DE69727966T2

DE69727966T2 - Ein mit krebs assoziiertes antigen kodierendes isoliertes nukleinsäuremolekül, das antigen selbst, und dessen verwendungen

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Publication number: DE69727966T2
Application number: DE69727966T
Authority: DE
Inventors: Yao-Tseng Chen; Matthew Scanlan; Ali Gure; J. Lloyd OLD; Elke Jager; Alexander Knuth; W. Jan DRIJFHOUT
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1996-10-03
Filing date: 1997-09-15
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2017-09-16
Also published as: ATE260930T1; HK1020968A1; AU732068B2; DK0948518T3; JP2001507212A; CN1232467A; ES2216169T3; JP3799483B2; US6274145B1; CA2266319C; EP0948518B1; NZ335485A; PT948518E; AU4349597A; DE69727966D1; US5804381A; CN1283652C; WO1998014464A1; EP0948518A1; EP0948518A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Krebs-assoziiertes Antigen und das Nucleinsäuremolekül, das für das Antigen kodiert, sowie deren Verwendung.
HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
Es wird weithin anerkannt, dass zahlreiche pathologische Leiden, wie z.B. Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen etc., durch die unangemessene Expression gewisser Moleküle gekennzeichnet ist. Diese Moleküle dienen somit als „Marker" für einen bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von ihrer Verwendung als Diagnose-„Ziele", d.h. als zu identifizierende Materialien, um diese abnormalen Zustände zu diagnostizieren, dienen die Moleküle als Reagenzien, die zur Erzeugung diagnostischer und/oder therapeutischer Wirkstoffe verwendet werden können. Ein keineswegs als einschränkend zu verstehendes Beispiel dafür ist die Verwendung von Krebsmarkern, um für einen bestimmten Marker spezifische Antikörper zu produzieren. Ein anderes nicht einschränkendes Beispiel ist die Verwendung eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül komplexiert, um zytolytische T-Zellen gegen abnormale Zellen zu bilden.
Die Herstellung solcher Materialien setzt natürlich eine Quelle von Reagenzien, die zu deren Bildung verwendet werden, voraus. Die Reinigung von Zellen ist ein anbeitsintensives Verfahren dafür, das weit davon entfernt ist, sicher zu sein. Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist die Isolierung von Nucleinsäuremolekülen, die für einen bestimmten Marker kodieren, gefolgt von der Verwendung des isolierten kodierenden Moleküls, um das gewünschte Molekül zu exprimieren.
Bis heute sind zwei Strategien eingesetzt worden, um solche Antigene z.B. in menschlichen Tumoren zu detektieren. Diese werden als der genetische und der bio chemische Ansatz bezeichnet. Der genetische Ansatz wird z.B. von dePlaen et al. in Proc. Natl. Sci. USA 85, 2275 (1988), dargestellt, was durch Verweis hierin aufgenommen ist. Bei diesem Ansatz werden mehrere hundert Pools von Plasmiden einer cDNA-Bank, die aus einem Tumor erhalten wurde, in Rezeptorzellen wie COS-Zellen oder in Antigen-negative Varianten von Tumorzelllinien, die auf die Expression des spezifischen Antigens untersucht wurden, transfiziert. Der biochemische Ansatz wird z.B. von Kawakami et al., Nature 369, 69 (1994), was hierin durch Verweis aufgenommen ist, dargestellt und basiert auf einer sauren Elution von Peptiden, die an MHC-Klasse-I-Moleküle von Tumorzellen gebunden waren, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Antigenische Peptide werden identifiziert, nachdem sie an leere MHC-Klasse-I-Moleküle mutierter Zelllinien, die in der Antigen-Verarbeitung fehlerhaft sind, gebunden waren, und ergeben spezifische Reaktionen mit zytotoxischen T-Lymphozyten. Diese Reaktionen schließen das Auslösen von CTL-Proliferation, TNF-Freisetzung und Lyse von Zielzellen ein, was in einem MTT-Test oder einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest gemessen werden kann.
Diese zwei Ansätze zur molekularen Definition von Antigenen weisen folgende Nachteile auf: Erstens sind sie sehr umständlich, zeitintensiv und teuer, und zweitens hängen sie vom Vorhandensein zytotoxischer T-Zelllinien (CTLs) mit vorbestimmter Spezifität ab.
Die diesen beiden bekannten Ansätze zur Identifikation und molekularen Definition von Antigenen innewohnenden Problemen werden am besten durch die Tatsache ersichtlich, dass es den Verfahren bisher lediglich gelungen ist, eine geringe Anzahl an neuen Antigenen in menschlichen Tumoren zu definieren. Siehe z.B. van der Bruggen et al., Science 254, 1643–1647 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178, 489-495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180, 35–42 (1994); Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 3515–3519 (1994). Eine neue Familie von Tumorabstoßungs-Antigenvorläufern ist in der WO 96/21673 identifiziert worden.
Die beschriebenen Verfahren verlassen sich ferner auf die Verfügbarkeit vorhandener permanenter Zelllinien der untersuchten Krebsart. Es ist sehr schwierig, Zelllinien gewisser Krebsarten zu sichern, wie z.B. von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10, 607–637 (1990), gezeigt wird. Zudem ist bekannt, dass einige Epithelzell-artige Krebsarten in vitro nur wenig anfällig für CTLs sind, was Routineanalysen ausschließt. Diese Probleme haben auf dem Fachgebiet dazu geführt, dass zusätzliche Verfahren zum Identifizieren von Krebs-assoziierten Antigenen entwickelt wurden.
Ein wichtiges Verfahren wird von Sahin et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11913 (1995), beschrieben. Zusammenfassend gesagt beinhaltet das Verfahren das Exprimieren von cDNA-Banken in einem prokaryotischen Wirt. (Die Banken sind aus einer Tumorprobe gesichert.) Die exprimierten Banken werden mit absorbierten und verdünnten Seren immungescreent, um diejenigen Antigene zu detektieren, die Humoralreaktionen mit hohem Titer hervorrufen. Dieses Verfahren ist als SEREX-Verfahren („Serological identification of antigens by Recombinant Expression Cloning") bekannt. Das Verfahren ist verwendet worden, um die Expression von vorhergehend identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen zu bestätigen sowie neue zu detektieren. Siehe die Patentanmeldung, auf die oben verwiesen wurde, und Sahin et al., s.o., sowie Crew et al., EMBO J 144, 2333–2340 (1995).
Die SEREX-Methode wurde bei Speiseröhrenkrebsproben eingesetzt, und ein Antigen ist nun identifiziert und das dafür kodierende Nucleinsäuremolekül isoliert und kloniert worden. Das Antigen hat sich bei Krebs als weit verbreitet erwiesen, ist jedoch in Nicht-Krebszellen nicht gefunden worden. Dies ist u.a. Gegenstand der Erfindung, die in der folgenden Offenbarung detaillierter beschrieben wird.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt das Expressionsmuster von RNA für das NY-ESO-1-Antigen in verschiedenen Gewebearten.
2 zeigt die Northern-Blot-Analyse von NY-ESO-1-mRNA, die in Hoden und der Zelllinie SK-MEL-19, jedoch nicht in zahlreichen anderen Zell- und Gewebeproben gefunden wurde.
3 zeigt potentielle Modifikationsstellen der abgeleiteten Aminosäuresequenz von NY-ESO-1.
