-
Diese
Erfindung ist eine Teilfortführungs-Anmeldung
einer früheren
Anmeldung, die beim Patent- und Markenamt der Vereinigten Staaten
von Rosen, C. et al. am 8. März
1994 eingereicht worden ist und welcher die Seriennummer 08/207,550
zugewiesen worden ist.
-
Diese
Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide,
welche von solchen Polynucleotiden codiert werden, die Verwendung
solcher Polynucleotide und Polypeptide ebenso wie die Herstellung von
solchen Polynucleotiden und Polypeptiden. Das Polypeptid der vorliegenden
Erfindung ist als ein Mitglied der Familie der vaskulären endothelialen
Wachstumsfaktoren identifiziert worden. Genauer gesagt handelt es sich
bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid
um den vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor 2, der hierin manchmal als „VEGF2" bezeichnet wird.
Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung eines solchen Polypeptids.
-
Die
Bildung neuer Blutgefäße oder
die Angiogenese ist unentbehrlich für die embryonale Entwicklung, das
nachfolgende Wachstum und die Gewebereparatur. Angiogenese ist jedoch
ein wesentlicher Teil bestimmter pathologischer Zustände wie
Neoplasie, z.B. Tumore und Gliome, und eine anomale Angiogenese
geht mit anderen Krankheiten einher, wie z.B. Entzündung, rheumatoider
Arthritis, Psoriasis und diabetischer Retinopathie (Folkman, J.
und Klagsbrun, M., Science 235: 442–447 (1987)).
-
Sowohl
saure als auch basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Moleküle stellen
Mitogene für
Endothelzellen und andere Zelltypen dar. Angiotropin und Angiogenin
können
Angiogenese induzieren, obschon deren Funktionen unklar sind (Folkman,
J., 1993, Cancer Medicine, S. 153–170, Lea and Febiger Press).
Ein hoch selektives Mitogen für
vaskuläre
Endothelzellen ist der vaskuläre
endotheliale Wachstumsfaktor oder VEGF (Ferrara, N. et al., Endocr.
Rev. 13: 19–32
(1992)), der auch unter dem Namen vaskulärer Permeabilitätsfaktor
(VPF) bekannt ist. Der vaskuläre
endotheliale Wachstumsfaktor ist ein sezerniertes angiogenes Mitogen,
dessen Zielzellenspezifität
auf vaskuläre
Endothelzellen beschränkt
zu sein scheint.
-
Das
murine VEGF-Gen ist charakterisiert worden und man hat dessen Expressionsmuster
in der Embryogenese untersucht. Es wurde eine anhaltende Expression
von VEGF in Epithelzellen beobachtet, welche an das gefensterte
Endothel angrenzen, z.B. im Choroidplexus und den Glomeruli der
Niere. Die Daten waren mit einer Rolle von VEGF als multifunktionellem
Regulator des Wachstums und der Differenzierung von Endothelzellen
vereinbar (Breier, G. et al., Development 114: 521–532 (1992)).
-
VEGF
ist strukturell mit den α-
und β-Ketten
des Thrombocyten-Wachstumsfaktors (PDGF), einem Mitogen für mesenchymale
Zellen, und dem Placenta-Wachstumsfaktor
(PLGF), einem Endothelzellen-Mitogen verwandt. Diese drei Proteine
gehören
zu derselben Familie und weisen ein gemeinsames konserviertes Motiv auf.
Acht Cystein-Reste, die zur Bildung von Disulfidbrücken beitragen,
sind in diesen Proteinen streng konserviert. Man hat alternativ
gespleißte
mRNAs für
sowohl VEGF, PLGF als auch PDGF identifiziert, und diese verschiedenen
Spleiß-Produkte
unterscheiden sich in ihrer biologischen Aktivität und in der Spezifität der Rezeptorbindung.
VEGF und PDGF üben
ihre Funktion als Homodimere oder Heterodimere aus und binden an Rezeptoren,
die nach der Rezeptordimerisierung eine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität auslösen.
-
VEGF
kommt auf Grund von alternativen Spleißvorgängen in vier verschiedenen
Formen von 121, 165, 189 und 206 Aminosäuren vor. VEGF121 und VEGF165
sind löslich
und sind in der Lage, Angiogenese zu fördern, wohingegen VEGF189 und
VEGF206 an Heparin enthaltende Proteoglycane an der Zelloberfläche gebunden
vorliegen. Die zeitliche und räumliche
Expression von VEGF ist mir der physiologischen Proliferation der
Blutgefäße in Verbindung
gebracht worden (Gajdusek, C. M. und Carbon, S. J., Cell Physiol.
139: 570–579 (1989);
McNeil, P. L., Muthukrishnan, L., Warder, E., D'Amore, P. A., J. Cell. Biol. 109: 811–822 (1989)).
Dessen hoch affine Bindungsstellen sind in Gewebeschnitten nur auf
Endothelzellen lokalisiert (Jakeman, L. B. et al., Clin. Invest.
89: 244–253
(1989)). Der Faktor kann aus Zellen der Hirnanhangdrüse und verschiedenen
Tumorzelllinien isoliert werden und ist mit manchen menschlichen
Gliomen in Verbindung gebracht worden (Plate, K. H., Nature 359:
845–848
(1992)). Interessanterweise verleiht die Expression von VEGF121
und VEGF165 Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters die Fähigkeit,
Tumore in Nacktmäusen
zu bilden (Ferrara, N. et al., J. Clin. Invest. 91: 160–170 (1993)).
Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der VEGF-Funktion durch monoclonale
anti-VEGF-Antikörper
das Tumorwachstum in immun-defizienten Mäusen inhibiert (Kim, K. J.,
Nature 362: 841–844
(1993)). Des Weiteren ist es gezeigt worden, dass eine dominant-negative
Mutation des VEGF-Rezeptors das Wachstum von Glioblastomen in Mäusen hemmt.
-
Es
ist auch festgestellt worden, dass der vaskuläre Permeabilitätsfaktor
für die
anhaltende mikrovaskuläre
Hyperpermeabilität
von Plasmaproteinen sogar nach der Beendigung einer Verletzung verantwortlich ist,
was ein charakteristisches Merkmal der normalen Wundheilung darstellt.
Dies deutet darauf hin, dass es sich bei VPF um einen wichtigen
Faktor bei der Wundheilung handelt. Brown. L. F. et al., J. Exp.
Med. 176: 1375–9
(1992).
-
Die
Expression von VEGF ist in vaskularisierten Geweben (z.B. Lunge,
Herz, Placenta und festen Tumoren) hoch und korreliert sowohl zeitlich
wie auch räumlich
mit der Angiogenese. Es ist auch gezeigt worden, dass VEGF in vivo
Angiogenese induziert. Da Angiogenese für die Reparatur von normalen
Geweben, insbesondere vaskulären
Geweben, unentbehrlich ist, hat man vogeschlagen, VEGF zur Förderung
der Reparatur von vaskulärem
Gewebe (z.B. bei der Atherosklerose) einzusetzen.
-
Das
US-Patent Nr. 5,073,492, welches am 17. Dezember 1991 an Chen et
al. erteilt worden ist, offenbart ein Verfahren zur synergistischen
Verstärkung
des Wachstums von Endothelzellen in einer geeigneten Umgebung, welches
die Zugabe von VEGF, Effektoren und Serumfaktor zu der Umgebung
umfasst. Auch hat man DNA der C-Untereinheit des vaskulären Endothelzellen-Wachstumsfaktors
mit Hilfe von Polymerasekettenreaktionsmethoden hergestellt. Die
DNA codiert ein Protein, das entweder als Heterodimer oder als Homodimer
vorliegen kann. Bei dem Protein handelt es sich um ein Mitogen von
vaskulären
Säuger-Endothelzellen, welches
als solches nützlich
für die
Förderung
der vaskulären
Entwicklung und Reparatur ist, wie es in der Europäischen Patentanmeldung
Nr. 92302750.2 offenbart ist, die am 30. September 1992 veröffentlicht
worden ist.
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auf der Grundlage der
Aminosäuresequenz-Homologie
zu menschlichem VEGF als ein mutmaßlicher neuer vaskulärer Endothelzellen-Wachstumsfaktor
identifiziert worden.
-
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue reife Polypeptide
bereitgestellt, ebenso wie biologisch aktive und diagnostisch oder
therapeutisch nützliche
Fragmente, Analoga oder Derivate davon. Die Polypeptide der vorliegenden
Erfindung sind menschlichen Ursprungs.
-
Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt,
welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, einschließlich mRNAs,
DNAs, cDNAs, genomischer DNA ebenso wie biologisch aktive und diagnostisch
oder therapeutisch nützliche
Fragmente, Analoga oder Derivate davon.
-
Gemäß noch einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Herstellung
solcher Polypeptide durch rekombinante Methoden bereitgestellt,
umfassend die Züchtung
von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen,
welche eine Nucleinsäuresequenz
enthalten, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert,
unter Bedingungen, welche die Expression und die anschließende Gewinnung
dieser Proteine begünstigen.
-
Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt,
um ein solches Polypeptid oder ein Polynucleotid, das ein derartiges
Polypeptid codiert, für
therapeutische Zwecke zu nutzen, um zum Beispiel Angiogenese, Wundheilung
zu stimulieren und vaskuläre
Gewebereparatur zu fördern.
-
Gemäß noch einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper gegen
solche Polypeptide bereitgestellt.
-
Gemäß noch einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antagonisten gegen
solche Polypeptide bereitgestellt, die dazu verwendet werden können, die
Funktion solcher Polypeptide zu hemmen, zum Beispiel das Wachstum
von Tumoren zu hemmen, diabetische Retinopathie, Entzündung, rheumatoide Arthritis
und Psoriasis zu behandeln.
-
Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuresonden
bereitgestellt, umfassend Nucleinsäuremoleküle von ausreichender Länge, um
spezifisch an Nucleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren.
-
Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt,
um Krankheiten oder eine Anfälligkeit
gegenüber
Krankheiten zu diagnostizieren, welche in Bezug zu Mutationen in
den Nucleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung und in den Proteinen, die von solchen
Nucleinsäuresequenzen
codiert werden, stehen.
-
Gemäß noch einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Nutzung von solchen Polypeptiden oder von Polynucleotiden, welche
solche Polypeptide codieren, für
in vitro-Zwecke bereitgestellt, die mit der wissenschaftlichen Forschung,
der Synthese von DNA und der Herstellung von DNA-Vektoren zu tun haben.
-
Diese
und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten Fachleuten
aus den hierin enthaltenen Lehren ersichtlich sein.
-
Die
folgenden Zeichnungen dienen der Veranschaulichung von Ausführungsformen
der Erfindung und sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung
zu beschränken,
wie er durch die Ansprüche
umspannt ist.
-
1 zeigt die cDNA-Sequenz und die entsprechende
abgeleitete Aminosäuresequenz
des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Es werden die Standard-Einbuchstabenabkürzungen
für Aminosäuren verwendet.
Die Sequenzierung wurde mit Hilfe des automatisierten DNA-Sequenziergeräts 373 (Applied
Biosystems, Inc.) durchgeführt.
Es ist vorausberechnet, dass die Genauigkeit der Sequenzierung höher als
97% liegt.
-
2 ist
eine Darstellung der Aminosäuresequenz-Homologie
zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und anderen Mitgliedern
der menschlichen PDGF/VEGF-Familie. Die eingerahmten Bereiche zeigen
die konservierten Sequenzen und die Lage der acht konservierten
Cystein-Reste an.
-
3 zeigt
eine Photographie eines Gels nach in vitro-Transkription, -Translation
und Elektrophorese des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Spur
1: 14C und Regenbogen-MG-Marker; Spur 2:
FGF-Kontrolle; Spur 3: VEGF2, das durch M13-Rückwärts- und Vorwärts-Primer
erzeugt wurde; Spur 4: VEGF2, das durch M13-Rückwärts- und VEGF-F4-Primer erzeugt
wurde; Spur 5: VEGF2, das durch M13-Rückwärts- und VEGF-F5-Primer erzeugt
wurde.
-
4.
Das VEGF2-Polypeptid wird in einem Baculovirus-System exprimiert,
welches aus Sf9-Zellen besteht. Protein aus dem Medium und aus dem
Cytoplasma von Zellen wurde mittels SDS-PAGE unter reduzierenden
und nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht.
-
5.
