DE69820419T2

DE69820419T2 - Klonierung und verwendung des lsr-rezeptors

Info

Publication number: DE69820419T2
Application number: DE69820419T
Authority: DE
Inventors: Bernard Bihain; Lydie Bougueleret; Frances Yen-Potin
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genset SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1997-08-06
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: EP1003783B1; CA2298849A1; EP1903057A3; EP1003783A2; US20020151498A1; US20020165154A1; DE69838720D1; EP1375516A3; ATE443721T1; CA2274302A1; DE69820419D1; JP2005143508A; EP1903057B1; AU745607C; JP3726969B2; EP1903057A2; WO1999007737A2; US20040077051A1; US7919091B2; AU745607B2

Description

EINLEITUNG
Die Erfindung betrifft einen neuen Polypeptid-LSR-Rezeptor-Komplex (Lipolysis Stimulated Receptor), gekennzeichnet durch seine funktionalen Aktivitäten, die Klonierung der komplementären cDNA der Messenger-RNA, die für jede der Untereinheiten des multimeren Komplexes codieren, Vektoren und transformierte Zellen, Methoden für die Diagnostik und Selektion von Verbindungen, die als Arzneimittel zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten und/oder Pathogenesen wie zum Beispiel Fettleibigkeit und Anorexie, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Diabetes, Hypertension und ganz allgemein der verschiedenen Krankheiten in Verbindung mit Störungen des Stoffwechsels der Zytokine verwendbar sind.
Die Fettleibigkeit ist ein sowohl ernstes wie auch verbreitetes Problem der Volksgesundheit: in den Industrieländern weist ein Drittel der Bevölkerung ein Übergewicht von mindestens 20%, bezogen auf das Idealgewicht, auf. Das Phänomen verstärkt sich sogar in den Regionen des Globus mit sich modernisierender Wirtschaft wie den Pazifikinseln und ganz allgemein. In den Vereinigten Staaten ist der Anteil an fettleibigen Personen von 25% Ende der 70er Jahre auf 33% zu Beginn der 90er Jahre gestiegen.
Die Fettleibigkeit erhöht das Risiko der Entstehung von kardiovaskulären oder Stoffwechselkrankheiten beträchtlich. Man schätzt, dass wenn die gesamte Bevölkerung ein Idealgewicht hätte, das Risiko der Koronarinsuffizienz um 25% und das der Herzinsuffizienz und der Apoplexien um 35% geringer wäre. Die Koronarinsuffizienz, die atheromatöse Erkrankung und die Herzinsuffizienz stehen an erster Stelle der durch Fettleibigkeit entstandenen kardiovaskulären Komplikationen. Bei einem Übergewicht von mehr als 30% ist die Entstehung von Koronarerkrankungen bei Personen unter 50 Jahren doppelt so hoch. Die bei anderen Krankheiten durchgeführten Studien sprechen ebenfalls für sich. Bei einem Übergewicht von 20% ist das Risiko der arteriellen Hypertension doppelt so hoch. Bei einem Übergewicht von 30% ist das Risiko der Entstehung eines nicht insulinabhängigen Diabetes dreimal so hoch. Das der Hyperlipidämien ist versechsfacht.
Die Liste der Krankheiten, deren Entstehung durch Fettleibigkeit begünstigt wird, ist lang: Hyperurikämie (11,4% bei fettleibigen Personen im Vergleich zu 3,4% bei der Gesamtbevölkerung), Erkrankungen des Verdauungsapparates, Störungen der Leberfunktionen und sogar bestimmte Krebsarten.
Gleich ob die physiologischen Veränderungen der Fettleibigkeit durch eine Erhöhung der Anzahl der Fettzellen oder durch eine Erhöhung der Menge der in jeder Fettzelle gespeicherten Triglyzeride oder durch beide Faktoren gekennzeichnet sind, dieses Übergewicht ist hauptsächlich auf ein Ungleichgewicht zwischen den aufgenommenen Kalorienmengen und den vom Organismus verbrauchten Kalorienmengen zurückzuführen. Die Forschungsarbeiten über die Ursachen dieses Ungleichgewichts gehen in mehrere Richtungen. Einige befassten sich mit der Untersuchung des Mechanismus der Aufnahme der Nahrungsmittel und somit der Moleküle, die die Nahrungsaufnahme und das Sättigungsgefühl steuern. Andere Studien bezogen sich auf den Grundstoffwechsel; das heißt auf die Art, in der der Organismus die aufgenommenen Kalorien verwendet.
Es gibt vier Arten von Behandlungen, die vorgeschlagen werden. Die Beschränkung der Nahrungsaufnahme ist die am häufigsten angewandte. Den Fettleibigen wird empfohlen, ihre Ernährungsgewohnheiten zu ändern, so dass sie weniger Kalorien aufnehmen. Diese Art der Behandlung ist kurzfristig wirksam. Die Zahl der Rückfälle ist jedoch hoch. Ebenfalls vorgeschlagen wird die Erhöhung des Kalorienverbrauchs durch Bewegung. Diese allein angewandte Behandlung ist unwirksam, sie verbessert jedoch den Gewichtsverlust bei Personen, die eine kalorienreduzierte Diät machen. Die gastrointestinale Chirurgie, die die Absorption von aufgenommenen Kalorien verringert, ist wirksam, wurde jedoch wegen der dabei auftretenden Nebenwirkungen praktisch aufgegeben. Die medikamentöse Behandlungsweise setzt entweder die anorexigene Wirkung von Molekülen, die im Bereich des zentralen Nervensystem eine Rolle spielen, oder die Wirkung von Molekülen, die den Energieverbrauch erhöhen, indem sie die Wärmeproduktion steigern, ein. Der Prototyp dieses Molekültyps sind die Schilddrüsenhormone, die die oxidativen Phosphorylierungen der mitochondrialen Atmungskette entkoppeln. Die Nebenwirkungen und die Toxizität dieser Art von Behandlung machen ihre Anwendung gefährlich. Eine Vorgehensweise, die auf eine Verringerung der Aufnahme von Nahrungsmittelfetten abzielt, indem diese im Innern des Verdauungstraktes unschädlich gemacht werden, wird ebenfalls angewandt. Sie führt jedoch zu schwer tolerierbaren physiologischen Ungleichgewichten: Defizit der Aufnahme von fettlöslichen Vitaminen, Flatulenz und Steatorrhoe. Gleich welche therapeutische Vorgehensweise in Betracht gezogen wird, die Behandlungen der Fettleibigkeit sind alle durch eine äußerst hohe Anzahl von Rückfällen gekennzeichnet. Die beim Menschen für die Fettleibigkeit verantwortlichen molekularen Mechanismen sind komplex und beziehen genetische und Umweltfaktoren mit ein. Auf Grund der geringen Wirksamkeit der bis heute bekannten Behandlungen müssen die genetischen Mechanismen, die die Fettleibigkeit bestimmen, dringend definiert werden, so dass gezieltere Arzneimittel entwickelt werden können.
Mehr als 20 Gene wurden als mögliche Kandidaten untersucht, entweder waren sie an Krankheiten beteiligt, bei denen die Fettleibigkeit eine der klinischen Manifestationen ist, oder sie sind Homologe der an der Fettleibigkeit bei Tieren beteiligten Gene. Das Gen OB, das sich in dem Chromosomenbereich 7q31 befindet, ist eines der am besten erforschten Gene. Sein Produkt, das Leptin, ist an den Sättigungsmechanismen beteiligt. Das Leptin ist ein Plasmaprotein von 16 kDa, das von den Adipozyten unter der Wirkung unterschiedlicher Reize produziert wird. Fettleibige Mäuse vom Typ ob/ob weisen ein Defizit des Gens des Leptins auf; dieses Protein ist im Plasma dieser Tiere nicht nachzuweisen. Die Verabreichung von mit Hilfe der Gentechnik hergestelltem Leptin an Mäuse ob/ob korrigiert ihre relative Hyperphagie und erlaubt eine Normalisierung ihres Gewichts. Bei dieser anorexigenen Wirkung des Leptins spielt ein Rezeptor des zentralen Nervensystems eine Rolle: der Rezeptor ob, der zur Familie der Rezeptoren für Zytokine der Klasse 1 gehört. Der Rezeptor ob kommt bei fettleibigen Mäusen der Rasse db/db in zu geringer Menge vor. Die Verabreichung von Leptin an diese Mäuse hat keine Auswirkung auf ihre Nahrungsaufnahme und erlaubt keine bedeutende Reduzierung ihres Gewichts. Die Mechanismen, mit Hilfe derer die Rezeptoren ob das Signal der Sättigung übertragen, sind nicht genau bekannt. Es ist wahrscheinlich, dass das Neuropeptid Y bei dieser Signalisierung eine Rolle spielt. An dieser Stelle muss darauf hingewiesen werden, dass die Rezeptoren ob nicht die einzigen Appetitregler sind. Der Rezeptor Melanocortin 4 ist ebenfalls beteiligt, denn die Mäuse, bei denen ein Mangel an diesem Rezeptor erzeugt wurde, sind fettleibig (Gura, 1997).
Die Entdeckung des Leptins und die Charakterisierung des Leptin-Rezeptors im Bereich des zentralen Nervensystems haben einen neuen Weg zur Erforschung von Arzneimitteln gegen Fettleibigkeit eröffnet. Dieser Weg hat sich jedoch schnell als enttäuschend erwiesen. Bis auf eine Ausnahme (Montague et al., 1997) zeigte es sich, dass die für Leptin oder für seinen Rezeptor ob kodierenden Gene bei den fettleibigen Personen normal waren. Ferner sind paradoxerweise die Plasmakonzentrationen an Leptin, dem Sättigungshormon, bei den meisten fettleibigen Personen anormal erhöht. Der größte Teil der Bemühungen in der therapeutischen Forschung in dieser Richtung bezog sich auf die Charakterisierung der Wirkung des Leptins im Bereich des zentralen Nervensystems.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung beruht auf der Konzentrierung der Forschungsarbeiten auf die Entdeckung der Mechanismen der Eliminierung von Leptin. Die am meisten anerkannte Hypothese der Arbeit ist, dass die Leptin-Konzentrationen im Plasma bei fettleibigen Personen erhöht sind, da dieses Hormon von dem Fettgewebe produziert wird und die Fettmasse bei fettleibigen Personen erhöht ist. Die Erfinder haben eine andere Hypothese aufgestellt und postuliert, dass die Leptin-Konzentrationen bei den Fettleibigen erhöht sind, da die Ausscheidung dieses Hormons verringert ist. Dieses Defizit führt zu einem Syndrom der Resistenz gegenüber Leptin und die fettleibige Person entwickelt eine entsprechende Reaktion auf die hohen Leptin-Konzentrationen. Aus dieser Sicht müsste die Behandlung fettleibiger Personen nicht in einer Erhöhung der Leptin-Konzentrationen, sondern in einer Normalisierung derselben bestehen. An dieser Stelle ist darauf hinzuweisen, dass die Rezeptoren vom Typ ob Signalisierungsrezeptoren sind. Diese Rezeptoren können das Leptin im Bereich der Plasmamembran binden, sie können das Protein jedoch nicht ins Innere der Zelle bringen, damit es dort abgebaut wird. Die Rezeptoren ob sind keine Endozytose-Rezeptoren.
LSR Rezeptor
Die Erfinder haben einen Rezeptor, insbesondere der Leber, mit der Bezeichnung LSR Rezeptor charakterisiert, der eine zweifache Aktivität hat. Der LSR Rezeptor erlaubt zum einen die Endozytose von Lipoproteinen, wenn er durch freie Fettsäuren aktiviert wird, und dient somit als Clearanceweg für Lipoproteine. Dieser Weg dient hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, zur Clearance von Partikeln intestinalen Ursprungs mit hohem Anteil an Triglyzeriden (Mann et al., 1995). Diese Aktivität, die besonders im Bereich der Leber zum Ausdruck kommt, hängt von dem Vorhandensein freier Fettsäuren ab, die durch Bindung an den Rezeptor zu einer reversiblen Änderung der Konfiguration dieses Komplexes führen und ihm erlauben, mit einer hohen Affinität unterschiedliche Klassen von Lipoproteinen, wie die Aproprotein B oder Aproprotein E enthaltenden Lipoproteine, zu binden.
Zum anderen bindet der LSR Rezeptor-Komplex unter normalen Bedingungen in Abwesenheit von freien Fettsäuren keine Lipoproteine, sondern ist in der Lage, ein Zytokin zu binden, insbesondere Leptin, und es dann zu internalisieren und abzubauen.
Man muss wissen, dass die Erfindung nicht die LSR Rezeptoren in natürlicher Form betrifft, das heißt, dass sie nicht ihrer natürlichen Umgebung entnommen werden, sondern dass sie durch Reinigung aus natürlichen Quellen oder auch durch genetische Rekombination oder aber durch chemische Synthese erhalten werden und so nicht-natürliche Aminosäuren enthalten können, wie nachfolgend beschrieben wird. Die Produktion eines rekombinanten LSR Rezeptors, die durchgeführt werden kann, indem man eine der Nukleotidsequenzen nach der Erfindung verwendet, ist besonders günstig, denn sie erlaubt, einen höheren Reinheitsgrad des Rezeptors zu erhalten.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen gereinigten LSR Rezeptor der Ratte, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von circa 66 kDa und eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von circa 58 kDa enthält.
Der gereinigte LSR Rezeptor der Ratte dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine die Aminosäurensequenz SEQ ID 2 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheit α oder eine die Aminosäurensequenz SEQ ID 4 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheit α' und eine, vorzugsweise drei, die Aminosäurensequenz SEQ ID 6 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheiten β enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen gereinigten LSR Rezeptor der Maus, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von circa 66 kDa und eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von circa 58 kDa enthält.
Der gereinigte LSR Rezeptor der Maus dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine die Aminosäurensequenz SEQ ID 16 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheit α oder eine die Aminosäurensequenz SEQ ID 17 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheit α' und eine, vorzugsweise drei, die Aminosäurensequenz SEQ ID 18 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheiten β enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen gereinigten LSR Rezeptor des Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von circa 72 kDa und eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von circa 64 kDa enthält.
Der gereinigte LSR Rezeptor des Menschen dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine die Aminosäurensequenz SEQ ID 8 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheit α oder eine die Aminosäurensequenz SEQ ID 10 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheit α' und eine, vorzugsweise drei, die Aminosäurensequenz SEQ ID 12 oder eine homologe Sequenz derselben umfassende Untereinheiten β enthält.
Ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel der LSR Rezeptoren dieser Erfindung ist ein rekombinanter LSR Rezeptor, der durch Expression in einem rekombinanten Wirt einer oder mehrerer der Nukleotidsequenzen nach der Erfindung erhalten wird. Dieser bevorzugte rekombinante Rezeptor besteht aus einer Untereinheit α oder α' und einer, vorzugsweise drei, Untereinheiten β, insbesondere einer Untereinheit α oder α' und drei Untereinheiten β eines menschlichen LSR Rezeptors.
LSR Polypetidsequenzen
Die Erfindung betrifft Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bestandteil eines LSR Rezeptors nach der Erfindung sind.
Man muss wissen, dass die Erfindung nicht die Polypeptide in natürlicher Form betrifft, das heißt, dass sie nicht ihrer Umgebung entnommen werden. Die Erfindung betrifft nämlich Peptide, die durch Reinigung aus natürlichen Quellen oder durch genetische Rekombination oder auch mit Hilfe der chemischen Synthese erhalten werden und so nicht-natürliche Aminosäuren enthalten können, wie nachfolgend beschrieben wird. Die Produktion eines rekombinanten Polypeptids, die durchgeführt werden kann, indem man eine der Nukleotidsequenzen nach der Erfindung oder ein Fragment einer dieser Sequenzen verwendet, ist besonders vorteilhaft, denn sie erlaubt, einen höheren Reinheitsgrad des gewünschten Polypeptids zu erhalten.
Die Erfindung betrifft also ein gereinigtes, isoliertes oder rekombinantes Polypeptid, das eine Sequenz von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10 bis 15, aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines LSR Rezeptors sowie die Homologen, Äquivalente oder Varianten des genannten Polypeptids oder eins seiner Fragmente enthält. Vorzugsweise ist die Sequenz von mindestens 10 bis 15 Aminosäuren des LSR Rezeptors ein biologisch aktives Fragment eines LSR Rezeptors.
Die Erfindung betrifft insbesondere gereinigte, isolierte oder rekombinante Polypeptide, die eine Sequenz von mindestens 10 bis 15 Aminosäuren eines LSR Rezeptors der Ratte, eines LSR Rezeptors der Maus oder eines menschlichen LSR Rezeptors enthalten.
In dieser Beschreibung wird der Ausdruck Polypeptid ebenfalls für ein Protein oder ein Peptid verwendet.
LSR Nukleotidsequenzen
Gegenstand dieser Erfindung sind ebenfalls gereinigte Sequenzen der Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen LSR Rezeptor oder ein Polypeptid nach der Erfindung codieren.
