DE69636938T2 - HYBRID AUS INTERFERON-alpha UND IMMUNGLOBULIN Fc-FRAGMENT VERBUNDEN DURCH EIN NICHT IMMUNOGENES PEPTID - Google Patents

HYBRID AUS INTERFERON-alpha UND IMMUNGLOBULIN Fc-FRAGMENT VERBUNDEN DURCH EIN NICHT IMMUNOGENES PEPTID Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Interferon-α („IFNα") war eines der ersten Cytokine, welches durch rekombinante DNA-Technologie Herstellung worden ist und von dem gezeigt worden ist, dass es einen therapeutischen Nutzen bei Zuständen wie z.B. Entzündungs-, viralen und malignen Krankheiten hat. Verschiedene IFNα-Präparationen, zu denen solche aus natürlichen Quellen gehören und solche, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt sind, sind bei einer Vielzahl von malignen und viralen Krankheiten eingesetzt worden oder werden derzeit hierfür getestet. IFNα kann die Rückbildung von manchen bestehenden Tumoren bewirken und positive Reaktionen bei manchen viralen Infektionen induzieren. Bisher ist IFNα in vielen Ländern für Indikationen wie z.B.: Kaposi Sarkom, Haarzellenleukämie, malignem Melanom, Basalzellencarcinom, multiplem Myelom, Nierenzellcarcinom, Hepatitis B, Hepatitis C, Feigwarzen, Herpes I/II, Varicella/Herpes zoster und Mycosis fungoides zugelassen oder getestet worden.
  • Die meisten Cytokine, einschließlich IFNα, haben eine relativ kurze Halbwertszeit im Kreislauf, da diese in vivo erzeugt werden, um lokal und transient zu wirken. Die Serum-Halbwertszeit von IFNα beträgt nur etwa zwei bis acht Stunden (Roche Labs. Referon A, Schering Intron A, Physicians' Desk Reference, 47. Auflage, 1993, S. 2006–2008, 2194–2201). Um IFNα als ein wirksames systemisches Therapeutikum einzusetzen, benötigt man relativ hohe Dosen und häufige Verabreichungen. Eine der empfohlenen therapeutischen Strategien für das AIDS-assoziierte Kaposi Sarkom beginnt zum Beispiel mit einer Induktionsdosis von 36 Millionen IE täglich für 10 bis 12 Wochen, die als eine intramuskuläre oder subcutane Injektion verabreicht werden, gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 36 Millionen IE, dreimal pro Woche. (Roche Labs. Referon A, Physicians' Desk Reference, 47. Auf lage, 1993, S. 2006–2008). Solche häufigen parenteralen Verabreichungen sind umständlich und schmerzhaft. Des Weiteren sind toxische Wirkungen, die wahrscheinlich durch die hohe Dosierung hervorgerufen werden, ein Problem für bestimmte Patienten. Es ist über Haut-, neurologische, endokrine und Immun-Toxizität berichtet worden. Um diese Nachteile zu überwinden, kann man das Molekül modifizieren, um dessen Halbwertszeit im Kreislauf zu erhöhen, oder die Formulierung des Arzneistoffs verändern, um seine Freisetzungsdauer zu verlängern. Die Dosierung und die Häufigkeit der Verabreichung können dann verringert werden, während die Wirksamkeit erhöht wird. Es ist berichtet worden, dass Dosen von weniger als neun Millionen Einheiten gut vertragen worden waren, wohingegen Dosen von mehr als 36 Millionen Einheiten schwere Toxizität induzieren und den Zustand des Patienten erheblich verändern können. (Quesada, J.R. et al., J. Clin. Oncol. 4: 234–43 (1988)). Es ist möglich, die toxischen Wirkungen wesentlich zu vermindern, indem man eine neue Form von IFNα herstellt, die im Kreislauf stabiler ist und die geringere Dosen erfordert. Es sind Bemühungen unternommen worden, ein rekombinantes IFNα-Gelatine-Konjugat mit einer verlängerten Retentionsdauer herzustellen (Tabata, Y. et al., Cancer Res. 51: 5532–8 (1991)). Eine Lipid-basierte verkapselte Formulierung von IFNα ist auch in Tieren getestet worden und hat eine verlängerte Freisetzung des Proteins im Peritoneum erreicht (Bonetti, A. und Kim, S. Cancer Chemother. Pharmacol. 33: 258–261 (1993)).
