DE69636752T2 - Menschlicher wachstumsfaktor 2, spezifisch für vaskuläre endothelzellen - Google Patents

Menschlicher wachstumsfaktor 2, spezifisch für vaskuläre endothelzellen Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung ist eine Teilfortführungs-Anmeldung einer früheren Anmeldung, die beim Patent- und Markenamt der Vereinigten Staaten von Rosen, C. et al. am 8. März 1994 eingereicht worden ist und welcher die Seriennummer 08/207,550 zugewiesen worden ist.
  • Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, welche von solchen Polynucleotiden codiert werden, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide ebenso wie die Herstellung von solchen Polynucleotiden und Polypeptiden. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist als ein Mitglied der Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren identifiziert worden. Genauer gesagt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid um den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 2, der hierin manchmal als „VEGF2" bezeichnet wird. Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung eines solchen Polypeptids.
  • Die Bildung neuer Blutgefäße oder die Angiogenese ist unentbehrlich für die embryonale Entwicklung, das nachfolgende Wachstum und die Gewebereparatur. Angiogenese ist jedoch ein wesentlicher Teil bestimmter pathologischer Zustände wie Neoplasie, z.B. Tumore und Gliome, und eine anomale Angiogenese geht mit anderen Krankheiten einher, wie z.B. Entzündung, rheumatoider Arthritis, Psoriasis und diabetischer Retinopathie (Folkman, J. und Klagsbrun, M., Science 235: 442–447 (1987)).
  • Sowohl saure als auch basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Moleküle stellen Mitogene für Endothelzellen und andere Zelltypen dar. Angiotropin und Angiogenin können Angiogenese induzieren, obschon deren Funktionen unklar sind (Folkman, J., 1993, Cancer Medicine, S. 153–170, Lea and Febiger Press). Ein hoch selektives Mitogen für vaskuläre Endothelzellen ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor oder VEGF (Ferrara, N. et al., Endocr. Rev. 13: 19–32 (1992)), der auch unter dem Namen vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VPF) bekannt ist. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor ist ein sezerniertes angiogenes Mitogen, dessen Zielzellenspezifität auf vaskuläre Endothelzellen beschränkt zu sein scheint.
  • Das murine VEGF-Gen ist charakterisiert worden und man hat dessen Expressionsmuster in der Embryogenese untersucht. Es wurde eine anhaltende Expression von VEGF in Epithelzellen beobachtet, welche an das gefensterte Endothel angrenzen, z.B. im Choroidplexus und den Glomeruli der Niere. Die Daten waren mit einer Rolle von VEGF als multifunktionellem Regulator des Wachstums und der Differenzierung von Endothelzellen vereinbar (Breier, G. et al., Development 114: 521–532 (1992)).
  • VEGF ist strukturell mit den α- und β-Ketten des Thrombocyten-Wachstumsfaktors (PDGF), einem Mitogen für mesenchymale Zellen, und dem Placenta-Wachstumsfaktor (PLGF), einem Endothelzellen-Mitogen verwandt. Diese drei Proteine gehören zu derselben Familie und weisen ein gemeinsames konserviertes Motiv auf. Acht Cystein-Reste, die zur Bildung von Disulfidbrücken beitragen, sind in diesen Proteinen streng konserviert. Man hat alternativ gespleißte mRNAs für sowohl VEGF, PLGF als auch PDGF identifiziert, und diese verschiedenen Spleiß-Produkte unterscheiden sich in ihrer biologischen Aktivität und in der Spezifität der Rezeptorbindung. VEGF und PDGF üben ihre Funktion als Homodimere oder Heterodimere aus und binden an Rezeptoren, die nach der Rezeptordimerisierung eine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität auslösen.
  • VEGF kommt auf Grund von alternativen Spleißvorgängen in vier verschiedenen Formen von 121, 165, 189 und 206 Aminosäuren vor. VEGF121 und VEGF165 sind löslich und sind in der Lage, Angiogenese zu fördern, wohingegen VEGF189 und VEGF206 an Heparin enthaltende Proteoglycane an der Zelloberfläche gebunden vorliegen. Die zeitliche und räumliche Expression von VEGF ist mir der physiologischen Proliferation der Blutgefäße in Verbindung gebracht worden (Gajdusek, C. M. und Carbon, S. J., Cell Physiol. 139: 570–579 (1989); McNeil, P. L., Muthukrishnan, L., Warder, E., D'Amore, P. A., J. Cell. Biol. 109: 811–822 (1989)). Dessen hoch affine Bindungsstellen sind in Gewebeschnitten nur auf Endothelzellen lokalisiert (Jakeman, L. B. et al., Clin. Invest. 89: 244–253 (1989)). Der Faktor kann aus Zellen der Hirnanhangdrüse und verschiedenen Tumorzelllinien isoliert werden und ist mit manchen menschlichen Gliomen in Verbindung gebracht worden (Plate, K. H., Nature 359: 845–848 (1992)). Interessanterweise verleiht die Expression von VEGF121 und VEGF165 Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters die Fähigkeit, Tumore in Nacktmäusen zu bilden (Ferrara, N. et al., J. Clin. Invest. 91: 160–170 (1993)). Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der VEGF-Funktion durch monoclonale anti-VEGF-Antikörper das Tumorwachstum in immun-defizienten Mäusen inhibiert (Kim, K. J., Nature 362: 841–844 (1993)). Des Weiteren ist es gezeigt worden, dass eine dominant-negative Mutation des VEGF-Rezeptors das Wachstum von Glioblastomen in Mäusen hemmt.
  • Es ist auch festgestellt worden, dass der vaskuläre Permeabilitätsfaktor für die anhaltende mikrovaskuläre Hyperpermeabilität von Plasmaproteinen sogar nach der Beendigung einer Verletzung verantwortlich ist, was ein charakteristisches Merkmal der normalen Wundheilung darstellt. Dies deutet darauf hin, dass es sich bei VPF um einen wichtigen Faktor bei der Wundheilung handelt. Brown. L. F. et al., J. Exp. Med. 176: 1375–9 (1992).
  • Die Expression von VEGF ist in vaskularisierten Geweben (z.B. Lunge, Herz, Placenta und festen Tumoren) hoch und korreliert sowohl zeitlich wie auch räumlich mit der Angiogenese. Es ist auch gezeigt worden, dass VEGF in vivo Angiogenese induziert. Da Angiogenese für die Reparatur von normalen Geweben, insbesondere vaskulären Geweben, unentbehrlich ist, hat man vogeschlagen, VEGF zur Förderung der Reparatur von vaskulärem Gewebe (z.B. bei der Atherosklerose) einzusetzen.
  • Das US-Patent Nr. 5,073,492, welches am 17. Dezember 1991 an Chen et al. erteilt worden ist, offenbart ein Verfahren zur synergistischen Verstärkung des Wachstums von Endothelzellen in einer geeigneten Umgebung, welches die Zugabe von VEGF, Effektoren und Serumfaktor zu der Umgebung umfasst. Auch hat man DNA der C-Untereinheit des vaskulären Endothelzellen-Wachstumsfaktors mit Hilfe von Polymerasekettenreaktionsmethoden hergestellt. Die DNA codiert ein Protein, das entweder als Heterodimer oder als Homodimer vorliegen kann. Bei dem Protein handelt es sich um ein Mitogen von vaskulären Säuger-Endothelzellen, welches als solches nützlich für die Förderung der vaskulären Entwicklung und Reparatur ist, wie es in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 92302750.2 offenbart ist, die am 30. September 1992 veröffentlicht worden ist.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auf der Grundlage der Aminosäuresequenz-Homologie zu menschlichem VEGF als ein mutmaßlicher neuer vaskulärer Endothelzellen-Wachstumsfaktor identifiziert worden.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue reife Polypeptide bereitgestellt, ebenso wie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoga oder Derivate davon. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind menschlichen Ursprungs.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNA ebenso wie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoga oder Derivate davon.
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide durch rekombinante Methoden bereitgestellt, umfassend die Züchtung von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen, welche eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, unter Bedingungen, welche die Expression und die anschließende Gewinnung dieser Proteine begünstigen.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein solches Polypeptid oder ein Polynucleotid, das ein derartiges Polypeptid codiert, für therapeutische Zwecke zu nutzen, um zum Beispiel Angiogenese, Wundheilung zu stimulieren und vaskuläre Gewebereparatur zu fördern.
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antagonisten gegen solche Polypeptide bereitgestellt, die dazu verwendet werden können, die Funktion solcher Polypeptide zu hemmen, zum Beispiel das Wachstum von Tumoren zu hemmen, diabetische Retinopathie, Entzündung, rheumatoide Arthritis und Psoriasis zu behandeln.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuresonden bereitgestellt, umfassend Nucleinsäuremoleküle von ausreichender Länge, um spezifisch an Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, um Krankheiten oder eine Anfälligkeit gegenüber Krankheiten zu diagnostizieren, welche in Bezug zu Mutationen in den Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung und in den Proteinen, die von solchen Nucleinsäuresequenzen codiert werden, stehen.
  • Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung von solchen Polypeptiden oder von Polynucleotiden, welche solche Polypeptide codieren, für in vitro-Zwecke bereitgestellt, die mit der wissenschaftlichen Forschung, der Synthese von DNA und der Herstellung von DNA-Vektoren zu tun haben.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten Fachleuten aus den hierin enthaltenen Lehren ersichtlich sein.
  • Die folgenden Zeichnungen dienen der Veranschaulichung von Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung zu beschränken, wie er durch die Ansprüche umspannt ist.
  • 1 zeigt die cDNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Es werden die Standard-Einbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren verwendet. Die Sequenzierung wurde mit Hilfe des automatisierten DNA-Sequenziergeräts 373 (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt. Es ist vorausberechnet, dass die Genauigkeit der Sequenzierung höher als 97% liegt.
  • 2 ist eine Darstellung der Aminosäuresequenz-Homologie zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und anderen Mitgliedern der menschlichen PDGF/VEGF-Familie. Die eingerahmten Bereiche zeigen die konservierten Sequenzen und die Lage der acht konservierten Cystein-Reste an.
  • 3 zeigt eine Photographie eines Gels nach in vitro-Transkription, -Translation und Elektrophorese des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Spur 1: 14C und Regenbogen-MG-Marker; Spur 2: FGF-Kontrolle; Spur 3: VEGF2, das durch M13-Rückwärts- und Vorwärts-Primer erzeugt wurde; Spur 4: VEGF2, das durch M13-Rückwärts- und VEGF-F4-Primer erzeugt wurde; Spur 5: VEGF2, das durch M13-Rückwärts- und VEGF-F5-Primer erzeugt wurde.
  • 4. Das VEGF2-Polypeptid wird in einem Baculovirus-System exprimiert, welches aus Sf9-Zellen besteht. Protein aus dem Medium und aus dem Cytoplasma von Zellen wurde mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht.
  • 5. Das Medium von Sf9-Zellen, die mit einer Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung infiziert worden waren, wurde präzipitiert und das resuspendierte Präzipitat wurde mittels SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt.
