DE69637382T2 - Interferon polymer-konjugate und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Interferon polymer-konjugate und verfahren zu ihrer herstellung Download PDF

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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf langwirkende Interferon enthaltene Präparationen. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Zusammensetzungen, die Interferon-Konjugate enthalten, welche einen einzelnen Polymerstrang enthalten.
  • Ein Konjugieren von biologisch aktiven Proteinen an Polymere wurde vorgeschlagen, um in vivo eine oder mehrere der Eigenschaften der Zirkulationsdauer, Wasserlöslichkeit oder Antigenität zu verbessern. Einige der Anfangskonzepte der Kopplung von Peptiden oder Polypeptiden an Polyethylenglykol (PEG) und ähnliche wasserlösliche Polymere sind im US-Patent 4,179,337 offenbart.
  • Konjugate werden durch Umsetzen eines biologisch aktiven Materials mit einem mehrfach molaren Überschuß eines Polymers, das so modifiziert wurde, daß es terminale Verknüpfungsgruppen enthält, gebildet.
  • Insulin und Hämoglobin waren unter den ersten therapeutischen Mitteln, die konjugiert wurden. Diese relativ großen Polypeptide enthalten mehrere freie ε-Amino-Bindungsstellen. Mehrere Polymere konnten ohne signifikanten Verlust an biologischer Aktivität gebunden werden.
  • Der Konjugationsprozeß ist allerdings nicht ohne Komplikationen. Eine übermäßige Polymerreaktion oder Reaktion unter Verwendung von molaren Überschüssen an Polymeren über bestimmte Verhältnisanteile hinaus kann in inaktiven Konjugaten resultieren. Es resultieren oft Probleme, wenn eine aktive Stelle einer therapeutischen Gruppierung (d. h. wo Gruppen, die mit Bioaktivität assoziiert sind, gefunden werden) durch Polymerbindung blockiert wird. Dieses Problem kann schwierig zu vermeiden sein, da das Polymer und das Protein typischerweise in Lösungs-basierten Reaktionen verknüpft werden. Es wurde eine Vor-Blockierung der aktiven Stellen mit reversiblen Materialien, z. B. Pyridoxalphosphat, vorgeschlagen, allerdings waren die Resultate inkonsistent. Die Probleme sind bei Proteinen mit relativ niedrigem Molekulargewicht und bei Peptiden besonders akut. Diese bioaktiven Materialien haben oft wenige Bindungsstellen, die nicht mit Bioaktivität assoziiert sind.
  • Interferone sind ein besonderes Beispiel für Proteine, die aus verbesserten Polymerkonjugationstechniken Nutzen ziehen könnten. Bereits früher wurden verschiedene Polymer-Interferon-Konjugate vorgeschlagen. Siehe zum Beispiel die US-Patente 4,766,106 und 4,917,888 , welche inter alia beta-Interferon konjugiert mit Methoxypolyethylenglykol-N-succinimidylglutarat oder Methoxypolyethylenglykol-N-succinimidylsuccinat beschreiben. Die Konjugationsreaktionen wurden unter Verwendung von relativ hohen molaren Überschüssen (das 10-, 20- und 50-fache) des Polymers durchgeführt. US-Patent Nr. 5,382,657 offenbart auch Interferon-Konjugate. In dieser Referenz werden allerdings die Konjugate unter Verwendung von mono-aktivierten, alpha-Alkyl-substituierten PEGs gebildet, und das Polymer wurde in molarem Überschuß mit dem Interferon umgesetzt.
  • Die europäische Patentanmeldung mit der Publikations-Nr. 0 236 987 beschreibt die Umsetzung von alpha- und gamma-Interferonen mit hohen molaren Überschüssen von Alkylimidoester-aktivierten Polyethylenglykolen. Die europäische Patentanmeldung mit der Publikations-Nr.0 510 356 beschreibt ein Konjugieren von alpha-Interferon mit Pyridinylcarbonyl- und Thiocarbonyl-aktiviertem PEG. In beiden Fällen beinhalteten allerdings die resultierenden Konjugate verschiedene Spezies, die eine weite Vielzahl von pegylierten Spezies enthalten, einschließlich einer substantiellen Menge, die mehr als einen Polymerstrang enthält.
  • WO 95/13090 beschreibt eine Umsetzung eines alpha-Interferons mit einem im wesentlichen nicht-antigenen Polymer in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels. Das Polymer wird bezüglich des alpha-Interferons in einem molaren Überschuß eingesetzt.
  • Trotz der oben beschriebenen Offenbarungen waren die Interferon-Polymerkonjugate inakzeptabel. Einer der Hauptnachteile war, daß der Level der beibehaltenen Interferonaktivität zu niedrig war. Außerdem ist die Isolierung der besonders erwünschten konjugierten Spezies aus Reaktionsgemischen, die konjugierte Spezies enthalten, welche variierende Grade der Polyethylenglykol-Substitution haben, zeitaufwendig und ineffizient.
  • Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit diesen Unzulänglichkeiten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von langwirkenden Interferon-enthaltenden Zusammensetzungen bereit. Das Verfahren umfaßt:
    Die Reaktion eines Mols eines Interferons mit 0,125 bis 0,75 mol eines bis-aktivierten, im wesentlichen nicht-antigenen Polymers unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine kovalente Konjugation des Interferons und des Polymers ohne substantiellen Verlust an Interferon-Aktivität herbeizuführen und eine Reaktionsmischung zu bilden, die Interferon-Polymerkonjugate enthält, welche vornehmlich Mono-Interferon-Polymerkonjugate und Bis-Interferon-Polymerkonjugate sind. In bevorzugten Aspekten dieser Ausführungsform liegt das bis-aktivierte Polymer in Mengen von 0,25 bis 0,75 mol pro Mol Interferon vor. Noch weiter bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen eine Umsetzung von etwa 0,25 bis etwa 0,5 mol an bis-aktiviertem Polymer pro Mol Interferon.
  • Das im wesentlichen nicht-antigene Polymer ist vorzugsweise ein Polyalkylenoxid, zum Beispiel ein Polyethylenglykol, das ein Molekulargewicht von 600 bis 60 000 hat. Es können auch andere im wesentlichen nicht-antigene Polymere eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Aspekte der Erfindung umfassen homobifunktionelle aktivierte Polymere, zum Beispiel Bis-succinimidylcarbonat-PEG. Andere eine geeignete Verknüpfung bildende Gruppierungen umfassen Abgangsgruppen, zum Beispiel Succinimidyl-aktivierte Ester, Amine usw.
  • Weitere Aspekte dieser Ausführungsform umfassen die weiteren optionalen Schritte einer Isolierung der Mono-Interferon-Polymerspezies und Bis-Interferon-Polymerspezies in der Reaktionsmischung von dem nicht-umgesetzten Interferon oder Polymer. Das Verfahren kann auch den zusätzlichen Schritt des Trennens der Mono-Interferon-Spezies von den Bis-Interferon-Spezies umfassen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt das Durchführen der Konjugationsreaktion des Interferons und des Polymers in der Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Interferon-Polymerkonjugat-enthaltende Zusammensetzungen bereitgestellt. Die Zusammensetzungen können als Teil einer pharmazeutisch verträglichen Lösung eingeschlossen sein, welche eine Mischung aus Mono-Interferon-Polymerkonjugaten und Bis-Interferon-Polymerkonjugaten enthält. Die in der Zusammensetzung enthaltenen Interferone sind kovalent mit dem nicht-antigenen Polymer, zum Beispiel durch eine Carbamat- oder Amid-Bindung, verknüpft. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten die Zusammensetzungen in erster Linie Mono-Interferon-Polymerkonjugate und Bis-Interferon-Polymerkonjugate.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen Interferone aller Typen, zum Beispiel alpha-, beta- und gamma-Interferone wie auch alle Subtypen der vorstehend genannten. alpha-Interferone sind allerdings bevorzugt.
  • Die Interferon-Polymerkonjugate, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, unterscheiden sich von Interferon-Konjugaten des Standes der Technik dahingehend, daß im wesentlichen alle der Mono- und Bis-Interferon-Spezies einen einzelnen Polymerstrang kovalent an das Interferon gebunden enthalten. Dies steht im Gegensatz zu anderen Interferon-Polymerkonjugaten, welche mit molaren Überschüssen von mono-aktiviertem Polymer hergestellt werden und welche daher mehrere Spezies, einschließlich eines signifikanten Teils mit mehr als einem Polymerstrang pro Interferon, enthalten. Solche Multipolymer-konjugierten Interferonspezies haben bewiesen, daß sie geringe Level an beibehaltener Interferonaktivität haben.