4 ist ein Hydrophilieprofil von NY-ESO-1, das hydrophile Domänen im Aminoterminus und einen langen hydrophoben Abschnitt nahe dem Carboxylende aufzeigt.
5 zeigt die Ergebnisse von CTL-Lyse-Untersuchungen, bei denen verschiedene Zellen verwendet wurden, die HLA-A2-positiv, NY-ESO-1-positiv, positiv für beide oder positiv für keines der beiden sind.
6 veranschaulicht Daten, die belegen, dass HLA-A2 das präsentierende Molekül für die Präsentation von von Seq.-ID-Nr. 1 abgeleiteten Peptiden ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Beispiel 1
Die gesamte RNA wurde mittels weithin bekannter Verfahren aus einer schnell gefrorenen Probe von gut bis mäßig differenziertem Schuppenzellkrebs der Speiseröhre extrahiert. Siehe z.B. Chomzynski, J. Analyt. Biochem. 162, 156–159 (1987), für ein derartiges Verfahren. Diese RNA wurde dazu verwendet, eine cDNA-Bank herzustellen, die dann gemäß den Angaben des Herstellers in λZAP-Phagenvektoren transfiziert wurde. Die λZAP-Bank wurde dann in E. coli transfiziert, wodurch 1,6 × 106 primäre Isolate erhalten wurden.
Anschließend wurde die SEREX-Methode von Sahin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11813 (1995), hierin durch Verweis aufgenommen), angewandt. Kurz gesagt wurde autologes Serum von Antikörpern gegen Moleküle, die für E. coli endogen sind, gestrippt, indem das Serum mit Lysaten von E. coli, die mit Phagen-λZAP, der keine cDNA-Klone der Speiseröhrenkrebszellen enthielt, transfiziert waren, kombiniert wurde.
Das entleerte Serum wurde dann verdünnt und mit Nitrocellulosemembranen, die Phagenplaques enthielten, vermischt. Die Plaques wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Filter mit an alkalische Phosphatase konjugierten sekundären Ziegen-Anti-Human-FCγ-Antikörpern inkubiert, und die reaktiven Phagenplaques wurden durch Inkubation mit 5-Brom-4-chlorindolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium sichtbar gemacht. Insgesamt wurden 13 positive Klone gefunden.
Beispiel 2
Nach der Identifikation wurden die reaktiven Klone durch Verdünnungsklonierung und Testen mit menschlichem Serum zu Monoklonalität subkloniert. Diese Klone wurden dann gereinigt, in vitro ausgeschnitten und gemäß den Angaben des Herstellers in pBK-CMV-Plasmidformen umgewandelt. Die insertierte DNA wurde dann mittels EcoRl-Xbal-Restriktionskartierung evaluiert, um verschiedene Inserts zu bestimmen. Acht verschiedene Inserts wurden identifiziert, deren Größe von etwa 500 bis etwa 1,3 Kilobasenpaaren reichte. Die Klone wurden mittels eines automatisierten ABI-PRISM-Sequencers sequenziert.
Tabelle 1 fasst die Ergebnisse zusammen. Ein Gen wurde durch vier überlappende Klone repräsentiert, ein zweites durch drei überlappende Klone und die restlichen sechs durch lediglich einen Klon.
Eine Homologiesuche brachte hervor, dass die als NY-ESO-2, -3, -6 und -7 bezeichneten Klone bereits bekannt waren. Siehe Elisei et al., J. Endocrin. Invest. 16. 533-540 (1993); Spritz et al., Nucl. Acids Res. 15, 10373–10391 (1987); Rabbits et al., Nature Genetics 4, 175–180 (1993); Crozat et al., Nature 363, 640–644 (1993); Gen-Bank H18368 und D25606. Von zwei der Klone (NY-ESO-3 und NY-ESO-6) wurde bereits gezeigt, dass sie in verschiedenen normalen menschlichen Geweben exprimiert werden. Es wurde kein Hinweis für eine Abstammungsbeschränkung gefunden. NY-ESO-6 (cDNA) scheint der untranslatierte 3'-Abschnitt des FUS/TLS-Gens zu sein. In hier nicht angeführten Versuchen zeigten das Sequenzieren und die Southern-Blot-Analyse von NY-ESO-6 keinen Hinweis auf Translokationen oder Punktmutationen beim Krebs. Vier der Klone, d.h. NY-ESO-1, -4, -5 und -8, zeigten keine starke Homologie mit Sequenzen der untersuchten Datenbanken und wurden genauer untersucht.
Tabelle 1. Aus Speiseröhrenkrebs-Bank durch Immunscreening mit autologem Serum isolierte Gene
Beispiel 3
Untersuchungen wurden durchgeführt, um die mRNA-Expression der NY-ESO-1-, -4-, -5- und -8-Klone zu evaluieren. Dafür wurden spezifische Oligonucleotid-Primer für jede Sequenz entworfen, so dass cDNA-Segmente aus 300 – 400 Basenpaaren amplifiziert werden konnten und die Primer-Schmelztemperatur im Bereich von 65-70 °C liegt. Reverse-Transkriptions-PCR wurde dann mittels im Handel erhältlicher Materialien und Standardvorschriften durchgeführt. Eine Vielzahl normaler Zelltypen sowie Tumorzelltypen wurden getestet. Die Klone NY-ESO-4 und NY-ESO-8 waren ubiquitär und wurden nicht weiter untersucht. NY-ESO-5 zeigte ein hohes Expressionsausmaß im Originaltumor und in normalem Ösophagusgewebe, was nahe legt, dass es ein Differenzierungsmarker ist.
Es stellte sich heraus, dass NY-ESO-1 in Tumor-mRNA und in Hoden, jedoch nicht in normalem Colon-, Nieren-, Leber- oder Hirngewebe exprimiert wurde. Dieses Expressionsmuster stimmt mit anderen Tumorabstoßungs-Antigenvorläufern überein.
Beispiel 4
Der obenstehend erläuterte RT-PCR-Test wurde für NY-ESO-1 bei einem umfassenderen Set an normalem Gewebe und Tumorgewebe durchgeführt. Die Tabellen 2, 3 und 4 zeigen diese Ergebnisse. Kurz gesagt stellte sich heraus, dass NY-ESO-1 in normalen Hoden und Eierstockzellen stark exprimiert wird. Geringe Mengen der RT-PCR-Produktion wurden in normaler Uterusmuskulatur gefunden, jedoch nicht in der Gebärmutterschleimhaut, wobei das positive Anzeichen nicht konsistent war. Das Schuppenepithel verschiedener Zelltypen, einschließlich normaler Speiseröhre und Haut, war ebenfalls negativ.
Als Tumoren nicht verwandter Zelllinien getestet wurden, zeigten 2 von 11 Melanom-Zelllinien sowie auch 16 von 67 Melanomproben, 6 von 33 Brustkrebsproben und 4 von 4 Blasenkrebesproben eine starke Expression. Bei anderen Tumorarten lag sporadische Expression vor.
