DE69817329T2

DE69817329T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Identifikation einer Substanz durch Oberflächenwechselwirkungen

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Publication number: DE69817329T2
Application number: DE69817329T
Authority: DE
Inventors: Andre Bernard; Bruno Michel; Hans Biebuyck; Heinz Schmid; Emmanuel Delamarche
Original assignee: International Business Machines Corp
Current assignee: International Business Machines Corp
Priority date: 1998-06-02
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2018-06-03
Also published as: US6537499B1; EP0962759B1; DE69817329D1; EP0962759A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Identifizieren einer vorzugsweise biochemische Moleküle umfassenden Substanz. Insbesondere besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, die Technik der Analyse unbekannter Biomoleküle zu verbessern, um Ergebnisse einfacher und schneller zu erhalten, sodass das Verfahren ohne den Einsatz großer Aufwendungen und hoher Kosten eingesetzt werden kann. Eine bevorzugte Ausführungsart der Erfindung ist ein Biosensor zum einfachen Nachweis unbekannter Biomoleküle.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, um den Substanztyp beispielsweise einer chemischen Substanz, vorzugsweise eines Biomoleküls, mit einem hohen Maß an selektiven Bindungseigenschaften zu ermitteln.
Es gibt Verfahren zum Analysieren der optischen Eigenschaften einzelner Substanzen wie etwa des Absorptions- oder Transmissionsverhaltens, aber alle diese Verfahren erfordern sehr genaue Messgeräte, welche Lichtquellen zum Emittieren definierter Wellenlängen sowie sehr genauer Nachweisvorrichtungen umfassen, wodurch diese Verfahren sehr aufwändig werden.
Es sind Verfahren zum Identifizieren von Substanzen durch Messung von deren Oberflächeneigenschaften wie etwa der Oberflächenkräfte oder der Adhäsionsarbeit bekannt. Die Adhäsionsarbeit einer auf eine Festkörperoberfläche aufgebrachten Substanz kann man durch Messen des Kontaktwinkels zwischen der Oberfläche und einem darauf gebrachten Flüssigkeitströpfchen ermitteln. Dieses Verfahren ist in einem Artikel von Israelachvili unter dem Titel „Interfacial Forces", J. Vac. Sci. Technol. A 10(5), Sept./Okt. 1992, S. 2961 bis 2971, beschrieben.
Ein anderer Ansatz zur Abschätzung der freien Oberflächenenergien von Festkörperoberflächen erfordert die direkte Untersuchung der Festkörper-Festkörper-Grenzflächen. In einem Artikel von Chaudhury und Whitesides, Langmuir, Bd. 7, Nr. 5, 1991, S. 1013 bis 1025, wird die Messung der freien Oberflächenenergie von elastischen Polymeren aus der Messung der Deformation halbkugelförmiger Linsen von Polydimethylsiloxan-Elastomeren und deren chemischer Derivate hergeleitet. Die Analysen der Linsendeformation erfolgten mittels der Youngschen Gleichung und des Johnson-Kendall-Roberts-Modells (YRK). Bei den Analysen wurden die über die Grenzfläche hinweg wirkenden Adhäsionskräfte gleich den rücktreibenden Kräften gesetzt, die der Linsendeformation entgegenwirken. Um genaue Ergebnisse zu erhalten, müssen die Elastizitätsmodule und die Poissonzahlen für jedes Material bekannt sein. Außerdem müssen für ein oder beide an der Messung beteiligte Materialien sphärische Linsen mit sehr gut definiertem Radius und glatten Oberflächen hergestellt werden.
Eine Abschätzung der Eigenschaften und der Art einer unbekannten Substanz kann man erhalten, indem man die Adhäsionsarbeit der auf eine Probenfläche aufgebrachten Substanz ermittelt. Die oben erwähnten Verfahren sind jedoch kompliziert und langwierig.
Ein weiterer Aspekt bei der Ermittlung der Bindungskonstanten von Substanzen durch Messung deren Oberflächeneigenschaften besteht in der direkten Wechselwirkung zwischen mindestens zwei Molekülen. Solche Wechselwirkungen, die sich von vielen schwachen Bindungen zwischen geometrisch zusammenpassenden und mit unterschiedlichen chemischen Gruppen beschichteten Oberflächen herleiten, können sehr stark sein. Im Bereich der Biomoleküle ist die Empfindlichkeit der Bindungseigenschaften so stark ausgeprägt, dass die molekulare Erkennung zwischen einem Rezeptormolekül und einem Liganden, einem Antikörper und einem Antigen sowie zwischen komplementären DNA-Strängen eine Basis zur Identifizierung von biochemischen Substanzen wie beispielsweise von Biomolekülen bietet.
Durch die Entwicklung von Rastersondenmikroskopen, insbesondere des Rasterkraftmikroskops (atomic force microscope, AFM) können Oberflächen in physiologischen Milieus mit molekularer Auflösung und mit Kräften bis in den pN-Bereich (Pikonewton) hinab analysiert werden, wie in einem Artikel von G. Binnig, C. F. Quate und Ch. Gerber, Phys. Ref. Lett. 56, 930(1986), beschrieben wird.