  • 6. VEGF2 wurde aus dem Überstand des Mediums aufgereinigt und mittels SDS-PAGE in Anwesenheit oder in Abwesenheit des Reduktionsmittels β-Mercaptoethanol analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt.
  • 7. Umkehrphasen-HPLC-Analyse von gereinigtem VEGF2 mit einer RP-300-Säule (0,21 × 3 cm, Applied Biosystems, Inc.). Die Säule war mit 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert (Lösungsmittel A) und die Proteine wurden mit einem 7,5 minütigen Gradienten von 0 bis 60% Lösungsmittel B eluiert, welches aus Acetonitril bestand, das 0,07% TFA („Trifluoressigsäure") enthielt. Die Elution des Proteins wurde über die Extinktion bei 215 nm (rote Linie) und 280 nm (blaue Linie) verfolgt. Der Prozentsatz des Lösungsmittels B ist durch die grüne Linie angezeigt.
  • 8 stellt die Wirkung von partiell gereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen im Vergleich zu basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor dar.
  • 9 stellt die Wirkung von gereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen dar.
  • Mit dem Begriff „Gen" ist der Abschnitt der DNA gemeint, der an der Erzeugung einer Polypeptidkette beteiligt ist; es umschließt Bereiche, die der codierenden Region vorangehen und dieser folgen (Leader und Trailer) ebenso wie dazwischen liegende Sequenzen (Introns) zwischen den einzelnen codierenden Abschnitten (Exons).
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle (Polynucleotide) bereitgestellt, die die reifen Polypeptide, welche die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 aufweisen, oder das reife Polypeptid, welches von der cDNA des Clons codiert wird, der unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 97161 am 24. Mai 1995 hinterlegt wurde, oder Polypeptide codieren, die weniger Aminosäurereste aufweisen als diejenigen, die in 1 zu sehen sind.
  • Ein Polynucleotid, welches ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann aus Osteoclastomen eines menschlichen Embryos im Frühstadium (Woche 8–9), aus dem Herz eines Erwachsenen oder aus verschiedenen Brustkrebs-Zelllinien erhalten werden. Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer cDNA-Bank gefunden, welche von einem menschlichen Embryo im Frühstadium (9. Woche) stammte. Es ist strukturell mit der VEGF/PDGF-Familie verwandt. VEGF2 enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von 419 Aminosäureresten codiert, von denen ungefähr die ersten 23 Aminosäurereste die mutmaßliche Leader-Sequenz darstellen, so dass das reife Protein 396 Aminosäuren umfasst, wobei dieses Protein die höchste Aminosäuresequenz-Homologie zu dem menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor zeigt (30% Identität), gefolgt von PDGFα (23%) und PDGFβ (22%).
  • Es ist von besonderer Bedeutung, dass alle acht Cysteine in allen vier Mitgliedern der Familie konserviert sind (siehe eingerahmte Bereiche von 2). Darüber hinaus ist das Kennzeichen für die PDGF/VEGF-Familie, PXCVXXXRCXGCCN (SEQ ID NO: 3), in VEGF2 konserviert (siehe 2).
  • Es ist beabsichtigt, dass das VEGF2-Polypeptid der vorliegenden Erfindung das Volllängen-Polypeptid und die Polynucleotidsequenz einschließt, welche beliebige Leader-Sequenzen und aktive Fragmente des Volllängen-Polypeptids codiert. Aktive Fragmente sollen beliebige Teile der Volllängen-Aminosäuresequenz einschließen, die weniger als die gesamten 419 Aminosäuren der Volllängen-Aminosäuresequenz aufweisen, wie sie in der SEQ ID NO: 2 und in der 2 gezeigt ist, aber immer noch die acht Cysteinreste beinhalten, von denen in 2 gezeigt ist, dass sie konserviert sind, und solche Fragmente enthalten immer noch VEGF2-Aktivität.
  • Es gibt mmindestens zwei alternativ gespleißte VEGF2-mRNA-Sequenzen, die in normalen Geweben vorhanden sind. Die Größe der zwei VEGF2-mRNA-Sequenzen, die der Volllängen- bzw. der verkürzten Version entsprechen, sind in 3 gezeigt; 3, Spur 5 zeigt zwei Banden, was auf das Vorhandensein der alternativ gespleißten mRNA hinweist, die das VEGF2-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
  • Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder in Form von DNA vorliegen, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und falls sie einzelsträngig ist, kann sie der codierende Strang oder der nicht codierende (Antisense-) Strang sein. Die codierende Sequenz, welche das reife Polypeptid codiert, kann mit der in 1 gezeigten codierenden Sequenz oder mit jener des hinterlegten Clons identisch sein oder es kann sich um eine unterschiedliche codierende Sequenz handeln, wobei diese codierende Sequenz infolge einer Redundanz oder einer Degeneriertheit des genetischen Codes dasselbe reife Polypeptid codiert wie die DNA aus 1 oder die hinterlegte cDNA.
  • Das Polynucleotid, welches das reife Polypeptid aus 1 codiert oder das reife Polypeptid, welches von der hinterlegten cDNA codiert wird, kann umfassen: nur die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und wahlweise zusätzliche codierende Sequenz) und eine nicht codierende Sequenz wie z.B. Introns oder nicht codierende Sequenz, welche 5' und/oder 3' von der codierenden Sequenz für das reife Polypeptid gelegen ist.
  • Somit umspannt der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, welches nur die codierende Sequenz für das Polypeptid umfasst, ebenso wie ein Polynucleotid, welches eine zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenz umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, welche Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids codieren, welches die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 aufweist, oder des von der cDNA des hinterlegten Clons codierten Polypeptids codieren. Bei der Variante des Polynucleotids kann es sich um eine natürlich vorkommende allelische Variante des Polynucleotids oder um eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids handeln.
  • Demnach schließt die vorliegende Erfindung Polynucleotide ein, welche dasselbe reife Polypeptid, wie in 1 gezeigt, codieren oder dasselbe reife Polypeptid, welches von der cDNA des hinterlegten Clons codiert wird, ebenso wie Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, ein Derivat oder ein Analogon des Polypeptids von 1 oder des von der cDNA des hinterlegten Clons codierten Polypeptids codieren. Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
  • Wie hierin vorstehend angegeben, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, welche eine natürlich vorkommende allelische Variante der in 1 gezeigten codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons darstellt. Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, stellt eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz dar, die eine Substitution, eine Deletion oder eine Addition von einem oder mehreren Nucleotiden enthalten kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändern.
  • Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch die codierende Sequenz im selben Leseraster an eine Markersequenz fusioniert aufweisen, welche die Aufreinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Bei der Markersequenz kann es sich um einen Hexahistidin-Marker handeln, welcher von einem pQE-9-Vektor beigesteuert wird, um eine Aufreinigung des reifen, an den Marker fusionierten Polypeptids im Fall eines bakteriellen Wirts zu ermöglichen, oder die Markersequenz kann beispielsweise ein Hämagglutinin (HA)-Marker sein, wenn ein Säuger-Wirt, z.B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Der HA-Marker entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleitet ist (Wilson, I. et al., Cell 37: 767 (1984)).
  • Mit dem Begriff „Gen" ist der Abschnitt der DNA gemeint, der an der Erzeugung einer Polypeptidkette beteiligt ist; es umschließt Bereiche, die der codierenden Region vorangehen und dieser folgen (Leader und Trailer) ebenso wie dazwischen liegende Sequenzen (Introns) zwischen den einzelnen codierenden Abschnitten (Exons).
  • Fragmente des Volllängen-Gens der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonde für eine cDNA-Bank eingesetzt werden, um die Volllängen-cDNA zu isolieren und um andere cDNAs zu isolieren, welche eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem Gen aufweisen oder die eine ähnliche biologische Aktivität haben. Sonden dieser Art weisen bevorzugt mindestens 30 Basen auf und können zum Beispiel 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann auch dazu verwendet werden, um einen cDNA-Clon zu identifizieren, welcher dem Volllängen-Transkript entspricht, sowie einen genomischen Clon oder Clone, welche das vollständige Gen einschließlich der regulatorischen und der Promotor-Bereiche, Exons und Introns enthalten. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst die Isolierung der codierenden Region des Gens, indem man die bekannte DNA-Sequenz dazu verwendet, um eine Oligonucleotid-Sonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu derjenigen des Gens der vorliegenden Erfindung ist, werden dazu verwendet, eine menschliche cDNA-Bank, eine genomische DNA-Bank oder eine mRNA-Bank zu durchmustern, um zu bestimmen, an welche Mitglieder der Bank die Sonde hybridisiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polynucleotide, welche an die hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, sofern eine mindestens 70%-ige, bevorzugt eine mindestens 90%-ige und stärker bevorzugt eine mindestens 95%-ige Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, welche unter stringenten Bedingungen an die hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide hybridisieren. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „stringente Bedingungen", dass eine Hybridisierung nur auftritt, wenn eine mindestens 95%-ige und bevorzugt mindestens 97%-ige Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, welche an die hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide hybridisieren, codieren in einer bevorzugten Ausführungsform Polypeptide, welche entweder im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität aufweisen wie das reife Polypeptid, welches von den cDNAs der 1 (SEQ ID NO: 1) oder der (den) hinterlegten cDNA(s) codiert wird.
  • Alternativ kann das Polynucleotid mindestens 20 Basen aufweisen, bevorzugt 30 Basen und stärker bevorzugt mindestens 50 Basen, welche an ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung hybridisieren, wobei das Polynucleotid, wie hierin vorstehend beschrieben, eine Identität dazu aufweist und Aktivität beibehält oder nicht beibehält. Zum Beispiel können solche Polynucleotide als Sonden für das Polynucleotid von SEQ ID NO: 1 verwendet werden, zum Beispiel zur Gewinnung des Polynucleotids oder als eine diagnostische Sonde oder als ein PCR-Primer.
  • Somit ist die vorliegende Erfindung auf Polynucleotide, welche eine mindestens 70%-ige Identität, bevorzugt eine mindestens 90%-ige Identität und stärker bevorzugt eine mindestens 95%-ige Identität zu einem Polynucleotid aufweisen, welches das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert, ebenso wie Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens 30 Basen und bevorzugt mindestens 50 Basen aufweisen, sowie auf Polypeptide gerichtet, welche von solchen Polynucleotiden codiert werden.
  • Die Hinterlegung(en), auf welche hierin Bezug genommen wird, werden nach den Vorschriften des Budapester Vertrags zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren aufrechterhalten. Diese Hinterlegungen werden lediglich als Annehmlichkeit für die Fachleute bereitgestellt und stellen kein Zugeständnis dar, dass eine Hinterlegung gemäß 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, welche in den hinterlegten Materialien enthalten sind, ebenso wie Aminosäuresequenz der davon codierten Polypeptide sind hierin unter Bezugnahme aufgenommen und sind maßgebend im Fall von irgendeinem Konflikt mit irgendeiner Beschreibung von Sequenzen hierin. Es kann eine Lizenz erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und es wird hiermit keine solche Lizenz erteilt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, welche die hergeleitete Aminosäuresequenz von 1 aufweisen oder welche die Aminosäuresequenz aufweisen, die von der hinterlegten cDNA codiert wird, ebenso wie Fragmente, Analoga und Derivate eines solchen Polypeptids.
  • Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bedeuten, sofern sie sich auf das Polypeptid von 1 oder auf dasjenige, welches von der hinterlegten cDNA codiert wird, beziehen, ein Polypeptid, welches noch das konservierte Motiv von VEGF-Proteinen, wie es in 2 gezeigt ist, sowie im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität aufweist.
  • Bei den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um rekombinante Polypeptide, um natürliche Polypeptide oder um synthetische Polypeptide handeln, bevorzugt um rekombinante Polypeptide handeln.
  • Bei dem Fragment, dem Derivat oder dem Analogon des Polypeptids von 1 oder jenem, welches von der hinterlegten cDNA codiert ist, kann es sich (i) um eines handeln, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder einem nicht konservierten Aminosäurerest (bevorzugt mit einem konservierten Aminosäurerest) substituiert sind, wobei es sich bei diesem substituierten Aminosäurerest um einen handeln kann, der durch den genetischen Code codiert ist oder nicht, oder (ii) um eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine substituierte Gruppe enthalten, oder (iii) um eines, in welchem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie z.B. mit einer Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) um eines, in dem die zusätzlichen Aminosäuren an das reife Polypeptid fusioniert sind, oder (v) um eines, das weniger Aminosäurereste umfasst, als in SEQ ID NO: 2 gezeigt sind, und noch das konservierte Motiv aufweist und dennoch immer noch die Aktivität besitzt, welche für die VEGF-Familie von Polypeptiden charakteristisch ist. Solche Fragmente, Derivate und Analoga sind aus den hierin enthaltenen Lehren als innerhalb des Umfangs von Fachleuten anzusehen.
  • Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in isolierter Form bereitgestellt und sind bevorzugt bis zur Homogenität aufgereinigt.
  • Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (z.B. der natürlichen Umgebung, falls es in der Natur vorkommt) entfernt wird. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, welches in einem lebenden Tier vorliegt, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von manchen oder von allen in dem natürlichen System miteinander vorkommenden Materialien getrennt ist, ist isoliert. Solche Polynucleotide könnten Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert in dem Sinn, dass ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil von dessen/deren natürlicher Umgebung ist.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (insbesondere das reife Polypeptid) ebenso wie Polypeptide, welche mindestens 70% Ähnlichkeit (bevorzugt mindestens 70% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweisen und stärker bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (stärker bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweisen und noch stärker bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch stärker bevorzugt mindestens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweisen, und umfassen auch Teile solcher Polypeptide, wobei ein solcher Teil des Polypeptids im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren enthält und stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren.
  • Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, bestimmt man „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden dadurch, indem man die Aminosäuresequenz und die konservierten Aminosäureaustäusche eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids vergleicht.
  • Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können dazu eingesetzt werden, um das entsprechende Volllängen-Polypeptid mittels Peptidsynthese herzustellen; daher können die Fragmente als Intermediate für die Herstellung der Volllängen-Polypeptide eingesetzt werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können dazu eingesetzt werden, um Volllängen-Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung beinhalten, Wirtszellen, die auf gentechnische Weise mit Vektoren der Erfindung konstruiert werden, sowie die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung mit Hilfe von rekombinanten Techniken.
  • Wirtszellen werden auf gentechnische Weise (transduziert oder transformiert oder transfiziert) mit den Vektoren dieser Erfindung konstruiert, bei denen es sich zum Beispiel um einen Clonierungsvektor oder um einen Expressionsvektor handeln kann. Der Vektor kann zum Beispiel in Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen etc. vorliegen. Die gentechnisch veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die je nach Bedarf modifiziert werden können um Promotoren zu aktivieren, Transformanten durch Selektion zu gewinnen oder um die VEGF2-Gene der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren. Die Kulturbedingungen wie z.B. Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind diejenigen, die zuvor bei der Wirtszelle verwendet worden sind, die für die Expression ausgewählt wurde, und sind durchschnittlich ausgebildeten Fachleuten ersichtlich.
  • Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können dazu eingesetzt werden, um Polypeptide durch rekombinante Techniken herzustellen. Demnach kann das Polynucleotid zum Beispiel in einem beliebigen aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren enthalten sein, um ein Polypeptid zu exprimieren. Zu solchen Vektoren gehören chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet sind, virale DNA wie z.B. Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies-Virus. Es kann jedoch ein beliebiger anderer Vektor verwendet werden, solange er in dem Wirt replizieren kann und lebensfähig ist.
  • Die zweckdienliche DNA-Sequenz kann mit einer Vielzahl von Methoden in den Vektor eingesetzt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) eingesetzt. Solche und andere Methoden sind als innerhalb des Rahmens von Fachleuten anzusehen.
  • Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktionell mit (einer) zweckdienlichen Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren kann man erwähnen: LTR oder SV40-Promotor, der E. coli lac- oder trp-Promotor, der PL-Promotor des Phagen Lambda sowie andere Promotoren, von denen man weiß, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomen-Bindungsstelle für die Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch zweckdienliche Sequenzen zur Amplifikation der Expression umfassen.
  • Darüber hinaus enthalten Expressionsvektoren bevorzugt eines oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion der transformierten Wirtszellen zur Verfügung zu stellen, wie z.B. Dihydrofolatreduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkultur oder wie z.B. Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli.
  • Der Vektor, welcher die zweckdienliche DNA-Sequenz, wie hierin vorstehend beschrieben, ebenso wie einen zweckdienlichen Promotor oder eine zweckdienliche Kontrollsequenz enthält, kann dazu verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um es zu ermöglichen, dass der Wirt das Protein exprimiert.
  • Als repräsentative Beispiele von zweckdienlichen Wirten lassen sich erwähnen: Bakterienzellen wie z.B. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, Pilzzellen wie z.B. Hefe; Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen wie z.B. CHO, COS oder Bowes-Melanomzellen; Adenoviren; Pflanzenzellen etc. Die Auswahl eines zweckdienlichen Wirts ist aus den hierin enthaltenen Lehren als innerhalb des Rahmens von Fachleuten anzusehen.
  • Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der Sequenzen umfassen, die vorstehend allgemein beschrieben sind. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie z.B. einen Plasmidvektor oder einen viralen Vektor, in welchen eine erfindungsgemäße Sequenz in einer Vorwärts- oder einer Rückwärts-Orientierung eingesetzt worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, wozu beispielsweise ein Promotor gehört, der funktionell mit der Sequenz verknüpft ist. Den Fachleuten sind eine Vielzahl geeigneter Vektoren und Promotoren bekannt, und diese sind im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiel angeführt. Bakterielle: pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), PBS, pD10, Phagescript, ϕX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontische: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch irgendein anderes Plasmid oder irgendein anderer Vektor verwendet werden, solange diese in dem Wirt replizieren können und lebensfähig sind.
  • Promotorregionen können von jedem beliebigen Gen ausgewählt werden, wobei CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder andere Vektoren mit selektierbaren Markern verwendet werden. Zwei zweckdienliche Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Speziell genannte bakterielle Promotoren umfassen lacI, IacZ, T3, T7, gpt, Lambda PR, PL und trp. Eukaryontische Promotoren umfassen den unmittelbar frühen CMV-Promotor, den HSV-Thymidinkinase-Promotor, den frühen und den späten SV40-Promotor, LTRs von Retroviren und den Maus-Metallothionein-I-Promotor. Eine Auswahl des zweckdienlichen Vektors und Promotors liegt ohne weiteres innerhalb des Wissens von durchschnittlich ausgebildeten Fachleuten.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, welche die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine höhere eukaryontische Wirtszelle wie z.B. eine Säugerzelle oder um eine niedere eukaryontische Zelle wie z.B. eine Hefezelle handeln, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie z.B. eine Bakterienzelle sein. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch eine Calciumphosphat-Transfektion, eine DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder eine Elektroporation bewerkstelligt werden. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).
  • Die Konstrukte in den Wirtszellen können auf eine herkömmliche Weise dazu verwendet werden, das von der rekombinanten Sequenz codierte Genprodukt zu erzeugen. Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide mit Hilfe von herkömmlichen Peptidsynthesegeräten synthetisch hergestellt werden.
  • Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder in anderen Zellen unter der Kontrolle von zweckdienlichen Promotoren exprimiert werden. Es können auch zell-freie Translationssysteme eingesetzt werden, um solche Proteine mit Hilfe von RNAs herzustellen, welche von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet worden sind. Zweckdienliche Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor N.Y. (1989) beschrieben, deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die Transkription der die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierenden DNA durch höhere Eukaryonten wird durch die Einführung einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-agierende, gewöhnlich etwa 10 bis 300 bp lange DNA-Elemente, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs von bp 100 bis 270, einen Enhancer des frühen Cytomegalievirus-Promotors, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
  • Im Allgemeinen beinhalten die rekombinanten Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker, welche eine Transformation der Wirtszelle ermöglichen, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen sowie einen von einem hoch exprimierten Gen abgeleiteten Promotor, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu steuern. Solche Promotoren können von Operons abgeleitet werden, die glycolytische Enzyme codieren, wie z.B. 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine u.d.. Die heterologe Struktursequenz wird in einer geeigneten Phase mit Sequenzen für die Initiation der Translation und der Termination und bevorzugt mit einer Leader-Sequenz zusammengesetzt, welche in der Lage ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium zu steuern. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, welches ein N-terminales Identifikationspeptid beinhaltet, das die gewünschten Eigenschaften verleiht, z.B. eine Stabilisierung oder eine vereinfachte Aufreinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
  • Nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden konstruiert, indem man eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Signalen für die Initiation der Translation und die Termination in einer funktionellen Lesephase mit einem funktionellen Promotor inseriert. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um die Erhaltung des Vektors zu gewährleisten und um, sofern dies wünschenswert ist, eine Amplifikation innerhalb des Wirts bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für eine Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obgleich wahlweise auch andere eingesetzt werden können.
  • Als ein repräsentatives, aber nicht beschränkendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für die Verwendung in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, welche von im Handel erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, die genetische Elemente des wohlbekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche im Handel erhältliche Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese Abschnitte des pBR322-„Gerüsts" werden mit einem zweckdienlichen Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
  • Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und dem Wachstum des Wirtsstamms auf eine angemessene Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch zweckdienliche Mittel induziert (z.B. durch Temperaturänderung oder durch chemische Induktion) und die Zellen werden für eine zusätzliche Zeitdauer in Kultur gehalten.
  • Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, mit physikalischen oder chemischen Mitteln aufgeschlossen und der so erhaltene Rohextrakt wird für eine weitere Aufreinigung aufbewahrt.
  • Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von Proteinen eingesetzt werden, können mit jeder beliebigen geeigneten Methode aufgeschlossen werden, wozu periodisches Einfrieren-Auftauen, Ultraschallbehandlung, mechanischer Aufschluss oder die Verwendung von Zell-lysierenden Agentien gehören, wobei solche Methoden den Fachleuten wohlbekannt sind.
