DE69737883T2 - Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Materialwissenschaften und analytischen Chemie, insbesondere ein Verfahren zum Manipulieren von Partikeln und eine Sortiervorrichtung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Ausführung eines vollständigen, funktionell integrierten Systems zur Implementierung biochemischer Analyse in einem planaren, miniaturisierten Format auf der Oberfläche eines leitenden und/oder fotoleitenden Substrats, mit Anwendungen in der pharmazeutischen und agrarwirtschaftlichen Wirkstofffindung und in In-vitro- oder genomischer Diagnostik. Des Weiteren kann das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Materialoberflächen zu erzeugen, die ein erwünschtes topographisches Relief und eine erwünschte chemische Funktionalität aufweisen, und oberflächenmontierte optische Elemente wie zum Beispiel Linsenanordnungen herzustellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • I – Ionen, elektrische Felder und Fluidströmung: feldinduzierte Bildung von planaren Bead-Anordnungen
  • Elektrokinese bezieht sich auf eine Klasse von Phänomenen, die durch die Wirkung eines elektrischen Feldes auf die mobilen Ionen, die aufgeladene Objekte in einer Elektrolytlösung umgeben, ausgelöst werden. Wenn ein Objekt mit gegebener Oberflächenladung in eine Lösung, die Ionen enthält, getaucht wird, bildet sich eine diffuse Ionenwolke, um die Oberflächenladung des Objekts abzuschirmen. Diese Anordnung einer Schicht von (unbeweglichen) Ladungen verbunden mit einem Objekt, das eingetaucht wird, und der Abschirmungswolke von (beweglichen) Gegenionen in Lösung wird „Doppelschicht" genannt. In diesem Bereich einer geringen, aber endlichen Dicke ist das Fluid nicht elektroneutral. Infolgedessen setzen elektrische Felder, die auf diesen Bereich wirken, Ionen in der diffusen Schicht in Bewegung, und diese wiederum reißen das umliegende Fluid mit. Die resultierenden Strömungsfelder geben die räumliche Verteilung des Ionenstroms in dem Fluid wieder. Das einfachste Beispiel eines elektrokinetischen Phänomens stellt die Elektroosmose dar. Sie entsteht, sobald ein elektrisches Feld parallel zur Oberfläche eines Probenbehälters oder einer Elektrode angelegt wird, der bzw. die feste Oberflächenladungen aufweist, wie zum Beispiel im Falle einer Siliziumoxidelektrode (im Bereich von neutralem pH). Da Gegenionen in der Elektrodendoppelschicht durch das elektrische Feld beschleunigt werden, ziehen sie Lösungsmittelmoleküle mit und bewirken eine große Fluidströmung. Diese Wirkung kann in schmalen Kapillaren sehr erheblich sein und zur Gestaltung von Fluidpumpsystemen vorteilhaft verwendet werden.
  • Ein verwandtes Phänomen ist die Elektrophorese, die den feldinduzierten Transport geladener Partikel betrifft, die in einem Elektrolyt eingetaucht sind. Wie bei der Elektroosmose, beschleunigt ein elektrisches Feld bewegliche Ionen in der Doppelschicht der Partikel. Wenn, im Gegensatz zum vorhergehenden Fall, das Partikel selbst beweglich ist, wird es diese feldinduzierte Bewegung der Ionen (und den resultierenden Ionenstrom) durch Bewegung in die entgegengesetzte Richtung kompensieren. Elektrophorese spielt eine wichtige Rolle bei industriellen Beschichtungsverfahren und ist, neben der Elektroosmose, von besonderem Interesse in Verbindung mit der Entwicklung der Kapillarelektrophorese zu einer Hauptstütze moderner bioanalytischer Auftrennungstechnologie.
  • Bei begrenzten geometrischen Anordnungen, wie zum Beispiel der einer flachen Experimentalkammer in der Form eines „Sandwich" von zwei planaren Elektroden, spielt die Verteilung der Oberflächenladung und die Topographie der Seitenoberflächen der Elektrode eine besonders wichtige Rolle bei der Bestimmung der Beschaffenheit und räumlichen Struktur der elektroosmotischen Strömung. Solch eine elektrochemische „Sandwich"-Zelle kann durch ein Elektrodenpaar gebildet werden, das durch einen geringen Anstand voneinander getrennt ist. Üblicherweise wird die untere Elektrode durch eine oxidbedeckte Siliziumhalbleiterscheibe gebildet, während die weitere Elektrode durch optisch transparentes, leitendes Indiumzinnoxid (ITO) gebildet wird. Die Siliziumhalbleiterscheibe (Si) stellt eine dünne Scheibe eines Siliziumeinzelkristalls dar, die dotiert ist, um geeignete Grade elektrischer Leitfähigkeit zu erreichen, und durch eine dünne Schicht Siliziumoxid (SiOx) von der Elektrolytlösung isoliert ist.
  • Die reversible Aggregation von Beads zu planaren Aggregaten angrenzend an eine Elektrodenoberfläche kann durch ein elektrisches (Gleichstrom- oder Wechselstrom-) -Feld induziert werden, das lotrecht an die Elektrodenoberfläche angelegt wird. Obwohl das Phänomen schon früher in einer Zelle beobachtet wurde, die durch ein Paar leitender ITO-Elektroden gebildet ist (Richetti, Prost und Barois, J. Physique Lettr. 45, L-1137 bis L-1143 (1984)), wurde es doch erst kürzlich gezeigt, dass die zugrundeliegende anziehende Wechselwirkung zwischen Beads durch elektrokinetische Strömung vermittelt wird (Yeh, Seul und Shraiman, „Assembly of Ordered Colloidal Aggregates by Electric Field Induced Fluid Flow", Nature 386, 57-59 (1997), deren Inhalte durch Hinweis hierin aufgenommen sind. Diese Strömung gibt die Wirkung von lateralen Ungleichmäßigkeiten in der räumlichen Verteilung der Strömung (current) in der Nähe der Elektrode wieder. Im einfachsten Falle werden solche Ungleichmäßigkeiten durch die Gegenwart eines Kolloidbeads nahe der Elektrode aufgrund der Tatsache, dass jedes Bead mit der Bewegung von Ionen im Elektrolyt interferiert, eingeführt. Daher wurde beobachtet, dass ein einzelnes Bead, wenn nahe der Elektrodenoberfläche platziert, eine toroidale Fluidströmung erzeugt, die auf das Bead zentriert ist. Es können auch willentlich räumliche Ungleichmäßigkeiten in den Eigenschaften der Elektrode durch verschiedene Verfahren zum Erzeugen lateraler Fluidströmung in Richtung von Bereichen geringer Impedanz eingeführt werden. Diese Verfahren werden in den nachfolgenden Abschnitten beschrieben.
  • Partikel, die in der elektrokinetischen Strömung eingebettet sind, werden ungeachtet ihrer spezifischen chemischen oder biologischen Beschaffenheit advektiert, während sie gleichzeitig das Strömungsfeld abändern. Infolgedessen betrifft die elektrofeldinduzierte Zusammensetzung von planaren Aggregaten und Anordnungen so unterschiedliche Partikel wie: kolloidale Polymergitter („Latex Beads"), Lipidvesikel, vollständige Chromosomen, Zellen und Biomoleküle, einschließlich Proteine und DNA, sowie Metall- oder Halbleiterkolloide und -Cluster.
  • Wichtig für die zu beschreibenden Anwendungen ist die Tatsache, dass die strömungsvermittelte anziehende Wechselwirkung zwischen Beads sich über Distanzen erstreckt, die die charakteristische Beadabmessung weit überschreiten. Planare Aggregate werden in Reaktion auf ein extern angelegtes elektrisches Feld gebildet und disassemblieren, sobald das Feld entfernt wird. Die Stärke des angelegten Feldes bestimmt die Starke der anziehenden Wechselwirkung, die dem Verfahren der Anordnungszusammensetzung zugrunde liegt, und wählt dadurch die spezifische Anordnung aus, die von den Beads in der Anordnung angenommen wird. Das heißt: Als eine Funktion der Zunahme der angelegten Spannung, bilden Beads zuerst planare Aggregate, in denen Partikel beweglich und locker gepackt sind, gehen dann eine dichtere Packung ein und weisen schließlich eine räumliche Anordnung in Form einer kristallinen, oder geordneten, Anordnung auf, die einem Blasenteppich (bubble raft ähnelt. Der Ablauf der Übergänge zwischen Zuständen erhöhter interner Ordnung ist reversibel, wobei komplette Disassemblierung von planaren Aggregaten bei Entfernung der angelegten Spannung eingeschlossen ist. In einer weiteren Anordnung bilden Beads bei geringer anfänglicher Konzentration kleine Cluster, die wiederum Positionen innerhalb einer geordneten „Überstruktur" einnehmen.
  • II – Bemusterung von Siliziumoxidelektrodenoberflächen
  • Elektrodenbemusterung in Übereinstimmung mit einer vorgegebenen Gestaltung ermöglicht die quasi-permanente Modifikation der elektrischen Impedanz der EIS-(Elektrolyt-Isolator-Halbleiter)-Struktur, die hier von Interesse ist.
  • Durch räumliches Modulieren der EIS-Impedanz bestimmt die Elektrodenbemusterung die Ionenströmung in der Nähe der Elektrode. Abhängig von der Frequenz des anliegenden elektrischen Feldes, suchen Beads entweder die Bereiche hoher Ionenströmung auf oder meiden sie. Somit fördert räumliche Bemusterung eine klare externe Steuerung der Anordnung und Form der Beadanordnungen.
  • -Bemusterung kann zwar auf vielen Wegen erreicht werden, zwei Verfahren bieten jedoch besondere Vorteile. Erstens stellt UV-vermitteltes Nachwachsen einer dünnen Oxidschicht auf einer angemessen präparierten Siliziumoberfläche eine günstige Methodik da, die fotolithographische Lackbemusterung und Ätzen vermeidet. In Gegenwart von Sauerstoff vermittelt UV-Bestrahlung die Konversion von exponiertem Silizium zu Oxid. Insbesondere hängt die Dicke der Oxidschicht von der Belichtungszeit ab und kann somit durch Platzieren gemusterter Masken in den UV-Bestrahlungsweg räumlich moduliert werden. Diese Modulation der Dicke, mit üblichen Veränderungen von ca. 10 Ångström, wandelt sich in räumliche Modulationen der Impedanz der Si/SiOx-Grenzfläche um, während sie eine flache und chemisch homogene obere Oberfläche, die zu der Elektrolytlösung freiliegt, zurücklässt. Zweitens können räumliche Modulationen in der Verteilung der Elektrodenoberflächenladung durch UV-vermittelte fotochemische Oxidation einer geeigneten chemischen Spezies erzeugt werden, die zuerst als ein monomolekularer Film auf die SiOx-Oberfläche aufgebracht wird. Dieses Verfahren erlaubt eine genaue Steuerung lokaler Eigenschaften der Elektrodendoppelschicht und somit der elektrokinetischen Strömung.
  • Eine Veränderung dieser fotochemischen Modulation ist die Erzeugung lateraler Gradienten in der EIS-Impedanz und somit in der Strömung, die in Reaktion auf das angelegte elektrische Feld erzeugt wird. Beispielsweise ist dies durch Steuerung der UV-Exponierung leicht erfüllt, um eine allmähliche laterale Veränderung in der Dicke des Oxids oder der Oberflächenladungsdichte einzuführen. Wie unten erläutert, dient die Steuerung lateraler Gradienten dazu, lateralen Bead-Transport zu induzieren, und ermöglicht die Implementierung solcher fundamentaler Operationen wie Einfangen und Kanalisieren (channeling) von Beads zu einem vorgegebenen Bestimmungsort entlang Leitungen in der Form von Impedanzeinrichtungen, die in die Si/SiOx-Grenzfläche eingebettet sind. Fotochemische Bemusterung von funktionalisierten chemischen Beschichtungen betrifft auch weitere Elektrodenoberflächenausführungen, einschließlich ITO.
  • III – Licht-regulierte Modulation der Grenzflächenimpedanz
  • Die räumliche und zeitliche Modulation der EIS-Impedanz in Übereinstimmung mit einem externen Beleuchtungsmuster stellt die Basis zur Steuerung der elektrokinetischen Kräfte bereit, die die Bead-Aggregation vermitteln. Die Licht-gesteuerte elektrokinetische Zusammensetzung planarer Kolloidanordnungen ermöglicht fern-interaktive Steuerung der Bildung, Anordnung und Neuordnung der Beadanordnungen in Reaktion auf entsprechende Beleuchtungsmuster und bietet dadurch einen weiten Bereich interaktiver Manipulationen von Kolloidbeads und Biomolekülen.
  • Um das Prinzip dieser Methodik zu verstehen, ist es hilfreich, sachbezogene fotoelektrische Eigenschaften von Elektroden kurz zu besprechen, oder spezieller, jene der EIS-Struktur, die durch die Elektrolytlösung (E), die isolierende SiOx-Schicht (I) und den Halbleiter (S) gebildet wird. Die fotoelektrischen Eigenschaften dieser Struktur sind eng verwandt mit denen eines Standardmetall-Isolator-Halbleiters (MIS) oder von Metall-Oxid-Halbleiter-(MOS-)-Vorrichtungen, die in S.M. Sze, „The Physics of Semiconductors", 2nd Edition, Chapt. 7 (Wiley Interscience 1981) beschrieben wurden.
  • Die Grenzfläche zwischen dem Halbleiter und der isolierenden Oxidschicht verdient besondere Aufmerksamkeit. Ausschlaggebend für das Verständnis der elektrischen Antwort der MOS-Struktur auf Licht ist das Konzept eines Raumladungsbereiches von kleiner, aber endlicher Dicke, der sich an der Si/SiOx-Grenzfläche in Gegenwart eines Bias-Potentials bildet. Im Falle der EIS-Struktur ist ein effektives Bias-Potential in der Form eines Übergangpotentials, unter allen Bedingungen, mit Ausnahme sehr spezieller, vorhanden. Der Raumladungsbereich bildet sich in Reaktion auf die Verzerrung der Halbleitervalenz und Leitungsbänder („Bandkrümmung") in der Nähe der Grenzfläche. Dieser Zustand wiederum gibt die Tatsache wieder, dass, während über die Grenzfläche ein Biaspotential besteht, in Gegenwart des isolierenden Oxids idealerweise kein Ladungstransfer erfolgt. Das heißt, in der Sprache der Elektrochemie, dass die EIS-Struktur faradaysche Effekte eliminiert. Stattdessen akkumulieren Ladungen mit entgegengesetzten Vorzeichen auf beiden Seiten der isolierenden Oxidschicht und erzeugen eine endliche Polarisation.
  • In Gegenwart eines umgekehrten Bias krümmen sich die Valenz- und Leitungsbandkanten eines n-dotierten Halbleiters nahe der Si/SiOx-Grenzschicht aufwärts und Elektronen fließen in Reaktion auf den entsprechenden Potentialgradienten aus dem Grenzflächenbereich. Als Resultat bildet sich eine Majoritätsträgersperrschicht nahe der Si/SiOx-Grenzfläche. Lichtabsorption in dem Halbleiter stellt einen Mechanismus bereit, um innerhalb dieses Bereichs Elektronenloch-Paare zu erzeugen. Vorausgesetzt, dass sie sich nicht unverzüglich rekombinieren, werden Elektronenloch-Paare durch das lokal wirkende elektrische Feld getrennt, und ein entsprechender fotoelektrischer Strom fließt. Es ist dieser letztere Effekt, der die Steuerung der elektrokinetischen Zusammensetzung der Beads in der Elektrolytlösung gestattet.
  • Um die entsprechende Frequenzabhängigkeit der Licht-induzierten Modulation der EIS-Impedanz in weiteren Einzelheiten zu verstehen, sind zwei Aspekte der Ersatzschaltung, welche die EIS-Struktur darstellt, beachtenswert. Erstens gibt es enge Analogien zwischen den genauen elektrischen Eigenschaften der elektrischen Doppelschicht an der Elektrolyt-Oxid-Grenzfläche und der Sperrschicht an der Grenzfläche zwischen dem Halbleiter und dem Isolator. Wie die Doppelschicht weist die Sperrschicht elektrische Eigenschaften ähnlich denen eines Kondensators mit einer spannungsabhängigen Kapazität auf. Wie diskutiert, dient die Beleuchtung zur Senkung der Impedanz der Sperrschicht. Zweitens lässt angesichts ihrer kapazitiv elektrischen Antwort die Oxidschicht Strom nur oberhalb einer charakteristischen („Grenzwert") Frequenz passieren. Vorausgesetzt, dass die Frequenz der angelegten Spannung den Grenzwert überschreitet, kann Beleuchtung somit die effektive Impedanz der gesamten EIS-Struktur senken.
  • Diese effektive Reduktion der EIS-Impedanz hängt auch von der Lichtintensität ab, die die Erzeugungsrate der Elektronenloch-Paare bestimmt. In der Abwesenheit signifikanter Rekombination fließt die Mehrheit der fotoerzeugten Elektronen aus der Sperrschichtregion und trägt zum fotoelektrischen Strom bei. Die verbliebene Lochladung akkumuliert an der Si/SiOx-Grenzfläche und schirmt das elektrische Feld, das in der Sperrschichtregion wirkt, ab. Als Resultat nimmt die Rekombinationsrate zu, und die Effizienz der Elektronenloch-Separation, und somit des fotoelektrischen Stroms, nimmt ab. Für gegebene Frequenz- und Amplitudenwerte der angelegten Spannung nimmt man daher an, dass mit Zunahme der Beleuchtungsintensität der Strom zunächst bis zu einem Höchstniveau ansteigt und dann abnimmt. Ebenso steigt die Impedanz zunächst bis zu einem Tiefstwert (bei maximalem Strom) an und nimmt dann ab.
  • Diese Intensitätsabhängigkeit kann vorteilhaft genutzt werden, um die laterale Verlagerung von Beads zwischen völlig exponierten und teilweise maskierten Bereichen der Grenzfläche zu induzieren. Wird die Beleuchtungsintensität erhöht, entsprechen die völlig exponierten Bereiche den Bereichen der Grenzfläche mit niedrigster Impedanz, und somit mit stärkster Strömung, und die Beads werden in diese Bereiche gezogen. Erreichen die völlig exponierten Bereiche den Zustand eines abnehmenden fotoelektrischen Stroms, kann die effektive EIS-Impedanz in diesen Bereichen die von teilweise maskierten Bereichen überschreiten, mit einer resultierenden Inversion des lateralen Strömungsgradienten. Beads werden dann aus den völlig exponierten Bereichen gezogen. Zusätzlich können zeitveränderliche Veränderungen im Beleuchtungsmuster verwendet werde, um die Beadbewegung zu bewirken.
  • IV – Integration von biochemischer Analyse in einem miniaturisierten, planaren Format
  • Die Implementation von Assays in einem planaren Anordnungsformat, insbesondere im Kontext von biomolekularem Screening und medizinischer Diagnostik, besitzt den Vorteil eines hohen Grades von Parallelität und Automatisierung, um einen hohen Durchsatz in komplexen, vielschrittigen analytischen Protokollen zu realisieren. Miniaturisierung resultiert in einer Abnahme relevanter Mischzeiten, die das geringe räumliche Ausmaß wiedergeben, sowie in einer Reduktion der erforderlichen Proben- und Reagenzienvolumen sowie des Energiebedarfs. Die Integration von biochemischen analytischen Techniken in einem miniaturisierten System auf der Oberfläche eines planaren Substrats („Chip") ergäbe substantielle Verbesserungen der Leistungsfähigkeit und eine Verringerung der Kosten von analytischen und diagnostischen Verfahren.
