DE69730534T2

DE69730534T2 - Zusatzstoff für transkutane immunisierung

Info

Publication number: DE69730534T2
Application number: DE69730534T
Authority: DE
Inventors: M. Gregory GLENN; R. Carl ALVING
Original assignee: US Department of Army
Current assignee: US Department of Army
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2017-11-15
Also published as: CN1241906A; KR100517028B1; US5980898A; AU744537B2; EP2272526A3; ATE349890T1; US7037499B1; WO1998020734A1; IL129919A; BR9712952A; JP4584361B2; IL129919A0; AU5265298A; AP9901540A0; DE69730534D1; ATE274805T1; CN1279976C; CA2272417C; DE69737218D1; EP1014787B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die transkutane Immunisierung und dafür nützliche Adjuvanzien, um eine Antigen-spezifische Immunantwort auszulösen.
Die transkutane Immunisierung benötigt sowohl die Passage eines Antigens durch die äußeren Barrieren der Haut, die normalerweise undurchlässig für eine solche Passage sind, und die Immunantwort gegenüber dem Antigen. In der US Anmeldung Nr. 08/749,164 wurde gezeigt, dass die Verwendung von Choleratoxin als ein Antigen eine starke Antikörperantwort auslöst, die gut reproduzierbar ist; das Antigen konnte in einer Salzlösung auf die Haut, mit oder ohne Liposomen, aufgetragen werden. In der vorliegenden Anmeldung zeigen wir transkutane Immunisierung unter Verwendung von Adjuvants wie beispielsweise bakteriellen Exotoxinen, ihren Untereinheiten und verwandten Toxinen.
Es gibt einen Bericht der transdermalen Immunisierung mit Transferosomen von Paul et al. (1995). In dieser Veröffentlichung werden Transferosomen als ein Träger für Proteine (bovines Serumalbumin und gap junction Proteine) verwendet, gegen welche die komplementvermittelte Lyse von Antigen-sensitiven Liposomen gerichtet ist. Es wurde keine Immunantwort induziert, wenn eine Lösung enthaltend das Protein, auf die Haut gegeben wurde; nur Transferosomen waren in der Lage, Antigen über die Haut zu transportieren und eine Immunisierung zu erreichen. Wie in der US Anmeldung Nr. 08/749,164 diskutiert wird, sind Transfersomen keine Liposomen.
Die 1 von Paul et al. (1995) zeigte, dass nur eine Formulierung aus Antigen und Transferosomen eine Immunantwort induzierte, was durch die Lyse von Antigen-sensitiven Liposomen gemessen wurde. Formulierungen aus Antigen in Lösung, Antigen und gemischten Mizellen und Antigen und Liposomen (d. h. smektische Mesophasen), die auf die Haut aufgetragen wurden, induzierten keine Immunantwort, die mit jener vergleichbar wäre, die durch subkutane Injektion induziert wird. Deshalb gab es eine Positivkontrolle (d. h. Antigen und Transferosomen), um ihre negative Schlussfolgerung zu validieren, dass eine Formulierung aus Antigen und Liposomen keine dermale Immunisierung bewirkte.
Paul et al. (1995) führen auf Seite 3521 aus, dass die Haut eine wirksame Schutzbarriere ist, die "für Substanzen mit einem Molekulargewicht von maximal 750 Da undurchdringbar ist", was die nicht invasive Immunisierung mit einem großen Immunogen durch die intakte Haut ausschließt. Deshalb führt diese Referenz weg von der Verwendung eines Moleküls wie Choleratoxin (das 85.000 Daltons groß ist), weil von solchen Molekülen nicht erwartet wird, dass sie die Haut durchdringen und deshalb würde von ihnen nicht erwartet, dass sie eine Immunisierung erreichen. Daher stellt die Haut eine Barriere dar, die das Durchdringen eines Adjuvants oder Antigen-ähnlichen Choleratoxins ohne die Offenbarung der vorliegenden Erfindung nicht erwarten lässt.
Paul und Cevc (1995) führen auf Seite 145 aus, dass "große Moleküle normalerweise nicht über die intakte Säugetierhaut gelangen. Es ist deshalb unmöglich, epikutan mit einfachen Peptid- oder Proteinlösungen zu immunisieren." Sie schlussfolgern, dass "die dermal verabreichten, liposomalen oder gemischten mizellaren Immunogene biologisch ebenso inaktiv sind wie einfache Proteinlösungen, gleichgültig ob sie mit dem Immunadjuvants Lipid A kombiniert werden oder nicht."
Wang et al. (1996) gaben eine Lösung aus Ovalbumin (OVA) in Wasser auf die Haut von rasierten Mäusen, um eine Antwort des allergischen Typs als ein Modell für atopische Dermatitis zu induzieren. Die Mäuse wurden betäubt und mit einem okklusiven Pflaster, das bis zu 10 mg OVA enthielt, bedeckt, das kontinuierlich für vier Tage auf der Haut gelegt wurde. Dieses Verfahren wurde nach zwei Wochen wiederholt.
In der 2 von Wang et al. (1996) zeigte ein ELISA Assay, der unternommen wurde um die IgG2a Antikörperantwort zu bestimmen, keine IgG2a Antikörperantwort gegenüber OVA. Jedoch konnten IgE Antikörper, die mit allergischen Antworten assoziiert sind, detektiert werden. In einem weiteren Experiment wurden die Mäuse stärker mit OVA in Lösung für vier Tage alle zwei Wochen zugepflastert. Dies wurde fünfmal wiederholt, d. h. die Mäuse trugen insgesamt für 20 Tage Pflaster. Wieder bildete die hohe Dosis an OVA keine signifikanten IgG2a Antikörper. Signifikante Mengen an IgE Antikörpern wurden gebildet.
Die Autoren führen auf Seite 4079 aus, dass "sie ein Tiermodell etablierten, um zu zeigen, dass das epikutane Aussetzen gegenüber Protein Ag, in der Abwesenheit von Adjuvants, Tiere sensibilisieren und eine dominante Th2-ähnliche Antwort mit hohen Mengen an IgE induzieren kann". Das übermäßige epikutane Aussetzen gegenüber hohen Dosen an Protein Antigen konnte keine signifikanten IgG Antikörper bilden, aber es konnte IgE Antikörper induzieren, das Kennzeichen einer Reaktion des allergischen Typs. Daher lehren Wang et al. (1996), dass die OVA Exposition, wie beschrieben, ein Modell für atopische Dermatitis und nicht eine Art der Immunisierung ist. Deshalb hätte man der Lehre der Referenz folgend erwartet, dass die transkutane Immunisierung mit Antigen große Mengen an IgE Antikörpern induzieren würde, wenn es in der Lage ist, die Haut zu durchdringen und eine Immunantwort zu induzieren. Demgegenüber haben wir unerwartet gefunden, dass ein Antigen, das auf die Haut in einer Salzlösung mit Adjuvants gegeben wird, große Mengen an IgG und einiges IgA, aber nicht IgE induziert.
Im Gegensatz zu den zitierten Referenzen haben die Erfinder gefunden, dass das Aufbringen von Antigen und Adjuvants auf die Haut ein transkutanes Transportsystem für Antigen bereitstellt, das eine Antigen-spezifische Immunantwort von IgG oder IgA induzieren kann. Das Adjuvants ist vorzugsweise ein ADP-ribosylierendes Exotoxin. Wahlweise können Hydration, Penetrationsverstärker oder okklusive Verbände in dem transkutanen Transportsystem verwendet werden.
Der Stand der Technik (z. B. Holmgren et al., 1993 Vaccine 11, 1179–1184; WO 94/17211 und Dickinson & Clements 1995 Infection and Immunity 63, 1617–1623) offenbaren verschiedene Zusammensetzungen, die ein Antigen und ein Adjuvants (z. B. Tetanustoxinfragment C in Kombination mit E. coli hitzelabilem Toxin oder "LT") umfassen. Der Stand der Technik lehrt insbesondere, dass solche Zusammensetzungen für die Verwendung als Vakzinen geeignet sein können, aber er offenbart nicht oder schlägt in irgendeiner Weise vor, dass solche Zusammensetzungen verwendet werden könnten, um eine Immunantwort durch transkutane Immunisierung nach Verabreichung auf die unperforierte Haut hervorzurufen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein System zur transkutanen Immunisierung bereitzustellen, das eine Immunantwort (z. B. humorale und/oder zelluläre Effektoren) in einem Tier oder dem Menschen induziert.
Das System erlaubt eine einfache Verabreichung einer Formulierung an unperforierte Haut eines Organismus, die ein Antigen und Adjuvants umfasst, um eine spezifische Immunantwort gegenüber dem Antigen zu induzieren.
Insbesondere kann das Adjuvants Antigen-präsentierende Zellen des Immunsystems aktivieren (z. B. Langerhans Zellen in der Epidermis, dermale dendritische Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen, B Lymphozyten) und/oder die Antigen-präsentierenden Zellen induzieren, um das Antigen zu phagozytieren. Die Antigen-präsentierenden Zellen präsentieren dann das Antigen gegenüber T und B Zellen. Im Falle der Langerhans Zellen können die Antigen-präsentierenden Zellen anschließend von der Haut zu den Lymphknoten wandern und das Antigen den Lymphozyten präsentieren (z. B. B und/oder T Zellen), wodurch eine Antigen-spezifische Immunantwort induziert wird.
Zusätzlich zum Auslösen von Immunreaktionen, die zur Bildung eines Antigen-spezifischen B Lymphozyten und/oder T Lymphozyten führen, einschließlich eines zytotoxischen T Lymphozyten (CTL), ist es ein anderes Ziel der Erfindung, Bestandteile des Immunsystems positiv und/oder negativ durch Verwendung des transkutanen Immunisierungssystems zu regulieren, um Antigen-spezifische Helfer T Lymphozyten (Th1, Th2 oder beide) zu beeinflussen.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung eines Antigens und eines Adjuvants in der Herstellung einer Formulierung für transkutane Immunisierung, wie in Anspruch 1 ausgeführt, bereitgestellt. Die Formulierung kann zusätzliche Antigene einschließen, so dass die transkutane Verabreichung der Formulierung eine Immunantwort gegenüber vielen Antigenen induziert. In einem solchen Fall können die Antigene von derselben Quelle abgeleitet sein, oder auch nicht, aber die Antigene werden unterschiedliche chemische Strukturen besitzen, so dass spezifische Immunantworten für die verschiedenen Antigene induziert werden. Antigen-spezifische Lymphozyten können an der Immunantwort teilhaben und, im Falle der Teilnahme von B Lymphozyten, können Antigen-spezifische Antikörper Teil der Immunantwort sein.
Die Formulierung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, kann verwendet werden, um einen Organismus zu behandeln. Wenn das Antigen von einem Pathogen abgeleitet ist, vakziniert die Behandlung den Organismus gegenüber Infektion durch das Pathogen oder gegenüber seinen pathogenen Wirkungen, wie solche, die durch Toxinsekretion verursacht werden. Eine Formulierung, die ein Tumorantigen einschließt, kann eine Krebsbehandlung bereitstellen, eine Formulierung, die ein Autoantigen einschließt, kann eine Behandlung für eine Krankheit bereitstellen, die durch das eigene Immunsystem des Organismus verursacht wird (z. B. Autoimmunkrankheit), und eine Formulierung, die ein Allergen einschließt, kann in der Immuntherapie verwendet werden, um eine allergische Krankheit zu behandeln.
Die Formulierung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, kann die Form eines Pflasters annehmen. Das Pflaster umfasst einen Verband und wirksame Mengen an Antigen und Adjuvants. Der Verband kann okklusiv oder nicht okklusiv sein. Das Pflaster kann zusätzliche Antigene einschließlich, so dass die Verabreichung des Pflasters eine Immunantwort gegenüber verschiedenen Antigenen auslöst. In einem solchen Fall können die Antigene von derselben Quelle abgeleitet sein, oder auch nicht, aber die Antigene werden unterschiedliche chemische Strukturen besitzen, so dass eine Immunantwort spezifisch für die verschiedenen Antigene induziert wird. Für eine wirksame Behandlung können mehrere Pflaster in häufig wiederholten Intervallen oder konstant über einen Zeitraum verabreicht werden.
Die Formulierung kann an die unperforierte Haut verabreicht werden, die über mehr als einem ableitenden Lymphknotenfeld liegt, unter Verwendung entweder einer einzelnen oder mehrerer Verabreichungen. Die Formulierung kann zusätzliche Antigene einschließen, so dass eine Verabreichung an unperforierte Haut eine Immunantwort gegenüber verschiedenen Antigenen induziert. In einem solchen Fall können die Antigene von derselben Quelle abgeleitet sein, oder auch nicht, aber die Antigene werden verschiedene chemische Strukturen haben, so dass eine Immunantwort spezifisch für die verschiedenen Antigene induziert wird.
Die Produkte der Erfindung können verwendet werden, um eine bestehende Krankheit zu behandeln, um eine Krankheit zu verhindern oder die Schwere und/oder Dauer einer Krankheit zu verringern. Jedoch ist die Induktion von Allergie, atopischer Erkrankung, Dermatitis oder Kontakthypersensitivität nicht bevorzugt.
Zusätzlich zu dem Antigen und dem Adjuvants kann die Formulierung weiterhin ein hydratisierendes Mittel (z. B. Liposomen), einen Penetrationsverstärker, oder beide umfassen. Beispielsweise kann die Antigen-Adjuvantsformulierung weiterhin eine Emulsion, hergestellt aus AQUAPHOR (Petrolatum, Mineralöl, Mineralwachs, Wollwachs, Panthenol, Bisabol und Glycerin), Emulsionen (z. B. wässrige Cremes), Öl-in-Wasser Emulsionen (z. B. ölige Cremes), wasserfreie Lipide und Öl-in-Wasser Emulsionen, wasserfreie Lipide und Wasser-in-Öl Emulsionen, Fette, Wachse, Öl, Silicone, Befeuchtungsmittel (z. B. Glycerol), ein Gelee (z. B. SURGILUBE, KY-Gelee) oder eine Kombination davon umfassen. Die Formulierung kann als eine wässrige Lösung bereitgestellt werden.
Die Formulierung schließt vorzugsweise kein organisches Lösungsmittel ein. Die Formulierung kann aufgebracht werden, nachdem die Haut mit Alkohol abgewischt wurde. Jedoch ist die Entfernung der Keratinozytenschicht vor Verabreichung der Formulierung in dem Ausmaß, wie es durch ein Enthaarungsmittel erreicht wird, nicht bevorzugt.
Das Antigen kann von einem Pathogen, das den Organismus infizieren kann (z. B. Bakterium, Virus, Pilz oder Parasit) oder einer Zelle (z. B. Tumorzelle oder normale Zelle), abgeleitet sein. Das Antigen kann ein Tumorantigen oder ein Autoantigen sein. Chemisch kann das Antigen ein Kohlenwasserstoff, Glycolipid, Glycoprotein, Lipid, Lipoprotein, Phospholipid, Polypeptid oder ein chemisches oder rekombinantes Konjugat der oben Genannten sein. Das Molekulargewicht des Antigens kann größer als 500 Daltons, vorzugsweise größer als 800 Daltons, und weiter bevorzugt größer als 1000 Daltons sein.
Das Antigen kann auf rekombinante Weise, durch chemische Synthese oder Reinigung aus einer natürlichen Quelle erhalten werden. Bevorzugt sind proteinöses Antigen der Konjugate mit Polysacchariden. Das Antigen kann wenigstens teilweise in zellfreier Form gereinigt sein. Alternativ dazu kann das Antigen in Form eines lebenden Virus, eines attenuierten lebenden Virus oder eines inaktivierten Virus bereitgestellt werden.
Der Einschluss eines Adjuvants kann die Verstärkung oder Modulation der Immunantwort erlauben. Darüber hinaus kann die Wahl eines geeigneten Antigens oder Adjuvants die präferentielle Induktion einer humoralen oder zellulären Immunantwort, spezifischer Antikörperisotypen (z. B. IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder eine Kombination davon) und/oder spezifischer T Zelluntergruppen (z. B. CTL, Th1, Th2, T_DTH oder einer Kombination davon) erlauben.
Vorzugsweise ist das Adjuvants ein ADP-ribosylierendes Exotoxin oder eine Untereinheit davon.
Wahlweise kann das Antigen in der Formulierung durch eine Nukleinsäure (z. B. DNA, RNA, cDNA, cRNA) bereitgestellt werden, die das Antigen oder Adjuvants, je nachdem, kodiert. Diese Technik wird als genetische Immunisierung bezeichnet.
Der Begriff „Antigen", wie er in der Erfindung verwendet wird, soll eine Substanz beschreiben, die eine spezifische Immunantwort induziert, wenn sie Immunzellen eines Organismus ausgesetzt wird. Ein Antigen kann ein einzelnes immunogenes Epitop oder eine Vielzahl von immunogenen Epitopen, die durch einen B Zell Rezeptor (d. h., Antikörper auf der Membran einer B Zelle) oder einen T Zell Rezeptor erkannt werden, aufweisen. Ein Molekül kann sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvants (z. B., Choleratoxin) sein, und deshalb kann die Formulierung nur einen Bestandteil aufweisen.
Der Begriff „Adjuvants", wie er in der Erfindung verwendet wird, soll eine Substanz beschreiben, die der Formulierung hinzugefügt wird, um beim Induzieren einer Immunantwort gegenüber dem Antigen zu helfen. Eine Substanz kann sowohl als Adjuvants als auch als Antigen wirken, indem sie sowohl Immunstimulation als auch eine spezifische Antikörper oder T Zell Antwort induziert.
Der Begriff „wirksame Menge", wie er in der Erfindung verwendet wird, soll die Menge an Antigen beschreiben, die eine Antigen-spezifische Antwort induziert. Eine solche Induktion einer Immunantwort kann eine Behandlung, wie beispielsweise Immunschutz, Desensibilisierung, Immunsuppression, Modulation von Autoimmunkrankheit, Verstärkung der Krebsüberwachung oder therapeutische Vakzinierung gegen eine etablierte infektiöse Krankheit bereitstellen.