Tabelle 4: NY-ESO-1-mRNA-Expression bei verschiedenen menschlichen Tumoren durch RT-PCR
Eine weitere Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das Vorhandensein von Anit-NY-ESO-1-Antikörper in Krebspatientensera mittels ELISA bestimmt werden konnte. Zusammenfassend gesagt wurde rekombinantes NY-ESO-1-Protein, das durch die untenstehend erläuterten Verfahren hergestellt wurde, mittels Standardverfahren auf feste Oberflächen aufgetragen. Von normalen Patienten und Patienten mit verschiedenen Krebsarten wurden Serumproben entnommen. Anti-NY-ESO-1-Antikörper sollten an diese binden. Sie wurden dann mit Ziegen-Anti-Human-IgG kontaktiert, mit alkalischer Peroxidase markiert und dann mit Substrat sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angeführt:
Beispiel 5
Anschließend wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um die Größe des NY-ESO-1-Transkripts zu untersuchen und die Gewebeexpressionsmuster zu bestätigen. Die Verfahrensweise von Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (1995)) wurde verwendet. Genauer gesagt wurden 20 μg der gesamten RNA pro Bahn in einem Formamid- und Formaldehyd-hältigen Puffer gelöst, auf 65 °C erhitzt und dann auf einem 1,2%igen Agarosegel mit 3 % Formaldehyd getrennt, gefolgt von einem Transfer auf Nitrocellulosepapier. Mittels einer ³²P-markierten Sonde wurde eine Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von hoch-stringentem Waschen. Der letzte Waschvorgang wurde 15 min lang bei 0,1×SSC, 0,1 % SDS, 60 °C durchgeführt.
RNA aus Hoden und eine Melanomzelllinie (SK-MEL-19), die in vorherigen Tests positiv für NY-ESO-1 gewesen waren, zeigten ein RNA-Transkript von etwa 0,8 – 0.9 kb. Eine Ösophaguskarzinomprobe zeigte ein Schleifen im 0,4- bis 0,9-Kilobasenbereich, was einen partiellen Abbau wiederspiegelte. RNA zusätzlicher getesteter Gewebe oder Zelllinien zeigte kein Transkript.
Um cDNA zu erhalten, die für das volle Transkript kodiert, wurde die Ösophagus-cDNA-Bank mittels Plaque-Hybridisierung erneut gescreent, und der ursprüngliche cDNA-Klon wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Beim Screenen von 3×10⁵ Klonen wurden sechs Positive gefunden. Die drei längsten Klone wurden sequenziert. Die Analyse der offenen Leseraster zeigte, dass alle drei die gesamte Kodierungsregion sowie untranslatierte 5'-Regionen unterschiedlicher Größe enthielten. Der längste Klon mit einer Länge von 755 Basenpaaren (ohne polyA) enthält eine 543 Basenpaare lange Kodierungsregion, zusammen mit 53 untranslatierten Basen am 5'-Ende und 151 untranslatierten Basenpaare am 3'-Ende. Siehe Seq.-ID-Nr. 1 (ebenso 3).
Der lange ORF deutete darauf hin, dass die abgeleitete Sequenz des NY-ESO-1-Proteins 180 Aminosäuren hat. Der einzelne immunpositive Klon enthielt eine Sequenz, die für 173 davon kodierte. Die abgeleitete Molekülmasse beträgt 17.995 Dalton.
Die Analyse zeigt, dass ein Übermaß an Glycinresten im N-Terminusabschnitt (30 der ersten 80, 4 in den restlichen 100) vorliegt. Die Hydrophilie-Analyse zeigte, dass hydrophile Antigensequenzen in der N-Terminushälfte des Moleküls gegeben waren, mit abwechselnd hydrophoben und hydrophilen Sequenzen, die in einem langen hydrophoben Schwanz am C-Terminus endeten (Aminosäuren 152 – 172), gefolgt von einem kurzen hydrophilen Schwanz. Dieses Muster legt eine Transmembrandomäne nahe. Es gibt mehrere potentielle N-Myristorylierungsstellen, 3 Phosphorylierungsstellen und keinen Hinweis auf N-Glykosylierungsstellen.
Beispiel 6
Eine Melanomzelllinie „NW-MEL-38" wurde 1995 aus einem Patienten, der an malignen Melanomen litt, gesichert. Serumproben, Peripherblutlymphozyten und Tumorproben wurden vom Probanden entnommen und eingefroren, bis die hierin beschriebenen Arbeiten durchgeführt wurde. Unter Vorwegnahme der Evaluierung von Anti tumor-T-Zellenreaktion bei diesem Patienten wurde der Patient als HLA-A1 und HLA-A2 typisiert.
Um zu bestimmen, ob die Melanome dieses Patienten NY-ESO-1 exprimierten, wurde die gesamte RNA mittels Standardverfahren aus den Tumorproben sowie der Zelllinie NW-MEL-38 isoliert. Dann wurden zwei Mikrogramm der gesamten RNA von jeder der Proben einer cDNA-Synthese unterzogen, wobei wiederum Standardverfahren angewandt wurden.
Die cDNA wurde dann in RT-PCR-Versuchen eingesetzt, wobei die folgenden Primer herangezogen wurden:

5' -CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G' – 3' (Seq.-ID-Nr. 2),
und
CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG – 3' (Seq.-ID-Nr. 3)

Diese Primer sollten ein Segment der Seq.-ID-Nr. 1 amplifizieren, das sich über die Nucleotide 271 bis 599 erstreckt.
Die Amplifizierung wurde über 35 Zyklen bei einer Anellierungstemperatur von 60 °C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Ethidiumbromid-Färbung auf 1,5%-igem Agarosegel sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass der Tumor sowie die Zelllinie Seq.-ID-Nr. 1 exprimierten. Die Zelllinien- und Tumorproben wurden in nachfolgenden Experimenten eingesetzt.
Beispiel 7
Das oben erläuterte isolierte cDNA-Molekül wurde dann zur Herstellung eines rekombinanten Proteins verwendet. Insbesondere wurde die cDNA durch Standardverfahren PCR-amplifiziert und dann in einen im Handel erhältlichen Plasmidvektor, d.h. pQE9, der His-Markierungen enthält, kloniert. In Versuchen, die hierin nicht ausführlich erläutert werden, wurde auch ein zweiter Vektor, pQE9K, verwendet. Dieser unterscheidet sich von PQE9 dadurch, dass durch pQE9K Kanamycin-Resistenz anstelle von Ampicillin-Resistenz verliehen wird.
Der Plasmid-Vektor wurde in den E.-coli-Stamm XL1-Blue transformiert, und positive Transformanten wurden durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung identifiziert. Die Herstellung eines rekombinanten Proteins wurde durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid angeregt, und das Protein wurde auf einer Ni²⁺-Ionenchromatographiesäule nach weithin bekannten Verfahren gereinigt. Das Protein wurde bei der Analyse mittels 15 % SDS-PAGE und Silberfärbung als ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 22 Kilodalton identifiziert. Dies stimmt mit der aus seiner Sequenz erwarteten Größe des Proteins überein.