Florin et al. haben mit dem Rasterkraftmikroskop die Adhäsionskraft zwischen der Spitze eines mit Avidin beschichteten AFM-Hebels einerseits und mit Biotin versetzten Agaroseperlen andererseits gemessen. Sie fanden, dass die zum Trennen der Spitze von den Perlen erforderliche Kraft in Stufen zu 160 pN gequantelt ist (E.-L. Florin, V. T. Moy und H. E. Gaub, Science, 264, 415(1994)). Dieses bekannte Verfahren eignet sich jedoch nicht für Messungen an Orten, wo das AFM-Verfahren nicht zur Verfügung steht. Florin vermag außerdem nicht zu zeigen, wie man unbekannte Substanzen charakterisieren kann.
In ähnlicher Weise zeigt die US-Patentschrift 5 620 857 die Verwendung einer Laseranordnung, die für die Reaktion zwischen einem Analyten und einem Reagens und insbesondere für den Prozess der Trennung eines ersten und eines zweiten Körpers verantwortlich ist. Es wird vorgeschlagen, optische Zangen zum Bewegen von Mikrokugeln aus Glas oder Latex zu verwenden, auf die biologische Moleküle aufgebracht wurden, sodass die Moleküle mit auf einer Festkörperoberfläche gebundenen Molekülen Wechselwirken können. Die zur Trennung der Mikrokugeln von dem Substrat aufgewendete Laserleistung liefert dabei einen Hinweis auf die Wechselwirkungskraft zwischen den am Scheitelpunkt der Kugel wechselwirkenden Moleküle. Insofern besteht kaum ein Unterschied zu der von Florin et al. veröffentlichten Arbeit. Bei dem oben erwähnten Fall mit dem AFM wird ein Piezoantrieb zum Verschieben im Subnanometerbereich verwendet. Weetall et al. ersetzen in der US-Patentschrift 5 620 857 den Servoantrieb durch optische Zangen und weisen die Kraft auch mit den Zangen nach.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Identifizieren unbekannter Substanzen bereitzustellen, das bezüglich der erforderlichen Ausrüstung weniger aufwändig ist und weniger Prozessschritte erfordert.
Das Verfahren soll leicht kontrollierbar sein und zuverlässige Ergebnisse liefern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zum Identifizieren von Substanzen auf der Grundlage von deren Bindungseigenschaften gegenüber einer bekannten Sonde bereitzustellen, die insbesondere ein biochemisches Molekül umfasst und keine hochkomplizierten Analysegeräte benötigt, die üblicherweise sehr teuer sind. Außerdem soll eine solche Vorrichtung leicht zu bedienen sein und als Biosensor verwendet werden, durch den eine Vielzahl unbekannter Substanzen identifiziert werden kann.
ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1 zum Identifizieren einer vorzugsweise biochemische Moleküle umfassenden Substanz, die normalerweise auf eine Probenfläche aufgebracht ist. Außerdem wird eine definierte Sonde verwendet, die vorteilhafterweise zur besseren Bedienung auf eine Kontaktfläche aufgebracht ist. Die beiden mit den oben erwähnten Schichten beschichteten Flächen werden in Kontakt miteinander gebracht und anschließend voneinander getrennt, während gleichzeitig die physikalischen Parameter gemessen werden, die für die Wechselwirkung zwischen der Substanz und der Sonde charakteristisch sind. Die erhaltenen Ergebnisse werden zur Identifizierung mit Referenzwerten verglichen. Diese Referenzwerte können aufgelistet sein oder mit Referenzverfahren gemessen werden, wie sie zum Beispiel oben in Bezug auf den Stand der Technik beschrieben wurden.
Zur Charakterisierung und Identifizierung einer unbekannten Substanz stellt die von den Bindungsstärke abhängige Adhäsionsarbeit einen geeigneten Parameter dar, der mit dem oben erwähnten Verfahren der Erfindung gemessen werden kann. Gemäß der Erfindung wird vorgeschlagen, einen gegossenen Elastomerstempel mit einer gut definierten Kontaktfläche zu verwenden, auf den eine bekannte Sonde aufgebracht wird. Diese Sonde wird in Richtung der Probenfläche verschoben, auf die die unbekannte Substanz, vorzugsweise biochemische Moleküle, aufgebracht wurden, bis sich beide Flächen in einem gut definierten Berührungskontakt befinden.
Der Begriff „Berührungskontakt" bedeutet, dass die Oberflächenformen der beiden aufeinander gesetzten Medien einander so ähnlich sind, dass außer dem durch starke Bindung an die Moleküle immobilisierten Wasser keine Fluide in die Ebene, an der die Flächen aufeinander treffen, eindringen können. Der Begriff „Fluide" bezieht sich sowohl auf Flüssigkeiten als auch auf Gase.
Während die beiden Oberflächen bis zum Berührungskontakt zusammengebracht werden, wird während dieser Belastungsphase die Kraft als Funktion von der Verschiebungsstrecke vom Punkt des Erstkontakts zwischen den beiden Flächen bis zum vollständigen Berührungskontakt ermittelt, der durch eine bestimmte Kraft gekennzeichnet ist. Anschließend werden die beiden Flächen so weit auseinandergezogen, bis sie vollständig voneinander getrennt sind. Auch die Kraft während der Trennphase wird als Funktion der Verschiebungsstrecke vom vollständigen Berührungskontakt bis zum Punkt der beginnenden vollständigen Trennung ermittelt.
Die während der Belastungsphase einwirkende Kraft wird vom Punkt des Erstkontakts bis zur Maximalbelastung aufsummiert. Dieses Integral entspricht der bei der elastischen Deformation des Stempels gespeicherten Energie. Die während der Entlastungsphase einwirkende Kraft wird ebenso vom Punkt der Maximalbelastung bis zur Belastung null nach dem Spielausgleich aufsummiert.
