DE69814352T2 - Matrixlose osteogene vorrichtungen und implantate und verfahren zu deren verwendung - Google Patents

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    • A61L2430/02Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Description

  • Daten der weitergeführten Anmeldung
  • Diese Anmeldung basiert auf vorrausgehenden Anmeldungen, U.S.S.N. 60/037,327 (Atty. Dock. Nr. CRP-111PR), eingereicht am 7. Februar 1997, und U.S.S.N. 60/047,909 (Atty. Dock. Nr. CRP-147PR), eingereicht am 29. Mai 1997.
  • Gebiet der Erfindung
  • Das Ziel der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Die hier offenbarte Erfindung betrifft Stoffe und ihre Verwendung für die Herstellung eines Medikaments für die Reparatur von Knochendefekten unter Verwendung von knochenbildenden Proteinen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Klasse von Proteinen wurde jetzt identifiziert, die kompetent sind, als echte chondrogene Gewebemorphogene zu wirken und allein in der Lage sind, die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen in funktionelles Knochen-, Knorpel-, Sehnen- und/oder ligamentales Gewebe zu induzieren. Diese Proteine, die hier als "knochenbildende Proteine" oder "morphogene Proteine" oder "Morphogene" bezeichnet werden, umfassen Mitglieder der Familie von morphogenen Proteinen des Knochens (BMPs), die ursprünglich durch ihre Fähigkeit identifiziert wurden, die ectopische, endochondrale Knochenmorphogenese zu induzieren. Die knochenbildenden Proteine werden im Stand der Technik im allgemeinen als Untergruppe der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren (Hogan (1996) Genes & Development 10: 1580–1594) klassifiziert. Mitglieder der Familie der Proteine der Morphogene umfassen das knochenbildende Protein-1 der Säuger (OP-1, auch bekannt als BMP-7 und das Drosophila-Homologe 60A), das knochenbildende Protein-2 (OP-2, auch bekannt als BMP-8), das knochenbildende Protein-3 (OP-3), BMP-2 (auch bekannt als BMP-2A oder CBMP-2A, und das Drosophila-Homologe DPP), BMP-3, BMP-4 (auch bekannt als BMP-2B oder CBMP-2B), BMP-5, BMP-6 und sein murines Homologes Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (auch bekannt als Vgr2), GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (auch bekannt als CDMP-1 oder MP52), GDF-6 (auch bekannt als CDMP-2), GDF-7 (auch bekannt als CDMP-3), das Xenopus-Homologe Vgl und NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP und NEURAL. Mitglieder dieser Familie codieren sezernierte Polypeptidketten, die gemeinsame strukturelle Eigenschaften haben, einschließlich der Prozessierung von einer Vorläufer-"pro-Form", um eine reife Polypeptidkette zu ergeben, die zur Dimerisierung in der Lage ist und die am Carboxy-Terminus eine aktive Domäne von etwa 97–106 Aminosäuren hat. Alle Mitglieder haben ein konserviertes Muster von Cysteinen in dieser Domäne und die aktive Form dieser Proteine kann entweder eine Disulfid-verknüpftes Homodimeres eines einzigen Mitglieds der Familie sein oder ein Heterodimeres von zwei verschiedenen Mitgliedern (vgl. z. B. Massague (1990) Annu. Rev. Cell. Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990) J. Biol. Chem. 254: 13198). Vgl. auch U. S. 5,011,691; U. S. 5,266,683, Ozkaynak et al., (1990) EMBO J. 9: 2085–2093, Wharton et al., (1991) PNAS 88: 9214–9218), (Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220–25227 und U. S. 5,266,683); Celeste et al., (1991) PNAS 87: 9843–9847); (Lyons et al., (1989) PNAS 86: 4554-4558). Die Offenbarungen beschreiben die Aminosäure- und DNA-Sequenzen ebenso wie die chemischen und physikalischen Charakteristika dieser knochenbildenden Proteine. Vgl. auch Wozney et al. (1988) Science 242: 1528–1534; BMP 9 (WO93/00432, veröffentlicht am 7. Januar 1993); DPP (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81–84; und Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861–867). WO95/33502, FR-A-2564732 und EP-A-0321277 offenbaren knochenbildende Zusammensetzungen, die eine Matrix umfassen.
  • Somit wurden echte knochenbildende Proteine nunmehr identifiziert, isoliert und cloniert, die in der Lage sind, die vorstehend beschriebene Kaskade von morphogenen Ereignissen zu induzieren, die in endochondraler Knochenbildung resultieren. Ob natürlicherweise vorkommend oder synthetisch hergestellt, von diesen knochenbildenden Faktoren ist gezeigt worden, daß sie, wenn sie in Verbindung mit einer herkömmlichen Matrix oder einem herkömmlichen Substrat, das die Anheftung, Proliferation und Differenzierung von migratorischen Vorläuferzellen erlaubt, in einen Säuger implantiert werden, die Rekrutierung von zugänglichen Vorläuferzellen induzieren und ihre Proliferation stimulieren und damit die Differenzierung in Chondrocyten und Osteoblasten induzieren und weiterhin die Differenzierung von intermediärem Knorpel induzieren, die Vaskularisierung, die Knochenbildung, die Remodellierung und letztlich die Markdifferenzierung. Darüber hinaus haben zahlreiche Anwender die Fähigkeit von diesen knochenbildenden Proteinen gezeigt, wenn sie entweder Matrixmaterial von natürlichen Quellen wie Kollagen oder synthetisch hergestellten polymerem Matrixmaterial zugemischt werden, daß sie die Knochenbildung induzieren, einschließlich der endochondralen Knochenbildung unter Bedingungen, wo sonst kein echter Knochenersatz stattfinden würde. Wenn diese knochenbildenden Proteine zum Beispiel mit einem Matrixmaterial kombiniert werden induzieren sie die Bildung von neuem Knochen bei: großen segmentalen Knochendefekten, Rückgratverschmelzen und Brüchen. Ohne Ausnahme beschreibt jede der vorstehend beschriebenen Offenbarungen Implantieren oder Verabreichung der knochenbildenden Proteine an der defekten Stelle durch Verpacken, Füllen und/oder Einwickeln der defekten Stelle mit einem Gemisch aus knochenbildendem Protein und Matrix, wobei das relative Volumen und die Oberfläche der Matrix von Bedeutung sind. Im Falle von nicht einheitlichen Defekten, die nicht spontan heilen war es bisher herkömmliche Praxis, Volumen von Gemischen aus Matrix-knochenbildendem Protein an der defekten Stelle zu implantieren, mit ausreichenden Volumen zur Füllung des Defekts, um eine 3-dimensionales Gerüst für die anschließende Bildung von neuem Knochen bereitzustellen. Während Standardknochenbrüche spontan und ohne Behandlung heilen können, hat es der Stand der Technik in Betracht gezogen, in dem Maße Brüche mit knochenbildenden Proteinen zu behandeln und war es Praxis im Stand der Technik, knochenbildende Proteine zusammen mit einer Matrix lokal an einer defekten Stelle bereitzustellen, um die Heilung zu fördern.
  • Während das Implantieren eines Volumens an Matrix im herkömmlichen Sinn, vor allem im Fall von nicht heilenden, nicht einheitlichen Defekten, klug sein kann, können sich bei gewissen Patienten als Resultat dieser Praxis klinische Konsequenzen entwickeln. Zum Beispiel können Patienten, denen wiederholte Konstruktionen oder Defektreparationen widerfahren, oder bei denen das Matrixvolumen groß ist, schädliche immunologische Reaktionen gegen Matrizes entwickeln, die von Kollagen abgeleitet sind. Kollagenmatitzes können gereinigt werden, aber Reste von Verunreinigungen können verbleiben, die für gewisse Patienten stark allergen sind. In einer anderen Ausführungsform kann entmineralisierte autogene, allogene oder xenogene Knochenmatrix anstelle von Kollagen verwendet werden. Eine solche Matrix ist Kollagen mechanisch überlegen und kann in einigen Fällen schädliche Immunreaktionen verhinidern, aber die richtige Herstellung ist teuer, zeitaufwendig und die Verfügbarkeit von zuverlässigen Quellen für Knochen kann beschränkt sein. Solche Matrizes aus natürlichen Quellen können durch inerte Materialien wie Plastik ersetzt werden, aber Plastik ist kein geeigneter Ersatz, da es nicht resorbiert und auf Anwendungen beschränkt ist, die einfache geometrische Konfigurationen erfordern. Bis jetzt wurden auch biologisch abbaubare Polymere und Copolymere als Matrizes zur Reparatur nicht einheitlicher Defekte verwendet, denen knochenbildende Proteine beigemischt waren. Während solche Matrizes einige der vorstehenden Unzulänglichkeiten überwinden können, erfordert die Verwendung solcher Matrizes immer noch die Bestimmung und Kontrolle von Eigenschaften wie der Polymerchemie, der Teilchengröße, der biologischen Verträglichkeit und anderer Besonderheiten, die für die Anwendbarkeit kritisch sind.
  • Zusätzlich würden Individuen, die wegen eines erworbenen oder angeborenen Zustands eine verminderte Fähigkeit haben, Knochenbrüche oder andere Defekte zu heilen, die normalerweise eine spontane Reparatur erfahren, aus Verfahren und injizierbaren Zusammensetzungen ihren Nutzen ziehen, die die Reparatur von Knochen und/oder Sehnen verbessern, ohne ein chirurgisches Verfahren zu erfordern. Letztlich stellt eine injizierbare Formulierung auch Mittel zur Reparatur von osteochondralen oder chondralen Defekten bereit, ohne ein chirurgisches Verfahren zu erfordern.
  • Es verbleibt Bedarf an Mitteln, Implantaten und Verfahren zur Reparatur von Knochendefekten, die nicht auf einer Matrixkomponente beruhen. Es verbleibt ein besonderer Bedarf an Mitteln, Implantaten und Verfahren, die die Verabreichung von Knocheninduzierenden Mengen an knochenbildenden Proteinen ohne gleichzeitige Verabreichung von raumfüllenden Matrixmaterialien erlaubt, die für den Empfänger von Nachteil sein können oder biomechanisch und drehstabil nicht ideal sind. Es verbleibt Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln, insbesondere injizierbaren Mitteln, die die Rate der Bildung von neuem Knochen beschleunigen und die Qualität verbessern.
  • Dem gemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel, Implantate und deren Verwendung für die Herstellung eines Medikaments für die Reparatur von Knochendefekten, Knorpeldefekten und/oder osteochondralen Defekten bereitzustellen, die den Bedarf einer Zumischung von knochenbildenden Proteinen zu einer Matrix umgehen. Die vorliegenden Erfindung stellt matrixfreie knochenbildende Mittel, Implantate und deren Verwendung für die Herstellung von Medikamenten für die Reparatur von nicht heilenden, nicht einheitlichen Defekten bereit, ebenso wie für die Förderung einer verbesserten Knochenbildung bei der Rückgratverschmelzung und Knochenbrüchen, und für die Förderung der artikulären Knorpelreparatur bei chondralen oder osteochondralen Defekten. Diese und andere Ziele, zusammen mit Vorteilen und Eigenschaften der hier offenbarten Erfindung, werden durch die folgende Beschreibung, die folgenden Figuren und die folgenden Ansprüchen anschaulich.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß ein knochenbildendes oder für den Knochen morphogenes Protein wie OP-1, allein oder in Zumischung zu einem geeigneten Träger und nicht einem herkömmlichen Matrixmaterial, die endochondrale Knochenbildung induzieren kann, die ausreichend ist, um segmentale Knochendefekte kritischer Größe zu reparieren. Somit überwindet diese Entdeckung die vorstehend beschriebenen Probleme, die mit herkömmlichen Materialien und Verfahren zur Reparatur von Knochendefekten einhergehen, weil sie die Eliminierung von Matrixmaterial erlaubt. Weiterhin ist diese Entdeckung angesichts der bestehenden orthopädischen und rekonstruktiven Praxis unerwartet und widerspricht dem gegenwärtigen Verständnis des Fachgebiets für die Prozesse der Knochenreparatur/-bildung.
  • Wie hier offenbart, wird nun anerkannt, daß ein knochenbildendes Protein einem Träger zugemischt werden kann, wie er hier definiert wird, um ein matrixfreies Mittel zu bilden, das, wenn es einem Säuger verabreicht wird, bei der Verbesserung der Reparatur von nicht einheitlichen Knochendefekten, Brüchen und Verschmelzungen wirksam ist. Wie hier offenbart, werden Verfahren und Mittel zur Induzierung der Bildung von neuem Knochen an einer lokalen Defektstelle bereitgestellt, ohne den Bedarf der Bereitstellung einer dreidimensionalen Strukturkomponente an der defekten Stelle. Wie hier beabsichtigt, ist eine "matrixfreie" knochenbildende Vorrichtung eine Vorrichtung, der zur Zeit der Verabreichung an den Empfänger ohne Matrix ist. Es ist zu verstehen, daß der Ausdruck "Matrix" eine Strukturkomponente oder ein Substrat meint, die eine dreidimensionale Form hat und an der gewisse zelluläre Ereignisse, die in die Morphogenese des endochondalen Knochens involviert sind, ablaufen; eine Matrix wirkt als eine zeitweise Gerüststruktur für die Infiltration von Zellen, die Zwischenräume für die Anheftung, die Proliferation und Differenzierung solcher Zellen hat.
  • Die Erfindung stellt in einem Aspekt die Verwendung einer matrixfreien Zusammensetzung ohne Gerüststrvktur für die Herstellung eines Medikaments für die Induktion von Knochenbildung in einem Säuger bereit, die ausreicht, um einen Defekt zu reparieren. Eine Ausführungsform umfaßt den Schritt der Bereitstellung einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung für einen defekten Ort, der eine Hohlraum definiert. Die matrixfreie Vorrichtung kann aus knochenbildendem Protein allein bestehen, oder sie kann aus knochenbildendem Protein in Zumischung zu mit einem biologisch verträglichen, amorphen, nicht starren Träger zusammengesetzt sein, der keine definierten Oberflächen hat. Diese Zusammensetzung induziert die Bildung von neuem Knochen, welcher den defekten Ort auffüllt und dabei den Defekt repariert. Wie hier beabsichtigt, wird eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung einem defekten Ort in einem Volumen bereitgestellt, das nicht ausreichend ist, um die Hohlraum an dem defekten Ort zu füllen. In gewissen Ausführungsformen umfaßt die Hohlraum ein Volumen, das zu einer endogenen oder spontanen Reparatur nicht in der Lage ist. Beispiele für Defekte, die für eine Reparatur mit dem vorliegenden Verfahren geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, segmentale Defekte mit kritischer Größe und nicht einheitliche Brüche.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Zusammensetzungen und ihre Verwendung für die Herstellung eines Medikaments für die Verbesserung der Reparatur eines Bruchs bereit durch die Bereitstellung von hier beschriebenen matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen für eine Bruchdefektstelle. Die Fähigkeit der hier beschriebenen Vorrichtungen, die Bruchreparatur substantiell zu verbessern, einschließlich der Beschleunigung der Wachstumsrate und der Verbesserung der Qualität von neu gebildetem Knochen, hat Implikationen auf die Verbesserung der Knochenheilung bei betroffenen Individuen wie Diabetikern, Rauchern, fettleibigen Individuen und anderen, die, wegen eines erworbenen oder angeborenen Zustands, eine verminderte Fähigkeit haben, Knochenbrüche zu heilen, einschließlich Individuen mit beeinträchtigtem Blutfluß zu ihren Extremitäten.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Implantat für die Induzierung der Knochenbildung in einem Säuger bereit, das ausreicht, um einen Defekt zu reparieren. Ein bevorzugtes Implantat umfaßt eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung, die an einem defekten Ort bereitgestellt wird, der eine Hohlraum definiert. Die Bereitstellung einer knochenbildenden Vorrichtung ohne eine gerüstbildende Struktur an einen Säuger an einer defekten Stelle resultiert in einem Implantat, das in der Lage ist, die Bildung von neuem Knochen zu induzieren, ausreichend, um die Reparatur von nicht einheitlichen Knochendefekten, Brüchen und Verschmelzungen zu fördern. Bei Bereitstellung der knochenbildenden Vorrichtung an der defekten Stelle hat das so gebildete Implantat ein zu Füllung der defekten Hohlraum nicht ausreichendes Volumen.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung zur Induzierung der Knochenbildung in einem Säuger bereit. Wie hier beabsichtigt, umfaßt eine bevorzugte knochenbildende Vorrichtung ein bei der Knochenbildung aktives Protein bereit, das in einem geeigneten Träger dispergiert ist. Bevorzugte knochenbildende Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6 (siehe nachstehend). Wie hier offenbart, sind bevorzugte Träger biologisch verträglich, nicht starr und amorph, ohne definierte Oberflächen oder dreidimensionale Struktureigenschaften. Somit fehlt den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung eine Gerüststruktur und sie sind im Wesentlichen frei von Matrix, wenn sie einem Säuger bereitgestellt werden. Beispiele für bevorzugte Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Pluronics und Alkylcellulosen. Wie vorstehend diskutiert, umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer solchen Vorrichtung an einer defekten Stelle, so daß das Volumen der Vorrichtung zur Füllung des Leervolumens an der defekten Stelle nicht ausreichend ist.
  • Die Implantate und Vorrichtungen der Erfindung sind auch in der Lage, die Reparatur von chondralen oder osteochondralen Defekten zu induzieren und fördern oder verbessern. Als Resultat dieser Entdeckung sind jetzt Mittel zur Förderung der Reparatur von Knochen und/oder Knorpel verfügbar, ohne das Erfordernis eines chirurgischen Verfahrens. Insbesondere für die Verbesserung der Reparatur eines Knochenbruchs ist in Betracht zu ziehen, daß eine geeignete Formulierung an der Bruchstelle zur Zeit der Bildung des Bruchs injiziert werden kann, um die Wachstumsrate von neu gebildetem Knochen zu beschleunigen und die Qualität von neu gebildetem Knochen zu verbessern.
  • Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl an Konfigurationen haben. Die Natur der Vorrichtung wird von der Art des Trägers abhängen, in dem das knochenbildende Protein dispergiert ist. Zum Beispiel kann eine bevorzugte Ausführungsform eine Pasten-ähnliche oder Kitt-ähnliche Konfiguration haben; solch eine Konfiguration kann das Resultat der Dispersion des knochenbildenden Proteins in einem Gel-ähnlichen Träger wie einem PluronicTM-Träger oder einer Alkylcellulose wie Carboxymethylcellulose sein, die dann mit einem geeigneten Befeuchtungsmittel wie zum Beispiel einer Salzlösung befeuchtet wird. Eine andere bevorzugte Ausführungsform kann eine Konfiguration des trockenen Pulvers haben; solch eine Vorrichtung folgt aus der Dispersion des knochenbildenden Proteins in einem flüssigen Träger wie Wasser mit oder ohne Excipient, gefolgt von Lyophilisierung. Eine dritte Formulierung ist eine Lösung, wie durch Kombination des Proteins mit einer sauren gepufferten Lösung, z. B. pH 4,0–4,5, zum Beispiel einem Acetat- oder Citratpuffer. Noch eine andere Formulierung ist eine Suspension, die durch Einbringung eines knochenbildenden Proteins in eine physiologische gepufferte Lösung, wie phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), gebildet wird. In Abhängigkeit von der Konfiguration der Vorrichtung kann die Verabreichung an der defekten Stelle durch eine Vielzahl von Verabreichungsverfahren erreicht werden. Eine Paste kann zum Beispiel als ein Bett ausgedrückt werden, das entlang der Oberfläche der defekten Stelle liegt. In einer anderen Ausführungsform kann eine viskose Flüssigkeit entlang einer oder mehrere Oberflächen der defekten Stelle gebürstet oder gepinselt werden oder durch eine weite Kalibriernadel injiziert werden. Weniger viskose Flüssigkeiten durch eine feine Kalibriernadel injiziert werden. Andere Konfigurationen und Verabreichungswege sind in Betracht zu ziehen und werden nachstehend detaillierter diskutiert.
  • Im allgemeinen sind die Proteine der Erfindung dimere Proteine, die die endochondrale Morphogenese von Knochen induzieren. Knochenbildende Proteine umfassen ein Paar von Polypeptiden, die, wenn sie gefaltet sind, eine Konfiguration annehmen, die ausreichend ist, damit das resultierende dimere Protein eine morphogenetische Wirkung ausübt. Das heißt, daß knochenbildende Proteine im allgemeinen alle der folgenden biologischen Funktionen in einer morphogenetisch sensitiven Umgebung induzieren: die Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; die Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; die Stimulierung der Proliferation von differenzierten Zellen; und die Unterstützung des Wachstums und der Erhaltung von differenzierten Zellen. Vorläuferzellen sind nicht bestimmte Zellen, die in der Lage sind, in einen oder mehr spezifische Typen von differenzierten Zellen zu differenzieren, in Abhängigkeit von ihrem genetischen Repertoire und der Gewebespezifität der sensitiven Umgebung, in der die Morphogenese induziert wird. In der vorliegenden Erfindung können knochenbildende Proteine die morphogenetische Kaskade induzieren, die die endochondrale Knochenbildung typisiert.
  • Wie hier verwendet umfaßt der Ausdruck "Morphogen", "Knochenmorphogen", "morphogenes Knochenprotein", "BMP", "knochenbildendes Protein" und "knochenbildender Faktor" die Klasse an Proteinen, die durch das menschliche knochenbildende Protein 1 (hOP-1) typisiert werden. die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen für hOP-1 werden in den SEQ ID Nrs 1 und 2 bereitgestellt. Zur Erleichterung der Beschreibung wird hOP-1 hier des weiteren als ein repräsentatives knochenbildendes Protein bezeichnet. Es wird jedoch vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet erkannt, daß hOP-1 lediglich ein Repräsentant der TGF-β-Unterklasse der echten Gewebemorphogene ist und in der Lage ist, als knochenbildendes Protein zu wirken, und es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung zu beschränken. Andere bekannte und nützliche Proteine umfassen BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP und NURAL und bei der Knochenbildung aktive Aminosäurevarianten davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die bei der Erfindung nützlichen Proteine biologisch aktive Speziesvarianten von jedem dieser Proteine, einschließlich von konservativen Aminosäuresequenzvarianten, von Proteinen, die von degenerierten Nucleotidsequenzvarianten codiert werden, und von bei der Knochenbildung aktiven Proteinen, die das konservierte Skelett von sieben Cysteinen gemeinsam haben, wie es hier definiert wird, und die von einer DNA-Sequenz codiert werden, die in der Lage ist, mit einer DNA-Sequenz zu hybridisieren, die ein hier offenbartes knochenbildendes Protein codiert. In noch einer anderen Ausführungsform umfassen nützliche knochenbildende Proteine diejenigen, die die konservierte Domäne von sieben Cysteinen gemeinsam haben und mindestens 70% Aminosäuresequenzhomologie (Ähnlichkeit) innerhalb der C-terminalen aktiven Domäne haben, wie hier definiert.
