DE69725592T2 - Verfahren zur gewinnung einer gereignigten matrix auf kollagenbasis aus submukosa gewebe - Google Patents
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Description
- Technisches Gebiet
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Gewinnung gereinigter Formen einer Matrix auf Kollagenbasis aus Submukosagewebe, die sich als implantierbare medizinische Struktur und insbesondere als Transplantat eignet.
- Hintergrund der Erfindung
- Gewebsimplantate in gereinigter Form, die aus Materialien auf Kollagenbasis stammen, wurden bereits hergestellt und in der Literatur beschrieben. Kohäsive Filme mit hoher Zugfestigkeit wurden unter Verwendung von Kollagenmolekülen oder Materialien auf Kollagenbasis hergestellt. Im Allgemeinen wurden jedoch Aldehyde zur Vernetzung der Kollagenmoleküle zur Herstellung von Filmen mit hoher Zugfestigkeit verwendet. Bei diesen Materialarten können die Aldehyde aus dem Film auslaufen, beispielsweise bei Hydrolyse. Da diese Reste zytotoxisch sind, eignen sich die Filme nur schlecht als Gewebsimplantate.
- Es wurden auch schon andere Techniken entwickelt, um Gewebsimplantate auf Kollagenbasis herzustellen und dabei die Probleme im Zusammenhang mit den mit Aldehyd vernetzten Kollagenmolekülen zu vermeiden. Eine solche Technik ist in US Patent Nr. 5.141.747 veranschaulicht, bei der die Kollagenmoleküle an ihren Lysin-Epsilon-Aminogruppen erst vernetzt oder gebunden und die gebundenen, und vorzugsweise modifizierten, Kollagenmoleküle anschließend denaturiert werden. Die offenbarte Verwendung dieses Kollagenmaterials dient der Wiederherstellung von Trommelfelldefekten. Obwohl offenbart wird, dass diese Membranen gute physikalische Eigenschaften aufweisen und bei der anschließenden Aufarbeitung sterilisiert werden, können sie kein Zellwachstum remodellieren oder generieren und im Allgemeinen können sie auch nicht neues Wachstum fördern oder verletzte oder kranke Gewebsstrukturen heilen.
- Im Allgemeinen arbeiten Forscher im Bereich der Chirurgie schon seit vielen Jahren an der Entwicklung neuer Techniken und Materialien zur Verwendung als Implantate und Transplantate als Ersatz oder zur Wiederherstellung verletzter oder kranker Gewebsstrukturen, wie beispielsweise Blutgefäße, Muskeln, Bänder, Sehnen und dergleichen. Es ist heute beispielsweise nicht unüblich, dass ein orthopädischer Chirurg eine Patellarsehne autogenen oder allogenen Ursprungs entnimmt, um sie als Ersatz für ein gerissenes Kreuzband einzusetzen. Die Operationsmethoden für diese Techniken sind bekannt. Ferner ist es üblich, dass Chirurgen implantierbare Prothesen aus Plastik, Metall und/oder Keramikmaterial zur Rekonstruktion oder zum Ersatz physiologischer Strukturen einsetzen. Trotz ihrer verbreiteten Anwendung weisen operativ implantierte Prothesen aber Risiken für den Patienten auf.
- Die Forscher haben auch versucht, zufriedenstellende Polymer- oder Plastikmaterialen zu entwickeln, die als solche funktionellen Gewebsstrukturen und/oder andere Bindegewebsstrukturen dienen, z. B. in Verbindung mit Hernien und Gelenkluxationen. Es wurde entdeckt, dass es schwierig ist, ein robustes und haltbares Plastikmaterial bereitzustellen, das sich als langfristiger Bindegewebsersatz eignet. Die das Plastikmaterial umgebenden Gewebe können sich infizieren, und Schwierigkeiten bei der Behandlung dieser Infektionen führen häufig zum Versagen des Implantats oder der Prothesen.
- Wie oben erwähnt wurden auch schon diverse Materialien auf Kollagenbasis für den oben erwähnten Gewebsersatz verwendet; diese Materialien haben aber entweder nicht die erforderliche Zugfestigkeit oder es gab Probleme mit Infektionen und anderen immunogenen Reaktionen, Verkapselung oder Probleme bei Beladung mit Antibiotika, Wachstumsfaktoren und dergleichen. US Patent Nr. 4.956.178 offenbart beispielsweise eine Submukosakollagen-Matrix aus dem Darmkanal von Säugetieren; es wird aber offenbart, dass die Kollagenmatrix mit Antibiotika beladen ist. In einem verwandten Patent, US Patent Nr. 5.372.821 wird offenbart, dass eine Submukosakollagen-Matrix mit herkömmlichen Techniken sterilisiert werden kann, z. B. Aldehydgerbung, Propylenoxid, Gammastrahlen und Peressigsäure. Es werden keine speziellen Verfahrensschritte offenbart, außer, dass die Submukosaschicht vor der Sterilisationsbehandlung zunächst vom umliegenden Gewebe entlaminiert wird.
- Es besteht daher ein Bedarf nach verbesserten gereinigten Formen von Matrizen auf Kollagenbasis aus entsprechenden Gewebequellen. Es besteht auch ein Bedarf nach einem Verfahren, mit dem die Entnahme dieser Matrizen aus den Gewebequellen erleichtert wird, damit solche verbesserten gereinigten Produkte erhalten werden. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit diesen Anforderungen.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zur Gewinnung einer Matrix auf Kollagenbasis aus einer Submukosagewebe-Quelle. Das Verfahren umfasst die Behandlung der Submukosagewebe-Quelle mit einem Desinfektionsmittel zur Bereitstellung einer desinfizierten Submukosagewebe-Quelle und Entfernung der Matrix auf Kollagenbasis von der desinfizierten Submukosagewebe-Quelle.
- Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren bereit für die Gewinnung einer Matrix auf Kollagenbasis aus einer Submukosagewebe-Quelle, das die Bereitstellung einer mit einem Desinfektionsmittel behandelten Submukosagewebe-Quelle und die Entfernung der Matrix auf Kollagenbasis von der Submukosagewebe-Quelle umfasst.
- Das erfindungsgemäße Verfahren liefert gereinigte Formen von Kollagenmatrizen aus Tela submucosa aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren, wobei die Matrizen eine biologische Belastung von im Wesentlichen Null aufweisen und/oder im Wesentlichen pyrogenfrei sind. Eine bevorzugte Kollagenmatrix kann in einen menschlichen oder tierischen Patienten implantiert werden, bei den meisten Patienten ohne eine zytotoxische Reaktion, Infektion, Abstoßung des Implantats oder andere schädliche Wirkungen hervorzurufen. Während eine bevorzugte implantierbare Kollagenmatrix, die gemäß einigen Aspekten des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde, primär Tela submucosa enthält, kann die Kollagenmatrix in diesem Fall auch Teilschichten aus Laminarmuskularis-Mukosa, Muskularis-Mukosa, Lamina propria, eine Schicht des Stratum compactum und/oder andere ähnliche Gewebematerialien, je nach Quelle, aus der sie stammt, enthalten.
- Ferner wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine gereinigte entlaminierte Kollagenmatrix aus Tela submucosa bereitgestellt, die aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren oder Menschen gewonnen wird, worin die gereinigte Submukosakollagen-Matrix durch Entlaminieren einer desinfizierten Quelle aus Tela submucosa zur Gewinnung der entlaminierten Kollagenmatrix aus Tela submucosa hergestellt wird. Eine vorteilhafte Matrix kann beispielsweise durch ein Verfahren erhalten werden, das die Behandlung einer unbearbeiteten, nicht entlaminierten Quelle von Tela submucosa aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren mit einem Desinfektionsmittel und anschließende Entlaminierung der Kollagenmatrix aus Tela submucosa vom anhängenden Gewebe umfasst. Die bevorzugte Kollagenmatrix weist eine biologische Belastung von im wesentlichen Null auf und kann in einen menschlichen oder tierischen Patienten implantiert werden, bei den meisten Patienten ohne eine zytotoxische Reaktion, Infektion, Abstoßung des Implantats oder eine andere schädliche Wirkung hervorzurufen.
- Ferner wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Verfahren zur Erhaltung einer hochreinen entlaminierten Kollagenmatrix aus Tela submucosa in einem im Wesentlichen sterilen Zustand bereitgestellt, worin eine desinfizierte Gewebequelle aus Tela submucosa zur Gewinnung der entlaminierten Kollagenmatrix aus Tela submucosa entlaminiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Behandlung einer nicht entlaminierten Quelle von Tela submucosa aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren oder Menschen mit einem Desinfektionsmittel und anschließende Entlaminierung der Tela submucosa von ihren anderen Ursprungsgeweben, die noch an der Tela submucosa anhaften.