Die Erfindung betrifft eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 8, vorzugsweise mindestens 10 und insbesondere mindestens 15, aufeinanderfolgende Nukleotide des Polynukleotids einer Genomsequenz, einer cDNA oder einer RNA, eines LSR Rezeptors sowie die komplementären Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure enthält.
Insbesondere betrifft die Erfindung gereinigte, isolierte oder rekombinante Nukleinsäuren, die eine Sequenz von mindestens 8, vorzugsweise 10 und insbesondere mindestens 15, aufeinanderfolgende Nukleotide einer Nukleinsäuresequenz eines LSR Rezeptors der Maus oder eines menschlichen LSR Rezeptors enthalten.
Die Erfindung betrifft ebenfalls veränderte, mutierte, äquivalente oder homologe Sequenzen der Nukleinsäuresequenzen nach der Erfindung oder eins ihrer Fragmente. Sie betrifft schließlich die Sequenzen, die in der Lage sind, sich spezifisch mit den Nukleinsäuresequenzen nach der Erfindung zu hybridisieren.
Die Erfindung betrifft also ebenfalls die Nukleinsäuresequenzen, die in dem Gen enthalten sind, das für den LSR Rezeptor codiert, insbesondere jeden der Exons des genannten Gens oder eine Kombination der Exons des genannten Gens oder auch ein Polynukleotid, das sich auf einem Abschnitt eines oder mehrerer Exons erstreckt. Bevorzugterweise codieren diese Nukleinsäuren für ein oder mehrere biologisch aktive Fragmente des menschlichen LSR Rezeptors.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die gereinigten Sequenzen von Nukleinsäuren, die für ein oder mehrere Regulierungselemente der Expression des LSR Gens codieren. In dieser Erfindung ebenfalls enthalten sind die Promotor- und/oder Regulator-Nukleinsäuresequenzen des Gens, das für den Rezeptor nach der Erfindung codiert, oder eine ihrer allelen Varianten, die mutierten, äquivalenten oder homologen Sequenzen oder eins ihrer Fragmente.
Die Erfindung betrifft ebenfalls gereinigte Hybridisierungs-Nukleinsäuresequenzen, mindestens 8 Nukleotide enthaltend, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich spezifisch mit einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung hybridisieren können.
Vorzugsweise können Fragmente der Nukleinsäure oder von Oligonukleotiden, die die Nukleotidsequenzen nach der Erfindung als Sequenzen haben, als Sonden oder Starter verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Methoden für die Musterung von cDNA-Banken und Banken der genomischen DNA, für die Klonierung der isolierten cDNA und/oder der Gene, die für den Rezeptor nach der Erfindung codieren, und für ihre Promotoren und/oder Regulatoren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz nach der Erfindung verwenden.
Die Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einer der vorhergehenden Methoden nach der Erfindung erhalten werden können, oder die Sequenzen, die in der Lage sind, sich mit den genannten Sequenzen zu hybridisieren, sind ein Teil der Erfindung.
Vektoren, Wirtszellen und transgene Tiere
Die Erfindung umfasst ebenfalls die Vektoren der Klonierung und/oder der Expression, die eine Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung enthalten.
Die Vektoren nach der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Teile enthalten, die die Expression und/oder die Sekretion der genannten Sequenzen in einer Wirtszelle erlauben, sind ebenfalls ein Teil der Erfindung.
Die Erfindung umfasst ferner die Wirtszellen, insbesondere die Eukaryonten- und Prokaryontenzellen, die von den Vektoren nach der Erfindung transformiert wurden, sowie die Säugetiere, mit Ausnahme des Menschen, die eine der genannten transformierten Zellen nach der Erfindung enthalten.
Unter den Säugetieren nach der Erfindung zieht man Tiere wie Mäuse, Ratten oder Kaninchen vor, die ein Polypeptid nach der Erfindung exprimieren, wobei der Phänotypus dem normalen oder veränderten LSR Rezeptor, insbesondere dem mutierten menschlichen Ursprungs, entspricht.
Diese Zellen und Tiere sind in einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids nach der Erfindung verwendbar und können ebenfalls als Analyse- und Musterungsmodell dienen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Zellen, Säugetieren oder Polypeptiden nach der Erfindung für die Untersuchung der Expression und der Aktivität des Rezeptors nach der Erfindung und direkte oder indirekte Wechselwirkungen zwischen dem genannten Rezeptor und chemischen oder biochemischen Verbindungen, die bei der Aktivität des genannten Rezeptors eine Rolle spielen können.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Zellen, Säugetieren oder Polypeptiden nach der Erfindung für die Musterung von chemischen oder biochemischen Verbindungen, die direkt oder indirekt mit dem Rezeptor nach der Erfindung interagieren können und/oder in der Lage sind, die Expression oder die Aktivität des genannten Rezeptors zu modulieren.
Herstellung von aus dem LSR Rezeptor hervorgegangenen Polypeptiden
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Synthese von synthetischen oder rekombinanten Polypeptiden der Erfindung, insbesondere mit Hilfe der chemischen Synthese oder durch Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung.
Die mit Hilfe der chemischen Synthese erhaltenen Polypeptide, die nicht-natürliche Aminosäuren, die den genannten rekombinanten Polypeptiden entsprechen, enthalten können, sind ebenfalls in der Erfindung enthalten.
Das Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung in rekombinanter Form ist ebenfalls in dieser Erfindung enthalten und ist dadurch gekennzeichnet, dass man die transformierten Zellen unter Bedingungen, die die Expression eines rekombinanten Polypeptids der Polypeptidsequenz nach der Erfindung erlauben, züchtet und dass man das genannte rekombinante Polypeptid erhält.
Die rekombinanten Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass man sie nach dem genannten Verfahren herstellen kann, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Antikörper
Die mono- oder polyklonalen Antikörper oder ihre Fragmente, chimäre Antikörper oder Immunkonjugate, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage sind, ein Polypeptid oder einen Rezeptor nach der Erfindung spezifisch zu erkennen, sind Teil der Erfindung.
Es ist insbesondere auf den Vorteil von Antikörpern hinzuweisen, bestimmte Polypeptide, Varianten oder Fragmente, insbesondere biologisch aktive, nach der Erfindung spezifisch zu erkennen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Methoden zum Nachweis und/oder zur Reinigung eines Polypeptids nach der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Antikörper nach der Erfindung verwenden.
Die Erfindung umfasst ferner gereinigte Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Hilfe einer Methode nach der Erfindung hergestellt werden.
Im Übrigen können die Antikörper der Erfindung, insbesondere die monoklonalen Antikörper, neben ihrer Verwendung zur Reinigung von Polypeptiden ebenfalls zum Nachweis dieser Polypeptide in einer biologischen Probe verwendet werden.
Ganz allgemein können die Antikörper der Erfindung vorteilhafterweise in jeder Situation verwendet werden, wo die normale oder anormale Expression eines normalen oder mutierten LSR Rezeptors-Polypeptids beobachtet werden muss.
Nachweis der allelischen Variabilität und Diagnostik
Teil der Erfindung sind ebenfalls die Verfahren zur Bestimmung einer allelischen Variabilität, einer Mutation, einer Deletion, einem Verlust der Heterozygotie oder einer genetischen Anomalie, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz oder einen Antikörper nach der Erfindung verwenden.
Diese Methoden beziehen sich zum Beispiel auf die Methoden zur Diagnose einer Prädisposition zur Fettleibigkeit, zu den damit verbundenen Risiken oder auf Krankheiten, die mit Störungen des Stoffwechsels der Zytokine verbunden sind, wobei anhand einer biologischen Probe des Patienten das Vorhandensein von Mutationen in mindestens einer der oben beschriebenen Sequenzen nachgewiesen wird. Die analysierten Nukleinsäuresequenzen können sowohl die der genomischen DNA, der cDNA oder der mRNA sein.
Auf dieser Erfindung basierende Nukleinsäuren oder Antikörper können ebenfalls für eine positive und differenzierende Diagnose bei einem isoliert genommenen Kranken oder für eine präsymptomatische Diagnose bei einem Risikopatienten, insbesondere mit einer Vorgeschichte in der Familie, verwendet werden.
Ferner kann der Nachweis einer spezifischen Mutation eine evolutive Diagnose erlauben, insbesondere in Bezug auf die Intensität der Erkrankung oder auf den wahrscheinlichen Zeitpunkt ihres Auftretens.
Musterung von Verbindungen, die von Interesse sind
Ebenfalls in der Erfindung enthalten sind Methoden zur Selektion von chemischen oder biochemischen Verbindungen, die zu einer direkten oder indirekten Wechselwirkung mit dem Rezeptor oder den Polypeptidsequenzen oder den Nukleotiden nach der Erfindung in der Lage sind und/oder erlauben, die Expression oder die Aktivität des LSR Rezeptors zu modulieren.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Selektion von chemischen oder biochemischen Verbindungen, die zu einer Wechselwirkung mit einer Nukleinsäuresequenz, die in einem für einen LSR Rezeptor codierenden Gen enthalten ist, in der Lage sind, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es das In-Kontakt-bringen einer Wirtszelle, die einen LSR Rezeptor oder ein Fragment des genannten Rezeptors exprimiert, mit einer Kandidatenverbindung, die in der Lage ist, die Expression oder die Regulation der Expression der genannten Nukleinsäuresequenz zu modifizieren, und den direkten oder indirekten Nachweis einer Modifizierung der Expression oder der Aktivität des LSR Rezeptors umfasst.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zur Selektion von chemischen oder biochemischen Verbindungen, die zu einer Wechselwirkung mit dem LSR Rezeptor in der Lage sind, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es das In-Kontakt-bringen eines LSR Rezeptor oder eines Fragment des genannten Rezeptors oder einer Wirtszelle, die einen LSR Rezeptor oder ein Fragment des genannten LSR Rezeptors exprimiert, mit einer Kandidatenverbindung, die in der Lage ist, die Aktivität des LSR Rezeptors zu modifizieren, und den direkten oder indirekten Nachweis einer Modifizierung der Aktivität des LSR Rezeptors oder der Bildung eines Komplexes zwischen der Kandidatenverbindung und dem genannten LSR Rezeptor oder dem genannten Polypeptid umfasst.
Die Erfindung umfasst Verbindungen, die zu einer direkten oder indirekten Wechselwirkung mit einem LSR Rezeptor in der Lage sind, sowie Verbindungen, die zu einer Wechselwirkung mit einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen des LSR Rezeptors in der Lage sind. Sie umfasst ebenfalls die chemischen oder biochemischen Verbindungen, die eine Modulation der Expression oder der Aktivität des Rezeptors nach der Erfindung erlauben. Die Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Hilfe einer der Methoden nach dieser Erfindung ausgewählt wurden, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Unter diesen Verbindungen nach der Erfindung bevorzugt man insbesondere die Antikörper nach der Erfindung, die Polypeptide nach der Erfindung, die Nukleinsäuren, Oligonukleotide und Vektoren nach der Erfindung oder ein Leptin oder eines seiner Derivate, vorzugsweise eine seiner Proteinvarianten, oder chemisch modifizierte Leptine oder mit Hilfe der genetischen Rekombination erhaltene oder das Protein gC1qR oder eine seiner analogen Verbindungen oder eines seiner Fragmente.
Die Erfindung umfasst schließlich Verbindungen, die in der Lage sind, die Expression oder die Aktivität des Rezeptors nach der Erfindung zu modulieren, als Arzneimittel zur Prävention von Krankheiten und/oder Pathogenesen wie die Fettleibigkeit oder die Anorexie, die Hyperlipidämie, die Arteriosklerose, den Diabetes, die Hypertension und ganz allgemein diverse Krankheiten, die mit Störungen des Stoffwechsels der Zytokine verbunden sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Der LSR Rezeptor
Die Erfindung betrifft einen gereinigten LSR Rezeptor („Lipolysis Stimulated Receptor"), vorzugsweise der Leber, der aus mindestens einer Untereinheit α oder α' und aus mindestens einer Untereinheit β besteht. Die Untereinheit α hat ein Molekulargewicht von circa 66 kDa bei der Ratte und bei der Maus und von circa 72 kDa beim Menschen. Die Untereinheit α' hat ein Molekulargewicht von circa 64 kDa bei der Ratte und bei der Maus und von circa 70 kDa beim Menschen. Die Untereinheit β hat ein Molekulargewicht von circa 58 kDa bei der Ratte und bei der Maus und von circa 64 kDa beim Menschen.
Die Erfinder haben die Hypothese aufgestellt, der zufolge die ergiebigste Form und wahrscheinlich auch die aktivste Form des LSR Rezeptors die ist, in der man eine Untereinheit α oder α' und drei Untereinheiten β findet. Es scheint jedoch möglich zu sein, dass die Untereinheiten α und α' zum einen und β zum anderen unterschiedliche biologische Funktionen haben und dass diese Funktionen in einer Zelle unabhängig von ihrer Zusammensetzung in Form des Rezeptors ausgeübt werden können.
Die Erfinder haben ebenfalls beobachtet, dass sich ein Komplex zwischen dem LSR Rezeptor und dem Rezeptor gC1qR mit einem Molekulargewicht von circa 33 kDa oder einem homologen Protein bilden kann. Es scheint, als sei der Rezeptor gC1qR temporär mit dem LSR Rezeptor verbunden und als würde die Gegenwart des Proteins C1q oder homologer Proteine nicht nur erlauben, gC1qR vom LSR Rezeptor zu trennen, sondern auch den LSR Rezeptor zu aktivieren, auch bei Nichtvorhandensein von Fettsäuren.
Aktivität des LSR Rezeptors und Anwendungsbereiche
Diese Erfindung bezieht sich also auf einen Rezeptor, insbesondere der Leberzelle, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, in Gegenwart von freien Fettsäuren Lipoproteine zu binden und bei Nichtvorhandensein von freien Fettsäuren ein Zytokin zu binden, vorzugsweise das Leptin, wobei die gebundenen Lipoproteine und das Zytokin inkorporiert und dann durch die Zelle abgebaut werden und der genannte Rezeptor ferner das Protein gC1qR oder eines seiner analogen Proteine binden kann.
Clearance von Lipoproteinen
Der LSR Rezeptor stellt den wichtigsten Weg der Eliminierung von Lipoproteinen intestinaler Herkunft und von Partikeln mit hohem Anteil an Triglyzeriden dar, insbesondere die VLDL und die Chylomikronen. Der LSR Rezeptor kann auch zur Eliminierung von LDL dienen, Partikel mit hohem Cholesteringehalt, die zum größten Teil über den LDL Rezeptor eliminiert werden, von denen jedoch circa 30% im Bereich der Leber über unterschiedliche Wege des LDL Rezeptors eliminiert werden.
Die Erfinder haben nachgewiesen, dass der LSR Rezeptor in der Lage ist, die Lipoproteine zu binden, insbesondere die Lipoproteine mit hohem Triglyzeridgehalt, sie dann zu internalisieren und abzubauen. Diese Aktivität der Clearance von Lipoproteinen durch den Rezeptor erfordert das Vorhandensein von freien Fettsäuren, zum Beispiel Oleat, und ist gehemmt in Gegenwart von Antikörpern, die gegen den LSR und gegen die vom LSR stammenden Peptide gerichtet sind.
Clearance von Zytokinen
Die Erfinder haben ebenfalls nachgewiesen, dass der LSR Rezeptor bei Nichtvorhandensein von freien Fettsäuren, zum Beispiel Oleat, in der Lage ist, Zytokine, vorzugsweise Leptin, zu binden. Die Funktion der Clearance des Leptins ist jedoch nur möglich, wenn der Rezeptor keine von der Lipase der Leber oder von der hormonempfindlichen Lipase des Fettgewebes produzierten Fettsäuren gebunden hat. Sobald die Zytokine gebunden sind, internalisiert sie der LSR Rezeptor und baut sie ab. Die Aktivität des Abbaus der Zytokine, vorzugsweise von Leptin, sind durch gegen den LSR oder gegen aus dem LSR hervorgegangene Peptide gerichtete Antikörper gehemmt.
Die Erfinder haben aufgezeigt, dass es die Untereinheit α des LSR Rezeptors ist, die eine besondere Rolle bei der Bindung von Zytokinen und vorzugsweise von Leptin spielt.
Ferner haben die Erfinder mit Hilfe von Mäusen nachgewiesen, dass die LSR Rezeptoren in vivo für ein Abfangen von Zytokinen in der Leber, vorzugsweise von Leptin, sorgen.
Die hohen Leptingehalte bei fettleibigen Personen können durch mehrere molekulare Mechanismen erklärt werden, die die Clearance von Leptin in der Leber verringern können, darunter insbesondere:

