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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen und Fragmente derselben,
die an der Biosyntheseproduktion von Sphinganpolysacchariden von
Sphingomonas sp. beteiligt sind und aus Sphingomonas sp. isoliert
werden. Die isolierten DNA-Fragmente können in die gleichen oder unterschiedliche
Stämme
von Sphingomonas sp. oder verwandte Bakterien in mehreren Kopien
eingearbeitet werden, um die Polysaccharid-, vorzugsweise Sphinganproduktion
zu erhöhen.
Die exogene DNA enthaltenden, gentechnisch veränderten Bakterien produzieren
signifikant größere Mengen
Polysaccharid im Vergleich zu nicht gentechnisch veränderten Bakterien
unter identischen Fermentationsbedingungen. Die vorliegende Erfindung
betrifft ferner Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Stämmen von
Sphingomonas sp. und anderen verwandten Bakterien derart, dass sie
Hyperproduzenten von Polysaccharid sind, sowie die gentechnisch
veränderten
Bakterien. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von DNA-Sequenzen,
die zum Erhöhen
der Produktion von Sphinganpolysacchariden in Sphingomonas sp. verwendbar
sind, werden ebenfalls beschrieben.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Zahl von Mikroorganismen produziert extrazelluläre Polysaccharide, die auch
als Exopolysaccharide oder EPS bekannt sind. Zu den Exopolysacchariden
gehören
Xanthangummi und eine Gruppe von Polysacchariden, die als "Sphingane" bekannt sind. "Sphingane" werden durch gramnegative
Bakterien der Gattung Sphingomonas produziert.
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Die "Sphingane" sind kapselartige
Polysaccharide, die ähnliche,
jedoch nicht identische Strukturen aufweisen und durch Mitglieder
der Gattung Sphingomonas sezerniert werden (T. J. Pollock, 1993,
J. Gen. Microbiol. 139: 1939–1945).
Die verschiedenen Sphingane weisen unterschiedliche Nebengruppen
auf und entweder L-Rhamnose oder L-Mannose findet sich an einer
Position im Rückgrat.
L-Mannose selbst ist in der Natur äußerst selten. Wässrige Lösungen der
Polymere weisen einzigartige und verwendbare rheologische Eigenschaften
auf (siehe R. Moorhouse 1987, "Structure/property
relationships of a family of microbiol polysaccharides", S. 187–206, in
M. Yalpani (Hrsg.), Industrial polysaccharides: genetic engineering,
structure/property relations and applications. Elsevier Science
Publishers B. V., Amsterdam). Es ist nicht klar, wie die Strukturvariationen
in den Polymeren zu deutlich verschiedenen rheologischen Eigenschaften
führen.
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Xanthomonas
campestris ist ein gramnegatives Bakterium, das ein Exopolysaccharid,
Xanthangummi, in großen
Mengen konstitutiv produziert. Jeanes et al., J. Appl. Polymer Sci.,
5, 519–526
(1961). Die Biosynthese von Xanthangummi wurde wegen dessen kommerzieller
Bedeutung ziemlich detailliert untersucht. Vor kurzem wurde ein
weiteres bakterielles Exopolysaccharid, Gellan, als Geliermittel
entwickelt. Es ist ein Mitglied der Sphinganfamilie von Polysacchariden,
die S-88 (siehe Kang und Veeder,
US-Patent
4 535 153 ), Welan (siehe Kang und Veeder,
US-Patent 4 342 866 ), NW11 (siehe
Robison und Stipanovic,
US-Patent
4 874 044 ), Rhamsan (siehe Peik et al.,
US-Patent 4 401 760 ), S-198 (siehe
Peik et al.,
US-Patent 4 529
797 ), S-657 (siehe Peik et al.,
europäische Patentanmeldung 209277A1 )
und Heteropolysaccharid-7 (siehe Kang und McNeely,
US-Patent 4 342 866 ) umfasst.
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Die
obigen Dokumente umfassen mehrere Patente, die Sphinganpolysaccharidzusammensetzungen betreffen.
Keines der Patente betrifft auch nur entfernt den Gegenstand der
vorliegenden Erfindung.
Stamm | Sphingan | Patentnummer |
ATCC31461 | Gellan | 4
326 053 |
S60 | S-60 | |
ATCC31554 | S-88 | 4
535 153 |
S88 | | |
ATCC31853 | S-198 | 4
529 797 |
S198 | | |
ATCC21423 | S-7 | 3
960 832 |
S7 | | |
ATCC31555 | Welan | 4
342 866 |
S130 | S-130 | |
ATCC31961 | Rhamsan | 4
401 760 |
S194 | S-194 | |
ATCC53159 | S-657 | EP-0209277 |
S-657 | | |
ATCC53272 | NW-11 | 4
874 044 |
NW11 | | |
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Die
chemischen Strukturen der Sphinganpolysaccharide sind alle in gewisser
Weise miteinander verwandt. Die Hauptkette jedes Sphingans besteht
aus einer verwandten Sequenz von vier Zuckern – D-Glucose, D-Glucuronsäure, L-Mannose
und L-Rhamnose.
Polysaccharidmitglieder der Sphingangruppe sind aufgrund der Kohlehydrate,
die das Polymerrückgrat
(Hauptkette) und die Seitenketten umfassen, voneinander unterscheidbar.
Die Sphingankohlehydrate können
Kohlehydratseitenketten und an Kohlehydraten am Polymergerüst befestigte
Acetyl- oder Glyceratgruppen enthalten.
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Verschiedene
Sphingane sind als Spezialpolymere und als Additive in Textilanwendungen,
Nahrungsmitteln, Kosmetika, Papier, Lacken, Zementen, beispielsweise
als Viskositätsmodifizierungsmittel,
in verschiedenen anderen Beschichtungsanwendungen und als Klebstoffe
und Additive für
Erdölprodukte
und Spezialchemikalien verwendbar.
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Der
Brennpunkt erster Untersuchungen, die in der vorliegenden Erfindung
kulminierten, lag auf der ersten Stufe in der Biosynthese eines
repräsentativen
Sphinganpolysaccharids S-88.
Dieses Sphingan wird durch den Sphingomonas-Stamm S-88 biosynthetisiert.
Vor der vorliegenden Erfindung war bekannt, dass einige, jedoch
nicht alle bakterielle Polysaccharidbiosynthesen von anderen Polysacchariden
als Sphinganen einen Isoprenylphosphatträger nutzen. Beispielsweise
ist im Falle der Xanthangummibiosynthese durch X. campestris, da
die Hauptkette von Xanthangummi nur Glucose enthält, die erste Synthesestufe
wahrscheinlich die Übertragung
eines Glucosephosphats von UDP-Glucose auf einen C55-Isoprenylphosphat(IP)-Träger. Mit zellfreien
Einarbeitungsassays stellten Ielpi et al., FEBS Lett., 130, 253
(1982) und J. Bacteriol., 175, 2490 (1993), fest, dass Glucose und
anschließend
eine zweite Glucose und dann Mannose, Glucuronsäure und Mannose aufeinanderfolgend
an Träger-IP
unter Zusammenbau der Wiederholungseinheit von Xanthangummi addiert
werden. Ganz ähnlich
wird die Wiederholungsuntereinheit Colansäure in Escherichia coli durch
zunächst Übertragung
von Glucose-P auf IP zusammengebaut; Johnson und Wilson, J. Bacteriol.,
129, 225 (1977). Im Gegensatz dazu wird im Falle der Synthese von
Succinoglycanpolysacchariden durch Rhizobium meliloti, ein Galactose-P
als erstes auf IP übertragen;
siehe Tolmasky et al., J. Biol. Chem., 257, 6751 (1982). Isoprenylträger sind
jedoch nicht an der Synthese von Dextran- oder Lävanpolysacchariden beteiligt
und die Rolle von Isoprenylträgern
in der Alginatsynthese ist nicht bekannt.
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Vor
der Untersuchung, die zur vorliegenden Erfindung führte, war
die Bedeutung der Rolle des Trägers in
der komplexen Kinetik der Biosynthese von Polysacchariden nicht
bekannt. Ferner war nicht bekannt, welche Rolle der Isoprenylphosphatträger in der
Gesamtsynthese von Sphinganpolysacchariden in Sphingomonas-Bakterien
spielen kann.
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Zuvor
zeigten Genkomplementierungstests, dass eine spezielle Klasse von
Mutationen in X. campestris, die gleichzeitig Bacr und
Gum– (Bacitracin-resistent
und Xanthangumminegativ) sind, innerhalb des gumD-Gens, das zur Übertragung
von Glucose-P von UDP-Glc auf IP unter Bildung von Glc-PPI erforderlich ist,
kartiert ist; Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., Band 176, S.
6229–6237,
Vanderslice et al., "Genetic
Engineering of polysaccharide structure in Xanthomonas campestris", S. 145–156, in
V. Crescenzi et al., Biomedical and Biotechnological Advances in
Industrial Polysaccharides, Gordon and Breach Science Publishers,
New York und N. E. Harding und Y. N. Patel, 1993, Faseb Journal,
Band 7, Nummer 7. Die letzte Verweisstelle offenbart Fragmente von
DNA, die die Synthese von Sphingan S-60 an nichtproduzierenden Mutanten
wiederherstellen können,
sie macht jedoch keine Angabe einer erhöhten Synthese in Bezug auf
den Stamm des Wildtyps. Frühere
Versuche zeigten auch, dass das gumD-Gen des Wildtyps von X. campestris
die Synthese von Sphinganen in analogen Bacr Sps– (Sphinganpolysaccharidnegativen)
Mutanten der Sphingomonas-Stämme S88
und NW11 wiederherstellen konnte. Es wurde angenommen, dass Bacr Sps– Sphingomonas-Mutanten auch
im Hinblick auf die Übertragung
von Glucose-P auf IP blockiert zu sein schienen.
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Aufgaben der Erfindung
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von DNA-Segmenten,
die von Sphingomonas sp. isoliert werden und zur Verstärkung der
Produktion von Sphinganpolysaccharid in einer Zahl von Mikroorganismen
und insbesondere einer Zahl von Sphingomonas-Stämmen verwendet werden können.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Hyperproduzentenstämmen von Mikroorganismen
und insbesondere einer Zahl von Stämmen von Sphingomonas, die
signifikant mehr Sphinganpolysaccharid als nicht gentechnisch veränderte Stämme produzieren.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Herstellung von Stämmen von Mikroorganismen und
insbesondere Stämmen
von Sphingomonas sp., die Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid
sind.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Isolierung von DNA-Segmenten, die in Sphingomonas-Stämme derart
insertiert werden können,
dass der erhaltene, gentechnisch veränderte Mikroorganismus ein
Hyperproduzent von Sphinganpolysaccharid wird.
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Diese
und/oder weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung können der
Beschreibung der Erfindung, die folgt, ohne weiteres entnommen werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
der vorliegenden Erfindung werden DNA-Sequenzen als Segmente oder
Fragmente, die die Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein
SpsB von ATCC31554, SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen,
aus sphinganproduzierenden Bakterien der hinterlegten Sphingomonas-Stämme ATCC31554,
ATCC53272 oder ATCC31461 isoliert. Das erhaltene Genmaterial wird
kloniert, als Mehrfachkopien in sphinganproduzierende oder -nichtproduzierende
Mutanten von Sphingomonas oder verwandten Bakterien eingebaut. Diese
DNA-Sequenzen erwiesen sich als verwendbar zur Wiederherstellung
der Sphinganproduktion in mutierten Bakterien, die kein Sphingan
produzieren. Darüberhinaus
wurde unerwarteter Weise ermittelt, dass die Wiederherstellung der
Sphinganproduktion in diesen Mutanten mit der Produktion von Sphinganmengen,
die signifikant größer als
die von Stämmen
des Wildtyps, die Sphingan produzieren, erwartete Produktion sind,
gekoppelt ist.
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Wir
entdeckten unerwarteterweise, dass DNA-Segmente oder -Fragmente,
die die Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein SpsB von ATCC31554,
SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen, die aus den
definierten Sphingomonas-Stämmen isoliert
werden, als Mehrfachkopien in sphinganproduzierende oder mutierte-nichtproduzierende
Bakterien des gleichen Stamms oder unterschiedlicher Stämme von
Sphingomonas insertiert werden können,
wobei das erhaltene, gentechnisch veränderte Bakterium ein Hyperproduzent
von Sphingan wird. Dies ist insbesondere insofern unerwartet, als
die DNA-Segmente oder -Fragmente, die aus beispielsweise Sphingomonas
S60 isoliert wurden und in den Sphingomonas-S88-Wildtyp oder nichtmucoide Mutanten insertiert
wurden, einen gentechnisch veränderten
Hyperproduzenten von S-88-Sphingan, das generell nicht mit S-60-Sphingan
kontaminiert ist, produzieren. Diese Komplementierung kann auf ziemlich
breite Weise für
verschiedene Stämme
von Sphingomonas (Komplementierung zwischen Stämmen) und auch zur Produktion
von Xanthangummi in Xanthomonas campestris (intergenerische Komplementierung)
verwendet werden.
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Wir
entdeckten ferner ein Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter,
hyperproduzierender Sphingomonas-Bakterien,
die die DNA-Segmente oder -Fragmente, die die Sequenz eines Gens
mit Codierung für
das Protein SpsB von ATCC31554, SnwB von ATCC53272 oder SgeB von
ATCC31461 umfassen, die aus sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stämmen isoliert
wurden, enthalten. Die DNA, die aus sphinganproduzierenden Bakterien
isoliert ist, wird zunächst
kloniert und dann in sphinganproduzierende Sphingomonas-Stämme oder
von sphinganproduzierenden Stämmen
abgeleitete nichtmucoide Mutanten wieder eingebaut.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül bereit,
das ein erstes DNA-Segment umfasst, wobei das erste DNA-Segment
- (a) aus sphinganproduzierenden Bakterien der
Sphingomonas sp. ATCC31554 isoliert ist, wobei das isolierte DNA-Molekül die in
SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz aufweist, oder ein Fragment desselben
ist und die Sequenz eines Gens mit Codierung für ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein
von ATCC31554 umfasst; oder
- (b) ein aus Sphingomonas sp. ATCC53272 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311
von E. coli sp. ATCC69733 insertiert ist, oder ein Fragment desselben
ist, wobei das erste DNA-Segment die Sequenz eines Gens mit Codierung
für ein
Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC53272 umfasst; oder
- (c) ein aus Sphingomonas sp. ATCC31461 erhaltenes DNA-Segment, das in pRK311
von Sphingomonas sp. ATCC69744 insertiert ist, oder ein Fragment
desselben ist, wobei das erste DNA-Segment die Sequenz eines Gens
mit Codierung für
ein Glykosyl-IP-Transferaseprotein von ATCC31461 umfasst,
wobei
das DNA-Molekül,
wenn es in ein Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium
in mehreren Kopien eingearbeitet ist, einen Hyperproduzenten von
Sphinganpolysaccharid gegenüber
dem Empfängerbakterium ergibt,
wobei das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist: worin
Glc für
Glucose steht, GlcA für
Glucuronsäure
steht, Rha für
Rhamnose steht, Man für
Mannose steht; X für
Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht;
W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht; die tiefgestellten
Indices v und y für
0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende
Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass
das Rückgrat
W und Z ausschließt,
wenn v und y gleich 0 sind.
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Das
DNA-Molekül
kann die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz aufweisen. Das erste
DNA-Segment kann das aus Sphingomonas sp. ATCC31554 erhaltene DNA-Segment,
das in pRK311 von E. coli ATCC69734 insertiert ist; das aus Sphingomonas
sp. ATCC31554 erhaltene DNA-Segment, das in pRK311 von E. coli ATCC69735
insertiert ist; das aus Sphingomonas sp. ATCC31461 erhaltene DNA-Segment,
das in pRK311 von Sphingomonas sp. ATCC69744 insertiert ist; ein
Restriktionsfragment, das durch Verdau des zweiten DNA-Segments
mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz mit dem Restriktionsenzym
HindIII, BamHI oder EcoRI erhalten wird; oder ein etwa 13-kb-Restriktionsfragment,
das durch Verdau eines dritten DNA-Segments von Sphingomonas sp.
ATCC53272 mit dem Restriktionsenzym Hind III erhalten wird, sein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur gentechnischen
Veränderung
eines Bakteriums, das von einem Sphingomonas sp.-Stamm stammt, zu
einem Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid bereit,
wobei
das Verfahren das Einarbeiten des isolierten DNA-Moleküls gemäß der obigen Definition in
ein Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium
in mehreren Kopien zur Erzeugung eines Bakteriums, das Sphinganpolysaccharid
gegenüber
dem Empfängerbakterium
unter identischen Fermentationsbedingungen überproduziert, umfasst, wobei
das Sphingan die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin
Glc für
Glucose steht, GlcA für
Glucuronsäure
steht, Rha für
Rhamnose steht, Man für
Mannose steht; X für
Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht;
W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht;
die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1
stehen können,
und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes
des Rückgrats
liegt, derart, dass das Rückgrat
W und Z ausschließt, wenn
v und y gleich 0 sind.
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Das
Sphingomonas sp.-Empfängerbakterium
kann ein sphinganproduzierender Stamm sein, beispielsweise ein Mitglied
eines Sphingomonas-Stammes, das aus der Gruppe von ATCC31554, ATCC31461, ATCC31853,
ATCC21423, ATCC31555, ATCC31961, ATCC53159 und ATCC53272 ausgewählt ist.
Bevorzugte Sphingomonas-Stämme
sind ATCC31554, ATCC31461 und ATCC53272.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Bakterium bereit, das von
einem Sphingomonas sp.-Stamm abgeleitet ist, wobei das Bakterium
mehrere Kopien eines DNA-Moleküls
gemäß der Erfindung
nach der obigen Beschreibung enthält, was dazu führt, dass
das Empfängerbakterium
ein Hyperproduzent von Sphinganpolysaccharid ist. Das Empfängerbakterium
kann ein sphinganproduzierender Stamm eines Sphingomonas sp.-Bakteriums, beispielsweise
wie oben beschrieben, oder Sphingomonas sp. ATCC69735 oder ATCC69744 sein.
Das auf diese Weise hergestellte Bakterium kann in einem Verfahren
zur Produktion von Sphingan verwendet werden, wobei das Verfahren
das Kultivieren des Sphingomonas-Bakteriums in einer Fermentationsbrühe zur Produktion
von Sphingan und das Isolieren des Sphingans aus der kultivierten
Fermentationsbrühe umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erhöhung der
Produktion von Sphingan in einem Sphingomonas-Bakterium bereit, wobei das Verfahren
umfasst:
- 1) Einarbeiten eines DNA-Moleküls der Erfindung
gemäß der obigen
Beschreibung in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium in mehreren Kopien
zur Bildung eines Bakteri ums, das Sphinganpolysaccharid gegenüber dem
Empfängerbakterium überproduziert;
- 2) Kultivieren des Bakteriums von Stufe 1 in einer Fermentationsbrühe zur Produktion
von Sphingan; und
- 3) Isolieren des Sphingans von Stufe 2, wobei das Sphingan die
folgende allgemeine Formel aufweist: worin
Glc für
Glucose steht, GlcA für
Glucuronsäure
steht, Rha für
Rhamnose steht, Man für
Mannose steht; X für
Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht;
W an den Glc-Rest Nr. 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha steht; die tiefgestellten
Indices v und y für
0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1 stehen können, und wobei das reduzierende
Ende des Polymers in Richtung des X-Restes des Rückgrats liegt, derart, dass
das Rückgrat
W und Z ausschließt,
wenn v und y gleich 0 sind. Das Empfängerbakterium kann ein sphinganproduzierender
Stamm eines Sphingomonas sp.-Bakteriums gemäß der obigen Beschreibung sein.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ferner gentechnisch veränderte Sphingomonas-Bakterien,
in die die oben beschriebenen isolierten DNA-Segmente oder -Fragmente
insertiert sind. Diese gentechnisch veränderten Bakterien enthalten
mehrere Kopien von isolierten DNA-Segmenten oder -Fragmenten gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die gentechnisch veränderten
Bakterien gemäß der vorliegenden
Erfindung sind Hyperproduzenten von Sphingan.
