DE69637385T2 - DNS-Segmente und Verfahren zur Erhöhung von Polysaccharid-Produktion - Google Patents

DNS-Segmente und Verfahren zur Erhöhung von Polysaccharid-Produktion Download PDF

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen und Fragmente derselben, die an der Biosyntheseproduktion von Sphinganpolysacchariden von Sphingomonas sp. beteiligt sind und aus Sphingomonas sp. isoliert werden. Die isolierten DNA-Fragmente können in die gleichen oder unterschiedliche Stämme von Sphingomonas sp. oder verwandte Bakterien in mehreren Kopien eingearbeitet werden, um die Polysaccharid-, vorzugsweise Sphinganproduktion zu erhöhen. Die exogene DNA enthaltenden, gentechnisch veränderten Bakterien produzieren signifikant größere Mengen Polysaccharid im Vergleich zu nicht gentechnisch veränderten Bakterien unter identischen Fermentationsbedingungen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Stämmen von Sphingomonas sp. und anderen verwandten Bakterien derart, dass sie Hyperproduzenten von Polysaccharid sind, sowie die gentechnisch veränderten Bakterien. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von DNA-Sequenzen, die zum Erhöhen der Produktion von Sphinganpolysacchariden in Sphingomonas sp. verwendbar sind, werden ebenfalls beschrieben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Zahl von Mikroorganismen produziert extrazelluläre Polysaccharide, die auch als Exopolysaccharide oder EPS bekannt sind. Zu den Exopolysacchariden gehören Xanthangummi und eine Gruppe von Polysacchariden, die als "Sphingane" bekannt sind. "Sphingane" werden durch gramnegative Bakterien der Gattung Sphingomonas produziert.
  • Die "Sphingane" sind kapselartige Polysaccharide, die ähnliche, jedoch nicht identische Strukturen aufweisen und durch Mitglieder der Gattung Sphingomonas sezerniert werden (T. J. Pollock, 1993, J. Gen. Microbiol. 139: 1939–1945). Die verschiedenen Sphingane weisen unterschiedliche Nebengruppen auf und entweder L-Rhamnose oder L-Mannose findet sich an einer Position im Rückgrat. L-Mannose selbst ist in der Natur äußerst selten. Wässrige Lösungen der Polymere weisen einzigartige und verwendbare rheologische Eigenschaften auf (siehe R. Moorhouse 1987, "Structure/property relationships of a family of microbiol polysaccharides", S. 187–206, in M. Yalpani (Hrsg.), Industrial polysaccharides: genetic engineering, structure/property relations and applications. Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam). Es ist nicht klar, wie die Strukturvariationen in den Polymeren zu deutlich verschiedenen rheologischen Eigenschaften führen.
  • Xanthomonas campestris ist ein gramnegatives Bakterium, das ein Exopolysaccharid, Xanthangummi, in großen Mengen konstitutiv produziert. Jeanes et al., J. Appl. Polymer Sci., 5, 519–526 (1961). Die Biosynthese von Xanthangummi wurde wegen dessen kommerzieller Bedeutung ziemlich detailliert untersucht. Vor kurzem wurde ein weiteres bakterielles Exopolysaccharid, Gellan, als Geliermittel entwickelt. Es ist ein Mitglied der Sphinganfamilie von Polysacchariden, die S-88 (siehe Kang und Veeder, US-Patent 4 535 153 ), Welan (siehe Kang und Veeder, US-Patent 4 342 866 ), NW11 (siehe Robison und Stipanovic, US-Patent 4 874 044 ), Rhamsan (siehe Peik et al., US-Patent 4 401 760 ), S-198 (siehe Peik et al., US-Patent 4 529 797 ), S-657 (siehe Peik et al., europäische Patentanmeldung 209277A1 ) und Heteropolysaccharid-7 (siehe Kang und McNeely, US-Patent 4 342 866 ) umfasst.
  • Die obigen Dokumente umfassen mehrere Patente, die Sphinganpolysaccharidzusammensetzungen betreffen. Keines der Patente betrifft auch nur entfernt den Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
    Stamm Sphingan Patentnummer
    ATCC31461 Gellan 4 326 053
    S60 S-60
    ATCC31554 S-88 4 535 153
    S88
    ATCC31853 S-198 4 529 797
    S198
    ATCC21423 S-7 3 960 832
    S7
    ATCC31555 Welan 4 342 866
    S130 S-130
    ATCC31961 Rhamsan 4 401 760
    S194 S-194
    ATCC53159 S-657 EP-0209277
    S-657
    ATCC53272 NW-11 4 874 044
    NW11
  • Die chemischen Strukturen der Sphinganpolysaccharide sind alle in gewisser Weise miteinander verwandt. Die Hauptkette jedes Sphingans besteht aus einer verwandten Sequenz von vier Zuckern – D-Glucose, D-Glucuronsäure, L-Mannose und L-Rhamnose. Polysaccharidmitglieder der Sphingangruppe sind aufgrund der Kohlehydrate, die das Polymerrückgrat (Hauptkette) und die Seitenketten umfassen, voneinander unterscheidbar. Die Sphingankohlehydrate können Kohlehydratseitenketten und an Kohlehydraten am Polymergerüst befestigte Acetyl- oder Glyceratgruppen enthalten.
  • Verschiedene Sphingane sind als Spezialpolymere und als Additive in Textilanwendungen, Nahrungsmitteln, Kosmetika, Papier, Lacken, Zementen, beispielsweise als Viskositätsmodifizierungsmittel, in verschiedenen anderen Beschichtungsanwendungen und als Klebstoffe und Additive für Erdölprodukte und Spezialchemikalien verwendbar.
  • Der Brennpunkt erster Untersuchungen, die in der vorliegenden Erfindung kulminierten, lag auf der ersten Stufe in der Biosynthese eines repräsentativen Sphinganpolysaccharids S-88. Dieses Sphingan wird durch den Sphingomonas-Stamm S-88 biosynthetisiert. Vor der vorliegenden Erfindung war bekannt, dass einige, jedoch nicht alle bakterielle Polysaccharidbiosynthesen von anderen Polysacchariden als Sphinganen einen Isoprenylphosphatträger nutzen. Beispielsweise ist im Falle der Xanthangummibiosynthese durch X. campestris, da die Hauptkette von Xanthangummi nur Glucose enthält, die erste Synthesestufe wahrscheinlich die Übertragung eines Glucosephosphats von UDP-Glucose auf einen C55-Isoprenylphosphat(IP)-Träger. Mit zellfreien Einarbeitungsassays stellten Ielpi et al., FEBS Lett., 130, 253 (1982) und J. Bacteriol., 175, 2490 (1993), fest, dass Glucose und anschließend eine zweite Glucose und dann Mannose, Glucuronsäure und Mannose aufeinanderfolgend an Träger-IP unter Zusammenbau der Wiederholungseinheit von Xanthangummi addiert werden. Ganz ähnlich wird die Wiederholungsuntereinheit Colansäure in Escherichia coli durch zunächst Übertragung von Glucose-P auf IP zusammengebaut; Johnson und Wilson, J. Bacteriol., 129, 225 (1977). Im Gegensatz dazu wird im Falle der Synthese von Succinoglycanpolysacchariden durch Rhizobium meliloti, ein Galactose-P als erstes auf IP übertragen; siehe Tolmasky et al., J. Biol. Chem., 257, 6751 (1982). Isoprenylträger sind jedoch nicht an der Synthese von Dextran- oder Lävanpolysacchariden beteiligt und die Rolle von Isoprenylträgern in der Alginatsynthese ist nicht bekannt.
  • Vor der Untersuchung, die zur vorliegenden Erfindung führte, war die Bedeutung der Rolle des Trägers in der komplexen Kinetik der Biosynthese von Polysacchariden nicht bekannt. Ferner war nicht bekannt, welche Rolle der Isoprenylphosphatträger in der Gesamtsynthese von Sphinganpolysacchariden in Sphingomonas-Bakterien spielen kann.
  • Zuvor zeigten Genkomplementierungstests, dass eine spezielle Klasse von Mutationen in X. campestris, die gleichzeitig Bacr und Gum (Bacitracin-resistent und Xanthangumminegativ) sind, innerhalb des gumD-Gens, das zur Übertragung von Glucose-P von UDP-Glc auf IP unter Bildung von Glc-PPI erforderlich ist, kartiert ist; Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., Band 176, S. 6229–6237, Vanderslice et al., "Genetic Engineering of polysaccharide structure in Xanthomonas campestris", S. 145–156, in V. Crescenzi et al., Biomedical and Biotechnological Advances in Industrial Polysaccharides, Gordon and Breach Science Publishers, New York und N. E. Harding und Y. N. Patel, 1993, Faseb Journal, Band 7, Nummer 7. Die letzte Verweisstelle offenbart Fragmente von DNA, die die Synthese von Sphingan S-60 an nichtproduzierenden Mutanten wiederherstellen können, sie macht jedoch keine Angabe einer erhöhten Synthese in Bezug auf den Stamm des Wildtyps. Frühere Versuche zeigten auch, dass das gumD-Gen des Wildtyps von X. campestris die Synthese von Sphinganen in analogen Bacr Sps (Sphinganpolysaccharidnegativen) Mutanten der Sphingomonas-Stämme S88 und NW11 wiederherstellen konnte. Es wurde angenommen, dass Bacr Sps Sphingomonas-Mutanten auch im Hinblick auf die Übertragung von Glucose-P auf IP blockiert zu sein schienen.
  • Aufgaben der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von DNA-Segmenten, die von Sphingomonas sp. isoliert werden und zur Verstärkung der Produktion von Sphinganpolysaccharid in einer Zahl von Mikroorganismen und insbesondere einer Zahl von Sphingomonas-Stämmen verwendet werden können.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Hyperproduzentenstämmen von Mikroorganismen und insbesondere einer Zahl von Stämmen von Sphingomonas, die signifikant mehr Sphinganpolysaccharid als nicht gentechnisch veränderte Stämme produzieren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Stämmen von Mikroorganismen und insbesondere Stämmen von Sphingomonas sp., die Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid sind.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von DNA-Segmenten, die in Sphingomonas-Stämme derart insertiert werden können, dass der erhaltene, gentechnisch veränderte Mikroorganismus ein Hyperproduzent von Sphinganpolysaccharid wird.
  • Diese und/oder weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung können der Beschreibung der Erfindung, die folgt, ohne weiteres entnommen werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In der vorliegenden Erfindung werden DNA-Sequenzen als Segmente oder Fragmente, die die Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein SpsB von ATCC31554, SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen, aus sphinganproduzierenden Bakterien der hinterlegten Sphingomonas-Stämme ATCC31554, ATCC53272 oder ATCC31461 isoliert. Das erhaltene Genmaterial wird kloniert, als Mehrfachkopien in sphinganproduzierende oder -nichtproduzierende Mutanten von Sphingomonas oder verwandten Bakterien eingebaut. Diese DNA-Sequenzen erwiesen sich als verwendbar zur Wiederherstellung der Sphinganproduktion in mutierten Bakterien, die kein Sphingan produzieren. Darüberhinaus wurde unerwarteter Weise ermittelt, dass die Wiederherstellung der Sphinganproduktion in diesen Mutanten mit der Produktion von Sphinganmengen, die signifikant größer als die von Stämmen des Wildtyps, die Sphingan produzieren, erwartete Produktion sind, gekoppelt ist.
  • Wir entdeckten unerwarteterweise, dass DNA-Segmente oder -Fragmente, die die Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein SpsB von ATCC31554, SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen, die aus den definierten Sphingomonas-Stämmen isoliert werden, als Mehrfachkopien in sphinganproduzierende oder mutierte-nichtproduzierende Bakterien des gleichen Stamms oder unterschiedlicher Stämme von Sphingomonas insertiert werden können, wobei das erhaltene, gentechnisch veränderte Bakterium ein Hyperproduzent von Sphingan wird. Dies ist insbesondere insofern unerwartet, als die DNA-Segmente oder -Fragmente, die aus beispielsweise Sphingomonas S60 isoliert wurden und in den Sphingomonas-S88-Wildtyp oder nichtmucoide Mutanten insertiert wurden, einen gentechnisch veränderten Hyperproduzenten von S-88-Sphingan, das generell nicht mit S-60-Sphingan kontaminiert ist, produzieren. Diese Komplementierung kann auf ziemlich breite Weise für verschiedene Stämme von Sphingomonas (Komplementierung zwischen Stämmen) und auch zur Produktion von Xanthangummi in Xanthomonas campestris (intergenerische Komplementierung) verwendet werden.
  • Wir entdeckten ferner ein Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter, hyperproduzierender Sphingomonas-Bakterien, die die DNA-Segmente oder -Fragmente, die die Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein SpsB von ATCC31554, SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen, die aus sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stämmen isoliert wurden, enthalten. Die DNA, die aus sphinganproduzierenden Bakterien isoliert ist, wird zunächst kloniert und dann in sphinganproduzierende Sphingomonas-Stämme oder von sphinganproduzierenden Stämmen abgeleitete nichtmucoide Mutanten wieder eingebaut.
  • Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül bereit, das ein erstes DNA-Segment umfasst, wobei das erste DNA-Segment
    • (a) aus sphinganproduzierenden Bakterien der Sphingomonas sp. ATCC31554 isoliert ist, wobei das isolierte DNA-Molekül die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz aufweist, oder ein Fragment desselben ist und die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC31554 umfasst; oder
    • (b) ein aus Sphingomonas sp. ATCC53272 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli sp. ATCC69733 insertiert ist, oder ein Fragment desselben ist, wobei das erste DNA-Segment die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC53272 umfasst; oder
    • (c) ein aus Sphingomonas sp. ATCC31461 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311 von Sphingomonas sp. ATCC69744 insertiert ist, oder ein Fragment desselben ist, wobei das erste DNA-Segment die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC31461 umfasst, wobei das DNA-Molekül, wenn es in ein Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium in mehreren Kopien eingearbeitet ist, einen Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid gegenüber dem Empfängerbakterium ergibt, wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
      Figure 00080001
      worin Glc für Glucose steht, GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht; X für Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht; W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht; die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass das Rückgrat W und Z ausschließt, wenn v und y gleich 0 sind.
  • Das DNA-Molekül kann die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz aufweisen. Das erste DNA-Segment kann das aus Sphingomonas sp. ATCC31554 erhaltene DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli ATCC69734 insertiert ist; das aus Sphingomonas sp. ATCC31554 erhaltene DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli ATCC69735 insertiert ist; das aus Sphingomonas sp. ATCC31461 erhaltene DNA-Segment, das in pRK311 von Sphingomonas sp. ATCC69744 insertiert ist; ein Restriktionsfragment, das durch Verdau des zweiten DNA-Segments mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz mit dem Restriktionsenzym HindIII, BamHI oder EcoRI erhalten wird; oder ein etwa 13-kb-Restriktionsfragment, das durch Verdau eines dritten DNA-Segments von Sphingomonas sp. ATCC53272 mit dem Restriktionsenzym Hind III erhalten wird, sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung eines Bakteriums, das von einem Sphingomonas sp.-Stamm stammt, zu einem Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid bereit,
    wobei das Verfahren das Einarbeiten des isolierten DNA-Moleküls gemäß der obigen Definition in ein Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium in mehreren Kopien zur Erzeugung eines Bakteriums, das Sphinganpolysaccharid gegenüber dem Empfängerbakterium unter identischen Fermentationsbedingungen überproduziert, umfasst, wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 00090001
    worin Glc für Glucose steht, GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht; X für Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht; W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht; die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass das Rückgrat W und Z ausschließt, wenn v und y gleich 0 sind.
  • Das Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium kann ein sphinganproduzierender Stamm sein, beispielsweise ein Mitglied eines Sphingomonas-Stammes, das aus der Gruppe von ATCC31554, ATCC31461, ATCC31853, ATCC21423, ATCC31555, ATCC31961, ATCC53159 und ATCC53272 ausgewählt ist. Bevorzugte Sphingomonas-Stämme sind ATCC31554, ATCC31461 und ATCC53272.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Bakterium bereit, das von einem Sphingomonas sp.-Stamm abgeleitet ist, wobei das Bakterium mehrere Kopien eines DNA-Moleküls gemäß der Erfindung nach der obigen Beschreibung enthält, was dazu führt, dass das Empfängerbakterium ein Hyperproduzent von Sphinganpolysaccharid ist. Das Empfängerbakterium kann ein sphinganproduzierender Stamm eines Sphingomonas sp.-Bakteriums, beispielsweise wie oben beschrieben, oder Sphingomonas sp. ATCC69735 oder ATCC69744 sein. Das auf diese Weise hergestellte Bakterium kann in einem Verfahren zur Produktion von Sphingan verwendet werden, wobei das Verfahren das Kultivieren des Sphingomonas-Bakteriums in einer Fermentationsbrühe zur Produktion von Sphingan und das Isolieren des Sphingans aus der kultivierten Fermentationsbrühe umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von Sphingan in einem Sphingomonas-Bakterium bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • 1) Einarbeiten eines DNA-Moleküls der Erfindung gemäß der obigen Beschreibung in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium in mehreren Kopien zur Bildung eines Bakteri ums, das Sphinganpolysaccharid gegenüber dem Empfängerbakterium überproduziert;
    • 2) Kultivieren des Bakteriums von Stufe 1 in einer Fermentationsbrühe zur Produktion von Sphingan; und
    • 3) Isolieren des Sphingans von Stufe 2, wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
      Figure 00110001
      worin Glc für Glucose steht, GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht; X für Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht; W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht; die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass das Rückgrat W und Z ausschließt, wenn v und y gleich 0 sind. Das Empfängerbakterium kann ein sphinganproduzierender Stamm eines Sphingomonas sp.-Bakteriums gemäß der obigen Beschreibung sein.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ferner gentechnisch veränderte Sphingomonas-Bakterien, in die die oben beschriebenen isolierten DNA-Segmente oder -Fragmente insertiert sind. Diese gentechnisch veränderten Bakterien enthalten mehrere Kopien von isolierten DNA-Segmenten oder -Fragmenten gemäß der vorliegenden Erfindung. Die gentechnisch veränderten Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung sind Hyperproduzenten von Sphingan.
  • Die DNA-Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Techniken, die ohne weiteres einschlägig bekannt sind, isoliert, gewonnen und kloniert werden. Danach wird die DNA in Bakterien der Gattung Sphingomonas in mehreren Kopien, generell als extrachromosomale oder Plasmid-DNA insertiert. Nach der Insertion in die Zielbakterien wird die Produktion von Sphingan durch Fermentieren der gentechnisch veränderten Bakterien unter den gleichen Bedingungen wie eine identische Konzentration von nicht-gentechnisch veränderten, sphinganproduzierenden Bakterien des gleichen Stamms bestimmt. Hyperproduzenten werden durch deren erhöhte Sphinganproduktion, bezogen auf den nicht-gentechnisch veränderten, sphinganproduzierenden Stamm bestimmt. DNA-Sequenzen zur Verstärkung der Produktion von Sphinganpolysaccharid von tatsächlich jedem beliebigen Mitglied von sphinganproduzierenden Sphingomonas sp.-Bakterien können unter Verwendung dieses Verfahrens ohne weiteres bestimmt werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Diagrammdarstellung der Restriktionsenzymspaltungsstellen eines DNA-Segments von 34 Kilobasennucleotideinheiten, das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms S88 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31554) isoliert wurde. Eine Zahl der in 1 präsentierten DNA-Sequenzen wurde in Sphingomonas-Bakterien insertiert und auf deren Fähigkeit zur Verstärkung der Sphinganproduktion untersucht. Restriktionsstellen für mehrere Enzyme sind ebenfalls in 1 (sowie den 2, 3, 8, 9 und 10) angegeben: B (BamHI), Bg (BglII), E (EcoRI), H (HindIII) und S (SalI). Die in 1 angegebene spsB-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SpsB codiert.