  • Es können auch verschiedene Säugerzell-Kultursysteme eingesetzt werden um rekombinantes Protein zu exprimieren. Zu Beispielen für Säuger-Expressionssysteme gehören die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, welche von Gluzman, Cell 23: 175 (1981) beschrieben worden sind, und andere Zelllinien, welche in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die Zelllinien C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK. Säuger-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch jegliche notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißdonor- und -akzeptorstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen und flankierende, nicht transkribierte 5'-Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von den SV40 Spleiß- und Polyadenylierungsstellen abgeleitet sind, können dazu verwendet werden, die benötigten, nicht transkribierten genetischen Elemente zur Verfügung zu stellen.
  • Die Polypeptide können aus den rekombinanten Zellkulturen mit Methoden gewonnen und aufgereinigt werden, welche Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie umfassen. Gegebenenfalls können bei der Vervollständigung der Konfiguration des reifen Proteins Protein-Rückfaltungsschritte eingesetzt werden. Schließlich kann man Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für finale Aufreinigungsschritte einsetzen.
  • Bei den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein natürlich aufgereinigtes Produkt handeln oder um ein Produkt aus chemisch-synthetischen Verfahren oder um ein Produkt, das durch rekombinante Techniken aus einem prokaryontischen oder einem eukaryontischen Wirt hergestellt worden ist (zum Beispiel durch bakterielle, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur). Je nach dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht glycosyliert sein. Erfindungsgemäße Polypeptide können auch einen Start-Methioninaminosäurerest enthalten.
  • Wie in den 8 und 9 gezeigt, ist das VEGF2-Polypeptid von SEQ ID NO: 2, ohne die anfänglichen 46 Aminosäuren, ein starkes Mitogen für vaskuläre Endothelzellen und stimuliert deren Wachstum und Proliferation. Die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse, die für die VEGF2-Nucleinsäuresequenz durchgeführt wurde, welche dieses Polypeptid codiert, bei der 20 μg RNA von verschiedenen menschlichen Geweben mit einer 32P-VEGF2-Sonde getestet wurden, zeigen, dass dieses Protein im Herz und in der Lunge aktiv exprimiert wird, was ein weiterer Hinweis auf mitogene Aktivität ist.
  • Dementsprechend kann VEGF2 dazu eingesetzt werden, um Angiogenese zu fördern, zum Beispiel um das Wachstum von transplantiertem Gewebe zu stimulieren, wenn eine Bypass-Operation der Herzkranzgefäße durchgeführt wird. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden um die Wundheilung zu fördern, insbesondere um geschädigtes Gewebe zu revaskularisieren oder den kollateralen Blutfluss während einer Ischämie zu stimulieren sowie in Fällen, in denen eine kapilläre Angiogenese erwünscht ist. VEGF2 kann eingesetzt werden, um Vollhautwunden wie z.B. Hautgeschwüre, einschließlich Druckgeschwüre, venöser Geschwüre und diabetischer Geschwüre, zu behandeln. Darüber hinaus kann VEGF2 dazu eingesetzt werden, um Verbrennungen dritten Grades und Vollhautverletzungen zu behandeln, wenn ein Hauttransplantat oder ein Hautlappen verwendet wird, um solche Verbrennungen oder Verletzungen zu beheben. VEGF2 kann auch in der plastischen Chirurgie eingesetzt werden, zum Beispiel zur Behandlung von Schnittwunden aus Verletzungen und Schnitten im Zusammenhang mit Operationen.
  • Analog hierzu kann VEGF2 dazu eingesetzt werden, das Wachstum von verletzten Knochen, Zahnhalteapparat oder Ligamentgewebe zu induzieren. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, um Stützgewebe der Zähne, einschließlich des Zements und des Desmodontiums zu regenerieren, welche durch Krankheit und Verletzung geschädigt worden sind.
  • Da Angiogenese wichtig ist, um Wunden rein und uninfiziert zu halten, kann VEGF2 in Verbindung mit Operationen und nach der Reparatur von Schnitten eingesetzt werden. Es kann auch für die Behandlung von Unterleibsverletzungen eingesetzt werden, bei denen ein hohes Infektionsrisiko besteht.
  • VEGF2 kann auch zur Förderung der Endothelbildung bei vaskulären Trans plantatoperationen eingesetzt werden. Im Fall von vaskulären Transplantaten, bei denen entweder transplantiertes oder synthetisches Material verwendet wird, kann VEGF2 auf die Oberfläche des Transplantats oder an der Kontaktstelle aufgebracht werden um das Wachstum von vaskulären Endothelzellen zu fördern. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, Schäden an Herzmuskelgewebe infolge von Herzinfarkt zu beheben. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, um das Herzgefäßsystem nach einer Ischämie zu reparieren. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, um infolge einer Koronaren Herzerkrankung und peripheren und ZNS-Gefäßerkrankung geschädigtes vaskuläres Gewebe zu behandeln.
  • VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, um künstliche Prothesen oder natürliche Organe, die in den Körper transplantiert werden sollen, zu beschichten, um die Abstoßung des transplantierten Materials zu minimieren und um die Vaskularisierung der transplantierten Materialien zu stimulieren.
  • VEGF2 kann auch zur Reparatur von vaskulärem Gewebe eingesetzt werden, zum Beispiel von jener, die während einer Arteriosklerose auftritt und die nach einer Ballonangioplastie notwendig ist, bei der vaskuläre Gewebe geschädigt werden.
  • VEGF2-Nucleinsäuresequenzen und VEGF2-Polypeptide können auch für in vitro-Zwecke, die mit wissenschaftlicher Forschung, Synthese von DNA und der Herstellung von DNA-Vektoren zu tun haben, und für die Herstellung von Diagnostika und Therapeutika zur Behandlung von menschlichen Krankheiten eingesetzt werden. Zum Beispiel kann VEGF2 für die in vitro-Züchtung von vaskulären Endothelzellen verwendet werden, wo man es in einer Konzentration von 10 pg/ml bis 10 ng/ml zu dem konditionierten Medium hinzugibt.
  • Fragmente des Volllängen-VEGF2-Gens können als Hybridisierungssonde für eine cDNA-Bank verwendet werden, um andere Gene zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem Gen aufweisen oder die eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Sonden dieser Art haben im Allgemeinen mindestens 50 Basenpaare, obgleich sie eine größere Anzahl an Basen aufweisen können. Die Sonde kann auch dazu verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der einem Volllängen-Transkript entspricht, und einen genomischen Clon oder genomische Clone zu identifizieren, welche das vollständige VEGF2-Gen einschließlich der regulatorischen und Promotorregionen, Exons und Introns enthalten. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst das Isolieren der codierenden Region des VEGF2-Gens, indem man die bekannte DNA-Sequenz dazu verwendet, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenzkomplementarität zu der Sequenz des Gens der vorliegenden Erfindung aufweisen, werden dazu verwendet, eine Bank von menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchmustern, um festzustellen, an welche Mitglieder der Bank die Sonde hybridisiert.
  • Diese Erfindung stellt Methoden zur Identifizierung von VEGF2-Rezeptoren bereit. Das Gen, welches den Rezeptor codiert, kann mit Hilfe von einer Vielzahl von Fachleuten bekannten Methoden identifiziert werden, zum Beispiel durch Liganden-Panning und FACS-Sortierung (Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kapitel 5 (1991)). Bevorzugt wird die Expressionsclonierung verwendet, bei der polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf VEGF2 reagiert, und eine cDNA-Bank, die aus dieser RNA erzeugt worden ist, wird in Pools aufgeteilt und dazu verwendet, COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die nicht auf VEGF2 reagieren. Man setzt transfizierte Zellen, die man auf Glas-Objektträgern wachsen lässt, markiertem VEGF2 aus. Man kann VEGF2 durch eine Vielzahl von Methoden markieren, wozu Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase gehören. Nach der Fixierung und Inkubation werden die Objektträger einer autoradiographischen Untersuchung unterzogen. Positive Pools werden identifiziert und Sub-Pools werden hergestellt und retransfiziert, wobei man einen iterativen Prozess aus der Bildung von Sub-Pools und erneuter Durchmusterung einsetzt, der schließlich einen einzelnen Clon ergibt, der den mutmaßlichen Rezeptor codiert.
  • Als eine alternative Herangehensweise zur Identifikation eines Rezeptors kann man markiertes VEGF2 mittels Photoaffinität an Zellmembran- oder Extraktpräparationen koppeln, die das Rezeptormolekül exprimieren. Vernetztes Material wird über PAGE aufgetrennt und auf einem Röntgenfilm exponiert. Der VEGF enthaltende markierte Komplex wird ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und einer Proteinmikrosequenzierung unterzogen. Die mittels Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz würde dazu verwendet werden, einen Satz von degenerierten Oligonucleotidsonden zu konstruieren, um eine cDNA-Bank zu durchmustern, um das Gen zu identifizieren, welches den mutmaßlichen Rezeptor codiert.
  • Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Durchmustern von Ver bindungen, um diejenigen zu identifizieren, die VEGF2-Agonisten oder -Antagonisten darstellen. Ein Beispiel für ein solches Verfahren macht sich die Fähigkeit von VEGF2 zunutze, die Proliferation menschlicher Endothelzellen in Gegenwart des Co-Mitogens ConA wesentlich zu stimulieren. Endothelzellen werden erhalten und man züchtet sie in Flachboden-Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) in einem Reaktionsgemisch, das mit ConA (Calbiochem, La Jolla, KA) supplementiert ist. Man fügt ConA, Polypeptide der vorliegenden Erfindung und die zu durchmusternden Verbindungen hinzu. Nach Inkubation bei 37° C werden die Kulturen mit 1 μCi 3[H]-Thymidin (5 Ci/mMol; 1 Ci = 37 GBq; NEN) für eine ausreichende Zeit, um das 3[H] einzubauen, pulsmarkiert und man erntet sie auf Glasfaserfiltern (Cambridge Technology, Waterton, MA). Der durchschnittliche 3[H]-Thymidin-Einbau (ZpM) („Zählimpulse pro Minute") von Kulturen im Dreifachansatz wird mit Hilfe eines Szintillationszählgeräts (Beckman Instruments, Irvine, KA) bestimmt. Ein signifikanter Einbau von 3[H]-Thymidin im Vergleich zu dem Kontrolltest, in dem die Verbindung nicht vorhanden ist, zeigt eine Stimulierung der Proliferation der Endothelzellen an.
  • Um auf Antagonisten zu testen, wird der vorstehend beschriebene Test durchgeführt, und die Fähigkeit der Verbindung, den Einbau von 3[H]-Thymidin in Gegenwart von VEGF2 zu hemmen, weist darauf hin, dass es sich bei der Verbindung um einen Antagonisten zu VEGF2 handelt. Alternativ können VEGF2-Antagonisten dadurch nachgewiesen werden, indem man VEGF2 und einen potenziellen Antagonisten mit Membran-gebundenen VEGF2-Rezeptoren oder mit rekombinanten Rezeptoren unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibitionstest kombiniert. VEGF2 kann markiert werden, wie z.B. durch Radioaktivität, so dass man anhand der Zahl der an den Rezeptor gebundenen VEGF2-Moleküle die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten bestimmen kann.