a) eine Veränderung eines Gens (eines der Gene) des LSR und/oder seines (seiner) Promotors (Promotoren);
b) eine Erleichterung des allosterischen Umbaus durch post-transkriptionelle Veränderungen, die einen Übergang von der zytokinkompetenten Konfiguration zu der Konfiguration des Rezeptors für Lipoproteine erlaubt;
c) einen ungenügenden Transport der LSR enthaltenden Vesikel von oder in Richtung der Plasmamembran (diese Funktion hängt von der Unversehrtheit des Zytoskeletts ab);
d) eine Erhöhung des Abbaus des LSR;
e) eine Erhöhung der Fettkalorienration, die, indem sie den Rezeptor zur Ausscheidung von Lipoproteinen bewegt, seine Kapazität zum Abbau von Leptin teilweise verringert.

Kontrolle der LSR Aktivität durch Zytokine
Schließlich haben die Erfinder nachgewiesen, dass Zytokine, insbesondere das Leptin, die Aktivität des LSR Rezeptors in Gegenwart von freien Fettsäuren modulieren. Insbesondere erhöhen die Zytokine die Lipoproteinausscheidung des LSR Rezeptors und, genauer gesagt, die Bindung, Internalisierung und den Abbau der VLDL und der LDL. Diese Erhöhung der LSR Aktivität könnte das Ergebnis der Erhöhung der sichtbaren Anzahl an LSR Rezeptoren an der Oberfläche der Zellen auf Grund einer Steigerung der Proteinsynthese und einer Mobilisierung der Endozytosevesikel sein. Ferner haben die Erfinder an Mäusen nachgewiesen, dass die Zytokine, vorzugsweise das Leptin, in vivo in der Lage sind, die post-prandiale lipämische Reaktion zu verringern.
Das Leptin und wahrscheinlich weitere Zytokine sind also Regulatoren der Aktivität des LSR. Ein Syndrom der Resistenz gegenüber Leptin oder andere Zytokine kann zu einer Hypertriglyzeridämie, entweder permanent oder beschränkt auf die post-prandiale Phase, führen.
Behandlungen der Fettleibigkeit
Die Rolle des LSR bei der Ausscheidung des Leptins erlaubt, ein physiopathologisches Modell vorzustellen, das eine Überprüfung der zur Behandlung der Fettleibigkeit angewandten Strategien erfordert. Es ist nämlich wichtig, die Leptin-Konzentrationen bei fettleibigen Personen zu verringern, um die physiologischen Fluktuationen dieses Hormons wiederherzustellen.
Deshalb ist es möglich, die Verwendung von Verbindungen zur Behandlung der Fettleibigkeit in Betracht zu ziehen, die die Modulierung der Anzahl von LSR Rezeptoren, ihrer Recyclinggeschwindigkeit oder der Veränderung ihrer Konfiguration erlauben und/oder Folgendes erlauben:

1. eine Kontrolle der Leptinämie und somit der Sättigungs- und Hungergefühle;
2. eine Wiederherstellung der normalen Leptin-Konzentrationen und die normale Regulierung des Essverhaltens zur normalen Wahrnehmung der Hunger- und Sättigungsgefühle;
3. eine Kontrolle der Triglyzeridämie;
4. eine Regulierung der Plasmakonzentrationen an Chylomikronrückständen, sehr atherogenen Partikeln.

