DE69720041T2 - Chemische amplifizierung zur synthese von musterordnungen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen die räumlich definierte chemische Synthese, die lithographische Verfahren einschließt. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen insbesondere neue Verfahren und Zusammensetzungen für die Synthese von Arrays aus verschiedenen Polymer-Sequenzen, wie beispielsweise Polypeptiden und Polynukleotiden. Gemäß eines spezifischen Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren der Synthese von verschiedenen Polymer-Sequenzen, wie beispielsweise Peptiden oder Polynukleotiden bereitgestellt. Die verschiedenen Polymersequenzen sind beispielsweise bei der Nukleinsäure-Analyse, bei Verfolgen der Genexpression, bei Rezeptor- und Nukleinsäure-Bindungsstudien, bei dem Oberflächen-basierenden DNA-Rechnen sowie in integrierten elektronischen Schaltkreisen und bei der Herstellung von anderen Miniatur-Vorrichtungen nützlich.
  • Verfahren der Synthese von Polymer-Sequenzen, wie beispielsweise Nukleotid- und Peptid-Sequenzen, sind bekannt. Verfahren der Synthese von Oligonukleotiden können beispielsweise in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait, ed., IRL Press, Oxford (1984), gefunden werden. Die sogenannte "Merrifield"-Festphasen-Peptidsynthese wird seit einigen Jahren üblicherweise verwendet und wird in Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2154 diskutiert. Festphasen-Synthesetechniken wurden für die Synthese von mehreren Peptidsequenzen, beispielsweise auf einer Anzahl von "Stäbchen" bereitgestellt. Vergleiche beispielsweise Geysen et al., J. Immun. Meth. (1987) 102:259-274. Andere Festphasen-Techniken umfassen beispielsweise die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen auf verschiedenen Cellulose-Scheiben, die in einer Säule gehalten werden. Vergleiche Frank und Doring, Tetrahedron (1988) 44:6031-6040. Wiederum andere Festphasen-Techniken werden in US-Patent Nr. 4,728,502 (erteilt an Hamill) und PCT-Puublikations-Nr. WO 90/00626 (Beattie, Erfinder) diskutiert.
  • Jede der oben beschriebenen Methoden produziert lediglich einen Polymer-Array von relativ geringer Dichte. So ist beispielsweise die in Geysen et al. diskutierte Methode darauf beschränkt, 96 verschiedene Polymere auf Stäbchen herzustellen, die in den Dimensionen einer Standardmikroliter-Platte voneinander getrennt sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurden verbesserte Verfahren der Herstellung von Hochdichte-Arrays von Peptiden, Polynukleotiden und anderen Polymer-Sequenzen innerhalb eines kurzen Zeitraums unter Verwendung der kombinatorischen Festphasensynthese entwickelt. Die "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis (VLSIPS)"-Technologie hat in hohem Maße die kombinatorische Festphasen-Polymersynthese vorangetrieben und hat den Weg zur klinischen Applikation von Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Array-Chips geebnet, wie beispielsweise diejenigen, die unter dem Markennamen GENECHIP vertrieben werden. Vergleiche Kozal et al., Nature Medicine, Band 2, S. 753-759 (1996). Die VLSIPS-Technologie wird in Pirrung et al., US-Patent Nr. 5,143,854 (vgl. auch PCT-Publikations-Nr. WO 90/15070), Fodor et al., PCT-Publikations-Nr. WO 92/10092, und PCT-Publikations-Nr. WO 95/11995; Fodor et al., Science (1991) 251:767-777, offenbart. Bekannte Ausführungsformen der VLSIPS-Technologie verwenden Strahlungs-labile Schutzgruppen und photolithographische Masken, um eine räumlich definierte, kombinatorische Polymersynthese auf einer Substratoberfläche zu erreichen. In diesen Ausführungsformen werden Masken verwendet, um das selektive Bestrahlen in bestimmten Bereichen der Oberfläche zu kontrollieren, die mit Verbindungs-Molekülen versehen sind, welche Strahlungs-labile Schutzgruppen enthalten. In den bestrahlten Bereichen werden die Strahlungs-labilen Schutzgruppen entfernt. Die Oberfläche wird anschließend mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die das gewünschte Monomer enthält. Das Monomer hat mindestens eine Stelle, die mit dem neu exponierten reaktiven Teil auf dem Verbindungs-Molekül reaktiv ist und mindestens eine zweite reaktive Stelle, die durch eine oder mehrere Strahlungs-labile Schutzgruppen geschützt ist. Das gewünschte Monomer wird anschließend an die ungeschützten Verbindungs-Moleküle gekoppelt. Das Verfahren kann wiederholt werden, um eine große Anzahl von Polymer-Sequenzen in bestimmten Bereichen zu synthetisieren.
  • Andere Verfahren zur Synthetisierung von Hochdichte-Polymer-Arrays verwenden Blöcke, die Kanäle für die Reagenz-Versorgung an vorgewählten Stellen auf dem Substrat enthalten. Vergleiche PCT-Publikations-Nr. WO 93/09668. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Block mit dem Substrat in Kontakt gebracht und den Reagenzien, die notwendig sind, um einen Teil des immobilisierten Polymers zu bilden, wird erlaubt, das Substrat über den Kanal (die Kanäle) zu erreichen. Der Block oder das Substrat kann ausgewechselt werden und der Prozess kann wiederholt werden, um Arrays aus Polymeren auf dem Substrat zu bilden. Die Block-Kanal-Methode kann mit Licht-gesteuerten Verfahren kombiniert werden.
  • Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen neue Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen bereit, die bei der Synthese von neuen Hochdichte-Arrays aus verschiedenen Polymer-Sequenzen nützlich sind. Die Polymer-Sequenzen werden aus einzelnen Synthese-Zwischenprodukten gebildet und umfassen verschiedene natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Peptide, Nukleotide, Polypeptide oder Polynukleotide. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzen ein neues chemisches Amplifikations-Verfahren unter Verwendung eines Katalysator-Systems, das durch Strahlung initiiert wird, um zur Synthese der Polymer-Sequenzen beizutragen. Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Verwendung photosensitiver Verbindungen, die als Katalysatoren wirken, um die Synthese-Zwischenprodukte chemisch in einer Weise zu verändern, die die Bildung von Polymer-Sequenzen fördert. Die photosensitiven Verbindungen umfassen solche, die üblicherweise als Strahlungs-aktivierte Katalysatoren (RACs) bezeichnet werden, und insbesondere photoaktivierte Katalysatoren (PACs). Die RACs können das Synthese- Zwischenprodukt chemisch selbst verändern oder sie können eine autokatalytische Verbindung aktivieren, die das Synthese-Zwischenprodukt in einer Weise chemisch ändert, die es erlaubt, das Synthese-Zwischenprodukt chemisch mit einem später zugesetzten Synthese-Zwischenprodukt oder mit einer anderen Verbindung zu verknüpfen.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ein oder mehrere Verbindungs-Moleküle an die Oberfläche eines Substrates, wie beispielsweise einer Glasplatte, gebunden oder auf andere Weise bereitgestellt. Der ungebundene Anteil des Verbindungs-Moleküls, der auch als terminales oder freies Ende des Verbindungs-Moleküls bezeichnet wird, hat eine reaktive funktionelle Gruppe, die blockiert, geschützt oder auf andere Weise durch eine entfernbare Schutzgruppe für die Reaktion unzugänglich gemacht wurde. Wenn die Schutzgruppe einmal entfernt ist, wird die funktionelle Gruppe für die Reaktion verfügbar, d.h. die reaktive funktionelle Gruppe ist unblockiert. Ein Photo-aktivierter Katalysator (PAC) befindet sich ebenfalls auf der Oberfläche des Substrats oder wird auf andere Weise auf dieser in der Nähe der Verbindungs-Moleküle bereitgestellt. Eine autokatalytische Verbindung kann ebenfalls auf der Oberfläche des Substrates vorhanden sein. Der Photo-aktivierte Katalysator wird vorliegend selbst oder in Kombination mit zusätzlichen katalytischen Komponenten als das Katalysator-System bezeichnet.
  • Unter Verwendung lithographischer Verfahren und Techniken, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind, wird ein Gruppe von ersten, ausgewählten Bereichen auf der Oberfläche des Substrates einer Strahlung bestimmter Wellenlängen ausgesetzt. Die Strahlung aktiviert den PAC, der anschließend entweder direkt oder durch eine autokatalytische Verbindung katalytisch die Schutzgruppe vom Verbindungs-Molekül entfernt und dieses für die Reaktion mit einem nachfolgend zugesetzten Synthese-Zwischenprodukt verfügbar macht.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verursacht die Strahlung, dass sich die Struktur des PAC ändert und einen Katalysator produziert, der in der Lage ist, auszulösen, dass die autokatalytische Verbindung, die im Rahmen der Anmeldung auch als Verstärker bezeichnet wird, eine Reaktion durchläuft, die mindestens ein Produkt erzeugt, das die Schutzgruppen von den Verbindungs-Molekülen in den ersten, ausgewählten Bereichen entfernt. Die Verwendung von PACs und autokatalytischen Verbindungen erhöht durch Katalyse in vorteilhafter Weise die Anzahl von Verbindungs-Molekülen, bei denen die Schutzgruppe entfernt ist. Anders ausgedrückt löst die Strahlung eine chemische Reaktion aus, die die Entfernung einer großen Anzahl von Schutzgruppen katalysiert. Wenn die Schutzgruppen entfernt sind, sind die reaktiven, funktionellen Gruppen der Verbindungs-Moleküle für die Reaktion mit einem nachfolgend zugesetzten Synthese-Zwischenprodukt oder mit einer anderen Verbindung verfügbar.
  • Das Substrat wird anschließend gewaschen oder andernfalls mit einem zusätzlichen Synthese-Zwischenprodukt in Kontakt gebracht, das mit den exponierten funktionellen Gruppen auf den Verbindungs-Molekülen reagiert, um eine Sequenz zu bilden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Verstärker autokatalytische Komponenten oder Gruppen, die eine Autokatalyse durchlaufen, wenn sie durch einen RAC, wie beispielsweise einen PAC, initiiert werden. Das Synthese-Zwischenprodukt hat ebenfalls eine reaktive funktionelle Gruppe, die blockiert ist oder auf sonstige Weise durch eine entfernbare Schutzgruppe für die Reaktion unverfügbar gemacht wurde. Auf diese Weise kann eine Sequenz von Monomeren beliebiger Länge durch schrittweise erfolgende Bestrahlung der Oberfläche des Substrates zur Initiierung einer katalytischen Reaktion zur Entfernung einer Schutzgruppe von einer reaktiven funktionellen Gruppe auf einem bereits vorhandenen Synthese-Zwischenprodukt und anschließendem Einführen eines Monomers, d.h. eines Synthese-Zwischenproduktes, das mit der reaktiven funktionellen Gruppe reagieren wird, und das eine Schutzgruppe für die spätere Entfernung durch eine nachfolgende Bestrahlung der Substratoberfläche aufweist, erzeugt werden.