  • 2 ist eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymspaltungsstellen eines DNA-Segments (etwa 28 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms S60 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31461) isoliert wurde. Restriktionsstellen für diese DNA-Sequenz sind in 2 als die Stellen B, E und H angegeben. Die sgeB-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SgeB codiert.
  • 3 ist eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymstellen eines DNA-Segments (etwa 33 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms NW11 (ATCC-Hinterlegungsnummer 53272) isoliert wurde. Restriktionsstellen für diese DNA-Sequenz sind in 3 als die Stellen E, H, B, Bg und S angegeben. Die snwB-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SnwB codiert.
  • 4 ist eine Diagrammdarstellung der DNA-Sequenz, die dem etwa 1950 Basenpaare enthaltenden spsB-Gen des Sphingomonas-Stamms S88 entspricht.
  • 5 ist eine Diagrammdarstellung einer abgeleiteten Aminosäuresequenz des SpsB-Proteins des Sphingomonas-Stamms S88.
  • 6 ist eine Diagrammdarstellung der chemischen Strukturen einer Zahl von Sphinganpolysacchariden, die für die durch die vorliegende Erfindung produzierten repräsentativ sind.
  • 7 ist eine Karte des Aufbaus der Plasmide pSEB24 und PSEB26, die detailliert in den Beispielen 6 und 12 der vorliegenden Anmeldung angegeben sind. Mcs1 ist eine multiple Klonierungsstelle, die die folgenden Restriktionsstellen (im Uhrzeigersinn, von oben): EcoRI, SmaI, BamHI, SalI, PstI, und HindIII umfasst. In ähnlicher Weise umfasst Mcs2 (im Uhrzeigersinn, von oben): HindIII, PstI, SalI, XbaI, BamHI, SmaI, SstI und EcoRI. OriT ist der Startpunkt der Konjugationsübertragung, OriV ist ein Replikationsursprung für einen breiten Wirtsbereich und ori ist der Replikationsursprung von pUC12 und 13.
  • 8 ist eine Diagrammdarstellung der Restriktionsenzymspaltungsstellen eines DNA-Segments mit 34 Kilobasennucleotideinheiten, das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms S88 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31554) isoliert wurde.
  • Die Restriktionsstellen für mehrere Enzyme sind ebenfalls in 1 (sowie 2 und 3) angegeben: B (BamHI), Bg (BglII), E (EcoRI), H (HindIII) und S (SalI). Die spsB-Region, die in 8 (auch 1) angegeben ist, entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SpsB codiert. Andere "sps"-Gene, die an der Sphinganbiosynthese beteiligt sind, sind durch Großbuchstaben angegeben: G, S, R, Q, I, K, L, J, F, D, C und E. Die als rhsACBD bezeichneten Gene geben die Kartenposition der Gene an, die an der Synthese einer Vorstufe für Sphingane: dTDP-(L)Rhamnose beteiligt sind. Die Gene 32, 26, 31 und 34 sind nicht-identifizierte offene Translationsleseraster und die atrDB-Gene codieren für eine Transportfunktion, die in keiner Beziehung zur Sphingansynthese steht. "Sec" gibt ein zur Sekretion von Sphinganen benötigtes Gen an und "Trase" gibt ein Gen an, das für ein Enzym codiert, das einen Zucker von einer Nucleotidzuckervorstufe zu Sphingan während des Zusammenbaus der Sphinganwiederholungseinheit überträgt.
  • 9 ist eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymspaltungsstellen eines DNA-Segments (etwa 42 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms S198 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31853) isoliert wurde. Restriktionsstellen für diese DNA-Sequenz sind in 9 als H (HindIII) und E (EcoRI) angegeben. Die Reihenfolge von eng beabstandeten Stellen, die in Klammern eingeschlossen sind, ist unbekannt. Die seitlichen Erstreckungen der Cosmidklone c2, c3, c4, c5 und des Subklons L242 sind als gestrichelte Linien angegeben. Die kastenförmige "B"-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein codiert, das Mutanten in dem S88-Gen spsB komplementiert.
  • 10 ist eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymspaltungsstellen eines DNA-Segments (etwa 42 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms S7 (ATCC-Hinterlegungsnummer 21423) isoliert wurde. Restriktionsstellen für diese DNA-Sequenz sind in 10 als H (HindIII), E (EcoRI) und B (BamHI) angegeben. Die seitlichen Erstreckungen der Cosmidklone c1, c2, c3 und c6 sind als gestrichelte Linien angegeben. Die Klone c2 und c3 erstrecken sich über die rechts in 10 angegebene Region hinaus. In ähnlicher Weise erstreckt sich der Klon c6 nach links. Die kastenförmige "B"-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein codiert, das Mutanten in dem S88-Gen spsB komplementiert.
  • 11 ist eine Diagrammdarstellung des Genclusters zur Sphingan-S-88-Synthese. In der Mitte der Karte befinden sich die Gennamen, -grenzen, vorgeschlagenen Funktionen und Nucleotidpositionen von Restriktionsenzymspaltungsstellen (B, BamHI; E, EcoRI; und H, HindIII). Klonierte Fragmente (c1Δ3, c2, c3, c4, c5 und c6), subklonierte Segmente (benannt nach dem verwendeten Restriktionsenzym und der näherungsweisen Länge in kbp) und Deletionen, die in dem S88-Chromosom erzeugt wurden, (jede Linie steht für das Vorhandensein von DNA) sind unter der Genkarte angegeben. Nach oben sind die Namen und Positionen von spontanen Sps Mutationen, Sps(+)- oder (–)-Komplementierungsergebnisse und die Sps-Phänotypen, die durch spezifische Insertionsmutationen in Plasmiden und dem S88-Chromosom verursacht werden, angegeben. Die mini-Tn10kan-Insertionen pZ167, pZ168, pZ180, pZ202 und pZ206 befanden sich in dem c2-Segment, das in das Plasmid pRK311 kloniert und in einen der zwei Deletionsstämme: ΔTn493 oder ΔTn495 eingeführt war. In ähnlicher Weise waren alle anderen Plasmidinsertionen in dem c3-Segment und in die Deletionsstämme ΔTn358 und 365 eingeführt. Die Positionsgenauigkeit für die mini-Tn10kan-Insertionen beträgt ± 50 bp, bezogen auf die sequenzierten Restriktionsstellen, während die graphische Genauigkeit ± 100 bp ist.
  • 12 zeigt das Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von SpsB und Glycosyl-IP-Transferasen. Die Zahlen rechts sind Restenummern für die äußerste rechte Aminosäure auf jeder Zeile. In jedem Zeilensatz befinden sich die Galactosyl-IP-Transferasen unmittelbar über der Sequenz für SpsB und die Glucosyl-IP-Transferasen darunter. Die Genprodukte sind rechts angegeben: ExoYn, Rhizobium sp. NGR234 (Gray et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 193); CpsD, S. agalactiae (Rubens et al., 1993, Mol. Microbiol., 8: 843); RfbP, S. enterica LT2 (Jiang et al., 1991, Mol. Microbiol., 5: 695); GumD, X. campestris B1459S-4L (Capage et al., 1987, internationales Patent WO/05938 ); Pss4, R. leguminosarum bv. viciae-Stamm VF39 (GenBank-Hinterlegungsnummer M93042); und Pss2, R. leguminosarum bv. phaseoli (Borthakur et al., 1988, Mol. Gen. Genet., 213: 155). Symbole: | gibt identische Aminosäuren für SpsB und Galactosyl- oder Glucosyl-IP-Transferasen darüber bzw. darunter an;: gibt eine konservative Aminosäuresubstitution auf der Basis der folgenden Gruppen verwandter Aminosäuren an: IFVWML, ST, QNED und HKR. Unterstrichene Sequenzen sind fortlaufende Segmente von etwa 20 hydrophoben Aminosäuren.
  • 13 zeigt die Alignments der rhsA-, B-, C- und D-Genprodukte und der dTDP-L-Rhamnose-Biosyntheseenzyme von S. enterica (Jiiang et al., 1991, Molecular Microbiology, 5: 695–713) und X. campestris (Köplin et al., 1993, J. Bacteriol., 175: 7786–7792) an. Die Symbole sind die gleichen wie in 12.
  • 14 ist eine Diagrammdarstellung der gesamten DNA-Sequenz des DNA-Segments, das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms S88 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31554) isoliert wurde, das der in der Restriktionskarte von 8 angegebenen Nucleotidsequenz (von Basenpaar 0 bis Basenpaar 28.800) entspricht.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die im Folgenden angegebenen Ausdrücke sollen durchgängig in der Beschreibung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden und haben die angegebene Bedeutung:
    • 1. Der Ausdruck "Sphingan" wird in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er eine Zahl verwandter, jedoch deutlich verschiedener Exopolysaccharide, die durch Mitglieder der Gattung Sphingomonas sezerniert werden, bezeichnet (Pollock, J. Gen. Microbiology 139: 1939–1945, 1993). Die Strukturen der Sphingane sind alle irgendwie verwandt. Die Hauptkette jedes Sphingans besteht aus einer verwandten Sequenz von vier Zuckern – D-Glucose, D-Glucuronsäure, L-Mannose und L-Rhamnose. Polysaccharidmitglieder der Sphingangruppe sind voneinander aufgrund der Kohlehydrate, die das Polymerrückgrat und die Seitenketten umfassen, unterscheidbar. Die Sphinganpolysaccharide können Kohlehydratseitenketten und an Kohlehydrate am Polymerrückgrat befestigte Acetyl- oder Pyruvylgruppen enthalten. Siehe Mikolajczak et al., Appl. and Env. Microbiol., 60: 402, (1994). Die Diagrammdarstellung der chemischen Strukturen verschiedener Sphingane, die unter Verwendung der DNA-Segmente und -Fragmente und der allgemeinen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, sind generell in 6 angegeben. Die Strukturen der Sphingane Gellan (S-60), Welan (S-130), Rhamsan (S-194), S-88, NW-11, S-198 und S-657 sind generell in 6 angegeben.
  • Typischerweise können Mitglieder der Sphingan-Polysaccharidfamilie durch die folgende allgemeine chemische Wiederholungsstruktur dargestellt werden:
    Figure 00170001
    worin Glc für Glucose steht; GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht; X für Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht; W an den Glc-Rest 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha stehen kann; die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt. Der hierin verwendete Ausdruck "Rückgrat" oder "Hauptkette" bezeichnet den Teil der Struktur, der die Ketten W und Z ausschließt, d. h., wenn v und y gleich 0 sind. Das "reduzierende Ende des Polymers" ist das Ende des Polymers, an das Zuckereinheiten während der Biopolymerisation addiert werden.
  • Einige Mitglieder der Sphinganpolysaccharidfamilie sind an verschiedenen Positionen acetyliert. Jedoch können die Polysaccharide einer chemischen Deacylierung auf herkömmliche Weise zur Entfernung der Acylgruppen unterzogen werden. Beispielsweise weist Gellan das gleiche Kohlehydratgerüst wie Welan (d. h. X = Rha) auf, doch fehlt ihm der Seitenkettenzucker (d. h. v = 0 und y = 0) und der Glucoserest 1 ist vollständig mit Glycerat substituiert. Die Gellanuntereinheitenstruktur ist ebenfalls am Glucoserest 1 partiell acetyliert.
    • 2. Der Ausdruck "Sphingomonas" wird in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er Stämme von gramnegativen Bakterien der Gattung Sphingomonas, die Exopolysaccharide oder Sphingane produzieren, wie oben beschrieben, bezeichnet. Eine Zahl gramnegativer Bakterien der Gattung Sphingomonas kann in der vorliegenden Erfindung entweder als Quelle für isolierte DNA-Sequenzen, die in andere Stämme sphinganproduzierender Bakterien (vorzugsweise gramnegative Bakterien der Gattung Sphingomonas) reinsertiert werden können, wobei Sphinganhyperproduzenten gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet werden, oder als Zielbakterium zur Inser tion von exogenen DNA-Sequenzen, wobei Sphinganhyperproduzenten gebildet werden, verwendet werden.
  • Die sphinganproduzierende Familie gramnegativer Bakterien wurde 1993 zum ersten Mal als zur Gattung Sphingomonas gehörend identifiziert. Siehe Pollock, J. Gen. Microb., 139, 1939 (1993). Es wurde noch nicht genau festgestellt, zu welcher Art die einzelnen Stämme gehören. Die den sphinganproduzierenden Stämmen von Sphingomonas nächstliegende Art scheint Sphingomonas paucimobilis zu sein. Jedoch ist es verfrüht, diese Stämme als zu dieser Art gehörend zu bezeichnen, bevor nicht eine detaillierte und endgültige taxonomische Analyse verfügbar ist. Es ist anzumerken, dass die Sphinganproduzenten der Gattung Sphingomonas zunächst in mehreren unterschiedlichen Gattungen klassifiziert wurden.
  • Die derzeit bekannten Arten von Sphingomonas umfassen S. paucimobilis, S. parapaucimobilis, S. adhaesiva, S. capsulata und S. yanoikuyae. Siehe Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 34, 99 (1990). Früher wurden diese Sphingomonas-Arten fälschlich der Gattung Pseudomonas zugeordnet.
    • 3. Die Ausdrücke "Spender" und "Empfänger" werden jeweils zur Beschreibung von Bakterien verwendet, aus denen DNA-Sequenzen entnommen werden und in die DNA-Sequenzen insertiert oder eingebaut werden.
    • 4. Der Ausdruck "Stamm" oder "Sphingomonas-Stamm" wird zur Beschreibung von gramnegativen Bakterien der Gattung Sphingomonas, die ein spezielles Sphingan-Exopolysaccharid (auf der Basis der chemischen Struktur) produzieren, verwendet. Der Einfachheit halber werden die sphinganproduzierenden Stämme von Sphingomonas durch das durch diesen Stamm produzierte Sphinganpolysaccharid bezeichnet. Beispielsweise produziert der Sphingomonas-Stamm 588 das Sphinganpolysaccharid S88, der Sphingomonas-Stamm S60 das Sphinganpolysaccharid S-60 (Gellan) und dergleichen. Die Sphingomonas-Stämme S88 (ATCC-Nr. 31554), S60 (ATCC-Nr. 31461), NW11 (ATCC-Nr. 53272), S130 (ATCC-Nr. 3155), S194 (ATCC-Nr. 31691), S198 (ATCC-Nr. 31853), S657 (ATCC-Nr. 53159) und S7 (ATCC-Nr. 21423) sind unter anderem repräsentative Stämme, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
    • 5. Der Ausdruck "Hyperproduzent" wird in der gesamten Beschreibung zur Beschreibung von gentechnisch veränderten Bakterien verwendet, die mehrere Kopien von DNA-Segmenten oder -Fragmenten enthalten, die aus dem gleichen Stamm oder einem unterschiedlichen Stamm sphinganproduzierender Bakterien isoliert wurden, die eine signifikant größere Menge (mindestens etwa 5% oder mehr auf Gewichtsbasis) an Sphinganpolysaccharid im Vergleich zu nicht gentechnisch veränderten oder Bakterien des Wildtyps des gleichen Stamms wie die gentechnisch veränderten Bakterien, die unter identischen oder im Wesentlichen identischen Fermentierungsbedingungen fermentiert werden, produzieren.
    • 6. Der Ausdruck "isoliert" wird zur Beschreibung von DNA verwendet, die aus einem Mikroorganismus entfernt und mindestens einem gewissen Reinigungsgrad, d. h. einer oder mehreren Reinigungsstufen, unterzogen wurde. Vorzugsweise wird isolierte DNA in im Wesentlichen reiner Form, d. h. in einer Form, die nur geringe Mengen an kontaminierendem Material enthält, das die Fähigkeit für isolierte DNA, durch Restriktionsenzyme fragmentiert oder segmentiert zu werden, in mehrere Kopien kloniert oder in Plasmidvektoren insertiert oder in anderer Weise in Bakterien insertiert oder eingearbeitet zu werden, nicht beeinflusst, hergestellt.
    • 7. Der Ausdruck "DNA" oder "chromosomale DNA", der in der gesamten Beschreibung in Bezug auf die aus Sphingomonas isolierte DNA verwendet wird, beschreibt DNA, die in den Chromosomen oder endogenen Plasmiden von Sphingomonas sp., generell vor einer Isolierung aus dem Mikroorganismus gefunden wird.
    • 8. Der Ausdruck "Sequenz" wird zur Beschreibung eines speziellen Segments von DNA verwendet, das entweder durch dessen Nucleotideinheiten oder dessen Muster von Stellen zur Restriktionsenzymspaltung identifiziert wird, generell aus DNA eines sphinganproduzierenden Bakteriums der Gattung Sphingomonas unter Verwendung von Restriktionsenzymen isoliert wird, wobei die erhaltene DNA-Sequenz in ein Bakterium zur Bildung eines Hyperproduzenten insertiert oder alternativ einer weiteren Restriktion zur Bildung von gegenüber dieser Sequenz kleineren kleinen Teilen oder Fragmenten von DNA unterzogen wird. Der Ausdruck "Teile" oder "Fragmente" wird zur Beschreibung von DNA-Sequenzen verwendet, die generell kleiner als DNA-Segmente sind. Bevorzugte DNA-Segmente zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind solche, die für Glycosyltransferasen (Glucosyl-, Galactosyl-, Rhamnosyl- und Glucuronosyltransferasen), Glycosyl-IP-Transferasen (die unter anderem Glucosyl-IP-Transferase-, Galactosyl-IP-Transferaseenzyme umfassen), ein Rhamnoseoperon (Synthese einer Rhamnosevorstufe zur Einarbeitung in bestimmte rhamnosehaltige Sphingane) und verschiedene Proteine, die an der Sekretion von Polysacchariden aus Bakterien beteiligt sind, codieren.
    • 9. Die Ausdrücke "insertiert", "Insertieren", "eingearbeitet" oder "Einarbeiten" werden in der gesamten Beschreibung verwendet, um das Verfahren und das Ergebnis der Übertragung von DNA-Segmenten, die aus der chromosomalen DNA eines sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stamms isoliert wurden, in den gleichen oder einen unterschiedlichen aufnehmenden, sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stamm zu beschreiben. Das Ergebnis ist ein Hyperproduzentenstamm, der mindestens zwei Kopien von mindestens einem wesentlichen Teil des übertragenen DNA-Segments enthält.
  • Beispielsweise kann isolierte DNA zunächst in Plasmidvektoren, beispielsweise unter zahlreichen anderen pRK311 oder pSEB24, durch einschlägig bekannte Techniken eingeführt, kloniert und dann durch Konjugation in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium übertragen werden. Nach der Insertion in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium repliziert der das relevante DNA-Fragment enthaltende Plasmidvektor dann in der Empfängerzelle unter Bildung von mehreren (mindestens 2 und üblicherweise 4–20) Kopien des DNA-Segments, das zur Hyperproduktion von Sphinganpolysaccharid notwendig ist. Zusätzlich zu Plasmidvektoren können auch Bakteriophagenvektoren und Transposonvektoren verwendet werden.