Das Medium von Sf9-Zellen, die mit einer Nucleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung infiziert worden waren, wurde präzipitiert
und das resuspendierte Präzipitat
wurde mittels SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau
angefärbt.
-
6.
VEGF2 wurde aus dem Überstand
des Mediums aufgereinigt und mittels SDS-PAGE in Anwesenheit oder
in Abwesenheit des Reduktionsmittels β-Mercaptoethanol analysiert und mit Coomassie-Brilliantblau
angefärbt.
-
7.
Umkehrphasen-HPLC-Analyse von gereinigtem VEGF2 mit einer RP-300-Säule (0,21 × 3 cm, Applied
Biosystems, Inc.). Die Säule
war mit 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert
(Lösungsmittel
A) und die Proteine wurden mit einem 7,5 minütigen Gradienten von 0 bis
60% Lösungsmittel
B eluiert, welches aus Acetonitril bestand, das 0,07% TFA („Trifluoressigsäure") enthielt. Die Elution
des Proteins wurde über
die Extinktion bei 215 nm (rote Linie) und 280 nm (blaue Linie)
verfolgt. Der Prozentsatz des Lösungsmittels
B ist durch die grüne
Linie angezeigt.
-
8 stellt
die Wirkung von partiell gereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum
von vaskulären Endothelzellen
im Vergleich zu basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor dar.
-
9 stellt
die Wirkung von gereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen
dar.
-
Mit
dem Begriff „Gen" ist der Abschnitt
der DNA gemeint, der an der Erzeugung einer Polypeptidkette beteiligt
ist; es umschließt
Bereiche, die der codierenden Region vorangehen und dieser folgen
(Leader und Trailer) ebenso wie dazwischen liegende Sequenzen (Introns)
zwischen den einzelnen codierenden Abschnitten (Exons).
-
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle (Polynucleotide)
bereitgestellt, die die reifen Polypeptide, welche die abgeleitete
Aminosäuresequenz
von 1 aufweisen, oder das reife Polypeptid,
welches von der cDNA des Clons codiert wird, der unter der ATCC- Hinterlegungsnummer
97161 am 24. Mai 1995 hinterlegt wurde, oder Polypeptide codieren,
die weniger Aminosäurereste
aufweisen als diejenigen, die in 1 zu
sehen sind.
-
Ein
Polynucleotid, welches ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung
codiert, kann aus Osteoclastomen eines menschlichen Embryos im Frühstadium
(Woche 8–9),
aus dem Herz eines Erwachsenen oder aus verschiedenen Brustkrebs-Zelllinien
erhalten werden. Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer
cDNA-Bank gefunden, welche von einem menschlichen Embryo im Frühstadium
(9. Woche) stammte. Es ist strukturell mit der VEGF/PDGF-Familie
verwandt. VEGF2 enthält
einen offenen Leserahmen, der ein Protein von 419 Aminosäureresten
codiert, von denen ungefähr
die ersten 23 Aminosäurereste
die mutmaßliche
Leader-Sequenz darstellen, so dass das reife Protein 396 Aminosäuren umfasst,
wobei dieses Protein die höchste Aminosäuresequenz-Homologie
zu dem menschlichen vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor zeigt (30% Identität), gefolgt von PDGFα (23%) und
PDGFβ (22%).
-
Es
ist von besonderer Bedeutung, dass alle acht Cysteine in allen vier
Mitgliedern der Familie konserviert sind (siehe eingerahmte Bereiche
von 2). Darüber
hinaus ist das Kennzeichen für
die PDGF/VEGF-Familie, PXCVXXXRCXGCCN (SEQ ID NO: 3), in VEGF2 konserviert
(siehe 2).
-
Es
ist beabsichtigt, dass das VEGF2-Polypeptid der vorliegenden Erfindung
das Volllängen-Polypeptid und
die Polynucleotidsequenz einschließt, welche beliebige Leader-Sequenzen
und aktive Fragmente des Volllängen-Polypeptids
codiert. Aktive Fragmente sollen beliebige Teile der Volllängen-Aminosäuresequenz einschließen, die
weniger als die gesamten 419 Aminosäuren der Volllängen-Aminosäuresequenz
aufweisen, wie sie in der SEQ ID NO: 2 und in der 2 gezeigt
ist, aber immer noch die acht Cysteinreste beinhalten, von denen
in 2 gezeigt ist, dass sie konserviert sind, und
solche Fragmente enthalten immer noch VEGF2-Aktivität.
-
Es
gibt mmindestens zwei alternativ gespleißte VEGF2-mRNA-Sequenzen, die
in normalen Geweben vorhanden sind. Die Größe der zwei VEGF2-mRNA-Sequenzen, die der
Volllängen-
bzw. der verkürzten
Version entsprechen, sind in 3 gezeigt; 3,
Spur 5 zeigt zwei Banden, was auf das Vorhandensein der alternativ
gespleißten
mRNA hinweist, die das VEGF2-Polypeptid der vorliegenden Erfindung
codiert.
-
Das
Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder
in Form von DNA vorliegen, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und
synthetische DNA einschließt.
Die DNA kann doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein, und falls sie einzelsträngig
ist, kann sie der codierende Strang oder der nicht codierende (Antisense-)
Strang sein. Die codierende Sequenz, welche das reife Polypeptid
codiert, kann mit der in 1 gezeigten
codierenden Sequenz oder mit jener des hinterlegten Clons identisch
sein oder es kann sich um eine unterschiedliche codierende Sequenz
handeln, wobei diese codierende Sequenz infolge einer Redundanz oder
einer Degeneriertheit des genetischen Codes dasselbe reife Polypeptid
codiert wie die DNA aus 1 oder die
hinterlegte cDNA.
-
Das
Polynucleotid, welches das reife Polypeptid aus 1 codiert
oder das reife Polypeptid, welches von der hinterlegten cDNA codiert
wird, kann umfassen: nur die codierende Sequenz für das reife
Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und
wahlweise zusätzliche
codierende Sequenz) und eine nicht codierende Sequenz wie z.B. Introns
oder nicht codierende Sequenz, welche 5' und/oder 3' von der codierenden Sequenz für das reife
Polypeptid gelegen ist.
-
Somit
umspannt der Begriff „Polynucleotid,
das ein Polypeptid codiert" ein
Polynucleotid, welches nur die codierende Sequenz für das Polypeptid
umfasst, ebenso wie ein Polynucleotid, welches eine zusätzliche codierende
und/oder nicht codierende Sequenz umfasst.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Varianten der hierin
vorstehend beschriebenen Polynucleotide, welche Fragmente, Analoga
und Derivate des Polypeptids codieren, welches die abgeleitete Aminosäuresequenz
von 1 aufweist, oder des von der cDNA
des hinterlegten Clons codierten Polypeptids codieren. Bei der Variante
des Polynucleotids kann es sich um eine natürlich vorkommende allelische
Variante des Polynucleotids oder um eine nicht natürlich vorkommende
Variante des Polynucleotids handeln.
-
Demnach
schließt
die vorliegende Erfindung Polynucleotide ein, welche dasselbe reife
Polypeptid, wie in 1 gezeigt, codieren
oder dasselbe reife Polypeptid, welches von der cDNA des hinterlegten
Clons codiert wird, ebenso wie Varianten solcher Polynucleotide,
wobei die Varianten ein Fragment, ein Derivat oder ein Analogon
des Polypeptids von 1 oder des von
der cDNA des hinterlegten Clons codierten Polypeptids codieren.
Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten
und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
-
Wie
hierin vorstehend angegeben, kann das Polynucleotid eine codierende
Sequenz aufweisen, welche eine natürlich vorkommende allelische
Variante der in 1 gezeigten codierenden
Sequenz oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons darstellt.
Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, stellt eine allelische Variante
eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz dar, die eine Substitution,
eine Deletion oder eine Addition von einem oder mehreren Nucleotiden
enthalten kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht
wesentlich verändern.
-
Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch die codierende Sequenz
im selben Leseraster an eine Markersequenz fusioniert aufweisen,
welche die Aufreinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung
ermöglicht.
Bei der Markersequenz kann es sich um einen Hexahistidin-Marker
handeln, welcher von einem pQE-9-Vektor beigesteuert wird, um eine
Aufreinigung des reifen, an den Marker fusionierten Polypeptids
im Fall eines bakteriellen Wirts zu ermöglichen, oder die Markersequenz
kann beispielsweise ein Hämagglutinin
(HA)-Marker sein, wenn ein Säuger-Wirt,
z.B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Der HA-Marker entspricht einem
Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein
abgeleitet ist (Wilson, I. et al., Cell 37: 767 (1984)).
-
Mit
dem Begriff „Gen" ist der Abschnitt
der DNA gemeint, der an der Erzeugung einer Polypeptidkette beteiligt
ist; es umschließt
Bereiche, die der codierenden Region vorangehen und dieser folgen
(Leader und Trailer) ebenso wie dazwischen liegende Sequenzen (Introns)
zwischen den einzelnen codierenden Abschnitten (Exons).
-
Fragmente
des Volllängen-Gens
der vorliegenden Erfindung können
als Hybridisierungssonde für
eine cDNA-Bank eingesetzt werden, um die Volllängen-cDNA zu isolieren und um andere cDNAs
zu isolieren, welche eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem Gen aufweisen
oder die eine ähnliche
biologische Aktivität
haben. Sonden dieser Art weisen bevorzugt mindestens 30 Basen auf
und können
zum Beispiel 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann auch dazu
verwendet werden, um einen cDNA-Clon zu identifizieren, welcher
dem Volllängen-Transkript
entspricht, sowie einen genomischen Clon oder Clone, welche das
vollständige
Gen einschließlich
der regulatorischen und der Promotor-Bereiche, Exons und Introns
enthalten. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst die Isolierung
der codierenden Region des Gens, indem man die bekannte DNA-Sequenz
dazu verwendet, um eine Oligonucleotid-Sonde zu synthetisieren.
Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu derjenigen
des Gens der vorliegenden Erfindung ist, werden dazu verwendet,
eine menschliche cDNA-Bank, eine genomische DNA-Bank oder eine mRNA-Bank
zu durchmustern, um zu bestimmen, an welche Mitglieder der Bank
die Sonde hybridisiert.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Polynucleotide, welche an
die hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, sofern
eine mindestens 70%-ige,
bevorzugt eine mindestens 90%-ige und stärker bevorzugt eine mindestens
95%-ige Identität
zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft
insbesondere Polynucleotide, welche unter stringenten Bedingungen
an die hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide hybridisieren.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „stringente Bedingungen", dass eine Hybridisierung
nur auftritt, wenn eine mindestens 95%-ige und bevorzugt mindestens
97%-ige Identität
zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, welche an die
hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide hybridisieren, codieren
in einer bevorzugten Ausführungsform
Polypeptide, welche entweder im Wesentlichen dieselbe biologische
Funktion oder Aktivität
aufweisen wie das reife Polypeptid, welches von den cDNAs der 1 (SEQ ID NO: 1) oder der (den) hinterlegten
cDNA(s) codiert wird.
-
Alternativ
kann das Polynucleotid mindestens 20 Basen aufweisen, bevorzugt
30 Basen und stärker bevorzugt
mindestens 50 Basen, welche an ein Polynucleotid der vorliegenden
Erfindung hybridisieren, wobei das Polynucleotid, wie hierin vorstehend
beschrieben, eine Identität
dazu aufweist und Aktivität
beibehält
oder nicht beibehält.
Zum Beispiel können
solche Polynucleotide als Sonden für das Polynucleotid von SEQ
ID NO: 1 verwendet werden, zum Beispiel zur Gewinnung des Polynucleotids
oder als eine diagnostische Sonde oder als ein PCR-Primer.
-
Somit
ist die vorliegende Erfindung auf Polynucleotide, welche eine mindestens
70%-ige Identität,
bevorzugt eine mindestens 90%-ige Identität und stärker bevorzugt eine mindestens
95%-ige Identität
zu einem Polynucleotid aufweisen, welches das Polypeptid von SEQ
ID NO: 2 codiert, ebenso wie Fragmente davon, wobei die Fragmente
mindestens 30 Basen und bevorzugt mindestens 50 Basen aufweisen,
sowie auf Polypeptide gerichtet, welche von solchen Polynucleotiden
codiert werden.
-
Die
Hinterlegung(en), auf welche hierin Bezug genommen wird, werden
nach den Vorschriften des Budapester Vertrags zur Internationalen
Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren
aufrechterhalten. Diese Hinterlegungen werden lediglich als Annehmlichkeit
für die
Fachleute bereitgestellt und stellen kein Zugeständnis dar, dass eine Hinterlegung
gemäß 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist.