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Die
DNA-Fragmente gemäß der vorliegenden
Erfindung können
durch Techniken, die ohne weiteres einschlägig bekannt sind, isoliert,
gewonnen und kloniert werden. Danach wird die DNA in Bakterien der
Gattung Sphingomonas in mehreren Kopien, generell als extrachromosomale
oder Plasmid-DNA insertiert. Nach der Insertion in die Zielbakterien
wird die Produktion von Sphingan durch Fermentieren der gentechnisch
veränderten
Bakterien unter den gleichen Bedingungen wie eine identische Konzentration
von nicht-gentechnisch veränderten,
sphinganproduzierenden Bakterien des gleichen Stamms bestimmt. Hyperproduzenten
werden durch deren erhöhte
Sphinganproduktion, bezogen auf den nicht-gentechnisch veränderten,
sphinganproduzierenden Stamm bestimmt. DNA-Sequenzen zur Verstärkung der
Produktion von Sphinganpolysaccharid von tatsächlich jedem beliebigen Mitglied
von sphinganproduzierenden Sphingomonas sp.-Bakterien können unter Verwendung
dieses Verfahrens ohne weiteres bestimmt werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Diagrammdarstellung der Restriktionsenzymspaltungsstellen eines
DNA-Segments von 34 Kilobasennucleotideinheiten, das aus chromosomaler
DNA des Sphingomonas-Stamms
S88 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31554) isoliert wurde. Eine Zahl der
in 1 präsentierten
DNA-Sequenzen wurde in Sphingomonas-Bakterien insertiert und auf
deren Fähigkeit
zur Verstärkung
der Sphinganproduktion untersucht. Restriktionsstellen für mehrere
Enzyme sind ebenfalls in 1 (sowie
den 2, 3, 8, 9 und 10)
angegeben: B (BamHI), Bg (BglII), E (EcoRI), H (HindIII) und S (SalI).
Die in 1 angegebene spsB-Region entspricht
der DNA-Sequenz, die für
das Protein SpsB codiert.
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2 ist
eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymspaltungsstellen eines
DNA-Segments (etwa 28 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler
DNA des Sphingomonas-Stamms S60 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31461)
isoliert wurde. Restriktionsstellen für diese DNA-Sequenz sind in 2 als
die Stellen B, E und H angegeben. Die sgeB-Region entspricht der
DNA-Sequenz, die für
das Protein SgeB codiert.
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3 ist
eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymstellen eines DNA-Segments
(etwa 33 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms
NW11 (ATCC-Hinterlegungsnummer
53272) isoliert wurde. Restriktionsstellen für diese DNA-Sequenz sind in 3 als
die Stellen E, H, B, Bg und S angegeben. Die snwB-Region entspricht
der DNA-Sequenz, die für
das Protein SnwB codiert.
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4 ist
eine Diagrammdarstellung der DNA-Sequenz, die dem etwa 1950 Basenpaare
enthaltenden spsB-Gen des Sphingomonas-Stamms S88 entspricht.
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5 ist
eine Diagrammdarstellung einer abgeleiteten Aminosäuresequenz
des SpsB-Proteins des Sphingomonas-Stamms S88.
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6 ist
eine Diagrammdarstellung der chemischen Strukturen einer Zahl von
Sphinganpolysacchariden, die für
die durch die vorliegende Erfindung produzierten repräsentativ
sind.
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7 ist
eine Karte des Aufbaus der Plasmide pSEB24 und PSEB26, die detailliert
in den Beispielen 6 und 12 der vorliegenden Anmeldung angegeben
sind. Mcs1 ist eine multiple Klonierungsstelle, die die folgenden
Restriktionsstellen (im Uhrzeigersinn, von oben): EcoRI, SmaI, BamHI,
SalI, PstI, und HindIII umfasst. In ähnlicher Weise umfasst Mcs2
(im Uhrzeigersinn, von oben): HindIII, PstI, SalI, XbaI, BamHI,
SmaI, SstI und EcoRI. OriT ist der Startpunkt der Konjugationsübertragung,
OriV ist ein Replikationsursprung für einen breiten Wirtsbereich
und ori ist der Replikationsursprung von pUC12 und 13.
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8 ist
eine Diagrammdarstellung der Restriktionsenzymspaltungsstellen eines
DNA-Segments mit 34 Kilobasennucleotideinheiten, das aus chromosomaler
DNA des Sphingomonas-Stamms
S88 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31554) isoliert wurde.
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Die
Restriktionsstellen für
mehrere Enzyme sind ebenfalls in 1 (sowie 2 und 3)
angegeben: B (BamHI), Bg (BglII), E (EcoRI), H (HindIII) und S (SalI).
Die spsB-Region,
die in 8 (auch 1) angegeben
ist, entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SpsB codiert.
Andere "sps"-Gene, die an der Sphinganbiosynthese
beteiligt sind, sind durch Großbuchstaben
angegeben: G, S, R, Q, I, K, L, J, F, D, C und E. Die als rhsACBD
bezeichneten Gene geben die Kartenposition der Gene an, die an der
Synthese einer Vorstufe für
Sphingane: dTDP-(L)Rhamnose beteiligt sind. Die Gene 32, 26, 31
und 34 sind nicht-identifizierte offene Translationsleseraster und
die atrDB-Gene codieren für
eine Transportfunktion, die in keiner Beziehung zur Sphingansynthese
steht. "Sec" gibt ein zur Sekretion
von Sphinganen benötigtes
Gen an und "Trase" gibt ein Gen an,
das für
ein Enzym codiert, das einen Zucker von einer Nucleotidzuckervorstufe
zu Sphingan während
des Zusammenbaus der Sphinganwiederholungseinheit überträgt.
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9 ist
eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymspaltungsstellen eines
DNA-Segments (etwa 42 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler
DNA des Sphingomonas-Stamms
S198 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31853) isoliert wurde. Restriktionsstellen
für diese
DNA-Sequenz sind in 9 als H (HindIII) und E (EcoRI)
angegeben. Die Reihenfolge von eng beabstandeten Stellen, die in
Klammern eingeschlossen sind, ist unbekannt. Die seitlichen Erstreckungen
der Cosmidklone c2, c3, c4, c5 und des Subklons L242 sind als gestrichelte
Linien angegeben. Die kastenförmige "B"-Region entspricht der DNA-Sequenz,
die für
das Protein codiert, das Mutanten in dem S88-Gen spsB komplementiert.
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10 ist eine Diagrammdarstellung von Restriktionsenzymspaltungsstellen
eines DNA-Segments (etwa 42 Kilobaseeinheiten), das aus chromosomaler
DNA des Sphingomonas-Stamms
S7 (ATCC-Hinterlegungsnummer 21423) isoliert wurde. Restriktionsstellen
für diese
DNA-Sequenz sind in 10 als H (HindIII), E (EcoRI)
und B (BamHI) angegeben. Die seitlichen Erstreckungen der Cosmidklone
c1, c2, c3 und c6 sind als gestrichelte Linien angegeben. Die Klone
c2 und c3 erstrecken sich über
die rechts in 10 angegebene Region hinaus.
In ähnlicher
Weise erstreckt sich der Klon c6 nach links. Die kastenförmige "B"-Region entspricht der DNA-Sequenz,
die für
das Protein codiert, das Mutanten in dem S88-Gen spsB komplementiert.
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11 ist eine Diagrammdarstellung des Genclusters
zur Sphingan-S-88-Synthese. In der Mitte der Karte befinden sich
die Gennamen, -grenzen, vorgeschlagenen Funktionen und Nucleotidpositionen
von Restriktionsenzymspaltungsstellen (B, BamHI; E, EcoRI; und H,
HindIII). Klonierte Fragmente (c1Δ3,
c2, c3, c4, c5 und c6), subklonierte Segmente (benannt nach dem
verwendeten Restriktionsenzym und der näherungsweisen Länge in kbp)
und Deletionen, die in dem S88-Chromosom
erzeugt wurden, (jede Linie steht für das Vorhandensein von DNA)
sind unter der Genkarte angegeben. Nach oben sind die Namen und
Positionen von spontanen Sps– Mutationen, Sps(+)-
oder (–)-Komplementierungsergebnisse
und die Sps-Phänotypen,
die durch spezifische Insertionsmutationen in Plasmiden und dem
S88-Chromosom verursacht werden, angegeben. Die mini-Tn10kan-Insertionen
pZ167, pZ168, pZ180, pZ202 und pZ206 befanden sich in dem c2-Segment, das in das
Plasmid pRK311 kloniert und in einen der zwei Deletionsstämme: ΔTn493 oder ΔTn495 eingeführt war.
In ähnlicher
Weise waren alle anderen Plasmidinsertionen in dem c3-Segment und
in die Deletionsstämme ΔTn358 und
365 eingeführt.
Die Positionsgenauigkeit für
die mini-Tn10kan-Insertionen
beträgt ± 50 bp,
bezogen auf die sequenzierten Restriktionsstellen, während die
graphische Genauigkeit ± 100
bp ist.
-
12 zeigt das Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen
von SpsB und Glycosyl-IP-Transferasen. Die Zahlen rechts sind Restenummern
für die äußerste rechte
Aminosäure auf
jeder Zeile. In jedem Zeilensatz befinden sich die Galactosyl-IP-Transferasen
unmittelbar über
der Sequenz für
SpsB und die Glucosyl-IP-Transferasen darunter. Die Genprodukte
sind rechts angegeben: ExoYn, Rhizobium sp. NGR234 (Gray et al.,
1990, J. Bacteriol. 172: 193); CpsD, S. agalactiae (Rubens et al.,
1993, Mol. Microbiol., 8: 843); RfbP, S. enterica LT2 (Jiang et
al., 1991, Mol. Microbiol., 5: 695); GumD, X. campestris B1459S-4L
(Capage et al., 1987, internationales Patent
WO/05938 ); Pss4, R. leguminosarum bv.
viciae-Stamm VF39 (GenBank-Hinterlegungsnummer M93042); und Pss2,
R. leguminosarum bv. phaseoli (Borthakur et al., 1988, Mol. Gen.
Genet., 213: 155). Symbole: | gibt identische Aminosäuren für SpsB und
Galactosyl- oder Glucosyl-IP-Transferasen darüber bzw. darunter an;: gibt
eine konservative Aminosäuresubstitution
auf der Basis der folgenden Gruppen verwandter Aminosäuren an:
IFVWML, ST, QNED und HKR. Unterstrichene Sequenzen sind fortlaufende
Segmente von etwa 20 hydrophoben Aminosäuren.
-
13 zeigt die Alignments der rhsA-, B-,
C- und D-Genprodukte
und der dTDP-L-Rhamnose-Biosyntheseenzyme von S. enterica (Jiiang
et al., 1991, Molecular Microbiology, 5: 695–713) und X. campestris (Köplin et
al., 1993, J. Bacteriol., 175: 7786–7792) an. Die Symbole sind
die gleichen wie in 12.
-
14 ist eine Diagrammdarstellung der gesamten
DNA-Sequenz des
DNA-Segments, das aus chromosomaler DNA des Sphingomonas-Stamms
S88 (ATCC-Hinterlegungsnummer 31554) isoliert wurde, das der in
der Restriktionskarte von 8 angegebenen
Nucleotidsequenz (von Basenpaar 0 bis Basenpaar 28.800) entspricht.
-
Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
-
Die
im Folgenden angegebenen Ausdrücke
sollen durchgängig
in der Beschreibung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung
verwendet werden und haben die angegebene Bedeutung:
- 1. Der Ausdruck "Sphingan" wird in der gesamten
Beschreibung derart verwendet, dass er eine Zahl verwandter, jedoch
deutlich verschiedener Exopolysaccharide, die durch Mitglieder der
Gattung Sphingomonas sezerniert werden, bezeichnet (Pollock, J.
Gen. Microbiology 139: 1939–1945,
1993). Die Strukturen der Sphingane sind alle irgendwie verwandt.
Die Hauptkette jedes Sphingans besteht aus einer verwandten Sequenz
von vier Zuckern – D-Glucose,
D-Glucuronsäure,
L-Mannose und L-Rhamnose.
Polysaccharidmitglieder der Sphingangruppe sind voneinander aufgrund
der Kohlehydrate, die das Polymerrückgrat und die Seitenketten
umfassen, unterscheidbar. Die Sphinganpolysaccharide können Kohlehydratseitenketten und
an Kohlehydrate am Polymerrückgrat
befestigte Acetyl- oder Pyruvylgruppen enthalten. Siehe Mikolajczak
et al., Appl. and Env. Microbiol., 60: 402, (1994). Die Diagrammdarstellung
der chemischen Strukturen verschiedener Sphingane, die unter Verwendung
der DNA-Segmente und -Fragmente und der allgemeinen Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung produziert werden, sind generell in 6 angegeben.
Die Strukturen der Sphingane Gellan (S-60), Welan (S-130), Rhamsan
(S-194), S-88, NW-11, S-198 und S-657 sind generell in 6 angegeben.
-
Typischerweise
können
Mitglieder der Sphingan-Polysaccharidfamilie durch die folgende
allgemeine chemische Wiederholungsstruktur dargestellt werden:
worin
Glc für
Glucose steht; GlcA für
Glucuronsäure
steht, Rha für
Rhamnose steht, Man für
Mannose steht; X für
Rha oder Man steht; Z an den Glc-Rest 2 gebunden ist und für α-L-Rha-(1-6)-α-L-Rha, α-L-Man oder α-L-Rha steht;
W an den Glc-Rest 1 gebunden ist und für β-D-Glc-(1-6)-α-D-Glc oder α-L-Rha stehen
kann; die tiefgestellten Indices v und y für 0, 0,33, 0,5, 0,67 oder 1
stehen können
und wobei das reduzierende Ende des Polymers in Richtung des X-Restes
des Rückgrats
liegt. Der hierin verwendete Ausdruck "Rückgrat" oder "Hauptkette" bezeichnet den Teil
der Struktur, der die Ketten W und Z ausschließt, d. h., wenn v und y gleich 0
sind. Das "reduzierende
Ende des Polymers" ist
das Ende des Polymers, an das Zuckereinheiten während der Biopolymerisation
addiert werden.
-
Einige
Mitglieder der Sphinganpolysaccharidfamilie sind an verschiedenen
Positionen acetyliert. Jedoch können
die Polysaccharide einer chemischen Deacylierung auf herkömmliche
Weise zur Entfernung der Acylgruppen unterzogen werden. Beispielsweise
weist Gellan das gleiche Kohlehydratgerüst wie Welan (d. h. X = Rha)
auf, doch fehlt ihm der Seitenkettenzucker (d. h. v = 0 und y =
0) und der Glucoserest 1 ist vollständig mit Glycerat substituiert.
Die Gellanuntereinheitenstruktur ist ebenfalls am Glucoserest 1
partiell acetyliert.
- 2. Der Ausdruck "Sphingomonas" wird in der gesamten
Beschreibung derart verwendet, dass er Stämme von gramnegativen Bakterien
der Gattung Sphingomonas, die Exopolysaccharide oder Sphingane produzieren,
wie oben beschrieben, bezeichnet. Eine Zahl gramnegativer Bakterien
der Gattung Sphingomonas kann in der vorliegenden Erfindung entweder
als Quelle für
isolierte DNA-Sequenzen, die in andere Stämme sphinganproduzierender
Bakterien (vorzugsweise gramnegative Bakterien der Gattung Sphingomonas) reinsertiert
werden können,
wobei Sphinganhyperproduzenten gemäß der vorliegenden Erfindung
gebildet werden, oder als Zielbakterium zur Inser tion von exogenen
DNA-Sequenzen, wobei Sphinganhyperproduzenten gebildet werden, verwendet
werden.
-
Die
sphinganproduzierende Familie gramnegativer Bakterien wurde 1993
zum ersten Mal als zur Gattung Sphingomonas gehörend identifiziert. Siehe Pollock,
J. Gen. Microb., 139, 1939 (1993). Es wurde noch nicht genau festgestellt,
zu welcher Art die einzelnen Stämme
gehören.
Die den sphinganproduzierenden Stämmen von Sphingomonas nächstliegende
Art scheint Sphingomonas paucimobilis zu sein. Jedoch ist es verfrüht, diese
Stämme
als zu dieser Art gehörend
zu bezeichnen, bevor nicht eine detaillierte und endgültige taxonomische
Analyse verfügbar
ist. Es ist anzumerken, dass die Sphinganproduzenten der Gattung
Sphingomonas zunächst
in mehreren unterschiedlichen Gattungen klassifiziert wurden.
-
Die
derzeit bekannten Arten von Sphingomonas umfassen S. paucimobilis,
S. parapaucimobilis, S. adhaesiva, S. capsulata und S. yanoikuyae.
Siehe Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 34, 99 (1990). Früher wurden
diese Sphingomonas-Arten
fälschlich
der Gattung Pseudomonas zugeordnet.
- 3. Die
Ausdrücke "Spender" und "Empfänger" werden jeweils zur
Beschreibung von Bakterien verwendet, aus denen DNA-Sequenzen entnommen
werden und in die DNA-Sequenzen insertiert oder eingebaut werden.
- 4. Der Ausdruck "Stamm" oder "Sphingomonas-Stamm" wird zur Beschreibung
von gramnegativen Bakterien der Gattung Sphingomonas, die ein spezielles
Sphingan-Exopolysaccharid (auf der Basis der chemischen Struktur)
produzieren, verwendet. Der Einfachheit halber werden die sphinganproduzierenden
Stämme
von Sphingomonas durch das durch diesen Stamm produzierte Sphinganpolysaccharid
bezeichnet. Beispielsweise produziert der Sphingomonas-Stamm 588
das Sphinganpolysaccharid S88, der Sphingomonas-Stamm S60 das Sphinganpolysaccharid
S-60 (Gellan) und
dergleichen. Die Sphingomonas-Stämme
S88 (ATCC-Nr. 31554), S60 (ATCC-Nr. 31461), NW11 (ATCC-Nr. 53272),
S130 (ATCC-Nr. 3155), S194 (ATCC-Nr. 31691), S198 (ATCC-Nr. 31853),
S657 (ATCC-Nr. 53159) und S7 (ATCC-Nr. 21423) sind unter anderem
repräsentative
Stämme,
die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
- 5. Der Ausdruck "Hyperproduzent" wird in der gesamten
Beschreibung zur Beschreibung von gentechnisch veränderten
Bakterien verwendet, die mehrere Kopien von DNA-Segmenten oder -Fragmenten
enthalten, die aus dem gleichen Stamm oder einem unterschiedlichen
Stamm sphinganproduzierender Bakterien isoliert wurden, die eine
signifikant größere Menge
(mindestens etwa 5% oder mehr auf Gewichtsbasis) an Sphinganpolysaccharid
im Vergleich zu nicht gentechnisch veränderten oder Bakterien des
Wildtyps des gleichen Stamms wie die gentechnisch veränderten
Bakterien, die unter identischen oder im Wesentlichen identischen
Fermentierungsbedingungen fermentiert werden, produzieren.
- 6. Der Ausdruck "isoliert" wird zur Beschreibung
von DNA verwendet, die aus einem Mikroorganismus entfernt und mindestens
einem gewissen Reinigungsgrad, d. h. einer oder mehreren Reinigungsstufen,
unterzogen wurde. Vorzugsweise wird isolierte DNA in im Wesentlichen
reiner Form, d. h. in einer Form, die nur geringe Mengen an kontaminierendem
Material enthält,
das die Fähigkeit
für isolierte
DNA, durch Restriktionsenzyme fragmentiert oder segmentiert zu werden,
in mehrere Kopien kloniert oder in Plasmidvektoren insertiert oder
in anderer Weise in Bakterien insertiert oder eingearbeitet zu werden,
nicht beeinflusst, hergestellt.
- 7. Der Ausdruck "DNA" oder "chromosomale DNA", der in der gesamten
Beschreibung in Bezug auf die aus Sphingomonas isolierte DNA verwendet
wird, beschreibt DNA, die in den Chromosomen oder endogenen Plasmiden
von Sphingomonas sp., generell vor einer Isolierung aus dem Mikroorganismus
gefunden wird.