  • Immunglobuline der IgG- und IgM-Klasse gehören zu den am reichlichsten vorhandenen Proteinen in menschlichem Blut. Sie zirkulieren mit Halbwertszeiten, die von einigen Tagen bis zu 21 Tagen reichen. Man hat festgestellt, dass IgG die Halbwertszeiten von mehreren Liganden-bindenden Proteinen (Proteinrezeptoren) erhöht, wenn es dazu eingesetzt wird, rekombinante Hybride zu bilden, wozu das lösliche CD4-Molekül, LHR und der IFNγ-Rezeptor gehören (Mordenti, J. et al., Nature 337: 525–31 (1989); Capon, D.J. und Lasky, L.A. US-Patent Nr. 5,116,964; Kurschner, C. et al., J. Immunol. 149: 4096–4100 (1992)). Das US-Patent Nr. 5,349,053 beschreibt chimäre Moleküle, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie allgemein die Spezifität erhöhen und die Bindungsaffinität von Immunglobulinen über die Superfamilie der Immunglobulingene hinaus verbessern, während sie ihre anderen nützlichen Merkmale beibehalten. Die beschriebenen chimären Moleküle umfassen ein Ligandenmolekül, welches mit einer konstanten Region eines Immun globulinmoleküls verknüpft ist. Das Patent beschreibt insgesamt 30 spezifische oder generische Beispiele für entsprechende Liganden. Das Dokument weist jedoch nicht auf irgendein Mitglied der Interferonfamilie hin. Darüber hinaus beschreibt das US-Patent Nr. 5,349,053 nur chimäre Moleküle, in denen das Ligandenmolekül direkt mit der konstanten Region verknüpft ist, ohne dass ein Peptidlinker verwendet wird.
  • WO 91/16353 beschreibt unter anderem Antikörperderivate, die aus zwei variablen Regionen eines Antikörpers bestehen (z.B. einer VH- und einer VL-Region). Diese zwei Regionen sind miteinander über ein Linkerpeptid verknüpft. Das Dokument liefert Beispiele für Peptidlinker, welche in diesem spezifischen Zusammenhang als geeignet beschrieben werden. Solche Hybride können jedoch insofern Probleme verursachen, als das Peptid am C-terminalen Ende der aktiven Untereinheit und das Peptid am N-terminalen Ende des Fc-Teils am Fusionspunkt eine neue Peptidsequenz erzeugen, die ein Neoantigen ist und die immunogen sein kann. Die Erfindung betrifft ein IFNα-Fc-Hybrid, welches so konstruiert worden ist, dass dieses Problem überwunden und die Halbwertszeit von IFNα verlängert wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein hybrides rekombinantes Protein, welches aus zwei Untereinheiten besteht. Jede Untereinheit umfasst ein menschliches Interferon, bevorzugt IFNα, verbunden durch einen Peptidlinker, der im Wesentlichen aus einer T-Zell-inerten Sequenz aufgebaut ist und mit einem menschlichen Immunglobulin-Fc-Fragment verknüpft ist, bevorzugt mit der γ4-Kette. Die γ4-Kette wird gegenüber der γ1-Kette bevorzugt, weil die erstere nur über geringe oder keine Komplementaktivierungsfähigkeit verfügt.
  • Das C-terminate Ende von IFNα ist mit dem N-terminalen Ende des Fc-Fragments verknüpft. Ein zusätzliches IFNα (oder ein anderes Cytokin) kann sich an das N-terminale Ende von beliebigen anderen ungebundenen Fc-Ketten in dem Fc-Fragment anheften, was zu einem Homodimer für die γ4-Kette führt. Falls es sich bei dem ausgewählten Fc-Fragment um eine andere Kette wie z.B. die μ-Kette handelt, dann führt dies, da die Fc-Fragmente Pentamere mit zehn möglichen Bindungsstellen bilden, zu einem Molekül, in dem Interferon oder ein anderes Cytokin mit jeder von zehn Bindungsstellen verknüpft ist.
  • Die zwei Untereinheiten des Hybrids sind durch ein für T-Zellen immunologisch inertes Peptid verknüpft (z.B. Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 1)). Das Peptid selbst ist immunologisch inaktiv. Die Einfügung dieses Peptids am Fusionspunkt beseitigt die durch das Verbinden der zwei Peptideinheiten generierte Neoantigenität. Das Linkerpeptid erhöht auch die Flexibilität dieser Einheiten und ermöglicht die Beibehaltung der biologischen Aktivität. Dieses relativ lange Linkerpeptid hilft, die mögliche sterische Hinderung von dem Fc-Teil des Hybrids zu überwinden, welcher sich auf die Aktivität des Hybrids störend auswirken könnte.
