DE69727958T2

DE69727958T2 - Zusammensetzungen und Verfahren zur Änderung der Bioverteilung von biologischen Agentien

Info

Publication number: DE69727958T2
Application number: DE69727958T
Authority: DE
Inventors: Thomas Porter; L. Patrick IVERSEN
Original assignee: University of Nebraska
Current assignee: BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF NEBRASKA, LI
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2017-06-21
Also published as: US7115583B2; JP4201348B2; US6537814B1; WO1998000172A3; CA2258882A1; CA2258882C; ATE260677T1; US20040057946A1; JP2009029810A; EP0938341B1; US7198949B2; US5849727A; JP2000515499A; DE69727958D1; WO1998000172A2; EP0938341A2; US20040013662A1; US6117858A

Description

Diese Erfindung betrifft eine neue und verbesserte Verwendung einer Lösung von proteinumkapselten, unlöslichen, gasgefüllten Mikrobläschen, wobei die Mikrobläschen mit einem biologischen Wirkstoff konjugiert sind, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Bereitstellung biologischer Wirkstoffe. Die Zusammensetzung kann mit verschiedenen Agentien verwendet werden und es kann eine zielgerichtete Bereitstellung biologisch aktiver Wirkstoffe erreicht werden. Dies ermöglicht die niedrigere Dosierung und verbesserte Wirksamkeit von Arzneistoffen, insbesondere von Agentien wie Oligonukleotide bei denen es problematisch ist, therapeutisch wirksame Konzentrationen an Zielorganen zu erreichen.
Verfahren zur Bereitstellung von Arzneistoffen werden bei der Formulierung sämtlicher Arzneistofftherapien eingesetzt, um die Arzneistoffverfügbarkeit zu vergrößern, um die Arzneistoffdosierung zu reduzieren und um folglich Arzneistoff induzierte Nebenwirkungen zu reduzieren. Diese Verfahren dienen dazu, die Abgabe von Arzneistoffen im Körper zu kontrollieren, zu regulieren und zu dirigieren. Die Ziele waren, seltenere Arzneistoffgaben zu ermöglichen, konstante und kontinuierliche therapeutisch wirksame Spiegel eines Arzneistoffs in der Zirkulation oder an einem spezifischen Zielorgan aufrechtzuerhalten, eine Verminderung unerwünschter Nebenwirkungen zu erreichen und eine Reduktion der Menge und Konzentration, die nötig ist, um den gewünschten therapeutischen Nutzen zu erzielen, zu fördern.
Bisher umfassten Systeme zur Bereitstellung von Arzneistoffen Arzneistoffträger auf der Basis von Proteinen, Polysacchariden, synthetischen Polymeren, Erythrocyten, DNA und Liposomen. Biologische Wirkstoffe einer neuen Generation wie monoclonale Antikörper, Gentherapievektoren, Anti-Krebs-Arzneistoffe wie Taxol, Medikamente auf viraler Basis und Oligo- und Polynucleotide zeigten im Hinblick auf die Bereitstellung verschiedene Probleme. Tatsächlich könnte die Arzneistoffbereitstellung die erste Hürde sein für das Erreichen der breiten therapeutischen Verwendung dieser biologischen Wirkstoffe, deren anfängliches Potential unbegrenzt schien, aber deren therapeutische Parameter die Realisierung des vollen Nutzens verhindert haben.
Synthetische Oligodesoxyribonucleotide, die chemisch modifiziert sind, um Nucleaseresistenz zu übertragen, repräsentieren einen fundamental andersartigen Ansatz der Arzneistofftherapie. Die häufigste Anwendung finden bislang Antisense-Oligos mit Sequenzen die komplementär zu einer spezifischen Ziel-mRNA Sequenz sind. Ein Antisense-Oligonucleotid Therapieansatz beinhaltet ein bemerkenswert einfaches und spezifisches Arzneistoffdesign-Konzept bei dem das Oligo eine mechanistische Intervention im Verlauf der Translation oder eines früheren prozessierenden Ereignisses verursacht. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit genspezifischer Aktionen, was sich in einer relativ niedrigen Dosierung und minimalen nicht zielgerichteten Nebenwirkungen widerspiegeln sollte.
Phosphorthioatanaloga von Polynucleotiden haben chirale Internucleotidverbindungen in denen einer der nicht brückenbildenden Liganden Schwefel ist. Das Phosphorthioatanalogon ist derzeit das am häufigsten verwendete Analogon in biologischen Studien sowohl in vitro als auch in vivo. Zu den auffälligsten Nachteilen von Phosphothioat-Oligonucleotiden zählen die hohen Herstellungskosten für ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigem Material und die unspezifische Bindung an Proteine. Daher bleiben die wichtigsten Vorteile des Antisense-Ansatzes (niedrige Dosierung und minimale Nebenwirkungen) hinter den Erwartungen zurück.
Versuche zur Bereitstellung von Arzneistoffen haben sich, was Oligonucleotide und Polynucleotide betrifft, auf zwei Schlüsselanforderungen konzentriert: die Transfektion von Oligonucleotiden in Zellen und die Veränderung der Verteilung von Oligonucleotiden in vivo.
Die Transfektion umfasst die Verbesserung der zellulären Aufnahmefähigkeit in vitro. Biologische Ansätze um die Aufnahmefähigkeit zu erhöhen haben virale Vektoren wie rekonstituierte Viren und Pseudovirionen sowie Chemikalien wie Liposome eingeschlossen. Verfahren zur Verbesserung der Bioverteilung haben sich auf Dinge wie kationische Lipide, von denen behauptet wird, dass sie die zelluläre Aufnahmefähigkeit für Arzneistoffe wegen der Anziehung der positiv geladenen Lipide an die negativ geladenen Oberflächen der meisten Zellen erhöhen, konzentriert.
Es wurde beschrieben, dass Lipofection und DC-Cholesterin Liposome den Gentransfer in vaskuläre Zellen in vivo bei Verabreichung durch einen Katheter verbessern. Es wurde auch beschrieben, dass kationische Lipid-DNA-Komplexe nach intratrachealer Verabreichung zu einem effektiven Gentransfer in Mäuselungen führen.
Auch die kationische liposomale Bereitstellung von Oligonucleotiden wurde durchgeführt, es wurde jedoch eine veränderte Verteilung in Lunge und Leber beobachtet. Asialoglycoprotein-poly(L)-Lysin-Komplexe erzielten limitierten Erfolg, ebenso wie die Komplexierung mit Liposomen, die das Sendaivirus-Mantelprotein enthielten. Die Toxizität und die Bioverteilung blieben wichtige Probleme.
Aus dem Vorangegangenen ist ersichtlich, dass ein zielgerichtetes System zur Arzneistoffbereitstellung für die Bereitstellung von biologischen Wirkstoffen, insbesondere von Poly- und Oligonucleotiden, nötig ist, um das vollständige Potential dieser Arzneistoffe auszuschöpfen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Zusammensetzung für die Bereitstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs an einem Zielort in vivo bereitzustellen, die die Bioverfügbarkeit erhöht und die die Toxizität vermindert.