Der Begriff „ableitendes Lymphknotenfeld", wie er in der Erfindung verwendet wird, bedeutet einen anatomischen Bereich, über welchen die gesammelte Lymphe durch einen Satz von definierten Lymphknoten (z. B., zervikal, axillar, inguinal, epitrochelear, popliteal, jene des Abdomen und des Thorax) gefiltert wird.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt, dass Choleratoxin (CT) die verstärkte Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Expression auf Langerhans Zellen (LC), Änderungen in LC Morphologie und Verlust an LCs (wahrscheinlich durch Migration) induziert. BALB/c Mäuse (H-2^d) wurden mit 250 μg Cholera CT oder seiner B Untereinheit (CTB) in Kochsalzlösung in das Ohr transkutan immunisiert. Vorherige Experimente hatten gezeigt, dass Mäuse einfach immunisiert werden können, wenn die Haut des Ohres (7000 anti-CT ELISA Einheiten nach einer einzelnen Immunisierung) verwendet wird. Nach 16 Stunden wurden epidermale Schichten hergestellt und hinsichtlich MHC Klasse II Molekülen (Skalierungseinheit beträgt 50 μm) gefärbt. Die Bilder zeigen (A) Kochsalzlösung alleine als eine Negativkontrolle, (B) transkutane Immunisierung mit CT in Kochsalzlösung, (C) transkutane Immunisierung mit CTB in Kochsalzlösung, und (D) intradermale Injektion mit Tumornekrosisfaktor-α (10 μg) als eine Positivkontrolle.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein transkutanes Immunisierungssystem transportiert Mittel zu spezialisierten Zellen (z. B., Antigen-präsentierende Zelle, Lymphozyt), die eine Immunantwort bilden (Bos, 1997). Diese Mittel, als eine Klasse, werden als Antigene bezeichnet. Antigene können aus Chemikalien, wie beispielsweise Kohlenhydrat, Glycolypid, Glycoprotein, Lipid, Lipoprotein, Phospholipid, Polypeptide, Protein, Konjugate davon oder anderen Materialien, von denen bekannt ist, dass sie eine Immunantwort induzieren, zusammengesetzt sein. Das Antigen kann als ein gesamter Organismus, wie beispielsweise ein Bakterium oder Virion, bereitgestellt werden; das Antigen kann aus einem Extrakt oder Lysat erhalten werden, entweder von gesamten Zellen oder Membran alleine; oder das Antigen kann chemisch synthetisiert oder durch rekombinante Mittel hergestellt werden oder durch die Inaktivierung eines Virus.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung sind im Stand der Technik gut bekannt, wonach das Antigen und Adjuvants mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel kombiniert werden. Geeignete Vehikel und ihre Herstellung sind beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin. Solche Formulierungen werden eine wirksame Menge des Antigens und Adjuvants zusammen mit einer geeigneten Menge des Vehikel enthalten, um pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen herzustellen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier geeignet sind. Die Formulierung kann in der Form einer Creme, Emulsion, Gel, Lotion, Salbe, Paste, Lösung, Suspension oder anderen, im Stand der Technik bekannten Formen, verabreicht werden. Insbesondere sind Formulierungen, welche die Hauthydration, Penetration oder beides verstärken, bevorzugt. Es können auch andere pharmazeutisch verträgliche Zusatzstoffe einschließlich beispielsweise Verdünnungsmittel, Bindemittel, Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Farbstoffe eingeschlossen werden.
Steigende Hydration des Stratum corneum wird die Geschwindigkeit der perkutanen Absorption eines gegebenen gelösten Stoffs (Robert und Walker, 1993) verstärken. So wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schließt „Penetrationsverstärker" keine Substanzen, wie beispielsweise: Wasser, physiologische Puffer, Kochsalzlösungen und Alkohole, welche die Haut nicht perforieren würden, ein.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Mittel zur Immunisierung durch unperforierte Haut ohne die Notwendigkeit, die Haut zu perforieren, bereitzustellen. Das transkutane Immunisierungssystem stellt ein Verfahren bereit, durch welches Antigene und Adjuvants zu dem Immunsystem transportiert werden können, insbesondere spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen, die unter der Haut liegen, wie beispielsweise Langerhans Zellen.
Ohne durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu werden, sondern nur um eine Erklärung für unsere Beobachtungen bereitzustellen, wird angenommen, dass das transkutane Immunisierungstransportsystem Antigen zu Zellen des Immunsystems trägt, wo eine Immunantwort induziert wird. Das Antigen kann durch die normalen, schützenden, äußeren Schichten der Haut (d. h., Stratum corneum) hindurchwandern und die Immunantwort direkt induzieren, oder durch eine Antigen-präsentierende Zelle (z. B., Makrophage, Gewebsmakrophage, Langerhans Zelle, dendritische Zelle, dermale dendritische Zelle, B Lymphozyt oder Kupffer Zelle), die prozessiertes Antigen an einen T Lymphozyten präsentiert. Wahlweise kann das Antigen durch das Stratum corneum über eine Haarwurzel oder eine Hauptorganell (z. B. Schweißdrüse, Öldrüse) hindurchwandern.
Die transkutane Immunisierung mit bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen (bAREs) kann auf die epidermale Langerhans Zelle abzielen, von der bekannt ist, dass sie eine der wirksamsten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) (Udey, 1997), ist. Wir haben herausgefunden, dass bAREs Langerhans Zellen aktivieren, wenn sie epikutan auf die Haut in Kochsalzlösung aufgebracht werden. Die Langerhans Zellen veranlassen spezifische Immunantworten durch Phagozytose des Antigens und Migration zu den Lymphknoten, wo sie als APCs agieren, um das Antigen den Lymphozyten zu präsentieren (Udey, 1997), und dadurch induzieren sie eine wirksame Antikörperantwort. Obwohl die Haut für gewöhnlich als eine Barriere gegenüber eindringenden Organismen erachtet wird, wird die Unvollkommenheit dieser Barriere durch die zahlreichen Langerhans Zellen bezeugt, die über die Epidermis verteilt sind, die vorgesehen sind, die Immunantwort gegen Organismen, welche über die Haut eindringen (Udey, 1997), zusammenzuführen.
Nach Udey (1997):
„Langerhans Zellen sind vom Knochenmark abgeleitete Zellen, die in allen stratifizierten Plattenepithelien von Säugetieren vorkommen. Sie weisen die gesamte akzessorische Zellaktivität auf, die in der uninfizierten Epidermis vorliegt, und in dem vorliegenden Musterbeispiel sind sie essentiell für die Einleitung und Weiterführung von Immunantworten, die gegen epikutan verabreichte Antigene gerichtet sind. Langerhans Zellen sind Mitglieder einer Familie von wirksamen akzessorischen Zellen („dendritischen Zellen"), die weit verteilt sind, aber unregelmäßig in Epithelien und festen Organen ebenso wie im lymphoiden Gewebe vorkommen ..."
„Es wurde jetzt erkannt, dass Langerhans Zellen (und wahrscheinlich andere dendritische Zellen) einen Lebenszyklus mit wenigstens zwei verschiedenen Stufen aufweisen. Langerhans Zellen, die in der Epidermis lokalisiert sind, bilden ein reguläres Netzwerk von Antigen-fangenden „Wächter" Zellen. Epidermale Langerhans Zellen können Partikel, einschließlich Mikroorganismen, verdauen und sind wirksame Prozessoren von komplexen Antigenen. Jedoch exprimieren sie nur niedrige Mengen an MHC Klasse I und II Antigenen und costimulatorischen Molekülen (ICAM-1, B7-1 und B7-2), und sie sind schlechte Stimulatoren von ungeprimten T Zellen. Nach Kontakt mit Antigen werden einige Langerhans Zellen aktiviert, verlassen die Epidermis und wandern zu T-zellabhängigen Regionen der regionalen Lymphknoten, wo sie sich als reife dendritische Zellen festsetzen. Während des Verlassens der Epidermis und der Wanderung zu den Lymphknoten zeigen Antigen-enthaltende epidermale Langerhans Zellen (jetzt die „Messenger") dramatische Änderungen in der Morphology, dem Oberflächen-Phänotyp und der Funktion. Im Gegensatz zu epidermalen Langerhans Zellen sind lymphoide dendritische Zellen im Wesentlichen nicht phagozytotisch und prozessieren Proteinantigene ineffizient, aber sie exprimieren hohe Mengen an MHC Klasse I und Klasse II Antigenen und verschiedenen costimulatorischen Molekülen, und sie sind die wirksamsten Stimulatoren von naiven T Zellen, die identifiziert wurden."
Wir stellen uns vor, dass die wirksame Antigen-präsentierende Fähigkeit der epidermalen Langerhans Zellen für transkutan transportierte Vakzinen ausgenützt werden kann. Ein transkutanes Immunisierungssystem, welches das Hautimmunsystem verwendet, würde den Transport von Vakzin Antigen nur zu den Langerhans Zellen in dem Stratum corneum (die äußerste Schicht der Haut, bestehend aus verhornten Zellen und Lipiden) über passive Diffusion und anschließende Aktivierung der Langerhans Zellen benötigen, um das Antigen aufzunehmen, zu B Zellfollikeln und/oder T Zell-abhängigen Regionen zu wandern und das Antigen den B und/oder T Zellen zu präsentieren (Stingl et al., 1989). Wenn andere Antigene als bAREs (beispielsweise BSA) von den Langerhans Zellen phagozytiert werden sollten, dann könnten diese Antigene ebenfalls zu den Lymphknoten zur Präsentation gegenüber T Zellen gebracht werden, und anschließend eine Immunantwort, die spezifisch für dieses Antigen (z. B., BSA) ist, induzieren. So ist ein Merkmal der transkutanen Immunisierung die Aktivierung der Langerhans Zelle, vermutlich durch ein bakterielles ADP-ribosylierendes Exotin, ADP-ribosylierende Exotoxin Bindungsuntereinheiten (z. B. Choleratoxin B Untereinheit) oder ein Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins.
Der Mechanismus der transkutanen Immunisierung über Langerhans Zell Aktivierung, Wanderung und Antigen Präsentation wird klar durch die Hochregulation von MHC Klasse II Expression in den epidermalen Langerhans Zellen von epidermalen Schichten, die transkutan mit CT oder CTB immunisiert wurden, gezeigt. Darüber hinaus wird das Ausmaß der Antikörperantwort, die durch transkutane Immunisierung induziert wird und der Isotypwechsel zu vorwiegend IgG für gewöhnlich mit T Zell Hilfe erreicht, die durch die Antigen-präsentierenden Zellen, wie Langerhans Zellen oder dendritische Zellen (Janeway und Travers, 1996) stimuliert wurden, und der Aktivierung von sowohl der Th1 und Th2 Wege, wie durch die Bildung von IgG1 und IgG2a (Paul und Seder, 1994; Seder und Paul, 1994) vorgeschlagen wird. Darüber hinaus wird die T Zell Proliferation gegenüber dem Antigen OVA in Mäusen gezeigt, die mit CT + OVA immunisiert wurden. Alternativ dazu kann eine starke Antikörperantwort durch ein Thymus-unabhängiges Antigen Typ 1 (TI-1) induziert werden, das direkt die B Zelle aktiviert (Janeway und Travers, 1996).
Das Spektrum von besser bekannten Hautimmunantworten wird durch Kontaktdermatitis und Atopie dargestellt. Kontaktdermatitis, eine pathogene Manifestation von LC Aktivierung, wird durch Langerhans Zellen gesteuert, die Antigen phagozytieren, zu Lymphknoten wandern, Antigen präsentieren und T Zellen für die massive zerstörerische zelluläre Antwort sensibilisieren, die an den betroffenen Hautstellen auftritt (Dahl, 1996; Leung, 1997). Atopische Dermatitis kann die Langerhans Zelle in einer ähnlichen Weise verwenden, aber ist durch Th2 Zellen gekennzeichnet und ist im Allgemeinen mit höheren Mengen an IgE Antikörpern assoziiert (Dahl, 1996; Leung, 1997).
Die transkutane Immunisierung mit Choleratoxin und verwandten bAREs andererseits ist eine neue Immunantwort mit einer Abwesenheit von oberflächlichen und mikroskopischen Postimmunisierungshautbefunden (d. h., nicht entzündete Haut), die durch die Abwesenheit von Lymphozyteninfiltration nach 24, 48 und 120 Stunden nach Immunisierung mit Choleratoxin gezeigt wird. Dies zeigt, dass Langerhans Zellen "alle akzessorische Zellaktivität aufweisen, die in nicht entzündeter Epidermis vorliegt, und dass sie im vorliegenden Musterbeispiel essentiell für die Initiation und das Fortschreiten der Immunantworten sind, die gegen epikutan verabreichte Antigene gerichtet ist" (Udey, 1997). Die Einzigartigkeit der transkutanen Immunantwort wird hier auch durch die sowohl hohen Mengen von Antigen-spezifischem IgG Antikörper als auch des Typs des gebildeten Antikörpers (z. B. IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgA) und die Abwesenheit von anti-CT IgE Antikörper, angezeigt.
So haben wir herausgefunden, dass bakteriell abgeleitete Toxine, die auf die Oberfläche der Haut aufgetragen werden, Langerhans Zellen oder andere Antigen-präsentierende Zellen aktivieren und eine potente Immunantwort induzieren, die sich in hohen Mengen von Antigen-spezifischen zirkulierenden IgG Antikörpern manifestiert. Solche Adjuvanzien können in der transkutanen Immunisierung verwendet werden, um die IgG Antikörperantwort gegenüber Proteinen zu verstärken, die ansonsten selbst nicht immunogen sind, wenn sie auf die Haut aufgetragen werden.
Transkutane Ansteuerung von Langerhans Zellen kann auch verwendet werden, um ihre Antigen-präsentierende Funktion zu deaktivieren, wodurch Immunisierung oder Sensibilisierung verhindert wird. Die Techniken, um Langerhans Zellen zu inaktivieren, schließen beispielsweise die Verwendung von Interleukin-10 (Peguet-Navarro et al., 1995), einen monoklonalen Antikörper gegenüber Interleukin-1β (Enk et al., 1993) oder Depletion über Superantigene, wie durch staphylococcales Enterotoxin-A (SEA) induzierte epidermale Langerhans Zelldepletion (Shankar et al., 1996), ein.
Transkutane Immunisierung kann über die Gangliosid GM1 bindende Aktivität von CT, LT oder Untereinheiten wie CTB, induziert werden (Craig und Cuatrecasas, 1975). Gangliosid GM1 ist ein ubiquitäres Zellmembranglycolipid, das in allen Säugetierzellen gefunden wird (Plotkin und Mortimer, 1994). Wenn die pentamere CT B Untereinheit an die Zelloberfläche bindet, wird eine hydrophile Pore gebildet, die es der A Untereinheit erlaubt, die Lipiddoppelschicht zu durchdringen (Ribi et al., 1988).
Wir haben gezeigt, dass transkutane Immunisierung durch CT oder CTB die Gangliosid GM1 Bindungsaktivität benötigen kann. Wenn Mäuse transkutan mit CT, CTA und CTB immunisiert wurden, führte nur CT und CTB zu einer Immunantwort. CTA enthält die ADP-ribosylierende Exotoxinakvitität, aber nur CT und CTB, welche die Bindungsaktivität enthalten, waren in der Lage, eine Immunantwort zu induzieren, was zeigt, dass die B Untereinheit notwendig und ausreichend war, um durch die Haut zu immunisieren. Wir schließen daraus, dass die Langerhans Zelle oder eine andere Antigen-präsentierende Zelle durch CTB Bindung an ihre Zelloberfläche aktiviert werden kann.
ANTIGEN
Erfindungsgemäßes Antigen kann durch rekombinante Mittel exprimiert werden, vorzugsweise als eine Fusion mit einem Affinitäts- oder Epitoptag (Summers und Smith, 1987; Goeddel, 1990; Ausubel et al., 1996); chemische Synthese eines Oligopeptids, entweder frei oder konjugiert an Trägerproteine kann verwendet werden, um erfindungsgemäßes Antigen zu erhalten (Bodanszky, 1993; Wisdom, 1994). Oligopeptide werden als eine Art Polypeptid erachtet.
Oligopeptidlängen von 6 Resten bis 20 Resten sind bevorzugt. Polypeptide können auch als verzweigte Strukturen synthetisiert werden, wie jene, die in den US Pat. Nr. 5,229,490 und 5,390,111 offenbart sind. Antigene Polypeptide schließen beispielsweise synthetische oder rekombinante B Zell- und T Zellepitope, universelle T Zellepitope und gemischte T Zellepitope von einem Organismus oder einer Krankheit und B Zellepitope von einem anderen, ein.
Antigen, das durch rekombinante Mittel oder Peptidsynthese erhalten wurde, ebenso wie erfindungsgemäßes Antigen, das aus natürlichen Quellen oder Extrakten erhalten wurde, können durch Mittel des Antigens' physikalische und chemische Eigenschaften, vorzugsweise durch Fraktionierung oder Chromatographie gereinigt werden (Janson und Ryden, 1989; Deutscher, 1990; Scopes, 1993).
Eine multivalente Antigenformulierung kann verwendet werden, um eine Immunantwort gegenüber mehr als einem Antigen zur selben Zeit, zu induzieren. Es können Konjugate verwendet werden, um eine Immunantwort gegenüber mehreren Antigenen zu induzieren, um die Immunantwort zu boostern, oder beides. Darüber hinaus können Toxine durch die Verwendung von Toxoiden geboostert werden, oder Toxoide können durch die Verwendung von Toxinen geboostert werden. Transkutane Immunisierung kann verwendet werden, um Antworten zu boostern, die anfänglich über andere Immunisierungswege induziert wurden, wie durch Injektion oder durch die oralen oder intranasalen Wege.
Antigen schließt beispielsweise Toxine, Toxoide, Untereinheiten davon, oder Kombinationen davon (z. B., Choleratoxin, Tetanustoxoid), ein.
Antigen kann in Wasser, einem Lösungsmittel, wie Methanol, oder einem Puffer gelöst werden. Geeignete Puffer schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Phosphat gepufferte Salzlösung (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ frei (PBS), normale Kochsalzlösung (150 mM NaCl in Wasser) und Tris Puffer. Antigen, das in neutralem Puffer nicht löslich ist, kann in 10 mM Essigsäure gelöst werden und anschließend auf das gewünschte Volumen mit neutralem Puffer, wie PBS, verdünnt werden. Im Falle von Antigen, das nur bei saurem pH löslich ist, kann Acetat-PBS bei saurem pH als ein Lösungsmittel nach dem Lösen in verdünnter Essigsäure verwendet werden. Glycerol kann ein geeigneter, nicht wässriger Puffer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sein.
Wenn ein Antigen, wie beispielsweise Hepatitis A Virus, nicht per se löslich ist, kann das Antigen in der Formulierung in einer Suspension oder sogar als ein Aggregat vorliegen.
Hydrophobes Antigen kann in einem Detergens gelöst werden, beispielsweise ein Polypeptid, das eine membranspannende Domäne enthält. Darüber hinaus kann für Formulierungen, die Liposomen enthalten, ein Antigen in einer Detergenslösung (z. B., ein Zellmembranextrakt) mit Lipiden gemischt werden, und Liposomen können anschließend durch Entfernen des Detergens durch Verdünnung, Dialyse oder Säulenchromatographie, gebildet werden. Gewisse Antigene, wie beispielsweise jene eines Virus (z. B., Hepatitis A) brauchen nicht per se löslich zu sein, sondern sie können direkt in ein Liposom in der Form eines Virosoms eingebaut werden (Morein und Simons, 1985).
Plotkin und Mortimer (1994) stellen Antigene, die zur Vakzinierung von Tieren oder Menschen verwendet werden können, um eine für bestimmte Pathogene spezifische Immunantwort zu induzieren, ebenso wie Verfahren zur Herstellung von Antigen, Bestimmung einer geeigneten Dosis von Antigen, Testen hinsichtlich Induktion einer Immunantwort und Behandeln von Infektion durch ein Pathogen (z. B., Bakterium, Virus, Pilz oder Parasit), bereit.
Bakterien schließen beispielsweise ein: Anthrax, Campylobacter, Cholera, Diphtherie, enterotoxigenes E. coli, Giardia, Gonococcus, Helicobacter pylori (Lee und Chen, 1994), Hemophilus influenza B, Hemophilus influenza nicht typisierbar, Meningococcus, Pertussis, Pneumococcus, Salmonella, Shigella, Streptococcus B, Gruppe A Streptococcus, Tetanus, Vibrio cholerae, Yersinia, Staphylococcus, Pseudomonas species und Clostridia species.