Die Sequenz der Polynucleotide, welche in den hinterlegten Materialien
enthalten sind, ebenso wie Aminosäuresequenz der davon codierten
Polypeptide sind hierin unter Bezugnahme aufgenommen und sind maßgebend
im Fall von irgendeinem Konflikt mit irgendeiner Beschreibung von
Sequenzen hierin. Es kann eine Lizenz erforderlich sein, um die
hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen,
und es wird hiermit keine solche Lizenz erteilt.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, welche die hergeleitete
Aminosäuresequenz
von 1 aufweisen oder welche die Aminosäuresequenz
aufweisen, die von der hinterlegten cDNA codiert wird, ebenso wie
Fragmente, Analoga und Derivate eines solchen Polypeptids.
-
Die
Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bedeuten, sofern
sie sich auf das Polypeptid von 1 oder
auf dasjenige, welches von der hinterlegten cDNA codiert wird, beziehen,
ein Polypeptid, welches noch das konservierte Motiv von VEGF-Proteinen,
wie es in 2 gezeigt ist, sowie im Wesentlichen
die gleiche biologische Funktion oder Aktivität aufweist.
-
Bei
den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um rekombinante
Polypeptide, um natürliche
Polypeptide oder um synthetische Polypeptide handeln, bevorzugt
um rekombinante Polypeptide handeln.
-
Bei
dem Fragment, dem Derivat oder dem Analogon des Polypeptids von 1 oder jenem, welches von der hinterlegten
cDNA codiert ist, kann es sich (i) um eines handeln, in dem einer
oder mehrere der Aminosäurereste
mit einem konservierten oder einem nicht konservierten Aminosäurerest
(bevorzugt mit einem konservierten Aminosäurerest) substituiert sind,
wobei es sich bei diesem substituierten Aminosäurerest um einen handeln kann,
der durch den genetischen Code codiert ist oder nicht, oder (ii)
um eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine substituierte
Gruppe enthalten, oder (iii) um eines, in welchem das reife Polypeptid
mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie z.B. mit einer
Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum
Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) um eines, in dem die zusätzlichen
Aminosäuren
an das reife Polypeptid fusioniert sind, oder (v) um eines, das
weniger Aminosäurereste
umfasst, als in SEQ ID NO: 2 gezeigt sind, und noch das konservierte
Motiv aufweist und dennoch immer noch die Aktivität besitzt,
welche für
die VEGF-Familie von Polypeptiden charakteristisch ist. Solche Fragmente,
Derivate und Analoga sind aus den hierin enthaltenen Lehren als
innerhalb des Umfangs von Fachleuten anzusehen.
-
Die
Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden
bevorzugt in isolierter Form bereitgestellt und sind bevorzugt bis
zur Homogenität
aufgereinigt.
-
Der
Begriff „isoliert" bedeutet, dass das
Material aus seiner ursprünglichen
Umgebung (z.B. der natürlichen
Umgebung, falls es in der Natur vorkommt) entfernt wird. Zum Beispiel
ist ein natürlich
vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, welches in einem lebenden
Tier vorliegt, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder
Polypeptid, das von manchen oder von allen in dem natürlichen
System miteinander vorkommenden Materialien getrennt ist, ist isoliert.
Solche Polynucleotide könnten
Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide
könnten
Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert in dem Sinn, dass
ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil von
dessen/deren natürlicher
Umgebung ist.
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen das Polypeptid von
SEQ ID NO: 2 (insbesondere das reife Polypeptid) ebenso wie Polypeptide,
welche mindestens 70% Ähnlichkeit
(bevorzugt mindestens 70% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ
ID NO: 2 aufweisen und stärker
bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit
(stärker
bevorzugt mindestens 95% Identität)
mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweisen und noch stärker bevorzugt
mindestens 95% Ähnlichkeit
(noch stärker
bevorzugt mindestens 90% Identität)
mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweisen, und umfassen auch
Teile solcher Polypeptide, wobei ein solcher Teil des Polypeptids
im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren enthält und stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren.
-
Wie
es auf dem Fachgebiet bekannt ist, bestimmt man „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden dadurch,
indem man die Aminosäuresequenz
und die konservierten Aminosäureaustäusche eines
Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids vergleicht.
-
Fragmente
oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können dazu
eingesetzt werden, um das entsprechende Volllängen-Polypeptid mittels Peptidsynthese
herzustellen; daher können
die Fragmente als Intermediate für
die Herstellung der Volllängen-Polypeptide
eingesetzt werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden
Erfindung können
dazu eingesetzt werden, um Volllängen-Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung beinhalten, Wirtszellen, die auf gentechnische
Weise mit Vektoren der Erfindung konstruiert werden, sowie die Herstellung
von Polypeptiden der Erfindung mit Hilfe von rekombinanten Techniken.
-
Wirtszellen
werden auf gentechnische Weise (transduziert oder transformiert
oder transfiziert) mit den Vektoren dieser Erfindung konstruiert,
bei denen es sich zum Beispiel um einen Clonierungsvektor oder um einen
Expressionsvektor handeln kann. Der Vektor kann zum Beispiel in
Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen etc.
vorliegen. Die gentechnisch veränderten
Wirtszellen können
in herkömmlichen Nährmedien
gezüchtet
werden, die je nach Bedarf modifiziert werden können um Promotoren zu aktivieren, Transformanten
durch Selektion zu gewinnen oder um die VEGF2-Gene der vorliegenden
Erfindung zu amplifizieren. Die Kulturbedingungen wie z.B. Temperatur,
pH-Wert und dergleichen sind diejenigen, die zuvor bei der Wirtszelle
verwendet worden sind, die für
die Expression ausgewählt
wurde, und sind durchschnittlich ausgebildeten Fachleuten ersichtlich.
-
Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können dazu eingesetzt werden,
um Polypeptide durch rekombinante Techniken herzustellen. Demnach
kann das Polynucleotid zum Beispiel in einem beliebigen aus einer
Vielzahl von Expressionsvektoren enthalten sein, um ein Polypeptid
zu exprimieren. Zu solchen Vektoren gehören chromosomale, nicht-chromosomale
und synthetische DNA-Sequenzen,
z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus;
Hefeplasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und
Phagen-DNA abgeleitet
sind, virale DNA wie z.B. Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies-Virus.
Es kann jedoch ein beliebiger anderer Vektor verwendet werden, solange
er in dem Wirt replizieren kann und lebensfähig ist.
-
Die
zweckdienliche DNA-Sequenz kann mit einer Vielzahl von Methoden
in den Vektor eingesetzt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz
mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden in (eine) geeignete
Restriktionsendonucleasestelle(n) eingesetzt. Solche und andere
Methoden sind als innerhalb des Rahmens von Fachleuten anzusehen.
-
Die
DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktionell mit (einer)
zweckdienlichen Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um
die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher
Promotoren kann man erwähnen:
LTR oder SV40-Promotor, der E. coli lac- oder trp-Promotor, der PL-Promotor des Phagen Lambda sowie andere
Promotoren, von denen man weiß,
dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen
Zellen oder deren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch
eine Ribosomen-Bindungsstelle für
die Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator.
Der Vektor kann auch zweckdienliche Sequenzen zur Amplifikation
der Expression umfassen.
-
Darüber hinaus
enthalten Expressionsvektoren bevorzugt eines oder mehrere selektierbare
Markergene, um ein phänotypisches
Merkmal zur Selektion der transformierten Wirtszellen zur Verfügung zu
stellen, wie z.B. Dihydrofolatreduktase oder Neomycin-Resistenz
für eukaryontische
Zellkultur oder wie z.B. Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz
in E. coli.
-
Der
Vektor, welcher die zweckdienliche DNA-Sequenz, wie hierin vorstehend
beschrieben, ebenso wie einen zweckdienlichen Promotor oder eine
zweckdienliche Kontrollsequenz enthält, kann dazu verwendet werden,
um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um es zu ermöglichen,
dass der Wirt das Protein exprimiert.
-
Als
repräsentative
Beispiele von zweckdienlichen Wirten lassen sich erwähnen: Bakterienzellen
wie z.B. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, Pilzzellen
wie z.B. Hefe; Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera
Sf9; Tierzellen wie z.B. CHO, COS oder Bowes-Melanomzellen; Adenoviren;
Pflanzenzellen etc. Die Auswahl eines zweckdienlichen Wirts ist
aus den hierin enthaltenen Lehren als innerhalb des Rahmens von
Fachleuten anzusehen.
-
Insbesondere
umfasst die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte,
die eine oder mehrere der Sequenzen umfassen, die vorstehend allgemein beschrieben
sind. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie z.B. einen Plasmidvektor
oder einen viralen Vektor, in welchen eine erfindungsgemäße Sequenz in
einer Vorwärts-
oder einer Rückwärts-Orientierung
eingesetzt worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform
umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, wozu beispielsweise
ein Promotor gehört,
der funktionell mit der Sequenz verknüpft ist. Den Fachleuten sind
eine Vielzahl geeigneter Vektoren und Promotoren bekannt, und diese
sind im Handel erhältlich.
Die folgenden Vektoren werden als Beispiel angeführt. Bakterielle: pQE70, pQE60,
pQE9 (Qiagen), PBS, pD10, Phagescript, ϕX174, pBluescript
SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontische: pWLNEO,
pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL
(Pharmacia). Es kann jedoch irgendein anderes Plasmid oder irgendein
anderer Vektor verwendet werden, solange diese in dem Wirt replizieren
können
und lebensfähig
sind.
-
Promotorregionen
können
von jedem beliebigen Gen ausgewählt
werden, wobei CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder andere
Vektoren mit selektierbaren Markern verwendet werden. Zwei zweckdienliche
Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Speziell genannte bakterielle Promotoren
umfassen lacI, IacZ, T3, T7, gpt, Lambda PR,
PL und trp. Eukaryontische Promotoren umfassen
den unmittelbar frühen
CMV-Promotor, den HSV-Thymidinkinase-Promotor, den frühen und
den späten
SV40-Promotor, LTRs von Retroviren und den Maus-Metallothionein-I-Promotor. Eine Auswahl
des zweckdienlichen Vektors und Promotors liegt ohne weiteres innerhalb
des Wissens von durchschnittlich ausgebildeten Fachleuten.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, welche die vorstehend
beschriebenen Konstrukte enthalten. Bei der Wirtszelle kann es sich
um eine höhere
eukaryontische Wirtszelle wie z.B. eine Säugerzelle oder um eine niedere
eukaryontische Zelle wie z.B. eine Hefezelle handeln, oder die Wirtszelle
kann eine prokaryontische Zelle wie z.B. eine Bakterienzelle sein.
Die Einführung
des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch eine Calciumphosphat-Transfektion,
eine DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder eine Elektroporation
bewerkstelligt werden. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic
Methods in Molecular Biology (1986)).
-
Die
Konstrukte in den Wirtszellen können
auf eine herkömmliche
Weise dazu verwendet werden, das von der rekombinanten Sequenz codierte
Genprodukt zu erzeugen. Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide
mit Hilfe von herkömmlichen
Peptidsynthesegeräten
synthetisch hergestellt werden.
-
Reife
Proteine können
in Säugerzellen,
Hefe, Bakterien oder in anderen Zellen unter der Kontrolle von zweckdienlichen
Promotoren exprimiert werden. Es können auch zell-freie Translationssysteme
eingesetzt werden, um solche Proteine mit Hilfe von RNAs herzustellen,
welche von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet
worden sind. Zweckdienliche Clonierungs- und Expressionsvektoren
zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden
von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite
Auflage, Cold Spring Harbor N.Y. (1989) beschrieben, deren Offenbarung
hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
-
Die
Transkription der die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierenden
DNA durch höhere
Eukaryonten wird durch die Einführung
einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-agierende,
gewöhnlich
etwa 10 bis 300 bp lange DNA-Elemente, die auf einen Promotor wirken,
um dessen Transkription zu erhöhen.
Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs von
bp 100 bis 270, einen Enhancer des frühen Cytomegalievirus-Promotors, den Polyoma-Enhancer
auf der späten
Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
-
Im
Allgemeinen beinhalten die rekombinanten Expressionsvektoren Replikationsursprünge und
selektierbare Marker, welche eine Transformation der Wirtszelle
ermöglichen,
z.B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen sowie einen
von einem hoch exprimierten Gen abgeleiteten Promotor, um die Transkription
einer stromabwärts
gelegenen Struktursequenz zu steuern. Solche Promotoren können von
Operons abgeleitet werden, die glycolytische Enzyme codieren, wie
z.B. 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder
Hitzeschockproteine u.d.. Die heterologe Struktursequenz wird in einer
geeigneten Phase mit Sequenzen für
die Initiation der Translation und der Termination und bevorzugt
mit einer Leader-Sequenz zusammengesetzt, welche in der Lage ist,
die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen
Raum oder in das extrazelluläre
Medium zu steuern. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein
Fusionsprotein codieren, welches ein N-terminales Identifikationspeptid
beinhaltet, das die gewünschten
Eigenschaften verleiht, z.B. eine Stabilisierung oder eine vereinfachte
Aufreinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
-
Nützliche
Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden konstruiert,
indem man eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein gewünschtes
Protein codiert, zusammen mit geeigneten Signalen für die Initiation
der Translation und die Termination in einer funktionellen Lesephase
mit einem funktionellen Promotor inseriert. Der Vektor umfasst einen
oder mehrere phänotypisch
selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um die Erhaltung
des Vektors zu gewährleisten
und um, sofern dies wünschenswert
ist, eine Amplifikation innerhalb des Wirts bereitzustellen. Geeignete
prokaryontische Wirte für
eine Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella
typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas,
Streptomyces und Staphylococcus, obgleich wahlweise auch andere
eingesetzt werden können.
-
Als
ein repräsentatives,
aber nicht beschränkendes
Beispiel können
nützliche
Expressionsvektoren für die
Verwendung in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen
Replikationsursprung umfassen, welche von im Handel erhältlichen
Plasmiden abgeleitet sind, die genetische Elemente des wohlbekannten
Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche im Handel
erhältliche
Vektoren schließen zum
Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden)
und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese Abschnitte
des pBR322-„Gerüsts" werden mit einem
zweckdienlichen Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz
kombiniert.
-
Nach
der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und dem Wachstum
des Wirtsstamms auf eine angemessene Zelldichte wird der ausgewählte Promotor
durch zweckdienliche Mittel induziert (z.B. durch Temperaturänderung
oder durch chemische Induktion) und die Zellen werden für eine zusätzliche
Zeitdauer in Kultur gehalten.
-
Die
Zellen werden üblicherweise
durch Zentrifugation geerntet, mit physikalischen oder chemischen Mitteln
aufgeschlossen und der so erhaltene Rohextrakt wird für eine weitere
Aufreinigung aufbewahrt.
-
Mikrobielle
Zellen, die bei der Expression von Proteinen eingesetzt werden, können mit
jeder beliebigen geeigneten Methode aufgeschlossen werden, wozu
periodisches Einfrieren-Auftauen, Ultraschallbehandlung, mechanischer
Aufschluss oder die Verwendung von Zell-lysierenden Agentien gehören, wobei
solche Methoden den Fachleuten wohlbekannt sind.
-
Es
können
auch verschiedene Säugerzell-Kultursysteme
eingesetzt werden um rekombinantes Protein zu exprimieren. Zu Beispielen
für Säuger-Expressionssysteme
gehören
die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, welche von Gluzman,
Cell 23: 175 (1981) beschrieben worden sind, und andere Zelllinien, welche
in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel
die Zelllinien C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK. Säuger-Expressionsvektoren umfassen
einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer
und auch jegliche notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißdonor-
und -akzeptorstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen und
flankierende, nicht transkribierte 5'-Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von den
SV40 Spleiß- und Polyadenylierungsstellen
abgeleitet sind, können
dazu verwendet werden, die benötigten,
nicht transkribierten genetischen Elemente zur Verfügung zu
stellen.
-
Die
Polypeptide können
aus den rekombinanten Zellkulturen mit Methoden gewonnen und aufgereinigt
werden, welche Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion,
Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie,
hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie
und Lektin-Chromatographie umfassen. Gegebenenfalls können bei
der Vervollständigung
der Konfiguration des reifen Proteins Protein-Rückfaltungsschritte eingesetzt
werden. Schließlich
kann man Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) für
finale Aufreinigungsschritte einsetzen.
-
Bei
den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein
natürlich
aufgereinigtes Produkt handeln oder um ein Produkt aus chemisch-synthetischen
Verfahren oder um ein Produkt, das durch rekombinante Techniken
aus einem prokaryontischen oder einem eukaryontischen Wirt hergestellt
worden ist (zum Beispiel durch bakterielle, Hefe-, höhere Pflanzen-,
Insekten- und Säugerzellen
in Kultur). Je nach dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren
verwendeten Wirt können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht
glycosyliert sein. Erfindungsgemäße Polypeptide
können
auch einen Start-Methioninaminosäurerest enthalten.
-
Wie
in den 8 und 9 gezeigt, ist das VEGF2-Polypeptid
von SEQ ID NO: 2, ohne die anfänglichen
46 Aminosäuren,
ein starkes Mitogen für
vaskuläre
Endothelzellen und stimuliert deren Wachstum und Proliferation.
Die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse, die für die VEGF2-Nucleinsäuresequenz
durchgeführt
wurde, welche dieses Polypeptid codiert, bei der 20 μg RNA von
verschiedenen menschlichen Geweben mit einer 32P-VEGF2-Sonde
getestet wurden, zeigen, dass dieses Protein im Herz und in der
Lunge aktiv exprimiert wird, was ein weiterer Hinweis auf mitogene
Aktivität
ist.
-
Dementsprechend
kann VEGF2 dazu eingesetzt werden, um Angiogenese zu fördern, zum
Beispiel um das Wachstum von transplantiertem Gewebe zu stimulieren,
wenn eine Bypass-Operation der Herzkranzgefäße durchgeführt wird. VEGF2 kann auch dazu
eingesetzt werden um die Wundheilung zu fördern, insbesondere um geschädigtes Gewebe
zu revaskularisieren oder den kollateralen Blutfluss während einer
Ischämie
zu stimulieren sowie in Fällen,
in denen eine kapilläre
Angiogenese erwünscht
ist. VEGF2 kann eingesetzt werden, um Vollhautwunden wie z.B. Hautgeschwüre, einschließlich Druckgeschwüre, venöser Geschwüre und diabetischer
Geschwüre,
zu behandeln. Darüber
hinaus kann VEGF2 dazu eingesetzt werden, um Verbrennungen dritten
Grades und Vollhautverletzungen zu behandeln, wenn ein Hauttransplantat
oder ein Hautlappen verwendet wird, um solche Verbrennungen oder
Verletzungen zu beheben. VEGF2 kann auch in der plastischen Chirurgie
eingesetzt werden, zum Beispiel zur Behandlung von Schnittwunden
aus Verletzungen und Schnitten im Zusammenhang mit Operationen.
-
Analog
hierzu kann VEGF2 dazu eingesetzt werden, das Wachstum von verletzten
Knochen, Zahnhalteapparat oder Ligamentgewebe zu induzieren. VEGF2
kann auch dazu eingesetzt werden, um Stützgewebe der Zähne, einschließlich des
Zements und des Desmodontiums zu regenerieren, welche durch Krankheit und
Verletzung geschädigt
worden sind.
-
Da
Angiogenese wichtig ist, um Wunden rein und uninfiziert zu halten,
kann VEGF2 in Verbindung mit Operationen und nach der Reparatur
von Schnitten eingesetzt werden. Es kann auch für die Behandlung von Unterleibsverletzungen
eingesetzt werden, bei denen ein hohes Infektionsrisiko besteht.
-
VEGF2
kann auch zur Förderung
der Endothelbildung bei vaskulären
Trans plantatoperationen eingesetzt werden. Im Fall von vaskulären Transplantaten,
bei denen entweder transplantiertes oder synthetisches Material
verwendet wird, kann VEGF2 auf die Oberfläche des Transplantats oder
an der Kontaktstelle aufgebracht werden um das Wachstum von vaskulären Endothelzellen
zu fördern.
VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, Schäden an Herzmuskelgewebe infolge
von Herzinfarkt zu beheben. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden,
um das Herzgefäßsystem
nach einer Ischämie
zu reparieren. VEGF2 kann auch dazu eingesetzt werden, um infolge
einer Koronaren Herzerkrankung und peripheren und ZNS-Gefäßerkrankung
geschädigtes
vaskuläres
Gewebe zu behandeln.
-
VEGF2
kann auch dazu eingesetzt werden, um künstliche Prothesen oder natürliche Organe,
die in den Körper
transplantiert werden sollen, zu beschichten, um die Abstoßung des
transplantierten Materials zu minimieren und um die Vaskularisierung
der transplantierten Materialien zu stimulieren.
-
VEGF2
kann auch zur Reparatur von vaskulärem Gewebe eingesetzt werden,
zum Beispiel von jener, die während
einer Arteriosklerose auftritt und die nach einer Ballonangioplastie
notwendig ist, bei der vaskuläre Gewebe
geschädigt
werden.
-
VEGF2-Nucleinsäuresequenzen
und VEGF2-Polypeptide können
auch für
in vitro-Zwecke, die mit wissenschaftlicher Forschung, Synthese
von DNA und der Herstellung von DNA-Vektoren zu tun haben, und für die Herstellung
von Diagnostika und Therapeutika zur Behandlung von menschlichen
Krankheiten eingesetzt werden. Zum Beispiel kann VEGF2 für die in
vitro-Züchtung
von vaskulären
Endothelzellen verwendet werden, wo man es in einer Konzentration
von 10 pg/ml bis 10 ng/ml zu dem konditionierten Medium hinzugibt.
-
Fragmente
des Volllängen-VEGF2-Gens
können
als Hybridisierungssonde für
eine cDNA-Bank verwendet werden, um andere Gene zu isolieren, die
eine hohe Sequenzähnlichkeit
zu dem Gen aufweisen oder die eine ähnliche biologische Aktivität besitzen.
Sonden dieser Art haben im Allgemeinen mindestens 50 Basenpaare,
obgleich sie eine größere Anzahl
an Basen aufweisen können.
Die Sonde kann auch dazu verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der
einem Volllängen-Transkript entspricht,
und einen genomischen Clon oder genomische Clone zu identifizieren,
welche das vollständige
VEGF2-Gen einschließlich
der regulatorischen und Promotorregionen, Exons und Introns enthalten.
Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst das Isolieren der codierenden
Region des VEGF2-Gens, indem man die bekannte DNA-Sequenz dazu verwendet, um
eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide,
die eine Sequenzkomplementarität zu
der Sequenz des Gens der vorliegenden Erfindung aufweisen, werden
dazu verwendet, eine Bank von menschlicher cDNA, genomischer DNA
oder mRNA zu durchmustern, um festzustellen, an welche Mitglieder der
Bank die Sonde hybridisiert.
-
Diese
Erfindung stellt Methoden zur Identifizierung von VEGF2-Rezeptoren
bereit. Das Gen, welches den Rezeptor codiert, kann mit Hilfe von
einer Vielzahl von Fachleuten bekannten Methoden identifiziert werden,
zum Beispiel durch Liganden-Panning
und FACS-Sortierung (Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2),
Kapitel 5 (1991)). Bevorzugt wird die Expressionsclonierung verwendet,
bei der polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die
auf VEGF2 reagiert, und eine cDNA-Bank, die aus dieser RNA erzeugt
worden ist, wird in Pools aufgeteilt und dazu verwendet, COS-Zellen
oder andere Zellen zu transfizieren, die nicht auf VEGF2 reagieren.
Man setzt transfizierte Zellen, die man auf Glas-Objektträgern wachsen
lässt,
markiertem VEGF2 aus. Man kann VEGF2 durch eine Vielzahl von Methoden
markieren, wozu Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle
für eine
ortsspezifische Proteinkinase gehören. Nach der Fixierung und
Inkubation werden die Objektträger
einer autoradiographischen Untersuchung unterzogen. Positive Pools
werden identifiziert und Sub-Pools werden hergestellt und retransfiziert,
wobei man einen iterativen Prozess aus der Bildung von Sub-Pools
und erneuter Durchmusterung einsetzt, der schließlich einen einzelnen Clon
ergibt, der den mutmaßlichen
Rezeptor codiert.
-
Als
eine alternative Herangehensweise zur Identifikation eines Rezeptors
kann man markiertes VEGF2 mittels Photoaffinität an Zellmembran- oder Extraktpräparationen
koppeln, die das Rezeptormolekül exprimieren.
