
durch Zugabe von 1,0 ml Hydrogellösung zu einer Ampulle von SOD
zur Bildung einer Endkonzentration [SOD] = 15 kU/ml hergestellt.
200 μl dieser
Lösung
wurden nach der Zugabe von 1,5 ml PBS zu dem Hydrogel entweder 20 oder
60 s photopolymerisiert. Die Proben wurden vor einer Analyse 24
h in einen Inkubator bei 37°C
gegeben.
-
Proben
zur Elektrophorese wurden durch Verdünnen von 100 μl der Probe
mit 300 μl
Probenpuffer (Bio-Rad technical manual LIT-188 REV C) hergestellt.
Die Proben wurden vor der Analyse nicht erhitzt. 10 μl Probe wurden
auf das Gel geladen mit Ausnahme von Proben, wobei SOD aus einem
Hydrogel freigesetzt wurde (in diesen Fällen wurden 20 μl verwendet).
Standards wurden nach dem Protokoll des Lieferanten durchgeführt. Die
Molekulargewichtsbanden in Elektrophoresegelen wurden durch Bildanalyse
integriert.
-
Es
scheinen zwei Formen von Teileinheiten mit niedrigem Molekulargewicht,
die nicht identisch sind, aufzutreten, wobei die Masse des Proteins
als Tetramerstruktur existiert. Zur Bildung einer Grundlinie für Vergleiche
der relativen Kompatibilität
wurde SDS-PAGE von SOD anfangs unter Verwendung einer Kochsalzlösungskontrolle
(keine Belichtung) durchgeführt.
Die Daten legen nahe, dass 92 % des Proteins als die Form mit hohem
Molekulargewicht (67 kDa) existieren, wobei die übrigen 8 % als die Monomerspezies
mit niedrigem Molekulargewicht (15,5 kDa) existieren. Es war auch
ein Peak von 12,7 kDa vorhanden, jedoch war die Bandenintensität sehr niedrig
und sie wurde daher nicht quantitativ bestimmt. Bei Zugabe des Initiators
und von Makromerformulierungskomponenten blieben die relativen Bandintensitäten nahezu
konstant, und bei Zugabe der UV-Einwirkung wurden keine sichtbaren Änderungen
beobachtet.
-
Native
PAGE-Analyse von SOD-Kontrolllösungen
(SOD in PBS, pH-Wert 7,4, [SOD] = 1,33 und 3,33 mg/ml) zeigt die
Wanderung einer einzigen Bande von SOD, wobei die Bandenintensität direkt
mit dem Proteingehalt in Beziehung steht. Lösungen mit Irgacure®/F127-Behandlung
und Hydrogelextraktion zeigen ähnliche
Wanderungen und Intensitäten
der SOD-Bande wie sie von der Kontrolle gezeigt wurden.
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SOD
wurde in die Initiatorlösung
(3 % F127 und 1200 ppm Irgacure®) durch
Pipettieren von 2 ml Initiatorlösung
in ei ne SOD enthaltende Ampulle (Endkonzentration [SOD] = 7,5 kU/ml)
eingearbeitet. 300-μl-Aliquots
von SOD/Initiator wurden unter der Schwarzlichtlampe (Leistung =
10 mW/cm2), lmax = 365 nm) bestrahlt. Die
Analyseergebnisse wurden als die Gesamtfläche der SOD-Peaks, die berechnete
SOD-Menge, die erwartete SOD-Menge und die prozentuale Rückgewinnung
analysiert. Irgacure®-Konzentrationen in Kontrolllösungen wurden ebenfalls
bestimmt und mit in den SOD/Initiatorproben beobachteten Konzentrationen
verglichen.