Andere Gegenstände der Erfindung werden offensichtlich aus der folgenden Beschreibung der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer Lösung von proteinumkapselten, unlöslichen, gasgefüllten Mikrobläschen bereit, wobei die Mikrobläschen mit einem biologischen Wirkstoff konjugiert sind, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Bereitstellung eines biologischen Wirkstoffs an einen spezifischen Zielort, wobei das Protein den mit Mikrobläschen konjugierten Wirkstoff zu Orten dirigiert, wo dieses Protein bioprozessiert wird, und nach Zerstörung der Mikrobläschen, ohne den Einsatz von externem Ultraschall auf den Zielort, diesen Wirkstoff abgibt.
Gemäß der Erfindung wird eine neue Zusammensetzung zur Bereitstellung biologisch aktiver Wirkstoffe offenbart. Die Zusammensetzung kann verwendet werden, um Wirkstoffe wie Therapeutika oder Diagnostika, bei denen die Bereitstellung problematisch ist wie Oligonukleotide sowie traditionelle Mittel, bereitzustellen und kann die jeweils wirksame Dosis drastisch reduzieren, den therapeutischen Index erhöhen und die Bioverfügbarkeit verbessern. Dies kann wiederum die Arzneistoffzytotoxizität und Nebenwirkungen reduzieren.
Die Erfindung verwendet die Konjugation des biologischen Wirkstoffs an ein filmogenes Protein, das aufgebaut ist als ein Mikrobläschen mit Proteinschale, welches ein unlösliches Gas umkapselt. Die Zusammensetzung wird als eine wässrige Suspension aus einer Vielzahl der Mikrobläschen zur parenteralen Verabreichung hergestellt. Die Konjugation des biologischen Wirkstoffs mit Mikrobläschen, die Albumin oder ähnliche Proteine umkapseln, kann die zielgerichtete Bereitstellung des biologischen Wirkstoffs an wechselnden Stellen, einschließlich denen, die traditionell mit dem Protein interagieren, ermöglichen.
1 ist ein Lineweaver-Burke-Diagramm der Bindungsdaten für PESDA-Mikrobläschen mit PS-ODN. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_m (berechnet für sieben Konzentrationen, die in Duplikaten eingesetzt wurden) für die Bindung an die Mikrobläschen betrug 1,76 × 10^–5 M (r² = 0,999; Y-int = 0,0566; 7 Konzentrationen). Dies liegt fast in dem Bereich, der für die Bindung eines 15mer PS-ODN mit der Sequenz 5'-(AACGTTGAGGGGCAT-3' (SEQ ID NR 1) an menschliches Serumalbumin in einer 3,7–4,8 × 10^–5 M Lösung beobachtet wurde, früher beschrieben von Srinivasan S. K. et al: „Characterization of binding sites, extent of binding, and drug interactions of oligonucleotides with albumin", Antisense Res. Dev. 5 (1995): 131.
Lange wurde die Ultraschall-Bildgebung als diagnostisches Hilfsmittel bei therapeutischen Verfahren eingesetzt. Sie basiert auf dem Prinzip, dass Wellen von Schallenergie auf ein Gebiet von Interesse konzentriert und reflektiert werden können, um ein Bild zu erzeugen. Gewöhnlich wird ein Ultraschalltransducer auf der Körperoberfläche, die über dem Gebiet liegt, das betrachtet werden soll, plaziert und es wird Ultraschallenergie, die durch Erzeugen und Empfangen von Schallwellen erzeugt wird, übertragen. Die Ultraschallenergie wird zum Transducer zurück reflektiert wo sie in ein Ultraschallbild übersetzt wird. Die Menge und Charakteristika der reflektierten Energie sind anhängig von den akkustischen Eigenschaften des Gewebes und vorzugsweise werden Kontrastmittel, die echogen sind, verwendet, um Ultaschallenergie im Gebiet von Interesse zu erzeugen und die erhaltene Bildgebung zu verbessern. Für eine Diskussion der Geräteausstattung für Kontrastechographie siehe DeJong und „Acoustic Properties of Ultrasound Contrast Agents", CIP-GEGEVENS KONINKLIJKE BIBLIOTHEEK, DENHAG (1993), pp. 120 et seq.
Die Kontrast-Echocardiographie wurde verwendet, um intracardiale Strukturen zu beschreiben, die valvuläre Fähigkeit zu untersuchen und intracardiale Shunts zu demonstrieren. Die myocardiale Kontrast-Echocardiographie (MCE) wurde verwendet, um die koronare Blutflussreserve beim Menschen zu messen. Es wurde herausgefunden, dass die MCE ein sicheres und nützliches Verfahren zur Evaluation relativer Veränderungen bei der myocardialen Perfusion und der Beschreibung von Risikogebieten ist.
Ultraschallschwingung wurde in der Medizin in therapeutischen Mengen auch verwendet, um die Absorption verschiedener Medikamente zu erhöhen. Zum Beispiel offenbart das japanische Patent Kokai Nummer 115591/1977, dass die percutane Absorption eines Medikaments durch Ultraschall verstärkt wird. Die U.S. Patente Nr. 4,953,565 und 5,007,438 offenbaren ebenfalls ein Verfahren zur percutanen Absorption von Medikamenten mit Hilfe von Ultraschall. Das U.S. Patent Nr. 5,315,998 offenbart einen Verstärker für die Arzneimitteltherapie, umfassend Mikrobläschen in Kombination mit Ultraschallenergie, um zu ermöglichen, dass das Medikament diffundieren und eindringen kann. Dies offenbart die Verwendung therapeutischer Mengen an Ultraschall für bis zu 20 Minuten, im Gegensatz zur Erfindung, die diagnostische Mengen an Ultraschall mit einer Exposition über viel kürzere Zeitperioden verwendet, um die Abgabe konjugierter biologischer Wirkstoffe zu erreichen.
Der Anmelder hat gezeigt, dass traditionelle Kontrastmittel für die diagnostische Ultraschalltherapie als spezifisches Gerät zur zielgerichteten Bereitstellung verwendet werden können, um therapeutische Wirkstoffe an den spezifisch bestimmten Stellen von Interesse abzugeben, wodurch die Arzneistoffverteilung verändert wird. Überraschenderweise kann dieses Ziel allein mit dem Kontrastmittel erreicht werden und ohne Verwendung von jeglichem diagnostischen Ultraschall.
Die erfindungsgemäße Arzneimittel umfasst eine flüssige Suspension, die Mikrobläschen eines unlöslichen Gases enthält, die einen Durchmesser von 0,1 bis 10 μm haben. Die Mikrobläschen werden durch Einschluß von Mikrobläschen eines Gases in eine Flüssigkeit gebildet. Die Mikrobläschen werden aus verschiedenen unlöslichen Gasen wie Fluorkohlenstoff oder Schwefelhexafluoridgas hergestellt. Die Flüssigkeit schließt jede Flüssigkeit ein, die Mikrobläschen bilden kann. Herkömmlicherweise kann jedes unlösliche Gas verwendet werden. Es muss bei Körpertemperatur gasförmig und nicht toxisch sein. Das Gas muss außerdem stabile Mikrobläschen mit einer durchschnittlichen Größe zwischen etwa 0,1 und 10 μm im Durchmesser bilden wenn das Arzneimittel mit Ultraschall behandelt wird, um Mikrobläschen zu bilden. Herkömmlicherweise werden Perfluorkohlenstoffgase wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorpentan bevorzugt. Von diesen Gasen werden Perfluorpropan und Perfluorbutan wegen ihrer bewiesenen Sicherheit bei intraokularer Injektion beim Menschen besonders bevorzugt. Sie wurden in Studien am Menschen für intraokulare Injektionen verwendet, um Netzhautablösungen zu stabilisieren (Wong und Thompson, Ophtalmology 95: 609–613). Die Behandlung mit intraokularem Perfluorpropan wird als Standardbehandlung dieser Erkrankung angesehen. Der Diffusionskoeffizient und die Blutlöslichkeit der Gase müssen außerdem niedriger sein als die von Stickstoff und Sauerstoff, die sobald sie im Inneren des Blutgefäßes sind diffundieren.