Die Rolle des LSR Rezeptors bei der Ausscheidung von Lipoproteinen intestinaler Herkunft in der Leber erlaubt die Verwendung von Verbindungen in Betracht zu ziehen, die in der Lage sind, die Expression und/oder die Aktivität des LSR zu modulieren, um die Verteilung der Lipide aus der Nahrung unter den peripheren Geweben, insbesondere den Fettgeweben, und der Leber zu modulieren. Eine Behandlung der Fettleibigkeit wird darin bestehen, den Abbau der Lipoproteine in der Leber zu begünstigen und dadurch ihre Speicherung in dem Fettgewebe zu verringern und ihre Plasmakonzentrationen zu regulieren. Dieser letzte Effekt erlaubt, die Verwendung derartiger Verbindungen in Betracht zu ziehen, um die mit der Fettleibigkeit verbundenen Risiken, insbesondere die atherogenen Risiken, zu verringern.
Behandlungen der Anorexie und der Cachexie
Es ist möglich, die Verwendung der Methoden zur Regulierung der LSR-Aktivitäten in Betracht zu ziehen, um Behandlungen einzuführen, die einen Ausweg aus dem teuflischen Kreislauf, der die nervöse Anorexie kennzeichnet, ermöglichen. Durch Verringerung der Anzahl von Rezeptoren müsste man die Gewichtszunahme bei magersüchtigen oder unterernährten Personen begünstigen.
Unter diesen Bedingungen ist es von Interesse, die Ausscheidung von Leptin selektiv zu hemmen, indem man synthetische Peptide oder pharmakologische Moleküle verwendet, die entweder die LSR-Synthese verringern oder seine Fähigkeit blockieren, Leptin und/oder Lipoproteine zu binden oder auch den Katabolismus des Rezeptors erhöhen.
Behandlungen der Störungen des Zytokin-Stoffwechsels
Die Analyse der primären Struktur der Untereinheit α des LSR, wie sie nachfolgend beschrieben wird, zeigt eine homologe Stelle zu den Bindungsstellen der an ihren Rezeptoren vorhandenen Zytokine sowie zwei Routingsignale, die die Endozytose und den schnellen Abbau der Liganden in den Lysozomen erlauben. Diese Beobachtung ist neuartig in dem Sinne, dass die Rezeptoren für die Zytokine nicht die Internalisierung und den Abbau der Liganden erlauben. Diese Rezeptoren wurden auf der Basis ihrer Eigenschaften der intrazellulären Signalisierung charakterisiert.
Außer dass er die Eigenschaft aufweist, den proteolytischen Abbau der Lipoproteine und des Leptins zu erlauben, ist es also sehr wahrscheinlich, dass der LSR Rezeptor auch den Abbau der anderen Zytokine vornimmt. Diese Funktion kann dank der Antikörper Anti-LSR und der transfektierten CHO-Zellen, die die Untereinheit α des LSR exprimieren, wie die, die im Beispiel 4 beschrieben werden, untersucht werden. Die Beteiligung des LSR an der Ausscheidung von Zytokinen ist wesentlich, denn diese Moleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Fettstoffwechsels, des Glucosestoffwechsels und bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme und der Gewichtszunahme.
Die molekularen Mechanismen, mit Hilfe derer die Zytokine die physiologischen Funktionen, die bei der Fettleibigkeit und ihren Komplikationen eine Rolle spielen, modulieren, sind zahlreich und komplex. Es ist jedoch anzumerken, dass die Störungen des Stoffwechsels der Zytokine mit der Hypertriglyzeridämie, die häufig von Infektionen durch Viren, Bakterien oder Protozoen begleitet ist, verbunden sind. Ferner führen die Zytokine und insbesondere der Tumor Necrosis Factor (TNF) zu einer vorübergehenden Hypertriglyzeridämie, die mit der, die in einigen Formen des Diabetes in Verbindung mit Fettleibigkeit zu beobachten ist, vergleichbar ist.
Die Verringerung der Anzahl von LSR Rezeptoren, die im Bereich der Leber von fettleibigen Mäusen exprimiert werden, könnte eine mangelnde Eliminierung bestimmter Zytokine erklären, wobei dieser Mangel zu Stoffwechselstörungen wie denen führt, die man bei der Fettleibigkeit findet. Die Verwendung von Leberzellen in der Kultur und der nachfolgend genannten verschiedenen Modelle fettleibiger Tiere erlaubt, unter allen Zytokinen und insbesondere denen, die zu einem Gewichtsverlust führen (IL-6, LIF, OSM, CNTF, IL-11, 1L-12α sowie TNFα und TNFβ), die zu bestimmen, die die Expression und/oder die Aktivität des LSR modulieren. Die Bestimmung solcher Zytokine kann zum Beispiel durchgeführt werden, indem man Methoden wie die in den Beispielen 4 bis 6 vorgestellten anwendet.
Schließlich werden bei der Untersuchung der primären Struktur des LSR α potenzielle Phosphorylierungsstellen nachgewiesen. Dies eröffnet die Perspektive einer Regulierung der zellulären Aktivität durch den LSR Rezeptor. Ein besonders wichtiges Beispiel wäre die Beteiligung des LSR an der Regulierung der Produktion von „Acute Phase Proteins" unter dem Einfluss verschiedener Reize, darunter die Zytokine.
Die Beteiligung des LSR an der Ausscheidung und am Abbau von Zytokinen könnte sich im Übrigen nicht auf die Leber beschränken. Wenn nämlich nachgewiesen wurde, dass die Expression des LSR vorrangig in der Leber stattfindet, so ist auch sicher, dass die Expression dieses Rezeptors nicht auf dieses Organ beschränkt ist. Eine Voruntersuchung durch Northern Blot an verschiedenen menschlichen Geweben konnte außer den Leberprodukten Expressionsprodukte im Bereich der Niere und des Hodens nachweisen. Eine weitergehende Untersuchung wird einen Nachweis der verschiedenen LSR exprimierenden Gewebe beim Menschen erlauben. Unter diesem Blickwinkel könnte der LSR nicht nur im Bereich der Leber, sondern auch in den peripheren Geweben am Abbau von Zytokinen beteiligt sein. Ein Defizit an dieser Aktivität könnte an der Entstehung von Autoimmunkrankheiten, von sklerotischen Plaquen und rheumatoider Arthritis beteiligt sein. Eine Ansammlung von Zytokinen wird häufig bei der Pathogenese dieser Krankheiten beobachtet.
Die Polypeptidsequenzen des LSR Rezeptors
Die Erfindung betrifft Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bestandteil eines LSR Rezeptors nach der Erfindung sind. Die Erfindung betrifft insbesondere Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Untereinheiten α, α' oder β des LSR Rezeptors bilden.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein gereinigtes, isoliertes oder rekombinantes Polypeptid, das eine Sequenz von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10 bis 15, aufeinanderfolgende Aminosäuren eines LSR Rezeptors enthält, sowie die Homologe, Äquivalente und Varianten des genannten Polypeptids oder eines seiner Fragmente. Vorzugsweise ist die Sequenz von mindestens 10 bis 15 Aminosäuren des LSR Rezeptors ein biologisch aktives Fragment eines LSR Rezeptors.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung gereinigte, isolierte oder rekombinante Polypeptide, die eine Sequenz von mindestens 10 bis 15 Aminosäuren eines LSR Rezeptors der Ratte, eines LSR Rezeptors der Maus und eines menschlichen LSR Rezeptors enthalten.
In einem ersten bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Polypeptid dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz von mindestens 10 bis 15 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen SEQ ID 2, SEQ ID 4 und SEQ ID 6 sowie den Varianten, Äquivalenten oder Homologen dieses Polypeptids, oder eines ihrer Fragmente enthält. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein Homolog oder ein biologisch aktives Fragment einer der oben genannten Sequenzen.
In einem zweiten bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Polypeptid dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz von mindestens 10 bis 15 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen SEQ ID 16, SEQ ID 17 und SEQ ID 18 sowie den Varianten, Äquivalenten oder Homologen dieses Polypeptids, oder eines ihrer Fragmente enthält. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein Homolog oder ein biologisch aktives Fragment einer der oben genannten Sequenzen.
In einem dritten bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Polypeptid dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz von mindestens 10 bis 15 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen SEQ ID 8, SEQ ID 10 und SEQ ID 12 sowie den Varianten, Äquivalenten oder Homologen dieses Polypeptids, oder eines ihrer Fragmente enthält. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein Homolog oder ein biologisch aktives Fragment einer der oben genannten Sequenzen.
Unter den bevorzugten Polypeptiden der Erfindung sind insbesondere die Polypeptide der menschlichen Sequenz mit SEQ ID 8, SEQ ID 10 oder SEQ ID 12 sowie die der Sequenz der Ratte mit SEQ ID 2, SEQ ID 4 oder SEQ ID 6 oder die der Sequenz der Maus mit SEQ ID 16, SEQ ID 17, SEQ ID 18 zu nennen. Die den in den 1 bis 6 dargestellten Bereichen entsprechenden Fragmente, deren Positionen auf den Sequenzen den Sequenzen SEQ ID 2, 8 oder 16 entsprechen, sind in den Tabellen 1, 3 und 4 genannt.
Schließlich betrifft die Erfindung ebenfalls die Polypeptide mit SEQ ID 29 und SEQ ID 30.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Polypeptide, die die oben beschriebenen Polypeptide umfassen, sowie ihre homologen, äquivalenten oder veränderten Polypeptide sowie die bevorzugterweise biologisch aktiven Fragmente der genannten Polypeptide.
Unter den Polypeptiden nach der Erfindung bevorzugt man ebenfalls die Polypeptide, die eine Aminosäurensequenz, ausgewählt unter den Aminosäurensequenzen, wie sie oben definiert sind, enthalten oder aus dieser bestehen, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bestandteil des Rezeptors nach der Erfindung sind.
Untersuchung der Polypeptidsequenzen der Untereinheiten α, α' und β des LSR Rezeptors
Die systematische Untersuchung der Produkte der 3 in dieser Anmeldung beschriebenen cDNA der Ratte ist auf 1 schematisch dargestellt. Die Untereinheit α des LSR Rezeptors der Ratte, ein von der längsten cDNA codiertes Protein LSR-Rn-2097), weist die folgenden Eigenschaften auf.
Potenzielle Glykosylierungsstellen findet man in den Positionen 12–14 und 577–579. Eine potenzielle Bindungsstelle für Glykosaminoglykane findet man in Position 14–17. Mehrere Phosphorylierungsstellen sind im Bereich des NH₂-terminalen Endes lokalisiert (in den Positionen 193–196, 597–600, 169–171, 172–174, 401–403, 424–426, 464–466, 467–469, 185–188, 222–225, 436–439, 396–399, 504–507, 530–533, 624–627, 608–615), und legen nahe, dass dieses in Richtung der intrazellulären Region orientiert ist.
Im Übrigen weist das Protein neben dem NH₂-terminalen Ende eine Sequenz hydrophober Aminosäuren auf, die durch zwei Aminosäuren, die die Struktur einer Haarnadel bilden, deren 2 Arme aus hydrophoben Aminosäuren bestehen, zweigeteilt sind. Man kann annehmen, dass diese Region die Bindungsstelle der Fettsäuren des LSR darstellt. Eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette kann so die Struktur eines Handschuhfingers annehmen. Die zwei Aminosäuren sind, genauer gesagt, im Fall des LSR der Ratte zwei Proline, die sich in den Positionen 31 und 33 der Polypeptidsequenz der Untereinheit α befinden.