  • Das Hybrid weist eine viel längere Halbwertszeit als das native IFNα auf. Auf Grund des Linkers ist es auch so konstruiert, um die Möglichkeit der Entstehung eines neuen immunogenen Epitops (eines Neoantigens) an der Stelle zu verringern, die ansonsten der Fusionspunkt des IFNα- und des Immunoglobulin-Fc-Abschnitts wäre.
  • Cytokine sind im Allgemeinen kleine Proteine mit relativ kurzen Halbwertszeiten, welche sich schnell in verschiedenen Geweben verteilen, einschließlich an unerwünschten Stellen. Man nimmt an, dass kleine Mengen mancher Cytokine die Blut-Hirn-Schranke überqueren und in das zentrale Nervensystem eintreten können, wodurch sie schwere neurologische Toxizität auslösen. Das mit dem Fcγ verknüpfte IFNα der vorliegenden Erfindung wäre besonders dafür geeignet, um Hepatitis B oder C zu behandeln, weil diese Produkte eine lange Verweildauer im Gefäßsystem haben (nach intravenöser Verabreichung) und nicht an unerwünschte Stellen vordringen.
  • Das beschriebene spezifische Hybrid kann auch als Modell für das Design und die Konstruktion anderer Cytokin-Fc-Hybride dienen. Derselbe oder ein ähnlicher Linker könnte dazu verwendet werden, um die Möglichkeit der Entstehung eines neuen immunogenen Epitops zu vermindern, während er die Beibehaltung der biologischen Aktivität ermöglicht. Cytokin-Fc-Hybride, in denen Interleukin-2 das Cytokin ist, oder Hybride, welche andere Cytokine einschließen, ließen sich mit denselben Methoden herstellen.
  • Ausführliche Beschreibung der Herstellung und der Nutzung der Erfindung
  • Das erfindungsgemäße Hybridmolekül umfasst eine Interferoneinheit, welche über einen einzigartigen Linker mit einer Immunoglobulin-Fc-Einheit verknüpft ist. Vorzugsweise sind die C-terminalen Enden der zwei Interferoneinheiten einzeln an jedes der beiden N-terminalen Enden des γ4-Fc-Fragments der schweren Kette befestigt, was zu einer Homodimer-Struktur führt. Ein einzigartiges Linkerpeptid, Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 1) wurde erzeugt, um die zwei Untereinheiten zu verbinden. Die vollständige Nucleotidsequenz des bevorzugten γ4-Hybrids (einschließlich des Linkers und des Fc-Teils) ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Der Linker befindet sich an den Aminosäureresten Nr. 189 bis 204.
  • Der Vorteil des Hybrids gegenüber dem nativen Cytokin liegt darin, dass die Halbwertszeit in vivo viel länger ist. Das das Interferon und das γ4-Ketten-Fc-Homodimer umfassende Hybrid ist größer als das native Interferon. Da die Poren in den Blutgefäßen der Leber groß sind, eignet sich diese größere Molekül besser für eine Verwendung bei der Behandlung von Hepatitis, bei der das verursachende Virus hauptsächlich die Leber befällt.
  • Das Linkerpeptid ist so konstruiert, um die Flexibilität der zwei Einheiten zu erhöhen und somit deren biologische Aktivität zu erhalten. Obwohl das Interferon und das Immunglobulin beide menschlichen Ursprungs sind, besteht immer die Möglichkeit, dass ein neues immunogenes Epitop an dem Fusionspunkt der zwei Moleküle generiert wird. Deshalb liegt der andere Vorteil des erfindungsgemäßen, hauptsächlich aus einer T-Zell-inerten Sequenz bestehenden Linkers darin, dass er die Immunogenität an dem Fusionspunkt vermindert. Mit Hinblick auf SEQ ID NO: 7 kann man sehen, dass eine aus den Resten unmittelbar vor Nummer 189 und unmittelbar nach 204 bestehende, neue Sequenz erzeugt werden würde, wenn der Linker (Reste Nummern 189–204) nicht vorhanden wäre. Diese neue Sequenz wäre ein Neoantigen für den menschlichen Körper.