  • Im Kontext der DNA-Manipulation und Analyse wurden erste Schritte in diese Richtung (d.h. Miniaturisierung) unternommen, indem auf einem Glassubstrat die Restriktionsenzymbehandlung von DNA und die nachfolgende Auftrennung der enzymatischen Verdaue mittels Kapillarelektrophorese, siehe beispielsweise Ramsey, PCT Veröffentlichung Nr. WO96/04547 , dessen Inhalte durch Hinweis hierin aufgenommen sind, oder die Amplifikation von DNA-Sequenzen mittels Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit nachfolgender elektrophoretischer Auftrennung kombiniert wurden, siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5.498,392 und 5,587,128 für Wilding et al., dessen Inhalte durch Hinweis hierin aufgenommen sind.
  • Obwohl diese Standardlaborverfahren in einem miniaturisierten Format demonstriert wurden, wurden sie nicht dazu verwendet, eine vollständiges System zu bilden. Ein vollständiges System erfordert zusätzliche Manipulation wie Front-End-Probenbearbeitung, Bindungs- und Funktionsassays und die Detektion schwacher Signale mit anschließender Informationsverarbeitung. Die wahre Herausforderung ist die der vollständigen funktionalen Integration, da sich in ihr die Systemarchitektur und die Gestaltungsbeschränkungen auf individuelle Komponenten manifestieren. Zum Beispiel wird ein strömungstechnisches Verfahren benötigt, um analytische Schritte zu verketten, die die räumliche Trennung von Analytsätzen und deren anschließenden Transport zu neuen Orten erfordern. Verschiedene Möglichkeiten wurden erwogen, einschließlich elektroosmotisches Pumpen und Transport von Tröpfchen durch Temperatur-induzierte Gradienten der lokalen Oberflächenspannung. Obwohl in Demonstrationsexperimenten durchführbar, verlangen diese Techniken recht strenge Anforderungen an das Layout des Gesamtsystems, um die sehr erheblichen Gleichstromspannungen zu handhaben, die für das effiziente elektroosmotische Mischen benötigt werden, oder die Substraterwärmung zu beschränken, wenn thermisch erzeugte Oberflächenspannungsgradienten erzeugt werden, um nachteilige Auswirkungen auf Protein- und andere Proben zu vermeiden. WO-96/07917 offenbart ein selbst-adressierbares mikroelektronisches System zum Manipulieren von DNA
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung kombiniert drei getrennte funktionale Elemente, um ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, um die interaktive räumliche Manipulation von Kolloidpartikeln („Beads") und Molekülen an einer Grenzschicht zwischen einer lichtempfindlichen Elektrode und einer Elektrolytlösung in Echtzeit zu ermöglichen. Die drei funktionalen Elemente sind: die elektrofeldinduzierte Zusammensetzung von planaren Partikelanordnungen an einer Grenzschicht zwischen einer isolierenden oder einer leitenden Elektrode und einer Elektrolytlösung; die räumliche Modulation der Grenzflächenimpedanz mittels UV-vermitteltem Oxidnachwachsen oder chemischer Oberflächenbemusterung; und schließlich die interaktive Steuerung des Zustandes der Grenzflächenimpedanz durch Licht in Echtzeit. Die Fähigkeiten der vorliegenden Erfindung begründen sich in der Tatsache, dass die räumliche Verteilung von Ionenströmen, und somit der Fluidströmung, die die Anordnungszusammensetzung vermittelt, durch externen Eingriff eingestellt werden kann. Von besonderem Interesse ist die Einführung von räumlichen Ungleichmäßigkeiten in den Eigenschaften der relevanten EIS-Struktur. Wie hierin beschrieben, können solche Inhomogenitäten durch Ausnützen der physikalischen und chemischen Eigenschaften der EIS-Struktur mit entweder permanenten oder temporären Eigenschaften erzeugt werden.
  • Die Erfindung betrifft die Ausführung eines vollständigen, funktional integrierten Systems zur Implementierung von biochemischen Analysen in einem planaren, miniaturisierten Format auf der Oberfläche einer Siliziumscheibe oder eines ähnlichen Substrats. Des Weiteren können das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Materialoberflächen zu erzeugen, die ein wünschenswertes topographisches Relief und eine wünschenswerte chemische Funktionalität aufweisen, und oberflächemontierte optische Bauelemente wie Linsenanordnungen herzustellen.
  • Die Kombination der drei funktionalen Elemente stattet die vorliegende Erfindung mit einem Satz operativer Fähigkeiten aus, Beads und Beadanordnungen in einer planaren Geometrie zu manipulieren, um die Implementierung von biochemischen analytischen Techniken zu ermöglichen. Diese fundamentalen Operationen betreffen Aggregate und Partikelanordnungen wie beispielsweise: kolloidale Polymergitter, Vesikel, ganze Chromosomen, Zellen und Biomolekülen, einschließlich Proteinen und DNA, sowie Metall- oder Halbleiterkolloide und Cluster.
  • Gruppen von Kolloidpartikeln können eingefangen werden, und Anordnungen können in ausgewiesenen Bereichen auf der Elektrodenoberfläche (1a, 1b und 2a-d) gebildet werden. Partikel und die Anordnungen, die sie in Reaktion auf das angelegte Feld bilden, können entlang Leitungen jedweder Konfiguration kanalisiert werden, die entweder durch UV-Oxid-Bemusterung in die Si/SiOx-Grenzschicht eingebettet werden oder sich durch ein externes Beleuchtungsmuster ergeben. Diese Kanalisierung (1c, 1d, 1e, 3c, 3d), in einer Ausrichtung lotrecht zu der des angelegten elektrischen Feldes, beruht auf lateralen Gradienten in der Impedanz der EIS-Struktur und somit im feldinduzierten Strom. Wie hierin erläutert, können solche Gradienten durch angemessene Beleuchtungsmuster eingeführt werden, und dies stellt die Mittel bereit, eine Gate-Version (gated version) der Translokation zu implementieren (1e). Die elektrokinetische Strömung, die den Prozess der Anordnungszusammensetzung vermittelt, kann auch für die Ausrichtung gestreckter Partikel, wie beispielsweise DNA, an der Elektrodenoberfläche ausgenutzt werden. Des Weiteren erlaubt die vorliegende Erfindung die Ausführung von Verfahren zum Sortieren und Trennen von Partikeln.
  • Anordnungen von Kolloidpartikeln können in ausgewiesene Bereiche platziert werden und bleiben dort bis zur Freigabe oder zum Abbau gebunden. Die Gesamtform der Anordnungen kann sich durch UV-Oxid-Bemusterung ergeben, oder in Echtzeit, durch Formen des Beleuchtungsmusters. Diese Fähigkeit ermöglicht die Definition von funktionell distinkten, permanenten oder temporären Kompartimenten auf der Elektrodenoberfläche. Anordnungen können Änderungen der Form, auferlegt in Echtzeit, unterworfen sein, und sie können mit anderen Anordnungen vereinigt werden (1f) oder in zwei oder mehr Subanordnungen oder Cluster (1g, 4a, 4b) getrennt werden. Des Weiteren kann der lokale Ordnungsstatus der Anordnung sowie die laterale Partikeldichte durch das externe elektrische Feld umkehrbar eingestellt werden oder durch Zugabe eines zweiten, chemisch inerten Beadbestandteils modifiziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Kombination von fundamentalen Operationen, um zunehmend komplexe Erzeugnisse und Verfahren zu entwickeln. Die hierin gegebenen Beispiele beschreiben die Implementierung analytischer Verfahren, die für einen vielfältige Probleme der Materialkunde, pharmazeutischen Wirstofffindung, genomischen Kartographie und Sequenzierungstechnologie essentiell sind. Wichtig für die Integration dieser und anderer Funktionalitäten in eine planare Geometrie ist die Fähigkeit, die mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellt ist, temporäre oder permanente Kompartimentierung zu bewirken, um gleichzeitige Prozesse oder sequentielle Schritte in einem Protokoll räumlich zu isolieren, und die Fähigkeit, Partikelsätze in einer Art zu manipulieren, die die Verkettung von analytischen Verfahren, die in verschiedenen ausgewiesenen Bereichen auf den Substratoberflächen durchgeführt werden, erlaubt.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Andere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung, die in der obigen kurzen Erläuterung diskutiert wurden, werden verständlicher, wenn sie im Zusammenhang mit der folgenden ausführlichen Beschreibung einer Ausführungsform, welche nur als Veranschaulichung verstanden werden wird, und den beigefügten Zeichnungen gesehen werden, die Aspekte der
  • Ausführungsform wiedergeben, wobei:
  • 1a-h Darstellungen der fundamentalen Operationen zur Beadmanipulation sind;
  • 2a und 2b Fotografien sind, die das Verfahren der Partikeleinfangens in ausgewiesenen Bereichen auf der Substratoberfläche darstellen;
  • 2c und 2d Fotografien sind, die die Partikelausgrenzung aus ausgewiesenen Bereichen auf der Substratoberfläche darstellen;
  • 3a und 3b Darstellungen des Oxidprofils einer Si/SiOx-Elektrode sind;
  • 3c und 3d Fotografien der Kanalisierung von Partikeln entlang Leitungen sind;
  • 4a und 4b Fotografien der Teilung eines existierenden Aggregats in kleine Cluster sind;
  • 5 eine Fotografie der Linsenwirkung (lensing action) einzelner Kolloidbeads ist;
  • 6a-c Seitenansichtsdarstellungen eines Layout-bewahrenden Transferverfahrens von einer Mikrotiterplatte zu einer planaren Zelle sind;
  • 7 eine Fotografie der Einlagerung von Abstandspartikeln innerhalb von Beadclustern ist;
  • 8 eine Darstellung von Bindungsassayvariationen ist; 9a und 9b Darstellungen zweier Mechanismen der Partikelsortierung sind;
  • 10 eine Darstellung einer planaren Anordnung von Bead-verankerten Sonde-Target-Komplexen (probe target complexes) ist; und
  • 11 eine Darstellung der DNA-Streckung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die drei funktionalen Elemente der vorliegenden Erfindung können so kombiniert werden, dass ein Satz fundamentaler Operationen für die interaktive räumliche Manipulation von Kolloidpartikeln und Molekülen bereitgestellt ist, die zu planaren Aggregaten an einer Elektrodenoberfläche zusammengesetzt sind. In der folgenden Beschreibung werden fundamentale Operationen dieses „Werkzeugsatzes" in der Reihenfolge zunehmender Komplexität beschrieben. Insbesondere ist es nützlich, ein Klassifikationsschema einzuführen, das auf der Gesamtzahl von Eingängen und Ausgängen, oder „Terminals", basiert, die in eine gegebene Operation involviert sind. Zum Beispiel ist das Zusammenlegen von zwei getrennten Anordnungen, oder Partikelsätzen, zu einer eine „drei-terminale" Operation, die zwei Eingänge und einen Ausgang involviert. Die gegenteilige drei-terminale Operation, die einen Eingang und zwei Ausgänge involviert, ist die Teilung einer gegebenen Anordnung in zwei Subanordnungen.
  • Experimentelle Bedingungen, die zu den Phänomenen führen, welche in den beigefügten Fotografien dargestellt sind, sind wie folgt. Eine elektrochemische Zelle wird durch ein Paar planarer ITO-Elektroden, die aus einer auf einem Glassubstrat aufgebrachten ITO-Schicht besteht, oder durch eine Si/SiOx-Elektrode am Boden und eine ITO-Elektrode an der Oberseite, getrennt durch einen üblichen Abstand von 50 Mikrometern oder weniger, gebildet. Angesichts seiner Abhängigkeit von den fotoelektrischen Eigenschaften der Si/SiOx-Grenzschicht, basiert die Lichtsteuerung auf der Verwendung einer Si/SiOx-Elektrode. Anschlüsse in der Form von Platinkabeln werden an die ITO- und an die Siliziumelektrode, welche zuerst geätzt wurde, um das isolierende Oxid in dem Kontaktbereich zu entfernen, mittels Silberepoxidharz angebracht. Die Zelle wird zunächst zusammengesetzt und dann, beruhend auf Kapillarwirkung, mit einer Suspension von Kolloidbeads gefüllt, mit 1 oder 2 Mikrometern Durchmesser, bei einer üblichen Konzentration von 0,1% Feststoffen in 0,1 mM Azidlösung, entsprechend ca. 2 × 10^8 Partikeln pro Milliliter. Die Anzahl ist so gewählt, um zwischen ½ und 1 vollen Monoschicht von Partikeln auf der Elektrodenoberfläche zu erhalten. Anionische (z.B. carboxyliertes Polystyrol, Siliziumoxid), kationische (z.B. aminiertes Polystyrol) oder nominell neutrale (z.B. Polystyrol) wurden sämtlich verwendet, um das grundsätzliche Phänomen, das den drei funktionalen Elementen der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, zu demonstrieren. Die Siliziumelektrode wurde aus einem 1 Quadratzoll großen Abschnitt einer Silizium- (100) Halbleiterscheibe gefertigt, üblicherweise 200-250 Mikrometer dick, n-dotiert zu üblicherweise 0,01 Ohm cm spezifischem Widerstand, und bedeckt mit einem dünnen Oxid von üblicherweise 30-40 Ångström Dicke. Eine dicke Oxidschicht von üblicherweise 6000-8000 Ångström Dicke, gewachsen unter Standardbedingungen in einem Ofen bei 950 Grad C, kann durch Standardfotolithografie geätzt werden, um die Strukturen von Interesse zu bestimmen. Alternativ kann eine dünne Oxidschicht unter UV-Beleuchtung auf einer zuvor nackten Oberfläche einer (100)-Orientierung nachwachsen. Angesichts der Leichtigkeit der Implementierung und Ausführung ist das UV-vermittelte Oxidnachwachsen die bevorzugte Technik: es stellt die Mittel zur Bemusterung der Oberfläche durch Platzieren einer Quarzmaske, die das gewünschte Muster im Weg der UV-Beleuchtung wiedergibt, bereit und hinterlässt eine chemisch homogene, topografisch flache obere Oberfläche. Um nicht-spezifische Partikeladsorption an der Elektrodenoberfläche zu vermeiden, sollten stringente Reinheitsbedingungen befolgt werden, wie jene, die in den nachstehenden allgemeinen experimentellen Bedingungen dargelegt sind.
  • Die fundamentale ein-terminale Operation ist eine „Einfangen-und-Halten" Operation (1a), welche eine Partikelanordnung in einem zugewiesenen Bereich von beliebigem Umriss auf der Oberfläche bildet, die sich durch UV-vermittelte Oxidbemusterung oder durch ein entsprechendes Muster der Beleuchtung, projiziert auf eine ansonsten uniforme Si/SiOx-Substratoberfläche, ergibt. 2a und 2b stellen einen Beadfang (bead capture) auf einer Oberfläche dar, gekennzeichnet durch einen sehr dünnen Oxidbereich 22 (von ca. 20-30 Ångström Dicke) und entsprechend niedriger Impedanz, während die verbliebene Oberfläche mit dem originalen, dicken Oxid bedeckt ist, mit entsprechend hoher Impedanz. In 2a gibt es kein angelegtes Feld und somit keinen Beadfang. Dagegen ist in 2b ein elektrisches Feld angelegt (10 Vp-p Quelle, 1 kHz) und der Beadfang erfolgt innerhalb des dünnen Oxidbereichs 22. Unter diesen Umständen beginnt eine Anordnung innerhalb weniger als einer Sekunde zu wachsen und wächst während der nächsten ca. 10 Sekunden weiter, während Beads aus zunehmend größeren Distanzen eintreffen, um zum nach außen wachsenden Umfang des Bereichs 22 hinzuzufügen. Das Wachstum endet, sobald die Anordnung sich der äußeren Grenze des entworfenen Targetbereichs nähert, d.h. dem Bereich, der durch das dünne Oxid bestimmt ist, das eine niedrige Impedanz aufweist. Der interne Ordnungszustand des eingefangenen Beadaggregats wird durch die Stärke der angelegten Spannung bestimmt, wobei höhere Werte zunehmend dichtere Packung der Beads und die eventuelle Bildung geordneter Anordnungen begünstigen, die eine hexagonale kristalline Konfiguration in der Form eines Blasenteppichs (bubble raft) aufweisen. Die Anordnung verbleibt an der Stelle, solang die angelegte Spannung vorhanden ist. Die Entfernung der angelegten Spannung führt zur Disassemblierung der Anordnung.
  • Die „Fangen-und-Halten"-Operation kann auch unter Beleuchtung mit sichtbarem oder infrarotem Licht implementiert werden, zum Beispiel durch einfaches Projizieren einer Maske, gemustert in dem gewünschten Layout, auf die Si/SiOx-Elektrode. Für diesen Zweck wurde eine gewöhnliche 100 W-Quarzmikroskopbeleuchtungseinrichtung an einem Zeiss-UEM-Mikroskop verwendet, mit Aperturen oder Masken, eingebracht in die Zwischenbildebene, um die benötigte Form in der Ebene der Elektrode bereitzustellen (bei richtigem Fokussieren unter Beleuchtungsbedingungen nach Koehler). Alternativ wurde außerdem eine IR-Laserdiode mit einer Leistung von 3 mW bei 650-680 nm verwendet. Eine einfache Modifikation des Einschlussmusters wird eher durch die Verwendung externer Beleuchtung als durch die Oxidbemusterung zum räumlichen Einschluss von Partikeln ermöglicht.
  • Zum „Fangen-und-Halten" gehört die ein-terminale Operation des „Ausschließen-und-Halten" (1b), welche Partikel aus einem ausgewiesenen Bereich auf der Oberfläche beseitigt. Eine Zunahme der Frequenz der angelegten Spannung auf ca. 100 kHz führt zur Inversion der Präferenz der Partikel, welche sich in dem dünnen Oxidteil der Oberfläche zusammensetzen (z.B. Bereich 22, 2b) und stattdessen Strukturen bilden, die das Äußere des Targetbereichumfangs dekorieren. Statt sich auf diesen Effekt zu verlassen, wird der Ausschluss von Partikeln aus den gewünschten Bereichen auch, in Analogie zur ursprünglichen „Fangen-und-Halten"-Operation, durch einfaches Einbetten der entsprechenden Struktur in die Si/SiOx-Grenzfläche mittels UV-vermittelten Oxidnachwachsens erreicht. In dem Beispiel aus 2c und 2d wird dies unter Bedingungen, die bezüglich 2a und 2b ansonsten identisch mit den oben beschriebenen sind, durch Anlegen von 20 V (pp) bei 10 kHz erreicht. Während die Oxiddicke in den nicht-ausgewiesenen Bereichen 24 ca. 30 Ångström beträgt, ist der Wert in den ausgewiesenen viereckigen Bereichen 26 ca. 40 Ångström, was eine entsprechend höhere Impedanz bei der angelegten Spannung bedeutet.
  • Die „Fangen-und-Halten"-Operation ermöglicht die räumliche Kompartimentierung der Substratoberfläche in funktionell distinkte Bereiche. Zum Beispiel können Partikel chemisch distinkter Art, die in die elektrochemische Zelle zu verschiedenen Zeiten eingebracht wurden oder in verschiedenen Stellen eingespeist wurden, durch Anwendung dieser Operation an räumlich isolierten Stellen gehalten werden.
  • Die fundamentale „zwei-terminale" Operation ist die Translokation (1c), oder der gesteuerte Transport eines Satzes von Partikeln von Stelle O zu Stelle F auf der Oberfläche; dort sind O und F Zielbereiche, bei denen die oben beschriebenen ein-terminalen Operationen angewandt werden können. Der ein-dimensionale, laterale Beadtransport, der bei der Translokation verwendet wird, wird erreicht, indem ein lateraler Strom entlang einer Leitung auferlegt wird, die die Bereiche O und F verbindet, wie in 3a und 3b dargestellt, oder durch Projektion eines entsprechenden linearen Beleuchtungsmusters. Bei dieser Kanalisierungsoperation bewegen sich Beads gemäß der zugrunde liegenden elektrokinetischen Strömung in die Richtung der geringeren Impedanz, in die Richtung des Pfeils, dargestellt in 3a und 3b.