Viren schließen beispielsweise ein: Adenovirus, Dengue Serotypen 1 bis 4 (Delenda et al., 1994; Fonseca et al., 1994; Smucny et al., 1995), Ebola (Jahrling et al., 1996), Enterovirus, Hepatitis Serotypen A bis E (Blum, 1995; Katkov, 1996; Lieberman und Greenberg, 1996; Mast, 1996; Shafara et al., 1995; Smedila et al., 1994; US Pat. Nr. 5,314,808 und 5,436,126), Herpes simplex Virus 1 oder 2, humanes Immundefizienzvirus (Deprez et al., 1996), Influenza, japanische Pferdeenzephalitis, Masern, Norwalk, Papillomvirus, Parvovirus B19, Polio, Tollwut, Rotavirus, Röteln, Rubeola, Vaccinia, Vacciniakonstrukte, die Gene enthalten, die für andere Antigene wie Malaria Antigene, Varicella und Gelbfieber kodieren.
Parasiten schließen beispielsweise ein: Entamoeba histolytica (Zhang et al., 1995); Plasmodium (Bathurst et al., 1993; Chang et al., 1989, 1992, 1994; Fries et al. 1992a, 1992b; Herrington et al., 1991; Khusmith et al., 1991; Malik et al., 1991; Migliorini et al., 1993; Pessi et al., 1991; Tam, 1988; Vreden et al., 1991; White et al., 1993; Wiesmueller et al., 1991) Leishmania (Frankenburg et al., 1996), Toxoplasmosis, und die Helminths.
Antigene können auch solche umfassen, die in der biologischen Kriegsführung verwendet werden, wie Ricin, für das Schutz über Antikörper erreicht werden kann.
ADJUVANTS
Die Formulierung kann auch ein Adjuvants enthalten, obwohl ein einzelnes Molekül sowohl Adjuvants als auch Antigeneigenschaften enthalten kann (z. B., Choleratoxin) (Elson und Dertzbaugh, 1994). Adjuvanzien sind Substanzen, die verwendet werden, um spezifisch oder unspezifisch eine Antigen-spezifische Immunantwort zu verstärken. Für gewöhnlich werden das Adjuvants und die Formulierung vor der Präsentation des Antigens gemischt, aber alternativ, können sie auch getrennt innerhalb eines kurzen Zeitintervalls präsentiert werden.
Adjuvanzien schließen beispielsweise ein: eine Ölemulsion (z. B., vollständiges oder unvollständiges Freund's Adjuvants), ein Chemokin (z. B., Defensine 1 oder 2, RANTES, MIP1-α, MIP-2, Interleukin-8) oder ein Zytokin (z. B., Interleukin-1β, -2, -6, -10 oder -12; γ-Interferon; Tumornekrosis Faktor-α; oder Granulozyten-Monozyten-Kolonie stimulierenden Faktor) (zusammengefasst in Nohira und Rubin, 1994), ein Muramyldipeptid Derivat (z. B., Murabutid, Threonyl-MDB oder Muramyltripeptid), ein Hitzeschockprotein oder ein Derivat, ein Derivat von Leishmania major LeIF (Skeiky et al., 1995), Choleratoxin oder Choleratoxin B, ein Lipopolysaccharid (LPS) Derivat (z. B., Lipid A oder Monophosphoryl Lipid A), oder Superantigen (Saloga et al., 1996). Siehe auch Richards et al. (1995) für Adjuvanzien, die bei Immunisierung nützlich sind. Adjuvanzien zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Formulierung sind jedoch beschränkt auf ADP-ribosylierende Exotoxine, B Untereinheiten davon, oder ein Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins.
Ein Adjuvants kann gewählt werden, um vorzugsweise Antikörper oder zelluläre Effektoren, spezifische Antikörperisotypen (z. B., IgM, IgD, IgA1, IgA2, sekretorisches IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 und/oder IgG4) oder spezifische T Zelluntergruppen (z. B., CTL, Th1, Th2 und/oder T_DTH) (Glenn et al., 1995) zu induzieren.
Choleratoxin ist ein bakterielles Exotoxin aus der Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine (als bAREs bezeichnet). Die meisten bAREs sind als A : B Dimer organisiert, mit einer Bindungs-B-Untereinheit und einer A Untereinheit, welche die ADP-Ribosyltransferase enthält. Solche Toxine schließen Diphtherietoxin, Pseudomonas Exotoxin A, Choleratoxin (CT), E. coli hitzelabiles Enterotoxin (LT), Pertussistoxin, C. botulinum Toxin C2, C. botulinum Toxin C3, C. limosum Exoenzym, B. cereus Exoenzym, Pseudomonas Exotoxin S, Staphylococcus aureus EDIN und B. sphaericus Toxin, ein.
Choleratoxin ist ein Beispiel für ein bARE, das mit A und B Untereinheiten organisiert ist. Die B Untereinheit ist die Bindungsuntereinheit und besteht aus einem B Untereinheit Pentamer, das nicht kovalent an die A Untereinheit gebunden ist. Das B Untereinheit Pentamer ist in einer symmetrischen Doughnut förmigen Struktur angeordnet, die an GM₁-Gangliosid auf der Zielzelle bindet. Die A Untereinheit dient dazu, die alpha Untereinheit einer Untergruppe der heteroprimären GTP Proteine (G Proteine) einschließlich der Gs Proteine, die zu erhöhten intrazellulären Mengen an cyclischem AMP führen, zu ADP-ribosylieren. Dies führt zur Freisetzung von Ionen und Flüssigkeit aus intestinalen Zellen im Fall von Cholera.
Choleratoxin (CT) und seine B Untereinheit (CTB) besitzen Adjuvantseigenschaften, wenn sie entweder als ein intramuskuläres oder orales Immunogen verwendet werden (Elson und Dertzbaugh, 1994; Trach et al., 1997). Ein anderes Antigen, hitzlabiles Enterotoxin von E. coli (LT), ist 80% homolog auf der Aminosäureebene mit CT und besitzt ähnliche Bindungseigenschaften; es scheint auch an den GM₁-Gangliosidrezeptor im Darm zu binden und besitzt ähnliche ADP-ribosylierende Exotoxinaktivitäten. Ein anderes bARE, Pseudomonas Exotoxin A (ETA) bindet an das α₂-Makroglobulinrezeptor low density Lipoprotein Rezeptor-related Protein (Kounnas et al., 1992). bAREs werden durch Krueger und Barbieri (1995) in einem Übersichtsartikel zusammengefasst.
Die Toxizität von CT über orale, nasale und intramuskuläre Wege beschränkt die Dosis, die als ein Adjuvants verwendet werden kann. In einer vergleichenden Studie von CT, das intramuskulär injiziert wurde, zeigte sich eine intensive Schwellung an der Stelle der Injektion. Im Gegensatz dazu verursachten gleiche oder größere Dosen an CT, die auf die Haut aufgebracht wurden, keine Toxizität.
Die Beispiele unten zeigen, dass Choleratoxin (CT), seine B Untereinheit (CTB), E. coli hitzelabiles Enterotoxin (LT) und Pertussistoxin potente Adjuvanzien für transkutane Immunisierung sind, die große Mengen an IgG Antikörpern, aber nicht an IgE Antikörpern induzieren. Ebenfalls gezeigt ist, dass CTB ohne CT auch große Mengen an IgG Antikörpern induzieren kann. So können beide bAREs und ein Derivat davon wirksam immunisieren, wenn sie epikutan auf die Haut in einer einfachen Lösung verabreicht werden. Darüber hinaus zeigen diese Beispiele, dass CT, CTB und bAREs sowohl als Adjuvants als auch als Antigen wirken können.
Wenn ein Adjuvants wie CT mit BSA gemischt wird, einem Protein, das für gewöhnlich nicht immunogen ist, wenn es auf die Haut aufgetragen wird, werden anti-BSA Antikörper induziert. Eine Immunantwort gegen Diphtherietoxoid wurde unter Verwendung von Pertussistoxin als Adjuvants induziert, aber nicht mit Diphtherietoxoid alleine. So können bAREs als Adjuvanzien für nicht immunogene Proteine in einem transkutanen Immunisierungssystem wirken.
Andere Proteine können ebenfalls sowohl als Adjuvants als auch als Antigen wirken. Beispielsweise können Toxoide wie Diphtherietoxoid, das unter Verwendung von Formalin toxoid gemacht wurde, Pertussistoxoid, das unter Verwendung von Hydrogenperoxid toxoid gemacht wurde oder mutante Toxine, wie Cholera oder hitzelabiles Enterotoxin von E. coli, die unter Verwendung genetischer Techniken, um die Ribosyltransferaseaktivität zu zerstören, toxoid gemacht wurden, weiterhin Adjuvantsqualitäten aufweisen und sowohl als Antigen als auch als Adjuvants wirken.
Schutz gegen die lebensbedrohlichen Infektionen Diphtherie, Pertussis und Tetanus (DPT) kann durch die Induktion großer Mengen an zirkulierenden anti-Toxin Antikörpern erreicht werden. Pertussis kann eine Ausnahme sein, weil einige Forscher das Gefühl haben, dass Antikörper, die gegen andere Abschnitte des eindringenden Organismus gerichtet sind, für den Schutz notwendig sind, obwohl dies kontrovers ist (siehe Schneerson et al., 1996), und die meisten der azellulären Pertussisvakzinen der neuen Generation haben PT als einen Bestandteil der Vakzine (Krueger und Barbieri, 1995). Die Pathologien in der Krankheit, die durch DPT verursacht werden, sind direkt mit den Wirkungen ihrer Toxine verbunden, und anti-Toxin Antikörper spielen sehr wahrscheinlich beim Schutz eine Rolle (Schneerson et al., 1996).
Im Allgemeinen können Toxine chemisch inaktiviert werden, um Toxoide zu bilden, die weniger toxisch sind, aber immunogen bleiben. Wir stellen uns vor, dass das transkutane Immunisierungssystem unter Verwendung Toxoid basierter Immunogene und Adjuvanzien anti-Toxin Mengen erreichen kann, die für Schutz gegen diese Krankheiten ausreichend – sind. Die anti-Toxin Antikörper können durch Immunisierung mit den Toxinen, oder genetisch detoxifizierten Toxoiden selbst oder mit Toxoiden und Adjuvanzien, wie CT, oder durch die Toxoide alleine, induziert werden. Von Toxinen, die genetisch toxoid gemacht wurden, die eine veränderte ADP-ribosylierende Exotoxinaktivität, aber nicht Bindungsaktivität besitzen, wird erwartet, dass sie als nicht toxische Aktivatoren von Antigen-präsentierenden Zellen, die in der transkutanen Immunisierung verwendet werden, nützlich sind. Wir erwarten, dass CT auch als ein Adjuvants wirken kann, um Antigen-spezifische CTLs durch transkutane Immunisierung zu induzieren (siehe Bowen et al., 1994; Porgador et al., 1997 für die Verwendung von CT als ein Adjuvants in der oralen Immunisierung).
Das bARE Adjuvants kann chemisch an andere Antigene konjugiert werden, einschließlich beispielsweise Kohlenhydrate, Polypeptide, Glycolipide und Glycoproteinantigene. Es wird erwartet, dass die chemische Konjugation mit Toxinen, ihren Untereinheiten oder Toxoiden mit diesen Antigenen die Immunantwort gegenüber diesen Antigenen erhöht, wenn sie epikutan verabreicht werden.
Um das Problem der Toxizität der Toxine (z. B., ist von Diphtherietoxin bekannt, dass es so toxisch ist, dass ein Molekül eine Zelle töten kann) und um die Schwierigkeit zu lösen, mit so potenten Toxinen wie Tetanus zu arbeiten, haben einige Forscher einen rekombinanten Ansatz gewählt, um genetisch hergestellte Toxoide herzustellen. Dies basiert auf der Inaktivierung der katalytischen Aktivität der ADP-Ribosyltransferase durch genetische Deletion. Diese Toxine behalten die Bindungsfähigkeiten, aber ihnen fehlt die Toxizität der natürlichen Toxine. Dieser Ansatz wurde beschrieben von Burnette et al. (1994), Rappuoli et al. (1995) und Rappuoli et al. (1996). Solche genetisch toxoid gemachten Exotoxine könnten für das transkutane Immunisierungssystem nützlich sein, weil sie keine Sicherheitsbedenken hervorrufen würden, weil die Toxoide nicht als toxisch erachtet würden. Sie können sowohl als Antigene als auch als Adjuvanzien zur Verstärkung der Immunantwort gegenüber sich selbst oder hinzugefügten Antigenen wirken. Darüber hinaus existieren einige Techniken, um Toxine chemisch toxoid zu machen, die dasselbe Problem angehen können (Scheerson et al., 1996). Alternativ dazu können Fragmente des Toxins oder Toxoids, wie das C Fragment von Tetanus verwendet werden. Diese Techniken könnten für manche Anwendungen, insbesondere pediatrische Anwendungen wichtig sein, in denen verdaute Toxine (z. B., Diphtherietoxin) möglicherweise gegenteilige Reaktionen hervorrufen könnten.
Eine Kombination von verschiedenen Adjuvanzien kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise könnte eine Kombination von bakterieller DNA enthaltend CpG Nukleotidsequenzen und ADP-ribosylierendes Exotoxin verwendet werden, um die T Helferantwort auf Antigene, die transkutan verabreicht wurden, zu richten. So könnten Th1 oder Th2 ähnliche Antworten gegenüber CT-Adjuvantsantigenen durch die Verwendung von nicht methylierter CpG bakterieller DNA oder anderen Proteinen wie LeIF oder Calciumkanalblockierern, umgeschaltet werden.
CpGs befinden sich in einer Klasse von Strukturen, die Muster aufweisen, die es dem Immunsystem erlauben, ihren pathogenen Ursprung zu erkennen, um die angeborene Immunantwort zu stimulieren, was zu adaptierten Immunantworten führt. (Medzhitov und Janeway, Curr. Opin. Immunol., 9: 4–9, 1997). Diese Strukturen werden als Pathogen assoziierte molekulare Muster (PAMPs) bezeichnet und schließen Lipopolysaccharide, Teichonsäuren, unmethylierte CpG Motive, doppelsträngige RNA und Mannine ein.
PAMPs induzieren endogene Signale, welche die Entzündungsantwort vermitteln, wirken als Costimulatoren der T Zell Funktion und kontrollieren die Effektorfunktion. Die Fähigkeit von PAMPs, diese Antworten zu induzieren, spielt eine Rolle in ihrem Potenzial als Adjuvanzien, und ihre Ziele sind APCs, wie Makrophagen und dendritische Zellen. Die Antigen-präsentierenden Zellen der Haut würden genauso durch PAMPs stimuliert, die durch die Haut gelangen. Beispielsweise könnte eine Langerhans Zelle, eine Art einer dendritischen Zelle, durch ein PAMP in Lösung auf der Haut mit einem transkutan schlecht immunogenen Molekül aktiviert werden, und könnte veranlasst werden, zu wandern und dieses schlecht immunogene Molekül den T Zellen in dem Lymphknoten zu präsentieren, wodurch eine Antikörperantwort gegenüber dem schlecht immunogenen Molekül induziert würde. PAMPs könnten in Verbindung mit anderen Hautadjuvanzien, wie Choleratoxin verwendet werden, um verschiedene costimulatorische Moleküle zu induzieren und verschiedene Effektorfunktionen zu kontrollieren, um die Immunantwort, beispielsweise von einer Th2 zu einer Th1 Antwort zu leiten.
Wenn ein immunisierendes Antigen ausreichende Langerhans Zell-aktivierende Fähigkeiten besitzt, dann wird ein getrenntes Adjuvants nicht benötigt, wie im Falle von CT, das sowohl Antigen als auch Adjuvants ist. Es ist vorgesehen, dass Gesamtzellpräparationen, lebende Viren, attenuierte Viren, DNA Plasmide und bakterielle DNA ausreichend sein könnten, um transkutan zu immunisieren.
LIPOSOMEN UND IHRE HERSTELLUNG
Liposomen sind geschlossene Vesikel, die einen inneren wässrigen Raum umgeben. Das innere Kompartiment ist von dem äußeren Medium durch eine Lipiddoppelschicht, die aus einzelnen Lipidmolekülen zusammengesetzt ist, getrennt. In der vorliegenden Erfindung kann Antigen durch unperforierte Haut zu spezialisierten Zellen des Immunsystems transportiert werden, wodurch eine Antigen-spezifische Immunantwort induziert wird. Die transkutane Immunisierung kann durch die Verwendung von Liposomen erreicht werden; jedoch werden die Liposomen, wie in den Beispielen gezeigt, nicht benötigt, um eine Antigen-spezifische Immunantwort auszulösen.
Die Liposomen können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken und Membranlipiden hergestellt werden (in einem Übersichtsartikel zusammengefasst von Gregoriadis, 1993). Die Liposomen können vorgeformt und anschließend mit dem Antigen gemischt werden. Das Antigen kann gelöst oder suspendiert werden, und anschließend zu (a) den vorgeformten Liposomen in einem lyophilisierten Zustand, (b) trockenen Lipiden als einer Quelllösung oder Suspension, oder (c) der Lösung aus Lipiden, die zur Bildung von Liposomen verwendet wurde, hinzugefügt werden. Sie können auch aus Lipiden gebildet werden, die aus dem Stratum corneum extrahiert wurden, einschließlich beispielsweise Ceramid- und Cholesterolderivaten (Wertz, 1992).
Chloroform ist ein bevorzugtes Lösungsmittel für Lipide, aber es kann sich beim Lagern zersetzen. Deshalb wird Chloroform in ein- bis dreimonatigen Intervallen vor seiner Verwendung als das Lösungsmittel zur Bildung von Liposomen redestilliert. Nach der Destillation kann 0,7% Ethanol als ein Konservierungsmittel hinzugefügt werden. Ethanol und Methanol sind andere geeignete Lösungsmittel.
Die Lipidlösung, die zur Bildung von Liposomen verwendet wird, wird in eine Rundbodenflasche gegeben. Birnenförmige Kochflaschen sind bevorzugt, insbesondere jene Flaschen, die von Lurex Scientific (Vineland, NJ, Kat. Nr. JM- 5490) vertrieben werden. Das Volumen der Flasche sollte mehr als zehnfach größer sein als das Volumen der erwarteten wässrigen Lösung der Liposomen, um eine gute Bewegung während der Liposomenbildung zu erlauben.
Unter Verwendung eines drehenden Verdampfers wird Lösungsmittel bei 37°C unter negativem Druck für 10 Minuten mit einem Filteraspirator, der an einen Wasserhahn angeschlossen ist, entfernt. Die Flasche wird unter geringem Vakuum (d. h., weniger als 50 mm Hg) für 1 Stunde in einem Dessikator getrocknet.
Um Antigen in Liposomen einzuschließen, kann eine wässrige Lösung enthaltend Antigen zu den lyophilisierten Liposomenlipiden in einem Volumen hinzugefügt werden, das zu einer Konzentration von ungefähr 200 mM bezüglich des Liposomenlipids führt, und geschüttelt oder gevortext werden, bis all die trockenen Liposomenlipide nass sind. Die Liposomen Antigen Mischung kann anschließend für 18 Stunden bis 72 Stunden bei 4°C inkubiert werden. Die Liposomen Antigen Formulierung kann sofort verwendet oder für mehrere Jahre gelagert werden. Es ist bevorzugt, eine solche Formulierung direkt in dem transkutanen Immunisierungssystem zu verwenden, ohne nicht eingeschlossenes Antigen zu entfernen. Techniken wie die Badsonifizierung können verwendet werden, um die Größe der Liposomen zu verringern, was die transkutane Immunisierung erhöhen kann.