- 8. Der Ausdruck "Sequenz" wird zur Beschreibung
eines speziellen Segments von DNA verwendet, das entweder durch
dessen Nucleotideinheiten oder dessen Muster von Stellen zur Restriktionsenzymspaltung identifiziert
wird, generell aus DNA eines sphinganproduzierenden Bakteriums der
Gattung Sphingomonas unter Verwendung von Restriktionsenzymen isoliert
wird, wobei die erhaltene DNA-Sequenz in ein Bakterium zur Bildung
eines Hyperproduzenten insertiert oder alternativ einer weiteren
Restriktion zur Bildung von gegenüber dieser Sequenz kleineren
kleinen Teilen oder Fragmenten von DNA unterzogen wird. Der Ausdruck "Teile" oder "Fragmente" wird zur Beschreibung
von DNA-Sequenzen verwendet, die generell kleiner als DNA-Segmente
sind. Bevorzugte DNA-Segmente zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung sind solche, die für
Glycosyltransferasen (Glucosyl-, Galactosyl-, Rhamnosyl- und Glucuronosyltransferasen),
Glycosyl-IP-Transferasen (die unter anderem Glucosyl-IP-Transferase-,
Galactosyl-IP-Transferaseenzyme umfassen), ein Rhamnoseoperon (Synthese
einer Rhamnosevorstufe zur Einarbeitung in bestimmte rhamnosehaltige
Sphingane) und verschiedene Proteine, die an der Sekretion von Polysacchariden
aus Bakterien beteiligt sind, codieren.
- 9. Die Ausdrücke "insertiert", "Insertieren", "eingearbeitet" oder "Einarbeiten" werden in der gesamten
Beschreibung verwendet, um das Verfahren und das Ergebnis der Übertragung
von DNA-Segmenten, die aus der chromosomalen DNA eines sphinganproduzierenden
Sphingomonas-Stamms isoliert wurden, in den gleichen oder einen
unterschiedlichen aufnehmenden, sphinganproduzierenden Sphingomonas-Stamm
zu beschreiben. Das Ergebnis ist ein Hyperproduzentenstamm, der
mindestens zwei Kopien von mindestens einem wesentlichen Teil des übertragenen
DNA-Segments enthält.
-
Beispielsweise
kann isolierte DNA zunächst
in Plasmidvektoren, beispielsweise unter zahlreichen anderen pRK311
oder pSEB24, durch einschlägig
bekannte Techniken eingeführt,
kloniert und dann durch Konjugation in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium übertragen
werden. Nach der Insertion in ein Sphingomonas-Empfängerbakterium
repliziert der das relevante DNA-Fragment enthaltende Plasmidvektor
dann in der Empfängerzelle
unter Bildung von mehreren (mindestens 2 und üblicherweise 4–20) Kopien
des DNA-Segments, das zur Hyperproduktion von Sphinganpolysaccharid
notwendig ist. Zusätzlich
zu Plasmidvektoren können
auch Bakteriophagenvektoren und Transposonvektoren verwendet werden.
-
Eine
Zahl von Plasmidvektoren ist zur Verwendung zur Insertion von isolierten
DNA-Segmenten oder -Fragmenten in Empfängerbakterien geeignet. Zusätzlich zu
den Plasmiden pRK311 und pSEB24, die oben beschrieben sind, sind
auch die im Folgenden angegebenen Plasmide unter anderen verwendbar:
Plasmide mit breitem Wirtsbereich der Inkompatibilitätsgruppe
P-1, wie RK2 und Derivate derselben, wie pRK290, pRK293, pRK404
(Ditta et al., Plasmid, Band 13, S. 149–153) und andere Derivate,
die das oriT-Gen enthalten, von dem Plasmid RP4, das eine Plasmidmobilisierung
ermöglicht,
wie pSUP101 (siehe Simon et al., Bio/technology, November, 1983)
sowie die Plasmide pLAFR1 und pLAFR3 (Friedman et al., Gene, 18,
289, 1982), und die Plasmide mit breitem Wirtsbereich der Inkompatibilitätsgruppe
Inc-Q, wie RSF1010 und Derivate derselben, wie pMMB22 und pMMB66
(Fürste
et al., Gene, 48, 119, 1986).
-
Die
Verwendung von Konjugation zur Übertragung
der Plasmidvektoren in Empfängerbakterien
ist generell wirksam. Bei anderen Bakteriengattungen ist es üblicher,
die Transformation kompetenter Zellen mit gereinigter DNA zu verwenden.
-
Elektroporation
wurde ebenfalls bei Sphingomonas zur Einführung von DNA-Fragmenten oder
Plasmiden in die Bakterien verwendet (siehe 1992, Monteiro et al.,
J. of App. Bacteriol., 72, 423). Unter Verwendung dieses Verfahrens,
ist es mög lich,
zwei oder mehrere Zellkopien isolierter DNA-Segmente oder -Fragmente
in Sphingomonas-Empfängerbakterien
durch einfache Zugabe isolierter DNA zu dem Bakterium und dann Erreichen
einer Übertragung über die
Zellmembran unter Verwendung des Elektroporationsverfahrens einzuarbeiten.
-
Monteiro
et al., aa0, beschreiben die Elektroporation als Mittel zur Einführung von
DNA in Sphingomonas. Elektroporation ist funktional das Gleiche
wie die Transformation von chemisch behandelten kompetenten Zellen,
beispielsweise nach einer Behandlung von Zellen mit Calciumchlorid-
oder Rubidiumsalzen. Die zu transformierende DNA wird durch Standardverfahren
gereinigt und kann in Plasmidform vorliegen oder auch nicht. Eine
Transformation ist jedoch üblicherweise
am wirksamsten, wenn die DNA doppelsträngig und geschlossen zirkulär ist. Daher
ist es nicht notwendig, das Konjugationsverfahren der Einführung von
DNA in Sphingomonas zu verwenden. Noch ist es notwendig, dass die
klonierten Segmente in ein Plasmid, einen Bakteriophagen oder Transposonvektor
insertiert sind. Vorzugsweise werden jedoch zunächst isolierte DNA in Plasmidvektoren
eingeführt
und dann die Plasmide, die die isolierten DNA-Fragmente enthalten,
in die Bakterien zu übertragen.
-
Das
Halten der DNA-Segmente auf Plasmiden oder anderen Vektoren, wie
Bakteriophagen- oder Transposonvektoren, in dem Empfänger Sphingomonas
ist nicht notwendig. Es ist Routine, zusätzliche Kopien eines DNA-Segments
in bakterielle DNA so einzuführen,
dass die Segmente in jeder Generation durch den gleichen Mechanismus,
der die bakterielle DNA repliziert, repliziert werden. Der folgende
Beispielabschnitt enthält
zwei Beispiele, die Verfahren zur Einführung zusätzlicher Kopien von DNA in
die bakterielle DNA derart, dass die Segmente in jeder Generation
durch den gleichen Mechanismus, der die bakterielle DNA repliziert, repliziert
werden, detailliert angeben.
- 10. Der Ausdruck "mehrere Kopien" wird in der gesamten
Beschreibung derart verwendet, dass er exogene DNA-Sequenzen, -Fragmente
oder -Segmente (mindestens wesentliche Teile der DNA) beschreibt,
die in Sphingomonas-Bakterien in mindestens zwei und vorzugsweise
mindestens vier Kopien eingearbeitet sind. Noch besser liegt die
Zahl von Kopien einer DNA-Sequenz, eines DNA-Fragments oder -Segments,
die in ein Bakterium der Gattung Sphingomonas insertiert sind, schließlich im
Bereich von etwa 4 bis etwa 20. Es ist anzumerken, dass in bestimmten
Fällen
eine DNA-Sequenz in einen einzigen Plasmidvektor eingebaut werden
kann, in das Sphingomonas-Bakterium
durch Konjugation übertragen
werden kann und das Plasmid in der Empfängerzelle replizieren kann,
wobei zwei oder mehrere Kopien der DNA-Sequenz, des DNA-Segments
oder -Fragments bereitgestellt werden.
- 11. Der Ausdruck "Biosynthese" wird in der gesamten
Beschreibung derart verwendet, dass er die biologische Produktion
oder Synthese von Sphingan durch Sphingomonas-Bakterien beschreibt. Sphinganpolysaccharide
werden aus individuellen Kohlehydrateinheiten in einer Reihe von
Stufen, die durch eine Zahl von Enzymen der Bakterien gesteuert
werden, synthetisiert.
- 12. Der Ausdruck "gentechnisch
verändert" wird in der gesamten
Beschreibung derart verwendet, dass er die Sphingomonas-Empfängerbakterien
beschreibt, in die exogene DNA, vorzugsweise als mehrere Kopien,
eingearbeitet ist. Gentechnisch veränderte Bakterien gemäß der vorliegenden
Erfindung sind Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid.
- 13. Der Ausdruck "mit
Codierung für
genetische Information" wird
in der gesamten Beschreibung derart verwendet, dass er DNA-Sequenzen
beschreibt, die genetische Information in Form einer speziellen
Reihenfolge von Nucleotideinheiten enthalten. Die genetische Information
in der DNA-Sequenz (beliebiger Länge) wird
als "vorteilhaft
oder wesentlich" für die Biosynthese
von Sphingan in Sphingomonas-Bakterien erachtet, wenn sie in mehreren
Kopien in einem gentechnisch veränderten
Bakterium die Sphinganproduktion durch die gentechnisch veränderten
Bakterien verstärkt.
Der Ausdruck "vorteilhaft
oder wesentlich" wird
zur Beschreibung von DNA verwendet, die aus Sphingomonas-Bakterien
isoliert wurde und eine genetische Information codiert, die bei
Einarbeitung in mehreren Kopien in ein Sphingomonas-Bakterium dieses
Bakterium in einen Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid transformiert.
Vorteilhafte oder wesentliche DNA zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung kann ein oder mehrere Gene oder Operons zur Biosynthese
von Glycosyltransferasen, beispielsweise unter anderen Glucosyl-IP-Transferase,
Galatocosyl-IP-Transferase; zur Biosynthese von Zuckersynthonen
wie Rhamnose, Mannose, Glucose, Galactose, sowie substituierten
Synthonen dieser Zucker, beispielsweise unter anderen dTDP-L-Rhamnose;
zur Biosynthese von Enzymen, die an der Polymerisation von Zuckersynthonen
unter Bildung von Sphingan beteiligt sind, beispielsweise Polymerasen,
und zur Sekretion von Polysaccharid aus der intakten Zellstruktur unter
anderen enthalten.
- 14. Der Ausdruck "Komplementierung
zwischen Stämmen" wird zur Beschreibung
des Einbaus von Sphingomonas-DNA-Sequenzen, -Segmenten oder -Fragmenten,
die aus einem ersten und unterschiedlichem Stamm von Sphingomonas
isoliert wurden, in einen zweiten Stamm verwendet. Ein unerwarteter
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, dass DNA-Fragmente von verschiedenen
Stämmen
von Sphingomonas als mehrere Kopien in andere Stämme von Sphingomonas unter
Bildung von Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid eingearbeitet
werden können.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren DNA-Fragmente zeigen
auch intergenerische Komplementierung (beispielsweise zur Verstärkung der
Xanthanproduktion in Xanthomonas campestris).
- 15. Der Ausdruck "Synthon" wird zur Beschreibung
eines Zuckers oder einer Zuckereinheit verwendet, die während der
Biosynthese von Sphinganen durch Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung
polymerisiert werden. Synthone umfassen Zuckerkomponenten, die Bauteile
oder -einheiten der Sphinganpolysaccharide umfassen und zur Biosynthese
von Sphinganen verwendet werden, beispielsweise Glucose, Galactose,
Rhamnose, Mannose, andere Zuckersynthone, die acetylierte und acylierte
Zucker und verwandte Vorstufen umfassen.
- 16. Der Ausdruck "Rhamnoseoperon" wird zur Beschreibung
einer DNA-Sequenz mit Codierung für ein Gen oder Operon verwendet,
das an der Biosynthese von Rhamnose oder Rhamnosesynthonen (wie dTDP-L-Rhamnose)
beteiligt ist, die bei der Biosynthese von bestimmten Sphinganpolysacchariden
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass DNA-Sequenzen, die die
Sequenz eines Gens mit Codierung für das Protein SpsB von ATCC31554,
SnwB von ATCC53272 oder SgeB von ATCC31461 umfassen, die aus den
definierten sphinganproduzierenden Sphingomonas-Spenderbakterien
erhalten wurden und als mehrere Kopien in den gleichen Stamm oder
einen unterschiedlichen Stamm von Sphingomonas-Empfängerbakterien
eingearbeitet wurden, die Sphingomonas-Empfängerbakterien in einen Hyperproduzenten
von Sphinganpolysaccharid transformieren. Es wurde ferner entdeckt,
dass auch wenn die DNA-Sequenz
aus Bakterien, die einen Typ eines Sphinganpolysaccharids produzieren,
isoliert ist, diese Sequenz als mehrere Kopien in einen unterschiedlichen
Stamm von Sphingomonas-Bakterien eingearbeitet werden kann und einen
Hyperproduzenten dieses unterschiedlichen Stamms ohne Kontamination
der Sphinganpolysaccharideigenschaften der Spenderbakterien ergibt.
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Die
relevante DNA-Sequenz, die in die Empfängerbakterien eingearbeitet
wird, codiert eine genetische Information, die für die Biosynthese eines Sphinganpolysaccharids
vorteilhaft oder wesentlich ist. Beispielsweise kann die vorteilhafte
oder wesentliche genetische Information für die Biosynthese von Sphingan durch
die Bakterien auf eine beliebige Zahl von Wegen verantwortlich sein
oder an dieser beteiligt sein. Die exogene DNA kann eine vorteilhafte
Wirkung auf die Biosynthese von Sphingan durch beispielsweise Expression
der Synthese von Enzymen oder anderen Proteinen, die an einem geschwindigkeitsbestimmenden
enzymatischen Schritt beteiligt sind, durch Induzieren der Synthese
eines Enzyms, Kofaktors oder einer anderen biochemischen Komponente,
die zu einer erhöhten
Produktion von Polysaccharid führt,
durch Erhöhen
der Produktion eines Enzyms, wie Polymerase, die die Verknüpfung von
Untereinheiten des Polysaccharids unterstützt, durch Bindung an ein oder
mehrere Repressorgene, durch Unterstützen der Sekretion des Polysaccharids
aus den Bakterien und Verhindern der Expression eines Repressors,
der normalerweise die Bildung von geschwindigkeitsbestimmenden Schritten
in der Biosynthese des Polysaccharids hemmt, zeigen.
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Die
relevanten DNA-Sequenzen werden aus Stämmen von Sphingomonas unter
Verwendung von Techniken und Verfahren, die Standard auf diesem
Gebiet sind, isoliert. Die Bakterien werden generell kultiviert (Standardfermentationsverfahren
mit einer Glucosekonzentration unter etwa 0,5%, vorzugsweise etwa
0,1% bis etwa 0,2%, gemäß der folgenden
detaillierten Beschreibung), wobei eine hohe Konzentration von Bakterien enthaltende
Brühe produziert
wird. Die Bakterienzellen werden dann zentrifugiert und zur DNA-Extraktion
resuspendiert. Die DNA kann aus den Bakterien durch zunächst Entfernen
der Proteine aus dem Gemisch und dann Ausfällen der DNA mit hohem Molekulargewicht
mit Ethanol oder Isopropanol extrahiert werden. Siehe Birnboim und
Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979).
-
Nach
der Ausfällung,
die oben beschrieben ist, werden die isolierten DNA-Segmente oder
-Fragmente generell zur Bildung von DNA zur Insertion in Empfänger-Sphingomonas
kloniert. Beispielsweise werden die DNA-Sequenzen mit hohem Molekulargewicht
von oben partiell mit einem Restriktionsenzym (beispielsweise SalI-Enzym)
verdaut und unter Verwendung von Standardverfahren einer Elektrophorese
unterzogen. Siehe Loftus et al., BioTechniques, 12, 172 (1992).
Nach der Elektrophorese werden die größeren DNA-Fragmente (20 kbp
und größer) weiter
gereinigt (Extraktion und Fällung).
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Die
aus den Bakterien isolierten DNA-Fragmente werden danach direkt
in Klonierungsvektoren (generell Plasmide) zur Klonierung der DNA
insertiert oder alternativ des weiteren Restriktionsenzymen unterworfen, um
kleinere DNA-Fragmente zu produzieren, die in Klonierungsvektoren
insertiert werden. Die Klonierung von DNA in der vorliegenden Erfindung
beruht auf allgemeinen Techniken und Verfahren, die auf diesem Gebiet Standard
sind. Es ist anzumerken, dass eine beliebige Zahl von Verfahren
zur Klonierung der DNA-Segmente gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden kann und die vorliegende Erfindung beispielsweise
nicht auf die Verwendung von Plasmid-Klonierungsvektoren beschränkt ist.
Beispielsweise können
die DNA-Fragmente durch Insertion in einen Bakteriophagenvektor,
beispielsweise Charon 4A, EMBL3 (siehe Rodriguez und Denhardt, Vektors,
Kapitel 2, S. 43, 1988, Butterworth Publishers, Boston) oder P1
(1990, Sternberg, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 103–107) kloniert
werden.
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Wie
detailliert in den folgenden Beispielen 1 und 12 beschrieben ist,
werden die DNA-Fragmente zunächst
zur Insertion in einen Klonierungsvektor vorbereitet. Eine beliebige
Zahl von Klonierungsvektoren zur Bildung von DNA-Segmenten oder -Fragmenten gemäß der vorliegenden
Erfindung kann verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wurde
es jedoch als vorteilhaft ermittelt, die DNA-Segmente oder -Fragmente
in den gleichen Plasmidvektor zu klonieren, der zur Insertion von
exogener DNA in ein Empfängerbakterium durch
Konjugation verwendet wird. Es ist jedoch möglich, einen Klonierungsvektor
(Plasmid- oder anderer Vektor) zu verwenden, der nicht als Vektor
zur Konjugation in ein Empfängerbakterium
verwendet werden soll, insbesondere wenn ein Transformationsverfahren
zur Insertion der DNA in das Empfängerbakterien verwendet werden
soll.
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Nach
der Insertion in einen Klonierungsvektor wird der die isolierte
DNA enthaltende Vektor in einen Bakteriophagen gepackt, durch einen
Transfektionsprozess in ein Bakterium (generell E. coli) übertragen
und in den transfizierten Bakterien repliziert. Die erhaltenen Kolonien
von Bakterienzellen, die klonierte DNA enthalten, werden gepoolt
und aufbewahrt oder direkt verwendet.
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Die
klonierte DNA wird danach gescreent, um die relative Wirksamkeit
eines DNA-Fragments zur Verstärkung
der Produktion von Sphingan in Sphingomonas zu bestimmen. Bei dem
Screeningverfahren wird die DNA in einem entsprechenden Vektor dann
in einem Empfängerstamm
von Sphingomonas durch Konjugation insertiert (beispielsweise Tri-parental
Mating, gemäß der Beschreibung
bei Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 7347 (1980)),
wobei das erhaltene, gentechnisch veränderte Bakterium, das die DNA
in mehreren Kopien enthält,
und dessen Sphinganproduktion dann zur Bestimmung der Aktivität getestet
wird.
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Die
DNA-Segmente oder -Fragmente, für
die bestimmt wurde, dass sie die Sphinganproduktion verstärken, werden
dann in einen Sphingomonas-Empfängerstamm übertragen,
wobei ein Hyperproduzentenstamm gebildet wird, der mindestens zwei
Kopien von mindestens einem wesentlichen Teil des übertragenen DNA-Segments,
wie früher
beschrieben wurde, enthält.
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Ein
bevorzugtes Screeningverfahren wurde zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung entwickelt. Bei diesem Verfahren wird DNA auf das Vorhandensein
von Genen, die für
eine Sphingansynthese vorteilhaft oder wesentlich sind, durch Insertion
der DNA in einen nicht-produzierenden Empfängerstamm von Sphingomonas
gescreent. Bei diesem Screeningverfahren wird eine nicht-produzierende
Mutante (beispielsweise Sps– Bacr des
Stamms S88), die von einem sphinganproduzierenden Stamm von Sphingomonas
abgeleitet ist, gentechnisch derart verändert, dass sie mehrere Kopien
der zu screenenden DNA enthält.
Nach Züchten
der gentechnisch veränderten,
nicht-produzierenden
Mutante auf Nähragaragarplatten,
die 1–3%
Glucose enthalten, und Vergleichen des Auftretens von Kolonien durch
die gentechnisch veränderten
Bakterien mit einer nicht-produzierenden Mutante von Sphingomonas-Bakterien,
die unter identischen Bedingungen gezüchtet wurden, kann eine optische
Bestimmung im Hinblick auf die Fähigkeit
dieser DNA, die Synthese von Sphingan in Sphingomonas-Bakterien
zu bewirken, generell erfolgen.