- Ferner wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine hochreine Kollagenmatrix aus Tela submucosa bereitgestellt, die aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren gewonnen wird und eine biologische Belastung von nahezu Null aufweist, worin die Kollagenmatrix aus Tela submucosa im Wesentlichen keine Oberflächentrümmer enthält, z. B. im Wesentlichen kein Muskelgewebe, Schleimhautschichten, Lipide oder Zellreste. Die bevorzugte Kollagenmatrix kann in einen menschlichen oder tierischen Patienten implantiert werden, bei den meisten Patienten ohne eine zytotoxische Reaktion, Infektion, Abstoßung des Implantats oder eine andere schädliche Wirkung für den Patienten hervorzurufen.
- Ferner wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine hochreine Tela submucosa bereitgestellt, die aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren gewonnen wird und worin die Tela submucosa in einem im Wesentlichen sterilen Zustand mit Wachstumsfaktoren entlaminiert wird, und die durch Spülen der entlaminierten Quelle von Tela submucosa mit einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Wasser, und anschließender Behandlung mit einem Desinfektionsmittel, vorzugsweise einer Persäure, bei einem pH-Wert von ca. 1,5 bis ca. 10 und anschließender Entlaminierung der Tela submucosa vom anhängenden Gewebe hergestellt wird. Die Persäure ist bei pH-Werten über 7 gepuffert. Es ist wünschenswert, dass so hergestellte Kollagenmatrizen einen ziemlich hohen Gehalt an einem oder mehreren Wachstumsfaktoren aufweisen.
- Ferner wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Gewebetransplantatzusammensetzung bereitgestellt, die eine im Wesentlichen pyrogenfreie Kollagenmatrix aus Tela submucosa enthält. Bevorzugtere Zusammensetzungen dieser Art enthalten eine Kollagenmatrix aus Tela submucosa, die einen Pyrogengehalt von ca. 1 Endotoxin-Einheit pro Gramm (EU/g) oder weniger aufweist.
- Ferner zeigt eine hochreine Tela submucosa gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben aktive Angiogenese in vivo bei Implantation in einen menschlichen oder tierischen Patienten.
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung gereinigter, implantierbarer Gewebestrukturen, die sich zur Förderung des Nachwachsens und Heilens verletzter oder erkrankter Gewebestrukturen eignen. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit Verfahren zur Gewinnung gereinigter Formen von Kollagenmatrix aus Tela submucosa, die sich zur Verwendung als implantierbares Gewebe eignen.
- Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
- Kurze Beschreibung der Zeichnung
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1 zeigt eine perspektivische Ansicht einer röhrenförmigen Transplantatstruktur, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde. - Detaillierte Beschreibung
- Zum besseren Verständnis der Grundsätze der Erfindung wird nun Bezug genommen auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, und zur Beschreibung dieser Ausführungsformen werden spezielle Begriffe verwendet. Es versteht sich aber dennoch, dass damit nicht beabsichtigt ist, den Umfang der Erfindung einzuschränken, so dass Änderungen, weitere Abwandlungen und Anwendungen der Grundsätze der Erfindung wie hierin beschrieben denen entsprechen, die einem Fachmann auf dem Gebiet, mit dem sich die Erfindung befasst, normalerweise geläufig wären.
- In der Beschreibung werden mehrere Begriffe verwendet. Damit die Beschreibung und die Ansprüche klar und konsistent verständlich sind, werden folgende Definitionen gegeben.
- Biologische Belastung – dieser Begriff bezieht sich auf lebende Mikroorganismen, angegeben in koloniebildenden Einheiten (CFU), die auf und/oder in einer gegebenen Materialmenge gefunden werden. Beispiele von Mikroorganismen sind Bakterien, Pilze und deren Sporen.
- Desinfektion – dieser Begriff bezieht sich auf eine Verringerung der biologischen Belastung eines Materials.
- Steril – dieser Begriff bezieht sich auf einen Zustand, in dem ein Material eine solche biologische Belastung aufweist, dass die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens eines lebenden Mikroorganismus (CFU) auf und/oder in einem gegebenen Abschnitt des Materials bei 1 : 1.000.000 oder darunter liegt.
- Pyrogen – dieser Begriff bezieht sich auf eine Substanz, die nach Einführung in einen Wirt eine fieberhafte Reaktion hervorruft.
- Endotoxin – dieser Begriff bezieht sich auf ein bestimmtes Pyrogen, das Teil der Zellwand gramnegativer Bakterien darstellt. Endotoxine werden kontinuierlich von den Bakterien und verunreinigten Materialien abgegeben.
- Reinigung – dieser Begriff bezieht sich auf die Behandlung eines Materials zur Entfernung ein oder mehrerer Verunreinigungen, die im Material vorliegen, beispielsweise Verunreinigungen, die schon von Natur aus im Material vorliegen, und/oder Mikroorganismen oder Bestandteile davon, die im Material vorliegen. Zur Veranschaulichung können die Verunreinigungen jene Verunreinigungen sein, die bekanntlich Toxizität, Infektiosität, Pyrogenität, Reizpotential, Reaktivität, hämolytische Aktivität, Karzinogenität und/oder Immunogenität verursachen.
- Biokompatibilität – dieser Begriff bezieht sich auf die Fähigkeit eines Materials, den in der Norm der International Standards Organization (ISO) Nr. 10993 und/oder dem amerikanischen Arzneibuch (USP) 23 und/oder dem Blue Book Memorandum Nr. G95-1 der U.S. Food and Drug Administration (FDA) mit dem Titel „Use of International Standard ISO-10993, Biological Evaluation of Medical Devices Part – 1: Evaluation and Testing [Anwendung der ISO-Norm 10993, biologische Auswertung von Medizinprodukten Teil – 1: Beurteilung und Tests]" beschriebenen Biokompatibilitätstest zu bestehen. In der Regel dienen diese Tests der Untersuchung der Toxizität, Infektiosität, Pyrogenität, des Reizpotentials, der Reaktivität, hämolytischen Aktivität, Karzinogenität und/oder Immunogenität eines Materials. Eine biokompatible Struktur oder ein biokompatibles Material ruft bei den meisten Patienten nach Einführung in den Körper keine Nebenwirkung oder unerwünschte Reaktion hervor. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass Biokompatibilität durch andere Verunreinigungen, wie z. B. Prionen, Tenside, Oligonucleotide und andere Biokompatibilität hervorrufende Mittel oder Verunreinigungen bewirkt werden kann.
- Verunreinigung – dieser Begriff bezieht sich auf eine unerwünschte Substanz auf einem Material, an einem Material haftend oder in einem Material. Dazu zählt, ohne aber darauf beschränkt zu sein: biologische Belastung, Endotoxine, Verarbeitungshilfsmittel wie z. B. antimikrobielle Mittel, Blut, Blutbestandteile, Viren, DNA, RNA, Sporen, Fragmente unerwünschter Gewebeschichten, Zellreste und Schleimhaut.
- Tela submucosa – dieser Begriff bezieht sich auf eine Schicht aus kollagenhaltigem Bindegewebe, das in den meisten Schleimhautteilen im Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen und dem Genitaltrakt von Tieren vorkommt.
- Wie oben erwähnt stellt das erfindungsgemäße Verfahren allgemein Transplantate und Materialien bereit, die eine gereinigte Matrixstruktur auf Kollagenbasis aufweisen. Vorteilhafte Transplantate werden aus einer Submukosagewebe-Quelle, beispielsweise einschließlich tierischer Gewebe wie Gewebe von Menschen oder anderen Säugetieren, z. B. Schweine-, Rinder- oder Schafgewebe, gewonnen.
- Wie viele tierische Gewebe ist auch Tela submucosa im natürlichen Zustand im Allgemeinen aseptisch, sofern der Mensch oder das Tier keine Infektion oder Krankheit hat. Dies trifft besonders zu, weil die Tela submucosa eine innere Schicht im Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen und dem Genitaltrakt von Tieren ist. Deshalb kommt sie im Allgemeinen nicht mit Bakterien und anderen Zellresten wie dem Darmepithel in Berührung. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, dass durch Desinfektion des Ursprungsgewebes für die Tela submucosa vor der Entlaminierung der aseptische Zustand der Schicht aus Tela submucosa konserviert oder im Wesentlichen konserviert werden kann, insbesondere, wenn das Entlaminierungsverfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird.
- Insbesondere wurde entdeckt, dass durch Desinfektion der Quelle von Tela submucosa und anschließender Entfernung einer gereinigten Matrix, die die Tela submucosa enthält, z. B. durch Entlaminierung der Tela submucosa von der Tunica muscularis und der Tunica mucosa, die Exposition der Tela submucosa mit Bakterien und anderen Verunreinigungen minimiert wird. Dies ermöglicht wiederum die Minimierung der Exposition der isolierten Matrix aus Tela submucosa gegenüber Desinfektionsmitteln oder Sterilisierungsmitteln, falls gewünscht, so dass die der Tela submucosa eigene Biochemie und viele der vorteilhaften Wirkungen der Tela submucosa erhalten bleiben.