  • Menschliches IFNα leitet sich von einer Familie von mehreren verschiedenen Genen ab. Mehr als 24 Arten sind bisher auf Grund von Gen- und Proteinsequenzdaten identifiziert worden. Sie unterscheiden sich voneinander durch irgendeine Zahl zwischen einigen wenigen bis maximal 35 Aminosäuren. Die meisten Arten weisen eine Signalpeptidsequenz von 23 Aminosäureresten und eine reife Aminosäuresequenz von 166 Aminosäureresten auf (Goeddel, D.V. et al., Nature 290: 20–26 (1981); Weissmann, C. und Weber, H. Prog. Nuc. Acid Res. Mol. Biol. 33: 251–300 (1986); Zoon, K.C. Interferon 9: 1–12 (1987)).
  • IFNα2 (auch IFNαA genannt) stellt eine der am intensivsten untersuchten Interferonarten dar. Die rekombinante Version von IFNα2 ist seit mehreren Jahren als Therapeutikum eingesetzt worden. Zwei rekombinante IFNα2-Produkte, IFNα2a und IFNα2b, sind jetzt im Handel erhältlich. Sie unterscheiden sich nur in einer Aminosäure an Position 23 und es gibt keinen wesentlichen Unterschied zwischen diesen in der biologischen Aktivität (von Gabain, A. et al., Eur. J. Biochem. 190: 257–61 (1990)).
  • IFNα2a wurde als Fusionspartner für das erfindungsgemäße Interferonhybrid ausgewählt, obgleich das IFNα2b oder irgendeine andere Interferonart (einschließlich IFNβ) genauso gut eingesetzt werden können. Es ist auch möglich, ähnliche Konstrukte mit anderen Cytokinen herzustellen, wie z.B. Interleukin-1 oder Interleukin-2. Man könnte den gleichen Linker verwenden oder man könnte diesen durch einen anderen ersetzen, welcher nicht immunogen ist und welcher die biologische Aktivität des Konstrukts aufrechterhält.
  • Die Vorteile der γ4-Kette als dem Fc-Teil in dem Hybrid bestehen darin, dass diese im menschlichen Kreislauf stabil ist. Die γ4-Kette vermeidet (im Gegensatz zur γ1-Kette) auch das breite Spektrum sekundärer biologischer Eigenschaften wie z.B. die Komplementfixierung und die Antikörper-abhängige Zell-vermittelte Cytotoxizität (ADCC), welche unerwünschte Eigenschaften darstellen können.
  • Die cDNA von IFNα2a lässt sich durch reverse Transkription und PCR gewinnen, wobei RNA verwendet wird, die aus Leukocyten extrahiert wird, welche IFNα exprimieren. Eine solche Zelllinie, KG-1, kann man von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland beziehen, wo sie unter der Nr. CCL-246 geführt wird. In der verwendeten Prozedur für die Herstellung des erfindungsgemäßen Hybrids wurden die Zellen vor der RNA-Extraktion mit Sendai-Virus herausgefordert, um deren Transkription von Interferonen zu erhöhen (Cantell, K. et al., Methods in Enzymology 78A: 29–38, Academic Press (1981)).
  • Wie vorstehend erwähnt, stellt IFNα eine Kollektion von IFN-Arten dar und jede Zelle exprimiert gleichzeitig mehrere verschiedene IFNα-Unterarten. Die DNA-Sequenzhomologie zwischen diesen Arten ist so hoch, dass eine RT-PCR wahr scheinlich eine Gruppe von diesen anstatt eines spezifischen Interferons amplifizieren würde. Um spezifisch die IFNα2a-cDNA zu erhalten, wurden die PCR-Primer so konstruiert, dass die letzten Nucleotide der zwei Primer an Positionen endeten, an denen die codierten Aminosäuren für IFNα2a spezifisch sind. Dabei handelt es sich um die Positionen S22 bzw. 161 (siehe Zoon, K.C. Interferon 9: 1–12 (1987)).
  • Indem man eine überlappende PCR-Technik verwendet (Daugherty, B.L. et al., Nucl. Acids Res. 19: 2471–6 (1991)), kann man leicht zwei Genabschnitte an jeder gewünschten Stelle ligieren. Ein Nachteil der PCR-Amplifikation ist jedoch die relativ hohe Mutationsrate (Saiki, R.K. et al., Science 239: 487 (1988)). So wurde auch eine DNA-Sequenzierung durchgeführt, um jeden mittels PCR gewonnenen DNA-Abschnitt auf die Abwesenheit von Mutationen zu überprüfen. Eine Sequenzierung kann mühsam und zeitaufwändig sein, wenn die Größe des Abschnitts über 1 kb ist, wie das bei der Volllängen-cDNA von IFNα-Fc der Fall ist. Man kann jedoch eine Restriktionsendonuclease-Stelle, BamHI, in die Nucleotidsequenz des Linkers einbauen, ohne dessen Aminosäuresequenz zu verändern. Diese Stelle liegt zwischen den Nucleotiden Nummer 15 und 16 in SEQ ID NO: 1.