Oberflächen, die von Substanzen mit großer Adhäsionsarbeit bedeckt sind, müssen auseinandergezogen werden, bis sie abreißen. Die Differenz zwischen den beiden Energien (Belastungsintegral, Entlastungsintegral) entspricht der Adhäsionsarbeit und entspricht jeweils der auf die Probenoberfläche aufgebrachten Substanz. Der erhaltene Wert der Adhäsionsarbeit kann nun mit einem aus gespeicherten Daten oder aus einer Referenzmessung gewonnenen Wert verglichen werden.
Ein weiteres alternatives Verfahren zur Identifizierung einer Substanz durch Gewinnen von Ergebnissen hoher Qualität und Aussagekraft über die Eigenschaften und die Art einer Substanz kann wie folgt durchgeführt werden:
Ebenso wie bei dem oben erwähnten Verfahren wird die unbekannte Substanz auf eine Probenfläche aufgebracht, die mit einer Kontaktfläche in Berührung gebracht wird, die mit einer definierten Sonde (Prüfsubstanz) beschichtet ist. Mindestens eine der Flächen, vorzugsweise die Kontaktfläche, ist aus einem flexiblen Material wie einem elastomeren Material hergestellt, sodass die beiden Flächen in Berührungskontakt miteinander gelangen können. Anschließend werden beide Flächen bis zur vollständigen Trennung auseinandergezogen, indem auf mindestens eine der Flächen eine zunehmende Kraft ausgeübt wird. Es ist wichtig, dass die vorzugsweise auf die Kontaktfläche gerichtete Kraft auf definierte Weise einwirkt, sodass der Trennschritt reversibel und auf standardisierte Weise wiederholt werden kann.
Ein für die Wechselwirkung zwischen der unbekannten Substanz und der Prüfsubstanz charakteristischer wert besteht in dem Zeitraum zwischen dem Einwirken der zunehmenden Kraft zum Trennen der beiden Flächen voneinander und dem Punkt der vollständigen Trennung. Der gemessene Zeitraum besitzt Aussagekraft für die zwischen der Substanz und der Prüfsubstanz wirkenden Bindungskräfte und ist daher für die unbekannte Substanz charakteristisch. Zur Identifizierung der gemessenen Substanz muss der gemessene Zeitraum mit einem Vergleichswert verglichen werden, der aus einer gespeicherten Datenmenge oder durch übliche Vergleichsmessungen gewonnen werden kann.
Anstatt der Einwirkung einer definierten zunehmenden Kraft, wie oben beschrieben wurde, wirkt bei einem weiteren alternativen Verfahren beim Trennschritt eine definierte konstante Kraft auf mindestens eine der beiden Flächen ein. Dabei werden keine physikalischen Parameter wie die einwirkenden Kräfte oder die Einwirkungsdauer gemessen, sondern es interessiert nur, ob sich die beiden Flächen nach Einwirken der konstanten Kraft in Kontakt befinden. Auf diese Weise kann eine Substanz allein durch ihr Bindungsverhalten klassifiziert werden. Durch dieses Einwirken einer konstanten Einzelkraft kann ein Schwellenwert ermittelt werden, der eine grobe Entscheidung darüber erlaubt, ob die zu untersuchende Substanz der einwirkenden Kraft widersteht, indem man prüft, ob die beiden Flächen sich noch berühren.
Die letztere Alternative erlaubt zwar nur eine grobe Einschätzung über die Eigenschaften und die Art der Substanz, aber man kann das Verfahren als erste Näherung einer groben Identifizierung oder Unterscheidung von Substanzen ansehen, und das Verfahren kann auf einfache Weise durchgeführt werden, sodass es sich für den Feldeinsatz eignet.
Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung nach Anspruch 6 zum Identifizieren einer vorzugsweise biochemische Moleküle umfassenden Substanz, mittels derer das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Hierfür umfasst die Vorrichtung im Grunde zwei Trägermittel, und zwar eins für die zu bestimmende Substanz und die andere für die bekannte Sonde (Prüfsubstanz). Die Sonde wird auf eine Kontaktfläche aufgebracht, die eine Oberfläche eines Trägermittels ist, welches in Form eines Stempels aus einem elastomeren Material gegossen ist. Um bei der Ermittlung der beteiligten Bindungskräfte zwischen der Substanz und der Prüfsubstanz eine bessere statistische Ausgewogenheit zu erzielen, beträgt die Kontaktfläche des Stempels von weniger als einem μm² bis zu mehreren mm². Die unbekannte Substanz hingegen wird auf eine Probenoberfläche wie beispielsweise auf ein Glassubstrat aufgebracht, die aus einem starren Material bestehen kann.
Um die beiden Flächen in Kontakt zueinander zu bringen sowie voneinander zu trennen, wird ein Trennmittel bereitgestellt, das vorzugsweise mit der Stempelanordnung verbunden ist, sodass der Stempel in Richtung der Probenfläche bewegt und von ihr entfernt werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsart umfasst das Trennmittel einen Schrittmotorantrieb, mit dem eine definierte Verschiebungsstrecke zwischen der Kontaktfläche des Stempels und der Probenfläche eingestellt werden kann.