Die Liposomen können wie oben beschrieben gebildet werden, aber ohne das Hinzufügen von Antigen zu der wässrigen Lösung. Antigen kann anschließend zu den vorgeformten Liposomen hinzugefügt werden, und deshalb wäre das Antigen in Lösung und/oder assoziiert mit, aber nicht eingeschlossen in die Liposomen. Dieses Verfahren zum Herstellen einer Liposomen enthaltenden Formulierung ist bevorzugt aufgrund seiner Einfachheit. Techniken wie die Badsonifizierung können verwendet werden, um die Größe und/oder Lamellarität der Liposomen zu verändern, um die Immunisierung zu verstärken.
Obwohl es nicht für die Durchführung der vorliegenden Erfindung benötigt wird, kann die Hydratisierung des Stratum corneum verstärkt werden durch Hinzufügen von Liposomen zu der Formulierung. Liposomen sind als Träger mit Adjuvanzien verwendet worden, um die Immunantwort gegenüber Antigenen, die mit Liposomen gemischt sind, in Liposomen eingeschlossen sind, an Liposomen angeheftet sind, oder mit Liposomen assoziiert sind, zu verstärken.
TRANSKUTANER TRANSPORT VON ANTIGEN
Eine wirksame Immunisierung kann mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden, weil der transkutane Transport von Antigen auf die Langerhans Zelle abzielen kann. Diese Zellen kommen in großer Vielzahl in der Haut vor und sind wirksame Antigenpräsentierende Zellen, die zu T Zell Gedächtnis und potenten Immunantworten führen (Udey, 1997). Aufgrund der Anwesenheit von großen Zahlen von Langerhans Zellen in der Haut, kann die Wirksamkeit des transkutanen Transport mit dem Oberflächenbereich, der gegenüber Antigen und Adjuvants ausgesetzt ist, in Verbindung stehen. Tatsächlich kann der Grund, warum transkutane Immunisierung so wirksam ist, darin liegen, dass sie auf eine größere Zahl dieser wirksamen Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich zu intramuskulärer Immunisierung abzielt. Jedoch kann sogar eine kleine Zahl von Langerhans Zellen oder dendritischen Zellen ausreichend für Immunisierung sein.
Wir stellen uns vor, dass die vorliegende Erfindung zu Zugang zu Immunisierung erhöht, während sie eine potente Immunantwort induziert. Weil transkutane Immunisierung nicht die Penetration durch die Haut und die Komplikationen und Schwierigkeiten davon einschließt, werden die Notwendigkeiten von geschultem Personal, steriler Technik und steriler Ausstattung reduziert. Darüber hinaus werden die Barrieren, an mehreren Stellen zu immunisieren oder mehrere Immunisierungen durchzuführen, verringert. Die Immunisierung durch eine einzelne Verabreichung der Formulierung ist ebenfalls vorgesehen.
Die Immunisierung kann erreicht werden unter Verwendung epikutanen Verabreichens einer einfachen Lösung aus Antigen und Adjuvants, die auf einen Mull unter einem okklusiven Pflaster aufgetragen ist, oder unter Verwendung anderer Pflastertechnologien; Cremes, Eintauchen, Salben und Sprays sind andere mögliche Verabreichungsverfahren. Die Immunisierung könnte durch ungeschultes Personal verabreicht werden, und sie ist zur Selbstverabreichung geeignet. Reihenimmunisierung im großen Umfang könnte aufgrund der einfachen Zugänglichkeit zu der Immunisierung stattfinden. Darüber hinaus würde ein einfaches Immunisierungsverfahren den Zugang von pediatrischen Patienten und der älteren Generation und Bevölkerungen der Dritte Welt Länder zu Immunisierung verbessern.
Ebenso könnten Tiere unter Verwendung der vorliegenden Erfindung immunisiert werden. Die Verabreichung an anatomische Stellen wie das Ohr, Bauchraum, Pfoten, Bindehaut, intertrigenöse Regionen oder die Analregion, oder Eintauchen oder Untertauchen könnte verwendet werden.
Bei früheren Vakzinen wurde ihre Formulierungen durch die Haut mit Nadeln injiziert. Die Injektion von Vakzinen unter Verwendung von Nadeln trägt gewisse Nachteile, einschließlich des Schmerzes, der mit Injektion verbunden ist, der Notwendigkeit von sterilen Nadeln und Spritzen, geschultem medizinischem Personal, um die Vakzine zu verabreichen, Unwohlsein von der Injektion und möglichen Komplikationen, die durch das Durchstechen der Haut mit der Nadel hervorgerufen werden. Die Immunisierung durch die Haut ohne die Verwendung von Nadeln (d. h., transkutane Immunisierung) stellt einen großen Vorteil für den Vakzinetransport durch das Vermeiden der zuvor genannten Nachteile dar.
Das erfindungsgemäße transkutane Transportsystem betrifft ebenfalls nicht die Penetration durch unperforierte Haut durch Schall oder elektrische Energie. Ein solches System, das ein elektrisches Feld verwendet, um einen dielektrischen Zusammenbruch des Stratum corneum zu induzieren, ist in dem US Pat. Nr. 5,464,386 offenbart.
Darüber hinaus kann die transkutane Immunisierung der Immunisierung unter Verwendung von Nadeln überlegen sein, weil durch die Verwendung von mehreren Orten auf mehr Immunzellen abgezielt wird, die auf große Oberflächenbereiche der Haut abzielen. Eine therapeutisch wirksame Menge an Antigen, die ausreicht um eine Immunantwort zu induzieren, kann transkutan entweder an einem einzigen kutanen Ort oder über einem Bereich von intakter Haut, die mehrere ableitende Lymphknotenfelder (z. B., zervikal, axillar, inguinal, epitrochelear, popliteal, jene des Abdomens und des Thorax) transportiert werden. Solche Orte, die nahe an unzähligen verschiedenen lymphatischen Knoten an Orten über den ganzen Körper liegen, werden einen weiter verteilten Stimulus an das Immunsystem bereitstellen, als wenn eine kleine Menge an Antigen an einen einzelnen Ort durch intradermale subkutane oder intramuskuläre Injektion injiziert wird.
Antigen, das durch die Haut hindurchtritt oder in die Haut eintritt, kann auf Antigenpräsentierende Zellen treffen, die das Antigen in einer Weise prozessieren, die eine Immunantwort induziert. Mehrere Immunisierungsstellen können eine größere Zahl von Antigen-präsentierenden Zellen rekrutieren, und die größere Population von Antigenpräsentierenden Zellen, die rekrutiert wurden, würde in einer größeren Induktion der Immunantwort resultieren. Die transkutane Immunisierung kann die Verabreichung in unmittelbarer Nähe zu einer Lymphknoten ableitenden Stelle erlauben und dadurch die Wirksamkeit oder Potenz der Immunisierung verbessern. Es ist vorstellbar, dass die Absorption durch die Haut Antigen zu den phagozytierenden Zellen der Haut transportieren kann, wie beispielsweise dermalen dendritischen Zellen, Makrophagen und anderen Antigen-präsentierenden Zellen der Haut; Antigen kann auch zu phagozytierenden Zellen der Leber, Milz und des Knochenmarks transportiert werden, von denen bekannt ist, dass sie als die Antigen-präsentierenden Zellen durch den Blutstrom oder das lymphatische System dienen. Das Ergebnis wäre eine weit verbreitete Verteilung von Antigen an Antigen-präsentierende Zellen zu einem Ausmaß, das selten, wenn überhaupt, durch herkömmliche Immunisierungspraktiken erreicht wird.
Das transkutane Immunisierungssystem kann direkt auf die Haut aufgebracht und luftgetrocknet werden; in die Haut oder Kopfhaut einmassiert werden; an der Stelle durch einen Verband, Pflaster oder absorbierendes Material gehalten werden; auf andere Weise durch eine Vorrichtung wie ein Strumpf, Pantoffel, Handschuh oder Hemd gehalten werden; oder auf die Haut aufgesprüht, um den Kontakt mit der Haut zu maximieren. Die Formulierung kann in einem absorbierenden Verband oder Mull verabreicht werden. Die Formulierung kann mit einem okklusiven Verband bedeckt werden, wie beispielsweise in einer Emulsion aus Antigenlösung und AQUAPHOR (Petrolatum, Mineralöl, Mineralwachs, Wollwachs, Panthenol, Bisabol und Glycerin von Beiersdorf), Plastikfilm, imprägniertem Polymer, COMFEEL (Coloplast) oder Vaseline; oder einem nicht okklusiven Verband, wie beispielsweies DUODERM (3M) oder OPSITE (Smith & Napheu). Ein okklusiver Verband schließt vollständig den Durchtritt von Wasser aus. Alternativ dazu kann ein teilweise okklusiver Verband, wie TEGADERM aufgebracht werden, um Hydration sicherzustellen, und er kann eine längere Verweildauer des Pflasters erlauben oder er kann die Mazeration der Haut verhindern.
Die Formulierung kann auf einzelne oder mehrere Stellen, auf einzelne oder mehrere Gliedmaßen oder auf große Oberflächenbereiche der Haut durch komplettes Eintauchen aufgebracht werden. Die Formulierung kann direkt an die Haut verabreicht werden.
Genetische Immunisierung wurde in den US Pat. Nr. 5,589,466 und 5,593,972 beschrieben. Die Nukleinsäure(n), die in der Formulierung enthalten ist/sind, können das Antigen kodieren. Die Nukleinsäure kann fähig sein, zu replizieren oder auch nicht; sie kann nicht integrierend und nicht infektiös sein. Die Nukleinsäure kann weiterhin eine regulatorische Region aufweisen (z. B., Promotor, Enhancer, Silencer, Transkriptionsinitiations- und Terminationsstellen, RNA Splice Akzeptor- und -Donorstellen, Polyadenylierungssignal, interne Ribosomenbindestelle, Translationsinitiations- und -terminationsstellen), die operativ mit der Sequenz verbunden ist, die das Antigen oder Adjuvants kodiert. Die Nukleinsäure kann mit einem Agens, das die Transfektion fördert, komplexiert sein, wie kationischem Lipid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Polybren-DMSO oder eine Kombination davon. Die Nukleinsäure kann Regionen aufweisen, die von viralen Genomen abgeleitet sind. Solche Materialien und Techniken sind bei Kriegler (1990) und Murray (1991) beschrieben.
Eine Immunantwort kann humorale (d. h., Antigen-spezifischer Antikörper) und/oder zelluläre (d. h., Antigen-spezifische Lymphozyten wie B Zellen, CD4⁺ T Zellen, CD8⁺ T Zellen, CTL, Th1 Zellen, Th2 Zellen und/oder T_DTH Zellen) Effektorarme aufweisen. Darüber hinaus kann die Immunantwort NK Zellen umfassen, die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) vermitteln.
Die Immunantwort, die durch die erfindungsgemäße Formulierung induziert wird, kann das Auslösen von Antigen-spezifischen Antikörpern und/oder zytotoxischen Lymphozyten (CTL, in einem Übersichtsartikel von Alving und Wassef, 1994, zusammengefasst) einschließen. Der Antikörper kann durch Immunassaytechniken nachgewiesen werden, und der Nachweis von verschiedenen Isotypen (z. B. IgM, IgD, IgA1, IgA2, sekretorisches IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4) kann erwartet werden. Eine Immunantwort kann auch durch einen Neutralisationsassay nachgewiesen werden.
Antikörper sind protektive Proteine, die durch B Lymphozyten gebildet werden. Sie sind hochspezifisch und zielen für gewöhnlich auf ein Epitop eines Antigens. Häufig spielen Antikörper eine Rolle beim Schutz gegenüber Krankheiten, indem sie spezifisch mit Antigenen reagieren, die von den Pathogenen, welche die Krankheit verursachen, abgeleitet sind. Die Immunisierung kann Antikörper, die spezifisch sind für das immunisierende Antigen, wie Choleratoxin, induzieren. Diese Antigen-spezifischen Antikörper werden induziert, wenn Antigen durch die Haut von Liposomen transportiert wird.
CTLs sind besonders protektive Immunzellen, die gebildet werden, um gegenüber Infektion durch ein Pathogen zu schützen. Sie sind ebenfalls hochspezifisch. Die Immunisierung kann CTLs induzieren, die spezifisch für ein Antigen sind, wie ein synthetisches Oligopeptid, basierend auf einem Malariaprotein, in Verbindung mit Selbst-Haupthistokompatibilitätsantigen. CTLs, die durch Immunisierung mit dem transkutanen Transportsystem induziert wurden, können Pathogen infizierte Zellen töten. Die Immunisierung kann auch eine Gedächtnisantwort hervorrufen, wie durch Boosterantworten in Antikörpern und CTLs, Lymphozytenproliferation durch Kultur von Lymphozyten, die mit dem Antigen stimuliert wurden, und Hypersensitivitätsantworten des verzögerten Typs gegenüber intradermalem Hautchallenge des Antigens alleine gezeigt wurde.
Es ist vorgesehen, dass die T Helferantwort, die durch die transkutane Immunisierung induziert wird, durch die Verwendung von Calciumkanalblockierern (z. B., Nifedipin, Verpamil), welche die Kontakthypersensitivitätsreaktion durch Inhibieren des Antigenkatabolismus und nachfolgende Präsentation durch epidermale Langerhans Zellen supprimieren, manipuliert werden kann. Von der transkutanen Verabreichung eines Calciumkanalblockierers wird erwartet, dass er die Oberflächenexpression von costimulatorischen Molekülen (z. B., B7 verwandte Familie) und die Bildung einer nachfolgenden T Helferantwort beeinflusst. Es wird ebenfalls erwartet, dass das Hinzufügen des Calciumkanalblockierers die Hypersensitivitätsantwort des verzögerten Typs inhibieren kann, und verwendet werden könnte, um eine Immunantwort zu selektieren, die vorherrschend eine zelluläre oder eine humorale Immunantwort ist.
In einem viralen Neutralisationsassay werden Verdünnungsreihen von Seren zu Wirtszellen hinzugefügt, die anschließend hinsichtlich Injektion nach Challenge mit infektiösem Virus beobachtet werden. Alternativ dazu können Verdünnungsreihen von Seren mit infektiösen Titern an Virus vor der Inokulation eines Tieres inkubiert werden, und die inokulierten Tiere werden anschließend hinsichtlich Infektionszeichen beobachtet.
Das erfindungsgemäße transkutane Immunisierungssystem kann bewertet werden unter Verwendung von Challengemodellen in entweder Tieren oder Menschen, welche die Fähigkeit zur Immunisierung mit dem Antigen, das Subjekt vor Krankheit zu schützen, bewerten. Ein solcher Schutz würde eine Antigen-spezifische Immunantwort zeigen. Im Falle des Challenge wird erachtet, dass das Erreichen von anti-Diphtherie Antikörpertitern von 5 IU/ml oder größer allgemein den optimalen Schutz anzeigt und dient als ein Surrogatmarker für Schutz (Plotkin und Mortimer, 1994).
Darüber hinaus kann das Plasmodium faciparum Challengemodell verwendet werden, um eine Antigen-spezifische Immunantwort in Menschen zu induzieren. Menschliche Freiwillige können unter Verwendung des transkutanen Immunisierungssystems enthaltend Oligopeptide oder Proteine (Polypeptide), die von dem Malariaparasit abgeleitet sind, immunisiert werden und anschließend gegenüber Malaria experimentell oder in der natürlichen Umgebung exponiert werden. Das Plasmodium yoelii Maus Malaria Challengemodell kann verwendet werden, um Schutz in der Maus gegenüber Malaria zu bewerten (Wang et al., 1995).
Alving et al. (1986) injizierten Liposomen enthaltend Lipid A als ein Adjuvants zur Induktion einer Immunantwort gegenüber Choleratoxin (CT) in Kaninchen und gegenüber einem synthetischen Protein bestehend aus einem Malariaoligopeptid enthaltend vier Tetrapeptide (Asn-Ala-Asn-Pro), die an BSA konjugiert waren. Die Autoren fanden, dass die Immunantwort gegenüber Choleratoxin oder gegenüber dem synthetischen Malariaprotein deutlich erhöht war durch Einschließen des Antigens innerhalb der Liposomen, die Lipid A enthalten, im Vergleich zu gleichen Liposomen, die kein Lipid A enthalten. Viele Antigene, die entweder von dem Circumsporozoit Protein (CSP) oder von Merozoit Oberflächenproteinen von Plasmodium falciparum abgeleitet waren, wurden in Liposomen, die Lipid A enthalten, eingeschlossen. Von allen Malariaantigenen, die in Liposomen, die Lipid A enthalten, eingeschlossen wurden, konnte gezeigt werden, dass sie humorale Effektoren (d. h. Antigen-spezifische Antikörper) induzieren, und von einigen konnte außerdem gezeigt werden, dass sie zellvermittelte Antworten ebenfalls induzieren. Die Bildung einer Immunantwort und Immunschutz in einem Tier, das mit einem Malariaantigen vakziniert wurde, könnte durch Immunfluoreszenz gegen gesamte, fixierte Malariasporozoiten oder das Abtöten von Zielzellen, die mit CSP transfiziert sind, durch CTLs untersucht werden.
Mäuse, die transkutan mit Choleratoxin immunisiert werden, sind gegenüber dem intranasalen Challenge mit einer 20 μg Dosis an Choleratoxin geschützt. Mallet et al. (persönliche Mitteilung) haben herausgefunden, dass C57B1/6 Mäuse eine fatale hämorrhagische Pneumonie als Antwort auf den intranasalen Challenge mit CT entwickeln. Alternativ dazu können die Mäuse mit einer intraperitonealen Dosis an CT gechallenged werden (Dragunsky et al., 1992). Choleratoxin spezifische IgG oder IgA Antikörper können Schutz gegen Choleratoxinchallenge bereitstellen (Pierce, 1978; Pierce und Reynolds, 1974).
Ähnliche schützende Wirkungen könnten in Menschen erwartet werden, die mit LT oder CT immunisiert werden und mit jeweils LT sekretierendem E. coli oder CT sekretierendem Vibrio cholerae gechallenged werden. Darüber hinaus konnte Überkreuzschutz zwischen CT und LT Immunsubjekten und CT und LT vermittelten Krankheiten gezeigt werden.
Wie in den Beispielen unten gezeigt ist, kann mukosale Immunität über den transkutanen Weg erreicht werden. Mukosales IgG und IgA kann in Mäusen, die mit CT transkutan immunisiert wurden, nachgewiesen werden. Dies kann wichtig sein für Schutz in Krankheiten, in denen die Pathologie an mukosalen Stellen, wie in LT oder CT vermittelten Krankheiten, auftritt, wo der Eintritt des pathogenen Organismus an einer mukosalen Stelle geschieht oder wo mukosale Infektion für die Pathogenese wichtig ist.
Es wird erwartet, dass transkutane Immunisierung gegen Krankheiten wie Influenza wirksam sein könnte, entweder durch das Induzieren mukosaler Immunität oder durch systemische Immunität oder durch eine Kombination von Immunität, wie humoral, zellulär oder mukosal.
Die Vakzinen können gegenüber Wirtseffekten, wie der Bindung von Erythrozyten an vaskuläres Endothel in Malaria durch die Induktion von anti-Sequestrin Antikörpern, wirksam sein.