  • Eine Zahl von Plasmidvektoren ist zur Verwendung zur Insertion von isolierten DNA-Segmenten oder -Fragmenten in Empfängerbakterien geeignet. Zusätzlich zu den Plasmiden pRK311 und pSEB24, die oben beschrieben sind, sind auch die im Folgenden angegebenen Plasmide unter anderen verwendbar: Plasmide mit breitem Wirtsbereich der Inkompatibilitätsgruppe P-1, wie RK2 und Derivate derselben, wie pRK290, pRK293, pRK404 (Ditta et al., Plasmid, Band 13, S. 149–153) und andere Derivate, die das oriT-Gen enthalten, von dem Plasmid RP4, das eine Plasmidmobilisierung ermöglicht, wie pSUP101 (siehe Simon et al., Bio/technology, November, 1983) sowie die Plasmide pLAFR1 und pLAFR3 (Friedman et al., Gene, 18, 289, 1982), und die Plasmide mit breitem Wirtsbereich der Inkompatibilitätsgruppe Inc-Q, wie RSF1010 und Derivate derselben, wie pMMB22 und pMMB66 (Fürste et al., Gene, 48, 119, 1986).
  • Die Verwendung von Konjugation zur Übertragung der Plasmidvektoren in Empfängerbakterien ist generell wirksam. Bei anderen Bakteriengattungen ist es üblicher, die Transformation kompetenter Zellen mit gereinigter DNA zu verwenden.
  • Elektroporation wurde ebenfalls bei Sphingomonas zur Einführung von DNA-Fragmenten oder Plasmiden in die Bakterien verwendet (siehe 1992, Monteiro et al., J. of App. Bacteriol., 72, 423). Unter Verwendung dieses Verfahrens, ist es mög lich, zwei oder mehrere Zellkopien isolierter DNA-Segmente oder -Fragmente in Sphingomonas-Empfängerbakterien durch einfache Zugabe isolierter DNA zu dem Bakterium und dann Erreichen einer Übertragung über die Zellmembran unter Verwendung des Elektroporationsverfahrens einzuarbeiten.
  • Monteiro et al., aa0, beschreiben die Elektroporation als Mittel zur Einführung von DNA in Sphingomonas. Elektroporation ist funktional das Gleiche wie die Transformation von chemisch behandelten kompetenten Zellen, beispielsweise nach einer Behandlung von Zellen mit Calciumchlorid- oder Rubidiumsalzen. Die zu transformierende DNA wird durch Standardverfahren gereinigt und kann in Plasmidform vorliegen oder auch nicht. Eine Transformation ist jedoch üblicherweise am wirksamsten, wenn die DNA doppelsträngig und geschlossen zirkulär ist. Daher ist es nicht notwendig, das Konjugationsverfahren der Einführung von DNA in Sphingomonas zu verwenden. Noch ist es notwendig, dass die klonierten Segmente in ein Plasmid, einen Bakteriophagen oder Transposonvektor insertiert sind. Vorzugsweise werden jedoch zunächst isolierte DNA in Plasmidvektoren eingeführt und dann die Plasmide, die die isolierten DNA-Fragmente enthalten, in die Bakterien zu übertragen.
  • Das Halten der DNA-Segmente auf Plasmiden oder anderen Vektoren, wie Bakteriophagen- oder Transposonvektoren, in dem Empfänger Sphingomonas ist nicht notwendig. Es ist Routine, zusätzliche Kopien eines DNA-Segments in bakterielle DNA so einzuführen, dass die Segmente in jeder Generation durch den gleichen Mechanismus, der die bakterielle DNA repliziert, repliziert werden. Der folgende Beispielabschnitt enthält zwei Beispiele, die Verfahren zur Einführung zusätzlicher Kopien von DNA in die bakterielle DNA derart, dass die Segmente in jeder Generation durch den gleichen Mechanismus, der die bakterielle DNA repliziert, repliziert werden, detailliert angeben.
    • 10. Der Ausdruck "mehrere Kopien" wird in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er exogene DNA-Sequenzen, -Fragmente oder -Segmente (mindestens wesentliche Teile der DNA) beschreibt, die in Sphingomonas-Bakterien in mindestens zwei und vorzugsweise mindestens vier Kopien eingearbeitet sind. Noch besser liegt die Zahl von Kopien einer DNA-Sequenz, eines DNA-Fragments oder -Segments, die in ein Bakterium der Gattung Sphingomonas insertiert sind, schließlich im Bereich von etwa 4 bis etwa 20. Es ist anzumerken, dass in bestimmten Fällen eine DNA-Sequenz in einen einzigen Plasmidvektor eingebaut werden kann, in das Sphingomonas-Bakterium durch Konjugation übertragen werden kann und das Plasmid in der Empfängerzelle replizieren kann, wobei zwei oder mehrere Kopien der DNA-Sequenz, des DNA-Segments oder -Fragments bereitgestellt werden.
    • 11. Der Ausdruck "Biosynthese" wird in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er die biologische Produktion oder Synthese von Sphingan durch Sphingomonas-Bakterien beschreibt. Sphinganpolysaccharide werden aus individuellen Kohlehydrateinheiten in einer Reihe von Stufen, die durch eine Zahl von Enzymen der Bakterien gesteuert werden, synthetisiert.
    • 12. Der Ausdruck "gentechnisch verändert" wird in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er die Sphingomonas-Empfängerbakterien beschreibt, in die exogene DNA, vorzugsweise als mehrere Kopien, eingearbeitet ist. Gentechnisch veränderte Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung sind Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid.
    • 13. Der Ausdruck "mit Codierung für genetische Information" wird in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er DNA-Sequenzen beschreibt, die genetische Information in Form einer speziellen Reihenfolge von Nucleotideinheiten enthalten. Die genetische Information in der DNA-Sequenz (beliebiger Länge) wird als "vorteilhaft oder wesentlich" für die Biosynthese von Sphingan in Sphingomonas-Bakterien erachtet, wenn sie in mehreren Kopien in einem gentechnisch veränderten Bakterium die Sphinganproduktion durch die gentechnisch veränderten Bakterien verstärkt. Der Ausdruck "vorteilhaft oder wesentlich" wird zur Beschreibung von DNA verwendet, die aus Sphingomonas-Bakterien isoliert wurde und eine genetische Information codiert, die bei Einarbeitung in mehreren Kopien in ein Sphingomonas-Bakterium dieses Bakterium in einen Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid transformiert. Vorteilhafte oder wesentliche DNA zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein oder mehrere Gene oder Operons zur Biosynthese von Glycosyltransferasen, beispielsweise unter anderen Glucosyl-IP-Transferase, Galatocosyl-IP-Transferase; zur Biosynthese von Zuckersynthonen wie Rhamnose, Mannose, Glucose, Galactose, sowie substituierten Synthonen dieser Zucker, beispielsweise unter anderen dTDP-L-Rhamnose; zur Biosynthese von Enzymen, die an der Polymerisation von Zuckersynthonen unter Bildung von Sphingan beteiligt sind, beispielsweise Polymerasen, und zur Sekretion von Polysaccharid aus der intakten Zellstruktur unter anderen enthalten.
    • 14. Der Ausdruck "Komplementierung zwischen Stämmen" wird zur Beschreibung des Einbaus von Sphingomonas-DNA-Sequenzen, -Segmenten oder -Fragmenten, die aus einem ersten und unterschiedlichem Stamm von Sphingomonas isoliert wurden, in einen zweiten Stamm verwendet. Ein unerwarteter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, dass DNA-Fragmente von verschiedenen Stämmen von Sphingomonas als mehrere Kopien in andere Stämme von Sphingomonas unter Bildung von Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid eingearbeitet werden können. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren DNA-Fragmente zeigen auch intergenerische Komplementierung (beispielsweise zur Verstärkung der Xanthanproduktion in Xanthomonas campestris).
    • 15. Der Ausdruck "Synthon" wird zur Beschreibung eines Zuckers oder einer Zuckereinheit verwendet, die während der Biosynthese von Sphinganen durch Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung polymerisiert werden. Synthone umfassen Zuckerkomponenten, die Bauteile oder -einheiten der Sphinganpolysaccharide umfassen und zur Biosynthese von Sphinganen verwendet werden, beispielsweise Glucose, Galactose, Rhamnose, Mannose, andere Zuckersynthone, die acetylierte und acylierte Zucker und verwandte Vorstufen umfassen.
    • 16. Der Ausdruck "Rhamnoseoperon" wird zur Beschreibung einer DNA-Sequenz mit Codierung für ein Gen oder Operon verwendet, das an der Biosynthese von Rhamnose oder Rhamnosesynthonen (wie dTDP-L-Rhamnose) beteiligt ist, die bei der Biosynthese von bestimmten Sphinganpolysacchariden gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass DNA-Sequenzen, die die Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein SpsB von ATCC31554, SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen, die aus den definierten sphinganproduzierenden Sphingomonas-Spenderbakterien erhalten wurden und als mehrere Kopien in den gleichen Stamm oder einen unterschiedlichen Stamm von Sphingomonas-Empfängerbakterien eingearbeitet wurden, die Sphingomonas-Empfängerbakterien in einen Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid transformieren. Es wurde ferner entdeckt, dass auch wenn die DNA-Sequenz aus Bakterien, die einen Typ eines Sphinganpolysaccharids produzieren, isoliert ist, diese Sequenz als mehrere Kopien in einen unterschiedlichen Stamm von Sphingomonas-Bakterien eingearbeitet werden kann und einen Hyperproduzenten dieses unterschiedlichen Stamms ohne Kontamination der Sphinganpolysaccharideigenschaften der Spenderbakterien ergibt.
  • Die relevante DNA-Sequenz, die in die Empfängerbakterien eingearbeitet wird, codiert eine genetische Information, die für die Biosynthese eines Sphinganpolysaccharids vorteilhaft oder wesentlich ist. Beispielsweise kann die vorteilhafte oder wesentliche genetische Information für die Biosynthese von Sphingan durch die Bakterien auf eine beliebige Zahl von Wegen verantwortlich sein oder an dieser beteiligt sein. Die exogene DNA kann eine vorteilhafte Wirkung auf die Biosynthese von Sphingan durch beispielsweise Expression der Synthese von Enzymen oder anderen Proteinen, die an einem geschwindigkeitsbestimmenden enzymatischen Schritt beteiligt sind, durch Induzieren der Synthese eines Enzyms, Kofaktors oder einer anderen biochemischen Komponente, die zu einer erhöhten Produktion von Polysaccharid führt, durch Erhöhen der Produktion eines Enzyms, wie Polymerase, die die Verknüpfung von Untereinheiten des Polysaccharids unterstützt, durch Bindung an ein oder mehrere Repressorgene, durch Unterstützen der Sekretion des Polysaccharids aus den Bakterien und Verhindern der Expression eines Repressors, der normalerweise die Bildung von geschwindigkeitsbestimmenden Schritten in der Biosynthese des Polysaccharids hemmt, zeigen.
  • Die relevanten DNA-Sequenzen werden aus Stämmen von Sphingomonas unter Verwendung von Techniken und Verfahren, die Standard auf diesem Gebiet sind, isoliert. Die Bakterien werden generell kultiviert (Standardfermentationsverfahren mit einer Glucosekonzentration unter etwa 0,5%, vorzugsweise etwa 0,1% bis etwa 0,2%, gemäß der folgenden detaillierten Beschreibung), wobei eine hohe Konzentration von Bakterien enthaltende Brühe produziert wird. Die Bakterienzellen werden dann zentrifugiert und zur DNA-Extraktion resuspendiert. Die DNA kann aus den Bakterien durch zunächst Entfernen der Proteine aus dem Gemisch und dann Ausfällen der DNA mit hohem Molekulargewicht mit Ethanol oder Isopropanol extrahiert werden. Siehe Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979).
  • Nach der Ausfällung, die oben beschrieben ist, werden die isolierten DNA-Segmente oder -Fragmente generell zur Bildung von DNA zur Insertion in Empfänger-Sphingomonas kloniert. Beispielsweise werden die DNA-Sequenzen mit hohem Molekulargewicht von oben partiell mit einem Restriktionsenzym (beispielsweise SalI-Enzym) verdaut und unter Verwendung von Standardverfahren einer Elektrophorese unterzogen. Siehe Loftus et al., BioTechniques, 12, 172 (1992). Nach der Elektrophorese werden die größeren DNA-Fragmente (20 kbp und größer) weiter gereinigt (Extraktion und Fällung).
  • Die aus den Bakterien isolierten DNA-Fragmente werden danach direkt in Klonierungsvektoren (generell Plasmide) zur Klonierung der DNA insertiert oder alternativ des weiteren Restriktionsenzymen unterworfen, um kleinere DNA-Fragmente zu produzieren, die in Klonierungsvektoren insertiert werden. Die Klonierung von DNA in der vorliegenden Erfindung beruht auf allgemeinen Techniken und Verfahren, die auf diesem Gebiet Standard sind. Es ist anzumerken, dass eine beliebige Zahl von Verfahren zur Klonierung der DNA-Segmente gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und die vorliegende Erfindung beispielsweise nicht auf die Verwendung von Plasmid-Klonierungsvektoren beschränkt ist. Beispielsweise können die DNA-Fragmente durch Insertion in einen Bakteriophagenvektor, beispielsweise Charon 4A, EMBL3 (siehe Rodriguez und Denhardt, Vektors, Kapitel 2, S. 43, 1988, Butterworth Publishers, Boston) oder P1 (1990, Sternberg, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 103–107) kloniert werden.
  • Wie detailliert in den folgenden Beispielen 1 und 12 beschrieben ist, werden die DNA-Fragmente zunächst zur Insertion in einen Klonierungsvektor vorbereitet. Eine beliebige Zahl von Klonierungsvektoren zur Bildung von DNA-Segmenten oder -Fragmenten gemäß der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wurde es jedoch als vorteilhaft ermittelt, die DNA-Segmente oder -Fragmente in den gleichen Plasmidvektor zu klonieren, der zur Insertion von exogener DNA in ein Empfängerbakterium durch Konjugation verwendet wird. Es ist jedoch möglich, einen Klonierungsvektor (Plasmid- oder anderer Vektor) zu verwenden, der nicht als Vektor zur Konjugation in ein Empfängerbakterium verwendet werden soll, insbesondere wenn ein Transformationsverfahren zur Insertion der DNA in das Empfängerbakterien verwendet werden soll.
  • Nach der Insertion in einen Klonierungsvektor wird der die isolierte DNA enthaltende Vektor in einen Bakteriophagen gepackt, durch einen Transfektionsprozess in ein Bakterium (generell E. coli) übertragen und in den transfizierten Bakterien repliziert. Die erhaltenen Kolonien von Bakterienzellen, die klonierte DNA enthalten, werden gepoolt und aufbewahrt oder direkt verwendet.
  • Die klonierte DNA wird danach gescreent, um die relative Wirksamkeit eines DNA-Fragments zur Verstärkung der Produktion von Sphingan in Sphingomonas zu bestimmen. Bei dem Screeningverfahren wird die DNA in einem entsprechenden Vektor dann in einem Empfängerstamm von Sphingomonas durch Konjugation insertiert (beispielsweise Tri-parental Mating, gemäß der Beschreibung bei Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 7347 (1980)), wobei das erhaltene, gentechnisch veränderte Bakterium, das die DNA in mehreren Kopien enthält, und dessen Sphinganproduktion dann zur Bestimmung der Aktivität getestet wird.
  • Die DNA-Segmente oder -Fragmente, für die bestimmt wurde, dass sie die Sphinganproduktion verstärken, werden dann in einen Sphingomonas-Empfängerstamm übertragen, wobei ein Hyperproduzentenstamm gebildet wird, der mindestens zwei Kopien von mindestens einem wesentlichen Teil des übertragenen DNA-Segments, wie früher beschrieben wurde, enthält.
  • Ein bevorzugtes Screeningverfahren wurde zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung entwickelt. Bei diesem Verfahren wird DNA auf das Vorhandensein von Genen, die für eine Sphingansynthese vorteilhaft oder wesentlich sind, durch Insertion der DNA in einen nicht-produzierenden Empfängerstamm von Sphingomonas gescreent. Bei diesem Screeningverfahren wird eine nicht-produzierende Mutante (beispielsweise Sps Bacr des Stamms S88), die von einem sphinganproduzierenden Stamm von Sphingomonas abgeleitet ist, gentechnisch derart verändert, dass sie mehrere Kopien der zu screenenden DNA enthält. Nach Züchten der gentechnisch veränderten, nicht-produzierenden Mutante auf Nähragaragarplatten, die 1–3% Glucose enthalten, und Vergleichen des Auftretens von Kolonien durch die gentechnisch veränderten Bakterien mit einer nicht-produzierenden Mutante von Sphingomonas-Bakterien, die unter identischen Bedingungen gezüchtet wurden, kann eine optische Bestimmung im Hinblick auf die Fähigkeit dieser DNA, die Synthese von Sphingan in Sphingomonas-Bakterien zu bewirken, generell erfolgen.
  • Die Bestimmung der Fähigkeit eines DNA-Segments oder -Fragments, die Sphinganproduktionsaktivität zu verstärken, beruht generell auf dem problemlosen Feststellen phänotypischer Unterschiede, die zwischen sphinganproduzierenden Bakterien und nicht-sphinganproduzierenden Mutanten auf Kulturplatten existieren. Beispielsweise sind sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stämme Mucoidproduzenten, die häufig zu einer Koloniebildung führen können, die durch einfache optische Inspektion leicht unterschieden wird (beispielsweise stehende runde Kolonien, die von einem breiten Ring umgeben sind, für Sphinganproduzenten gegenüber flachen, grob durchscheinenden Kolonien für Nichtproduzenten).
  • In bestimmten Fällen kann, wie im folgenden Beispiel 2 detaillierter beschrieben ist, wenn die phänotypischen Unterschiede zwischen sphinganproduzierenden Bakterien und nicht-sphinganproduzierenden Bakterien in einem Sphingomonas-Stamm nicht leicht oder ohne weiteres erkennbar sind, dass Screeningverfahren derart modifiziert werden, dass auf eine Aktivität der relevanten DNA in Bakterien gescreent wird, wobei denen die phänotypischen Unterschiede zwischen Produzenten und Nichtproduzenten durch optische Inspektion einfacher erkennbar sind. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung nutzt die Tatsache, dass in der vorliegenden Erfindung verwendbare DNA-Fragmente Komplementierungen zwischen Stämmen und intergenerische Komplementierung zeigen und in mehreren Kopien die Sphinganproduktion in tatsächlich allen Sphingomonas-Stämmen verstärken.
  • DNA-Segmente oder -Fragmente, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, zeigen auch Aktivität im Xanthomonas campestris. Folglich können DNA-Fragmente, die durch Verwendung von einem oder mehreren Stämmen von Sphingomonas-Bakterien nicht ohne weiteres gescreent werden, in eine nicht-xanthanproduzierende Mutante von X. campestris, beispielsweise unter anderem X59m31, in mehreren Kopien eingebaut werden und dann durch optische Inspektion auf die Produktion von Xanthan gescreent werden. Die nicht-produzierenden Mutanten von X. campestris, beispielsweise X59m31, werden durch Selektion der Überlebenden eines Einwirkens von Bacitracin und Beobachten, ob die durch die Bacitracinresistenten Mutanten gebildeten Kolonien auf YM-Agaragarplatten im Hinblick auf das Aussehen mucoid (Produzenten) oder nicht-mucoid (Nichtproduzenten) sind, erhalten (siehe Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., 176, S. 6229–6237, und US-Patent 5 338 841 ). Diejenige DNA, die eine erhöhte Produktion eines Polysaccharids (Sphingan oder Xanthan) in den gescreenten Bakterien zeigt, ist ein Beleg für eine Komplementierung zwischen Stämmen oder intergenerische Komplementierung und sie verstärkt die Sphinganpolysaccharidproduktion in anderen Stämmen von Sphingomonas-Bakterien oder sogar unterschiedlichen Bakteriengattungen (Xanthomonas).