  • Die zwei Genabschnitte aus der PCR können separat in Clonierungsvektoren cloniert werden. Dies macht die DNA-Sequenzierung einfacher und schneller, da beide Abschnitte nur ein paar hundert Basenpaare lang sind. Sobald die Clone mit den richtigen DNA-Sequenzen identifiziert sind, können die zwei Genabschnitte über die BamHI-Stelle miteinander verknüpft werden. Eine zweite Runde einer überlappenden PCR und eine anschließende DNA-Sequenzierung des Volllängen-Abschnitts sind nicht notwendig.
  • Es gibt mehrere Wege, das rekombinante Protein in vitro zu exprimieren, einschließlich in E. coli-, in Baculovirus-, in Hefe-, in Säugerzellen- und in anderen Expressionssystemen. Das prokaryontische System, E. coli, ist nicht in der Lage, die posttranslationellen Modifikationen wie z.B. Glycosylierung auszuführen. Aber dies stellt wahrscheinlich kein schwerwiegendes Problem für das IFNα-Fc-Hybrid dar, da das native IFNα- und das Immunoglobulin γ4-Molekül nicht stark glycosyliert sind.
  • Des Weiteren ist es berichtet worden, dass rekombinantes IFNα ohne jegliche Glycosylierung seine biologische Aktivität beibehält (Baron, E. und Narula, S. Bio/technology 10: 179–190 (1990)). Allerdings kann die Aufreinigung von rekombinantem Protein aus E. coli-Lysat schwierig sein. Die von E. coli exprimierten fremden Proteine aggregieren häufig und bilden unlösliche Einschlusskörper. So ist üblicherweise eine Solubilisierung und anschließende Rückfaltung der Einschlusskörper erforderlich (Schein, C.H. und Noteborn, H.M. Bio/technology 6: 291–294 (1988); Wilkinson, D.L. und Harrison, R.G. Bio/technology 9: 443–448 (1991)).
  • Das Hefe-Expressionssystem Pichia pastoris (Invitrogen, San Diego, KA) überwindet einige der Probleme, auf die man trifft, wenn man ein bakterielles System verwendet. Es ergibt gewöhnlich eine hohe Ausbeute und besitzt die Fähigkeit, verschiedene posttranslationelle Modifikationen auszuführen. Die exprimierten fremden Proteine können in den Kulturüberstand sezerniert werden, in dem sich nicht viele andere Proteine befinden, was die Protein-Aufreinigung und das Hochfahren des Prozesses einfacher macht. Dieses System wurde zuerst ausprobiert, um entweder das IFNα-Fc-Hybrid oder das Wildtyp-IFNα2a zu exprimieren. Leider stellte man bei SDS-PAGE fest, dass sezerniertes IFNα-Fc teilweise abgebaut war, wohingegen die beim IFNα2a alleine nicht der Fall war. Man nahm an, dass der Abbau durch Protease-Aktivitäten verursacht wurde, die, wie von Scorer, C.A. et al., Gene 136: 111–9 (1993) berichtet, in dem Hefe-Expressionssystem vorhanden sind. Der relativ schwache Punkt in der Gelenkregion stellt das mögliche Ziel für die Proteasen dar.
  • Ein Säugerzellen-Expressionssystem für das IFNα-Fc-Hybrid wurde ebenfalls ausprobiert. Es wurde der Säuger-Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) benutzt, der einen CMV-Promotor und ein NEO-Reistenzgen enthält. Die Wirtszellen, NSO-Zellen, wurden mit Hilfe der Elektroporationsmethode mit dem pcDNA3/IFNα-Fc-Expressionsvektor transfiziert. Die Zellen wurden einer Selektion mit G418 in einer Konzentration von 0,8 mg/ml unterzogen. Die IFNα-Fc exprimierenden Clone wurden mittels ELISA identifiziert. Der Hybrid wurde in diesem System erfolgreich exprimiert und es gab keinen Abbau.