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SOD
wurde ferner in Hydrogel über
eine Massegelpolymerisation unter Verwendung von Bestrahlungszeiten
von 2 und 5 min eingearbeitet. Nach der Polymerisation wurde SOD
aus 200 μl
Massegelen (8 mm × 10
mm) über
zwei Tage in PBS extrahiert. Jede der Extraktionsproben wurde auf
die SOD-Menge analysiert und die kumulative Menge wurde als zurückgewonnener
Prozentanteil gegenüber
dem Anfang berechnet. Die Peakfläche
von SOD in Irgacure®/F127 blieb im Vergleich
zu der nicht bestrahlten Kontrolle nach UV-Bestrahlung (bis zu 5
min Bestrahlungsdauer) konstant. Die Daten zeigen ferner, dass die
Abbauprodukte des Irgacure®-Photoinitiators in den
Kontrolllösungen
in den SOD/Irgacure®-Behandlungslösungen nicht
geändert
waren. Alle in den Proben beobachteten Abbaupeaks wurden Irgacure®-Abbau
zugeschrieben. Die Extraktion von SOD aus Hydrogel führte zu
86,4 und 78,2 % der erwarteten zurückgewonnenen Menge. Die Extraktion war
sehr wahrscheinlich nicht vollständig,
da gezeigt wurde, dass SOD in vitro über 49 h nur partiell freigesetzt
wird. Chromatogramme für
aus Hydrogel extrahierter SOD zeigen, dass die Peakverteilungen ähnlich denen
in Kontrolllösungen
blieben.
-
Kapillartests
wurden durchgeführt.
In diesem Satz von Experimenten wurde eine Standardkurve von SOD
in Wasser hergestellt (1,48–11,84
kU/ml). SOD-Kompatibilitätsproben
wurden mit 1,2, 1,6 und 11,9 kU/ml hergestellt. Die Trennung durch
CE zeigt, dass drei scharfe Peaks vorhanden sind (3,15, 3,20 und
3,27 min). Der dritte Peak hat eine Schulter, die ein möglicher
vierter Peak ist. Jeder Peak wurde getrennt integriert und der dritte
Peak wurde so integriert, dass er die Schulterpeakfläche umfasst.
Die Standardkurve der Gesamtpeakfläche gegen die SOD-Konzentration zeigt
eine hervorragende Linearität
(R^2 = 1,000) über
[SOD] = 1,48 bis 11,84 kU/ml. Die Ergebnisse zeigen, dass die detektierten
Konzentrationen von SOD in Irgacure®/F127
(keine Bestrahlung) 130 und 82 % der erwarteten Konzentrationen
waren. Wenn SOD/Initiator-Proben bestrahlt wurden, blieben die SOD-Konzentrationen
ungeachtet der SOD-Konzentration hoch. Ergebnisse von Proben mit
niedrigem [SOD) (1,2 kU/ml) zeigten eine stärkere Ansprechvariabilität als die
mit höheren Konzentrationen
(11,9 kU/ml) hergestellten. Aus massephotopolymerisiertem Hydrogel
extrahierte SOD zeigte 89–108
% der erwarteten rückgewonnenen
SOD-Konzentration und die Peakverteilung blieb ähnlich der SOD-Kontrolle.
-
Unter
Standardtestbedingungen wurde die Reduktion von Cytochrom C (10–5 M)
bei 25°C
mit 5 × 10–5 M
Xanthinoxidase (XOD) in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,8),
der 0,1 mM EDTA enthielt, ermittelt. Die Hemmung der Reduktion von
Cytochrom C um 50 % wurde als eine Einheit der SOD-Aktivität definiert.
Ein kontinuierliche spektrophotometrische Bestimmung der Rate wurde über 5 min
bei 550 nm unter Verwendung eines Hitachi UV/Vis-Spektrophotometers
durchgeführt.
Kompatibilitätslösungen wurden
hergestellt und mit [SOD] = 5000 U/ml behandelt und dann mit normaler
Kochsalzlösung
zu einer Endkonzentration [SOD) = 10 U/ml verdünnt. Die relative spezifische
Aktivität
wurde durch Vergleich der Behandlungslösungsaktivität mit der
Kontrolllösungsaktivität bestimmt
([Kontrolle] = 10 U/ml mit 50 %iger Hemmung der Cytochrom-C-Reduktionsaktivität).