  • Unter Verwendung des einfachen Screeningverfahrens in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung, das generell leicht zu identifizierende phänotypische Unterschiede zwischen Produzenten und Nichtproduzenten von Sphingan nutzt, kann ein Fachmann üblicher Erfahrung unter Verwendung von ohne weiteres verfügbaren Klonierungs- und Übertragungstechniken ohne weiteres DNA-Segmente oder -Fragmente erhalten, die in der vorliegenden Erfindung zur Verstärkung der Produktion von Sphinganpolysacchariden in Sphingomonas-Bakterien verwendet werden können, ohne übermäßigen oder unnötigen Arbeitsaufwand einzusetzen.
  • Ein weiterer Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft die verstärkte Produktion von Sphinganpolysaccharid. Zur Produktion von Sphinganpolysaccharid werden gentechnisch veränderte Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung unter geeigneten Fermentationsbedingungen, die einschlägig bekannt sind, kultiviert. Ein geeignetes Medium oder eine geeignete Fermentationsbrühe zur Kultivierung der gentechnisch veränderten Sphingomonas-Bakterien ist ein wässriges Medium, das generell eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise Kohlehydrate, die Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose oder Maltodextrine umfassen, eine Stickstoffquelle, beispielsweise anorganisches Ammonium, anorganisches Nitrat, organische Aminosäuren oder proteinartige Materialien, wie hydrolysierte Hefe, Sojamehl oder Kasein, Destillatemulsionen oder Getreideeinweichlauge, anorganische Salze und Vitamine enthält. Eine breite Vielzahl von Fermentationsmedien unterstützt die Produktion von Sphinganen gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Die Kohlehydrate sind in der Fermentationsbrühe in variierenden Mengen, jedoch üblicherweise zwischen etwa 1 und 5 Gew.-% des Fermentationsmediums enthalten. Die Kohlehydrate können alle auf einmal vor der Fermentation oder alternativ während der Fermentation zugesetzt werden. Die Stickstoffmenge kann im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,4 Gew.-% des wässrigen Mediums liegen. Eine einzige Kohlenstoffquelle oder Stickstoffquelle sowie Gemische dieser Quellen können verwendet werden.
  • Unter den anorganischen Salzen, die bei der Fermentierung von Sphingomonas-Bakterien Verwendung finden, sind Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Nitrat-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen enthalten. Spurenmetalle, wie Magnesium, Mangan, Cobalt, Eisen, Zink, Kupfer, Molybdän, Iodid und Borat, können ebenfalls vorteilhafterweise enthalten sein. Vitamine, wie Biotin, Folat, Lipoat, Niacinamid, Pantothenat, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin und Vitamin B12 und Gemische derselben, können ebenfalls vorteilhafterweise verwendet werden.
  • Die Fermentation wird bei Temperaturen zwischen etwa 25° und 35°C durchgeführt, wobei optimale Produktivität innerhalb eines Temperaturbereichs von etwa 28 und 32°C erhalten wird. Das Inokulum wird durch Standardverfahren des Volumen-Scale-Up, die Schüttelkolbenkulturen und kleinskalige Tauchrührfermentation umfassen, hergestellt. Das Medium zur Herstellung des Inokulums kann gleich dem Produktionsmedium sein oder es kann ein beliebiges von mehreren einschlägig bekannten Standardmedien, wie Luria Broth oder YM Medium, sein. Die Kohlehydratkonzentration kann in den Impfkulturen auf weniger als etwa 1 Gew.-% verringert sein. Mehr als eine Impfstufe kann verwendet werden, um das gewünschte Inokulationsvolumen zu erhalten. Typische Inokulationsvolumina liegen im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 10% des gesamten Endfermentationsvolumens.
  • Das Fermentationsgefäß enthält typischerweise einen Rührer zum Rühren des Inhalts. Das Gefäß kann auch automatische Kontrollen des pH-Werts und der Schaumbildung aufweisen. Das Produktionsmedium wird in das Gefäß gegeben und an Ort und Stelle durch Erhitzen sterilisiert. Alternativ kann die Kohlehydrat- oder Kohlenstoffquelle getrennt vor der Zugabe sterilisiert werden. Eine zuvor gezüchtete Impfkultur wird zu dem gekühlten Medium (generell bei der Fermentationstemperatur von etwa 28 bis etwa 32°C) gegeben und die gerührte Kultur wird etwa 48 bis etwa 96 h fermentiert, wobei eine Brühe hoher Viskosität produziert wird. Das Sphinganpolysaccharid wird aus der Brühe durch das Standardverfahren einer Fällung mit einem Alkohol, generell Isopropanol, gewonnen.
  • Als spezielles Beispiel offenbart diese Anmeldung DNA-Segmente oder -Fragmente, die aus mehreren Bakterienstämmen, insbesondere den Sphingomonas-Stämmen S88, S60, NW11, S198, S7 und S194 (erhältlich von der American Type Culture Collection als Hinterlegungen ATCC31554, ATCC31461, ATCC53272, ATCC31853, ATCC21423 bzw. ATCC31961), isoliert wurden. Diese DNA-Segmente oder -Fragmente wurden als zum Erhöhen der Produktion von Sphingan S-88, S-60 und NW-11 in den jeweiligen Stämmen von Sphingomonas-Bakterien verwendbar ermittelt, wenn sie in mehreren Kopien als extrachromosomale (Plasmid-)DNA in den Bakterienstämmen eingearbeitet wurden.
  • Im Falle des Sphingomonas-Stamms S88 zeigt das isolierte Segment von chromosomaler DNA eine Größe von etwa 34 Kilobaseeinheiten und es enthält zwischen 23 und 25 Gene. Wie durch die Karte von Klonen für S88 in 1 gezeigt ist, ist die 34-kbp-Region die kombinierten Strecken von zwei Klonen: c3 und c2. Eine Zahl von DNA-Sequenzen ausgehend von dieser 34-kb-DNA-Sequenz der Bezeichnung C1Δ3, c2, c3, c4, c5, c6 H15.6, B7.1, B8.6, E5.9, E1.5, E2.4, E4.5, E6.6, E12.8 und dergleichen ist ebenfalls in 1 dargestellt. Die 8 und 11 beschreiben die isolierte chromosomale DNA von S88 in weiteren Einzelheiten.
  • Im Falle des Sphingomonas-Stamms S60 wurde eine Zahl von DNA-Sequenzen aus der chromosomalen DNA isoliert, wobei diese c1, c2 und c3 umfassen (siehe 2). Die Sequenz c2 wurde kloniert, in einen pRK311-Vektor platziert und in die Sphingomonas-Bakterienstämme S88, S60 und NW11 insertiert, um sphinganproduzierende Aktivität festzustellen (siehe Beispiel 9, das hierin detaillierter beschrieben ist).
  • Im Falle des Sphingomonas-Stamms S198, S7 und S194 wurden ebenfalls DNA-Segmente aus diesen Stämmen isoliert (siehe 9 und 10). Eine Zahl zusätzlicher DNA-Segmente kann auch aus diesen Stämmen nach der allgemeinen Methodik, die in dieser Anmeldung detaillierter angegeben ist, isoliert werden und zur Herstellung einer erhöhten Sphinganproduktion in Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Im Falle des Sphingomonas-Stamms NW11 wurden die DNA-Fragmente c1, c2, c2.1, c2.2, c2Hd, c2H1, c2H2, c2H3, c2E10 isoliert (siehe 3). Die Sequenz c2.2 wurde kloniert, in einen pRK311-Vektor platziert und in die Sphingomonas-Bakterienstämme S88, S60 und NW11 insertiert, um sphinganproduzierende Aktivität festzustellen (siehe Beispiel 9, das hierin detaillierter beschrieben ist).
  • Die im Folgenden angegebenen DNA-Segmente wurden unter Verwendung eines Verfahrens gemäß der generellen obigen Beschreibung aus den Stämmen S88, S60 und NW11 von Sphingomonas hergestellt. Jedes dieser DNA-Segmente (das als DNA-Segmente voller Länge in Plasmidvektoren angegeben ist) ändert, wenn es in einen oder mehrere Sphingomonas-Stämme (Sphinganproduzent des Wildtyps oder von einem Produzent des Wildtyps abgeleitete nicht-mucoide Mutante) insertiert ist, die Bakterien in Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid. Jedes der DNA-Segmente oder -Fragmente ist von dem DNA-Segment oder -Fragment, das aus Sphingomonas-Stämmen isoliert wurde, abgeleitet, und wie angegeben in Plasmidvektoren insertiert. Die DNA-Segmente oder -Fragmente sind durch Karten von Restriktionsenzymspaltungsstellen definiert (siehe 1, 2 und 3).
    • Stamm S88 pRK311-S88c1Δ3 pRK311-S88c2 pRK311-S88c3 pRK311-S88c4 pRK311-S88c5 pSEB24-S88H15.6 pSEB24-S88B8.6 pSEB24-S88E4.5 pSEB24-S88E6.6
    • Stamm S60 pRK311-S60c2
    • Stamm NW11 pRK311-NW11c2.2
  • Die klonierte DNA kann in sphinganproduzierende Sphingomonas des Wildtyps oder nicht-sphinganproduzierende Mutanten eingeführt werden, um die Hyperproduktionswirkung zu realisieren. Beispielsweise kann die klonierte DNA in mehreren Kopien in entweder sphinganproduzierende Stämme des Wildtyps bzw. von sphinganproduzierenden Stämmen abgeleitete nicht-mucoide Mutanten eingeführt werden. Die erhaltenen gentechnisch veränderten Bakterien sind Hyperproduzenten von Sphingan im Vergleich zu sphinganproduzierenden Bakterien des Wildtyps oder mutierten nicht-produzierenden Bakterien des gleichen Stamms.
  • Die Einführung mehrerer Kopien der relevanten gescreenten DNA in diese Stämme von Sphingomonas-Bakterien erhöhte in ganz unerwarteter und genereller Weise das durch die rekombinanten Bakterien produzierte Sphingan im Vergleich zu der von den Wildtypbakterien produzierten Sphinganmenge. Das Phänomen war ein generelles und die Sphinganzunahme zeigte Komplementierung zwischen Stämmen.
  • Nach Einführung der klonierten DNA in das Bakterium in mehreren Kopien weisen die rekombinanten Bakterien nun eine Sphinganpolysaccharid-Syntheseaktivität in Höhen auf, die gegenüber dem Wildtyp erhöht sind. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren DNA-Segmente tragen Gene, die zur Synthese von Sphingan durch Sphingomonas-Stämme vorteilhaft oder wesentlich sind, wobei diese ein DNA-Fragment umfassen, das für ein Protein codiert, das zum Befestigen eines ersten Glucoserests an einem Träger-Isoprenylphosphat, was eine frühe Stufe im Zusammenbau oder der Biosynthese von Sphingan in diesen Stämmen ist, erforderlich ist.
  • Die DNA-Sequenz des spsB-Gens (4) und die abgeleitete Aminosäuresequenz des SpsB-Proteins (5) sind ebenfalls offenbart. Alle DNA-Fragmente, die DNA mit Codierung für das SpsB-Protein (oder ein analoges Protein, wie SgeB, SnwB, SneB, SssB und SrhB, unter anderen, in Abhängigkeit vom Sphingomonas-Stamm) enthalten, können in Sphingomonas-Stämme als mehrere Kopien unter Verstärkung der Produktion von Sphingan durch die erhaltenen, gentechnisch veränderten Bakterien eingearbeitet werden.
  • In ähnlicher Weise gilt das Gleiche für DNA-Segmente oder -Fragmente, die das sgeB-Gen (mit Codierung für das SpsB-analoge SgeB-Protein), das aus S60 Sphingomonas isoliert wurde, und das snwB-Gen, das aus NW11 Sphingomonas isoliert wurde, enthalten. Das sgeB-Gen (2) ist analog dem spsB-Gen der chromosomalen DNA von S88 (und den entsprechenden sneB-, sssB- und srhB-Genen von jeweils den S198-, S7- und S194-Stämmen von Sphingomonas, die für die SneB-, SssB- und SrhB-Proteine codieren) insofern, als angenommen wird (auf der Basis der DNA-Hybridisierung mit dem spsB-Gen von S88 entsprechenden Fragmenten), dass es für ein Protein codiert, das dem durch das spsB-Gen codierten Protein analog ist. Die in 3 angegebene snwB-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SnwB codiert. Das snwB-Gen ist analog dem spsB-Gen der chromosomalen DNA von S88 und dem sgeB-Gen der chromosomalen DNA von S60. Diese DNA-Fragmente können in Plasmide, wie generell im Vorhergehenden beschrieben, unter Bildung mehrerer Kopien zur Verstärkung der Sphinganproduktion in Sphingomonas insertiert werden.
  • Es wird angenommen, dass das spsB-Gen für Glucosyl-IP-Transferase in Sphingomonas S88 codiert. Es gibt beträchtliche Homologiebelege zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen des SpsB-Proteins und vermutlichen Glucosyl-IP-Transferasen von anderen Bakteriengattungen. Der stärkste Beleg, dass das spsB-Gen für eine Glucosyl-IP-Transferase codiert, ist die Ähnlichkeit von dessen abgeleiteter Aminosäuresequenz mit den Sequenzen anderer Gene, für die generell angenommen wird, dass sie für Glucosyl-IP-Transferasen codieren. Tatsächlich besteht beträchtliche Homologie für die Carboxylhälften von Glucosyl- und Galactosyl-IP-Transferasen. Obwohl den aminoterminalen Regionen diese extensive Homologie fehlt, ist das SpsB-Protein dem RfbP-Protein von S. enterica (1991, Jiang et al., Mol. Microbiol., 5, 695) insofern ähnlich, als es mehrere hydrophobe Strecken aufweist, die membrandurchspannende Domänen nahelegen. Die hydrophoben Domänen von SpsB umfassen die Aminosäuren 35–59 (mittlere Hydropathie +2,2), 68–86 (+1,7), 105–123 (+2,3) und 282–303 (+2,9). Die Position der letzteren hydrophoben Region ist diesen verwandten Genprodukten gemeinsam. Sie befindet sich benachbart zur Region größter Homologie.
  • In bevorzugten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung werden DNA-Segmente oder -Fragmente, die DNA-Sequenzen mit Codierung für Glucosyl-IP-Transferasen der Sphingomonas-Stämme S88, S60 oder NW11 codieren, vorteilhafterweise in mehreren Kopien in Sphingomonas-Empfängerbakterien zur Verstärkung der Sphinganproduktion in den Empfängerbakterien verwendet. Zusätzlich zum Einbau von Genen mit Codierung für Glucosyltransferaseenzyme können Gene oder DNA-Fragmente mit Codierung für Zuckersynthone oder Zuckervorstufen (d. h. Zuckerkomponenten, die Bauteile der Sphinganpolysaccharide umfassen und zur Biosynthese von Sphinganen verwendet werden, beispielsweise Glucose, Galactose, Rhamnose, Mannose, andere Zuckersynthone und Vorstufen) oder mit Codierung für Enzyme oder Proteine, die die Polymerisation oder Sekretion des Polysaccharids aus der intakten Zellstruktur unterstützen, vorteilhafterweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beschreibung der Beispiele sollte nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend betrachtet werden.
  • Beispiele 1–21
  • In den folgenden Beispielen 1–21 sind Bakterienstämme, Plasmide und Bakteriophagen in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet. Luria-Bertani- und YM-Medien waren Standardmedien (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237). Verwendete Antibiotikamengen (Sigma): Bacitracin (Bac) 73 Einheiten/mg und 0,01–8 mg/ml wie spezifiziert, Rifampicin (Rif) 50 μg/ml; Streptomycin (Stm) 50 μg/ml; Kanamycin (Kan) 25 μg/ml; Chloramphenicol (Cam) 15 μg/ml; und Tetracyclin (Tet) 4–12 μg/ml. Tabelle 1. Bakterienstämme, Plasmide und Bakteriophage
    Name Genotyp/Phänotyp (Polysaccharid) Quelle (Referenz)a
    Sphingomonas
    S88 Stmr Bacr Sps+ (Sphingan S-88) ATCC31554
    S88m260 Stmr Bacr Sps Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 6229–6237
    S60 Stmr Bacr Sps+ (Sphingan S-60 oder Gellan) ATCC31461
    X. campestris
    X59 Rifr Bacr Gum+ (Xanthan) Thorne, et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 3593–3600
    X59m31 Rifr Bacr Gum Thorne, et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 3593–3600
    E. coli K-12
    HMS174 F hsdR19 (rK mK+) recA1 rpoB331 (Rif) In(nnD-nnE)1 W. Studier
    DH5aTM F φ80dlacZΔM15 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 supE44 hsdR17 (rKmK+) Δ (argF-lac) U169 Bethesda Res. Lab.
    Plasmide
    pRK2013 ori(colE1) Kanr ori(RK2) Tra+ Figurski et al., 1979, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76: 1648–1652
    pRK311 oriV(RK2) Tetr oriT λcos lacZ(o) Ditta et al. 1985, Plasmid 13: 149–153 (7)
    pMMB66EH oriV(RSF1010) oriT Ampr lacl tacP Mcs1 Fürste et al., 1986, Gene, 48: 119–131
    pUC12, 13 ori(colE1) Ampr Vieira und Messing, 1982, Gene 19: 259–268
    pC194 ori (grampositive Bakterien) Camr Horinouchi und Weisblum, 1982, J. Bacteriol. 150: 815–825
    pSEB23 ori(colE1) Ampr Camr Mcs2 vorliegende Erfindung
    pSEB24 oriV(RSF1010) oriT Ampr Camr Mcs2 vorliegende Erfindung
    pNH-Kan/oriT ori(colE1) Ampr Kanr oriT Hengen und Lyer, 1992, BioTechniques 13: 57–62
    pSEB26 ori(colE1) Ampr Camr Kanr oriT Mcs2 vorliegende Erfindung
    Bakteriophage
    λ NK1316 b522(ΔattP) c/857 Pam80 nin5 mini-Tn10 kan/Plac-ATS-Transposase Kleckner et al., 1991, "Uses of transposons with emphasis on Tn10", S. 139–180. In J. H. Miller (Hrsg.), Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego"
    • a ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion einer Bibliothek von DNA-Segmenten von Sphingomonas
  • Zur Synthese von Sphinganen wesentliche DNA-Fragmente wurden aus Sphingomonas-Stämmen kloniert. Eine vollständige Bibliothek von DNA-Segmenten wurde wie im Folgenden hergestellt. Ein Bakterienstamm (in diesem Beispiel S88) wurde über Nacht in 25 ml eines flüssigen YM-Mediums bei 30°C geschüttelt, wobei eine große Menge Zellen enthaltende Viskosebrühe er halten wurde. YM-Medium enthielt 3 g Bacto Yeast Extract, 3 g Bacto Malt Extract, 5 g Bacto Peptone (Difco) und 10 g D-Glucose (Difco) pro Liter Wasser. Natriumazid wurde bis auf 0,01% zugegeben und Sphinganaseenzym (1994, Mikolajczak et al., Appl. Environ. Microbiol., 60, 402) wurde 8 h bei 37°C zur Verdauung von Sphinganexopolysacchariden zur partiellen Verringerung der Viskosität und der Bildung großer Zellmengen zugegeben. Die Zellen wurden zentrifugiert und zu DNA-Extraktion durch das Verfahren von Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979) resuspendiert. Die Proteine wurden aus dem geklärten Lysat mit einem gleichen Volumen von Phenol/CHCl3/Isoamylalkohol (24/24/1) durch leichtes Schütteln über 16 h bei 25°C und dann mit einem Volumen von CHCl3/Isoamylalkohol (24/1) über 3 h bei 25°C entfernt. 1/10 des Volumens von 3 M Natriumacetat (pH-Wert 5,2) wurde zugegeben und die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde mit 2 Volumina Ethanol gefällt und dann getrocknet und in 0,5 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,1 mM EDTA) resuspendiert.