Schützende Antikörper, wie anti-Hepatitis A, B oder Hepatitis E Antikörper können über den transkutanen Weg unter Verwendung von gesamtem inaktiviertem Virus, virusabgeleiteten Untereinheiten oder rekombinanten Produkten induziert werden.
Schutz gegen Tetanus, Diphtherie und andere Toxin vermittelte Krankheiten kann durch transkutan induzierte anti-Toxin Antikörper verliehen werden. Von einem Tetanus "booster" Pflaster könnte man sich vorstellen, dass es Adjuvants, wie CT und Toxoide, wie Tetanus und Diphtherie oder Fragmente, wie das Tetanus C Fragment enthält. Boostern könnte anschließend an die primäre Immunisierung durch Injektion oder transkutane Immunisierung mit denselben oder ähnlichen Antigenen erreicht werden. Für injizierbare Immunisierungen, die Immunität induzieren, aber mögliche Nebenwirkungen beim Boostern besitzen, kann ein transkutaner Boost bevorzugt sein. Orale oder nasale Immunisierung kann denkbar unter Verwendung des transkutanen Weges geboostert werden. Die gleichzeitige Verwendung von injizierbaren und transkutanen Immunisierungen könnte ebenfalls verwendet werden.
Vakzinierung wurde auch für eine Behandlung von Krebs und Autoimmunerkrankungen verwendet. Beispielsweise kann eine Vakzinierung mit einem Tumorantigen (z. B., Prostata spezifisches Antigen) eine Immunantwort in Form von Antikörpern, CTLs und Lymphozytenproliferation induzieren, was es dem Immunsystem des Körpers erlaubt, Tumorzellen zu erkennen und abzutöten. Von zielenden dendritischen Zellen, von denen Langerhans Zellen eine spezifische Untergruppe sind, wurde gezeigt, dass sie eine wichtige Strategie in der Krebsimmuntherapie sind. Tumorantigene, die für Vakzinierung nützlich sind, wurden für Melanome beschrieben (U.S. Patent Nr. 5,102,663, 5,141,742 und 5,262,177), Prostatakarzinom (US Pat. Nr. 5,538,866) und Lymphome (US Pat. Nr. 4,816,249, 5,068,177 und 5,227,159). Die Vakzinierung mit T Zell Rezeptor Oligopeptid kann eine Immunantwort induzieren, die das Fortschreiten von Autoimmunkrankheit aufhält (US Pat. Nr. 5,612,035 und 5,614,192; Antel et al., 1996; Vandenbark et al., 1996). Die US Pat. Nr. 5,552,300 beschreibt auch Antigene, die für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten geeignet sind.
Das Folgende beabsichtigt die vorliegende Erfindung genauer darzustellen; jedoch ist die Durchführung der Erfindung nicht in irgendeiner Weise durch die Beispiele limitiert oder beschränkt.
BEISPIELE
Immunisierungsverfahren
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden mit #40 Rasierer rasiert. Dieses Rasieren konnte ohne irgendwelche Zeichen einer Verletzung an der Haut durchgeführt werden. Das Rasieren wurde von dem mittleren Thorax bis gerade unterhalb des Nackens des Halses durchgeführt. Den Mäusen wurde anschließend erlaubt, sich für 24 Stunden auszuruhen. Zuvor wurden die Mäuse zur Identifizierung ohrmarkiert und vorgeblutet, um eine Probe eines Vorimmunserums zu erhalten. Die Mäuse wurden auch transkutan ohne Rasieren durch Verabreichen von bis zu 50 μl der Immunisierungslösung an jedes Ohr immunisiert.
Die Mäusen wurden anschließend in der folgenden Weise immunisiert. Die Mäuse wurden mit 0,03–0,06 ml einer 20 mg/ml Lösung aus Xylazin und 0,5 ml 100 mg/ml Ketamin betäubt; die Mäuse wurden durch diese Dosis des Betäubungsmittels für ungefähr eine Stunde immobilisiert. Die Mäuse wurden mit der ventralen Seite nach unten auf eine warme Decke gesetzt.
Die Immunisierungslösung wurde anschließend auf die dorsal rasierte Haut einer Maus in der folgenden Weise aufgetragen: eine 1,2 cm × 1,6 cm Schablone aus Polystyren wurde vorsichtig auf den Rücken gelegt, und ein mit Kochsalzlösung benetzter steriler Mull wurde verwendet, um die Haut teilweise zu befeuchten (dies erlaubte sogar das Verabreichen der Immunisierungslösung), die Immunisierungslösung wurde anschließend mit einer Pipette auf den Bereich aufgetragen, der durch die Schablone umrissen ist, wodurch ein 2 cm² Fleck von Immunisierungslösung erhalten wurde. Alternativ dazu wurde ein festes Volumen von Immunisierungslösung gleichmäßig auf den rasierten Bereich oder das Ohr aufgebracht. Es wurde vorsichtig vorgegangen, um die Haut nicht mit der Pipettenspitze zu kratzen oder zu reiben. Die Immunisierungslösung wurde um den Bereich herum ausgebracht, um mit der weichen Seite der Pipettenspitze bedeckt zu sein.
Die Immunisierungslösung (zwischen ungefähr 100 μl bis ungefähr 200 μl) wurde auf dem Rücken der Maus für 60 bis 180 Minuten belassen. Am Ende der 60 Minuten wurde die Maus vorsichtig am Nacken des Halses und dem Schwanz unter einen reichlichen Strom lauwarmen Leitungswassers gehalten und für 10 Sekunden gewaschen. Die Maus wurde anschließend vorsichtig mit einem Stück eines sterilen Mulls trockengetupft, und ein zweites Waschen wurde für 10 Sekunden durchgeführt; die Maus wurde anschließend ein zweites Mal trockengetupft und in den Käfig gelassen.
Die Mäuse schienen keine gegenteiligen Wirkungen von der Betäubung, Immunisierung, Waschverfahren oder Toxizität von den Exotoxinen zu zeigen. Es wurde keine Hautirritation, Schwellung oder Röte nach der Immunisierung beobachtet, und die Mäuse schienen sich gut zu entwickeln. Die Immunisierung unter Verwendung des Ohrs wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Fell vor der Immunisierung nicht entfernt wurde.
Antigen
Die folgenden Antigene wurden für die Immunisierung und den ELISA verwendet, und sie wurden unter Verwendung von sterilem PBS oder normaler Kochsalzlösung gemischt. Choleratoxin oder CT (List Biologicals, Kat #101B, Lot #10149CB), CT B Untereinheit (List Biologicals, Kat #BT01, Lot #CVXG-14E), CT A Untereinheit (List Biologicals, Kat #102A, Lot #CVXA-17B), CT A Untereinheit (Calbiochem, Kat #608562); Pertussistoxin, salzfrei (List Biologicals, Lot #181120a); Tetanustoxoid (List Biologicals, Lots #1913a und 1915a); Pseudomonas Exotoxin A (List Biologicals, LOT #ETA25a); Diphtherietoxoid (List Biologicals, Lot #15151); hitzelabiles Enterotoxin von E. coli (Sigma, Lot #9640625); bovines Serumalbumin oder BSA (Sigma, Kat #3A-4503, Lot #31F-O116); und Hemophilus influenza B Konjugat (Connaught, Lot #6J81401).
ELISA – IgG(H + L)
Antikörper, die spezifisch für CT, LT, ETA, Pertussistoxin, Diphtherietoxoid, Tetanustoxoid, Hemophilus influenza B Konjugat, Influenza, Sequestrin und BSA sind, wurden unter Verwendung eines ELISA in einer Technik ähnlich wie in Glenn et al. (1995) bestimmt. Alle Antigene wurden in steriler Kochsalzlösung in einer Konzentration von 2 μg/ml gelöst. Fünfzig Mikroliter dieser Lösung (0,1 μg) pro Vertiefung wurde auf IMMULON-2 Polystyrenplatten (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit 0,5% Casein/0,05% Tween 20 Blockierpufferlösung für eine Stunde blockiert. Die Seren wurden mit 0,5% Casein/0,05% Tween 20 Verdünnung verdünnt; Verdünnungsreihen wurden senkrecht auf der Platte durchgeführt. Die Inkubation betrug 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Die Platten wurden anschließend in einer PBS-0,05% Tween 20 Waschlösung viermal gewaschen, und Ziege anti-Maus IgG(H + L) Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelter (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Ca, Kat #170-6516) sekundärer Antikörper wurde in Caseinverdünnung zu einer Verdünnung von 1/500 verdünnt und auf den Platten für eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Platten wurden anschließend viermal in der PBS-Tween Waschlösung gewaschen. Einhundert Mikroliter eines 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolon)-schwefelsäuresubstrats (Kirkegaard und Perry) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, und die Platten wurden bei 405 nm nach 20–40 Minuten Entwicklung gelesen. Die Ergebnisse wurden als das geometrische Mittel von individuellen Seren und Standardabweichung des Mittels von ELISA Einheiten (die Serumverdünnung, an der die Absorption gleich 1,0 ist) oder als individuelle Antikörperantworten in ELISA Einheiten, angegeben.
ELISA – IgG(γ), IgM(μ) und IgA(α)
IgG(γ), IgM(μ) und IgA(α) anti-CT Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA mit einer Technik ähnlich der von Glenn et al. (1995) bestimmt. CT wurde in steriler Kochsalzlösung in einer Konzentration von 2 μg/ml verdünnt. Fünfzig Mikroliter dieser Lösung (0,1 μg) pro Vertiefung wurden auf IMMULON-2 Polystyrenplatten (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit einer 0,5% Casein-Tween 20 Blockierungspufferlösung für eine Stunde blockiert. Die Seren wurden verdünnt und Caseinverdünnung und Verdünnungsreihen wurden auf der Platte durchgeführt. Diese wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platten wurden anschließend in einer PBS-Tween Waschlösung viermal gewaschen, und Ziege anti-Maus IgG(γ) HRP-gekoppelter (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, Kat #172-1038), Ziege anti-Maus IgM(μ) HRP-gekoppelter (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, Kat #172-1030) oder Ziege anti-Maus IgA HRP-gekoppelter (Sigma, St. Louis, MO, Kat #1158985) sekundärer Antikörper wurde in Caseinverdünnung in einer Verdünnung von 1/1000 verdünnt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf den Platten belassen. Die Platten wurden anschließend viermal in einer PBS-Tween Waschlösung gewaschen. Einhundert Mikroliter eines 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolon)-schwefelsäuresubstrates von (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) wurden zu den Vertiefungen hinzugefügt, und die Platten wurden bei 405 nm gelesen. Die Ergebnisse sind als das geometrische Mittel von individuellen Seren und Standardabweichung des Mittels von ELISA Einheiten (die Serumverdünnung, bei der die Absorption gleich 1,0 ist) angegeben.
ELISA – IgG Subklasse
Antigen-spezifischer IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3) Subklassen Antikörper gegen CT, LT, ETA und BSA wurde wie bei Glenn et al. (1995) beschrieben, durchgeführt. Der Festphasen ELISA wurde in IMMULON-2 Polystyrenplatten (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) durchgeführt. Die Vertiefungen wurden mit den jeweiligen Antigenen in Kochsalzlösung über Nacht (0,1 μg/50 μl) inkubiert und mit 0,5% Casein-Tween 20 blockiert. Einzelne Mausseren, die in 0,5% Casein verdünnt waren, wurden in Reihe verdünnt und bei Raumtemperatur für vier Stunden inkubiert. Sekundäre Antikörper bestanden aus Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziege anti-Maus Isotyp spezifischem Antikörper (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, The Binding Site, San Diego, CA). Es wurde eine Standardkurve für jede Subklasse unter Verwendung von Mausmyelom IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 (The Binding Site, San Diego, CA) bestimmt. Die Standardvertiefungen wurden mit Ziege anti-Maus IgG(H + L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, Kat #172-1054) beschichtet, um die Myelom IgG Subklassestandards zu fangen, die in einer Verdünnungsreihe hinzugefügt wurden. Die Myelom IgG Subklasse wurde ebenfalls unter Verwendung des Peroxidase konjugierten Ziege anti-Maus Subklassen spezifischen Antikörpers detektiert. Sowohl die Testseren als auch die Myelomstandards wurden unter Verwendung von 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolon)-schwefelsäure (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) als Substrat detektiert. Die Absorptionen wurden bei 405 nm gelesen. Die einzelnen Antigen-spezifischen Subklassen wurden quantifiziert unter Verwendung der Werte aus der linearen Titrationskurve, die gegenüber der Myelom Standardkurve berechnet wurde, und als μg/ml angegeben.
ELISA – IgE
Eine Antigen-spezifische IgE Antikörperquantifizierung wurde unter Verwendung eines Protokolls von Pharmingen Technical Protocols, Seite 541 des Forschungsproduktekatalogs, 1996–1997 durchgeführt (Pharmingen, San Diego, CA). Fünfzig Mikroliter 2 μg/ml gereinigter anti-Maus IgE Fänger mAb (Pharmingen, Kat #02111D) in 0,1 M NaHCO₃(pH 8,2) wurden zu IMMUNO Platten (Nunc, Kat #12-565-136) hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, dreimal mit PBS-Tween 20 gewaschen, mit 3% BSA in PBS für zwei Stunden blockiert und dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Die Seren wurden in 1% BSA in PBS verdünnt, in Verdünnungen von 1/100 hinzugefügt und in Reihen senkrecht herunter verdünnt (z. B., 1/100, 1/200 usw.). Gereinigte Maus IgE Standards (Pharmingen, Kat #0312D) wurden mit einer Anfangsverdünnung von 0,25 μg/ml hinzugefügt und in Reihen senkrecht verdünnt. Die Platten wurden für zwei Stunden inkubiert und fünfmal mit PBS-Tween gewaschen.
Biotinylierter anti-Maus IgE mAB (Pharmingen, Kat #02122D) wurde auf 2 μg/ml in 1% BSA in PBS verdünnt, für 45 Minuten inkubiert und fünfmal mit PBS-Tween gewaschen. Avidinperoxidase (Sigma A3151, 1 : 400 einer 1 mg/ml Lösung) wurde für 30 min hinzugefügt, und die Platten wurden sechsmal mit PBS-Tween gewaschen. Sowohl die Testseren als auch die IgE Standards wurden unter Verwendung von 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolon)-schwefelsäure (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) als Substrat bestimmt. Die Absorptionen wurden bei 405 nm gelesen. Einzelne Antigen-spezifische Subklassen wurden quantifiziert unter Verwendung der Werte von der linearen Titrationskurve, die gegenüber der IgE Standardkurve berechnet wurde, und als μg/ml angegeben.
Liposomenherstellung
Wo Liposomen in die Formulierung für transkutane Immunisierung eingeschlossen wurden, wurden multilamellare Liposomen, die aus Dimyristoylphosphatidylcholin, Dimyristolphosphatidylglycerol, und Cholesterol zusammengesetzt sind, gemäß Alving et al. (1993) hergestellt. Dimyristolphosphatidylcholin, Dimyristolphosphatidylglycerol und Cholesterol wurden von Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL) bezogen. Stocklösungen der Lipide in Chloroform wurden aus dem –20°C Gefrierschrank entnommen, wo sie aufbewahrt wurden.
Die Lipide wurden in einem molaren Verhältnis von 0,9 : 0,1 : 0,75 Dimyristolphosphatidylcholin, Dimyristolphosphatidylglycerol und Cholesterol in einer birnenförmigen Flasche gemischt. Unter Verwendung eines drehenden Verdampfers wurde das Lösungsmittel bei 37°C unter negativem Druck für 10 Minuten entfernt. Die Flasche wurde weiter unter niedrigem Vakuum für zwei Stunden in einem Dessikator getrocknet, um Restlösungsmittel zu entfernen. Die Liposomen wurden bei 37 mM Phospholipid unter Verwendung von sterilem Wasser gequollen, lyophilisiert und bei –20°C gelagert. Diese Liposomen wurden in ihrem lyophilisierten Zustand mit normaler Kochsalzlösung (pH 7,0) gemischt, um eine bestimmte Phospholipidkonzentration in der Kochsalzlösung zu erreichen. Alternativ dazu wurden die getrockneten Lipide gequollen, um Liposomen mit normaler Kochsalzlösung (pH 7,0) herzustellen und wurden nicht lyophilisiert.
Beispiel 1
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung immunisiert, die wie folgt hergestellt worden war: Liposomen, die wie oben unter "Liposomenherstellung" beschrieben, hergestellt wurden, wurden mit Kochsalzlösung gemischt, um Liposomen zu bilden. Die vorgeformten Liposomen wurden anschließend in entweder Kochsalzlösung (Gruppe der Liposomen alleine) verdünnt oder mit CT in Kochsalzlösung, um eine Immunisierungslösung enthaltend Liposomen bei 10–150 mM Phospholipid mit 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungslösung zu erhalten. CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg CT pro 100 μg Lösung für die Gruppe herzustellen, die CT alleine erhielt. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Mäuse wurden transkutan nach 0 und 3 Wochen immunisiert. Die Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, 3 Wochen nach der Boosterimmunisierung bestimmt und mit den Präimmunseren verglichen. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, war die Menge an anti-CT Antikörper, die durch CT ohne Liposomen induziert wurde, nicht anders als die Menge an anti-CT Antikörpern, die unter Verwendung von Liposomen gebildet wurden, mit Ausnahme der Mäuse, in denen 150 mM Liposomen verwendet wurden. CT in Kochsalzlösung alleine war in der Lage, Mäuse gegen CT zu immunisieren, um hohe Antikörpertiter zu bilden.
Tabelle 1. anti-CT Antikörper
Beispiel 2
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 3 Wochen wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: BSA wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 200 μg BSA pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die BSA alleine erhielt, herzustellen; BSA und CT wurden in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 200 μg BSA und 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die BSA und CT erhielt, herzustellen. Wo Liposomen verwendet wurden, wurden die Liposomen, wie oben unter "Liposomenherstellung" beschrieben, hergestellt und zuerst mit Kochsalzlösung gemischt, um die Liposomen zu bilden. Sie wurden anschließend in BSA oder BSA und CT in Kochsalzlösung verdünnt, um eine Immunisierungslösung enthaltend Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 200 μg BSA pro 100 μl Immunisierungslösung oder 200 μg BSA + 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungslösung zu erhalten. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, mit Seren 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. BSA alleine, mit oder ohne Liposomen, war nicht in der Lage eine Antikörperantwort auszulösen. Jedoch stimulierte das Hinzufügen von CT eine Immunantwort gegen BSA. CT wirkte als ein Adjuvants für die Immunantwort gegenüber BSA, und anti-BSA Antikörper mit hohen Titern wurden gebildet.