-
SOD
in normaler Kochsalzlösung
(10 U/ml, keine Bestrahlung) wurde als Kontrollprobe zum relativen
Kompatibili tätsvergleich
verwendet. Die durch den Test definierte theoretische enzymatische
Aktivität
war eine Hemmaktivität
von 50 % und die Kontrolllösung
zeigte die erwartete Reaktion (51,5 % Hemmung). Bei Zugabe des Initiators
und/oder von Makromerkomponenten wurde keine dramatische Änderung
der SOD-Aktivität
beobachtet. Ferner wurden, wenn SOD/Hydrogel-Formulierungen 1 min
UV-Einwirkung unterzogen wurden, die SOD-Aktivitätsgrade (50,9 % Hemmung) beibehalten.
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In-vitro-Freisetzungseigenschaften
-
Anschließend wurden
massephotopolymerisierte Hydrogelvorrichtungen, die vier Konzentrationen
von SOD (1, 3, 5 und 10 kU/ml) enthielten, hergestellt und bezüglich der
in-vitro-Freisetzungskinetiken
von SOD bewertet. SOD wurde in jeder der individuellen Komponenten
der Hydrogelvorpolymerlösung
in Gegenwart oder Abwesenheit von ultraviolettem Licht (10 mW/cm2) gelöst
und die SOD wurde dann durch Gelelektrophorese (SDS PAGE und native
PAGE), Umkehrphasen-HPLC,
Kapillarelektrophorese und Test der enzymatischen Aktivität (als Hemmung
der Cytochrom-C-Reduktion) charakterisiert. Keine Änderungen
der Proteincharakterisierung oder enzymatischen Aktivität wurden
unter Verwendung dieser Techniken beobachtet. Die Freisetzungskinetiken
von SOD aus Massehydrogelen wurden in vitro bei Hydrogelbeladungen
im Bereich von 1000 bis 10000 U/ml bestimmt.
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10
%ige Makromerlösungen
wurden unter Verwendung von 1200 ppm Irgacure und 3 % F127 in normaler
Kochsalzlösung
hergestellt. Parallel zu dem in-vivo-Untersuchungsmodell wurden
vier Dosen von SOD (1, 3, 5 und 10 kU/ml) in die Makromerlösung eingebaut
und in 200-μl-Aliquots
massephotopolymerisiert (365 nm, 10 mW/cm2).
Die SOD-Freisetzung in PBS wurde unter Verwendung des Mikro-BCA-Verfahrens
im Zeitverlauf überwacht;
die Aktivität
von freigesetztem SOD wurde ebenfalls unter Verwendung der Cytochrom-C-Hemmungsanalyse charakterisiert.
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Die
Hydrogelvernetzungsdichte und die wirksame Größe der Molekülart sind
zwei Hauptdeterminanten der Arzneimittelfreisetzungskinetiken aus dem
Hydrogel. In diesem Fall sind drei Molekulargewichtsarten von SOD
(67-kDa-Oligomer, 15,5- und 12,7-kDa-Monomere) vorhanden. Auf der
Basis von Daten unter Verwendung von Dextranmodellverbindungen wurde
erwartet, dass die Art mit niedrigem Molekulargewicht innerhalb
der ersten 12 h vollständig
aus dem Gel eluiert und die Art mit mittlerem Molekulargewicht (67
kDa) zunächst
einen Freisetzungsstoß innerhalb
der ersten 48 h mit längerer Freisetzung,
die bei Depletion der Oberflächendiffusionszone
offensichtlich wird, zeigt.
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Die
Freisetzung von SOD aus Hydrogel in vitro in Kochsalzlösung war
zweiphasig. Aus 10 %igen Makromerlösungen gebildete Hydrogele
setzten 90 % des eingebauten SOD innerhalb von 48 h frei (t1/2 = 4 h), während die übrigen 10 % mit einer Kinetik nullter
Ordnung während
der folgenden 7 Tage freigesetzt werden (t100 =
8 Tage). Im Gegensatz zu den mit Dextran erhaltenen Daten führt die
Zunahme der Arzneimitteldiffusionsweglänge verbunden mit dem gehinderten
Diffusionsvermögen
der Art mit größerem Molekulargewicht
zu einer auf 8 Tage verlängerten
Freisetzungsdauer. Die spezifische Aktivitätsanalyse von Probenelutionsmedien
zeigt verlängerte Formulierungsstabilität.