  • Oxidbemusterung kann auf zwei Wegen angewendet werden, um einen lateralen Strom entlang der Si/SiOx-Grenzfläche zu erzeugen. Das einfachste Verfahren ist in 3c dargestellt und zeigt einen großen offenen Haltebereich 32, der durch drei schmale Leitungen 34 versorgt wird, die durch Ätzung eines Thermaloxids bestimmt werden. Beads bewegen sich zum Haltebereich 32 entlang der schmalen Leitungen 34, um eine Beadanordnung zu bilden. 3d ist eine Ansicht der Anordnung aus 3c in Großmaßstab. Das Prinzip, das in der Transporterzeugung angewandt wird, ist das des Wechsels des Streckungsverhältnisses (schmale Leitung verbunden mit breitem Haltebereich) des eingebetteten Musters mit konstanten Werten für die innere dünne Oxiddicke und das äußere dicke Oxid, wie in 3a dargestellt. In den 3c und 3d war die angelegte Spannung 10 V (pp) bei 10 kHz. Ein alternativer Ansatz zum Erzeugen eines Beadtransports, ermöglicht durch UV-vermitteltes Oxidnachwachsen, ist es, die Oxiddicke entlang der Leitungen in einer gesteuerten Weise zu verändern. Dies ist leicht durch UV-Belichtung durch einen Verlauffilter zu erreichen. Unterschiede in der Oxiddicke zwischen O und F von so wenig wie 5-10 Ångström genügen, um lateralen Transport hervorzurufen. In dieser Situation braucht das Streckungsverhältnis der Leitung und der Haltebereiche nicht verändert zu werden. Dies ist in 3b dargestellt.
  • Die Verwendung externer Beleuchtung, um Leitungen durch Veränderung der Beleuchtungsintensität entlang der Leitung zu bestimmen, um den erforderlichen Impedanzgradienten zu erzeugen, hat den Vorteil, dass die Leitung nur eine temporäre Struktur darstellt und dass die Bewegungsrichtung, falls gewünscht, modifiziert oder umgekehrt werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt Mechanismen des Licht-vermittelten aktiven linearen Transports von planaren Aggregaten von Beads unter interaktiver Steuerung bereit. Dies wird durch Anpassung eines externen Beleuchtungsmusters in Echtzeit entweder durch Bewegung des Musters über die Substratoberfläche, so dass die beleuchtete Beadanordnung mitgezogen wird, erreicht, oder durch elektronische Modulation der Form des Musters, um Bewegung der Partikel zu induzieren.
  • Zwei Arten des Licht-vermittelten aktiven Transports sind:
    • i) Direkte Translokation („Traktorstrahl"), welche ein Verfahren zur Translokation von Anordnungen und zum Strukturieren ihrer Gesamtform durch Anpassung von Parametern ist, so dass in beleuchteten Oberflächenbereichen Partikelzusammensetzung begünstigt wird, wie hierin beschrieben. Anordnungen folgen einfach dem auferlegten Muster. Die Bewegungsrate ist durch die Partikelbeweglichkeit in dem Fluid beschränkt und hängt somit von dem Partikeldurchmesser und der Fluidviskosität ab.
    • ii) Transverse Anordnungsbeschränkung ist ein Beadtransportmechanismus, der mit peristaltischem Pumpen von Fluiden durch flexible Schläuche verwandt ist. Die Lichtsteuerungskomponente der vorliegenden Erfindung kann zur einfachen Implementierung dieses sehr allgemeinen Konzepts verwendet werden. Ein planares Aggregat von Beads mit mehreren Komponenten ist, falls gewünscht durch UV-Bemusterung oder einfach durch Licht auf einen rechteckigen Kanal begrenzt. Durch Diffusion können Beads sich entlang des Kanals frei bewegen (in beide Richtungen). Ein Beleuchtungsmuster, das dem transversen Kanalausmaß entspricht, wird gebildet und dann zeitlich verändert, um eine Wanderwelle mit Transversalbeschränkung, die sich in eine Richtung entlang des Kanals bewegt, zu erzeugen. Eine solche Beschränkungswelle kann auf verschiedene Weisen gebildet werden. Ein konzeptionell einfaches Verfahren ist es, eine beschränkende Maske auf die Probe zu projizieren und das projizierte Maskenmuster in der gewünschten Weise zu bewegen. Dieses Verfahren kann ferner elektronisch durch Steuerung des Beleuchtungsmusters einer geeigneten Lichtquellenanordnung implementiert werden, um somit die Notwendigkeit von beweglichen Teilen in der Optik zu vermeiden.
  • Die Steuerung des lateralen Beadtransports durch Änderung oder Bewegung von Beleuchtungsmustern hat den Vorteil, dass sie wann immer und wo immer notwendig (auf einer gegebenen Substratoberfläche) angewendet werden kann, ohne die Notwendigkeit, Impedanzgradienten durch vorgegebene UV-Bemusterung aufzuerlegen. Andererseits kann ein vorgegebenes Impedanzmuster weitere Fähigkeiten in Verbindung mit der Licht-Steuerung bereitstellen. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, Beads entgegen einem Substrateingebetteten Impedanzgradienten zu transportieren, um Beads aufgrund von Beweglichkeit zu trennen.
  • Leitungen, die O und F miteinander verbinden, müssen nicht geradlinig sein: wie bei Schienen, die die Bewegung von Zügen bestimmen, können Leitungen in jedweder gewünschten Art und Weise geformt sein (1d). Eine Gate-Version der Translokation (1e) erlaubt den Partikeltransport von O nach F nur nachdem die Leitung durch ein Gate-Signal (gated signal) geöffnet wird (oder in Echtzeit gebildet wird). Diese Operation wendet die UV-Oxidbemusterung an, um zwei Haltebereiche, O und F, und ferner die Lichtsteuerung aufzubauen, um temporär eine Leitung, die O und F miteinander verbindet, aufzubauen. Eine alternative Implementierung basiert auf einem Oxid-eingebetten Impedanzgradienten. Eine Zone entlang der Leitungen wird mit ausreichend hoher Intensität beleuchtet, um Partikel fernzuhalten und dadurch den Durchtritt zu sperren. Entfernung (oder Reduktion der Intensität) der Beleuchtung öffnet die Leitung. Im ersteren Fall ermöglicht Licht den Transport der Beads, während im letzteren Fall Licht den Transport der Beads verhindert.
  • Die fundamentalen drei-terminalen Operationen sind das Zusammenlegen und Trennen von Sätzen oder Anordnungen von Beads (1f und 1g). Das Zusammenlegen von zwei Anordnungen (1f) schließt ein: die vorhergehenden zwei fundamentalen Operationen des „Fangen-und-Halten", angewandt auf zwei räumlich isolierte Beadsätze in den Plätzen O1 und O2, und ihr jeweiliges Kanalisieren entlang zusammenlaufender Leitungen in einen gemeinsamen Zielbereich, und ihr letztendliches Kanalisieren, nach dem Mischen oder einer chemischen Reaktion, zum finalen Zielort, einem dritten Haltebereich, F. Dies wird unter den oben angegebenen Bedingungen durch Anwenden ein-terminaler und Gate-gesteuerter (gated) zwei-terminaler Operationen erreicht.
  • Das Auftrennen einer Anordnung in zwei Subanordnungen (1g) ist ein spezieller Fall einer allgemein komplexeren Sortierungsoperation. Sortierung schließt die Einordnung von Beads in einem gegebenen Satz oder einer gegebenen Anordnung zu einer Untermenge oder zwei Untermengen ein, beispielsweise gemäß ihrer Fluoreszenzintensität. Im einfacheren speziellen Fall soll eine gegebene Anordnung, gehalten in Bereich O, in zwei Subanordnungen entlang einer Demarkationslinie getrennt werden, und die Subanordnungen sollen zu den Zielbereichen F1 und F2 geleitet werden. Unter den oben angegebenen Bedingungen wird dies durch Anwendung der „Fangen-und-Halten"-Operation auf die Anordnung O erreicht. Leitungen verbinden O mit F1 und F2. Hochintensitätsbeleuchtung entlang einer eng fokussierten Linie dient dazu, die Anordnung in einer bestimmten Art und Weise aufzuteilen, wiederum auf Gate-gesteuerter Translokation beruhend, um den Transport entlang der Leitungen weg von dem Haltebereich O zu steuern. Eine noch einfachere Ausführung, genannt unterschiedslose Teilung, ordnet Partikel zufällig F1 und F2 durch Gate-gesteuerte Translokation der Anordnung in O zu P1 und F2 zu, nachdem Leitungen wie oben beschrieben geöffnet werden.
  • 4a und 4b stellen eine Variante dar, bei welcher Beads im Bereich O (4a) in vielfache Bereiche F1, F2, ... Fn (4b) geteilt werden. Diese reversible Teilung eines Aggregats oder einer Anordnung in n Subanordnungen, oder Cluster, wird bei carboxylierten Polystyrolkugeln von 2 Mikrometern Durchmesser bei einer Konzentration entsprechend einer Elektrodenumhüllung eines kleinen Teils einer Monoschicht, bei einer Frequenz von 500 Hz, durch Erhöhung der angelegten Spannung von üblicherweise 5 V (pp) auf 20 V (pp) erreicht. Diese Fragmentierung einer Anordnung in kleinere Cluster gibt die Auswirkung einer feldinduzierten Partikelpolarisation wieder. Die Teilung ist nützlich, um Partikel einer Anordnung über einen größeren Substratbereich zur Präsentation für mögliche Analyten in Lösung zu verteilen, und zum nachfolgenden Scannen der einzelnen Cluster mit analytischen Instrumenten, um einzelne Messungen durchzuführen.
  • Die drei hierin beschriebenen funktionalen Elemente der vorliegenden Erfindung können außerdem kombiniert werden, um zusätzliche fundamentale Operationen zu erhalten, um die Ausrichtung anisotroper Objekte zu steuern, die in der elektroosmotischen Strömung eingebettet sind,, welche durch das angelegte elektrische Feld an der Elektrodenoberfläche erzeugt wird. Die Ausrichtung der Strömung in der Ebene des Substrats wird durch Impedanzgradienten gesteuert, die in der Weise gestaltet sind, wie im Zusammenhang mit der Kanalisierunsoperation beschrieben. Dies wird verwendet, um kontrollierbar anisotrope Objekte auszurichten, wie in 1h dargestellt, und kann angewendet werden, um Biomoleküle wie beispielsweise DNA zu strecken und auszurichten.
  • Eine zusätzliche fundamentale Operation, die den vorhergehenden Satz ergänzt, ist die einer permanenten Verankerung einer Anordnung an das Substrat. Dies wird am besten durch Anwendung von Ankerchemien erreicht, die analog zu jenen sind, die auf heterobifunktionalen Vernetzungsmitteln beruhen, welche angewendet werden, um Proteine durch Amidbindungsausbildung zu verankern. Molekulare Erkennung, zum Beispiel zwischen biotinylierten Partikeln und Oberflächen-verankertem Streptavidin, stellt ein weitere Klasse der Kopplungschemien zur Permanentverankerung dar.
  • Allgemeine experimentelle Bedingungen
  • Die funktionalen Elemente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, namentlich die elektrofeldinduzierte Zusammensetzung planarer Partikelanordnungen, die räumliche Modulation der Grenzflächenimpedanz mittels UV-vermittelter Oxid- oder chemischer Oberflächenbemusterung und schließlich die Kontrolle über den Status der Grenzflächenimpedanz durch Licht, wurden in experimentellen Studien gezeigt. Diese Studien verwendeten n-dotierte Siliziumhalbleiterscheiben (spezifische elektrische Widerstände im Bereich von 0,01 Ohm cm), bedeckt mit entweder thermisch gewachsenen Oxidschichten von mehreren tausend Ångström Dicke oder dünnen Oxidschichten, nachgewachsen nach Entfernung des ursprünglichen „nativen" Oxids in HF unter UV-Beleuchtung aus einer Deuteriumquelle in Gegenwart von Sauerstoff zu einer typischen Dicke zwischen 10 und 50 Ångström. Zur lithographischen Bemusterung von thermisch gewachsenem Oxid wurden Standardverfahren verwendet, die auf einer Labortischplatte (anstatt in einem Reinraum) implementiert werden, um Merkmale im Bereich von mehreren Mikrometern zu erzeugen.
  • Oberflächen wurden sorgfältig unter Einhaltung des Industriestandards RCA und von Piranha-Reinigungsprotokollen gereinigt. Substrate wurden in Wasser aufbewahrt, das vor der Verwendung mit einem Millipore Reinigungssystem aufbereitet wurde. Oberflächen wurden durch Messung des Kontaktwinkels charakterisiert, den ein 20 Mikroliter großes, auf der Oberfläche platziertes und (von der Seite) durch ein Teleskop betrachtetes Wassertröpfchen aufweist. Der Kontaktwinkel ist definiert als der Winkel, der durch die Oberfläche und die Tangente zur Tröpfchenkontur (in Seitenansicht) am Kontaktpunkt mit der Oberfläche gebildet (subtended) wird. Zum Beispiel würde eine perfekt hemisphärische Tröpfchenform einem Kontaktwinkel von 90 Grad entsprechen. Chemische Oberflächenderivatisierung mit Mercapto-Propyl-Trimethoxysilan (2% in trockenem Toluol) erzeugte Oberflächen mit typischen Kontaktwinkeln von 70 Grad. Oxidation der terminalen Thiolfunktionalität unter UV-Bestrahlung in der Gegenwart von Sauerstoff verringerte den Kontaktwinkel in weniger als 10 min Belichtung mit UV aus der Deuteriumquelle auf null. Andere Silanreagenzien wurden auf ähnliche Weise verwendet, um hydrophobe Oberflächen zu erzeugen, die durch Kontaktwinkel von mehr als 110 Grad gekennzeichnet sind.
  • Einfache elektrochemische „Sandwich" Zellen wurden durch Verwendung von Kapton-Film als Abstandshalter zwischen Si/SiOx und leitendem Indium-Zinnoxid (ITO) gebildet, die auf einem dünnen Glassubstrat aufgetragen wurden. Kontakte zu Platinanschlüssen wurden mit Silberepoxidharz unmittelbar an der Spitze der ITO-Elektrode und der (von Oxid freien) Rückseite der Si-Elektrode hergestellt. In dieser Zwei-Elektroden-Konfiguration wurden Wechselstromfelder durch einen Funktionsgenerator, mit angelegten Spannungen im Bereich bis zu 20 V und wechselnden Frequenzen von Gleichstrom bis 1 MHz, erzeugt, wobei Hochfrequenzen die Bildung von Partikelketten begünstigen, die die Elektroden verbinden. Ströme wurden mit einem Potentiostat überwacht und von einem Oszilloskop angezeigt. Vorteilhafterweise verwendeten Epifluoreszenz sowie Reflexions-Differential-Interferenzkontrastmikroskopie Laserbeleuchtung. Licht-induzierte Modulationen der EIS-Impedanz wurden ebenfalls mit einer einfachen 100 W-Mikroskopbeleuchtungseinrichtung sowie einer 3 mW-Laserdiode erzeugt, die Licht bei 650-680 nm emittierte.
  • Es wurden Kolloidbeads, sowohl anionische und kationische als auch nominell neutrale, mit einem Durchmesser im Bereich von mehreren hundert Ångström bis 20 Mikrometern verwendet, die in einer NaN2-Lösung gelagert wurden.
  • Es wurde genau auf kolloidale Stabilität geachtet, um nicht-spezifische Interaktionen zwischen Partikeln und zwischen Partikeln und der Elektrodenoberfläche zu vermeiden. Bakterielle Kontamination kolloidaler Suspensionen wurde sorgfältig vermieden.
  • Typische Betriebsbedingungen, die, sofern nicht anders angegeben, die meisten der hierin beschriebenen Ergebnisse erzeugten, waren: 0,2 mM NaN2 (Natriumazid-) Lösungen, die Partikel bei einer Konzentration beinhalten, so dass beim Aufbringen auf die Elektrode nicht mehr als eine vollständige Monoschicht Partikel wird; angelegte Gleichstrompotentiale im Bereich von 1-4 V und Wechselstrompotentiale im Bereich von 1-10 V (Spitze-zu-Spitze) und 500 Hz-10 kHz, mit einem Elektrodenabstand von 50 Mikrometern; anionische (carboxyliertes Polystyrol) Beads von 2 Mikrometern Durchmesser, sowie (nominell neutrale) Polystyrolbeads von 2-20 Mikrometern Durchmesser.
  • Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann in mehreren verschiedenen Bereichen Verwendung finden, von denen Beispiele im Detail diskutiert werden. Jedes Beispiel beinhaltet Hintergrundinformationen, gefolgt von der Anwendung der vorliegenden Erfindung für diese besondere Anwendung.
  • Beispiel I – Herstellung von Oberflächen und Beschichtungen mit gestalteten Eigenschaften
  • Die vorliegende Erfindung kann zur Herstellung planarer Oberflächen und Beschichtungen mit gestalteten Eigenschaften verwendet werden. Insbesondere ermöglichen die funktionalen Elemente der vorliegenden Erfindung die Bildung von Anordnungen, die aus Partikeln eines weiten Bereiches von Größen (ca. 100 Ångström bis 10 Mikrometer) und chemischer Zusammensetzung oder Oberflächenfunktionalität in Reaktion auf Wechselstrom- oder Gleichstromfelder. Diese Anordnungen können in ausgewiesenen Bereichen des Substrats platziert und umgrenzt werden, und der Abstand zwischen den Partikeln und der interne Ordnungsstatus in der Anordnung können durch Einstellen des angelegten Feldes vor dem Verankern der Anordnung an das Substrat gesteuert werden. Die neu gebildeten Oberflächen zeigen vor-gestaltete mechanische, optische und chemische Eigenschaften, und sie können durch nachfolgende Behandlung wie z.B. chemische Vernetzung weiterer Modifikation unterzogen werden.
  • Vornehmlich die mechanische und/oder chemische Modifikation von Oberflächen und Beschichtungen bestimmt die Interaktion zwischen Materialien in einem weiten Bereich von Anwendungen, die von geringer Adhäsion (z.B., die bekannten „klebefreien" Oberflächen, die bei Haushaltswaren von Bedeutung sind) oder geringer Reibung (z.B., um den Verschleiß von Computerfestplatten zu reduzieren), Hydrophobie (die Tendenz, Wasser abzuweisen, z.B. von bestimmten Textilwaren), katalytischer Aktivität oder spezifischer chemischer Funktionalität abhängig sind, um entweder molekulare Interaktionen mit Oberflächen zu unterdrücken oder sie zu fördern. Der letztere Bereich ist von besonderer Bedeutung für die Entwicklung von verlässlichen und langlebigen Biosensoren und bioelektronischen Vorrichtungen. Zuletzt hängt eine große Anzahl Anwendungen von Oberflächen mit festgelegter Topographie und/oder chemischer Funktionalität ab, um als Matrizen zu wirken, die die Wachstumsmorphologie der aufgetragenen Materialien steuern, oder als „Befehlsoberflächen", die die Ausrichtung von optisch aktiven Molekülen in aufgetragenen dünnen organischen Filmen steuern, wie in Flüssigkristallanzeigeanwendungen.
  • Umfangreiche Forschung wurde der Bildung von Oberflächen durch Adsorption von dünnen organischen Filmen bekannter Zusammensetzung aus der Flüssig- oder Gasphase durch verschiedene Verfahren gewidmet. Ungeachtet ihrer scheinbaren Einfachheit und weit verbreiteten Verwendung können diese Verfahren beim Erzielen von verlässlichen und reproduzierbaren Ergebnissen schwer zu handhaben sein. Zudem sind molekulare Filme nicht gut dazu geeignet, Oberflächen zu erzeugen, die eine ebenmäßige Topographie aufweisen.