  • Die durch das Verfahren der Erfindung erhältlichen Produkte können zur Behandlung von auf Interferon ansprechende Zustände bei Säugern verwendet werden. Die Behandlungsverfahren umfassen eine Verabreichung einer wirksamen Menge der hierin beschriebenen Zusammensetzungen, die die Interferon-Konjugate enthalten, an Säuger, die eine solche Therapie benötigen.
  • Als Resultat der vorliegenden Erfindung werden hochaktive, langwirkende Interferon-enthaltende Konjugate bereitgestellt. In bevorzugten Ausführungsformen stellen die Konjugate infolge des im wesentlichen gleichmäßigen Vorliegens eines einzelnen Polymerstrangs pro Konjugat eine vorhersagbare gleichmäßige Interferonaktivität bereit.
  • Ein weiteres Merkmal der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist das, daß die erhöhte Kreislaufzeit mit nur geringen Verlusten bei der beibehaltenen Interferonaktivität erreicht wird. Dies wird erreicht, indem Interferon-Konjugate gebildet werden, die sorgfältig kontrollierte Verhältnisse von bis-aktiviertem Polymer zu dem Interferon verwenden, so daß die meisten Polymere in einer weniger statistischen Art an Interferon-Lysine binden und so eine gleichmäßige Interferon-Bioaktivität maximieren. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt weitere Vorteile gegenüber den Verfahren des Standes der Technik bereit. Trotz einer Verwendung von bis-aktivierten Polymeren zur Herbeiführung einer Bindung des Polymers an das Interferon wird die Vernetzung zu hochmolekulargewichtigen Spezies, die Ketten aus alternierendem Polymer und Interferon umfassen, von der erwartet wird, daß sie resultiert, unerwartet und im wesentlichen durch die genauen Verhältnisse der entsprechenden Reaktanden vermieden.
  • Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "bis" bzw. "Bis" so verstanden werden, daß er sich auf Polymere bezieht, die sowohl alpha- als auch omega-terminale Gruppierungssubstitutionen haben. "Bis-aktivierte Polymere" soll so verstanden werden, daß der Ausdruck Polymere mit alpha- und omega-terminalen Gruppierungen umfaßt, die als geeignete Abgangsgruppen während Konjugations(Verknüpfungs-)reaktionen mit Interferonen dienen.
  • "Bis-Interferon-Polymerkonjugate" soll so verstanden werden, daß der Ausdruck einen einzelnen Strang von im wesentlichen nicht-antigenem Polymer mit zwei Molekülen Interferon kovalent gebunden, eines am alpha-Ende und eines am omega-Ende des Polymers, beschreibt. "Mono-Interferon-Polymerkonjugate" soll so verstanden werden, daß ein Konjugat beschrieben wird, das ein einzelnes Interferon-Molekül kovalent an ein Ende eines einzelnen Strangs von im wesentlichen nicht-antigenem Polymer gebunden enthält.
  • Der Ausdruck "auf Interferon ansprechender Zustand" soll so verstanden werden, daß er alle Erkrankungszustände, zum Beispiel Virusinfektionen, Krebsarten oder verwandte Zustände umfaßt, welche aus einer exogenen Interferonverabreichung Nutzen ziehen. Details bezüglich solcher Zustände werden unten in Abschnitt 6 bereitgestellt.
  • Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die folgende Beschreibung verwiesen und ihr Umfang wird in den beigefügten Ansprüchen aufgezeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • 1. Interferone
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt Interferone (IFNs) aller Typen. Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren können alpha-, beta- und gamma-Interferone wie auch Subtypen der vorstehend genannten umfassen. Die Interferone können aus einer Säugerquelle, zum Beispiel Menschen-, Rinder- oder Schweineproben, zum Beispiel Geweben, isoliert oder extrahiert werden. Die Interferone können auch unter Verwendung von Rekombinationstechniken, zum Beispiel solchen, die synthetische Gene verwenden, welche in E. coli exprimiert werden, und anderer Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Pestka, "Interferon α" in Human Cytokines, Blackwall Scientific Publications 1–16 (1992). alpha-Interferone (αIFN) sind für die Konjugate der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Ein besonders bevorzugtes αIFN ist IFNα-2b, ein rekombinant hergestelltes Produkt der Schering Plough Corp., Madison, NJ. Alternative Ausführungsformen der Erfindung umfassen IFNs, die nicht vollständig autolog zu solchen des Säugers, der einer Behandlung bedarf, sind, aber dennoch verwendet werden können, da die polymere Modifikation die antigenen Reaktionen, wenn sie überhaupt auftreten, ausreichend reduziert. Ein Schlüssel ist allerdings, daß das nicht-autologe IFN eine ausreichende Bioaktivität oder IFN-Wirkung, zum Beispiel antivirale Aktivität, im Target-Säuger hat. Andere Substanzen, einschließlich IFN-Fraktionen oder Predecessor-Polypeptide, können in den Konjugaten der vorliegenden Erfindung ebenfalls enthalten sein. Der Ausdruck "IFN-Wirkung bei Säugern", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine in vivo-Interferonaktivität, die der entspricht, die mit unmodifizierten IFNs beobachtet wird. Diese Substanzen werden hergestellt, indem Techniken eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel Gewebekultur, Extraktion aus Tierquellen oder DNA-Rekombinationsmethologien. Transgene Quellen für IFN und verwandte Gruppierungen werden ebenfalls in Betracht gezogen. Solche Materialien werden von transgenen Tieren, zum Beispiel Mäusen, Meerschweinchen, Ziegen, Kühen usw., erhalten, bei denen das IFN-Protein in Milch, Blut oder Geweben exprimiert wird. Es ist auch einzusehen, daß die Rekombinationstechniken auch eine Glykosylierungsstelle für eine Addition einer Kohlenhydratgruppierung an das rekombinant abgeleitete Polypeptid enthalten können. Das Verfahren, durch welche das IFN für die Konjugate der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist nicht auf die hierin beschriebenen beschränkt.
  • αIFN hat gegenüber anderen Interferon-Spezies, zum Beispiel β- und γ-IFNs, bestimmte Vorteile. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung sind die αIFNs besonders bevorzugt, und zwar wegen ihrer biochemischen und serologischen Eigenschaften, zum Beispiel der dokumentierten antiviralen Eigenschaften und der effektiven Blutstromdiffusion. Es ist allerdings zu verstehen, daß die Erfindung alle Typen der Interferone umfaßt.
  • 2. Nicht-antigene Polymere
  • Um die Mono- und Bis-Interferon-Konjugate der vorliegenden Erfindung zu bilden, werden Polymere, zum Beispiel Polyalkylenoxide) (PAOs) in aktivierte Formen übergeführt, wobei dieser Begriff dem Fachmann bekannt ist. Auf diese Weise wird eine und werden vorzugsweise beide der terminalen Polymer-Hydroxyl-Endgruppen (d. h. die alpha- und omega-terminalen Hydroxyl-Gruppen) in reaktive funktionelle Gruppen umgewandelt, welche eine kovalente Konjugation erlauben. Dieses Verfahren wird häufig als "Aktivierung" bezeichnet und das Produkt wird als ein "aktiviertes Poly(alkylenoxid)" bezeichnet. Polymere, die sowohl alpha- als auch omega-Verknüpfungsgruppen enthalten, werden als bis-aktivierte Polyalkylenoxide bezeichnet. Andere im wesentlichen nicht-antigene Polymere werden in ähnlicher Weise "aktiviert" oder funktionalisiert. Unter den im wesentlichen nicht-antigenen Polymeren sind bis-aktivierte Polyalkylenoxide (PAOs), zum Beispiel Bis-Polyethylenglykole, bevorzugt. Darüber hinaus sind homobifunktionelle bis-aktivierte Polymere zum Beispiel Bis-Succinimidylcarbonat-aktiviertes PEG, besonders bevorzugt.
  • Die aktivierten Polymere sind so für eine Reaktion mit Interferon und zur Bildung von IFN-Polymer-Konjugaten geeignet, wobei eine Bindung vorzugsweise entweder an der Amino-terminalen α-Amino-Gruppe oder ε-Amino-Gruppe von Lysinen, die am IFN gefunden werden, erfolgt. Freie Carbonsäure-Gruppen, geeigneterweise aktivierte Carbonyl-Gruppen, oxidierte Kohlenhydrat-Gruppierungen können ebenfalls als Bindungsstellen für Hydrazin- oder Carbazat-aktivierte Polymere verwendet werden. Es können auch Mercapto-Gruppen, wenn sie am IFN verfügbar sind, als Bindungsstellen für geeignet aktivierte Polymere verwendet werden.