Andere inerte Gase wie Schwefelhexafluorid sind ebenfalls in der Erfindung verwendbar, vorausgesetzt deren Diffusionskoeffizient und deren Blutlöslichkeit ist niedriger als die von Stickstoff und Sauerstoff. Der erfindungsgemäße Wirkstoff wird in einer pharmazeutisch wirksamen Darreichungsform zur peripheren Verabreichung an den Wirt formuliert. Herkömmlicherweise ist ein derartiger Wirt ein menschlicher Wirt, obwohl auch andere Wirtssäugetiere wie Kaninchen oder Pferde dieser Therapie unterworfen werden können.
Das erfindungsgemäße flüssige Arzneimittel verwendet eine Flüssigkeit in der die Mikrobläschen durch eine Schicht aus filmogenem Protein stabilisiert sind. Geeignete Proteine schließen natürlich vorkommende Proteine wie Albumin, menschliches Gammaglobulin, menschliches Apotransferin und Urease ein. Die Erfindung verwendet vorzugsweise ein natürlich vorkommendes Protein aber synthetische Proteine können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugt wird menschliches Serumalbumin.
Wahlweise kann eine wässrige Lösung verwendet werden, die eine Mischung eines pharmazeutisch verträglichen Zuckers, z. B. Dextrose, in Verbindung mit dem früher beschriebenen Protein enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße flüssige Arzneimittel die Ultraschall-behandelte Mischung aus im Handel erhältlichem Albumin (menschlich), U.S.P.-Lösung (herkömmlicherweise erhältlich als sterile wässrige Lösungen mit 5 oder 25 Gew.-%) und im Handel erhältlicher Dextrose, U.S.P. zur intravenösen Verabreichung. Die Mischung wird unter Umgebungsbedingungen, d. h. Zimmertemperatur und -druck, mit Ultraschall behandelt und wird während der Ultraschallbehandlung mit einem unlöslichen Gas (99,9 Gew.-%) perfundiert.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst das flüssige Arzneimittel eine 2- bis 8-fach Verdünnung von 5 bis 50 Gew.-% Dextrose und 2 bis 10 Gew.-% menschlichem Serumalbumin. Beispielhaft für andere erfindungsgemäße Zuckerlösungen sind eine wässrige Monosaccharidlösung (z. B. mit der Formel C₆H₁₂O₆ wie die Hexosezucker, Dextrose oder Fruktose oder deren Mischungen), eine wässrige Disaccharidlösung (z. B. mit einer Formel C₁₂H₂₂O₁₁ wie Saccharose, Laktose oder Maltose oder deren Mischungen) oder eine wässrige Polysaccharidlösung (z. B. lösliche Stärken mit der Formel C₆H₁₀O₅(n), worin n eine ganze Zahl zwischen 20 und etwa 200 ist, wie Amylase oder Dextran oder deren Mischungen.
Die Mikrobläschen werden durch Ultraschallbehandlung gebildet, typischerweise mit einer Ultraschallsonde. Die Ultraschallbehandlung mit Ultraschallenergie bewirkt eine Hohlraumbildung innerhalb der Dextrose-Albumin-Lösung dort wo Partikel oder Gas in der Lösung vorkommen. Diese Stellen an denen Hohlräume entstehen schwingen schließlich mit und erzeugen kleine Mikrobläschen (etwa 7 μm groß), die nicht-kollabierend und stabil sind. Im Allgemeinen werden Bedingungen für die Ultraschallbehandlung bevorzugt, die Konzentrationen größer etwa 4 × 10⁸ M von Mikrobläschen zwischen 5 und 6 μm erzeugen. Herkömmlicherweise wird die Lösung für etwa 80 Sekunden mit Ultraschall behandelt werden während sie mit einem unlöslichen Gas perfundiert wird.
Ein zweites Herstellungsverfahren umfasst das Schütteln per Hand von 15 ± 2 ml Ultraschall-behandeltem Dextrose/Albumin mit 8 ± 2 ml Perfluorkohlenstoffgas vor der Ultraschallbehandlung. Danach folgt die Ultraschallbehandlung für 80 ± 5 Sekunden.
Diese Mikrobläschengrößen sind besonders ideal, da ein Mikrobläschen einen mittleren Durchmesser von weniger als 10 μm und größer als 0,1 μm haben muss, um ausreichend lungendurchgängig zu sein und stabil genug sein muss um eine signifikante Diffusion der Gase im Mikrobläschen nach intravenöser Injektion und während des Transports zum Zielort zu verhindern.
Die Mikrobläschen werden als Nächstes mit dem Medikament inkubiert, so dass das Medikament mit dem Mikrobläschen konjugiert wird. Ziemlich unerwartet wurde gezeigt, dass filmogene Proteine in Form von Mikrobläschen, wie zuvor in Kontrastmitteln verwendet, ihre Fähigkeit Medikamente zu binden erhalten. Dies ist überraschend weil traditionell gedacht wurde, dass bei der Formulierung von Mikrobläschen-Kontrastmitteln die Proteinkugel aus denaturiertem Protein hergestellt wurde. Der Anmelder hat gezeigt, dass, wenn ein unlösliches Gas anstelle von Luft für das Mikrobläschen verwendet wird, viel von der Ultraschallenergie vom Gas absorbiert wird und das Protein seine Bindungsaktivität erhält. Luftgefüllte Mikrobläschen erhalten ihre Bindungsfähigkeiten nicht und können daher nicht im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Behandlung schließt die Verwendung eines Arzneimittels ein, das mit einem Proteinmikrobläschen mit einem Durchmesser von etwa 0,1 bis 10 μm konjugiert ist. Die Erfindung verwendet Mittel, die traditionell bei der Ultraschalldiagnostik verwendet werden.