  • Alternativ würde die Reaktion eines bekannten sekundären Botenstoff-Systems nach der Interaktion von VEGF2 und dem Rezeptor gemessen und in Anwesenheit oder Abwesenheit der Verbindung verglichen werden. Solche sekundären Botenstoff-Systeme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf cAMP, Guanylatcyclase, Ionenkanäle oder die Hydrolyse von Phosphoinositid. In einem anderen Verfahren wird eine Säugerzelle oder eine Membranpräparation, welche den VEGF2-Rezeptor exprimiert, in Gegenwart der Verbindung mit markiertem VEGF2 inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Interaktion zu verstärken oder zu blockieren, könnte dann gemessen werden.
  • Potenzielle VEGF2-Antagonisten umfassen einen Antikörper oder in manchen Fällen ein Oligonucleotid, welcher/s an das Polypeptid bindet und die VEGF2-Funktion wirksam ausschaltet. Alternativ kann ein potenzieller Antagonist ein eng verwandtes Protein sein, welches an VEGF2-Rezeptoren bindet, wobei diese jedoch inaktive Formen des Polypeptids darstellen und dadurch die Wirkung von VEGF2 verhindern. Beispiele für diese Antagonisten umfassen eine negativ dominante Mutante des VEGF2-Polypeptids, zum Beispiel kann eine Kette der heterodimeren Form von VEGF2 dominant sein und kann auf eine Weise mutiert sein, dass die biologische Aktivität nicht bewahrt wird. Ein Beispiel einer negativ dominanten Mutante umfasst verkürzte Versionen eines dimeren VEGF2, das in der Lage ist, mit einem anderen Dimer zu interagieren, um Wildtyp-VEGF2 zu bilden; das so erhaltene Homodimer ist jedoch inaktiv und zeigt keine charakteristische VEGF-Aktivität.
  • Ein anderer potenzieller VEGF2-Antagonist ist ein Antisense-Konstrukt, das mit Hilfe der Antisense-Technologie hergestellt wird. Die Antisense-Technologie kann dazu verwendet werden, Genexpression durch die Bildung von Dreifach-Helices oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide Methoden auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Zum Beispiel wird codierende 5'-Teil der Polynucleotidsequenz, der die reifen Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, dazu verwendet, ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu konstruieren. Ein DNA-Oligonucleotid wird so konstruiert, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, die an der Transkription beteiligt ist (Dreifachhelix, siehe Lee et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)), wodurch die Transkription und die Produktion von VEGF2 verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das VEGF2-Polypeptid (Antisense – Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxyribonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch auf eine solche Weise an Zellen abgegeben werden, dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von VEGF2 zu verhindern.
  • Potenzielle VEGF2-Antagonisten umfassen auch kleine Moleküle, die an das aktive Zentrum des Polypeptids binden und dieses besetzen, wodurch sie das katalytische Zentrum für das Substrat unzugänglich machen, so dass die normale biologische Aktivität unterdrückt wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf kleine Peptide oder Peptid-artige Moleküle.
  • Die Antagonisten können dazu eingesetzt werden, die Angiogenese, die für feste Tumormetastasen notwendig ist, zu begrenzen.
  • Man stellt fest, dass die mRNA, welche VEGF2 codiert, in mindestens zwei Brustkrebszelllinien in moderaten Mengen exprimiert ist, was auf die Rolle der VEGF2-Polypeptide in dem malignen Phänotyp hindeutet. Bei Gliomen handelt es sich ebenfalls um einen Typ von Neoplasien, welche mit den Antagonisten der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
  • Die Antagonisten können auch dazu verwendet werden, chronische Entzündung zu behandeln, welche durch erhöhte vaskuläre Permeabilität verursacht wird. Außer bei diesen Funktionsstörungen können die Antagonisten auch dazu verwendet werden, mit Diabetes assoziierte Retinopathien, rheumatoide Arthritis und Psoriasis zu behandeln.
  • Die Antagonisten können in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger benutzt werden, z.B. wie hierin nachfolgend beschrieben.
  • Die VEGF2-Polypeptide und Agonisten und Antagonisten können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids oder des Agonisten oder des Antagonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Ein solcher Träger umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte an die Art der Verabreichung angepasst sein.
  • Die Erfindung stellt auch eine(n) pharmazeutische(n) Packung oder Kit bereit, die (der) einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der Arzneimittel der Erfindung gefüllt sind. Zu (einem) solchen Behälter(n) kann ein Beipackzettel in der Form gehören, wie er von Regierungsbehörden vorgeschrieben ist, welche die Herstellung, den Gebrauch oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten regeln, wobei der Bei packzettel die Zulassung durch die Behörde zur Herstellung, zum Gebrauch oder Verkauf für eine Anwendung am Menschen widerspiegelt. Außerdem können die Arzneimittel zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
  • Die Arzneimittel können in einer dienlichen Weise verabreicht werden, wie z.B. über lokale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intratumorale, subkutane, intranasale oder intradermale Wege. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die wirksam für die Behandlung und/oder die Vorbeugung der spezifischen Indikation ist. Im Allgemeinen werden die Arzneimittel in einer Menge von mindestens 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht und in den meisten Fällen werden diese in einer Menge von nicht mehr als etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. In den meisten Fällen wird die Dosis in einem Bereich von etwa 10 μg/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich liegen, wobei die Verabreichungswege, die Symptome etc. berücksichtigt werden.
  • Die VEGF2-Polypeptide und Agonisten oder Antagonisten, die Polypeptide sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung auch durch Expression eines solchen Polypeptids in vivo eingesetzt werden, was häufig als „Gentherapie" bezeichnet wird.
  • So können zum Beispiel Zellen wie z.B. Knochenmarkzellen mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA) gentechnisch verändert werden, welches das Polypeptid ex vivo codiert, die gentechnisch veränderten Zellen werden dann an den mit dem Polypeptid zu behandelnden Patienten abgegeben. Solche Methoden sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. zum Beispiel können Zellen durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren durch Verwendung eines retroviralen Partikels gentechnisch verändert werden, welches RNA enthält, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
  • Auf ähnliche Weise können die Zellen in vivo gentechnisch zur Expression eines Polypeptids in vivo verändert werden, zum Beispiel durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann eine Produktionszelle für die Erzeugung eines retroviralen Partikels, welches RNA enthält, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten verabreicht werden, um Zellen in vivo gentechnisch zu verändern und eine in vivo-Expression des Polypeptids zu erreichen. Dieses und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch derartige Methoden sollten Fachleuten aus den Lehren der vorliegenden Erfindung ersichtlich sein. Das Expressionsvehikel zur gentechnischen Veränderung der Zellen kann zum Beispiel ein anderes als ein retrovirales Partikel sein, zum Beispiel ein Adenovirus, welches dazu verwendet werden kann, Zellen in vivo nach einer Kombination mit einem geeigneten Abgabevehikel gentechnisch zu verändern.
  • Retroviren, von denen die hierin vorstehend erwähnten retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Moloney-Maus-Leukämievirus, Milznekrosevirus, Retroviren wie z.B. Rous-Sarkomvirus, Harvey-Sarkomvirus, Vogelleukosevirus, Gibbonaffen-Leukämievirus, menschliches Immunschwächevirus, Adenovirus, myeloproliferatives Sarkomvirus und Mammatumorvirus. In einer Ausführungsform ist der retrovirale Plasmidvektor von Moloney-Mausleukämievirus abgeleitet.
  • Der Vektor beinhaltet einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, welche verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die retrovirale LTR; den SV40-Promotor und den menschlichen Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, der in Miller et al., Biotechniques, Band 7, Nr. 9, 980–990 (1989) beschrieben ist, oder einen beliebigen anderen Promotor (z.B. zelluläre Promotoren wie z.B. eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Histon-, polIII- und β-Actin-Promotoren). Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Adenovirus-Promotoren, Thymidinkinase (TK)-Promotoren und B19 Parvovirus-Promotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird Fachleuten aus den hierin enthaltenen Lehren ersichtlich sein.
  • Die Nucleinsäuresequenz, welche das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, welche verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Adenovirus-Promotoren wie z.B. der späte Hauptpromotor von Adenovirus oder heterologe Promotoren wie z.B. den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor; den Promotor des respiratorischen Syncytial-Virus (RSV); induzierbare Promotoren wie z.B. den MMT-Promotor, den Metallothioneinpromotor; Hitzeschockpromotoren; den Albumin-Promotor; den ApoAl-Promotor; menschliche Globin-Promotoren; virale Thymidinkinase-Promotoren wie z.B. den Herpes simplex Thymidinkinase-Promotor; retrovirale LTRs (einschließlich der hierin vorstehend beschriebenen modifizierten retroviralen LTRs); den β-Actin-Promotor; und menschliche Wachstumshormon-Promotoren. Bei dem Promotor kann es sich auch um den nativen Promotor handeln, welcher die Gene kontrolliert, die das Polypeptid codieren.
  • Der retrovirale Plasmidvektor wird verwendet, um Verpackungszelllinien zu transduzieren, um Produktionszelllinien zu erzeugen. Beispiele für Verpackungszellen, die transfiziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Linien PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 und DAN, wie sie in Miller, Hum. Gene Ther. Band 1, S. 5–14 (1990) beschrieben sind, was hier unter Bezugnahme in Gesamtheit aufgenommen ist. Der Vektor kann die Verpackungszellen mit Hilfe eines beliebigen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens transduzieren. Solche Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und CaPO4-Präzipitation. In einer Alternative kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom verkapselt oder mit einem Lipid gekoppelt und dann an einen Wirt verabreicht werden.
  • Die Produktionszelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorpartikel, welche die Nucleinsäuresequenz(en) beinhalten, die die Polypeptide codiert(en). Solche retrovirale Vektorpartikel können dann dazu verwendet werden, eukaryontische Zellen zu transduzieren, entweder in vitro oder in vivo. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en) exprimieren, welche das Polypeptid codiert(en). Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf hämatopoetische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und Bronchialepithelzellen.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des VEGF2-Gens als Teil eines diagnostischen Tests zum Nachweis von Krankheiten oder der Anfälligkeit gegenüber Krankheiten, welche in Zusammenhang mit dem Vorliegen von Mutationen in VEGF2-Nucleinsäuresequenzen stehen.
  • Einzelpersonen, die Mutationen im VEGF2-Gen tragen, können durch eine Vielzahl von Techniken auf der DNA-Ebene ermittelt werden. Nucleinsäuren für die Diagnose lassen sich aus den Zellen eines Patienten gewinnen, wie z.B. aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis eingesetzt werden oder kann mit Hilfe der PCR vor der Analyse enzymatisch amplifiziert werden (Saiki et al., Nature 324: 163–166 (1996)). RNA oder cDNA können ebenfalls für denselben Zweck eingesetzt werden. Als ein Beispiel kann man PCR-Primer, die zu der VEGF2 codierenden Nucleinsäure komplementär sind, dazu einsetzen, um VEGF2-Mutationen zu identifizieren und zu untersuchen. Man kann zum Beispiel Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zu dem normalen Genotyp nachweisen. Punktmutationen können identifiziert werden, indem man amplifizierte DNA an radioaktiv markierte VEGF2-RNA- oder alternativ an radioaktiv markierte VEGF2-Antisense-DNA-Sequenzen hybridisiert. Man kann perfekt zueinander passende Sequenzen durch RnaseA-Verdau oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur von Duplexmolekülen mit Fehlpaarungen unterscheiden.