  • In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Carbamat (Urethan)-Bindungen gebildet, indem die IFN-ε-Amino-Gruppe und aktivierten Polyalkylenoxide verwendet werden. Vorzugsweise wird die Carbamat-Verknüpfung gebildet, wie es in dem US-Patent Nr. 5,122,614 der Anmelderin dieses Patents beschrieben ist. Dieses Patent offenbart die Bildung von Mono- und Bis-N-succinimidylcarbonat-Derivaten von Polyalkylenoxiden. Alternativen umfassen para-Nitrophenylcarbonat- und Carbonylimidazol-aktivierte Polymere. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird allerdings das aktivierte Polymer nur in den hierin definierten molaren Verhältnissen, d. h. 0,125 bis 0,75 mol pro Mol Interferon, anstelle der substantiellen molaren Überschüsse, die in dem '614-Patent gelehrt werden, eingesetzt.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung werden Polymere, die mit Amid-bildenden Linkern aktiviert sind, zum Beispiel mit cyclischem Imid-aktivierte Polyalkylenoxide, Succinimidylester oder dgl., verwendet, um die Verknüpfung zwischen dem Interferon und Polymerendgruppen zu bewerkstelligen; siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,349,001 von Greenwald et al. Noch andere Aspekte der Erfindung umfassen eine Verwendung von anderen aktivierten Polymeren, um kovalente Bindungen des Polymers mit dem Interferon über ε-Amino- oder andere Gruppen zu bilden. Isocyanat- oder Isothiocyanat-Formen von endständig aktivierten Polymeren können zum Beispiel verwendet werden, um Harnstoff- oder Thioharnstoff-basierte Bindungen mit den Lysinamino-Gruppen zu bilden. PEG-Dialdehyd kann auch mit dem Interferon umgesetzt werden, anschließend eine Reduzierung mit NaCNBH3 durchgeführt werden, um eine sekundäre Amin-Verknüpfung zu bilden.
  • Geeignete Polymere werden im Gewicht wesentlich variieren, allerdings werden üblicherweise Polymere mit Molekulargewichten im Bereich von 600 bis 60 000 für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausgewählt. Molekulargewichte von 1000 bis 40 000 sind bevorzugt und 2000 bis 20 000 sind ganz besonders bevorzugt.
  • Die eingeschlossenen Polymersubstanzen sind vorzugsweise bei Raumtemperatur auch wasserlöslich. Eine nicht-limitierende Liste von solchen Polymeren umfaßt Polyalkylenoxid-Homopolymere, zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykole, poloxyethenylierte Polyole, Copolymere davon und Blockcopolymere davon, vorausgesetzt, daß die Wasserlöslichkeit der Blockcopolymeren aufrechterhalten wird.
  • Als Alternative zu Polymeren auf PAO-Basis können wirksam nicht-antigene Materialien, zum Beispiel Dextran, Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polymere auf Kohlenhydratbasis und dgl., verwendet werden. In der Tat kann die Aktivierung von alpha- und omega-terminalen Gruppen dieser polymeren Substanzen in einer Weise ähnlich der, die zum Umwandeln von Polyalkylenoxiden eingesetzt wird, und somit dem Fachmann klar sein wird, durchgeführt werden. Der Fachmann wird erkennen, daß die vorstehend genannte Liste lediglich veranschaulichend ist und daß alle Polymermaterialien, die die hierin beschriebenen Qualitäten haben, in Betracht gezogen werden. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung meint der Ausdruck "nicht-antigen wirksam" alle Materialien, die auf dem Fachgebiet als nicht- toxisch verstanden werden und die keine wahrnehmbare immunogene Reaktion bei Säugern hervorrufen.
  • 3. Reaktionsbedingungen
  • Konjugationsreaktionen, die manchmal als Pegylierungsreaktionen bezeichnet werden, werden im allgemeinen in Lösung mit einem molaren Überschuß an Polymer und ungeachtet der Stelle, wo das Polymer an das Protein binden wird, durchgeführt. Solche allgemeinen Techniken erwiesen sich allerdings für ein Konjugieren von Interferonen an nicht-antigene Polymere und zum Aufrechterhalten ausreichender Interferonaktivität als inadäquat. Ein Weg, um die Interferon-Bioaktivität aufrecht zu erhalten, besteht darin, den Einschluß von solchen Interferonlysine, die mit der aktiven Stelle assoziiert sind, im Polymer-Kupplungsprozeß zu vermeiden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt Konjugate bereit, die hohe Konzentrationen an aufrechterhaltener Aktivität haben, indem die Verwendung von mehrfachen molaren Überschüssen an aktiviertem Polymer während der Konjugationsreaktionen vermieden wird.
  • Die Bedingungen, unter welchen die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, umfassen auch eine Umsetzung eines Interferons mit einem geeigneterweise aktivierten, bis-aktivierten, im wesentlichen nicht-antigenen Polymers, zum Beispiel einem bis-aktivierten PEG, in einer geeigneten Pufferlösung bei einem Verhältnis von bis-aktiviertem Polymer zu Interferon von 0,125:1 bis 0,75:1. In getrennten Ausführungsformen übersteigt die Obergrenze für die Menge an Polymer, die in Konjugationsreaktionen eingeschlossen ist, "0,75" zu dem Ausmaß, daß es möglich ist, das aktivierte Polymer und Interferon ohne Bildung einer wesentlichen Menge von Spezies mit hohem Molekulargewicht umzusetzen, d. h. mehr als 20% der Konjugate, die mehr als etwa einen Polymerstrang pro Molekül Interferon enthalten. In diesem Aspekt der Erfindung wird zum Beispiel in Betracht gezogen, daß Verhältnisse von bis zu etwa 2:1 verwendet werden können, um signifikante Mengen der gewünschten Konjugate zu bilden, welche danach von beliebigen Spezies mit hohem Molekulargewicht isoliert werden können.
  • Die Konjugationsreaktion wird unter relativ milden Bedingungen durchgeführt, um eine Inaktivierung des Interferons zu vermeiden. Milde Bedingungen umfassen ein Halten des pHs der Reaktionslösung im Bereich von 6 bis 8 und der Reaktionstemperaturen im Bereich von 0 bis 30°C und vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur, d. h. 19 bis 22°C. Eine nicht-limitierende Liste geeigneter Puffer umfaßt Phosphat, Citrat, Acetat, usw.
  • Diese Reaktionsbedingungen stehen im Gegensatz zu solchen, die typischerweise für Polymerkonjugationsreaktionen verwendet werden, in denen das aktivierte Polymer in mehrfach molaren Überschüssen bezüglich des Targets vorliegt. In bevorzugten Aspekten der Erfindung liegt das Polymer in Mengen von 0,25 bis 0,75 Äquivalenten pro Äquivalent Interferon vor. Die bevorzugtesten Aspekte der Erfindung umfassen ein Umsetzen von 0,25 bis 0,05 Äquivalenten Polymer pro Äquivalent Interferon. Obgleich die hierin beschriebenen Reaktionsbedingungen in signifikanten Mengen an unmodifizierten Interferon resultieren können, kann das unmodifizierte Interferon in einfacher Weise in zukünftige Chargen für weitere Konjugationsreaktionen zurückgeführt werden.
  • Obgleich das Verfahren der vorliegenden Erfindung bis-aktivierte Polymerformen zur Bildung der Polymer-Konjugate umfaßt, erzeugen die Verfahren der vorliegenden Erfindung überraschenderweise sehr wenig, d. h. weniger als 5% und bevorzugter weniger als 3%, Spezies mit hohem Molekulargewicht und Spezies, die mehr als einen Polymerstrang pro Interferon enthalten. Obgleich die Anmelderin keine Bindung an eine Theorie angeht, wird angenommen, daß eine Schleifenbildung des Polymers in schützender Art oder sterische Hinderung eine Erzeugung von Spezies mit hohem Molekulargewicht und von Spezies, die mehr als einen Polymerstrang pro Interferon enthalten, inhibiert.