  • Gemäß der Cosmidklonierungsstrategie von Loftus, Foster und Ross (BioTechniques, 12, 172, 1992), wurde S88-DNA mit SalI-Enzym partiell verdaut, durch 1%ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Tris-Acetat-EDTA-Puffer einer Elektrophorese unterzogen und Fragmente, die größer als 20 kbp waren, wurden durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die SalI-verdaute S88-DNA wurde mit Klenow-DNA-Polymerase zum Anfügen von dCMP und dTMP an die kohäsiven Enden behandelt, 20 min bei 70°C erhitzt und mit Ethanol gefällt. Das Vektorplasmid pRK311 (1985, Ditta et al., Plasmid 13, 149–153) wurde mit BamHI-Enzym vollständig verdaut und dann 15 min bei 65°C erhitzt und durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die BamHI-verdaute pRK311-DNA wurde mit Klenow-DNA-Polymerase zur Addition von dGMP und dAMP wie oben behandelt und dann gereinigt. Die Ligationsreaktion mit T4-DNA-Ligase enthielt gleiche Molmengen von Vektor und Insertfragmenten. Alle Restriktionsenzyme, Kle now-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase stammten von Stratagene und die Reaktionsbedingungen des Herstellers wurden verwendet. Nach Verpackung in Bakteriophagen (GigapackTM IIXL von Stratagene) wurden die ligierten Moleküle in E. coli DH5αTM durch Transfektion übertragen und die Zellen auf LB-Platten, die Tetracyclin mit einer Konzentration von 4 bis 12 μg/ml enthielten, verteilt. Eine Bibliothek von 1700 und eine von 3400 Tetr-Kolonien wurden getrennt gepoolt und eingefroren. Die Tetr-Kolonien (10 von 10 getesteten) enthielten Inserts von 25 bis 30 kbp mit internen SalI-Restriktionsstellen.
  • In ähnlicher Weise wurden Bibliotheken chromosomaler DNA-Segmente ebenfalls von anderen Sphingomonas-Stämmen, die NW11, S60, S198, S194 und S7 umfassen, hergestellt. In diesen Fällen wurden die Zellen, die die Quelle für die klonierte DNA waren, in einem Medium mit Glucose von weniger als 0,5% (Gew/V) gezüchtet und die Sphinganasebehandlung weggelassen.
  • Beispiel 2
  • Isolierung von Biosynthese-DNA-Fragmenten für Sphingan S-88
  • Fragmente von DNA, die in Plasmide kloniert waren, wurden auf das Vorhandensein von Genen, die für die Sphingan-S-88-Synthese wesentlich sind, durch Beobachten einer Wiederherstellung der Sphingansynthese in sphingannegativen Mutanten gescreent. Zuvor ermittelten wir, dass die meisten der spontanen Bacitracin-resistenten Mutanten des Sphingomonas-Stamms S88, die auf YM-Platten, die Bacitracin mit 500–800 μg/ml enthielten, wachsen konnten, keine Sphinganpolysaccharide produzierten (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., 176, S. 6229–6237). Dies bildete die Basis für ein einfaches Screeningverfahren für diese spezielle Klasse von Mutanten.
  • Die Mutante S88m260 ist ein repräsentatives Mitglied dieser Sps Bacr-Gruppe. Das Unvermögen, Exopolysaccharide durch S88m260 und die anderen Bacr Sps-Mutanten herzustellen, führte zu einem Kolonieaussehen, das im Vergleich zu den Wildtypkolonien flacher, von rauer Oberfläche und durchscheinend war, und die Bacr Sps-Kolonien waren auch von einem engen lichtreflektierenden Halo umgeben, wenn sie gegen das Licht gehalten und von unten betrachtet wurden. Diese Phänotypunterschiede waren nicht so offensichtlich wie die mächtige Schleimbildung von X. campestris des Wildtyps und das flache Aussehen von entsprechenden Gum-Mutanten. Die Koloniephänotypen wurden durch Züchten von Kulturen in flüssigem YM-Medium und Wiegen der getrockneten Exopolysaccharide nach Fällung mit Isopropylalkohol verifiziert. Mehrere Sps-Mutanten waren empfindlich gegenüber Bacitracin und es wurde infolgedessen ermittelt, das sie Gene definieren, die für Sphingansynthese wesentlich waren, die jedoch von den mit dem Bacitracin-resistenten Phänotyp verbundenen Gen verschieden waren.
  • Plasmid-DNA von der Genbibliothek wurde von E. coli auf Xanthomonas oder Sphingomonas durch Tri-parental Mating übertragen (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347, 1980). Gemische von Donorzellen, die Mob+ Tra rekombinante Plasmide (pRK311 mit S88-Insert) enthielten, Helferzellen, die Mob+ Tra+-pRK2013-Plasmid enthielten, und Exopolysaccharid-negative Empfängerzellen im Verhältnis 5:2:10 wurden auf nicht-selektive YM-Platten, denen Glucose fehlte, punktförmig aufgetragen und 6–16 h bei 30°C inkubiert. Exkonjugante von Xanthomonas wurden durch Verteilen einer Ösenmenge des Mating-Gemischs auf Platten, die Rifampicin (50 μg/ml) zur Selektion gegenüber Helfer- und Donorzellen und Tetracyclin (4–12 μg/ml) für pRK311 oder Chloramphenicol (20 μg/ml) für pSEB24 zur Selektion auf das rekombinante Plasmid enthielten, isoliert. Sphingomonas ist von Natur aus gegenüber Streptomycin resistent, was zur Selektion gegenüber den Donor- und Helferzellen verwendet wird, wenn Sphingomonas der Empfänger ist.
  • Zur Feststellung einer Komplementierung wurden die Exkonjuganten des Stamms S88 mit dem Auge als entweder Sps+ (stehende runde opake Kolonien, umgeben von einem hellen Ring, wenn sie gegen das Licht gehalten und von unten betrachtet wurden) oder Sps (flache raue durchscheinende Kolonien ohne Ring) beurteilt. In ähnlicher Weise waren Gum+-Kolonien, die ausgehend von Xanthomonas-Exkonjuganten gewachsen waren, mucoid im Hinblick auf das Aussehen im Vergleich zu den matten oder nicht-glänzenden Kolonien des Gum-Empfängers.
  • Versuche zur Identifizierung der S88-Klone in der Bibliothek direkt in nicht-mucoiden Mutanten von S88 waren nicht erfolgreich (kein klar belegbarer mucoider Phänotyp). Wir änderten dann unseren Ansatz, um die Klone nach Übertragung der Bibliothek in nicht-mucoide Mutanten des gumD-Gens von X. campestris herauszufinden. Dies ermöglichte uns, den Anfangsklon "S88c1" herauszufinden, was im Folgenden detaillierter beschrieben ist.
  • Die S88-Genbibliothek wurde von E. coli in den X. campestris-Stamm X59m31, der einen Bacr Gum-Defekt in dem GumD-Gen aufweist, (Pollock et al., J. Bacteriol., 176, S. 6229–6237, 1994; Thorne et al., J. Bacteriol., 169, 3593, 1987) übertragen. Aufgrund dieser intergenerischen Verbindung fanden wir einige Gum+ Tetr-Kolonien auf YM-Platten und diese traten mit einer Häufigkeit von etwa 10–3 bis 10–4 auf. Individuelle Plasmide wurden ausgehend von den komplementierten Mutanten gereinigt und zur Restriktionsanalyse in E. coli zurückübertragen. Die gereinigten Plasmide wurden in Sphingomonas S88m260 übertragen und etwa 10% der Transkonjuganten wurden Sps+. Ein Plasmid (pRK311-S88c1) wurde gewonnen und für die folgenden Arbeiten verwendet. Das Plasmid pRK311-S88c1 komplementierte ebenfalls mehrere zusätzliche, unabhängig voneinander isolierte Bacr Sps-Mutationen in den Sphingomonas-Stamm S88 und Bacr Gum Mutanten von X. campestris. Wir isolierten die Exopolysaccharide, die in das Kulturmedium durch die Exkonjugante für jede intergenerische Verbindung sezerniert wurden, und verifizierten durch Dünnschichtchromatographie, dass Säurehydrolysate die für das Polysaccharid der Empfängerzelle erwarteten Zuckerreste enthielten. Das Plasmid pRK311-S88c1 stellte die Sphingansynthese für Sphingomonas und die Xanthangummisynthese für X. campestris wieder her. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Plasmid pRK311-S88c1 für Exopolysaccharid-Biosynthesefunktionen, die in den Bacr-polysaccharidnegativen Mutanten fehlten, codierte und dass Gene von einer Gattung die fehlende Funktion in einer zweiten Gattung ersetzen können. Das Segment S88c1 ist ähnlich dem in 1 gezeigten Segment S88c1Δ3 mit Ausnahme davon, dass S88c1 auch ein zusätzliches 7,5-kbp-HindIII-Fragment am äußersten rechten Ende von S88c1Δ3 umfasst. Das 7,5-kbp-Segment wurde speziell aus S88c1 deletiert, wobei das Derivat S88c1Δ3 erhalten wurde.
  • Das oben beschriebene Verfahren zur Bestimmung von DNA-Fragmenten, die zur Wiederherstellung der Gummiproduktion (Sphingangummi in Sphingomonas sp. oder Xanthangummi in X. campestris) verwendbar sind, ist reproduzierbar und zusätzliche Klone wurden in direkten Versuchen isoliert. Ein direktes Screening der Klonbibliothek auf Segmente, die Sps Bacr-Mutationen 76 und 78 von Sphingomonas S88 komplementierten, ergab drei zusätzliche Klone, die partiell mit S88c1 überlappten. Die drei klonierten Segmente wiesen jeweils eine Länge von etwa 23–27 kb auf. Zwei der drei Segmente komplementierten die Mutante S88m260. Eine Karte von Restriktionsenzymspaltungsstellen ist in den 1 und 8 angegeben.
  • Das oben beschriebene Verfahren wird zur Bestimmung von DNA-Fragmenten, die aus den Sphingomonas-Stämmen S60, NW11, S198, S7 und S194 und anderen sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stämmen isoliert wurden, die zur Erhöhung der Sphinganproduktion in jedem dieser Stämme verwendbar sind, verwendet.
  • Beispiel 3
  • DNA-Sequenz des spsB-Gens und abgeleitete Aminosäuresequenz des SpsB-Proteins
  • Die doppelsträngige Nucleotidsequenz für 1950 bp der spsB-Region wurde von einem Fragment von 3300 bp, das von dem Plasmid pSEB24-S88E4.5::Tn#72 subkloniert war, erhalten. Die Sequenz des codierenden Strangs ist in 4 angegeben. Es gab ein langes offenes Leseraster (ORF), das wir spsB nannten. Die codierende Region begann mit ATG am Nucleotid 361 und sie lief bis zum TGA-Stopcodon bei 1771. Dieses ORF codierte für 470 Aminosäuren und ihm ging eine vermutete Ribosomenbindungsstelle voraus. Die abgeleitete Aminosäuresequenz unter Verwendung von Standard-Einbuchstabenabkürzungen ist in 5 angegeben.
  • Beispiel 4
  • DNA-DNA-Hybridisierung des klonierten S88-Segments und der chromosomalen DNA von entweder S88 oder S60
  • Um zu zeigen, dass die klonierte DNA in dem Plasmid pRK311-S88c1Δ3 von fortlaufenden Sequenzen von S88-DNA stammte, markierten wir die Plasmid-S88c1Δ3-DNA und hybridisierten sie mit getrennten Restriktionsfragmenten von DNA von Sphingomonas-Stämmen S88, mutiertem S88m260 und S60, dem Wildtypproduzenten von Gellan. Das Vorliegen einer Hybridisierung mit EcoRI-Fragmenten von etwa 1,5, 2,4, 4,5, 5,9 und 12 kbp ist konsistent mit Kontinuität für die klonierte DNA in sowohl der Wildtyp- als auch der mutierten S88-DNA. Das für S88c1Δ3 angegebene, äußerste linke Fragment von 6,6 kbp weist tatsächlich 12,8 kbp auf, wenn die überlappenden Klone S88c2, S88c3 und S88c4 mit EcoRI verdaut werden, da eine der EcoRI-Stellen von der multiplen Klonierungsstelle des Vektors stammt. Die Hybridisierung zwischen S88-DNA und S60-DNA, die Gellan produziert, zeigte, dass ähnliche Gensequenzen vorhanden sind, die Genorganisation jedoch unter schiedlich sein kann. Wegen der Strukturähnlichkeit zwischen den durch diese zwei Sphingomonas-Stämme sezernierten Exopolysacchariden vermuten wir, dass sie ähnliche Transferasegene aufweisen. Die Region der S88-S60-Homologie ist in 2 angegeben. In unabhängigen Tests auf DNA-Homologie lokalisierten wir die homologe Region zwischen dem Stamm NW11 und S88 wie in 3 angegeben.
  • Beispiel 5
  • Klonierung des Sphingan-Biosynthesegenclusters von den Stämmen S60, NW11, S198, S7 und S194
  • DNA-Fragmente wurden von Sphingomonas S60, NW11, S198, S7 und S194 isoliert. Das Verfahren war gleich der Beschreibung in den obigen Beispielen für den Stamm S88. Die Karten der Restriktionsstellen der DNA-Fragmente von den Stämmen S60, NW11, S198, S7 und S194 sind in den 2, 3, 9 bzw. 10 angegeben. Die Größen von Restriktionsfragmenten, die durch Verdau von DNA mit einzelnen oder mehreren Restriktionsenzymen erzeugt wurden, sind hier für zwei unabhängig voneinander isolierte Klone, pRK311-S194c1 und pRK311-S194c2 aufgelistet. Die Größen wurden durch Vergleichen der elektrophoretischen Migration der Fragmente durch Agarosegele mit Fragmenten bekannter Größe: Fragmenten von Bakteriophage-Lambda-DNA nach Verdau mit HindIII und der "Kb DNA Ladder" von Stratagene bestimmt. Die Fragmentgrößen identifizieren die DNA-Sequenzen, die in diesen zwei klonierten Sequenzen enthalten sind.
  • Im Folgenden sind Daten für die Fragmentgrößen für das Plasmid pRK311-S194c1, das ein aus Sphingomonas S194 isoliertes c1-Fragment enthielt, angegeben. Die Fragmentgrößen in Kilobasenpaaren für pRK311-S194c1 sind: (EcoRI) > 25, 8,3, 5,4 und 1,5; (EcoRI + HindIII) 13,0, 9,7, 8,3, 5,4, 2,8 und 1,5; (HindIII) > 25 und 2,8; (BamHI + HindIII) > 25, 5,8, 3,9, 2,0 und 0,8; (BamHI) > 25, 5,8 und 4,7; (BamHI + EcoRI + HindIII) 13,0, 8,3, 5,8, 5,4, 3,9, 2,0, 1,5 und 0,8; (BamHI + EcoRI) 15,0, 8,3, 5,8, 5,4, 4,7 und 1,5. Die Fragmentgrößen in Kilobasenpaaren für pRK311-S194c2 sind: (EcoRI) 14,5, 10,0, 8,3, 6,1, 2,6 und 1,35; (EcoRI + HindIII) 13, 8,3, 5,7, 4,6, 4,0, 2,6, 1,8, 1,35, 0,75, 0,35 und 0,25; (HindIII) > 20, 12,8, 4,6, 2,1, 0,75 und 0,25; (BamHI + HindIII) > 20, 3,8, 3,1, 2,8, 2,3, 1,65, 1,6, 1,3, 1,2, 0,95, 0,9, 0,8 und 0,25; (BamHI) > 20, 5,8, 3,1, 2,8, 2,6, 2,3, 2,0, 1,6 und 0,25; (BamHI + EcoRI + HindIII) 13, 8,3, 3,8, 3,1, 2,4, 2,3, 1,6, 1,35, 1,3, 0,95, 0,9, 0,85, 0,8, 0,45, 0,35 und 0,3; (BamHI + EcoRI) 14,5, 8,3, 4,9, 3,1, 2,4, 2,3, 2,0, 1,6, 1,35, 1,3, 0,85, 0,45 und 0,2.
  • Beispiel 6
  • Konstruktion der Plasmide pSEB24 und pSEB26
  • Die Plasmide pSEB24 und pSEB26 (7) wurden derart zusammengebaut, dass sie spezifische Replikations- und Konjugationsverbindungsfunktionen, Arzneistoffresistenzgene, die für Sphingomonas geeignet und mit mini-Tn10kan kompatibel waren, und multiple Klonierungsstellen enthielten. Das Plasmid pSEB24 weist einen breiten Wirtsbereich auf, während pSEB26 in E. coli, jedoch nicht in entweder Sphingomonas oder Xanthomonas repliziert. Zunächst wurde das Camr-Gen auf einem HpaII-Sau3A-Fragment von 1031 bp, das von dem Plasmid pC194 von Staphylococcus aureus (1982, Horinouchi und Weisblum, J. Bacteriol. 150, 815) entnommen war, stumpfendig gemacht und dann an die stumpfendig gemachte XbaI-Stelle des Plasmids pUC13 ligiert (1982, Vieira und Messing, Gene 259). Die Camr-Kassette wurde von diesem Plasmid auf einem BamHI-SalI-Fragment entfernt, stumpfendig gemacht und in pUC12 zwischen der singulären SspI-Stelle und der nächsten der zwei PvuII-Stellen (ebenfalls stumpfendig) insertiert, wobei das Plasmid pSEB23 erhalten wird, das Ampr und Camr ist und mit zugesetztem X-Gal und IPTG blaue Kolonien bildet. Zur Konstruktion von pSEB24 ligierten wir das ScaI-PvuII-Fragment von etwa 2130 bp von pSEB23 an den ScaI-PvuII-Teil von pMMB66EH (1986, Fürste et al., Gene 48, 119), um den oriv (Replikationsursprung eines breiten Wirtsbereichs von RSF1010) zu erhalten und das Ampr-Gen zu regenerieren. Das HindIII-BamHI-Fragment von 2700 bp, das die oriT-Sequenz des Plasmids pNH-Kan/oriT (Hengen und Iyer, 1992, BioTechniques 13: 57–62) enthält, wurde stumpfendig an das 3200-bp-PvuII-linearisierte pSEB23-Plasmid unter Bildung von pSEB26 ligiert. Die durch die BamHI-PvuII-Ligation regenerierte BamHI-Stelle wurde durch Restriktion entfernt, wodurch Auffüllen der kohäsiven Enden und Religation folgten.