Vernetztes Material wird über
PAGE aufgetrennt und auf einem Röntgenfilm
exponiert. Der VEGF enthaltende markierte Komplex wird ausgeschnitten,
in Peptidfragmente aufgelöst
und einer Proteinmikrosequenzierung unterzogen. Die mittels Mikrosequenzierung
erhaltene Aminosäuresequenz
würde dazu
verwendet werden, einen Satz von degenerierten Oligonucleotidsonden
zu konstruieren, um eine cDNA-Bank zu durchmustern, um das Gen zu
identifizieren, welches den mutmaßlichen Rezeptor codiert.
-
Diese
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Durchmustern von Ver bindungen,
um diejenigen zu identifizieren, die VEGF2-Agonisten oder -Antagonisten
darstellen. Ein Beispiel für
ein solches Verfahren macht sich die Fähigkeit von VEGF2 zunutze,
die Proliferation menschlicher Endothelzellen in Gegenwart des Co-Mitogens ConA wesentlich
zu stimulieren. Endothelzellen werden erhalten und man züchtet sie
in Flachboden-Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge,
MA) in einem Reaktionsgemisch, das mit ConA (Calbiochem, La Jolla,
KA) supplementiert ist. Man fügt
ConA, Polypeptide der vorliegenden Erfindung und die zu durchmusternden
Verbindungen hinzu. Nach Inkubation bei 37° C werden die Kulturen mit 1 μCi 3[H]-Thymidin (5 Ci/mMol; 1 Ci = 37 GBq;
NEN) für
eine ausreichende Zeit, um das 3[H] einzubauen,
pulsmarkiert und man erntet sie auf Glasfaserfiltern (Cambridge
Technology, Waterton, MA). Der durchschnittliche 3[H]-Thymidin-Einbau
(ZpM) („Zählimpulse
pro Minute") von
Kulturen im Dreifachansatz wird mit Hilfe eines Szintillationszählgeräts (Beckman
Instruments, Irvine, KA) bestimmt. Ein signifikanter Einbau von 3[H]-Thymidin im Vergleich zu dem Kontrolltest,
in dem die Verbindung nicht vorhanden ist, zeigt eine Stimulierung
der Proliferation der Endothelzellen an.
-
Um
auf Antagonisten zu testen, wird der vorstehend beschriebene Test
durchgeführt,
und die Fähigkeit der
Verbindung, den Einbau von 3[H]-Thymidin
in Gegenwart von VEGF2 zu hemmen, weist darauf hin, dass es sich
bei der Verbindung um einen Antagonisten zu VEGF2 handelt. Alternativ
können
VEGF2-Antagonisten dadurch
nachgewiesen werden, indem man VEGF2 und einen potenziellen Antagonisten
mit Membran-gebundenen VEGF2-Rezeptoren oder mit rekombinanten Rezeptoren
unter geeigneten Bedingungen für
einen kompetitiven Inhibitionstest kombiniert. VEGF2 kann markiert
werden, wie z.B. durch Radioaktivität, so dass man anhand der Zahl
der an den Rezeptor gebundenen VEGF2-Moleküle die Wirksamkeit des potenziellen
Antagonisten bestimmen kann.
-
Alternativ
würde die
Reaktion eines bekannten sekundären
Botenstoff-Systems
nach der Interaktion von VEGF2 und dem Rezeptor gemessen und in
Anwesenheit oder Abwesenheit der Verbindung verglichen werden. Solche
sekundären
Botenstoff-Systeme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
cAMP, Guanylatcyclase, Ionenkanäle
oder die Hydrolyse von Phosphoinositid. In einem anderen Verfahren
wird eine Säugerzelle oder
eine Membranpräparation,
welche den VEGF2-Rezeptor exprimiert, in Gegenwart der Verbindung
mit markiertem VEGF2 inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese
Interaktion zu verstärken
oder zu blockieren, könnte
dann gemessen werden.
-
Potenzielle
VEGF2-Antagonisten umfassen einen Antikörper oder in manchen Fällen ein
Oligonucleotid, welcher/s an das Polypeptid bindet und die VEGF2-Funktion wirksam
ausschaltet. Alternativ kann ein potenzieller Antagonist ein eng
verwandtes Protein sein, welches an VEGF2-Rezeptoren bindet, wobei
diese jedoch inaktive Formen des Polypeptids darstellen und dadurch
die Wirkung von VEGF2 verhindern. Beispiele für diese Antagonisten umfassen
eine negativ dominante Mutante des VEGF2-Polypeptids, zum Beispiel
kann eine Kette der heterodimeren Form von VEGF2 dominant sein und
kann auf eine Weise mutiert sein, dass die biologische Aktivität nicht
bewahrt wird. Ein Beispiel einer negativ dominanten Mutante umfasst
verkürzte
Versionen eines dimeren VEGF2, das in der Lage ist, mit einem anderen
Dimer zu interagieren, um Wildtyp-VEGF2 zu bilden; das so erhaltene
Homodimer ist jedoch inaktiv und zeigt keine charakteristische VEGF-Aktivität.
-
Ein
anderer potenzieller VEGF2-Antagonist ist ein Antisense-Konstrukt,
das mit Hilfe der Antisense-Technologie hergestellt wird. Die Antisense-Technologie
kann dazu verwendet werden, Genexpression durch die Bildung von
Dreifach-Helices oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren,
wobei beide Methoden auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA
oder RNA basieren. Zum Beispiel wird codierende 5'-Teil der Polynucleotidsequenz, der die
reifen Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, dazu verwendet,
ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren
Länge zu
konstruieren. Ein DNA-Oligonucleotid wird so konstruiert, dass es
komplementär
zu einer Region des Gens ist, die an der Transkription beteiligt ist
(Dreifachhelix, siehe Lee et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979);
Cooney et al., Science 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science
251: 1360 (1991)), wodurch die Transkription und die Produktion
von VEGF2 verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert
in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das
VEGF2-Polypeptid (Antisense – Okano,
J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxyribonucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).
Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch auf eine solche Weise
an Zellen abgegeben werden, dass die Antisense-RNA oder -DNA in
vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von VEGF2 zu verhindern.
-
Potenzielle
VEGF2-Antagonisten umfassen auch kleine Moleküle, die an das aktive Zentrum
des Polypeptids binden und dieses besetzen, wodurch sie das katalytische
Zentrum für
das Substrat unzugänglich machen,
so dass die normale biologische Aktivität unterdrückt wird. Beispiele für kleine
Moleküle
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf kleine Peptide oder Peptid-artige Moleküle.
-
Die
Antagonisten können
dazu eingesetzt werden, die Angiogenese, die für feste Tumormetastasen notwendig
ist, zu begrenzen.
-
Man
stellt fest, dass die mRNA, welche VEGF2 codiert, in mindestens
zwei Brustkrebszelllinien in moderaten Mengen exprimiert ist, was
auf die Rolle der VEGF2-Polypeptide in dem malignen Phänotyp hindeutet. Bei
Gliomen handelt es sich ebenfalls um einen Typ von Neoplasien, welche
mit den Antagonisten der vorliegenden Erfindung behandelt werden
können.
-
Die
Antagonisten können
auch dazu verwendet werden, chronische Entzündung zu behandeln, welche
durch erhöhte
vaskuläre
Permeabilität
verursacht wird. Außer
bei diesen Funktionsstörungen
können
die Antagonisten auch dazu verwendet werden, mit Diabetes assoziierte
Retinopathien, rheumatoide Arthritis und Psoriasis zu behandeln.
-
Die
Antagonisten können
in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger benutzt
werden, z.B. wie hierin nachfolgend beschrieben.
-
Die
VEGF2-Polypeptide und Agonisten und Antagonisten können in
Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger eingesetzt
werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame
Menge des Polypeptids oder des Agonisten oder des Antagonisten und
einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Excipienten. Ein solcher Träger
umfasst, ist aber nicht beschränkt
auf Kochsalzlösung, gepufferte
Kochsalzlösung,
Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die
Formulierung sollte an die Art der Verabreichung angepasst sein.
-
Die
Erfindung stellt auch eine(n) pharmazeutische(n) Packung oder Kit
bereit, die (der) einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem
oder mehreren Inhaltsstoffen der Arzneimittel der Erfindung gefüllt sind.
Zu (einem) solchen Behälter(n)
kann ein Beipackzettel in der Form gehören, wie er von Regierungsbehörden vorgeschrieben
ist, welche die Herstellung, den Gebrauch oder den Verkauf von Arzneimitteln
oder biologischen Produkten regeln, wobei der Bei packzettel die
Zulassung durch die Behörde
zur Herstellung, zum Gebrauch oder Verkauf für eine Anwendung am Menschen
widerspiegelt. Außerdem
können
die Arzneimittel zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen
verwendet werden.
-
Die
Arzneimittel können
in einer dienlichen Weise verabreicht werden, wie z.B. über lokale,
intravenöse,
intraperitoneale, intramuskuläre,
intratumorale, subkutane, intranasale oder intradermale Wege. Die
Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die wirksam für die Behandlung
und/oder die Vorbeugung der spezifischen Indikation ist. Im Allgemeinen
werden die Arzneimittel in einer Menge von mindestens 10 μg/kg Körpergewicht
verabreicht und in den meisten Fällen
werden diese in einer Menge von nicht mehr als etwa 8 mg/kg Körpergewicht
pro Tag verabreicht. In den meisten Fällen wird die Dosis in einem
Bereich von etwa 10 μg/kg
bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht
täglich
liegen, wobei die Verabreichungswege, die Symptome etc. berücksichtigt
werden.
-
Die
VEGF2-Polypeptide und Agonisten oder Antagonisten, die Polypeptide
sind, können
gemäß der vorliegenden
Erfindung auch durch Expression eines solchen Polypeptids in vivo
eingesetzt werden, was häufig
als „Gentherapie" bezeichnet wird.
-
So
können
zum Beispiel Zellen wie z.B. Knochenmarkzellen mit einem Polynucleotid
(DNA oder RNA) gentechnisch verändert
werden, welches das Polypeptid ex vivo codiert, die gentechnisch
veränderten
Zellen werden dann an den mit dem Polypeptid zu behandelnden Patienten
abgegeben. Solche Methoden sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
zum Beispiel können
Zellen durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren durch Verwendung
eines retroviralen Partikels gentechnisch verändert werden, welches RNA enthält, die
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
-
Auf ähnliche
Weise können
die Zellen in vivo gentechnisch zur Expression eines Polypeptids
in vivo verändert
werden, zum Beispiel durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren.
Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann eine Produktionszelle
für die
Erzeugung eines retroviralen Partikels, welches RNA enthält, die
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten
verabreicht werden, um Zellen in vivo gentechnisch zu verändern und
eine in vivo-Expression des Polypeptids zu erreichen. Dieses und
andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden
Erfindung durch derartige Methoden sollten Fachleuten aus den Lehren
der vorliegenden Erfindung ersichtlich sein. Das Expressionsvehikel
zur gentechnischen Veränderung
der Zellen kann zum Beispiel ein anderes als ein retrovirales Partikel
sein, zum Beispiel ein Adenovirus, welches dazu verwendet werden
kann, Zellen in vivo nach einer Kombination mit einem geeigneten
Abgabevehikel gentechnisch zu verändern.
-
Retroviren,
von denen die hierin vorstehend erwähnten retroviralen Plasmidvektoren
abgeleitet werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Moloney-Maus-Leukämievirus,
Milznekrosevirus, Retroviren wie z.B. Rous-Sarkomvirus, Harvey-Sarkomvirus,
Vogelleukosevirus, Gibbonaffen-Leukämievirus, menschliches Immunschwächevirus,
Adenovirus, myeloproliferatives Sarkomvirus und Mammatumorvirus.
In einer Ausführungsform
ist der retrovirale Plasmidvektor von Moloney-Mausleukämievirus abgeleitet.
-
Der
Vektor beinhaltet einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren,
welche verwendet werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf die retrovirale LTR; den SV40-Promotor und den menschlichen
Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, der in Miller et al., Biotechniques,
Band 7, Nr. 9, 980–990 (1989)
beschrieben ist, oder einen beliebigen anderen Promotor (z.B. zelluläre Promotoren
wie z.B. eukaryontische zelluläre
Promotoren, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf die Histon-, polIII- und β-Actin-Promotoren).
Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf Adenovirus-Promotoren,
Thymidinkinase (TK)-Promotoren und B19 Parvovirus-Promotoren. Die
Auswahl eines geeigneten Promotors wird Fachleuten aus den hierin
enthaltenen Lehren ersichtlich sein.
-
Die
Nucleinsäuresequenz,
welche das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, steht
unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren,
welche verwendet werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Adenovirus-Promotoren wie z.B. der späte Hauptpromotor von Adenovirus
oder heterologe Promotoren wie z.B. den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor;
den Promotor des respiratorischen Syncytial-Virus (RSV); induzierbare
Promotoren wie z.B. den MMT-Promotor, den Metallothioneinpromotor; Hitzeschockpromotoren;
den Albumin-Promotor; den ApoAl-Promotor; menschliche Globin-Promotoren;
virale Thymidinkinase-Promotoren wie z.B. den Herpes simplex Thymidinkinase-Promotor; retrovirale
LTRs (einschließlich
der hierin vorstehend beschriebenen modifizierten retroviralen LTRs);
den β-Actin-Promotor;
und menschliche Wachstumshormon-Promotoren.
Bei dem Promotor kann es sich auch um den nativen Promotor handeln,
welcher die Gene kontrolliert, die das Polypeptid codieren.
-
Der
retrovirale Plasmidvektor wird verwendet, um Verpackungszelllinien
zu transduzieren, um Produktionszelllinien zu erzeugen. Beispiele
für Verpackungszellen,
die transfiziert werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf die Linien PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12,
T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86,
GP+envAm12 und DAN, wie sie in Miller, Hum. Gene Ther. Band 1, S.
5–14 (1990)
beschrieben sind, was hier unter Bezugnahme in Gesamtheit aufgenommen
ist. Der Vektor kann die Verpackungszellen mit Hilfe eines beliebigen,
auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens transduzieren. Solche Verfahren
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und CaPO4-Präzipitation.
In einer Alternative kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom
verkapselt oder mit einem Lipid gekoppelt und dann an einen Wirt
verabreicht werden.
-
Die
Produktionszelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorpartikel,
welche die Nucleinsäuresequenz(en)
beinhalten, die die Polypeptide codiert(en). Solche retrovirale
Vektorpartikel können
dann dazu verwendet werden, eukaryontische Zellen zu transduzieren,
entweder in vitro oder in vivo. Die transduzierten eukaryontischen
Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en)
exprimieren, welche das Polypeptid codiert(en). Eukaryontische Zellen,
die transduziert werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf hämatopoetische
Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten,
Endothelzellen und Bronchialepithelzellen.
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des VEGF2-Gens als Teil eines
diagnostischen Tests zum Nachweis von Krankheiten oder der Anfälligkeit
gegenüber
Krankheiten, welche in Zusammenhang mit dem Vorliegen von Mutationen
in VEGF2-Nucleinsäuresequenzen
stehen.
-
Einzelpersonen,
die Mutationen im VEGF2-Gen tragen, können durch eine Vielzahl von
Techniken auf der DNA-Ebene ermittelt werden. Nucleinsäuren für die Diagnose
lassen sich aus den Zellen eines Patienten gewinnen, wie z.B. aus
Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsiematerial. Die genomische
DNA kann direkt zum Nachweis eingesetzt werden oder kann mit Hilfe
der PCR vor der Analyse enzymatisch amplifiziert werden (Saiki et
al., Nature 324: 163–166
(1996)). RNA oder cDNA können
ebenfalls für
denselben Zweck eingesetzt werden. Als ein Beispiel kann man PCR-Primer,
die zu der VEGF2 codierenden Nucleinsäure komplementär sind,
dazu einsetzen, um VEGF2-Mutationen zu identifizieren und zu untersuchen.
Man kann zum Beispiel Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung
der Größe des amplifizierten
Produkts im Vergleich zu dem normalen Genotyp nachweisen. Punktmutationen
können
identifiziert werden, indem man amplifizierte DNA an radioaktiv
markierte VEGF2-RNA- oder alternativ an radioaktiv markierte VEGF2-Antisense-DNA-Sequenzen
hybridisiert. Man kann perfekt zueinander passende Sequenzen durch
RnaseA-Verdau oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur von
Duplexmolekülen
mit Fehlpaarungen unterscheiden.
-
Ein
auf Unterschieden in der DNA-Sequenz basierendes genetisches Austesten
lässt sich
durch einen Nachweis der Veränderung
der elektrophoretischen Mobilität
von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel erreichen.
Kleine Sequenz-Deletionen und -Insertionen können durch hoch auflösende Gelelektrophorese
sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von verschiedenen Sequenzen
lassen sich auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterscheiden, in denen
die Mobilitäten
verschiedener DNA-Fragmente
in dem Gel an verschiedenen Stellen auf Grund ihrer spezifischen
Schmelz- oder partiellen Schmelztemperaturen verlangsamt sind (siehe
z.B. Myers et al., Science 230: 1242 (1985)).
-
Sequenzveränderungen
an spezifischen Stellen lassen sich auch durch Nuclease-Protektionstests wie
z.B. RNase- und S1-Protektion oder die chemische Spaltungsmethode
(z.B. Cotton et al., PNAS, USA 85: 4397–4401 (1985)) aufdecken.
-
Demnach
lässt sich
der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Methoden wie z.B.
Hybridisierung, RNase-Protektion, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung
oder durch die Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B. durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus
(RFLP)) und Southern-Blot-Analyse
der genomischen DNA erreichen.
-
Außer durch
die eher herkömmliche
Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung
lassen sich Mutationen auch durch in situ-Analyse nachweisen.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Test zum Nachweis
von veränderten Spiegeln
von VEGF2-Protein in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression
der Proteine im Vergleich zu normalen Kontroll-Gewebeproben das
Vorhandensein einer Krankheit oder die Anfälligkeit gegenüber einer Krankheit
nachweisen kann, zum Beispiel eine anomale Zelldifferenzierung.
Tests, die verwendet werden, um Spiegel des VEGF2-Proteins in einer
Probe zu bestimmen, die von einem Wirt erhalten worden ist, sind
Fachleuten wohlbekannt und umfassen Radioimmuntests, kompetitive
Bindungstests, Western Blot-Analyse, ELISA-Tests und den „Sandwich"-Test. Ein ELISA-Test
(Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2), Kapitel 6,
(1991) umfasst zunächst
das Herstellen eines Antikörpers,
der für
das VEGF2-Antigen spezifisch ist, bevorzugt eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich wird
ein Reporter-Antikörper
gegen den monoclonalen Antikörper
hergestellt. An den Reporter-Antikörper wird ein nachweisbares
Reagenz angelagert, wie z.B. Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem
Beispiel ein Meerrettichperoxidase-Enzym. Eine Probe wird einem Wirt
entnommen und auf einem festen Träger inkubiert, z.B. einer Polystyrolplatte,
welche die Proteine in der Probe bindet. Alle freien Proteinbindungsstellen
auf der Platte werden dann abgedeckt, indem man mit einem nicht
spezifischen Protein wie z.B. Rinderserumalbumin inkubiert. Als
nächstes
wird der monoclonale Antikörper
in der Platte inkubiert, während
dieser Zeit heften sich die monoclonalen Antikörper an alle VEGF2-Proteine
an, die auf der Polystyrolplatte gebunden sind. Alle ungebundenen
monoclonale Antikörper
werden mit Puffer weggewaschen. Der an Meerrettichperoxidase gekoppelte
Reporter-Antikörper
wird in die Platte gegeben, was zu einer Bindung des Reporter-Antikörpers an
alle an VEGF2 gebundenen monoclonalen Antikörper führt. Nicht gebundener Reporter-Antikörper wird
dann weggewaschen. Es werden dann Peroxidase-Substrate zu der Platte
hinzugefügt
und die Menge an Farbe, die sich in einem bestimmten Zeitraum entwickelt,
ist ein Maß für die Menge
von VEGF2-Protein, das in einem gegebenen Volumen einer Patientenprobe
vorliegt, wenn man diese mit einer Standardkurve vergleicht.
-
Man
kann einen Kompetitiionstest verwenden, in dem für VEGF2 spezifische Antikörper an
einen festen Träger
gebunden sind. Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden dann
markiert, zum Beispiel durch Radioaktivität, und eine von dem Wirt entnommene
Probe wird dann über
den festen Träger
laufen gelassen und die Menge des Markers, welche zum Beispiel durch
Flüssig-Szintillations chromatographie
nachgewiesen wird, lässt
sich dann mit einer Menge von VEGF2 in der Probe korrelieren.
-
Ein „Sandwich"-Test ist ähnlich wie
ein ELISA-Test. In einem „Sandwich"-Test lässt man
VEGF2 über einen
festen Träger
laufen und dieser bindet an einen an dem festen Träger angebrachten
Antikörper.
Ein zweiter Antikörper
wird dann an den VEGF2 gebunden. Ein dritter Antikörper, der
markiert ist und spezifisch für
den zweiten Antikörper
ist, wird dann über
den festen Träger
laufen gelassen und bindet an den zweiten Antikörper und eine Menge kann dann
quantitativ bestimmt werden.
-
Die
Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch wertvoll für die Identifizierung
von Chromosomen. Die Sequenz ist spezifisch gegen eine bestimmte
Stelle auf einem einzelnen menschlichen Chromosom gerichtet und
kann mit dieser hybridisieren. Darüber hinaus gibt es einen aktuellen
Bedarf für
die Identifizierung von bestimmten Stellen auf dem Chromosom. Derzeit
sind wenige Chromosomen-Markierungsreagenzien
für die
Markierung einer chromosomalen Lage verfügbar, die auf tatsächlichen
Sequenzdaten basieren (Polymorphismen von Wiederholungen). Die Kartierng
von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden
Erfindung stellt einen wichtigen ersten Schritt bei der Korrelierung
dieser Sequenzen mit Genen dar, welche mit Krankheiten assoziiert
sind.
-
In
Kürze,
Sequenzen können
auf Chromosomen kartiert werden, indem man ausgehend von der cDNA
PCR-Primer herstellt (bevorzugt 15–25 bp). Man setzt eine Computer-Analyse
der cDNA ein, um schnell Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein
Exon in der genomischen DNA überspannen,
wodurch der Amplifikationsprozess verkompliziert würde. Diese
Primer werden dann für
eine PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden eingesetzt,
welche einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur diejenigen
Hybride, welche das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht,
werden ein amplifiziertes Fragment liefern.
-
Die
PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist eine schnelle Methode,
um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Mit
Hilfe der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotid-Primern
kann mit Gruppen von Fragmenten von spezifischen Chromosomen oder
Pools von großen
genomischen Clonen auf analoge Weise eine Sublokalisierung erreicht
werden. Andere Strategien der Kartierung, welche auf ähnliche
Weise dazu verwendet werden können,
das zugehörige
Chromosom zu kartieren, schließen
in situ-Hybridisierung, eine Vor- Durchmusterung
mit markierten, durchflusssortierten Chromosomen und eine Vorselektion
mittels Hybridisierung ein, um chromosomenspezifische cDNA-Banken
zu konstruieren.
-
Man
kann Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons
bei einer Metaphasen-Chromosomenspreitung dazu einsetzen, um eine
genaue chromosomale Lage in einem Schritt zu liefern. Diese Technik
kann mit einer cDNA eingesetzt werden, die nur 50 oder 60 Basen
lang ist. Für
eine Übersicht über diese
Technik siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic
Techniques. Pergamon Press, New York (1988).
-
Sobald
eine Sequenz auf eine genaue chromosomale Lage kartiert worden ist,
kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit
genetischen Kartierungsdaten korreliert werden. (Solche Daten lassen
sich zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online
verfügbar über die
Welch Medical Library der Johns Hopkins-Universität) finden).
Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, welche auf dieselbe
chromosomale Region kartiert worden sind, wird dann durch Kopplungsanalyse
(die gemeinsame Vererbung von physikalisch aneinander angrenzenden
Genen) ermittelt).
-
Als
nächstes
ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen
Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Einzelpersonen
herauszufinden. Falls eine Mutation bei einigen oder bei allen betroffenen
Einzelpersonen, aber nicht bei irgendeiner der Normalpersonen beobachtet
wird, dann ist es wahrscheinlich, dass die Mutation das ursächliche
Agens der Krankheit ist.
-
Bei
der heutigen Auflösung
von physikalischer Kartierung und genetischen Kartierungsmethoden könnte eine
cDNA, die genau auf eine chromosomale Region lokalisiert ist, die
mit einer Krankheit assoziiert ist, eines von zwischen 50 und 500
potenziellen verursachenden Genen sein. (Hierbei ist eine Auflösung der Kartierung
von 1 Megabase und ein Gen pro 20 kb unterstellt).