Ebenfalls neben dem NH₂-terminalen Ende befindet sich eine Konsensussequenz der Bindung an Clathrin, ein Protein, das die Innenseite der „coated pits" bekleidet (Chen et al., 1990). Diese spezifischen Regionen der Plasmamembran erlauben die schnelle Endozytose der Membranproteine. Eine solche Konsensussequenz findet man im Bereich des LRP-α₂-Makroglobulin, der CRAM und des LDL-Rezeptors (Herz et al., 1988; Lee et al., 1990; Goldstein et al., 1995). Eine Mutation in diesem Bereich hat eine bedeutende Verzögerung der Internalisierung des LDL zur Folge und führt zu einer familiären Hypercholesterinämie (Davis et al., 1986).
Der Rezeptor besitzt anschließend eine Sequenz hydrophober Aminosäuren, die einen potenziellen transmembranären Bereich darstellen. Die Länge dieses Segments erlaubt nur ein einziges Passieren durch die Phospholipiddoppelschicht (Brendel et al., 1992).
Zwischen diesem Signal der Bindung an Clathrin und der hydrophoben Kette, die dem einzigen transmembranären Segment entspricht, befinden sich 2 Motive LI und LL (Letourneur et al., 1992). Diese beiden Motive werden in den folgenden Proteinen wiedergefunden: glut 4 Glukosetranporter (Verhey et al., 1994); der unveränderten Kette und dem Histokompatibilitätskomplex der Klasse II (Zhong et al., 1997; Parra-Lopez et al., 1997). Diese Signale steuern die Endozytose und die intrazelluläre Adressierung der Proteine in dem peripheren Membransystem.
Neben C-Terminal findet man anschließend eine Region mit hoher Cysteinkonzentration, die eine Homologie mit den Rezeptoren der Zytokine und folgenden Rezeptoren aufweist: den Rezeptoren für TNF 1 und 2 (Tumor Necrosis Factor 1 und 2); dem Rezeptor für NGF mit geringer Affinität (Nerve Growth Factor), dem löslichen Rezeptor für TNF des Fibromvirus Shope; CD40, CD27 und CD30, den Rezeptoren für die Zytokine CD40L, CD27L und CD30L; dem Protein der Zelle T4-1BB, dem Rezeptor für das putative Zytokin 4-1BBI, dem Antigen FAS(APO 1), dem Rezeptor für das Protein FASL, das an der Apoptose beteiligt ist, dem Antigen OX40 der T-Zelle, dem Rezeptor für das Zytokin OX40L und dem Protein A53 des Vacciniavirus (Cytokines and their receptors, 1996; Banner et al., 1993).
Neben diesem Segment mit hoher Cysteinkonzentration findet man eine Region mit Aminosäuren, die alternativ + und – geladen sind (Brendel et al., 1992). Diese Region bildet eine potenzielle Bindungsstelle für die Apoproteinliganden Apo B und Apo E. Diese Region enthält ferner ein RSRS-Motiv, das man im Bereich des Lamins (Simos et al., 1994) und des SF2' (Krainer et al., 1991) wiederfindet.
Die Form LSR α', die von der cDNA LSR-Rn-2040 codiert wird, besitzt alle oben beschriebenen Bereiche nach der Sequenz LSR α, die von cDNA LSR-Rn-2097 codiert wird, mit Ausnahme des Elements LI/LL, dessen Dublett Leukin durch alternatives Splicing eliminiert wird. Obwohl sie sehr ähnliche Sequenzen besitzen, könnten sich die Untereinheiten α, die von LSR-Rn-2097 codiert werden, und α', die von LSR-Rn-2040 codiert werden, also in ihrer Recyclinggeschwindigkeit und ihrer Adressierung unterscheiden. Die Form β, die von LSR-Rn-1893 codiert wird, besitzt weder einen transmembranären Bereich noch eine Region mit hoher Cysteinkonzentration und einem Homolog der Rezeptoren für Zytokine. Sie besitzt jedoch im NH₂-terminalen Bereich die hydrophobe Region, die durch eine Wiederholung von Prolin getrennt wird, die Region mit hohem Anteil an geladenen Aminosäuren und das Motiv RSRS. Dieser Bestandteil befindet sich wahrscheinlich vollständig außerhalb der Zelle, in der er über Disulfidbrücken entweder an das Produkt LSR-Rn-2040 oder an das von LSR-Rn-2097 gebunden ist.
In der folgenden Tabelle 1 sind die verschiedenen oben beschriebenen Bereiche oder Motive aufgeführt, ihre eventuelle Zugehörigkeit zu jeder der Untereinheiten des LSR Rezeptors sowie die Anfangs- und Endpositionen der genannten Bereiche oder Motive oder Regionen, die die genannten Bereiche oder Motive enthalten, wie sie in der Sequenz SEQ ID 2 genannt sind, genannt.
Tabelle 1
Vergleich der Polypeptidsequenzen der LSR Rezeptoren bei der Ratte, der Maus und beim Menschen
Die Längen der Polypeptidsequenzen sowie die SEQ ID ihrer jeweiligen Sequenzen in der beigefügten Liste der drei Arten von Untereinheiten der LSR Rezeptoren nach der Erfindung bei der Ratte, der Maus und beim Menschen sind der folgenden Tabelle 21 genannt.
Tabelle 2a
Diese Polypeptidsequenzen wurden aus jeder der drei entsprechenden cDNA-Sequenzen bei der Ratte, der Maus und beim Menschen, die weiter unten ausführlich beschrieben werden, erhalten. Die zur Bezeichnung dieser cDNA-Sequenzen verwendete Nomenklatur, die die Länge an Nukleotiden wiedergibt, sowie die SEQ ID ihrer jeweiligen Sequenzen in der beigefügten Liste sind in der folgenden Tabelle 2b aufgeführt.
Tabelle 2b
Die Proteinsequenz, die der Untereinheit α des LSR Rezeptors entspricht, die von der Sequenz LSR-Hs-2062 abgeleitet ist, hat eine Länge von 649 Aminosäuren. Sie ist in einer Reihe angeordnet mit den Proteinsequenzen, die von LSR-Mm-1886 abgeleitet sind, mit einer Länge von 594 Aminosäuren, und von LSR-Rn-2097, mit einer Länge von 593 Aminosäuren (2). Die Konservierung der Proteinsequenzen ist sehr gut (80,2% beziehungsweise 82,2% Identität bei 591 und 590 überlappenden Aminosäuren). Die in der Proteinsequenz des LSR α der Ratte nachgewiesenen funktionalen Bereiche finden sich in der Sequenz LSR α des Menschen sowie in der des LSR α der Maus (2).
Die menschlichen Proteine, die den Formen LSR-Hs-2005 (α') und LSR-Hs-1858 (β) entsprechen, haben eine vorausgesagte Größe von 630 beziehungsweise 581 Aminosäuren. Die Proteine der Ratte, die den Formen LSR-Rn-2040 (α') und LSR-Rn-1893 (β) entsprechen, haben eine vorausgesagte Größe von 574 beziehungsweise 525 Aminosäuren. Die Proteine der Maus, die den Formen LSR-Mm-1829 (α') und LSR-Mm-1682 (β) entsprechen, haben eine vorausgesagte Größe von 575 beziehungsweise 526 Aminosäuren. Die Aneinanderreihung der drei menschlichen Formen (3), der drei bei der Ratte beschriebenen Formen (4) und der drei bei der Maus beschriebenen Formen (5) zeigt, dass bei den drei Gattungen alle Proteinformen das Signal NPGY der Bindung an das Clathrin und das Motiv RSRS konservieren. Die langen Formen (α) des Menschen (Produkt von LSR-Hs-2062), der Ratte (Produkt von LSR-Rn-2097) und der Maus (Produkt von LSR-Mm-1886) weisen die gesamten funktionalen Eigenschaften des LSR auf. Die drei kurzen Formen (β) (Produkte von LSR-Hs-1817, LSR-Rn-1893 beziehungsweise LSR-Mm-1682) verlieren den Bereich Dileucin der lyosomalen Adressierung, den transmembranären Bereich und den Print des Zytokin-Rezeptors. Es ist ebenfalls anzumerken, dass die drei intermediären Formen (α') (Produkt von LSR-Hs-2005, LSR-Rn-2040 und LSR-Mn-1829) den Dileucin-Bereich verlieren, wobei der transmembranäre Bereich und der dem Print des Zytokin-Rezeptors entsprechende Bereich konserviert bleiben (3, 4 und 5). Die 6 stellt schließlich die Proteine aus den drei beim Menschen nachgewiesenen Formen der cDNA und die Motive, die jede von ihnen infolge des Splicing, aus dem sie hervorgegangen ist, enthält, dar.
In der folgenden Tabelle 3 sind die verschiedenen oben beschriebenen Bereiche oder Motive sowie die Anfangs- und Endpositionen der genannten Bereiche oder Motive oder der Regionen, die die genannten Bereiche oder Motive enthalten, wie sie in der Sequenz SEQ ID 16 der Maus genannt sind, aufgeführt.
Tabelle 3
In der folgenden Tabelle 4 sind die verschiedenen oben beschriebenen Bereiche oder Motive sowie die Anfangs- und Endpositionen der genannten Bereiche oder Motive oder der Regionen, die die genannten Bereiche oder Motive enthalten, wie sie in der Sequenz SEQ ID 8 der Maus genannt sind, aufgeführt.
Tabelle 4
Als Schlussfolgerung erlaubt die oben beschriebene Ähnlichkeit in Bezug auf die Sequenz und die LSR-Struktur die bei der Ratte und/oder der Maus gemachten Beobachtungen auf den Menschen zu übertragen.
Unter einem homologen Polypeptid versteht man die Polypeptide, die im Vergleich zum natürlichen Polypeptid bestimmte Veränderungen aufweisen, wie insbesondere eine Deletion, ein Abbrechen, eine Längung, eine chimäre Fusion und/oder eine Mutation, insbesondere punktförmig. Unter den homologen Polypeptiden bevorzugt man die, deren Aminosäuresequenz mindestens 80%, vorzugsweise 90%, Identität zu den Aminosäuresequenzen der Polypeptide nach der Erfindung aufweisen.
Unter einem äquivalenten Polypeptid versteht man ein Polypeptid, das mindestens eine der Aktivitäten des LSR Rezeptors aufweist, insbesondere die Aktivität des Lipoprotein- oder Chylomikron-Rezeptors, die Aktivität des Zytokin-Rezeptors, insbesondere des Leptin-Rezeptors, oder die Aktivität des Rezeptors des Proteins gC1q-R oder eines seiner analogen Proteine. Unter einem äquivalenten Polypeptid ist ebenfalls jedes Polypeptid zu verstehen, das aus dem alternativen Splicing der genomischen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptide nach der Erfindung codiert, hervorgegangen ist.
Unter einem veränderten Polypeptid (oder einer Proteinvariante) sind die gesamten mutierten Polypeptide, die, insbesondere beim Menschen, vorhanden sein können und die insbesondere dem Abbrechen, den Deletionen und/oder Additionen von Aminosäureresten, Substitutionen oder Mutationen entsprechen, sowie die künstlichen veränderten Polypeptide, die dennoch veränderte Polypeptide genannt werden, zu verstehen. Im vorliegenden Fall stehen die veränderten Polypeptide insbesondere zum Teil im Zusammenhang mit dem Auftreten und der Entwicklung der Fettleibigkeit oder der Anorexie. Sie können ebenfalls mit dem Auftreten und/oder der Entwicklung von mit der Fettleibigkeit verbundenen Risiken oder Komplikation in Verbindung stehen, insbesondere im kardiovaskulären Bereich und/oder im Bereich der mit Störungen des Zytokinstoffwechsels verbundenen Erkrankungen.
Unter einem Polypeptidfragment versteht man ein Polypeptid oder ein Peptid, das durch eine mindestens 15 Nukleotide oder Basen, vorzugsweise 20 Basen oder 30 Basen, enthaltende Nukleinsäuresequenz codiert wird. Diese Fragmente können insbesondere eine punktförmige Mutation im Vergleich zur normalen Polypeptidsequenz umfassen oder spezifischen Aminosäuresequenzen von veränderten, künstlichen oder beim Menschen vorhandenen Polypeptiden wie den mit einer Polymorphie verbundenen, die insbesondere mit der Fettleibigkeit oder den oben genannten Erkrankungen im Zusammenhang stehen, entsprechen.
Unter einem biologisch aktiven Fragment versteht man insbesondere ein Fragment der Polypeptid-Aminosäurensequenz:

– das mindestens eine der Aktivitäten des LSR-Rezeptors, insbesondere die Aktivität des Lipoprotein-Rezeptors oder des Zytokin-Rezeptors, insbesondere des Leptin-Rezeptors oder des der zellulären Signalisierung aufweist und/oder
– in der Lage ist, von einem spezifischen Antikörper des Rezeptors nach der Erfindung erkannt zu werden und/oder
– in der Lage ist, von einer Verbindung erkannt zu werden, die zum Beispiel durch Aufhebung der Bindung eines spezifischen Liganden des genannten Rezeptors die Aktivität des LSR Rezeptors modulieren kann und/oder
– in der Lage ist, die Adressierung und/oder die zelluläre Lokalisierung des LSR Rezeptors zu modulieren und/oder ganz allgemein einen Bereich oder ein biologisch aktives Motiv des LSR Rezeptors darstellt.

Unter den bevorzugten biologisch aktiven Fragmenten nach der Erfindung zählt man insbesondere:

– die eine Bindungsstelle für Clathrin enthaltenden Fragmente,
– die eine Bindungsstelle für Fettsäuren, insbesondere eine Bindungsstelle für Fettsäuren, die eine Sequenz hydrophober Aminosäuren enthalten, die durch zwei benachbarte Proline in zwei Teile geteilt ist, was zu einer Struktur einer Haarnadel führt, deren Arme aus hydrophoben Aminosäuren bestehen, enthaltenden Fragmente,
– die eine hydrophobe Region, die einen transmembranären Bereich darstellt, enthaltenden Fragmente,
– die eine Region, die in der Lage ist, die Endozytose und die intrazelluläre Adressierung der Proteine in dem peripheren Membransystem zu kontrollieren, enthaltenden Fragmente, insbesondere ein Fragment, das eine die Motive LI und LL enthaltende Stelle enthält,
– die eine Bindungsstelle für Zytokine, insbesondere eine Stelle, die eine Region mit hoher Cysteinkonzentration einschließt, enthaltenden Fragmente,
– die Fragmente, die eine Region enthalten, die eine potenzielle Bindungsstelle für Lipoproteinliganden wie ApoB und ApoE definiert, insbesondere eine Region, die eine Sequenz von alternativ + und – geladenen Aminosäuren enthält, und
– die ein RSRS-Motiv enthaltenden Fragmente.