Nun wurden eukaryotische Transfektanten hergestellt. Dazu wurde die NY-ESO-1-Kodierungssequenz aus dem oben beschriebenen pQE9-Vektor isoliert und dann in BamHI-HindIII-Stellen des eukaryotischen Expressionsvektors pcDNA 3.1 kloniert. Als nächstes wurden COS-7-Zellen mit diesem Vektor transfiziert, indem Zellproben mit 150 ng des oben erläuterten Plasmids und 150 ng Plasmid pcDNA-1-Amp kontaktiert wurden, die entweder cDNA für HLA-A2.1 oder cDNA für HLA-A1 enthielten. Das weithin bekannte DEAE-Dextran-Chloroquin-Verfahren wurde verwendet. Die Zellen wurden dann bei 37 °C 48 h lang inkubiert und anschließend in einem CTL-Stimulationstest getestet. Der Test erfolgte gemäß Traversari et al., Immunogenetics 35, 145–148 (1992), was hierin durch Verweis aufgenommen ist. Zusammenfassend gesagt wurden 2500 CTLs (NW38-IVS-1, siehe Beispiel 9 unten) in 100 μl RPMI, er gänzt mit 100 % Humanserum und 25 U/ml rekombinantem IL-2 zu Mikrowells mit COS-7-Transfektanten (20.000 Zellen/Well) zugesetzt. Nach 24 h wurden 50 μl Überstand aus jedem Well entnommen, und die TNF-α-Mengen wurden in einem Standardtest, d.h. einem Test, in dem die Zytotoxizität gegen WEHI-164-Klon-13-Zellen getestet wurde, mittels MTT ermittelt. Die positiven Zellen wurden in der Western-Blot-Analyse, die im folgenden Beispiel beschrieben wird, verwendet.
Die verwendeten CTLs waren CTL NW38-IVS-1, hergestellt gemäß Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511–3515 (1984), was hierin durch Verweis aufgenommen ist. Insbesondere wurden gemischte Lymphozyten-T-Zellen-Kulturen hergestellt, indem 10⁵ autologe NW38-MEL-1-Tumorzellen und 10⁶ Lymphozyten aus peripherem Blut vom Probanden kombiniert wurden. Das Zytokin IL-2 wurde zugesetzt, und die gemischte Kultur wurde bei 37 °C 1 Woche lang inkubiert. Tumorzellen wurden entfernt, und eine neue Aliquote aus 5×10⁴ Tumorzellen wurde zusammen mit IL-2 zugesetzt. Dieser Vorgang wurde wöchentlich wiederholt, bis beim Testen gegen ⁵¹Cr-markierte NW-MEL-38-Zellen eine starke Reaktion ersichtlich war. Die Reaktions-T-Zellen wurden gesammelt und eingefroren, bis sie in weiteren Versuchen eingesetzt wurden.
Beispiel 8
Unter Verwendung der oben beschriebenen Serumproben sowie der oben beschriebenen Zelllysate aus der Zelllinie NW-MEL-38 und der oben beschriebenen COS-7-Transfektanten und dem ebenfalls oben beschriebenen gereinigten rekombinanten Protein wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Serumproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Therapie des Patienten abgenommen. Bei den Ergebnissen lag kein Unterschied vor.
In diesen Tests wurden 1 μg rekombinantes NY-ESO-1-Protein oder 5 μl Zelllysate jeden Typs in SDS verdünnt und 5 min lang aufgekocht und anschließend auf einem 15 % SDS-Gel Elektrophorese unterzogen. Nach dem Blotten über Nacht auf Nitrocellulose (0,45 μm) und Blockieren mit 3 % BSA wurden die Blots mit Serum, das 1:1000, 1:10.000 und 1:100.000 verdünnt war, oder mit einem monoklonalem Antikörper gegen NY-ESO-1, verdünnt 1:50, als positive Kontrolle inkubiert. Der monoklonale Antikörper wurde wie folgt hergestellt. BALB/C-Mäuse wurden durch 5 subkutane Injektionen mit rekombinantem NY-ESO-1-Protein in Intervallen von 2 – 3 Wochen immunisiert. Die Immunisierungsformulierung schloss 50 μg rekombinantes Protein in Adjuvans ein. Die erste Injektion verwendete komplettes Freundsches Adjuvans, und danach wurde unvollständiges Freundsches Adjuvans verwendet. Aus den immunisierten Mäusen wurden Milzzellen entnommen und mit der Mausmyelom-Zelllinie SP2/0 fusioniert, um Hybridome zu erzeugen.
Sobald Hybridome erzeugt worden waren, wurden sie kloniert und ihre Überstände mittels Standard-Festphasen-ELISA auf Mikrotiterplatten gegen rekombinantes Protein gescreent. Der Test erfolgte gemäß Dippold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114–6118 (1980), was hierin durch Verweis aufgenommen ist. Unter Verwendung von rekombinantem NY-ESO-1 wurde auch eine Reihe negativer Kontrollen durchgeführt. Serumantikörper, die an rekombinantes Protein banden, das wie oben beschrieben von E. coli erzeugt wurde, wurden durch Ziegen-Anti-Human-IgG, markiert mit alkalischer Phosphatase in einer Verdünnung von 1:10.000, visualisiert und dann mit NBT-Phosphat sichtbar gemacht. Nicht transfizierte COS-7-Zellen wurden ebenfalls als Kontrolle eingesetzt. Auch Serum von gesunden Probanden wurde als Kontrolle verwendet.
Bei Serumverdünnungen von 1:100.000 zeigte sich starke Reaktivität gegen das rekombinante Protein sowie Reaktivität gegen das Lysat von NW-MEL-38. Gegen die nicht transfizierten COS-7-Zellen lag keine Reaktivität vor, und auch das Serum eines gesunden Probanden wies keine Reaktivität auf.
Beispiel 9
Beim Testen der COS-7-Transfektanten, siehe oben, und bei den in diesem Beispiel erläuterten Tests wurde eine zytolytische T-Zelllinie „NW38-IVS-1" verwendet. Diese „CTL" wurde durch In-vitro-Stimulation der oben erwähnten Lymphozyten aus peripherem Blut unter Verwendung der Tumorzelllinie NW-MEL-38 erzeugt. Dies wurde durch Standardverfahren durchgeführt.
Die CTL wurde in einem Zytotoxizitätstest mit NW-MEL-38 (das HLA-A1-, -A2-positiv und NY-ESO-1-positiv war) zusammen mit zwei allogenischen Zelllinien, die NY-ESO-1-positiv und HLA-A2-positiv waren (SK-MEL-37 und MZ-MEL-19), einer Zelllinie, die MHC-Klasse-1-negativ ist (SK-MEL-19), einer Zelllinie, die HLA-A2-positiv jedoch NY-ESO-1-negativ ist (NW-MEL-145) sowie mit Kontrollzelllinien K562 und autologen, Phytohemagglutinin-stimulierten Blasten verwendet. Verschiedene Effektor/Ziel-Verhältnisse wurden verwendet, und die Lyse ⁵¹Cr-markierter Zielzellen wurde als Parameter gemessen. 5 veranschaulicht dies.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CTL NW38-IVS-1 sowohl die autologe Zelllinie NW-MEL-38 als auch die allogenischen Zelllinien, die HLA-A2- und ESO-1-positiv waren, lysierte. Daher war die CTL mit allogenischen Materialien reaktiv. Siehe 6.
Beispiel 10
Da Patient NW38 HLA-A1- und HLA-A2-positiv war, wurden Versuche durchgeführt, um herauszufinden, welches MHC-Molekül das präsentierende Molekül war.