Therapeutische Stoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nach ihrer Fähigkeit an das filmogene Protein zu binden ausgewählt. Zum Beispiel kann, wenn das filmogene Protein Albumin ist, der therapeutische oder diagnostische Stoff Oligonucleotide (wie Antisense- oder Antigen-Oligos), Polynukleotide (wie retrovirale oder adenovirale Vektoren oder Sonden oder Plasmidvektoren oder -sonden) oder Ribozyme einschließen, die alle an Albumin binden und als solche eine Konjugation mit dem Mikrobläschen eingehen können. Eine Liste von Medikamenten, die an Albumin an Stelle 1 (die ihre Bindungskapazität erhält) binden und daher bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Verbindungen in der Albumin-Ausführungsform eingesetzt werden könnten, folgt:
Andere Arzneistoffe, die an Albumin binden, speziell an Stelle 1, könnten in dieser Ausführungsform auch verwendet werden und können vom Fachmann durch Arzneistoff-Interaktionstests und pharmakologische Tests ermittelt werden, die für den Fachmann Standard sind wie in „Drug Information" oder „Facts and Comparisons", veröffentlicht von Berney Olin und vierteljährlich aktualisiert. Andere derartige Referenzen sind auf dem Fachgebiet breit zugänglich. Tests zur Bestimmung geeigneter Kombinationen von Protein und Therapeutikum sind hier offenbart und können verwendet werden, um jede Kombination auf ihre Fähigkeit zu testen, in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu funktionieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde herausgefunden, dass proteinüberzogene Mikrobläschen aus unlöslichem Gas stabile Konjugate mit Oligonucleotiden bilden. Die Oligo-konjugierten Bläschen werden dann in das Tier eingebracht und der Proteinfilm leitet den konjugierten Wirkstoff an Interaktionsstellen. Schließlich wird, wenn sich das Bläschen auflöst, der Wirkstoff an der Gewebestelle freigesetzt.
Dies ist von besonderer Bedeutung für die Oligonucleotid- und Polynucleotidtherapie, da die erste Hürde für eine effektive Antisense-, Anti-Gen- oder sogar Gentherapie bei der eine virale oder Plasmid-vermittelte Nucleotidbereitstellung eingesetzt wird, die Fähigkeit des Therapeutikums ist, den Zielort in ausreichend hohen Konzentrationen zu erreichen, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Therapeutische Orte können die Stelle eines spezifischen Tumors, ein Organ, das aufgrund differentieller Genaktivierung ein spezielles Genprodukt exprimiert, eine Verletzungs- oder Thrombosestelle, einen Ort zur weiteren Prozessierung oder Verteilung des Therapeutikums etc. einschließen. Herkömmlicherweise wird der Zielort basierend auf der Bioprozessierung des filmogenen Proteins ausgewählt. Zum Beispiel nehmen die Nieren und die Leber Albumin auf und Albumin-Mikrobläschen können verwendet werden um die Verabreichung konjugierter bioaktiver Wirkstoffe spezifisch zu diesen Gebieten zu dirigieren. Der Stoffwechsel und die Bioprozessierung anderer filmogener Proteine kann anhand von pharmakologischen Standardtexten wie „Basic and Clinical Pharmakology" von Bertram G. Katzung, dessen entsprechende relevante Offenbarung durch Bezugnahme eingeschlossen, einfach ermittelt werden.
Die bevorzugte Art und Weise der erfindungsgemäßen Bereitstellungstherapie schließt das Erhalten eines flüssigen Arzneimittels und das Einbringen dieses Mittels in einen Wirt durch intravenöse Injektion, intravenös (i. v. Infusion), perkutan oder intramuskulär, ein. Das Mikrobläschen wird im Tier dann prozessiert und wird aufgenommen und interagiert entsprechend dem filmogenen Protein welches das Mikrobläschen überzieht. Schließlich löst sich das Bläschen auf, wobei der bioaktive Wirkstoff am Ort der Proteinprozessierung bereitgestellt wird.
Von den Anmeldern wurde früher gezeigt, dass die Mikrobläschen-Konjugation biologischer Wirkstoffe in zielgerichteten Bereitstellungsprotokollen, mit der Bereitstellung des biologischen Wirkstoffes bei Einwirkung von Ultraschall auf den Zielort, verwendet werden kann, was die Hohlraumbildung des Mikrobläschens und letzten Endes die Freisetzung des biologischen Wirkstoffs an dem Ort der Interaktion mit dem Ultraschallfeld verursacht.
Ziemlich unerwartet hat der Anmelder nun herausgefunden, dass die Anwendung von Ultraschall für die zielgerichtete Bereitstellung von biologischen Wirkstoffen an Orte an denen eine Bioprozessierung der Proteinhülle stattfindet nicht nötig ist. Das Protein leitet das Mikrobläschen und das Konjugat an Orte der Bioprozessierung und während sich das Bläschen auflöst wird das Oligo oder ein anderer biologischer Wirkstoff freigesetzt, um am Ort zu interagieren, was einem Bruchteil des biologischen Wirkstoffs ermöglicht, den gleichen biologischen Effekt zu erzielen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in der Erfindung verwendete Mittel eine Perfluorkohlenstoff-verstärkte ultraschallbehandelte Dextrose/Albumin-Lösung, umfassend eine ultraschallbehandelte 3-fach Verdünnung von 5% menschlichem Serumalbumin mit 5% Dextrose.
Während der Ultraschallbehandlung wird die Lösung für etwa 80 Sekunden mit Perfluorkohlenstoff perfundiert, was die Löslichkeit und Diffussionsfähigkeit des Mikrobläschengases erniedrigt. Die resultierenden Mikrobläschen werden bei Zimmertemperatur für mindestens 120 ± 5 Minuten konzentriert, wobei sich die überschüssige Lösung in der Ultraschallspritze absetzt. Die Mikrobläschen werden dann einem therapeutischen Wirkstoff ausgesetzt und man lässt sie interagieren, so dass der Wirkstoff an die Mikrobläschen konjugiert wird. Als Nächstes werden die konjugierten Mikrobläschen in eine sterile Spritze überführt, die zur parenteralen Injektion in ein Säugetier vorgesehen ist, vorzugsweise in der Nähe des Zielorts an dem der Stoff Aktivität zeigt.
Verfahren zur Ultraschall-Bildgebung bei denen Mikrobläschen, die durch Ultraschallbehandlung einer wässrigen Proteinlösung gebildet werden, in ein Säugetier injiziert werden, um die akustischen Eigenschaften eines bestimmten Gebietes zu verändern, welches dann mit Ultraschall gescannt wird, um ein Bild zur Verwendung bei medizinischen Verfahren zu erhalten, sind wohlbekannt. Siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 4,572,203, U.S. Patent Nr. 4,718,433 und U.S. Patent Nr. 4,774,958, deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Es ist die Verwendung dieser Art von Kontrastmitteln als Arzneimittel als Teil eines zielgerichteten Bereitstellungssystems, was die neue Verbesserung dieser Erfindung darstellt.
Es wurde gezeigt, dass die Erfindung die Effizienz und die therapeutische Aktivität, durch Verändern der Bioverteilung verschiedener Medikamente einschließlich, was am meisten bemerkenswert ist, antisense-Oligonukleotide, die traditionell mit ineffektiven pharmakologischen Eigenschaften belastet waren, einschließlich einer hohen Clearence-Rate und Toxizität, drastisch erhöhen kann.
Dies ist besonders bedeutend da die Therapie mit Mikrobläschen mit therapeutischem Wirkstoff jegliche toxischen Effekte bei Personen, die vielleicht bestimmte Therapeutika nicht in Dosierungen und Konzentrationen, die zum Erreichen eines vorteilhaften Ergebnisses nötig sind, tolerieren könnten, reduzieren kann.