  • In noch einer anderen Ausführungsform können die knochenbildenden Proteine der Erfindung als ostengen aktive Proteine definiert werden, die eine der generischen Sequenzen haben, wie sie hier definiert werden, einschließlich OPX und die Generischen Sequenzen 7 und 8 oder die Generischen Sequenzen 9 und 10. OPX paßt die Homologien zwischen den verschiedenen Arten der knochenbildenden Proteine OP1 und OP2 an und wird durch die Aminosäuresequenz beschrieben, die nachstehend und in Seq. ID Nr. 3 beschrieben ist. Die Generische Sequenz 9 ist eine Sequenz mit 96 Aminosäuren, die das Skelett mit sechs Cysteinen enthält, das durch hOP1 definiert ist (Reste 330–431 von Seq. ID Nr. 2), und worin die restlichen Reste die Homologien zwischen OP1, OP2, OP3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-15, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, UNIVIN, NODAL, DORSALIN, NURAL, SCREW und ADMP anpassen. Das heißt, jeder der nicht-Cysteinreste wird unabhängig aus dem entsprechenden Rest in dieser zitierten Gruppe von Proteinen ausgewählt. Die Generische Sequenz 10 ist eine Sequenz mit 102 Aminosäuren, die das Skelett mit sieben Cysteinen enthält, das durch hOP1 definiert ist (335–431 Seq. ID Nr. 2) und worin die restlichen Reste die Homologien zwischen der vorstehend zitierten Proteingruppe anpassen.
  • Wie hier beabsichtigt, umfaßt diese Familie an knochenbildenden Proteinen längere Formen eines vorgegebenen Proteins ebenso wie phylogenetische, d. h. Arten- und allelische Varianten und biosynthetische Mutanten, einschließlich C-terminale Additions- und Deletionsmutanten und Varianten, so wie diejenigen, die das konservierte C-terminale Cysteinskelett verändern können, unter der Voraussetzung, daß die Veränderung noch die Bildung einer dimeren Art des Proteins zuläßt, die eine Konformation hat, die in der Lage ist, die Knochenbildung in einem Säuger zu induzieren, wenn sie in den Säuger implantiert wird. Zusätzlich können die knochenbildenden Proteine, die bei dieser Erfindung von Nutzen sind, Formen umfassen, die verschiedene Glycosilierungsmuster und verschiedene N-Termini haben, natürlicherweise vorkommen können oder biosynthetisch abgeleitet sein können, und die durch Expression von rekombinanter DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen produziert werden können. Die Proteine sind als einzelne Art aktiv (d. h. Homodimer) oder kombiniert als gemischte Arten, einschließlich Heterodimeren.
  • Die Implantate der Erfindung erfordern keinen Träger für das knochenbildende Protein, um die Knochenbildung zu induzieren, die ausreicht, um einen Knochendefekt kritischer Größe zu füllen oder die Reparatur eines Bruchs in einem Tier zu verbessern. Wenn bei der Ausführung der Erfindung das Protein in Verbindung mit einem Träger bereitgestellt wird, muß der Träger ohne Gerüststruktur sein, wie vorstehend festgestellt. Wenn ein bevorzugter Träger einem knochenbildenden Protein zugemischt wird eine Vorrichtung gebildet, die im wesentlichen frei von Matrix ist, wie hier definiert. "Im wesentlichen frei von Matrix" ist so zu verstehen, daß die trägerlose Vorrichtung, wie sie vor der Verabreichung formuliert wird, keine Substratkomponente enthält, die per se als Gerüst dient. Das heißt, daß die Vorrichtung kein Substrat enthält, das von einer exogenen Quelle eingeführt wurde und in der Lage ist, als Gerüst zu dienen. Anders ausgedrückt, ist der Träger anerkanntermaßen vor der Verabreichung wegen seiner chemischen Natur nicht in der Lage, zu der Vorrichtung eine Gerüststruktur beizutragen. Per Definition sind bevorzugte Träger biologisch verträglich, nicht starr und amorph und haben keine definierten Oberflächen. Wie hier verwendet, bedeutet "nicht starr" eine Trägerformulierung, die lose oder locker ist oder anders im wesentlichen nicht in der Lage, eine dreidimensionale Struktur bereitzustellen oder zu bilden, die eine oder mehr definierte Oberflächen hat. Wie hier verwendet, bedeutet "amorph" das Fehlen einer definierten dreidimensionale Form, oder einer spezifischen Gestalt, das heißt ohne besondere Gestalt oder Form oder mit einer undefinierten Gestalt oder Form. Bevorzugte Träger sind auch biologisch verträglich, nicht partikulär, adhärent mit Knochen, Knorpel und/oder Muskel und inert. In gewissen Ausführungsform sind wasserlösliche Träger bevorzugt. Zusätzlich tragen bevorzugte Träger kein signifikantes Volumen zu der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung bei. Das heißt, bevorzugte Träger erlauben die Dispersion eines knochenbildenden Proteins so, daß das Endvolumen der resultierenden Vorrichtung weniger ist als das Volumen des Hohlraums an der defekten Stelle. Wie nachstehend diskutiert, kann ein bevorzugter Träger ein Gel sein, eine wäßrige Lösung, eine Suspension oder eine viskose Flüssigkeit. Zum Beispiel können besonders bevorzugte Träger ohne Einschränkung Pluronics, Alkylcellulosen, Acetatpuffer, physiologische Salzlösungen, Lactose, Mannitol und/oder andere Zucker umfassen. In einer anderen Ausführungsform könne knochenbildende Proteine allein an einer defekten Stelle bereitgestellt werden.
  • Zusammenfassend können die Implantate und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die endochondrale und intramembrane Knochenbildung zu induzieren, die ausreicht, Knochendefekte zu reparieren, die nicht spontan heilen, ebenso wie die Wachstumsrate und/oder Qualität der Knochenneubildung zu erhöhen und zu verbessern, insbesondere bei der Reparatur von Brüchen und Verschmelzungen, einschließlich Verschmelzungen des Rückgrats. Die Verfahren, Implantate und Vorrichtungen sind auch in der Lage, die Reparatur von osteochondralen und/oder subchondralen Defekten zu induzieren. Das heißt, die Implantate und Vorrichtungen sind in der Lage, die Bildung von neuem Knochen und des darüberliegenden Oberflächenknorpels zu induzieren. Die vorliegenden Erfindung ist insbesondere geeignet für die Verwendung bei Empfängern, die allergisch gegen Kollagen oder Matrix sind. Sie ist auch besonders geeignet für die Verwendung bei Patienten, die wiederholte rekonstruktive Chirurgie benötigen ebenso wie für Krebspatienten als eine Alternative für Rekonstruktionsverfahren unter Verwendung von Metallgelenken. Die vorliegende Erfindung ist auch für Individuen von Nutzen, deren Fähigkeit zur spontanen Knochenreparatur beeinträchtigt ist, wie Diabetiker, Raucher, fettleibige Individuen, immundefiziente Individuen und alle Individuen mit reduziertem Blutfloß zu ihren Extremitäten. Andere Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, prosthetische Reparatur, Rückgratverschmelung, Scoliose, Schädel-/Gesichtwiederherstellung und massive Allograftreparatur.
  • Ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Um den Inhalt der beanspruchten Erfindung klarer und genauer zu beschreiben, ist es beabsichtigt, daß die folgenden Definitionen eine Anleitung bei der Bedeutung von spezifischen Ausdrücken sind, die in der folgenden geschriebenen Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden.
  • "Knochenbildung" bedeutet die Bildung von endochondralem Knochen oder die Bildung von intramembranem Knochen. Bei Menschen beginnt die Knochenbildung während der ersten 6–8 Wochen der Entwicklung des Fötus. Vorläuferstammzellen von mesenchymalem Ursprung wandern zu vorbestimmten Stellen, wo sie entweder: (a) kondensieren, proliferieren und in knochenbildende Zellen (Osteoblasten) differenzieren, ein Prozeß, der im Schädel beobachtet wird und als "intramembrane Knochenbildung" bezeichnet wird; oder (b) kondensieren, proliferieren und in knorpelbildende Zellen (Chondroblasten) als Zwischenprodukt differenzieren, die anschließend von knochenbildenden Zellen ersetzt werden. Spezifischer differenzieren mesenchymale Stammzellen in Chondrocyten. Die Chondrocyten werden dann kalzifiziert, hypertrophieren und werden durch neugebildeten Knochen ersetzt, der von differenzierten Osteoblasten gemacht wird, die nun an der Stelle anwesend sind. Anschließend wird der mineralisierte Knochen extensiv umgeformt und danach von einem Knöchelchen verdrängt, das mit funktionellen Knochenmarkselementen gefüllt ist. Dieser Prozeß wird bei langen Knochen beobachtet und als "endochondrale Knochenbildung" bezeichnet. Im Leben nach dem fötalen Zustand hat der Knochen die Fähigkeit zur Selbstreparatur bei Verletzung, indem er den zellulären Prozeß der embryonalen endochondralen Knochenentwicklung nachahmt. Das heißt, daß mesenchymale Vorläuferstammzellen aus dem Knochenmark, Peristeum und Muskel induziert werden können, zu der defekten Stelle zu wandern und die vorstehend beschriebene Kaskade an Ereignissen beginnen. Dort akkumulieren sie, proliferieren und differenzieren in Knorpel, der dann von neugebildetem Knochen ersetzt wird.
  • "Defekt" oder "defekte Stelle", wie hier beabsichtigt, definiert einen Hohlraum, der eine Störung einer Knochenstruktur ist, die eine Reparatur erfordert. Der Defekt kann weiterhin einen osteochondralen Defekt definieren, der eine strukturelle Störung des Knochens und des darüberliegenden Knorpels umfaßt. "Hohlraum" ist so verstanden, daß er einen dreidimensionalen Defekt bedeutet, wie zum Beispiel eine Lücke, eine Höhle, ein Loch oder andere substantielle Unterbrechungen bei der strukturellen Integrität eines Knochens oder Gelenks. Ein Defekt kann das Resultat eines Unfalls sein, einer Krankheit, eines chirurgischen Eingriffs und/oder von prosthetischem Versagen. In gewissen Ausführungsformen ist die defekte Stelle ein Hohlraum, der ein Volumen hat, das einer endogenen oder spontanen Reparatur nicht zugänglich ist. Solche Defekte werden auch als segmentale Defekte von kritischer Größe bezeichnet. Im Stand der Technik ist anerkannt, daß solche Defekte eine Lücke von etwa 3–4 cm sind, mindestens aber größer als 2,5 cm, der spontanen Reparatur unzugänglich. In anderen Ausführungsformen ist die defekte Stelle ein nicht kritischer segmentaler Defekt von etwa mindestens 0,5 cm, aber nicht mehr als etwa 2,5 cm. Im allgemeinen sind diese in der Lage einer gewissen spontanen Reparatur, obgleich biomechanisch unterlegen derjenigen, die durch Anwendung der vorliegenden Erfindung möglich gemacht wird. In gewissen anderen Ausführungsformen ist der Defekt ein osteochondraler Defekt wie ein osteochondraler Pfropf. Andere Defekte, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung einer Reparatur zugänglich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, nicht einheitliche Brüche; Hohlräume in Knochen; Tumorresektionen; frische Brüche; Abnormalitäten des Schädels/des Gesichts; Rückgratverschmelzungen, ebenso wie diejenigen, die von Krankheiten wie Krebs, Arthritis einschließlich Osteoarthritis und anderen degenerativen Knochenstörungen herrühren. "Reparatur" ist so gemeint, daß sie die Induktion einer Knochenneubildung bedeutet, die ausreichend ist, den Hohlraum an der defekten Stelle zu füllen, "Reparatur" bedeutet aber nicht oder legt zwingend ein Verfahren der vollständigen Heilung nahe, oder eine Behandlung, das zu 100% wirksam bei der Wiederherstellung eines Defekts zum physiologischen/strukturellen Zustand vor dem Defekt ist.
  • "Matrix" wird im Stand der Technik so verstanden, daß sie ein den Knochen leitendes Substrat bedeutet, das eine gerüstbildende Struktur hat, an die infiltrierende Zellen anheften können, proliferieren und an dem morphogenen Prozeß teilhaben, der in Knochenbildung kulminiert. In gewissen Ausführungsformen kann die Matrix partikulär und porös sein, wobei die Porosität eine kritische Eigenschaft bei ihrer Wirksamkeit bei der Induktion der Knochenbildung ist, insbesondere bei der endochondralen Knochenbildung. Wie früher beschrieben, ist eine Matrix so zu verstehen, daß sie der herkömmlichen knochenbildenden Vorrichtung gewisse strukturelle Komponenten bereitstellt (d. h. bis jetzt eine poröse partikuläre Matrixkomponente wie Kollagen, demineralisierten Knochen oder synthetische Polymere umfassend), um dabei wie eine vorübergehende und resorbierbare Gerüststruktur für infiltrierende Zellen zu wirken, die Zwischenräume für Anheftung, Proliferation und Differenzierung von solchen Zellen hat. Dem entsprechend bedeutet der Ausdruck "matrixfreie knochenbildende Vorrichtung" oder knochenbildende Vorrichtung, die "im Wesentlichen frei von Matrix" ist eine Vorrichtung, der zum Zeitpunkt der Verabreichung an den Empfänger eine im Fachgebiet anerkannte Matrix fehlt. Darüber hinaus ist im Wesentlichen frei von Matrix so zu verstehen, daß, wenn eine Vorrichtung an der defekten Stelle bereitgestellt wird, kein Substrat von exogener Quelle eingeführt wird, die per se als Gerüst dienen kann. Matrixfrei oder im Wesentlichen frei von Matrix ist nicht so gemeint, daß es eine endogenen Matrix ausschließt, die nach der Verabreichung der hier offenbarten Vorrichtungen und/oder Implantate an der defekten Stelle induziert oder gebildet wird. Somit betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Induzierung der Bildung einer endogenen Matrix durch Bereitstellung der hier offenbarten matrixfreien Vorrichtungen oder Implantate an der defekten Stelle.
  • "Knochenbildende Vorrichtung" ist so zu verstehen, daß sie eine Zusammensetzung bedeutet, die ein knochenbildendes Protein umfaßt, das in einem biologisch verträglichen, nicht starren, amorphen Träger dispergiert ist, der keine definierten Oberflächen hat. Knochenbildende Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage eine Knochenbildung zu induzieren, die ausreichend ist, eine defekte Stelle zu füllen, die einen Hohlraum definiert. Knochenbildende Vorrichtungen sind matrixfrei, wenn sie der defekten Stelle bereitgestellt werden und werden der defekten Stelle in einem Volumen verabreicht, das nicht ausreicht, den Hohlraum zu füllen, der durch die defekte Stelle definiert wird. Eine Vorrichtung kann jede geeignete Konfiguration haben, wie eine Flüssigkeit, ein Pulver, eine Paste, oder ein Gel, um nur einige zu nennen. Bevorzugte Eigenschafen für knochenbildende Vorrichtungen, die für die Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf adhärent mit Knochen, Knorpel und/oder Muskel; und wirksam dabei, zumindest eine lokale Quelle an knochenbildendem Protein an der defekten Stelle bereitzustellen, selbst wenn vorübergehend. Wie hier beabsichtigt, umfaßt die Bereitstellung einer lokalen Quelle an Protein sowohl das Zurückhalten von Protein an der defekten Stelle als auch die kontrollierte Freisetzung von Protein an der defekten Stelle. Alles, was für vorliegende Erfindung erforderlich ist, ist, daß knochenbildende Vorrichtung wirksam ist bei der Bereitstellung des knochenbildenden Proteins mit einer Konzentration, die ausreicht, die Knochenbildung zu induzieren, die den dreidimensionalen Defekt füllt, die den Hohlraum definiert, der einer Reparatur bedarf. Zusätzlich zu knochenbildenden Proteinen können auch verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere biologisch aktive Mittel innerhalb einer knochenbildenden Vorrichtung vorhanden sein: Somit können verschiedene bekannte Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-α und TGF-β mit einer knochenbildenden Vorrichtung kombiniert werden und können an der defekten Stelle bereitgestellt werden. Eine knochenbildende Vorrichtung kann auch verwendet werden, um chemotherapeutische Mittel, Insulin, Enzyme, Enzyminhibitoren und/oder chemisch anlockende/chemotaktische Faktoren bereitzustellen.
  • "Knochenbildendes Protein" oder morphogenes Protein für den Knochen wird im allgemeinen so verstanden, daß es ein Protein bedeutet, das die volle Kaskade an morphogenen Ereignissen induzieren kann, die in der endochondralen Knochenbildung kulminieren. Wie an anderer Stelle hierin beschrieben, wird die Klasse an Proteinen durch das menschliche knochenbildende Protein (hOP1) typisiert. Andere knochenbildende Pioteine, die bei der Ausführung der Erfindung von Nutzen sind, umfassen die bei der Knochenbildung aktiven Formen von OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP, Vgl, Vgr, 60A Protein, GDF-1, GDF-3, GDF-5, 6, 7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP und NURAL und Aminosäuresequenzvarianten davon. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform umfaßt das knochenbildende Protein eines von: OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9 und Aminosäuresequenzvarianten und Homologe davon, einschließlich Arthomologen davon. Insbesondere bevorzugte knochenbildende Proteine sind diejenigen, die eine Aminosäuresequenz haben, die mindestens 70% Homologie mit den C-teminalen Aminosäuren 102–106 von OP1, BMP2 und verwandten Proteinen hat, die die konservierte Domäne von 7 Cysteinen definieren. Gewisse bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen das knochenbildende Protein OP-1. Gewisse andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen reifes OP-1 das in einer physiologischen Salzlösung solubilisiert ist. Wie woanders hier weiter beschreiben, können die knochenbildenden Proteine, die zur Verwendung bei der Erfindung der Anmelder geeignet sind, mittels Routineexperimenten unter Verwendung des auf dem Fachgebiet anerkannten und von Reddi und Sampath beschriebenen Biotests identifiziert. werden. "Aminosäuresequenzhomologie" wird hier so verstanden, daß sie eine Aminosäuresequenzähnlichkeit bedeutet. Homologe Sequenzen haben identische oder ähnliche Aminosäurereste gemeinsam, wobei ähnliche Reste konservative Substitutionen oder erlaubte Punktmutationen von entsprechenden Aminosäureresten in einer ausgerichteten Referenzsequenz sind. Somit ist ein Polypeptidsequenzkandidat, der 70% Aminosäurehomologie mit einer Referenzsequenz teilt, einer, bei dem 70% der ausgerichteten Reste entweder identisch sind oder konservative Substitutionen des entsprechenden Rests in der Referenzsequenz. Beispiele für konservative Variationen umfassen die Substitution eines hydrophoben Rests wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie die Substitution von Arginin durch Lysin, Glutaminsäure durch Asparaginsäure oder Glutamin durch Asparagin und dergleichen. Der Ausdruck "konservative Variation" umfaßt auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle der nicht substituierten Ausgangsaminosäure, mit der Maßgabe, daß ein Antikörper, der gegen das substituierte Polypeptid gebildet wird, auch mit dem nicht substituierten Polypeptid immunologisch reagiert.
  • Bei der Erfindung nützliche Proteine umfassen eukaryontische Proteine, die als knochenbildende Proteine identifiziert wurden (vgl. U. S. Patent 5,011,691, das durch Bezugnahme eingeschlossen ist), wie die OP-1-, OP-2-, OP-3- und CBMP-2-Proteine, so wie in der Aminosäuresequenz verwandte Proteine wie DPP (aus Drosophila), Vgl (aus Xenopus), Vgr-1 (aus Maus), GDF-1 (aus Mensch, vgl. Lee (1991), PNAS 88: 4250–4254), 60A (aus Drosophila, vgl. Wharton et al. (1991), PNAS 88: 9214–9218), Dorsalin-1 (aus Huhn, vgl. Basler et al. (1993) Cell 73: 687–702 und GenBank-Zugangsnummer L12032) und GDF-5 (aus Maus, vgl. Storm et al. (1994) Nature 368: 639–643). BMP-3 wird auch bevorzugt. Zusätzliche nützliche Proteine umfassen biosynthetische morphogene Konstrukte, die in U. S.-Pat. Nr. 5,011,691 offenbart sind, z. B. COP-1, 3–5, 7 und 16, ebenso wie andere Proteine, die im Stand der Technik bekannt sind. Noch andere Proteine umfassen ostengen aktive Formen von BMP-3b (vgl. Takao et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 219: 656–662), BMP-9 (vgl. W095/33830), BMP-15 (vgl. WO96/35710), BMP-12 (vgl. WO95/16035), CDMP-1 (vgl. WO94/12814), CDMP-2 (vgl. WO94/12814), BMP-10 (vgl. WO94/26893), GDF-1 (vgl. WO92/00382, GDF-10 (vgl. WO95/10539), GDF-3 (vgl. WO94/15965) und GDF-7 (vgl. WO95/01802).
  • Noch andere nützliche Proteine umfassen Proteine, die durch DNAs codiert werden, die in der Lage sind, mit einer DNA zu hybridisieren, die ein hier beschriebenes knochenbildendes Protein codiert, und verwandte Analoga, Homologe, Muteine und dergleichen (vgl. nachstehend).