  • Dementsprechend wird anschließend eine zweite Gruppe von ausgewählten Bereichen auf dem Substrat bestrahlt, die dieselbe oder eine andere als die erste Gruppe von ausgewählten Bereichen auf dem Substrat ist, und die entfernbaren Schutzgruppen auf den Synthese-Zwischenprodukten oder Verbindungs-Molekülen werden entfernt. Das Substrat wird anschließend mit einem zusätzlichen, anschließend zugefügten Synthese-Zwischenprodukt für die Reaktion mit den exponierten funktionellen Gruppen in Kontakt gebracht. Dieser Vorgang wird wiederholt, um selektiv Synthese-Zwischenprodukte aufzubringen, bis Polymere von gewünschter Länge und chemischer Sequenz erhalten werden. Schutzgruppen auf dem zuletzt, zugefügten Synthese-Zwischenprodukt in der Polymersequenz werden anschließend optional entfernt und die Sequenz wird danach wahlweise verkappt. Seitenketten-Schutzgruppen werden, sofern sie in der Polymer-Sequenz vorliegen, ebenfalls entfernt. Diese Technik wird, sofern Photonen-Strahlung verwendet wird, als "photochemische Amplifikation für die Synthese von gemusterten Arrays" oder "PASPA" genannt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung produziert der RAC eine Säure, wenn er Strahlung ausgesetzt wird; der Verstärker ist ein Ester, der gegenüber einer Säurekatalysierten thermolytischen Spaltung labil ist und selbst eine Säure produziert; die Schutzgruppe ist eine Säure-entfernbare Schutzgruppe, und das Monomer ist ein Nukleotid, das eine Säure-entfernbare Schutzgruppe an seiner C-5'-Hydroxyl-Gruppe umfasst, wenn beispielsweise die Synthese in 3'-5'-Richtung durchgeführt wird. Es sollte verstanden werden, dass die Lehren der vorliegenden Erfindung gleichermaßen nützlich sind, um eine Synthese von Polynukleotiden in 5'-3'-Richtung durchzuführen. In diesem Fall befindet sich die Schutzgruppe an der 3'-Hydroxyl-Gruppe. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Monomer eine Aminosäure, die eine Säure-entfernbare Schutzgruppe an ihrem Amino- oder Carboxyterminus um fasst, und das Verbindungs-Molekül endet in einer Amino- oder Carboxysäure-Gruppe, die eine Säure-entfernbare Schutzgruppe trägt.
  • Unter Verwendung der hier offenbarten Techniken ist es möglich, relativ kleine und präzise bekannte Bereiche auf der Oberfläche des Substrates in vorteilhafter Weise zu bestrahlen. Die Strahlung verursacht nicht direkt die Entfernung der Schutzgruppen, wie z.B. durch eine photochemische Reaktion bei Absorption der Strahlung durch das Synthese-Zwischenprodukt oder Verbindungs-Molekül selbst, sondern die Strahlung wirkt vielmehr als Signal für die Initiierung einer chemischen katalytischen Reaktion, die die Schutzgruppe in einer amplifizierten Weise entfernt. Daher kann die Strahlungsintensität, wie sie bei Durchführung der vorliegenden Erfindung zur Initiierung der katalytischen Entfernung der Schutzgruppen durch einen Katalysator-System verwendet wird, sehr viel geringer sein als beispielsweise bei der direkten Photo-Entfernung, was im Vergleich zu vielen nicht-amplifizierten Techniken in einer besseren Auflösung resultieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung ist vorteilhaft, weil sie die Synthese von Polymeren jeder gewünschten chemischen Sequenz in bekannten Bereichen auf einem Substrat mit hoher Synthese-Genauigkeit, wenigen Synthese-Merkmalen und verbesserter Herstellungsfähigkeit ermöglicht. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei der Herstellung von Hochdichte-Nukleinsäure-Sonden-Arrays oder bei der Immobilisierung von Nukleinsäure-Sequenzen auf der Oberfläche eines Substrates. Hochdichte-Nukleinsäure-Sonden-Arrays stellen ein wirksames Mittel bereit, um Nukleinsäuren zu analysieren, eine Genexpression zu verfolgen, und um Rechnungen durchzuführen.
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung von Hochdichte-Polymer-Arrays unter Verwendung chemischer Amplifikationstechniken bereitzustellen. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstel lung von Polymer-Arrays mit geringerem Zeitaufwand und geringeren Strahlungsintensitäten bereitzustellen, die Polymer-Reinheit zu verbessern, die räumliche Auflösung und den Kontrast zwischen dem Polymer und dem Substrat zu verbessern und den Bereich auf dem Substrat zu verringern, in dem die Polymer-Sequenzen synthetisiert werden können, wodurch viele und verschiedene Polymer-Sequenzen auf einem Substrat ermöglicht werden. Es ist darüber hinaus ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Entfernung von Schutzgruppen von Synthese-Zwischenprodukten bei der Bildung von Polymer-Sequenzen unter Verwendung photosensitiver Verbindungen zur Initiierung katalytischer Reaktionen bereitzustellen. Es ist darüber hinaus ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung die Präzision, den Kontrast und die Leichtigkeit der Herstellung bei der Produktion von Polymer-Arrays zu verbessern.
  • Diese und andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch Verweis auf die verbleibenden Teile der Beschreibung und die anliegenden Zeichnungen ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Im Verlauf der nachfolgenden detaillierten Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen wird Bezug auf die anliegenden Zeichnungen genommen, in denen
  • 1 eine graphische Darstellung der Konzentration von PAC versus Bestrahlungszeit in Sekunden ist.
  • 2 eine Abbildung ist, die 5 μm- und 2 μm-Strukturen zeigt, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
  • 3 ein Array ist, der gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
  • 4 eine graphische Darstellung ist, die das nicht-lineare Verhalten der Antwort als eine Funktion der Bestrahlungsdosis zeigt.
  • 5 eine graphische Darstellung der photokinetischen Antwort als eine Funktion der Trioctylaminkonzentration ist.
  • 6 ein Chromatogramm eines markierten T6-Polymers ist, das mittels des chemisch amplifizierten Photo-Verfahrens synthetisiert wurde.
  • 7 ein Chromatogramm eines markierten T6-Polymers ist, das mittels TCA/DCM synthetisiert wurde.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BESTIMMTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Prinzipien der vorliegenden Erfindung können besonders vorteilhaft dazu verwendet werden, ein Verfahren der Herstellung ausgewählter Polymer-Sequenzen in präziser Weise in einem Polymer-Array durch die Verwendung von Strahlung zur Initiierung der katalytischen Entfernung der Schutzgruppen bereitzustellen, um in einem schrittweise erfolgenden Verfahren die Polymer-Kettenbildung zu ermöglichen.
  • Wie hierin verwendet, sollen die folgenden Begriffe die folgenden allgmeinen Bedeutungen haben:
    • 1. Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden, die durch die Erfindung untersucht werden können, umfassen Agonisten und Antagonisten für Zellmembran-Rezeptoren, Toxine und Gifte, virale Epitope, Hormone, Opiate, Steroide, Peptide, Enzymsubstrate, Co-Faktoren, Arzneimittel, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide und Proteine, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
    • 2. Monomer: Ein Monomer ist ein Mitglied einer Gruppe von kleinen Molekülen, die zusammengefügt werden oder zusammengefügt werden können, um ein Polymer oder eine Verbindung zu bilden, die aus zwei oder mehreren Mitgliedern besteht. Die Gruppe der Monomere umfasst (ist jedoch nicht beschränkt auf) beispielsweise die Gruppe der üblichen L-Aminosäuren, die Gruppe der D-Aminosäuren, die Gruppe der synthetischen und/oder natürlichen Aminosäuren, die Gruppe der Nukleotide und die Gruppe der Pentosen und Hexosen, wobei jede Gruppe dem Fachmann hinreichend bekannt ist. Die besondere Reihenfolge von Monomeren in einem Polymer wird vorliegend als die "Sequenz" des Polymers bezeichnet. Wie vorliegend verwendet bezieht sich "Monomere" auf jedes Mitglied einer Basisgruppe für die Synthese eines Polymers und ist nicht auf ein einzelnes "mer" beschränkt. Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren bilden beispielsweise eine Basisgruppe von 400 Monomeren für die Synthese von Polypeptiden. Monomere können ferner Trimere, Oligomere, Polymere usw. umfassen. Unterschiedliche Basisgruppen von Monomeren können in aufeinanderfolgenden Schritten bei der Synthese eines Polymers verwendet werden. Darüber hinaus kann jede der Gruppen geschützte Mitglieder umfassen, die nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung wird vorliegend hauptsächlich hinsichtlich der Herstellung von Molekülen beschrieben, die Sequenzen von Monomeren, wie beispielsweise Aminosäuren umfassen, kann jedoch in einfacher Weise auch auf die Herstellung von anderen Polymeren angewendet werden. Solche Polymere umfassen beispielsweise sowohl lineare als auch cyclische Polymere von Nukleinsäuren, Polysacchariden, Phospholipiden und Peptiden, die entweder α-, β- oder ω-Aminosäuren aufweisen, Heteropolymere, bei denen ein bekannter Wirkstoff kovalent an irgendeines der obigen gebunden ist, Polynukleotide, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylen-Sulfide, Polysiloxane, Polyamide, Polyacetate oder andere Polymere, die beim Studium dieser Offenbarung offensichtlich sein werden. Solche Polymere sind "verschieden", wenn Polymere mit verschiedenen Monomersequenzen in verschiedenen vorbestimmten Bereichen eines Substrates gebildet werden. Verfahren der Cyclisierung und Polymer-Umkehr von Polymeren werden in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Serien-Nr. 796,727, eingereicht am 22. November 1991, mit dem Titel "POLYMER REVERSAL ON SOLID SURFACES" offenbart.
    • 3. Peptide: Ein Peptid ist ein Polymer, bei dem die Monomere α-Aminosäuren sind, und durch Amid-Bindungen zusammengefügt sind, und das alternativ als ein Polypeptid bezeichnet wird. Aminosäuren können das L-optische Isomer oder das D-optische Isomer sein. Der Begriff "Polypeptid" bezeichnet wie vorliegend verwendet zwei oder mehrere Aminosäuremonomere in der Länge oder größer und umfasst oftmals mehr als 20 Aminosäuremonomere oder Monomere in einer Größenordnung von hunderten. Für Aminosäuren werden Standardabkürzungen verwendet (z.B. P für Prolin). Die Identifizierung von Aminosäuren und ihre Abkürzungen sind hinreichend bekannt und in Stryer, Biochemistry, Dritte Ausgabe, 1988, enthalten.
    • 4. Rezeptor: Ein Rezeptor ist ein Molekül, das eine Affinität für einen Liganden aufweist. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder künstliche Moleküle sein. Sie können in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Arten verwendet werden. Rezeptoren können kovalent oder nicht-kovalent entweder direkt oder über eine spezifische Bindungs-Substanz an ein Bindungs-Mitglied gebunden werden. Beispiele für Rezeptoren, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen Antikörper, Zellmembran-Rezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren, die mit spezifischen Antigen-Determinanten reaktiv sind, Viren, Zellen, Arzneimittel, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Co-Faktoren, Lektine, Zucker, Polysaccharide, zelluläre Membranen und Organellen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Rezeptoren werden manchmal im Stand der Technik als Anti-Liganden bezeichnet. So, wie der Begriff Rezeptoren vorliegend verwendet wird, wird keine unterschiedliche Bedeutung beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptor-Paar" wird gebildet, wenn sich zwei Moleküle durch molekulare Erkennung vereinigt haben, um einen Komplex zu bilden. Spezifische Beispiele von Rezeptoren, die mittels dieser Erfindung untersucht werden können, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf):
    • a) Rezeptoren von Mikroorganismen: Die Bestimmung von Liganden, die an Rezeptoren von Mikroorganismen binden, wie beispielsweise spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überleben der Mikroorganismen essentiell sind, würden ein nützliches Hilfsmittel für die Entdeckung neuer Klassen von Antibiotika darstellen. Von besonderem Wert würden Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozonen und Bakterien sein, die gegen derzeit verwendete Antibiotika resistent sind.
    • b) Enzyme: Ein Rezeptor kann beispielsweise eine Bindungs-Stelle eines Enzyms umfassen, wie beispielsweise eines Enzyms, das für die Spaltung eines Neurotransmitters verantwortlich ist; die Bestimmung von Liganden für diesen Typ von Rezeptor, um die Wirkung eines Enzyms zu modulieren, das einen Neurotransmitter spaltet, ist nützlich bei der Entwicklung von Arzneimitteln, die bei der Behandlung von krankhaften Zuständen der Neurotransmission verwendet werden können.