  • Ein auf Unterschieden in der DNA-Sequenz basierendes genetisches Austesten lässt sich durch einen Nachweis der Veränderung der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel erreichen. Kleine Sequenz-Deletionen und -Insertionen können durch hoch auflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von verschiedenen Sequenzen lassen sich auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterscheiden, in denen die Mobilitäten verschiedener DNA-Fragmente in dem Gel an verschiedenen Stellen auf Grund ihrer spezifischen Schmelz- oder partiellen Schmelztemperaturen verlangsamt sind (siehe z.B. Myers et al., Science 230: 1242 (1985)).
  • Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen lassen sich auch durch Nuclease-Protektionstests wie z.B. RNase- und S1-Protektion oder die chemische Spaltungsmethode (z.B. Cotton et al., PNAS, USA 85: 4397–4401 (1985)) aufdecken.
  • Demnach lässt sich der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Methoden wie z.B. Hybridisierung, RNase-Protektion, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder durch die Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B. durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)) und Southern-Blot-Analyse der genomischen DNA erreichen.
  • Außer durch die eher herkömmliche Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung lassen sich Mutationen auch durch in situ-Analyse nachweisen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Test zum Nachweis von veränderten Spiegeln von VEGF2-Protein in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontroll-Gewebeproben das Vorhandensein einer Krankheit oder die Anfälligkeit gegenüber einer Krankheit nachweisen kann, zum Beispiel eine anomale Zelldifferenzierung. Tests, die verwendet werden, um Spiegel des VEGF2-Proteins in einer Probe zu bestimmen, die von einem Wirt erhalten worden ist, sind Fachleuten wohlbekannt und umfassen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western Blot-Analyse, ELISA-Tests und den „Sandwich"-Test. Ein ELISA-Test (Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2), Kapitel 6, (1991) umfasst zunächst das Herstellen eines Antikörpers, der für das VEGF2-Antigen spezifisch ist, bevorzugt eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich wird ein Reporter-Antikörper gegen den monoclonalen Antikörper hergestellt. An den Reporter-Antikörper wird ein nachweisbares Reagenz angelagert, wie z.B. Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettichperoxidase-Enzym. Eine Probe wird einem Wirt entnommen und auf einem festen Träger inkubiert, z.B. einer Polystyrolplatte, welche die Proteine in der Probe bindet. Alle freien Proteinbindungsstellen auf der Platte werden dann abgedeckt, indem man mit einem nicht spezifischen Protein wie z.B. Rinderserumalbumin inkubiert. Als nächstes wird der monoclonale Antikörper in der Platte inkubiert, während dieser Zeit heften sich die monoclonalen Antikörper an alle VEGF2-Proteine an, die auf der Polystyrolplatte gebunden sind. Alle ungebundenen monoclonale Antikörper werden mit Puffer weggewaschen. Der an Meerrettichperoxidase gekoppelte Reporter-Antikörper wird in die Platte gegeben, was zu einer Bindung des Reporter-Antikörpers an alle an VEGF2 gebundenen monoclonalen Antikörper führt. Nicht gebundener Reporter-Antikörper wird dann weggewaschen. Es werden dann Peroxidase-Substrate zu der Platte hinzugefügt und die Menge an Farbe, die sich in einem bestimmten Zeitraum entwickelt, ist ein Maß für die Menge von VEGF2-Protein, das in einem gegebenen Volumen einer Patientenprobe vorliegt, wenn man diese mit einer Standardkurve vergleicht.
  • Man kann einen Kompetitiionstest verwenden, in dem für VEGF2 spezifische Antikörper an einen festen Träger gebunden sind. Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden dann markiert, zum Beispiel durch Radioaktivität, und eine von dem Wirt entnommene Probe wird dann über den festen Träger laufen gelassen und die Menge des Markers, welche zum Beispiel durch Flüssig-Szintillations chromatographie nachgewiesen wird, lässt sich dann mit einer Menge von VEGF2 in der Probe korrelieren.
  • Ein „Sandwich"-Test ist ähnlich wie ein ELISA-Test. In einem „Sandwich"-Test lässt man VEGF2 über einen festen Träger laufen und dieser bindet an einen an dem festen Träger angebrachten Antikörper. Ein zweiter Antikörper wird dann an den VEGF2 gebunden. Ein dritter Antikörper, der markiert ist und spezifisch für den zweiten Antikörper ist, wird dann über den festen Träger laufen gelassen und bindet an den zweiten Antikörper und eine Menge kann dann quantitativ bestimmt werden.
  • Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch wertvoll für die Identifizierung von Chromosomen. Die Sequenz ist spezifisch gegen eine bestimmte Stelle auf einem einzelnen menschlichen Chromosom gerichtet und kann mit dieser hybridisieren. Darüber hinaus gibt es einen aktuellen Bedarf für die Identifizierung von bestimmten Stellen auf dem Chromosom. Derzeit sind wenige Chromosomen-Markierungsreagenzien für die Markierung einer chromosomalen Lage verfügbar, die auf tatsächlichen Sequenzdaten basieren (Polymorphismen von Wiederholungen). Die Kartierng von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung stellt einen wichtigen ersten Schritt bei der Korrelierung dieser Sequenzen mit Genen dar, welche mit Krankheiten assoziiert sind.
  • In Kürze, Sequenzen können auf Chromosomen kartiert werden, indem man ausgehend von der cDNA PCR-Primer herstellt (bevorzugt 15–25 bp). Man setzt eine Computer-Analyse der cDNA ein, um schnell Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, wodurch der Amplifikationsprozess verkompliziert würde. Diese Primer werden dann für eine PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden eingesetzt, welche einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur diejenigen Hybride, welche das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment liefern.
  • Die PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist eine schnelle Methode, um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotid-Primern kann mit Gruppen von Fragmenten von spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Clonen auf analoge Weise eine Sublokalisierung erreicht werden. Andere Strategien der Kartierung, welche auf ähnliche Weise dazu verwendet werden können, das zugehörige Chromosom zu kartieren, schließen in situ-Hybridisierung, eine Vor- Durchmusterung mit markierten, durchflusssortierten Chromosomen und eine Vorselektion mittels Hybridisierung ein, um chromosomenspezifische cDNA-Banken zu konstruieren.
  • Man kann Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons bei einer Metaphasen-Chromosomenspreitung dazu einsetzen, um eine genaue chromosomale Lage in einem Schritt zu liefern. Diese Technik kann mit einer cDNA eingesetzt werden, die nur 50 oder 60 Basen lang ist. Für eine Übersicht über diese Technik siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques. Pergamon Press, New York (1988).
  • Sobald eine Sequenz auf eine genaue chromosomale Lage kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartierungsdaten korreliert werden. (Solche Daten lassen sich zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online verfügbar über die Welch Medical Library der Johns Hopkins-Universität) finden). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, welche auf dieselbe chromosomale Region kartiert worden sind, wird dann durch Kopplungsanalyse (die gemeinsame Vererbung von physikalisch aneinander angrenzenden Genen) ermittelt).
  • Als nächstes ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Einzelpersonen herauszufinden. Falls eine Mutation bei einigen oder bei allen betroffenen Einzelpersonen, aber nicht bei irgendeiner der Normalpersonen beobachtet wird, dann ist es wahrscheinlich, dass die Mutation das ursächliche Agens der Krankheit ist.
  • Bei der heutigen Auflösung von physikalischer Kartierung und genetischen Kartierungsmethoden könnte eine cDNA, die genau auf eine chromosomale Region lokalisiert ist, die mit einer Krankheit assoziiert ist, eines von zwischen 50 und 500 potenziellen verursachenden Genen sein. (Hierbei ist eine Auflösung der Kartierung von 1 Megabase und ein Gen pro 20 kb unterstellt).
  • Die Polypeptide, deren Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, welche diese exprimieren, können als Immunogen verwendet werden, um Antikörper dagegen herzustellen. Bei diesen Antikörpern kann es sich zum Beispiel um polyclonale oder monoclonale Antikörper handeln. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper ebenso wie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbank. Es können ver schiedene, auf dem Fachgebiet bekannte Methoden für die Herstellung solcher Antikörper und Fragmente eingesetzt werden.
  • Antikörper, die gegen das einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechende Polypeptid erzeugt worden sind, kann man durch direkte Injektion des Polypeptids in ein Tier oder durch Verabreichung des Polypeptids an ein Tier, bevorzugt ein nicht-menschliches, erlangen. Der so erhaltene Antikörper wird dann an das Polypeptid selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert, dazu verwendet werden, Antikörper zu erzeugen, die das gesamte native Polypeptid binden. Solche Antikörper können dann dazu verwendet werden, um das Polypeptid aus Geweben zu isolieren, die jenes Polypeptid exprimieren. Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann eine beliebige Methode verwendet werden, die Antikörper liefert, die durch kontinuierliche Kulturen von Zelllinien erzeugt werden. Beispiele umfassen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975)), die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983)) und die EBV-Hybridom-Technik, um menschliche monoclonale Antikörper zu erzeugen (Cole et al., 1985, in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96).
  • Methoden, die für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben worden sind (US-Patent 4,946,778) können angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu erzeugen. Es können auch transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu erzeugen.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben; es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Sofern nicht anderweitig angegeben, sind alle Teile oder Mengen nach Gewicht angegeben.
  • Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig vorkommende Methoden und/oder Begriffe beschrieben.
  • „Plasmide" werden durch den Kleinbuchstaben p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Nummern vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, öffentlich unbeschränkt zugänglich oder können aus verfügbaren Plasmiden gemäß veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Darüber hinaus sind gleichwertige Plasmide zu den beschriebenen auf dem Fachgebiet bekannt und werden einem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann ersichtlich sein.
  • „Verdau" von DNA bezieht sich auf eine katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, welches nur bei bestimmten Sequenzen in der DNA funktioniert. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und deren Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und andere Erfordernisse wurden so verwendet, wie es einem durchschnittlich begabten Fachmann bekannt wäre. Für analytische Zwecke wird üblicherweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung eingesetzt. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten für Plasmid-Konstruktionen werden üblicherweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Zweckdienliche Puffer und Substratmengen für jeweilige Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Gewöhnlich werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37° C verwendet, aber diese können gemäß den Vorschriften des Herstellers variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
  • Eine Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung eines 8 Prozent Polyacrylamidgels durchgeführt, welches von Goeddel, D. et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057 (1980) beschrieben ist.
  • „Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und ligieren somit nicht an ein anderes Oligonucleotid ohne Zugabe eines Phosphats von einem ATP in Gegenwart einer Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotid ligiert an ein Fragment, welches nicht dephosphoryliert worden ist.
  • „Ligierung" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., a.a.O. S. 146). Sofern nicht anderweitig vermerkt, kann eine Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg von ungefähr äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht werden.