  • Die Konjugationsreaktionen der vorliegenden Erfindung stellen zunächst eine Reaktionsmischung oder einen Reaktionspool bereit, der Mono- und Bis-Interferon-Konjugate, nicht-umgesetztes Interferon, nicht-umgesetztes Polymer und üblicherweise weniger als 5% Spezies mit hohem Molekulargewicht enthält. Die Spezies mit hohem Molekulargewicht umfassen Konjugate, die mehr als einen Polymerstrang enthalten, und/oder polymerisierte PEG-IFN-Spezies. Nachdem die nicht-umgesetzten Spezies und die Spezies mit hohem Molekulargewicht entfernt wurden, werden Zusammensetzungen, die in erster Linie Mono- und Bis-Interferon-Polymerkonjugate enthalten, gewonnen. Unter Annahme der Tatsache, daß die Konjugate zum größten Teil einen einzelnen Polymerstrang umfassen, sind die Konjugate im wesentlichen homogen. Diese Zusammensetzungen haben wenigstens 60% der biologischen Aktivität, die mit dem nativen oder unmodifizierten Interferon assoziiert ist, was unter Verwendung eines Standardvirus-Protektions-Assays gemessen wird, zum Beispiel mit einem CPE-Assay mit EMC-Virus-Stimulation von A549-humanen Lungenkarzinomzellen. Siehe zum Beispiel Larocca, A.T., Borden, E.C. und Colby, C.B. in Human Cytokines. Handbook für Basic & Clinical Research, B.B. Aggarwal & S.U. Gutterman (Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, Boston, 1991.
  • In bevorzugten Aspekten der Erfindung hat das Gemisch allerdings 75% der biologischen Aktivität, die mit unmodifizierten Interferon assoziiert ist, und am bevorzugtesten hat das Gemisch 90% der biologischen Aktivität, die mit unmodifizierten Interferon assoziiert ist.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise eher limitierte Verhältnisse von Polymer zu Interferon. So wurde festgestellt, daß die Interferon-Konjugate vornehmlich auf Spezies (Mono- oder Bis-) limitiert sind, die nur einen Polymerstrang enthalten. Darüber hinaus ist die Bindung des Polymers an die Interferonlysine wesentlich weniger statistisch als bei Verwendung höherer molarer Überschüsse an Polymerlinker. In Abhängigkeit von den verwendeten molaren Verhältnissen liefern zum Beispiel die Konjugationsreaktionen, die gemäß der Erfindung durchgeführt werden, Pools, die eine Kombination von Mono- und Bis-Interferon-Polymerkonjugaten in Verhältnissen (basierend auf dem Proteingehalt) im Bereich von 1:1 bis 5:1 Mono:Bis, vorzugsweise Mono:Bis und am bevorzugtesten 2:1 Mono:Bis, enthalten.
  • Eine repräsentative Konjugationsreaktion wird nachfolgend angegeben: 0,125 bis 0,75 mol bis-aktiviertes Polymer werden in Wasser zur Injektion (pH etwa 6,0) gelöst und dann zu einer Interferon-Lösung, die mit einem geeigneten Puffer, zum Beispiel Phosphatpuffer, auf etwa pH 6,5 eingestellt ist, gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur (etwa 20 bis 25°C) für eine geeignete Zeit, zum Beispiel etwa 2 Stunden, unter kontinuierlichem leichten Mischen inkubieren gelassen. Danach wird die Konjugationsreaktion mit einem mehrfach molaren Überschuß von Glycin gestoppt. Die resultierende Reaktionslösung oder der resultierende Pool von Konjugaten enthält (basierend auf dem Proteingehalt) 1:1 bis 5:1 Mono:Bis-Interferon-Polymerkonjugate. Das in dem Reaktionspool vorliegende unmodifizierte Interferon kann, nachdem die Konjugationsreaktion abgeschreckt wurde, unter Verwendung von Ionenaustausch- oder Größenausschlußchromatographie oder ähnlicher Trenntechniken in zukünftige Reaktionen recyclet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise weniger als 5% unmodifiziertes Interferon.
  • 4. Isolierung von Mono- und Bis-Konjugaten
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Mono- und Bis-Interferon-Polymerspezies aus der Reaktionsmischung unter Entfernung von Spezies mit hohem Molekulargewicht und unmodifiziertem Interferon isoliert. Eine Abtrennung wird durchgeführt, indem die gemischten Spezies in eine Pufferlösung gegeben werden, die 1 bis 10 mg/ml der Interferon-Polymerkonjugate enthält. Geeignete Lösungen haben einen pH von 6,0 bis 9,0 und vorzugsweise von 7,5 bis 8,5. Die Lösungen enthalten vorzugsweise ein oder mehrere Puffersalz(e), ausgewählt aus KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 und NaOH. Natriumphosphatpuffer sind bevorzugt.
  • In Abhängigkeit vom Reaktionspuffer kann die Interferon-Polymerkonjugat-Lösung zunächst einem Pufferaustausch/einer Ultrafiltration unterzogen werden, um nicht-umgesetztes Polymer zu entfernen. Beispielsweise kann die PAO-Interferon-Konjugat-Lösung durch eine Membran mit einer niedrigen Molekulargewichtsausschlußgrenze (10 000 bis 30 000 Dalton) ultrafiltriert werden, um die meisten unerwünschten Materialien, zum Beispiel nicht-umgesetztes Polymer, oberflächenaktive Mittel, wenn sie vorliegen, oder dgl. zu entfernen.
  • Die Fraktionierung der Konjugate zu einem Pool, der die gewünschten Mono- und Bis-Spezies enthält, wird vorzugsweise unter Verwendung eines Anionenaustausch-Chromatographiemediums durchgeführt. Solche Medien sind fähig, selektiv PAO-Interferon-Konjugate durch Differenzen in der Ladung, die in einer voraussagbaren Art variieren können, selektiv zu binden. Beispielsweise wird die Oberflächenladung von αIFN durch die Anzahl der verfügbaren geladenen Aminosäuren an der Oberfläche des Proteins bestimmt. Von diesen geladenen Aminosäuren dienen Lysin-Reste als der Punkt einer potentiellen Bindung von Polyalkylenoxid-Konjugaten. Daher werden Mono- und Bis-Interferon-Konjugate eine von den anderen Spezies verschiedene Ladung haben, was eine selektive Isolierung ermöglicht. Die Verwendung von stark polaren Anionenaustauscherharzen, zum Beispiel quaternären Amin-Anionenaustauscherharzen ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung speziell bevorzugt. Unter den im Handel verfügbaren quaternären Anionenaustauscherharzen, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, finden sich Q-HD, QA TRISACRYL® und QMA-SPHEROSIL®, quaternäre Aminharze, auf eine Polymermatrix aufgetragen, hergestellt von IBF, Garenne, Frankreich, für Sepracor, Marlborough, Massachusetts; TMAE650M®, ein Tetramethylaminoethyl-Harz, aufgetragen auf eine Polymermatrix, hergestellt von EM-Separators of Gibbstown, New Jersey; QAE550C® und SUPERQC®, jeweils ein quaternäres Aminharz, aufgetragen auf eine Polymermatrix und hergestellt von TosoHaas, Montgomeryville, PA. QMA-Accell, hergestellt von Millipore, Millford, MA und PEI-Harze, hergestellt von JT Baker, Phillipsburg, NJ, können ebenfalls verwendet werden. Auch andere geeignete Anionenaustauscherharze, z. B. DEAE-Harze, verwendet werden.
  • Das Anionenaustauscherharz wird zum Beispiel vorzugsweise in eine Säule gepackt und durch herkömmliche Mittel äquilibriert. Ein Puffer, der denselben pH und dieselbe Osmolalität wie die Polymer-konjugiertes Interferon-Lösung hat, wird verwendet. Der Elutionspuffer enthält vorzugsweise ein oder mehrere Salze, ausgewählt aus KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 und (NH4)2CO3. Die Konjugat-enthaltende Lösung wird dann an der Säule absorbiert, wobei die Spezies mit hohem Molekulargewicht und nicht-umgesetztes Polymer nicht zurückgehalten werden. Bei Beendigung der Beladung wird ein Gradientenfluß eines Elutionspuffers mit steigenden Salzkonzentrationen auf die Säule angewendet, um die gewünschte Fraktion von Polyalkylenoxid-konjugiertem Interferon zu eluieren. Die eluierten, gepoolten Fraktionen werden vorzugsweise nach dem Anionenaustauscher-Trennungsschritt auf einheitliche Mono- und Bis-Interferon-Polymerkonjugate limitiert. Unkonjugierte Interferonspezies können dann durch herkömmliche Techniken wieder aus der Säule gewaschen werden. Wenn es gewünscht wird, können Mono- und Bis-Interferon-Spezies auch über zusätzliche Ionenaustauscherchromatographie oder Größenaus schlußchromatographie voneinander getrennt werden.
  • Techniken, die mehrere isokratische Schritte steigender Konzentration verwenden, können ebenfalls verwendet werden. Mehrere isokratische Elutionsschritte steigender Konzentration werden in der sequentiellen Flution von Mono- und dann Bis-Interferon-Polymerkonjugaten resultieren.