Ferner werden Messmittel zum Messen beispielsweise der einwirkenden Kräfte bereitgestellt, die auf die Oberflächen gerichtet sind, um die Oberflächen in Kontakt miteinander zu bringen oder sie voneinander zu trennen. Desgleichen kann das Messmittel zur Ermittlung der Zeitspanne zwischen dem Berührungskontakt der beiden Oberflächen und dem Zustand der vollständigen Trennung vorgesehen sein. Es kann eine Lichtquelle zum Einkoppeln von Licht in die Stempelanordnung bereitgestellt werden, um festzustellen, ob der Stempel die Probenfläche berührt oder von ihr getrennt ist. Zu diesem Zweck muss der Stempel aus einem lichtdurchlässigen Material bestehen, sodass Licht in den Stempel eingekoppelt werden kann, der als Lichtwellenleiter dient. Falls sich der Stempel und die Probenoberfläche berühren, tritt das in den Stempel eingekoppelte Licht durch die Grenzflächenschicht zwischen der Kontaktfläche und der Probenfläche in den Grundkörper, auf dem die Probenfläche bereitgestellt wird. Vorzugsweise besteht auch der Grundkörper der Probenfläche aus einem lichtdurchlässigen Material, sodass durchgelassenes Licht ohne hohe Verluste durch den Grundkörper treten kann. Unmittelbar am Grundkörper ist ein Nachweismittel zum Messen der Intensität des durchgelassenen Lichts angebracht.
Falls zwischen der Kontaktfläche und der Probenfläche kein Kontakt besteht, ist die Intensität des durchgelassenen Lichts infolge der Reflexion an der Kontaktfläche des Stempels deutlich verringert, der durch ein Medium mit einem im Vergleich zum Stempelmaterial unterschiedlichen Brechungsindex umgeben ist. Aus dem zum Beispiel mittels einer CCD-Kamera oder ganz einfach mit dem Auge empfangenen Signal des Lichtnachweismittels kann man genaue Informationen über den tatsächlichen Zustand der beiden Flächen gewinnen, und zwar ob sie sich berühren oder voneinander getrennt sind. Dieses Signal kann als Start- oder Stoppsignal zum Messen der oben erwähnten Zeitspanne zum Trennen der beiden Flächen dienen. Ebenso kann das Lichtnachweismittel Informationen darüber bereitstellen, ob der Zustand des Berührungskontakts zwischen der Kontaktfläche und der Probenfläche erreicht wurde.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsart nach den Ansprüchen 16 und 17 kann die erfindungsgemäfle Vorrichtung als Biosensor zum Nachweis und zur Charakterisierung einer Vielzahl von Substanzen in Form von Biomolekülen verwendet werden. Der Biosensor umfasst mindestens einen aus einem elastomeren Material wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellten Stempel mit einem Durchmesser von ungefähr 0,1 μm bis 1 mm und einem Durchmesser-Höhen-Verhältnis von ungefähr 2 bis 10. Auf die Kontaktfläche des Stempels werden chemische Verbindungen mit Molekülen aufgebracht, die selektive Bindungseigenschaften aufweisen. Diese Prüfmoleküle werden gerichtet so an der Kontaktfläche aufgebracht, dass die aktive Seite jedes Moleküls von der Stempelfläche weg zeigt und für selektive Nachweiszwecke verwendet werden kann. Jedes Molekül ist fest mit der Kontaktfläche verbunden und kann mehrere Male verwendet werden. Wenn der Stempel gegen die Probenfläche gedrückt wird und einen Berührungskontakt herstellt, können die einzelnen Moleküle infolge der Nachgiebigkeit des Stempels ihre Liganden in einer spezifischen, für biologische Systeme typischen Weise erkennen und sich mit ihnen verbinden. Wird der Stempel von der Probenfläche weggezogen, wird eine stärkere Kraft benötigt als für Vergleichssysteme ohne spezifische Erkennung. Die Bindungsenergie kann wie oben ausgeführt gemessen werden.
Auf ähnliche Weise können in einer automatischen Anordnung eine Vielzahl auf vielen einzelnen Probenflächen haftender Substanzen geprüft und klassifiziert werden, wenn die Probenflächen auf einer Mikrotiterplatte angebracht sind.
Außerdem kann der Biosensor eine Mehrstempelanordnung bereitstellen, wobei jeder Stempel eine Kontaktfläche aufweist, die mit einer Art von Biomolekülen beschichtet ist, die unterschiedliche selektive Bindungseigenschaften haben. Die Stempel der Anordnung sind durch ein normales Verbindungsmittel miteinander verbunden, sodass der Kontakt zwischen den Kontaktflächen jedes Stempels mit einer Probenfläche gleichzeitig erfolgen kann.
Der oben beschriebene Ansatz zum Messen von biologischen Molekülen mit dieser Art des erfindungsgemäßen Biosensors funktioniert auch in verdünnten und in Mischungssystemen. Bei einem verdünnten System ist die Oberfläche des Sensors nur zum Teil mit der zu analysierenden Substanz bedeckt. Zu einer teilweisen Bedeckung der Sensorfläche mit der zu analysierenden Substanz kann es durch zu kurze Einwirkung einer Lösung mit dieser Substanz auf die Oberfläche oder durch einen niedrigen Haftkoeffizienten zwischen der Oberfläche und dieser Substanz kommen. In einem Mischungssystem liegt die zu identifizierende Substanz gemeinsam mit anderen Molekülen auf der Sensoroberfläche vor, die gleichzeitig aus einer Lösung mit mehreren Molekülarten abgeschieden werden. In diesem Fall gibt der Anteil der mit der zu identifizierenden Substanz beschichteten Sensorfläche den relativen Haftkoeffizienten der verschiedenen Moleküle zu der Oberfläche und deren Konzentrationen wieder. In beiden Fällen kann die Adhäsionsarbeit deutlich verringert sein, da die Dichte der zu identifizierenden Substanz auf der Oberfläche abnimmt.