  • Wie hier verwendet bedeutet "Träger" eine biologisch verträgliches nicht starres, amorphes Material, das keine definierten Oberflächen hat, das geeignet ist für die Vorrichtungen, Implantate und Verfahren der vorliegenden Erfindung. Wie zuvor festgehalten bedeutet "nicht starr" eine Trägerformulierung, die lose oder locker ist oder anders im wesentlichen nicht in der Lage, eine dreidimensionale Struktur bereitzustellen oder zu bilden, die eine oder mehr definierte Oberflächen hat. Wie hier verwendet, bedeutet "amorph" das Fehlen einer definierten dreidimensionale Form, oder einer spezifischen Gestalt, das heißt ohne besondere Gestalt oder Form oder mit einer undefinierten Gestalt oder Form. Geeignete Träger sind auch nicht partikulär und nicht porös, das heißt porenlos. Trägern, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, fehlt eine dreidimensionale Gerüststruktur und sind im wesentlichen matrixfrei. Somit ist "im wesentlichen frei von Matrix" auch so zu verstehen, daß es bedeutet, daß, wenn eine einen Träger enthaltende Vorrichtung an einer defekten Stelle bereitgestellt wird, kein Substrat von einer exogenen Quelle einschließlich des Trägers eingeführt wird, das per se als Gerüst wirken kann. Vor der Verabreichung an und der Implantation in den Empfänger wird von dem Träger wegen seiner chemischen Natur anerkannt, daß er nicht in der Lage ist, zu der Vorrichtung eine dreidimensionale Gerüststruktur beizutragen. Bevorzugte Träger sind zumindest vorübergehend adhärent zu Geweben wie Knochen, Knorpel und/oder Muskel. Gewisse bevorzugte Träger sind wasserlöslich, viskos und/oder inert. Zusätzlich tragen bevorzugte Träger kein signifikantes Volumen zu der Vorrichtung bei. Gegenwärtig bevorzugte Träger umfassen ohne Einschränkung Alkylcellulosen, Pluronics, Gelatinen, Polyethylenglycole, Dextrine, pflanzliche Öle und Zucker. Insbesondere umfassen bevorzugte Träger gegenwärtig, sind aber nicht beschränkt auf, Pluronic F 127, Carboxymethylcellulosen, Lactose, Mannitol und Sesamöl. Andere bevorzugte Träger umfassen Acetatpuffer, (20 mM, pH 4,5), physiologische Salzlösung (PBS) und Citratpuffer. Im Falle von Vorrichtungen, die Träger wie Acetat, Pluronics und PBS umfassen, kann die Verabreichung durch Injektion in der Präzipitation gewisser knochenbildender Proteine an der Verabreichungstelle resultieren.
  • "Implantat", wie hierin beabsichtigt, umfaßt knochenbildendes Protein, das in einem biologisch verträglichen nicht starren, amorphen Träger dispergiert ist, der an einer defekten Stelle, die einen Hohlraum definiert, keine definierten Oberflächen hat. Das heißt, daß das Implantat der vorliegenden Erfindung hier so betrachtet wird, daß es die defekte Stelle per se umfaßt, an der die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verabreicht/deponiert wurde. Es wird weiterhin so beabsichtigt, daß zum Zeitpunkt der Verabreichung einer Vorrichtung einem Implantat die Gerüststruktur fehlt und es im Wesentlichen matrixfrei ist. Implantate, die von der Anwendung des vorliegenden Verfahrens resultieren, sind in der Lage, die Knochenbildung in einer defekten Stelle in einem Säuger zu induzieren, ausreichend, den Defekt mit neugebildetem Knochen zu füllen und ohne das Erfordernis des Einschlusses einer Matrix oder Gerüststruktur zur Zeit der Verabreichung der Vorrichtung, und ausreichend, um den Hohlraum im Wesentlichen zu füllen und dabei strukturell die Größe und Form des Defekts zu definieren.
  • Die Mittel zur Herstellung und Verwendung der Implantate der Vorrichtungen der Erfindung, ebenso wie andre materielle Aspekte bezüglich ihrer Natur und ihres Nutzens, einschließlich, wie der beanspruchte Gegenstand der Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, wird aus dem folgenden weiter verstanden, welches die gegenwärtig als beste erachtete Ausführungsform der Erfindung darstellt. Es versteht sich, daß die Erfindung nicht auf solche beispielhafte Arbeit beschränkt ist oder auf spezifische Details, wie sie in diesen Beispielen dargelegt sind.
  • I. BETRACHTUNGEN ZUM PROTEIN
  • A. Biochemische, strukturelle und funktionelle Eigenschaften von morphogenen Proteinen des Knochens
  • Natürlicherweise vorkommende Proteine, die hier als knochenbildende oder für Knochen morphogene Proteine identifiziert und/oder anerkannt werden, bilden eine getrennte Subgruppe innerhalb der losen evolutionären Gruppierung von Sequenz-verwandten Proteinen, die als TGF-β-Superfamilie oder -Supergenfamilie bekannt sind. Die natürlicherweise vorkommenden Morphogene des Knochens haben eine substantielle Aminosäuresequenzhomologie in ihren C-terminalen Regionen (Domänen). Typischerweise werden die vorstehend erwähnten natürlicherweise vorkommenden knochenbildenden Proteine als Vorläufer translatiert, die eine N-terminale Signalpeptidsequenz haben, typischerweise weniger als etwa 30 Reste, gefolgt von einer "pro"-Domäne, die abgespalten wird, um die reife C-terminale Domäne zu ergeben. Das Signalpeptid wird bei der Translation rasch abgespalten, an einer Spaltstelle, die bei einer vorgegebenen Sequenz unter Verwendung des Verfahrens von Von Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683–4691 vorrausgesagt werden kann. Die pro-Domäne ist typischerweise etwa dreimal größer als die voll prozessierte reife C-terminale Domäne. Hier betrifft die "pro"-Form eines Morphogens ein Morphogen, das ein gefaltetes Paar an Polypeptiden umfaßt, von denen jedes die pro- und reife Form eines morphogenen Polypeptids umfaßt. Typischerweise ist unter physiologischen Bedingungen die pro-Form eines Morphogens löslicher als die reife Form. Die pro-Form scheint die primäre Form zu sein, die von einer kultivierten Säugerzelle sezerniert wird.
  • In bevorzugten Ausführungsformen hat das Paar an morphogenen Polypeptiden Aminosäuresequenzen, von denen jede ein Sequenz umfaßt, die eine definierte Verwandtschaft mit einer Aminosäuresequenz eines Referenzmorphogens hat. Hier haben die bevorzugten knochenbildenden Proteine eine definierte Verwandtschaft mit einer Sequenz, die in dem ostengen aktiven menschlichen OP-1, SEQ ID NR: 2 anwesend ist. Jede oder mehrere der natürlicherweise vorkommenden oder biosynthetischen Sequenzen, die hier offenbart sind, könnten jedoch in ähnlicher Weise als Referenzsequenz verwendet werden. Bevorzugte knochenbildende Polypeptide haben eine definierte Verwandtschaft mit mindestens der Domäne der sechs C-terminalen Cysteine von menschlichem OP-1, Reste 335–431 von SEQ ID NR: 2. Vorzugsweise haben knochenbildende Proteine eine definierte Verwandtschaft mit mindestens der Domäne der sieben C-terminalen Cysteine von menschlichem OP-1, Reste 330–431 von SEQ ID NR: 2. Das heißt, daß jedes bevorzugte Polypeptide in einem dimeren Protein mit morphogener Aktivität des Knochens eine Sequenz umfaßt, die einer Referenzsequenz entspricht oder ein funktionelles Äquivalent dazu ist.
  • Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen funktionell äquivalente Anordnungen von Cysteinresten, die innerhalb der Referenzsequenz verteilt sind, einschließlich Aminosäureinsertionen oder -deletionen, die die lineare Anordnung dieser Cysteine ändern, ihre Beziehung in der gefalteten Struktur des dimeren morphogenen Proteins aber nicht materiell stören, einschließlich ihrer Fähigkeit zur Bildung von solchen Disulfidbrücken innerhalb einer Kette oder zwischen Ketten, wie sie für die morphogene Aktivität erforderlich sein können. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen weiterhin diejenigen, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste sich von dem entsprechenden Rest in der Referenzsequenzunterscheiden, d. h. der Domäne der sieben C-terminalen Cysteine (hier auch als Skelett der sieben konsevierten Cysteine bezeichnet) von menschlichem OP-1, mit der Maßgabe, daß dieser Unterschied nicht die morphogene Aktivität des Knochens zerstört. Entsprechend sind konservative Susbstitutionen von entsprechenden Aminosäuren in der Referenzsequenz bevorzugt. Aminosäurereste, die konservative Susbstitutionen von entsprechenden Resten in der Referenzsequenz sind, sind diejenigen, die physikalisch oder funktionell dem entsprechenden Referenzrest ähnlich sind, d. h. eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften einschließlich der Fähigkeit zur Bildung von kovalenten oder Wasserstoffbindungen oder dergleichen haben. Insbesondere bevorzugte konservative Susbstitutionen sind diejenigen, die die Kriterien erfüllen, die Dayhoff et al.
  • (1978), 5 Atlas of Protein Sequence and Structure, Suppl. 3, Kap: 22 (S. 354–352), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C. 20007, für eine akzeptierte Punktmutation definiert hat, deren Lehren durch Bezugnahme hier eingeschlossen werden.
  • Knochenbildendes Protein aus natürlicher Quelle in seiner reifen, nativen Form ist ein glycosyliertes Dimer, das typischerweise ein offenbares Molekulargewicht von etwa 30–36 kDa hat, wie mittels SDS-PAGE bestimmt. Wenn reduziert, ergibt das Protein von 30 kDa zwei glycosylierte Peptiduntereinheiten, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 16 kDa und 18 kDa haben. Im reduzierten Zustand hat das Protein keine nachweisbare knochenbildende Aktivität. Das nicht glycosylierte Protein, das auch knochenbildende Aktivität hat, hat ein apparentes Molekulargewicht von etwa 27 kDa. Wenn reduziert, ergibt das Protein von 27 kDa zwei nicht glycosylierte Polypeptide, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 14 kDa bis 16 kDa haben und in der Lage sind, in einem Säuger die endochondrale Knochenbildung zu induzieren. Wie vorstehend beschrieben, umfassen insbesondere nützliche Sequenzen diejenigen, die die C-terminalen 102 Aminosäuresequenzen von DPP (aus Drosophila) umfassen, Vgl (aus Xenopus), Vgr-1 (aus Maus), die OP1- und OP2-Proteine, (vgl. U.S.-Pat. Nr. 5,011,691 und Oppermann et al., ebenso wie die Proteine, die als BMP2, BMP3, BMP4 (vgl. WO88/00205, U.S.-Patent Nr. 5,013,649 und WO91/18098), BMP5 und BMP6 (vgl. WO90/11366, PCT/US90/01630) und BMP8 und 9 bezeichnet werden.
  • In gewissen bevorzugten Ausführungsformen umfassen hier nützliche morphogene Proteine des Knochens diejenigen, bei denen die Aminosäuresequenzen eine Sequenz umfassen, die eine mindestens 70%-ige Aminosäuresequenzhomologie oder "Ähnlichkeit" oder vorzugsweise eine 80%-ige Homologie oder Ähnlichkeit mit einem morphogenen Referenzprotein hat, das ausgewählt ist aus den vorstehenden natürlicherweise vorkommenden Proteinen. Vorzugsweise ist das Referenzprotein menschliches OP-1 und die Referenzsequenz davon ist die C-terminale Domäne der sieben Cysteine, die in ostengen aktiven Formen von menschlichem OP-1, Reste 330–431 von SEQ ID NR: 2, anwesend ist. Morphogene Proteine des Knochens, die hier von Nutzen sind, umfassen dem entsprechend allelische, phylogenetische Gegenstücke und andere Varianten der bevorzugten Referenzsequenz, natürlicherweise vorkommend oder biosynthetisch produziert (d. h. einschließlich "Muteinen" oder "mutanten Proteinen"), ebenso wie neue Mitglieder der allgemeinen morphogenen Familie von Proteinen, einschließlich der vorstehend dargestellten und identifizierten. Gewisse insbesondere bevorzugte morphogene Polypeptide haben mindestens eine 60%-ige Aminosäureidentität mit der bevorzugten Referenzsequenz von menschlichem OP-1, noch mehr bevorzugt mindestens eine 65%-ige Aminosäureidentität damit.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die Familie von morphogenen Polypeptiden des Knochens, die bei der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, und Mitglieder davon, durch die generische Aminosäuresequenz definiert. Zum Beispiel erfüllen die Generische Sequenz 7 (SEQ ID NR: 4) und die Generische Sequenz 8 (SEQ ID NR: 5), die nachstehend offenbart werden, die Homlogie, die von den bisher identifizierten Mitgliedern der Proteinfamilie geteilt wird, einschließlich mindestens OP-1, OP-2, OP-3, CBMP-2A, CBMP-2B, BMP-3, 60A, DPP, Vgl, BMP-5, BMP-6, Vgr-1 und GDF-1. Die Aminosäuresequenzen für diese Proteine werden hier beschrieben und/oder im Fachgebiet, wie vorstehend zusammengefaßt. Die generischen Sequenzen umfassen sowohl die Aminosäureidentität, die von diesen Sequenzen in der C-terminalen Domäne geteilt wird, definiert durch die Skelette von sechs oder sieben Cysteinen, (Generische Sequenzen 7 und 8), ebenso wie alternative Reste für die variablen Positionen innerhalb der Sequenz. Die generischen Sequenzen stellen ein geeignetes Skelette von Cysteinen bereit, wobei sich inter- oder intramolekulare Disulfidbindungen bilden können, und enthalten gewisse kritische Aminosäuren, die wahrscheinlich die Tertiärstruktur der gefalteten Proteine beeinflussen. Zusätzlich lassen die generischen Sequenzen ein zusätzliches Cystein an Position 41 (Generische Sequenz 7) oder an Position 46 (Generische Sequenz 4) zu, womit die morphogen aktiven Sequenzen OP-2 und OP-3 umfaßt werden.
  • Generische Sequenz 7
    Figure 00230001
    worin jedes Xaa unabhängig ausgewählt ist aus einer Gruppe von einer oder mehreren spezifischen Aminosäuren, die wie folgt definiert sind: "Res." bedeutet "Rest" und Xaa an Res. 2 = (Tyr oder Lys); Xaa an Res. 3 = (Val oder Ile); Xaa an Res. 4 = (Ser, Asp oder Glu); Xaa an Res. 6 = (Arg, Gln, Ser, Lys oder Ala); Xaa an Res. 7 = (Asp oder Glu); Xaa an Res. 8 = (Leu, Val oder Ile); Xaa an Res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn oder Ser); Xaa an Res. 12 = (Asp, Arg, Asn oder Glu); Xaa an Res. 13 = (Trp oder Ser); Xaa an Res. 14 = (Ile oder Val); Xaa an Res. 15 = (Ile oder Val); Xaa an Res. 16 = (Ala oder Ser); Xaa an Res. 18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa an Res. 19 = (Gly oder Ser); Xaa an Res. 20 = (Tyr oder Phe); Xaa an Res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu oder Gly); Xaa an Res. 23 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa an Res. 26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln, Ala, oder Ser); Xaa an Res. 28 = (Glu, Lys, Asp, Gln oder Ala); Xaa an Res. 30 = (Ala, Ser, Pro, Gln, Ile oder Asn); Xaa an Res. 31 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa an Res. 33 = (Leu, Val oder Met); Xaa an Res. 34 = (Asn, Asp, Ala, Thr oder Pro); Xaa an Res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala oder Lys); Xaa an Res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa an Res. 37 = (Met, Phe, Gly oder Leu); Xaa an Res. 38 = (Asn, Ser oder Lys); Xaa an Res. 39 = (Ala, Ser, Gly oder Pro); Xaa an Res. 40 = (Thr, Leu oder Ser); Xaa an Res. 44 = (Ile, Val oder Thr); Xaa an Res. 45 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa an Res. 46 = (Gln oder Arg); Xaa an Res. 47 = (Thr, Ala oder Ser); Xaa an Res. 48 = (Leu oder Ile); Xaa an Res. 49 = (Val oder Met); Xaa an Res. 50 = (His, Asn oder Arg); Xaa an Res. 51 _ (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val); Xaa an Res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val, Gly oder Leu); Xaa an Res. 53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly oder Phe); Xaa an Res. 54 = (Pro, Ser oder Val); Xaa an Res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val, Pro oder Lys); Xaa an Res. 56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly, Ile oder His); Xaa an Res. 57 = (Val, Ala oder Ile); Xaa an Res. 58 = (Pro oder Asp); Xaa an Res. 59 = (Lys, Leu oder Glu); Xaa an Res. 60 = (Pro, Val oder Ala); Xaa an Res. 63 = (Ala oder Val); Xaa an Res. 65 = (Thr, Ala oder Glu); Xaa an Res. 66 _ (Gln, Lys, Arg oder Glu); Xaa an Res. 67 = (Leu, Met oder Val); Xaa an Res. 68 = (Asn, Ser, Asp oder Gly); Xaa an Res. 69 = (Ala, Pro oder Ser); Xaa an Res. 70 = (Ile, Thr, Val oder Leu); Xaa an Res. 71 = (Ser, Ala, oder Pro); Xaa an Res. 72 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa an Res. 74 = (Tyr oder Phe); Xaa an Res. 75 = (Phe, Tyr, Leu oder His); Xaa an Res. 76 = (Asp, Asn oder Leu); Xaa an Res. 77 = (Asp, Glu, Asn, Arg oder Ser); Xaa an Res. 78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr oder Asp); Xaa an Res. 79 = (Ser, Asn, Asp, Glu oder Lys); Xaa an Res. 80 = (Asn, Thr oder Lys); Xaa an Res. 82 = (Ile, Val oder Asn); Xaa an Res. 84 = (Lys oder Arg); Xaa an Res. 85 = (Lys, Asn, Gln, His, Arg oder Val); Xaa an Res. 86 = (Tyr, Glu oder His); Xaa an Res. 87 = (Arg, Gln, Glu oder Pro); Xaa an Res. 88 = (Asn, Glu, Trp oder Asp); Xaa an Res. 90 = (Val, Thr, Ala oder Ile); Xaa an Res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp, Gln oder Glu); Xaa an Res. 93 = (Ala, Gly, Glu oder Ser); Xaa an Res. 95 = (Gly oder Ala) und Xaa an Res. 97 = (His oder Arg).
  • Die Generische Sequenz 8 (SEQ ID NR: 5) umfaßt die gesamte Generische Sequenz 7 und umfaßt zusätzlich die folgende Sequenz (SEQ ID NR: 6) an ihrem N-Terminus:
  • Figure 00240001
  • Dem entsprechend ist beginnend mit Rest 7 jede "Xaa" in der Generischen Sequenz 8 eine spezifizierte Aminosäure, definiert wie bei der Generischen Sequenz 7, mit dem Unterschied, daß jede Zahl für einen Rest der Generischen Sequenz 7 in der Generischen Sequenz 8 um fünf verschoben ist. Somit betrifft "Xaa an Res. 2 = (Tyr oder Lys)" in der Generischen Sequenz 7 Xaa an Res. 7 in der Generischen Sequenz 8. In der Generischen Sequenz 8, Xaa an Res. 2 = (Lys, Arg, Ala oder Gln); Xaa an Res. 3 = (Lys, Arg, oder Met); Xaa an Res. 4 = (His, Arg oder Gln); und Xaa an Res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr oder Tyr).
  • In einer anderen Ausführungsform umfassen nützliche knochenbildende Proteine diejenigen, die durch die Generischen Sequenzen 9 und 10 definiert sind, wie hier vorstehend beschrieben.
  • Wie vorstehend festgehalten, haben gegenwärtig bevorzugte morphogene Polypeptidsequenzen des Knochens, die bei dieser Erfindung von Nutzen sind, mehr als 60% Identität, vorzugsweise mehr als 65% Identität mit der Aminosäuresequenz, die die bevorzugte Referenzsequenz von hOP-1 definiert. Diese besonders bevorzugten Sequenzen umfassen allelische und phylogenetische Gegenstückvarianten der OP-1- und OP-2-Proteine, einschließlich des Proteins 60A von Drosophila. Dem entsprechend umfassen in gewissen besonders bevorzugten Ausführungsformen nützliche morphogene Proteine aktive Proteine, die Paare von Polypeptidketten innerhalb der generischen Aminosäuresequenz umfassen, die hier als "OPX" (SEQ ID NR: 3) bezeichnet, welche das Skelett von sieben Cysteinen definiert und die Homologien zwischen mehreren identifizierten Varianten von OP-1 und OP-2 beinhaltet. Wie hier beschrieben, wird jedes Xaa an einer gegebenen Position unabhängig ausgewählt aus den Resten, die an der entsprechenden Position in der C-terninalen Sequenz von OP-1 oder OP-2 der Maus oder des Menschen vorkommt.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform haben nützliche, bei der Knochenbildung aktive Proteine Polypeptidketten mit Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfassen, die von einer Nucleinsäure codiert wird, die unter Hybridisierungsbedingungen mit niedriger, mittlerer oder hoher Stringenz mit DNA oder RNA hybridisieren, die morphogene Referenzsequenzen codieren, d. h. C-terminale Sequenzen, die die konservierten Domänen von sieben Cysteinen von OP-1, OP-2, BMP2, 4, 5, 6, 60A, GDF3, GDF6, GDF7 und dergleichen definieren. Wie hier verwendet, sind Hybridisierungsbedingungen mit hoher Stringenz als Hybridisierung gemäß bekannter Verfahren definiert in 40% Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's Lösung und 0.1% SDS bei 37°C übernacht und Waschen mit 0,1 X SSPE, 0.1% SDS bei 50°C. Standardbedingungen für Stringenz sind in kommerziell erhältlichen Standardtexten der molekularen Clonierung gut charakterisiert.
  • Wie vorstehend festgehalten sind bei der vorliegenden Erfindung nützliche Proteine im allgemeinen dimere Proteine, die ein gefaltetes Paar der vorstehenden Polypeptide umfassen. Solche morphogenen Proteine sind inaktiv, wenn sie reduziert sind, sind aber aktiv als oxidierte Homodimere und wenn sie in Kombination mit anderen der Erfindung oxidiert werden, um Heterodimere zu ergeben. Somit können die Mitglieder eines gefalteten Paares von morphogenen Polypeptiden in einem morphogen aktiven Protein unabhängig von jedem der vorstehend erwähnten spezifischen Polypeptide ausgewählt werden.