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Die
Bestimmung der Fähigkeit
eines DNA-Segments oder -Fragments, die Sphinganproduktionsaktivität zu verstärken, beruht
generell auf dem problemlosen Feststellen phänotypischer Unterschiede, die
zwischen sphinganproduzierenden Bakterien und nicht-sphinganproduzierenden
Mutanten auf Kulturplatten existieren. Beispielsweise sind sphinganproduzierenden
Sphingomonas-Stämme
Mucoidproduzenten, die häufig zu
einer Koloniebildung führen
können,
die durch einfache optische Inspektion leicht unterschieden wird
(beispielsweise stehende runde Kolonien, die von einem breiten Ring
umgeben sind, für
Sphinganproduzenten gegenüber
flachen, grob durchscheinenden Kolonien für Nichtproduzenten).
-
In
bestimmten Fällen
kann, wie im folgenden Beispiel 2 detaillierter beschrieben ist,
wenn die phänotypischen
Unterschiede zwischen sphinganproduzierenden Bakterien und nicht-sphinganproduzierenden
Bakterien in einem Sphingomonas-Stamm nicht leicht oder ohne weiteres
erkennbar sind, dass Screeningverfahren derart modifiziert werden,
dass auf eine Aktivität
der relevanten DNA in Bakterien gescreent wird, wobei denen die
phänotypischen
Unterschiede zwischen Produzenten und Nichtproduzenten durch optische
Inspektion einfacher erkennbar sind. Dieser Aspekt der vorliegenden
Erfindung nutzt die Tatsache, dass in der vorliegenden Erfindung
verwendbare DNA-Fragmente Komplementierungen zwischen Stämmen und
intergenerische Komplementierung zeigen und in mehreren Kopien die
Sphinganproduktion in tatsächlich
allen Sphingomonas-Stämmen verstärken.
-
DNA-Segmente
oder -Fragmente, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind,
zeigen auch Aktivität
im Xanthomonas campestris. Folglich können DNA-Fragmente, die durch
Verwendung von einem oder mehreren Stämmen von Sphingomonas-Bakterien nicht ohne
weiteres gescreent werden, in eine nicht-xanthanproduzierende Mutante
von X. campestris, beispielsweise unter anderem X59m31, in mehreren
Kopien eingebaut werden und dann durch optische Inspektion auf die
Produktion von Xanthan gescreent werden. Die nicht-produzierenden
Mutanten von X. campestris, beispielsweise X59m31, werden durch
Selektion der Überlebenden
eines Einwirkens von Bacitracin und Beobachten, ob die durch die
Bacitracinresistenten Mutanten gebildeten Kolonien auf YM-Agaragarplatten
im Hinblick auf das Aussehen mucoid (Produzenten) oder nicht-mucoid
(Nichtproduzenten) sind, erhalten (siehe Pollock et al., 1994, J.
Bacteriol., 176, S. 6229–6237, und
US-Patent 5 338 841 ). Diejenige
DNA, die eine erhöhte
Produktion eines Polysaccharids (Sphingan oder Xanthan) in den gescreenten
Bakterien zeigt, ist ein Beleg für
eine Komplementierung zwischen Stämmen oder intergenerische Komplementierung
und sie verstärkt
die Sphinganpolysaccharidproduktion in anderen Stämmen von
Sphingomonas-Bakterien oder sogar unterschiedlichen Bakteriengattungen
(Xanthomonas).
-
Unter
Verwendung des einfachen Screeningverfahrens in diesem Aspekt der
vorliegenden Erfindung, das generell leicht zu identifizierende
phänotypische
Unterschiede zwischen Produzenten und Nichtproduzenten von Sphingan
nutzt, kann ein Fachmann üblicher
Erfahrung unter Verwendung von ohne weiteres verfügbaren Klonierungs-
und Übertragungstechniken
ohne weiteres DNA-Segmente oder -Fragmente erhalten, die in der
vorliegenden Erfindung zur Verstärkung
der Produktion von Sphinganpolysacchariden in Sphingomonas-Bakterien
verwendet werden können,
ohne übermäßigen oder
unnötigen
Arbeitsaufwand einzusetzen.
-
Ein
weiterer Aspekt gemäß der vorliegenden
Erfindung betrifft die verstärkte
Produktion von Sphinganpolysaccharid. Zur Produktion von Sphinganpolysaccharid
werden gentechnisch veränderte
Bakterien gemäß der vorliegenden
Erfindung unter geeigneten Fermentationsbedingungen, die einschlägig bekannt
sind, kultiviert. Ein geeignetes Medium oder eine geeignete Fermentationsbrühe zur Kultivierung
der gentechnisch veränderten
Sphingomonas-Bakterien ist ein wässriges
Medium, das generell eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise Kohlehydrate,
die Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose oder Maltodextrine umfassen,
eine Stickstoffquelle, beispielsweise anorganisches Ammonium, anorganisches
Nitrat, organische Aminosäuren
oder proteinartige Materialien, wie hydrolysierte Hefe, Sojamehl
oder Kasein, Destillatemulsionen oder Getreideeinweichlauge, anorganische
Salze und Vitamine enthält.
Eine breite Vielzahl von Fermentationsmedien unterstützt die
Produktion von Sphinganen gemäß der vorliegenden
Erfindung.
-
Die
Kohlehydrate sind in der Fermentationsbrühe in variierenden Mengen,
jedoch üblicherweise
zwischen etwa 1 und 5 Gew.-% des Fermentationsmediums enthalten.
Die Kohlehydrate können
alle auf einmal vor der Fermentation oder alternativ während der
Fermentation zugesetzt werden. Die Stickstoffmenge kann im Bereich
von etwa 0,01 bis etwa 0,4 Gew.-% des wässrigen Mediums liegen. Eine
einzige Kohlenstoffquelle oder Stickstoffquelle sowie Gemische dieser
Quellen können
verwendet werden.
-
Unter
den anorganischen Salzen, die bei der Fermentierung von Sphingomonas-Bakterien
Verwendung finden, sind Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-,
Nitrat-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche
Ionen enthalten. Spurenmetalle, wie Magnesium, Mangan, Cobalt, Eisen,
Zink, Kupfer, Molybdän,
Iodid und Borat, können
ebenfalls vorteilhafterweise enthalten sein. Vitamine, wie Biotin,
Folat, Lipoat, Niacinamid, Pantothenat, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin
und Vitamin B12 und Gemische derselben,
können
ebenfalls vorteilhafterweise verwendet werden.
-
Die
Fermentation wird bei Temperaturen zwischen etwa 25° und 35°C durchgeführt, wobei
optimale Produktivität
innerhalb eines Temperaturbereichs von etwa 28 und 32°C erhalten
wird. Das Inokulum wird durch Standardverfahren des Volumen-Scale-Up, die Schüttelkolbenkulturen
und kleinskalige Tauchrührfermentation
umfassen, hergestellt. Das Medium zur Herstellung des Inokulums
kann gleich dem Produktionsmedium sein oder es kann ein beliebiges
von mehreren einschlägig
bekannten Standardmedien, wie Luria Broth oder YM Medium, sein.
Die Kohlehydratkonzentration kann in den Impfkulturen auf weniger
als etwa 1 Gew.-% verringert sein. Mehr als eine Impfstufe kann
verwendet werden, um das gewünschte
Inokulationsvolumen zu erhalten. Typische Inokulationsvolumina liegen
im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 10% des gesamten Endfermentationsvolumens.
-
Das
Fermentationsgefäß enthält typischerweise
einen Rührer
zum Rühren
des Inhalts. Das Gefäß kann auch
automatische Kontrollen des pH-Werts und der Schaumbildung aufweisen.
Das Produktionsmedium wird in das Gefäß gegeben und an Ort und Stelle
durch Erhitzen sterilisiert. Alternativ kann die Kohlehydrat- oder
Kohlenstoffquelle getrennt vor der Zugabe sterilisiert werden. Eine
zuvor gezüchtete
Impfkultur wird zu dem gekühlten
Medium (generell bei der Fermentationstemperatur von etwa 28 bis
etwa 32°C)
gegeben und die gerührte
Kultur wird etwa 48 bis etwa 96 h fermentiert, wobei eine Brühe hoher
Viskosität
produziert wird. Das Sphinganpolysaccharid wird aus der Brühe durch
das Standardverfahren einer Fällung
mit einem Alkohol, generell Isopropanol, gewonnen.
-
Als
spezielles Beispiel offenbart diese Anmeldung DNA-Segmente oder -Fragmente,
die aus mehreren Bakterienstämmen,
insbesondere den Sphingomonas-Stämmen
S88, S60, NW11, S198, S7 und S194 (erhältlich von der American Type
Culture Collection als Hinterlegungen ATCC31554, ATCC31461, ATCC53272, ATCC31853,
ATCC21423 bzw. ATCC31961), isoliert wurden. Diese DNA-Segmente oder
-Fragmente wurden als zum Erhöhen
der Produktion von Sphingan S-88, S-60 und NW-11 in den jeweiligen
Stämmen
von Sphingomonas-Bakterien verwendbar ermittelt, wenn sie in mehreren
Kopien als extrachromosomale (Plasmid-)DNA in den Bakterienstämmen eingearbeitet
wurden.
-
Im
Falle des Sphingomonas-Stamms S88 zeigt das isolierte Segment von
chromosomaler DNA eine Größe von etwa
34 Kilobaseeinheiten und es enthält
zwischen 23 und 25 Gene. Wie durch die Karte von Klonen für S88 in 1 gezeigt
ist, ist die 34-kbp-Region die kombinierten Strecken von zwei Klonen:
c3 und c2. Eine Zahl von DNA-Sequenzen ausgehend von dieser 34-kb-DNA-Sequenz
der Bezeichnung C1Δ3,
c2, c3, c4, c5, c6 H15.6, B7.1, B8.6, E5.9, E1.5, E2.4, E4.5, E6.6,
E12.8 und dergleichen ist ebenfalls in 1 dargestellt.
Die 8 und 11 beschreiben
die isolierte chromosomale DNA von S88 in weiteren Einzelheiten.
-
Im
Falle des Sphingomonas-Stamms S60 wurde eine Zahl von DNA-Sequenzen
aus der chromosomalen DNA isoliert, wobei diese c1, c2 und c3 umfassen
(siehe 2). Die Sequenz c2 wurde kloniert,
in einen pRK311-Vektor platziert und in die Sphingomonas-Bakterienstämme S88,
S60 und NW11 insertiert, um sphinganproduzierende Aktivität festzustellen
(siehe Beispiel 9, das hierin detaillierter beschrieben ist).
-
Im
Falle des Sphingomonas-Stamms S198, S7 und S194 wurden ebenfalls
DNA-Segmente aus diesen Stämmen
isoliert (siehe 9 und 10).
Eine Zahl zusätzlicher
DNA-Segmente kann auch aus diesen Stämmen nach der allgemeinen Methodik,
die in dieser Anmeldung detaillierter angegeben ist, isoliert werden und
zur Herstellung einer erhöhten
Sphinganproduktion in Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden.
-
Im
Falle des Sphingomonas-Stamms NW11 wurden die DNA-Fragmente c1, c2,
c2.1, c2.2, c2Hd, c2H1, c2H2, c2H3, c2E10 isoliert (siehe 3).
Die Sequenz c2.2 wurde kloniert, in einen pRK311-Vektor platziert
und in die Sphingomonas-Bakterienstämme S88,
S60 und NW11 insertiert, um sphinganproduzierende Aktivität festzustellen
(siehe Beispiel 9, das hierin detaillierter beschrieben ist).
-
Die
im Folgenden angegebenen DNA-Segmente wurden unter Verwendung eines
Verfahrens gemäß der generellen
obigen Beschreibung aus den Stämmen
S88, S60 und NW11 von Sphingomonas hergestellt. Jedes dieser DNA-Segmente
(das als DNA-Segmente
voller Länge
in Plasmidvektoren angegeben ist) ändert, wenn es in einen oder
mehrere Sphingomonas-Stämme
(Sphinganproduzent des Wildtyps oder von einem Produzent des Wildtyps
abgeleitete nicht-mucoide Mutante) insertiert ist, die Bakterien
in Hyperproduzenten von Sphinganpolysaccharid. Jedes der DNA-Segmente
oder -Fragmente ist von dem DNA-Segment
oder -Fragment, das aus Sphingomonas-Stämmen isoliert wurde, abgeleitet,
und wie angegeben in Plasmidvektoren insertiert. Die DNA-Segmente
oder -Fragmente sind durch Karten von Restriktionsenzymspaltungsstellen definiert
(siehe 1, 2 und 3).
- Stamm S88
pRK311-S88c1Δ3
pRK311-S88c2
pRK311-S88c3
pRK311-S88c4
pRK311-S88c5
pSEB24-S88H15.6
pSEB24-S88B8.6
pSEB24-S88E4.5
pSEB24-S88E6.6
- Stamm S60
pRK311-S60c2
- Stamm NW11
pRK311-NW11c2.2
-
Die
klonierte DNA kann in sphinganproduzierende Sphingomonas des Wildtyps
oder nicht-sphinganproduzierende Mutanten eingeführt werden, um die Hyperproduktionswirkung
zu realisieren. Beispielsweise kann die klonierte DNA in mehreren
Kopien in entweder sphinganproduzierende Stämme des Wildtyps bzw. von sphinganproduzierenden
Stämmen
abgeleitete nicht-mucoide
Mutanten eingeführt
werden. Die erhaltenen gentechnisch veränderten Bakterien sind Hyperproduzenten
von Sphingan im Vergleich zu sphinganproduzierenden Bakterien des
Wildtyps oder mutierten nicht-produzierenden Bakterien des gleichen
Stamms.
-
Die
Einführung
mehrerer Kopien der relevanten gescreenten DNA in diese Stämme von
Sphingomonas-Bakterien erhöhte
in ganz unerwarteter und genereller Weise das durch die rekombinanten
Bakterien produzierte Sphingan im Vergleich zu der von den Wildtypbakterien
produzierten Sphinganmenge. Das Phänomen war ein generelles und
die Sphinganzunahme zeigte Komplementierung zwischen Stämmen.
-
Nach
Einführung
der klonierten DNA in das Bakterium in mehreren Kopien weisen die
rekombinanten Bakterien nun eine Sphinganpolysaccharid-Syntheseaktivität in Höhen auf,
die gegenüber
dem Wildtyp erhöht sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren DNA-Segmente tragen
Gene, die zur Synthese von Sphingan durch Sphingomonas-Stämme vorteilhaft
oder wesentlich sind, wobei diese ein DNA-Fragment umfassen, das
für ein
Protein codiert, das zum Befestigen eines ersten Glucoserests an
einem Träger-Isoprenylphosphat,
was eine frühe
Stufe im Zusammenbau oder der Biosynthese von Sphingan in diesen
Stämmen
ist, erforderlich ist.
-
Die
DNA-Sequenz des spsB-Gens (4) und
die abgeleitete Aminosäuresequenz
des SpsB-Proteins (5) sind ebenfalls offenbart.
Alle DNA-Fragmente, die DNA mit Codierung für das SpsB-Protein (oder ein
analoges Protein, wie SgeB, SnwB, SneB, SssB und SrhB, unter anderen,
in Abhängigkeit
vom Sphingomonas-Stamm) enthalten, können in Sphingomonas-Stämme als
mehrere Kopien unter Verstärkung
der Produktion von Sphingan durch die erhaltenen, gentechnisch veränderten
Bakterien eingearbeitet werden.
-
In ähnlicher
Weise gilt das Gleiche für
DNA-Segmente oder -Fragmente, die das sgeB-Gen (mit Codierung für das SpsB-analoge SgeB-Protein),
das aus S60 Sphingomonas isoliert wurde, und das snwB-Gen, das aus
NW11 Sphingomonas isoliert wurde, enthalten. Das sgeB-Gen (2)
ist analog dem spsB-Gen der chromosomalen DNA von S88 (und den entsprechenden
sneB-, sssB- und srhB-Genen von jeweils den S198-, S7- und S194-Stämmen von
Sphingomonas, die für
die SneB-, SssB- und SrhB-Proteine codieren) insofern, als angenommen
wird (auf der Basis der DNA-Hybridisierung mit dem spsB-Gen von
S88 entsprechenden Fragmenten), dass es für ein Protein codiert, das
dem durch das spsB-Gen codierten Protein analog ist. Die in 3 angegebene
snwB-Region entspricht der DNA-Sequenz, die für das Protein SnwB codiert.
Das snwB-Gen ist analog dem spsB-Gen der chromosomalen DNA von S88
und dem sgeB-Gen der chromosomalen DNA von S60. Diese DNA-Fragmente können in
Plasmide, wie generell im Vorhergehenden beschrieben, unter Bildung
mehrerer Kopien zur Verstärkung
der Sphinganproduktion in Sphingomonas insertiert werden.
-
Es
wird angenommen, dass das spsB-Gen für Glucosyl-IP-Transferase in Sphingomonas
S88 codiert. Es gibt beträchtliche
Homologiebelege zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen des SpsB-Proteins und
vermutlichen Glucosyl-IP-Transferasen
von anderen Bakteriengattungen. Der stärkste Beleg, dass das spsB-Gen
für eine
Glucosyl-IP-Transferase codiert, ist die Ähnlichkeit von dessen abgeleiteter
Aminosäuresequenz
mit den Sequenzen anderer Gene, für die generell angenommen wird,
dass sie für
Glucosyl-IP-Transferasen codieren. Tatsächlich besteht beträchtliche
Homologie für
die Carboxylhälften
von Glucosyl- und Galactosyl-IP-Transferasen.
Obwohl den aminoterminalen Regionen diese extensive Homologie fehlt,
ist das SpsB-Protein dem RfbP-Protein
von S. enterica (1991, Jiang et al., Mol. Microbiol., 5, 695) insofern ähnlich, als
es mehrere hydrophobe Strecken aufweist, die membrandurchspannende
Domänen
nahelegen. Die hydrophoben Domänen
von SpsB umfassen die Aminosäuren
35–59
(mittlere Hydropathie +2,2), 68–86
(+1,7), 105–123
(+2,3) und 282–303
(+2,9). Die Position der letzteren hydrophoben Region ist diesen
verwandten Genprodukten gemeinsam. Sie befindet sich benachbart
zur Region größter Homologie.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
gemäß der vorliegenden
Erfindung werden DNA-Segmente oder -Fragmente, die DNA-Sequenzen mit Codierung
für Glucosyl-IP-Transferasen
der Sphingomonas-Stämme S88,
S60 oder NW11 codieren, vorteilhafterweise in mehreren Kopien in
Sphingomonas-Empfängerbakterien zur
Verstärkung
der Sphinganproduktion in den Empfängerbakterien verwendet. Zusätzlich zum
Einbau von Genen mit Codierung für
Glucosyltransferaseenzyme können
Gene oder DNA-Fragmente mit Codierung für Zuckersynthone oder Zuckervorstufen
(d. h. Zuckerkomponenten, die Bauteile der Sphinganpolysaccharide umfassen
und zur Biosynthese von Sphinganen verwendet werden, beispielsweise
Glucose, Galactose, Rhamnose, Mannose, andere Zuckersynthone und
Vorstufen) oder mit Codierung für
Enzyme oder Proteine, die die Polymerisation oder Sekretion des
Polysaccharids aus der intakten Zellstruktur unterstützen, vorteilhafterweise
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
-
Die
folgenden Beispiele sind zur Erläuterung
der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beschreibung der Beispiele
sollte nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner
Weise beschränkend betrachtet
werden.
-
Beispiele 1–21
-
In
den folgenden Beispielen 1–21
sind Bakterienstämme,
Plasmide und Bakteriophagen in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet.
Luria-Bertani- und YM-Medien waren Standardmedien (Pollock et al.,
1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237).