    • c) Antikörper: Die Erfindung könnte beispielsweise bei der Untersuchung eines Rezeptors nützlich sein, der eine Liganden-Bindungsstelle auf einem Antikörper-Molekül umfasst, welcher sich mit einem Epitop eines Antigens von Interesse verbindet; die Analyse einer Sequenz, die ein antigenes Epitop maskiert, könnte zur Entwicklung von Impfstoffen führen, in denen das Immunogen auf einer oder auf mehreren solcher Sequenzen basiert, oder zur Entwicklung von verwandten diagnostischen Agenzien oder Verbindungen, die bei den therapeutischen Behandlungen, beispielsweise bei Autoimmunerkrankungen nützlich sind (z.B. durch Blockierung der Bindung der "Selbst"-Antikörper).
    • d) Nukleinsäuren: Sequenzen von Nukleinsäuren könnten synthetisiert werden, um Sequenzen bereitzustellen, die von verschiedenen Rezeptor-Molekülen erkannt werden, wie beispielsweise Protein- oder andere DNA- oder RNA-Moleküle. Nukleinsäuren im Bereich der vorliegenden Erfindung umfassen natürlich vorkommende oder synthetische Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga, modifizierte Nukleinsäuren, Nukleinsäuren, die modifizierte Nukleotide enthalten, modifizierte Nukleinsäure-Analoga, Peptid-Nukleinsäuren und ähnliche oder Mischungen derselben.
    • e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die in der Lage sind, eine chemische Reaktion zu fördern, die die Konversion von einem oder mehreren Reaktanten in ein oder mehrere Produkte umfasst. Solche Polypeptide umfassen üblicherweise eine Bindungsstelle, die für mindestens einen Reaktanten oder ein Zwischenprodukt der Reaktion spezifisch ist, sowie eine aktive Funktionalität in der Nähe der Bindungsstelle, wobei die Funktionalität in der Lage ist, den gebunden Reaktanten chemisch zu modifizieren. Katalytische Polypeptide und andere werden beispielsweise in PCT-Publikations-Nr. WO 90/05746, WO 90/05749 und WO 90/05785 diskutiert.
    • f) Hormonrezeptoren: Die Bestimmung des Liganden, der mit hoher Affinität an einen Rezeptor bindet, wie beispielsweise die Rezeptoren für Insulin und Wachstums-Hormon, ist nützlich bei der Entwicklung, z.B. eines oralen Ersatzstoffes für die tägliche Injektionen, die Diabetiker vornehmen müssen, um die Symptome der Diabetes zu lindern, oder eines Ersatzstoff für das Wachstums-Hormon. Andere Beispiele für Hormon-Rezeptoren umfassen die vasokonstriktiven Hormon-Rezeptoren; die Bestimmung von Liganden für diese Rezeptoren könnte zur Entwicklung von Arzneimitteln für die Kontrolle des Blutdrucks führen.
    • g) Opiat-Rezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an die Opiat-Rezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich bei der Entwicklung von weniger abhängig machenden Ersatzstoffen für Morphine und verwandte Arzneimittel.
    • 5. Substrat: Ein Material, das eine feste oder halb-feste Oberfläche aufweist, die in der Regel aus Glas oder geeigneten Polymer-Materialien hergestellt ist. In vielen Ausführungsformen ist mindestens eine Oberfläche des Substrates im Wesentlichen flach, obwohl es in einigen Ausführungsformen erstrebenswert sein kann, Syntheseregionen für verschiedene Polymere physikalisch zu separieren, beispielsweise durch Vertiefungen, erhöhte Bereiche, geätzte Furche oder ähnliches. In einigen Ausführungsformen enthält das Substrat selbst Vertiefungen, Furchen, Durchfluss-Bereiche usw., die die gesamten oder einen Teil der Synthesebereiche bilden. Gemäß anderer Ausführungsformen können kleine Kugeln auf der Oberfläche bereitgestellt werden, und Verbindungen, die darauf synthetisiert werden, können bei Abschluss der Synthese wahlweise freigesetzt werden. Substrate sind im Stand der Technik bekannt und können leicht kommerziell durch Lieferanten, wie beispielsweise durch USPG, PPG Industries, AFG Industries und andere, erhalten werden.
    • 6. Schutzgruppe: Ein Material, das selektiv entfernt werden kann, um eine aktive Stelle zu exponieren, wie beispielsweise im speziellen Beispiel einer Aminosäure eine Amin-Gruppe. Zur Veranschaulichung umfassen Schutzgruppen diejenigen, die Photo-labil (vgl. Fodor et al., PCT-Publikations-Nr. WO 92/10092, US-Serien-Nr. 07/971,181 , eingereicht am 2. November 1992, und US-Serien-Nr. 08/310,817 , eingereicht am 22. September 1994) Säure-labil, und Basen-labil sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Für eine umfangreiche Liste von Schutzgruppen, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, vgl. auch Greene, T.W. und Wuts, P.Gu.M., Protective Groups in Organic Synthesis, (1991). Nützliche, repräsentative Säure-sensitive Schutzgruppen umfassen Dimethoxytrityl (DMT), tert-Butylcarbamat (tBoc) und Trifluoracetyl (Tfa). Nützliche repräsentative Basen-sensitive Schutzgruppen umfassen 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Isobutyl (iBu), Benzoyl (Bz) und Phenoxyacetyl (pac). Andere Schutzgruppen umfassen Acetamidomethyl, Acetyl, tert-Amyloxycarbonyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, 2-(4-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl, 2-Brombenzyloxycarbonyl, tert-Butyl, tert-Butyloxycarbonyl, 1-Carbobenzoxamido-2,2,2-trifluorethyl, 2,6-Dichlorbenzyl, 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-2-propyloxycarbonyl, 2,4-Dinitrophenyl, Dithiosuccinyl, Formyl, 4-Methoxybenzensulfonyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Phenyl-2-propyloxycarbonyl, α-2,4,5-Tetramethylbenzyloxycarbonyl, p-Toluensulfonyl, Xanthenyl, Benzylester, N-Hydroxysuccinimid-Ester, p-Nitrobenzylester, p-Nitrophenylester, Phenylester, p-Nitrocarbonat, p-Nitrobenzylcarbonat, Trimethylsilyl und Pentachlorphenylester und ähnliche.
    • 7. Vorbestimmter Bereich: Ein vorbestimmter Bereich ist eine eingegrenzte Fläche auf einem Substrat, die zur Bildung eines ausgewählten Polymers verwendet wird, verwendet wurde oder verwendet werden soll, und die im Weiteren hier alternativ als "Reaktions-"Bereich, "ausgewählter" Bereich oder einfach als "Bereich" bezeichnet wird. Der vorbestimmte Bereich kann jede brauchbare Form haben, z.B. rund, rechteckig, elliptisch, keilförmig usw. In einigen Ausführungsformen ist ein vorbestimmter Bereich und somit die Fläche, auf der jede einzelne Polymersequenz synthetisiert wird, kleiner als etwa 1 mm2, vorzugsweise weniger als 1 cm2, wobei weniger als 0,5 mm2 sogar noch mehr bevorzugt wird. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen haben die Bereiche eine Fläche von weniger als 10.000 μm2 oder vorzugsweise weniger als 100 μm2. Innerhalb dieser Bereiche wird das darin synthetisierte Polymer vorzugsweise in einer im Wesentlichen reinen Form synthetisiert.
    • 8. Im Wesentlichen rein: Ein Polymer wird innerhalb eines vorbestimmten Bereiches eines Substrates als "im Wesentlichen rein" erachtet, wenn dieses Eigenschaften zeigt, die es von anderen vorbestimmten Bereichen unterscheiden. Üblicherweise wird die Reinheit in Form der biologischen Aktivität oder Funktion als Ergebnis einer gleichförmigen Sequenz gemessen. Solche Eigenschaften wird man typischerweise über die Bindung mit einem ausgewählten Liganden oder Rezeptor messen. Vorzugsweise ist der Bereich ausreichend rein, so dass die vorherrschende Art in dem vorbestimmten Bereich die gewünschte Sequenz ist. Gemäß bevorzugter Aspekte der Erfindung ist das Polymer mindestens 5 % rein, vorzugsweise mehr als 10 % bis 20 % rein, mehr bevorzugt mehr als 95 % rein, wobei sich die Reinheit für diesen Zweck auf das Verhältnis der Anzahl von Polymer-Molekülen, die in einen vorbestimmten Bereich gebildet werden und eine gewünschte Sequenz haben, zu der gesamten Anzahl der Moleküle, die in dem vorbestimmten Bereich gebildet werden, bezieht.
    • 9. Katalysator: Ein Katalysator ist jeder Stoff, der in einer chemischen Reaktion nicht verbraucht wird und die Reaktionsrate beeinflusst. Reaktionen, die durch Katalysatoren beeinflusst werden, werden als katalytische Reaktionen bezeichnet. Autokatalytische Reaktionen sind Reaktionen, in denen mindestens eins der Produkte ebenfalls ein Katalysator für die Reaktion ist. Ein Autokatalysator ist ein Stoff, der eine Reaktion durchläuft, die ein Produkt erzeugt, das ebenfalls ein Katalysator für dieselbe Reaktion ist. Einige autokatalytische Reaktionen haben eine relativ langsame Reaktionsrate zu Beginn, die Reaktion wird jedoch bei weiterem Fortschreiten beschleunigt, da sich mehr katalytisches Produkt ansammelt. Wenn eine Substanz oder eine Kombination von Substanzen zwei oder mehrere gleichzeitige Reaktionen durchläuft, die unterschiedliche Produkte ergeben, kann die Verteilung der Produkte durch die Verwendung eines Katalysators beeinflusst werden, der selektiv eine Reaktion im Verhältnis zu der (den) anderen beschleunigt.
    • 10. Strahlungs-aktivierter Katalysator (RAC): Ein Strahlungs-aktivierter Katalysator (RAC) ist eine Verbindung oder Gruppe, die mindestens einen Katalysator produziert, wenn sie bestrahlt wird. RACs umfassen Radikale, Säuren, Basen, Ionen und Metalle, sind aber nicht auf diese beschränkt.
    • 11. Verstärker: Ein Verstärker ist jedes Material, das ein Strahlungs-initiiertes chemisches Signal so amplifiziert, dass die wirksame Quantenausbeute der Strahlung erhöht wird. Verstärker umfassen katalytische Materialien, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Verwendung eines Verstärkers in Strahlungs-unterstützten chemischen Prozessen wird chemische Amplifikation genannt. Die chemische Amplifikation hat zahlreiche Vorteile. Nicht-limitierende Beispiele der Vorteile einer chemischen Amplifikation umfassen die Fähigkeit, die Zeit und Intensität der Bestrahlung zu verringern, die notwendig ist, um eine gewünschte chemische Reaktion zu verursachen. Die chemische Amplifikation verbessert ferner die räumliche Auflösung und den Kontrast in gemusterten Arrays, die unter Verwendung dieser Technik gebildet werden.
    • 12. Strahlungssensibilisator: Ein Strahlungssensibilisator ist jedes Material, das die Wellenlänge der Strahlung, die notwendig ist, um die gewünschte Reaktion zu initiieren, verlagert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Vorrichtungen und Zusammensetzungen für die Bildung von Arrays mit einer großen Anzahl von verschiedenen Polymer-Sequenzen bereit. Die hier bereitgestellten Verfahren und Zusammensetzungen betreffen die Umwandlung von Strahlungssignalen in chemische Produkte in einer amplifizierten Weise, die insbesondere nützlich bei der Polymer-Synthese ist. Die Erfindung umfasst ferner die Arrays, die unter Verwendung der hier offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen gebildet werden. Ein Aspekt der Erfindung umfasst Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen für die Synthese eines Arrays aus verschiedenen Polymeren in ausgewählten und vorbestimmten Bereichen eines Substrates. Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst diese Arrays sowie verschiedene Verfahren ihrer Verwendung.