  • Die morphogenen Proteine des Knochens, die bei den Materialien dieser Erfindung von Nutzen sind, umfassen Proteine, die jede der vorstehend beschriebenen Polypeptidketten umfassen, entweder isoliert aus natürlicherweise vorkommenden Quellen oder hergestellt mittels rekombinanter DNA- oder anderer synthetischer Verfahren und umfassen allelische und phylogenetische Gegenstückvarianten dieser Proteine ebenso wie biosynthetische Varianten (Muteine) davon und verschiedene verkürzte und Fusionskonstrukte. Man stellt sich vor, daß auch Deletions- oder Additionsmutanten aktiv sind, einschließlich derer, die die konservierte C-terminale Domäne mit sechs oder sieben Cysteinen ändern können, mit der Maßgabe, daß die Veränderung nicht die Beziehung dieser Cysteine in der gefalteten Struktur funktionell zerstören. Dem entsprechend werden solche aktiven Formen als das Äquivalent der hier offenbarten, spezifisch beschriebenen Konstrukte betrachtet. Die Proteine können Formen umfassen, die verschiedene Glycosylierungsmuster haben, verschiedene N-Termini, eine Familie von verwandten Proteinen, die Regionen von Aminosäuresequenzhomologie haben, und aktive verkürzte oder mutierte Formen von nativen oder biosynthetischen Proteinen, hergestellt durch Expression von rekombinanter DNA in Wirtszellen.
  • Die hier betrachteten morphogenen Proteine des Knochens können von intakter oder verkürzter cDNA oder von synthetischen DNAs in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden, und gereinigt, gespalten, wiedergefaltet und dimerisiert werden, um morphogen aktive Zusammensetzungen zu bilden. Gegenwärtig bevorzugte Wirtszellen umfassen E. coli oder Säugerzellen, wie CHO-, COS- oder BSC-Zellen. Ausführliche Beschreibungen der bei der Ausführung dieser Erfindung nützlichen morphogenen Proteine des Knochens, einschließlich ihrer Herstellung, Verwendung und Testung auf knochenbildende Aktivität sind in zahlreichen Veröffentlichungen offenbart, einschließlich US-Patent Nr. 5,266,683 und 5,011,691, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
  • Somit können angesichts dieser Offenbarung geübte Gentechniker Gene von cDNA oder genomischen Bibliotheken zahlreicher verschiedener biologischer Arten isolieren, die geeignete Aminosäuresequenzen codieren, oder DNAs aus Oligonucleotiden konstruieren, und sie dann in verschiedenen Arten von Wirtszellen exprimieren, einschließlich Prokaryonten und Eukaryonten, um große Mengen an aktiven Proteinen zu produzieren, die in der Lage sind, die Morphogenese von endochondialem Knochen in einem Säuger zu stimulieren.
  • B. Die Gewinnung von morphogenem Protein des Knochens, OP-1
  • 1. Lyphilisiertes Protein
  • OP-1 kann aus 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, mit 5% Mannitol, Lactose, Glycin oder anderen Zusatz- oder Volumenmitteln unter Verwendung von Standardlyophilisierungsprotokollen lyophilisiert werden. Von auf diese Weise wiederhergestelltem OP-1 ist beobachtet worden, daß es bei Aufbewahrung bei 4°C oder 30°C mindestens sechs Monate biologisch aktiv ist.
  • OP-1 kann auch aus einem Succinat- oder Citratpuffer (oder einem anderen nicht flüchtigen Puffer) für die Wiederherstellung in Wasser lyophilisiert werden, oder von Wasser für die Wiederherstellung in 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5. Im allgemeinen sind Zusatzstoffe wie Lactose, Sucrose, Glycin und Mannitol geeignet für die Verwendung bei lyophilisierten matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen. In gewissen Ausführungsformen können solche Vorrichtungen (0,5 mg/ml OP-1 und 5% Zusatz) vor der Lyophilisierung in einer feuchten oder trockenen Konfiguration hergestellt werden.
  • Zum Beispiel sind flüssige Formulierungen von OP-1 in 10 und 20 mM Acetatpuffer (pH 4, 4,5 und 5) mit und ohne Mannitol (0%, 1% und 5%) für mindestens sechs Monate stabil und ostengen aktiv.
  • II. BETRACHTUNGEN ZUM TRÄGER
  • Wie bereits erklärt, bedeutet "Träger", wie hier verwendet, ein biologisch verträgliches, nicht starres amorphes Material, das keine definierten Oberflächen hat und für die Verwendung bei den Vorrichtungen, Implantaten und Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Geeignete Träger sind nicht partikulär und nicht porös, das heißt porenlos. Trägern, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, fehlt eine Gerüststruktur und sind im wesentlichen matrixfrei. Somit ist "im wesentlichen frei von Matrix" auch so zu verstehen, daß es bedeutet, daß, wenn eine einen Träger enthaltende Vorrichtung an einer defekten Stelle bereitgestellt wird, kein Substrat von einer exogenen Quelle einschließlich des Trägers eingeführt wird, das per se als Gerüst wirken kann. Vor der Verabreichung an und der Implantation in den Empfänger wird von dem Träger wegen seiner chemischen Natur anerkannt, daß er im Wesentlichen nicht in der Lage ist, zu der Vorrichtung eine dreidimensionale Gerüststruktur beizutragen. Bevorzugte Träger sind zumindest vorübergehend adhärent zu Geweben wie Knochen, Knorpel und/oder Muskel. Gewisse bevorzugte Träger sind wasserlöslich, viskos und/oder inert. Zusätzlich tragen bevorzugte Träger nicht ein signifikantes zum Volumen zu einer Vorrichtung bei. Gegenwärtig bevorzugte Träger werden ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: Alkylcellulosen, Pluronics, Gelatinen, Polyethylenglycolen (PEG), Dextrinen, pflanzlichen Ölen und Zuckern. Insbesondere bevorzugte Träger umfassen gegenwärtig, sind aber nicht beschränkt auf, Pluronics F127, Carboxymethylcellulosen (CMC), (d. h. CMC niedriger Viskosität von Aqualon), Lactose, PEG, Mannitol, Sesamöl und Hetastärke (Hespan, Dupont) und Kombinationen davon. Andere bevorzugte Träger umfassen ohne Einschränkung Acetatpuffer, (20 mM, pH 4,5), physiologische Salzlösung und Citratpuffer. Im Falle von Vorrichtungen, die Träger wie Acetat, Pluronics und PBS enthalten, kann die Verabreichung mittels Injektion in einer Ausfällung gewisser knochenbildender Proteine an der Verabreichungsstelle resultieren.
  • III. ÜBERLEGUNGEN ZUR FORMULIERUNG UND ZUR VERABREICHUNG
  • Die Vorrichtungen der Erfindung können unter Verwendung von Routineverfahren formuliert werden. Alles, was erforderlich ist, ist die Bestimmung der gewünschten Endkonzentration des knochenbildenden Proteins pro Volumeneinheit an Träger, wobei man im Gedächtnis halten muß, daß das verabreichte Volumen an Vorrichtung weniger sein wird als das Volumen des Hohlraums an der defekten Stelle. Die gewünschte Endkonzentration an Protein wird von der spezifischen Aktivität des Proteins abhängen ebenso wie von der Art, dem Volumen und/oder der anatomischen Lage des Defekts. Zusätzlich kann die gewünschte Endkonzentration an Protein vom Alter, dem Geschlecht und/oder dem Gesundheitszustand des Empfängers abhängen. Es wurde beobachtet, daß für segmentale Defekte kritischer Größe von etwa mindestens 2,5 cm Länge typischerweise 0,05 ml (oder mg) einer Vorrichtung, die 0,5 bis 1,5 mg knochenbildendes Protein enthält, eine Knochenbildung induziert, die ausreicht, um die Lücke zu füllen. Im Falle von frischen Brüchen mit Defekten nicht kritischer Größe, wurde beobachtet, daß etwa 0,1–0,5 mg Protein die Lücke oder den Defekt reparieren. Die Optimierung der Dosen erfordert nur Routineversuche und gehört zum Können eines Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet.
  • Wie nachstehend beispielhaft dargestellt, können die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl an Konfigurationen annehmen. Zum Beispiel kann eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung in Lösung durch Solubilisierung gewisser Formen von OP-1 in Lösungen von Acetat- (20 mM, pH 4,5) oder Citratpuffern oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,5, formuliert werden. In einigen Fällen kann das knochenbildende Protein nicht vollständig solubilisiert werden und/oder kann bei Verabreichung an der defekten Stelle ausfallen. Suspensionen, Aggregatbildung und/oder in vivo-Präzipitation beeinträchtigen nicht die Wirksamkeit der matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung, wenn sie gemäß der hier offenbarten Erfindung durchgeführt wird. Matrixfreie Vorrichtungen in Lösung sind besonders geeignet für die Verabreichung durch Injektion, wie die Bereitstellung einer Vorrichtung an einer Bruchstelle durch Injektion statt chirurgischer Mittel.
  • Allgemein gesagt unterscheidet sich die Konfiguration von matrixfreien Vorrichtungen, die für die Verabreichung durch Injektion geeignet ist, von denjenigen, die für die Verwendung an einer offenen chirurgischen Stelle bevorzugt werden. Zum Beispiel sind lyophilisierte Herstellungen von matrixfreien Vorrichtungen eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform für die Reparatur dieser Art von Defekt. Die vorstehend beschriebenen matrixfreien Vorrichtungen in Lösung können verwendet werden, um eine lyophilisierte Konfiguration herzustellen. Wie zum Beispiel nachstehend beschrieben kann das knochenbildende Protein OP-1 den vorstehend beschriebenen Puffern beigemischt und dann lyophilisiert werden. OP-1 kann auch aus Mannitol-haltigem Wasser lyophilisiert werden.
  • Wie nachstehend beispielhaft dargestellt, können lyophilisierte Konfigurationen von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen die Knochenbildung in segmentalen Defekten kritischer und nicht kritischer Größe induzieren. Zum Beispiel umfaßt die Bereitstellung einer lyophilisierten Vorrichtung an einer segmentalen defekten Stelle die Ablage von nicht zusammenhängenden Teilmengen der lyophilisierten Vorrichtung entlang der Länge des bloßgelegten Muskels, der den segmentalen Defekt überspannt, so daß die Gesamtzahl an Teilmengen eine Menge an knochenbildendem Protein bereitstellt, die ausreicht, die Knochenbildung zu induzieren, die letztlich den Hohlraum an der defekten Stelle füllt. Der Plazierung folgt der Routineverschluß der defekten Stelle, wobei die Schichten an Muskel und assoziiertem Gewebe Schicht für Schicht vernäht werden, um die Teilmengen im Hohlraum an der defekten Stelle einzuschließen. Diese Art von Verabreichung und chirurgischem Verschluß erfordern nur Routinekönnen und -versuche. Ähnliche Formulierungen und Verabreichungsverfahren können verwendet werden, um die Knochenbildung für die Reparatur von Lücken zu induzieren, die durch fehlende Prosthetic, Knochentumorresektion, Schädel-/Gesichtsrekonstruktion, Rückgratverschmelzung und massive Allograftdefekte verursacht sind. Alle Modifikationen der vorstehend beschriebenen Verabreichungsverfahren, die für spezialisierte Anwendungen von lyophilisierten matrixfreien Vorrichtungen erforderlich sind, gehören zum Können des Durchschnittsfachmanns und erfordern lediglich Routineversuche.
  • Noch eine andere Konfiguration von matrixfreien Vorrichtungen ist nachstehend beispielhaft dargestellt. Das knochenbildende Protein und ein Träger wie Carboxymethylcellulose (niedrige Viskosität, Aqualon, oder Pluronic F127 können zusammengemischt werden, um eine Paste zu bilden. In einigen Ausführungsformen wird ungefähr Salzlösung zu dem Träger zugegeben, um eine Paste zu bilden; in der ein knochenbildendes Protein wie OP-1 dispergiert werden kann. Eine Pastenkonfiguration kann verwendet werden, um die Oberfläche eines Defektes, wie einem Hohlraum, zu bestreichen. Pasten können verwendet werden, um Bruchdefekte zu bestreichen, chondrale oder osteochondrale Defekte, ebenso wie Knochendefekte an einer prothetischen Implantationsstelle. Eine Paste kann auch injiziert werden oder ausgepreßt in einen oder entlang einer der Oberfläche eines Defekts, auf eine ähnliche Weise wie das Ausdrücken von Zahnpasta oder Dichtmasse aus einer Tube, so daß ein Bett an matrixfreier Vorrichtung entlang der Länge der defekten Stelle verabreicht wird. Typischerweise wird der Durchmesser des ausgepreßten Betts von der Art des Defekts bestimmt, ebenso wie vom Volumen des Hohlraums an der defekten Stelle.
  • Es können auch Träger wie Carboxymethylcellulose verwendet werden, um eine Vorrichtung mit einer Konfiguration wie ein Kitt zu formulieren. Wie für den Durchschnittsfachmann offensichtlich ist resultiert eine solche Konfiguration aus der Anpassung des Anteil an Träger im Verhältnis zum Befeuchtungsmittel, wobei weniger Befeuchtungsmittel eine trockenere Vorrichtung produziert und mehr eine feuchtere Vorrichtung produziert. Die genaue Konfiguration der Vorrichtung, die geeignet ist, einen Defekt zu reparieren, wird mindestens von der Art des Defekts und von der Größe des Defekts abhängen. Der Durchschnittsfachmann wird diese Variablen kennen.
  • Noch eine andere Konfiguration, die geeignet ist für die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung, ist ein Gel. Dies wird nachstehend beispielhaft durch die Pluronic enthaltende matrixfreie Vorrichtung dargestellt, die Knochenbildung in vivo induzieren kann. Gele dieser Art wurden verwendet, um Brüche zu behandeln ebenso wie Lückenreparaturen. Eine nützliche Eigenschaft dieser Konfiguration ist, daß die Viskosität des Gels durch Anpassung der Menge an Träger manipuliert werden kann, womit ein weiter Bereich an Anwendungen (z. B. segmentale Defekte, Brüche und Rekonstruktionen) und Verabreichungsarten (z. B. Injektionen, Bestreichen, Auspressen und dergleichen) zugänglich ist. Somit kann diese Form der Vorrichtung mindestens die Formen einer injizierbaren Flüssigkeit, einer viskosen Flüssigkeit und eines auspreßbaren Gels annehmen, indem man einfach die Menge an Träger manipuliert, in der das knochenbildende Protein dispergiert wird.
  • In noch anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Herstellungen der aktuellen knochenbildenden Vorrichtung unmittelbar vor der Verabreichung an dem defekten Ort erfolgen. Zum Beispiel können CMC enthaltende Vorrichtungen vor Ort hergestellt werden, geeignet für die Zumischung unmittelbar vor der Chirurgie. In einer Ausführungsform wird das CMC mit niedriger Viskosität (Aqualon) getrennt vom knochenbildenden Protein OP-1 verpackt und bestrahlt. Das OP-1-Protein wird dann dem CMC-Träger zugemischt und auf knochenbildende Aktivität getestet. Bei auf diese Weise hergestellten Vorrichtungen wurde beobachtet, daß sie so biologisch aktiv sind wie die herkömmliche Vorrichtung ohne CMC. Wiederum ist nur die Bestimmung der wirksamen Menge an knochenbildendem Protein erforderlich, die eine Knochenbildung induziert, die ausreicht, die defekte Stelle zu füllen und ein Vorrichtungsvolumen einhält, das kleiner ist als das Volumen der defekten Stelle. Die genaue Art, in der die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung formuliert wird, und wann oder wie die Formulierung erfolgt, ist für die Ausführung nicht kritisch.
  • Die Ausführung der Erfindung wird noch vollständiger durch die folgenden Beispiele verstanden, die hier nur zur Illustration dargestellt sind und keinesfalls als Beschränkung der Erfindung verstanden werden sollten.
  • N. BIOLOGISCHER TEST A. Biologischer Test auf knochenbildende Aktivität: endochondrale Knochenbildung und verwandte Eigenschaften Im folgenden werden innerhalb des Umfangs der Erfindung des Anmelders liegende Protokolle für die Identifikation und Charakterisierung bona fide von knochenbildenden Proteinen oder morphogenen Proteinen des Knochens ebenso wie knochenbildenden Vorrichtungen dargestellt.
  • Der im Stand der Technik anerkannte biologische Test für die Knochenbildung, wie beschrieben von Sampath und Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 6591–6595) und in dem US-Pat. Nr. 4,968,590, deren Offenbarung durch Bezugnahme hier eingeschlossen sind, wird verwendet, um die Wirksamkeit der Reinigungsprotokolle zu belegen. Wie nachstehend gezeigt, besteht dieser Test in der Aufbringung der Testproben auf subkutane Stellen bei allogenen Ratten unter Ätherbetäubung. In die Haut über dem Bereich des Brustkorbs wird unter sterilen Bedingungen ein vertikaler Einschnitt (1 cm) gemacht und mittels stumpfer Sektion eine Tasche hergestellt. Unter gewissen Umständen werden etwa 25 mg Testprobe tief in diese Tasche implantiert und der Einschnitt mit einem Metallclip geschlossen. Die heterotrope Stelle läßt die Untersuchung der Induktion des Knochens zu ohne mögliche Zweideutigkeiten, die bei Verwendung von orthotopen Stellen resultieren.
  • Die aufeinanderfolgenden zellulären Reaktionen, die an der heterotropen Stelle auftreten, sind komplex. Die vielstufige Kaskade der endochondralen Knochenbildung umfaßt: Bindung von Fibrin und Fibronectin an die implantierte Matrix, Chemotaxis von Zellen, Proliferation von Fibroblasten, Differenzierung in Chondroblasten, Knorpelbildung, Einwachsen von Blutgefäßen, Knochenbildung, Ummodellierung und Knochenmarkdifferenzierung.
  • Bei Ratten zeigt dieses biologische Modell eine kontrollierte Progression durch die Stadien der Matrix-induzierten endochondralen Knochenentwicklung einschließlich: (1) transiente Infiltration durch polymorphonucleäre Leukocyten am Tag eins; (2) die Wanderung und Proliferation von mesenchymalen Zellen an den Tagen zwei und drei; (3) das Auftauchen von Chondrocyten an den Tagen fünf und sechs; (4) die Bildung von Knorpelmatrix am Tag acht; (5) Calcifizierung des Knorpels am Tag acht (9) Einwachsen von Gefäßen, Erscheinen von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (10) Erscheinen der Ummodellierung von Osteaoblasten und Knochen an den Tagen zwölf bis achtzehn; und (11) hämotopoetische Knochenmarksdifferenzierung in dem Knöchelchen am Tag einundzwanzig.
  • Histologische Sezierung und Anfärbung wird vorgezogen, um das Ausmaß an Knochenbildung in den Implantaten zu bestimmen. Anfärbung mit Toluidinblau oder Hämotoxylin/Eosin zeigt klar die letztliche Entwicklung von endochondralem Knochen: Biologische Tests von zwölf Tagen sind üblicherweise ausreichend, um zu bestimmen, ob eine Knochen induzierende Wirkung mit der Testprobe assoziiert ist.
  • Zusätzlich kann die Aktivität der alkalischen Phosphatase als Marker für die Knochenbildung verwendet werden. Die Enzymaktivität kann nach Homogenisierung des ausgeschnittenen Testmaterials spektrophotometrisch bestimmt werden. Die Aktivität hat ihren Höhepunkt an den Tagen 9–10 in vivo und nimmt danach langsam ab. Proben, die bei der Histologie keine Knochenentwicklung zeigen, sollten bei diesen Testbedingungen keine Aktivität der alkalischen Phosphatase haben. Dieser Test ist von Nutzen bei der Quantifizierung und um eine Abschätzung der Knochenbildung sehr schnell nach der Entnahme der Testproben von der Ratte zu bekommen. Es wurden zum Beispiel Proben, die knochenbildendes Protein mit mehreren verschiedenen Reinheitsstufen enthielten, getestet, um die wirksamste Dosis/den wirksamsten Reinheitsgrad zu bestimmen, um eine Formulierung zu finden, die im Industriemaßstab produziert werden könnte. Die Resultate, wie sie als Niveau der Aktivität der alkalischen Phosphatase und der histologischen Bewertung gemessen werden, können als "knochenbildende Einheiten" dargestellt werden. Eine knochenbildende Einheit stellt die Menge an Protein dar, die für die halb-maximale knochenbildende Aktivität am Tag 12 erforderlich ist. Zusätzlich können Dosiskurven für die Knochen induzierende Aktivität in vivo bei jedem Schritt eines Reinigungsschemas konstruiert werden, indem man verschiedenen Konzentrationen an Protein tested. Dem entsprechend kann der Durchschnittsfachmann repräsentative Dosiskurven unter Verwendung von lediglich Routineversuchen konstruieren.
  • B. Knochenbildung nach der Implantierung von knochenbildenden, matrixfreien OP-1-Vorrichtungen Knochenbildende Vorrichtungen wurden mit 62,5 μg lyophilisiertem OP-1 mit oder ohne 25 mg Kollagenmatrix hergestellt. Diese Vorrichtungen wurden durch ihre Fähigkeit bewertet, die Knochenbildung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen ectopischen Knochenbildungstests an der Ratte an sowohl intramuskulären als subkutanen Stellen zu fördern. Zusätzlich wurde die Masse an gebildetem Knochen durch Messung der Calciumgehalte und Gewichte der entfernten Vorrichtungen bewertet. Die geschaffenen Daten sind in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.
  • Wie aus der Histologie und dem Calciumgehalt offensichtlich bildete sich Knochen als Antwort auf alle matrixfreien OP-1-Proben. Diese Daten zeigen, daß die Implantierung einer matrixfreien OP-1-Vorrichtung allein ausreichend ist, die endochondrale Knochenbildung an ectopischen Stellen der Ratte zu induzieren.
  • Tabelle 1. Knochenbildung gg. Konzentrationen von OP-1 Intramuskuläre Stelle
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Tabelle 2. Knochenbildung gg. Konzentrationen von OP-1 Subkutane Stelle
    Figure 00350002
  • C. Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen, die wasserlösliche Träger enthalten
  • Auch OP-1, das wasserlöslichen Trägern zugemischt war, fördert die Knochenbildung. Bei dieser Untersuchung wurden Mannitol, Carboxymethylcellulose, Dextrin, PEG3350, ein Pluronic-Gel und Kollagen durch Zugabe von 0,9%-iger steriler Salzlösung zu einer Paste formuliert. Zehn μg an in Wasser aufgelöstem OP-1 wurden zu der Paste zugegeben, um eine matrixfreie Vorrichtung herzustellen, und die Vorrichtung wurde unmittelbar intramuskulär in Ratten injiziert. Nach 12 Tagen, wurden die implantierten Vorrichtungen entfernt und mittels Calciumgehalt und Histologie auf Knochenbildung bewertet. Diese Daten bestätigen die vorstehend beschriebene Beobachtung, daß eine Kollagenmatrix für die Induktion einer volumenfüllenden Knochenbildung nicht essentiell ist. Von den bewerteten wasserlöslichen Trägern zeigt Mannitol insgesamt die besten Resultate, wobei die anderen relativ vergleichbar erschienen.