Gegen diese Effekte kann man durch aktives Einfangen der zu identifizierenden Substanz aus der Lösung mittels immobilisierter Fängermoleküle an der Oberfläche vorgehen. Bei diesem Vorgehen wird zuerst die Sensorfläche mit einem Molekül belegt, der die zu identifizierende Substanz spezifisch bindet und immobilisiert und so an der Sensorfläche konzentriert. Der Vorteil dieses in der Immunochemie üblichen Vorgehens besteht zum Beispiel in der Verwendung der möglichen hohen Affinitätskonstante und der hohen Selektivität zwischen den Fängermolekülen und der zu identifizierenden Substanz. In diesem Fall bleibt die gemessene Adhäsionsarbeit auch bei verdünnten oder Mischungslösungen hoch.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Im Folgenden wir die Erfindung unter Bezug auf die folgenden schematischen Zeichnungen ausführlich beschrieben. Man beachte, dass die Figuren nicht maßstabsgerecht sind.
1 veranschaulicht eine schematische Seitenansicht einer Vorrichtung zum Identifizieren einer Substanz,
2 veranschaulicht ein Diagramm zum Bestimmen der Adhäsionsarbeit,
3a,b,c veranschaulicht eine als Biosensor verwendete Vorrichtung zum Identifizieren von Biomolekülen,
4 veranschaulicht eine Anordnung zum Identifizieren der spezifischen biologischen Wechselwirkung auf einer Titerplatte; und
5 veranschaulicht eine schematische Seitenansicht eine Biosensors als Mechanismus zur Lichtübertragung.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSARTEN
Das Grundkonzept der vorliegenden Erfindung wird in Verbindung mit den 1 bis 5 beschrieben.
1 zeigt eine Vorrichtung zum Identifizieren einer vorzugsweise Biomoleküle umfassenden Substanz. Die zu analysierende Substanz 1 wird auf eine Probenfläche 2 aufgetragen, welche die Oberfläche eines Glassubstrats 3 sein kann. Zum Messen der senkrecht auf die Probenfläche 2 wirkenden Kräfte ist das Substrat 3 vorzugsweise auf einer Skala 4 angebracht, die eine Anzeige 5 umfasst, auf der die Stärke der tatsächlich auf die Probenfläche 2 sowie auf die Skala 4 ausgeübten Kraft angezeigt wird.
Auf einem Rahmen 4', der sich in direktem Kontakt mit einem Grundgestell befindet, auf dem die Skala 4 angebracht ist, wird ein Halterungsmittel 6 bereitgestellt, das senkrecht verschiebbar mit einem Trennmittel 7 verbunden ist, welches zum Beispiel als Schrittmotor oder einfach als handbediente Schraube oder als piezoelektrisches Element ausgeführt ist.
Der Grundkörper des Halterungsmittels 6 kann wie später erklärt eine Lichtquelle 14 oder ein anderes Mittel zum Messen physikalischer Parameter wie beispielsweise Kraftsensoren oder Lagesensoren bereitstellen. Das Halterungsmittel 6 selbst oder ein weiterer von diesem getrennter Körper 8 wird bereitgestellt, der durch Gießen als elastomerer Stempel mit einer Kontaktfläche 9 hergestellt wird, auf den eine Prüfsubstanz p aufgebracht wird.
Durch Betätigung des Trennmittels 7 wird der Stempel 8 so lange in Richtung Probenfläche 2 verschoben, bis es zwischen beiden Flächen zum gut definierten Berührungskontakt kommt. Der Stempel 8 wird anschließend wie oben beschrieben zusammen mit der Sonde p auf ähnliche Weise von der Probenfläche 2 weggezogen. Die während der Belastungs- und der Entlastungsphase durch die Skala 4 gemessene Kraft wird als Funktion von der Verschiebungsstrecke des Schrittmotorantriebs 7 ermittelt. Mit dem Messmittel 4 ist ein Vergleichsmittel 13 verbunden, um die gemessenen physikalischen Parameter zum Identifizieren der unbekannten Substanz mit Referenzwerten zu vergleichen.
In dem Diagramm von 2 ist die einwirkende Kraft auf der Ordinate als Funktion von der Verschiebungsstrecke des Schrittmotorantriebs auf der Abszisse dargestellt, wobei sich die Adhäsionsarbeit aus der Differenz zwischen den Integralen der während der Belastungs- und der Entlastungsphase wirkenden Kraft über die Verschiebungsstrecke ergibt. In 2 stellt die schraffierte Fläche das Integral der Belastungsphase und die punktierte Fläche W des Diagramms die Adhäsionsarbeit zwischen der Substanz und der Prüfsubstanz dar.