  • Ein alternativer Ansatz zum Problem ist die Modifikation leitender Oberflächen durch elektrophoretische Abscheidung von in Suspension vorliegenden Partikeln. Dies ist eine weit verwendete Technik im industriellen Rahmen, um Lackierungen von Metallteilen herzustellen und Phosphor für Bildschirme abzuscheiden. Der aktive Abscheidungsprozess erhöht signifikant die Kinetik der Formierung (im Gegensatz zur passiven Adsorption von organischen Filmen aus Lösungen), eine wichtige Erwägung in praktischen Anwendungen. Elektrophoretische Abscheidung benötigt hohe elektrische Gleichstromfelder und erzeugt Schichten, in welchen Partikel permanent an der Oberfläche adsorbiert werden. Während Partikel in auf diese Art aufgetragenen Monoschichten üblicherweise zufällig verstreut werden, ist die Bildung von polykristallinen Monoschichten auch von kleinen (150 Ångström) Goldkolloiden auf Carbon-beschichteten Kupfergittern ebenfalls bekannt. In den meisten Anwendungen ist jedoch die Verwendung Carbonbeschichteter Kuperfergitter nicht wünschenswert.
  • Im Stand der Technik wurden Verfahren für die Bildung geordneter planarer Partikelanordnungen unter bestimmten Bedingungen beschrieben. Zum Beispiel ist die Bildung geordneter kolloidaler Anordnungen in Reaktion auf elektrische Wechselstromfelder an leitenden Indium-Zinnoxid-(ITO-)-Elektroden bekannt. Die resultierten Schichten wurden jedoch aus kleinen Flicken geordneter Anordnungen gebildet, die zufällig über die Oberfläche des ansonsten blanken ITO-Substrats verteilt waren. Ferner wurden vorher Anordnungen monodisperser Kolloidbeads und globulärer Proteine unter Verwendung von konvektiver Strömung und Kapillarkräften hergestellt. Dieses letztere Verfahren hat jedoch den Nachteil, abgeschiedene Partikelanordnungen immobilisiert und luftexponiert zurückzulassen, was die Modifizierung von Anordnungen durch nachfolgende Flüssigphasenchemie erschwert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bildung planarer Anordnungen mit präziser Kontrolle über die mechanischen, optischen und chemischen Eigenschaften der neu erzeugten Schicht bereit. Dieses Verfahren besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Diese ergeben sich aus der Kombination von Wechselstromfeld-induzierter Anordnungsformierung auf isolierenden Elektroden (Si/SiOx), die durch UV-vermitteltes Oxidnachwachsen bemustert werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Bildung geordneter planarer Anordnungen aus der Flüssigphase (in welcher Partikel ursprünglich in Suspension vorliegen) in ausgewiesenen Positionen, und gemäß einem gegebenen Gesamtumriss. Dies beseitigt die oben ausgewiesenen Nachteile des Stands der Technik, d.h. Trockenzustand, uneinheitliche oder keine Topographie, zufälliges Platzieren innerhalb eines Aggregats, Partikelimmobilisierung und unkontrolliertes, zufälliges Platzieren geordneter Flicken auf dem Substrat.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass Anordnungen durch das angelegte elektrische Feld in einer flüssigen Umgebung erhalten bleiben. Dieser Prozess hinterlässt die Anordnung in einem Zustand, der leicht disassembliert, weiterer chemischer Modifikation wie z.B. Vernetzung unterzogen oder durch chemische Verankerung an das Substrat dauerhaft ausgebildet werden kann. Weiterhin ist die flüssige Umgebung günstig, um die einwandfreie Funktion vieler Proteine und supramolekularer Proteinzusammensetzungen, aus denen Anordnungen bestehen können, zu gewährleisten. Zudem ermöglicht es die nachfolgende Flüssigphasenabscheidung zusätzlicher Molekülschichten (durch chemisches Binden an Beads oder Proteinen in der abgeschiedenen Schicht), das zyklische Durchlaufen der Anordnungen von Zuständen unterschiedlicher Dichte und interner Ordnung (einschließlich der völligen Disassemblierung der Anordnung) in Reaktion auf elektrische Felder und die chemische Vernetzung von Partikeln in zwei-dimensional verbundenen Schichten, oder Gelen, beispielsweise gebildet aus chemisch funktionalisierten Silicakugeln. Die vorliegende Erfindung kann auf isolierenden Elektroden wie z.B. Oxid-bedecktem Silizium ausgeführt werden, um faradaysche Prozesse zu minimieren, die chemische Reaktionen nachteilig beeinflussen könnten, welche im Gelbildungsprozess oder in der Verankerung der Anordnung an das Substrat involviert sind. Die Verwendung von Si/SiOx-Elektroden ermöglicht zudem die Steuerung der Anordnungsplatzierung durch externe Beleuchtung.
  • Die Bildung von Kolloidanordnungen bestehend aus kleinen Partikeln gemäß der vorliegenden Erfindung stellt einen Weg zur Erzeugung von Oberflächen mit Reliefstruktur im Ausmaß des Partikeldurchmessers bereit. Neben ihren optischen Eigenschaften sind solche „mikrorauhen" Oberflächen als Substrate für die Abscheidung von DNA von Interesse, solchermaßen, dass sterische Zwänge verringert und somit ein Enzymzugang ermöglicht wird.
  • Partikel, für die die Erfindung Anwendung findet, schließen Silicakugeln, Polymerkolloide, Lipidvesikel (und ähnliche Zusammensetzungen) ein, die Membranproteine wie Bakteriorhodopsin (bR) eine Licht-getriebene Protonenpumpe, die in der Form von Membranflicken und -Scheiben oder Vesikeln extrahiert werden kann, enthalten. Strukturierte und funktionalisierte Oberflächen, bestehend aus fotoaktiven Pigmenten, sind im Zusammenhang des Bereitstellens von Elementen planarer optischer Vorrichtungen zur Entwicklung innovativer Anzeigen- und Speichertechnik von Interesse. Weitere Bereiche mit möglicher Bedeutung für topographisch strukturierte und chemisch funktionalisierte Oberflächen sind die Herstellung von Matrizenoberflächen zur kontrollierten Kristallkeimbildung der durch Abscheidung wachsenden Schicht und Befehlsoberflächen zur Flüssigkristallausrichtung. Die vorliegende Erfindung ermöglicht zudem die Herstellung von zufällig heterogenen Verbundwerkstoffoberflächen. Zum Beispiel erzeugt die Bildung von Anordnungen, die aus einer Mischung von gleichgroßen hydrophoben und hydrophilen Beads bestehen, eine Oberfläche, deren Benetzungs- und Schmierungseigenschaften durch die Beschaffenheit der abgeschiedenen gemischten Beadanordnung gesteuert werden können. Auf diese Weise ist die Lage der einzelnen Beads zufällig, aber der relative Anteil jeden Beadtyps innerhalb der Anordnung ist steuerbar.
  • Beispiel II – Zusammensetzung von Linsenanordnungen und optischen Strahlenbeugungselementen
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um Linsenanordnungen und andere oberflächenmontierte optische Elemente wie beispielsweise Beugungsgitter herzustellen. Die funktionalen Elemente der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Platzierung und die Umgrenzung dieser Elemente an ITO, was die Integration mit existierender Anzeigentechnik ermöglicht, und an Si/SiOx, was die Integration mit existierender Silizium-basierter Vorrichtungstechnik ermöglicht.
  • Silica- oder andere Oxidpartikel, Polymerlatexbeads oder weitere Objekte mit hohem Brechungsindex, die in einer wässrigen Lösung suspendiert sind, brechen Licht. Geordnete planare Beadarrays beugen zudem sichtbares Licht, wobei ein kennzeichnendes Beugungsmuster scharfer Punkte erzeugt wird. Dieser Effekt bildet die Basis holographischer Techniken bei Anwendungen optischer Informationsverarbeitung.
    • A – Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Anordnungen lichtbrechender Kolloidbeads als Lichtsammelelemente in planaren Anordnungsformaten in Verbindung mit der Detektion geringer Lichtstärke und der CCD-Bildgebung bereit. CCD und ähnliche Flächendetektionssysteme werden von der erhöhten Lichtsammeleffizienz in Festphasenfluoreszenz- oder Lumineszenz-Bindungsassays profitieren. Dieses Assayformat beruht auf der Detektion eines Fluoreszenzsignals, das das Binden von Sonden (grobes) an Bead-verankerte Targets nahe dem Detektor anzeigt. Um den Durchsatz zu maximieren, ist es wünschenswert, simultan so viele Bindungsereignisse wie möglich zu beobachten. An dieser Stelle ist die Anordnungsformierung durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders nützlich, da es die Platzierung und dichte Packung von Beads im Zielbereich ermöglicht, der durch den CCD-Detektor überwacht wird, und gleichzeitig den zusätzlichen Vorteil einer Linsenwirkung und der resultierenden Zunahme der Lichtsammeleffizienz. Erhöhte Sammlungseffizienz wurde in Experimenten gezeigt, die einzelne, große (10 Mikrometer Durchmesser) Polystyrolbeads als Linsenelemente verwendeten, um kleine (1 Mikrometer Durchmesser) fluoreszierende Polystyrolbeads abzubilden. Unter den oben dargelegten experimentellen Bedingungen induzierte eine angelegte Spannung von 5 V (pp) bei 300 Hz innerhalb einer Sekunde die Ansammlung von kleinen Partikeln unter einzelnen großen Beads. Dies wird in 5 dargelegt, in der allein kleine Beads, z.B. 52, dunkel erscheinen, wohingegen kleine Beads, z.B. 54, geschart unter einem großen Bead 56 heller und vergrößert erscheinen. Die kleinen Beads zerstreuen sich wieder, sobald die Spannung abgeschaltet wird.
    • B – Die Verwendung von Kolloidbeadanordnungen als Beugungsgitter und somit als holographische Elemente ist bereits bekannt. Beugungsgitter haben die Eigenschaft, Licht über einen engen Wellenlängenbereich zu beugen, so dass für einen gegebenen Einfallswinkel und eine gegebene Wellenlänge des Beleuchtungslichtes die Anordnung nur eine spezifische Wellenlänge passieren lässt (oder ein schmales Wellenlängenband, zentriert auf den nominalen Wert), die durch die Abstände zwischen den Partikeln bestimmt wird. Weithin diskutierte Anwendungen von Beugungsgittern reichen von einfacher Wellenlängefilterung zu der anspruchsvolleren Ausführung räumlicher Filter und verwandter holographischer Elemente, die bei der optischen Informationsverarbeitung essentiell sind. Die vorliegende Erfindung sorgt für ein schnelles und gut kontrolliertes Verfahren, planare Anordnungen in einem kristallinen Ordnungszustand auszubilden, welche als oberflächenmontierte optische Beugungselemente wirken. Zudem können die resultierenden Oberflächen so gestaltet werden, dass sie ein topographisches Relief aufweisen, um wellenlängenselektives Reflexionsvermögen zu erhöhen. Diese Anordnungen können in ausgewiesenen Bereichen auf einer Substratoberfläche gebildet werden. im Gegensatz zum langsamen und umständlichen Verfahren nach dem Stand der Technik, solche Anordnungen durch Bildung von Gleichgewichtskristallen in wässrigen Lösungen mit geringem Salzgehalt herzustellen, stellt die vorliegende Erfindung einen neuen Ansatz bereit, schnell und zuverlässig Partikelanordnungen an einer fest-flüssigen Grenzschicht zu erzeugen. Dieser Ansatz beruht auf der feldinduzierten Anordnungsformierung zum Auslösen des Verfahrens und auf der UV-vermittelten Bemusterung oder Lichtsteuerung, um die Anordnungen zu positionieren und zu formen. Zudem können der Abstand zwischen den Partikeln und der interne Ordnungsstatus, und somit die Beugungseigenschaften der Anordnung durch Einstellen des angelegten elektrischen Felds fein abgestimmt werden. Beispielsweise wandelt ein feldinduzierter, reversibler Übergang zwischen Ordnung und Unordnung in der Anordnung das Beugungsmuster von einem aus scharfen Punkten bestehenden zu einem aus einem diffusen Ring bestehenden um. Das Zusammensetzen solcher Anordnungen auf der Oberfläche von Siliziumhalbleiterscheiben, wie hierin beschrieben, stellt ein unmittelbares Verfahren zur Integrierung in existierende mikroelektronische Gestaltungen bereit. Anordnungen können durch chemisches Verbinden an die Substratoberfläche oder, beruhend auf van der Waals Anziehung zwischen Beads und Substrat in ihrer Position arretiert werden.
  • Beispiel III – Ein neuer Mechanismus zur Ausführung eines Partikel-basierten Displays
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Elemente zum Implementieren lateraler Partikelbewegung als einen neuen Ansatz zur Ausführung eines Partikel-basierten Displays bereit. Die Elemente der vorliegenden Erfindung sorgen für die Steuerung der lateralen Bewegung von kleinen Partikeln in Gegenwart einer vorgeformten Linsenanordnung, die aus großen, lichtbrechenden Partikeln besteht.
  • Kolloidpartikel wurden zuvor in Flatpanel-Displaytechnologie verwendet. Das Arbeitsprinzip dieser Gestaltungen basiert auf der elektrophoretischen Bewegung von Pigmenten in einem farbigen Fluid, begrenzt zwischen zwei planaren Elektroden. In dem AUS- (dunklen) Zustand sind die Pigmente in dem Fluid suspendiert, und die Farbe des Fluids bestimmt die Erscheinung des Displays in diesem Zustand. Um den AN- (hellen) Zustand zu erreichen, werden Partikel nahe der vorderen (transparenten) Elektrode unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes assembliert. In diesem letzteren Zustand wird Auflicht durch die Schicht von Partikeln, die an der Elektrode assembliert sind, reflektiert, und das Display erscheint hell. Prototypendisplays, die kleine reflektierende Partikel in Übereinstimmung mit dieser Gestaltung verwenden, sind bekannt. Diese Displays leiden jedoch an einer Reihe gewichtiger Probleme einschließlich: elektrochemische Degradation und Mangel an kolloidaler Stabilität durch anhaltende Exposition zu den starken elektrischen Gleichstromfeldern, die benötigt werden, um annehmbare Schaltgeschwindigkeiten zu erzielen; und Ungleichförmigkeiten, die durch Partikelmigration in Reaktion auf Feldgradienten eingeführt werden, die der Gestaltung des Adressierungsschemas anhaften.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Mechanismus zur Gestaltung eines Partikel-basierten Displays bereit, welcher sich die elektrofeldinduzierte Anordnungsformierung sowie kontrollierte, feldinduzierte laterale Partikelverlagerungen zu Nutze macht. Zunächst wird eine Linseanordnung gebildet, die aus Kolloidbeads besteht. Diese Linsenanordnung dient zudem als Abstandsanordnung, um einen gut definierten Abstand zwischen der unteren Elektrode und der oberen Elektrode zu erhalten, die nun über die (vorgeformte) Anordnung platziert werden kann. Dies ermöglicht die Herstellung von uniformen Flatpanel-Displays mit schmalem Spalt, der durch den Partikeldurchmesser bestimmt wird.
  • Als Nächstes werden kleine Kolloidpartikel zur Elektrolytlösung in dem Spalt hinzugefügt. Diese können fluoreszierend sein oder können weißes Auflicht reflektieren. Unter der Wirkung eines elektrischen Wechselstromfeldes geeigneter Frequenz können diese kleinen Partikel lateral bewegt werden, um vorzugsweise innerhalb der durch einen größeren Bead beanspruchten Fläche zu assemblieren. Wenn durch einen größeren Bead betrachtet, erscheinen kleine fluoreszente Beads, die unter einem größeren Bead assembliert vorliegen, hell aufgrund der erhöhten Lichtsammeleffizienz, die durch die Linsenwirkung des größeren Beads bereitgestellt wird; dies ist der AN-Zustand (5). Bei Bewegung aus der durch den größeren Bead beanspruchten Fläche heraus erscheinen die Partikel dunkel und können durch adäquate Maskierung völlig unsichtbar gemacht werden; dies ist der AUS-Zustand. Die erforderliche laterale Partikelbewegung kann durch eine Änderung in der angelegten Spannung oder einer Änderung in der Lichtintensität induziert werden. Jedes große oder "Linsen"-Bead führt eine laterale Ungleichheit in der Stromverteilung innerhalb des Elektrolyts ein, da der Strom durch die Gegenwart jedes "Linsen"-Beads gestört wird.
  • Im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen Displays verwendet die vorliegende Erfindung Wechselstrom-, nicht Gleichstromfelder und isolierende (anstatt leitende) Elektroden, wodurch elektrochemische Degradation minimiert wird. Die laterale Ungleichheit, die durch die Linsenanordnung eingeführt wird, ist wünschenswert, da sie laterale Gradienten in der Stromverteilung innerhalb der Displayzelle einführt. Diese Gradienten vermitteln die laterale Bewegung von kleinen Beads über kurze charakteristische Strecken hinweg, die durch den Durchmesser der großen "Linsen"-Beads bestimmt werden, um einen Wechsel zwischen AN- und AUS-Zuständen zu bewirken. Somit trägt die vorliegende Erfindung leicht der existierenden Technologie zur aktiven Matrixadressierung Rechnung.
  • Beispiel IV – Layout-erhaltender Transfer von Beadsuspensionen von Mikrotiterplatten zu planaren Zellen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Transfer von Suspensionen von Beads oder Biomolekülen auf die Elektrodenoberfläche bereit, in solcher Weise, so dass die räumliche Kodierung in der ursprünglichen Reservoiranordnung, herkömmlicherweise die konventionelle 8 × 12-Anordnung von Wells in einer Mikrotiterplatte, bewahrt bleibt. Solch ein Fluidtransferschema ist in Anbetracht dessen, dass Verbindungsbibliotheken üblicherweise in 8 × 12-Wells gehandhabt und versendet werden, von maßgeblicher praktischer Bedeutung.
  • Die vorliegende Erfindung benutzt chemische Bemusterung, um einzelne Kompartimente für jeden MxN-Beadsatz zu bestimmen und sie entsprechend abzugrenzen. Im vorliegenden Fall wird die Bemusterung durch UV-vermittelte fotochemische Oxidation einer Monoschicht von Thiol-abgeschlossenem Alkylsilan erreicht, das chemisch an das Si/SiOx-Substrat adsorbiert ist. Unvollständige Oxidation von Thiolresten erzeugt Sulfonatreste und führt dazu, dass die exponierte Oberfläche geladen und hydrophil ist. Die hydrophilen Teile der Oberfläche in der Form eines Rasters von Vierecken oder Kreisen dienen als Haltebereiche.
  • Die erste Funktion von chemischer Oberflächenbemusterung in hydrophile Sektionen, die von hydrophoben Teilen umgeben sind, ist gemäß der vorliegenden Erfindung sicherzustellen, dass Tröpfchen, die aus verschiedenen Wells dispensiert werden, nicht verschmelzen, sobald sie mit dem Substrat in Kontakt kommen. Entsprechende Beadsuspensionen verbleiben infolgedessen räumlich isoliert und bewahren das Layout der ursprünglichen MxN-Wellplatte. Die zweite Aufgabe der chemischen Oberflächenbemusterung der vorliegenden Erfindung ist es, eine Verteilung der Oberflächenladung in der Form der MxN-Rasterplatte zu bewirken, welche sicherstellt, dass einzelne Beadanordnungen in den Grenzen der entsprechenden Haltebereiche verbleiben, selbst wenn die Flüssigphase zusammenhängend wird.