- Eine implantierbare Kollagenmatrix aus Tela submucosa, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen wird, kann wie oben beschrieben aus dem Magen-Darm-Trakt, den Atemwegen, den Harnwegen oder dem Genitaltrakt von Tieren gewonnen werden. Vorzugsweise werden die Gewebe aus Tela submucosa, die auf Kollagen basieren und somit im Wesentlichen Kollagen enthalten, aus dem Magen-Darm-Trakt von Säugetieren und ganz besonders bevorzugt aus dem Darmtrakt von Schweinen gewonnen. Eine besonders bevorzugte Quelle im ganzen Dünndarm wird aus ausgewachsenen Schweinen mit einem Gewicht über ca. 450 Pfund gewonnen. Därme von gesunden Tieren enthalten Blutgefäße und der Darmtrakt ist durchblutet, und sie enthalten verschiedene Mikroben wie z. B. E. coli im Darmlumen. Daher werden diese Verunreinigungen durch Desinfektion des gesamten Darms vor der Entlaminierung der Tela submucosa im Wesentlichen entfernt, so dass ein bevorzugtes implantierbares Gewebe aus Tela submucosa erhalten wird, das im Wesentlichen frei von Blut und Blutbestandteilen und anderen mikrobiellen Organismen, Pyrogenen oder anderen Erregern ist. Es wird davon ausgegangen, dass dieses Verfahren den der Tela submucosa eigenen aseptischen Zustand im Wesentlichen konserviert, wobei aber zu verstehen ist, dass die vorliegende Erfindung nicht durch eine Theorie eingeschränkt werden soll.
- Ferner ist es wünschenswert, dass die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Kollagenmatrix im Wesentlichen frei von Antibiotika, antiviralen Mitteln oder antimikrobiellen Mitteln ist, welche die Biochemie der Matrix und ihre Wirksamkeit nach der Implantation beeinträchtigen könnten. In der Vergangenheit sah ein Verfahren zur Behandlung solcher Gewebematerialien Spülen des entlaminierten Gewebes in Kochsalzlösung und Einweichen des Materials in einem antimikrobiellen Mittel, wie z. B. in U.S. Patent Nr. 4.956.178 beschrieben, vor. Solche Techniken können fakultativ zwar mit isolierter Submukosa durchgeführt werden, aber bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren vermeiden die Verwendung von antimikrobiellen Mitteln und dergleichen, die nicht nur die Biochemie der Kollagenmatrix beeinträchtigen, sondern auch unnötigerweise in die Gewebe des Patienten eingeführt werden könnten.
- Wie oben besprochen wurde entdeckt, dass eine hochreine Form einer implantierbaren Kollagenmatrix aus Tela submucosa erhalten werden kann, wenn zunächst eine Quelle von Tela submucosa vor dem Entfernen einer gereinigten Kollagenmatrix, die die Schicht aus Tela submucosa enthält, z. B. durch Entlaminieren der Quelle von Tela submucosa, desinfiziert wird. Es wurde auch entdeckt, dass bestimmte Verarbeitungsvorteile und verbesserte Eigenschaften der resultierenden Schicht aus Tela submucosa mit diesem Verfahren erhalten werden, einschließlich leichtere Entfernung der anhängenden Gewebe von der Submukosaschicht und ein charakteristisches geringes Verunreinigungsprofil.
- In erfindungsgemäßen Verfahren wird die Quelle von Tela submucosa vorzugsweise ein oder mehrmals mit einem Lösungsmittel, zweckmäßigerweise Wasser, gespült. Im Anschluss an den Spülschritt erfolgt eine Behandlung mit einem Desinfektionsmittel. Das Desinfektionsmittel ist bevorzugt ein Oxidationsmittel. Bevorzugte Desinfektionsmittel sind Peroxy-Verbindungen, vorzugsweise organische Peroxy-Verbindungen und insbesondere Persäuren. Diese Desinfektionsmittel werden bevorzugt in einem flüssigen Medium verwendet, vorzugsweise in einer Lösung mit einem pH-Wert von ca. 1,5 bis ca. 10, insbesondere mit einem pH-Wert von ca. 2 bis ca. 6, und ganz besonders bevorzugt mit einem pH-Wert von ca. 2 bis ca. 4. In den erfindungsgemäßen Verfahren wird das Desinfektionsmittel im Allgemeinen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer verwendet, die zur Gewinnung charakteristischer, gereinigter Submukosa-Matrizen wie hierin beschrieben führen, die bevorzugt eine biologische Belastung von im Wesentlichen Null aufweisen und/oder im Wesentlichen pyrogenfrei sind. In dieser Hinsicht umfassen wünschenswerte erfindungsgemäße Verfahren das Eintauchen der Gewebequelle (z. B. durch Untertauchen oder Abduschen) in einem flüssigen Medium, das das Desinfektionsmittel enthält, für einen Zeitraum von mindestens ca. 5 Minuten, in der Regel ca. 5 Minuten bis ca. 40 Stunden und speziell ca. 0,5 Stunden bis ca. 5 Stunden.
- Ein bevorzugtes Peroxy-Desinfektionsmittel ist Wasserstoffperoxid. Die Konzentration von Wasserstoffperoxid kann zwischen 0,05 Vol.-% und 30 Vol.-% schwanken. Insbesondere beträgt die Wasserstoffperoxid-Konzentration zwischen ca. 1 Vol.-% und 10 Vol.-% und ganz besonders bevorzugt bei ca. 2 Vol.-% bis 5 Vol.-%. Die Lösung kann auf einen pH-Wert von ca. 5 bis 9 gepuffert sein. Insbesondere liegt der pH-Wert bei 6 bis 7,5. Diese Konzentrationen können in Wasser oder einer wässrigen Lösung von ca. 2 Vol.-% bis ca. 30 Vol.-% Alkohol verdünnt werden. Ganz besonders bevorzugt ist der Alkohol Ethanol. Die Temperatur der Lösung kann zwischen ca. 15 und 50°C schwanken. Insbesondere liegt die Temperatur der Lösung im Bereich von ca. 20 bis 40°C. Ganz besonders bevorzugt beträgt die Temperatur der Lösung ca. 32 bis 37°C. Die Expositionszeit kann zwischen ca. 10 und 400 Minuten schwanken. Vorzugsweise beträgt die Expositionszeit ca. 120 bis 240 Minuten. Insbesondere beträgt die Expositionszeit 180 bis 210 Minuten.
- Ein bevorzugtes organisches Peroxid-Desinfektionsmittel ist Perpropionsäure. Die Konzentration von Perpropionsäure kann zwischen ca. 0,1 Vol.-% und 10 Vol.-% schwanken. Insbesondere beträgt die Perpropionsäure-Konzentration zwischen ca. 0,1 Vol.-% und 1,0 Vol.-% und ganz besonders bevorzugt ca. 0,2 Vol.-% bis 0,5 Vol.-%. Diese Perpropionsäure-Konzentrationen können in Wasser oder einer wässrigen Lösung von ca. 2 Vol.-% bis ca. 30 Vol.-% Alkohol verdünnt werden.
- Ganz besonders bevorzugt ist der Alkohol Ethanol. Die Gewebequelle aus Tela submucosa kann ca. 15 Minuten bis ca. 40 Stunden mit der organischen Peroxid-Lösung in Kontakt gebracht werden, insbesondere zwischen ca. 0,5 Stunden und ca. 8 Stunden. Weitere Peroxy-Desinfektionsmittel, die sich zur Anwendung eignen, sind in „Peroxygen Compounds", S. Block, in Disinfection, Sterilisation and Preservation, S. Block, Herausgeber, 4. Ausgabe, Philadelphia, Lea & Febiger, S. 167–181, 1991; und „Disinfection with peroxygens", M. G. C. Baldry and J. A. L. Fraser, in Industrial Biocides, K. Payne, Herausgeber, New York, John Wiley and Sons, S. 91–116, 1988, beschrieben.