-
Die
Polypeptide, deren Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon
oder Zellen, welche diese exprimieren, können als Immunogen verwendet
werden, um Antikörper
dagegen herzustellen. Bei diesen Antikörpern kann es sich zum Beispiel
um polyclonale oder monoclonale Antikörper handeln. Die vorliegende Erfindung
umfasst auch chimäre,
Einzelketten- und humanisierte Antikörper ebenso wie Fab-Fragmente
oder das Produkt einer Fab-Expressionsbank. Es können ver schiedene, auf dem
Fachgebiet bekannte Methoden für
die Herstellung solcher Antikörper
und Fragmente eingesetzt werden.
-
Antikörper, die
gegen das einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechende
Polypeptid erzeugt worden sind, kann man durch direkte Injektion
des Polypeptids in ein Tier oder durch Verabreichung des Polypeptids
an ein Tier, bevorzugt ein nicht-menschliches, erlangen. Der so
erhaltene Antikörper
wird dann an das Polypeptid selbst binden. Auf diese Weise kann
sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert,
dazu verwendet werden, Antikörper
zu erzeugen, die das gesamte native Polypeptid binden. Solche Antikörper können dann
dazu verwendet werden, um das Polypeptid aus Geweben zu isolieren,
die jenes Polypeptid exprimieren. Zur Herstellung von monoclonalen
Antikörpern
kann eine beliebige Methode verwendet werden, die Antikörper liefert,
die durch kontinuierliche Kulturen von Zelllinien erzeugt werden.
Beispiele umfassen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256:
495–497
(1975)), die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik
(Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983)) und die EBV-Hybridom-Technik,
um menschliche monoclonale Antikörper
zu erzeugen (Cole et al., 1985, in: Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96).
-
Methoden,
die für
die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben worden sind
(US-Patent 4,946,778) können
angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser
Erfindung zu erzeugen. Es können
auch transgene Mäuse
verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte
dieser Erfindung zu erzeugen.
-
Die
vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden
Beispiele beschrieben; es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende
Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Sofern nicht anderweitig
angegeben, sind alle Teile oder Mengen nach Gewicht angegeben.
-
Um
das Verständnis
der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig vorkommende Methoden
und/oder Begriffe beschrieben.
-
„Plasmide" werden durch den
Kleinbuchstaben p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Nummern
vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder
im Handel erhältlich, öffentlich unbeschränkt zugänglich oder
können
aus verfügbaren
Plasmiden gemäß veröffentlichten
Verfahren konstruiert werden. Darüber hinaus sind gleichwertige
Plasmide zu den beschriebenen auf dem Fachgebiet bekannt und werden
einem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann ersichtlich sein.
-
„Verdau" von DNA bezieht
sich auf eine katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, welches
nur bei bestimmten Sequenzen in der DNA funktioniert. Die verschiedenen
hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und
deren Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und andere Erfordernisse
wurden so verwendet, wie es einem durchschnittlich begabten Fachmann
bekannt wäre.
Für analytische Zwecke
wird üblicherweise
1 μg Plasmid
oder DNA-Fragment
mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung eingesetzt. Zum Zweck
der Isolierung von DNA-Fragmenten für Plasmid-Konstruktionen werden üblicherweise
5 bis 50 μg
DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Zweckdienliche
Puffer und Substratmengen für
jeweilige Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Gewöhnlich werden
Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37° C verwendet, aber diese können gemäß den Vorschriften
des Herstellers variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt
auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, um das
gewünschte
Fragment zu isolieren.
-
Eine
Größenauftrennung
der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung eines 8 Prozent
Polyacrylamidgels durchgeführt,
welches von Goeddel, D. et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057 (1980)
beschrieben ist.
-
„Oligonucleotide" bezieht sich entweder
auf ein einzelsträngiges
Polydesoxynucleotid oder auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die
chemisch synthetisiert sein können.
Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und ligieren
somit nicht an ein anderes Oligonucleotid ohne Zugabe eines Phosphats
von einem ATP in Gegenwart einer Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotid
ligiert an ein Fragment, welches nicht dephosphoryliert worden ist.
-
„Ligierung" bezieht sich auf
den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten
(Maniatis, T. et al., a.a.O. S. 146). Sofern nicht anderweitig vermerkt,
kann eine Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen
mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg von ungefähr äquimolaren Mengen der zu ligierenden
DNA-Fragmente erreicht
werden.
-
Sofern
nicht anderweitig angegeben, wurden Transformationen, wie in der
Methode von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52: 456–457 (1973)
beschrieben, durchgeführt.
-
Beispiel 1
-
Expressionsmuster von
VEGF2 in menschlichen Geweben und in Brustkrebszelllinien.
-
Es
wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um die Expressionsspiegel
des VEGF2-Gens in menschlichen Geweben und menschlichen Brustkrebszelllinien
zu untersuchen. Proben von zellulärer Gesamt-RNA wurden mit dem
RNAzolTM B-System (Biotecx Laboratories, Inc.)
isoliert. Etwa 10 μg
Gesamt-RNA, die von jedem Brustgewebe und der angegebenen Zelllinie
isoliert worden war, wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt
und mit dem Blotting-Verfahren auf einen Nylonfilter übertragen
(Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring
Harbor Press, 1989). Die Markierungsreaktion wurde gemäß dem Prime-It-Kit
von Stratagene Cloning Systems, Inc. mit 50 ng DNA-Fragment durchgeführt. Die
markierte DNA wurde mit einer Select-G-50-Säule von 5 Prime–3Prime,
Inc., Boulder, CO, USA aufgereinigt. Der Filter wurde dann mit dem
radioaktiv markierten Volllängen-VEGF2-Gen
bei 100.000 ZpM/ml in 0,5 M NaPO4 und 7%
SDS über
Nacht bei 65°C
hybridisiert. Nach zweimaligem Waschen bei Raumtemperatur und zweimal
bei 60°C
mit 0,5 × SSC,
0,1% SDS wurden die Filter über
Nacht bei –70°C mit einer
Verstärkerfolie
exponiert. Eine Boten-RNA von 1,6 kb Größe wurde in 2 Brustkrebszelllinien
beobachtet.
-
Beispiel 2
-
Clonierung und Expression
von VEGF2 mit dem Baculovirus-Expressionssystem.
-
Die
cDNA-Sequenz, welche das VEGF2-Protein ohne die 46 Aminosäuren am
N-Terminus codiert, siehe ATCC #97161, wurde mit den PCR-Oligonucleotid-Primern
amplifiziert, die den 5'-
und den 3'-Sequenzen
des Gens entsprachen.
-
Der
5'-Primer hat die
Sequenz TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCC GCC ATG GAG GCC ACG
GCT TAT GC (SEQ ID NO: 4) und enthält eine BamHI-Restriktionsstelle
(in Fettschrift) und 17 Nucleotide einer Nucleotidsequenz, die zur
5'-Sequenz von VEGF2
(nt 150–166)
komplementär
ist.
-
Der
3'-Primer hat die
Sequenz GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGG TCT (SEQ ID NO: 5) und enthält die Spaltstelle
für das
Restriktionsenzym XbaI und 18 Nucleotide, die komplementär zu der
3'-Sequenz von VEGF2
sind, einschließlich
des Stoppcodons und der 15 Nucleotide langen Sequenz vor dem Stoppcodon.
-
Die
amplifizierten Sequenzen wurden aus einem 1% Agarosegel mit einem
im Handel erhältlichen
Kit („Geneclean", Bio 101 Inc., La
Jolla, KA) isoliert. Das Fragment wurde dann mit den Endonucleasen
BamHI und XbaI verdaut und dann noch einmal auf einem 1% Agarosegel
aufgereinigt. Dieses Fragment wurde an den BamHI- und XbaI-Stellen
in den Baculovirus-Transfervektor pAcGP67A (Pharmingen) ligiert.
Durch diese Ligierung wurde die VEGF2-DNA im Leseraster mit der
Signalsequenz des Baculovirus-Gens gp67 cloniert und war am 3'-Ende der Signalsequenz
in dem Vektor gelegen. Dieser wurde als pAcGP67A-VEGF2 bezeichnet.
-
Um
VEGF2 mit der Signalsequenz des gp67-Gens zur Expression in den
Vektor pRG1 zu clonieren, wurde VEGF2 mit der Signalsequenz und
etwas Sequenz stromaufwärts
an der stromaufwärts
von der VEGF2-cDNA gelegenen XhoI-Restriktionsendonucleasestelle und an
der XbaI-Restriktionsendonucleasestelle durch das XhoI- und XbaI-Restriktionsenzym
aus dem Plasmid pAcGP67A-VEGF2 ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde
auf einem 1% Agarosegel vom Rest des Vektors getrennt und wurde
mit dem „Geneclean"-Kit aufgereinigt.
Es wurde als F2 bezeichnet.
-
Der
Vektor pRG1 (eine Modifikation des Vektors pVL941) wird für die Expression
des VEGF2-Proteins mit dem Baculovirus-Expressionssystem eingesetzt
(für einen Übersichtsartikel
siehe: Summers, M.D. und Smith, G.E., 1987, A manual of methods
for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas
Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555). Dieser Expressionsvektor
enthält
den starken Polyhedrin-Promotor des nucleären Polyeder-Virus von Autographa
californica (AcMNPV), gefolgt von den Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen
BamHI SmaI, XbaI, BglII und Asp718. Eine Stelle für die Restriktionsendonuclease
XhoI ist stromaufwärts
von der BamHI-Stelle gelegen. Die Sequenz zwischen XhoI und BamHI
ist dieselbe wie diejenige in dem Vektor pAcGp67A (Bandstörung). Die
Polyadenylierungsstelle des Affenvirus SV40 wird für eine effiziente
Polyadenylierung eingesetzt. Für
eine leichte Selektion von rekombinantem Virus ist das β-Galactosidase-Gen
von E. coli in derselben Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor
eingeführt,
gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens. Die
Polyhedrin-Sequenzen sind auf beiden Seiten von viralen Sequenzen
für die
Zell-vermittelte homologe Rekombination von cotransfizierter viraler
Wildtyp-DNA flankiert. Viele andere Baculovirus-Vektoren könnten an
Stelle von pRG1 verwendet werden, wie z.B. pAc373, pVL941 und pAcIM1
(Luckow, V.A. und Summers, M.D., Virology 170: 31–39).
-
Das
Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und XbaI verdaut
und dann mit Kälberdarmphosphatase
mit auf dem Fachgebiet bekannten Methoden dephosphoryliert. Die
DNA wurde dann aus einem 1% Agarosegel mit dem im Handel erhältlichen
Kit („Geneclean", BIO 101 Inc., La
Jolla, CA) isoliert. Diese Vektor-DNA wird als V2 bezeichnet.
-
Das
Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E.
coli HB101-Zellen wurden dann transformiert und Bakterien identifiziert,
die das Plasmid (pBac gp67-VEGF2) mit dem VEGF2-Gen enthielten,
wobei die Enzyme BamHI und XbaI verwendet wurden. Die Sequenz des
clonierten Fragments wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
-
5 μg des Plasmids
pBac gp67-VEGF2 wurden mit 1,0 μg
eines im Handel erhältlichen
linearisierten Baculovirus („BaculoGoldTM Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, KA) mit der
Lipotransfektions-Methode (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 7413–7417
(1987)) cotransfiziert.
-
1 μg von BaculoGoldTM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBac gp67-VEGF2
wurden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt,
welche 50 μl
Serum-freies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburgh,
MD) enthielt. Danach wurden 10 μl
Lipofectin plus 90 μl
Grace-Medium hinzugefügt,
gemischt und für
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch
tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) hinzugegeben,
die in einer 35 mm-Gewebekultur-Platte mit 1 ml Grace-Medium ohne
Serum ausgesät
worden waren. Die Platte wurde hin und her geschaukelt, um die neu
hinzugegebene Lösung
zu mischen. Die Platte wurde dann für 5 Stunden bei 27°C inkubiert.
Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung aus der Platte entfernt
und es wurde 1 ml Grace Insekten-Medium hinzugefügt, welches mit 10% fötalem Kälberserum
supplementiert war. Die Platte wurde in einen Inkubator zurückgestellt und
die Züchtung
bei 27° C
für vier
Tage fortgesetzt.