  • Das Transferverfahren umfasst die Schritte, die in den 6a-c dargestellt sind. Zuerst wird, wie in 6a in Seitenansicht dargestellt, die MxN-Platte von Wells 62 mit dem Muster 64 auf der planaren Substratoberfläche ausgerichtet. Wellböden 62 sind durchbohrt, um die Bildung von hängenden Suspensionstropfen zu erlauben, oder bevorzugt wird das Verfahren durch eine Halterungsvorrichtung (nicht gezeigt) ermöglicht, die MxN-wirksame Trichter bereitstellt, um den geometrischen Dimensionen der MxN-Platte an der Oberseite zu entsprechen und die Größe des Ausgabeendes zu reduzieren. Solch eine Ausgabehalterung sichert zudem die präzise Steuerung der Tröpfchenvolumina, die dazu eingestellt sind, den Targethaltebereich auf der gemusterten Substratoberfläche leicht zu überfüllen. Der Satz MxN-Tropfen wird dann durch Inkontaktbringen mit den hydrophilen Haltebereichen des vorbemusterten Substrats und auf kapillarer Wirkung beruhend abgesetzt.
  • Die Platte wird als Nächstes zurückgezogen und die obere Elektrode vorsichtig abgesenkt, um die elektrochemische Zelle zu bilden, wobei zuerst, wie in 6b dargestellt, einzelne flüssigkeitsgefüllte Haltebereiche auf dem Substrat kontaktiert werden, auf die Suspensionen beschränkt sind. Überfüllen stellt sicher, dass Kontakt mit einzelnen Suspensionen eingegangen wird. Das elektrische Feld wird nun eingeschaltet, um eine Anordnungsformierung in den MxN-Haltebereichen zu erzeugen und die Erhaltung der Gesamtbeschaffenheit der MxN-Beadsätze zu sichern, während der Spalt weiter geschlossen wird (oder mit zusätzlichem Puffer gefüllt wird), um schließlich einzelne Suspensionströpfchen in eine zusammenhängende Flüssigkeitsphase zu verschmelzen, wie in 6c dargestellt. In der vollständig assemblierten Zelle aus 6c werden, während die Tröpfchen miteinander verschmolzen werden, die Beads aus jedem Tröpfchen in ihren entsprechenden Positionen erhalten und isoliert, wobei die ursprüngliche MxN-Anordnung der Wells wiedergegeben wird. Die vorliegende Erfindung stellt somit die Operationen bereit, die für diese Implementierung eines Layout-erhaltenden Transferverfahrens zum Beladen planarer elektrochemischer Zellen nötig sind.
  • Beispiel V – Herstellen heterogener Gruppen (panels) von Partikeln
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer heterogenen Gruppe (panel) von Beads und möglicherweise von Biomolekülen bereit, die Analyten in einer angrenzenden Flüssigkeit präsentiert werden. Eine heterogene Gruppe beinhaltet Partikel oder Biomoleküle, die sich in der Beschaffenheit der chemischen oder biochemischen Bindungsstellen unterscheiden, die sie den Analyten in Lösung darbieten. Im Falle des Bindens wird das Analyt durch die Koordinaten des Beads oder des Clusters von Beads, die positiv bewertet werden, identifiziert. Das vorliegende Verfahren beruht auf den funktionalen Elementen der Erfindung, eine planare Anordnung einer Beadmischung mit mehreren Komponenten zu assemblieren, welche chemische Markierungen in der Form von Anhangsmolekülen tragen und nach Durchführung des Assays auf diese Weise identifiziert werden können.
  • Diagnostische Assays werden häufig in einem planaren Format einer heterogenen Gruppe angewendet, die aus einfachen Liganden, Proteinen und anderen biomolekularen Targets besteht. Zum Beispiel ermöglicht eine heterogene Gruppe in einem diagnostischen Testkit die schnelle Prüfung eines gegebenen Analyts, der in Lösung zugesetzt wird, gegen einen ganzen Satz Targets. Heterogene Gruppen von Proteinen sind im Zusammenhang mit dem aufkommenden Gebiet der Proteomforschung von großem gegenwärtigem Interesse. Das Ziel dieser Forschung ist, durch Scannen der Gruppe mit empfindlichen analytischen Methoden wie beispielsweise Massenspektrometrie jedes Protein in einer Mehrkomponentenmischung zu identifizieren, die aus einer Zelle extrahiert und durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt wurde. Idealerweise entspricht die Lage jedes Punktes eindeutig einem bestimmten Protein. Diese Analyse würde beispielsweise die direkte Überwachung von Genexpressionsstärken in einer Zelle während eines bestimmten Punktes in ihrem Zyklus oder bei einer bestimmten Phase in der Embryonalentwicklung erlauben.
  • Die Erzeugung einer Anordnung heterogener Targets ist zentral für kürzlich vorgeschlagene Strategien für Wirkstoffscreening und DNA-Mutationsanalyse in einem planaren Format. Die Platzierung von Liganden in einer spezifischen Konfiguration auf der Oberfläche eines planaren Substrats dient dazu, einen Schlüssel zur Identität jedes beliebigen in einem großen Satz von Targets zu erhalten, die gleichzeitig einem Analyt in Lösung zum Binden oder Hybridisieren präsentiert werden. In einem Assay, der auf Fluoreszenz beruht, erzeugt Bindung an ein spezifisches Target helle Punkte auf dem Substrat, deren räumliche Koordinaten die Identität des Targets direkt anzeigen.
  • Drei prinzipielle Strategien wurden bisher verwendet, um heterogene Gruppen herzustellen. Erstens können Proteingruppen durch zweidimensionale Gelelektrophorese erzeugt werden, die auf einem elektrischen Gleichstromfeld beruht, um Proteine zunächst anhand der Ladung und dann anhand der Größe (oder des Molekulargewichts) zu trennen. Selbst nach jahrelangen Verbesserungen erzielt diese Methode Ergebnisse mit schlechter Reproduzierbarkeit, die im Allgemeinen den schlecht definierten Eigenschaften der Gelmatrix zugeschrieben werden.
  • Zweitens können einzelne Tröpfchen, die einem Satz von Reservoirs entnommen werden, welche Lösungen der verschiedenen Targets beinhalten, entweder per Hand oder durch Verwendung eines der verschiedenen Verfahren der automatisierten Abgabe dispensiert werden (oder „printing"; siehe z.B. Schena et al., Science 270, 467-470 (1995). „Printing" wurde angewandt, um Gruppen von Oligonukleotiden zu erzeugen, die für Hybridisations-basierte Screeningassays gedacht sind. Printing hinterlässt eine getrocknete Probe und ist daher für Proteine, die unter solchen Bedingungen denaturieren werden, möglicherweise nicht geeignet. Die begleitenden Probleme der Fluidhandhabung, die dem Erhalt und der Entnahme der Proben aus einer großen Anzahl von Reservoirs innewohnen, sind erheblich.
  • Drittens können Targetliganden können durch Anwenden einer Variante der Festphasensynthese, die auf einer kombinatorischen Strategie der fotochemisch aktivierten Elongationreaktionen beruht, erzeugt werden. Dieser Ansatz wurde durch erhebliche technische Probleme in der chemischen Synthese auch nur der einfachsten linearen Oligomere beschränkt. Die Synthese nichtlinearer Verbindungen in dieser planaren Geometrie ist äußerst schwierig.
  • Die vorliegende Erfindung zur Bildung heterogener Gruppen benötigt das chemische Anhängen von Targetliganden an Beads. Liganden können durch eine Vielfalt gut etablierter Kopplungsreaktionen „offline" an Beads gekoppelt werden. Für bestehende Zwecke muss die Beadidentität chemisch kodiert werden, so dass sie nach Bedarf bestimmt werden kann. Verschiedene Verfahren der Kodierung oder der binären Kodierung von Beads sind verfügbar. Kurze Oligonukleotide können zum Beispiel zur Identifizierung eines Beads mittels ihrer Sequenz dienen, die durch kleinmaßstabliche Sequenzierungsverfahren bestimmt werden kann. Alternativ können chemisch inerte Molekülanhänge verwendet werden, die durch analytische Standardmethoden leicht identifiziert werden.
  • Im Gegensatz zu sämtlichen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Erzeugung heterogener Gruppen durch in situ erfolgende, reversible Bildung einer planaren Anordnung von „kodierten" Beads, die in Lösung an eine Elektrode anliegen, bereit. In Bezug auf chemische Identität kann die Anordnung willkürlich sein, ist aber in Bezug auf räumliche Positionen eindeutig. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Erstens ist es reversibel, so dass die Gruppe nach dem Bindungsassay disassembliert werden kann, um negativ bewertete Beads zu verwerfen. Positive Beads können weiteren Analysen unterzogen werden, ohne dass intermediäre Schritte zur Probenrückgewinnung, Aufreinigung oder zum Transfer zwischen Behältern erforderlich wären. Zweitens wird die Gruppe bei Bedarf gebildet, das heißt, entweder vor Ausführung des tatsächlichen Bindungsassays oder nach der Ausführung des Assays auf der Oberfläche von einzelnen Beads in Suspension. Der letztere Modus minimiert mögliche nachteilige Wirkungen, die aufkommen können, wenn Sonden an planaren Targetoberflächen mit einer hohen Konzentration von Targetstellen binden. Drittens können, um die Scananalyse von Sonden aufzunehmen, Abstände zwischen den Partikeln innerhalb der Anordnung durch feldinduzierte Polarisation oder durch Hinzufügung inerter Abstandspartikel, die sich in ihrer Größe von den kodierten Beads unterscheiden, angepasst werden. 7 stellt die Verwendung von kleinen Abstandsbeads 72 zur Auftrennung von kodierten Beads 74 dar. Wie dargestellt, ist der Abstand von Beads 74 größer als der Abstand von vergleichbaren Beads in 4b. Zuletzt ermöglicht UV-vermitteltes Oxidnachwachsen, wie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, auf einfache Weise das Einbetten eines Rastermusters mit ausgewählter Bemaßung in das Substrat, um die Bildung von kleinen, Layout-bewahrenden Subanordnungen in den Niedrigimpedanzfeldern des Rasters zu gewährleisten.
  • Um die Gruppe zu erzeugen, wird eine Beadmischung mit mehreren Komponenten, die zum Beispiel Verbindungen tragen, welche durch Bead-basierte kombinatorische Chemie hergestellt wurden, zwischen die Elektroden gebracht. Jede Beadausführung kann in vielfachen Kopien vorliegen. Anordnungen werden in Reaktion auf ein externes Feld in einem ausgewiesenen Bereich der Elektrodenoberfläche gebildet. Dieser neue Ansatz einer In-situ-Zusammensetzung von Gruppen beruht auf Beads, die eine eindeutige chemische Markierung oder einen eindeutigen chemischen Kode tragen, um ihre Identifikation nach der Durchführung eines Bindungsassays zu erlauben. Diese Erfindung ermöglicht „on-line"-Markierung von Beads durch ein fotochemisches Beadeinfärbungsverfahren. Ausgewählte Beads in einer Anordnung werden einzeln durch eine fokussierte Lichtquelle beleuchtet, um eine Färbereaktion auf der Beadoberfläche oder in dem Beadinnenraum einzuleiten, um eine positive Assaybewertung anzuzeigen. Beads, die so markiert sind, können anschließend von unmarkierten Beads durch ein Licht-aktiviertes Sortierungsverfahren, das hierin beschrieben ist, abgetrennt werden. Zahlreiche UV-aktivierte Reaktionen sind verfügbar, um dieses Beadfärbungsverfahren zu implementieren.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht verschiedene Verfahren zum Verwerfen von Beads mit negativen Bewertungen, üblicherweise die große Mehrheit, bei Zurückbehaltung jener mit positiver Bewertung. Dieses Verfahren macht sich, im Gegensatz zu sämtlichen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, die Tatsache zu Nutze, dass die Anordnung eine temporäre Partikelkonfiguration darstellt, die durch das angelegte elektrische Feld erhalten wird und nach Belieben neu angeordnet oder disassembliert werden kann. Diese Fähigkeit, zusammen mit der Tatsache, dass Biomoleküle niemals der Luft ausgesetzt werden (wie bei dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren des „Printing"), ermöglicht die In-situ-Verkettung analytischer Verfahren, die die heterogene Gruppe im Zusammenhang mit anschließender „downstream"-Analyse benötigen.
  • Erstens kann, wenn positive Beads in einer Subsektion der Anordnung geclustert sind, die Licht-gesteuerte Anordnungsteilungsoperation der vorliegenden Erfindung angewandt werden, um die Anordnung so zu zerlegen, dass negative Teile der Anordnung verworfen (oder für eine anschließende Verwendung recycelt) werden. Zweitens kann, wenn positive und negative Beads zufällig vermischt werden, ein Fluoreszenz-aktiviertes Sortierungsverfahren, das auf der Basis der vorliegenden Erfindung in einem, wie hierin beschrieben, planaren Format implementiert wird, angewandt werden. Im Falle einer Fluoreszenz-aktivierten Sortierung können positive und negative Beads jeweils als helle und dunkle Objekte identifiziert werden. In dem speziellen Fall, dass nur einige wenige positive Beads auffallen, können diese durch Fixierung mit optischen Pinzetten, einem Werkzeug zum „Einfangen" und/oder Manipulieren einzelner lichtbrechender Partikel unter Beleuchtung und Disassemblierung der Anordnung durch Entfernung des Feldes aus der Anordnung entfernt werden, oder indem die gesamte Anordnung durch die fundamentalen Operationen der vorliegenden Erfindung einer lateralen Verlagerung unterzogen wird.
  • Die übliche Aufgabe beim Screenen eines großen Satzes von Verbindungen ist die, nach einer sehr kleinen Anzahl positiver Ereignisse in einer großen Anzahl von Tests zu suchen. Der Satz verworfener Beads umfasst üblicherweise bei jedem Assayschritt die Mehrheit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung minimiert somit den in negative Ereignisse investierten Aufwand wie beispielsweise die schwierige In-situ-Synthese von Targetliganden, unabhängig davon, ob sie sich aufgrund des Bindens einer Sonde, die in der Lösung dargeboten wurde, als interessant erweisen werden oder nicht.
  • Das Verfahren zur Bildung einer heterogenen Gruppe gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Beads jeder Ausführung in allgemein zufälliger Zusammensetzung. Die Erzeugung einer heterogenen Gruppe, wobei jede Position in der Gruppe einen Cluster von Beads der gleichen Ausführung beinhaltet, das heißt, Beads, die aus dem gleichen Reservoir stammen (6a), kann wünschenswert sein, um eine ausreichend große Anzahl positiver Ereignisse sicherzustellen, um Detektion zu ermöglichen. Eine praktische Lösung ergibt sich aus der Anwendung des Layout-bewahrenden Fluidtransferschemas, das hierin beschrieben wird. In diesem Verfahren werden Beads einer MxN-Wellplatte Layout-bewahrend auf ein chemisch bemustertes Substrat in einer solchen Weise transferiert, dass die räumliche Kodierung der Beadidentitäten bewahrt wird.
  • Beispiel VI – Bindungs- und funktionale Assays in einem planaren Format der Beadanordnung
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um phasenvermischte Bindungsassays sowie bestimmte funktionale Assays in einem planaren Anordnungsformat zu implementieren. Mehrere Kombinationen sind möglich, die die Gegenwart von Probe oder Target in Lösung, auf der Oberfläche von Kolloidbeads oder auf der Elektrodenoberfläche wiedergeben. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Bildung einer planaren Anordnung zum Präsentieren von Targets für Sonden in Lösung vor Ausführung des Bindungsassays („vorgeformte” Anordnung; 8). Nach Ausführung des Bindungsassays in Suspension kann alternativ eine planare Beadanordnung vor einer Detektoroberfläche gebildet werden („nachgeformte” Anordnung; 8). Die vorliegende Erfindung stellt zudem die Verfahren bereit zur Implementierung funktionaler Assays durch Ermöglichen des Zusammensetzens von bestimmten Zelltypen an einer planaren Detektor- oder Sensoroberfläche zum Überwachen der Expositionseffekte von kleinmolekularen Wirkstoffen in Lösung auf die Zellen.
  • Bindungsassays, insbesondere jene, die Proteine wie z.B. Enzyme und Antikörper umfassen, stellen ein grundsätzliches Werkzeug medizinischer Diagnostik dar. Sie basieren auf der spezifischen biochemischen Interaktion zwischen einer Sonde, wie zum Beispiel einem kleinen Molekül, und einem Target, wie zum Beispiel einem Protein. Assays ermöglichen mit hoher molekularer Spezifität die schnelle Detektion von geringen Mengen eines Analyts in Lösung. Viele Verfahren wurden gestaltet, um Signale zu erzeugen, die entweder durch Erhalten einer qualitativen Antwort (Binden oder kein Binden) oder quantitative Ergebnisse in der Form von Bindungs- oder Assoziationskonstanten ein Binden anzeigen. Zum Beispiel kann, wenn ein Enzym ein Analyt bindet, die resultierende katalytische Reaktion dazu verwendet werden, einen einfachen Farbwechsel zu erzeugen, um Bindung anzuzeigen, oder sie kann an andere Verfahren gekoppelt werden, um chemische oder elektrische Signale zu erzeugen, aus denen Bindungskonstanten bestimmt werden. Monoklonale Antikörper, bereitgestellt von einem einzelnen gemeinsamen Vorläufer, können dazu präpariert werden, geradezu jedes gegebene Target zu erkennen, und Immunoassays, die auf einer Antikörper-Antigen-Erkennung und -Bindung basieren, haben sich zu einem wichtigen diagnostischen Werkzeug entwickelt. Wie beim Enzymbinden kann das Antikörperbinden eines antigenen Analyts durch eine Vielfalt von Methoden erkannt werden, einschließlich der klassischen Methode Enzym-gekoppelter Immunoassays (ELISA), in welchem die Reaktion eines Antikörper-gekoppelten Enzyms als Indikator ausgenutzt wird. Ein gebräuchliches und konzeptuell einfaches Schema gewährleistet die Detektion des Bindens eines Antikörpers an ein Targetanalyt, indem ein Fluoreszenz-markierter zweiter Antikörper, der den ersten (oder primären) Antikörper erkennt, bereitgestellt wird.
  • Bindungsassays, die lösliche globuläre Proteine umfassen, werden häufig in Lösung durchgeführt, um unbeeinflusste Interaktionen zwischen Protein und Target zu gewährleisten. Solche Flüssigphasenassays, insbesondere wenn bei geringen Konzentrationen von Target oder Sonde durchgeführt, minimieren mögliche Schwierigkeiten, die aufkommen können, wenn entweder Target oder Sonde im Überfluss oder in enger Nachbarschaft vorkommen. Ebenso tendieren die Kinetiken dazu, langsam zu sein. Kooperative Effekte, wie zum Beispiel der Volumenausschluss-Effekt („crowding"), die sich aus der engen Nachbarschaft von Sonden ergeben, müssen sorgfältig gesteuert werden, sobald entweder Sonde oder Target chemisch an ein festes Substrat verankert wird.
  • Trotzdem wird dieses letztere Festphasenformat der Bindungsassays auch sehr häufig verwendet, wann immer die Situation es erfordert. Zum Beispiel kann die Gegenwart eines Proteins auf der Zelloberfläche zum „Schwenksuchen" (panning) nach den Zellen genutzt werden, die dieses Protein exprimieren, in einer Kultur mit vielen weiteren Zellen, die es nicht exprimieren: Erwünschte Zellen lagern sich an die Oberfläche eines Behälters, der mit einer Schicht eines sekundären Antikörpers vorbeschichtet ist, welcher gegen einen primären Antikörper gerichtet ist, der das erwünschte Zelloberflächenprotein dekoriert. Ebenso können bestimmte Phagen genetisch manipuliert werden, um Proteine auf ihren Oberflächen auszustellen, und wenn das ausgestellte Protein ein Antikörper ist, können diese durch einen Bindungsassay identifiziert werden, der eine kleinmolekulare Sonde wie zum Beispiel ein Antigen einschließt (Watson et al., „Recombinant DNA", 2nd Edition (Scientific American Books, W.H. Freeman and Co., New York, NY, 1983). Zusätzlich beherbergt die planare Geometrie eine Vielfalt optischer und elektrischer Detektionsschemata, die in Umwandlern und Sensoren implementiert sind.