  • Es gibt mehrere Vorteile bei diesem Säuger-Expressionssystem. Erstens wird das rekombinante Protein in den Kulturüberstand sezerniert und es gibt keine Bildung von Aggregaten, wodurch die Aufreinigung erleichert wird. Ein Chromatographieschritt mit einer Protein A-Säule ergibt ein aufgereinigtes IFNα-Fc-Protein. Auch besitzt das in diesem System hergestellte Protein ein Glycosylierungsmuster, welches dem natürlichen Protein sehr ähnlich ist, da es von Säugerzellen exprimiert wird. Des Weiteren ist eine native IFNα2a-Signalpeptidsequenz in dem Expressionsvektor enthalten. Daher hat das von den Zellen sezernierte Protein ein authentisches N-terminales Ende, wohingegen es in den E. coli – oder Hefe-Expressionssystemen entweder kein Signalpeptid gibt oder ein nicht-IFNα-Signalpeptid verwendet wird. So oder so bringt dies (einen) zusätzliche(n) künstliche(n) Aminosäurerest(e) am N-terminalen Ende des rekombinanten IFNα-Fc ein.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist die Aufreinigung des rekombinanten IFNα-Fc-Proteins aus dem Kulturüberstand relativ unkompliziert. Das Protein kann leicht mit einer Reinheit von mehr als 90%, wie durch SDS-PAGE beurteilt, durch einen Schritt einer Affinitäts-Chromatographie mit einer Protein A-Säule gewonnen werden.
  • Es gibt mehrere verfügbare Test-Methoden zur Messung der biologischen Aktivität von IFNα. Unter Verwendung eines antiviralen Tests ist gezeigt worden, dass das Hybrid von SEQ ID NO: 7 eine spezifische Aktivität aufweist, die etwa fünf- bis zehnmal höher ist als die eines verwandten IFNα-Fc-Hybrids, in dem das Linkermolekül die Sequenz Gly Gly Ser Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 2) besaß und der Fc-Teil des Hybrids von menschlichem IgG1 statt IgG4 abgeleitet war. Nichtsdestotrotz war die biologische Aktivität des in SEQ ID NO: 7 gezeigten Hybrids, obgleich sie gegenüber dem ähnlichen Hybrid wesentlich verbessert war, immer noch niedriger als die des nativen IFNα. Es ist jedoch zu erwarten, dass dieses Hybrid eine längere Halbwertszeit als das native IFNα in vivo besitzt. Diese Erwartung gründet sich auf Ergebnisse, die zeigen, dass das verwandte IFNα-Hybrid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Linkersequenz und einem IgG1-Fc-Teil in einer pharmakokinetischen Studie in einem Maus-Modell eine viel längere Halbwertszeit zeigte als das native IFNα.
  • Da zu erwarten ist, dass das Hybrid von SEQ ID NO: 7 eine längere Halbwertszeit in vivo besitzt als das native IFNα, ist zu erwarten, dass dieses neue Hybrid für klinische Anwendungen gegenüber dem nativen IFNα bevorzugt wird, obwohl dessen spezifische Aktivität geringer ist. Dies ist so, weil C × t (die Fläche unter der Konzentration gegen die Zeitkurve) auf Grund der längeren Halbwertszeit bis zu mehrere hundert Male größer wäre als für natives IFNα. Dies bedeutet, dass bei einer gleich hohen molaren Dosierung des nativen IFNα und des Hybrids letzteres eine mehrere hundertfach erhöhte Exposition gegenüber IFNα bieten würde, was eine enorm erhöhte Wirksamkeit bei derselben Dosierung und weniger häufige Verabreichungen zur Folge hat.
  • Bei der Messung der spezifischen Aktivität wird eine molare Dosierung bevorzugt, anstatt die Aktivität als Einheiten pro Masse des Proteins auszudrücken. Dies ist so, weil Interferone ihre Wirkung durch die Bindung an ihre spezifischen Rezeptoren ausüben, was in direkter Relation zur Anzahl der vorhandenen Moleküle steht. Zudem ist das Molekulargewicht des IFNα-Fcγ4 mehr als fünffach höher als das des Wildtyp-IFNα2a, das 20 kD beträgt. Wenn man dies berücksichtigt, liefert das Messen der Aktivität in Einheiten/μMol anstatt in Einheiten/mg einen besseren Vergleich der spezifischen Aktivität.