  • Der Temperaturbereich zur Flution liegt zwischen 4°C und 25°C. Eine Flution wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 6°C bis 22°C durchgeführt. Die Flution der PAO-αIFN-Fraktion wird zum Beispiel durch UV-Extinktion bei 280 nm detektiert. Eine Fraktionssammlung kann durch einfache Zeitelutionsprofile erreicht werden.
  • 5. Oberflächenaktive Mittel
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein oberflächenaktives Mittel in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt. Geeignete oberflächenaktive Mittel umfassen Mittel des ionischen Typs, zum Beispiel Natriumdodecylsulfat (SDS). Andere ionische oberflächenaktive Mittel, zum Beispiel Lithiumdodecylsulfat, quaternäre Ammonium-Verbindungen, Taurocholinsäure, Caprylsäure, Decansulfonsäure usw. können ebenfalls eingesetzt werden. Es können auch nicht-ionische oberflächenaktive Mittel verwendet werden. Zum Beispiel können Materialien wie Polyoxyethylensorbitane (Tweens), Polyoxyethylenether (Tritons) eingesetzt werden. Siehe auch Neugebauer, A. Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. Die einzigen Beschränkungen bei den oberflächenaktiven Mitteln, die in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden, sind, daß sie unter Bedingungen und mit Konzentrationen verwendet werden, die keine substantielle irreversible Denaturierung des Interferons bewirken und eine Polymerkonjugation nicht vollständig inhibieren. Die oberflächenaktiven Mittel liegen in den Reaktionsmischungen in Mengen von 0,01 bis 0,5%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,5% und am bevorzugtesten von 0,075 bis 0,25%, vor. Gemische der oberflächenaktiven Mittel werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Obgleich sich die Anmelder nicht durch eine Theorie binden, wird angenommen, daß die oberflächenaktiven Mittel ein vorübergehendes, reversibles Schutzsystem während des Polymerkonjugationsprozesses bereitstellen. αIFN enthält zum Beispiel drei Lysine in der Region der aktiven Stelle. Es wurde gefunden, daß dieser relativ positiv geladene Bereich des Polypeptids eine substantielle Polymerkonjugation während der Lösung-basierten Prozesse ohne eine Art von Schutz durchmacht, speziell wenn molare Überschüsse an Polymer verwendet werden. Dies führt zu einem substantiellen oder vollständigen Verlust der Bioaktivität. Es wurde festgestellt, daß die oberflächenaktiven Mittel überraschend wirksam sind, um eine Polymerkonjugation in diesem Bereich selektiv zu verhindern, während eine Lysin-basierte oder Aminoende-basierte Konjugation an anderen Bereichen des Polypeptids ablaufen gelassen wird.
  • 6. Behandlung
  • Produkte der vorliegenden Erfindung können für eine Behandlung von verschiedenen medizinischen Zuständen in einem Säuger eingesetzt werden. Die Verfahren umfassen eine Verabreichung einer wirksamen Menge an Interferon-Polymerkonjugaten, die wie hierin beschrieben hergestellt wurden, an einen Säuger, der einer solchen Behandlung bedarf. Die Konjugate sind u. a. zur Behandlung von auf Interferon ansprechenden Zuständen oder Zuständen, die positiv oder günstig ansprechen werden, einsetzbar; diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet für eine Interferon-basierte Therapie bekannt. So können die Interferon-Konjugate ohne Beschränkung eingesetzt werden, um Zustände zu behandeln, die aus der inhibierenden Replikation von Interferon-sensitiven Viren Nutzen ziehen. Außerdem können die Konjugate verwendet werden, um verschiedene Immunantworten zu modifizieren, einschließlich Inhibierung einer Antikörperantwort auf Antigenstimulation, Inhibierung von Hypersensitivitätsreaktionen, Regulation der NK-Zellaktivitätsverstärkung von cytotoxischer T-Zellaktivität, Modulierung der Prostaglandin-Produktion und Verstärkung der Phagozytose durch Makrophagen.
  • Weitere Zustände, bei denen die Interferon-Polymerkonjugate verwendet werden können, umfassen Haarzell-Leukämie, venereale oder genitale Warzen (Condylomata acuminata), AIDS-bedingte Kaposis-Sarkom, Hepatitis und Hepatitis-artige virale Erkrankungen, einschließlich Hepatitis-B und chronische Nicht-A-Nicht-B/C-Hepatitis und verschiedene feste Tumore.
  • Die Menge des Interferon-Polymerkonjugats, die zur Behandlung der oben beschriebenen Zustände verabreicht wird, basiert auf der Interferon-Aktivität des Polymerkonjugats. Sie ist eine Menge, die ausreichend ist, um eine positive klinische Antwort in signifikanter Weise hervorzubringen. Die maximale Dosis für Säuger, einschließlich Menschen, ist die höchste Dosis, die keine klinisch bedeutenden Nebenwirkungen verursacht. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind derartige klinisch bedeutende Nebenwirkungen solche, die eine Beendigung der Therapie infolge von schweren grippeartigen Symptomen, Depression des zentralen Nervensystems, schweren gastrointestinalen Störungen, Alopezie, schwerem Hautjucken oder Rash erfordern. Substantielle Abnormalitäten bei den weißen und/oder roten Blutkörperchen und/oder Leberenzyme oder Anämie-artige Zustände können ebenfalls Dosis-limitierend sein.
  • Natürlich werden die Dosierungen der Interferon-basierten Zusammensetzungen in Abhängigkeit von der Interferon-Gruppierung und dem ausgewählten Polymer etwas variieren. Im allgemeinen wird das Konjugat jedoch in Mengen, die von 100 000 bis mehrere Millionen IU/m2 Interferon pro Tag, basierend auf dem Zustand des Säugers, reichen, verabreicht. Der oben angegebene Bereich ist veranschaulichend und der Fachmann wird die optimale Dosierung des ausgewählten Konjugats auf der Basis der klinischen Erfahrung und der Behandlungsindikation bestimmen.
  • Die IFN-Polymerkonjugate und Zusammensetzungen, die die Mono- und Bis-Interferon-Polymerkonjugate der vorliegenden Erfindung enthalten, können in einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung oder in mehreren geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung an Säuger enthalten sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in der Form einer Lösung, einer Suspension, einer Tablette, einer Kapsel oder dgl., die nach auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden, sein. Es wird auch in Betracht gezogen, daß eine Verabreichung von solchen Zusammensetzungen hauptsächlich auf parenteralem Weg erfolgen wird, obgleich der orale Weg durch Inhalation jede nach Bedarf des Arztes gewählt werden kann.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, ein weiteres Verständnis der Erfindung bereitzustellen, sollen aber den effektiven Rahmen der Erfindung in keiner Weise beschränken.
  • Beispiel 1
  • In diesem Beispiel wurde Bis-succinimidycarbonat-aktiviertes Polyethylenglykol, Molekulargewicht 8000, verwendet, um alpha-Interferon zu modifizieren. Das Bis-succinimidylcarbonat-aktivierte PEG wurde entsprechend dem Verfahren des oben genannten US-Patents, Nr. 5,122,614 hergestellt. Das Interferon war rekombinantes αIFN-2b, (rαIFN), ein Produkt der Schering Plough-Corporation, Madison, New Jersey.
  • Interferon alpha (0,25 μmol, 5 mg) wurde mit 100 mM Phosphatpuffer auf pH 6,5 eingestellt. Das aktivierte PEG wurde in Wasser zur Injektion (pH etwa 6,0) gelöst und dann zu dem alpha-Interferon gegeben, und zwar in einem Verhältnis von ein halbes Mol bis-aktiviertes Polymer pro Mol Interferon. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur (21°C) für etwa 2 Stunden bei kontinuierlichem leichtem Mischen inkubiert. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion mit 10-fach molaren Überschuß an Glycin gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurde durch SEC-HPLC (BioRad, Bio-Sil, SEC-125-Säule) bei einer Durchflußrate von 1,0 ml/Minute unter Verwendung eines 0,1 molaren Phosphatpuffers, pH 7,0 mit einer Detektion bei 280 nm analysiert. Die Resultate der HPLC-Analyse waren wie folgt: Tabelle 1
    Retentionszeit % Peakfläche Bemerkungen
    7,32 3 Spezies mit hohem Molekulargewicht
    7,51 3 Spezies mit hohem Molekulargewicht
    7,78 14 Bis-IFN-PEG
    8,29 29 Mono-IFN-PEG
    10,1 (nativ) 50 ummodifiziertes IFN
  • Was Tabelle 1 angeht, so ist zu ersehen, daß die Reaktionsmischung (auf der Basis des Interferon-Proteins) etwa 50% modifiziertes Interferon und etwa 50% unmodifiziertes Interferon enthält. Das modifizierte Interferon ist außerdem dadurch definiert, daß es etwa 6% (3+3) höhere modifizierte Formen von IFN-Polymerkonjugaten, etwa 14% Bis-Interferon-Polymerkonjugate und etwa 29% Mono-Interferon-Polymerkonjugate enthielt. Demnach war das Verhältnis von Mono- zu Bis-Konjugaten in der Reaktionsmischungslösung etwa 2:1. Ein Pool, der das nicht-umgesetzte Interferon, Mono- und Bis-Interferon-Konjugate enthielt, wurde unter Verwendung von SEC-HPLC isoliert.