Derselbe Versuch wie oben in Zusammenhang mit COS-7-Zellen beschrieben wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass bei diesen Versuchen darauf geachtet wurde, getrennte Gruppen an Cotransformanten, die entweder mit HLA-A1-cDNA oder NLA- A2-cDNA, jedoch nicht mit beiden transformiert worden waren, zu sichern. Die Ergebnisse zeigen, dass die CTL NW38-IVS-1 COS-7-Transfektanten, die ausschließlich sowohl NY-ESO-1 als auch HLA-A2 enthielten, lysierte. Siehe 6. Die Versuche bestätigten auch die Spezifität der CTL, da die in Beispiel 9 beschriebenen NY-ESO-1-negativen, HLA-A2-positiven Zellen für andere Moleküle positiv waren, von denen bekannt ist, dass sie zu durch HLA-A2-Moleküle repräsentierten Peptiden verarbeitet werden.
Beispiel 11
Sobald das repräsentierende MHC-Molekül als HLA-A2 identifiziert worden war, wurde Screening der Aminosäuresequenz für NY-ESO-1 durchgeführt, um sämtliche Peptide zu identifizieren, die dieses Motiv erfüllen, und zwar unter Verwendung des von D'Amaro et al., Human Immunol. 43, 13–18 (1995), und Drijfhout et al., Human Immunol. 43, 1–12 (1995), erläuterten Modells, das hierin durch Verweis aufgenommen ist. Peptide, die sämtlichen dadurch abgeleiteten Aminosäuresequenzen entsprachen, wurden mittels Standardverfahren synthetisiert und dann in Zytotoxizitätstests nach Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511–3515 (1984), was durch Verweis hierin aufgenommen ist, verwendet. Insbesondere wurde die Zelllinie CEMX721.174.T2 („T2" hierin nachstehend) verwendet, da sie keine Antigene auf MHC-komplexierte Peptide verarbeitet, wodurch sie ideal für Versuche der hierin beschriebenen Art ist. Proben von T2-Zellen wurden durch Standardverfahren mit 100 μCi Na(⁵¹Cr)O₄ markiert und dann drei Mal gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit 10 μg/ml Peptid und 2,5 μg/ml β2-Mikroglobulin. Die Inkubation erfolgte 1 h lang bei Raumtemperatur. Anschließend wurden Reaktionszellen (100 μl einer CTL-NW-38-IVS-1-Suspension) in einem Effektor/Ziel-Verhältnis von 90:1 zugesetzt und 4 h lang in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C inkubiert. Dann wurden die Platten mit 200×g 5 min lang zentrifugiert, 100 μl Überstand entfernt und die Radioaktivität gemessen. Der Prozentsatz an ⁵¹Cr-Freisetzung wurde gemäß bekannter Strategien ermittelt. Es stellte sich heraus, dass die Peptide SLLMWITQCFL (Seq.-ID-Nr. 4), SLLMWITQC (Seq.-ID-Nr. 5) und QLSLLMWIT (Seq.-ID-Nr. 6) die drei besten Stimulatoren der CTLs waren. Vergleichbare Ergebnisse ergaben sich bei der Verwendung von NW-MEL-38 und Zelllinien SK-MEL-37 und MZ-MEL-19 als Ziele, wie obenstehend dargestellt ist.
Die vorhergehenden Beispiele beschreiben die Isolation eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein Speiseröhrenkrebs-assoziiertes Antigen kodiert. „Assoziiert" wird hierin verwendet, da, obwohl klar ist, dass das relevante Molekül durch Speiseröhrenkrebs exprimiert worden ist, andere Krebsarten wie Melanom, Brust-, Prostata- und Lungenkrebs das Antigen ebenfalls exprimieren.
Die Erfindung bezieht sich auf die Nucleinsäuremoleküle, die wie beschrieben für Antigene kodieren und unter stringenten Bedingungen zur Referenzsequenz Seq.-ID-Nr. 1 hybridisieren. „Stringente Bedingungen" bezieht sich hierin auf Bedingungen, wie sie in der US-A-5.342.774 spezifiziert sind, d.h. 18 h Hybridisierung bei 65 °C gefolgt von vier einstündigen Waschschritten bei 2×SSC, 0,1 % SDS und einer letzten Waschung bei 0,2×SSC, noch bevorzugter 0,1×SSC, 0,1 % SDS 30 min lang sowie wechselnde Bedingungen, die dasselbe Ausmaß an Stringenz erfordern, und stringentere Bedingungen.
Teil der Erfindung sind auch Expressionsvektoren, die die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung in operabler Bindung (d.h. "operabel gebunden") an einen Promotor beinhalten. Die Konstruktion solcher Vektoren wie auch die Transformation oder Transfektion von Zellen, um eukaryotische Zelllinien oder prokaryotische Zellstämme, die für das Molekül von Interesse kodieren, herzustellen, ist für Fachleute auf dem Gebiet kein Problem. Beispiele für Wirtszellen, die auf diese Art und Weise verwendet werden können, sind COS-Zellen, CHO-Zellen, Hefezellen, Insektenzellen (z.B. Spodoptera frugiperda), NIH-3T3-Zellen usw. Auch prokaryotische Zellen wie E. Coli und andere Bakterien können verwendet werden.
Ebenfalls Teil der Erfindung ist das hierin beschriebene Antigen, sowohl in ursprünglicher Peptidform als auch in posttranslational modifizierter Form. Das Molekül ist groß genug, um ohne jegliche posttranslationale Modifikation antigenisch zu sein, und ist daher als Immunogen nützlich, wenn es in Vorläuferformen sowie posttranslational modifizierten Formen mit einem Adjuvans (oder ohne dieses) kombiniert wird. Die durch dieses Antigen erzeugten poly- sowie monoklonalen Antikörper sind ebenso Teil der Erfindung wie das Hybridisieren, das den monoklonalen Antikörper ausbildet. Dieser kann therapeutisch als ganzes Protein oder in Teilen, wie untenstehend erläutert, eingesetzt werden. Teil der Erfindung sind zudem Antikörper gegen dieses Antigen, wie polyklonale, monoklonale, reaktive Fragmente wie Fab, F(ab)₂' oder andere Fragmente, sowie Chimären, humanisierte Antikörper, rekombinant erzeugte Antikörper usw.
Aus der Offenbarung geht hervor, dass die Proteine und Nucleinsäuremoleküle der Erfindung diagnostisch verwendet werden können. Das hierin erläuterte SEREX-Verfahren wird bei einer Immunreaktion auf ein Pathologie-assoziiertes Antigen angeführt. Die jeweilige Pathologie kann daher durch z.B. Testen einer Körperflüssigkeitsprobe eines Probanden wie Serum auf die Reaktivität mit dem Antigen an sich geprüft werden. Die Reaktivität würde als Anzeichen für das mögliche Vorhandensein der Pathologie erachtet werden, so dass die Expression des Antigens durch einen beliebigen Standard-Nucleinsäurehybridisierungstest, wie sie auf dem Gebiet weithin bekannt sind und hierin nicht erläutert werden müssen, getestet werden könnte. Anhand von Standardimmunoassays könnte auch auf Antikörper gegen das jeweilige Molekül getestet werden.
Die Analyse der Seq.-ID-Nr. 1 zeigt, dass darin nichtkodierende 5'- und 3'-Regionen vorhanden sind. Die Erfindung bezieht sich auf die isolierten Nucleinsäuremoleküle, die zumindest das kodierende Segment, d.h. Nucleotide 54 – 593, enthalten und einen beliebigen oder alle der Nucleotide 1 – 53 und/oder 594 – 747 der Seq.-ID-Nr. 1 umfassen können.