  • TABELLE 3
    Figure 00360001
  • D. Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen in Lösung
  • Von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen in Lösung wurde auch gezeigt, daß sie die Knochenbildung induzieren, wenn sie intramuskulär (IM) oder intradermal (ID) verabreicht werden. In einem beispielhaften Experiment wurden matrixfreie OP-1-Vorrichtungen in 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, hergestellt. Die Vorrichtungen wurden so hergestellt, daß die gewünschte Dosis (5–50 mg) an OP-1 in 100 μl Injektionsvolumen verabreicht würde. Beide Arten der Verabreichung induzierten die Knochenbildung, wie mittels Calciumgehalt, Histologie und Explantgewicht gemessen.
  • E. Pluronic-Gel enthaltende matrixfreie OP-1-Vorrichtung
  • Gegenwärtig bevorzugte Experimente wurden mit einer Pluronic-Formulierung der matrixfreien OP-1-Vorrichtung begonnen. In einer Ausführungsform hat diese Vorrichtung die einzigartige Eigenschaft, bei Kühlschranktemperaturen flüssig zu sein, aber Gel-ähnlich, wenn sie auf Raumtemperatur erwärmt wird. Dies erlaubt, daß die Vorrichtung in eine Spritze gezogen wird, wenn sie kalt ist und nach einigen Minuten bei Raumtemperatur eine leichte Injektion zuläßt. Dies war von Nutzen für die Injektion solcher OP-1-Vorrichtungen in Bruchstellen, da das Gel die Erhaltung von OP-1 an der Stelle der Verletzung zuläßt.
  • Pluronic-Gel, das aus 0,5 g kommerziell erhältlichem Pluronic F127 hergestellt wurde, zu dem 1,35 ml Wasser zugegeben wurden, ist bei Kühlschranktemperatur eine visköse Flüssigkeit und bei Raumtemperatur ein halbfestes Gel. Nach 12 Tagen wurde als Reaktion auf IM Verabreichung von matrixfreien OP-1-Pluronic-Gel-Vorrichtungen die Knochenbildung beobachtet. Das Gel wurde nicht direkt in den Muskel injiziert, sondern wurde ohne Verwendung einer Nadel in den Muskellappen injiziert. Knochen bildete sich auch als Reaktion auf SC Verabreichung derselben Pluronic-Gel-Vorrichtungen. Die OP-1-Dosis (5–25 mg) war in 50 μg Gel enthalten.
  • Die Wiedergewinnung von OP-1 aus den Gel-Vorrichtungen wurde durch Extraktion mit 8 M Harnstoffpuffer und Injektion des Extrakts in eine HPLC bestimmt. Es wurde eine 100%-ige Wiedergewinnung von OP-1 aus dem Gel erhalten. Außerdem waren die Harnstoffextrakte von ausgewählten Gelen so aktiv wie ein OP-1-Standard. Eines der Gele wurde zum Beispiel nach 10 Tagen Lagerung bei Kühlschranktemperatur in einer Spritze wieder extrahiert; es wurde eine 100%-ige Wiedergewinnung von OP-1 erhalten und erneut war der Extrakt so aktiv wie ein OP-1-Standard.
  • Wie nachstehend beschrieben, kann sterilgefiltertes OP-1 zu autoklaviertem oder bestrahltem Gel in aseptischer Weise zugegeben werden, so daß eine sterile Vorrichtung bereitgestellt werden kann.
  • OP-1 wurde autoklavierten Pluronic-Gelen zugemischt. Das Gel wurde hergestellt, autoklaviert und dann gekühlt, so daß es sich vor der Zumischung von OP-1 verflüssigte. Das OP-1-Gel wurde dann in Spritzen gefüllt, die bei 5°C aufbewahrt wurden. Es wurde beobachtet, daß die Proben mindestens 2 Wochen bei 5°C stabil waren. Ungefähr mindestens 50–60% des ursprünglichen OP-1 verblieben nach 7 Wochen Lagerung bei 5°C. Gele wurden auch aus bestrahltem Pluronic F127 hergestellt. Wiedergewinungen von 40–50% wurden nach 7 Wochen bei 5°C beobachtet.
  • Ein zweiter Zeitverlauf wurde zum Zweck der Bewertung der Knochenbildung als Reaktion auf matrixfreie OP-1-Pluronic-Gel-Vorrichtungen durchgeführt. Volumen von 50 μl an Pluronic-Gel, die 0 oder 10 μg an OP-1 enthielten, wurden in einen Muskellappen injiziert. Implantate, die am Tag 7, 12 und 21 entnommen wurden, wurden auf ihren Calciumgehalt und die Aktivität der alkalischen Phosphatase analysiert. Der Zeitverlauf der Knochenbildung war ähnlich dem, der mit der Standard-OP-1-Vorrichtung beobachtet wurde, die Kollagen enthielt.
  • V. TIERSTUDIEN: VERFAHREN DER VERWENDUNG VON MATRIXFREIEN OP-1-VORRICHTUNGEN UND -IMPLANTATEN
  • A. Heilung von segmentalen Defekten kritischer Größe in Hunden unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
  • 1. Experiment 1
  • Die folgenden Experimente zeigen die Wirksamkeit von injizierbaren und gefriergetrockneten Formulierungen von rhOP-1 für die Heilung von segmentalen Defekten kritischer und unkritischer Größe in einem etablierten Ulna-Defektmodell des Hundes. Drei Formulierungen von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen, die alle OP-1 enthielten, wurden in Defekten kritischer Größe (2,5 cm) und/oder Defekten unkritischer Größe (5 mm, 3 mm, 1,5 mm) bewertet. Wie vorstehend beschrieben, sind Defekte kritischer Größe Defekte, die nicht spontan heilen. Die . drei bewerteten Formulierungen waren (1) 20 mM Acetatpufferlösung (pH 4,5); (2) phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, etwa pH 7,5); und (3) lyophilisiertes (gefriergetrocknetes) Protein allein. Die Menge an OP-1, die an den Defekten kritischer Größe bereitgestellt wurde, war 1,75 mg; 0,35 mg Protein wurde an den Defekten mit unkritischer Größe bereitgestellt. Unmittelbar vor dem Verschluß der Wunde wurde OP-1 mit Acetat oder PBS zugemischt und dann mit insgesamt 1 ml an der defekten Stelle injiziert. Lyophilisierte Proben wurden entlang der Länge des Defekts in 5 separaten Teilmengen in diskreten, nicht zusammenhängenden Orten entlang der Länge des Defekts plaziert.
  • Unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren wurden osteoperiosteale segmentale Defekte der zuvor beschriebenen Größe bilateral in der mittleren Region der Ulna von zwanzig erwachsenen, zu diesem Zweck gezüchteten Mischlingshunden geschaffen. Alle Tiere waren zwischen einem und zwei Jahren alt, wogen 35 bis 50 Pfund und wurden von Lieferanten mit USDA-Lizenz bereitgestellt. Eine spezielle Aufmerksamkeit wurde darauf gerichtet, Tiere einheitlicher Größe und einheitlichen Gewichts auszuwählen, um Abweichungen bei der Knochengeometrie und -last zu beschränken. Die Tiere wurden vor der Operation radiographisch durchmustert, um sich der richtigen Größe und der Reife des Skeletts zu versichern und daß keine offensichtlichen Abnormalitäten der Knochen existierten. Die Tiere wurden auch klinisch überprüft, um akute und chronische medizinische Zustände während einer Quarantänezeit von zwei Wochen auszuschließen. Ein vollständiges Blutbild mit Zelldifferenzierung wurde vor der Chirurgie durchgeführt.
  • Der Bogen wurde wegen der mechanischen Stabilität beibehalten, aber es wurde keine interne oder externe Fixierung verwendet. Die Stelle wurde mit Salzlösung gespült, um Knochensplitter und ausgetretene Markzellen zu entfernen, dann getrocknet und vor der Bereitstellung der Formulierung an der Stelle wurde Homöostase erreicht. Die weichen Gewebe wurden vor der Injektion der Formulierungen 1 oder 2 (Acetat oder PBS) sorgfältig in Schichten geschlossen. Die Formulierung der Vorrichtung 3 (lyophilisiertes Protein allein) wurde vor der Schließung der Gewebeschichten entlang dem Raum zwischen den Knochen plaziert, um das Implantat zu enthalten. Das Verfahren wurde dann auf der contralateralen Seite wiederholt, außer daß vor dem Wundverschluß keine OP-1-Vorrichtung bereitgestellt wurde.
  • Den Tieren wurden nach der Chirurgie intramuskulär vier Tage lang Antibiotika verabreicht und unmittelbar nach dem Eingriff wurden routinemäßig vorher-nachher-Radiogramme aufgenommen, um sich einer einwandfreien Plazierung zu versichern. Die Tiere wurden nach der Operation für 24 bis 72 Stunden in 3 × 4 Erholungskäfigen gehalten, danach wurden sie in Geläufe transferiert und ihnen die uneingeschränkte Bewegung erlaubt.
  • Es wurden zweiwöchige Radiogramme aufgenommen, um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Zusätzlich wurde zweiwöchig vor der Operation bis zur Tötung Blut (Serum) entnommen, um die Antikörperbildung durch den Sponsor zu untersuchen. Bei der Tötung wurde alle Ulnae en bloc entnommen und diejenigen, die ausreichend geheilt waren, wurden durch Torsion mechanisch getestet. Segmente wurden mittels Histologie auf Gewebeantwort, Knochenarchitektur und Ummodellierung, und Qualität und Menge an neuer Knochenbildung und -heilung bewertet.
  • Die Tiere wurden 4, 6, 8 oder 12 Wochen nach der Operation getötet.
  • 1b(3). Radiogramme
  • Radiogramme der Vorderglieder wurden zweiwöchig bis acht Wochen nach der Operation aufgenommen und dann wiederum bei der Tötung an Woche zwölf nach der Operation. Es wurden Standardaufnahmezeiten und -intensitäten verwendet, und es wurden Sandsäcke verwendet, um die Extremitäten in konsistenter Weise zu positionieren. Die Radiogramme wurden bewertet und mit früheren Radiogrammen verglichen, um die Qualität und Geschwindigkeit der Defektheilung einzuschätzen.
  • Mechanische Testung
  • Unmittelbar nach der Sektion, wenn die Heilung durch Befühlen mit der Hand ausreichend erschien, wurden Proben auf Versagen bei Verdrehung auf einer MTS hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf (Minneapolis, MN) getestet, die unter Hubkontrolle bei einer konstanten Vorschubrate von 50 mm/Min. in einer zylindrischen Aluminiummuffe und einzementiert mit Methylmethacrylat geführt wurde, unter Verwendung des Protokolls des Herstellers. Ein Ende war starr fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn gedreht. Da die Ulna des Hundes eine leichte Krümmung hat, wurden die Proben exzentrisch montiert, um die Drehung der Proben coaxial mit der der Testvorrichtung zu halten. Die Torsionskraft wurde mittels eines Hebelarms von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen. Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online Aufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis zum Versagen erhalten wurden, und die Energieaufnahme bis zum Versagen als die Fläche unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
  • Ergebnisse
  • Die Knochenheilungscharakteristika, mechanische Stärke und Histologie von Ulna-Defekten kritischer Größe, die mit rhOP-1 ohne Trägermaterial behandelt worden waren, waren ähnlich denen von Defekten, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren. In Kürze waren die experimentellen Beobachtungen wie folgt: die radiographisch beobachteten Knochenneubildung und Heilmuster bei Defekten, die mit rhOP-1 ohne Marix behandelten wurden, waren ähnlich den Heilmustern, die vorstehend mit der herkömmlichen, Kollagen enthaltenden OP-1-Vorrichtung beobachtet wurden. Im allgemeinen war die Knochenneubildung schon zwei Wochen nach der Operation offensichtlich. Der neue Knochen fuhr bis zur Tötung zwölf Wochen nach der Operation fort, sich zu verdichten, zu konsolidieren und sich umzugestalten. Diese Untersuchung zeigte, daß eine funktionelle Knochenvereinigung mit menschlichen OP-1-Vorrichtungen ohne Matrix möglich ist. Außerdem waren das Erscheinungsbild und die Charakteristika der Histologie nach zwölf Wochen ähnlich dem, wie sie mir der herkömmlichen, Kollagen enthaltenden Matrix OP-1-Vorrichtung beobachtet wurden. Von den sechs Defekten, die mit einer matrixfreien OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren, hatten vier zwölf Wochen nach der Operation solide knochige Verbindungen. Die restlichen beiden Defekte in demselben Tier zeigten radiographisch etwas frühe Knochenneubildung, waren jedoch bei der Tötung unvollständig überbrückt oder gefüllt mit neuem Knochen. Die mittlere Torsionslast bis zum Versagen des geheilten Defekts war 40,05 N (Dies stellt das Äquivalent von etwa 79% von zuvor getesteten segmentalen Defekten dar, die mit der herkömmlichen, Kollagen enthaltenden OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 61% von zuvor getesteter intakter Kontroll-Ulna).
  • Radiographisch wurde bei allen drei Formulierungen zwei Wochen nach der Operation eine extensive Knochenneubildung beobachtet. Zwischen zwei bis 12 Wochen erhöhte der neue Knochen sein Volumen und seine Radiodichtigkeit und füllte und überbrückte die Defekte. 12 Wochen nach der Operation (Tötung) hatte der radiodichte neue Knochen die Defekte, die mit rhOP-1-Formulierungen behandelt worden waren, signifikant gefüllt und überbrückt. Alle rhOP-1-Defekte bei der Tötung nach 12 Wochen mechanisch stabil und mit neuem Knochen überbrückt. Bei dem radiographischen Erscheinungsbild wurden zwischen den drei Formulierungen keine signifikanten Unterschiede gefunden, obwohl die Formulierungen 1 und 2 zu allen Zeitpunkten leicht besser wirkten als Formulierung 3.
  • Histologisch war proliferierender neuer Knochen innerhalb und in der Umgebung der Defekte vorhanden, die mit rhOP-1 behandelt worden waren. Die Überbrückung der Defekte und knochige Heilung waren im Wesentlichen 12 Wochen nach der Operation vollständig mit Lücken von Fibroknorpel zwischen Flächen von neuem signifikanten Knochenwachstum. Anzeichen für frühe Cortexentwicklung mit Verdichtung der Ränder von neuem Knochen waren bei allen rhOP-1-Defekten vorhanden. Es gab keine Unterschiede in der Bewertung der histologischen Reihenfolge, basierend auf der Art der Formulierung, obwohl Formulierung 2 bei der Qualität der Verbindung besser abschnitt als die Formulierungen 3 und 1.
  • Die mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung 1 war 47,64 N (94% der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 73% der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Die mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung 2 war 51,96 N (102% der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 80% der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Die mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung 3 war 50,86 N (100% der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 78% der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den mechanischen Testergebnissen zwischen den Formulierungsarten festgestellt. Defekte der Formulierung 2 waren bei der maximalen Last beim Versagen etwas besser als Formulierungen 3 und 1.
  • Tabelle 4. Mechanische Testergebnisse für Defekte mit kritischer und unkritischer Größe, die mit rhOP-1 behandelt wurden, gegenüber nicht behandelten Kontrollen. Mittel ± SD (Probengröße)
    Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Es wurden auch Formulierungen getestet, die 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5 und 5% Mannitol verwendeten. Untersuchungen unter Verwendung von unkritischen Defekten (5 mm Lücken) zeigten eine klare Verbesserung bei der Heilungsrate, wenn OP-1 anwesend war, im Vergleich mit Kontrollen. Spezifisch zeigten die Kontrollen im Durchschnitt nach 8 Wochen 14% der Stärke von intakten Ulnae, während mit OP-1 behandelte Defekte im Durchschnitt 79% zeigten. Radiographisch war schon nach zwei Wochen nach der Operation neuer Knochen offensichtlich und begann nach acht Wochen signifikant die Defekte zu füllen und zu überbrücken, die mit rhOP-1-Formulierungen behandelt worden waren. Keiner der sechs unbehandelten Kontrolldefekte war am Ende des Untersuchungszeitraums komplett geheilt. Einer der drei Defekte mit Formulierung 1 (Acetatpuffer) und drei der drei Defekte, die mit Formulierung 2 (PBS) behandelt worden waren, waren nach 8 Wochen vollständig mit neuem Knochen gefüllt und überbrückt. Alle sechs Defekte, die OP-1 erhielten, hatten Knochenneubildung und waren mechanisch stabil. Defekte mit Formulierung 2 waren signifikant besser bei den Resultaten der radiographischen Bewertung, bei der bis zum Versagen absorbierten Energie und bei der histologischen Qualität der Verbindung als mit Formulierung 1 behandelte Defekte. Andererseits wurden zwischen den beiden Formulierungen keine Unterschiede bei der mittleren Belastung beim Versagen, der Winkeldeformation und dem histologischen Gesamterscheinung gefunden. Beide Formulierungen waren bei allen Kategorien signifikant besser als Kontrolldefekte. Histologisch war proliferierender neuer Knochen innerhalb und in der Umgebung der Defekte vorhanden, die mit rhOP-1 behandelt worden waren. Die Überbrückung der Defekte und knochige Heilung waren 8 Wochen nach der Operation fast vollständig mit Lücken von Fibroknorpel zwischen Flächen von signifikantem neuem Knochenwachstum. Anzeichen für frühe Cortexentwicklung und Knochenremodellierung waren bei einigen der rhOP-1-Defekte vorhanden. Alle unbehandelten Kontrollen resultierten in unvollständigen Vereinigungen, obwohl potentiell eine längerfristige Heilung durch eine gewisse Knochenneubildung an den Wirtsknochenenden und endostealen Regionen angezeigt wurde. Die mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung 2 war 53,23 N (104,5% der Defekte mit kritischer Größe, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 81,6% der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Der Vergleich von Defekten unkritischer Größe, die mit 0,35 mg OP-1 behandelt worden waren, mit zuvor getesteten Defekten kritischer Größe, die mit 1,5 mg OP-1 ohne Trägermaterial behandelt worden waren (injizierbare Formulierungen) zeigten keinen signifikanten Unterschied bei der mittleren Beladung beim Versagen.
  • C. Heilung von Bruchdefekten unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
  • 1. Bruchuntersuchung am Kaninchen
  • Die Untersuchung eines Reparaturmodells von Brüchen bei Kaninchen (Mittelschaftbruch der Ulna) zeigt auch die Wirksamkeit der Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung. Diese Untersuchung verglich die Wirkung der Verabreichung von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen in drei Konfigurationen: 1) Acetatpuffer pH 4,5 (lösliches OP-1), 2) PBS (Suspension von OP-1) und 3) Pluronic-Gel. Vier Kaninchen wurden in jeder Gruppe unmittelbar nach der Bildung des Bruchs behandelt; contralaterale Kontrollen waren Arme ohne Defekt. Die Tiere wurden 3 Wochen nach der Behandlung getötet. Zusammenfassend zeigten Tiere, denen die Acetat oder Pluronic enthaltenden OP-1-Vorrichtungen injiziert worden waren, einen signifikant größeren Bruchkallus bei radiographischer, Tast- und histologischer Untersuchung. Die mittlere Torsionsbelastung bis zum Versagen für alle Ulnae, die mit OP-1 behandelt worden waren, war 8,89 ± 2,99 N (Mittelwert f Standardabweichung) (8 Proben). Während die mittlere Torsionsbelastung bis zum Versagen für unbehandelte Kontroll-Ulna 7,9 2,92 N war (9 Proben).
  • 1a. Beschreibung des Testmaterials
  • Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen in Lösung wurden verwendet. Die drei bewerteten Lösungskonfigurationen waren: (1) rhOP, zugemischt einer phosphatgepufferten Salzlösung, 8,71 mg OP-1/ml. Die Vorrichtungen wurden in einzelne Röhrchen verpackt. Der geschätzte Bereich des verabreichten Vorrichtungsvolumens war zwischen 30 μl und 110 μl pro Stelle; (2) rhOP, zugemischt 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, 0,99 mg OP-1/ml. Die Vorrichtungen wurden in einzelne Röhrchen verpackt, die 130 μl enthielten. Die Vorrichtung wurde in eine Spritze gezogen. In allen Fällen wurden weniger als 100 μl an jeder Stelle verabreicht. Der geschätzte Bereich von verabreichtem Implantatvolumen war zwischen 60 μl und 90 μl pro Stelle; und (3) rhOP in Pluronic-Gel, 0,87 mg OP-1/ml. Die Vorrichtung wurde in eine Spritze gepackt. Die Vorrichtung wurde bis zur Verabreichung an der defekten Stelle gekühlt aufbewahrt (verstrichene Zeit weniger als eine Minute). Jedes Dicke Gel wurde in allen Fällen unter Verwendung einer Nadel mit großer Kalibrierung (18) verabreicht.
  • In allen Fällen wurden die Dosierungen kalibriert, um etwa 100 μg rhOP-1 an jeder Bruchstelle zu verabreichen.
  • Insgesamt wurden zwölf erwachsene männliche While New Zealand-Kaninchen, die zu diesem Zweck gezüchtet worden waren und die beim Beginn der Untersuchungen mindestens 9 Monate alt waren, verwendet. Alle Tiere waren vom Skelett her reif und wogen zwischen 2,4 und 3,0 kg und wurden von Lieferanten mit USDA-Lizenz bereitgestellt. Die Tiere wurden untersucht, um akute oder chronische medizinische Bedingungen während einer Quarantäneperiode auszuschließen und wurden radiographisch untersucht, um sich einer geeigneten Größe, Reife des Skeletts zu versichern und das keine offensichtlichert Anormalitäten im Knochenbau existierten. Eine spezielle Aufmerksamkeit wurde darauf gerichtet, Tiere von einheitlichem Geschlecht, einheitlicher Größe und einheitlichem Gewichts auszuwählen, um Abweichungen bei der Stärke der geheilten Brüche zu beschränken. Expertimentelle traverse Brüche wurden unter Verwendung chirurgischer Standardverfahren bilateral in der zentralen Ulna von jedem Tier geschaffen. Die linke Ulna diente bei jedem Tier als unbehandelte Kontrolle. In Kürze wurden unter Verwendung von aseptischen Standardverfahren bilaterale Brüche induziert, indem laterale Schnitte von etwa 2,0 cm Länge gemacht wurden und die Freilegung der rechten Ulna wurde durch scharfe und stumpfe Sektion erreicht. Eine transverse Osteotomy wurde in der Mitte der Ulna unter Verwendung einer elektrischen chirurgischen Säge erzeugt. Die Stelle wurde dann mit resorbierbarem Faden geschlossen. Eine matrixfreie OP-1-Vorrichtung in Lösung wurde dann durch die weichen Gewebe in die Bruchstelle injiziert. Das Verfahren wurde dann auf der linken Seite wiederholt mit der Ausnahme, daß diesen Bruchstellen keine OP-1-Vorrichtung bereitgestellt wurde.