Im Idealfall sind diese Messwerte bei aus Polydimethylsiloxanen hergestellten elastischen Stempeln von der Stärke der Belastung und der Geschwindigkeit der Belastungs- und Entlastungszyklen unabhängig. Bei Stempeln aus realen Kunststoffen müssen für die Belastungs- und Entlastungszyklen identische Geschwindigkeiten eingehalten werden. Die Kontaktfläche des Stempels 8 kann von weniger als einem Quadratmikrometer bis zu mehreren Quadratmillimetern betragen. Eine große Kontaktfläche des Stempels, die sich in Berührungskontakt mit der Stempelfläche befindet, bildet Durchschnittswerte über viele Moleküle und stellt somit die bei vielen Biosensoranwendungen erforderlichen statistischen Informationen bereit. Die Oberfläche des Stempels ist wesentlich größer als die Spitze des Rasterkraftmikroskops bei dem gut bekannten AFM-Verfahren, sodass die mittels der oben erwähnten erfindungsgemäßen Erfindung gewonnenen Ergebnisse von statistischem Wert sind.
Ein sehr wichtiger Aspekt der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass man die Kontaktfläche mit definierten biologischen Molekülen bedecken kann, die empfindliche Bindungseigenschaften aufweisen. So ist es möglich, dass die Kontaktfläche des Stempels zum Beispiel mit einem Liganden bedeckt ist, der speziell aktive und unversehrte Moleküle einfängt und ausrichtet und so denaturierte oder anderweitig inaktive Moleküle aussondert. Dies ist in 3 zu sehen, in der eine als Biosensor verwendete erfindungsgemäße Vorrichtung gezeigt ist. Der Stempel 8 ist mit einer speziellen Schicht von Biomolekülen beschichtet, die die Sonde p darstellen, welche mit entsprechenden auf der Probenfläche 2 in 3 bereitgestellten Substanzen 1 sehr selektiv wechselwirkt. Der Stempel 8 wird anschließend auf die Probenfläche 2 abgesenkt, sodass die speziellen Biomoleküle der Sonde p mit der auf die Probenfläche 2 aufgebrachten Substanz 1 chemisch Wechselwirken.
Die Erkennung funktioniert auch bei verdünnten und Mischungssystemen, obwohl die Adhäsionsarbeit mit abnehmender Dichte der zu identifizierenden Substanz auf der Oberfläche deutlich verringert sein kann.
Bei dem in 3b gezeigten verdünnten und/oder Mischungssystem ist die Oberfläche 9 des Sensors, während sie sich in Kontakt mit der Probenfläche 2 befindet, nur teilweise mit der zu analysierenden Substanz 1 bedeckt. Zur teilweisen Bedeckung der Sensorfläche 9 mit der zu analysierenden Substanz 1 kann es kommen, wenn die die Substanz 1 enthaltende Lösung zu kurz auf die Probenfläche einwirkt oder wenn der Haftkoeffizient zwischen der Fläche 2 und dieser Substanz 1 klein ist. Bei einem Mischungssystem liegt die zu identifizierende Substanz 1 gleichzeitig mit anderen Molekülen 15 auf der Fläche 9 des Sensor vor, die parallel aus einer mehrere Molekülarten enthaltenden Lösung abgeschieden wurden. In diesem Fall gibt der Anteil der durch die Substanz 1 beschichteten Kontaktfläche 9 des Sensors den relativen Haftkoeffizienten und die Konzentration der verschiedenen Moleküle an der Fläche wieder. In beiden Fällen kann die Adhäsionsarbeit mit abnehmender Dichte der zu identifizierenden Substanz auf der Fläche deutlich verringert sein.
Eine Strategie zur Verhinderung dieser Effekte besteht im aktiven Einfangen der zu identifizierenden Substanz 1 aus der Lösung an der Oberfläche durch immobilisierte Fängermoleküle, wie in der linken und rechten Zeichnung von 3c gezeigt ist. Bei dieser Strategie wird die Fläche 9 des Sensors zuerst mit einem Molekül wie der Prüfsubstanz p beschichtet, die die zu identifizierende Substanz 1 bindet und immobilisiert und so an der Sensorfläche konzentriert. Die Vorteile dieser in der Immunochemie üblichen Verfahrensweise besteht zum Beispiel in der Verwendung der möglicherweise hohen Affinitätskonstanten und der hohen Selektivität zwischen dem Fängermolekül und der zu identifizierenden Substanz. In diesem Fall bleibt die gemessene Adhäsionsarbeit auch bei verdünnten oder Mischungslösungen hoch.
In ähnlicher Weise können viele der in 4 gezeigten Probenflächen 2 auf einer Mikrotiterplatte 10 angeordnet werden, sodass eine automatische Vorrichtung die Substanzen 1 testen kann, die an jeder auf einer Mikrotiterplatte 10 angeordneten Probenfläche bereitgestellt werden. Folglich kann ein automatisch verschobener Stempel 8 in der durch die Pfeile angezeigten Weise nacheinander mit verschiedenen Probenflächen 2 Wechselwirken.
Sämtliche Ausführungsarten der in den 1, 3 und 4 gezeigten erfindungsgemäßen Vorrichtung beruhen auf einer Waage als Kraftübertragungsvorrichtung. Die beschriebenen Anordnungen sind einfacher als andere typische Ansätze für Sensoren wie Gitterkopplungsvorrichtungen oder Quarzwaagen. Eine noch einfachere Mehrkanalerkennung lässt sich durch Verwendung eines Halterungsmittels erreichen, das eine Vielzahl einzelner Stempel vorzugsweise mit Durchmessern zwischen einem Bruchteil eines Mikrometers und mehreren Millimetern sowie Breite-Höhe-Verhältnissen von ungefähr zehn bereitstellt, d. h., dass die Stempel zehnmal so lang wie ihr Durchmesser sind.