- Ein weiteres oxidierendes Desinfektionsmittel ist Chlorhexidin (1,6-Di(4-chlorphenyldiguanido)hexan) in seiner Digluconat-Form. Die Konzentration von Chlorhexidin-Digluconat kann im Bereich von ca. 0.1 Gew.-% bis 15 Gew.-% liegen. Insbesondere liegt die Chlorhexidin-Digluconat-Konzentration im Bereich von ca. 0.1 Gew.-% bis 2 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt bei ca. 0,2 Gew.-% bis 5 Gew.-%. Die Lösung kann auf einen pH-Wert von ca. 5 bis 8 gepuffert sein. Insbesondere liegt der pH-Wert bei ca. 5,5 bis 7. Diese Konzentrationen können in Wasser oder einer wässrigen Lösung von ca. 2 Vol.-% bis ca. 20 Vol-% Alkohol verdünnt werden. Ganz besonders bevorzugt ist der Alkohol Ethanol in einer Konzentration von ca. 5% bis 10%. Die Temperatur der Lösung kann zwischen ca. 15 und 30°C schwanken. Die Expositionszeit kann zwischen ca. 10 und 400 Minuten schwanken. Vorzugsweise beträgt die Expositionszeit ca. 30 bis 60 Minuten. Weitere Chlormittel sind in „Chlorhexidine", G. W. Denton, in Disinfection, Sterilisation and Preservation, S. Block, Herausgeber, 4. Ausgabe, Philadelphia, Lea & Febiger, S. 274–289, 1991, beschrieben.
- In bevorzugten Herstellungsverfahren kann eine Persäure oder ein anderes Desinfektionsmittel in einer verdünnten wässrigen Alkohollösung, in der der Alkohol vorzugsweise 1 bis ca. 6 Kohlenstoffatome aufweist und in der der Alkohol im Allgemeinen ca. 1 Vol.-% bis ca. 30 Vol.-% der Lösung enthält, gelöst sein. Bevorzugtere Alkohole zur Verwendung in der Erfindung sind ausgewählt aus der Ethanol, Propanole und Butanole umfassenden Gruppe. Ethanol ist der für diese Zwecke am meisten bevorzugte Alkohol.
- Wenn für die Desinfektion eine Persäure verwendet wird, wird diese vorzugsweise aus der Peressigsäure, Perpropionsäure oder Perbenzoesäure umfassenden Gruppe ausgewählt. Peressigsäure wird als Desinfektionsmittel besonders bevorzugt. Die Peressigsäure wird vorzugsweise in ca. 2 Vol.-% bis ca. 10 Vol.-% alkoholischer Lösung verdünnt. Die Konzentration der Peressigsäure kann beispielsweise zwischen ca. 1,0 Vol.-% bis ca. 0,5 Vol.-% schwanken. Ganz besonders bevorzugt liegt die Konzentration der Peressigsäure bei ca. 0,1 Vol.-% bis ca. 0,3 Vol.-%. Wasserstoffperoxid kann ebenfalls als Desinfektionsmittel verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Gewebequelle aus Tela submucosa, z. B. aus dem Dünndarm, mit Desinfektionsmitteln wie Glutaraldehyd, Formalin und dergleichen desinfiziert werden, die auch für ihre Fähigkeit bekannt sind, in Kollagenmatrizen zu erheblicher Vernetzung zu führen, im Gegensatz zur Wirkung anderer Desinfektionsmittel wie z. B. Persäuren, die zur Desinfektion verwendet werden können, ohne Vernetzung herbeizuführen. Darüber hinaus kann die Quelle von Tela submucosa durch Strahlung, z. B. Gammastrahlung, für Desinfektionszwecke behandelt werden.
- Variationen des Desinfektionsverfahrens können auch folgende umfassen:
- 1. Darm wird mit 0,2% Peressigsäure, 5% ethanolischer Lösung im Gewichtsverhältnis von Lösung zu Darm von 10 : 1 behandelt. Die Lösung weist einen pH-Wert von 2,6 auf. Lösung und Darm werden zwei Stunden lang kräftig miteinander gemischt.
- 2. Darm wird mit 1% Peressigsäure, 25% ethanolischer Lösung im Gewichtsverhältnis von Lösung zu Darm von 5 : 1 behandelt. Die Lösung weist einen pH-Wert von 2 auf. Lösung und Darm werden eine Stunde lang kräftig miteinander gemischt.
- 3. Darm wird mit 1% Peressigsäure, 15% Ethanol und 10% Wasserstoffperoxid-Lösung im Gewichtsverhältnis von Lösung zu Darm von 5 : 1 behandelt. Lösung und Darm werden eine Stunde lang kräftig miteinander gemischt.
- 4. Ein ganzer Dünndarm wird vier Mal mit hochreinem Wasser 15 Minuten lang gespült. Der Darm wird dann mit einem Elektronenstrahl mit 1,5 MRAD behandelt.
- 5. Ein ganzer Dünndarm wird vier Mal mit hochreinem Wasser 15 Minuten lang gespült. Der Darm wird dann längs auf einem Förderband mit pulsierendem Licht mit hoher Intensität bestrahlt, das den Darm desinfiziert.
- Nach der oben beschriebenen Behandlung wird die Schicht aus Tela submucosa von ihrer Quelle, z. B. Darm, Uterus einer Kuh und dergleichen, entlaminiert. Es wurde gefunden, dass es durch dieses Entlaminierungsverfahren nach der Desinfektion leichter ist, die Schicht aus Tela submucosa von den anhaftenden Geweben zu befreien, z. B. zumindest von anhängendem Tunica-muscularis-Gewebe, im Vergleich zur Entfernung der Schicht aus Tela submucosa vor der Desinfektion. Darüber hinaus wurde gefunden, dass die resultierende Schicht aus Tela submucosa in der bevorzugtesten Form überlegene Histologie aufweist, indem weniger Gewebe anhängt und sich weniger Trümmer auf der Oberfläche befinden als bei einer Schicht aus Tela submucosa, die erhalten wurde, indem zuerst die Schicht aus Tela submucosa von ihrer Quelle entlaminiert wird und die Schicht dann desinfiziert wird. Ferner kann mit diesem Verfahren gleichmäßigeres Gewebe aus Tela submucosa erhalten werden und eine Tela submucosa mit den gleichen oder ähnlichen physikalischen und biochemischen Eigenschaften kann gleichbleibender in jedem separaten Verfahrensschritt erhalten werden. Ein wichtiger Punkt ist, dass mit diesem Verfahren eine hoch gereinigte, im Wesentlichen sterile Tela submucosa erhalten wird.
- Die Abstreifung der Quelle von Tela submucosa erfolgt vorzugsweise durch Verwendung einer desinfizierten oder sterilen Füllmaschine zur Herstellung einer Tela submucosa, die im Wesentlichen steril ist und nur minimal aufbereitet wurde. Eine geeignete Füllmaschine ist die Stridhs Universal Machine für Schweinedärme Modell 3-U-400, die von AB Stridhs Maskiner, Göteborg, Schweden, vertrieben wird. Die gemessene biologische Belastung ist daher minimal oder liegt im Wesentlichen bei Null. Natürlich können auch andere Mittel zum Entlaminieren der Quelle von Tela submucosa verwendet werden, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen, einschließlich beispielsweise die manuelle Entlaminierung.
- Es wurde auch gefunden, dass bevorzugtere erfindungsgemäße Verfahren nicht nur Verunreinigungen, die in der Kollagenmatrix aus Tela submucosa enthalten sind, beseitigen oder signifikant reduzieren, sondern auch ein Gewebe ergeben, das im Wesentlichen keinen erheblichen Abbau der physikalischen und mechanischen Eigenschaften zeigt, z. B. Porositätsgefälle (d. h. wenn eine Seite der Submukosaschicht stärker porös ist als die andere Seite) und hohe Festigkeit, beispielsweise Berstfestigkeit. Es wurde darüber hinaus gefunden, dass bevorzugtere Verfahren keinen Einfluss auf das Porositätsgefälle der Kollagenmatrix aus Tela submucosa haben, das letztendlich die Wirksamkeit des Gewebeimplantats beeinträchtigt. Das Gewebe wird beispielsweise nicht notwendigerweise mit einem Vernetzungsmittel oder einem Material, das die Porosität oder die native Struktur der Kollagenmatrix zerstört, behandelt. Bei Einsatz von Wasserstoffperoxid besitzt die Matrix als Ganzes ferner eine höhere Porosität und einen höheren Sauerstoffgehalt. Dadurch kann sichergestellt werden, dass keine Verunreinigungen anwesend sind, z. B. Endotoxine, Pyrogene und dergleichen.
- In einer vorteilhaften Ausführungsform zeigen die erfindungsgemäß erhaltenen Matrizen auf Kollagenbasis (z. B. einschließlich der Tela submucosa) ferner die Fähigkeit zur Induzierung einer aktiven Angiogenese, d. h. dem Einsprossen von Blutgefäßen in der Gewebematrix. In dieser Hinsicht umfassen diese bevorzugten Matrizen der Erfindung vorteilhafte Komponenten, mit denen die Matrizen natürlich vorkommen, einschließlich beispielsweise ein oder mehrere der folgenden Substanzen: Glykosaminoglykane, Glykoproteine, Proteoglykane und/oder Wachstumsfaktoren (z. B. der transformierende Wachstumsfaktor a, der transformierende Wachstumsfaktor a und/oder der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (basisch)).