  • Solche Arrays werden beispielsweise bei der Analyse von Nukleinsäure verwendet. Polynukleotid- oder Nukleinsäure-Arrays sind insbesondere für die Überprüfung der Genauigkeit von zuvor aufgeklärten Sequenzen und für den Nachweis von Mutationen und Polymorphismen geeignet. Solche Arrays werden ferner bei Screening-Untersuchungen verwendet, um deren Interaktion mit Rezeptoren wie beispielsweise Antikörpern oder Nukleinsäuren zu ermitteln. Einige Ausführungsformen der Erfindung sorgen beispielsweise für das Screening von Peptiden, um zu ermitteln, welches Peptid (wenn überhaupt) aus einer diversen Gruppe von Peptiden eine starke Bindungsaffinität zu einem Rezeptor hat.
  • In einigen Ausführungsformen werden die gemäß dieser Erfindung gebildeten Arrays bei kompetitiven Assays oder anderen hinreichend bekannten Techniken verwendet, um nach Verbindungen mit bestimmten Aktivitäten zu suchen. Umfangreiche Sammlungen von synthetischen oder natürlichen Verbindungen werden beispielsweise auf vorbestimmten Bereichen eines Substrates immobilisiert. Die Reaktion der immobilisierten Verbindungen (oder Verbindung) mit verschiedenen Testzusammensetzungen, wie beispielsweise Mitgliedern einer chemischen Bibliothek oder eines biologischen Extraktes, werden getestet, indem kleine Aliquots jedes Mitglieds der Bibliothek oder des Extraktes auf einen unterschiedlichen Bereich verteilt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird eine große Sammlung von humanen Rezeptoren auf ein Substrat aufgebracht, einer in jedem Bereich, um einen Array zu bilden. Ein pflanzlicher oder tierischer Extrakt wird anschließend auf eine Bindung an verschiedene Rezeptoren des Arrays untersucht.
  • Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können auch Nukleinsäure-Sequenzen an bestimmten Stellen oder vorbestimmten Bereichen eines Substrates immobilisiert werden. In einigen Ausführungsformen werden solche Arrays aus immobilisierten Nukleinsäuren in Hybridisierungs-Assays zum Verfahren der Genexpression, für Nukleinsäure-Amplifikationen, für das Rechnen mit Nukleinsäure und zur Analyse von Nukleinsäuren im Allgemeinen verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung weist einige Gemeinsamkeiten mit Strahlungs-gesteuerten Verfahren auf, die in US-Patent Nr. 5,143,854 diskutiert werden. Die Strahlung-gesteuerten Verfahren, die in diesem Patent diskutiert werden, umfassen die Aktivierung von vorbestimmten Bereichen auf dem Substrat und das anschließende Inkontaktbringen des Substrates mit einer vorgewählten Monomer-Lösung. Die vorbestimmten Bereiche können beispielsweise durch eine Lichtquelle aktiviert werden, die durch eine Maske gezeigt wird (ähnlich wie bei photolithographischen Methoden, die bei der Herstellung von integrierten Schaltkreisen verwendet werden). Andere Bereiche des Substrates bleiben inaktiv, weil sie durch die Maske von einer Anstrahlung ausgenommen sind. Somit bestimmt ein Lichtmuster, welche Bereiche des Substrates mit einem gegebenen Monomer reagieren. Durch wiederholtes Aktivieren verschiedener Gruppen vorbestimmter Bereiche und durch Bereitstellung verschiedener Monomerzusammensetzungen auf diesen wird ein Array verschiedener Polymere auf oder nahe des Substrats hergestellt.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein Substrat mit einem Verbindungs-Molekül, welches eine Schutzgruppe hat, mit einem Strahlungs-aktivierten Katalysator und einem Verstärker bereitgestellt. Der RAC wird selektiv bestrahlt, um einen Katalysator in den vorgewählten Bereichen zu erzeugen. Der Katalysator und der Verstärker helfen bei der Entfernung der Schutzgruppe auf den Verbindungs-Molekülen. Das Verbindungs-Molekül, das eine neu exponierte reaktive Gruppe aufweist, wird mit einem Monomer in Kontakt gebracht, das in der Lage ist, mit dem Verbindungs-Molekül zu reagieren. Das Monomer hat ebenfalls eine Schutzgruppe, die in einem nachfolgenden Reaktionsschritt entfernt werden kann. Durch dieses schrittweise erfolgende Vorgehen werden verschiedene Arrays von Polymeren in vorgewählten Bereichen eines Substrates synthetisiert.
  • Photochemische Amplifikation zur Synthese von gemusterten Arrays
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein photochemisches Amplifikationverfahren, in dem Photonen-Strahlungssignale auf eine Weise in chemische Signale konvertiert werden, die die wirksame Quantenausbeute des Photons in der gewünschten Reaktion erhöht. Die Verwendung von photochemischer Amplifikation bei Verfahren der Synthese von gemusterten Arrays (PASPA) ist insbesondere vorteilhaft, weil die Zeit und die Intensität der Bestrahlung, die benötigt werden, um Schutzgruppen zu entfernen, im Vergleich zu bekannten photochemischen Verfahren verringert werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen in vorteilhafter Weise gemusterte Arrays her, die eine verbesserte räumliche Auflösung und einen verbesserten Kontrast aufweisen.
  • Üblicherweise werden Strahlungssignale durch ein Katalysator-System aufgenommen, einschließlich z.B. eines Photoaktivierten Katalysators (PAC). Der Katalysator aktiviert einen Verstärker, der die wirksame Quantenausbeute der Photonen in nachfolgenden chemischen Reaktionen erhöht. Solche nachfolgenden Reaktionen umfassen die Entfernung der Schutzgruppen bei der Synthese von gemusterten Arrays.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein Photo-aktivierter Säurekatalysator (PAAC) bestrahlt. Die resultierende Säure, die von dem PAAC produziert wird, aktiviert einen Verstärker, der daraufhin eine Säure-katalysierte Reaktion durchläuft und selbst eine Säure produziert, die Säure-labile Schutzgruppen von einem Verbindungs-Molekül oder Synthese-Zwischenprodukt entfernt. Die Kombination von PACs und Verstärkern konvertiert und amplifiziert das Photonensignal, das auf die Oberfläche des Substrates gestrahlt wird. Aufgrund der Amplifikation ist die wirksame Quantenausbeute der Bestrahlung, die auf die Oberfläche des Substrates gerichtet ist, sehr viel größer als eins, was zu einer hohen Sensitivität führt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verbindungs-Moleküle mit reaktiven funktionalen Gruppen, die durch Schutzgruppen geschützt sind, auf der Oberfläche eines Substrates bereitgestellt. Ein Katalysator-System, das einen PAC und einen Verstärker umfasst, wird ebenfalls auf der Oberfläche bereitgestellt. Eine Gruppe von ausgewählten Bereichen auf der Oberfläche des Substrates wird bestrahlt, wobei hinreichend bekannte lithographische Verfahren verwendet werden, die z.B. in Thompson, L.F., Willson, C.G., and Bowden, M.J., Introduction to Microlithography, American Chemical Society, 1994, S. 212-232, diskutiert werden.
  • Der PAC-Katalysator, der durch die oben besprochene Bereich-selektive Bestrahlung aktiviert wird, wirkt derart, dass eine Reaktion des Verstärkers initiiert wird. Der Verstärker produziert mindestens ein Produkt, das die Schutzgruppen von den Verbindungs-Molekülen in den ersten ausgewählten Bereichen entfernt. Vorzugsweise ist der Verstärker in der Lage, die Schutzgruppen in einer katalytischen Weise zu entfernen. Das Substrat wird anschließend gewaschen oder andernfalls mit einem ersten Monomer in Kontakt gebracht, das mit den exponierten funktionalen Gruppen der Verbindungs-Moleküle reagiert. Diese gebundenen Monomere werden zuerst-gebundene Monomere genannt.
  • Eine zweite Gruppe von ausgewählten Bereichen wird anschließend bestrahlt. Die Strahlungs-initiierten Reaktionen entfernen die Schutzgruppen von Molekülen in der zweiten Gruppe an ausgewählten Bereichen, d.h. den Verbindungs-Molekülen und den zuerst-gebundenen Monomeren. Das Substrat wird anschließend mit einem zweiten Monomer in Kontakt gebracht, das eine entfern bare Schutzgruppe umfasst, um mit exponierten funktionalen Gruppen zu reagieren. Dieser Prozess wird wiederholt, um selektiv Monomere zuzufügen, bis Polymere einer gewünschten Länge und einer gewünschten chemischen Sequenz erhalten werden. Die Schutzgruppen werden anschließend wahlweise entfernt und die Sequenz wird anschließend wahlweise abgedeckt (capped). Seitenketten-schützende Gruppen, sofern vorhanden, werden ebenfalls wahlweise entfernt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Monomer ein 2'-Desoxynukleosid-phosphoramidit, das eine Säure-entfernbare Schutzgruppe an seiner 5'-Hydroxyl-Gruppe umfasst. Wie zuvor erwähnt, befindet sich in einer andere Ausführungsform die Schutzgruppe an der 3'-Hydroxyl-Gruppe, wenn die Synthese des Polynukleotids von der 5'- in die 3'-Richtung verläuft. Das Nukleosid-phosphoramidit wird in der folgenden Formel dargestellt:
    Figure 00220001
    wobei die Base Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin ist, R1 eine Schutzgruppe ist, die die 5'-Hydroxyl-Gruppe für eine Reaktion unverfügbar macht und Dimethoxytrityl, tert.-Butyloxycarbonyl oder jede der zuvor genannten Schutzgruppen einschliesst; R2 Cyanoethyl, Methyl, t-Butyl, Trimethylsilyl und dergleichen ist und R3 und R4 Isopropyl, Cyclohexon und dergleichen sind. Exocyclische Amine, die auf den Basen vorhanden sind, können ebenfalls mit Acyl-Schutzgruppen wie beispielsweise Benzoyl, Isobutyryl, Phenoxyacetyl und dergleichen geschützt werden. Die Verbindungs-Moleküle enthalten eine Säure- oder Base-entfernbare Schutzgruppe. Nützliche Verbindungs-Moleküle sind dem Fachmann wohl bekannt und repräsentative Beispiele umfassen Oligoether, wie beispielsweise Hexaethylenglykol, Oligomere von Nukleotiden, Estern, Carbonaten, Amiden und dergleichen. Nützliche Schutzgruppen umfassen diejenigen, die zuvor aufgelistet wurden, und andere dem Fachmann bekannte.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Monomer eine Aminosäure, die eine Säure- oder Basen-entfernbare Schutzgruppe an ihrem Amino- oder Carboxyterminus umfasst und das Verbindungs-Molekül endet in einer Amino- oder Carboxysäure-Gruppe, die eine Säure- oder Basen-entfernbare Schutzgruppe trägt. Schutzgruppen umfassen tert-Butyloxycarbonyl, 9-Fluorphenylmethoxycarbonyl und jede der zuvor erwähnten Schutzgruppen sowie andere dem Fachmann bekannte.
  • Es ist dem Fachmann offensichtlich, dass die photochemisch amplifizierte Strahlungs-basierte Aktivierung nicht auf Photo-aktivierte Verstärker oder Katalysatoren oder auf Säure- oder Base-Produktionskaskaden beschränkt ist. Verschiedene Verbindungen oder Gruppen können Katalysatoren oder Verstärker als Antwort auf eine Bestrahlung produzieren. Nicht-beschränkende Beispiele umfassen die Photogenerierung von Radikalen unter Verwendung von Diphenylsulfid, Benzoylperoxid, 2,2'-Azobis(butyronitril), Benzoin und dergleichen; Kationen wie beispielsweise Triarylsulfoniumsalze, Diaryliodoniumsalze und dergleichen; und Anionen.