  • Sofern nicht anderweitig angegeben, wurden Transformationen, wie in der Methode von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52: 456–457 (1973) beschrieben, durchgeführt.
  • Beispiel 1
  • Expressionsmuster von VEGF2 in menschlichen Geweben und in Brustkrebszelllinien.
  • Es wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um die Expressionsspiegel des VEGF2-Gens in menschlichen Geweben und menschlichen Brustkrebszelllinien zu untersuchen. Proben von zellulärer Gesamt-RNA wurden mit dem RNAzolTM B-System (Biotecx Laboratories, Inc.) isoliert. Etwa 10 μg Gesamt-RNA, die von jedem Brustgewebe und der angegebenen Zelllinie isoliert worden war, wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und mit dem Blotting-Verfahren auf einen Nylonfilter übertragen (Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989). Die Markierungsreaktion wurde gemäß dem Prime-It-Kit von Stratagene Cloning Systems, Inc. mit 50 ng DNA-Fragment durchgeführt. Die markierte DNA wurde mit einer Select-G-50-Säule von 5 Prime–3Prime, Inc., Boulder, CO, USA aufgereinigt. Der Filter wurde dann mit dem radioaktiv markierten Volllängen-VEGF2-Gen bei 100.000 ZpM/ml in 0,5 M NaPO4 und 7% SDS über Nacht bei 65°C hybridisiert. Nach zweimaligem Waschen bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS wurden die Filter über Nacht bei –70°C mit einer Verstärkerfolie exponiert. Eine Boten-RNA von 1,6 kb Größe wurde in 2 Brustkrebszelllinien beobachtet.
  • Beispiel 2
  • Clonierung und Expression von VEGF2 mit dem Baculovirus-Expressionssystem.
  • Die cDNA-Sequenz, welche das VEGF2-Protein ohne die 46 Aminosäuren am N-Terminus codiert, siehe ATCC #97161, wurde mit den PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die den 5'- und den 3'-Sequenzen des Gens entsprachen.
  • Der 5'-Primer hat die Sequenz TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCC GCC ATG GAG GCC ACG GCT TAT GC (SEQ ID NO: 4) und enthält eine BamHI-Restriktionsstelle (in Fettschrift) und 17 Nucleotide einer Nucleotidsequenz, die zur 5'-Sequenz von VEGF2 (nt 150–166) komplementär ist.
  • Der 3'-Primer hat die Sequenz GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGG TCT (SEQ ID NO: 5) und enthält die Spaltstelle für das Restriktionsenzym XbaI und 18 Nucleotide, die komplementär zu der 3'-Sequenz von VEGF2 sind, einschließlich des Stoppcodons und der 15 Nucleotide langen Sequenz vor dem Stoppcodon.
  • Die amplifizierten Sequenzen wurden aus einem 1% Agarosegel mit einem im Handel erhältlichen Kit („Geneclean", Bio 101 Inc., La Jolla, KA) isoliert. Das Fragment wurde dann mit den Endonucleasen BamHI und XbaI verdaut und dann noch einmal auf einem 1% Agarosegel aufgereinigt. Dieses Fragment wurde an den BamHI- und XbaI-Stellen in den Baculovirus-Transfervektor pAcGP67A (Pharmingen) ligiert. Durch diese Ligierung wurde die VEGF2-DNA im Leseraster mit der Signalsequenz des Baculovirus-Gens gp67 cloniert und war am 3'-Ende der Signalsequenz in dem Vektor gelegen. Dieser wurde als pAcGP67A-VEGF2 bezeichnet.
  • Um VEGF2 mit der Signalsequenz des gp67-Gens zur Expression in den Vektor pRG1 zu clonieren, wurde VEGF2 mit der Signalsequenz und etwas Sequenz stromaufwärts an der stromaufwärts von der VEGF2-cDNA gelegenen XhoI-Restriktionsendonucleasestelle und an der XbaI-Restriktionsendonucleasestelle durch das XhoI- und XbaI-Restriktionsenzym aus dem Plasmid pAcGP67A-VEGF2 ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde auf einem 1% Agarosegel vom Rest des Vektors getrennt und wurde mit dem „Geneclean"-Kit aufgereinigt. Es wurde als F2 bezeichnet.
  • Der Vektor pRG1 (eine Modifikation des Vektors pVL941) wird für die Expression des VEGF2-Proteins mit dem Baculovirus-Expressionssystem eingesetzt (für einen Übersichtsartikel siehe: Summers, M.D. und Smith, G.E., 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des nucleären Polyeder-Virus von Autographa californica (AcMNPV), gefolgt von den Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI SmaI, XbaI, BglII und Asp718. Eine Stelle für die Restriktionsendonuclease XhoI ist stromaufwärts von der BamHI-Stelle gelegen. Die Sequenz zwischen XhoI und BamHI ist dieselbe wie diejenige in dem Vektor pAcGp67A (Bandstörung). Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus SV40 wird für eine effiziente Polyadenylierung eingesetzt. Für eine leichte Selektion von rekombinantem Virus ist das β-Galactosidase-Gen von E. coli in derselben Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor eingeführt, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens. Die Polyhedrin-Sequenzen sind auf beiden Seiten von viralen Sequenzen für die Zell-vermittelte homologe Rekombination von cotransfizierter viraler Wildtyp-DNA flankiert. Viele andere Baculovirus-Vektoren könnten an Stelle von pRG1 verwendet werden, wie z.B. pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V.A. und Summers, M.D., Virology 170: 31–39).
  • Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und XbaI verdaut und dann mit Kälberdarmphosphatase mit auf dem Fachgebiet bekannten Methoden dephosphoryliert. Die DNA wurde dann aus einem 1% Agarosegel mit dem im Handel erhältlichen Kit („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA) isoliert. Diese Vektor-DNA wird als V2 bezeichnet.
  • Das Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli HB101-Zellen wurden dann transformiert und Bakterien identifiziert, die das Plasmid (pBac gp67-VEGF2) mit dem VEGF2-Gen enthielten, wobei die Enzyme BamHI und XbaI verwendet wurden. Die Sequenz des clonierten Fragments wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • 5 μg des Plasmids pBac gp67-VEGF2 wurden mit 1,0 μg eines im Handel erhältlichen linearisierten Baculovirus („BaculoGoldTM Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, KA) mit der Lipotransfektions-Methode (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417 (1987)) cotransfiziert.
  • 1 μg von BaculoGoldTM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBac gp67-VEGF2 wurden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt, welche 50 μl Serum-freies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburgh, MD) enthielt. Danach wurden 10 μl Lipofectin plus 90 μl Grace-Medium hinzugefügt, gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) hinzugegeben, die in einer 35 mm-Gewebekultur-Platte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät worden waren. Die Platte wurde hin und her geschaukelt, um die neu hinzugegebene Lösung zu mischen. Die Platte wurde dann für 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung aus der Platte entfernt und es wurde 1 ml Grace Insekten-Medium hinzugefügt, welches mit 10% fötalem Kälberserum supplementiert war. Die Platte wurde in einen Inkubator zurückgestellt und die Züchtung bei 27° C für vier Tage fortgesetzt.
  • Nach vier Tagen wurde der Überstand gesammelt und ein Plaquetest durchgeführt, ähnlich wie von Summers und Smith (vorstehend) beschrieben. Als eine Modifikation wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburgh) eingesetzt, welches eine leichte Isolierung der blaugefärbten Plaques erlaubt. (Eine ausführliche Beschreibung eines „Plaquetests" kann auch auf Seite 9–10 in dem Benutzer-Handbuch für Insektenzell-Kultur und Baculovirologie gefunden werden, welches von Life Technologies Inc., Gaithersburgh verteilt wird.
  • Vier Tage nach der seriellen Verdünnung wurde das Virus zu den Zellen hinzugefügt, blau gefärbte Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette gepickt. Der die rekombinanten Viren enthaltende Agar wurde dann in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch eine kurze Zentrifugation entfernt und der Überstand, welcher die rekombinanten Viren enthielt, wurde dazu verwendet, Sf9-Zellen zu infizieren, die in 35 mm Platten ausgesät worden waren. Vier Tage später wurden die Überstände von diesen Kulturplatten geerntet und dann bei 4°C gelagert.
  • Man ließ Sf9-Zellen in Grace-Medium wachsen, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS supplementiert war. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-gp67-VEGF2 mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 infiziert. Sechs Stunden später wurde das Medium entfernt und mit SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein (Life Technologies Inc., Gaithersburgh) ersetzt. 42 Stunden später wurden 5 μCi 35S-Methionin und 5 μCi 35S-Cystein (Amersham) hinzugefügt. Die Zellen wurden weiter für 16 Stunden inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet und die markierten Proteine durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht wurden.
  • Protein vom Medium und vom Cytoplasma der Sf9-Zellen wurde mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen untersucht. Siehe 4. Das Medium wurde gegen 50 mM MES, pH 5,8, dialysiert. Man erhielt nach der Dialyse Präzipitate und resuspendierte diese in 100 mM Na-Citrat, pH 5,0. Das resuspendierte Präzipitat wurde wieder mittels SDS-PAGE untersucht und wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Siehe 5.
  • Der Mediumüberstand wurde auch 1:10 in 50 mM MES, pH 5,8, verdünnt und auf eine SP-650M-Säule (1,0 × 6,6 cm, Toyopearl) bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Protein wurde mit Stufengradienten bei 200, 300 und 500 mM NaCl eluiert. Der VEGF2 wurde mit der Elution bei 500 mM NaCl erhalten. Das Eluat wurde durch SDS-PAGE in Anwesenheit oder Abwesenheit des Reduktionsmittels β-Mercaptoethanol analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Siehe 6.
  • Beispiel 3
  • Expression von rekombinantem VEGF2 in COS-Zellen.
  • Das Expressionsplasmid VEGF2-HA ist von dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen) abgeleitet, enthaltend: 1) den SV40-Replikationsursprung, 2) ein Ampicillin-Resistenz-Gen, 3) einen E. coli-Replikationsursprung, 4) den CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinker-Region, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, welches den gesamten VEGF2-Vorläufer und einen HA-Marker codiert, welcher im Leseraster an dessen 3'-Ende fusioniert ist, wurde in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, daher wird die Expression des rekombinanten Proteins von dem CMV-Promotor gesteuert. Der HA-Marker entspricht einem Epitop, das von dem Hämagglutinin-Protein von Influenzavirus, wie früher beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, Cell 37: 767 (1984)) abgeleitet ist. Die Fusion des HA-Markers an das Zielprotein ermöglicht einen einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, welcher das HA-Epitop erkennt.