- Bevorzugte erfindungsgemäß erhaltene Matrizen auf Kollagenbasis, bevorzugt Submukosa enthaltende Matrizen, sind ferner durch den in Tabelle 1 unten aufgeführten niedrigen Verunreinigungsgrad gekennzeichnet, wobei jeder Verunreinigungsgrad einzeln genommen wurde oder in einer beliebigen Kombination mit einigen oder allen der anderen offenbarten Verunreinigungsgrade. Die Abkürzungen in Tabelle 1 sind wie folgt: CFU/g = koloniebildende Einheiten pro Gramm; PFU/g = plaquebildende Einheiten pro Gramm; ig/mg = Mikrogramm pro Milligramm; ppm/kg = Teile pro Million pro Kilogramm.
- Ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäß erhaltene Matrizen auf Kollagenbasis haben einen Gehalt an Endotoxin unter 1 EU/g und insbesondere unter 0,5 EU/g.
- Gereinigte erfindungsgemäß erhaltene Matrizen auf Kollagenbasis können auf zahlreichen Wegen verarbeitet werden, um kollagenhaltige Matrizen zu erhalten, die sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden können. Die Submukosa kann beispielsweise so konfiguriert sein, dass sie Gewebetransplantate für Gefäßanwendungen ergibt, z. B. wie allgemein in US Patent Nr. 2.127.903 und 4.902.508 beschrieben. Mit Bezug auf
1 zur Anwendung als Gefäfltransplantat wird nun eine allgemein röhrenförmige Transplantatstruktur11 mit der Matrix12 auf Kollagenbasis, oder diese enthaltend, geformt, deren Durchmesser „D" dem eines aufnehmenden Blutgefäßes annähernd entspricht. In einem Modus kann dies durch Manipulation eines röhrenförmigen Segments oder eines Flächenstücks der Tela submucosa zur Definition eines Zylinders mit einem Durchmesser „D", der ungefähr dem Durchmesser des aufnehmenden Blutgefäßes entspricht, und Vernähen, Verkleben oder anderweitig Befestigen der Längsnaht13 zur Bildung eines Gefäßtransplantats mit entsprechendem Durchmesser und einem Lumen14 zum Durchleiten von Blut erzielt werden. In beispielhaften Herstellungsverfahren wird das Transplantat über einer sterilen Stange oder einem sterilen Mandrin geformt, dessen Außendurchmesser etwa dem Durchmesser des das Transplantat aufnehmenden Gefäßes entspricht. Beispielsweise wird die Stange in das Lumen des Segments aus Tela submucosa, das seine natürliche Röhrenform behält, eingeführt. Überflüssiges Gewebe wird dann zusammengefasst und der gewünschte Lumendurchmesser wird durch Nähen entlang der Transplantatlänge (beispielsweise mit zwei durchgehenden Nahtlinien oder einer einzelnen unterbrochenen Nahtlinie) oder durch Verwendung anderer im Stand der Technik anerkannter Techniken zur Fixierung von Gewebe, erreicht. Alternativ wird ein Flächenstück der erfindungsgemäßen Tela submucosa um die Stange gewickelt, um einen überlappenden Saum zu bilden, der dann vernäht, verklebt oder anderweitig fixiert werden kann, um die röhrenförmige Transplantatkonstruktion zu erhalten. In bevorzugten Formen kann die innere Lumenfläche des Transplantats von der Schleimhautseite der Tela submucosa gebildet sein. - Die erfindungsgemäß erhaltene Tela submucosa besitzt mechanische Eigenschaften, die für Gewebetransplantatmaterialien in Gefäßanwendungen sehr wünschenswert sind, einschließlich eines niedrigen Porositätsindexes, hoher Nachgiebigkeit und hoher Berstfestigkeit. Ein Fachmann erkennt, dass das bevorzugte Gewebetransplantatmaterial eine so geringe Porosität aufweist, dass intraoperative Blutungen vermieden werden, aber dennoch eine so hohe Porosität, dass Streckung eines neu entwickelten Vasa vasorum durch das Transplantatmaterial möglich ist, um Neointima und Lumenfläche zu ernähren.
- Das erfindungemäß erhaltene Gewebe aus Tela submucosa kann auch bearbeitet werden, um flüssige Zusammen setzungen zu erhalten, beispielsweise unter Verwendung der in US Patent Nr. 5.275.826 beschriebenen Techniken. In dieser Hinsicht können Lösungen oder Suspensionen der Tela submucosa hergestellt werden, indem die Tela submucosa mit einer Protease (z. B. Trypsin oder Pepsin) für eine ausreichend lange Zeit zerkleinert und/oder aufgeschlossen wird, um das Gewebe löslich zu machen und eine im Wesentlichen homogene Lösung zu bilden. Das Submukosa-Ausgangsmaterial wird vorzugsweise durch Reißen, Schneiden, Mahlen, Scheren oder dergleichen zerkleinert. Mahlen der Submukosa im gefrorenen oder gefriergetrockneten Zustand ist vorteilhaft, aber gute Resultate können auch erzielt werden, wenn eine Suspension aus Submukosa-Stücken in einem Hochgeschwindigkeitsmischer behandelt und bei Bedarf durch Zentrifugieren und Abgieflen des Abwassers entwässert wird. Die zerkleinerte Tela submucosa kann zu einem Pulver getrocknet, beispielsweise gefriergetrocknet, werden. Anschließend kann das Pulver nach Wunsch hydratisiert, d. h. mit Wasser oder gepufferter physiologischer Kochsalzlösung und fakultativ mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen kombiniert werden, um eine flüssige Gewebetransplantatzusammensetzung zu erhalten, z. B. mit einer Viskosität von ca. 2 bis ca. 300.000 cps bei 25EC. Transplantatzusammensetzungen mit höherer Viskosität können eine gel- oder pastenförmige Konsistenz aufweisen.
- Erfindungsgemäß erhaltene fluidisierte Tela submucosa ist als injizierbares Heterotransplantat für Gewebe, beispielsweise für Knochen- oder anderes Gewebe, verwendbar, das wiederhergestellt oder verstärkt werden muss, in der Regel zur Korrektur von traumatischen oder krankheitsbedingten Gewebsdefekten. Die vorliegenden flüssigen Submukosa-Zusammensetzungen werden vorteilhaft auch als Füllstoff für Implantate verwendet, die beispielsweise ein oder mehrere Flächenstücke aus Tela submucosa in versiegelten (vernähten) Beuteln zur Verwendung bei kosmetischen Eingriffen oder Operationen zur Behandlung von Traumata enthalten.
- In einer beispielhaften Präparation wird wie hierin beschriebene Tela submucosa in kleine Stücke zerkleinert (z. B. durch Schneiden), die in einen Edelstahlbehälter mit flachem Boden gelegt werden. In den Behälter wird flüssiger Stickstoff zum Einfrieren der Proben gegeben, die im gefrorenen Zustand dann zu einem groben Pulver aus Tela submucosa zerkleinert werden. Diese Aufbereitung kann beispielsweise mit einer manuellen Dornpresse mit zylindrischem Messingblock auf der Oberseite der gefrorenen Proben durchgeführt werden. Der Block dient als Schnittstelle zwischen den Proben und dem Dorn der Presse. In regelmäßigen Abständen kann den Proben aus Tela submucosa flüssiger Stickstoff zugeführt werden, damit sie gefroren bleiben.
- Es können auch andere Verfahren zur Zerkleinerung der Proben aus Tela submucosa verwendet werden, um ein Pulver aus Tela submucosa zu erhalten. Beispielsweise können die Proben aus Tela submucosa erst gefriergetrocknet und dann mit einer manuellen Dornpresse oder anderen Mahlmitteln gemahlen werden. Alternativ kann Tela submucosa in einem Mischer mit hoher Schergeschwindigkeit aufbereitet werden, um nach dem Entwässern und Trocknen ein Pulver aus Tela submucosa zu erhalten.
- Durch weiteres Mahlen des Pulvers aus Tela submucosa mit einem vorgekühlten Mörser und Pistill kann ein gleichförmiges Produkt mit einer feineren Zerteilung erhalten werden. Auch hier wird wieder flüssiger Stickstoff verwendet, um fest gefrorene Teilchen im endgültigen Mahlschritt zu erhalten. Das Pulver kann beispielsweise mit gepufferter Kochsalzlösung problemlos hydratisiert werden, um ein erfindungs gemäßes flüssiges Gewebetransplantatmaterial mit der gewünschten Viskosität zu erhalten.