  • Eine Kombination von Flüssigphasen- und Festphasenassay kann durch Verwendung von Beads, die entweder mit einer Sonde oder einem Target dekoriert sind, wie in Verfahren, die dekorierte magnetische Beads zur Probenpräparation oder Aufreinigung durch Isolieren der bindenden von den nicht-bindenden Molekülen in einer gegebenen Mehrkomponentenmischung verwenden, entwickelt werden. Neueste Beispiele der Verwendung dieser Beads umfassen die Aufreinigung von Matrizen für Anwendungen in der DNA-Sequenzierung oder die Extraktion von mRNAs von (laierten) Zellen durch Hybridisation an Beads, die mit Polyadenin (polyA)-Resten dekoriert sind.
  • Funktionale Assays, die geeignete Zelltypen umfassen, werden verwendet, um extrazelluläre Effekte der kleinmolekularen Wirkstoffe auf den Zellmetabolismus zu überwachen. Zellen werden in der direkten Umgebung eines planaren Sensors platziert, um die lokale Konzentration von Agenzien, die von der Zelle freigesetzt werden, zu maximieren oder den lokalen pH zu überwachen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Mittel bereit, phasenvermischte Bindungsassays in einer planaren Geometrie mit einem Grad an Flexibilität und Steuerung zu implementieren, der bei Verfahren gemäß dem Stand der Techniknicht verfügbar ist. Somit bietet sie die Flexibilität, in situ, reversibel und unter externer räumlicher Steuerung, zur Ausbildung entweder einer planaren Gruppe von Targetstellen zum Binden von Analyten, die in einer anliegenden Flüssigphase vorhanden sind, oder einer planaren Anordnung von Sonde-Target-Komplexen nach Ausführung eines Bindungsassays in Lösung. Das Binden kann an der Oberfläche von einzelnen Beads, die in Lösung suspendiert sind, an der Oberfläche von Beads, die benachbart zur Elektrodenoberfläche zu Anordnungen vor-assembliert sind, oder an der Elektrodenoberfläche selbst ablaufen. Entweder das Target- oder das Sondenmolekül muss auf einem Bead angeordnet sein, um einen Bead-basierten Assay gemäß der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen. Wenn das Sondenmolekül P auf einem Bead angeordnet ist, wie in 8 dargestellt, kann das Targetmolekül T entweder in Lösung, auf einem Bead oder auf der Elektrodenoberfläche sein. Das Gleiche gilt umgekehrt.
  • Zum Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Schwenksuchen („panning"), das zum Klonieren von Zelloberflächenrezeptoren genutzt wird, in einer wesentlich schnelleren und kontrollierten Art und Weise zu implementieren, als mittels Stand der Technik Verfahren möglich ist. Bei einem Substrat, das mit einer Schicht Antikörper bedeckt wurde, die gegen das gesuchte Zelloberflächenprotein gerichtet sind, ermöglicht die vorliegende Erfindung die schnelle Zusammensetzung einer planaren Anordnung von Zellen oder dekorierten Beads in der Nähe der Antikörperschicht und die anschließende Disassemblierung der Anordnung, um nur jene Zellen oder Beads zurück zu lassen, die imstande sind, einen Komplex mit dem Oberflächen-gebundenen Antikörper auszubilden.
  • Ein weiteres Beispiel von Interesse in dieser Kategorie betrifft die Phagendisplays. Diese Technik kann verwendet werden, um Bead-verankerten Sonden eine Proteintargetschicht zu präsentieren. Beadanordnungen können nun dazu verwendet werden, ein Protein von Interesse zu identifizieren. Das heißt, Beads werden mit kleinmolekularen Sonden dekoriert, und benachbart zum Phagendisplay wird eine Anordnung gebildet. Binden resultiert in einem Sonde-Target-Komplex, der Beads hält, während andere beseitigt werden, sobald das elektrische Feld ausgeschaltet wird, oder wenn Lichtsteuerung angewendet wird, um Beads vom Phagendisplay zu entfernen. Wenn Beads kodiert sind, können viele Bindungstests parallel ausgeführt werden, da zurückgehaltene Beads nach dem Binden einzeln identifiziert werden können.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen leicht kompetitive Bindungsassays. Zum Beispiel zeigen im Anschluss an das Binden einer fluoreszenten Sonde an ein Target-dekoriertes Bead in Lösung und die Bildung einer planaren Beadanordnung an der Elektrode fluoreszierende Bereiche in der Anordnung die Position von positiven Targets an, und diese können weiter untersucht werden, indem sie kompetitivem Binden unterworfen werden.
  • Das heißt, während die Fluoreszenz einer ausgewählten Sektion der planaren Anordnung überwacht wird, wird ein Inhibitor (bei Enzymassays) oder andere Antagonisten (mit bekannter Bindungskonstante) zur elektrochemischen Zelle hinzugefügt, und die Abnahme der Fluoreszenz, die dem Bereich von Interesse entstammt, wird als Funktion der Antagonistenkonzentration gemessen, um eine Bindungskonstante für die ursprüngliche Sonde zu bestimmen. Dies ist ein Beispiel der Verkettung analytischer Schritte, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht wird.
  • Die Tatsache, dass ein Sonde-Target-Komplex an einem Kolloidbead verankert ist, wie in den Verfahren der vorliegenden Erfindung, führt zu praktischen Vorteile, da dies die Trennung der positiven von negativen Ereignissen ermöglicht. Insbesondere wenn Festphasenassays auf einem planaren Substrat ausgeführt werden, ist ein zusätzlicher Vorteil planarer Beadanordnungen die Verstärkung der Lichtsammeleffizienz, die durch die Beads bereitgestellt wird, wie hierin beschrieben.
  • Wenn erwünscht, können Beads strikt als Beförderungsvehikel für Kleinmolekülproben dienen. Das heißt, eine Anordnung Proben-dekorierter Beads wird an einer Target-dekorierten Oberfläche gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildet. UV-aktivierte Spaltung der Sonde von dem Beadträger gewährleistet, dass die Sonde in direkter Nähe zur Targetschicht freigegeben wird, wodurch Geschwindigkeit und Effizienz des Assays erhöht werden. Die Identität der spezifischen Sonde, die mit dem Target interagiert, kann anhand der Position des Beads das die Sonde liefert, bestimmt werden.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung betreffen nicht nur vielfältige Kolloidbeads (die kein spezielles präparatives Verfahren erfordern, um sie zum Beispiel zu magnetisieren), sondern auch Lipidvesikel und Zellen, die entweder mit Sonde oder Target dekoriert sind oder diese in ihrer äußeren Hülle eingebettet enthalten. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können daher nicht nur auf Bead-verankerte lösliche Proteine, sondern möglicherweise auf integrale Membranrezeptoren oder auf Zelloberflächenrezeptoren angewendet werden.
  • Insbesondere die schnelle Zusammensetzung von Zellen in einem ausgewiesenen Bereich der Substratoberfläche ermöglicht die Implementierung höchst paralleler Zell-basierter funktionaler Assays. Die vorliegende Erfindung macht es möglich, Zellen kleinmolekularen Wirkstoffkandidaten in Lösung auszusetzen und sie schnell in der Nähe eines Sensors, der in der Elektrodenoberfläche eingebettet ist, zu assemblieren oder vorassemblierte Zellen solchen Agenzien auszusetzen, die in die benachbarte Flüssigphase freigegeben werden. Im einfachsten Fall sind sämtliche Zellen vom gleichen Typ und die Agenzien werden aufeinander folgend verabreicht. Selbst in dieser sequentiellen Ausführung erhöht elektrokinetisches Vermischen den Durchsatz. Dennoch ermöglichen, wie hierin beschrieben, die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch die parallele Ausführung von Bindungsassays und somit von funktionalen Assays in einem planaren Format durch Kodierung der Identität unterschiedlicher Zellen durch ein „Layout-bewahrendes Transfer-"-Verfahren aus einer 8 × 12 Wellplatte, wie hierin beschrieben, und das Isolieren von Zellen, die positiv bewertet werden, indem ein Feedback aus einer räumlich aufgelösten Bildgebung oder einem räumlich aufgelösten Messverfahren bereitgestellt wird, um eine spezifische Stelle in der Zellanordnung anzuvisieren.
  • Beispiel VII – Trennung und Sortierung von Beads und Partikeln
  • Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, mehrere Verfahren zur Auftrennung und Sortierung von Kolloidpartikeln und Biomolekülen in einer planaren Geometrie zu implementieren. Diese beinhalten insbesondere Techniken der lateralen Trennung von Beads in Mischungen. Einzelne Beads können von einer Anordnung, die in Reaktion auf ein elektrisches Feld durch Anwendung von optischen Pinzetten gebildet wird, entfernt werden.
  • Die Trennung von Komponenten in einer gegebenen Mischung chemischer Verbindungen ist eine grundlegende Aufgabe der analytischen Chemie. Ebenso erfordert biochemische Analyse häufig die Trennung von Biomolekülen, Beads oder Zellen durch elektrophoretische Methoden nach Größe und/oder Oberflächenladung, während die Sortierung (am üblichsten in nur zwei Sub-Klassen) von Zellen in Suspension oder von vollständigen Chromosomen gemäß optischen Eigenschaften wie zum Beispiel Fluoreszenzemission gewöhnlich unter Verwendung von Feldflussfraktionierung einschließlich Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung durchgeführt wird.
  • In einer planaren Geometrie wurden Beadmischungen, die der Diffusion ausgesetzt sind, früher durch Anwendung eines elektrischen Wechselstromfeldes in Verbindung mit lithographischer Bemusterung der Elektrodenoberfläche, die dazu gestaltet ist, gerichteten Drift zu fördern, nach Beweglichkeit aufgetrennt. Im Wesentlichen wird das elektrische Wechselstrom- oder pulsierende Feld zum Bewegen kleiner Beads in eine bestimmte Richtung für eine Zeitspanne verwendet. Kapillarelektrophorese wurde in einer planaren Geometrie implementiert, siehe z.B. B.B. Haab and R.A. Mathies, Anal. Chem 67, 3253-3260 (1995).
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auf verschiedene Weisen angewendet werden, um die Aufgabe von Trennung, Sortierung und Isolation in einer planaren Geometrie zu implementieren. Im Gegensatz zu den Ansätzen des Standes der Technik bietet die vorliegende Erfindung einen signifikanten Grad an Flexibilität bereit, aus verschiedenen verfügbaren Verfahren das für die jeweilige Aufgabe am besten geeignete auszuwählen. In einigen Fällen kann mehr als eine Auftrennungsmethode angewendet werden, und dies stellt die Basis für die Implementierung einer zweidimensionalen Auftrennung bereit. Das heißt, Beads können nach zwei verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften getrennt werden. Zum Beispiel können Beads zuerst nach Größe und nachfolgend, indem die angelegte Frequenz zum Induzieren der Kettenbildung erhöht wird, nach Polarisierbarkeit aufgetrennt werden. Diese Flexibilität bietet bestimmte Vorteile im Rahmen der Integration analytischer Funktionalitäten in einer planaren Geometrie. Mehrere Verfahren werden nun beschrieben.
    • i) Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, „Siebung" in lateraler, elektrofeldinduzierter Strömung auf Oberflächen, die durch UV-vermitteltes Oxidnachwachsen bemustert werden, zu implementieren, um Beads in einer Mischung nach Größe zu sortieren. Die fundamentalen Operationen der Erfindung werden zum Einrichten gerichteter lateraler Partikelbewegung entlang von Leitungen, die durch UV-vermitteltes Oxidnachwachsen ausgelegt werden, angewendet. Leitungen werden so gestaltet, dass sie sukzessive schmalere Beschränkungen umfassen, durch welche Partikel passieren müssen. Sukzessiv feinere Abschnitte erlauben nur sukzessiv kleineren Partikeln, diesen „Siebungs"-Mechanismus zu passieren (9a). Wie in 9a dargestellt, erfolgt die primäre Partikelströmung von links nach rechts, während eine transverse Strömung in der Richtung von oben nach unten aufgebaut wird, wobei ein Oxidprofil wie gezeigt verwendet wird. Zusätzlich werden Reihen von Barrieren 92, die aus dickem Oxid gebildet sind, entlang der Leitung angeordnet, wobei der Abstand zwischen den Barrieren in jeder Reihe in der transversen Richtung abnimmt. Während sich die Partikel entlang der Leitung bewegen, sortieren die Barrierenreihen kleinere Partikel in der transversen Richtung aus. Im Gegensatz zu früheren Verfahren, die auf elektrophoretischer Auftrennung, großen elektrischen Gleichstromfeldern und dem dazugehörigen möglichen Problem der Elektrolyse und Interferenz von elektroosmotischer Strömung in einer Richtung gegenläufig zu dem feldgerichteten Partikeltransport basieren, verwendet die vorliegende Erfindung elektrische Wechselstromfelder und laterale Gradienten in der Grenzflächenimpedanz, um Transport zu erzeugen. Das vorliegende Verfahren hat den Vorteil, Elektrolyse zu vermeiden und nutzt den expliziten Vorteil der elektroosmotischen Strömung, um Partikeltransport zu erzeugen und zu steuern. Die Verwendung von Si/SiOx-Elektroden ermöglicht zudem die Verwendung von Lichtsteuerungskomponenten der vorliegenden Erfindung, um lateralen Transport von Beads in Echtzeit zu modifizieren. Zum Beispiel kann externe Beleuchtung verwendet werden, um lokal den lateralen Impedanzgradienten zu neutralisieren, der durch UV-vermitteltes Nachwachsen von Oxid induziert wird. Partikel in diesen neutralen „Zonen" würden nicht länger einer Nettokraft unterliegen und kommen zur Ruhe. Dieses Prinzip kann als Basis zur Implementierung eines Schemas zur lokalen Konzentration von Partikeln zu scharfen Bändern und somit zur Verbesserung der Auflösung in der nachfolgenden Auftrennung verwendet werden.
    • ii) Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, „Zonenverfeinerung" zu implementieren, ein Verfahren zum Ausschließen von Minderheitskomponenten einer Mischung nach Größe oder Form aus einer wachsenden Kristallanordnung von Mehrheitskomponenten. Dieses Verfahren hängt deutlich von den Fähigkeiten der vorliegenden Erfindung ab, gerichtete Kristallisation zu induzieren. Das Zonenverfeinerungsverfahren wird mit großem Erfolg zur Herstellung großer einzelner Siliziumkristalle von sehr hoher Reinheit verwendet, indem Verunreinigungen von dem Wirtsgitter (host lattice) ausgeschlossen werden. Dieses Konzept ist aus dem chemischen Standardverfahren der Aufreinigung durch Rekristallisation bekannt, bei dem Atome oder Moleküle, die sich in Größe, Form oder Ladung ausreichend von der Wirtsspezies unterscheiden, so dass sie nicht als Substitutionsverunreinigung in das sich bildende Wirts-Kristallgitter passen, in die Lösung abgegeben werden. Durch Ermöglichung des Wachstums planarer Anordnungen in eine bestimmte Richtung und bei einer kontrollierten Rate, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Implementierung eines analogen Zonenverfeinerungsverfahrens für planare Anordnungen. Die einfachste Geometrie ist die lineare Geometrie. Eine Mehrkomponentenmischung von Beads mit unterschiedlichen Größen und/oder Formen wird zunächst in einem rechteckförmigen Haltebereich auf der Oberfläche gefangen, der durch UV-Bemusterung angeordnet wurde. Als nächstes wird die Kristallisation an einem Ende des Haltebereichs durch Beleuchtung initiiert und zugelassen, dass sie in Reaktion auf ein fortschreitendes Beleuchtungsmuster langsam über den gesamten Haltebereich vorrückt. Im Allgemeinen lösen Unterschiede von ca. 10% im Beadradius die Entfernung aus.
    • iii) Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, Fraktionierung in einer transversen Strömung in einer Art und Weise zu implementieren, die Partikel gemäß ihrer Beweglichkeit auftrennt. Feldflussfraktionierung betrifft eine ganze Klasse von Techniken, die breite Anwendung in der Auftrennung von Molekülen oder Partikeln in Suspension finden. Das Prinzip ist die Auftrennung von Partikeln, die in einem Feld, das transvers zur Strömung wirkt, einer Fluidströmung unterworfen sind. Eine Kategorie solcher Techniken wird unter der Bezeichnung elektrische Feldflussfraktionierung zusammengefasst, wobei freie Strömungselektrophorese ein relevantes Beispiel darstellt, da sie mit einer planaren Geometrie kompatibel ist. Die freie Strömungselektrophorese verwendet die kontinuierliche Strömung eines regenerierten Puffers zwischen zwei eng beabstandeten Platten in der Gegenwart eines elektrischen Gleichstromfeldes, das in der Ebene der begrenzenden Platten transvers zur Richtung der Fluidströmung angelegt wird. Während sie das elektrische Feld durchlaufen, werden geladene Partikel im Verhältnis zu ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit ausgelenkt und in getrennten Ausgängen für nachfolgende Analysen gesammelt. Im Gegensatz zur konventionellen Elektrophorese ist die freie Strömungselektrophorese ein kontinuierliches Verfahren mit hohem Durchsatz und benötigt kein unterstützendes Medium wie zum Beispiel ein Gel. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Implementierung der Feldflussfraktionierung in einer planaren Geometrie. Wie oben erläutert, dienen durch UV-Oxidprofilierung auferlegte Impedanzgradienten dazu, Partikelbewegung entlang der Elektrodenoberfläche in Reaktion auf das externe elektrische Feld zu vermitteln. In einer Zelle mit einem geringen Abstand weist die resultierende elektrokinetische Strömung ein „plug"-Profil auf, mit dem Vorteil, sämtliche Partikel identischen Werten des Durchflussgeschwindigkeitsfeldes auszusetzen, wodurch Bandverzerrungen minimiert werden, die durch das parabole Geschwindigkeitsprofil der laminaren Strömung eingeführt werden, die üblicherweise in freier Strömungselektrophorese verwendet wird. Ein zweites Strömungsfeld, transvers zur primären Strömungsrichtung, kann dazu verwendet werden, Partikelauftrennung zu vermitteln. Diese auslenkende Strömung kann in Reaktion auf einen zweiten Impedanzgradienten erzeugt werden. Ein bequemes Verfahren zum Auferlegen dieses zweiten Gradienten ist es, UV-Oxidbemusterung zu nutzen, um geeignete Strömungsfelder zu gestalten. Sowohl die longitudinale als auch die transverse Strömung rezirkulieren und erlauben somit kontinuierliche Operationen sogar in einer geschlossenen Zelle, im Gegensatz zu jeder verwandten Stand der Technik Methode. Zusätzliche Flexibilität wird bei Anwendung der Lichtsteuerungskomponente der vorliegenden Erfindung geboten, um das Substrat mit einem stationären Muster zu beleuchten, dessen Intensitätsprofil in der Richtung transvers zur primären Fluidströmung gestaltet wird, um den gewünschten Impedanzgradienten zu induzieren und damit eine transverse Fluidströmung zu erzeugen (9b). Dies hat den signifikanten Vorteil, eine selektive Aktivierung der transversen Strömung in Reaktion auf die Detektion eines fluoreszenten Beads, das ein vorgelagertes Überwachungsfenster passiert, zu erlauben. Nicht-fluoreszente Beads würden die transverse Strömung nicht aktivieren und würden nicht ausgelenkt. Dieses Verfahren repräsentiert ein planares Analogon der Durchflusszytometrie, oder der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung.