  • Die Konstruktionsstrategie des Plasmids ist wie folgt beschrieben:
    Die DNA-Sequenz, welche VEGF2, ATCC # 97161 codiert, wurde mittels PCR konstruiert, wobei zwei Primer eingesetzt wurden: der 5'-Primer (CGC GGA TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA) (SEQ ID NO: 6) enthält eine BamHI-Stelle, gefolgt von 18 Nucleotiden der codierenden Sequenz von VEGF2, beginnend von dem Startcodon; die 3'-Sequenz (CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT TTG TGG TCT 3') (SEQ ID NO: 7) enthält komplementäre Sequenzen zu einer XbaI-Stelle, dem HA-Marker, einer XhoI-Stelle und den letzten 15 Nucleotiden der codierenden Sequenz von VEGF2 (ohne das Stopcodon). Daher enthält das PCR-Produkt eine BamHI-Stelle, die codierende Sequenz, gefolgt von einer XhoI-Restriktionsendonucleasestelle und dem im Leseraster fusionierten HA-Marker ein Translationsterminations-Stoppcodon nahe dem HA-Marker und eine XbaI-Stelle. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, KA 92037) transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medienplatten ausplattiert und resistente Kolonien wurden durch Selektion gewonnen. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und mittels Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des korrekten Fragments untersucht. Für die Expression des rekombinanten VEGF2 wurden COS-Zellen mit der DEAE-Dextran-Methode (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) mit dem Expressionsvektor transfiziert. Die Expression des VEGF2-HA-Proteins wurde mittels radioaktiver Markierung und der Immunpräzipitationsmethode nachgewiesen (E. Harlow, D. Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Die Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit 35S-Cystein markiert. Das Kulturmedium wurde dann gesammelt und die Zellen mit Detergenz lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) (Wilson, I. et al., id. 37: 767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium wurden mit einem HA-spezifischen monoclonalen Antikörper präzipitiert. Präzipitierte Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen analysiert.
  • Beispiel 4
  • Die Wirkung von partiell aufgereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen.
  • Am Tag 1 wurden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) in einer Dichte von 2–5 × 104 Zellen/35 mm-Platte in M199-Medium ausgesät, das 4% fötales Rinderserum (FBS), 16 Einheiten/ml Heparin und 50 Einheiten/ml Wachstumszusätze für Endothelzellen (ECGS, Biotechnique, Inc.) enthielt. Am Tag 2 wurde das Medium durch M199 ersetzt, das 10% FBS, 8 Einheiten/ml Heparin enthielt. Das VEGF2-Protein von SEQ ID NO: 2 ohne die anfänglichen 45 Aminosäurereste (VEGF) und basisches FGF (bFGF) wurden in den gezeigten Konzentrationen hinzugefügt. An den Tagen 4 & 6 wurde das Medium ausgetauscht. Am Tag 8 wurde die Zellzahl mit einem Coulter Counter bestimmt (siehe 8).
  • Beispiel 5
  • Die Wirkung von aufgereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen.
  • Am Tag 1 wurden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) in einer Dichte von 2–5 × 104 Zellen/35 mm-Platte in M199-Medium ausgesät, das 4% fötales Rinderserum (FBS), 16 Einheiten/ml Heparin und 50 Einheiten/ml Wachstumszusätze für Endothelzellen (ECGS, Biotechnique, Inc.) enthielt. Am Tag 2 wurde das Medium durch M199 ersetzt, das 10% FBS, 8 Einheiten/ml Heparin enthielt. Aufgereinigtes VEGF2-Protein von SEQ ID NO: 2 ohne die anfänglichen 45 Aminosäurereste wurde an diesem Punkt zu dem Medium hinzugefügt. An den Tagen 4 & 6 wurde das Medium durch frisches Medium und Zusätze ersetzt. Am Tag 8 wurde die Zellzahl mit einem Coulter Counter bestimmt (siehe 9).
  • Beispiel 6
  • Expression via Gentherapie
  • Fibroblasten werden von einem Individuum durch Hautbiopsie gewonnen. Das so erhaltene Gewebe wird in Gewebekultur-Medium gelegt und in kleine Stücke aufgeteilt. Kleine Gewebebrocken werden auf eine feuchte Oberfläche einer Gewebekulturplatte gelegt, ungefähr zehn Stückchen werden in jede Flasche gesetzt. Die Flasche wird auf den Kopf gestellt, dicht verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Flasche umgedreht und die Gewebebrocken bleiben an dem Boden der Flasche haften, und frisches Medium (z.B. Ham-F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin) wird hinzugefügt. Dies wird dann bei 37°C für ungefähr eine Woche inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium hinzugegeben und danach alle paar Tage gewechselt. Nach weiteren zwei Wochen in Kultur entsteht eine Einzelzellschicht von Fibroblasten. Die Einzelzellschicht wird mit Trypsin behandelt und in größere Flaschen für die Züchtung in größerem Maßstab verteilt.
  • pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA 7: 219–25 (1988)), welches von den langen terminalen Wiederholungen des Moloney-Maus-Sarkomvirus flankiert ist, wird mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit Kälberdarmphosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel der Größe nach aufgetrennt und unter Verwendung von Glaskügelchen aufgereinigt.
  • Die cDNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird mit Hilfe von PCR-Primern amplifiziert, die den Sequenzen am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Stelle und der 3'-Primer enthält ferner eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen des linearen Gerüsts des Moloney-Maus-Sarkomvirus und des amplifizierten EcoRI- und HindIII-Fragments werden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase zusammengegeben. Das so erhaltene Gemisch wird unter Bedingungen gehalten, die für die Ligierung der zwei Fragmente zweckdienlich sind. Das Ligierungsgemisch wird dazu benutzt, HB101-Bakterien zu transformieren, welche dann auf einen Kanamycin enthaltenden Agar ausplattiert werden, um zu bestätigen, dass der Vektor das Gen von Interesse korrekt eingesetzt aufwies.
  • Die amphotropen Verpackungszellen PA317 oder Gp+Am12 lässt man in Gewebekultur in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin bis zur Konfluenz wachsen. Der das Gen enthaltende MSV-Vektor wird dann zu dem Medium hinzugefügt und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen produzieren nun infektiöse Viruspartikel, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden nun als Produktionszellen bezeichnet).
  • Frisches Medium wird zu den transduzierten Produktionszellen hinzugefügt und das Medium wird anschließend von einer 10 cm-Platte von konfluenten Produktionszellen geerntet. Das verbrauchte Medium, welches die infektiösen Viruspartikel enthält, wird durch einen Millipore-Filter gefiltert, um abgelöste Produktionszellen zu entfernen, und diese Medium wird dann dazu verwendet, die Fibroblastenzellen zu infizieren. Das Medium wird von einer subkonfluenten Platte von Fibroblasten entfernt und schnell mit dem Medium von den Produktionszellen ausgetauscht. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Wenn der Virustiter hoch ist, dann werden so gut wie alle Fibroblasten infiziert sein und es ist keine Selektion notwendig. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie z.B. neo oder his aufweist.
  • Die gentechnisch veränderten Fibroblasten werden dann in den Wirt injiziert, entweder allein oder nachdem man sie auf Cytodex 3-Mikroträger-Kügelchen bis zur Konfluenz hat wachsen lassen. Die Fibroblasten produzieren jetzt das Proteinprodukt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (21)

  1. Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz kodierend ein Polypeptid, welches Aminosäuren +1 bis +373 von SEQ ID Nr. 2 umfasst; (b) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz kodierend ein Polypeptid, welches Aminosäuren –23 bis +373 von SEQ ID Nr. 2 umfasst; (c) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz kodierend ein Polypeptid, welches Aminosäuren –46 bis +373 von SEQ ID Nr. 2 umfasst; (d) einem Polynucleotid umfassend die kodierende Sequenz von SEQ ID Nr. 1; (e) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz, welche mindestens 90% identisch ist zu einer der Nucleotidsequenzen nach (b) bis (d), wobei das Polynucleotid ein Polypeptid mit der Aktivität des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 2 (VEGF2) kodiert; (f) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz, welche mindestens 95% identisch ist zu einer der Nucleotidsequenzen nach (a) bis (d), wobei das Polynucleotid ein Polypeptid mit der Aktivität des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 2 (VEGF2) kodiert; (g) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz kodierend für ein Polypeptid, welches mindestens 90% identisch ist zu einem Polypeptid, welches von einer der Nucleotidsequenzen nach (b) bis (d) kodiert wird, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid mit der Aktivität des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 2 (VEGF2) kodiert; (h) einem Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz kodierend für ein Polypeptid, welches mindestens 95% identisch ist zu einem Polypeptid, welches von einer der Nucleotidsequenzen nach (a) bis (d) kodiert wird, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid mit der Aktivität des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 2 (VEGF2) kodiert; und (i) dem Komplementärstrang eines der Polynucleotide nach (a) bis (h).
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, welches DNA ist.
  3. Polynucleotid nach Anspruch 2, welches genomische DNA ist.
  4. Polynucleotid nach Anspruch 2 oder 3, welches humane DNA ist.
  5. Polynucleotid nach Anspruch 1, welches RNA ist.
  6. Polynucleotid nach Anspruch 1, welches humane RNA ist.
  7. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 2 bis 6, welches für die Verwendung in der Zubereitung eines Polypeptids ist, das angiogene Aktivität aufweist und/oder Endothelisation fördert.
  8. Vektor, welcher das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält.
  9. Vektor nach Anspruch 8, wobei das Polynucleotid operativ verbunden ist mit Expressionskontrollsequenzen, welche die Expression in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen ermöglichen.
  10. Genetisch veränderte Wirtszelle umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches operativ verbunden ist mit Expressionskontrollsequenzen, welche die Expression in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen ermöglichen, oder den Vektor nach Anspruch 8 oder 9.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit VEGF2 Aktivität umfassend: in Kulturbringen der Wirtszelle nach Anspruch 10 und die Gewinnung des Polypeptids, welches durch das Polynucleotid kodiert wird.
  12. Verfahren zur Herstellung von Zellen, welche in der Lage sind, ein aktives Polypeptid zu exprimieren, umfassend die genetische Veränderung von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 8 oder 9.
  13. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, welche durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, oder welches erhältlich ist durch das Verfahren nach Anspruch 11.
  14. Antikörper, der spezifisch ist für ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von Position –46 bis Position –1 von SEQ ID Nr. 2 umfasst, oder für ein immunogenes Fragment davon.
  15. Antagonist/Inhibitor gegen das Polypeptid nach Anspruch 13, wobei der Antagonist/Inhibitor ein Antikörper ist, welcher das Polypeptid spezifisch erkennt.
  16. Arzneimittel umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das Polypeptid nach Anspruch 13 oder eine DNA, welche das Polypeptid kodiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, oder den Antagonisten/Inhibitor nach Anspruch 15 und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  17. Diagnosemittel umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder den Antikörper nach Anspruch 14.
  18. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 13 oder des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung der Angiogenese, Wundheilung, oder zur Förderung der Reparatur von vasculärem Gewebe.
  19. Verwendung des Antagonisten nach Anspruch 15 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Tumorwachstum oder zur Behandlung von diabetischer Retinopathie, Entzündung, rheumatischer Arthritis oder Psoriasis.
  20. Verfahren für die Diagnose einer Erkrankung oder einer Anfälligkeit für eine Erkrankung, welche in Bezug steht mit der Expression des Polypeptids nach Anspruch 13 umfassend: Bestimmung einer Mutation in der Nucleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert.
  21. Diagnoseverfahren umfassend: Analyse der Anwesenheit des Polypeptids nach Anspruch 13 in einer Probe, die von einem Wirt stammt.
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