Tabelle 2. anti-BSA Antikörper
Beispiel 3
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: LT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg LT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die LT alleine erhielt, herzustellen. Wo Liposomen verwendet wurden, wurden die Liposomen, wie oben unter "Liposomenherstellung" beschrieben, hergestellt und zuerst mit Kochsalzlösung gemischt, um die Liposomen zu bilden. Die vorgeformten Liposomen wurden anschließend in LT in Kochsalzlösung verdünnt, um eine Immunisierungslösung enthaltend Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 100 μg LT pro 100 μl Immunisierungslösung zu erhalten. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die anti-LT Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, drei Wochen nach der zweiten Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. LT war deutlich immunogen sowohl mit als auch ohne Liposomen, und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen nachgewiesen werden. LT und CT sind Mitglieder der Familie der bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxine (bAREs). Sie sind als A : B Proenzyme organisiert, mit der ADP-Ribosyltransferaseaktivität, die in der A Untereinheit enthalten ist und der Zielzellbindung, die eine Funktion der B Untereinheit ist. LT ist 80% homolog mit CT auf der Aminosäureebene und besitzt eine ähnliche, nicht kovalente Bindungsuntereinheitenorganisation, Stöchiometrie (A : B5), dasselbe Bindungsziel, Gangliosid GM1 und ist ähnlich in der Größe (MW ~ 80.000). Die Ähnlichkeiten von LT und CT scheinen ihre Immunogenität über den transkutanen Weg zu beeinflussen, wie durch das ähnliche Ausmaß der Antikörperantwort gegenüber sowohl CT als auch LT reflektiert wird (Tabellen 1 und 3).
Tabelle 3: anti-LT Antikörper
Beispiel 4
6 bis 8 Wochen alte C57B1/6 Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden einmal unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: LT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg LT pro 100 μl Kochsalzlösung herzustellen. Die Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die anti-LT Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG (H + L)" beschrieben, 3 Wochen nach der einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. LT war eindeutig immunogen mit einer einzelnen Immunisierung, und Antikörper wurden nach drei Wochen gebildet. Eine schnelle Verstärkung der Antikörpertiter und Antworten auf eine einzelne Immunisierung wäre ein nützlicher Aspekt des transkutanen Immunisierungsverfahrens. Es ist vorstellbar, dass eine schnelle einzelne Immunisierung nützlich wäre in Epidemien, für Reisende und wo der Zugang zu medizinischer Versorgung schlecht ist.
Tabelle 4. anti-LT Antikörper
Beispiel 5
8 bis 12 Wochen alte C57B1/6 Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden einmal immunisiert unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde: CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung herzustellen. Die Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die anti-CT Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, 3 Wochen nach der einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. CT war hoch immunogen mit einer einzelnen Immunisierung. Eine schnelle Verstärkung der Antikörpertiter und Antworten auf eine einzelne Immunisierung kann ein nützlicher Aspekt für das transkutane Immunisierungsverfahren sein. Es ist vorstellbar, dass eine schnelle einzelne Immunisierung nützlich wäre in Epidemien, für Reisende und wo der Zugang zu medizinischer Versorgung schlecht ist.
Tabelle 5. anti-CT Antikörper
Beispiel 6
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen von fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: ETA wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg ETA pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die ETA alleine erhielt, herzustellen. Wo Liposomen verwendet wurden, wurden die Liposomen hergestellt, wie oben unter "Liposomenherstellung" beschrieben, und zuerst mit Kochsalzlösung gemischt, um die Liposomen zu bilden. Die vorgeformten Liposomen wurden anschließend mit ETA in Kochsalzlösung verdünnt, um eine Immunisierungslösung enthaltend Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 100 μg ETA pro 100 μl Immunisierungslösung zu erhalten. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, an Seren drei Wochen nach der zweiten Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. ETA war eindeutig immunogen sowohl mit als auch ohne Liposomen, und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden. ETA unterscheidet sich von CT und LT darin, dass ETA ein einzelnes 613 Aminosäurenpeptid mit A und B Domänen auf demselben Peptid ist und an einen ganz verschiedenen Rezeptor, das α2-Makroglobulinrezptor low density Lipoproteinrezeptor-related Protein (Kounnas, et al. 1992) bindet. Trotz der Unähnlichkeiten zwischen ETA und CT in der Größe, Struktur und des Bindungsziels, induzierte ETA auch eine transkutane Antikörperantwort.
Tabelle 6. anti-ETA Antikörper
Beispiel 7
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungslösung herzustellen, LT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um 100 μg LT pro 100 μl Immunisierungslösung herzustellen, ETA wurde in Kochsalzlösung gemischt, um 100 μg ETA pro 100 μl Immunisierungslösung herzustellen, und CT und BSA wurden in Kochsalzlösung gemischt, um 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungslösung und 200 μg BSA pro 100 μl Immunisierungslösung herzustellen. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Mäuse wurden transkutan nach 0 und 3 Wochen immunisiert, und die Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG Subklasse" beschrieben, 3 Wochen nach der Boosterimmunisierung bestimmt und mit den Präimmunseren verglichen. Die IgG Subklassenantwort gegenüber CT, BSA und LT besaß ähnlichen Mengen an IgG1 und IgG2a, was die Aktivierung von T Helfern von sowohl Th1 und Th2 Lymphozyten wiederspiegelt (Seder und Paul, 1994), wohingegen die IgG Subklassenantwort gegen ETA fast ausschließlich aus IgG1 und IgG3 bestand, was mit einer Th2-ähnlichen Antwort übereinstimmt (Tabelle 7). So scheint es, dass alle IgG Subklassen unter Verwendung von transkutaner Immunisierung gebildet werden können.
Tabelle 7. IgG Subklassen von induzierten Antikörpern
Beispiel 8
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: LT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg LT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die LT erhielt, herzustellen, CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die CT alleine erhielt, herzustellen, ETA wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg ETA pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die ETA alleine erhielt, herzustellen, und BSA und CT wurden in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg BSA und 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die BSA und CT erhielt, herzustellen.
Die Mäuse wurden transkutan nach 0 und 3 Wochen immunisiert, und die Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgE" beschrieben, 1 Woche nach der Boosterimmunisierung bestimmt und mit den Präimmunseren verglichen. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wurden keine IgE Antikörper gefunden, obwohl die Sensitivität des Nachweises 0,003 μg/ml betrug. IgG Antikörper wurden in denselben Mäusen unter Verwendung von "ELISA IgG(H + L)" in Seren 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung bestimmt. Die IgG Antikörperantwort gegen LT, ETA, CT und BSA sind gezeigt, um anzuzeigen, dass die Tiere erfolgreich immunisiert wurden und mit hohen Titern von Antikörpern auf die jeweiligen Antigene antworteten.
Tabelle 8. IgE Antikörper gegen LT, ETA, CT und BSA
Beispiel 9
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 mg CT pro 100 ml Immunisierungslösung herzustellen. Die Immunisierungslösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Mäuse wurden transkutan nach 0 und 3 Wochen immunisiert, und die Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L) und ELISA IgG(γ)" beschrieben, bestimmt. Die Bestimmungen wurden nach 1 und 4 Wochen nach der Anfangsimmunisierung durchgeführt und mit den Präimmunseren verglichen. Wie in Tabelle 9 gezeigt, wurden hohe Mengen an anti-CT IgG(γ) Antikörpern durch CT in Kochsalzlösung induziert. Geringe Mengen an IgM konnten unter Verwendung von IgM(μ) spezifischem Sekundärantikörper nachgewiesen werden. Nach 4 Wochen war die Antikörperantwort primär IgG.
Die Daten sind in ELISA Einheiten angegeben.
Tabelle 9. IgG(γ) und IgM(μ)
Beispiel 10
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden einmal unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung herzustellen. Die Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext. Die Mäuse wurden transkutan nach 0 und 3 Wochen immunisiert. Die Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, 5 Wochen nach der Boosterimmunisierung bestimmt und mit den Präimmunseren verglichen. Wie in Tabelle 10 gezeigt, wurden Serum anti-CT IgA Antikörper nachgewiesen.
Tabelle 10. anti-CT IgA Antikörper
Beispiel 11
6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: CT wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungslösung zu erhalten. Die Immunisierungslösung wurde 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Mäuse wurden mit 100 μl Immunisierungslösung transkutan nach 0 und 3 Wochen immunisiert, und die Antikörpermengen wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" und "ELISA IgG(γ)" beschrieben, bestimmt. Die Antikörperbestimmungen wurden 8 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung durchgeführt und mit den Präimmunseren verglichen. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurden hohe Mengen an Serum anti-CT Antikörpern durch CT in Kochsalzlösung induziert. Lungenspülung IgG konnte durch einen ELISA unter Verwendung von IgG(H + L) oder IgG(γ) spezifischem Antikörper nachgewiesen werden. Der Antikörper, der auf der Lungenschleimhautoberfläche gefunden wurde, wird durch das Spülungsverfahren, das verwendet wird, um Schleimhautantikörper zu sammeln, verdünnt, so sind die exakten Mengen an nachgewiesenem Antikörper nicht so signifikant wie die bloße Anwesenheit von nachweisbarem Antikörper.
Lungenspülungen wurden nach dem Opfern der Maus erhalten. Die Luftröhre und die Lungen wurden durch vorsichtige Dissektion exponiert, und die Luftröhre wurde oberhalb der Gabelung durchgeschnitten. Ein 22 Gauge Polypropylenröhrchen wurde eingesetzt und mit der Luftröhre verbunden, um einen festen Verschluss an den Rändern zu bilden. Ein halber Milliliter PBS wurde unter Verwendung einer 1 ml Spritze, die an das Gefäß angeschlossen wurde, eingeführt, und die Lungen wurden vorsichtig mit der Flüssigkeit aufgefüllt. Die Flüssigkeit wurde entnommen und es wurde wieder aufgefüllt für insgesamt 3 Spülrunden. Die Lungenspülung wurde anschließend bei –20°C eingefroren.
Tabelle 11 zeigt die IgG(H + L) und IgG(γ) Antikörperantwort gegen Choleratoxin in dem Serum und Lungenspülungen nach 8 Wochen. Die Daten sind in ELISA Einheiten ausgedrückt. Antikörper sind eindeutig für alle Mäuse in den Lungenspülungen nachweisbar. Die Anwesenheit von Antikörpern in der Schleimhaut kann wichtig für Schutz gegen mukosal aktive Krankheiten sein.
Tabelle 11. Mukosale Antikörper gegen CT
Beispiel 12
BALB/c Mäuse wurden transkutan nach 0 und 3 Wochen, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu vier Mäusen immunisiert. Die Liposomen wurden, wie oben unter "Liposomenherstellung" beschrieben, hergestellt und zuerst mit Kochsalzlösung gemischt, um die Liposomen zu bilden. Die vorgeformten Liposomen wurden anschließend mit entweder CT, CTA oder CTB in Kochsalzlösung verdünnt, um eine Immunierungslösung enthaltend bei 50 mM Phosphoplipid mit 50 μg Antigen (CT, CTA oder CTB) pro 100 μl Immunisierungslösung zu erhalten. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, eine Woche nach der Boosterimmunisierung bestimmt und mit den Präimmunseren verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. CT und CTB sind eindeutig immunogen, wohingegen CTA dies nicht war. So ist die B Untereinheit von CT notwendig und ausreichend, um eine starke Antikörperantwort zu induzieren.
Tabelle 12. Antikörper gegen CT, CTA und CTB
Beispiel 13
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 3 Wochen mit 100 μg Diphtherietoxoid und 10 μg Pertussistoxin pro 100 μl Kochsalzlösung immunisiert. Die Lösungen wurden 10 Sekunden vor der Immunisierung gevortext.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, quantifiziert. Anti-Diphtherietoxoid Antikörper wurden nur in Tieren nachgewiesen, die mit sowohl Pertussistoxin als auch Diphtherietoxoid immunisiert wurden. Die am besten ansprechende wies anti-Diphtherietoxoid Antikörper ELISA Einheiten von 1.038 auf. So wirkt eine kleine Menge an Pertussistoxin als ein Adjuvants für Diphtherietoxoid Antigen. Das Toxoid alleine induzierte keine Immunantwort, was nahe legt, dass das Verfahren des Toxoidmachens den Abschnitt des Moleküls beeinflusst hatte, der für die Adjuvantswirkungen, die in dem ADP-ribosylierenden Exotoxin gefunden werden, verantwortlich ist.
Tabelle 13. Antikörper gegen Diphtherie
Beispiel 14
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden einmal nach 0, 8 und 20 Wochen mit 50 μg Pertussistoxin (List, Katalog, # 181, Lot #181-20a) pro 100 μl Kochsalzlösung immunisiert.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, quantifiziert. Anti-Pertussistoxin Antikörper wurden eine Woche nach dem letzten Boost in Tieren, die mit Pertussis immunisiert wurden, nachgewiesen. Alle fünf Tiere wiesen erhöhte Mengen an Anti-Pertussistoxin Antikörper nach der letzten Immunisierung auf. So wirkt Pertussistoxin als ein Adjuvants für sich selbst und induziert PT spezifische IgG Antikörper. Der Adjuvantseffekt von PT kann nützlich sein in Kombinationsvakzinen wie Diphtherie/Pertussis/Tetanus/Hib zum Verstärken der Antikörperantwort gegen gleichzeitig verabreichte Antigene, ebenso wie gegen PT selbst.
Tabelle 14. Antikörperantwort gegen Pertussistoxin
Beispiel 15
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden einmal nach 0 Wochen mit 50 μg Tetanustoxoid und 100 μg Choleratoxin pro 100 μl Kochsalzlösung immunisiert.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, quantifiziert. Anti-Tetanustoxoid Antikörper wurden nach 8 Wochen in Tier 5173 bei 443 ELISA Einheiten nachgewiesen.
Beispiel 16
Die Möglichkeit, dass orale Immunisierung durch das Putzen nach epikutaner Verabreichung und dem anschließenden Waschen der Verabreichungsstelle auftritt, wurde unter Verwendung von ¹²⁵I markiertem CT, um das Schicksal des Antigens/Adjuvants zu verfolgen, untersucht. Die Mäuse wurden betäubt und transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, mit 100 μg ¹²⁵I-markiertem CT (150.000 cpm/μg CT) immunisiert. Die Kontrollmäuse blieben für 6 Stunden betäubt, um das Putzen auszuschließen, und die Testmäuse wurden für eine Stunde betäubt, und anschließend wurde nach dem Waschen das Putzen zugelassen. Die Mäuse wurden nach 6 Stunden geopfert, und die Organe wurden gewogen und hinsichtlich ¹²⁵I auf einem Packard Gamma Zähler gezählt. Insgesamt wurden 2–3 μg CT auf der rasierten Haut an der Immunisierungsstelle (14.600 cpm/μg Gewebe) nachgewiesen, während ein Maximum von 0,5 μg CT in dem Magen (661 cpm/μg Gewebe) und dem Darm (9 cpm/μg Gewebe) nachgewiesen wurde.
Die orale Immunisierung (n = 5) mit 10 μg CT in Kochsalzlösung nach 0 und 3 Wochen (ohne NaHCO₃) induzierte eine über 6 Wochen durchschnittliche IgG Antikörperantwort von < 1.000 ELISA Einheiten, wohingegen die transkutane Immunisierung mit 100 μg CT, von der oben gezeigt wurde, dass sie zu weniger als 5 μg CT, das nach dem Waschen auf der Haut zurückgehalten wird, führt, zu einer anti-CT Antwort von 42.178 ELISA Einheiten nach 6 Wochen führt. Die Induktion einer Immunantwort gegen oral gefüttertes CT benötigt das Hinzufügen von NaHCO₃ zu der Immunisierungslösung (Piece, 1978; Lycke und Holmgren, 1986). So trägt die orale Immunisierung nicht signifikant zu den Antikörpern bei, die nachgewiesen werden, wenn CT epikutan auf die Haut aufgetragen wird.
Beispiel 17
Der in vivo Nachweis von Langerhans Zellaktivierung wurde erhalten unter Verwendung von Choleratoxin (CT) in Kochsalzlösung, das epikutan auf die Haut aufgetragen wurde, insbesondere den Ohren der Maus, wo große Populationen von Langerhans Zellen einfach visualisiert werden können (Enk et al., 1993; Bacci et al., 1997), und Färben des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Molekülen, die in aktivierten Langerhans Zellen hochreguliert sind (Shimada et al., 1987).
BALB/c Mausohren wurden auf der dorsalen Seite mit entweder 100 μg CT in Kochsalzlösung, 100 μg CTB in Kochsalzlösung, Kochsalzlösung alleine oder einer intradermalen Injektion der Positivkontrollen 100 pg LPS oder 10 μg TNFα für eine Stunde beschichtet, während die Maus betäubt war. Die Ohren wurden anschließend sorgfältig gewaschen und, nach 24 Stunden, wurden die Ohren entfernt, und epidermale Schichten wurden geerntet und hinsichtlich MHC Klasse II Expression, wie bei Caughman et al., (1986) beschrieben, gefärbt. Epidermale Schichten wurden mit MKD6 (anti-I-A^d) oder Negativkontrolle Y3P (anti-I-A^k) gefärbt, und Ziege anti-Maus FITC F(ab)₂ wurde als ein Reagens im zweiten Schritt verwendet. Bei Mäusen, die transkutan auf dem Ohr (wie oben ohne Rasieren beschrieben) immunisiert wurden, wurde zuvor gezeigt, dass sie anti-CT Antikörper von 7.000 ELISA Einheiten drei Wochen nach einer einzelnen Immunisierung aufwiesen.
Es wurden eine verstärkte Expression von MHC Klasse II Molekülen, wie durch die Farbintensität nachgewiesen, die reduzierte Zahl von Langerhans Zellen (insbesondere mit Choleratoxin) und Veränderungen in der Langerhans Zellmorphologie in den epidermalen Schichten der Mäuse gefunden, die mit CT und CTB im Vergleich zu den Kontrollen (1) immunisiert worden waren, was nahe legt, dass die Langerhans Zellen durch das epikutan verabreichte Choleratoxin aktiviert wurden (Aiba und Katz, 1990; Enk et al., 1993).
Beispiel 18
Die Langerhans Zellen stellen das epidermale Kontingent einer Familie von potenten accessorischen Zellen dar, die als "dendritische Zellen" bezeichnet werden. Von Langerhans Zellen (und vielleicht verwandten Zellen in der Dermis) wird angenommen, dass sie für Immunantworten benötigt werden, die gegen fremde Antigene, die in der Haut angetroffen werden, gerichtet sind. Der "Lebenszyklus" einer Langerhans Zelle ist durch wenigstens zwei verschiedene Stufen gekennzeichnet. Langerhans Zellen in der Epidermis (die "Sentinellen") können Partikel verdauen und Antigene wirksam prozessieren, aber sie sind schwache Stimulatoren von ungeprimten T Zellen. Im Gegensatz dazu sind Langerhans Zellen, die induziert wurden, zu den Lymphknoten nach Kontakt mit Antigen in der Epidermis (die "Messenger") zu wandern, sind schlecht phagozytotisch und besitzen beschränkte Antigen-prozessierende Fähigkeiten, aber sie sind potente Stimulatoren von naiven T Zellen. Wenn die Langerhans Zellen sowohl ihre "sentinelle" als auch ihre "messenger" Rolle erfüllen sollen, müssen sie in der Lage sein, in der Epidermis zu persistieren und auch in der Lage sein, die Epidermis in einer kontrollierten Weise nach der Exposition gegenüber Antigen zu verlassen. So stellt die Regulation der Langerhans Zell-Keratinozytenadhäsion einen Schlüsselkontrollpunkt im Langerhans Zelltrafficking und der Funktion dar.
Langerhans Zellen exprimieren E-Cadherin (Blauvelt et al., 1995), ein homophiles Adhäsionsmolekül, das vorherrschend in Epithelien auftritt. Keratinozyten exprimieren ebenfalls dieses Adhäsionsmolekül, und E-Cadherin vermittelt eindeutig die Adhäsion von murinen Langerhans Zellen an Keratinozyten in vitro. Es ist bekannt, dass E-Cadherin in der Lokalisation von Langerhans Zellen in der Epidermis involviert ist. Siehe Stingl et al. (1989) für einen Übersichtsartikel der Charakterisierung und Eigenschaften von Langerhans Zellen und Keratinozyten.