  • Beispiel 2
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß das molare Verhältnis von bis-aktiviertem PEG zu Interferon etwa 1:1 war. Die Resultate der HPLC-Analyse sind unten in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2
    Retentionszeit % Peakfläche Bemerkungen
    7,43 3 Spezies mit hohem Molekulargewicht
    7,85 9 Bis-IFN-PEG
    8,3 29 Mono-IFN-PEG
    10,05 59 unmodifiziertes IFN
  • In diesem bestimmten Beispiel kann gesehen werden, daß Peak-Flächen, die allen konjugierten Spezies entsprechen, etwas weniger sind als die, die unter Verwendung der Reaktionsbedingungen von Beispiel 1 beobachtet werden. Insbesondere die Konzentration an Spezies mit hohem Molekulargewicht (Interferon-konjugiert mit mehreren Polymersträngen oder polymerisierte Spezies) ist etwa 3%. Trotz der Verdoppelung der Anzahl der Äquivalente an Polymer, das in der Konjugationsreaktion vorliegt, nahm demnach die Menge an Spezies mit hohem Molekulargewicht tatsächlich ab. Etwa 9% des Interferons wurde in Bis-IFN-PEG-Konjugate transformiert und etwa 29% des Interferons wurde in Mono-IFN-PEG umgewandelt. Etwa 59% des Interferons war unmodifiziert. Es wurde festgestellt, daß der Reaktionspool unter diesen Bedingungen ein Verhältnis von etwa 3:1 Mono- zu Bis-Konjugate enthielt. Wie es in Beispiel 1 der Fall war, wurden die Spezies mit hohem Molekulargewicht aus dem Pool, der die verbleibenden IFN-Spezies enthielt, abgetrennt.
  • Beispiel 3
  • In diesem Beispiel wurden die Pools von IFN und PEG-IFN-Konjugat der Beispiel 1 und 2 durch SEC-HPLC gereinigt, um unmodifiziertes IFN zu Konzentrationen von weniger als 2% zu entfernen. Die gereinigten Konjugat-Pools wurde dann konzentriert und auf biologische Aktivität analysiert. Die Resultate wurden dann mit unmodifizierten alpha-Interferon verglichen. Die Aktivität wurde unter Verwendung eines CPE-Assays mit EMC-Virus, das humane A549-Lungenkarzinomzellen angriff, bestimmt. Tabelle 3
    IFN-Probe Virus-Schutzassay, IC50 (pg/ml) Aktivität (%)
    unmodifiziertes IFN 0,31 100
    Beispiel 1-Pool 0,33 94
    Beispiel 2-Pool 0,36 86
  • Wie aus den Resultaten gesehen werden kann, hatten die Zusammensetzungen, die aus dem Verfahren von Beispiel 1 erhalten worden waren, eine CPE-Aktivität, die nahezu gleich der von unmodifiziertem IFN war. die CPE-Aktivität nahm ab, wenn das Verhältnis von Mono- zu Bis-Interferon-Konjugaten in den Reaktionslösungen zunahm. Beispielsweise war die CPE-Aktivität mit dem Beispiel 1-Pool (Mono:Bis = 2:1) am höchsten und nahm ab, wenn das Verhältnis von Mono zu Bis erhöht wurde. Es wurde postuliert, daß, wenn die Ingredientien in niedrigen Polymer-Interferon-molaren Verhältnissen umgesetzt wurden, das bis-aktivierte Polymer in einer weniger statistischen Art an das Interferon band, was zu einer größeren beibehaltenen Aktivität führte. Eine andere Möglichkeit ist, daß Bis-IFN-PEG bei der Vernetzung und dem "Capping" von IFN-Rezeptoren an A549-Zellen wirksamer sein kann, als Mono-IFN-PEG, was in einer erhöhten biologischen Aktivität resultiert.
  • Beispiel 4
  • In diesem Beispiel wurde rekombinantes αIFN-2b, (rαIFN), mit aktiviertem ω-Methoxy-Polyethylenglykol-α-N-Succinimidylcarbonat (SC-mPEG) konjugiert, wie es im US-Patent Nr. 5,122,614 beschrieben ist. Das Polymer hatte ein Molekulargewicht von etwa 5000.
  • Etwa 36 mg des rαIFN wurden in 0,1 molarem Natriumphosphat, pH 7,5 unter Verwendung eines Centricon-10 (ein Produkt der Amicon Corporation, Beverly, Mass.) dialysiert. Die Endkonzentration von rαIFN war etwa 3 mg/ml. Danach wurden 42 mg SC-mPEG5000 zu der Proteinlösung gegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt und dann mit Glycin abgeschreckt. Als nächstes wurde das Reaktionsgemisch in 10 mM Natriumphosphat, pH 8, dialysiert, um das PEGylierte IFN zu fraktionieren, wobei ein Centricon-30 verwendet wurde. Es wurde bestimmt, daß die resultierenden Konjugate etwa 4 Polymerstränge pro Interferon hatten. Ein Virus-Schutzassay wurde in der gleichen Weise durchgeführt wie der, der für die Bis-IFN-Konjugate durchgeführt wurde, und es wurde festgestellt, daß die Menge auf aufrechterhaltener Aktivität, berechnet über CPE, nur etwa 30% derjenigen des unmodifizierten Interferons war, welches zur gleichen Zeit analysiert wurde.
  • Aus dem Vorstehenden kann festgestellt werden, daß die bis-aktivierten Polymere signifikante Vorteile gegenüber den Mono-aktivierten Polymeren zum Modifizieren von Interferonen haben. Außerdem kann auch gesehen werden, daß die molaren Verhältnisse von Reaktionsingredientien, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, unerwartete Vorteile gegenüber den molaren Überschüssen, die in der Vergangenheit verwendet wurden, haben.
  • In der Beschreibung zitierte Literaturstellen: Dies ist eine Liste von Literaturstellen, die von der Anmelderin zitiert wurden, und ist lediglich aus Gründen der Zweckdienlichkeit für den Benutzer angeführt: sie ist nicht Teil des europäischen Patentdokuments. Obgleich große Sorgfalt bei der Angabe der entsprechenden Literaturstellen walten gelassen wurde, können Fehler und Weglassungen nicht ausgeschlossen werden und das EPA weist diesbezüglich jede Verantwortung von sich.
  • Patentdokumente, die in der Beschreibung zitiert sind:
  • Nicht-Patent-Literatur, die in der Beschreibung zitiert wird:
    • • Interferon α. PESTKA. Human Cytokines. Blackwell Scientific Publications, 1992, 1–16 [0025]
    • • LAROCCA, A.T.; BORDEN, E.C.; COLBY, C.B. Human Cytokines. Handbock for Basic & Clinical Research. Blackwell Scientific Publications, 1991 [0039]
    • • NEUGEBAUER. A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry. Calbiochem Corp, 1992 [0050]

Claims (19)

  1. Verfahren zur Herstellung von Interferon-Polymerkonjugaten, umfassend die Reaktion eines Interferons mit einem bis-aktivierten, im wesentlichen nicht-antigenen Polymer in einem molaren Verhältnis des im wesentlichen nicht-antigenen Polymers zum Interferon von 0,125:1 bis 0,75:1 unter Bedingungen, die hinreichend sind, die kovalente Konjugation des Interferons und des Polymers herbeizuführen und eine Reaktionsmischung, die Mono-Interferon-Polymerkonjugate und Bis-Interferon-Polymerkonjugate enthält, zu bilden.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das genannte molare Verhältnis des bis-aktivierten, im wesentlichen nicht-antigenen Polymers zum Interferon von 0,25:1 bis 0,5:1 ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das im wesentlichen nicht-antigene Polymer ein Polyalkylenoxid enthält.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Polyalkylenoxid ein Polyethylenglycol ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Reaktionsmischung Interferon in einem Verhältnis von 1:1 bis 5:1 von Mono- zu Bis-Interferon-Konjugaten enthält.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das im wesentlichen nicht-antigene Polymer ein Molekulargewicht von 2.000 bis 20.000 hat.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend die Abtrennung des Mono-Interferon-Polymerkonjugats und des Bis-Interferon-Polymerkonkugats von der Reaktionsmischung
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Interferon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus alpha-Interferonen, beta-Interferonen und gamma-Interferonen.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Interferon ein menschliches Interferon ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das menschliche Interferon durch Rekombinationstechniken hergestellt wird.