Die Proteinsubstanz wie menschliches Serumalbumin wird im Körper leicht metabolisiert und ausgeschieden und ist daher für den menschlichen Körper nicht schädlich. Außerdem ist die Menge des in Mikrobläschen eingeschlossenen Gases extrem niedrig und wird leicht in Körperflüssigkeit gelöst. Es ist lange bekannt, dass Perfluorpropan und Perfluorbutan für Menschen sicher sind. Beide wurden am Menschen für intraokulare Injektionen verwendet, um Netzhautablösungen zu stabilisieren. Wong und Thompson, Ophtalmology 95: 609–613. Daher sind die Anti-Thrombose Wirkstoffe, die in der Erfindung verwendet werden extrem sicher und nicht toxisch für Patienten.
Die Erfindung ist besonders nützlich zur Bereitstellung von Nucleotidsequenzen in Form von Gentherapievektoren oder Antisense- oder Anti-Gen-Strategien, um letzten Endes Genexpressionen in Zielzellen zu verändern.
Antisense Oligonucleotide stellen, auf Grund ihrer Fähigkeit spezifisch die Synthese von Zielgenen zu hemmen, potentielle Werkzeuge in Forschung und Therapie dar. Ein theoretischer Hauptvorteil dieser Oligos ist deren potentielle Spezifität zur Bindung an eine Stelle in der Zelle. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein synthetisches Oligonucleotid von mindestens 6 Nucleotiden, vorzugsweise komplementär zu DNA (Anti-Gen) oder RNA (Antisense) gezeigt, das mit dem Vorgang der Transkription oder Translation endogener Proteine interferiert.
Jedes bekannte Verfahren zur Oligonucleotidsynthese kann verwendet werden, um die Oligonucleotide herzustellen. Sie werden am bequemsten unter Verwendung irgendeines der im Handel erhältlichen automatischen Nucleinsäuresynthesegeräte wie der DNA-Synthesizer (Model 380B) von Applied Biosystems (Foster City, CA) hergestellt. Gemäß den Herstellerprotokollen unter Verwendung der Phosphoamiditchemie. Phosphothioat-Oligonucleotide wurden nach den Verfahren, welches in Stek und Zahn, J. Chromatography, 326: 263–280 und im Applied Biosystems DNA Synthesizer User Bulletin, Models 380A-380B-381-EP, Dezember 1989 beschrieben ist, synthetisiert und gereinigt. Das Oligo wird in die Zellen durch Verfahren eingebracht, die Fachleuten bekannt sind. Siehe Iverson et al.: „Anti-Cancer Drug Design" (1991), 6531–6538, hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die traditionelle Beschränkung der Oligonucleotidtherapie war die Herstellung des Oligonucleotidanalogons, das im wesentlichen resistent ist gegenüber den Endo- und Exonukleasen, die im Blut und in den Körperzellen zu finden sind. Während gezeigt wurde, dass nichtmodifizierte Oligos ineffektiv waren, halfen verschiedene Modifizierungen dieser Oligos dieses Problem zu mindern.
Modifizierte oder verwandte Oligonucleotide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können eine oder mehrere Modifikationen der Nucleinsäurebasen, Zuckeranteile, Internucleosid-Phosphatbindungen oder Kombinationen von Modifikationen an diesen Stellen einschließen. Die Internucleosid-Phosphatbindungen können Phosphothioat, Phosphoamidat, Methylphosphonat, Phosphorodithioat und Kombinationen aus solch ähnlichen Bindungen sein (um modifizierte Oligonucleotide mit Mischrückgrat herzustellen). Die Modifizierungen können intern oder an dem/den Ende(n) des Oligonucleotidmoleküls vorkommen und können Additionen an das Molekül der Internucleosid-Phosphatbindungen sein wie Cholesterol, Diaminverbindungen mit variierender Anzahl von Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und terminale Ribose-, Desoxyribose- und Phosphatmodifikationen, die schneiden oder mit den gegenüberliegenden Ketten oder assoziierten Enzymen oder anderen Proteinen, die an das Genom binden, vernetzen.
Diese Modifikationen helfen traditionell, das Oligo vor enzymatischer Degradierung in der Zelle abzuschirmen. Jede der vorstehenden Modifikationen kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Modifizierung jedoch ein Phosphothioat-Oligonucleotid.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Illustration und beabsichtigen nicht, diese Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken. Fachleute werden es zu schätzen wissen, dass zahlreiche andere bioaktive Wirkstoffkombinationen in der Erfindung verwendet werden können und sogar darin eingeplant sind. Wenn zum Beispiel das filmogene Protein Transferrin ist, könnte der bioaktive Wirkstoff jeder Transferrin bindende pharmakologische Wirkstoff sein.
In allen folgenden Beispielen sind alle Anteile und Prozentsätze Gew.-Anteile/-%, alle Verdünnungen sind Volumenverdünnungen.
BEISPIEL 1
Synthese des Phosphothiat-Oligonucleotids
Kettenverlängerungssynthesen wurden durchgeführt auf eimem 1 μmol Säulenträger in einem ABI Model 391 DNA Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, CA) oder bereitgestellt von Lynx Therapeutics, Inc. (Hayward CA). Bei der Synthese von 1 μmol wurden Cyanoethyl-Phosphoroamidite und eine Sulfurierung mit Tetraethylthiuramdisulfid wie im ABI User Bulletin 58 eingesetzt.
Radioaktiv markierte Oligonucleotide wurden als Hydrogenphosphonat-Material von Glen Research (Bethesda, MD) synthetisiert. Die gleichmäßig ³⁵S-markierten PS-ODN mit den Sequenzen 5'-TAT GCT GTG CCG GGG TCT TCG GGC-3' (24mer komplementär zu c-myb, SEQ ID NR 2) und 5'-TTAGGG-3' (SEQ ID NR 3) wurden in einem Endvolumen von 0,5 ml mit der Perfluorkohlenstoff-exponierten ultraschallbehandelten Dextrose/Albumin-Mikrobläschenlösung für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Lösungen wurden stehen gelassen, so dass die Mikrobläschen an die Oberfläche steigen konnten und es wurden 100 μl von der klaren Lösung am Boden und 100 μl vom Überstand, der die Mikrobläschen enthielt, abgenommen.
Herstellung des Mikrobläschen-Wirkstoffs
5% menschliches Serumalbumin und 5% Dextrose wurden im Handel erworben. Drei Teile der 5%-igen Dextrose und ein Teil des 5%-igen menschlichen Serumalbumins (insgesamt 16 ml) wurden in eine 35 ml Monojetspritze aufgezogen. Jede Dextrose/Albumin-Probe wurde mit 8 ± 2 ml von entweder einem Fluorkohlenstoffgas (Decafluorbutan, Molekulargewicht 238 g/mol) oder Raumluft von Hand geschüttelt und die Probe wurde dann für 80 ± 5 Sekunden einer elektromechanischen Ultraschallbehandlung bei 20 kHz ausgesetzt. Die mittlere Größe von vier auf diese Weise hintereinander hergestellten Proben von Perfluorkohlenstoff-exponierten, ultraschallbehandelten Dextrose/Albumin (PESDA)-Mikrobläschen betrug 4,6 ± 0,4 μm, wie anhand von Hemocytometrie bestimmt wurde, und die mittlere Konzentration betrug 1,4 × 10⁹ Bläschen/ml, wie mit einem Coulter-Zähler bestimmt wurde. Die Mikrobläschenlösung wurde dann in einem 1000fachen Volumenüberschuß 5%iger Dextrose gewaschen, um nicht mit den Mikrobläschen verbundenes Albumin zu entfernen. Man ließ die Mikrobläschen innerhalb von vier Stunden aufsteigen. Die untere Lösung wurde dann entfernt, wodurch der gewaschene Schaum übrig blieb. Der gewaschene Schaum wurde dann mit 0.9% Natriumchlorid gemischt.