-
Beispiel 2: Prävention
primärer
Adhäsionen
in Rattenmodell
-
Tiermodelle
-
In-vivo-Wirksamkeitsexperimente
wurden in Modellen der primären
und sekundären
Adhäsion des
Cornu uteri von Ratten (rat uterine horn adhesion model, RUHAM)
zum Vergleich der relativen Wirksamkeiten von SOD, wenn es durch
IP Bolus zugeführt
wurde, mit einer gesteuerten Hydrogelzufuhr durchgeführt. Kontrollgruppen
umfassen unbehandelte (unverletzte) und Hydrogel (kein SOD)-Tiere. Die
letzten in-vivo-Wirksamkeitsuntersuchungen
verwendeten Dosisbereich-Untersuchungsmodelle
(1, 3, 5 und 10 kU/ml) in primären
und sekundären RUHAM-Modellen.
Der für
in-vivo-Bewertungsuntersuchungen
verwendete Endpunkt lag eine Woche nach der Behandlung.
-
Die
Experimente wurden unter Verwendung von zwei Modellen des Cornu
uteri von Ratten, die Adhäsionen
als Antwort auf eine anfängliche
ischämische
Verletzung entwickeln, durchgeführt.
Das erste Modell erzeugt Adhäsionen
de novo (primäres Modell) über einen
Zeitraum von 7 Tagen. Das zweite Modell ist ein Neubildungs(sekundäres)modell,
wodurch die in dem primären
Modell entwickelten fibrinösen
Adhäsionen
lysiert werden und eine Neubildung von Adhäsionen 7 Tage nach der Adhäsiolyse beobachtet
wird. 40 sexuell reife weibliche Sprague-Dawley-Ratten (225–250 g)
wurden in dem primären
Adhäsionsmodell
verwendet. Die Tiere wurden nach einer intramuskulären Injektion
von 4 ml/kg eines Gemischs aus Ketamin (25 mg/ml), Xylazin (1,3
mg/ml) und Acepromazin (0,33 mg/ml) anästhesiert. Aseptische Technik
wurde während
des operativen Verfahrens verwendet. Nach der Präparation des Abdomens wurde
ein unterer Mittellinienschnitt von 3 cm zur Freilegung der Beckenhöhle gemacht. Die
Cornu uteri wurden so positioniert, das der vaskuläre Bogen
freilag. Eine Ischämie
des zentralen Teils der Cornus uteri wurde durch Kauterisierung des
vaskulären
Bogens unter Verwendung von bipolarer Elektrokaustik induziert.
Es wurde sorgfältig darauf
geachtet, die vordersten und hintersten Gefäße, die das Horn mit Blut versorgen,
nicht zu kauterisieren, um eine minimale Durchblutung beizubehalten
und die Organfunktion sicherzustellen. Zwei weitere Läsionen wurden
an der antimesenterischen Oberfläche
des Horn etwa 2,5 cm entfernt unter Verwendung von Elektrokaustik
gesetzt. Nach der chirurgischen Läsion wurden die Tiere einer
der vier Behandlungsgruppen in will kürlicher Weise zugeordnet. Die
muskuloperitonealen Schichten und die darüber liegenden Faszien wurden
mit einem absorbierbaren 4-0-Vicrylnahtmaterial geschlossen und
der Hautschnitt wurde unter Verwendung von 7-mm-Klammern aus nichtrostendem
Stahl geschlossen.
-
Die
Tiere wurden am Ende von einer Woche bezüglich Adhäsionsbildung bewertet. Der "Prozentsatz an Adhäsionen" längs des
Cornu uteri wird als die an Adhäsionen
beteiligte gemessene Länge
der Cornus uteri, geteilt durch die Gesamtlänge des Cornu uteri, multipliziert
mit 100 berechnet. Die "prozentuale
Wirksamkeit" ist
100 minus dem "Prozentsatz an
Adhäsionen".