  • Strahlungs-aktivierte Katalysatoren (RACs)
  • Nützliche RACs im Bereich der vorliegenden Erfindung umfassen diejenigen, die in der Lage sind, direkt oder indirekt die Entfernung einer Schutzgruppe von einem Verbindungs-Molekül oder einer Polymer-Kette zu katalysieren und die auf Basis ihrer Sensitivität gegenüber Strahlung bei bestimmten Wellenlängen ausgewählt werden. Nützliche Wellenlängen umfassen diejenigen im infraroten, sichtbaren, ultravioletten und Röntgenbereich. Gemäß einer Ausführungsform produzieren die RACs bei Bestrahlung mit bestimmten Wellenlängen Säuren oder Basen für die Aktivierung von Verstärkern oder anderer Katalysatoren bei der chemisch amplifizierten Entfernung von Schutzgruppen.
  • Vorzugsweise interferiert der RAC, der für eine bestimmte Synthesestrategie gewählt wurde, nicht ungebührend mit nachfolgenden oder vorhergehenden Syntheseschritten bei der Bildung des Polymers. Überraschenderweise erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise die Verwendung von Photokatalysatoren oder Produkten von Photokatalysatoren, die in bekannten Verfahren der Synthese von Polymer-Arrays nachteilig sein können. Beispielsweise produzieren einige PAACs starke Säuren, die eine signifikante Depurinierung verursachen und daher nicht unmittelbar für die Polynukleotidsynthese verwendet werden können. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt jedoch die Verwendung derjenigen PAAC-Typen, die starke Säure produzieren, da nur geringe Mengen der PAACs benötigt werden und demgemäß nur eine geringe Menge starker Säure produziert wird. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Bestrahlungssensitivität der verschiedenen verwendeten Verbindungen.
  • Eine bevorzugte Klasse von RACs umfasst PAACs, wie beispielsweise Naphthochinondiazid-Sulfonsäuren wie beispielsweise diejenigen, die durch Kosar, Light Sensitive Systems, John Wiley & Sons, 1965, S. 343 bis 352, offenbart werden. Diese PAACs bilden eine Säure als Antwort auf Strahlung verschiedener Wellenlängen, die vom sichtbaren bis zum Röntgenbereich reichen. Bevorzugte PAACs umfassen die 2,1,4-Diazonaphthochinon-Sulfonsäureester und die 2,1,5-Diazonaphthochinon-Sulfonsäureester. Weitere nützliche PACs umfassen die Familie der Nitrobenzylester und die s-Triazin-Derivate. Geeignete s-Triazin-Säurebildner werden beispielsweise in US-Patent Nr. 4,189,323 , offenbart. Nichtionische PAACs umfassen halogenierte, nicht-ionische Photosäure-generierende Verbindungen wie beispielsweise 1,1-Bis[p-chlorphenyl]-2,2,2-trichlorethan (DDT); 1,1-Bis[p-methoxyphenyl]-2,2,2-trichlorethan; 1,2,5,6,9,10-Hexabromcyclododecan; 1,10-Dibromdecan; 1,1-Bis[p-chlorphenyl]-2,2,-dichlorethan; 4,4-Dichlor-2-(trichlormethyl)benzhydrol(Kelthan); Hexachlordimethylsulfon; 2-Chlor-6-(trichlormethyl)pyridin; o,o-Diethyl-o-(3,5,6-trichlor-2-pyridyl)phosphorthionat; 1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan; N(1,1-Bis[p-chlorphenyl]-2,2,2-trichlorethyl)acetamid; Tris[2,3-dibrompropyl]isocyanurat; 2,2-Bis[p-chlorphenyl]-1,1-dichlorethylen; Tris[trichlormethyl]s-triazin; und ihre Isomere, Analoge, Homologe und Rest-Verbindungen sind ebenfalls für einige Anwendungen geeignet. Geeignete PAACs werden ferner in den europäischen Patentanmeldenummern 0164248 und 0232972 offenbart. PAACs, die insbesondere für tiefe UV-Bestrahlung bevorzugt werden, umfassen 1,1-Bis(p-chlorphenyl)-2,2,2-trichlorethan (DDT); 1,1-Bis(p-methoxyphenol)-2,2,2-trichlorethan; 1,1-Bis(chlorphenyl)-2,2,2-trichlorethanol; Tris(1,2,3-methansulfonyl)benzen; und Tris(trichlormethyl)triazin.
  • In einigen Ausführungsformen werden Onium-Salze als PACs bevorzugt. Wenn Polynukleotid-Arrays synthetisiert werden, wird ein Strahlungs-Sensibilisator verwendet, um die Strahlungssensitivität der Onium-Salze von Wellenlängen weg zu verschieben, die die Ausgangsmaterialien beschädigen. Geeignete Strahlungs-Sensibilisatoren zur Verwendung mit Onium-Salzen oder anderen RACs sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und umfassen, Benzophenon, Thiophen, Fluoren, Anthrachinon, Chinolin, Phenanthracen, Flavon, Michlers-Keton, Chrysen, Anthracen, Eosin und dergleichen. Es ist verständlich, dass zusätzliche Sensibilisatoren dem Fachmann hinreichend bekannt sind und auf Basis der vorliegenden Offenbarung einfach zu identifizieren sind.
  • Beispiele für Onium-Salze, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen diejenigen, die Halogen (z.B. I, Br, Cl etc.)-Komplex-Anionen von bivalenten bis heptavalenten Metallen oder Nicht-Metallen, z.B. Sb, Sn, Fe, Bi, Al, Ga, In, Ti, Zr, Sc, Cul, Cr, Hf und Cu sowie B, P, und As aufweisen. Beispiele für geeignete Onium-Salze sind Diaryl-diazoniumsalze und Onium-Salze der Gruppe VI und VII des Periodensystems, beispielsweise Halonium-Salze, quartuäres Ammonium, Phosphonium und Arsonium-Salze, aromatische Sulfonium-Salze und Sulfuoxonium-Salze oder Seleonium-Salze. Beispiele für geeignete bevorzugte Onium-Salze können in den US-Patent Nrn. 4,442,197 ; 4,603,101 und 4,624,912 gefunden werden. Sulfonium-Analoga können unter Verwendung von Gruppe-VI-Elementen wie beispielsweise 0, S, Se, Te hergestellt werden. Onium-Analoga können unter Verwendung von Gruppe-VII-Elementen wie beispielsweise I, Br, und Cl hergestellt werden. Für einen Überblick über Onium-Salze und Photosäure-Bildnern, vgl. Pappas, J. Imaging Technology (1985), 11, 146. Eine weitere Gruppe von geeigneten Säure-Bildnern ist die Familie der sulfonierten Ester, einschließlich der Sulfonyloxy-Ketone. Geeignete sulfonierte Ester wurden in J. of Photopolymer Science und Technology (1991), 4, 3, 337-340, beschrieben und umfassen Benzointosyl, t-Butylphenyl-α-(p-toluensulfonyloxy)-acetat und t-Butyl-α-(p-toluensulfonyloxy)-acetat. Sowohl ionische, einschließlich Di-tert-butylphenyliodoniumtriflat (TBI-T), Di-tert-butylphenyliodoniumcamphorsulfonat (TBI-CAM) und Di-tert-butylphenyliodoniumdichloracetat (TBI-DCA), als auch nicht-ionische, einschließlich Naphthalimidotriftet und Phthalimidotosylat oder Mischungen dieser Photosäuren sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich. Nützliche PACs im Bereich der vorliegenden Erfindung umfassen
    Figure 00270001
  • Alkyl bezeichnet gesättigte oder ungesättigte, geradkettig oder verzweigte Kohlenstoffatome mit 1 bis 50 Kohlenstoffen, vorzugsweise mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, und besonders bevorzugt mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Aromatische Gruppen umfassen geradkettige oder cyclische Aromaten, substituiert oder unsubstituiert mit 1 bis 50 Kohlenstoffen, vorzugsweise mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Ein bevorzugter PAC für die Polynukleotidsynthese ist der o-Nitrobenzylester der Toluensulfonsäure, wie beispielsweise das 2-Nitro-3,4-dimethoxybenzyltosylat mit der Struktur:
    Figure 00280001
  • Die Ester produzieren Bei Bestrahlung katalytische Mengen von p-Toluensulfonsäure. Andere PACs, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen die folgenden:
    Figure 00280002
    wobei R Sulfonat, Tosylat, Mesolat, PF6 oder BF4 ist, in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Sensibilisators der Formel:
    Figure 00290001
  • Katalytische Verstärker
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Polynukleotidsynthese werden maskierte Säuren, einschließlich Ester, Anhydride und Nitrite als Auto-Katalysatoren verwendet. Gemäß einer speziellen, bevorzugten Ausführungsform ist der RAC ein PAAC, der bei Bestrahlen mit einer geeigneten Wellenlänge eine Säure bildet. Der katalytische Verstärker ist ein Ester, der gegenüber einer Säure-katalysierten thermolytischen Spaltung durch die von dem PAAC produzierten Säure labil ist. Der Verstärker selbst produziert eine Säure, die verwendet wird, um eine Säure-labile Schutzgruppe zu entfernen. Das Backen des Substrats nach der Bestrahlung ist in einigen Ausführungsformen notwendig, da die Säure-Autokatalyse nur bei Erwärmen auftritt. Eine bevorzugte katalytische maskierte Säure für die Polynukleotidsynthese ist der Ester der Pentafluorbenzoesäure, wie beispielsweise das 1,4-Cyclohex-2-endiylbis(pentafluorbenzoat), das nachfolgend dargestellt ist:
    Figure 00290002
  • sDie Säure katalysiert die Spaltung des Esters, wodurch Pentafluorbenzoesäure und Benzen produziert werden, und sie regeneriert die katalytische Säure. Die produzierte Säure entfernt wirksam die Säure-labilen Gruppen, verursacht jedoch nicht die Degradation oder Depurinierung von Polynukleotiden. Andere nützliche katalytische Verstärker im Bereich der vorliegenden Erfindung umfassen diejenigen, die in Ichimura, Mol. Cryst. Liq. Cryst. (1996) Band 280, S. 307-312, und Ichimura, Chem. Lett. (1995) S. 551-552 identifiziert wurden, sowie diejenigen, die durch die nachfolgenden allgemeinen Formeln dargestellt sind, wobei R jede geeignete Gruppe ist:
    Figure 00300001
    Figure 00310001
  • Die Auswahl der Temperatur ist ferner von den nachfolgenden Syntheseschritten abhängig. Eine zu hohe Temperatur könnte die Synthese-Intermediate beschädigen. Eine zu niedrige Temperatur könnte nicht ausreichen, um die Thermolyse zu aktivieren. Ein geeigneter Temperaturbereich zur Induktion der Säurekatalysierten Thermolyse von 1,4-Cyclohex-2-endiylbis(pentafluorbenzoat) ist 70 bis 100°C.
  • Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung können geeignete Reaktionsbedingungen (einschließlich Temperatur) für eine Vielzahl von Ausführungsformen durch den Fachmann bestimmt werden. Chemische und thermische Stabilität von verschiedenen Verbindungen ist beispielsweise bekannt oder kann einfach bestimmt werden. Eine Versuchsreihe, die die Effizienz der Synthese als Funktion der Temperatur, Bestrahlungsintensität oder Bestrahlungszeit zeigt, liegt im Bereich des Könnens des Fachmanns.
  • Wenn ein Säure-Autokatalyse-System verwendet wird, kann (muss jedoch nicht notwendigerweise) die Schutzgruppe eine Säure-entfernbare Schutzgruppe sein, und das Monomer kann ein Nukleotid sein, das eine Säure-entfernbare Schutzgruppe an seiner C-5'- oder C-3'-Hydroxylgruppe aufweist.