- Zur Herstellung eines anderen bevorzugten flüssigen Materials kann ein Pulver aus Tela submucosa durch ein Drahtgeflecht gesiebt, aufgefangen und zu einer im Wesentlichen homogenen Lösung proteolytisch aufgeschlossen werden. Das Pulver kann beispielsweise 48 Stunden bei Raumtemperatur mit 1 mg/ml Pepsin (Sigma Chemical Co., St. Louis Mo.) und 0,1 M Essigsäure aufgeschlossen und mit HCl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt werden. Nach dieser Behandlung kann das Reaktionsmedium mit Natriumhydroxid zur Inaktivierung der peptischen Aktivität neutralisiert werden. Die nun lösliche Submukosa kann anschließend durch Salzpräzipitation der Lösung eingeengt und zur weiteren Reinigung und/oder Gefriertrocknung separiert werden, um eine protease-lösliche Darmsubmukosa in Pulverform zu erhalten.
- Erfindungsgemäß erhaltene flüssige Zusammensetzungen aus Tela submucosa sind als Gewebeersatz, zur Gewebeverstärkung und/oder zur Gewebereparatur weithin einsetzbar. Die flüssigen Submukosa-Zusammensetzungen können verwendet werden, um das Nachwachsen von natürlichem Bindegewebe oder Knochen im Bereich eines bereits bestehenden Defekts anzuregen. Durch Injektion einer wirksamen Menge einer flüssigen Submukosa-Zusammensetzung in den Locus eines Gewebsdefekts oder eine Wunde, die heilen soll, können die biotropen Eigenschaften der Tela submucosa problemlos ausgenutzt werden.
- Es ist auch möglich, Konstrukte mit großer Oberfläche zu bilden, indem zwei oder mehr erfindungsgemäße Segmente aus Tela submucosa kombiniert werden, beispielsweise mit den in US Patent Nr. 2.127.903 und/oder der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/32146 vom 17. Oktober 1996, der veröffentlichten Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US96/04271, eingereicht am 5. April 1996, verwendeten Techniken. So können mehrere Streifen aus Tela submucosa miteinander verbunden werden, beispielsweise durch Zusammendrücken überlappender Bereiche der Streifen unter dehydratisierenden Bedingungen, zur Bildung eines insgesamt planaren Konstrukts, dessen Oberfläche größer ist als die Oberfläche einer planaren Fläche der einzelnen, zur Bildung des Konstrukts verwendeten Streifen.
- Erfindungsgemäß erhaltene Tela submucosa kann auch zur Herstellung von Gewebetransplantatkonstrukten verwendet werden, die für orthopädische Gewebeanwendungen geeignet sind, beispielsweise für die Wiederherstellung von Sehnen oder Bändern, mithilfe von Techniken des Standes der Technik, die auf andere natürliche oder synthetische Transplantatmaterialien angewendet wurden. Beispielsweise können die allgemein in US Patent Nr. 2.127.903 und 5.281.422 beschriebenen Reparaturtechniken unter Anwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Tela submucosa durchgeführt werden.
- Für Anwendungen als Sehnen- und Bänderersatz kann ein Segment der Tela submucosa durch Längsstreckung auf eine verlängerte Länge vorab konditioniert werden. Ein Segment aus Tela submucosa kann beispielsweise konditioniert werden, indem längere Zeit eine Belastung auf die Längsachse des Segments aufgebracht wird (z. B. durch Aufhängen eines Gewichts am Segment) für einen Zeitraum, der ausreicht, um eine Dehnung des Gewebesegments von ca. 10% bis ca. 20% zu erreichen. Das Transplantatmaterial kann auch durch Dehnung in der seitlichen Dimension vorbereitet werden. Das Segment aus Tela submucosa kann dann allein oder in Verbindung mit anderen Segmenten in mehrere Formen gebracht werden, um als Bänder- oder Sehnenersatz zu dienen oder ein gerissenes oder durchtrenntes Sehnen- oder Bänderstück zu ersetzen oder zu überbrücken.
- Für solche Anwendungen als Bindegewebetransplantat wird das Segment vorteilhaft so geformt, dass es eine ein- oder mehrschichtige Konfiguration aufweist, wobei zumindest die sich gegenüberliegenden Endabschnitte und/oder die sich gegenüberliegenden Seitenabschnitte so geformt sind, dass sie mehrere Schichten Transplantatmaterial aufweisen, um als Verstärkung für die Anbringung von physiologischen Strukturen, wie z. B. Knochen, Sehnen, Bänder, Knorpel und Muskeln, zu dienen. Bei der Anwendung als Bänderersatz werden die gegenüberliegenden Enden an ersten bzw. zweiten Knochen befestigt, wobei die Knochen in der Regel wie bei einem Kniegelenk angelenkt sind. Bei der Anwendung als Sehnenersatz wird das erste Ende der Transplantatkonstruktion an einem Knochen befestigt und das andere Ende an einem Muskel.
- Wie oben beschrieben ist es bei Bindegewebsanwendungen vorteilhaft, die Endabschnitte des Transplantats so zu bilden, manipulieren oder formen, dass sie beispielsweise an einer Knochenstruktur befestigt werden können, so dass das Risiko des Reißens des Transplantats am Befestigungspunkt verringert wird. Für diese Zwecke kann das Transplantatmaterial aus Tela submucosa gefaltet oder teilweise umgestülpt werden, um mehrere Schichten zum Greifen, beispielsweise mit Unterlegscheiben mit Dornen oder Klemmen, zu erhalten. Alternativ kann ein Segment aus Tela submucosa umgeklappt werden, damit es an die Endabschnitte anstößt, um einen ersten Bindegewebsabschnitt zur Befestigung beispielsweise an einem ersten Knochen und eine Biegung im Zwischenabschnitt für einen zweiten Bindegewebsabschnitt zur Befestigung an einen zweiten Knochen, der relativ zum ersten Knochen angelenkt ist, zu erhalten.
- Beispielsweise kann einer der Endabschnitte des Transplantats aus Tela submucosa so gestaltet sein, dass er durch einen Tunnel, beispielweise im Femur, gezogen und daran befestigt werden kann, während der andere Endabschnitt so gestaltet sein kann, dass er durch einen Tunnel in der Tibia gezogen und daran befestigt werden kann, um ein Substitut für das natürliche Kreuzband zu bilden, wobei das Segment so ausgelegt ist, dass es zur Bereitstellung einer Bänderfunktion, d. h. einer Spannungs- und Positionierungsfunktion eines normalen Ligaments, unter Spannung zwischen die Tunnels gestellt werden kann.
- Da Transplantate, die in orthopädischen Anwendungen zum Einsatz kommen, in der Regel unter Spannung operativ installiert werden, werden bevorzugt zwei oder sogar noch mehr Gewebesegmente kombiniert, um ein Transplantatkonstrukt mit mehreren Schichten zu erhalten. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung dient deshalb auch der Bereitstellung von Transplantaten, in denen zwei oder mehr Segmente aus Submukosa so angeordnet sind, dass ihre Endabschnitte mit den verbundenen Endabschnitten und/oder seitlichen Abschnitten zur Befestigung an Knochen-, Sehnen-, Bänder- oder anderen physiologischen Strukturen verbunden sind. Bei einem Verfahren zur Bereitstellung eines Doppelsegments kann ein röhrenförmiges Segment zur Herstellung einer doppelwandigen Röhre in ein anderes Segment gezogen werden, dessen verbundene Enden beispielsweise an einem Knochen, einer Sehne oder einem Ligament befestigt werden können. Diese Doppelsegmente sorgen für verbesserte Zugfestigkeit und Widerstand gegen Dehnung unter Spannung. Bei anderen Formen können mehrere Segmente oder Streifen aus Tela submucosa in einer geflochtenen Konfiguration angeordnet werden, beispielsweise in einer diamantförmigen oder rollenförmigen geflochtenen Konfiguration oder in einer netzartigen Konfiguration, einschließlich mehrere Schlaufen, die mit benachbarten Schlaufen verbunden sind, die zweckmäßig für die Reparatur von Bändern oder Sehnen verwendet werden.
- Die erfindungsgemäße Tela submucosa kann auch zur Bereitstellung eines orthopädischen Transplantats zur Verwendung als Bindegewebe zum Zusammenhalten gebrochener Knochenstücke in der richtigen Orientierung im Körper verwendet werden, wobei das Gewebesegment so geformt ist, dass es als Frakturhülle um die Segmente des gebrochenen Knochens fungiert und an Knochen befestigt werden kann.