Eine solche Anordnung ist in 5 gezeigt, bei der ein Halterungsmittel 6 eine Vielzahl einzelner Stempel 8 bereitstellt, die mit den anderen jeweils über ein Verbindungsstück 11 verbunden sind. Im Idealfall sind der Einzelstempel 8 und das Verbindungsstück 11 aus lichtdurchlässigem PDMS hergestellt.
Im Rahmen einer Fertigungstoleranz von ungefähr 1% weisen alle Stempel 8 dieselbe Länge auf und sind mit Molekülen bedeckt, die Unterschiede erkennen können. Diese Stempel 8 werden in Berührungskontakt mit der Probenfläche 2 gebracht und nach wenigen Sekunden wird die Gesamtheit der elastomeren Stempel 8 langsam von der Probenfläche 8 entfernt. Die Stempel 8 ohne spezifische Wechselwirkung verlassen die Probenfläche sofort, während die Stempel 8 mit spezifischer Wechselwirkung in Kontakt mit der Oberfläche bleiben und so lange gedehnt werden, bis die elastische Kraft die Wechselwirkungskraft übersteigt.
Zur Identifizierung der unbekannten Substanzen kann die Adhäsionsarbeit wie in dem oben beschriebenen Beispiel durch genaue Messung der Trennzeit ermittelt werden. Da die lichtdurchlässigen Stempel für das von einer Lichtquelle 14 ermittierte Licht als Wellenleiter dienen, kann die Trennung mittels eines Erkennungsmittels 12 wie beispielsweise eines menschlichen Auges oder einer unter der ebenfalls aus einem lichtdurchlässigen Material hergestellten Probenfläche positionierten CCD-Kamera leicht nachgewiesen werden.
LISTE DER BEZUGSNUMMERN

1: Substanz
2: Probenfläche
3: Substrat
4: Skala
4': Rahmen
5: Anzeige
6: Halterungsmittel
7: Trennmittel
8: Körper, Stempel
9: Kontaktfläche
10: Mikrotiterplatte
11: Verbindungsstück
12: Erkennungsstück
13: Vergleichsmittel
14: Lichtquelle
15: Fängermoleküle

p Sonde

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer vorzugsweise biochemische Moleküle umfassenden Substanz (1) durch Berühren der Substanz (1) mit einer Sonde (p) und Trennen der beiden voneinander, wobei der Wert mindestens eines die Wechselwirkung zwischen der Sonde (p) und der Substanz kennzeichnenden physikalischen Parameters gemessen wird und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Aufbringen der Substanz (1) auf eine Probenfläche (2) und der Sonde (p) auf eine Kontaktfläche (9) eines Elastomerstempels, – Aufzeichnen des physikalischen Parameters, während die Flächen (2, 9) in Berührungskontakt miteinander gebracht und voneinander entfernt werden, – Vergleichen des gemessenen Wertes mit einem Referenzwert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der(die) gemessene(n) Parameter einen oder mehrere der folgenden Parameter umfassen, – die während des Kontaktierens und des Trennens auf die Substanz (1) und die Sonde (p) ausgeübten Kräfte, und/oder – das Ausmaß der zum Kontaktieren und Trennen erforderlichen Verschiebung der Substanz (1) und der Sonde (p) und/oder – die Zeitdauer zwischen dem beginnenden Entfernen und der vollständigen Trennung der Substanz (1) und der Sonde (p).
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Identifizierung der Substanz (1) durch Messen der Adhäsionsarbeit zwischen der Substanz und der Sonde (p) erfolgt, nachdem die Substanz auf eine Probenoberfläche (2) und die Sonde (p) auf die Kontaktfläche (9) mit elastischen Eigenschaften aufgebracht wurde, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – in einem ersten Schritt Herstellen eines Berührungskontakts zwischen der Kontaktfläche (9) und der Probenfläche (2) durch Ausüben einer ersten Kraft auf mindestens eine Fläche, – in einem zweiten Schritt Entfernen der beiden Flächen (2, 9) voneinander durch Ausüben einer zweiten Kraft, bis die vollständige Trennung zwischen beiden Flächen eingetreten ist, – wobei ein Ausmaß der Verschiebung der verschobenen Fläche so gemessen wird, dass in dem ersten Schritt ein erstes Ausmaß der Verschiebung, beginnend vom ersten Kontakt zwischen den beiden Flächen (2, 9) bis zu einem Zustand des Berührungskontakts, und dass in dem zweiten Schritt ein zweiter Betrag der Verschiebung, beginnend vom Zustand des Berührungskontakts bis zur vollständigen Trennung der beiden Flächen (2, 9), gemessen wird, und – Bilden der Integrale der ersten und der zweiten Kraft jeweils als eine Funktion der ersten und der zweiten Verschiebung und Subtrahieren der Ergebnisse der beiden Integrale, um die Adhäsionsarbeit zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Identifizierung der Substanz (1) durch Messen einer Zeitdauer zwischen der beginnenden Trennung und der vollständigen Trennung der Substanz (1) und der Sonde (p) erfolgt, nachdem die Substanz (1) auf die Probenoberfläche (2) und die Sonde (p) auf die Kontaktfläche (9) mit elastischen Eigenschaften aufgebracht wurde, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Herstellen eines Berührungskontakts zwischen der Kontaktfläche (9) und der Probenoberfläche (2), – Entfernen der beiden Flächen (2, 9) voneinander durch Ausüben einer definierten zunehmenden Kraft auf mindestens eine der Flächen, bis die vollständige Trennung zwischen beiden Flächen (2, 9) eingetreten ist, – Messen der Zeitdauer und Vergleichen der Zeitdauer mit einem Referenzwert der Zeitdauer zur Identifizierung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Identifizierung der Substanz (1) durch Ausüben einer definierten konstanten Kraft zwischen der Oberfläche (1) und der Sonde (p) zum Trennen erfolgt, nachdem die Substanz (1) auf die Probenfläche (2) und die Sonde auf die Kontaktfläche (9) mit elastischen Eigenschaften aufgebracht wurde, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Herstellen eines Berührungskontakts zwischen der Kontaktfläche und der Probenoberfläche, – Entfernen der beiden Flächen voneinander durch Ausüben einer definierten konstanten Kraft auf mindestens eine der Flächen, – Erkennen des Zustands jeder Oberfläche dahingehend, ob sie sich in Bezug auf die ausgeübte Kraft im Kontakt oder nicht im Kontakt befindet, und Vergleichen dieses Ergebnisses mit dem Referenzwert zur Identifizierung.