  • Den Tieren wurden intramuskulär vier Tage lang nach der Chirurgie Antibiotika verabreicht. Die Tiere wurden nach der Operation in Erholungskäfigen gehalten, bis sie bei vollem Bewußtsein waren und ihr Gewicht trugen, wonach sie in Standardkäfige transferiert wurden und ihnen die uneingeschränkte Bewegung erlaubt wurde. Die Glieder wurden nicht geformt.
  • Wöchentliche Radiogramme wurden aufgenommen, um das Fortschreiten der Heilung zu beobachten. Alle Tiere wurden drei Wochen nach der Operation getötet. Alle Ulnae wurden en bloc gewonnen und mechanisch durch Torsion getestet. Die Bruchheilung wurde weiterhin mittels Histologie auf die Qualität und Menge von Knochenneubildung und Heilung bewertet.
  • Eine Woche nach der Operation war bei allen Brüchen die frühe Knochenneubildung offensichtlich. Spuren von leicht radiodichtem Material waren entlang den periostealen Grenzen anwesend. Die Menge an Knochenneubildung war eine Woche nach der Operation bei den Brüchen mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen signifikant größer als bei den (unbehandelten) Brüchen. Zwei Wochen nach der Operation war bei allen Brüchen, die mit der matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt wurden, ein Fortschreiten der Knochenneubildung offensichtlich. Nach drei Wochen war der Knochenkallus groß und die Brüche waren in der Gegenwart von OP-1 im Wesentlichen oder vollständig geheilt. Auf der linken (unbehandelten) Stelle war die Bruchstelle nach drei Wochen jedoch noch offensichtlich und die Menge an gebildetem Kallus weniger.
  • Die mittlere Torsionslast bis zum Versagen für alle Ulnae, die mit einer OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren, war 8,89 ± 2,99 N (8) (Mittelwert ± Standardabweichung (Probengröße)). Die mittlere Torsionslast bis zum Versagen für unbehandelte Kontrollulna war 7,91 ± 2,92 N (9).
  • Ein größeres Volumen an neuem Knochen und eine vollständige Überbrückung der Bruchstelle wurde bei allen rechten (mit OP-1-Vorrichtung behandelt) Brüchen im Vergleich mit links beobachtet. Die Proliferation von Kallus wurde beobachtet, die sich in das weiche Gewebe der behandelten Brüche ausdehnte. Die linken (unbehandelten) Stellen zeigten einheitlich Proliferation von neuem Knochen an den periostealen und endostealen Grenzen und frühe Knorpelbildung am Bruch, zeigten aber nicht konsistent vollständige knochige Überbrückung des Bruchs.
  • Konsistent mit den radiographischen Resultaten, wurde ein größeres Volumen von neuem Knochen bei den Stellen beobachtet, die mit OP-1-Vorrichtungen behandelt worden waren.
  • 2. Bruchuntersuchung bei der Ziege
  • Noch ein anderes Tiermodell für die Bewertung der verbesserten Bruchreparatur unter Verwendung von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen ist ein Ziegen-Modell (akuter Bruch des mittleren Schafts der Tibia). Die Untersuchung vergleicht 0,5 mg OP-1 in Acetatpuffer und 1 mg OP-1 in Acetatpuffer und 1 mg OP-1 präzipitiert in PBS, unmittelbar nach der Schaffung des Bruchs unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren injiziert. Die Tiere werden beobachtet und versorgt wie bei den vorstehend beschriebenen Hunde- und Kaninchenuntersuchungen und werden typischerweise 2, 4 und 6 Wochen nach der Behandlung getötet.
  • Es wird erwartet, daß durch den Einschluß von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen bei diesen Tieren eine verbesserte Knochenreparatur resultiert, wie bei den Kaninchenuntersuchungen gezeigt.
  • D. Reparatur von osteochondralen Defekten unter Verwendung matrixfreier OP-1-Vorrichtungen
  • 1. Osteochondralen Defekte in Kaninchen
  • Die folgende Untersuchung zeigt, daß matrixfreie knochenbildenden Vorrichtungen sowohl die Reparatur des artikulären Knorpel, der den Knochen überzieht, als auch die Reparatur des darunter liegenden Knochens verbessern kann. In dieser Untersuchung wurde ein osteochondrales Standarddefektmodell des Kaninchens verwendet, um die verschiedenen injizierbaren Formen von OP-1 bei der Heilung dieser Art von Defekt zu bewerten.
  • Matrixfreie Vorrichtungen, die OP-1 enthalten, wurden in zwei verschiedenen injizierbaren Bereitstellungsformulierungen und in einer gefriergetrockneten Formulierung hergestellt. Alle Proben enthielten 125 μg OP-1. Formulierung 1: 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, mit 5% Mannitol, Gesamtvolumen 50 μl; Formulierung 2: Suspension in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS); und Formulierung 3: gefriergetrocknet in Teilmengen von einer Probe.
  • Insgesamt sechs erwachsene männliche Kaninchen wurden verwendet. Osteochondrale Defekte mit einer vollen Dicke von 4 mm im Durchmesser wurden bilateral in der Sulcus der Kniescheibe von jedem Tier erzeugt, insgesamt 12 Defekte unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren. Der linke Defekt erhielt eine der drei OP-1-Formulierungen und die Defekte der rechten Seite dienten als unbehandelte Kontrolle. Alle Tiere wurden zwölf Wochen nach der Operation getötet und die distalen Schienbeine en bloc entnommen. Die Defektstellen wurden histologisch und durch Betasten bewertet, wie hier vorstehend beschrieben.
  • Bei allen Defekten außer einem Defekt der PBS-Gruppe zeigt die OP-1-Seite eine signifikante Heilung mit Regenerierung von Knochen und Knorpel. Obwohl auch bei den meisten der Kontrolldefekte ohne OP-1 eine Heilung beobachtet werden kann, ist die Reparatur unterlegen; üblicherweise ist die Heilung des darunter liegenden Knochens unvollständig und eine signifikante Unterproduktion von Glycosaminoglycanen (GAG) im Knorpel (wie durch leichtes Anfärben mit Toluidin zu sehen ist).
  • 2. Schafmodell
  • Reparatur von osteochondralen und chondralen Defekten kann auch in einem Standard-Ziegen- oder Schafmodell bewertet werden. Zum Beispiel wird unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren jedes Schaf in einer Untersuchung an beiden Gelenken des vorderen Knies operiert und es werden zwei Defekte per Gelenk geschaffen (einer auf dem medialen Kondylus und einer auf dem lateralen Kondylus). Eines der Gelenke hat einen chondralen Defekt mit standärdisierter partieller Dicke (5 mm im Durchmesser) auf jedem Kondylus, während das andere Gelenk zwei ähnliche, aber tiefere chondralen Defekt mit voller Dicke (etwa 1–2 mm im subchondralen Knochen). Ein Gelenk des Tieres wird mit einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungsformulierung und das andere Gelenk wird als unbehandelte Kontrolle gelassen. Jede Gruppe hat eine Untergruppe, die früh nach 8 Wochen getötet wird und eine andere, die für eine Langzeitbewertung 6–7 Monate gehalten wird. Es wird erwartet, daß die matrixfreien Vorrichtungen, die jede der hier beschriebenen Formulierungen verwenden, die Geschwindigkeit und die Qualität der Reparatur sowohl des artikulären Knorpel als auch des darunter liegenden Knochens erhöhen, in Übereinstimmung mit den hier vorstehend beschriebenen Resultaten.
  • E. Heilung von segmentalen Defekten unkritischer Größe in Hunden unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
  • 1. Experiment 2
  • Wie bereits in Experiment 1 beispielhaft dargestellt (vgl. Sektion V.A.1.) können injizierbare Formulierungen von rhOP-1 verwendet werden, um Defekte unkritischer Größe (d. h. 5 mm, 3 mm, 1,5 mm) zu heilen. Das folgende Experiment ist eine Erweiterung von Experiment 1 und konzentriert sich auf das Defektmodell von 3 mm. Wie nachstehend detaillierter beispielhaft dargestellt ist, zeigten Defekte unkritischer Größe (3 mm), die mit rhOP-1 behandelt werden, eine verbesserte Heilung und extensivere Knochenneubildung. Wie nachstehend gezeigt, stellt ein Defekt von 3 mm ein konsistentes und reproduzierbares Modell für die Bewertung der Beschleunigung von Prozessen der Bruchreparatur dar.
  • Dieses Experiment bewertet die Heilung von Defekten unkritischer Größe, die mit zwei OP-1-Formulierungen behandelt werden, rhOP-1 in Acetat/Lactosepuffer (OP/Puffer) und rhOP-1 in einem Carboxymethylcellulose (CMC) (OP/CMC)-Gel etwa vier Wochen nach der Operation. Die nachstehend zusammengefaßten Resultate zeigen, daß Defekte unkritischer Größe, die mit injizierbarem rhOP-1 in CMC-Lösung und in Acetatpufferlösung behandelt würden, signifikant schneller handelten im Vergleich mit Kontrollen mit CMC und Pufferträger und unbehandelten Kontrollen. Radiographisch zeigten die Defekte in beiden Gruppen mit OP-1-Behandlung (OP/CMC und OP/Puffer) eine frühe radiodichte Knochenbildung und Knochenüberbrückung 4 Wochen nach der Operation. Die mit OP/CMC behandelten Defekte waren entlang der lateralen Ulna fast vollständig gefüllt und überspannt mit Knochen nicht einheitlicher Dichte und unter Einbau der Ränder des Wirtsknochens. Proliferativer neuer Knochen war bei den mit OP/Puffer behandelten Defekten vorhanden. Keiner der Kontrolldefekte mit Träger (CMC und Puffer allein) zeigte nach 4 Wochen Anzeichen von Knochendefektheilung. Das histologische Aussehen von mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten Defekten war ähnlich. Bei den mit OP behandelten Defekten hatten sich an den Defekträndern und entlang der Knochenhaut der Ulna, die sich über die defekte Stelle erstreckte, signifikante Mengen an neuem Knochen gebildet. Die Überbrückung des Knochendefekts war nach dem Zeitabschnitt von 4 Wochen nahezu vollständig. Mineralisierender Knorpel und fibröses Gewebe waren bei den mit OP behandelten Defekten vorhanden. Im Gegensatz dazu waren die Defekte mit Trägerkontrolle mit fibrösem Gewebe gefüllt und davon umgeben und hatten minimale Mengen von Knochenneubildung an den Defekträndern. Durchschnittlich hatten die mit OP/CMC behandelten Defekte nach 4 Wochen eine Torsionsstärke, die 51% der Stärke von intakten Ulna war im Vergleich von 14% bei den CMC-Trägerkontrollen. Defekte, die mit der OP/Pufferlösung behandelt wurden, hatten eine mittlere Torsionsstärke, die 44% der Stärke von intakten Ulna, während die Defekte mit Pufferkontrolle nur 9% der Torsionsstärke von intakten Ulna erreichten. Die mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten Gruppen hatten nach 4 Wochen (9%) und 8 Wochen (27%) höhere mechanische Stärken als die unbehandelten Kontrollen.
  • Experimenteller Aufbau
  • Die Testproben bestanden aus rekombinantem menschlichem knochenbildendem Protein-1 (rhOP-1) in einem injizierbaren Verabreichungs-Matrixsystem. Die beiden rhOP-1-Formulierungen und die beiden Kontrollen mit nur Träger wurden bewertet und mit zuvor getesteten und berichteten unbehandelten Kontrolldefekten verglichen. Nur über zwei dieser drei Formulierungen wird hier berichtet. Eine Formulierung (OP/CMC) bestand aus 0,35 mg rhOP-1 in 100 μl Carboxymethylcellulose (CMC)-Gel, und wurde in drei sterilen Spritzen bereitgestellt. Eine zweite Formulierung (OP/Puffer) bestand aus 0,35 mg rhOP-1 in 100 μl Acetatpuffer und wurde als OP-1-Lösung bereitgestellt. Die Kontrolle aus nur Träger bestand aus 100 μl CMC-Gel (CMC-Kontrolle), die in drei sterilen Spritzen bereitgestellt wurde und aus 100 μl Acetatpuffer (Pufferkontrolle), die als Kontrolllösung bereitgestellt wurde. Proben mit bekannten Mengen wurden und Inhalt wurden von Creative BioMolecules, Inc. (Hopkinton, MA) hergestellt und geliefert.
  • Bilaterale segmentale Defekte der Ulna, 3,0 mm lang, wurden in allen Tieren geschaffen. Die rechten Defekte erhielten eine der beiden rhOP-1-Formulierungen, so daß drei Stellen von jeder Formulierung untersucht wurden. Die linken Defekte erhielten die Kontrolle mit nur Träger, die kein rhOP-1 enthielt. Es wurden wöchentliche Radiogramme aufgenommen, um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Bei der Tötung wurden alle Ulnae en bloc gewonnen und wurden, wenn ausreichend geheilt, mechanisch durch Torsion getestet. Segmente wurden mittels Histologie auf Gewebeantwort, Qualität und Menge an Knochenneubildung und Ausmaß an Heilung bewertet. Erwachsene männliche Mischlingshunde, die für diesen Zweck gezüchtet worden waren, wurden wegen ihrer Verfügbarkeit, der leichten Behandlung, der anatomischen Größe und wegen der bekannten Charakteristika der Knochenreparatur und der Remodellierung bei dieser Untersuchung verwendet. Alle Tiere waren vom Skelett her reif, wogen zwischen 44 und 63 Pfund (im Mittel 54 1b) und wurden von Mariin Creek Kennels, USDA Nummer 71-B-108 (Willowford, AK) geliefert. Es wurde insbesondere darauf Wert gelegt, Tiere von einheitlicher Größe und einheitlichem Gewicht auszusuchen, um Unterschiede in der Knochengeometrie und Belastung zu beschränken.
  • Chirurgie
  • Anästhesie wurde durch intravenöse Injektion von Natriumpentothal mit der Dosis von 5,0 mg/lb Körpergewicht erreicht. Nach der Induktion wurde ein endotrachealer Tubus plaziert und die Anästhesie mittels Inhalation von Isofluoran aufrechterhalten. Beide Vorderläufe wurden auf sterile Weise vorbereitet und zurechtgelegt. Es wurde ein lateraler Schnitt von etwa 2 Zentimeter Länge vorgenommen und die Freilegung der Ulna wurde durch stumpfe und scharfe Sektion erreicht. Der Defekt von 3,0 mm wurde in der mittleren Ulna unter Verwendung einer Stichsäge erzeugt. Der Bogen wurde wegen der mechanischen Untersuchung beibehalten und es wurde keine interne oder externe Fixierung verwendet. Die Stelle wurde mit Salzlösung gespült, um Knochensplitter und ausgetretene Markzellen zu entfernen. Die weichen Gewebe wurden sorgfältig in Schichten um den Defekt geschlossen. Die geeignete Probenformulierung dann entsprechend dem Behandlungsschema in die defekte Stelle injiziert. Die Prozedur wurde dann auf der contralateralen Seite mit der geeigneten Probe wiederholt.
  • Radiogramme
  • Es wurden wöchentlich Radiogramme der Vorderläufe bis vier Wochen nach der Operation erhalten. Es wurden Standardaufnahmezeiten und -intensitäten verwendet. Um die radiographischen Resultate zu quantifizieren wurde jedem Radiogramm ein numerischer Wert zugeteilt, der auf der in Tabelle 5 beschriebenen Bewertungsskala beruhte.
  • Tabelle 5 RADIOGRAPHISCHE BEWERTUNGSSKALA
    Grad:
    Keine Veränderung gegenüber Aussehen unmittelbar nach der Operation 0
    Spur von radiodichtem Material im Defekt 1
    Flockige Radiodichte mit Flecken neuer Verkalkung 2
    Der Defekt ist zumindest an einem Punkt mit Material nicht einheitlicher Radiodichte überbrückt 3
    Der Defekt ist auf der medialen und lateralen Seite des Defekts mit Material nicht einheitlicher Radiodichte überbrückt, die Schnittenden des Randes bleiben sichtbar 4
    Wie Grad 3; mindestens einer von vier Rändern wird von neuem Knochen verdeckt 5
    Der Defekt wird von einheitlichem neuen Knochen überbrückt; die Schnittenden des Randes sind nicht mehr sichtbar 6
  • Tötung
  • Die Tiere wurden unter Verwendung einer intravenösen Überdosis an Barbiturat getötet. Die Ulna und der Bogen wurden unmittelbar en bloc entnommen und in mit Salzlösung getränkten Windeln plaziert. Beide Ulnae wurden einer Makrophotographie unterzogen und Kontaktradiogramme aufgenommen. Weiche Gewebe wurden sorgfältig von der defekten Stelle weggeschnitten. Eine wassergekühlte Säge wurde verwendet, um die Ulna in Stücke einheitlicher Länge von 9 cm zu zersägen, wobei die defekte Stelle in der Mitte der Testprobe gelegen ist.
  • Mechanische Testung
  • Unmittelbar nach der Sektion, wenn die Heilung durch Befühlen mit der Hand ausreichend erschien, wurden Proben auf Versagen bei Verdrehung auf einer MTS hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf (Minneapolis, MN) getestet, die unter Hubkontrolle bei einer konstanten Vorschubrate von 50 mm/Min. geführt wurde. Jedes Ende des Knochensegments war in eine zylindrischen Aluminiummuffe montiert und mit Methylmethacrylat einzementiert. Ein Ende war starr fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn gedreht. Da die Ulna des Hundes eine leichte Krümmung hat, wurden die Proben exzentrisch montiert, um die Drehung der Proben coaxial mit der der Testvorrichtung zu halten. Die Torsionskraft wurde mittels eines Hebelarms von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen. Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online Aufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis zum Versagen erhalten wurden, und die Energieaufnahme bis zum Versagen als die Fläche unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
  • Histologie
  • Getestete und nicht getestete Proben wurden für die histologische Bewertung vorbereitet. Die einzelnen Proben wurden unmittelbar nach der mechanischen Testung oder bei nicht getesteten Proben nach der Sektion durch Eintauchen in 10 %-ige gepufferte Formalinlösung fixiert. Auf einer wassergekühlten Diamantensäge wurden die Proben durch Durchschneiden der Proben entlang ihrer langen Achse geteilt. Dieses Verfahren resultieret in zwei Portionen von jeder Probe für verschiedene histologische Präparationen, einschließlich nicht entkalkter Grundschnitte und nicht entkalkter Mikrotomschnitte.
  • Nach der Fixierung wurden die Proben, die für die nicht entkalkten Schnitte vorgesehen werden, in graduierten Ethylalkohollösungen von 70% bis 100% hydriert. Die Proben wurden dann in Methylmethacrylatmonomer plaziert und die Polymerisation zugelassen. Die Grundschnitte wurden durch Schneiden der Proben auf einer wassergekühlten Mark V CS600-A (East Grandy, CT) Sektionssäge hoher Geschwindigkeit in Schnitte von etwa 700 bis 1.000 Micron Dicke erhalten. Diese Schnitte wurden auf einen Acrylobjektträger montiert und unter Verwendung einer metallurgischen Schleifscheibe auf 100 Micron Dicke abgeschliffen und Mikroradiogramme wurden unter Verwendung von Standardverfahren aufgenommen. Nach der Mikroradiographie wurden die Schnitte weiter auf etwa 50 Micron abgeschliffen und mit basischem Fuchsin und Toluidinblau für die histologische Bewertung angefärbt, die die Qualität der Verbindung, das Aussehen und die Qualität des Knochenrands und des gitterförmigen Knochens, die Anwesenheit von Knochenmarkselementen, die Remodellierung des Knochens und die entzündliche Reaktion bewertete (Tabelle 6).
  • TABELLE 6 HISTOLOGISCHE BEWERTUNGSSKALA
    Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE
  • Radiographische Bewertung
  • Eine Zusammenfassung der radiographischen Grade für jede Stelle wird in Tabelle 7 bereitgestellt. 4 Wochen nach der Operation hatten die Defekte, die mit OP/CMC behandelt waren, einen mittleren radiographischen Grad von 3 von 6 möglichen Punkten. Mit OP/Puffer behandelte Defekte hatten einen mittleren radiographischen Grad von 4. Defekte, die mit der CMC-Trägerkontrolle und nur mit Puffer behandelt waren, hatten im Schnitt endgültige radiographische Grade von 1,33 und 1,0. Bei beiden Gruppen, die mit OP-1 behandelt waren, OP/CMC und OP/Puffer, gab es schon drei Wochen nach der Operation Anzeichen von radiodichter Knochenneubildung in den Defekten und entlang den lateralen Rändern des Defekts. Nach vier Wochen hatten sich in den Defekten und in dem umgebenden subkutanen Gewebe signifikante Mengen an neuem Knochen gebildet. Die OP/CMC-Defekte waren fast vollständig gefüllt und mit Knochen uneinheitlicher Dichte entlang der lateralen Grenze der Ulna überbrückt. Der neue Knochen wurde signifikant mit den defekten Rändern eingebaut. In zwei der drei mit OP/Puffer behandelten Defekte blieben die Ränder des Wirts sichtbar, obwohl proliferativer neuer Knochen anwesend war. Im Gegensatz dazu war vier Wochen nach der Operation keiner der OP/CMC- oder OP/Puffer-Defekte vollkommen überbrückt oder gefüllt. In der CMC-Kontrollgruppe überlagerte nach drei Wochen früher neuer Knochen die Knochenränder des Wirts und nahm weiterhin an Radiodichte zu. Erneut zeigten die Pufferkontrolldefekte nach vier Wochen im Gegensatz dazu an den Defekträndern nur ein leichtes Anwachsen der Radiodichte. Keiner der Kontrolldefekte in den Gruppen zeigte Anzeichen von knochiger Defektheilung.