  • Beispiel 1: Clonierung der menschlichen IFNα-cDNA und Konstruktion des IFNα-Fc-Expressionsvektors
  • 6 × 106 KG-1-Zellen (ATCC 246) wurden mit 200 Einheiten Sendai-Virus über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und gründlich mit PBS gewaschen. Die Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des RNA-ZOL-RNA-Isolierungskits (BIOTEX, Houston, TX) extrahiert, wobei man der vom Hersteller gelieferten Prozedur folgte. Der erste Strang der cDNA wurde durch reverse Transkription unter Verwendung von AMV-reverser Transkriptase mit Oligo-dT als 3'-Primer durch Inkubation in 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 60 mM KCl und 6 mM MgCl2 für 1 Stunde bei 42°C synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde direkt als Matrize für eine PCR eingesetzt, um die IFNα-cDNA zu amplifizieren. Der 5'-Primer für die PCR enthielt eine HindIII-Stelle und die codierende Sequenz für die ersten 21 Aminosäuren von dem IFNα2a-Leaderpeptid (SEQ ID NO: 3). Der 3'-Primer enthielt die Sequenz, die einen Teil des Linkers (SEQ ID NO: 1) und die letzten fünf Aminosäuren von IFNα2a codierte, sowie eine in die Linkersequenz (SEQ ID NO: 4) integrierte BamHI-Stelle. Der PCR-Puffer enthielt 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 0,1 mMol von jedem dNTP, 0,5 μMol von jedem Primer, 5 μl RT-Reaktionsgemisch und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die PCR-Bedingungen waren 94°C (1 Min.), 55°C (2 Min.) und 72°C (2 Min.) für 40 Zyklen auf einem GeneAmp 9600-PCR-System (Perkin-Elmer, Norwalk, CT).
  • Die cDNA des menschlichen Immunglobulins γ4-Fc wurde durch reverse Transkription und PCR auf dieselbe Weise, wie vorstehend beschrieben, erhalten. Die RNA wurde aus menschlichen B-Zellen der Mandel extrahiert. Der 5'-Primer hatte die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Sequenz. Der 3'-Primer hatte die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Sequenz.
  • Die zwei PCR-amplifizierten DNA-Abschnitte wurden an den HindIII/BamHI-Stellen bzw. an den BamHI/EcoRI-Stellen in pUC18-Vektoren cloniert. Nachdem deren DNA-Sequenzen durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Kits von USB (Cleveland, Ohio) bestätigt worden waren, wurden die zwei Abschnitte über die BamHI-Stelle durch eine Zweitrundenclonierung miteinander ligiert. Die Volllängen-cDNA von IFNα-Fc wurde dann über die HindIII- und EcoRI-Stellen in einen Säuger-Expressionsvektor, pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, KA), eingesetzt.
  • Beispiel 2: Expression von IFNα-Fc in Säugerzellen
  • 107 NSO-Zellen wurden mit 10 μg linearisiertem pcDNA3/IFNα-Fc-Plasmid in 0,8 ml PBS gemischt und für 5 Min. auf Eis gehalten. Es wurde dann eine Elektroporation bei 200 V, 960 μF unter Verwendung eines Gene Pulser (BioRad, Hercules, KA) durchgeführt. Die Zellen wurden dann für 20 Minuten zurück auf Eis gestellt und in 10 ml mit 2% FKS („FCS", fötales Kälberserum) supplementiertem DMEM auf eine 100 mm-Gewebekulturplatte transferiert. Nach einer Inkubation für 2 Tage bei 37°C wurden die Zellen gewaschen und in dem gleichen Medium resuspendiert. 0,6 mg/ml G 418 wurden hinzugefügt, um die Selektion zu starten. Die Zellen wurden in acht Mikroplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Kolonien erschienen nach einer Woche und waren nach zwei Wochen bereit für die Durchmusterung. Die Überstände von jeder Vertiefung mit einer einzelnen wachsenden Kolonie wurden gesammelt. Das IFNα-Fc im Überstand wurde quantitativ mit Hilfe eines ELISA-Tests bestimmt, wobei Ziege-anti-Mensch-IgG und anti-Mensch-Fc verwendet wurden, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert waren. Die Clone mit höheren ELISA-Ablesewerten und einer kleineren Koloniegröße wurden für die Subclonierung ausgewählt. Diese Kolonien wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen transferiert und mit einem Medium versorgt, welches G 418 enthielt. Der Clon mit dem höchsten Sekretionsspiegel wurde expandiert und an das Wachstum in einer Spinnerflasche angepasst. Für eine Präparation in großem Maßstab wurde der Kulturüberstand gesammelt und durch eine mit PBS äquilibrierte Protein A-Agarosesäule laufen gelassen. Das an Protein A gebundene Protein wurde mit 50 mM Citronensäure (pH 3,0) eluiert und durch Lyophilisierung aufkonzentriert.