- In anderen orthopädischen Anwendungen kann die erfindungsgemäß erhaltene Tela submucosa zur Reparatur von Knochengewebe verwendet werden, beispielsweise unter Anwendung der allgemeinen, in US Patent Nr. 5.641.518 beschriebenen Methoden. So kann Tela submucosa in Pulverform in eine verletzte oder kranke Knochenregion zur Reparatur implantiert werden. Das Pulver aus Tela submucosa kann allein oder in Kombination mit ein oder mehreren zusätzlichen bioaktiven Mitteln wie z. B. physiologisch kompatible Mineralien, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Chemotherapeutika, Antigen, Antikörper, Enzyme und Hormone, verwendet werden. Vorzugsweise wird das pulverförmige Implantat zu einer vorab festgelegten dreidimensionalen Gestalt gepresst, die in die Knochenregion implantiert wird und während des Transplantatersatzes mit endogenem Gewebe im Wesentlichen ihre Form behält.
- Erfindungsgemäß erhaltene Tela submucosa kann auch als Zellwachstumssubstrat verwendet werden, beispielsweise in Flächen-, Pasten- oder Gelform, in Kombination mit Nährstoffen, die das Wachstum der Zellen fördern, z. B. eukaryotische Zellen wie beispielsweise Endothel-, fibroblastische, fötale Haut-, Osteosarkom- und Adenokarzinomzellen (siehe z. B. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/24661 vom 15. August 1996, in der die Internationale Anmeldung Nr. PCT/US96/01842, eingereicht am 9. Februar 1996 veröffentlicht wird). In bevorzugten Formen unterstützt das Substrat aus Tela submucosa die Proliferation und/oder Differenzierung von Säugetierzellen, einschließlich menschlicher Zellen.
- Die Tela submucosa kann auch als Kollagenmatrix in Zusammensetzungen zur Herstellung transformierter Zellen verwendet werden (siehe beispielsweise Internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/25179 vom 22. August 1996, in der die Internationale Anmeldung Nr. PCT/US96/02136, eingereicht am 16. Februar 1996, veröffentlicht wird, und Internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/22611 vom 24. August 1995, in der die Internationale Anmeldung Nr. PCT/US95/02251, eingereicht am 21. Februar 1995, veröffentlicht wird). Solche Zusammensetzungen für die Zelltransformation enthalten im Allgemeinen gereinigte erfindungsgemäße Tela submucosa, beispielsweise in flüssiger oder Pastenform, in Kombination mit einem rekombinanten Vektor (z. B. ein Plasmid), das eine Nukleinsäuresequenz enthält, mit der Targetzellen in vitro oder in vivo genetisch transformiert werden sollen. Die für die Transformation vorgesehenen Zellen können beispielsweise Knochenvorläuferzellen enthalten.
- Erfindungsgemäß erhaltene Tela submucosa kann auch zur Reparatur von Körperwänden verwendet werden, beispielsweise einschließlich der Reparatur von Bauchwanddefekten wie z. B. Hernien, unter Verwendung von Techniken analog den in Ann. Plast. Surg., 1995, 35: 3740380; und J. Surg. Res., 1996, 60: 107–114 beschriebenen. Bei diesen Anwendungen fördern bevorzugte Gewebetransplantate von Tela submucosa die günstige Organisation, Vaskularität und Konsistenz des remodellierten Gewebes. In dermatologischen Anwendungsfällen kann Tela submucosa zur Wiederherstellung von Wunden 1. oder 2. Grades und zur Hautaugmentation unter Verwendung von allgemeinen Transplantationstechniken, die im Stand der Technik und in der Literatur bekannt sind (siehe beispielsweise Annals of Plastic Surgery 1995, 35: 381–388), verwendet werden. Bei der Behandlung von Verbrennungen ist es darüber hinaus allgemein bekannt, ein Hautsubstitut bereitzustellen, auf das gezüchtete Epidermistransplantate (vorzugsweise gezüchtete Epidermis-Autotransplantate oder CEA) transplantiert werden. Bei solchen gezüchteten Transplantaten wurden in der Regel Keratinozyten und/oder Fibroblasten auf das Hautsubstitut transplantiert. Erfindungsgemäß kann die gereinigte Tela submucosa als Hautsubstitut verwendet werden, beispielsweise in Form eines Flächenstücks, und die CEA kann demnach auf die Tela submucosa transplantiert werden. Bei einer Durchführung dieses Aspekts der Erfindung können Keratinozyten beispielsweise durch Seeding oder Transfer eines Keratinozyten-Blatts auf die Schleimhautseite der Tela submucosa transplantiert werden. Fibroblasten können ebenfalls auf die Schleimhautseite und/oder auf die gegenüberliegende (abluminale) Seite der Tela submucosa transplantiert werden.
- Die erfindungsgemäß erhaltene Tela submucosa kann auch bei der Gewebetransplantation in urogenitalen Anwendungen verwendet werden. Die Tela submucosa kann beispielweise bei der Wiederherstellung der Harnblase zur Bereitstellung eines Gerüsts für die Harnblasenregeneration unter Anwendung von Techniken entsprechend den in US Patent Nr. 5.645.860; Urology, 1995, 46: 396–400; und J. Urology, 1996, 155: 2098 allgemein beschriebenen verwendet werden. In flüssiger Form kann die erfindungsgemäße Tela submucosa auch bei einem endoskopischen Injektionsverfahren zur Korrektur von vesiko-ureteralem Reflux verwendet werden. Bei solchen Anwendungen kann eine submukosale Injektion beispielsweise im Bereich unter der Harnleiteröffnung eines Patienten erfolgen, um das Wachstum der glatten Muskulatur und die Kollagenbildung an der Injektionsstelle anzuregen.
- In anderen Bereichen können mit erfindungsgemäß erhaltener Tela submucosa hergestellte Gewebetransplantatkonstrukte für neurologische Anwendungen verwendet werden, beispielsweise bei Techniken, für die zur Reparatur von Defekten, die durch Trauma, Tumorresektion oder Dekompressionsverfahren entstanden sind, ein Durasubstitut benötigt wird.
- Die folgenden spezifischen Beispiele dienen der Förderung des Verständnisses der vorliegenden Erfindung und ihrer Merkmale und Vorteile. Es versteht sich, dass diese spezifischen Beispiele der Veranschaulichung dienen und die vorliegende Erfindung nicht einschränken.
- BEISPIEL 1
- Dreißig Fuß ganzer Darm eines ausgewachsenen Schweins wird mit Wasser gespült. Dieses Material wird dann zwei Stunden unter Rühren in einer 0,2 Vol.-%igen Peressigsäurelösung in einer 5 Vol.-%igen wässrigen Ethanollösung behandelt. Die Schicht aus Tela submucosa wird dann in einer desinfizierenden Hüllmaschine vom Darm entlaminiert. Die entlaminierte Tela submucosa wird vier (4) Mal mit sterilem Wasser gespült und auf Verunreinigungen wie z. B. Endotoxine, Mikroben und Pyrogene, untersucht. Das resultierende Gewebe wies eine biologische Belastung von praktisch Null auf. Die Schicht aus Tela submucosa konnte leicht und gleichmäßig vom Dickdarm abgelöst werden und wies auf ihrer Oberfläche nur minimale Gewebereste auf.
- BEISPIEL 2
- Ein zehn Fuß langer Abschnitt eines ganzen Schweinedarms wird mit Wasser gewaschen. Nach dem Spülen wird dieser Abschnitt von Tela submucosa ca. 2½ Stunden in 0,2 Vol.-% Peressigsäure in einer 5 Vol.-%igen wässrigen Ethanollösung unter Rühren behandelt. Im Anschluss an die Behandlung mit Peressigsäure wird die Schicht aus Tela submucosa vom Darm gelöst. Die resultierende Tela submucosa wird dann vier (4) Mal mit sterilem Wasser gespült. Die biologische Belastung betrug praktisch Null.
- BEISPIEL 3
- Ein kleiner Abschnitt aus Darmkollagenmaterial mit Tela submucosa wurde einer Ratte subkutan implantiert. Innerhalb von 72 Stunden war signifikante Angiogenese zu beobachten.
- BEISPIEL 4
- Zwei Dünndarmabschnitte werden mit unterschiedlichen Verfahren aufgearbeitet. Der erste Abschnitt wird mit Leitungswasser gespült, 2 Stunden lang in einer 5 Vol.-%igen wässrigen Ethanollösung mit 0,2 Vol.-% Peressigsäure mit einem pH-Wert von ca. 2,6, desinfiziert, bis zur Tela submucosa entlaminiert, in gereinigtem Wasser gespült, in zwei Proben zerteilt und schnell eingefroren. Der zweite Abschnitt wird in Leitungswasser gespült, bis zur Tela submucosa entlaminiert, in gereinigtem Wasser gespült, 20 Minuten in eine 10%ige Neomycinsulfat-Lösung gelegt (wie in US Patent Nr. 4.902.508 beschrieben), mit gereinigtem Wasser gespült, in zwei Proben zerteilt und schnell eingefroren. Die vier wie oben vorbereiteten Proben werden auf ihre biologische Belastung und ihren Endotoxingehalt untersucht. Die ersten beiden Proben weisen jeweils biologische Belastungen unter 0,1 CFU/g und Endotoxingehalte unter 0,1 EU/g auf. Das zweite Probenpaar weist eine biologische Belastung von 1,7 CFU/g bzw. 2,7 CFU/g und einen Endotoxingehalt von 23,9 EU/g bzw. 15,7 EU/g auf.