  11. Interferon-Polymerkonjugate erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 1.
  12. Zusammensetzung, die ein Konjugat aus Interferon und im wesentlichen nicht-antigenem Polymer enthält, umfassend Interferon, das in einem Verhältnis von 1:1 bis 5:1 von Mono-Interferon-Polymerkonjugaten zu Bis-Interferon-Polymerkonjugaten vorhanden ist.
  13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das im wesentlichen nicht-antigene Polymer ein Polyethylenglycol ist.
  14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin die Konjugate eine Carbamatverknüpfung zwischen dem Interferon und dem im wesentlichen nicht-antigenen Polymer beinhalten.
  15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin die Konjugate eine Amidverknüpfung zwischen dem Interferon und dem im wesentlichen nicht-antigenen Polymer beinhalten.
  16. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das im wesentlichen nicht-antigene Polymer ein Molekulargewicht von 2.000 bis 20.000 hat.
  17. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das Interferon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus alpha-Interferonen, beta-Interferonen und gamma-Interferonen.
  18. Zusammensetzung, die ein Konjugat aus Interferon und im wesentlichen nicht-antigenem Polymer enthält, bestehend aus Mono-Interferon-Polymerkonjugaten und Bis-Interferon-Polymerkonjugaten.
  19. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 zur Verwendung in einer medizinischen Behandlung.
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Families Citing this family (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
PT858343E (pt) 1995-11-02 2004-07-30 Schering Corp Terapia por infusao continua de uma dose baixa de citoquina
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US20030190307A1 (en) * 1996-12-24 2003-10-09 Biogen, Inc. Stable liquid interferon formulations
US20050158273A1 (en) * 1997-09-25 2005-07-21 Harris J. M. Soluble, degradable polyethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
FR2774687B1 (fr) * 1998-02-06 2002-03-22 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques
US6180096B1 (en) 1998-03-26 2001-01-30 Schering Corporation Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
TWI250024B (en) * 1998-03-26 2006-03-01 Schering Corp Articles comprising formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
SK287491B6 (sk) 1998-10-16 2010-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie
PT1121156E (pt) 1998-10-16 2006-05-31 Biogen Idec Inc Conjugados de polimeros de interferao-beta-1a e as suas utilizacoes
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
ES2364086T3 (es) 1999-07-07 2011-08-24 Zymogenetics, Inc. Receptor de citoquina humana.
SK2942002A3 (en) * 1999-08-27 2002-08-06 Maxygen Aps A conjugate exhibiting interferon beta, a nucleotide sequence, an expressing vector, a host cell containing such a nucleotide sequence, method for the preparation thereof, pharmaceutical composition containing the same and its use
US7144574B2 (en) * 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US7431921B2 (en) * 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
EP1224939A4 (de) 1999-10-12 2005-01-12 Santen Pharmaceutical Co Ltd Interferon komplex und dessen medizinische verwendung
US7230081B1 (en) 1999-11-12 2007-06-12 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma conjugates
BR0015506A (pt) * 1999-11-12 2002-07-23 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de interferon gama, métodos para sua preparação, composições farmacêuticas que compreendem ás moléculas e seu uso no tratamento de doenças
EP1234035B1 (de) 1999-12-03 2010-02-24 ZymoGenetics, Inc. Menschliches zytokinrezeptor
WO2001051510A2 (en) 2000-01-10 2001-07-19 Maxygen Holdings Ltd G-csf conjugates
RU2278123C2 (ru) 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
DE60116137T2 (de) * 2000-05-16 2006-08-24 Lipoxen Technologies Ltd. Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
GB2380482A (en) * 2000-07-07 2003-04-09 Gennady P Samokhin Biologically active protein conjugates formed by first protecting active site
EP1346726A4 (de) * 2000-12-25 2004-09-15 Shiseido Co Ltd Parfumzusammenstellung die das sympathetische system stimulieren
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US20030012783A1 (en) 2001-02-20 2003-01-16 Wayne Kindsvogel Antibodies that bind both BCMA and TACI
EP2080771A3 (de) 2001-02-27 2010-01-06 Maxygen Aps Neue Interferon-betaartige Moleküle
EP1370676A4 (de) 2001-03-02 2004-09-22 Zymogenetics Inc Cytokin-rezeptor aus maus
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US7166571B2 (en) * 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7312192B2 (en) * 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6913903B2 (en) * 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
KR100480430B1 (ko) * 2001-12-04 2005-04-06 선바이오(주) 인터페론-베타와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
US20050095224A1 (en) * 2001-12-07 2005-05-05 Ramachandran Radhakrishnan Compositions and method for treating hepatitis virus infection
EP3669887A1 (de) * 2002-01-18 2020-06-24 Biogen MA Inc. Polyalkylen-polymer-verbindungen und verwendungen davon
JP2005535575A (ja) * 2002-04-11 2005-11-24 ザイモジェネティクス インコーポレイティッド 卵巣癌を治療するためのインターロイキン−２４の使用法
BR0309401A (pt) 2002-04-19 2007-02-21 Zymogenetics Inc polinucleotìdeo isolado, vetor de expressão, célula cultivada, método para produzir polipeptìdeos, e um anticorpo para um polipeptìdeo, e, anticorpo
DK1517710T3 (da) 2002-06-21 2011-07-18 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylerede faktor VII-glycoformer
DE14169110T1 (de) 2002-06-28 2022-05-12 Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- Modifizierte 2'- und 3'-Nukleosid-Prodrugs zur Behandlung von Flaviridae-Infektionen
WO2004005341A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040175359A1 (en) * 2002-11-12 2004-09-09 Desjarlais John Rudolph Novel proteins with antiviral, antineoplastic, and/or immunomodulatory activity
PT1667708E (pt) * 2002-12-26 2012-09-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados de interferão-beta-1b e polietileno glicol apresentando uma potência biológica in vitro aumentada
MXPA05006945A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor.
JP2006521372A (ja) * 2003-03-28 2006-09-21 バイオポリメド インコーポレーテッド 生物学的活性物質と生体適合性高分子の１：１接合体、この製造方法とこれを含む薬学組成物
SI3521297T1 (sl) 2003-05-30 2022-04-29 Gilead Pharmasset Llc Modificirani fluorirani nukleozidni analogi
DK2251353T3 (da) 2003-08-07 2013-06-03 Zymogenetics Inc Homogene fremstillinger af IL-29
JP2007533298A (ja) 2003-10-10 2007-11-22 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ Ｉｌ−２１の誘導体
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
PL2256134T3 (pl) 2003-11-13 2014-06-30 Hanmi Science Co Ltd Fragment Fc Ig do nośnika leku i sposób jego wytwarzania
EP1718664A4 (de) 2004-02-02 2008-08-13 Ambrx Inc Modifizierte menschliche vierhelix-bündel-peptide und ihre verwendungen
EP1734988A4 (de) * 2004-03-01 2009-08-05 Enzon Pharmaceuticals Inc Interferon-beta-polymerkonjugate
US7632924B2 (en) 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
CA2910494C (en) 2004-07-19 2018-10-23 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
CN101023094B (zh) * 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
JP2008508310A (ja) 2004-07-29 2008-03-21 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド がんおよび自己免疫障害を治療するためのｉｌ−２８およびｉｌ−２９の使用法
US7632491B2 (en) 2004-08-12 2009-12-15 Schering Corporation Stable pegylated interferon formulation
ES2725457T3 (es) * 2004-09-14 2019-09-24 Gilead Pharmasset Llc Preparación de ribofuranosil pirimidinas y purinas 2'fluoro-2'-alquil-sustituidas u otras opcionalmente sustituidas y sus derivados
NZ555386A (en) 2004-12-22 2011-01-28 Ambrx Inc Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
CN101087875B (zh) 2004-12-22 2012-08-22 Ambrx公司 氨酰基-tRNA合成酶的组合物及其用途
SG160437A1 (en) 2004-12-22 2010-04-29 Ambrx Inc Modified human growth hormone
US8080391B2 (en) 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
US7365127B2 (en) * 2005-02-04 2008-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Process for the preparation of polymer conjugates
EP1856156A2 (de) 2005-02-08 2007-11-21 ZymoGenetics, Inc. Anti-il-20-, anti-il-22- und anti-il-22ra-antikörper und bindungspartner sowie verwendungsverfahren bei entzündungen
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
AU2006247591B2 (en) 2005-05-12 2011-12-15 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
CN101247821B (zh) 2005-06-03 2013-01-23 Ambrx公司 经改良人类干扰素分子和其用途
MX2007015819A (es) * 2005-06-13 2008-02-22 Nastech Pharm Co Suministro de derivados peptidicos a traves de la mucosa.