  • Beispiel 7
  • Erhöhte Produktion des Polysaccharids S-88 nach Einführung von Kopien von S88-DNA-Fragmenten in den Stamm S88
  • Spezifische Restriktionsfragmente des DNA-Segments, das in 1 gezeigt ist, die aus dem Stamm S88 isoliert wurden, wurden durch DNA-Ligation in Mehrfachkopie-Plasmidvektoren insertiert und in den Wildtypstamm S88 und abstammende Nicht-mucoidmutanten von S88 durch das im obigen Beispiel 2 beschriebene triparentale Konjugationssystem übertragen. Die Polysaccharidsynthese wird durch die klonierte DNA, wenn sie in die Mutanten übertragen wird, wiederhergestellt. Die Mengen von Sphinganexopolysacchariden, die durch die rekombinantes Plasmid enthaltenden Stämme und Stämme, denen die zusätzlichen Plasmidgene fehlten, angesammelt wurden, wurden nach Kultivieren der Bakterien in flüssigem Medium ermittelt. Nach 24 ständiger Zucht bei 30°C unter Schütteln in Prallblechkolben wurden zwei Volumina Isopropylalkohol zur Fällung der Exopolysaccharide zugesetzt. Zwei bis drei unabhängige Kulturen wurden für jeden Stamm getestet. Die Niederschläge wurden auf Filtern gewonnen, bei 80°C getrocknet und gewogen. Das mittlere Gewicht des Niederschlags und die Standardabweichung sind für jeden Stamm im Folgenden in Tabelle 2 angegeben. Die rekombinanten Stämme, die zusätzliche Kopien der klonierten Gene trugen, produzier ten mehr Sphingan S-88 als Wildtypstämme, die nur den normalen Satz von Biosynthesegenen tragen. Tabelle 2
    Wirt Plasmid Isopropylalkoholfällung Trockengewicht (mg) und Standardabweichung relatives Gewicht
    S88 - 105 ± 9 1,0
    S88m265 pRK311-S88c1Δ3 148 ± 16 1,4
    S88m265 pRK311-S88c2 175 ± 16 1,7
    S88m265 pRK311-S88c3 160 ± 7 1,5
    S88m265 pRK311-S88c4 123 ± 14 1,2
    S88m265 pSEB24-S88H15.6 162 ± 5 1,5
    S88m265 pSEB24-S88B8.6 194 ± 7 1,8
    S88m265 pSEB24-S88E4.5 154 ± 36 1,5
    S88 - 114 ± 12 1,0
    S88#78 pRK311-S88c1Δ3 171 ± 2 1,5
    S88#78 pRK311-S88c2 179 ± 7 1,6
    S88#78 pRK311-S88c3 200 ± 9 1,8
    S88#78 pRK311-S88c4 189 ± 10 1,7
    S88#78 pSEB24-S88c5 151 ± 4 1,3
    S88#78 pSEB24-S88E6.6 171 ± 35 1,5
    S88#78 pSEB24-S88E12.8 114 ± 10 1,0
  • Dem erfahrenen Praktiker ist klar, dass die Restriktionskarte und Nucleotidsequenz des spsB-Gens und der umgebenden DNA ausreichende Information zur Konstruktion von zahlreichen zusätzlichen Subfragmenten der Region von etwa 32 kb durch Standard-Gentechnikverfahren liefern ( 8). Diese zusätzlichen Fragmente können durch die hier beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Segmenten, die auch eine ähnliche Zunahme der Produktion von Sphinganpolysacchariden bewirken, getestet werden. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass eine kleine Fraktion der Subsegmente (beispielsweise pSEB24-S88E12.8) keine signifikante Stimulation der Produktion zeigt. Indessen bewirken tatsächlich alle Subsegmente die erhöhte Polysaccharidansammlung. Aufgrund unserer bisherigen Tests nehmen wir an, dass pSEB24-S88B8.6 und pRK311-S88c3 den größten Stimulus zur Sphinganproduktion liefern.
  • Die erhöhte Produktion erfordert nicht das Vorhandensein von Antibiotika in der Kultur, um eine Selektion auf die rekombinanten Plasmide aufrechtzuerhalten.
  • Die erhöhte Produktion kann das Ergebnis einer Insertion von einem oder mehreren DNA-Fragmenten, vorzugsweise mit Codierung für ein Gen oder einen Satz von Genen von diesem Chromosomensegment in das Chromosom oder endogene native Plasmide sein. Ein Fachmann üblicher Erfahrung kann ohne weiteres zusätzliche DNA-Fragmente in ein sphinganproduzierendes Bakterium durch Insertion von DNA-Fragmenten, die relevante sphinganproduzierende Gene enthalten, in das bestehende Bakterienchromosom, in endogene native Plasmide oder in exogene Plasmidvektoren einführen. Es ist anzumerken, dass die Ergebnisse, die in dieser Anmeldung belegt sind, zeigen, dass eine erhöhte Sphinganproduktion nicht von der Verwendung eines speziellen Plasmidvektors abhängig ist.
  • Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt die Fusion von einem der oben beschriebenen DNA-Fragmente mit Codierung für Gensegmente oder Gruppen von Genen mit DNA-Sequenzen, für die bekannt ist, dass sie die Genexpression kontrollieren, beispielsweise und ohne Beschränkung dem lac-Promotor von Escherichia coli.
  • Beispiel 8
  • Identifizierung von Exopolysaccharid, das durch rekombinante S88-Stämme produziert wird, als Sphingan-S88
  • Um zu verifizieren, dass das durch die gentechnisch veränderten Stämme produzierte Exopolysaccharid das gleiche wie der Empfängertyp war, identifizierten wir die Monosaccharide in Säurehydrolysaten durch Dünnschichtchromatographie.
  • Extrazelluläres Xanthan von X. campestris und Sphingan S-88 von Sphingomonas wurden aus flüssigem Kulturmedium durch Fällung mit 2–3 Volumina Isopropylalkohol abgetrennt, bei 80°C getrocknet und gewogen. Die Polysaccharide wurden in Wasser für Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit 5 mg/ml resuspendiert. Wasserfreie Trifluoressigsäure (88 μl, von Sigma Chemical Co.) wurde mit 75 μl HPLC-Wasser (Baker) und 225 μl Polysaccharid (5 mg/ml) in einem 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gemischt und 16 h bei 95°C inkubiert. Die Hydrolysate wurden unter Vakuum getrocknet, in 200 μl HPLC-Wasser resuspendiert, in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, erneut getrocknet und in 45 μl HPLC-Wasser resuspendiert. Die Proben (25 μg/ml) konnten gefroren aufbewahrt werden. Zuckerstandards (D-Glucose, D-Glucuronsäure, D-Mannose, L-Mannose, L-Rhamnose und L-Fucose) wurden in HPLC-Wasser mit 4 mg/ml resuspendiert. Vorbeschichtete, Kanäle aufweisende Silicagelchromatographieplatten (Kieselgel 60 CF 254, 10 × 20 cm, E. Merck) wurden über Nacht in 0,3 M NaH2PO4 getränkt, 30 min bei Raumtemperatur und dann 10 min bei 95°C getrocknet. Proben von 1–2 μl wurden als Punkte aufgetragen und das Chromatogramm wurde einem steigenden Lösemittelgemisch von 40 ml Aceton, 5 ml Butanol und 5 ml entionisiertem Wasser 2,5 bis 3 h bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die Platte wurde 3 min bei 65°C getrocknet und dann durch Tauchen in eine Lösung von 25 ml Aceton, 0,5 ml Anilin, 0,5 g Diphenylamin und 3,75 ml Phosphorsäure gefärbt, worauf 30 min bei 95°C getrocknet wurde. Wenn X. campestris der Empfänger der S88-DNA-Fragmente war, waren Glucose, Mannose und Glucuronsäure vorhanden. Wenn der Sphingomonas-Stamm S88 der Empfänger für das gumD-Gen von X. campestris war, dann waren Rhamnose, Glucose, Mannose und Glucuronsäure in dem S-88-Exopolysaccharid ähnlichen Mengen vorhanden.
  • Beispiel 9
  • Stimulierung der Produktion der Sphingane S-88, S-60 und NW-11 durch DNA-Fragmente, die von den Stämmen S88, S60 und NW11 erhalten wurden
  • Die DNA-Fragmente, die von den Stämmen S88, S60 und NW11 nach dem in den obigen Beispielen 5, 6 und 7 angegebenen allgemeinen Verfahren erhalten wurden, wurden zum Erhöhen der Produktion der Sphingane S-88, Gellan (S-60) und NW-11 in Sphingomonas-Stämmen verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
    Wirt Plasmid Isopropylalkoholfällung Trockengewicht (mg) und Standardabweichung relatives Gewicht
    S88 pRK311 98 ± 5 1,0
    S88 pRK311-S88c2 155 ± 24 1,6
    S88 pRK311-S60c2 133 ± 11 1,4
    S88 pRK311-NWc2.2 165 ± 15 1,7
    S60 pRK311 49 ± 11 1,0
    S60 pRK311-S88c2 73 ± 2 1,5
    S60 pRK311-S60c2 74 ± 2 1,5
    S60 pRK311-NWc2.2 55 ± 6 1,1
    NW11 pRK311 98 ± 5 1,0
    NW11 pRK311-S88c2 105 ± 6 1,2
    NW11 pRK311-S60c2 124 ± 5 1,4
    NW11 pRK311-NWc2.2 100 ± 1 1,2
  • In dem generellen Ansatz können DNA-Fragmente, die aus einem speziellen Stamm von Sphingomonas isoliert wurden, zum Erhö hen der Produktion eines Sphingans (das nicht von diesem Stamm produziert wird) in einen unterschiedlichen Stamm von Sphingomonas durch Insertion der isolierten DNA-Fragmente in mehreren Kopien nach den Techniken und Verfahren, die in den obigen Beispielen und insbesondere Beispiel 7 angegeben sind, verwendet werden.
  • In dem generellen Ansatz, der durch das vorliegende Experiment gestützt wird, kann ein DNA-Fragment, das für die Produktion von Sphingan in einem beliebigen Sphingomonas-Stamm wesentliches genetisches Material enthält, in einen entsprechenden Plasmidvektor oder anderes insertiert und in mehreren Kopien in eine sphinganproduzierende oder nicht-mucoide Mutante des gleichen oder eines verschiedenen Sphingomonas-Stamms, aus dem die DNA isoliert wurde, der ein Sphinganproduzent ist oder eine nicht-produzierende Mutante des sphinganproduzierenden Stamms ist, eingeführt werden. Der erhaltene, gentechnisch veränderte Sphingomonas-Mikroorganismus produziert Sphingan in Mengen, die generell die durch den nicht gentechnisch veränderten, nicht-mutierten Sphinganproduzenten unter identischen Fermentationsbedingungen produzierte Menge übersteigen.
  • Die folgenden Experimente werden angegeben, um zu zeigen, dass die Einarbeitung von mehreren Kopien von DNA-Fragmenten in Stämme von Sphingomonas sowie andere Bakterien Routine ist.
  • Beispiel 10
  • Insertion von Lactoseverwendungsgenen in das Chromosom von X. campestris
  • Unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren, die Restriktionsenzyme und DNA-Ligation umfassen, insertierten wir die Lactoseverwendungsgene von einem Transposon, Tn951, angrenzend an ein zuvor kloniertes Segment von X. campestris-DNA, das auf einem Plasmid getragen wird, das in X. campestris nicht replizieren kann. Thorne et al., J. Indust. Microbiol., 3, 321 (1988). Das rekombinante Plasmid wurde dann durch Konjugation in X. campestris übertragen. In dem Empfängerbakterium rekombinierte die homologe DNA von X. campestris, die angrenzend zu Lactoseverwendungsgenen lokalisiert ist, mit der zellulären DNA durch normale homologe Rekombination unter Verwendung der Lactoseverwendungsgene, so dass sie an das Bakterienchromosom gebunden und mit diesem fortlaufend war. Das Ergebnis war die stabile Insertion des klonierten Segments in das Bakterienchromosom. Dies wird durch das Diagramm in dem Papier vollständiger erklärt. Der gleiche Ansatz der Insertion von Genen in Bakterien wurde von anderen bei zahlreichen Gelegenheiten verwendet.
  • Es ist anzumerken, dass es nicht notwendig ist, ein Plasmid als Vektor zur Einführung von exogener DNA in ein Bakterium vor der oben beschriebenen DNA-Rekombination zu verwenden. Es ist auch bekannt, dass von Bakteriophagen oder Transposons getragene DNA-Segmente sich selbst in das Bakterienchromosom durch positionsspezifische DNA-Rekombination insertieren. Üblicherweise insertieren sich Bakteriophagen spezifisch an einem oder einigen wenigen Orten, während Transposons üblicherweise an zahlreichen, im Wesentlichen willkürlichen Orten insertiert werden. Ferner ist es nicht notwendig, dass die DNA an einen Klonierungsvektor, wie ein Plasmid, gebunden in die Zelle getragen wird. Es ist bekannt, dass DNA-Fragmente durch Transformation in Bakterienzellen eindringen können und die Fähigkeit zur Rekombination mit der zellulären DNA beibehalten können.
  • Beispiel 11
  • Positionsspezifische Insertion eines Gens mit Codierung für Resistenz gegenüber Kanamycin in bakterielle DNA von Sphingomonas S88 an mehreren verschiedenen, willkürlich ausgewählten Orten
  • Dieses Beispiel zeigt, dass es Routine ist, Segmente klonierter DNA in die zelluläre DNA von Sphingomonas zu insertieren. Zunächst wurde das X88E12.8-Fragment (siehe 1) in die EcoRI-Stelle in der multiplen Klonierungsstelle des Plasmidvektors pSEB26 (7) ligiert. Das Plasmid pSEB26 weist das Ampicillin-Resistenzgen, Chloramphenicol-Resistenzgen, die multiple Klonierungsstelle, das Lac-Segment und den oriT wie in Plasmid pSEB24 (auch in 7 gezeigt) auf. Es unterscheidet sich jedoch dadurch, dass es einen Replikationsursprung eines engen Wirtsbereichs von dem Plasmid pBR322 anstelle der oriV-Sequenz eines breiten Wirtsbereichs des Plasmids pSEB24 aufweist. Der pBR322-Ursprung ermöglicht eine Replikation des Plasmids in Escherichia coli, jedoch nicht in Sphingomonas. Daher besteht der einzige Weg dafür, dass in das Plasmid pSEB26 klonierte DNA-Sequenzen in Sphingomonas bestehen können, darin, dass sie in die bakterielle DNA, beispielsweise das Chromosom oder endogene Plasmide, integriert werden, bevor das Plasmid aus der Zelle oder Kultur verloren geht. Zweitens wurde durch Routineverfahren das pSEB26-S88E12.8-Plasmid einer Mutagenese mit dem Transposon mini-Tn10kan (1991, Kleckner et al., 204, S. 139–180) unterzogen. Eine Mutagenese durch Transposition in dem nicht unterdrückenden Wirt HMS174 erfolgte mit dem Tn10-Derivat 103 (mini-Tn10kan/Ptac-ATS-Transposase), das von dem Lambda-Bakteriophagen NK1316 getragen wird. Das Ergebnis war die Insertion eines Kanamycin-Resistenzgens in das Plasmid. Wir isolierten mehrere unabhängige Insertionen des Kanamycin-Resistenzgens jeweils an einem unterschiedlichen Ort innerhalb des S88E12.8-Segments. Drittens übertrugen wir unter Verwendung des Triparental Mating-Schemas jedes der re kombinanten Plasmide getrennt in Sphingomonas S88 und selektierten auf Kanamycin-resistente Nachkommen. In tatsächlich jedem Fall rekombinierten die S88-DNA-Sequenzen, die auf einer der beiden Seiten des Kanamycin-Resistenzgens lokalisiert waren, mit dem Chromosom der Empfängerzelle derart, dass das Kanamycin-Resistenzgen in das Bakterienchromosom integriert wurde. Durch Integration in das Bakterienchromosom konnte das Gen die Unfähigkeit des Vektorplasmids zur Replikation in Sphingomonas überleben.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass exogene DNA-Segmente (in diesem Fall das Kanamycin-Resistenzgen) in einen Empfänger so eingeführt werden können, dass das eintretende Gen in das Bakterienchromosom integriert wird. Der Ort der Integration wird durch die DNA-Sequenzen, die dem Gen benachbart sind, bestimmt. In diesem Fall integrierte das exogene Gen in verschiedene Stellen innerhalb des E12.8-Segments des Stamms S88. Die Integration durch homologe Rekombination ist ein routinemäßig durchgeführtes Verfahren der Genmanipulation.
  • Beispiel 12
  • Weitere DNA-Sequenzierung und Analyse
  • Beide DNA-Stränge wurden zwischen den BamHI-Stellen bei 1 und 28804 bp, wie in 8 gezeigt ist, sequenziert. Das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren von Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 5463–5467) wurde zur Sequenzierung gruppierter Deletionen, die in pBluescriptIIKS(+) mit Exonuclease III und S1-Nuclease erzeugt wurden, verwendet. Interne Sequenzierungsprimer wurden ebenfalls verwendet. Die Sequenzen wurden mit den Programmen SuperClone und SuperSee von Coral Software (San Diego) und durch das Verfahren von Kyte und Doolittle (Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105–132) für membrandurchspannende Proteindomänen analysiert. Homologe Proteinsegmente wurden in der Sammeldatenbibliothek am NCBI mit dem "blastp"-Programm (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410) identifiziert. DNA-Hybridisierung erfolgte durch Standardverfahren unter Verwendung von Nylonmembranen und dem GeniusTM 1 Kit (Boehringer Mannheim).
  • Beispiel 13
  • Klonierung von an der Biosynthese von Sphingan S88 beteiligten Genen
  • Dieses Beispiel folgt einigen der Lehren von Beispiel 2. Wir ermittelten früher, dass die meisten sphinganpolysaccharid-negativen (Sps) Mutanten des Sphingomonas-Stamms S88 auf Bacitracin enthaltenden YM-Platten wachsen (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237). Kartierungsexperimente (die später beschrieben sind) platzierten alle diese Mutation in ein Gen, das wir spsB nannten. Die in 11 aufgelisteten repräsentativen SpsB-Mutationen (260, 265 und 102w) waren ebenfalls Bacitracin-resistent (Bacr). Umgekehrt war der bac8-Stamm typisch für Mutanten, die zunächst als Bacr selektiert wurden und die sich dann als Sps erwiesen. Wie in Beispiel 2 angegeben führte hierbei der Fehlschlag, Sphingan S-88 durch die Sps Bacr-Mutanten herzustellen, zu einem Aussehen der Kolonien, das flacher, von rauer Oberfläche und durchscheinend im Vergleich zu Wildtypkolonien, die auch von einem engen lichtbrechenden Halo umgeben waren, wenn sie gegen das Licht gehalten und von unten betrachtet wurden, war. Den Sps-Mutanten gelang es auch nicht, Sphingane in flüssiges YM-Medium zu sezernieren, was durch das Fehlen von durch Alkohol fällbaren Exopolysacchariden beurteilt wurde. Eine kleine Fraktion der Sps Bacr-Mutanten trug zweite Mutationen. Beispielsweise waren Kolonien der Mutante 102w eher weiß als gelb. Die Mutante 134 wies eine Mutation in dem rhsD-Gen zusätzlich zu spsB auf. Und die Mutanten 54 und 302 wiesen Defekte im Hinblick auf spsK sowie spsB auf. Die Sps-Mutationen, die unmittelbar über der Genkarte in 11 angegeben sind, waren entweder spontan oder wurden nach Einwirken von Ultraviolettlicht oder Ethylmethansulfonat erhalten. Alle hier untersuchten anderen Mutationen (die in 11 mit dem Vorsatz "Y" oder "B" angegeben sind) waren das Ergebnis von willkürlichen Insertionen des Transposons mini-Tn10kan.