  • Strahlung, Sensibilisatoren und Substrate
  • Die Wahl von Strahlungsquellen basiert auf dem Sensitivitäts-Spektrum des RAC. Eine potentielle Beschädigung der Synthese-Substrate, -Intermediate oder -Produkte wird ebenfalls be rücksichtigt. In einigen Ausführungsformen kann die Strahlung ultraviolettes (UV), infrarotes (IR) oder sichtbares Licht sein. Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist die Strahlungsquelle ein Lichtstrahl mit einer Wellenlänge im Bereich von 190 bis 500 nm, vorzugsweise von 250 bis 450 nm, und besonders bevorzugt von 365 bis 400 nm. Spezifische Strahlungswellenlängen umfassen 193 nm, 254 nm, 313 nm, 340 nm, 365 nm, 396 nm, 413 nm, 436 nm und 500 nm. Geeignete Lichtquellen umfassen Hochdruck-Quecksilberdampflampen und sind problemlos kommerziell von Oriel, OAI, Cannon, A, B Manufacturing erhältlich. Das Sensitivitäts-Spektrum eines RAC kann durch Bereitstellung von Strahlungs-Sensibilisatoren verändert werden. Die Energie des Sensibilisators muss an den PAC angepasst werden und umfasst 2-Ethyl-9,10-dimethoxy-anthracen, Perylen, Phenothiazin, Xanthon und ähnliche. Zahlreiche Strahlungs-Sensibilisatoren sind dem Fachmann bekannt und umfassen die zuvor genannten. Es sollte verstanden werden, dass der Fachmann in der Lage sein wird, auf Basis der vorliegenden Offenbarung problemlos zusätzliche Strahlungs-Sensibilisatoren zu identifizieren.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat herkömmliches Glas, Pyrex, Quarz, irgendeines von einer Vielzahl von polymeren Materialien oder dergleichen. Selbstverständlich kann das Substrat aus jedem einer Vielzahl von Materialien wie beispielsweise Silikon, Polystyren, Polycarbonat oder ähnlichen hergestellt werden. Bei Benutzung wird die Oberfläche des Substrates in geeigneter Weise durch Reinigung, z.B. mit organischen Lösungsmitteln, Methylenchlorid, DMF, Ethylalkohol oder dergleichem behandelt. Wahlweise kann das Substrat mit geeigneten Verbindungs-Molekülen auf der Oberfläche desselben bereitgestellt werden. Die Verbindungs-Moleküle können beispielsweise Aryl-Acetylen, Ethylenglykol, Oligomere, die 2-10 Monomere oder mehr umfassen, Diamine, Di-Säuren, Aminosäuren oder Kombinationen derselben sein. Anschließend wird die Oberfläche mit geschützten, oberflächenaktiven Gruppen, wie beispielsweise tert-Butyloxycarbonyl (TBOC)- oder Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-geschützten Aminosäuren versehen. Solche Techniken sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
  • In den Licht-gesteuerten Verfahren wird das Licht, das durch die Maske scheint, an den Rändern der dunklen Bereiche der Maske in verschieden starkem Ausmass abgelenkt. Daher tritt eine gewisse unerwünschte Entfernung von photosensitiven Schutzgruppen an den Rändern der "dunklen" Bereiche auf. Diese Wirkung wird durch die wiederholte Verschiebung der Maske und durch die nachfolgenden Bestrahlungen verstärkt, was letztlich zu inhomogenen Synthesestellen an den Rändern der vorbestimmten Bereiche führt. Da in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der RAC die Spaltung des Verstärkers katalysiert, wobei eine Säure produziert wird, die verwendet wird, um eine Säure-labile Schutzgruppe zu entfernen, ist die effektive Quanten-Ausbeute der Strahlung sehr viel größer als eins, was zu einer hohen Sensitivität führt. Zusätzlich kann die Sensitivität des Verfahrens durch Kontrolle der Konzentrationen des RAC oder Photo-Katalysators und des Verstärkers auf der Polymer-Matrix optimiert werden. Eine höhere Konzentration resultiert in einer höheren Sensitivität. Weitere Vorteile werden dem Fachmann offensichtlich sein.
  • Anwendungen chemischer Amplifikationsverfahren
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in vielerlei Hinsicht nützlich, insbesondere bei der Analyse von Nukleinsäure, bei den Verfolgen der Genexpression, bei der Amplifikation von Nukleinsäuren, bei der Wirkstoff-Entdeckung, bei der Herstellung von Miniatur-Elektronik, -Mechanik oder anderen -Vorrichtungen und bei dem auf DNA-basierenden Rechnen.
  • A. Nukleinsäureanalyse
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein wirksames Mittel zur Herstellung von Hochdichte-Polynukleotid-Arrays bereit, das bei einer Vielzahl von Anwendungen der Nukleinsäureanalyse erfolg reich eingesetzt worden ist. Polynukleotid-Arrays sind in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) beim Nachweis spezifischer Mutationen oder Polymorphismen und bei der Überprüfung der Genauigkeit und der Beseitigung von Unklarheiten von zuvor bestimmten Sequenzen.
  • B. Verfolgen der Genexpression
  • Polynukleotid-Arrays können verwendet werden, um gleichzeitig die Expression von multiplen Genen oder eventuell allen Genen zu verfolgen, da Transkript-Sequenzen verfügbar werden. Das Verfolgen der Genexpression auf Ebene der mRNAs kann durch Extraktion von mRNA oder Gesamt-RNA aus Geweben oder Zellproben; Fragmentierung und Markierung der RNA-Proben; Hybridisierung der fragmentierten RNA-Proben mit Polynukleotid-Arrays und Nachweis der Hybridisieruungs-Muster zur quantitativen Bestimmung des Gehaltes an spezifischen mRNAs durchgeführt werden. Verschiedene Ebenen der Transkript-Prozessierung, wie beispielsweise RNA-Spleißen können ebenfalls durch Verwendung von Polynukleotid-Arrays verfolgt werden. Spezifische Ausführungsformen für das Verfolgen der Genexpression werden in US-Patent Anmeldungs-Nr. 08/529,115, eingereicht am 15. September 1995, und PCT-Anmeldungs-Nr. PCT/US 96/14839, eingereicht am 13. September 1996, offenbart, die in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke durch Verweis eingeschlossen sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird ferner verwendet, um Nukleinsäure-Sequenzen auf einem Substrat zu immobilisieren. Immobilisierte Nukleinsäure-Sequenzen werden für verschiedene Hybridisierungs-Assays verwendet. Die Hybridisierung solcher immobilisierten Nukleinsäuren mit mRNA-Proben (oder immobilisierten mRNA-Proben) wird in einigen Ausführungsformen nachgewiesen, um die Genexpression zu verfolgen.
  • C. Wirkstoffentdeckungs
  • Die signifikant erhöhte Auflösung, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wurde, erlaubt die Synthese von mehr Polymeren auf einem gegebenen Oberflächenabschnitt. Aus diesem Grund kann die Erfindung verwendet werden, um eine chemische Bibliothek zu bilden und ein Screening nach biologischen Aktivitäten bei einer großen Anzahl von Verbindungen unter Verwendung kombinatorischer Chemie bei der Wirkstoffentdeckung durchzuführen.
  • D. DNA-Rechnen
  • Polynukleotide wurden bei dem auf DNA-basierenden Rechnen verwendet. Räumlich definierte Polynukleotid-Arrays sind nützlich für bestimmte Aufgaben beim DNA-Rechnen. Rechnen mit DNA verwendet die Ligation, die enzymatische Spaltung und die Hybridisierung von Polynukleotiden. In einigen Ausführungsformen werden Polynukleotid-Arrays verwendet, um das Ergebnis einer DNA-Rechnung durch Nachweis des Vorhandenseins von spezifischen Polynukleotiden durch spezifische Hybridisierung zu überprüfen. In einigen anderen Ausführungsformen wird das Rechnen mit DNA durch Manipulation der Polynukleotid-Arrays bewerkstelligt, die mittels chemischer Amplifikation hergestellt wurden.
  • Alternative Ausführungsformen
  • Gemäß weiterer Ausführungsformen wird die räumlich definierte Polymersynthese durch Aufbringen eines Photoresists, wie beispielsweise solche, die in großem Umfang in der Halbleiterindustrie verwendet werden und ausführlicher in Ghandi, "VLSI Fabrication Principles", Wiley (1983), Kapitel 10, besprochen werden, durchgeführt. Gemäß dieser Ausführungsformen wird ein Resist aufgebracht, selektiv bestrahlt und geätzt, was dazu führt, dass ein Teil des Substrates exponiert für die Kopplung verbleibt. Diese Schritte der Aufbruingung des Resists, der selektiven Entfernung des Resists und der Monomerkopplung werden wiederholt, um Polymere der gewünschten Sequenz an den gewünschten Stellen zu bilden.
  • In einigen spezifischen Ausführungsformen wird ein "Positiv-Tone"-Resist, das aus Diazonaphthochinon-novolac (DNQ/N) besteht, in eine Kresol-Formaldehyd-Polymermatrix eingebaut. Dieses Resist und seine Varianten werden routinemäßig in der Mikroelektronik-Industrie für Submikron-Auflösungs-Lithographie verwendet, wie ausführlicher in Reiser, "Photoreactive Polymers: the Science and Technology of Resists", Wiley (1989), erläutert wird. Hochkontrast-Detritylierung bei einer Auflösung von < 4 μm wurde in einfachen Kontakt-Druck-Experimenten mit diesem Resist gezeigt. Unglücklicherweise komplizieren die alkalischen Bedingungen, die benötigt werden, um die DNQ/N-Resiste zu entwickeln (wässrig [OH] > 0,1 M) ihre direkte Verwendung in einer mehrschrittigen Polymersynthese, wie beispielsweise in einem Polynukleotid-Array-Herstellungsverfahren, aufgrund der Hydrolyse von Alkali-labilen Nukleobasen-Schutzgruppen, die verwendet werden, um Nebenreaktionen während der Synthese mit Standardphosphoramidit-Monomeren unter Verwendung von Dimethoxytrityl (DMT) als Schutzgruppe zu verhindern. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Alkali-resistente Säure-labile Nukleobasen-Schutzgruppen, wie beispielsweise Monomethoxytrityl (MMT), und eine Alkali-labile 5'-Hydroxylgruppe, um diese Schwierigkeit zu vermeiden. MMT ist vollständig resistent gegenüber dem wässrigen Alkali-Entwickler, und wird problemlos nach der Synthese mit verdünnter Säure entfernt. Der Alkali-labile Schutz wird für die 5'-Hydroxylgruppe verwendet, so dass diese in denselben alkalischen Lösungen, die für die Entwicklung des Resists verwendet werden, empfindlich für die Spaltung wird, so dass die beiden Prozesse gleichzeitig auftreten. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet die Benzoyl-Gruppe als Alkali-labile Schutzgruppe, weil die Benzoyl-Gruppe ausreichend selektiv für die 5'-Hydroxyl-Gruppe bei der Herstellung des Monomers ist. Acyl-Schutzreste, die sterisch stärker gehindert sind, wie beispielsweise Isobutyryl oder Pivaloyl können ebenfalls verwendet werden um die Selektivität bei der Monomerherstellung zu verstärken.
  • BEISPIEL I
  • Entfernen der Schutzgruppen durch Säureamplifikation
  • Im folgenden Experiment wird die wirksame Entfernung der Schutzgruppe gezeigt, wie sie durch die vorliegende Erfindung gelehrt wird.