Verwendete Antibiotikamengen (Sigma): Bacitracin (Bac) 73 Einheiten/mg
und 0,01–8 mg/ml
wie spezifiziert, Rifampicin (Rif) 50 μg/ml; Streptomycin (Stm) 50 μg/ml; Kanamycin
(Kan) 25 μg/ml;
Chloramphenicol (Cam) 15 μg/ml;
und Tetracyclin (Tet) 4–12 μg/ml. Tabelle 1. Bakterienstämme, Plasmide und Bakteriophage
Name | Genotyp/Phänotyp
(Polysaccharid) | Quelle
(Referenz)a |
Sphingomonas |
S88 | Stmr Bacr Sps+
(Sphingan S-88) | ATCC31554 |
S88m260 | Stmr Bacr Sps– | Pollock
et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 6229–6237 |
S60 | Stmr Bacr Sps+
(Sphingan S-60 oder Gellan) | ATCC31461 |
X. campestris |
X59 | Rifr Bacr Gum+
(Xanthan) | Thorne,
et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 3593–3600 |
X59m31 | Rifr Bacr Gum– | Thorne,
et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 3593–3600 |
E. coli
K-12 |
HMS174 | F– hsdR19
(rK– mK+)
recA1 rpoB331
(Rif)
In(nnD-nnE)1 | W.
Studier |
DH5aTM | F– φ80dlacZΔM15
recA1
endA1 gyrA96
thi-1 relA1 supE44
hsdR17 (rK–mK+)
Δ (argF-lac)
U169 | Bethesda
Res. Lab. |
Plasmide |
pRK2013 | ori(colE1)
Kanr
ori(RK2) Tra+ | Figurski
et al., 1979, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76: 1648–1652 |
pRK311 | oriV(RK2)
Tetr oriT
λcos lacZ(o) | Ditta
et al. 1985, Plasmid 13: 149–153
(7) |
pMMB66EH | oriV(RSF1010)
oriT
Ampr lacl tacP Mcs1 | Fürste et
al., 1986, Gene, 48: 119–131 |
pUC12,
13 | ori(colE1)
Ampr | Vieira
und Messing, 1982, Gene 19: 259–268 |
pC194 | ori
(grampositive Bakterien) Camr | Horinouchi
und Weisblum, 1982, J. Bacteriol. 150: 815–825 |
pSEB23 | ori(colE1)
Ampr
Camr Mcs2 | vorliegende
Erfindung |
pSEB24 | oriV(RSF1010)
oriT
Ampr Camr Mcs2 | vorliegende
Erfindung |
pNH-Kan/oriT | ori(colE1)
Ampr
Kanr oriT | Hengen
und Lyer, 1992, BioTechniques 13: 57–62 |
pSEB26 | ori(colE1)
Ampr
Camr Kanr oriT Mcs2 | vorliegende
Erfindung |
Bakteriophage |
λ NK1316 | b522(ΔattP) c/857
Pam80
nin5
mini-Tn10
kan/Plac-ATS-Transposase | Kleckner
et al., 1991, "Uses
of transposons with emphasis on Tn10", S. 139–180. In J. H. Miller (Hrsg.),
Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego" |
- a ATCC: American
Type Culture Collection, Rockville, MD.
-
Beispiel 1
-
Konstruktion einer Bibliothek von DNA-Segmenten
von Sphingomonas
-
Zur
Synthese von Sphinganen wesentliche DNA-Fragmente wurden aus Sphingomonas-Stämmen kloniert.
Eine vollständige
Bibliothek von DNA-Segmenten wurde wie im Folgenden hergestellt.
Ein Bakterienstamm (in diesem Beispiel S88) wurde über Nacht
in 25 ml eines flüssigen
YM-Mediums bei 30°C
geschüttelt, wobei
eine große
Menge Zellen enthaltende Viskosebrühe er halten wurde. YM-Medium
enthielt 3 g Bacto Yeast Extract, 3 g Bacto Malt Extract, 5 g Bacto
Peptone (Difco) und 10 g D-Glucose
(Difco) pro Liter Wasser. Natriumazid wurde bis auf 0,01% zugegeben
und Sphinganaseenzym (1994, Mikolajczak et al., Appl. Environ. Microbiol.,
60, 402) wurde 8 h bei 37°C
zur Verdauung von Sphinganexopolysacchariden zur partiellen Verringerung
der Viskosität
und der Bildung großer
Zellmengen zugegeben. Die Zellen wurden zentrifugiert und zu DNA-Extraktion
durch das Verfahren von Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res., 7,
1513 (1979) resuspendiert. Die Proteine wurden aus dem geklärten Lysat
mit einem gleichen Volumen von Phenol/CHCl3/Isoamylalkohol (24/24/1)
durch leichtes Schütteln über 16 h
bei 25°C
und dann mit einem Volumen von CHCl3/Isoamylalkohol (24/1) über 3 h
bei 25°C
entfernt. 1/10 des Volumens von 3 M Natriumacetat (pH-Wert 5,2)
wurde zugegeben und die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde mit
2 Volumina Ethanol gefällt
und dann getrocknet und in 0,5 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,1 mM
EDTA) resuspendiert.
-
Gemäß der Cosmidklonierungsstrategie
von Loftus, Foster und Ross (BioTechniques, 12, 172, 1992), wurde
S88-DNA mit SalI-Enzym partiell verdaut, durch 1%ige Agarose mit
niedrigem Schmelzpunkt in Tris-Acetat-EDTA-Puffer einer Elektrophorese
unterzogen und Fragmente, die größer als
20 kbp waren, wurden durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt.
Die SalI-verdaute S88-DNA wurde mit Klenow-DNA-Polymerase zum Anfügen von dCMP und dTMP an die
kohäsiven
Enden behandelt, 20 min bei 70°C erhitzt
und mit Ethanol gefällt.
Das Vektorplasmid pRK311 (1985, Ditta et al., Plasmid 13, 149–153) wurde
mit BamHI-Enzym vollständig
verdaut und dann 15 min bei 65°C
erhitzt und durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die BamHI-verdaute
pRK311-DNA wurde mit Klenow-DNA-Polymerase zur Addition von dGMP
und dAMP wie oben behandelt und dann gereinigt. Die Ligationsreaktion
mit T4-DNA-Ligase enthielt gleiche Molmengen von Vektor und Insertfragmenten.
Alle Restriktionsenzyme, Kle now-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase
stammten von Stratagene und die Reaktionsbedingungen des Herstellers
wurden verwendet. Nach Verpackung in Bakteriophagen (GigapackTM IIXL von Stratagene) wurden die ligierten
Moleküle
in E. coli DH5αTM durch Transfektion übertragen und die Zellen auf
LB-Platten, die Tetracyclin mit einer Konzentration von 4 bis 12 μg/ml enthielten,
verteilt. Eine Bibliothek von 1700 und eine von 3400 Tetr-Kolonien wurden getrennt gepoolt und eingefroren.
Die Tetr-Kolonien (10 von 10 getesteten)
enthielten Inserts von 25 bis 30 kbp mit internen SalI-Restriktionsstellen.
-
In ähnlicher
Weise wurden Bibliotheken chromosomaler DNA-Segmente ebenfalls von anderen Sphingomonas-Stämmen, die
NW11, S60, S198, S194 und S7 umfassen, hergestellt. In diesen Fällen wurden
die Zellen, die die Quelle für
die klonierte DNA waren, in einem Medium mit Glucose von weniger
als 0,5% (Gew/V) gezüchtet
und die Sphinganasebehandlung weggelassen.
-
Beispiel 2
-
Isolierung von Biosynthese-DNA-Fragmenten
für Sphingan
S-88
-
Fragmente
von DNA, die in Plasmide kloniert waren, wurden auf das Vorhandensein
von Genen, die für
die Sphingan-S-88-Synthese
wesentlich sind, durch Beobachten einer Wiederherstellung der Sphingansynthese
in sphingannegativen Mutanten gescreent. Zuvor ermittelten wir,
dass die meisten der spontanen Bacitracin-resistenten Mutanten des
Sphingomonas-Stamms
S88, die auf YM-Platten, die Bacitracin mit 500–800 μg/ml enthielten, wachsen konnten,
keine Sphinganpolysaccharide produzierten (Pollock et al., 1994,
J. Bacteriol., 176, S. 6229–6237).
Dies bildete die Basis für
ein einfaches Screeningverfahren für diese spezielle Klasse von
Mutanten.
-
Die
Mutante S88m260 ist ein repräsentatives
Mitglied dieser Sps– Bacr-Gruppe.
Das Unvermögen, Exopolysaccharide
durch S88m260 und die anderen Bacr Sps–-Mutanten
herzustellen, führte
zu einem Kolonieaussehen, das im Vergleich zu den Wildtypkolonien
flacher, von rauer Oberfläche
und durchscheinend war, und die Bacr Sps–-Kolonien
waren auch von einem engen lichtreflektierenden Halo umgeben, wenn
sie gegen das Licht gehalten und von unten betrachtet wurden. Diese
Phänotypunterschiede
waren nicht so offensichtlich wie die mächtige Schleimbildung von X.
campestris des Wildtyps und das flache Aussehen von entsprechenden
Gum–-Mutanten.
Die Koloniephänotypen
wurden durch Züchten
von Kulturen in flüssigem
YM-Medium und Wiegen der getrockneten Exopolysaccharide nach Fällung mit
Isopropylalkohol verifiziert. Mehrere Sps–-Mutanten
waren empfindlich gegenüber
Bacitracin und es wurde infolgedessen ermittelt, das sie Gene definieren,
die für
Sphingansynthese wesentlich waren, die jedoch von den mit dem Bacitracin-resistenten Phänotyp verbundenen
Gen verschieden waren.
-
Plasmid-DNA
von der Genbibliothek wurde von E. coli auf Xanthomonas oder Sphingomonas
durch Tri-parental Mating übertragen
(Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347, 1980). Gemische
von Donorzellen, die Mob+ Tra– rekombinante
Plasmide (pRK311 mit S88-Insert) enthielten, Helferzellen, die Mob+ Tra+-pRK2013-Plasmid
enthielten, und Exopolysaccharid-negative Empfängerzellen im Verhältnis 5:2:10
wurden auf nicht-selektive YM-Platten, denen Glucose fehlte, punktförmig aufgetragen
und 6–16
h bei 30°C
inkubiert. Exkonjugante von Xanthomonas wurden durch Verteilen einer Ösenmenge
des Mating-Gemischs auf Platten, die Rifampicin (50 μg/ml) zur
Selektion gegenüber
Helfer- und Donorzellen und Tetracyclin (4–12 μg/ml) für pRK311 oder Chloramphenicol
(20 μg/ml)
für pSEB24
zur Selektion auf das rekombinante Plasmid enthielten, isoliert.
Sphingomonas ist von Natur aus gegenüber Streptomycin resistent,
was zur Selektion gegenüber
den Donor- und Helferzellen verwendet wird, wenn Sphingomonas der
Empfänger
ist.
-
Zur
Feststellung einer Komplementierung wurden die Exkonjuganten des
Stamms S88 mit dem Auge als entweder Sps+ (stehende
runde opake Kolonien, umgeben von einem hellen Ring, wenn sie gegen
das Licht gehalten und von unten betrachtet wurden) oder Sps– (flache
raue durchscheinende Kolonien ohne Ring) beurteilt. In ähnlicher
Weise waren Gum+-Kolonien, die ausgehend
von Xanthomonas-Exkonjuganten gewachsen waren, mucoid im Hinblick
auf das Aussehen im Vergleich zu den matten oder nicht-glänzenden
Kolonien des Gum–-Empfängers.
-
Versuche
zur Identifizierung der S88-Klone in der Bibliothek direkt in nicht-mucoiden
Mutanten von S88 waren nicht erfolgreich (kein klar belegbarer mucoider
Phänotyp).
Wir änderten
dann unseren Ansatz, um die Klone nach Übertragung der Bibliothek in
nicht-mucoide Mutanten des gumD-Gens von X. campestris herauszufinden.
Dies ermöglichte
uns, den Anfangsklon "S88c1" herauszufinden,
was im Folgenden detaillierter beschrieben ist.
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Die
S88-Genbibliothek wurde von E. coli in den X. campestris-Stamm X59m31,
der einen Bacr Gum–-Defekt
in dem GumD-Gen aufweist, (Pollock et al., J. Bacteriol., 176, S.
6229–6237,
1994; Thorne et al., J. Bacteriol., 169, 3593, 1987) übertragen.
Aufgrund dieser intergenerischen Verbindung fanden wir einige Gum+ Tetr-Kolonien auf
YM-Platten und diese traten mit einer Häufigkeit von etwa 10–3 bis
10–4 auf.
Individuelle Plasmide wurden ausgehend von den komplementierten
Mutanten gereinigt und zur Restriktionsanalyse in E. coli zurückübertragen.
Die gereinigten Plasmide wurden in Sphingomonas S88m260 übertragen
und etwa 10% der Transkonjuganten wurden Sps+.
Ein Plasmid (pRK311-S88c1) wurde gewonnen und für die folgenden Arbeiten verwendet.
Das Plasmid pRK311-S88c1 komplementierte ebenfalls mehrere zusätzliche,
unabhängig voneinander
isolierte Bacr Sps–-Mutationen in den
Sphingomonas-Stamm S88 und Bacr Gum– Mutanten
von X. campestris. Wir isolierten die Exopolysaccharide, die in
das Kulturmedium durch die Exkonjugante für jede intergenerische Verbindung
sezerniert wurden, und verifizierten durch Dünnschichtchromatographie, dass Säurehydrolysate
die für
das Polysaccharid der Empfängerzelle
erwarteten Zuckerreste enthielten. Das Plasmid pRK311-S88c1 stellte
die Sphingansynthese für
Sphingomonas und die Xanthangummisynthese für X. campestris wieder her.
Diese Ergebnisse zeigten, dass das Plasmid pRK311-S88c1 für Exopolysaccharid-Biosynthesefunktionen,
die in den Bacr-polysaccharidnegativen Mutanten fehlten,
codierte und dass Gene von einer Gattung die fehlende Funktion in
einer zweiten Gattung ersetzen können.
Das Segment S88c1 ist ähnlich dem
in 1 gezeigten Segment S88c1Δ3 mit Ausnahme davon, dass S88c1
auch ein zusätzliches 7,5-kbp-HindIII-Fragment
am äußersten
rechten Ende von S88c1Δ3
umfasst. Das 7,5-kbp-Segment
wurde speziell aus S88c1 deletiert, wobei das Derivat S88c1Δ3 erhalten
wurde.
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Das
oben beschriebene Verfahren zur Bestimmung von DNA-Fragmenten, die zur
Wiederherstellung der Gummiproduktion (Sphingangummi in Sphingomonas
sp. oder Xanthangummi in X. campestris) verwendbar sind, ist reproduzierbar
und zusätzliche
Klone wurden in direkten Versuchen isoliert. Ein direktes Screening der
Klonbibliothek auf Segmente, die Sps– Bacr-Mutationen 76 und 78 von Sphingomonas S88
komplementierten, ergab drei zusätzliche
Klone, die partiell mit S88c1 überlappten.
Die drei klonierten Segmente wiesen jeweils eine Länge von
etwa 23–27
kb auf. Zwei der drei Segmente komplementierten die Mutante S88m260. Eine
Karte von Restriktionsenzymspaltungsstellen ist in den 1 und 8 angegeben.
-
Das
oben beschriebene Verfahren wird zur Bestimmung von DNA-Fragmenten,
die aus den Sphingomonas-Stämmen
S60, NW11, S198, S7 und S194 und anderen sphinganproduzierenden
Sphingomonas-Stämmen
isoliert wurden, die zur Erhöhung
der Sphinganproduktion in jedem dieser Stämme verwendbar sind, verwendet.
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Beispiel 3
-
DNA-Sequenz des spsB-Gens und abgeleitete
Aminosäuresequenz
des SpsB-Proteins
-
Die
doppelsträngige
Nucleotidsequenz für
1950 bp der spsB-Region
wurde von einem Fragment von 3300 bp, das von dem Plasmid pSEB24-S88E4.5::Tn#72
subkloniert war, erhalten. Die Sequenz des codierenden Strangs ist
in 4 angegeben. Es gab ein langes offenes Leseraster
(ORF), das wir spsB nannten. Die codierende Region begann mit ATG
am Nucleotid 361 und sie lief bis zum TGA-Stopcodon bei 1771. Dieses
ORF codierte für
470 Aminosäuren
und ihm ging eine vermutete Ribosomenbindungsstelle voraus. Die
abgeleitete Aminosäuresequenz
unter Verwendung von Standard-Einbuchstabenabkürzungen ist in 5 angegeben.
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Beispiel 4
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DNA-DNA-Hybridisierung des klonierten
S88-Segments und der chromosomalen DNA von entweder S88 oder S60
-
Um
zu zeigen, dass die klonierte DNA in dem Plasmid pRK311-S88c1Δ3 von fortlaufenden
Sequenzen von S88-DNA stammte, markierten wir die Plasmid-S88c1Δ3-DNA und
hybridisierten sie mit getrennten Restriktionsfragmenten von DNA
von Sphingomonas-Stämmen
S88, mutiertem S88m260 und S60, dem Wildtypproduzenten von Gellan.
Das Vorliegen einer Hybridisierung mit EcoRI-Fragmenten von etwa
1,5, 2,4, 4,5, 5,9 und 12 kbp ist konsistent mit Kontinuität für die klonierte
DNA in sowohl der Wildtyp- als auch der mutierten S88-DNA. Das für S88c1Δ3 angegebene, äußerste linke
Fragment von 6,6 kbp weist tatsächlich
12,8 kbp auf, wenn die überlappenden
Klone S88c2, S88c3 und S88c4 mit EcoRI verdaut werden, da eine der
EcoRI-Stellen von der multiplen Klonierungsstelle des Vektors stammt.
Die Hybridisierung zwischen S88-DNA und S60-DNA, die Gellan produziert,
zeigte, dass ähnliche
Gensequenzen vorhanden sind, die Genorganisation jedoch unter schiedlich
sein kann. Wegen der Strukturähnlichkeit
zwischen den durch diese zwei Sphingomonas-Stämme sezernierten Exopolysacchariden
vermuten wir, dass sie ähnliche
Transferasegene aufweisen. Die Region der S88-S60-Homologie ist
in 2 angegeben. In unabhängigen Tests auf DNA-Homologie
lokalisierten wir die homologe Region zwischen dem Stamm NW11 und
S88 wie in 3 angegeben.
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Beispiel 5
-
Klonierung des Sphingan-Biosynthesegenclusters
von den Stämmen
S60, NW11, S198, S7 und S194
-
DNA-Fragmente
wurden von Sphingomonas S60, NW11, S198, S7 und S194 isoliert. Das
Verfahren war gleich der Beschreibung in den obigen Beispielen für den Stamm
S88. Die Karten der Restriktionsstellen der DNA-Fragmente von den
Stämmen
S60, NW11, S198, S7 und S194 sind in den 2, 3, 9 bzw. 10 angegeben.
Die Größen von
Restriktionsfragmenten, die durch Verdau von DNA mit einzelnen oder mehreren
Restriktionsenzymen erzeugt wurden, sind hier für zwei unabhängig voneinander
isolierte Klone, pRK311-S194c1 und pRK311-S194c2 aufgelistet. Die
Größen wurden
durch Vergleichen der elektrophoretischen Migration der Fragmente
durch Agarosegele mit Fragmenten bekannter Größe: Fragmenten von Bakteriophage-Lambda-DNA
nach Verdau mit HindIII und der "Kb
DNA Ladder" von
Stratagene bestimmt. Die Fragmentgrößen identifizieren die DNA-Sequenzen,
die in diesen zwei klonierten Sequenzen enthalten sind.
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Im
Folgenden sind Daten für
die Fragmentgrößen für das Plasmid
pRK311-S194c1, das ein aus Sphingomonas S194 isoliertes c1-Fragment
enthielt, angegeben. Die Fragmentgrößen in Kilobasenpaaren für pRK311-S194c1
sind: (EcoRI) > 25,
8,3, 5,4 und 1,5; (EcoRI + HindIII) 13,0, 9,7, 8,3, 5,4, 2,8 und
1,5; (HindIII) > 25
und 2,8; (BamHI + HindIII) > 25,
5,8, 3,9, 2,0 und 0,8; (BamHI) > 25,
5,8 und 4,7; (BamHI + EcoRI + HindIII) 13,0, 8,3, 5,8, 5,4, 3,9,
2,0, 1,5 und 0,8; (BamHI + EcoRI) 15,0, 8,3, 5,8, 5,4, 4,7 und 1,5.