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In
einem zweiten Experiment wurden sieben Tagen nach dem Start des
primären
Adhäsionsmodells
Tiere (n = 40) geöffnet
und die Cornus uteri erneut freigelegt. Unter Verwendung mikroskopischer Operationstechniken
wurden Adhäsionen
zwischen dem Cornus uteri und anderen Organen sorgfältig herausseziert
und lysiert. Bipolare Elektrokaustik wurde zur Beibehaltung der
Hämostase
verwendet. Nach der Beendigung der Adhäsiolyse wurden die Tiere verschiedenen
Gruppen zugeordnet, gemäß dem Protokoll
behandelt und die Peritoneumhöhlen wurden
geschlossen. Tiere wurden am Ende des Zeitraums von einer Woche
hinsichtlich der Adhäsionsneubildung
bewertet und die Adhäsionspunktezahlen
wurden wie oben beschrieben berechnet.
-
Sowohl
in den primären
als auch den sekundären
Adhäsionsmodellen
wurden Tiere willkürlich
einer von vier Gruppen nach dem folgenden Versuchsplan zugeordnet:
Gruppe
1: Konrollläsion
ohne weitere Behandlung
Gruppe 2: nur Hydrogelbarriere
Gruppe
3: SOD allein
Gruppe 4: SOD enthaltendes Hydrogel
-
Für die Behandlungsgruppen
2 und 4 (in denen Hydrogel erforderlich war) wurden Formulierungen
wie oben beschrieben hergestellt und 0,25 ml Lösung wurden auf die mediale
und laterale Oberfläche der
Cornus uteri mit einem Gesamtvolumen von 1 ml pro Tier appliziert.
Die Zubereitung wurde anschließend
durch Bestrahlung mit langwelligem Ultraviolettlicht, das eine nominale
Bestrahlung von 20 mW/cm2 während 20
s lieferte, photopolymerisiert.
-
In
Gruppe 3 wurde mit normaler Kochsalzlösung rekonstituierte lyophilisierte
SOD auf die Oberfläche
jedes Cornu uteri in 0,25-ml-Aliquots wie oben beschrieben getropft.
Vier Experimente wurden zur Bestimmung der Wirkung einer Dosis auf
die primäre und
sekundäre
Adhäsionsbildung
durchgeführt.
Dosen im Bereich von 2000 bis 10000 U/ml wurden verglichen, wenn
sie direkt auf Peritoneumgewebe appliziert und wenn sie als Ergänzung zur
Hydrogelformulierung gegeben wurden.
-
Ergebnisse
des primären
Adhäsionsmodells
-
Die
Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Bei allen "unbehandelten" Kontrolltieren (Gruppe
1) hafteten 93 % oder mehr der Oberfläche des Cornu uteri am benachbarten
Mesometrium und/oder Organen, was zu Wirksamkeitspunktezahlen von
7 % oder weniger führte.
Als Barriere für
die Adhäsionsbildung appliziertes
Hydrogel (Gruppe 2) zeigte einen breiten Bereich von Wirksamkeitswerten
im Bereich von 11 bis 46 % Wirksamkeit. Die Applikation einer SOD-Lösung (Gruppe
3) führte
zu Wirksamkeitspunktezahlen von 86–93 %. Wirksamkeitspunktezahlen
reichten von 79 zu 85 %, wenn SOD enthaltendes Hydrogel appliziert
wurde (Gruppe 4). Keine signifikante Wirkung auf die Wirksamkeit
wurde beobachtet, wenn die Bolusdosis von SOD oder in das Hydrogel eingearbeiteter
SOD 2000 (10000 U/kg) oder 10000 U/ml (50000 U/kg) betrug.
-
Beispiel 3: Prävention
der Adhäsionsneubildung
in Rattenmodell
-
Ergebnisse
in sekundärem
Adhäsionsmodell
-
Die
Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Bei allen "unbehandelten" Kontrolltieren (Gruppe
1) hafteten 94 % oder mehr der Oberfläche des Cornu uteri am benachbarten
Mesometrium oder anderen Organen, was zu Wirksamkeitspunktezahlen
von 6 % oder weniger führte.