    • iv) Die Erfindung kann dazu verwendet werden, die Bildung von Partikelketten in Richtung der Senkrechten zur Elektrodenebene zu induzieren. Die Ketten repräsentieren Leitungen zum Strömungstransport zwischen den Elektroden und ihr Bilden kann eine feldinduzierte Polarisierung wiedergeben. Ketten sind in transverser Strömung wesentlich unbeweglicher als einzelne Partikel, so dass dieser Effekt dazu verwendet werden kann, Partikel gemäß der Oberflächeneigenschaften, die zur Nettopolarisierung beitragen, aufzutrennen. Der Effekt reversibler Kettenbildung wurde unter den experimentellen Bedingungen, die hierin angegeben sind, gezeigt. Zum Beispiel tritt die reversible Kettenbildung für carboxylierte Polystyrolbeads von 1 Mikrometer Durchmesser bei einer Spannung von 15 V (pp) bei Frequenzen höher als 1 MHz auf.
    • v) Die Erfindung kann dazu verwendet werden, einzelne Beads aus einem planaren Array zu isolieren. Fluoreszenzbindungsassays in einem planaren Anordnungsformat, wie hierin beschrieben, können einzelne, helle Beads innerhalb einer großen Anordnung erzeugen, was besonders starkes Binden anzeigt. Um die entsprechenden Beads zu isolieren und zu entnehmen, können optische Pinzetten in der Form eines scharf fokussierten Laserpunktes verwendet werden, um ein einzelnes Bead von Interesse zu fixieren. Die Lichtsteuerungskomponente der vorliegenden Erfindung kann im Zusammenhang mit den optischen Pinzetten verwendet werden, um solch ein einzelnes Bead durch Bewegung der Anordnung relativ zu dem Bead, oder umgekehrt, oder durch Disassemblierung der Anordnung und Zurückbehalten von nur dem markierten Bead zu entnehmen. Dies ist eine recht einzigartige Fähigkeit, die insbesondere in dem Kontext, Beads in bestimmten Bindungsassays zu isolieren, nützlich sein wird. Eine gewerbliche Geräteausstattung ist erhältlich, um optische Pinzetten in dem Feld eines Mikroskops zu positionieren. Bewegung im größeren Maßstab wird durch Translokation der Anordnung in situ oder einfach durch Bewegen der externen Probenhalterung ermöglicht. Dieses Verfahren eignet sich zur Automatisierung im Zusammenhang mit der Verwendung von Bildanalysesoftware mit Spitzenfindungsfunktion und Rückkopplungskontrolle.
    • vi) Die Erfindung kann verwendet werden, eine Licht-induzierte Operation zur Sektionierung („shearing") der Anordnung zu implementieren, um fluoreszente oder anderweitig begrenzte Teile einer Anordnung der Übriggebliebenen aufzutrennen. Diese Operation ermöglicht es, eine gegebene Anordnung zu segmentieren und die entsprechenden Beads für nachgeschaltete Analysen zu isolieren.
  • Die Grundlage für die Implementierung dieser Anordnungssegmentation ist die Licht-Steuerungskomponente der vorliegenden Erfindung in dem Modus, in dem Partikel aus einem Bereich einer Si/SiOx-Grenzfläche getrieben werden, die mit hoher Intensität beleuchtet wird. Es wird an dieser Stelle hervorgehoben, dass dieser Effekt gänzlich ohne Bezug zu der Licht-induzierten Kraft auf Beads ist, die der Wirkung von optischen Pinzetten zu Grunde liegt. Dieser vorliegende Effekt, der mit einem großen Satz von Partikeln operiert, wurde unter den experimentellen Bedingungen, die hierin angegeben wurden, unter Verwendung einer 100 W-Beleuchtungseinrichtung an einem Zeiss-UEM-Mikroskop, betrieben mit Epi-Beleuchtung, gezeigt. Eine einfache Implementierung stellt die Überlagerung eines Linien-fokussierten Strahls, der durch Manipulation von Strahlensteuerungselementen extern des Mikroskops angeordnet wird, auf das einheitliche Beleuchtungsmuster dar, das an die gesamte Anordnung angelegt wird. Beads werden aus dem beleuchteten linearen Teil getrieben. Andere Implementierungen machen sich zwei separat gesteuerte Strahlen zunutze, die teilweise überlagert werden. Die lineare Aufteilung kann in verschiedenen relativen Scher- und Anordnungsorientierungen wiederholt werden.
  • Beispiel VIII – Screening zur Wirkstofffindung in planarer Geometrie
  • Die funktionalen Elemente der vorliegenden Erfindung können kombiniert werden, um Verfahren zum Handhaben und Screenen von Verbindungen und kombinatorischen Bibliotheken in einem planaren Format zu implementieren. Die prinzipiell erforderlichen Elemente für diese Aufgabe sind: Proben- und Reagensabgabe aus dem Satz von ursprünglichen Probenreservoirs, üblicherweise im Format von 8 × 12 Wells in einer Mikrotiterplatte, in eine planare Zelle; Herstellung von planaren Targetanordnungen oder von Sonde-Target-Komplexen an der planaren Elektrodenoberfläche vor oder nach Ausführung eines Bindungsassays; Evaluierung des Bindungsassays durch Aufnahme der räumlichen Verteilung von Markerfluoreszenz oder Radioaktivität, wahlweise gefolgt von quantitativen pharmakokinetischen Messungen der Affinitäts- oder Bindungskonstanten; Isolierung von Beads, die positiv bewertet sind, und Entfernung von anderen Beads aus der weiteren Bearbeitung; und Sammlung spezifischer Beads zur zusätzlichen nachgeordneten Analyse. Die vorliegende Erfindung betrifft all diese Elemente, und die fundamentalen Operationen dieser Erfindung stellen die Mittel zur Verkettung dieser Verfahren in einem planaren Format bereit.
  • Eine zentrale Angelegenheit bei der Implementierung kosteneffektiver Strategien moderner therapeutischer Wirkstofffindung ist die Gestaltung und Implementierung von Screeningassays in einer Art und Weise, welche Hochdurchsatz ermöglicht, während pharmakokinetische Daten als Basis bereitgestellt werden, um vielversprechende Wirkstoff-„Leads” aus einer üblicherweise gewaltigen Verbindungsbibliothek auszuwählen. Das heißt, molekulare Spezifität für das Target, die durch eine Bindungskonstante charakterisiert wird, ist ein maßgeblicher Faktor in der Evaluierung einer neuen Verbindung als ein mögliches therapeutisches Mittel. Übliche Targets schließen Enzyme und Rezeptoren sowie Nukleinsäureliganden ein, die eine charakteristische sekundäre Struktur aufweisen.
  • Das aufkommende Paradigma für die „Lead"-Findung in pharmazeutischen und verwandten Industrien, wie zum Beispiel agrarwirtschaftliche Biotechnologie, ist die Zusammensetzung neuer synthetischer Verbindungsbibliotheken durch eine breite Vielfalt neuer Verfahren „kombinatorischer" Festphasensynthese. Kombinatorische Chemie bezeichnet eine Kategorie von Strategien für die parallele Synthese und Testung vieler Verbindungen oder Verbindungsmischungen in Lösung oder auf festen Hilfsmitteln. Zum Beispiel erzeugt eine kombinatorische Synthese eines linearen Oligopeptids, das n Aminosäuren umfasst, gleichzeitig sämtliche Verbindungen, die die möglichen Sequenzpermutationen von n Aminosäuren darstellen. Die am häufigsten verwendete Implementierung kombinatorischer Synthese beruht auf Kolloidbeadträgern (colloidal bead supports) zum Kodieren von Reaktionsschritten und somit der Identität jeder Verbindung. Beads, die in der gegenwärtigen Praxis bevorzugt werden, neigen dazu, groß (bis zu 500 Mikrometer im Durchmesser) und porös zu sein, um ihre Kapazität der Verbindungslagerung zu maximieren, und müssen kodiert werden, um die Identität der Verbindung, die sie tragen, zu wahren.
  • Mehrere Verfahren zum Kodieren, oder binären Kodieren, von Beads stehen zur Verfügung. Zwei Beispiele sind wie folgt. Erstens können Beads mit kurzen Oligonukleotiden markiert werden, wie zum Beispiel die 17-mere, die üblicherweise in Hybridisationsexperimenten verwendet werden. Die Sequenz solch kurzen Sonden kann durch kleinmaßstabliche Sequenzierungstechniken bestimmt werden, wie zum Beispiel die direkte Maxam-Gilbert-Sequenzierung oder die Massenspektrometrie. Dieses Kodierungsschema ist geeignet, wenn die Aufgabe nach Screening von Nukleinsäureliganden- oder Oligopeptidbibliotheken verlangt. Zweitens können Elemente einer kombinatorischen Bibliothek mit chemisch inerten Molekülmarkierungen verknüpft werden. Im Gegensatz zum bisherigen Fall werden diese Markierungsmoleküle nicht sequentiell verknüpft. Stattdessen wird die Abfolge der Reaktionsschritte durch die formale Zuordnung eines binären Kodes zu einzelnen Markierungsmolekülen und ihren Mischungen kodiert, die an das Bead in jedem aufeinanderfolgenden Reaktionsschritt angehängt werden. Die Markierungen werden leicht durch analytische Standardtechniken wie zum Beispiel Gaschromatographie identifiziert. Diese allgemeine Kodierungsstrategie wird gegenwärtig in der Synthese kombinatotischer Bibliotheken auf Kolloidbeads angewendet.
  • Kommerzielle Verbindungsbibliotheken sind groß, angesichts dessen, dass sogar für das vorgenannte 17-mer die Anzahl der Sequenzpermutationen 4^17, oder ca. 10^10, beträgt. Die hohe Spezifität üblicher biologischer Substrat-Target-Interaktionen impliziert jedoch, dass die große Mehrheit an Verbindungen in der Kollektion für das jeweilige Target inaktiv ist. Aufgabe des Screenings ist es, aus diesem großen Satz die wenigen potentiellen „Lead"-Verbindungen auszuwählen, die Aktivität in Bindungs- oder in funktionalen Assays zeigen. Die prinzipielle Strategie der Wirkstofffindung in der pharmazeutischen Industrie, die weitgehend in Bibliotheken natürlicher Verbindungen angewendet wird, ist, einzelne Verbindungen aus der Bibliothek zufällig auszuwählen und sie einer Reihe von Tests zu unterziehen. Systematische Screeningverfahren werden somit benötigt, um schnelles Screenen und Bewerten einer gesamten Bibliothek synthetischer Verbindungen zu implementieren, die in der Praxis häufig Elemente im Bereich von 10^7 beinhaltet.
  • In der gegenwärtigen Praxis werden Verbindungen zunächst von ihren festen Trägern gespalten und eluiert und in Mikrotiterplatten gelagert. Weitere Probenhandhabung im Verlauf des Screenings beruht primär auf Pipettieren und Transferieren zwischen verschiedenen Behältern, üblicherweise Wells in Mikrotiterplatten, durch Roboter. Während Arbeitsplatzroboter einen Schritt in die Richtung der Automatisierung des Verfahrens darstellen, beruhen sie auf dem herkömmlichen Mikrotiterplattenformat von 8 × 12 Wells und der Probenhandhabung mittels Pipettieren und stellen somit lediglich eine inkrementelle operative Verbesserung dar. Eine signifikante zusätzliche Erwägung ist das Bedürfnis, Reagenzien und Proben durch Verkleinerung des räumlichen Maßstabes der analytischen Verfahren zu schonen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Satz Operationen bereit, um integrierte Probenhandhabung und Screeningverfahren für Bead-basierte Verbindungsbibliotheken in einem planaren Format zu realisieren. Aufgrund der Reagenzien- und Probenvolumina verringert dies signifikant Zeit und Kosten. Der grundlegende Vorteil der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist, dass sie einen großen Satz fundamentaler Operationen bereitstellen, um Sätze von Beads in einem planaren Format zu manipulieren, was die Beadhandhabung zwischen den Stationen in einem vielschrittigen analytischen Verfahren erlaubt.
  • Insbesondere, wie vorher hierin beschrieben, ermöglichen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Implementierung der folgenden relevanten Verfahren: Probentransfer von Mikrotiterplatten zu einer planaren elektrochemischen Zelle; Bildung heterogener Gruppen von Targetstellen an der Substratoberfläche; Festphasenbindungsassays; und Isolierung spezifischer Beads aus einer Anordnung. Zusätzlich stellen die fundamentalen Operationen der vorliegenden Erfindung die Mittel zur Verkettung dieser Verfahren auf der Oberfläche einer planaren Elektrode bereit.
  • Wie hierin für Hybridisierungsassays beschrieben, sind mehrere Varianten möglich. Das heißt, Bindungsassays können ausgeführt werden, indem Proteintargets wie zum Beispiel Enzymen erlaubt wird, an Verbindungen auf der Oberfläche eines Beads, entweder in Suspension oder in einer planaren Anordnung arrangiert, zu binden. Die übliche Praxis kombinatorischer Chemie, die auf großen porösen Trägerbeads basiert, berücksichtigt die gleichzeitige Handhabung kleinerer Beads, an deren äußere Oberfläche Verbindungen mittels inerter chemischer Abstandhalter verankert werden. Solche kleinen Beads (bis zu 10 Mikrometer im Durchmesser) werden leicht durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung manipuliert. Große Beads werden als Lagerbehälter für markierte Verbindung verwendet.
  • Alternativ kann in einer Lösung, innerhalb der Wells von Mikrotiterplatten, das Binden zwischen Target und einer radioaktiv oder anderweitig markierten Sonde auftreten, wenn die Verbindungen schon von ihrem Syntheseträger gespalten wurden. In diesem Falle können Sonde-Target-Komplexe durch Komplexierung mit kodierten Beads in jedem Well, zum Beispiel durch das Verfahren des sekundären Antikörpers, das Proteintarget an einen Bead-verankerten Antikörper zu binden, eingefangen werden. Bead-gefangene Komplexe von Sonde und Target werden dann zu der planaren Zelle zur Proximitätsanalyse und weiteren Bearbeitung transferiert, wie in 10 dargestellt. Wie in 10 dargestellt, wird zugelassen, dass sich die Sonde-Target-Komplexe 102 in Lösung bilden. Antikörperbeschichtete Beads 104 werden zu der Lösung hinzugefügt, was zu einem Bead-verankerten Komplex 106 führt. Die Bead-verankerten Komplexe 106 werden auf der Elektrode 108 aus den Wells 110 abgeschieden, und eine planare Anordnung von Bead-verankerten Komplexen wird gebildet. Wenn fluoreszente Sonden 114 verwendet werden, übermitteln diese Fluoreszenz an den Bead-verankerten Komplex, wobei Detektion ermöglicht wird.
  • Die Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sind gut für die Aufgabe geeignet, eine kleine Anzahl positiver Ereignisse in einem großen Satz zu identifizieren. Die Aufnahme einer gesamten Anordnung von Sonde-Target-Komplexen wird ferner durch die Nähe zu einem Area-Detektor und durch die Bead-Linsenwirkung verstärkt. Die Isolierung einer kleinen Anzahl positiver Bewertungen aus der Anordnung wird leicht, zum Beispiel durch Anwendung optischer Pinzetten, wie hierin beschrieben, erreicht. Der beträchtliche Rest der Anordnung kann sodann verworfen werden. Dies wiederum reduziert die Komplexität der Anwendung stringenterer Tests beträchtlich, wie zum Beispiel die Bestimmung von Bindungskonstanten, da diese auf die wenigen behaltenen Beads beschränkt sein können. Diese Tests können direkt, ohne Erfordernis für weitere Probentransfers in neue Behälter, für die Proben angewendet werden, die das erste Screening passieren.
  • Beispiel IX – Hybridisierungsassays in planarem Anordnungsformat
  • Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, Festphasenhybridisierungsassays in einem planaren Anordnungsformat in einer Konfiguration ähnlich der eines Proteinbindungsassays zu implementieren, in welchem Targetmoleküle chemisch an Kolloidbeads angebracht sind. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Bildung einer planaren Anordnung verschiedener Targetoligonukleotide, um einer Mischung von Strängen in Lösung präsentiert zu werden. Alternativ kann die Anordnung nach der Hybridisierung in Lösung gebildet werden, um die Detektion und Analyse der räumlichen Verteilung von Fluoreszenz oder Radioaktivität in der Anordnung zu ermöglichen.
  • Beträchtliche Forschung und Entwicklung wird derzeit in Anstrengungen investiert, miniaturisierte Geräteausstattung zur Extraktion und Präparation von DNA-Proben, einschließlich Amplifikation, Transkription, Markierung und Fragmentierung, mit nachfolgender Analyse, die auf Hybridisierungsassays sowie elektrophoretischer Auftrennung beruht. Hybridisierungsassays in planarem Anordnungsformat werden als ein diagnostisches Werkzeug zur schnellen Detektion von spezifischen einzelnen Basenpaarmutationen in einem bekannten DNA-Abschnitt entwickelt, und zur Bestimmung von Expressionsleveln zellulärer Gene mittels Analyse der entsprechenden mRNA- oder cDNA-Level. Hybridisierung von zwei komplementären DNA-Einzelsträngen umfasst molekulare Erkennung und nachfolgende Wasserstoffbrückenbindungsbildung zwischen entsprechenden Nucleobasen in den zwei gegenüberliegenden Strängen gemäß der Regeln A-T und G-C; hier repräsentieren A, T, G beziehungsweise C die vier Nucleobasen Adenin, Thymin, Guanosin und Cytosin, die in der DNA vorkommen; in mRNA ist Thymin durch Uracil ersetzt. Die Bildung von Doppelstrang- bzw. Duplex-DNA benötigt die Paarung von zwei stark negativ geladenen DNA-Strängen, und die Ionenkonzentration des Puffers zusammen mit der Temperatur spielt eine entscheidende Rolle.
  • Wie oben diskutiert, sind zwei grundsätzliche Verfahren, um heterogene Anordnungen von Targetsträngen auf der Oberfläche eines planaren Substrats zu präparieren, Mikroabgabe („Printing") und in situ, räumlich kodierte Synthese von Oligonucleotiden, die sämtliche möglichen Sequenzpermutationen für eine gegebene Stranggesamtlänge darstellen. In diesem Zusammenhang muss die Hybridisierung unbedingt in nächster Nähe zu einer planaren Substratoberfläche erfolgen, und diese Bedingung benötigt Sorgfalt, falls Komplikationen aufgrund sterischer Behinderung und unspezifischer Bindung von Strängen an das Substrat vermieden werden sollen. Unspezifische Adsorption kann ein ernsthaftes Problem darstellen, insbesondere in Gegenwart elektrischer Gleichstromfelder, die in gegenwärtigen kommerziellen Gestaltungen verwendet werden, die auf elektrophoretischer Abscheidung zum Beschleunigen der Hybridisationskinetiken auf der Oberfläche beruhen. Des Weiteren gibt es die technischen Schwierigkeiten, wie oben behandelt, die aus sterischer Behinderung und Kollektiveffekten resultieren, die den Volumenausschluss-Effekt (crowding) von Sondensträngen an der Oberfläche wiedergeben.
  • Im Zusammenhang von DNA-Analyse werden üblicherweise kolloidale (magnetische) Beads verwendet. Zum Beispiel werden sie zum Einfangen von DNA in einem weit verbreiteten Screeningverfahren verwendet, um aus Klonbibliotheken cDNAs zu selektieren. Insbesondere wird zugelassen, dass cDNAs mit Sequenzen langer genomischer DNA hybridisieren, die nachfolgend an magnetische Beads verankert wird, um die hybridisierte cDNA aus der Mischung zu extrahieren.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Bildung planarer Anordnungen von Oligonukleotid-dekorierten Kolloidbeads entweder vor oder nach Hybridisierung eines fluoreszenten Sondenstrangs an einen Bead-verankerten Targetstrang oder nach Hybridisierung in einer freien Lösung und Fangen des Targetstrangs, der an seinem Ende funktionalisiert ist, mittels Bead. Im Gegensatz zu Verfahren des Stands der Technik benötigt die vorliegende Erfindung keine Hybridisierung, die in der Nähe der planaren Substratoberfläche erfolgt, wenngleich dies eine Variante darstellt, wenn Bead-verankerte Sondenstränge zu Substrat-verankerten Targetsträngen befördert werden müssen.