  • Wir konstruierten eine Bibliothek von Genen aus dem Sphingomonas-Stamm S88 in dem Cosmid eines breiten Wirtsbereichs pRK311 und übertrugen die gepoolten Klone von E. coli auf S88m260 durch Konjugationsverbindung. Jedoch erschienen wiederholt keine Sps+-Kolonien unter den 103 bis 104 gescreenten Tetr-Exkonjuganten. Wir übertrugen dann die Bibliothek auf zuvor isolierte Bacr Gum (gumD)-Mutanten von X. campestris (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237; und Thorne et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 3593–3600). Es ist erforderlich, dass das gumD-Gen Glucose-6-phosphat von UDP-Glucose auf Isoprenylphosphat als erste Stufe beim Zusammenbau von Xanthangummi überträgt (Capage et al., Oktober 1987, internationales Patent WO87/05938 , und Ielpi et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 2490–2500). Wir dachten, dass der Zusammenbau von Sphingan S-88 wahrscheinlich auch mit Glucose begann und dass es für das Enzym von Sphingomonas möglich sein könnte, die Bacr Gum-Mutanten in X. campestris zu komplementieren, da DNA-Segmente, die das gumD-Gen von X. campestris enthalten, die Synthese von Sphingan S-88 in Bacr Sps-Mutanten von Sphingomonas wiederherstellen konnten. (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237). Bei den intergenerischen Verbindungen fanden wir Gum+-Kolonien von X. campestris auf YM-Platten mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro 103 bis 104 Tetr-Exkonjuganten.
  • Plasmide wurden aus den komplementierten X. campestris-Mutanten durch Transformation von E. coli gereinigt und dann in die Sphingomonas S88-Mutante 260 eingebunden. Etwa 5–25% der Exkonjuganten wurden Sps+. Die Häufigkeit einer Übertragung für den Vektor allein (pRK311) war 100- bis 1000- fach höher als für die größeren rekombinanten Plasmide. Obwohl die meisten der rekombinanten Plasmide ausgedehnte Deletionen erlitten, wenn sie in Sphingomonas eingebaut wurden, wurde eines intakt gewonnen und für die anschließenden Arbeiten verwendet: pRK311-S88c1. Die äußersten linken 21 kbp von S88c1 sind in 1, 8 und 11 als Subklon c1Δ3 angegeben. Das Plasmid pRK311-S88c1 stellte auch die Polysaccharidsynthese für mehrere andere, unabhängig voneinander isolierte Bacr Sps-Mutanten von Stamm S88 und Bacr Gum Mutanten von X. campestris wieder her. Wir isolierten die Polysaccharide, die in das Kulturmedium durch die Exkonjuganten für jede intergenerische Verbindung sezerniert wurden, und verifizierten durch Dünnschichtchromatographie, dass Säurehydrolysate die neutralen Zucker enthielten, die für das Polysaccharid der Empfängerzelle erwartet wurden. Exopolysaccharid von der Sphingomonas-Mutante 260, die das Plasmid pRK311-S88c1 trägt, enthielt Glucose, Mannose und Rhamnose, während X. campestris m31 mit pRK311-S88c1 nur Glucose und Mannose enthielt. Jedes Polysaccharid enthielt auch Glucuronsäure, obwohl die Gewinnung des sauren Zuckers aufgrund der Hydrolysebedingungen systematisch niedrig war.
  • Wir verlängerten die klonierte Region nach links in 11 durch Screening der Bibliothek auf Segmente, die die Sps Bacr-Mutanten 76 und 78 komplementierten. Wir screenten 104 bis 106 Exkonjuganten und erhielten vier weitere Klone (S88c2, c3, c4 und c5), die das S88c1-Segment partiell überlappten. Ähnlich wurde der Klon c6 durch Komplementierung der SpsMutanten 43, 71 und 104 isoliert. Die fünf klonierten Segmente wiesen jeweils eine Länge von etwa 22–28 kb auf und mindestens ein Ende jedes Segments ist in 11 gezeigt. Wir identifizierten einen Satz von etwa 15 Sps-Mutationen, die weder durch den Klon c2 noch den Subklon c1Δ3 komplementiert wurden. Keine dieser Mutationen wurde durch den c1-Klon voller Länge, der sich um etwa 8 kbp gegenüber c1Δ3 weiter nach rechts erstreckt, komplementiert und keine wurde durch c6, das sich um etwa 18 kbp links von c2 in 3 erstreckt, komplementiert. Der Satz "nicht verknüpfter" Mutationen legt zusätzliche Gene nahe, die für die Sphingansynthese wesentlich sind, jedoch nicht unmittelbar angrenzend an den in 11 gezeigten Cluster von Genen sind.
  • Beispiel 14
  • Kartierung der sps-Gene durch funktionale Komplementierung
  • Die Grenzen der spsG-, spsK-, spsF-, spsD-, spsC-, spsE-, spsB- und rhsD-Gene wurden durch Komplementierungstests unter Verwendung der Sps-Punktmutanten als Empfänger im Hinblick auf die Konjugation bestimmt. Die Ergebnisse sind in 11 über der Karte zusammengefasst. Rekombinante Plasmide, die kleine subklonierte DNA-Segmente oder größere Segmente trugen, wurden insertionaler Mutagenese mit mini-Tn10kan in E. coli unterzogen und dann durch Verbindung in Sps-Mutanten des Stamms S88 übertragen. Zwei verwendbare Plasmidvektoren eines breiten Wirtsbereichs wurden verwendet: pRK311 und pSEB24 (7). Die Exkonjuganten, die den Arzneistoffresistenzmarker des eintretenden Plasmids aufnahmen, wurden dann auf der Basis des Aussehens der Kolonie als Sps+ oder Sps bewertet. Die Bacr Sps-S88-Mutanten wurden zunächst auf den E4.5-Subklon kartiert und dann wurde das E4.5-Segment einer insertionalen Zufallsmutagenese mit mini-Tn10kan ausgesetzt. Insertionen in die Positionen B231 und B230 (11) beeinflussten die Wiederherstellung der Sphingansynthese für die Mutante 260 nicht, jedoch blockten die Insertionen B233, B239 und B238 eine Komplementierung. Die Mutante 134 wurde durch das Segment B8.6, jedoch nicht durch entweder E4.5 oder E5.9 komplementiert. Die Mutante 134 weist einen Defekt in dem spsB-Gen und auch in dem nahegelegenen rhsD-Gen auf. Der genauere Ort der rhsD-Mutation wurde durch Einwirken einer mini-Tn10kan-Mutagenese auf das B8.6-Segment und Analysieren des Komplementierungsmusters für die B441-, B440-, B438-, B437- und B435-Insertionen bestimmt. Die Mutanten 54 und 302 schie nen auch doppelte Mutanten mit Defekten in den spsK- und spsB-Genen zu sein. Die spsF-Mutanten (62, 68 und 94 von 11) wurden aufgrund des Fehlens einer Komplementierung durch die Segmente B12.6 und c1Δ3 und durch Wiederherstellung der Synthese von Sphingan S-88 durch die Klone c3 und c5 lokalisiert und von dem nahegelegenen spsDCE-Cluster abgetrennt. Komplementierungsergebnisse für die fortlaufenden spsD-, spsC- und spsE-Gene nach der insertionalen Mutagenese des E6.6-Fragments sind ebenfalls in 11 angegeben. Die Komplementierungsergebnisse schlugen zwei Gruppen vor: eine erste, die die Mutationen 76 und 78 umfasst, und eine zweite, die die Mutationen 69, 72, b104, 3, 9 und 41 umfasst. Eine spätere Analyse der DNA-Sequenzen löste die letztere Gruppe in zwei unterschiedliche fortlaufende Gene auf: spsC und spsE. Die spsG-Mutationen (11, 43, 71, 81 und 104 von 11) wurden durch den c6-Klon und das B4.5-Subfragment von Fragment B12.6 komplementiert (siehe 11). Die insertionale Mutagenese des B12.6-Segments ergab die Plasmide Y652, Y635, Y636, Y653, Y640 und Y641. Von diesen waren nur Y652 und Y641 zur Komplementierung der spsG-Mutanten fähig.
  • Beispiel 15
  • Phänotypen von mini-Tn10kan-Chromosomen- und Plasmidinsertionen
  • Segmente von klonierter S88-DNA wurden an das verbindbare Camr-Plasmid mit engem Wirtsbereich pSEB26 (11) ligiert, einer Mutagenese durch mini-Tn10kan in E. coli ausgesetzt und dann durch Konjugation in den Wildtyp(Sps+)-Sphingomonas-Stamm S88 übertragen. Die Plasmide waren zur Replikation in Sphingomonas nicht fähig, so dass das Beibehalten des Kanr-Gens die Rekombination mit dem Bakterienchromosom erforderte. Wir wählten nur die Rekombinanten, die Kanr und Cams waren, in der Erwartung, dass diese Gruppe keine Plasmidsequenzen zurückbehielt. Obwohl wir die physikalischen Strukturen dieser DNA-Substitutionen nicht verifi zierten, verwendeten wir routinemäßig die gleichen Plasmide, Stämme und Selektionsschemata zur Erzeugung positionsspezifischer chromosomaler Deletionen (unterer Teil von 11) und bestätigten diese doppelten Rekombinationsereignisse durch Restriktionskartierung und DNA-Hybridisierung. Kolonien der Kanr Cams-Chromosomenrekombinationen wurden als Sps+ oder Sps beurteilt (im oberen Teil von 11 für Insertionen, die mit einem vorangestellten "c" markiert sind, gezeigt). Für die Mutanten, die einen Sps-Phänotyp zeigen (cY776, cY757, cY771, cY770, cY676, cB589, cB583, cB580, cB579, cB300, cY726, cY725, cY676, cY673, cY721 und cY602), war es sinnvoll, anzunehmen, dass eine doppelte Rekombination auftrat. Jedoch war es für die Sps+-Rekombinanten möglich, dass das gesamte Plasmid in das Chromosom in einer der homologen Regionen integrierte, was zu einem defekten und einem normalen Gen in dem Chromosom führt.
  • Um die Ungewissheit einer doppelten Rekombination zu vermeiden, erzeugten wir große positionsspezifische Deletionen in dem Chromosom und führten dann replizierende Plasmide, die entweder die S88c2- oder S88c3-DNA-Segmente mit einzelnen mini-Tn10kan-Insertionen zur Inaktivierung bestimmter Gene trugen, ein. Die Positionen und Sps+- oder Sps-Phänotypen der Insertionen sind in der Nähe des oberen Teils von 11 durch das voranstehende "p" angegeben. Die Ergebnisse der chromosomalen und Plasmidmutationsstrategie passen zueinander und sowohl essentielle (–) als auch nicht-essentielle (+) Regionen wurden beobachtet.
  • Beispiel 16
  • DNA-Sequenz: G + C-Gehalt, Verwendung von seltenen Codons und Translationsstartsequenzen
  • Die DNA-Sequenz von 28804 bp wurde für beide Stränge bestimmt (siehe 14). Ein Durchschnittsprofil (und Standardabweichung) für ein typisches Sphingomonas-Gen in diesem Cluster wurde auf der Basis der gedrehten G + C-Gehalte, der Häufigkeiten seltener Codons und von "Shine-Dalgarno"- oder Translationsinitiationssequenzen bestimmt (Tabelle 4). Eine hohe Häufigkeit von G oder C in der dritten Codon-Position war für jedes der Gene typisch. Ein Satz von selten verwendeten Codons für Sphingomonas wurde in frühen Arbeiten durch Analyse von 2500 Codons aus den rhsACBD-Operon und den spsB, D-, C- und E-Genen identifiziert. Jedes seltene Codon in den Sets war mit weniger als 0,2% der Gesamtmenge vorhanden und diese umfassten: AGA, AGG, CGA, TGT, GGA, ATA, CTA, TTA, TTG, AAA, TTT, CCA, CCT, AGT, TCA, TCT, ACA und ACT. Die Translation beginnt üblicherweise in E. coli angrenzend an eine und strangabwärts einer Sequenz, die komplementär zum 3'-Terminus von 16S-rRNA ist (Shine und Dalgarno, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 71: 1342). Die analoge "Shine-Dalgarno"-Sequenz, die komplementär zu 16S-rRNA in S. paucimobilis DSM1098 ist, ist TAAGGAGGTG (Moore et al., 1993, Lett. Appl. Microbiol. 17: 115–118).
  • Wenn ein Gen in diesem Cluster zum Durchschnittsgenprofil passte und unter Bildung eines Sps-Phänotyps mutiert werden konnte, erhielt es eine "sps"-Bezeichnung. Jedoch ergab unsere Suche nach Proteinähnlichkeiten keinen signifikanten Hinweis auf mögliche Funktionen der spsG-, I- und F-Gene. Zusätzlich gab es vier weitere offene Leseraster, die das typische Genprofil erfüllten und keine signifikante Ähnlichkeit mit Proteinsequenzen in Computerdatenbanken zeigten. Da jedoch Mutationen in diesen vermutlichen Genen die Polysaccharidsynthese nicht sichtbar änderten, wurden sie mit "Urf" für unidentifiziertes Leseraster markiert. Es gab vier Urf-Sequenzen (32, 26, 31 und 34), die nach der Größe des abgeleiteten Proteins in Kilodaltons benannt wurden.
  • Tabelle 4. Profile von sps-Genen
    Figure 00660001
  • Die unter "vermutliche Translationsstartsequenzen" aufgelisteten Sequenzen sind der Reihe nach SEQ ID NO: 2 bis 26.
  • Beispiel 17
  • Identifizierung von Glucosyl-IP-Transferase als spsB-Gen
  • Die meisten der Sps-Mutationen, die nach einer Ultraviolett- oder chemischen Mutagenese isoliert wurden, befanden sich im spsB-Gen. Es wird angenommen, dass das SpsB-Protein die erste Stufe beim Zusammenbau von Sphingan S-88 wegen der überraschenden Ähnlichkeit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von SpsB mit anderen Genprodukten, von denen angenommen wird, dass sie für Glycosyl-IP-Transferasen codieren, katalysiert. 12 zeigt ein Alignment von Aminosäuresequenzen von vermuteten Glucosyl- und Galactosyl-IP-Transferasen. Es besteht beträchtliche Homologie für die C-terminalen Hälften dieser Proteine. Obwohl den N-terminalen Regionen diese extensive Homologie fehlt, ist das SpsB-Protein dem RfbP-Protein von S. enterica (Jiang et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 695–713) dadurch ähnlich, dass es mehrere hydrophobe Regionen aufweist, die membrandurchspannende Domänen nahelegen (in 12 unterstrichen). Die hydrophen Domänen von SpsB umfassen die Aminosäuren 35–59 (mittlere Hydropathie +2,2), 68–86 (+1,7), 105–123 (+2,3) und 282–303 (+2,9). Die Position des letzteren hydrophoben Segments war diesen verwandten Genprodukten gemeinsam und war in der Mitte des Proteins angrenzend an die Region größter Homologie lokalisiert.
  • Die von der DNA-Sequenz abgeleitete spsB-Codierungsdomäne wurde durch Komplementierungsuntersuchungen bestätigt. Wir beobachteten, ob verschiedene Insertionen von mini-Tn10kan in dem E4.5-Segment die Komplementierung von Bacr Sps-Mutanten störten oder nicht. Die Stellen einer Insertion von mini-Tn10kan und "+"- oder "–"-Komplementierungsergebnisse sind über dem spsB-Gen in 11 angegeben. Drei mini-Tn10kan-Insertionen ergaben keine Wiederherstel lung der Sphingansynthese an der SpsMutante S88m260 (B233, B239 und B238), während mehrere flankierende Insertionen, die B231 und B230 umfassten, deren Fähigkeit zur Lieferung der fehlenden Funktion beibehielten.
  • Beispiel 18
  • Rhamnose-Biosyntheseoperon von Sphingomonas S88
  • Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch die rhsACBD-Gene codiert werden, waren sehr ähnlich Enzymen von S. enterica Gruppe B und X. campestris, die dTDP-L-Rhamnose in vier Stufen aus dTTP und Glucose-1-phosphat synthetisieren (13). Wir übernahmen die bereits bestehende Nomenklatur mit Glucose-1-phosphat-thymidylyltransferase, die durch das rhsA-Gen codiert wird, und die aufeinanderfolgenden katalytischen Stufen, die durch die rhsB-, C- und D-Gene codiert werden. Jedoch war das Sphingomonas-Operon in vierfacher Hinsicht einzigartig. Erstens war die Reihenfolge der Gene ACBD → von entweder S. enterica (BDAC →) oder X. campestris (BACD →) verschieden. Zweitens waren intercistronische Regionen fast nicht vorhanden. Start- und Stopcodons überlappten oder waren eng beabstandet: rhsA-ATGA-rhsC-TGATCCATG-rhsB-TGATG-rhsD. Drittens war der mittlere G + C-Gehalt für das rhsACBD-Operon (66%) relativ hoch, insbesondere in der dritten Codonposition (89%), und über das Operon gleichförmig. Und viertens stimmte der hohe G + C-Gehalt mit den umgebenden Genen in dem Cluster und nicht verwandten Genen von anderen Sphingomonas-Arten überein.
  • Zunächst wurde nur eine Mutation (# 134) innerhalb des rhs-Clusters isoliert und sie trat gleichzeitig mit einer zweiten Mutation in dem spsB-Gen auf. Wir berücksichtigten die Möglichkeit, dass Rhs-Mutationen letal sein könnten. Daher testeten wir, ob Einzelmutationen, die spezifisch innerhalb des rhs-Clusters technisch erzeugt wurden, die Sphingansynthese blockieren oder nicht. Wir konstruierten zunächst eine S88-Mutante mit einer großen Chromosomendeletion (ΔTn365 in 11), die die spsD- bis rhs-Gene durchspannt, und führten dann Plasmide ein, die die fehlende DNA, jedoch mit mini-Tn10kan-Insertionen an speziellen Stellen, trugen. Wenn die Insertionen in den Plasmiden innerhalb des spsD-, C-, E-, B- oder rhs-Operons lokalisiert waren, blieben die Zellen Sps. Jedoch störten Insertionen innerhalb von entweder Urf32, 26, 31, 34, atrD oder atrB die Komplementierung der Deletionsmutation nicht und die Zellen wurden Sps+.
  • Beispiel 19
  • Glycosyltransferasen von Sphingomonas S88
  • Drei Gene codieren wahrscheinlich für Glycosyltransferasen: spsQ, spsK und spsL. Jedoch konnten die Zuckerspezifitäten für diese Transferasen nicht durch Sequenzanalyse allein bestimmt werden, da die Proteine nur beschränkte lokale Homologien zu anderen Glycosyl- und Rhamnosyltransferasen zeigten. Wie von anderen angegeben, sind die Glycosyltransferasen selbst für Enzyme aus einem einzigen Bakterium, die die gleichen Zucker in einer identischen Verknüpfung anbringen, sehr divergent (Glucksman et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 7045–7055). Das abgeleitete spsQ-Genprodukt war ähnlich dem orf11 angrenzend an gnd in E. coli K-12, wofür angenommen wird, dass es für eine Rhamnosyltransferase codiert, (Stevenson et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 4144–4156) und auch ähnlich den ExoO- und ExoU-Glucosyl-Transferasen von R. meliloti (Reuber und Walker, 1993, Cell, 74: 269–280). Das spsQ-Gen war essentiell für die Sphingan-S-88-Synthese. mini-Tn10kan wurde in das spsQ-Gen (Z206 in 11) auf einem Plasmid, das das S88c2-Segment trägt, insertiert und das mutierte Plasmid wurde dann in S88-Zellen, die eine chromosomale Deletion der spsGSRQI-Gene tragen, eingeführt. Die Empfängerzellen waren lebensfähig, doch war die Polysaccharidsynthese blockiert. Das abgeleitete spsL-Genprodukt war ähnlich dem spsQ-Produkt, wenn ein Vergleich durch eine Punktmatrixanalyse durchgeführt wur de, und es zeigte eine lokale Ähnlichkeit zu einer Rhamnosyltransferase (RfbN) von S. enterica und einer vermutlichen Abequosyltransferase von Yersinia pseudotuberculosis (Liu et al., 1995, J. Bacteriol., 177: 4084–4088). Recherchen nach spsK ähnlichen Proteinen ergaben nur marginale Ähnlichkeiten, wofür vorherrschende Mitglieder Glycosyltransferasen waren, die eine gemeinsame vermutliche Bindungsstelle für UDP enthielten. Die mögliche Beteiligung von UDP legt eine Glucosyl- oder Glucuronosyltransferase nahe. Eine Mutante mit einer speziellen Insertion in dem spsK-Gen (pY882 in 14) sowie Nichtinsertionsmutanten 54 und 302 waren lebensfähig, stellten jedoch kein Polysaccharid her.