WO2006134173A2 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
DE602006016965D1 (de) 2005-09-28 2010-10-28 Zymogenetics Inc Il-17a- und il-17f-antagonisten und verwendungsverfahren
DK2339014T3 (en) 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
JP5486809B2 (ja) * 2006-02-14 2014-05-07 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー Ｃ末端におけるポリペプチドの結合
KR101513732B1 (ko) 2006-02-21 2015-04-21 넥타르 테라퓨틱스 분할된 분해가능한 폴리머 및 이로부터 제조된 컨주게이트
WO2007130453A2 (en) 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
AR078117A1 (es) 2006-06-20 2011-10-19 Protech Pharma S A Una muteina recombinante del interferon alfa humano glicosilado, un gen que codifica para dicha muteina, un metodo de produccion de dicho gen, un metodo para obtener una celula eucariota productora de dicha muteina, un metodo para producir dicha muteina, un procedimiento para purificar dicha muteina
CA2662755C (en) 2006-09-08 2017-04-04 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
CN106008699A (zh) 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
PT2061878E (pt) 2006-09-08 2014-04-22 Ambrx Inc Supressor híbrido arnt para células de vertebrados
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
ES2385114T3 (es) 2007-03-30 2012-07-18 Ambrx, Inc. Polipéptidos de FGF-21 modificados y sus usos
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
US7625555B2 (en) 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
AU2008308509B2 (en) 2007-10-04 2014-10-23 Zymogenetics, Inc. B7 family member zB7H6 and related compositions and methods
ES2664822T3 (es) * 2007-10-16 2018-04-23 Biocon Limited Una composición farmacéutica sólida administrable por vía oral y un proceso de la misma
JP5547083B2 (ja) 2007-11-20 2014-07-09 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用
EP2247743B1 (de) 2008-02-08 2016-04-06 Ambrx, Inc. Modifizierte leptin-polypeptide und deren verwendungen
TW200946541A (en) 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
KR20230003298A (ko) 2008-04-30 2023-01-05 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
US8173621B2 (en) * 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
US8658766B2 (en) 2008-06-27 2014-02-25 Zymogenetics, Inc. Soluble hybrid Fcγ receptors and related methods
KR20110033922A (ko) 2008-07-08 2011-04-01 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 전사의 신호 변환자 및 활성제（ｓｔａｔｓ）의 증식 및 활성화의 신규한 억제제
MX2011000859A (es) 2008-07-23 2011-02-24 Ambrx Inc Polipeptidos g-csf bovinos modificados y sus usos.
AR072596A1 (es) 2008-07-23 2010-09-08 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Un complejo proteico que comprende una proteina dimerica y un polimero no peptidico
PL2337846T3 (pl) 2008-09-26 2018-06-29 Ambrx, Inc. Mikroorganizmy i szczepionki z replikacją zależną od nie-naturalnych aminokwasów
CA2737026C (en) 2008-09-26 2019-12-24 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
NZ593649A (en) 2008-12-23 2013-11-29 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside analogs
TW201031675A (en) 2008-12-23 2010-09-01 Pharmasset Inc Synthesis of purine nucleosides
CA2748057C (en) 2008-12-23 2018-07-03 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidates
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
TWI583692B (zh) * 2009-05-20 2017-05-21 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
KR101763808B1 (ko) 2009-06-04 2017-08-16 노파르티스 아게 ＩｇＧ 콘쥬게이션을 위한 자리의 확인 방법
PE20121799A1 (es) 2009-12-21 2013-01-02 Ambrx Inc Polipeptidos de somatotropina porcina modificados y sus usos
EA201290541A1 (ru) 2009-12-21 2013-05-30 Амбркс, Инк. Модифицированные бычьи соматотропиновые полипептиды и их применение
CN102188715A (zh) * 2010-03-03 2011-09-21 北京双鹭药业股份有限公司 一类蛋白质多肽的复合分子及应用
EP2542569B1 (de) 2010-03-05 2020-09-16 Omeros Corporation Chimäre hemmermoleküle mit komplementaktivierung
US8563530B2 (en) 2010-03-31 2013-10-22 Gilead Pharmassel LLC Purine nucleoside phosphoramidate
KR101715981B1 (ko) 2010-03-31 2017-03-13 길리애드 파마셋 엘엘씨 뉴클레오사이드 포스포르아미데이트
JP2013528374A (ja) 2010-05-10 2013-07-11 パーシード セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｖｌａ４のポリペプチド阻害剤
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
AU2011291943B2 (en) 2010-08-17 2015-01-22 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
SG190357A1 (en) * 2010-11-19 2013-06-28 Venus Remedies Ltd Novel conjugates for targeted drug delivery
EP3042910B1 (de) 2010-11-30 2019-01-09 Gilead Pharmasset LLC 2'-spiro-nukleoside zur therapie von hepatitis c
EP2726502A1 (de) 2011-07-01 2014-05-07 Bayer Intellectual Property GmbH Relaxin-fusionspolypeptide und ihre verwendung
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
EP2859017B1 (de) 2012-06-08 2019-02-20 Sutro Biopharma, Inc. Antikörper mit nichtnatürlichen stellenspezifischen aminosäureresten, verfahren zu deren herstellung und verfahren zu deren verwendung
EP3135690A1 (de) 2012-06-26 2017-03-01 Sutro Biopharma, Inc. Modifizierte fc-proteine mit stellenspezifischen nichtnatürlichen aminosäureresten, konjugate daraus, verfahren zu deren herstellung und verfahren zu deren verwendung
EP3584255B1 (de) 2012-08-31 2022-02-16 Sutro Biopharma, Inc. Modifizierte aminosäuren mit einer azidogruppe
ES2865473T3 (es) 2013-07-10 2021-10-15 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
SI3650014T1 (sl) 2013-08-27 2022-01-31 Gilead Pharmasset Llc Formulacija kombinacije dveh protivirusnih spojin
US9840493B2 (en) 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
PE20170950A1 (es) 2014-10-24 2017-07-13 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (fgf-21) modificados y usos de los mismos
EA037151B1 (ru) * 2014-11-06 2021-02-11 Фармаэссентия Корпорейшн Способ лечения с использованием пегилированного интерферона
CN107226858B (zh) * 2016-03-23 2020-12-29 清华大学 干扰素高分子结合体ifn-pmpc的制备及其应用
KR20220147721A (ko) 2016-11-14 2022-11-03 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
ES2963839T3 (es) 2017-02-08 2024-04-02 Bristol Myers Squibb Co Polipéptidos de relaxina modificados que comprenden un potenciador farmacocinético y usos de los mismos
US20220056093A1 (en) 2018-09-11 2022-02-24 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
CN113366015A (zh) 2018-10-19 2021-09-07 Ambrx公司 白细胞介素-10多肽缀合物、其二聚体及其用途
CA3128081A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods and uses of antibody-tlr agonist conjugates
EP4117732A1 (de) 2020-03-11 2023-01-18 Ambrx, Inc. Interleukin-2-polypeptidkonjugate und verfahren zur verwendung davon
EP3954393A1 (de) 2020-08-13 2022-02-16 Bioasis Technologies Inc. Kombinationstherapien zur verabreichung über die blut-hirn-schranke hinweg
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
EP4313163A1 (de) 2021-04-03 2024-02-07 Ambrx, Inc. Anti-her2-antikörper-wirkstoff-konjugate und verwendungen davon

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
EP0000938B1 (de) * 1977-08-22 1984-10-17 National Research Development Corporation Makromolekulare kovalente Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
EP0098110B1 (de) * 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Zusammensetzung mit längerer Wirkung
DE3572982D1 (en) * 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4680338A (en) * 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5004605A (en) * 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US5162430A (en) * 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2069082T3 (es) * 1989-08-07 1995-05-01 Debio Rech Pharma Sa Derivados polimericos de farmacos biologicamente activos.
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
US5386014A (en) * 1989-11-22 1995-01-31 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable, non-immunogenic red blood cell substitute
JPH06506217A (ja) * 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
CA2101361A1 (en) * 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
ATE214940T1 (de) * 1993-11-10 2002-04-15 Enzon Inc Verbesserte interferon-polymerkonjugate

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