Weitere Untersuchungen, wie oben erläutert, zeigen, dass das Molekül zu Peptiden verarbeitet wird, die Lyse durch zytolytische T-Zellen hervorrufen. Beispiel 7 veranschaulichte, dass diese Art der Motivanalyse für HLA-A2-Moleküle durchgeführt werden kann. Viel Arbeit wurde in die Erforschung von Motiven für verschiedene MHC- oder HLA-Moleküle investiert, die hier anwendbar ist. Daher bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen, die in einem therapeutischen Verfahren nützlich sind, worin ein oder mehrere Peptide, die an ein HLA-Molekül auf der Oberfläche von Tumorzellen eines Patienten binden, dem Patienten in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, dass die Peptide an die MHC/HLA-Moleküle binden und Lyse durch T-Zellen hervorrufen. Die oben angeführte Erläuterung für HLA-A2-Moleküle ist keineswegs die einzige Art der Verabreichung, die verwendet werden kann. Eine beliebige Kombination von Peptiden kann herangezogen werden. Diese Peptide, die alleine oder in Kombination verwendet werden können, sowie das gesamte Protein oder immunreaktive Abschnitte davon können einem Probanden, der sie benötigt, durch eine beliebige Standardverabreichungsart, wie z.B. intravenös, intradermal, subkutan, oral, rektal und transdermal, verabreicht werden. Es können auch normale pharmazeutische Träger, Adjuvantien wie Saponine, GM-CSF und Interleukine usw. verwendet werden. Weiters können diese Peptide und Proteine in Vakzinen mit dem angeführten Material, wie auch dendritische Zellen oder andere Zellen, die die relevanten MHC/Peptid-Komplexe repräsentieren, formuliert werden.
In ähnlicher Weise bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen, die in Therapien nützlich sind, worin das Nucleinsäuremolekül, das für NY-ESO-1 kodiert, in einen Vektor, wie einen Vektor auf Adenovirus-Basis, eingebaut ist, um dieses in eukaryotische Zellen, wie menschliche Zellen, transfizierbar zu machen. Ähnlich können Nucleinsäuremoleküle, die für ein oder mehrere der Peptide kodieren, in diese Vektoren eingebaut sein, die dann den Hauptbestandteil der Nucleinsäure-basierten Therapien darstellen.
Jeder dieser Tests kann auch in Progressions-/Regressionsuntersuchungen verwendet werden. Der Verlauf einer Anomalie, die die Expression von NY-ESO-1 beinhaltet, kann durch einfaches Überwachen der Mengen des Proteins, dessen Expression usw. durch eine beliebige oder alle der oben erläuterten Verfahren überwacht werden.
Es sollte klar sein, dass diese Verfahren auch dazu verwendet werden können, die Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung zu bestimmen. Im Wesentlichen kann ein Basiswert für das NY-ESO-1-Protein durch einen beliebigen der obenstehend erläuterten Tests herangezogen, ein gegebener therapeutischer Wirkstoff verabreicht und dann der Proteinspiegel danach überwacht werden, wobei Veränderungen im ESO-1-Anteil als Anzeichen der Wirksamkeit der Behandlung dienen.
Wie obenstehend angedeutet wurde, beinhaltet die Erfindung u.a. das Erkennen einer „integrierten" Immunreaktion auf das NY-ESO-Molekül. Eine Ramifikation dieses ist die Fähigkeit, den Verlauf der Krebstherapie zu überwachen. Bei diesem Verfahren erhält ein Proband, der behandelt werden muss, eine Impfung, wie sie hierin beschrieben wurde. Eine solche Impfung führt z.B. zu einer T-Zellen-Reaktion gegen Zellen, die HLA/Peptid-Komplexe auf ihren Zellen aufweisen. Die Reaktion kann auch eine Antikörperreaktion einschließen, die möglicherweise eine Folge der Freisetzung von Antikörper-provozierenden Proteinen durch die Lyse von Zellen durch die T-Zellen ist. Die Wirkung einer Vakzine kann daher durch Überwachen einer Antikörperreaktion kontrolliert werden. Wie oben angedeutet wurde, kann eine Erhöhung des Antikörpertiters als Anzeichen für einen Fortschritt durch eine Vakzine betrachtet werden, und umgekehrt. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Überwachen der Wirksamkeit einer Vakzine nach deren Verabreichung, indem die Antikörperspiegel beim Probanden bestimmt werden, der für die Vakzine selbst oder ein großes Molekül, das Teil der Vakzine ist, spezifisch ist.
Die Identifizierung von NY-ESO-1-Proteinen, wie sie bei pathologischen Erkrankungen wie Krebs vorkommen, legt zusätzlich zu den oben erläuterten auch eine Anzahl anderer therapeutischer Ansätze nahe. Die obenstehenden dargestellten Versuche beweisen, dass Antikörper in Reaktion auf die Expression des Proteins erzeugt werden. Die Erfindung stellt daher Zusammensetzungen bereit, die sich auf die Behandlung von Erkrankungen, die durch abartige oder abnormale Mengen an NY-ESO-1-Proteinen gekennzeichnet sind, durch die Verabreichung von Antikörpern, wie humanisierte Antikörper, Antikörperfragmente usw., beziehen. Diese können durch geeignete zystostatische oder zytotoxische Reagenzien etikettiert oder markiert sein.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können bei Verfahren verwendet werden, bei denen auch T-Zellen verabreicht werden. Es muss zudem festgestellt werden, dass die T-Zellen in vitro durch reagierende Zellen wie dendritische Zellen, Lymphozyten oder beliebige andere immunreagierende Zellen hervorgebracht und dann in den behandelten Probanden zurückperfundiert werden können.
Es ist festzustellen, dass die Erzeugung von T-Zellen und/oder Antikörpern auch durch die Verabreichung von Zellen, die vorzugsweise so behandelt wurden, dass sie nicht proliferativ sind, erreicht werden kann, die die für die Reaktion relevanten T-Zellen- oder B-Zellen-Epitope repräsentieren, wie z.B. die obenstehend erläuterten Epitope.
Die therapeutischen Ansätze können auch Antisense-Therapien einschließen, worin ein Antisense-Molekül, vorzugsweise mit einer Länge von 10 bis 100 Nucleotiden, dem Probanden entweder „unverdünnt" oder in einem Träger wie einem Liposom verabreicht wird, um die Einbindung in eine Zelle zu erleichtern, worauf eine Hemmung der Expression des Proteins folgt. Solche Antisense-Sequenzen können auch in geeignete Vakzinen, wie virale Vektoren (z.B. Vaccinia), bakterielle Konstrukte, wie Varianten der bekannten BCG-Vakzine, usw., integriert sein.
Ebenfalls Teil der Erfindungen sind Peptide, die Nonamere, Decamere oder Undecamere sein können, die als die folgende Kernsequenz aufweisend definiert sind:
LLMWIT (Seq.-ID-Nr. 7)
wobei sie zumindest ein zusätzlicher Restterminus zum ersten L-Rest, vorzugsweise Serin, aufweisen, wobei sie bis zu drei besitzen können, worin Serin an L gebunden ist, um -SL- auszubilden, sowie 0 bis 4 zusätzliche Aminosäuren am C-Terminus, die wie oben dargestellt an HLA-A2-Moleküle binden, wodurch eine CTL-Reaktion hervorgerufen wird. Diese Peptide können therapeutisch verwendet werden, indem sie einem Patienten, der HLA-A2-positiv ist und in Zusammenhang mit einer Erkrankung NY-ESO-1 exprimiert, verabreicht werden, sowie diagnostisch, d.h. um zu ermitteln, ob HLA-A2-positive Zellen oder relevante CTLs vorhanden sind, usw.