- BEISPIEL 5
- Drei Dünndarmabschnitte werden mit unterschiedlichen Verfahren aufgearbeitet. Der erste Abschnitt wird mit Leitungswasser gespült, 2 Stunden lang in einer 5 Vol.-%igen wässrigen Ethanollösung mit 0,2 Vol.-% Peressigsäure mit einem pH-Wert von ca. 2,6, desinfiziert, bis zur Tela submucosa entlaminiert, in gereinigtem Wasser gespült und schnell eingefroren. Der zweite Abschnitt wird in Leitungswasser gespült, bis zur Tela submucosa entlaminiert, in gereinigtem Wasser gespült, gemäß den Verfahren in Beispiel 1 in US Patent Nr. 5.460.962 desinfiziert (40stündige Behandlung in einer 0,1 Vol.-%igen wässrigen Lösung aus Peressigsäure, gepuffert auf pH 7,2) und schnell eingefroren. Die dritte Probe wird in Leitungswasser gespült, bis zur Tela submucosa entlaminiert, in gereinigtem Wasser gespült, gemäß den Verfahren in Beispiel 2 in US Patent Nr. 5.460.962 desinfiziert (Behandlung in einer 0,1 Vol.-%igen Peressigsäure in stark salzhaltiger Lösung, gepuffert auf pH 7,2) und schnell eingefroren. Alle drei Proben wurden auf Endotoxine untersucht. Der Endotoxingehalt betrug < 0,14 EU/g für die erste Probe, > 24 EU/g für die zweite Probe und > 28 EU/g für die dritte Probe.
- BEISPIEL 6
- Zwei Schweinedünndarmabschnitte wurden mit 7 × 106 plaque-bildenden Einheiten (PFU) eines Virus infiziert. Die beiden Abschnitte wurden mit einer Lösung aus 0,18% Peressigsäure und 4,8% wässrigem Ethanol im Gewichtsverhältnis von Lösung zu Material von 9 : 1 behandelt. Eine erste Probe wurde 5 Minuten in diese Lösung getaucht; die zweite Probe wurde 2 Stunden eingetaucht. Das 5 Minuten aufbereitete Material enthielt 400 PFU pro Gramm Material. Das 2 Stunden aufbereitete Material enthielt null PFU pro Gramm Material.
- BEISPIEL 7
- Wie hierin beschrieben aufbereitete Tela submucosa wurde zur Bestimmung ihres Nukleinsäuregehalts untersucht. Vier Materialproben mit einem Gewicht von jeweils 5 mg wurden einer DNA/RNA-Extraktion unterzogen, wie im DNA/RNA Isolation Kit von Amersham Lifescience Inc., Arlington Heights, Illinois, beschrieben. Die Nukleinsäurequantifizierung erfolgte durch spektrophotometrische Bestimmung der optischen Dichte der Lösungen bei 260 nm und 280 nm. Der durchschnittliche Nukleinsäuregehalt betrug 1,9 ± 0,2 μg/mg Material.
- Wie in US Patent Nr. 4.902.508 beschrieben hergestellte Dünndarm-Submukosa wurde zur Bestimmung ihres Nukleinsäuregehalts untersucht. Vier Materialproben mit einem Gewicht von jeweils 5 mg wurden einer DNA/RNA-Extraktion unterzogen, wie im DNA/RNA Isolation Kit von Amersham beschrieben. Die Nukleinsäurequantifizierung erfolgte durch spektrophotometrische Bestimmung der optischen Dichte der Lösungen bei 260 nm und 280 nm. Der durchschnittliche Nukleinsäuregehalt betrug 2,4 ± 0,2 μg/mg Material.
- BEISPIEL 8
- Gemäß den hierin beschriebenen Methoden hergestellte Abschnitte aus Tela submucosa wurden für Biokompatibilitätstests wie in der Norm ISO 10993 beschrieben an ein unabhängiges Testlabor (NamSA, Inc., Northwood, Ohio) geschickt. Die Proben wurden auf akute systemische Toxizität nach USP, intrakutane Toxizität nach USP, Zytotoxizität, LAL Endotoxin, materialvermittelte Pyrogenität, direkte Kontakthämolyse und primäre Hautreizung untersucht. Die Proben bestanden alle Tests, was darauf hinweist, dass das Material biokompatibel ist.
- Es versteht sich, dass Abwandlungen der oben beschriebenen Aufbereitungsverfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich sind. Die Gewebequelle für die Tela submucosa, z. B. Magen, Dickdarm, Kuhuterus und dergleichen, kann beispielweise teilweise entlaminiert und mit einem Desinfektions- oder Sterilisationsmittel behandelt werden, und die Tela submucosa kann dann vollständig entlaminiert werden. Anhängende Schichten aus Mesenterium und/oder Serosa des Dickdarms können vorteilhaft vor der Behandlung mit dem Desinfektionsmittel entfernt werden, wonach die Entlaminierung der restlichen anhängenden Gewebe von der Tela submucosa erfolgt. Im Anschluss an diese Schritte können fakultativ zusätzliche Desinfektionsschritte erfolgen, z. B. enzymatische Reinigung und/oder Nukleinsäureentfernung. Alternativ kann die Quelle der Tela submucosa nur minimal mit einem Desinfektionsmittel oder einem anderen Mittel behandelt und die Tela submucosa von der Tunica muscularis und Tunica mucosa getrennt werden, wonach eine vollständige Desinfektionsbehandlung zum Erreichen der gewünschten Kontaminationsgrenze(n) erfolgt. Diese Abwandlungen und Modifikationen gelten als Teil des hierin beschriebenen Verfahrens und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Claims (28)
- Verfahren zur Gewinnung einer Matrix auf Kollagenbasis aus einer Submukosagewebe-Quelle, umfassend: Behandlung der Submukosagewebe-Quelle mit einem Desinfektionsmittel zur Bereitstellung einer desinfizierten Submukosagewebe-Quelle; und Entfernung der Matrix auf Kollagenbasis von der desinfizierten Submukosagewebe-Quelle:
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Submukosagewebe-Quelle aus einem Verdauungstrakt eines Säugetieres stammt.
- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier ein Schwein ist.
- Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Submukosagewebe-Quelle aus dem Dünndarm eines Schweins stammt.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Desinfektionsmittel ein Oxidationsmittel ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Desinfektionsmittel eine Peroxy-Verbindung ist.
- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Desinfektionsmittel eine organische Peroxy-Verbindung ist.
- Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Desinfektionsmittel eine Persäure ist.
- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Persäure aus der Peressigsäure, Perpropionsäure und Perbenzoesäure umfassenden Gruppe ausgewählt ist.
- Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Persäure Peressigsäure ist.
- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung die Behandlung der Submukosagewebe-Quelle mit einem Alkohol und die Persäure enthaltenden Medium umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein bis ca. sechs Kohlenstoffatome aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol aus der aus Ethanol, Propanolen und Butanolen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
- Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Ethanol ist.
- Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium eine wässrige Ethanollösung mit ca. 0,1 Vol.-% bis ca. 0,3 Vol.-% Peressigsäure ist.
- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung die Behandlung der Submukosagewebe-Quelle mit einem die Persäure enthaltenden und einen pH-Wert von ca. 2 bis ca. 6 aufweisenden Medium umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium einen pH-Wert von ca. 2 bis ca. 4 aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Persäure Peressigsäure ist und das Medium ca. 0,1 Vol.-% bis ca. 0,3 Vol.-% Peressigsäure enthält.
- Verfahren zur Gewinnung einer Matrix auf Kollagenbasis aus einer Submukosagewebe-Quelle, umfassend: Bereitstellung einer Submukosagewebe-Quelle, die mit einer Desinfektionsquelle behandelt wurde, und Entfernung der Matrix auf Kollagenbasis aus der Submukosagewebe-Quelle.
- Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Submukosagewebe-Quelle aus einem Dünndarm stammt.
- Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Desinfektion die Behandlung der Submukosagewebe-Quelle mit einem Oxidationsmittel umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung den Kontakt der Submukosagewebe-Quelle mit einem das Oxidationsmittel enthaltenden wässrigen Medium umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung den Kontakt der Submukosagewebe-Quelle mit einem eine Peroxy-Verbindung enthaltenden wässrigen Medium umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Peroxy-Verbindung eine Persäure ist.
- Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Persäure Peressigsäure ist.
- Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium einen Alkohol enthält.
- Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Ethanol ist.
- Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Dünndarm von einem Schwein stammt.
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