Die Fragmentgrößen in Kilobasenpaaren
für pRK311-S194c2
sind: (EcoRI) 14,5, 10,0, 8,3, 6,1, 2,6 und 1,35; (EcoRI + HindIII)
13, 8,3, 5,7, 4,6, 4,0, 2,6, 1,8, 1,35, 0,75, 0,35 und 0,25; (HindIII) > 20, 12,8, 4,6, 2,1,
0,75 und 0,25; (BamHI + HindIII) > 20,
3,8, 3,1, 2,8, 2,3, 1,65, 1,6, 1,3, 1,2, 0,95, 0,9, 0,8 und 0,25;
(BamHI) > 20, 5,8,
3,1, 2,8, 2,6, 2,3, 2,0, 1,6 und 0,25; (BamHI + EcoRI + HindIII)
13, 8,3, 3,8, 3,1, 2,4, 2,3, 1,6, 1,35, 1,3, 0,95, 0,9, 0,85, 0,8,
0,45, 0,35 und 0,3; (BamHI + EcoRI) 14,5, 8,3, 4,9, 3,1, 2,4, 2,3,
2,0, 1,6, 1,35, 1,3, 0,85, 0,45 und 0,2.
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Beispiel 6
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Konstruktion der Plasmide pSEB24 und pSEB26
-
Die
Plasmide pSEB24 und pSEB26 (7) wurden
derart zusammengebaut, dass sie spezifische Replikations- und Konjugationsverbindungsfunktionen,
Arzneistoffresistenzgene, die für
Sphingomonas geeignet und mit mini-Tn10kan kompatibel waren, und
multiple Klonierungsstellen enthielten. Das Plasmid pSEB24 weist
einen breiten Wirtsbereich auf, während pSEB26 in E. coli, jedoch
nicht in entweder Sphingomonas oder Xanthomonas repliziert. Zunächst wurde
das Camr-Gen auf einem HpaII-Sau3A-Fragment
von 1031 bp, das von dem Plasmid pC194 von Staphylococcus aureus
(1982, Horinouchi und Weisblum, J. Bacteriol. 150, 815) entnommen
war, stumpfendig gemacht und dann an die stumpfendig gemachte XbaI-Stelle
des Plasmids pUC13 ligiert (1982, Vieira und Messing, Gene 259).
Die Camr-Kassette wurde von diesem Plasmid
auf einem BamHI-SalI-Fragment entfernt, stumpfendig gemacht und
in pUC12 zwischen der singulären
SspI-Stelle und der nächsten
der zwei PvuII-Stellen (ebenfalls stumpfendig) insertiert, wobei
das Plasmid pSEB23 erhalten wird, das Ampr und
Camr ist und mit zugesetztem X-Gal und IPTG
blaue Kolonien bildet. Zur Konstruktion von pSEB24 ligierten wir
das ScaI-PvuII-Fragment von etwa 2130 bp von pSEB23 an den ScaI-PvuII-Teil
von pMMB66EH (1986, Fürste
et al., Gene 48, 119), um den oriv (Replikationsursprung
eines breiten Wirtsbereichs von RSF1010) zu erhalten und das Ampr-Gen zu regenerieren. Das HindIII-BamHI-Fragment
von 2700 bp, das die oriT-Sequenz des Plasmids pNH-Kan/oriT (Hengen
und Iyer, 1992, BioTechniques 13: 57–62) enthält, wurde stumpfendig an das
3200-bp-PvuII-linearisierte pSEB23-Plasmid unter Bildung von pSEB26
ligiert. Die durch die BamHI-PvuII-Ligation regenerierte BamHI-Stelle wurde
durch Restriktion entfernt, wodurch Auffüllen der kohäsiven Enden
und Religation folgten.
-
Beispiel 7
-
Erhöhte
Produktion des Polysaccharids S-88 nach Einführung von Kopien von S88-DNA-Fragmenten
in den Stamm S88
-
Spezifische
Restriktionsfragmente des DNA-Segments, das in
1 gezeigt
ist, die aus dem Stamm S88 isoliert wurden, wurden durch DNA-Ligation
in Mehrfachkopie-Plasmidvektoren insertiert und in den Wildtypstamm
S88 und abstammende Nicht-mucoidmutanten von S88 durch das im obigen
Beispiel 2 beschriebene triparentale Konjugationssystem übertragen.
Die Polysaccharidsynthese wird durch die klonierte DNA, wenn sie
in die Mutanten übertragen
wird, wiederhergestellt. Die Mengen von Sphinganexopolysacchariden, die
durch die rekombinantes Plasmid enthaltenden Stämme und Stämme, denen die zusätzlichen
Plasmidgene fehlten, angesammelt wurden, wurden nach Kultivieren
der Bakterien in flüssigem
Medium ermittelt. Nach 24 ständiger
Zucht bei 30°C
unter Schütteln
in Prallblechkolben wurden zwei Volumina Isopropylalkohol zur Fällung der
Exopolysaccharide zugesetzt. Zwei bis drei unabhängige Kulturen wurden für jeden
Stamm getestet. Die Niederschläge
wurden auf Filtern gewonnen, bei 80°C getrocknet und gewogen. Das
mittlere Gewicht des Niederschlags und die Standardabweichung sind
für jeden
Stamm im Folgenden in Tabelle 2 angegeben. Die rekombinanten Stämme, die
zusätzliche
Kopien der klonierten Gene trugen, produzier ten mehr Sphingan S-88
als Wildtypstämme,
die nur den normalen Satz von Biosynthesegenen tragen. Tabelle 2
Wirt | Plasmid | Isopropylalkoholfällung Trockengewicht
(mg) und Standardabweichung | relatives
Gewicht |
S88 | - | 105 ± 9 | 1,0 |
S88m265 | pRK311-S88c1Δ3 | 148 ± 16 | 1,4 |
S88m265 | pRK311-S88c2 | 175 ± 16 | 1,7 |
S88m265 | pRK311-S88c3 | 160 ± 7 | 1,5 |
S88m265 | pRK311-S88c4 | 123 ± 14 | 1,2 |
S88m265 | pSEB24-S88H15.6 | 162 ± 5 | 1,5 |
S88m265 | pSEB24-S88B8.6 | 194 ± 7 | 1,8 |
S88m265 | pSEB24-S88E4.5 | 154 ± 36 | 1,5 |
S88 | - | 114 ± 12 | 1,0 |
S88#78 | pRK311-S88c1Δ3 | 171 ± 2 | 1,5 |
S88#78 | pRK311-S88c2 | 179 ± 7 | 1,6 |
S88#78 | pRK311-S88c3 | 200 ± 9 | 1,8 |
S88#78 | pRK311-S88c4 | 189 ± 10 | 1,7 |
S88#78 | pSEB24-S88c5 | 151 ± 4 | 1,3 |
S88#78 | pSEB24-S88E6.6 | 171 ± 35 | 1,5 |
S88#78 | pSEB24-S88E12.8 | 114 ± 10 | 1,0 |
-
Dem
erfahrenen Praktiker ist klar, dass die Restriktionskarte und Nucleotidsequenz
des spsB-Gens und der umgebenden DNA ausreichende Information zur
Konstruktion von zahlreichen zusätzlichen
Subfragmenten der Region von etwa 32 kb durch Standard-Gentechnikverfahren
liefern ( 8). Diese zusätzlichen Fragmente
können
durch die hier beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Segmenten,
die auch eine ähnliche
Zunahme der Produktion von Sphinganpolysacchariden bewirken, getestet
werden. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass eine kleine Fraktion
der Subsegmente (beispielsweise pSEB24-S88E12.8) keine signifikante Stimulation
der Produktion zeigt. Indessen bewirken tatsächlich alle Subsegmente die
erhöhte
Polysaccharidansammlung. Aufgrund unserer bisherigen Tests nehmen
wir an, dass pSEB24-S88B8.6 und pRK311-S88c3 den größten Stimulus
zur Sphinganproduktion liefern.
-
Die
erhöhte
Produktion erfordert nicht das Vorhandensein von Antibiotika in
der Kultur, um eine Selektion auf die rekombinanten Plasmide aufrechtzuerhalten.
-
Die
erhöhte
Produktion kann das Ergebnis einer Insertion von einem oder mehreren
DNA-Fragmenten, vorzugsweise mit Codierung für ein Gen oder einen Satz von
Genen von diesem Chromosomensegment in das Chromosom oder endogene
native Plasmide sein. Ein Fachmann üblicher Erfahrung kann ohne
weiteres zusätzliche
DNA-Fragmente in ein sphinganproduzierendes Bakterium durch Insertion
von DNA-Fragmenten, die relevante sphinganproduzierende Gene enthalten,
in das bestehende Bakterienchromosom, in endogene native Plasmide
oder in exogene Plasmidvektoren einführen. Es ist anzumerken, dass
die Ergebnisse, die in dieser Anmeldung belegt sind, zeigen, dass
eine erhöhte
Sphinganproduktion nicht von der Verwendung eines speziellen Plasmidvektors
abhängig
ist.
-
Ebenfalls
innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt die Fusion
von einem der oben beschriebenen DNA-Fragmente mit Codierung für Gensegmente
oder Gruppen von Genen mit DNA-Sequenzen, für die bekannt ist, dass sie
die Genexpression kontrollieren, beispielsweise und ohne Beschränkung dem lac-Promotor
von Escherichia coli.
-
Beispiel 8
-
Identifizierung von Exopolysaccharid,
das durch rekombinante S88-Stämme
produziert wird, als Sphingan-S88
-
Um
zu verifizieren, dass das durch die gentechnisch veränderten
Stämme
produzierte Exopolysaccharid das gleiche wie der Empfängertyp
war, identifizierten wir die Monosaccharide in Säurehydrolysaten durch Dünnschichtchromatographie.
-
Extrazelluläres Xanthan
von X. campestris und Sphingan S-88 von Sphingomonas wurden aus
flüssigem
Kulturmedium durch Fällung
mit 2–3
Volumina Isopropylalkohol abgetrennt, bei 80°C getrocknet und gewogen. Die
Polysaccharide wurden in Wasser für Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) mit 5 mg/ml resuspendiert. Wasserfreie Trifluoressigsäure (88 μl, von Sigma
Chemical Co.) wurde mit 75 μl
HPLC-Wasser (Baker) und 225 μl
Polysaccharid (5 mg/ml) in einem 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gemischt
und 16 h bei 95°C
inkubiert. Die Hydrolysate wurden unter Vakuum getrocknet, in 200 μl HPLC-Wasser
resuspendiert, in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, erneut getrocknet
und in 45 μl
HPLC-Wasser resuspendiert. Die Proben (25 μg/ml) konnten gefroren aufbewahrt
werden. Zuckerstandards (D-Glucose, D-Glucuronsäure, D-Mannose, L-Mannose,
L-Rhamnose und L-Fucose) wurden in HPLC-Wasser mit 4 mg/ml resuspendiert. Vorbeschichtete,
Kanäle
aufweisende Silicagelchromatographieplatten (Kieselgel 60 CF 254,
10 × 20
cm, E. Merck) wurden über
Nacht in 0,3 M NaH2PO4 getränkt, 30
min bei Raumtemperatur und dann 10 min bei 95°C getrocknet. Proben von 1–2 μl wurden
als Punkte aufgetragen und das Chromatogramm wurde einem steigenden
Lösemittelgemisch
von 40 ml Aceton, 5 ml Butanol und 5 ml entionisiertem Wasser 2,5
bis 3 h bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die Platte wurde 3 min bei
65°C getrocknet
und dann durch Tauchen in eine Lösung von
25 ml Aceton, 0,5 ml Anilin, 0,5 g Diphenylamin und 3,75 ml Phosphorsäure gefärbt, worauf
30 min bei 95°C
getrocknet wurde. Wenn X. campestris der Empfänger der S88-DNA-Fragmente
war, waren Glucose, Mannose und Glucuronsäure vorhanden. Wenn der Sphingomonas-Stamm S88 der Empfänger für das gumD-Gen
von X. campestris war, dann waren Rhamnose, Glucose, Mannose und
Glucuronsäure
in dem S-88-Exopolysaccharid ähnlichen
Mengen vorhanden.
-
Beispiel 9
-
Stimulierung der Produktion der Sphingane
S-88, S-60 und NW-11
durch DNA-Fragmente, die von den Stämmen S88, S60 und NW11 erhalten
wurden
-
Die
DNA-Fragmente, die von den Stämmen
S88, S60 und NW11 nach dem in den obigen Beispielen 5, 6 und 7 angegebenen
allgemeinen Verfahren erhalten wurden, wurden zum Erhöhen der
Produktion der Sphingane S-88, Gellan (S-60) und NW-11 in Sphingomonas-Stämmen verwendet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Wirt | Plasmid | Isopropylalkoholfällung Trockengewicht
(mg) und Standardabweichung | relatives
Gewicht |
S88 | pRK311 | 98 ± 5 | 1,0 |
S88 | pRK311-S88c2 | 155 ± 24 | 1,6 |
S88 | pRK311-S60c2 | 133 ± 11 | 1,4 |
S88 | pRK311-NWc2.2 | 165 ± 15 | 1,7 |
S60 | pRK311 | 49 ± 11 | 1,0 |
S60 | pRK311-S88c2 | 73 ± 2 | 1,5 |
S60 | pRK311-S60c2 | 74 ± 2 | 1,5 |
S60 | pRK311-NWc2.2 | 55 ± 6 | 1,1 |
NW11 | pRK311 | 98 ± 5 | 1,0 |
NW11 | pRK311-S88c2 | 105 ± 6 | 1,2 |
NW11 | pRK311-S60c2 | 124 ± 5 | 1,4 |
NW11 | pRK311-NWc2.2 | 100 ± 1 | 1,2 |
-
In
dem generellen Ansatz können
DNA-Fragmente, die aus einem speziellen Stamm von Sphingomonas isoliert
wurden, zum Erhö hen
der Produktion eines Sphingans (das nicht von diesem Stamm produziert wird)
in einen unterschiedlichen Stamm von Sphingomonas durch Insertion
der isolierten DNA-Fragmente in mehreren Kopien nach den Techniken
und Verfahren, die in den obigen Beispielen und insbesondere Beispiel 7
angegeben sind, verwendet werden.
-
In
dem generellen Ansatz, der durch das vorliegende Experiment gestützt wird,
kann ein DNA-Fragment, das für
die Produktion von Sphingan in einem beliebigen Sphingomonas-Stamm
wesentliches genetisches Material enthält, in einen entsprechenden
Plasmidvektor oder anderes insertiert und in mehreren Kopien in
eine sphinganproduzierende oder nicht-mucoide Mutante des gleichen
oder eines verschiedenen Sphingomonas-Stamms, aus dem die DNA isoliert wurde,
der ein Sphinganproduzent ist oder eine nicht-produzierende Mutante
des sphinganproduzierenden Stamms ist, eingeführt werden. Der erhaltene,
gentechnisch veränderte Sphingomonas-Mikroorganismus
produziert Sphingan in Mengen, die generell die durch den nicht
gentechnisch veränderten,
nicht-mutierten Sphinganproduzenten unter identischen Fermentationsbedingungen
produzierte Menge übersteigen.
-
Die
folgenden Experimente werden angegeben, um zu zeigen, dass die Einarbeitung
von mehreren Kopien von DNA-Fragmenten
in Stämme
von Sphingomonas sowie andere Bakterien Routine ist.
-
Beispiel 10
-
Insertion von Lactoseverwendungsgenen
in das Chromosom von X. campestris
-
Unter
Verwendung von Standardklonierungsverfahren, die Restriktionsenzyme
und DNA-Ligation umfassen, insertierten wir die Lactoseverwendungsgene
von einem Transposon, Tn951, angrenzend an ein zuvor kloniertes
Segment von X. campestris-DNA, das auf einem Plasmid getragen wird,
das in X. campestris nicht replizieren kann. Thorne et al., J. Indust.
Microbiol., 3, 321 (1988). Das rekombinante Plasmid wurde dann durch
Konjugation in X. campestris übertragen.
In dem Empfängerbakterium
rekombinierte die homologe DNA von X. campestris, die angrenzend
zu Lactoseverwendungsgenen lokalisiert ist, mit der zellulären DNA
durch normale homologe Rekombination unter Verwendung der Lactoseverwendungsgene,
so dass sie an das Bakterienchromosom gebunden und mit diesem fortlaufend
war. Das Ergebnis war die stabile Insertion des klonierten Segments
in das Bakterienchromosom. Dies wird durch das Diagramm in dem Papier
vollständiger
erklärt.
Der gleiche Ansatz der Insertion von Genen in Bakterien wurde von
anderen bei zahlreichen Gelegenheiten verwendet.
-
Es
ist anzumerken, dass es nicht notwendig ist, ein Plasmid als Vektor
zur Einführung
von exogener DNA in ein Bakterium vor der oben beschriebenen DNA-Rekombination
zu verwenden. Es ist auch bekannt, dass von Bakteriophagen oder
Transposons getragene DNA-Segmente sich selbst in das Bakterienchromosom
durch positionsspezifische DNA-Rekombination insertieren. Üblicherweise
insertieren sich Bakteriophagen spezifisch an einem oder einigen
wenigen Orten, während
Transposons üblicherweise
an zahlreichen, im Wesentlichen willkürlichen Orten insertiert werden.
Ferner ist es nicht notwendig, dass die DNA an einen Klonierungsvektor,
wie ein Plasmid, gebunden in die Zelle getragen wird. Es ist bekannt,
dass DNA-Fragmente durch Transformation in Bakterienzellen eindringen
können
und die Fähigkeit
zur Rekombination mit der zellulären
DNA beibehalten können.
-
Beispiel 11
-
Positionsspezifische Insertion eines Gens
mit Codierung für
Resistenz gegenüber
Kanamycin in bakterielle DNA von Sphingomonas S88 an mehreren verschiedenen,
willkürlich
ausgewählten
Orten
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass es Routine ist, Segmente klonierter DNA in
die zelluläre
DNA von Sphingomonas zu insertieren. Zunächst wurde das X88E12.8-Fragment
(siehe 1) in die EcoRI-Stelle in der
multiplen Klonierungsstelle des Plasmidvektors pSEB26 (7)
ligiert. Das Plasmid pSEB26 weist das Ampicillin-Resistenzgen, Chloramphenicol-Resistenzgen, die
multiple Klonierungsstelle, das Lac-Segment und den oriT wie in Plasmid
pSEB24 (auch in 7 gezeigt) auf. Es unterscheidet
sich jedoch dadurch, dass es einen Replikationsursprung eines engen
Wirtsbereichs von dem Plasmid pBR322 anstelle der oriV-Sequenz eines breiten
Wirtsbereichs des Plasmids pSEB24 aufweist. Der pBR322-Ursprung ermöglicht eine
Replikation des Plasmids in Escherichia coli, jedoch nicht in Sphingomonas.
Daher besteht der einzige Weg dafür, dass in das Plasmid pSEB26
klonierte DNA-Sequenzen in Sphingomonas bestehen können, darin,
dass sie in die bakterielle DNA, beispielsweise das Chromosom oder
endogene Plasmide, integriert werden, bevor das Plasmid aus der
Zelle oder Kultur verloren geht. Zweitens wurde durch Routineverfahren
das pSEB26-S88E12.8-Plasmid einer Mutagenese mit dem Transposon
mini-Tn10kan (1991, Kleckner et al., 204, S. 139–180) unterzogen. Eine Mutagenese
durch Transposition in dem nicht unterdrückenden Wirt HMS174 erfolgte
mit dem Tn10-Derivat 103 (mini-Tn10kan/Ptac-ATS-Transposase),
das von dem Lambda-Bakteriophagen
NK1316 getragen wird. Das Ergebnis war die Insertion eines Kanamycin-Resistenzgens
in das Plasmid. Wir isolierten mehrere unabhängige Insertionen des Kanamycin-Resistenzgens
jeweils an einem unterschiedlichen Ort innerhalb des S88E12.8-Segments.