Das HLA-A2-Molekül ist ein MHC-Klasse-I-Molekül, und die T-Zellen, die auf Komplexe aus Peptiden und Klasse-I-Molekülen reagieren, sind im Allgemeinen CD8⁺-Zellen. Eine weitere Teilmenge der T-Zellen, CD4⁺-Zellen, reagiert auf Komplexe aus MHC-Klasse-II-Molekülen und Peptiden, und MHC-Klasse-II eingeschränkte CD4⁺-T-Zellenreaktionen gegen rekombinante NY-ESO-1, die durch autologe kultivierte dendritische Zellen repräsentiert werden, wurden bei Melanom-Patienten detektiert. In hierin nicht beschriebenen Ergebnissen wurden insbesondere CD4⁺-Zellen von anderen Zellen aus PBLs oder Serumproben mittels weithin bekannter Verfahren getrennt. Dann wurden sie mit dendritischen Zellen gemischt, die mit NY-ESO-1-Protein gepulst worden waren. Eine Proliferation von CD4⁺-Zellen wurde beobachtet, was der hierin erläuterten integrierten Immunreaktion eine weitere Facette verleiht. Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind daher diese CD4⁺-T-Zellen, Peptide, die an die MHC-Klasse-11-Moleküle binden, sowie deren Verwendung in der Therapie.
Weitere Merkmale und Anwendungen der Erfindung sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich und müssen hierin nicht erläutert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Krebs-assoziiertes Antigen kodiert, wobei das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz aufweist, deren Komplementärsequenz unter stringenten Bedingungen an das Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das aus der in den Nucleotiden 54 – 593 von Seq.-ID-Nr. 1 dargelegten Nucleotidsequenz besteht.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das aus den Nucleotiden 54 – 593 von Seq.-ID-Nr. 1 besteht.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das aus beliebigen von Nucleotid 1 bis Nucleotid 747 von Seq.-ID-Nr. 1 besteht, mit der Maßgabe, dass das isolierte Nucleinsäuremolekül zumindest die Nucleotide 54 bis 593 von Seq.-ID-Nr. 1 enthält.
Expressionsvektor, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 operabel an einen Promotor gebunden umfasst.
Expressionsvektor, der ein mutiertes oder abgeschwächtes Virus und das isolierte Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, worin das Virus Adenovirus oder Vaccinavirus ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, der weiters ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das für ein MHC oder HLA kodiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, der weiters ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das für ein Cytokin kodiert.
Isolierte eukaryotische Zelllinie oder prokaryotischer Zellstamm, die bzw. der mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert oder transfiziert ist.
Isolierte eukaryotische Zellline oder prokaryotischer Zellstamm, die bzw. der mit einem isolierten Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 transformiert oder transfiziert ist.
Isolierte eukaryotische Zelllinie nach Anspruch 10, worin die Zelllinie nicht-proliferativ gemacht worden ist.
Isolierte eukaryotische Zelllinie nach Anspruch 10, worin die Zelllinie eine Fibroblasten-Zelllinie ist.
Isolierte eukaryotische Zelllinie nach Anspruch 10, worin die Zelllinie auch mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert ist, das für ein Cytokin kodiert.
Isolierte eukaryotische Zelllinie nach Anspruch 13, worin die Zelllinie weiters mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert ist, das für ein HLA-Molekül kodiert.
Isolierte eukaryotische Zelllinie nach Anspruch 13 oder Expressionsvektor nach Anspruch 8, worin das Cytokin ein Interleukin ist.
Isolierte eukaryotische Zelllinie oder Expressionsvektor nach Anspruch 15, worin das Interleukin IL-2, IL-4 oder IL-12 ist.
Isoliertes Krebs-assoziiertes Antigen, das die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz umfasst, für die die Nucleotide 54 bis 593 von Seq.-ID-Nr. 1 kodieren.
Zum Transfizieren einer Zelle nützliches Expressionssystem, umfassend: (i) einen ersten Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül enthält, das für ein isoliertes Krebs-assoziiertes Antigen nach Anspruch 17 kodiert, sowie (ii) einen zweiten Vektor, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) einem Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül enthält, das für ein MHC- oder HLA-Molekül kodiert, das ein Antigen aufweist, das vom Krebs-assoziierten Antigen stammt, und (b) einem Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül enthält, das für ein Interleukin kodiert.
Immunogene Zusammensetzung, die ein isoliertes Antigen nach Anspruch 17 oder einen für das Antigen kodierenden Expressionsvektor und ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans umfasst.
Immunogene Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz aus 8 bis 12 miteinander verknüpften Aminosäuren in einem isolierten Krebs-assoziierten Antigen nach Anspruch 17 besteht, das die gesamte Aminosäuresequenz umfasst, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, worin das Adjuvans ein Cytokin, ein Saponin oder GM-CSF ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin die Zusammensetzung mehrere Peptide umfasst, die mit einem spezifischen MHC-Molekül komplexieren.
Immunogene Zusammensetzung, die zumindest einen Expressionsvektor, der für mehrere Peptide kodiert, die von der Aminosäuresequenz abgeleitet sind, für die Seq.-ID-Nr. 1 kodiert, sowie ein Adjuvans oder einen Träger umfasst.
Isoliertes Peptid, das von der Aminosäuresequenz abgeleitet ist, für die Seq.-ID-Nr. 1 kodiert, worin das isolierte Peptid an ein HLA-Molekül bindet, ein Nonamer, Decamer oder Undecamer ist und die Aminosäuresequenz von Seq.-ID-Nr. 7, eine bis drei zusätzliche N-terminate Aminosäuren sowie bis zu vier zusätzliche C-terminale Aminosäuren umfasst.
Isoliertes Peptid nach Anspruch 24, das aus der aus Seq.-ID-Nr. 4, Seq.-ID-Nr. 5 und Seq.-ID-Nr. 6 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder isoliertes Peptid nach Anspruch 24, worin das MHC- oder HLA-Molekül HLA-A2 ist.
Vakzine, die zur Behandlung eines Probanden nützlich ist, der an einer krebsartigen Erkrankung leidet, umfassend ein isolierte Zelllinie nach Anspruch 14 und ein pharmakologisch annehmbares Adjuvans.
Vakzine nach Anspruch 27, worin die Zelllinie nicht-proliferativ gemacht worden ist.
Materialzusammensetzung, die zur Behandlung einer krebsartigen Erkrankung nützlich ist, umfassend (i) ein Peptid, das von der Aminosäuresequenz abgeleitet ist, für die Seq.-ID-Nr. 1 kodiert, (ii) ein MHC- oder HLA-Molekül und (iii) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Materialzusammensetzung, die zur Behandlung einer krebsartigen Erkrankung nützlich ist, umfassend eine nicht-proliferative Zelllinie, auf deren Oberfläche ein Peptid exprimiert wird, das von der Aminosäuresequenz abgeleitet ist, für die Seq.-ID-Nr. 1 kodiert.