Bindungsstudien
Das radioaktive 24-mer PS-ODN wurde in einer Konzentration von 5 nM zu einer gewaschenen Lösung von PESDA und bei Raumluft ultraschallbehandelten Dextrose/Albumin (RA-SDA)-Mikrobläschen gegeben. Ein nicht-radioaktives PS-ODN 20-mer wurde in Röhrchen gegeben, die das radioaktive 24-mer in aufsteigenden Konzentrationen (0; 3,3; 10; 32,7; 94,5; 167 und 626 μM) enthielten. Die Mikrobläschensuspension wurde durch Inversion gemischt und bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
Messung der Radioaktivität
Die Radioaktivität in Lösungen wurde bestimmt durch Flüssig-Scintillationszählung in einem Flüssig-Scintillationszähler (Modell LSC7500; Beckman Instruments GmbH, München, Deutschland). Das Probenvolumen betrug 100 μl wozu 5 ml Hydrocount biologisch abbaubarer Scintillationscocktail gegeben wurden und es wurde gemischt. Die Proben wurden sofort nach jedem Experiment gezählt und dann wieder nach 24 Stunden, um den Einfluß von Chemilumineszenz und Quenching zu verringern.
Durchflußzytometrie
Die Einheitlichkeit der PS-ODN-Bindung von Raumluft- gegenüber Perfluorkohlenstoff-enthaltenden ultraschallbehandelten Dextrose/Albumin-Mikrobläschen wurde mit Durchflußzytometrie bestimmt. Eine Mikrobläschenlösung wurde in einem 1000fachen Überschußvolumen steriler Kochsalzlösung gewaschen. Drei Gruppen von Proben wurden wie folgt in dreifacher Ausfertigung hergestellt: Gruppe A (Kontrolle), in der 100 μl Mikrobläschen zu 900 μl Kochsalz gegeben wurden; Gruppe B, in der 100 μl Mikrobläschen zu 900 μl Kochsalz gegeben wurden und wozu 2 μl FITC-markiertes 20-mer gegeben wurden (Endkonzentration des 20-mers ist 151 nM) und Gruppe C, in der 100 μl Mikrobläschen zu 800 μl Kochsalzlösung, 2 μl FITC-markiertem 20-mer und 100 μl unmarkiertem 20-mer (Endkonzentration beträgt 151 nM) gegeben wurden. Die Inkubationen wurden alle für 20 Minuten bei Zimmertemperatur durchgeführt.
Die gewaschenen Mikrobläschensuspensionen wurden in steriler Kochsalzlösung (Baxter) verdünnt und dann mit FITC-markiertem PS-ODN inkubiert. Die Durchflußzytometrie-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung eines FACStar Plus (Becton Dickinson), das mit einem t 100 mW Luft-gekühlten Argonlaser und der Lysis II Aufnahme- und Analysesoftware ausgestattet war. Es wurden die list mode Daten für mindestens 10⁴ gesammelte Mikrobläschen verwendet und eine unabhängige Auswertung für jede Probe.
Studienprotokoll
Für die Studie wurde eine variable Durchfluß-Mikrosphärenabtastkammer entwickelt, die ähnlich der ist, die wir früher beschrieben haben (Mor-Avi V. et al.: „Stability of Albunex microspheres under ultrasonic irradiation; an in vitro study", J. Am. Soc. Echocardiology 7 (1994): S29). Diese System besteht aus einer zirkulären Abtastkammer, die mit einem Masterflex-Durchflußsystem (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) verbunden ist. Die Abtastkammer war auf jeder Seite eingeschlossen von Wasser-gefüllten Kammern und nach jeder Seite durch akustisch transparentes Material abgeschlossen. Die PS-ODN-markierten PESDA-Mikrobläschen (0,1 μl) wurden als Bolus über eine Sekunde proximal der Abtastkammer injiziert und flossen bei einer kontrollierten Durchflußrate von 100 ml/min durch einen Plastikschlauch in eine mit Leitungswasser gefüllte Abtastkammer. Sobald die Bläschen die Abtastkammer passierten wurde der Scanner (2,0 MHz Frequenz, 1,2 Mpascal Peaknegativdruck) entweder so eingestellt, dass er Ultraschall bei einer gewöhnlichen 30 Hz Rahmenrate aussandte oder er wurde ausgeschaltet. Nach der Passage durch die Abtastkammer wurde die Lösung dann durch einen gleich großen Plastikschlauch in einen geeichten Zylinder passiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen. Nachfolgend wurden die nächsten 10 ml in ein Sammelröhrchen aufgenommen. Das Sammelröhrchen, das die ausgeflossenen Mikrobläschen enthielt wurde stehen gelassen, um die Mikrobläschen an der Oberfläche von jeglichen freien Oligonucleotiden im unteren Teil der Probe zu trennen. Tropfen von sowohl dem oberen als auch dem unteren Teil des Ausflusses wurden dann auf einen Hemocytometer-Objektträger gegeben und bei 10facher Vergrößerung analysiert. Dann wurden Fotographien dieser Objektträger gemacht und die Anzahl von Mikrobläschen in einem 36 cm² Feld wurde von Hand gezählt. Die oberen und unteren Schichten des verbleibenden Ausflusses wurden dann zur Analyse des Oligonucleotidgehalts unter Verwendung der Durchflußzytometrie, in gleicher Weise wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Mikrobläschenproben, die mit den verschiedenen Oligonucleotidlösungen behandelt waren, wurden 15fach (v/v) mit einer Lösung aus Formamid und EDTA gemischt und für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Diese Proben wurden dann mit einem Model 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems) in einem 20%-igen Polyacrylamidgel analysiert. Die Daten wurden mit der GeneScanner Software gewonnen, so dass der Bereich der Fluoreszenintensität unter der Kurve bestimmt werden konnte.
BEISPIEL 2
Phosphothioat-Oligonucleotid Bindung von PESDA- versus RA-SDA-Mikrobläschen
Die Verteilung von PS-ODN- gegenüber PESDA-Mikrobläschen (obere Schicht) und der gewaschenen (Albumin freien) und ungewaschenen (Albumin enthaltenden) unteren Schichten ohne Mikrobläschen, wie durch Flüssig-Scintillationszählung ermittelt, sind in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1 OLIGONUCLEOTIDBINDUNG AN ALBUMIN IN PESDA-MIKRO-BLÄSCHEN BLÄSCHEN IN ANWESENHEIT VON FREIEM ALBUMIN
GEWASCHENE BLÄSCHEN (KEIN FREIES ALBUMIN)
Diese Daten deuten darauf hin, dass Albumin in der ungewaschenen Lösung, das nicht mit Mikrobläschen assosiiert ist, an das PS-ODN bindet, so dass die Verteilung von PS-ODN gleich ist für Mikrobläschen (obere Schicht) und die umgebende Lösung (untere Schicht, p = HS). Die Entfernung von Albumin, das nicht mit Mikrobläschen assoziiert ist (gewaschene Bläschen in Tabelle 1), zeigt keine signifikante Verteilung der PS-ODNs auf die PESDA-Mikrobläschen (1,67 für TTAGGG PS-ODN und 2,16 für c-myb PS-ODN). Die Wiedergewinnung der Gesamtradioaktivität in den in Tabelle 1 gezeigten Experimenten lag bei 96% der zugegebenen Radioaktivität, was nicht signifikant unterschiedlich zu 100% ist.