Drittens übertrugen
wir unter Verwendung des Triparental Mating-Schemas jedes der re kombinanten
Plasmide getrennt in Sphingomonas S88 und selektierten auf Kanamycin-resistente
Nachkommen. In tatsächlich
jedem Fall rekombinierten die S88-DNA-Sequenzen, die auf einer der
beiden Seiten des Kanamycin-Resistenzgens lokalisiert waren, mit
dem Chromosom der Empfängerzelle
derart, dass das Kanamycin-Resistenzgen in das Bakterienchromosom
integriert wurde. Durch Integration in das Bakterienchromosom konnte
das Gen die Unfähigkeit
des Vektorplasmids zur Replikation in Sphingomonas überleben.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass exogene DNA-Segmente (in diesem Fall das Kanamycin-Resistenzgen)
in einen Empfänger
so eingeführt
werden können,
dass das eintretende Gen in das Bakterienchromosom integriert wird.
Der Ort der Integration wird durch die DNA-Sequenzen, die dem Gen
benachbart sind, bestimmt. In diesem Fall integrierte das exogene
Gen in verschiedene Stellen innerhalb des E12.8-Segments des Stamms
S88. Die Integration durch homologe Rekombination ist ein routinemäßig durchgeführtes Verfahren der
Genmanipulation.
-
Beispiel 12
-
Weitere DNA-Sequenzierung und Analyse
-
Beide
DNA-Stränge
wurden zwischen den BamHI-Stellen bei 1 und 28804 bp, wie in 8 gezeigt
ist, sequenziert. Das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren von
Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 5463–5467) wurde
zur Sequenzierung gruppierter Deletionen, die in pBluescriptIIKS(+)
mit Exonuclease III und S1-Nuclease erzeugt wurden, verwendet. Interne
Sequenzierungsprimer wurden ebenfalls verwendet. Die Sequenzen wurden
mit den Programmen SuperClone und SuperSee von Coral Software (San Diego)
und durch das Verfahren von Kyte und Doolittle (Kyte und Doolittle,
J. Mol. Biol. 157: 105–132)
für membrandurchspannende
Proteindomänen
analysiert. Homologe Proteinsegmente wurden in der Sammeldatenbibliothek
am NCBI mit dem "blastp"-Programm (Altschul
et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410) identifiziert. DNA-Hybridisierung
erfolgte durch Standardverfahren unter Verwendung von Nylonmembranen
und dem GeniusTM 1 Kit (Boehringer Mannheim).
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Beispiel 13
-
Klonierung von an der Biosynthese von
Sphingan S88 beteiligten Genen
-
Dieses
Beispiel folgt einigen der Lehren von Beispiel 2. Wir ermittelten
früher,
dass die meisten sphinganpolysaccharid-negativen (Sps–)
Mutanten des Sphingomonas-Stamms S88 auf Bacitracin enthaltenden YM-Platten
wachsen (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237).
Kartierungsexperimente (die später beschrieben
sind) platzierten alle diese Mutation in ein Gen, das wir spsB nannten.
Die in 11 aufgelisteten repräsentativen
SpsB–-Mutationen
(260, 265 und 102w) waren ebenfalls Bacitracin-resistent (Bacr). Umgekehrt war der bac8-Stamm typisch
für Mutanten,
die zunächst
als Bacr selektiert wurden und die sich
dann als Sps– erwiesen.
Wie in Beispiel 2 angegeben führte
hierbei der Fehlschlag, Sphingan S-88 durch die Sps– Bacr-Mutanten herzustellen, zu einem Aussehen
der Kolonien, das flacher, von rauer Oberfläche und durchscheinend im Vergleich
zu Wildtypkolonien, die auch von einem engen lichtbrechenden Halo
umgeben waren, wenn sie gegen das Licht gehalten und von unten betrachtet
wurden, war. Den Sps–-Mutanten gelang es
auch nicht, Sphingane in flüssiges
YM-Medium zu sezernieren, was durch das Fehlen von durch Alkohol
fällbaren Exopolysacchariden
beurteilt wurde. Eine kleine Fraktion der Sps– Bacr-Mutanten trug zweite Mutationen. Beispielsweise
waren Kolonien der Mutante 102w eher weiß als gelb. Die Mutante 134
wies eine Mutation in dem rhsD-Gen zusätzlich zu spsB auf. Und die
Mutanten 54 und 302 wiesen Defekte im Hinblick auf spsK sowie spsB
auf. Die Sps–-Mutationen,
die unmittelbar über
der Genkarte in 11 angegeben sind, waren entweder spontan
oder wurden nach Einwirken von Ultraviolettlicht oder Ethylmethansulfonat
erhalten. Alle hier untersuchten anderen Mutationen (die in 11 mit dem Vorsatz "Y" oder "B" angegeben sind) waren das Ergebnis von
willkürlichen
Insertionen des Transposons mini-Tn10kan.
-
Wir
konstruierten eine Bibliothek von Genen aus dem Sphingomonas-Stamm
S88 in dem Cosmid eines breiten Wirtsbereichs pRK311 und übertrugen
die gepoolten Klone von E. coli auf S88m260 durch Konjugationsverbindung.
Jedoch erschienen wiederholt keine Sps
+-Kolonien
unter den 10
3 bis 10
4 gescreenten
Tet
r-Exkonjuganten. Wir übertrugen dann die Bibliothek
auf zuvor isolierte Bac
r Gum
– (gumD)-Mutanten
von X. campestris (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237; und
Thorne et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 3593–3600). Es ist erforderlich,
dass das gumD-Gen Glucose-6-phosphat von UDP-Glucose auf Isoprenylphosphat als erste
Stufe beim Zusammenbau von Xanthangummi überträgt (Capage et al., Oktober
1987, internationales Patent
WO87/05938 ,
und Ielpi et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 2490–2500). Wir dachten, dass der Zusammenbau
von Sphingan S-88 wahrscheinlich auch mit Glucose begann und dass
es für
das Enzym von Sphingomonas möglich
sein könnte,
die Bac
r Gum
–-Mutanten
in X. campestris zu komplementieren, da DNA-Segmente, die das gumD-Gen
von X. campestris enthalten, die Synthese von Sphingan S-88 in Bac
r Sps
–-Mutanten von Sphingomonas
wiederherstellen konnten. (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6229–6237).
Bei den intergenerischen Verbindungen fanden wir Gum
+-Kolonien
von X. campestris auf YM-Platten mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro 10
3 bis 10
4 Tet
r-Exkonjuganten.
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Plasmide
wurden aus den komplementierten X. campestris-Mutanten durch Transformation von E.
coli gereinigt und dann in die Sphingomonas S88-Mutante 260 eingebunden.
Etwa 5–25%
der Exkonjuganten wurden Sps+. Die Häufigkeit
einer Übertragung
für den
Vektor allein (pRK311) war 100- bis 1000- fach höher als für die größeren rekombinanten Plasmide.
Obwohl die meisten der rekombinanten Plasmide ausgedehnte Deletionen
erlitten, wenn sie in Sphingomonas eingebaut wurden, wurde eines
intakt gewonnen und für
die anschließenden
Arbeiten verwendet: pRK311-S88c1. Die äußersten linken 21 kbp von S88c1
sind in 1, 8 und 11 als
Subklon c1Δ3
angegeben. Das Plasmid pRK311-S88c1 stellte auch die Polysaccharidsynthese
für mehrere
andere, unabhängig
voneinander isolierte Bacr Sps–-Mutanten
von Stamm S88 und Bacr Gum– Mutanten
von X. campestris wieder her. Wir isolierten die Polysaccharide,
die in das Kulturmedium durch die Exkonjuganten für jede intergenerische
Verbindung sezerniert wurden, und verifizierten durch Dünnschichtchromatographie,
dass Säurehydrolysate
die neutralen Zucker enthielten, die für das Polysaccharid der Empfängerzelle
erwartet wurden. Exopolysaccharid von der Sphingomonas-Mutante 260,
die das Plasmid pRK311-S88c1 trägt,
enthielt Glucose, Mannose und Rhamnose, während X. campestris m31 mit pRK311-S88c1
nur Glucose und Mannose enthielt. Jedes Polysaccharid enthielt auch
Glucuronsäure,
obwohl die Gewinnung des sauren Zuckers aufgrund der Hydrolysebedingungen
systematisch niedrig war.
-
Wir
verlängerten
die klonierte Region nach links in 11 durch
Screening der Bibliothek auf Segmente, die die Sps– Bacr-Mutanten 76 und 78 komplementierten. Wir
screenten 104 bis 106 Exkonjuganten
und erhielten vier weitere Klone (S88c2, c3, c4 und c5), die das
S88c1-Segment partiell überlappten. Ähnlich wurde der
Klon c6 durch Komplementierung der Sps–Mutanten
43, 71 und 104 isoliert. Die fünf
klonierten Segmente wiesen jeweils eine Länge von etwa 22–28 kb auf
und mindestens ein Ende jedes Segments ist in 11 gezeigt. Wir identifizierten einen Satz von
etwa 15 Sps–-Mutationen,
die weder durch den Klon c2 noch den Subklon c1Δ3 komplementiert wurden. Keine
dieser Mutationen wurde durch den c1-Klon voller Länge, der
sich um etwa 8 kbp gegenüber
c1Δ3 weiter
nach rechts erstreckt, komplementiert und keine wurde durch c6,
das sich um etwa 18 kbp links von c2 in 3 erstreckt,
komplementiert. Der Satz "nicht
verknüpfter" Mutationen legt
zusätzliche
Gene nahe, die für
die Sphingansynthese wesentlich sind, jedoch nicht unmittelbar angrenzend
an den in 11 gezeigten Cluster von Genen
sind.
-
Beispiel 14
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Kartierung der sps-Gene durch funktionale
Komplementierung
-
Die
Grenzen der spsG-, spsK-, spsF-, spsD-, spsC-, spsE-, spsB- und
rhsD-Gene wurden durch Komplementierungstests unter Verwendung der
Sps–-Punktmutanten
als Empfänger
im Hinblick auf die Konjugation bestimmt. Die Ergebnisse sind in 11 über
der Karte zusammengefasst. Rekombinante Plasmide, die kleine subklonierte
DNA-Segmente oder größere Segmente
trugen, wurden insertionaler Mutagenese mit mini-Tn10kan in E. coli unterzogen und dann
durch Verbindung in Sps–-Mutanten des Stamms
S88 übertragen. Zwei
verwendbare Plasmidvektoren eines breiten Wirtsbereichs wurden verwendet:
pRK311 und pSEB24 (7). Die Exkonjuganten, die
den Arzneistoffresistenzmarker des eintretenden Plasmids aufnahmen,
wurden dann auf der Basis des Aussehens der Kolonie als Sps+ oder Sps– bewertet.
Die Bacr Sps–-S88-Mutanten wurden
zunächst
auf den E4.5-Subklon kartiert und dann wurde das E4.5-Segment einer
insertionalen Zufallsmutagenese mit mini-Tn10kan ausgesetzt. Insertionen
in die Positionen B231 und B230 (11)
beeinflussten die Wiederherstellung der Sphingansynthese für die Mutante
260 nicht, jedoch blockten die Insertionen B233, B239 und B238 eine
Komplementierung. Die Mutante 134 wurde durch das Segment B8.6,
jedoch nicht durch entweder E4.5 oder E5.9 komplementiert. Die Mutante
134 weist einen Defekt in dem spsB-Gen und auch in dem nahegelegenen
rhsD-Gen auf. Der genauere Ort der rhsD-Mutation wurde durch Einwirken einer mini-Tn10kan-Mutagenese
auf das B8.6-Segment und Analysieren des Komplementierungsmusters
für die B441-,
B440-, B438-, B437- und B435-Insertionen bestimmt. Die Mutanten
54 und 302 schie nen auch doppelte Mutanten mit Defekten in den spsK-
und spsB-Genen zu sein. Die spsF-Mutanten (62, 68 und 94 von 11) wurden aufgrund des Fehlens einer Komplementierung
durch die Segmente B12.6 und c1Δ3
und durch Wiederherstellung der Synthese von Sphingan S-88 durch
die Klone c3 und c5 lokalisiert und von dem nahegelegenen spsDCE-Cluster abgetrennt.
Komplementierungsergebnisse für
die fortlaufenden spsD-, spsC- und spsE-Gene nach der insertionalen
Mutagenese des E6.6-Fragments sind ebenfalls in 11 angegeben. Die Komplementierungsergebnisse
schlugen zwei Gruppen vor: eine erste, die die Mutationen 76 und
78 umfasst, und eine zweite, die die Mutationen 69, 72, b104, 3,
9 und 41 umfasst. Eine spätere
Analyse der DNA-Sequenzen löste
die letztere Gruppe in zwei unterschiedliche fortlaufende Gene auf:
spsC und spsE. Die spsG-Mutationen (11, 43, 71, 81 und 104 von 11) wurden durch den c6-Klon und das B4.5-Subfragment
von Fragment B12.6 komplementiert (siehe 11).
Die insertionale Mutagenese des B12.6-Segments ergab die Plasmide
Y652, Y635, Y636, Y653, Y640 und Y641. Von diesen waren nur Y652
und Y641 zur Komplementierung der spsG-Mutanten fähig.
-
Beispiel 15
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Phänotypen
von mini-Tn10kan-Chromosomen- und Plasmidinsertionen
-
Segmente
von klonierter S88-DNA wurden an das verbindbare Camr-Plasmid
mit engem Wirtsbereich pSEB26 (11)
ligiert, einer Mutagenese durch mini-Tn10kan in E. coli ausgesetzt
und dann durch Konjugation in den Wildtyp(Sps+)-Sphingomonas-Stamm
S88 übertragen.
Die Plasmide waren zur Replikation in Sphingomonas nicht fähig, so
dass das Beibehalten des Kanr-Gens die Rekombination
mit dem Bakterienchromosom erforderte. Wir wählten nur die Rekombinanten,
die Kanr und Cams waren,
in der Erwartung, dass diese Gruppe keine Plasmidsequenzen zurückbehielt.
Obwohl wir die physikalischen Strukturen dieser DNA-Substitutionen
nicht verifi zierten, verwendeten wir routinemäßig die gleichen Plasmide,
Stämme
und Selektionsschemata zur Erzeugung positionsspezifischer chromosomaler
Deletionen (unterer Teil von 11)
und bestätigten
diese doppelten Rekombinationsereignisse durch Restriktionskartierung
und DNA-Hybridisierung. Kolonien der Kanr Cams-Chromosomenrekombinationen wurden als Sps+ oder Sps– beurteilt
(im oberen Teil von 11 für Insertionen, die mit einem
vorangestellten "c" markiert sind, gezeigt).
Für die
Mutanten, die einen Sps–-Phänotyp zeigen (cY776, cY757,
cY771, cY770, cY676, cB589, cB583, cB580, cB579, cB300, cY726, cY725,
cY676, cY673, cY721 und cY602), war es sinnvoll, anzunehmen, dass
eine doppelte Rekombination auftrat. Jedoch war es für die Sps+-Rekombinanten möglich, dass das gesamte Plasmid
in das Chromosom in einer der homologen Regionen integrierte, was
zu einem defekten und einem normalen Gen in dem Chromosom führt.
-
Um
die Ungewissheit einer doppelten Rekombination zu vermeiden, erzeugten
wir große
positionsspezifische Deletionen in dem Chromosom und führten dann
replizierende Plasmide, die entweder die S88c2- oder S88c3-DNA-Segmente
mit einzelnen mini-Tn10kan-Insertionen zur Inaktivierung bestimmter
Gene trugen, ein. Die Positionen und Sps+-
oder Sps–-Phänotypen
der Insertionen sind in der Nähe
des oberen Teils von 11 durch das voranstehende "p" angegeben. Die Ergebnisse der chromosomalen
und Plasmidmutationsstrategie passen zueinander und sowohl essentielle
(–) als
auch nicht-essentielle
(+) Regionen wurden beobachtet.
-
Beispiel 16
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DNA-Sequenz: G + C-Gehalt, Verwendung
von seltenen Codons und Translationsstartsequenzen
-
Die
DNA-Sequenz von 28804 bp wurde für
beide Stränge
bestimmt (siehe 14). Ein Durchschnittsprofil
(und Standardabweichung) für
ein typisches Sphingomonas-Gen in diesem Cluster wurde auf der Basis der
gedrehten G + C-Gehalte, der Häufigkeiten
seltener Codons und von "Shine-Dalgarno"- oder Translationsinitiationssequenzen
bestimmt (Tabelle 4). Eine hohe Häufigkeit von G oder C in der
dritten Codon-Position war für
jedes der Gene typisch. Ein Satz von selten verwendeten Codons für Sphingomonas
wurde in frühen Arbeiten
durch Analyse von 2500 Codons aus den rhsACBD-Operon und den spsB,
D-, C- und E-Genen identifiziert. Jedes seltene Codon in den Sets
war mit weniger als 0,2% der Gesamtmenge vorhanden und diese umfassten:
AGA, AGG, CGA, TGT, GGA, ATA, CTA, TTA, TTG, AAA, TTT, CCA, CCT,
AGT, TCA, TCT, ACA und ACT. Die Translation beginnt üblicherweise
in E. coli angrenzend an eine und strangabwärts einer Sequenz, die komplementär zum 3'-Terminus von 16S-rRNA
ist (Shine und Dalgarno, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 71: 1342).
Die analoge "Shine-Dalgarno"-Sequenz, die komplementär zu 16S-rRNA
in S. paucimobilis DSM1098 ist, ist TAAGGAGGTG (Moore et al., 1993,
Lett. Appl. Microbiol. 17: 115–118).
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Wenn
ein Gen in diesem Cluster zum Durchschnittsgenprofil passte und
unter Bildung eines Sps–-Phänotyps mutiert werden konnte,
erhielt es eine "sps"-Bezeichnung. Jedoch
ergab unsere Suche nach Proteinähnlichkeiten
keinen signifikanten Hinweis auf mögliche Funktionen der spsG-,
I- und F-Gene. Zusätzlich
gab es vier weitere offene Leseraster, die das typische Genprofil
erfüllten
und keine signifikante Ähnlichkeit
mit Proteinsequenzen in Computerdatenbanken zeigten. Da jedoch Mutationen
in diesen vermutlichen Genen die Polysaccharidsynthese nicht sichtbar änderten,
wurden sie mit "Urf" für unidentifiziertes
Leseraster markiert. Es gab vier Urf-Sequenzen (32, 26, 31 und 34),
die nach der Größe des abgeleiteten
Proteins in Kilodaltons benannt wurden.
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Tabelle
4. Profile von sps-Genen
-
Die
unter "vermutliche
Translationsstartsequenzen" aufgelisteten
Sequenzen sind der Reihe nach SEQ ID NO: 2 bis 26.
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Beispiel 17
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Identifizierung von Glucosyl-IP-Transferase
als spsB-Gen
-
Die
meisten der Sps–-Mutationen, die nach
einer Ultraviolett- oder
chemischen Mutagenese isoliert wurden, befanden sich im spsB-Gen.
Es wird angenommen, dass das SpsB-Protein die erste Stufe beim Zusammenbau
von Sphingan S-88 wegen der überraschenden Ähnlichkeit
der abgeleiteten Aminosäuresequenz von
SpsB mit anderen Genprodukten, von denen angenommen wird, dass sie
für Glycosyl-IP-Transferasen
codieren, katalysiert. 12 zeigt
ein Alignment von Aminosäuresequenzen
von vermuteten Glucosyl- und Galactosyl-IP-Transferasen. Es besteht
beträchtliche
Homologie für
die C-terminalen Hälften
dieser Proteine. Obwohl den N-terminalen Regionen diese extensive
Homologie fehlt, ist das SpsB-Protein dem RfbP-Protein von S. enterica
(Jiang et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 695–713) dadurch ähnlich,
dass es mehrere hydrophobe Regionen aufweist, die membrandurchspannende
Domänen
nahelegen (in 12 unterstrichen). Die hydrophen
Domänen
von SpsB umfassen die Aminosäuren
35–59
(mittlere Hydropathie +2,2), 68–86
(+1,7), 105–123
(+2,3) und 282–303
(+2,9). Die Position des letzteren hydrophoben Segments war diesen
verwandten Genprodukten gemeinsam und war in der Mitte des Proteins
angrenzend an die Region größter Homologie lokalisiert.