Materialzusammensetzung nach Anspruch 30 oder Vakzine nach Anspruch 28, worin die Zelllinie eine menschliche Zelllinie ist.
Isolierter Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das Antigen binden kann, wobei der Antikörper oder das Fragment für ein isoliertes Krebs-assoziiertes Antigen nach Anspruch 17 spezifisch ist.
Isolierter Antikörper oder isoliertes Fragment nach Anspruch 32, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 32 oder 33, das ein Fab-Fragment oder ein F(ab')₂-Fragment ist.
Isolierter Antikörper oder isoliertes Fragment nach Anspruch 32, der bzw. das rekombinant erzeugt ist.
Isolierter Antikörper nach Anspruch 35, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Isolierter Antikörper nach Anspruch 35, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Verfahren zum Screenen auf Krebs in einer von einem Probanden entnommenen Probe, umfassend das Kontaktieren der isolierten Probe mit einem Nucleinsäuremolekül, das spezifisch an die gesamte oder einen Teil der Seq.-ID-Nr. 1 hybridisiert, und das Bestimmen der Hybridisierung an Seq.-ID-Nr. 1 als Indikator für Krebszellen in der Probe.
Verfahren zum Screenen auf Krebs in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem isolierten Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprü che 32 bis 37 und das Bestimmen der Bindung des Antikörpers oder Fragments an ein Ziel als Indikator für Krebs.
Verfahren zum Diagnostizieren einer krebsartigen Erkrankung bei einem Probanden, umfassend das Kontaktieren einer vom Probanden entnommenen Probe, die eine immunreaktive Zelle enthält, mit einer Zelllinie, die mit einem isolierten Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 transfiziert ist, und das Bestimmen der Wechselwirkung der transfizierten Zelllinie mit der immunreaktiven Zelle, wobei die Wechselwirkung die krebsartige Erkrankung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 40, worin die immunreaktive Zelle enthaltende Probe Blut oder Serum umfasst.
Verfahren zum Bestimmen von Regression, Progression oder Einsetzen einer krebsartigen Erkrankung, umfassend das Überwachen einer von einem Patienten mit der krebsartigen Erkrankung entnommenen Probe bezüglich (i) eines Proteins, für das eine isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, (ii) eines Peptids, das vom Protein abgeleitet ist, oder (iii) zytolytischer T-Zellen, die für das Peptid spezifisch sind, und eines MHC-Moleküls, mit dem es nichtkovalent komplexiert, worin das Ausmaß des Parameters die Progression oder Regression oder das Einsetzen der krebsartigen Erkrankung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 42, worin die isolierte Probe eine Körperflüssigkeit, ein Exsudat oder eine Gewebeprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 42, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das sich spezifisch an das Protein oder Peptid bindet.
Verfahren nach Anspruch 44, worin der Antikörper oder das Fragment mit einer radioaktiven Markierung oder einem Enzym markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 44, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, worin das Antikörperfragment ein Fab-Fragment oder ein F(ab')₂-Fragment ist.
Verfahren nach Anspruch 44, worin der Antikörper oder das Fragment rekombinant erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 48, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 48, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 42, umfassend das Amplifizieren von RNA, die für das Protein kodiert.
Verfahren nach Anspruch 51, worin das Amplifizieren das Durchführen von Polymerase-Kettenreaktion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 42, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem Nucleinsäuremolekül, das spezifisch an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das für das Protein kodiert oder es exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 42, umfassend das Testen der Probe auf das Protein.
Verfahren zum Diagnostizieren einer krebsartigen Erkrankung, umfassend das Testen einer von einem Probanden entnommenen Probe auf eine immunreaktive Zelle, die für ein Peptid spezifisch ist, das von einem Protein stammt, für das Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert und das an ein MHC-Molekül komplexiert ist, wobei das Vorhandensein der immunreaktiven Zelle die krebsartige Erkrankung anzeigt.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Probanden, der an einer krebsartigen Erkrankung leidet, umfassend das Kontaktieren einer vom Probanden entnommenen immunreaktive Zelle enthaltenden Probe mit einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 9 bis 16 unter Bedingungen, die die Vermehrung der immunreaktiven Zellen begünstigen.
Zelle, die transfiziert ist mit (i) einer Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und (ii) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein MHC- oder HLA-Molekül kodiert, das ein Peptid aufweist, das von einem Protein stammt, für das die Nucleinsäure kodiert, zur Verwendung bei der Behandlung eines Probanden mit einer krebsartigen Erkrankung, worin das Peptid von Zellen bereitgestellt wird, die mit der krebsartigen Erkrankung assoziiert sind.
Verwendung einer Zelle nach Anspruch 57 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der krebsartigen Erkrankung, wobei die Verwendung das Behandeln der Zelle umfasst, um sie nicht-proliferativ zu machen.
Verwendung eines Reagens, das im Wesentlichen aus nicht-proliferativen Zellen besteht, an deren Oberfläche nichtkovalenter Komplex aus MHC-Molekül und Peptid exprimiert wird, das von einem Protein abgeleitet ist, für das Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Probanden, der an einer krebsartigen Erkrankung leidet.
Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, wobei der Antikörper oder das Fragment spezifisch an ein Protein, für das Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, oder ein vom Protein abgeleitetes Peptid bindet, das auf einer Krebszelle exprimiert wird, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Probanden, der an einer krebsartigen Erkrankung leidet, wobei der Antikörper oder das Fragment an ein Antikrebsmittel gekoppelt ist, in einer Menge, die ausreicht, um die krebsartige Erkrankung zu behandeln.
Verwendung nach Anspruch 60, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 60, worin das Antikörperfragment ein Fab-Fragment oder ein F(ab')₂-Fragment ist.
Verwendung nach Anspruch 60, worin der Antikörper oder das Fragment rekombinant erzeugt ist.
Verwendung nach Anspruch 63, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 63, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, einer Vakzine nach Anspruch 27 oder einer Materialzusammensetzung nach Anspruch 30 bei der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen das Einsetzen einer krebsartigen Erkrankung.
Verwendung eines isolierten Krebs-assoziierten Antigens nach Anspruch 17, welches die gesamte Aminosäuresequenz umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer krebsartigen Erkrankung.
Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit einer Vakzine nach einem der Ansprüche 27 oder 28 oder einer Vakzine, die eine immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 23 oder 26 oder eine Materialzusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 31 umfasst, nach der Verabreichung der Vakzine an einen Probanden, umfassend das Bestimmen von Antikörpern in vom Probanden entnommener Probe, die sich an die Vakzine oder an ein Molekül bindet, das die Vakzine umfasst, worin eine Veränderung der Menge der Antikörper nach der Verabreichung der Vakzine in Bezug auf die Menge vor der Verabreichung die Wirksamkeit oder die Wirkungslosigkeit anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 56, Zelle nach Anspruch 57 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 59 bis 67, worin ein Proband mit einer krebsartigen Erkrankung zumindest eines von Antikörpern gegen das Protein, für das das isolierte Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 kodiert, oder zytolytischen T-Zellen, die für Komplexe von HLA-Molekülen spezifisch sind, sowie ein Peptid aufweist, das vom Protein in einer Körperflüssigkeit des Probanden abgeleitet ist.