Als Barriere zur Adhäsionsneubildung
appliziertes Hydrogel (Gruppe 2) führte zu Wirksamkeitspunktezahlen
von 20 bis 40 %. Wenn SOD-Lösung
appliziert wurde (Gruppe 3), reichten Punktezahlen von 0 bis 29
%. Schließlich
führte
die Applikation von SOD nach der Einarbeitung in Hydrogel (Gruppe
4) zu Wirksamkeitspunktezahlen im Bereich von 67 bis 94 %. Keine
signifikante Wirkung auf die Wirksamkeit wurde beobachtet, wenn
eine Bolusdosis von SOD bzw. eine Dosis von in Hydrogel eingearbeitetem
SOD 2000, 5000 oder 10000 U/ml betrug.
-
Da
als Funktion der Dosis kein signifikanter Unterschied ermittelt
wurde, wurden die Daten von individuellen Experimenten kombiniert,
um Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen für sowohl primäre als auch
sekundäre
Modelle zusammenzufassen, wie in 3 gezeigt
ist.
-
Diamond
et al., Fert. and Ster. 47:864 (1987); Peters et al., Br. J. Obstet.
Gyn. 99:59 (1992); Lucian et al., Obstet. & Gyn. 74:220 (1989); Luciano et al., Fert.
and Ster. 48:1025 (1987); und Surrey et al., J. Repro. Med. 27:658
(1982) zeigten in Tiermodellen, dass die Verringerung von sekundären Adhäsionen schwieriger
als die von primären
Adhäsionen
ist. Auf der Basis der hier angegebenen Daten ist es wahrscheinlich,
dass primäre
und sekundäre
Adhäsionen bei
Ratten durch unterschiedliche pathologische Folgen gebildet werden.
Wenn histologische Bewertungen und die Neigung zur Adhäsionsbildung
an den Wundorten verglichen werden, werden die Unterschiede zwischen
den zwei Modellen offensichtlich.
-
Die
Lyse von Fibrin und die anschließende Adhäsionsresorption erfolgt in
dem primären
Modell vom Tag 7 bis zum Tag 28. Im Gegensatz dazu führt das
sekundäre
Adhäsionsmodell
zu fortbestehenden Collagenadhäsionen,
die über
einen Zeitraum von 8 Wochen nicht resorbiert werden. Diese Daten
zeigen, dass die Notwendigkeit einer pharmakologischen Intervention,
die über
einen längeren
Zeitraum andauert als sie ein einziger Bolus bereitstellen kann,
zur Verhinderung sekundärer
Adhäsionen
besteht. In diesem sekundären
Modell gebildete Adhäsionen sind
den in der klinischen Situation erfahrenen qualitativ ähnlich.
Obwohl andere Hydrogelformulierungen in Adhäsionsmodellen Wirksamkeit zeigten, stellten
die spezielle Formulierung und das Applikationsverfahren, die für diese
Untersuchung verwendet wurden, eine marginale Wirksamkeit als Barriere
bereit. Jedoch zeigten SOD, das in die gleiche Formulierung geladen
wurde, oder die direkte Applikation einer SOD-Lösung auf die Cornus uteri in
dem primären
Modell eine viel höhere
Wirksamkeit. Dies zeigt, dass bei diesem primären Adhäsionsmodell Wirksamkeit durch
SOD aufgrund einer frühen
Intervention in die pathologische Sequenz hervorgerufen wurde, was
mit der Produktion von von Sauerstoff abgeleiteten Radikalen während der
Anfangsstadien einer Entzündung
konsistent ist. Ferner kann, da die Eliminierungsrate von SOD aus
Blut rasch ist, spekuliert werden, dass die durch die Bolusdosis
gezeigte Wirksamkeit in einem kurzen Zeitrahmen erfolgte. In dem sekundären Modell
bestand eine dramatische Abnahme der Wirksamkeit, wenn die Barriere
allein oder ein SOD-Bolus appliziert wurden. Jedoch wurde ein signifikanter
Wirksamkeitsgrad erreicht, wenn die zwei Therapiearten kombiniert
wurden (d. h. die Barriere mit SOD beladen wurde). Dies stützt die
Hypothese, dass eine längere
Einwirkung von SOD erforderlich ist, wenn lysierte reife Collagenadhäsionen, die ähnlich den
in der klinischen Population gebildeten sind, statt den in dem primären Modell
gebildeten kurzlebigen fibrinösen
Adhäsionen
behandelt werden.