Vorrichtung zum Identifizieren einer vorzugsweise biochemische Moleküle enthaltenden Substanz (1), die Folgendes umfasst: ein Halterungsmittel (6) in Form eines gegossenen elastomeren Stempels (8) mit mindestens einer Kontaktfläche (9) mit elastischen Eigenschaften, eine gegenüber der Kontaktfläche (9) angeordnete Probenfläche, ein im Kontakt mit dem Halterungsmittel (6) und/oder mit der Probenfläche (2) befindliches Trennmittel (7) zum Verschieben mindestens einer Kontaktfläche (9) zur Probenfläche (2) und von dieser weg, ein Erkennungsmittel (12) zum Erkennen der Situation der Flächen (2, 9), ob, sich diese in Berührungskontakt befinden oder vollständig getrennt sind, ein Messmittel (4) zum Messen eines oder mehrerer physikalischer Parameter, wenn die Flächen in Berührungskontakt gebracht und/oder entfernt werden, und ein Vergleichsmittel (13) zum Vergleichen des/der physikalischen Parameter mit Referenzwerten zur Identifizierung.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der die Kontaktfläche (9) einen Bruchteil eines μm² bis zu einigen mm² beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der der Stempel (8) aus lichtdurchlässigem Material besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei dem der Stempel (8) aus Siloxanen, speziell aus Polydimethylsiloxanen (PDMS), besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der die aus bekannten Biomolekülen mit selektiven Bindungseigenschaften bestehende Sonde auf die Kontaktfläche (9) aufgebracht wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8, bei der eine Lichtquelle (14) Licht so in den Stempel (8) einkoppelt, dass der Stempel (8) als Wellenleiter fungiert, so dass ein Teil des Lichtes durch die Kontaktfläche (9) des Stempels (8) tritt und ein anderer Teil des Lichtes an der Kontaktfläche (9) reflektiert wird und das Erkennungsmittel (12) so angeordnet ist, dass es das durchgelassene Licht misst.
Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der eine Vielzahl von Stempeln (8) als Muster angeordnet sind und das Lichterkennungsmittel (12) eine CCD-Kamera ist, durch die das durchgelassene Licht an jeder einzelnen Kontaktfläche (9) getrennt erkannt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der jeder Stempel (8) einen Durchmesser von 0,1 μm bis 1 mm und ein Durchmesser-Höhe-Verhältnis von etwa 2 bis 10 besitzt, d. h., dass jeder Stempel (8) zweimal bis zehnmal so lang wie sein Durchmesser ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der das Trennmittel (7) ein Schrittmotor ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der das Trennmittel (7) mit der Kontaktfläche (9) und/oder der Probenoberfläche (2) verbunden ist und eine Kraft zwischen den beiden Flächen (2, 9) zum Verschieben mindestens einer der Flächen zur anderen Fläche oder von ihr weg bereitstellt.
Vorrichtung zur Identifizierung von Substanzen nach Anspruch 6, die als Biosensor verwendet wird.
Biosensor zum Identifizieren einer vorzugsweise biochemische Moleküle umfassenden Substanz, der mindestens ein als Stempel (8) geformtes und aus elastomerem Material bestehendes Halterungsmittel (6) besitzt und eine Kontaktfläche (9) bereitstellt, auf die eine bekannte chemische Verbindung, vorzugsweise ein definiertes Biomolekül, mit einer selektiven Bindungseigenschaft aufgebracht wird.
Biosensor nach Anspruch 17, bei dem eine Vielzahl einzelner Halterungsmittel (6) bereitgestellt werden, die eine mit verschiedenen Biomolekülen mit unterschiedlichen selektiven Bindungseigenschaften beschichtete Kontaktfläche (9) besitzen.
Biosensor nach Anspruch 18, bei dem die Stempel (8) durch ein Verbindungsstück (11) so miteinander verbunden sind, dass der Kontakt zwischen den Kontaktflächen (9) jedes Stempels (8) und einer Probenoberfläche (2) gleichzeitig erfolgt.