Von der Wanderung der epidermalen Langerhans Zellen (LC) und ihrem Transport von Antigen aus der Haut zu den ableitenden Lymphknoten ist bekannt, dass sie wichtig sind in der Induktion von kutanen Immunantworten, wie der Kontaktsensibilisierung. Während des Transits zu den Lymphknoten sind die Langerhans Zellen einer Vielzahl von phänotypischen Änderungen unterworfen, die für ihre Bewegung aus der Haut und der Aufnahme der Fähigkeit zur Antigenpräsentation benötigt werden. Zusätzlich zu der Hochregulation von MHC Klasse II Molekülen kommen Veränderungen in der Expression von Adhäsionsmolekülen, welche die Interaktionen mit der umgebenden Gewebematrix und mit T Lymphozyten regulieren. Von der Wanderung der Langerhans Zelle ist bekannt, dass sie mit einer merklichen Reduktion in der Expression von E-Cadherin (Schwarzenberger und Udey, 1996) und einer parallelen Hochregulation von ICAM-1 (Udey, 1997) assoziiert ist.
Die transkutane Immunisierung mit bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen (bARE's) zielen auf die Langerhans Zellen in der Epidermis. Die bAREs aktivieren die Langerhans Zelle und transformieren sie dabei von ihrer sentinellen Rolle zu ihrer messenger Rolle. Verdautes Antigen wird anschließend zu dem Lymphknoten gebracht, wo es B und T Zellen präsentiert wird (Streilein und Grammer, 1989; Kripke et al., 1990; Tew et al., 1997). In dem Vorgang reift die Langerhans Zelle zu einer Antigen-präsentierenden dendritischen Zelle in dem Lymphknoten (Schuler und Steinman, 1985); Lymphozyten, die in einen Lymphknoten eintreten, segregieren in B Zell Follikel und T Zellregionen. Von der Aktivierung der Langerhans Zelle, eine wandernde Langerhans Zelle zu werden, ist bekannt, dass sie nicht nur mit einem merklichen Anstieg von MHC Klasse II Molekülen assoziiert ist, sondern auch der merklichen Reduktion in der Expression von E-Cadherin und der Hochregulation von ICAM-1.
Wir stellen uns vor, dass Choleratoxin (CT) und seine B Untereinheit (CTB) die Expression von ICAM-1 hochreguliert und die Expression von E-Cadherin auf den Langerhans Zellen herunterreguliert, ebenso wie die Expression von MHC Klasse II Molekülen auf der Langerhans Zelle hochreguliert. CT oder CTB wirken als ein Adjuvants bei der Freisetzung der sentinellen Langerhans Zelle, um Antigene wie BSA oder Diphtherietoxoid zu präsentieren, die von der Langerhans Zelle an demselben Ort und Zeit beim Zusammentreffen mit dem CT oder CTB phagozytiert wurden, wenn sie als ein Adjuvants wirken. Die Aktivierung einer Langerhans Zelle, um die Expression von ICAM-1 hoch zu regulieren und die Expression von E-Cadherin herunter zu regulieren, kann durch Zytokinfreisetzung einschließlich TNFα und IL-1β aus den epidermalen Zellen oder den Langerhans Zellen selbst vermittelt werden.
Von diesem Verfahren der Adjuvanz für transkutane Immunisierung wird angenommen, dass es für jede Verbindung funktioniert, welche die Langerhans Zelle aktiviert. Die Aktivierung könnte in der Weise auftreten, dass sie E-Cadherin herunterreguliert und ICAM-1 heraufreguliert. Die Langerhans Zellen würden anschließend die Antigene, die aus Mischungen solcher Langerhans zellaktivierenden Verbindungen und Antigenen (wie Diphtherietoxoid oder BSA) gebildet wurden, zu den Lymphknoten tragen, wo die Antigene den T Zellen präsentiert werden und eine Immunantwort auslösen. So kann eine aktivierende Substanz wie ein bARE als ein Adjuvants für ein ansonsten transkutan nicht immunogenes Antigen, wie Diphtherietoxoid verwendet werden, indem es die Langerhans Zelle aktiviert, das Antigen wie Diphtherietoxoid zu phagozytieren, zu dem Lymphknoten zu wandern, zu einer dendritischen Zelle zu reifen und das Antigen den T Zellen zu präsentieren.
Die T Zellhelferantwort gegen Antigene, die in der transkutanen Immunisierung verwendet wird, kann durch die Anwendung von Zytokinen und/oder Chemokinen beeinflusst werden. Beispielsweise kann Interleukin-10 (IL-10) die Antikörperantwort hin zu einer Th2 IgG1/IgE Antwort verlagern, wohingegen anti-IL-10 die Produktion von IgG2a verstärken kann (Bellinghausen et al., 1996).
Beispiel 19
Sequestrin ist ein Molekül, das auf der Oberfläche von Malaria infizierten Erythrozyten exprimiert wird, das als Verankerung der Malaria infizierten roten Blutzelle an das vaskuläre Endothel wirkt. Dies ist essentiell für das Überleben des Parasiten und trägt direkt zu der Pathogenese von P. falciparum Malaria in Kindern bei, die an zerebraler Malaria sterben. In zerebraler Malaria werden die Gehirnkapillaren mit einer großen Vielzahl von parasitierten roten Blutzellen aufgrund der spezifischen Interaktion des Sequestrinmoleküls mit dem wirtsendothelialen Rezeptor CD36 verstopft. Ockenhouse et al. identifizierten sowohl den Wirtsrezeptor CD36 als auch das Parasitenmolekül (Sequestrin), welches diese Rezeptor-Ligandeninteraktion vermittelt. Ockenhouse et al. haben die Domäne des Sequestrinmoleküls, die mit dem CD36 Rezeptor interagiert, kloniert und als E. coli hergestelltes, rekombinantes Protein exprimiert. Ein verkürztes 79 Aminosäure Sequestrin Produkt wurde in dem Beispiel unten verwendet.
Die aktive Immunisierung mit rekombinantem Sequestrin oder DNA, die das Gen für Sequestrin kodiert, könnte Antikörper hervorrufen, welche die Adhäsion von Malaria parasitierten Erythrozyten an wirtsendotheliales CD36 blockiert und dadurch die Vervollständigung des parasitären Lebenszyklus verhindert, was zum Tod des Parasiten aufgrund seiner Unfähigkeit an das Endothel zu binden, führt. Die Strategie ist, ein Verfahren zur Immunisierung zu entwickeln, das hohe Titer von blockierenden Antikörpern hervorruft. Ein Verfahren ist es, die Vakzine transkutan zu transportieren. Die Messung von sowohl Gesamtantikörpertitern als auch Blockierungsaktivität und Opsonization bildet die Basis dieses Ansatzes der transkutanen Immunisierung. Das rekombinante Sequestrinprotein, das in den vorliegenden Versuchen verwendet wurde, ist 79 Aminosäuren lang (~18 kDa) und umfasst die CD36 Bindungsdomäne des Moleküls. Wir haben außerdem nacktes DNA Konstrukt konstruiert, das diese Domäne umfasst und haben Antikörper unter Verwendung des epidermalen Genpistolentransports hervorgerufen.
BALB/c Mäuse (n = 3) wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 8 Wochen unter Verwendung von 120 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: ein Plasmid, das P. falciparum Sequestrin kodiert, wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 80 μg Plasmid, 80 mg CT (List Biologicals) pro 100 μl Kochsalzlösung herzustellen. Einhundertzwanzig μl wurden auf das unmarkierte Ohr nach vorsichtiger Reinigung des Ohrs mit einem Alkoholstäbchen (Triad Alcohol Pad, 70% Isopropylalkohol) aufgebracht. Die Immunisierungslösung wurde nicht durch Waschen entfernt.
Die Antikörper gegen Sequestrin wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, in Seren bestimmt, die von der Schwanzvene nach 3, 4, 7 und 9 Wochen nach der Primärimmunisierung gesammelt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt.
Sequestrin DNA mit CT induzierte eine nachweisbare Antikörperantwort gegen das exprimierte Protein nach der zweiten Boosterimmunisierung. Damit Immunisierung auftritt, muss das Protein exprimiert und durch das Immunsystem prozessiert werden. So wirkt CT als ein Adjuvants für die Immunantwort gegen Sequestrinprotein, das durch das Plasmid, das für Sequestrin kodiert, exprimiert wird.
Von DNA Vakzinen wurde gezeigt, dass sie neutralisierende Antikörper und CTLs in nicht humanen Primaten gegen Krankheiten wie Malaria (Gramzinski, Vaccine 15: 913–915, 1997) und HIV (Shriver, et al., Vaccine 15: 884–887, 1997) auslösen, und es wurde nachgewiesen, dass sie Schutz bieten bei verschiedenen Schweregraden in verschiedenen Modellen (McClements et al., Vaccine, 15: 857–60, 1997). Von der DNA Immunisierung durch die Haut könnte erwartet werden, dass sie Antworten ähnlich jenen der Genpistole hervorruft, die auf das Hautimmunsystem abzielt (Prayaga et al., Vaccine, 15: 1349–1352, 1997).
Tabelle 15: Serumantikörper gegen Sequestrin (Seq) Protein in Tieren, die mit Seq DNA und Choleratoxin (CT) immunisiert wurden
Beispiel 20
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen unter Verwendung von Sequestrin immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0, 2 und 8 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: nach 0 Wochen wurden die Mäuse mit 59 μg CT und 192 μg Sequestrin in 410 μl für die Gruppe, die Sequestrin und CT erhielt, 192 μg in 410 μl für Sequestrin alleine, und 120 μg CTB und 250 μg Sequestrin in 520 μl für die Gruppe, die Sequestrin und CTB erhielt, immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse mit 345 μl Kochsalzlösung enthaltend entweder 163 μg Sequestrin für die Gruppe mit Sequestrin alleine, 345 μl Kochsalzlösung enthaltend 163 μg Sequestrin mit 60 μg CT für die Gruppe mit CT plus Sequestrin, 345 μl Kochsalzlösung enthaltend 163 μg Sequestrin und 120 μg CTB für die Gruppe mit Sequestrin plus CTB, geboostert. Bei dem zweiten Boostern wurde den Mäusen 120 μg Sequestrin für die Gruppe mit Sequestrin alleine, 120 μg Sequestrin und 120 μg CT für die Gruppe mit CT plus Sequestrin, und 120 μg Sequestrin und 120 μg CTB für die Gruppe mit Sequestrin plus CTB, gegeben.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, mit Seren 3, 5, 7, 9, 10, 11 und 15 Wochen nach der ersten Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. Sequestrin alleine induzierte eine kleine, aber nachweisbare Antikörperantwort. Jedoch stimulierte das Hinzufügen von CT eine sehr viel stärkere Immunantwort gegen Sequestrin, und CTB induzierte eine Immunantwort, die Sequestrin alleine überlegen war. CT und CTB wirkten als Adjuvanzien für die Immunantwort gegen Sequestrin, einem rekombinanten Protein.
Beispiel 21
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: FLUSHIELD (Wyeth-Ayerst, gereinigtes Subvirion, 1997–98 Formel, Lot #U0980-35-1) wurde lyophilisiert und in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 90 μg FLUSHIELD Supervirion pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die Influenza alleine erhielt, herzustellen; Influenza und CT wurden in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 90 μg FLUSHIELD Antigene und 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die Influenza und CT erhielt, herzustellen.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, mit Seren 3 Wochen nach der ersten Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt. Influenza alleine induzierte eine keine Antikörperantwort. Jedoch stimulierte das Hinzufügen von CT eine sehr viel stärkere Immunantwort, die jener überlegen war, die mit Influenza alleine beobachtet wurde. So wirkte CT als ein Adjuvants für die Immunantwort gegen FLUSHIELD, Subvirion Influenza Vakzine, eine Mischung von viral abgeleiteten Antigenen.
Tabelle 17. Serumantikörper gegen Influenza (Inf) Typen A und B in Tieren, die mit Inf alleine oder Inf + Choleratoxin (CT) immunisiert wurden
Beispiel 22
LT gehört in die Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine und entspricht CT im Molekulargewicht, bindet an Gangliosid GM1, ist 80% homolog mit CT und besitzt eine ähnliche A : B5 Stöchiometrie. So wurde LT auch als ein Adjuvants für DT in der transkutanen Immunisierung verwendet. BALB/c Mäuse (n = 5) wurden, wie oben beschrieben, nach 0, 8 und 18 Wochen mit einer Kochsalzlösung enthaltend 100 μg LT (Sigma, Katalog #E-8015, Lot 17hH12000) und 100 μg CT (List Biologicals, Katalog #101b) in 200 μl Kochsalzlösung, immunisiert. LT induzierte eine mäßige Antwort gegen DT, wie in Tabelle 18 gezeigt ist.
ETA (List Biologicals, Lot #ETA 25A) gehört in die Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine, aber es ist ein einzelnes Polypeptid, das an einen unterschiedlichen Rezeptor bindet. Einhundert μg ETA wurden in 100 μl Kochsalzlösung enthaltend 100 μg CT, in BALB/c Mäuse auf den Rücken, wie zuvor beschrieben, nach 0, 8 und 18 Wochen verabreicht. ETA boostete die Antwort gegen DT nach 20 Wochen. So waren andere ADP-ribosylierende Exotoxine in der Lage, als Adjuvanzien für gleichzeitig verabreichte Proteine zu wirken (Tabelle 18).
Tabelle 18. Kinetiken von Diphtherietoxoid (DT) Antikörpertitern in Tieren, die mit Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (ETA) und DT oder E. coli hitzelabilem Enterotoxin (LT) und DT immunisiert wurden
Beispiel 23
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 Wochen, 8 Wochen und 18 Wochen mit 100 μl Kochsalzlösung enthaltend 100 μg Choleratoxin (List Biologicals, Katalog #101B, Lot #10149CB), 50 μg Tetatnustoxoid (List Biologicals, Katalog #191B, Lots #1913a und 1915b) und 83 μg Diphtherietoxoid (List Biologicals, Katalog #151, Lot #15151), immunisiert.
Die Antikörper gegen CT, DT und TT wurden unter Verwendung eines ELISA, wie beschrieben unter "ELISA IgG(H + L)", quantifiziert. Anti-CT, -DT oder -TT Antikörper wurden 23 Wochen nach der Primärimmunisierung nachgewiesen. Anti-Diphtherietoxoid und Choleratoxin Antikörper waren in allen immunisierten Mäusen erhöht. Die am besten ansprechende wies anti-Tetanustoxoid Antikörper ELISA Einheiten von 342, ungefähr 80mal die Menge an Antikörper, die in Serum von nicht immunisierten Tieren nachgewiesen wurde, auf. So kann eine Kombination von nicht verwandten Antigenen (CT/TT/DT) verwendet werden, um gegen die einzelnen Antigene zu immunisieren. Dies zeigt, dass Choleratoxin als ein Adjuvants für multivalente Vakzinen verwendet werden kann.
Tabelle 19. Serum Antikörper in Tieren, die gleichzeitig mit Choleratoxin, Tetanustoxoid und Diphtherietoxoid immunisiert wurden
Beispiel 25
Die transkutane Immunisierung unter Verwendung von CT induziert potente Immunantworten. Die Immunantwort gegen eine transmuskuläre Injektion und orale Immunisierung wurde mit der transkutanen Immunisierung unter Verwendung von CT als Adjuvants und Antigen verglichen. 25 μg CT (List Biologicals, Katalog #101b), gelöst in Kochsalzlösung, wurde oral in 25 μl an BALB/c Mäuse (n = 5) unter Verwendung einer 200 μl Pipettenspitze, verabreicht. Die Mäuse schluckten einfach die Immunisierungslösung.
Fünfundzwanzig μl 1 mg/ml CT in Kochsalzlösung wurde auf das Ohr, wie beschrieben, an die Gruppe, die transkutan markiert war, verabreicht. Fünfundzwangzig μg CT in Kochsalzlösung wurde IM in den vorderen Schenkel der Gruppe, die mit intramuskulär markiert war, injiziert.
Die Mäuse, die IM mit CT injiziert wurden, entwickelten deutliche Schwellung und Empfindlichkeit an der Injektionsstelle und entwickelten hohe Mengen an anti-CT Antikörpern. Mäuse, die transkutan immunisiert wurden, wiesen keine Röte oder Schwellung an der Immunisierungsstelle auf und entwickelten hohe Mengen an anti-CT Antikörpern. Mäuse, die oral immunisiert wurden, entwickelten sehr viel niedrigere Mengen an Antikörpern im Vergleich zu den Mäusen, die transkutan immunisiert wurden. Dies zeigt, dass die orale Immunisierung durch Putzen in den transkutan immunisierten Mäusen nicht für die hohen Mengen an Antikörpern verantwortlich ist, die durch transkutane Immunisierung induziert werden. Insgesamt ist der transkutane Immunisierungsweg sowohl der oralen als auch der IM Immunisierung überlegen, weil hohe Mengen an Antikörpern ohne nachteilige Reaktionen gegen die Immunisierung erreicht werden.
Tabelle 20. Kinetiken von Choleratoxin Antikörpertitern in Tieren, die über den transkutanen, oralen oder intramuskulären Weg immunisiert wurden
Beispiel 26
BALB/c Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0, 8 und 20 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungslösung, die wie folgt hergestellt wurde, immunisiert: Hib Konjugat (Connaught, Lot #6J81401, 86 μg/ml) wurde lyophilisiert, um das Antigen zu konzentrieren. Die lyophilisierte Produkt wurde in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immunisierungslösung enthaltend 50 μg Hib Konjugat pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die Hib Konjugat alleine erhielt, herzustellen; Hib Konjugat und CT wurden in Kochsalzlösung gemischt, um eine Immuinisierungslösung enthaltend 50 μg Hib Konjugat und 100 μg CT pro 100 μl Kochsalzlösung für die Gruppe, die Hib Konjugat und CT erhielt, herzustellen.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, mit Seren 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt. Hib Konjugat alleine induzierte eine geringe aber nachweisbare Antikörperantwort. Jedoch stimulierte das Hinzufügen von CT eine sehr viel stärkere Immunantwort gegen Hib Konjugat. CT wirkte als ein Adjuvants für die Immunantwort gegen Hib Konjugat. Dies zeigt, dass ein Polysaccharidkonjugat Antigen als ein transkutanes Antigen in dem beschriebenen Verfahren verwendet werden kann.
Tabelle 21. Antikörper gegen Haemophilus influenzae b (Hib)
Beispiel 27
Emulsionen, Cremes und Gele können praktische Vorteile für ein geeignetes Verteilen der Immunisierungsverbindung über die Hautoberfläche, über Haar- oder Körperfalten bereitstellen. Darüber hinaus können solche Präparationen Vorteile, wie Okklusion oder Hydration liefern, welche die Wirksamkeit der Immunisierung verstärken.