  • TABELLE 7 RESULTATE DER RADIOGRAPHISCHEN BEWERTUNG
    Figure 00560001
  • Eine Woche nach der Operation gab es bei keinem der OP/CMC-Defekte Veränderungen beim radiogräphischen Aussehen. Nach 2 Wochen waren Spüren von radiodichten Gebieten an den abgeschnittenen Knochenenden vorhanden. Nach 3 Wochen war ein Anwachsen von Radiodichte von neuem Knochen, der sich in den Defekten und entlang den lateralen Defekträndern bildete. Ein Defekt zeigte Anzeichen von früher knochiger Überbrückung. Nach 4 Wochen hatten die OP/CMC-Defekte eine signifikante Menge an radiodichtem neuen Knochen in dem Defekt. Die Defekte waren entlang der lateralen Grenze der Ulna fast vollständig mit Knochen nicht einheitlicher Dichte gefüllt und überbrückt. Neuer Knochen wurde signifikant mit den Defekträndern eingebaut. Keiner der mit OP/CMC behandelten Defekte war 4 Wochen nach der Operation vollständig mit neuem Knochen gefüllt oder solide davon überbrückt. Der letztliche radiographische Grad für jeden Defekt war 3 von 6 möglichen Punkten (Mittelwert 3,0 ± 0,0, n = 3).
  • CMC-Kontrolle – 4 Wochen
  • Zwei Wochen nach der Operation gab es keine signifikanten Veränderungen beim radiographischen Aussehen der CMC-Kontrolldefekte. Nach 3 Wochen begannen bei 2 von 3 Defekten die Ränder des Wirts mit neuem Knochen überlagert zu werden. Nach 4 Wochen zeigten die CMC-Defekte ein gewisses Anzeichen der Aktivität für neuen Knochen an den Defekträndern, aber kein Anzeichen von knochiger Defektheilung. Die letztlichen radiographischen Grade waren 1, 2 und 1 von 6 möglichen Punkten (Mittelwert 1,33 ± 0,58, n = 3).
  • OP/Puffer – 4 Wochen
  • Eine Woche nach der Operation gab es bei keinem der mit OP/Puffer behandelten Defekte Veränderungen beim radiographischen Aussehen. Zwei Wochen nach der Operation waren Spuren von radiodichten Gebieten in den OP/Puffer-Defekten und entlang den Defektgrenzen anwesend. Eine signifikante Knochenneubildung wurde auch in den subkutanen Geweben um die Defekte gesehen. Nach 3 Wochen erschienen Flocken an neuem Knochen in den Defekten und in den darüberliegenden weichen Geweben bildete sich neuer Knochen. Nach 4 Wochen gab es ein signifikantes Anwachsen bei der Bildung von radiodichtem neuen Knochen, der die mit OP-1 behandelten Defekte füllte und überbrückte. In zwei von drei Defekten blieben die Ränder sichtbar, obwohl proliferativer neuer Knochen die Defekte füllte und überbrückte. Keiner der mit OP/Puffer behandelten Defekte war zum Zeitpunkt der Tötung nach 4 Wochen vollständig gefüllt mit neuem Knochen oder davon solide überbrückt. Die letztlichen radiographischen Grade waren 3, 4 und 5 von 6 möglichen Punkten (Mittelwert 4,0 ± 1,0, n = 3).
  • Pufferkontrolle – 4 Wochen
  • 3 Wochen nach der Operation gab es bei keinem der nur mit der Pufferkontrolle behandelten Defekte signifikante Veränderungen beim radiographischen Aussehen. Nach 4 Wochen wurde eine Erhöhung bei der Radiodichte an den Rändern beobachtet, obwohl keine Anzeichen der Defektheilung evident waren. Der letztliche radiographische Grad für jede Stelle war 1 von 6 möglichen Punkten (Mittelwert 1,0 ± 0,0, n = 3).
  • Grobe Beobachtungen
  • OP-1-Defekte: Alle mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten Defekte waren manuell stabil und hatten sichtbar eine Masse von Knochenneubildung an der Defektstelle.
  • Trägerkontrolldefekte: Keiner der CMC- und nur Pufferkontrolldefekte war nach 4 Wochen manuell stabil, obwohl alle mechanisch getestet wurden.
  • Mechanische Testung
  • Eine Zusammenfassung der mechanischen Testresultate erscheint in Tabelle 8 OP/CMC 4 Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit OP/CMC behandelt waren, 33,08 ± 16,41 N (n = 3). Dies bedeutet 51% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 31,13 ± 15,32 Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 41,64 ± 30,52 Nm-Grad.
  • CMC-Kontrolle
  • 4 Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit CMC-Kontrolle behandelt waren, 9,32 ± 16,41 N (n = 3). Dies bedeutete 14% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 33,36 ± 25,95 Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 10,53 ± 8,62 Nm-Grad.
  • OP/Puffer
  • 4 Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit OP/Puffer behandelt waren, 29,03 ± 16,79 N (n = 3). Dies bedeutet 44% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 36,14 ± 14,71 Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 37,87 ± 27,73 Nm-Grad.
  • Pufferkontrolle
  • 4 Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit Pufferkontrolle behandelt waren, 5,62 ± 1,65 N (n = 3). Dies bedeutet 9% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 24,91 ± 12,03 Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 3,94 ± 4,12 Nm-Grad.
  • TABELLE 8 MECHANISCHE TESTRESULTATE
    Figure 00600001
  • Histologie
  • Eine Zusammenfassung der Resultate der histologischen Bewertung ist in Tabelle 9 dargestellt. Von 12 Gesamtpunkten war der mittlere histologische Grad der Defekte, die mit OP/CMC behandelt waren, 7,00 ± 0,87. Der mittlere histologische Grad der CMC-Kontrolldefekte war 4,50 ± 0,87. Die mittleren histologischen Grade der OP/Pufferdefekte und der Pufferkontrollen waren 6,08 f 0,14 und 4,0 ± 1,0.
  • OP/CMC
  • Die Behandlung resultierte nach vier Wochen in einer frühen osteochondralen Überbrückung mit Gebieten an mineralisierendem Knorpel. In mit OP/CMC behandelten Defekten wurde eine signifikante Knochenneubildung in den periostealen und endostealen Bereichen der Ulna beobachtet, die sich über die Grenzen des Defekts ausbreitete. Gebiete von mineralisierendem Knorpel und etwas fibröses Gewebe waren in den Defekten vorhanden. Die Überbrückung der Defekte war nach vier Wochen nicht erreicht. Die Ränder des Wirts blieben sichtbar, obwohl es Anzeichen des Einbaus von neuem Knochen und Remodellierung gab.
  • CMC-Kontrolle
  • Nach vier Wochen wurde in den CMC-Kontrolldefekte keine vollständige knochige Heilung beobachtet. Die Kontrolldefekte resultierten in fibrösen Verbindungen mit keinen Anzeichen von knochiger Überbrückung. Es wurde beobachtet, daß fibröses Gewebe und mineralisierender Knorpel die Defekte füllten und umgaben. Sehr kleine Mengen an neuem Knochen hatten sich entlang der Knochenhaut der Ulna und am der endostealen Region der Ulna in der Nähe der Ränder des Wirts gebildet. Es wurden Anzeichen an Resorption des Rands des Wirts an den Enden des Defekts beobachtet.
  • OP/Puffer
  • Behandelte Defekte wurden mit mineralisierendem Knorpel und fibrösem Gewebe gefüllt. In den endostealen und periostealen Regionen der Ulna in der Nähe der Grenzen des Defekts bildete sich neuer Knochen und frühe Zeichen von Überbrückung mit neuem Knochen waren evident, obwohl keiner der Defekte vollkommen überbrückt war. Die Knochenränder des Wirts zeigten Anzeichen von Einbau mit neuem Knochen, wurden aber nach vier Wochen nicht völlig überdeckt. Es wurde eine gewisse Remodellierung der Knochenränder des Wirts und eine frühe Verdichtung entlang der Grenzen des neuen Knochens beobachtet. Neuer Knochen bildete sich auch in den subkutanen Gewebeschichten, die die defekte Stelle überlagerten und sich über die Defektgrenzen erstreckten.
  • Pufferkontrolle
  • In keinem der Pufferkontrolldefekte wurde vier Wochen nach der Operation vollständige knochige Heilung beobachtet. Nicht behandelte Defekte zeigten fibröse Verbindungen mit keinen Anzeichen von knochiger Verknüpfung; es wurde fibröses Gewebe beobachtet, das die Defekte füllte und sie umgab. Andere nicht behandelte Defekte zeigten kein Anzeichen einer fibrösen oder anderen Verbindung. Sehr wenig Knochenneubildung wurde bei den Pufferkontrolldefekten beobachtet. Endostealer neuer Knochen erstreckte sich aus der Markhöhle der Ulna und entlang den lateralen Defektgrenzen bildete sich periostealer neuer Knochen. Die Knochenenden des Wirts waren sichtbar mit Anzeichen von Randresorption.
  • TABELLE 9 RESULTATE DER HISTOLOGISCHEN BEWERTUNG
    Figure 00620001
  • 2. Experiment 3
  • Von rekombinantem menschlichem knochenbildendem Protein-1 (rhOP-1), wenn implantiert in Kombination mit Knochenkollagenmatrix, wurde gezeigt, daß es diaphyseale segmentale Defekte kritischer Größe in Tieren durch die Bildung von neuem Knochen heilt, der biologisch und biomechanisch funktionell ist. Der Zweck dieser Untersuchung war die Bewertung der Wirksamkeit von matrixfreien injizierbaren Formulierungen von rhOP-1 für die Beschleunigung der Knochenheilung in einem Hundemodell für Defekte unkritischer Größe.
  • Bilaterale osteoperiosteale segmentale Defekte von 3,0 mm Länge wurden in der mittleren Ulna von 18 erwachsenen männlichen Mischlingshunden erzeugt. Der Bogen wurde ohne zusätzliche Fixierung wegen der mechanischen Stabilität erhalten. Weiche Gewebe wurden vor der Injektion von rhOP-1 geschlossen. Neun Tiere erhielten rhOP-1-Formulierungen in einen Defekt und die Trägerkontrollen in den contralateralen Defekt und sie wurden 4 Wochen nach der Operation getötet. Neun unbehandelte Kontrolldefekte wurden in Zeiträumen von 4, 8 und 12 Wochen für den Vergleich mit der rhOP-1-Behandlung bewertet. In regelmäßigen Abständen wurden Radiogramme aufgenommen, um das Fortschreiten der Heilung zu untersuchen. Bei der Tötung wurden alle Ulnae durch Torsion mechanisch getestet, ob die Heilung ausreichend war. Nicht entkalkte histologische Schnitte wurden für die Qualität und Menge an Knochenneubildung und das Ausmaß an Heilung bewertet.
  • Radiographisch war die Knochenneubildung schon zwei Wochen nach der Operation in mit rhOP-1 behandelten Defekten evident und nach 4 Wochen überbrückte neuer Knochen den Defekt. Im Gegensatz dazu zeigten Stellen mit Trägerkontrollen 4 Wochen nach der Operation wenig oder keine Knochenbildung. Darüber hinaus waren die Torsionsstärken von mit rhOP-1 behandelten Defekten nach 4 Wochen signifikant größer als mit Träger behandelte oder unbehandelte Kontrollen. Weiterhin waren die Torsionsstärken von behandelten Defekten nach 4 Wochen praktisch gleich der Stärke von nicht behandelten Kontrollen nach 12 Wochen. Eine eindeutige Beschleunigung der Defektheilung und der Knochenbildung resultierte aus der Behandlung mit rhOP-1. Die histologischen Befunde korrelierten mit den radiographischen und mechanischen Testergebnissen.
  • Die Resultate dieser Untersuchung bestätigen, daß knochenbildende Proteine, die in Defekte unkritischer Größe injiziert werden, die Defektheilung beschleunigen können, einschließlich Kallusbildung am Bruch und Bildung von überbrückendem Knochen. Defekte, die mit rhOP-1 behandelt wurden, bildeten neuen Knochen signifikant schneller und stellten die Stärke und Steifheit des Bruchs früher wieder her als unbehandelte Kontrollen.
  • Zusammenfassend hat die Fähigkeit der hier vorstehend beschriebenen matrixfreien Vorrichtungen, die Defektreparatur zu verbessern, einschließlich der Beschleunigung der Rate und der Verbesserung der Qualität von neu gebildetem Knochen, Auswirkungen für die Verbesserung der Knochenheilung bei betroffenen Individuen wie Diabetikern, Rauchern, fettleibigen Individuen, alten Individuen, von Osteoporose betroffenen Individuen, Benutzern von Steroiden und anderen, die wegen eines erworbenen oder angeborenen Zustands eine reduzierte Fähigkeit haben, Knochenbrüche zu heilen, einschließlich Individuen mit gestörtem Blutfloß zu ihren Extremitäten. Solche Individuen erleben eine gestörte Heilung, was von einer reduzierten Fähigkeit resultiert, Vorläuferzellen zu fördern, und erleben Nekrose und/oder Sepsis.
  • Die hier offenbarten Verfahren und Formulierungen stellen durch beschleunigte Knochenbildung eine verbesserte Knochenbildung bereit. Spezifisch kann bei Befolgung der hier offenbarten Verfahren und Protokolle die Rate der Knochenbildung, einschließlich Bildung von Knochenkallus und Überbrückung, beschleunigt werden. Wie hier beispielhaft dargestellt, erfolgt die Brückenbildung schneller und in einem kürzeren Zeitrahmen, was die stabilere Knochenbildung zuläßt, und dabei die biomechanische Stärke von sich neu bildendem Knochen verbessert.
  • Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, daß die Kallusbildung eine Stufe in dem vielstufigen Heilungsprozeß ist, der in der Knochenbildung kulminiert. Spezifisch umfaßt der Heilungsprozeß fünf Stufen: Ereignis, Entzündung, Bildung von weichem Kallus, Bildung von hartem Kallus und Remodellierung. Das Ereignis beginnt mit der Einleitung des Bruchs und geht weiter, bis die Energie völlig verteilt ist. Das Entzündungsstadium ist durch Hämatombildung an der Bruchstelle charakterisiert, Kriochennekrose an den Enden der Fragmente und einem Entzündungsinfiltrat. Granulationsgewebe ersetzt nach und nach das Hämatom, Fibroblasten produzieren Kollagen und Osteoclasten beginnen, nekrotischen Knochen zu entfernen. Das Abflauen von Schmerz und Schwellung markiert den Beginn der dritten Stufe des weichen Kallus. Diese. Stufe ist durch eine erhöhte Vaskularisierung und reichliche Bildung von neuem Knorpel charakterisiert. Das Ende der Stufe des weichen Kallus geht einher mit der Verbindung der Fragmente durch fibröses oder Knorpelgewebe. Während der vierten Stufe oder der des harten Kallus wandelt sich der Kallus in gewobenen Knochen um und erscheint klinisch geheilt. Die letzte Stufe des Heilungsprozesses umfaßt die langsame Remodellierung von gewobenem zu lamellarem Knochen und die Rekonstruktion des medullaren Kanals (vgl. "Current Diagnosis & Treatment in Orthopedics," Hrsg. H. B. Skinner (LANGE Medical Book Publ.)).
  • F. Reparatur von chondralen Defekten mit matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen Schaaf)
  • 1. Experiment 1
  • Unter Verwendung von ähnlichen Verfahren und Materialien wie vorstehend beschrieben (vgl. die entsprechenden Teile von D.2) wurde die folgende Untersuchung durchgeführt, um weiter hin zu zeigen, daß das beispielhafte knochenbildende Protein OP-1, wenn es in einer matrixfreien Vorrichtungen verabreicht wird, die aktive Knorpelbildung und die Reparatur von chondralen Defekten in gewichttragenden Gelenken induzieren kann.
  • Wie bereits vorstehend beschrieben ist ein Defekt eine strukturelle Zerstörung des Knorpels und kann die Konfiguration eines Hohlraums annehmen, eines dreidimensionalen Defekts, wie zum Beispiel einer Lücke, einer Höhle, eines Lochs oder einer anderen substantiellen Zerstörung der strukturellen Integrität. Defekte im artikulären Knorpel können sich durch die gesamte Tiefe des artikulären Knorpel erstrecken und/oder in den Knochen unter dem Knorpel (osteochondrale Defekte) oder die Defekte können oberflächlich sein und beschränkt auf das Knorpelgewebe selbst (chondrale oder subchondrale Defekte).
  • Am Anfang erfährt beschädigter Knorpelmatrix einen Abbau durch Metalloproteinasen, die durch zelluläre Bestandteile in der Nähe freigesetzt werden. Der proteolytische Abbau befreit von beschädigten Matrixkomponenten und setzt dabei anabolische Cytokine frei, die in der Matrix eingeschlossen sind. Wie es gegenwärtig verstanden wird, stimulieren von der Matrix freigesetzte Cytokine die Proliferation von Chondrocyten und, was wichtig ist, die Synthese einer neuen makromolekularen Matrix. Die Anwesenheit von Zusammenlagerungen von proliferierenden Chondrocyten, wie mikroskopisch bestimmt, ist einer der ersten Indikatoren der Reparaturantwort des Knorpels. Vermutlich wirkt diese Reparatur der katabolischen Wirkung der Proteasen entgegen und stabilisiert das Gewebe durch erhöhte Matrixsynthese.
  • Der artikuläre Knorpel und die Reparatur des artikulären Knorpel sind durch Standardverfahren der Histologie und Histochemie leicht zu untersuchen. Diese Verfahren sind im Fachgebiet bekannt und umfassen mikroskopische Untersuchungen von Schnitten von Knorpel, die durch eines einer Zahl von histochemischen Färbemitteln gefärbt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Toluidinblau, Hämatoxylin und Eosin, von Kossa, Safranin 0 und Masson's Trichromfarbe. Nach der Anwendung von verschiedenen Farben kann der Durchschnittsfachmann die Reparaturantwort des Knorpels durch die Identifikation von proliferierenden Chondrocyten und die Bestimmung der Qualität und Menge an Matrix wie Kollagen und Proteoglycanen bewerten, die von den Chondrocyten synthetisiert werden.
  • Wie hier verwendet, betrifft artikulärer Knorpel spezifisch Hyalin-Knorpel, eine nicht vaskuläres, nicht mineralisiertes Gewebe, welches die artikulierenden Oberflächen der Teile von Knochen in Gelenken bedeckt. Unter physiologischen Bedingungen liegt artikulärer Knorpel über stark vaskulärem mineralisiertem Knochen, der als subchondraler Knochen bezeichnet wird. Artikulärer Knorpel ist durch spezialisierte knorpelbildende Zellen charakterisiert, Chondrocyten genannt, die eingebettet sind in eine extrazelluläre Matrix, die Fasern von Kollagen (vorwiegend Typ ID Kollagen, ebenso wie die seltenen Typen wie die Typen IX und XI) umfaßt, verschiedene Proteoglycane, einschließlich Glycosaminoglycane, andere Proteine und Wasser.
  • In dieser Untersuchung wurden Schafe als ein Modell zur Bewertung der Reparatur von chondralen Defekten von 1–2 mm Gesamttiefe × 7 mm Gesamtdurchmesser auf der gewichttragenden kondylären Oberfläche des Knies verwendet. Die Defekte waren chondrale Defekte partieller Tiefe und umfaßten nicht den subchondralen Knochen, was durch das Fehlen einer Blutung nach der Schaffung des Defekts evident war. Eine weitere Bestätigung wurde durch die Histologie von dünnen Schnitten zum Zeitpunkt der Tötung erhalten; die Defekte erstreckten sich nicht in den subchondralen Knochen.
  • Das experimentelle Protokoll wird in Tabelle 10 bereitgestellt. Unter Verwendung von standardisierten Chirurgieverfahren wurde ein Defekt 2 mm Gesamttiefe x 7 mm Gesamtdurchmesser auf der gewichttragenden kondylären Oberfläche des rechten und linken Knies chirurgisch gemacht. Das rechte Knie diente als Kontrollknie. Eine flüssige matrixfreie OP-1-Vorrichtung (50 oder 250 μg OP-1) in 20 mM Natriumacetat, pH 4,5, wurde entweder als ein einziger Bolus mittels Injektion in das intraartikuläre Gelenk verabreicht oder intermittierend mittels einer lokal implantierten subkutanen Minipumpe (ALZET® 2002, ALZA Scientific Products, Palo Alto, CA) verabreicht (0,5 μl pro Stunde für 2 Wochen Dauer; insgesamt 200 μl). Zahlreiche geeignete Minipumpen sind leicht verfügbar und werden vom Durchschnittsfachmann routinemäßig für die Verabreichung von pharmazeutischen und/oder therapeutischen Mitteln verwendet; der Durchschnittsfachmann wird die bevorzugte Art und Rate der Verabreichung unter den Umständen einschätzen können. Die Heilung der chondralen Defekte wurde mit histologischen und histochemischen Standardverfahren bewertet.
  • Tabelle 10 Reparatur von chondralem Defekt beim Schaf
    Figure 00670001
  • Die bisher gesammelten Daten einer 3-monatigen Untersuchung mit Minipumpe (Gruppe III und N) offenbaren, daß matrixfreie OP-1-Vorrichtungen die Knorpelbildung und die anschließende Reparatur von chondralen Defekten induzieren können. Nach zwölf Wochen wurde bei den Kontrolldefekten nur wenig Hinweise für die chondrale Defektreparatur beobachtet. Mittels der histologischen und histochemischen Standardbewertung wurde jedoch in dem mit matrixfreiem OP-1 behandelten Tier sowohl die Bildung von neuem Knorpel als auch die Fusion von altem und neuem Knorpel beobachtet. Unter Verwendung von im Stand der Technik anerkannten histologischen und histochemischen Indizes als Maß für die chondrale Reparatur, stimulierte OP-1 das Einwachsen von synovialen Zellen in das defekte Gebiet. Diese Zellen differenzierten zu Proteoglycan-reichen artikulären Chondrocyten voller Dicke und davon resultierte die Reparatur des chondralen Defekts.