  • Die Fähigkeit zur Ausführung von Hybridisierung entweder in Lösung, auf der Oberfläche einzelner Beads oder an der Substratoberfläche stellt einen beispiellosen Flexibilitätsgrad bereit. Die Vorteile von Beadanordnungen, wie hierin beschrieben, machen es außerdem möglich, einzelne Beads, oder Beadgruppen, aus einer größeren Anordnung auf der Grundlage der Bewertung in einem Hybridisierungsassay auszuwählen und zu isolieren. Diese Isolierung ermöglicht die Implementierung von nachfolgenden Assays mit den Strängen von Interesse. Die Tatsache, dass Beads beweglich bleiben, bedeutet auch, dass die interessanten Beads in ausgewiesenen Haltebereichen für Mikrosequenzierung gesammelt werden können, oder zu einem Substratbereich, der der PCR-Amplifikation zugewiesen ist, bewegt werden können.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, einen Hybridisierungsassay in einem planaren Anordnungsformat in ein oder zwei prinzipiellen Variationen zu implementieren. Alle involvieren die Gegenwart des gesamten Beadrepertoires in der planaren Anordnung oder Gruppe, die an der Elektrodenoberfläche zum parallelen Auslesen gebildet wurde. Wie im Allgemeinen bei heterogenen Gruppen, ist das Beadarrangement innerhalb der Anordnung entweder zufällig (bezüglich der chemischen Identität), und die Identität der Beads mit hoher Bewertung in dem Bindungsassay muss nachfolgend bestimmt werden, oder sie ist räumlich durch Anwendung des hierin beschriebenen „Layout-bewahrenden Transfer"-Verfahrens der Probenbeladung kodiert.
  • Die erstgenannte Variante wird leicht implementiert und berücksichtigt Anordnungsbildung entweder vor oder nach Ausführung des Bindungsassays. Zum Beispiel kann das Binden in Suspension vor der Zusammensetzung von Beads zu der Anordnung ausgeführt werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung berücksichtigt, wie bei dem vorgenannten cDNA-Selektionsverfahren, auch die Verwendung von Beads als Einfangelemente für endfunktionalisierte Target-DNA, zum Beispiel mittels Biotin-Streptavidin-Komplexierung. In diesem letzteren Fall dienen Beads als ein Beförderungsvehikel zum Sammeln sämtlicher Sonde-Target-Komplexe an der Elektrodenoberfläche, wo sie zur Erleichterung der Analyse zu einer Anordnung assembliert werden. Insbesondere die Nährungs-CCD-Detektion von Beads auf Elektroden profitiert von der Linsenwirkung der Beads in der Anordnung. Diese Ausführung wird bevorzugt verwendet, wenn nur eine kleine Anzahl positiver Bewertungen erwartet wird.
  • Hybridisierung an eine vorgeformte Beadanordnung kann sich eine Variante des Assays zunutze machen, die die räumliche Kodierung bewahrt. Eine Anordnung von Beadclustern wird durch das, oben beschriebene, „Layout bewahrende Transfer"-Verfahren gebildet und einer Mischung von cDNA ausgesetzt. Die resultierende räumliche Verteilung der Fluoreszenzintensität oder Radioaktivität entspricht der relativen Häufigkeit von cDNAs in der Mischung. Dieses Verfahren beruht auf der Detektion charakteristischer Fluoreszenz oder eines anderen Signals des Sonde-Target-Komplexes auf der Oberfläche eines einzelnen Beads. Angesichts der Tatsache, dass die Anordnung durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht ortsfest gehalten wird, kann die Aufnahmeerfassung erweitert werden, um ein robustes Signal-zum-Rauschen zur Detektion geringer Signalstärken zu erreichen. Ein Signal, das durch ein Bead mit 10 Mikrometern Durchmesser mit höchstens 10^8 Sonde-Target-Komplexen auf der Oberfläche des Beads erzeugt wird, kann detektiert werden. Die Linsenwirkung des Beads unterstützt die Detektion.
  • Die funktionalen Elemente der vorliegenden Erfindung können, wie bei der Implementierung von Wirkstoffscreenings, kombiniert werden, um ein mehrere präparative und analytische Verfahren an DNA auszuführen.
  • Beispiel X – Ausrichtung und Streckung von DNA in elektrofeldinduzierter Strömung
  • Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, hochmolekulargewichtige DNA in ihre aufgewickelte Konfiguration zu überführen, indem die fundamentalen Operationen angewendet werden, wie sie auch für andere Kolloidpartikel eingesetzt werden. Jedoch kann die elektrokinetische Strömung, die durch ein elektrisches Feld an einer bemusterten Elektrodenoberfläche induziert wird, zusätzlich dazu verwendet werden, die DNA in Richtung der Strömung in eine lineare Konfiguration zu strecken.
  • Kürzlich wurden Verfahren eingeführt, welche auf optischer Aufnahme beruhen, um eine Schnittstellenkarte für Restriktionsenzyme entlang der Form eines gestreckten DNA-Moleküls anzulegen. Diese ist im Allgemeinen bekannt als „Restriktionskarte". Diese Verfahren, welche das Studium der Interaktion von diesen und anderen Proteinen mit DNA ermöglichen und auch zur Entwicklung von Verfahren zur Sequenzierung von DNA führen können, hängen von der Fähigkeit ab, DNA auf einem planaren Substrat zu strecken und auszurichten.
  • Für einzelne DNA-Moleküle wurde dies bisher erreicht, indem das Molekül Streckkräften ausgesetzt wurde, wie zum Beispiel jenen, die Fluidströmung, magnetische Felder, die auf DNA verankerte magnetische Beads wirken, oder Kapillarkräfte ausüben. Zum Beispiel wurden DNA-„Kämme” erzeugt, indem DNA Moleküle in ein verdunstendes Elektrolyttröpfchen platziert wurden. Wenn Vorkehrungen getroffen werden, das chemische Anhängen eines Endes des Moleküls an die Oberfläche zu fördern, wird die DNA-Kette gestreckt, sobald die schwindende Kontaktlinie zwischen dem einschrumpfenden Tröpfchen und der Oberfläche über die angebundenen Moleküle tritt. Dies hinterlässt trockene DNA-Moleküle, die in zufälligen Positionen im Substratbereich, der zunächst von dem Tröpfchen bedeckt wurde, angehängt, in veränderlichen Graden ausgestreckt werden und allgemein in einem Muster radialer Symmetrie ausgerichtet werden, die die Tröpfchenform wiedergibt. Lineare Pinsel (brushes), bestehend aus einem Satz DNA Moleküle, die chemisch von einem Ende bis zu einer gemeinsamen Linie von Verankerungspunkten angebunden werden, wurden bisher auch durch Ausrichtung und Streckung der DNA-Moleküle, die vorher auf das Substrat verdunstet wurden, mittels Dielektrophorese in einem elektrischen Wechselstromfeld, das zwischen zwei Metallelektroden angelegt wird, hergestellt.
  • Die vorliegende Erfindung beruft sich auf elektrokinetische Strömung an einer Elektrode, die durch UV-vermitteltes Nachwachsen von Oxid bemustert wird, um einen neuen Ansatz zur Platzierung von DNA-Molekülen in einer vorbestimmten Anordnung auf einer planaren Elektrodenoberfläche und zur Streckung der Moleküle aus ihren nativen Coil-Konfigurationen zu einer ausgestreckten, linearen Konfiguration bereitzustellen, die in einer vorbestimmten Ausrichtung ausgerichtet wird. Dieses Verfahren wird in 11 dargestellt und wird durch Erzeugung gesteuerter Gradienten in der Strömungsumgebung entlang der Ausdehnung des DNA Coils vollendet. Das Geschwindigkeitsgefälle veranlasst verschiedene Teile des Coils, sich mit verschiedenen Geschwindigkeiten zu bewegen, wodurch das Coil ausgestreckt wird. Durch Aufrechterhalten eines Staupunktes mit einer Geschwindigkeit von null wird das ausgestreckte Coil in seiner Position fixiert. Dieses Verfahren besitzt mehrere Vorteile gegenüber Ansätzen im Stand der Technik. Zunächst werden DNA-Moleküle in ihrem Coilzustand der Licht-Steuerung unterzogen, um Anordnungen erwünschter Form in jeder Position auf der Oberfläche zu bilden. Dies ist möglich, da große DNA aus Kosmiden oder YACs Coils mit einem Radius im Bereich von einem Mikrometer ausbildet und damit in einer Art und Weise analog zu Kolloidbeads agiert. Ein Satz von DNA-Molekülen kann damit in ein gewünschtes anfängliches Arrangement gebracht werden. Zweitens stellt UV-Bemusterung sicher, dass die Streckkraft, die durch elektrokinetische Strömung erzeugt wird, in eine vorbestimmte Richtung gerichtet wird. Das Vorhandensein von Metallelektroden in Kontakt mit der Probe, ein Nachteil des dielektrophoretischen Verfahrens des Standes der Technik, wird durch Eliminieren dieser Kontaminierungsquelle vermieden, die insbesondere in Gegenwart eines elektrischen Feldes schwierig zu kontrollieren ist. Auf bemusterten Si/SiOx-Elektroden wurden Strömungsgeschwindigkeiten im Bereich von mehreren Mikrometern/Sekunde erzeugt, wie für die Ausdehnung von einzelnen DNA-Molekülen in der Strömung benötigt. Somit bestimmen Gradienten im Strömungsfeld sowohl die partielle Streckung als auch die Orientierung der entstehenden linearen Konfiguration. Drittens ermöglicht die vorliegende Erfindung direkte Echtzeitsteuerung der Geschwindigkeit der elektrofeldinduzierten Strömung, und dies wiederum fördert explizite Steuerung über die partielle Streckung.

Claims (23)

  1. Verfahren zum Manipulieren von Teilchen und zum Bilden einer Anordnung von Teilchen, die in einer Elektrolytlösung in Suspension sind, die an der oberen Oberfläche einer Siliciumelektrode vorhanden ist, die eine Schicht aus Siliciumoxid umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Erzeugen eines elektrischen Wechselfeldes an der Elektrode und Ausführen eines der folgenden Schritte: – Bemustern entweder der Oberfläche oder des Innenraums der Elektrode, um die Impedanz der Elektrode zu senken, derart, dass das elektrische Feld die Bewegung der Partikel in Übereinstimmung mit der bemusterten Fläche auf der Oberfläche der Elektrode steuert; – Beleuchten der Siliciumelektrodenoberfläche mit einem vorgegebenen Lichtmuster, um die Impedanz der Elektrode zu senken und um die Bewegung der Partikel in Übereinstimmung mit dem vorgegebenen Lichtmuster zu steuern; – Bemustern entweder der Oberfläche oder des Innenraums der Elektrode, um die Impedanz der Elektrode zu senken, und Beleuchten der Siliciumelektrodenoberfläche mit einem vorgegebenen Lichtmuster, um die Impedanz der Elektrode zu modifizieren und um die Bewegung der Partikel in Übereinstimmung mit dem vorgegebenen Lichtmuster und der Bemusterung entweder der Oberfläche oder des Innenraums der Elektrode zu steuern.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das elektrische Feld ein konstantes und/oder ein zeitlich veränderliches elektrisches Feld umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bemusterungsschritt unter Verwendung eines UV-vermittelten Oxid-Nachwachsens und/oder einer chemischen Oberflächenbemusterung und/oder einer Oberflächenladungsdichten-Profilierung ausgeführt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Elektrode eine lichtempfindliche Elektrode ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Beleuchtungsschritt unter Verwendung wenigstens einer einzigen, räumlich modulierten Lichtquelle ausgeführt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Beleuchtungsschritt den folgenden weiteren Schritt umfasst: Beleuchten eines ausgewählten Bereichs der Elektrode, um die Partikel dazu zu veranlassen, sich in dem ausgewählten Bereich zu bewegen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Beleuchtungsschritt den folgenden weiteren Schritt umfasst: Beleuchten eines ausgewählten Bereichs der Elektrodenoberfläche mit einem Lichtmuster mit hoher Intensität, um so die Partikel dazu zu veranlassen, sich aus dem ausgewählten Bereich zu bewegen.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Beleuchtungsschritt zeitlich veränderlich ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem längs der Elektrode eine Wanderwelle mit Transversalbeschränkung aufgebaut wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bemusterungsschritt den folgenden weiteren Schritt umfasst: Erzeugen eines ausgewählten Bereichs mit niedriger Impedanz auf der Elektrode, um die Partikel dazu zu veranlassen, sich in den ausgewählten Bereich zu bewegen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Frequenz des elektrischen Feldes eingestellt wird, um die Partikel an der Grenze, die den Bereich mit niedriger Impedanz ergibt, anzuordnen.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bemusterungsschritt den folgenden weiteren Schritt umfasst: Vorsehen der Oberfläche mit niedriger Impedanz mit Ausnahme eines ausgewählten Bereichs, um die Partikel dazu zu veranlassen, sich aus dem ausgewählten Bereich zu bewegen.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bemusterungsschritt verwendet wird, um einen ersten und einen zweiten Bereich mit niedriger Impedanz auf der Elektrode zu erzeugen, und der Beleuchtungsschritt verwendet wird, um den ersten und den zweiten Bereich wahlweise zu verbinden, um die Partikel dazu zu veranlassen, sich wahlweise zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich zu bewegen.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bemusterungsschritt verwendet wird, um einen ersten, einen zweiten und einen dritten Bereich mit niedriger Impedanz auf der Oberfläche zu erzeugen, und der Beleuchtungsschritt verwendet wird, um die Kolloidteilchen wahlweise dazu zu veranlassen, sich von dem ersten und dem zweiten Bereich in den dritten Bereich zu bewegen.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bemusterungsschritt verwendet wird, um einen ersten, einen zweiten und einen dritten Bereich mit niedriger Impedanz auf der Oberfläche zu erzeugen, und der Beleuchtungsschritt verwendet wird, um die Partikel wahlweise dazu zu veranlassen, sich zu trennen und sich von dem ersten in den zweiten und in den dritten Bereich zu bewegen.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die folgenden Schritte umfasst: Definieren eines Musters auf der Elektrode, wobei das Muster eine schmale Leitung, die mit einem weiten Bereich verbunden ist, umfasst; und Bilden eines im Wesentlichen konstanten Oxids mit verringerter Dicke auf der Elektrode, wobei das Oxid mit verringerter Dicke im Wesentlichen der schmalen Leitung und dem weiten Bereich entspricht.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die folgenden Schritte umfasst: Definieren eines Musters auf der Elektrode, wobei das Muster eine schmale Leitung enthält; und Bilden eines Oxids mit veränderlicher Dicke auf der Elektrode, wobei das Oxid mit veränderlicher Dicke im Wesentlichen der schmalen Leitung entspricht und von einer ersten Dicke an einem ersten Ende der schmalen Leitung zu einer zweiten Dicke an einem zweiten Ende der schmalen Leitung zunimmt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Oxid mit veränderlicher Dicke von der ersten Dicke zu der zweiten Dicke im Wesentlichen linear zunimmt.
  19. Sortiervorrichtung zum Implementieren der differentiellen seitlichen Verlagerung von Partikeln, die an einer Grenzfläche zwischen einer Elektrode und einer Elektrolytlösung in Suspension sind, wobei die Vorrichtung umfasst: einen Generator für elektrisches Feld, der ein elektrisches Feld an der Grenzfläche erzeugt; eine Elektrode; eine Elektrolytlösung, die eine im Wesentlichen kontinuierliche Strömung besitzt, die die Verlagerung der Partikel in einer Richtung, die zu der Grenzfläche im Wesentlichen parallel ist, bewirkt; wobei die Elektrode bemustert ist und modifizierte elektrochemische Eigenschaften besitzt; eine Beleuchtungsquelle, die die Elektrode mit einem einstellbaren, vorgegebenen Lichtmuster beleuchtet; und mehrere Partikel, die sich in der Elektrolytlösung befinden, wobei auf die Partikel durch eine Kombination von Kräften eingewirkt wird, die sich aus der im Wesentlichen kontinuierlichen Elektrolytströmung und aus dem elektrischen Feld in Übereinstimmung mit dem vorgegeben Lichtmuster und den elektrochemischen Eigenschaften der Elektrode ergeben, wobei die Partikel in Übereinstimmung mit Veränderungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften, die die Beweglichkeit der Partikel bestimmen, verlagert werden.
  20. Sortiervorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Bemusterung mehrere Reihen von intermittierend beabstandeten Barrierenbereichen mit hoher Impedanz enthält, wobei der intermittierende Abstand der Barrieren von einer Reihe zur nächsten abnimmt, wobei die Reihen quer über die Elektrode positioniert sind; wobei die Elektrode ferner bemustert ist, damit sie ein Impedanzprofil aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Impedanzprofil in der Richtung über die Elektrode abnimmt, wobei das Impedanzprofil auf einer Seite der Elektrode, die der Reihe von Barrieren mit dem größten intermittierenden Abstand entspricht, einen hohen Wert hat und auf einer gegenüberliegenden Seite der Elektrode, die der Reihe von Barrieren mit dem kleinsten intermittierenden Abstand entspricht, einen niedrigen Wert hat; wobei das elektrische Feld die Partikel dazu veranlasst, sich in einer Richtung, die zu der Elektrolytströmung im Wesentlichen transversal ist, in Übereinstimmung mit der Veränderung der Impedanz zwischen der ersten und der zweiten Seite der Elektrode zu bewegen, wobei die Reihen von intermittierend beabstandeten Barrieren in der Weise wirken, dass sie Partikel der Größe nach in Übereinstimmung mit dem intermittierenden Abstand der Reihen von Barrieren trennen.
  21. Sortiervorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Elektrode eine lichtempfindliche Elektrode ist.
  22. Sortiervorrichtung nach Anspruch 19, bei der das Impedanzprofil durch ein vorgegebenes Beleuchtungsmuster erzeugt wird.
  23. Sortiervorrichtung nach Anspruch 19, bei der: die Elektrodenbemusterung einen Bereich mit niedriger Impedanz enthält, der durch einen Bereich mit hoher Impedanz begrenzt ist, wobei der Bereich mit niedriger Impedanz eine schmale Leitung, die mit einer breiten Leitung in Verbindung steht, enthält, wobei beide Leitungen parallel zu der Richtung der kontinuierlichen Strömung des Elektrolyts orientiert sind, die breite Leitung eine Reihe von intermittierend beabstandeten Bereichen mit Barrieren hoher Impedanz, die quer zu der Breite der breiten Leitung verlaufen, aufweist; ein Teil der mehreren Partikel von den restlichen Partikeln optisch unterscheidbar ist; ein Detektor zum visuellen Untersuchen der Partikel die Länge der schmalen Leitung in Reaktion auf die kontinuierliche Strömung des Elektrolyts durchläuft; das Beleuchtungsmuster im Wesentlichen die Form eines Rechtecks hat, dessen längere Abmessung im Wesentlichen auf die Breite der breiten Leitung eingestellt ist, wobei das Rechteck eine kleinere Abmessung besitzt, die im Wesentlichen äquivalent zum Durchmesser der Partikel eingestellt ist, wobei sich das Muster vor den Barrieren befindet und wobei das Beleuchtungsmuster mit einem Intensitätsprofil übereinstimmt, das im Zentrum der breiten Leitung einen maximalen Intensitätswert besitzt und auf beiden Seiten der breiten Leitung symmetrisch zu niedrigeren Intensitätswerten abnimmt; und eine Verzögerungsaktivierungsschaltung vorgesehen ist, die das Beleuchtungsprofil in Reaktion auf ein aus der visuellen Untersuchung der Partikel abgeleitetes Signal aktiviert, um so ein beleuchtetes Partikel dazu zu veranlassen, sich aus Bereichen mit maximaler Intensität zu Bereichen mit niedriger Intensität des Intensitätsprofils zu verlagern und in die intermittierenden Zwischenräumen zwischen den Barrieren abgelenkt zu werden.
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