Hitzelabiles Enterotoxin (LT) von E. coli (Sigma, Katalog #E-8015, Lot 17hH1200) wurde verwendet, um die Wirksamkeit der transkutanen Immunisierung zu vergleichen, unter Verwendung einer einfachen Kochsalzlösung und einer allgemein erhältlichen Salbe auf Petroleumbasis, AQUAPHOR, das "alleine oder zusammen mit irgendeiner anderen Salbe verwendet werden kann, die wässrige Lösungen verwendet, oder in Kombination mit anderen ölbasierten Substanzen und allen herkömmlichen topischen Medikamenten." (Seite 507 PDR, for Non-prescriptions Drugs, 1994, 15. Auflage). Die Mäuse wurden mit einem Bereich von Dosen behandelt, um die relative Antikörperantwort für die abfallenden Dosen in dem Vergleichsvehikel zu bewerten.
BALB/c Mäuse wurden wie oben beschrieben immunisiert, mit der Ausnahme, dass die Immunisierungslösung für 3 Stunden auf den Rücken aufgetragen wurde. Es wurden Kochsalzlösungen von LT hergestellt, um eine 50 μl Lösungsdosis und entweder 100 μg, 50 μg, 25 μg oder 10 μg Antigen in der Lösung unter Verwendung von jeweils 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml oder 0,2 mg/ml Lösung zu transportieren. Nach 3 Stunden wurde der Rücken vorsichtig unter Verwendung eines feuchten Mulls abgewischt, um die Immunisierungslösung zu entfernen.
Die Wasser-in-Öl Präparation wurde wie folgt durchgeführt: gleiche Volumina von AQUAPHOR und Antigen in Kochsalzlösung wurden in 1 ml Glas Tuberculin Luer-Lock-Spritzen gemischt, unter Verwendung einer 15-er emulgierenden Kanüle, welche die beiden Spritzen verbindet, und gemischt, bis die Mischung homogen war. Es wurde jeweils eine 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml oder 0,5 mg/ml LT Lösung in Kochsalzlösung verwendet, um mit einem gleichen Volumen an AQUAPHOR gemischt zu werden. 50 μl dieser Mischung wurde auf den rasierten Nacken für 3 Stunden aufgebracht und anschließend vorsichtig durch Wischen mit Mull entfernt. Dosen von Antigen für die Wasser-in-Öl LT enthaltenden Emulsionen wurden gewogen, um 50 μl zu transportieren. Das Gewicht pro Volumenverhältnis wurde durch Hinzufügen des spezifischen Gewichts von Kochsalzlösung (1,0 g/ml) und AQUAPHOR 0,867 g/ml, und Dividieren der Summe durch 2 für ein abschließendes spezifisches Gewicht von 0,9335 g/ml, berechnet. Ungefähr 47 mg der Wasser-in-Öl Emulsion enthaltend LT wurde an die Maus für die Immunisierung verabreicht.
Ein Dosisantwortverhältnis für sowohl Kochsalzlösung als auch Wasser-in-Öl Emulsion verabreichtes LT war offensichtlich (Tabelle 22). Einhundert μg induzierten die höchste Menge an Antikörpern, und 10 μg induzierten eine niedrigere, aber potente Immunantwort. Wasser-in-Öl emulgiertes LT induzierte eine ähnliche Antwort gegen LT in Kochsalzlösung und scheint einen geeigneten Transportmechanismus für die transkutane Immunisierung anzubieten. Ebenso könnten Gele, Cremes und komplexere Formulierungen wie Öl-in-Wasser-in-Öl verwendet werden, um Antigen für die transkutane Immunisierung zu transportieren. Solche Zusammensetzungen könnten in Verbindung mit Pflastern, okklusiven Verbänden oder Reservoiren verwendet werden und können eine Langzeitanwendung oder Kurzzeitanwendung des immunisierenden Antigens und Adjuvants erlauben.
Tabelle 22. Serum Antikörper gegen E. coli hitzelabiles Enterotoxin (LT) in Tieren, die mit verschiedenen Dosen an LT in einer Kochsalzlösung oder AQUAPHOR Emulsion immunisiert wurden
Beispiel 28
Die Mäuse wurden transkutan, wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, in Gruppen zu fünf Mäusen immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0, 8 und 18 Wochen mit 100 μl Kochsalzlösung enthaltend 50 μg Tetanustoxoid (List Biologicals, Katalog #191B, Lots #1913a und #1915b) und 83 μg Diphtherietoxoid (List Biologicals, Katalog #151, Lot #15151) alleine oder in Kombination mit 100 μg Choleratoxin (List Biologicals, Katalog #101B, Lot #10149CB) immunisiert.
Anti-Diphtherietoxoid Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA, wie unter "ELISA IgG(H + L)" beschrieben, quantifiziert. Erhöhte Mengen an anti-Toxoid Antikörpern wurden in Tieren nachgewiesen, die mit entweder TT/DT oder CT/TT/DT immunisiert wurden. Jedoch waren die Antikörpertiter weit überlegen in Tieren, in denen CT als ein Adjuvants eingeschlossen war. Dieser anti-Toxoidtiter war offensichtlich in beiden Gruppen nach jeder aufeinanderfolgenden Immunisierung erhöht (8 und 18 Wochen). Während DT eine geringe, aber signifikante Antwort gegen sich selbst induzieren kann, kann das Ausmaß der Antwort gesteigert werden durch 1) den Einschluss von Choleratoxin als ein Adjuvants und 2) Boostern mit dem Adjuvants Choleratoxin und Antigen (Diphtherietoxoid). Klassische Boosterantworten sind vom T Zell Gedächtnis abhängig, und das Boostern der anti-DT Antikörper in diesem Versuch zeigt, dass T Zellen in der transkutanen Immunisierung involviert sind.
Beispiel 29
C57B1/6 Mäuse wurden transkutan mit CT (Azid frei, Calbiochem), wie oben beschrieben, auf dem rasierten Rücken der Maus immunisiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung eines lethalen Challengemodells 6 Wochen nach Immunisierung gechallenged (Mallet et al., Immunoprophylactic efficacy of nontoxic mutants of Vibrio cholerae toxin (CTK63) and Escherichia coli heat-labile toxin (LTK63) in a mouse cholera toxin intranasal challenge model, eingereicht bei Immunology Letters). Während des Challenge wurde den Mäusen 20 μg CT (Calbiochem, Azid frei), gelöst in Kochsalzlösung intranasal über eine Plastikpipettenspitze gegeben, während sie mit 20 μl Ketamin-Rompin betäubt waren. In Versuch #1 überlebten 12/15 immunisierte Mäuse den Challenge nach 14 Tagen, und 1/9 nicht immunisierte Kontrollmäuse überlebten. Fünf Kontrollmäuse wurden vor dem Challenge aufgrund der Betäubung verloren. Die Mäuse in Challenge #1 wiesen anti-CT Serum Antikörper von 15.000 ELISA Einheiten (geometrisches Mittel) auf, und fünf immunisierte Mäuse, die zu dem Zeitpunkt des Challenge geopfert wurden, wiesen Lungenspülung IgG auf, das in 5/5 Mäusen nachgewiesen wurde. Die Lungenspülungen wurden wie oben beschrieben gesammelt.
Die Immunisierung und der Challenge wurden mit naiven C57B1/6 Mäusen wiederholt, und 7/16 der immunisierten Mäuse überlebten den Challenge, während nur 2/17 der nicht immunisierten Mäuse den Challenge überlebten. Immunisierte Mäuse in Challenge #2 wiesen anti-CT IgG Antikörper von 41.947 ELISA Einheiten (geometrisches Mittel) auf. Lungenspülungen von fünf Mäusen, die zum Zeitpunkt des Challenge geopfert wurden, zeigten sowohl anti-CT IgG als auch IgA (Tabelle 24). Stuhlproben von 8/9 Mäusen zeigten sowohl anti-CT IgG als auch IgA (Tabelle 25). Die Stuhlproben wurden frisch von Tieren gesammelt, die spontan zu dem Zeitpunkt des Challenge Stuhl ausschieden. Die Stuhlproben wurden bei –20°C eingefroren. Zum Zeitpunkt des ELISA wurden die Stuhlproben aufgetaut, in 100 μl PBS homogenisiert, zentrifugiert, und ein ELISA wurde mit dem Überstand durchgeführt. Die gesamte Überlebensrate unter den immunisierten Mäusen war 19/31 oder 61%, wohingegen die gesamte Überlebensrate unter den nicht immunisierten Mäusen 3/26 oder 12% betrug.
Tabelle 24. Lungenspülung anti-Choleratoxin IgG und IgA Antikörpertiter
Beispiel 30
C57B1/6 weibliche Mäuse wurden von Charles River Laboratories erhalten. Die Mäuse wurden mit 200 μg Ovalbumin (OVA) (Sigma, Lot #14H7035, Stockkonzentration 2 mg/ml in PBS) und 50 μg Choleratoxin (List Biologicals, Lot #101481B, Stockkonzentration 5 mg/ml) immunisiert. Es wurde ein Packard Cobra Gamma Zähler (Serien #102389) verwendet, um die Menge an freigesetztem ⁵¹Cr zu messen.
C57B1/6 Mäuse wurden mit 0,03 ml Ketamin-Rompin betäubt und auf dem Rücken mit einem Rasierer ohne Verletzung der Haut rasiert, und sie ruhten sich für 24 Stunden aus. Die Mäuse wurden betäubt, anschließend nach 0 und 28 Tagen mit 150 μl Immunisierungslösung immunisiert, die auf den rasierten Rücken über einen 2 cm² Bereich für 2 Stunden aufgebracht wurde. Die Mäuse wurden anschließend zweimal mit feuchtem Mull abgewischt. Die Mäuse zeigten keine gegenteiligen Effekte von entweder der Betäubung, Immunisierung oder dem Waschverfahren. Dieses Verfahren wurde wöchentlich für 3 Wochen wiederholt.
Milzlymphozyten wurden eine Woche nach der Boosterimmunisierung gesammelt. Die Zellen wurden in vitro in RPMI-1640 und 10% FBS (mit Penicillin-Streptomycin, Glutamin, nicht essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat und 2-Mercaptoethanol) für 6 Tage mit dem Zusatz von 5% Ratten Concanavalin A Überstand als eine Quelle für IL-2, mit oder ohne Antigen, kultiviert. Die Zielzellen bestanden aus syngenischen (H-2^b) EL4 Zellen alleine und EL4 Zellen, die mit dem CTL Peptid SINFEKKL gepulst waren, allogenischen (H-2k) L929 Zellen und EG7 Zellen. Die Zielzellen (1 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung) wurden für 1 h mit 0,1 mCi pro Vertiefung ⁵¹Cr (Na₂CrO₄ Quelle, Amersham) markiert, und sie wurden den Effektorzellen in Verhältnissen im Bereich von 3 : 1 bis 100 : 1 hinzugefügt. Die Zellmischungen wurden in 96-Vertiefungsrundboden Gewebskulturplatten (Costar, Katalog #3524) in 0,2 ml vollständigem RPMI-1640, 10% FBS Medium für 5 h bei 37°C in einer 5% CO₂ Feuchtatmosphäre inkubiert. Am Ende der 5-stündigen Kultur wurden die Überstände durch Baumwollstreifen absorbiert und für die Bestimmung der ⁵¹Cr Freisetzung verarbeitet. Die spezifische Lyse wurde bestimmt als:
% Spezifische Lyse = 100 × [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)].
Wie in Tabelle 26 gezeigt, wurden Teil 1 CTLs gegen das mit EL4 Peptid gepulste Zellen in einem E : T Verhältnis von 100 : 1 für die Gruppe, die mit CT + OVA immunisiert wurde, nachgewiesen. CTL Assays sind nicht positiv, wenn die Prozent spezifische Lyse nicht über 10% oder eindeutig über der mediumstimulierten Effektorenhintergrund Prozent Lyse liegt. Ebenso, wie in Tabelle 26 gezeigt, wurden Teil 2 CTLs gegen das EG7 (OVA transfizierte Zellen) in einem E : T Verhältnis von 100 : 1 für die Gruppe, die mit CT + OVA immunisiert wurde, nachgewiesen. So diente CT als Adjuvants für die Bildung von CTLs über den transkutanen Weg.
Tabelle 26. OVA-spezifische CTL, die transkutan induziert wurden Teil 1 – Zielzellen: EL4 + Peptid
Teil 2 – Zielzellen: EG7 (OVA transfiziert)
Beispiel 31
C57B1/6 Mäuse (n = 6) wurden transkutan wie oben unter "Immunisierungsverfahren" beschrieben, immunisiert. Die Mäuse wurden nach 0 und 4 Wochen mit 100 μl Kochsalzlösung enthaltend 100 μg Choleratoxin (List Biologicals, Katalog #101B, Lot #10149CB) und 205 μg Ovalbumin Protein (Sigma, Alumbinhühnerei, Güte V Katalog #A5503, Lot #14H7035) immunisiert.
Einzelzellsuspensioen wurden aus Milzen hergestellt, die von Tieren nach acht Wochen nach der ersten Immunisierung geerntet wurden. Splenozyten wurden in Kultur genommen mit 8 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einem 200 μl Volumen, enthaltend OVA Protein oder ein irrelevantes Protein Conalbumin in den angegebenen Konzentrationen. Die Kulturen wurden für 72 Stunden bei 37°C in einem CO₂ Inkubator inkubiert, zu dieser Zeit wurden 0,5 μCi/Vertiefung ³H Thymidin zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Zwölf Stunden später wurde die Proliferation durch Ernten der Platten und Quantifizieren des eingebauten radiomarkierten Thymidins durch Flüssigszintillationszählung bewertet. Die Rohwerte des ³H Einbaus sind in cpm angegeben und der X-fache Anstieg (cpm experimentell/cpm Medium) ist links auf jeder Probe angeben. X-fache Anstiege größer als drei werden als signifikant erachtet.
Signifikante Proliferation wurde nur nachgewiesen, wenn die Splenozyten mit dem Protein Ovalbumin, mit dem die Tiere in vivo immunisiert wurden, stimuliert wurden und nicht mit dem irrelevanten Protein Conalbumin. So induziert die transkutane Immunisierung mit Choleratoxin und Ovalbumin Protein eine Antigen-spezifische Proliferation von Splenozyten in vitro, was anzeigt, dass eine zelluläre Immunantwort durch dieses Verfahren hervorgerufen wird.
Tabelle 27. Antigen-spezifische Proliferation von Milzzellen aus Tieren, die mit Choleratoxin (CT) und Ovalbumin (OVA) immunisiert wurden
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Claims

Verwendung eines Antigens und eines Adjuvants, wobei das Adjuvants ein ADP-ribosylierendes Exotoxin, eine B-Untereinheit davon oder ein Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins ist, für die Herstellung einer Formulierung für die transkutane Immunisierung, wobei die Formulierung eine Immunantwort induziert, die spezifisch für das Antigen nach der Verabreichung auf die unperforierte Haut ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung weiterhin einen Verband umfasst, um einen Patch für die transkutane Immunisierung zu bilden.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Verband ein okklusiver Verband ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine Menge des Antigens, die wirksam ist um die Immunantwort zu induzieren, nicht in ein Liposom eingeschlossen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvants die Präsentation des Antigens gegenüber einem Lymphozyt verstärkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvants eine Antigen-präsentierende Zelle aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Antigen-präsentierende Zelle eine Langerhans Zelle oder eine dermale dendritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvants die Expression des Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II auf einer Antigen-präsentierenden Zelle verstärkt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Antigen-präsentierende Zelle eine Langerhans Zelle oder eine dermale dendritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvants eine Antigen-präsentierende Zelle, die unter einer Verabreichungsstelle angeordnet ist, veranlasst zu einem ableitenden Lymphknoten zu wandern.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Antigen-präsentierende Zelle eine Langerhans Zelle oder eine dermale dendritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvants einer Langerhans Zelle signalisiert, zu einer dendritischen Zelle zu reifen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung im Wesentlichen aus Antigen und Adjuvants besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei sowohl Antigen- als auch Adjuvantseigenschaften in einem einzelnen Molekül enthalten sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Formulierung im Wesentlichen aus nur einem Bestandteil besteht, der sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvants ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein Bestandteil der Formulierung ein Antigen ist, das keine Adjuvantseigenschaften aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung eine wässrige Lösung ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung kein organisches Lösungsmittel aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung keinen Penetrationsverstärker aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung als eine Creme, eine Emulsion, ein Gel, eine Lotion, eine Salbe, eine Paste oder eine Suspension gebildet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen wenigstens teilweise gereinigt und von einem Pathogen abgeleitet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterium, Virus, Pilz und Parasit.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein wenigstens teilweise gereinigtes Tumorantigen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein wenigstens teilweise gereinigtes Autoantigen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein wenigstens teilweise gereinigtes Allergen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen wenigstens teilweise gereinigt ist und mehr als 500 Daltons Molekulargewicht aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen wenigstens teilweise gereinigt ist und mehr als 800 Daltons Molekulargewicht aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen wenigstens teilweise gereinigt ist und mehr als 1000 Daltons Molekulargewicht aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 25–27, wobei das Antigen proteinös ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 25–27, wobei das Antigen ein Konjugat mit einem Polysaccharid ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen als eine ganze Zelle, ein Bakterium, ein Virion, ein lebendes Virus, ein attenuiertes Virus, ein inaktiviertes Virus oder ein Virosom bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung wenigstens zwei verschiedene, getrennte Antigene aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen als eine Nukleinsäure, die das Antigen kodiert, bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Nukleinsäure nicht integrieren und nicht replizieren kann.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Nukleinsäure weiterhin eine regulatorische Region aufweist, die operativ mit der Sequenz, die das Antigen kodiert, verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Formulierung keinen Penetrationsverstärker, virales Partikel, Liposom oder geladenes Lipid aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Verwendung eines hydratisierenden Mittels.
Verwendung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Verwendung eines Penetrationsverstärkers.
Verwendung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Verwendung eines Befeuchtungsmittels.
Verwendung nach Anspruch 38, wobei das Befeuchtungsmittel Glycerol ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung eine Menge des Antigens aufweist, die wirksam ist um die Immunantwort zu induzieren, wobei das Antigen in Lösung und/oder mit einem Liposom assoziiert vorliegt, aber nicht darin eingeschlossen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants einen Rezeptor auf Antigen-präsentierenden Zellen bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants GM₁-Gangliosid bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants das α₂-Makroglobulinrezeptor low density Lipoprotein Rezeptor-related Protein bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants Choleratoxin, die B-Untereinheit von Choleratoxin oder eine mutantes Toxoid von Choleratoxin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants E. coli hitzelabiles Enterotoxin, die B-Untereinheit von E. coli hitzelabilem Enterotoxin oder ein mutantes Toxoid von E. coli hitzelabilem Enterotoxin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants Diphtherietoxin, die B-Untereinheit von Diphtherietoxin oder ein mutantes Toxoid von Diphtherietoxin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants Pertussistoxin, die B-Untereinheit von Pertussistoxin oder ein mutantes Toxoid von Pertussistoxin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei das Adjuvants Pseudomonas Exotoxin A, die B-Untereinheit von Pseudomonas Exotoxin A oder ein mutantes Toxoid von Pseudomonas Exotoxin A ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–40, wobei die Immunantwort keine allergische Reaktion, Dermatitis oder atopische Reaktion ist.
Patch für die Verwendung in der transkutanen Immunisierung, wobei der Patch ein Antigen und eine Adjuvants aufweist, wobei das Adjuvants ein ADP-ribosylierendes Exotoxin, eine B-Untereinheit davon oder ein Toxoid eines ADP-ribosilierenden Exotoxins ist.
Patch nach Anspruch 50, für die Verwendung in einem der Ansprüche 1–49.