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Die
von der DNA-Sequenz abgeleitete spsB-Codierungsdomäne wurde
durch Komplementierungsuntersuchungen bestätigt. Wir beobachteten, ob
verschiedene Insertionen von mini-Tn10kan in dem E4.5-Segment die
Komplementierung von Bacr Sps–-Mutanten störten oder
nicht. Die Stellen einer Insertion von mini-Tn10kan und "+"- oder "–"-Komplementierungsergebnisse
sind über
dem spsB-Gen in 11 angegeben. Drei mini-Tn10kan-Insertionen
ergaben keine Wiederherstel lung der Sphingansynthese an der Sps–Mutante S88m260
(B233, B239 und B238), während
mehrere flankierende Insertionen, die B231 und B230 umfassten, deren
Fähigkeit
zur Lieferung der fehlenden Funktion beibehielten.
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Beispiel 18
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Rhamnose-Biosyntheseoperon von Sphingomonas
S88
-
Die
abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der Proteine, die durch die rhsACBD-Gene codiert werden, waren sehr ähnlich Enzymen
von S. enterica Gruppe B und X. campestris, die dTDP-L-Rhamnose in vier
Stufen aus dTTP und Glucose-1-phosphat synthetisieren (13). Wir übernahmen die bereits bestehende
Nomenklatur mit Glucose-1-phosphat-thymidylyltransferase, die durch
das rhsA-Gen codiert wird, und die aufeinanderfolgenden katalytischen
Stufen, die durch die rhsB-, C- und D-Gene codiert werden. Jedoch
war das Sphingomonas-Operon in vierfacher Hinsicht einzigartig.
Erstens war die Reihenfolge der Gene ACBD → von entweder S. enterica (BDAC →) oder X.
campestris (BACD →)
verschieden. Zweitens waren intercistronische Regionen fast nicht
vorhanden. Start- und Stopcodons überlappten oder waren eng beabstandet:
rhsA-ATGA-rhsC-TGATCCATG-rhsB-TGATG-rhsD. Drittens war der mittlere
G + C-Gehalt für
das rhsACBD-Operon (66%) relativ hoch, insbesondere in der dritten
Codonposition (89%), und über
das Operon gleichförmig.
Und viertens stimmte der hohe G + C-Gehalt mit den umgebenden Genen
in dem Cluster und nicht verwandten Genen von anderen Sphingomonas-Arten überein.
-
Zunächst wurde
nur eine Mutation (# 134) innerhalb des rhs-Clusters isoliert und sie trat gleichzeitig mit
einer zweiten Mutation in dem spsB-Gen auf. Wir berücksichtigten
die Möglichkeit,
dass Rhs–-Mutationen letal
sein könnten.
Daher testeten wir, ob Einzelmutationen, die spezifisch innerhalb
des rhs-Clusters technisch erzeugt wurden, die Sphingansynthese
blockieren oder nicht. Wir konstruierten zunächst eine S88-Mutante mit einer
großen
Chromosomendeletion (ΔTn365
in 11), die die spsD- bis rhs-Gene durchspannt, und
führten dann
Plasmide ein, die die fehlende DNA, jedoch mit mini-Tn10kan-Insertionen
an speziellen Stellen, trugen. Wenn die Insertionen in den Plasmiden
innerhalb des spsD-, C-, E-, B- oder rhs-Operons lokalisiert waren,
blieben die Zellen Sps–. Jedoch störten Insertionen
innerhalb von entweder Urf32, 26, 31, 34, atrD oder atrB die Komplementierung
der Deletionsmutation nicht und die Zellen wurden Sps+.
-
Beispiel 19
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Glycosyltransferasen von Sphingomonas
S88
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Drei
Gene codieren wahrscheinlich für
Glycosyltransferasen: spsQ, spsK und spsL. Jedoch konnten die Zuckerspezifitäten für diese
Transferasen nicht durch Sequenzanalyse allein bestimmt werden,
da die Proteine nur beschränkte
lokale Homologien zu anderen Glycosyl- und Rhamnosyltransferasen
zeigten. Wie von anderen angegeben, sind die Glycosyltransferasen
selbst für
Enzyme aus einem einzigen Bakterium, die die gleichen Zucker in
einer identischen Verknüpfung
anbringen, sehr divergent (Glucksman et al., 1993, J. Bacteriol.
175: 7045–7055).
Das abgeleitete spsQ-Genprodukt war ähnlich dem orf11 angrenzend
an gnd in E. coli K-12, wofür
angenommen wird, dass es für
eine Rhamnosyltransferase codiert, (Stevenson et al., 1994, J. Bacteriol.
176: 4144–4156)
und auch ähnlich
den ExoO- und ExoU-Glucosyl-Transferasen von R. meliloti (Reuber
und Walker, 1993, Cell, 74: 269–280).
Das spsQ-Gen war essentiell für
die Sphingan-S-88-Synthese. mini-Tn10kan
wurde in das spsQ-Gen (Z206 in 11)
auf einem Plasmid, das das S88c2-Segment trägt, insertiert und das mutierte
Plasmid wurde dann in S88-Zellen, die eine chromosomale Deletion
der spsGSRQI-Gene tragen, eingeführt.
Die Empfängerzellen
waren lebensfähig,
doch war die Polysaccharidsynthese blockiert. Das abgeleitete spsL-Genprodukt
war ähnlich
dem spsQ-Produkt, wenn ein Vergleich durch eine Punktmatrixanalyse
durchgeführt
wur de, und es zeigte eine lokale Ähnlichkeit zu einer Rhamnosyltransferase (RfbN)
von S. enterica und einer vermutlichen Abequosyltransferase von
Yersinia pseudotuberculosis (Liu et al., 1995, J. Bacteriol., 177:
4084–4088).
Recherchen nach spsK ähnlichen
Proteinen ergaben nur marginale Ähnlichkeiten,
wofür vorherrschende
Mitglieder Glycosyltransferasen waren, die eine gemeinsame vermutliche
Bindungsstelle für
UDP enthielten. Die mögliche
Beteiligung von UDP legt eine Glucosyl- oder Glucuronosyltransferase
nahe. Eine Mutante mit einer speziellen Insertion in dem spsK-Gen (pY882 in 14) sowie Nichtinsertionsmutanten 54 und
302 waren lebensfähig,
stellten jedoch kein Polysaccharid her.
-
Beispiel 20
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Sekretion von Polysaccharid von Bakterien
-
Gemeinsame
Strategien zur Sekretion von Polysacchariden von verschiedenen Bakterien
werden durch Sequenzähnlichkeiten
für essentielle
Genprodukte nahegelegt. Derartige Vergleiche (Tabelle 5) zeigten, dass
bis zu fünf
der sps-Gene an der Sekretion von Sphinganen beteiligt sein können: spsD,
C, E, J und S. Die in Tabelle 5 zusammengefassten Sequenzbeziehungen
gelten für
Proteine, für
die beträchtliche
Informationen gesammelt wurden, wie die in "Exo"-Proteine
von R. meliloti. Jedoch sind die Familien funktional verwandter
Proteine größer als
durch die Tabelle impliziert wird. Drei verschiedene Segmente des
SpsD-Proteins von 51, 29 und 22 Aminosäuren zeigten jeweils 29, 31
und 36 Prozent Identität
zu ExoF. Die benachbarten spsC- und spsE-Gene mit überlappenden
Start- und Stopcodons (TGATG) codieren für Proteine, die zwei verschiedenen
Domänen
innerhalb von ExoP ähnlich
sind. Die ähnlichen
SpsC-ExoP-Sequenzen umfassen ein Motiv (PX2PX4SPKX11GXMXG), das
vor kurzem an einer Kettenlängenbestimmung
für Bakterien-O-Antigene beteiligt
war (Becker et al., 1995, Mol. Bicrobiol., 16: 191–203). Drei
Segmente von SpsC mit 92, 30 bzw. 19 Aminosäuren waren 22, 30 und 42 identisch
zu ähnlich
angeordneten Sequenzen von der N-terminalen
Hälfte von
ExoP und zwei Segmente von SpsE mit 75 und 98 Aminosäuren waren
32 und 29% identisch zur C-terminalen
Hälfte
von ExoP. Drei Segmente von SpsS mit 37, 20 und 44 Aminosäuren waren
zu 38, 55 und 23 identisch zu ExoT. Das abgeleitete SpsJ-Protein
zeigte eine gewisse Ähnlichkeit
zu KpsT-, BexA- und ABC-Transportern durch das Teilen einer vermutlichen
nucleotidbindenden Domäne.
Obwohl das spsR-Gen für
die Sphingansynthese nicht erforderlich war, war dessen Genprodukt
Bakterien- und Pilzpolysaccharidlyasen entfernt ähnlich. Daher kann es zur Freisetzung
der Glucuronsäure
enthaltenden Sphingane von entweder zellulären oder Substratoberflächen oder
zur Wiederverwendung des Polymers als Kohlenstoffquelle wichtig sein.
-
Wie
in
11 gezeigt ist, waren spontane Punktmutationen
und mini-Tn10kan-Insertionen in den SpsD-, spsC-, spsE- und spsS-Genen lebensfähig, jedoch
sammelten sie kein Sphingan S-88 in Kulturüberständen an. Im Gegensatz dazu
waren Mutationen in analogen Genen von R. meliloti (Harding et al.,
1993, J. Gen. Microbiol., 139: 447–457) und X. campestris letal.
mini-Tn10kan-Chromosomeninsertionen in dem spsJ-Gen waren auch Sps
–.
Jedoch waren mini-Tn10kan-Insertionen
in SpsJ, die auf einem Mehrfachkopieplasmid in einem mutierten Stamm
mit einer großen
Chromosomendeletion gehalten wurden, entweder Sps
+ oder
Sps
–. Tabelle 5. Ähnlichkeiten von Sekretionsproteinen
Bakterium | Polysaccharid | entsprechende
Genproduktea |
Sphingomonas
S88 | Sphingan
S-88 | SpsD | SpsC | SpsE | SpsJ | SpsS |
R.
meliloti | Succinoglycan | ExoF | ExoP | ExoP | | ExoT |
X.
campestris | Xanthangummi | GumB | GumC | | | GumJ |
E.
coli | Polysialinsäure | KPsD | | | KpsT | |
H.
influenzae | Gruppe-II-Kapsel | BexD | BexC | BexA | | |
- a Verweisstellen
für die
Sekretionsrollen der einzelnen Proteine:
- ExoF, ExoP, ExoT (Becker et al., 1995, Mol. Microbiol, 16: 191;
Horinouchi und Weisblum, 1982, J. Bacteriol., 150, 815; und Reuber
und Walker, 1993, Cell, 74: 269)
- GumB, GumC, GumJ (Glucksmann et al., 1993, J. Bacteriol., 175:
7033; Becker et al., 1995, Mol. Microbiol., 16: 191; und Glucksmann
et al., 1993, J. Bacteriol., 175: 7045)
- KpsD und KpsT (Wunder et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 4025;
und Smith et al., 1990, Mol. Microbiol., 4: 1863)
- BexD, BexC und BexA (Kroll et al., 1990, Mol. Microbiol., 4:
1853)
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Beispiel 21
-
ABC-Transporter für lytisches oder toxisches
Protein
-
Innerhalb
des sps-Clusters waren zwei benachbarte Gene, atrB und atrD, lokalisiert,
wobei diese für einen
ABC-Transporter eines lytischen oder toxinähnlichen Proteins und ein Zusatzprotein
für den
Transport zu codieren schienen. Eine Hämolysingen (hlyA) wurde bereits
in Pseudomonas paucimobilis, das nun als Sphingomonas reklassifiziert
wurde, identifiziert. Wir vermieden die "hly"-Bezeichnung
an diesem Zeitpunkt, da wir mit unseren Stämmen keine eindeutige Hämolyse auf
Agaragarplatten, die Erythrozyten von Schafen enthielten, detektierten.
Etwa 48% der Aminosäuren,
die von der DNA-Sequenz des atrB-Gens abgeleitet waren, waren identisch
zu denen des Cyclolysin-ABC-Transporters von Bordatella pertussis.
Das atrB-Genprodukt war auch überraschend ähnlich dem
gesamten HlyB-Protein von E. coli und dem LktB-Protein von Pasteurella
haemolytica, die Hämolysin
bzw. Leukotoxin transportieren. Ferner war die C-terminale Hälfte von
atrB vielen anderen ABC-Transportern, die die C-terminale Hälfte des
NdvA- Proteins von
R. meliloti und die zwei wiederholten ATP-Bindungsdomänen innerhalb des humanen mehrfacharzneistoffresistenten
Proteins Mdr1 umfassten, ähnlich.
Das atrD-Genprodukt war im Hinblick auf die Sequenz dem HlyD-Protein
von E. coli und dem LktD-Protein von P. haemolytica ähnlich.
Im Gegensatz zu den verwandten Transportgenen von anderen Gattungen
gab es kein analoges lytisches oder toxisches Gen angrenzend an
die Sphingomonas-atrB- und atr-D-Gene oder innerhalb des sps-Clusters.
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Folgerungen
-
Eine
wechselseitige Genkomplementierung von polysaccharidnegativen Mutationen
in einer Gattung von Bakterien durch DNA, die einer zweiten Gattung
entnommen wurde, wurde zum ersten Mal für Sphingomonas und Rhizobium
belegt (Borthakur et al., 1988, Mol. Gen. Genct., 213: 155). In
diesem frühen
Fall wurde die Wiederherstellung von Mucoidbildung auf Agaragarplatten
beobachtet. Es wurde später
berichtet, dass eine wechselseitige intergenerische Komplementierung
für das
gumD-Gen von X. campestris und das spsB-Gen des Sphingomonas-Stamms
S88 erfolgte (Pollock et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 6229) und
wir zeigten, dass das komplementierende Gen von dem Spender die
Synthese des Exopolysaccharids des Empfängers wiederherstellte, durch
Zusammensetzungsanalysen.
-
In
der vorliegenden Anmeldung belegen die Experimente, dass das spsB-Gen
mit Codierung für
Glucosyl-IP-Transferase eine wichtige Stufe in der Biosynthese von
Sphinganen ist. Infolgedessen umfassen DNA-Fragmente, die in Empfängerbakterien
gemäß der vorliegenden
Erfindung einzuarbeiten sind, vorzugsweise ein Gen mit Codierung
für ein
Glycosyl-IP-Transferaseenzym
(Glucosyl-, Galactosyl- oder verwandte IP-Transferasen). Es wird
angenommen, dass die erste Stufe beim Zusammenbau von Sphingan S-88
beispielsweise sehr wahrscheinlich die Übertragung eines Glucose-P
auf das Träger-IP
ist. Infolgedessen ist der Einbau eines Gens, das für ein Enzym
codiert, das diese Biosynthesereaktion erleichtert, vorteilhafterweise
in DNA-Fragmenten gemäß der vorliegenden
Erfindung enthalten.
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Unsere
Untersuchungen zeigten, dass innerhalb des großen sps-Genclusters in Sphingomonas
S88 ein kleineres Operon mit Codierung für die Biosynthese von dTDP-L-Rhamnose
(rhsACBD) vorliegt. Die Sequenzähnlichkeit
zwischen dem rhs-Operon und anderen Rhamnoseoperons impliziert die
gleichen vier enzymatischen Stufen für die L-Rhamnosesynthese in
Sphingomonas und sie ist ein Beleg für das Anstreben des Einbaus
eines rhs-Operons in das DNA-Fragment.
-
Die
verschiedenen Sphinganexopolysaccharide können ähnlich den Schutzkapseln von
vielen invasiven pathogenen Bakterien als Verteidigungsmittel in
der Natur betrachtet werden. Sie können auch eine Rolle bei der
Zellanheftung an ein Substrat spielen. Die anderen sphinganproduzierenden
Stämme
von Sphingomonas weisen ebenfalls Gencluster auf, die ähnlich dem
hier detailliert beschriebenen S88-Cluster organisiert sind, wodurch
die in den hier präsentierten
Beispielen erhaltenen Ergebnisse als Anleitung dienen können, um dem
Fachmann die Gewinnung verarbeitbarer DNA-Fragmente aus allen Sphingomonas
sp. zu ermöglichen.
-
Die
vorliegende Offenbarung hat gezeigt, dass die Herstellung eines
Sphingangummi-Hyperproduzenten aus einem Sphingan-Nichtproduzenten
oder normalen Produzenten (Empfängerbakterium)
durch Insertieren von DNA, die aus einem sphinganproduzierenden
Sphingomonas sp.-Spenderbakterium, das die vorteilhafte oder wesentliche
genetische Information für
die Biosynthese von Sphingan codiert, isoliert wurde, in das Empfängerbakterium
ohne weiteres erhalten werden kann. Hyperproduzenten sind ohne weiteres
erhältlich und
das Verfahren ist generell für
tatsächlich
jeden sphinganproduzierenden Stamm von Sphingomonas sp. verwendbar.
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In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das DNA-Fragment bzw. die DNA-Fragmente, die von dem Spenderbakterium
erhalten wurden, das Gene oder andere DNA-Fragmente, wie spsB von
S88, enthält,
die für
Glucosyl-IP-Transferase (die erste Stufe beim Zusammenbau von Sphingankohlehydraten)
codieren, vorteilhafterweise in der vorliegenden Erfindung verwendet.
In anderen Ausführungsformen
gemäß der vorliegenden
Erfindung, insbesondere den Ausführungsformen,
in denen Rhamnose ein wichtiges Zuckersynthon oder ein wichtiger
Baustein des gebildeten Polysaccharids ist, (beispielsweise im Falle
von Sphingen S-88, Gellen S-60, und Welan S-130) kann der Einbau
eines Rhamnoseoperons oder -gens (wie die rhsABCD-Gene von S-88) vorzugsweise
verwendet werden, um die Produktion von bestimmten Sphinganpolysacchariden
durch die Hyperproduzenten der vorliegenden Erfindung zu maximieren.
Ferner können
Gene oder andere DNA-Fragmente mit Codierung für Glycosyl-Transferasen, beispielsweise spsQ, spsK
und spsL des Sphingomonas-Stamms S88, oder zur Sekretion des schließlich gebildeten
Polysaccharids (beispielsweise spsD, C, E, J und S von Sphingomonas
S88) vorteilhafterweise verwendet werden, wobei der Einbau dieser
Enzyme die Produktion des schließlich produzierten Polysaccharids
unterstützt.
Andere DNA-Fragmente
oder Gene mit Codierung für
alle der oben beschriebenen Enzyme oder Funktionen können ebenfalls
vorteilhafter Weise in Abhängigkeit
von dem gewünschten
Polysaccharid verwendet werden.
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Es
ist anzumerken, dass ein Fachmann üblicher Erfahrung durch Verfolgen
der Lehren der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres DNA-Fragmente
erhalten und diese Fragmente in Empfängerbakterien einbauen kann,
um Sphingen-Hyperproduzenten zu produzieren. Diese Hyperproduzenten
können
ohne weiteres unter Verwendung von einschlägig bekannten einfachen gentechnischen
Verfahren produziert werden.
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Hinterlegungen
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Die
ersten sechs im Folgenden aufgelisteten Mikroorganismen wurden bei
der American Type Culture Collection, in 12301 Parklaven Drive,
Rockville, Maryland 20852, nach dem Budapest Treaty for the International
Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure hinterlegt. Alle Beschränkungen in Bezug auf die Verfügbarkeit
der hinterlegten Materialien werden bei Erteilen eines Patents hierauf
unwiderruflich entfernt. Die letzten drei Mikroorganismen sind bei
der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, öffentlich
zugänglich.
Mikroorganismus | ATCC-Bezeichnung |
Xanthomonas
campestris, X59m31 | 55653 |
Escherichia
coli DH5α,
pRK311-S88c1 | 69732 |
E.
coli DH5α,
pRK311-NWc1 | 69733 |
E.
coli DH5α,
pRK311-S88c2 | 69734 |
Sphingomonas
sp. S88#78,
pRK311-S88c3 | 69735 |
Sphingomonas
sp. S60 prk311-S60c2 | 69744 |
Sphingomonas
sp. S198 | 31853 |
Sphingomonas
sp. S7 | 21423 |
Sphingomonas
sp. S194 | 31961 |
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Selbstverständlich dienen
die hier im Vorhergehenden beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen
zum Zwecke der Bereitstellung einer Beschreibung der vorliegenden
Erfindung mittels Beispielen und sie sollen nicht als Beschränkung der
vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise betrachtet werden. Verschiedene
Modifikationen oder Änderungen,
die an dem hierin oben Beschriebenen durch den Fachmann durchgeführt werden
können,
werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung betrachtet und
sollen in der Idee und der Aufgabe dieser Anmeldung und der folgenden
Ansprüche
enthalten sein.
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