  • Beispiel 20
  • Sekretion von Polysaccharid von Bakterien
  • Gemeinsame Strategien zur Sekretion von Polysacchariden von verschiedenen Bakterien werden durch Sequenzähnlichkeiten für essentielle Genprodukte nahegelegt. Derartige Vergleiche (Tabelle 5) zeigten, dass bis zu fünf der sps-Gene an der Sekretion von Sphinganen beteiligt sein können: spsD, C, E, J und S. Die in Tabelle 5 zusammengefassten Sequenzbeziehungen gelten für Proteine, für die beträchtliche Informationen gesammelt wurden, wie die in "Exo"-Proteine von R. meliloti. Jedoch sind die Familien funktional verwandter Proteine größer als durch die Tabelle impliziert wird. Drei verschiedene Segmente des SpsD-Proteins von 51, 29 und 22 Aminosäuren zeigten jeweils 29, 31 und 36 Prozent Identität zu ExoF. Die benachbarten spsC- und spsE-Gene mit überlappenden Start- und Stopcodons (TGATG) codieren für Proteine, die zwei verschiedenen Domänen innerhalb von ExoP ähnlich sind. Die ähnlichen SpsC-ExoP-Sequenzen umfassen ein Motiv (PX2PX4SPKX11GXMXG), das vor kurzem an einer Kettenlängenbestimmung für Bakterien-O-Antigene beteiligt war (Becker et al., 1995, Mol. Bicrobiol., 16: 191–203). Drei Segmente von SpsC mit 92, 30 bzw. 19 Aminosäuren waren 22, 30 und 42 identisch zu ähnlich angeordneten Sequenzen von der N-terminalen Hälfte von ExoP und zwei Segmente von SpsE mit 75 und 98 Aminosäuren waren 32 und 29% identisch zur C-terminalen Hälfte von ExoP. Drei Segmente von SpsS mit 37, 20 und 44 Aminosäuren waren zu 38, 55 und 23 identisch zu ExoT. Das abgeleitete SpsJ-Protein zeigte eine gewisse Ähnlichkeit zu KpsT-, BexA- und ABC-Transportern durch das Teilen einer vermutlichen nucleotidbindenden Domäne. Obwohl das spsR-Gen für die Sphingansynthese nicht erforderlich war, war dessen Genprodukt Bakterien- und Pilzpolysaccharidlyasen entfernt ähnlich. Daher kann es zur Freisetzung der Glucuronsäure enthaltenden Sphingane von entweder zellulären oder Substratoberflächen oder zur Wiederverwendung des Polymers als Kohlenstoffquelle wichtig sein.
  • Wie in 11 gezeigt ist, waren spontane Punktmutationen und mini-Tn10kan-Insertionen in den SpsD-, spsC-, spsE- und spsS-Genen lebensfähig, jedoch sammelten sie kein Sphingan S-88 in Kulturüberständen an. Im Gegensatz dazu waren Mutationen in analogen Genen von R. meliloti (Harding et al., 1993, J. Gen. Microbiol., 139: 447–457) und X. campestris letal. mini-Tn10kan-Chromosomeninsertionen in dem spsJ-Gen waren auch Sps. Jedoch waren mini-Tn10kan-Insertionen in SpsJ, die auf einem Mehrfachkopieplasmid in einem mutierten Stamm mit einer großen Chromosomendeletion gehalten wurden, entweder Sps+ oder Sps. Tabelle 5. Ähnlichkeiten von Sekretionsproteinen
    Bakterium Polysaccharid entsprechende Genproduktea
    Sphingomonas S88 Sphingan S-88 SpsD SpsC SpsE SpsJ SpsS
    R. meliloti Succinoglycan ExoF ExoP ExoP ExoT
    X. campestris Xanthangummi GumB GumC GumJ
    E. coli Polysialinsäure KPsD KpsT
    H. influenzae Gruppe-II-Kapsel BexD BexC BexA
    • a Verweisstellen für die Sekretionsrollen der einzelnen Proteine:
    • ExoF, ExoP, ExoT (Becker et al., 1995, Mol. Microbiol, 16: 191; Horinouchi und Weisblum, 1982, J. Bacteriol., 150, 815; und Reuber und Walker, 1993, Cell, 74: 269)
    • GumB, GumC, GumJ (Glucksmann et al., 1993, J. Bacteriol., 175: 7033; Becker et al., 1995, Mol. Microbiol., 16: 191; und Glucksmann et al., 1993, J. Bacteriol., 175: 7045)
    • KpsD und KpsT (Wunder et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 4025; und Smith et al., 1990, Mol. Microbiol., 4: 1863)
    • BexD, BexC und BexA (Kroll et al., 1990, Mol. Microbiol., 4: 1853)
  • Beispiel 21
  • ABC-Transporter für lytisches oder toxisches Protein
  • Innerhalb des sps-Clusters waren zwei benachbarte Gene, atrB und atrD, lokalisiert, wobei diese für einen ABC-Transporter eines lytischen oder toxinähnlichen Proteins und ein Zusatzprotein für den Transport zu codieren schienen. Eine Hämolysingen (hlyA) wurde bereits in Pseudomonas paucimobilis, das nun als Sphingomonas reklassifiziert wurde, identifiziert. Wir vermieden die "hly"-Bezeichnung an diesem Zeitpunkt, da wir mit unseren Stämmen keine eindeutige Hämolyse auf Agaragarplatten, die Erythrozyten von Schafen enthielten, detektierten. Etwa 48% der Aminosäuren, die von der DNA-Sequenz des atrB-Gens abgeleitet waren, waren identisch zu denen des Cyclolysin-ABC-Transporters von Bordatella pertussis. Das atrB-Genprodukt war auch überraschend ähnlich dem gesamten HlyB-Protein von E. coli und dem LktB-Protein von Pasteurella haemolytica, die Hämolysin bzw. Leukotoxin transportieren. Ferner war die C-terminale Hälfte von atrB vielen anderen ABC-Transportern, die die C-terminale Hälfte des NdvA- Proteins von R. meliloti und die zwei wiederholten ATP-Bindungsdomänen innerhalb des humanen mehrfacharzneistoffresistenten Proteins Mdr1 umfassten, ähnlich. Das atrD-Genprodukt war im Hinblick auf die Sequenz dem HlyD-Protein von E. coli und dem LktD-Protein von P. haemolytica ähnlich. Im Gegensatz zu den verwandten Transportgenen von anderen Gattungen gab es kein analoges lytisches oder toxisches Gen angrenzend an die Sphingomonas-atrB- und atr-D-Gene oder innerhalb des sps-Clusters.
  • Folgerungen
  • Eine wechselseitige Genkomplementierung von polysaccharidnegativen Mutationen in einer Gattung von Bakterien durch DNA, die einer zweiten Gattung entnommen wurde, wurde zum ersten Mal für Sphingomonas und Rhizobium belegt (Borthakur et al., 1988, Mol. Gen. Genct., 213: 155). In diesem frühen Fall wurde die Wiederherstellung von Mucoidbildung auf Agaragarplatten beobachtet. Es wurde später berichtet, dass eine wechselseitige intergenerische Komplementierung für das gumD-Gen von X. campestris und das spsB-Gen des Sphingomonas-Stamms S88 erfolgte (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 6229) und wir zeigten, dass das komplementierende Gen von dem Spender die Synthese des Exopolysaccharids des Empfängers wiederherstellte, durch Zusammensetzungsanalysen.
  • In der vorliegenden Anmeldung belegen die Experimente, dass das spsB-Gen mit Codierung für Glucosyl-IP-Transferase eine wichtige Stufe in der Biosynthese von Sphinganen ist. Infolgedessen umfassen DNA-Fragmente, die in Empfängerbakterien gemäß der vorliegenden Erfindung einzuarbeiten sind, vorzugsweise ein Gen mit Codierung für ein Glycosyl-IP-Transferaseenzym (Glucosyl-, Galactosyl- oder verwandte IP-Transferasen). Es wird angenommen, dass die erste Stufe beim Zusammenbau von Sphingan S-88 beispielsweise sehr wahrscheinlich die Übertragung eines Glucose-P auf das Träger-IP ist. Infolgedessen ist der Einbau eines Gens, das für ein Enzym codiert, das diese Biosynthesereaktion erleichtert, vorteilhafterweise in DNA-Fragmenten gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • Unsere Untersuchungen zeigten, dass innerhalb des großen sps-Genclusters in Sphingomonas S88 ein kleineres Operon mit Codierung für die Biosynthese von dTDP-L-Rhamnose (rhsACBD) vorliegt. Die Sequenzähnlichkeit zwischen dem rhs-Operon und anderen Rhamnoseoperons impliziert die gleichen vier enzymatischen Stufen für die L-Rhamnosesynthese in Sphingomonas und sie ist ein Beleg für das Anstreben des Einbaus eines rhs-Operons in das DNA-Fragment.
  • Die verschiedenen Sphinganexopolysaccharide können ähnlich den Schutzkapseln von vielen invasiven pathogenen Bakterien als Verteidigungsmittel in der Natur betrachtet werden. Sie können auch eine Rolle bei der Zellanheftung an ein Substrat spielen. Die anderen sphinganproduzierenden Stämme von Sphingomonas weisen ebenfalls Gencluster auf, die ähnlich dem hier detailliert beschriebenen S88-Cluster organisiert sind, wodurch die in den hier präsentierten Beispielen erhaltenen Ergebnisse als Anleitung dienen können, um dem Fachmann die Gewinnung verarbeitbarer DNA-Fragmente aus allen Sphingomonas sp. zu ermöglichen.
  • Die vorliegende Offenbarung hat gezeigt, dass die Herstellung eines Sphingangummi-Hyperproduzenten aus einem Sphingan-Nichtproduzenten oder normalen Produzenten (Empfängerbakterium) durch Insertieren von DNA, die aus einem sphinganproduzierenden Sphingomonas sp.-Spenderbakterium, das die vorteilhafte oder wesentliche genetische Information für die Biosynthese von Sphingan codiert, isoliert wurde, in das Empfängerbakterium ohne weiteres erhalten werden kann. Hyperproduzenten sind ohne weiteres erhältlich und das Verfahren ist generell für tatsächlich jeden sphinganproduzierenden Stamm von Sphingomonas sp. verwendbar.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung wird das DNA-Fragment bzw. die DNA-Fragmente, die von dem Spenderbakterium erhalten wurden, das Gene oder andere DNA-Fragmente, wie spsB von S88, enthält, die für Glucosyl-IP-Transferase (die erste Stufe beim Zusammenbau von Sphingankohlehydraten) codieren, vorteilhafterweise in der vorliegenden Erfindung verwendet. In anderen Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere den Ausführungsformen, in denen Rhamnose ein wichtiges Zuckersynthon oder ein wichtiger Baustein des gebildeten Polysaccharids ist, (beispielsweise im Falle von Sphingen S-88, Gellen S-60, und Welan S-130) kann der Einbau eines Rhamnoseoperons oder -gens (wie die rhsABCD-Gene von S-88) vorzugsweise verwendet werden, um die Produktion von bestimmten Sphinganpolysacchariden durch die Hyperproduzenten der vorliegenden Erfindung zu maximieren. Ferner können Gene oder andere DNA-Fragmente mit Codierung für Glycosyl-Transferasen, beispielsweise spsQ, spsK und spsL des Sphingomonas-Stamms S88, oder zur Sekretion des schließlich gebildeten Polysaccharids (beispielsweise spsD, C, E, J und S von Sphingomonas S88) vorteilhafterweise verwendet werden, wobei der Einbau dieser Enzyme die Produktion des schließlich produzierten Polysaccharids unterstützt. Andere DNA-Fragmente oder Gene mit Codierung für alle der oben beschriebenen Enzyme oder Funktionen können ebenfalls vorteilhafter Weise in Abhängigkeit von dem gewünschten Polysaccharid verwendet werden.
  • Es ist anzumerken, dass ein Fachmann üblicher Erfahrung durch Verfolgen der Lehren der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres DNA-Fragmente erhalten und diese Fragmente in Empfängerbakterien einbauen kann, um Sphingen-Hyperproduzenten zu produzieren. Diese Hyperproduzenten können ohne weiteres unter Verwendung von einschlägig bekannten einfachen gentechnischen Verfahren produziert werden.
  • Hinterlegungen
  • Die ersten sechs im Folgenden aufgelisteten Mikroorganismen wurden bei der American Type Culture Collection, in 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, nach dem Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure hinterlegt. Alle Beschränkungen in Bezug auf die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien werden bei Erteilen eines Patents hierauf unwiderruflich entfernt. Die letzten drei Mikroorganismen sind bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, öffentlich zugänglich.
    Mikroorganismus ATCC-Bezeichnung
    Xanthomonas campestris, X59m31 55653
    Escherichia coli DH5α, pRK311-S88c1 69732
    E. coli DH5α, pRK311-NWc1 69733
    E. coli DH5α, pRK311-S88c2 69734
    Sphingomonas sp. S88#78, pRK311-S88c3 69735
    Sphingomonas sp. S60 prk311-S60c2 69744
    Sphingomonas sp. S198 31853
    Sphingomonas sp. S7 21423
    Sphingomonas sp. S194 31961
  • Selbstverständlich dienen die hier im Vorhergehenden beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen zum Zwecke der Bereitstellung einer Beschreibung der vorliegenden Erfindung mittels Beispielen und sie sollen nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise betrachtet werden. Verschiedene Modifikationen oder Änderungen, die an dem hierin oben Beschriebenen durch den Fachmann durchgeführt werden können, werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung betrachtet und sollen in der Idee und der Aufgabe dieser Anmeldung und der folgenden Ansprüche enthalten sein.
  • Sequenzprotokoll
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  • Sequenzprotokoll
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Claims (17)

  1. Isoliertes DNA-Molekül, das ein erstes DNA-Segment umfasst, wobei das erste DNA-Segment (a) aus sphinganproduzierenden Bakterien der Sphingomonas sp. ATCC31554 isoliert ist, wobei das isolierte DNA-Molekül die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz aufweist, oder ein Fragment desselben ist und die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC31554 umfasst; oder (b) ein aus Sphingomonas sp. ATCC53272 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli sp. ATCC69733 insertiert ist, oder ein Fragment desselben ist, wobei das erste DNA-Segment die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC53272 umfasst; oder (c) ein aus Sphingomonas sp. ATCC31461 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311 von Sphingomonas sp. ATCC69744 insertiert ist, oder ein Fragment desselben ist, wobei das erste DNA-Segment die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC31461 umfasst, wobei das DNA-Molekül, wenn es in ein Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium in mehreren Kopien eingearbeitet ist, einen Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid gegenüber dem Empfängerbakterium ergibt, wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 01340001
    worin Glc für Glucose steht, GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht, X für Rha oder Man steht, Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht, W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht, die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass das Rückgrat W und Z ausschließt, wenn v und y gleich 0 sind.
  2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das erste DNA-Segment die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz aufweist.
  3. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das erste DNA-Segment ein aus Sphingomonas sp. ATCC31554 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli ATCC69734 insertiert ist, ist.
  4. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das erste DNA-Segment ein aus Sphingomonas sp. ATCC31554 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli ATCC69735 insertiert ist, ist.
  5. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das erste DNA-Segment ein Restriktionsfragment ist, das durch Verdau eines DNA-Segments mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz mit dem Restriktionsenzym Hind III, BamH I oder EcoR I erhalten wird.
  6. Verfahren zur gentechnischen Veränderung eines Bakteriums, das von einem Sphingomonas sp.-Stamm stammt, zu einem Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid, wobei das Verfahren das Einarbeiten des isolierten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in ein Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium in mehreren Kopien zur Erzeugung eines Bakteriums, das Sphinganpolysaccharid gegenüber dem Empfängerbakterium unter identischen Fermentationsbedingungen überproduziert, umfasst, wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 01350001
    worin Glc für Glucose steht, GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht, X für Rha oder Man steht, Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht, W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht, die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass das Rückgrat W und Z ausschließt, wenn v und y gleich 0 sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium ein sphinganproduzierender Stamm ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Bakterium, in das das DNA-Molekül insertiert wird, ein Mitglied eines Sphingomonas-Stamms ist, das aus der Gruppe von ATCC31554, ATCC31461, ATCC31853, ATCC21423, ATCC31555, ATCC31961, ATCC53159, ATCC53272 ausgewählt ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bakterium, in das das DNA-Molekül insertiert wird, ein Mitglied eines Sphingomonas-Stamms ist, das aus der Gruppe von ATCC31554, ATCC31461, ATCC53272 ausgewählt ist.
  10. Rekombinantes Bakterium, das von einem Sphingomonas sp.-Stamm abgeleitet ist, wobei das Bakterium mehrere Kopien des DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält, wodurch das Empfängerbakterium ein Hyperproduzent von Sphinganpolysaccharid ist.
  11. Bakterium nach Anspruch 10, wobei das Empfängerbakterium ein sphinganproduzierender Stamm eines Sphingomonas sp.-Bakteriums ist.
  12. Bakterium nach Anspruch 11, das von einem Sphingomonas-Stamm, der aus der Gruppe gemäß der Definition in Anspruch 8 oder 9 ausgewählt ist, abgeleitet ist.
  13. Bakterium nach Anspruch 10, wobei das Bakterium Sphingomonas sp.-ATCC69735 oder ATCC69744 ist.
  14. Verfahren zur Erhöhung der Produktion von Sphingan in einem Sphingomonas-Bakterium, das umfasst: 1) Einarbeiten eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium in mehreren Kopien zur Bildung eines Bakteriums, das Sphinganpolysaccharid gegenüber dem Empfängerbakterium überproduziert; 2) Kultivieren des Bakteriums von Stufe 1 in einer Fermentationsbrühe zur Produktion von Sphingan; und 3) Isolieren des Sphingans von Stufe 2, wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
    Figure 01360001
    worin Glc für Glucose steht, GlcA für Glucuronsäure steht, Rha für Rhamnose steht, Man für Mannose steht, X für Rha oder Man steht, Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht, W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht, die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass das Rückgrat W und Z ausschließt, wenn v und y gleich 0 sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Empfängerbakterium ein sphinganproduzierender Stamm eines Sphingomonas sp.-Bakteriums ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Bakterium, in das die DNA-Sequenz eingearbeitet ist, ein Mitglied eines Sphingomonas-Stamms, der aus der Gruppe gemäß der Definition in Anspruch 8 oder 9 ausgewählt ist, ist.
  17. Verfahren zur Produktion von Sphingan, das das Kultivieren eines Sphingomonas-Bakteriums gemäß der Definition in Anspruch 10 in einer Fermentationsbrühe zur Produktion von Sphingan und Isolieren des Sphingans aus der kultivierten Fermentationsbrühe umfasst.
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