  • Es wurde ein System benutzt, das einen Ester der Toluensulfonsäure als einen PAAC und einen autokatalytischen Ester der Pentafluorbenzoesäure (1,4-Cyclohex-2-endiylbis-(pentafluorbenzoat)) als Verstärker verwendet. Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die Zeit und Intensität zu bestimmen, die notwendig sind, um ein wirksames Entfernen des Schutzes zu erreichen.
  • Die Synthese von 1,4-Cyclohex-2-endiylbis-(pentafluorbenzoat) und 2-Nitro-3,4-dimethoxybenzyltosylat wurde nach Houlihan et al., Chemistry of Mat. 3:462-471, 1991, durchgeführt. Die Ausbeuten betrugen jeweils 54% und 62%.
  • Lösungen, die Poly(methylmethacrylat) (PMMA, durchschnittliches Molekulargewicht von 15.000 Dalton) (14,0 Gew.-%), 1,4-Cyclohex-2-endiylbis-(pentafluorbenzoat) (7,0 Gew.-%) und 2-Nitro-3,4-dimethoxybenzyltosylat (0,5, 0,8, 1,2, 1,6, oder 2,3 Gew.-%) in Cyclohexanon enthielten, wurden durch Schleuderbeschichtung als ca. 1 μm dicke Filme auf Glassubstrate aufgebracht, die 5'-Dimethoxytrityl (DMT)-geschützte Grundmoleküle trugen. In diesem Fall ließ man die Oberfläche des Glassubstrates mit DMT-Hexaethyloxyglykol-CE-phosphoramidit reagieren.
  • Die resultierenden Filme wurden bei 85°C für 1 Minute getrocknet (vorgebacken) und anschließend mit ansteigenden Lichtdosen (365-400 nm) von einer kollimierten Quelle (Oriel, Straford, CT) durch eine Chrom-auf-Quarz-Maske in Kontakt mit dem Substrat bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Filme bei 85 °C für 1 Minute nachgebacken und durch Spülen mit Aceton (2 Minuten) abgezogen.
  • Die freie Hydroxyl-Gruppe wurde anschließend mit einer Lösung von Fluorpruime(c) Fluoresceinamidit in Aetonitril unter Verwendung eines modifizierten Appliued Biosystems Inc. (ABI)-DNA Synthesizers umgesetzt. Das Fluoresceinamidit wurde mit den freien Hydroxyl-Gruppen gekoppelt, nicht aber mit den DMT-geschützten Hydroxyl-Gruppen. Die Fluoreszenzabgabe der Oberfläche des Substrates wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops gemessen. Die Effizienz der Kopplung, die als Intensität der Fluoreszenz gemessen wurde, wurde als ein Maß für die Wirksamkeit der Schutzentfernung verwendet.
  • Als Kontrolle, bei der vollständig der Schutz entfernt ist, wurde bei einem anderen Glasobjektträger der Schutz mittels Ethanolamin-Ethanol (1:1 v/v, 30 min) entfernt, und die Fluoreszenzabgabe der Oberfläche des Substrats wurde ebenfalls unter Verwendung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops gemessen. Die Effizienz der Schutzentfernung wurde in Prozent der Schutzentfernung unter Verwendung des Kontroll-Objektträgers als 100% entfernter Schutz ausgedrückt.
  • Eine vollständige Kopplung trat bei geringen Dosen auf, die von 660 mJ/cm2 bis weniger als 33 mJ/cm2 reichten. Wie in 1 gezeigt, war die benötigte Bestrahlungszeit abhängig von der Menge des PAC im Substrat. Wenn eine Formulierung verwendet wurde, die 0,02 g PAC und 0,09 g Ester (Verstärker) pro 1 g der PMMA-Vorratslösung enthielt, betrug die benötigte Bestrahlungsdosis 0,1 J/cm2, was einer Bestrahlungszeit von 3 Sekunden entsprach.
  • BEISPIEL II
  • Hochauflösende-Synthese eines Polynukleotids und Hybridisierung mit einer Polynukleotidsonde
  • Eine weitere wichtige Überlegung für die Anwendung der hier offenbarten Verfahren ist, ob das Verfahren der Schutzentfernung die nachfolgende Synthese und Funktionsfähigkeit der gewünschten Polymer-Arrays stört. Das folgende Experiment zeigt, dass durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung funktionstüchtige Polynukleotid-Arrays synthetisiert wurden.
  • Es wurde eine Kombination eines PAC und eines Verstärkers in Form einer maskierten Säure verwendet, um ein Standard-Schachbrettmuster eines Polynukleotids auf einem Glasträger zu synthetisieren. Der resultierende Glasträger, der die Polynukleotid-Arrays umfasste, wurde mit einer komplementären Polynukleotid-Sonde hybridisiert, um die Auflösung und Integrität der Arrays zu überprüfen.
  • Lösungen, die Poly(methylmethacrylat) (PMMA, durchschnittliches Molekulargewicht 15.000) (14,0 Gew.-%), 1,4-Cyclohex-2-endiyl-bis(pentafluorbenzoat) (7,0 Gew.-%) und 2-Nitro-3,4-dimethoxybenzyltosylat (1,2 Gew.-%) in Cyclohexanon enthielten, wurden durch Schleuderbeschichtung als ungefähr 1 μm dicke Filme auf Glassubstrate aufgebracht, die 5'-Dimethoxytrityl (DMT)-geschützte Grundmoleküle trugen.
  • Die resultierenden Filme wurden bei 85°C für 1 Minute getrocknet (vorgebacken) und anschließend mit Licht einer kollimierten Quelle (Oriel) (0,2 J/cm2, 365-400 nm) durch eine Chrom-auf-Quarz-Maske in Kontakt mit dem Substrat bestrahlt.
  • Nach der Bestrahlung wurden die Filme bei 85°C für 1 Minute nachgebacken und durch Spülen mit Aceton, Ethanol und wiederum Aceton (jede Spülung 2 Minuten) abgezogen. Die freie Hydroxyl-Gruppe wurde anschließend mit einem DMT-geschützten Nu kleotidphosphoramidit in Acetonitril unter Verwendung eines modifizierten Applied Biosytems Inc. (ABI)-DNA Synthesizers umgesetzt. Dieses Beschichtungs-/Bestrahlungs-/Abzieh-Verfahren wurde wiederholt angewendet, um ein Polynukleotid der Sequenz 5'-CATTTACAGC-3' herzustellen.
  • Bei dem resultierenden Polynukleotid wurde mittels Ethanolamin-Ethanol (1:1 v/v, 18 Stunden) der Schutz entfernt, und anschließend wurde es mit einem Fluoreszenz-markiertem Ziel hybridisiert, das die komplementäre Sequenz 5'-GCTGTAAATG-3' umfasste.
  • Die hohe erreichte Fluoreszenz-Intensität, die mit einem Fluoreszenz-Rastermikroskop beobachtet wurde, ist eine Messung der kombinierten Wirksamkeit von Polynukleotidsynthese und Hybridisierung. Die Ausbeute an dem Polymer, das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurde, war vergleichbar zu der das Standard-McNPoc VLSIPS Verfahren. Die Daten zeigen ein Schachbrettmuster mit einer Strukturgröße von 10 μm. Die hohe Fluoreszenzintensität verwies ferner auf eine gute Reinheit der synthetisierten Polynukleotide, wie durch die effiziente Hybridisierung von komplementären Sonden mit den Arrays gezeigt wurde.
  • Wie in 2 dargestellt, wurde mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Auflösung gedruckt, die Linien von 5 μm und 2 μm zeigte. Ein Poly(ethylenglykol)-Verbindungs-Molekül, das eine DMT-geschützte Hydroxylgruppe umfasste, wurde kovalent an das Substrat gebunden. Die Oberfläche des Substrates wurde anschließend mit einem Polymer beschichtet, das einen PAC und einen Verstärker umfasste, und wie oben beschrieben bestrahlt und erwärmt. Der Polymerfilm wurde anschließend entfernt, gefolgt von der Reaktion der freien Hydroxylgruppen mit einem Biotin-Phosphoramidit. Das Bild von 2 wurde durch Inkubation des Substrates mit einer kolloidalen Gold-Markierung erhalten, die an Streptavidin konjugiert war, und unter Verwendung eines Zeiss-Mikroskops mit einer CCD-Kamera nachgewiesen.
  • Wie in 3 zu sehen ist, wurde ein Fluoreszenzbild eines Sonden-Arrays gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung erstellt. Die Sonden variieren in ihrer Länge von 10 bis 20 Basen und wurden durch Wiederholung der Syntheseschritte hergestellt, d.h. Beschichten des Substrates mit einem Polymer, das ein Katalysatorsystem umfasst, Bestrahlen des Substrates, um eine katalytische Reaktion zu initiieren, die die Schutzgruppen von den reaktiven funktionellen Gruppen entfernen soll, Abstreifen der Polymerschicht und anschließendes Zusetzen eines Monomers, das mit den freien reaktiven Gruppen reagieren soll, in der Größenordnung von 30 Mal. Die Größen der Strukturen in 3 variieren von 100 bis 20 μm.
  • BEISPIEL III
  • Lithographische Bewertung
  • Wie in 4 gezeigt, spiegelt der hohe Kontrast, der in Photo-Verfahren beobachtet wurde, die Nicht-Linearität der Antwort als eine Funktion der Bestrahlungsdosis wieder. Bei herkömmlichen Photoresisten rührt diese Nicht-Linearität vom Löslichkeitsverhalten des Polymers her. Obwohl das katalytische Photo-Verfahren, das in dieser Anmeldung beschrieben wird, keinen Entwicklungsschritt umfasst, wurde nicht-lineares Verhalten beobachtet. Dies resultiert wahrscheinlich von einem Titrationseffekt: es muss sich eine Menge an Säure ansammeln, bevor die DMT-Gruppe entfernt wird.
  • Das lithographische Verhalten des Verfahrens wurde bewertet, indem ein 0,5 μm dicker Film von Poly(methylmethacrylat) (PMMA), der den Nitrobenzylester PAC (0,5 Gew.-%) und den Verstärker (8 Gew.-%) mit den folgenden Strukturen enthielt: Photo-aktivierter Katalysator (PAC)
    Figure 00420001
    durch Schleuderbeschichtung auf ein Glassubstrat aufgebracht wurde, das kovalent gebundene Polynukleotide trug, dessen terminale 5'-Hydroxyl-Gruppen DMT-geschützt waren. Die beschichteten Substrate wurden bei 85°C für 2 Minuten vorgebacken, mit verschiedenen Dosen bei 365 nm bestrahlt und bei 85°C für 2 Minuten nachgebacken. Die Polymerbeschichtung wurde anschließend durch Waschen mit Aceton entfernt, und die Oberfläche wurde mit einem Fluoreszenz-Kopplungs-Reagenz behandelt. Wie durch die Sensitivitätskurve in 4 gezeigt, erzeugte das lithographische Verfahren ein direktes Bild mit einer Sensitivität von 600 mJ/cm2 bei 365 nm und einem Kontrast von 3.0. Durch Erhöhung der Konzentration des PAC kann die Sensitivität des Systems signifikant verbessert werden. Dies könnte jedoch zu einer Verringerung im Kontrast führen. Der Kontrast wurde unter Verwendung der Kontrast-Gleichung, wie in Reiser, Arnost, Photoreactive Polymers: the Science and Technology of Resists, S. 226-228 (1989) definiert, berechnet.
  • Zusätzlich zu der Optimierung der Sensitivität und des Kontrastes durch Veränderung der Konzentration des PAC und des Verstärkers ist es ferner möglich, diese beiden Eigenschaften zu beeinflussen, indem man ein Amin zu der Formulierung zusetzt, um die Umwelt-Stabilität und die Auflösung des Resists zu verbessern. Die photokinetische Antwort wurde als Funktion der Konzentration des Trioctylamins gemessen. Wie in 5 dargestellt stieg die Dosis, die notwendig war, um eine vollständige Detritylierung zu erreichen, mit steigenden Konzentrationen von Trioctylamin (ansteigend von 130, 240, 400 und 650 mJ/cm2 für die zugesetzte Base von jeweils 0,0, 0,08, 0,24 und 0,56 Gew.-%.