Die Bindungsaffinität von PS-ODN an gewaschene Mikrobläschen wurde durch Zugabe steigender Mengen an überschüssigem nicht-radioaktivem PS-ODN als ein kompetitiver Ligand für Bindungsstellen evaluiert. In diesem Fall wurde ein 20mer PS-ODN mit der Sequenz 5'-d(CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC)-3' (SEQ ID NR 4) eingesetzt, um das radioaktive 24mer zu verdrängen. Die Albumin Proteinkonzentration in den Experimenten mit den gewaschenen Mikrobläschen betrug 0,28 ± 0,04 mg/ml, wie mit dem Bradford-Test bestimmt (Bradford M. et al.: „A Rapid and Sensitive Method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal. Biochem. 72 (1976): 248. Die beobachteten Bindungsdaten sind als Lineweaver-Burke-Diagramm in 1 dargestellt. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_m (berechnet für 7 Konzentrationen, die in Duplikaten getestet wurden) für die Bindung an die Mikrobläschen war 1,76 × 10^–5 M.
Die Verteilung von FITC-markierten Mikrobläschen ist in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 VERTEILUNG VON OLIGONUKLEOTID (PS-ODN)-GEBUNDENEN MIKROBLÄSCHEN

PE: Prozent Ereignisse
MI: Mittlere Intensität
SE: Standardfehler

Die signifikante Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität in den Proben mit unmarkiertem PS-ODN im Überschuß deutet darauf hin, dass die Bindung an die Mikrobläschen gesättigt werden kann. Folgerichtig sind, da die Bindung gesättigt werden kann, die unspezifischen Interaktionen von PS-ODN mit der Mikrobläschenoberfläche limitiert. Eine Gauss-Verteilung von PS-ODN gegen gewaschene PESDA-Mikrobläschen deutete darauf hin, dass das Albumin auf diesen Mikrobläschen seine Bindungsstelle für das Oligonucleotid behalten hat. Das Fehlen einer Gauss-Verteilung für gewaschenes RA-SDA deutete darauf hin, dass der Verlust der Bindungsstelle 1 für dieses Oligonucleotid im Albumin während der Ultraschallbehandlung dieser Mikrobläschen erfolgte. Zur Diskussion der Bindungseigenschaften von Albumin, besonders in Bezug auf Oligonucleotide, siehe Kumar, Shashi et al.: „Characterization of Binding Sites, Extent of Binding, and Drug Interactions of Oligonucleotides with Albumin", Antisense Research and Development 5 (1995): 131–139, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Aus dem Vorangegangenen ist ersichtlich, dass PS-ODN an das Albumin in PESDA-Mikrobläschen bindet, was darauf hindeutet, dass die Bindungsstelle 1 im Albumin nach der Herstellung dieser Bläschen durch elektromechanische Ultraschallbehandlung biologisch aktiv ist. Diese Bindungsstellenaffinität geht verloren wenn die elektromechanische Ultraschallbehandlung nur mit "room sir" durchgeführt wird. Außerdem zeigt das Entfernen von Albumin, das nicht mit PESDA-Mikrobläschen assoziiert ist, durch Waschen eine signifikante Aufteilung der PS-ODNs mit den Mikrobläschen (Tabelle 1). Diese Beobachtungen verdeutlichen, dass mit Dextrose/Albumin-Lösungen, die Perfluorkohlenstoff enthalten, keine Denaturierung des Albumins während der Ultraschallbehandlung auftritt, wie es für die Ultraschallbehandlung in Gegenwart von Luft vorgeschlagen wurde. Die aufrechterhaltene Bindungsaffinität von Albumin (besonders an Stelle 1) in PESDA-Mikrobläschen wurde bestätigt durch die Bindungsaffinität von PS-ODN gegenüber gewaschenen PESDA-Mikrobläschen in Anwesenheit aufsteigender Mengen von überschüssigem nicht-radioaktivem PS-ODN als kompetitivem Ligand für Bindungsstellen (Tabelle 2). Die signifikante Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität in den Proben, die überschüssiges unmarkiertes PS-ODN enthalten, deutet darauf hin, dass die Bindung an Mikrobläschen gesättigt werden kann.
BEISPIEL 3
VERÄNDERTE BIOVERTEILUNG ÜBER MIKROBLÄSCHEN-BEREITSTELLUNG VON ANTISENSE-OLIGOS
Gemäß der Erfindung wurden Antisense Phosphothioat-Oligonucleotide gegen die Cytochrom P450 IIB1 Gensequenz entworfen, um den Stoffwechsel von Phenobarbital zu verändern. Die Oligonucleotide wurden an Perfluorpropan-exponierte ultraschallbehandelte Dextrose/Albumin-Mikrobläschen (PESDA) wie früher beschrieben konjugiert und intravenös in Ratten eingebracht. Die Oligonucleotide wurden gemäß der bekannten Cytochrom P450 IIB1-Sequenz der Ratte synthetisiert und hatten folgende Sequenzen:
GGAGCAAGATACTGGGCTCCAT (SEQ ID NR 5)
AAAGAAGAGAGAGAGCAGGGAG (SEQ ID NR 6).
Für alle Untersuchungen wurden männliche Sprague-Dawley Ratten (Sasco, Omaha), die zwischen 210 und 290 g wogen, verwendet. Sie wurden in den Tierställen des Medizinischen Zentrums der Universität von Nebraska, einer AAALAC-anerkannten Tierzuchteinrichtung, gehalten. Die Tiere wurden einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus ausgesetzt und hatten Zugang zu Purina Rattenfutter und Leitungswasser ad libitum.
Den Ratten in Gruppen mit PB wurde intraperitoneal Phenobarbital (Mallinckrodt, St. Louis) zu 80 ml/kg/Tag × 2 Tage injiziert. Die PB-Injektionen wurden simultan mit den Injektionen von ODN-Mikrobläschen verabreicht. Die Phosphorothioat-ODN Injektionen waren 1 ml/kg/Tag × 2 Tage. Die Schlafzeiten wurden 48 Stunden nach der ersten Injektion gemessen. Den Ratten wurden 100 ml/kg Hexobarbital (Sigma, St. Louis), das täglich frisch hergestellt wurde, intraperitoneal injiziert. Das Volumen dieser Injektion ist 1 m/kg Körpergewicht.