  • Die Heilung eines Knorpeldefekts partieller Dicke ohne Beteiligung von subchondralem Knochen in einem erwachsenen Tier ist ohne Präzedenzfall und zeigt, daß die aktive Knorpelbildung eine Eigenschaft des Reparaturprozesses ist, der von einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung induziert wird. Aus diesen Untersuchungen wird geschlossen, daß eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung verwendet werden kann, um chondrale Defekte in vivo zu reparieren. Es ist insbesondere wichtig, daß eine solche Reparatur an einem gewichttragenden Gelenk in einem großen Tiermodell wie dem Schaf vorkommen kann.
  • Andere Untersuchungen der Reparatur von chondralen Defekten unter Verwendung von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen (zum Beispiel die Experimente, die vorstehend in Gruppe I und ID dargestellt sind) sind gegenwärtig noch in der Durchführung. Es werden ähnliche Ergebnisse erwartet wie die, die mit dem vorstehend beschriebenen experimentellen Beispiel der Verabreichung mit einer Minipumpe erhalten wurden, das heißt, es wird erwartet, daß einziger Bolus von injizierbarer matrixfreier Vorrichtung in das intraartikuläre Gelenk einen chondralen Defekt in gewichttragenden Gelenken repariert.
  • G. Alternative Verfahren zur Heilung von segmentalen Defekten unkritischer Größe unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
  • 1. Experiment 1: Die Wirkungen der verzögerten Verabreichung von matrixfreier knochenbildender Vorrichtung auf die Reparatur von Defekten unkritischer Größe (Hunde)
  • Der Zweck dieser Untersuchung war die Beurteilung der Heilung von Defekten unkritischer Größe, die zu verschiedenen verzögenen Verabreichungszeiten nach der Verletzung mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt wurden. Die nachstehend beispielhaft dargestellte besondere Vorrichtung ist eine injizierbare Formulierung der matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung. Es wird erwartet, daß andere Ausführungsformen der Vorrichtung ähnliche Resultate ergeben.
  • In Kürze sind die experimentellen Beobachtungen wie folgt: im allgemeinen heilten segmentale Defekte unkritischer Größe, die mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt wurden, 4 Wochen nach der Verletzung in signifikant höherem Maß im Vergleich mit Kontrollen mit injizierbarem Träger. Von besondere Signifikanz sind die unerwarteten Resultate, die anzeigen, daß mindestens ein Indiz für die Defektheilung, speziell die erhöhte mechanische Stärke der Ulna, durch die Manipulation der Zeit nach der Verletzung, zu der die matrixfreien OP-1-Vorrichtungen verabreicht werden, erhöht werden kann.
  • Zum Zwecke dieses Experiments und wie hier verwendet, bedeutet Verletzung das zufällige Auftreten eines Defekts (wie ein unerwarteter physischer Unfall, der im Auftreten von Defekten unkritischer Größe resultiert), das beabsichtigte Auftreten eines Defekts (wie die chirurgische Manipulation, die im Auftreten von Defekten unkritischer Größe resultiert), oder nicht traumatisch induzierte Defekte, die von einer oder von mehreren der folgenden Krankheiten oder Störungen verursacht sein können: Sauerstoffmangel; Ischämie; primäre und metastatische Tumorbildung; infektiöse Krankheiten; entzündliche Krankheiten; sogenannte Kollagenerkrankungen (einschließlich Defekten der Kollagensynthese, des Kollagenabbaus oder bei normaler Matrix); angeborene, genetische oder Entwicklungskrankheiten; Ernährungskrankheiten; metabolische Krankheiten; idiopathische Krankheiten; und Krankheiten in Zusammenhang mit abnormer mineralischer Homöostase, um nur einige zu nennen.
  • Einige der hier beispielhaft dargestellten Verfahren beinhalten den Schritt der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung an einer defekten Stelle nach dem Beginn des Heilungsprozesses; die Stufen des Heilungsprozesses und die damit verbundenen physiologischen Ereignisse wurden früher beschrieben. Ein anderes der Verfahren umfaßt den Schritt der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung an einer defekten Stelle während der Reifung der endogenen Matrix an der Stelle; die Ereignisse, die mit der endogenen Matrixbildung während der endochondralen Knochenbildung einhergehen, wurden auch früher beschrieben. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegenden Erfindung die Verwendung einer matrixfreien Vorrichtung für die Herstellung eines Medikaments für die Reparatur eines Knochendefekts, eines chondralen Defekts oder eines osteochondralen Defekts bereit, die den Schritt der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung zu Zeiten nach der Verletzung umfassen, die verzögert sind. Solche Verzögerungen können kurzfristig sein, mittel- oder langfristig, wie nachstehend beschrieben. Das Ausmaß, um das die Verabreichung verzögert ist, hängt von den Umständen ab und der Durchschnittsfachmann wird leicht die Bedeutung davon verstehen.
  • Wie nachstehend gezeigt ist die verbesserte Heilung und Defektreparatur das Ergebnis der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung an einer defekten Stelle zu vergangenen Zeiten nach der Verletzung. Zum Beispiel kann die verzögerte Verabreichung Zeiten von mindestens 0,5 Stunden bis zu mindestens 6 Stunden nach der Verletzung umfassen; in einer anderen Ausführungsform können die verzögerten Verabreichungszeiten Zeiten von mindestens 6 Stunden bis zu 24 Stunden umfassen, oder von mindestens 24 Stunden bis zu 48 Stunden nach der Verletzung. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist die Verzögerung mindestens 6 Stunden. Andere Verabreichungzeiten nach der Verletzung werden durch die vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen. In gewissen anderen gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen können die verzögerten Verabreichungszeiten von mindestens 48 Stunden bis zu mindestens 72 Stunden nach der Verletzung betragen. In noch anderen Ausführungsformen können die Verabreichungszeiten signifikant über 72 Stunden hinausreichen, d. h. knochenbildende Vorrichtungen könne an der defekten Stelle erst in der Stufe der Remodellierung der Knochenheilung verabreicht werden. Es werden auch Verfahren in Betracht gezogen, bei denen matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen an der Stelle eines Defekts unkritischer Größe zu vielen Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht werden. Zum Beispiel ist eine gegenwärtig bevorzugte Vielzahl von 0,5 bis 6 Stunden und 7 Tage nach der Verletzung. Eine Vielzahl von verzögerten Verabreichungen kann mittels manueller Verabreichung an die defekte Stelle oder mittels automatischer Verabreichungen unter Verwendung einer früher beschriebenen Minipumpe erreicht werden.
  • Experimenteller Aufbau
  • Insgesamt 12 erwachsene Mischlingshunde wurden verwendet. Wie früher beschrieben wurden bilaterale segmentale Defekte der Ulna von 3 mm Länge in allen Tieren erzeugt. Wie in dieser besonderen Untersuchung beispielhaft dargestellt war die verwendete matrixfreie Formulierung von OP-1 3,5 mg OP-1/ml, die in 100 Mikroliter Lactose/Acetatpuffer verabreicht wurde, wie vorstehend beschrieben. Zwölf Tieren wurden in den rechten Defekt matrixfreie Vorrichtungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht und Kontrollvorrichtungen wurden in den linken Defekt zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht. Drei Tiere wurden bei der Schaffung des Defekts behandelt (0 Stunden), drei 6 Stunden nach der Verletzung und drei 48 Stunden nach der Verletzung. Alle Tiere wurden 4 Wochen nach der Chirurgie getötet. Es wurden wöchentlich Radiogramme aufgenommen, um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Bei der Tötung wurden Knochensegmente mittels Histologie auf Gewebereaktion, Qualität und Menge an Knochenneubildung und Ausmaß an Heilung beurteilt. Alle Ulnae wurden en bloc gewonnen und in Torsion mechanisch getestet.
  • Wie früher beschrieben wurden die Ulnae direkt nach der Sektion durch Torsion auf Versagen in einer MTS hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf unter Hubkontrolle bei einer konstanten Vorschubrate von 50 mm/Min. geführt wurde. Ein Ende war starr fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn gedreht. Die Torsionskraft wurde mittels eines Hebelarms von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen. Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten würden mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online Computeraufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis zum Versagen erhalten wurden und die Energieaufnahme bis zum Versagen als die Fläche unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
  • Resultate
  • Alle Proben wurden 4 Wochen nach der Chirurgie mechanisch getestet. Mechanisch hatten die Defekte, die die matrixfreie OP-1-Vorrichtung 6 Stunden nach der Verletzung erhielten, die höchste Torsionkraft; 73% von intakten Ulnae verglichen mit 64% nach 48 Stunden und 60% zur Stunde 0. Die Kontrolldefekte bei 0 Stunden, 6 Stunden und 48 Stunden nach der Verletzung hatten Kräfte von 23%, 28% und 24%.
  • Diese Untersuchung zeigt das überraschende Resultat, daß eine verbesserte Heilung eines Defekts unkritischer Größe durch eine verzögerte Verabreichung einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung an der defekten Stelle nach der Verletzung erreicht werden kann. Dieses unerwartete Resultat steht in Beziehung zum Stadium der Knochenheilung oder der endogenen Matrixbildung an der defekten Stelle, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Ereignissen wie Klümpchenbildung, Infiltration von Vorläuferzellen und Kallusbildung, insbesondere weicher Kallus, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus wird erwartet, daß andere Defektreparaturprozesse unter Einschluß des Knochens, wie die Reparatur von osteochondralen Defekten ähnlich denen, wie sie hier beschrieben wurden, durch eine verzögerte Verabreichung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen an der defekten Stelle nach der Verletzung verbessert werden können.
  • H. Weiter Untersuchungen der Reparatur von chondralen Defekten unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen (Schaf)
  • 1. Experiment 1: Glycosaminoglycane und andere Polymere als Träger für knochertbildendes Protein
  • Wie früher beschrieben sind gewisse bevorzugte Kategorien von Verbindungen als Träger in den hier betrachteten matrixfreien Vorrichtungen geeignet. Unter den gegenwärtig bevorzugten Kategorien sind Verbindungen, die im Fachgebiet als Gleitmittel anerkannt sind, speziell diejenigen, die natürlicherweise vorkommen und natürlicherweise physiologische Funktionen wie der Schutz und die Schmierung von Zellen und die Erhaltung der Integrität von Gewebe erfüllen, um nur einige zu nennen. Solche Verbindungen sind im allgemeinen auch Befeuchtungsmittel und die Feuchtigkeit haltende Mittel. Eine Subkategorie von gegenwärtig bevorzugten Gleitmitteln umfaßt die Biopolymere, die als Glycosaminoglycane bekannt sind. Glycosaminoglycane, die bei der vorliegenden Erfindung in Betracht kommen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Hyaluronsäure, Chondroitin, Dermatan und Keratan, um nur einige zu nennen. Es können sowohl sulfonierte als nicht sulfonierte Formen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Andere Glycosaminoglycane sind für die Formulierung von matrixfreien Vorrichtungen geeignet, und der Durchschnittsfachmann wird andere geeignete Verbindungen entweder wissen oder in der Lage sein, sich ihrer unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten zu versichern. Für eine detaillierte Beschreibung von Glycosaminoglycanen vgl. Aspinall, Polysaccharides, Pergamon Press, Oxford (1970).
  • Ein insbesondere bevorzugtes Glycosaminoglycan ist Hyaluronsäure (HA). HA ist ein natürlicherweise vorkommendes anionisches Polysaccharid oder komplexer Zucker. Sie wird in Knorpel und synovialer Flüssigkeit gefunden. HA ist im kosmetischen Grad und im medizinischen Grad erhältlich; zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der medizinische Grad im allgemeinen bevorzugt. HA kann beim Molekulargewicht von niedrig bis hoch reichen. In gewissen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist Material mit hohem Molekulargewicht vorzuziehen; nur als Beispiel kann HA 190 (1,9 a 106 Da; 1% wird gegenwärtig bevorzugt, es sind aber Konzentrationen geeignet, die von 0,5–2% reichen), der Salzlösung zugemischt wurde, zweimal wöchentlich intraartikulär verabreicht werden (0,1 ml/kg), um chondrale Defekte zu reparieren. In anderen Ausführungsformen kann HA mit niedrigem Molekulargewicht (wie HA80, 0,8 x 106 Da; 1% wird bevorzugt, es sind aber Konzentrationen geeignet, die weniger als oder gleich 4% sind) verwendet werden. Unter Verwendung der hier bereitgestellten Lehren kann der Durchschnittsfachmann die Umstände beurteilen, unter denen die HA mit hohem Molekulargewicht dem Material mit niedrigem Molekulargewicht für die Defektreparatur vorzuziehen ist, und umgekehrt. Darüber hinaus wird dem Durchschnittsfachmann bewußt sein, daß HA in Lösung eine viskose Flüssigkeit ist, und daß die Viskosität durch Einstellung des Molekulargewichts und des Gehalts an HA manipuliert werden kann. Zum Beispiel ist es in einigen Ausführungsformen bevorzugt, sich der Viskosität der synovialen Flüssigkeit im Gelenk anzugleichen. Unter Verwendung von Fachwissen und Routineexperimenten, zusammen mit den hier bereitgestellten Lehren, kann der Durchschnittsfachmann matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen für die Reparatur von chondralen Defekten formulieren, die HA als Träger verwenden; die Viskosität der Vorrichtung ebenso wie der Proteingehalt können, wie durch die Umstände erforderlich und wie hier gelehrt, leicht angepaßt werden. HA ist kommerziell von mehreren Quellen erhältlich, einschließlich Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA) und Collaborative Laboratories (Esst Setauket, NY).
  • Glycosaminoglycan und andere polymere Träger wie Hyaluronsäure, die zur Verwendung mit den vorliegenden matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen geeignet sind, können in dem Schafmodell für chondrale Defekte beurteilt werden, das vorstehend beschrieben ist. Zum Beispiel werden mittels chirurgischer Standardverfahren in der gewichttragenden Oberfläche des medialen und lateralen Kondylus von beiden Kniegelenken in einem Schaf Defekte von 2 x 7 mm gemacht. Ein Kniegelenk wird durch intraartikuläre Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung mit OP-1/Hyaluronsäure behandelt und das andere Gelenk wird mit Hyaluronsäure allein behandelt.
  • Zwei Gruppen an Schafen werden untersucht: Gruppe I wird nach 8 Wochen getötet und Gruppe ID wird nach 6 Monaten getötet. Wie früher beschrieben kann die Heilung von chondralen Defekten mittels Radiologie und histologischen und histochemischen Standardverfahren beurteilt werden. Von jedem Knie werden monatlich Radiogramme aufgenommen. Eine arthroskopische Untersuchung wird unter Verwendung von Standardverfahren und Standardausrüstung unter Anästhesie genau vor der Tötung vorgenommen. Unmittelbar nach der Tötung werden Proben des Kniegelenks in 10 %-igem gepuffertem Formalin fixiert. Die Proben werden longitudinal geteilt und ein Teil in graduierter Ethylalkohollösung von 70–100% entkalkt und in Methylmethacrylat eingebettet, geschnitten und für die hostologische Beurteilung angefärbt.
  • Es wird erwartet, daß Hyaluronsäure enthaltende matrixfreie Vorrichtungen die Rate der Reparatur von chondralen Defekten erhöhen und das erreichte Maß an Reparatur verbessern. Die Reparatur kann in Tiermodellen durch Standardverfahren der Knorpelcharakterisierung beurteilt werden, einschließlich der histologischen Bewertung von gefärbten und fixierten Gewebeschnitten, der Lokalisierung von knorpelspezifischen Makromolekülen (wie Typ ID Kollagen und Aggrecan), der Bestimmung des Profils an Proteoglycan und der mechanischen Testung. Alles Vorstehende kann durch einen Durchschnittsfachmann unter Verwendung von Routineexperimenten und dem Wissen auf dem Fachgebiet durchgeführt werden.
  • Äquivalente
  • Die Erfindung kann in andern spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne die wesentlichen Merkmale davon zu verlassen. Die vorstehenden Ausführungsformen sind daher so zu verstehen, daß sie unter allen Aspekten eher illustrativ als beschränkend für die hier beschrieben Erfindung sind. Der Umfang der Erfindung wird daher eher durch die beigefügten Ansprüche als durch die vorstehende Beschreibung festgelegt, und alle Abänderungen, die innerhalb der Bedeutung und dem Bereich von Äquivalenz der Ansprüche liegen, sind so zu betrachten, daß sie umfaßt werden.
  • SEQUENZLISTEN
    Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001

Claims (36)

  1. Verwendung einer matrixfreien Zusammensetzung, der eine Gerüststruktur fehlt, wobei die matrixfreie Zusammensetzung ein knochenbildendes Protein umfasst, das in einem biokompatiblen, nicht starren amorphen Träger verteilt ist, der keine definierten Oberflächen besitzt, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung der Knochenbildung in einem Säuger, die ausreicht, um eine defekte, einen Hohlraum definierende Stelle aufzufüllen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Volumen der matrixfreien knochenbildenden Zusammensetzung nicht ausreicht, um den Hohlraum aufzufüllen.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die defekte Stelle ein Volumen definiert, das endogen nicht repariert werden kann.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Knochenbildung eine endochondrale Knochenbildung ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Knochenbildung eine intramembranöse Knochenbildung ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger ein Gel umfasst.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger eine wässrige Lösung umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alkylcellulosen; Pluronics; Gelatinen; Polyethylenglycolen (PEG); Dextrinen und pflanzlichen Ölen.
  9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Carboxymethylcellulose; Mannit; PEG 3350; Pluronic F127 und Sesamöl.
  10. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das knochenbildende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OP1; OP2; OP3; BMP2; BMP3, BMP4; BMP5; BMP6; BMP9; BMP-10; BMP-11; BMP-12; BMP-15; BMP-3b; DPP; Vgl; Vgr; 60A-Protein; GDF-1; GDF-3; GDF-5; GDF-6; GDF-7; GDF-8; GDF-9; GDF-10; GDF-11 und Aminosäuresequenzvarianten davon.
  11. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das knochenbildende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OP1; OP2; BMP2; BMP4; BMP5; BMP6 und Aminosäuresequenzvarianten davon.
  12. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das knochenbildende Protein ein Morphogen ist, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70% Homologie zu den C-terminalen Aminosäuren 102–106 des menschlichen OP1, einschließlich der konservierten sieben Cystein-Domäne, besitzt.
  13. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das knochenbildende Protein OP1 ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das knochenbildende Protein das reife in einer Kochsalzlösung solubilisierte OP1 ist.
  15. Matrixfreie Zusammensetzung, der eine Gerüststruktur fehlt, zur Induzierung der Knochenbildung, die ausreicht, um eine defekte, einen Hohlraum definierende Stelle aufzufüllen, wobei die matrixfreie Zusammensetzung umfasst: ein in einem biokompatiblen, nicht starren amorphen Träger, der keine definierten Oberflächen besitzt, verteiltes knochenbildendes Protein.
  16. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Träger ein Gel umfasst.
  17. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Träger eine wässrige Lösung umfasst.
  18. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alkylcellulosen; Pluronics; Gelatinen; Polyethylenglycolen (PEG); Dextrinen und pflanzlichen Ölen.
  19. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Carboxymethylcellulose; Mannit; PEG 3350; Pluronic F127 und Sesamöl.
  20. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das knochenbildende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OP1; OP2; OP3; BMP2; BMP3; BMP4; BMP5; BMP6; BMP-10; BMP-11; BMP-12; BMP-15; BMP-3b; BMP9; DPP, Vgl; Vgr; 60A-Protein; GDF-1; GDF-3; GDF-5; GDF-6; GDF-7; GDF-8; GDF-9; GDF-10; GDF-11 und Aminosäuresequenzvarianten davon.
  21. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das knochenbildende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OP1; OP2; BMP2; BMP4; BMP5; BMP6 und Aminosäuresequenzvarianten davon.
  22. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das knochenbildende Protein ein Morphogen ist, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70% Homologie zu den C-terminalen Aminosäuren 102–106 des menschlichen OP1; einschließlich der konservierten sieben Cystein-Domäne, besitzt.
  23. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das knochenbildende Protein OP1 ist.
  24. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das knochenbildende Protein das reife in einer Kochsalzlösung solubilisierte OP1 ist.
  25. Verwendung von im Wesentlichen reinem knochenbildenden Protein, das frei von einem Träger oder einer Gerüststruktur ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung der Knochenbildung in einem Säuger, das ausreicht, um eine defekte, einen Hohlraum definierende Stelle aufzufüllen.
  26. Verwendung der matrixfreien Zusammensetzung nach Anspruch 15 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Steigerung der Quantität oder Qualität der Kallusbildung an einer osteogen defekten Stelle in einem Säuger.
  27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das knochenbildende Protein ein Morphogen ist, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70% Homologie zu den C-terminalen Aminosäuren 102–106 des menschlichen OP1, einschließlich der konservierten sieben Cystein-Domäne, besitzt.
  28. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das knochenbildende Protein OP1 ist.
  29. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das knochenbildende Protein eine durch OPX (SEQ ID No. 3) definierte Aminosäuresequenz; eine generische Sequenz 6 (SEQ. ID No. 4); eine generische Sequenz 7 (SEQ. ID No. 5); eine generische Sequenz 8 (SEQ. ID No. 6) oder eine generische Sequenz 9 (SEQ. ID No. 7) umfasst.
  30. Verwendung der matrixfreien Zusammensetzung nach Anspruch 15 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Beschleunigung der Knochenbildung an einer defekten Stelle.
  31. Verwendung der matrixfreien Zusammensetzung nach Anspruch 15 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung einer endogenen Matrixbildung an einer defekten Stelle.
  32. Verwendung der matrixfreien Zusammensetzung, der eine Gerüststruktur fehlt, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Reparieren eines Knochendefektes, eines chondralen Defektes oder eines osteochondralen Defektes, zur Verabreichung bei einem Defekt, wobei die Verabreichung nach der Verletzung verzögert ist; wobei die matrixfreie Zusammensetzung ein knochenbildendes Protein umfasst, das in einem biokompatiblen, nicht starren amorphen Träger verteilt ist, der keine definierten Oberflächen besitzt.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Verabreichung um mindestens 6 Stunden nach der Verletzung verzögert ist.
  34. Matrixfreie Zusammensetzung, der eine Gerüststruktur fehlt, zur Reparatur eines chondralen Defektes, wobei die matrixfreie Zusammensetzung ein knochenbildendes Protein und einen Glycosaminoglycan-Träger umfasst.
  35. Matrixfreie Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei der Träger Hyaluronsäure ist.
  36. Verwendung der matrixfreien Zusammensetzung nach Anspruch 34 für die Herstellung eines Arzneimittels zum Reparieren eines chondralen Defekts.
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