  • BEISPIEL IV
  • Kopplungs-Effizienz bei der Polynukleotid-Array-Herstellung
  • Wir haben das chemisch amplifizierte Photoverfahren in Verbindung mit Nukleosid-Phosphoramidit-Kopplungschemie verwendet, um Polynukleotide mit gemischten und ungemischten Sequenzen herzustellen. Durch Verwendung eines spaltbaren Verbindungs-Molekül und einer Fluoreszenz-Markierung (FL*Markierung) am 3'-Ende der Sequenz kann das Polynukleotid von dem Glassubstrat entfernt und durch HPLC analysiert werden. Eine typische Sondensequenz hat den folgenden Aufbau (wobei B eine Nukleotidbase repräsentiert): Substrat--Verbindungsmolekül--FL*Markierung--3'-BBBBBB5'-OH
  • Nach der Synthese wurde die Sequenz von der Oberfläche gespalten, und gleichzeitig wurde der Schutz durch Einweichen in Ethanol/Ethylendiamin (1:1 v/v) für 15 Stunden bei 25°C entfernt. Die Sequenz wurde anschließend direkt mittels einer HPLC mit einer Rnionen-Austauscher-Säule und einem Fluoreszenzdetektor analysiert. Um das chemisch amplifizierte Photoverfahren mit herkömmlicher Polynukleotid-Chemie zu vergleichen wurde jede Sonden-Sequenz zweifach synthetisiert: einmal unter Verwendung des chemisch amplifizierten Photoverfahrens für den Schritt der Entfernung des Schutzes und einmal unter Verwendung des herkömmlichen Schutz-entfernenden Reagenzes, 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan (TCA/DCM).
  • Die 6 und 7 zeigen Chromatogramme eines markierten T6-Polymers, das jeweils mittels des chemisch applizierten Photoverfahrens und mittels TCA/DCM synthetisiert wurde. Der vorherrschende Peak bei 21,7 Minuten entspricht dem Polymer voller Länge, wohingegen die kleineren Peaks, die früher eluieren, die kürzeren, trunkierten Polymere repräsentieren. Die Integrationsdaten zeigten, dass die Ausbeute für das Polymer voller Länge 63% unter Verwendung des Photoverfahrens und 80% unter Verwendung von TCA/DCM betrug, was einer schrittweisen Effizienz von jeweils 93% und 96% entspricht. weitere Analysen der übrigen Sequenzen zeigten, dass die schrittweise Kopplungseffizienz für das Photoverfahren von 90 bis 96% reicht, was an die Effizienzen heranreicht, die unter Verwendung von TCA/DCM als Schutz-entfernendes Reagenz erzielt wurden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Zusammensetzungen und Apparate für die Synthese von Polymeren auf Substraten bereit. Es ist verständlich, dass die beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung lediglich illustrativ für einige Anwendungen des erfindungsgemäßen Prinzips sind. Zahlreiche Modifikationen könnten vom Fachmann durchgeführt werden, ohne vom Erfindungsgedanken und vom Bereich der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise wurde die Erfindung primär unter Bezugnahme auf die Verwendung von PAACs, katalytischen Verbindungen, die gegenüber Säurespaltung labil sind, wie beispielsweise Säure-thermolytische Spaltung und Säure-entfernbaren Schutzgruppen, beschrieben, jedoch ist es für den Fachmann einfach zu erkennen, dass Photobasen, Basen-labile Schutzgruppen und andere Systeme, die chemische Amplifikation umfassen, verwendet werden können. Es sollte für den Fachmann offensichtlich sein, dass die Photokatalysator-Bildner Schutzgruppen sein können und autokatalytische Reaktionen durchlaufen können. Es sollte ebenfalls vom Fachmann problemlos erkennbar sein, dass andere Strahlungsquellen als Licht verwendet werden können. Beispielsweise könnte es in einigen Ausführungsformen erwünscht sein, Ausgangsverbindungen zur Bildung von Katalysatoren oder Säuren zu verwenden, die gegenüber der Bestrahlung mit einem Elektronenstrahl, gegenüber Röntgenbestrahlung in Kombination mit Elektronenstrahl-Lithographie oder Röntgenstrahl-Lithographie-Verfahren empfindlich sind. Der Umfang der Erfindung sollte daher nicht unter Bezugnahme der obigen Beschreibung, sondern unter Bezugnahme der anliegenden Ansprüche bestimmt werden.

Claims (29)

  1. Verfahren zum Entfernen einer Schutzgruppe eines Synthese-Zwischenproduktes, Schritte umfassend, bei denen man: a) eine Oberfläche bildet, umfassend i) eine photosensitive Verbindung oder Gruppe, wobei die photosensitive Verbindung oder Gruppe bei Bestrahlung einen Katalysator bildet, und ii) eine autokatalytische Verbindung oder Gruppe, wobei die autokatalytische Verbindung oder Gruppe ein Schutzgruppen-entfernendes Produkt erzeugt, wenn die autokatalytische Verbindung durch den Katalysator aktiviert wird; und b) mindestens einen Teil der Oberfläche bestrahlt, um die Schutzgruppe zu entfernen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein DMT-geschütztes Nukleotid ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die photosensitive Gruppe und die autokatalytische Gruppe Teile derselben Verbindung sind.
  4. Verfahren zur Synthese von Polymeren mit verschiedenen Sequenzen, Schritte umfassend, bei denen man: a) eine Oberfläche bildet, umfassend i) eine photosensitive Verbindung oder Gruppe, wobei die photosensitive Verbindung oder Gruppe bei Bestrahlung einen Katalysator bildet, und ii) eine autokatalytische Verbindung oder Gruppe, wobei die autokatalytische Verbindung oder Gruppe ein Schutzgruppen-entfernendes Produkt erzeugt, wenn die autokatalytische Verbindung durch den Katalysator aktiviert wird; b) mindestens einen Teil der Oberfläche bestrahlt, um die Schutzgruppe zu entfernen; c) die Oberfläche mit einem ersten Monomer in Kontakt bringt; d) mindestens einen anderen Teil der Oberfläche bestrahlt, um die Schutzgruppe zu entfernen; und e) die Oberfläche mit einem zweiten Monomer in Kontakt bringt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, worin die photosensitive Verbindung ein PAC ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, worin die autokatalytische Verbindung eine maskierte Säure ist.
  7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 4, worin das Synthese-Zwischenprodukt eine Aminosäure oder ein Polypeptid ist.
  8. Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren, Schritte umfassend, bei denen man: a) eine Oberfläche bildet, umfassend i) eine photosensitive Verbindung oder Gruppe, wobei die photosensitive Verbindung oder Gruppe bei Bestrahlung einen Katalysator bildet, und ii) eine autokatalytische Verbindung oder Gruppe, wobei die autokatalytische Verbindung oder Gruppe ein Schutzgruppen-entfernendes Produkt erzeugt, wenn die autokatalytische Verbindung durch den Katalysator aktiviert wird; b) mindestens einen Teil der Oberfläche bestrahlt, um die Schutzgruppe zu entfernen; c) die Oberfläche mit einem ersten Monomer in Kontakt bringt; d) mindestens einen anderen Teil der Oberfläche bestrahlt, um die Schutzgruppe zu entfernen; e) die Oberfläche mit einem zweiten Monomer in Verbindung bringt; f) die Schritte a bis e wiederholt, um Polynukleotid-Anordnungen von gewünschter Länge zu synthetisieren; und g) eine Ziel-Nukleinsäure mit den Polynukleotid-Anordnungen hybridisiert.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 8, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein Verbindungs-Molekül ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 8, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein Nukleotid oder ein Polynukleotid ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 8, worin die entfernbare Schutzgruppe eine Säure-entfernbare Gruppe ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 8, worin die photosensitive Verbindung Toluolsulfonsäure ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 8, worin die photosensitive Verbindung Pentafluorbenzoesäure ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 8, worin die entfernbare Schutzgruppe 5'-Dimethoxytrityl ist.
  15. Vorrichtung zur chemischen Festphasensynthese, die ein Substrat umfasst, das i) ein Synthese-Zwischenprodukt umfasst, das eine entfernbare Schutzgruppe umfasst; ii) eine photosensitive Verbindung oder Gruppe umfasst, wobei die photosensitive Verbindung oder Gruppe bei Bestrahlung einen Katalysator bildet, und iii) eine autokatalytische Verbindung oder Gruppe umfasst, wobei die autokatalytische Verbindung oder Gruppe ein Schutzgruppen-entfernendes Produkt erzeugt, wenn die autokatalytische Verbindung durch den Katalysator aktiviert wird.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die photosensitive Verbindung ein PAC ist.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die autokatalytische Verbindung eine maskierte Säure ist.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein Verbindungs-Molekül ist.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein Nukleotid ist.
  20. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein Polynukleotid ist.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Synthese-Zwischenprodukt eine Aminosäure ist.
  22. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Synthese-Zwischenprodukt ein Polypeptid ist.
  23. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die entfernbare Schutzgruppe eine Säure-entfernbare Gruppe ist.
  24. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin der PAC Toluolsulfonsäure ist.
  25. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die autokatalytische Verbindung Pentafluorbenzoesäure ist.
  26. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die Säure-entfernbare Schutzgruppe 5'-Dimethoxytrityl ist.
  27. Verfahren zur Synthetese eines Polymer-Arrays auf einem Substrat, Schritte umfassend, bei denen man: a) eine Oberfläche des Substrates bereitstellt, die eine oder mehrere darauf gebundene Synthese-Zwischenprodukte und ein Katalysatorsystem aufweist, wobei die Synthese-Zwischenprodukte eine reaktive Gruppe aufweisen, die durch eine Schutzgruppe vor einer Reaktion geschützt ist; b) die Oberfläche des Substrates mit einer Strahlung bestimmter Wellenlänge bestrahlt; c) eine katalytische Reaktion initiiert, um die Schutzgruppe von den Synthese-Zwischenprodukten zu entfernen, um ungeschützte reative Gruppen zu erhalten; d) ein anschließend zugefügtes Synthese-Zwischenprodukt mit der ungeschützten reaktiven Gruppe umsetzt, wobei das anschließend zugefügte Synthese-Zwischenprodukt eine reaktive Gruppe aufweist, die durch eine Schutzgruppe vor einer Reaktion geschützt ist; e) die Schritte b) bis d) wiederholt, oder nicht, bis eine gewünschte Polymersequenz erhalten wird.
  28. Substrat zur Verwendung bei der Herstellung eines Polymer-Arrays, umfassend a) ein Substrat mit ein oder mehreren darauf gebundenen Synthese-Zwischenprodukten, wobei die Synthese-Zwischenprodukte eine reaktive Gruppe aufweisen, die durch eine Schutzgruppe vor einer Reaktion geschützt ist, und b) ein Katalysatorsystem, das die Synthese-Zwischenprodukte in Kontakt bringt und in der Lage ist, das Entfernen der Schutzgruppe zu katalysieren.
  29. Verfahren zur Herstellung eines Substrates zur Verwendung bei der Herstellung eines Polymer-Arrays, Schritte umfassend, bei denen man a) eine Substratoberfläche mit einem oder mehreren darauf gebundenen Synthese-Zwischenprodukte bereitstellt, wobei die Synthese-Zwischenprodukte eine reaktive Gruppe aufweisen, die durch eine Schutzgruppe vor einer Reaktion geschützt sind; b) über die Substratoberfläche eine Polymerschicht zieht, die ein Katalysatorsystem aufweist, das in der Lage ist, das Entfernen der Schutzgruppe zu katalysieren.
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