Jeder Ratte wurden 100 mg/kg Hexobarbital intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden auf den Rücken gelegt, um sicherzustellen, dass sie sich noch unter Hexobarbital-Sedierung befanden. Die Schlafzeit ist definiert als die Zeit von der an sie auf den Rücken gelegt werden bis zu der Zeit zu der sie sich umdrehen. Die aufgelisteten Schlafzeiten sind die Mittelwerte für jedes Tier in der Gruppe ± Standardabweichung.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bereitstellung der Oligonukleotid-konjugierten Mikrobläschen die Wirksamkeit des Medikaments beträchtlich verbesserte. Ratten, denen eine 1/20 Dosis des Oligos verabreicht wurde, zeigten eine Schlafzeit von mehr als 50 Minuten. Die wird verglichen mit nicht mit Mikrobläschen konjugiertem Oligo mit einer Schlafzeit von ungefähr 13 Minuten.
Die Ratten wurden schließlich unter Verwendung von Ethylether getötet und es wurden Mikrosomen hergestellt, wie von Franklin und Estabrook (1971) beschrieben. Die Leber wurde jeweils mit 12 ml 4% Kochsalzlösung über die Portalvene perfundiert und dann aus dem Tier entfernt. Die Leber wurde jeweils in kleine Stücke zerschnitten, in 0,25 M Saccharose (Sigma) homogenisiert und bei 8000 g für 20 Minuten bei 4°C in einer Sorvall RC2-B Zentrifuge (Dupont, Wilmington, DE) zentrifugiert. Der Überstand wurde aufgehoben und in 0,25 M Saccharose resuspendiert und bei 100.000 g für 45 Minuten bei 4°C in einer Sorvall OTD55B Ultrazentrifuge (Dupont) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,15% KCl (Sigma) resuspendiert und bei 100.000 g für eine Stunde bei 4°C zentrifugiert, das endgültige Pellet wurde im gleichen Volumen Puffer (10 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA, 20% Glycerol; Sigma) resuspendiert und bei –80°C eingefroren.
Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bradford-Test bestimmt (Bradford, 1976). 80 μl Aliquote des Homogenats wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) gegeben. Dann wurden 20 μl Bradford-Reagens (Bio-Rad, Richmond, CA) zugegeben und die Platten wurden bei 595 nm im Mikroplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Newport, MN) gelesen. Die Daten wurden verglichen mit einer Standardkurve, die mit bekannten Konzentrationen von Rinderserumalbumin (Sigma) erzeugt wurde.
Der CYP IIB1-Gehalt wurde bestimmt durch die Aktivität zur Pentoxyresorufin O-Dealkylierung (PROD), (Burke et al. 1985). Für jede Microsomenprobe wurden 1 mg Protein in 1 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, 1 ml 2 μM 5-Pentoxyresorufin (Pierce, Rockford, IL) und 17 μl 60 mM NADPH gemischt und für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Mischung wurde dann in eine 2 ml-Küvette gegeben und in einem RF5000U Spektrofluorophotometer (Shimadzu, Columbia, MD) unter Verwendung einer Exzitationswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 585 nm gemessen. Die Konzentrationen der Proben wurden aus einer Standardkurve für Resorufinstandards (Pierce, Rockford, IL) errechnet. Die Ergebnisse wurden dokumentiert in nmol Resorufin/mg Protein/min.
Eine direkte Messung von CYP IIB1 Protein wurde mit einem ELISA-Test unter Verwendung eines Antikörpers gegen das CYP IIB1 Protein (Schuurs und Van Weeman, 1977) durchgeführt. In einer Nunc-Immunoplatte mit 96 Vertiefungen (InterMed, Skokie, IL) wurden pro Vertiefung 50 μg Leber in 100 μl 0,35% Natriumbicarbonatpuffer über Nacht ausplattiert. Die Microsomen wurden dreimal mit 1% Rinderserumalbumin in PBS (PBS/BSA) gewaschen und für eine Stunde bei 37°C mit 200 μl PBS/BSA inkubiert. Die PBS/BSA-Lösung wurde entfernt und es wurden 50 μl CYP IIB1 Antikörper (Oxygene, Dallas) zugegeben und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Microsomen wurden fünfmal mit Kochsalzlösung/Tween 20 (Sigma) gewaschen und es wurden 50 μl Meerrettichperoxidase-Antikörper (Biorad) zugegeben. Die Microsomen wurden für eine Stunde bei 37°C inkubiert und fünfmal mit Kochsalzlösung/Tween 20 und zweimal mit 85% Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 100 μl Meerrettichperoxidasesubstrat (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) zugegeben und die Platte wurde fortlaufend in einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices) bei 405 nm für eine Stunde abgelesen. Die Ergebnisse wurden dokumentiert als Meerrettichperoxidaseaktivität in mOD/min.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Oligo-konjugierten Mikrobläschen das Oligonucleotid zu Leber und Niere dirigierten. Dies sind Orte an denen der Phenobarbital-Stoffwechsel stattfindet. Wie früher beschrieben wurden jedem Tier am Ende einer zweitägigen Behandlung mit PB und/oder ODNs 100 mg/kg HB i. p. injiziert. Kontrollratten zeigten eine Schlafzeit von etwa 23 Minuten. PB-Gabe führte zu einer signifikanten Reduktion der Schlafzeit auf etwa 11,4 ± 4,5 Minuten. PB stimuliert die CYP IIB1 mRNA, was dazu führt, dass Hexobarbital, das durch CYP IIB1 hydroxyliert wird, schneller metabolisiert wird und dessen sedativer Effekt verringert wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Lösung von proteinumkapselten, unlöslichen, gasgefüllten Mikrobläschen, wobei die Mikrobläschen mit einem biologischen Wirkstoff konjugiert sind, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Bereitstellung eines biologischen Wirkstoffs an einen spezifischen Zielort, wobei das Protein den mit Mikrobläschen konjugierten Wirkstoff zu Orten dirigiert, wo dieses Protein bioprozessiert wird, und nach Zerstörung der Mikrobläschen, ohne den Einsatz von externem Ultraschall auf den Zielort, diesen Wirkstoff abgibt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, menschlichem Gammaglobulin, menschlichem Apotransferrin und Urease.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Protein Albumin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gas Perfluorkohlenstoffgas ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Gas ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan und Perfluorpentan.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Gas Perfluorpropan oder Perfluorbutan ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der biologische Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Oligonucleotid, einem Polynucleotid und einem Ribozym.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der biologische Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense-Oligonucleotid, einer Oligonucleotidsonde und einem Polynucleotidvektor.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Mikrobläschen einen Durchmesser von 0,1 bis 10 μm haben.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Mikrobläschen durch folgende Schritte gebildet werden: Mischen einer wässrigen Lösung umfassend etwa 2 bis etwa 10 Gew.-% menschliches Serumalbumin, etwa 2-fach bis 8-fach verdünnt mit 5 bis 50 Gew.-% Dextrose; und Aussetzen dieser Lösung einer Ultraschallsonde zur Herstellung von Hohlräumen dort, wo Partikel in der Lösung vorkommen, und damit Erzeugung stabiler Mikrobläschen mit einem Durchmesser von etwa 0,1 bis 10 μm.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Verdünnung von Albumin mit Dextrose eine Dreifach-Verdünnung ist.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei das menschliche Serumalbumin eine 5-Gew.-%-Lösung ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Dextrose eine 5-Gew.-%-Lösung ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Arzneimittel für eine intravenöse, perkutane oder intramuskuläre Verabreichung an einen Patienten vorgesehen ist.