-
Nach
vier Tagen wurde der Überstand
gesammelt und ein Plaquetest durchgeführt, ähnlich wie von Summers und
Smith (vorstehend) beschrieben. Als eine Modifikation wurde ein
Agarosegel mit „Blue
Gal" (Life Technologies
Inc., Gaithersburgh) eingesetzt, welches eine leichte Isolierung
der blaugefärbten
Plaques erlaubt. (Eine ausführliche
Beschreibung eines „Plaquetests" kann auch auf Seite
9–10 in
dem Benutzer-Handbuch für
Insektenzell-Kultur und Baculovirologie gefunden werden, welches
von Life Technologies Inc., Gaithersburgh verteilt wird.
-
Vier
Tage nach der seriellen Verdünnung
wurde das Virus zu den Zellen hinzugefügt, blau gefärbte Plaques
wurden mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette gepickt. Der die rekombinanten
Viren enthaltende Agar wurde dann in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert,
das 200 μl
Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch eine kurze Zentrifugation
entfernt und der Überstand,
welcher die rekombinanten Viren enthielt, wurde dazu verwendet,
Sf9-Zellen zu infizieren, die in 35 mm Platten ausgesät worden
waren. Vier Tage später
wurden die Überstände von
diesen Kulturplatten geerntet und dann bei 4°C gelagert.
-
Man
ließ Sf9-Zellen
in Grace-Medium wachsen, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS supplementiert war.
Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-gp67-VEGF2
mit einer Multiplizität
der Infektion (MOI) von 1 infiziert. Sechs Stunden später wurde
das Medium entfernt und mit SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein
(Life Technologies Inc., Gaithersburgh) ersetzt. 42 Stunden später wurden
5 μCi 35S-Methionin und 5 μCi 35S-Cystein
(Amersham) hinzugefügt.
Die Zellen wurden weiter für
16 Stunden inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet und
die markierten Proteine durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht
wurden.
-
Protein
vom Medium und vom Cytoplasma der Sf9-Zellen wurde mittels SDS-PAGE unter reduzierenden
und nicht reduzierenden Bedingungen untersucht. Siehe 4.
Das Medium wurde gegen 50 mM MES, pH 5,8, dialysiert. Man erhielt
nach der Dialyse Präzipitate
und resuspendierte diese in 100 mM Na-Citrat, pH 5,0. Das resuspendierte
Präzipitat
wurde wieder mittels SDS-PAGE untersucht und wurde mit Coomassie-Brilliantblau
gefärbt.
Siehe 5.
-
Der
Mediumüberstand
wurde auch 1:10 in 50 mM MES, pH 5,8, verdünnt und auf eine SP-650M-Säule (1,0 × 6,6 cm,
Toyopearl) bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Protein
wurde mit Stufengradienten bei 200, 300 und 500 mM NaCl eluiert.
Der VEGF2 wurde mit der Elution bei 500 mM NaCl erhalten. Das Eluat wurde
durch SDS-PAGE in Anwesenheit oder Abwesenheit des Reduktionsmittels β-Mercaptoethanol analysiert
und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Siehe 6.
-
Beispiel 3
-
Expression von rekombinantem
VEGF2 in COS-Zellen.
-
Das
Expressionsplasmid VEGF2-HA ist von dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen)
abgeleitet, enthaltend: 1) den SV40-Replikationsursprung, 2) ein
Ampicillin-Resistenz-Gen, 3) einen E. coli-Replikationsursprung,
4) den CMV-Promotor,
gefolgt von einer Polylinker-Region, einem SV40-Intron und einer
Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, welches den gesamten
VEGF2-Vorläufer
und einen HA-Marker codiert, welcher im Leseraster an dessen 3'-Ende fusioniert
ist, wurde in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, daher wird
die Expression des rekombinanten Proteins von dem CMV-Promotor gesteuert.
Der HA-Marker entspricht einem Epitop, das von dem Hämagglutinin-Protein
von Influenzavirus, wie früher
beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M.
Connolly und R. Lerner, Cell 37: 767 (1984)) abgeleitet ist. Die
Fusion des HA-Markers an das Zielprotein ermöglicht einen einfachen Nachweis
des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, welcher das HA-Epitop
erkennt.
-
Die
Konstruktionsstrategie des Plasmids ist wie folgt beschrieben:
Die
DNA-Sequenz, welche VEGF2, ATCC # 97161 codiert, wurde mittels PCR
konstruiert, wobei zwei Primer eingesetzt wurden: der 5'-Primer (CGC GGA
TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA) (SEQ ID NO: 6) enthält eine BamHI-Stelle, gefolgt
von 18 Nucleotiden der codierenden Sequenz von VEGF2, beginnend
von dem Startcodon; die 3'-Sequenz
(CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT
TTG TGG TCT 3')
(SEQ ID NO: 7) enthält
komplementäre
Sequenzen zu einer XbaI-Stelle, dem HA-Marker, einer XhoI-Stelle
und den letzten 15 Nucleotiden der codierenden Sequenz von VEGF2
(ohne das Stopcodon). Daher enthält
das PCR-Produkt eine BamHI-Stelle, die codierende Sequenz, gefolgt
von einer XhoI-Restriktionsendonucleasestelle und dem im Leseraster
fusionierten HA-Marker ein Translationsterminations-Stoppcodon nahe
dem HA-Marker und
eine XbaI-Stelle. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp
wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und ligiert.
Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURE (Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, KA 92037) transformiert, die transformierte
Kultur wurde auf Ampicillin-Medienplatten ausplattiert und resistente
Kolonien wurden durch Selektion gewonnen. Plasmid-DNA wurde aus
den Transformanten isoliert und mittels Restriktionsanalyse auf die
Anwesenheit des korrekten Fragments untersucht. Für die Expression
des rekombinanten VEGF2 wurden COS-Zellen mit der DEAE-Dextran-Methode (J.
Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) mit dem Expressionsvektor
transfiziert. Die Expression des VEGF2-HA-Proteins wurde mittels
radioaktiver Markierung und der Immunpräzipitationsmethode nachgewiesen
(E. Harlow, D. Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1988)). Die Zellen wurden zwei Tage nach
der Transfektion für
8 Stunden mit 35S-Cystein markiert. Das
Kulturmedium wurde dann gesammelt und die Zellen mit Detergenz lysiert
(RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC,
50 mM Tris, pH 7,5) (Wilson, I. et al., id. 37: 767 (1984)). Sowohl das
Zelllysat als auch das Kulturmedium wurden mit einem HA-spezifischen
monoclonalen Antikörper
präzipitiert.
Präzipitierte
Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen
analysiert.
-
Beispiel 4
-
Die Wirkung von partiell
aufgereinigtem VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen.
-
Am
Tag 1 wurden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC)
in einer Dichte von 2–5 × 104 Zellen/35 mm-Platte in M199-Medium ausgesät, das 4%
fötales
Rinderserum (FBS), 16 Einheiten/ml Heparin und 50 Einheiten/ml Wachstumszusätze für Endothelzellen
(ECGS, Biotechnique, Inc.) enthielt. Am Tag 2 wurde das Medium durch
M199 ersetzt, das 10% FBS, 8 Einheiten/ml Heparin enthielt. Das
VEGF2-Protein von SEQ ID NO: 2 ohne die anfänglichen 45 Aminosäurereste
(VEGF) und basisches FGF (bFGF) wurden in den gezeigten Konzentrationen
hinzugefügt.
An den Tagen 4 & 6
wurde das Medium ausgetauscht. Am Tag 8 wurde die Zellzahl mit einem
Coulter Counter bestimmt (siehe 8).
-
Beispiel 5
-
Die Wirkung von aufgereinigtem
VEGF2-Protein auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen.
-
Am
Tag 1 wurden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC)
in einer Dichte von 2–5 × 104 Zellen/35 mm-Platte in M199-Medium ausgesät, das 4%
fötales
Rinderserum (FBS), 16 Einheiten/ml Heparin und 50 Einheiten/ml Wachstumszusätze für Endothelzellen
(ECGS, Biotechnique, Inc.) enthielt. Am Tag 2 wurde das Medium durch
M199 ersetzt, das 10% FBS, 8 Einheiten/ml Heparin enthielt. Aufgereinigtes VEGF2-Protein
von SEQ ID NO: 2 ohne die anfänglichen
45 Aminosäurereste
wurde an diesem Punkt zu dem Medium hinzugefügt. An den Tagen 4 & 6 wurde das Medium
durch frisches Medium und Zusätze
ersetzt. Am Tag 8 wurde die Zellzahl mit einem Coulter Counter bestimmt
(siehe 9).
-
Beispiel 6
-
Expression via Gentherapie
-
Fibroblasten
werden von einem Individuum durch Hautbiopsie gewonnen. Das so erhaltene
Gewebe wird in Gewebekultur-Medium gelegt und in kleine Stücke aufgeteilt.
Kleine Gewebebrocken werden auf eine feuchte Oberfläche einer
Gewebekulturplatte gelegt, ungefähr
zehn Stückchen
werden in jede Flasche gesetzt. Die Flasche wird auf den Kopf gestellt,
dicht verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen.
Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Flasche umgedreht und
die Gewebebrocken bleiben an dem Boden der Flasche haften, und frisches
Medium (z.B. Ham-F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin)
wird hinzugefügt.
Dies wird dann bei 37°C
für ungefähr eine
Woche inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium hinzugegeben
und danach alle paar Tage gewechselt. Nach weiteren zwei Wochen in
Kultur entsteht eine Einzelzellschicht von Fibroblasten. Die Einzelzellschicht
wird mit Trypsin behandelt und in größere Flaschen für die Züchtung in
größerem Maßstab verteilt.
-
pMV-7
(Kirschmeier, P.T. et al., DNA 7: 219–25 (1988)), welches von den
langen terminalen Wiederholungen des Moloney-Maus-Sarkomvirus flankiert
ist, wird mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit
Kälberdarmphosphatase
behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel der Größe nach
aufgetrennt und unter Verwendung von Glaskügelchen aufgereinigt.
-
Die
cDNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird
mit Hilfe von PCR-Primern amplifiziert, die den Sequenzen am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende entsprechen.
Der 5'-Primer enthält eine
EcoRI-Stelle und der 3'-Primer
enthält
ferner eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen des linearen Gerüsts des
Moloney-Maus-Sarkomvirus
und des amplifizierten EcoRI- und HindIII-Fragments werden in Gegenwart
von T4-DNA-Ligase zusammengegeben. Das so erhaltene Gemisch wird
unter Bedingungen gehalten, die für die Ligierung der zwei Fragmente
zweckdienlich sind. Das Ligierungsgemisch wird dazu benutzt, HB101-Bakterien
zu transformieren, welche dann auf einen Kanamycin enthaltenden
Agar ausplattiert werden, um zu bestätigen, dass der Vektor das
Gen von Interesse korrekt eingesetzt aufwies.
-
Die
amphotropen Verpackungszellen PA317 oder Gp+Am12 lässt man
in Gewebekultur in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit
10% Kälberserum
(CS), Penicillin und Streptomycin bis zur Konfluenz wachsen. Der
das Gen enthaltende MSV-Vektor wird dann zu dem Medium hinzugefügt und die
Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen
produzieren nun infektiöse
Viruspartikel, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden
nun als Produktionszellen bezeichnet).
-
Frisches
Medium wird zu den transduzierten Produktionszellen hinzugefügt und das
Medium wird anschließend
von einer 10 cm-Platte von konfluenten Produktionszellen geerntet.
Das verbrauchte Medium, welches die infektiösen Viruspartikel enthält, wird
durch einen Millipore-Filter gefiltert, um abgelöste Produktionszellen zu entfernen,
und diese Medium wird dann dazu verwendet, die Fibroblastenzellen
zu infizieren. Das Medium wird von einer subkonfluenten Platte von
Fibroblasten entfernt und schnell mit dem Medium von den Produktionszellen
ausgetauscht. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium
ersetzt. Wenn der Virustiter hoch ist, dann werden so gut wie alle
Fibroblasten infiziert sein und es ist keine Selektion notwendig. Wenn
der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen
Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie z.B. neo
oder his aufweist.
-
Die
gentechnisch veränderten
Fibroblasten werden dann in den Wirt injiziert, entweder allein
oder nachdem man sie auf Cytodex 3-Mikroträger-Kügelchen bis zur Konfluenz hat
wachsen lassen. Die Fibroblasten produzieren jetzt das Proteinprodukt.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-