  • Beispiel 3: Charakterisierung des IFNα-Fc-Hybrids
  • Die Reinheit des aus dem NSO-Kulturmedium isolierten rekombinanten Proteins wurde mittels SDS-PAGE und Western-Blot untersucht. Es war nur eine Proteinbande auf der geblotteten Membran zu sehen, die mit Ponceau S auf Gesamtprotein angefärbt worden war, was die Homogenität der Proteinpräparation zeigt. Das scheinbare Molekulargewicht dieses Proteins liegt unter reduzierenden Bedingungen bei ungefähr 55 kD und bei 110 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen, was exakt die vorhergesagte Größe für das IFNα-Fc-Hybrid ist. Die Verdopplung seines scheinbaren Molekulargewichts unter nicht-reduzierenden Bedingungen weist darauf hin, dass der Hybrid in Form eines Dimers vorliegt. Das rekombinante Protein kann sowohl von anti-Fc- als auch von anti-IFNα-Antikörpern erkannt werden, was bestätigt, dass er aus zwei Untereinheiten besteht, dem IFNα und dem Fc-Fragment.
  • Bei dem Bioaktivitätstest für IFNα-Fc handelte es sich um einen antiviralen Test. Speziell handelte es sich bei der verwendeten Testmethode um eine Modifikation des von Robert M. Friedman et al. (Measurement of antiviral activity induced by interferons α, β und γ, Current Protocols in Immunology, 1994, S. 6.9.1–6.9.8) beschriebenen Protokolls. In Kürze, menschliche Lungencarcinomzellen (A 549, ATCC #CCL 185) wurden in einer Dichte von 40.000 Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Seriell 1:2 verdünntes IFNα-Fc-Hybrid oder natives IFNα (NIH # Gxa01-901-535) wurden hinzugefügt und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Jede Probe wurde im Dreifachansatz getestet. Das Kulturmedium wurde gegen ein frisches ausgetauscht, das Encephalomyocarditis-Virus (ATCC #VR 129B) in einer Konzentration von etwa 0,1 MOI/Zelle enthielt, und für weitere 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die toten Zellen wurden weggewaschen, indem heftig mit PBS auf und ab pipettiert wurde. Die anhaftenden Zellen wurden mit 2% Formaldehyd fixiert und mit Giemsa-Farbstoff angefärbt. Die Platten wurden mit Leitungswasser abgespült und trocknen gelassen. Die gefärbten Zellen wurden in Methanol aufgelöst und die Proben wurden bei 595 nm spektrophotometrisch gemessen. Die antivirale Aktivität des IFNα-Fc-Hybrids wurde berechnet, indem man sie mit dem IFNα-Standard verglich, und man stellte fest, dass sie etwa 30 bis 60% der Aktivität des IFNα-Standards aufwies.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die hierin verwendeten Begriffe und Ausdrücke nur beispielhaft und nicht beschränkend sind und dass der Umfang der Erfindung nur in den Ansprüchen definiert ist, welche folgen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001

Claims (7)

  1. Hybridmolekül, umfassend ein Interferonmolekül, dessen C-terminales Ende über einen Peptidlinker mit dem N-teminalen Ende eines Immunglobulin-Fc-Fragments verbunden ist.
  2. Hybridmolekül nach Anspruch 1, wobei das Interferonmolekül IFNα2a, IFNα2b oder IFNβ ist.
  3. Hybridmolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Peptidlinker die Sequenz Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID No. 1) umfasst.
  4. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein anderes Interferonmolekül an seinem C-terminalen Ende über einen anderen Peptidlinker mit dem N-terminalen Ende einer der Ketten des Immunglobulin-Fc-Fragments verbunden ist und dadurch ein Homodimer gebildet wird.
  5. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fc-Fragment ein γ4-Kette-Fc-Fragment ist.
  6. Arzneimittel, umfassend Hybridmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
  7. Verwendung des Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hepatitis, Haarzell-Leukämie, multiplem Myelom oder anderen Krebsen oder viralen Erkrankungen.
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