Zu diesen Fragmenten zählt man insbesondere die Polypeptide, wie sie in den Tabellen 1, 2 und 4 definiert sind, oder alle Fragmente der Nukleotide von SEQ ID 2, 8 oder 16, die die genannten Polypeptide enthalten, oder alle äquivalenten, homologen oder veränderten Fragmente.
Weitere bevorzugte Fragmente schließen antigene Peptide wie die der Sequenzen SEQ ID 29 und 30 mit ein.
Die Nukleotidsequenzen des LSR Rezeptors
Gegenstand dieser Erfindung sind isolierte Sequenzen der Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen LSR Rezeptor oder ein Polypeptid nach der Erfindung codieren.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 8, vorzugsweise mindestens 10 und insbesondere 15 aufeinander folgende Nukleotide mit SEQ ID 19 sowie komplementäre Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 8, vorzugsweise mindestens 10 und insbesondere 15 aufeinander folgende Nukleotide mit SEQ ID 41 sowie komplementäre Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, die für den menschlichen LSR Rezeptor codiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz enthält, die den Nukleotiden 1898 bis 21094, insbesondere den Nukleotiden 2001 bis 20979, insbesondere den Nukleotiden 2145 bis 20979 mit SEQ ID 19 sowie den komplementären Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure entspricht.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Nukleinsäuresequenzen, die in dem Gen enthalten sind, das für den menschlichen LSR Rezeptor codiert, insbesondere jedem der Exons des genannten Gens oder einer Kombination von Exons des genannten Gens, oder auch ein Polynukleotid, das sich auf einem Abschnitt eines oder mehrerer Exons erstreckt. Bevorzugterweise codieren diese Nukleinsäuren für ein oder mehrere biologisch aktive Fragmente des menschlichen LSR Rezeptors.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1 bis 1897 mit SEQ ID 19 entspricht, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 21095 bis 22976 mit SEQ ID 19 entspricht, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID 7, SEQ ID 9 und SEQ ID 11 enthält, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID 1, SEQ ID 3 und SEQ ID 5 enthält, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID 13, SEQ ID 14 und SEQ ID 15 enthält, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1898 bis 2001 mit SEQ ID 19 oder bevorzugt den Nukleotiden 1898 bis 2144 mit SEQ ID 19 entspricht, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 20980 bis 21094 mit SEQ ID 19 entspricht, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält.
Unter den Nukleinsäuren nach der Erfindung bevorzugt man die Nukleinsäuren der Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID 7, SEQ ID 9 und SEQ ID 11, die Sequenzen SEQ ID 1, SEQ ID 3 und SEQ ID 5 sowie die Sequenzen SEQ ID 13, SEQ ID 14 und SEQ ID 15 sowie deren komplementäre Sequenzen enthalten.
Ebenso ein Teil der Erfindung sind die veränderten, mutierten, äquivalenten oder homologen Sequenzen nach der Erfindung sowie deren Fragmente oder Nukleinsäuresequenzen, die in der Lage sind, sich spezifisch mit den Sequenzen nach der Erfindung zu hybridisieren.
Menschliche genomische Sequenz
Die Erfindung betrifft also die genomische Sequenz des menschlichen LSR Rezeptors, vorzugsweise die Sequenz SEQ ID 19, sowie deren komplementäre Sequenzen oder eine ihrer allelischen Varianten, die mutierten, äquivalenten oder homologen Sequenzen oder eines ihrer Fragmente.
Das Gen des menschlichen LSR (SEQ ID 19) enthält 10 Exons, die über 21 094 pb verteilt sind. Die Größe der Exons ist wie folgt: 356, 345, 120, 57, 147, 174, 60, 132, 626 beziehungsweise 141 pb (Tabelle 5).
Tabelle 5
In der Spalte EXON sind die von 1 bis 10 nummerierten Exons in der Reihenfolge 5'-3' ihrer Position auf der Genomsequenz aufgeführt. In den Spalten ANFANG und ENDE ist die Position des ersten und des letzten Nukleotids des betreffenden Exons genannt. In den Spalten 5' SPLIC. und 3' SPLIC. sind die Sequenzen der Splicingsstelle, die an das Exon am 5' und 3' Ende grenzt, aufgeführt. In den Spalten BL 5' und BL 3' sind die Basen am 5' Ende beziehungsweise 3' Ende eines Exons genannt, die erst nach dem Splicing am Leserahmen des Messengers beteiligt werden. Zum Beispiel: da das Exon 7 eine freie Basis am 3' Ende hat, kann dieses Exon an das 5' Ende des Exons 8, das zwei freie Basen am 5' Ende hat, angefügt werden. Das Ganze aus 1 Base + 2 Basen stellt das Codon wieder her, das von dem Intron in der genomischen Sequenz zerstört wurde. Das Exon 7 kann an seinem 3' Ende an jedes beliebige Exon, das am 5' Ende zwei freie Basen hat, angefügt werden; wenn das neu entstandene Codon nicht einem Stoppcodon entspricht, wird der geöffnete Leserahmen konserviert bleiben.
Die Exons 1 und 2 sowie 9 und 10 sind gezwungenermaßen co-gespliced und bilden so einen Block 5', der den Exons 1 und 2 entspricht und einen Block 3', der den Exons 9 und 10 entspricht. Der funktionale minimale Messenger, der dem Produkt dieser vier Exons entspricht, hätte so eine Größe von circa 1 331 pb. Bei den anderen Exons erlauben alle möglichen Kombinationen den offenen Leserahmen zu konservieren.
Die Größe der nicht codierenden Exons am 5' Ende konnte nicht genau bestimmt werden. Die Sequenzen 5' UTR der Ratte unterscheiden sich nämlich zu sehr von denen des Menschen, um die Untersuchung dieser Sequenzen durchzuführen und das wirkliche Ende 5' der cDNA des menschlichen LSR zu identifizieren. Diese kann dank der Isolierung des 5' Endes der menschlichen LSR Messenger mit Hilfe der von den Erfindern entwickelten Abfangmethoden des 5' Endes (WO 9634981) vorgenommen werden. Die nachfolgend beschriebene Polyadenylierungsstelle ist die einzige, die vor dem Gen USF2 vorhanden ist und befindet sich am 3' Ende des menschlichen Gens LSR. Es ist also sehr wahrscheinlich, dass die nicht-translatierte Region 3' dieses Gens sehr kurz ist (geschätzte Größe circa 100 pb). Alle angegebenen Größen bezüglich der Moleküle der cDNA des menschlichen LSR müssen also je nach Größe des nicht-translatierten 5' Endes angepasst werden. Die erhaltene Sequenz der menschlichen cDNA hat unter Berücksichtigung der gesamten aus der Untersuchung der genomischen Sequenz abgeleiteten Exons eine Größe von 2 158 pb. Diese Form würde der Form LSR-Rn-2097 entsprechen.
Die Lokalisierung bestimmter Expressionssignale der Nukleotidsequenz SEQ ID 19 ist in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
In der Spalte Signal sind die charakteristischen Merkmale des Moleküls der Messenger RNA beschrieben: Start der Translation (ATG), Ende der Translation (STOPP) und Signal der Polyadenylierung (POLY Ad). In den Spalten Anfang und Ende ist die Position im Nukleotid vom Anfang und Ende dieser Signale auf der genomischen Sequenz SEQ ID 19 genannt. Ein ATG-Signal des Starts der Translation wird dem anderen vorgezogen, da es ein für den Start günstigeres Umfeld aufweist.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die gereinigten Nukleinsäuresequenzen, die für ein oder mehrere Regulationselemente der Expression des menschlichen LSR Gens codieren. Ebenfalls Teil der Erfindung sind die Nukleinsäuresequenzen des Promotors und/oder Regulators des Gens, das für den Rezeptor nach der Erfindung codiert, oder eine ihrer allelischen Varianten, die mutierten, äquivalenten oder homologen Sequenzen oder eines ihrer Fragmente.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine gereinigte Nukleinsäure, die sich am 5' Ende der codierenden Sequenz des Gens LSR befindet. Diese Nukleinsäure ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1 bis 1897 der SEQ ID 19 entspricht, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält. Kürzere Fragmente dieser Nukleinsäure können ebenfalls als Expressionspromotoren des LSR Gens oder als jede beliebige Sequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, die sich am 3' Ende der transkribierten Sequenz des LSR Gens befindet. Diese Nukleinsäure ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 21095 bis 22976 der SEQ ID 19 entspricht, sowie die Sequenzen komplementärer Nukleinsäuren dieser Nukleinsäure enthält. Kürzere Fragmente dieser Nukleinsäure können ebenfalls als Expressionsregulatoren von Genen verwendet werden.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die genomische Sequenz des menschlichen LSR Rezeptors, vorzugsweise die Sequenz SEQ ID 41, sowie ihre komplementären Sequenzen oder eine ihrer allelischen Varianten, die mutierten, äquivalenten oder homologen Sequenzen oder eines ihrer Fragmente.
Vergleich der genomischen Organisationen beim Menschen, bei der Ratte und der Maus
Es ist interessant, festzustellen, dass eine Synthenie (Konservierung der Organisationen bestimmter chromosomischer Regionen zwischen Arten) zwischen der Region des Chromosoms 7 der Maus, wo das Gen Lisch7 lokalisiert ist, in unmittelbarer Nähe von USF2, und der Region 19q13 des menschlichen Chromosoms 19, das den LSR enthält, gut beschrieben ist. Die Organisation der beiden Gene Lisch7/LSR und USF2 ist zwischen Arten konserviert. Ebenso findet man ApoE, von zentromererer Lokalisierung in Bezug auf diese Gene, sowohl bei der Maus wie auch beim Menschen. Es ist bemerkenswert, dass der Rezeptor für die LSR Lipoproteine und einer ihrer Liganden ApoE in einer gleichen Chromosomenregion lokalisiert sind. Es kommt nämlich häufig vor, dass der Rezeptor und der Ligand co-reguliert werden. Eine solche Situation würde erlauben, in Betracht zu ziehen, dass bei der Maus beobachtete Phänomene auf den Menschen übertragbar sind.
cDNA-Sequenzen des Menschen, der Ratte und der Maus
Die Erfindung betrifft ferner 3 unterschiedliche cDNA, die aus dem Gen des LSR Rezeptors durch alternatives Splicing entstanden sind. Diese 3 cDNA wurden beim Menschen, bei der Ratte und der Maus identifiziert (Tabelle 2b). Sie codieren für die 3 Typen von Untereinheiten des LSR Rezeptors, α (lang), α' (mittel) und β (kurz). Die längste cDNA enthält alle 10 Exons des Gens. Die mittlere cDNA enthält nicht das Exon 4. Die kürzeste schließlich enthält nicht die Exons 4 und 5.
Die Nukleotidsequenz der cDNA LSR-Hs-2062 des Menschen, die für die Untereinheit α des LSR Rezeptors codiert, und die Nukleotidsequenz der cDNA LSR-Rn-2097 der Ratte sind auf 1 955 überlappenden pb zu 78,6% identisch. Diese Zahlen liegen bei 78,8% beziehungsweise 1 851 pb, wenn die Sequenz LSR-Mm-1886 der Maus (lange Form) mit der menschlichen Sequenz in einer Reihe liegt. Dieses zeigt eine sehr große Konservierung der Nukleinsäuresequenzen zwischen den Arten. Die größten Unterschiede werden in dem nicht translatierten 5' Ende (wenn die Sequenz verfügbar ist), in dem ersten codierenden Exon und in dem nicht translatierten 3' Ende beobachtet. (7).
Die Erfindung betrifft also ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen SEQ ID 7, SEQ ID 9 und SEQ ID 11, den Sequenzen SEQ ID 1, SEQ ID 3 und SEQ ID 5 und den Sequenzen SEQ ID 13, SEQ ID 14 und SEQ ID 15 sowie den komplementären Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure, oder einer ihrer allelischen Varianten, den mutierten, äquivalenten oder homologen Sequenzen oder einem ihrer Fragmente.
Die Nukleinsäuren, die die codierenden Phasen der oben genannten Nukleinsäuren zwischen den Startcodons und den Endcodons der Translation bilden, sind ebenfalls ein Teil der Erfindung.
Die Nukleinsäuren, die für die Polypeptidfragmente nach der Erfindung codieren, sind ebenfalls ein Teil der Erfindung. Hinzuweisen ist insbesondere auf die Nukleinsäuren, die für die in den Tabellen 1, 3 und 4 beschriebenen Fragmente codieren.
So beschreibt die Tabelle 7 die Positionierung solcher Fragmente der Nukleinsäure auf der menschlichen Sequenz SEQ ID 7.
Tabelle 7
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, die der Sequenz des 5'UTR der cDNA, die für den menschlichen LSR Rezeptor codieren, entspricht. Diese Nukleinsäure ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1898 bis 2001 der SEQ ID 19 oder bevorzugterweise den Nukleotiden 1898 bis 2144 der SEQ ID 19 entspricht, sowie die komplementären Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure enthält. Kürzere Fragmente dieser Nukleinsäure können ebenfalls verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine gereinigte Nukleinsäure, die der Sequenz des 3'UTR der cDNAc, die für den menschlichen LSR Rezeptor codieren, entspricht. Diese Nukleinsäure ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 20980 bis 21094 der SEQ ID 19 entspricht, sowie die komplementären Nukleinsäuresequenzen dieser Nukleinsäure enthält. Kürzere Fragmente dieser Nukleinsäure können ebenfalls verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die gereinigten Nukleinsäuren, die den Sequenzen der 5'UTR oder der 3'UTR der cDNA, die für den LSR Rezeptor der Ratte oder der Maus codieren, entsprechen. Kürzere Fragmente dieser Nukleinsäure können ebenfalls verwendet werden.
Die 5'UTR und 3'UTR können Elemente enthalten („responsive elements" und „enhancers"), die an der Regulierung der Transkription und der Translation beteiligt sind. Diese Regionen spielen insbesondere eine Rolle bei der Stabilität der mRNA. Ferner enthält 5'UTR das Motiv Shine-Delgarno, das bei der Translation der mRNA unerlässlich ist.
Unter Nukleinsäure, Nukleinsequenz oder Nukleinsäuresequenz versteht man ein natürliches, isoliertes oder synthetisches DNA- und/oder RNA-Fragment, das nicht-natürliche Nukleotide enthält oder nicht enthält, das eine präzise Kettenbildung von modifizierten oder nicht-modifizierten Nukleotiden bezeichnet, das erlaubt, ein Fragment, ein Segment oder eine Region einer Nukleinsäure zu definieren.
Unter äquivalenten Nukleinsequenzen versteht man die Nukleinsequenzen, die für die Polypeptide nach der Erfindung codieren, unter Berücksichtigung der Degenerierung des genetischen Code, die Sequenzen der komplementären DNA und die Sequenzen der entsprechenden RNA sowie die Nukleinsequenzen, die für die äquivalenten Polypeptide codieren.
Unter homologen Nukleinsequenzen versteht man die Nukleinsequenzen, die für die homologen Polypeptide codieren und/oder die Nukleinsequenzen, die einen Identitätsgrad von mindestens 80%, vorzugsweise 90%, aufweisen. Nach der Erfindung ist die Identität lediglich statistisch, sie bedeutet, dass die Sequenzen mindestens 80% und vorzugsweise 90% gemeinsame Nukleotide aufweisen. Es handelt sich vorzugsweise um Sequenzen, die sich spezifisch mit einer der Sequenzen der Erfindung hybridisieren können. Vorzugsweise sind die spezifischen Hybridisierungsbedingungen so, wie sie in den Beispielen definiert sind, oder so, dass sie mindestens 95% Homologie gewährleisten.
Die Länge dieser Hybridisierungs-Nukleinsequenzen kann zwischen 8, 10, 15, 20 oder 30 und 200 Nukleotiden, insbesondere zwischen 20 und 50 Nukleotiden, bevorzugterweise zwischen 20 und 30 Nukleotiden, variieren.
Unter Allel oder allelischer Variante versteht man die natürlichen mutierten Sequenzen, die den beim menschlichen Wesen vorhandenen Polymorphien und insbesondere Polymorphien entsprechen, die zum Auftreten und/oder zur Entwicklung der Fettleibigkeit oder Anorexie führen können. Diese Polymorphien können ebenfalls zum Auftreten und/oder zur Entwicklung von mit der Fettleibigkeit verbundenen Risiken oder Komplikationen, insbesondere im kardiovaskulären Bereich, und/oder zu Krankheiten führen, die mit Störungen des Zytokinstoffwechsels verbunden sind.
Unter mutierten Nukleinsequenzen versteht man die Nukleinsequenzen, die mindestens eine punktförmige Mutation im Vergleich zur normalen Sequenz enthalten. Wenn die Sequenzen nach der Erfindung im Allgemeinen normale Sequenzen sind, so sind es ebenfalls mutierte Sequenzen, sofern sie mindestens eine punktförmige Mutation, maximal 10% Mutationen, im Vergleich zur normalen Sequenz enthalten.
Vorzugsweise betrifft diese Erfindung mutierte Nukleinsequenzen, in denen die punktförmigen Mutationen nicht stumm sind, d. h. dass sie zu einer Modifizierung der codierten Aminosäure im Vergleich zu der normalen Sequenz führen. Bevorzugterweise beziehen sich diese Mutationen auf Aminosäuren, die den LSR Rezeptor und/oder den LSR Komplex oder die entsprechenden Bereiche oder Fragmente desselben strukturieren. Diese Mutationen können sich auch auf Aminosäuren beziehen, die in den Regionen enthalten sind, die den Rezeptorstellen, den Lipoproteinen oder den Zytokinen, insbesondere dem Leptin, oder den Bindungsstellen der Cofaktoren, insbesondere der freien Fettsäuren, oder auch den Phosphorylierungsstellen entsprechen. Diese Mutationen können sich ebenfalls auf am Transport, an der Adressierung und membranären Verankerung des LSR beteiligte Sequenzen beziehen.
Im Allgemeinen interessiert sich diese Erfindung ebenso für die normalen LSR Polypeptide wie für die mutierten LSR Polypeptide und für ihre Fragmente und die entsprechenden DNA- und RNA-Sequenzen, wobei die LSR Polypeptide die Polypeptide des Rezeptors nach der Erfindung bezeichnen.
Nach der Erfindung können die Fragmente von Nukleinsequenzen insbesondere für Bereiche der Rezeptoren und Polypeptide codieren, die eine Funktion oder eine biologische Aktivität, wie sie oben definiert ist, besitzen, Bereiche oder Regionen enthalten, die sich stromaufwärts oder -abwärts von der codierenden Sequenz befinden und regulierende Elemente der Expression des LSR Gens enthalten oder auch eine Sequenz besitzen, die ihre Verwendung als Sonde oder als Starter bei den Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung oder Amplifikation von Nukleinsequenzen erlaubt. Diese Fragmente weisen vorzugsweise eine Mindestgröße von 8, 10 Basen auf und man bevorzugt Fragmente mit 20 Basen, vorzugsweise 30 Basen.
Unter den Fragmenten, die, insbesondere für die Diagnostik, interessant sein können, sind insbesondere die intronischen genomischen Sequenzen des Gens des LSR Komplexes, wie insbesondere die Verbindungssequenzen zwischen den Introns und den Exons, die normalen oder mutierten, zu nennen.
Die Nukleinsäuresequenzen, die als Sens- und Antisens-Oligonukleotide verwendbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Sequenzen unter den Sequenzen nach der Erfindung ausgewählt werden, sind Teil der Erfindung.
Unter den interessanten Nukleinsäurefragmenten sind so insbesondere die Antisens-Oligonukleotide zu nennen, das heißt, deren Struktur durch Hybridisierung mit der Zielsequenz für eine Hemmung der Expression des entsprechenden Produktes sorgt. Zu nennen sind ebenfalls die Sens-Oligonukleotide, die durch Wechselwirkung mit den an der Regulierung der Expression des entsprechenden Produkts beteiligten Proteinen entweder zu einer Hemmung oder zu einer Aktivierung dieser Expression führen.
Die Mutationen enthaltenden Sequenzen, die an den Promotor- und/oder Regulatorsequenzen der Gene des LSR Komplexes beteiligt sein können, die Auswirkungen auf die Expression der entsprechenden Proteine, insbesondere auf ihr Expressionsniveau, haben können, gehören ebenfalls zu den vorhergehenden Sequenzen nach der Erfindung.
Die als Starter oder Sonde verwendbaren Nukleinsequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Nukleinsequenz eine Sequenz nach der Erfindung ist, gehören ebenfalls zu der Erfindung.
Diese Erfindung betrifft die gesamten Starter, die von den Nukleotidsequenzen der Erfindung abgeleitet werden können und die erlauben können, die genannten Nukleotidsequenzen der Erfindung nachzuweisen, insbesondere die mutierten Sequenzen, wobei insbesondere eine Methode zur Amplifikation wie die PCR-Methode oder eine ähnliche Methode angewendet wird.
Diese Erfindung betrifft die gesamten Sonden, die von den Nukleotidsequenzen der Erfindung abgeleitet werden können, insbesondere von den Sequenzen, die in der Lage sind, sich mit ihnen zu hybridisieren, und die erlauben können, die genannten Nukleotidsequenzen der Erfindung nachzuweisen, insbesondere die normalen Sequenzen von den mutierten Sequenzen zu unterscheiden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung als Sonde oder Starter für den Nachweis und/oder die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung.
Die gesamten Sonden und Starter nach der Erfindung können mit Hilfe dem Fachmann bekannter Verfahren markiert werden, um ein nachweisbares und/oder quantifizierbares Signal zu erhalten.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Nukleotidsequenzen, die nicht-natürliche Nukleotide enthalten können, insbesondere zum Beispiel schwefelhaltige Nukleotide oder der Struktur α oder β.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls selbstverständlich die DNA- wie RNA-Sequenzen sowie die Sequenzen, die sich mit ihnen hybridisieren, ebenso die entsprechenden Doppelstrang-DNA.
Im Folgenden werden die vorhergehenden DNA-Sequenzen Gene des LSR Komplex genannt werden, gleich ob es sich um normale oder pathologische Sequenzen handelt. Man muss wissen, dass diese Erfindung nicht die genomischen Nukleotidsequenzen in ihrer natürlichen chromosomischen Umgebung betrifft, das heißt in natürlichem Zustand. Es handelt sich um Sequenzen, die isoliert wurden, das heißt, dass sie direkt oder indirekt entnommen wurden, zum Beispiel durch Copy (cDNA), wobei ihre Umgebung mindestens teilweise modifiziert wurde.
So kann es sich sowohl um teilweise modifizierte genomische cDNA wie auch DNA handeln oder um eine, die in Sequenzen enthalten ist, die sich mindestens teilweise von den Sequenzen, die sie natürlich enthalten, unterscheiden.
Diese Sequenzen können ebenfalls als nicht-natürlich bezeichnet werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Methoden für die Musterung von Banken von cDNA und genomischer DNA, für die Klonierung der isolierten cDNA und/oder der Gene, die für den Rezeptor nach der Erfindung und für ihre Promotoren und/oder Regulatoren codieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsequenz nach der Erfindung verwenden. Von diesen Methoden sind insbesondere folgende zu nennen:

– die Musterung von cDNA-Banken und die Klonierung der isolierten cDNA (Sambrock et al., 1989; Suggs et al., 1981; Woo et al., 1979) mit Hilfe von Nukleinsequenzen nach der Erfindung;
– die Musterung von Banken mit Markierungen von 5' Enden (WO 96/34981) für Nukleinsequenzen nach der Erfindung und so die Isolierung von Markierungen, die die Klonierung vollständiger cDNA und der entsprechenden Promotoren anhand von Banken genomischer DNA erlaubt;
– die Musterung genomischer Banken, zum Beispiel von BACs (Chumakov et al., 1992; Chumakov et al., 1995) und gegebenenfalls eine genetische Analyse nach der FISH-Methode (Cherif et al., 1990) mit Hilfe von Sequenzen nach der Erfindung, die die Isolierung und die chromosomische Lokalisierung, anschließend die vollständige Sequenzierung der für den LSR Rezeptor codierenden Gene erlaubt.

Ebenfalls Teil der Erfindung ist eine Sequenz, insbesondere eine genomische Sequenz, die für einen Rezeptor oder ein Polypeptid nach der Erfindung codiert, oder eine Nukleinsäuresequenz eines Promotors und/oder Regulators eines Gens, das für einen Rezeptor oder ein Polypeptid nach der Erfindung codiert, oder eine ihrer allelischen Varianten, eine mutierte, äquivalente oder homologe Sequenz, oder eins ihrer Fragmente, dadurch gekennzeichnet, dass man sie mit Hilfe der vorhergehenden Methoden nach der Erfindung erhalten kann, oder eine Sequenz, die in der Lage ist, sich mit den genannten Sequenzen zu hybridisieren.
Vektoren, Wirtszellen und transgene Tiere
Die Erfindung umfasst ebenfalls die Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung enthalten.
Die Vektoren nach der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Elemente enthalten, die die Expression und/oder die Sekretion der genannten Sequenzen erlauben, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Die Vektoren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Promotor- und/oder Regulatorsequenz nach der Erfindung oder eine Sequenz der zellulären Adressierung nach der Erfindung oder eines ihrer Fragmente enthalten, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Die genannten Vektoren enthaften vorzugsweise einen Promotor, Start- und Endsignale der Translation sowie für die Regulierung der Transkription geeignete Regionen. Sie müssen in beständiger Form in der Zelle gehalten werden können und können gegebenenfalls besondere Signale besitzen, die die Sekretion des translatierten Proteins spezifizieren.
Diese verschiedenen Kontrollsignale werden je nach verwendeter Wirtszelle ausgewählt. Zu diesem Zweck können die Nukleinsäuresequenzen nach der Erfindung in Vektoren für eine autonome Replikation in einen ausgewählten Wirt oder in integrative Vektoren des ausgewählten Wirts inseriert werden. Unter den Systemen für eine autonome Replikation verwendet man vorzugsweise je nach verwendeter Wirtszelle Systeme vom Plasmid- oder Virustyp, wobei der Virusvektor insbesondere ein Adenovirus (Perricaudet et al., 1992), ein Retrovirus, ein Poxvirus oder ein Herpesvirus (Epstein et al., 1992) sein kann. Der Fachmann kennt die anzuwendenden Verfahren für jedes dieser Systeme.
Wenn man die Integration der Sequenz in die Chromosomen der Wirtszelle wünscht, kann man zum Beispiel Systeme vom Plasmid- oder Virustyp verwenden; ein solches Virus ist zum Beispiel das Retrovirus (Temin, 1986) oder die AAV (Carter, 1993).
Derartige Vektoren werden nach den normalerweise vom Fachmann angewandten Methoden hergestellt, und die dabei entstandenen Klone können mit Hilfe von Standardmethoden, zum Beispiel die Lipofektion, die Elektroporation, der thermische Schock, in einen geeigneten Wirt eingefügt werden.
Die Erfindung umfasst ferner die Wirtszellen, insbesondere die Eukaryonten und Prokaryonten, die durch die Vektoren nach der Erfindung transformiert wurden, sowie die transgenen Tiere, mit Ausnahme des Menschen, die eine der genannten transformierten Zellen nach der Erfindung enthalten.
Unter den zu diesen Zwecken verwendbaren Zellen kann man selbstverständlich die Bakterienzellen nennen (Olins und Lee, 1993), aber auch die Hefezellen (Buckholz, 1993), ebenso die Tierzellen, insbesondere die Kulturen von Säugetierzellen (Edwards und Aruffo, 1993) und insbesondere die Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO), jedoch ebenfalls die Zellen von Insekten, in denen man Verfahren anwenden kann, die zum Beispiel das Baculovirus einsetzen (Luckow, 1993). Ein für die Expression der Proteine der Erfindung bevorzugter zellulärer Wirt besteht aus den CHO-Zellen.
Unter den Säugetieren nach der Erfindung bevorzugt man Tiere wie Mäuse, Ratten oder Kaninchen, die ein Polypeptid nach der Erfindung exprimieren, wobei der Phänotypus dem normalen oder varianten LSR Rezeptor, insbesondere dem mutierten menschlichen Ursprungs, entspricht.
Unter den besonders interessanten Tiermodellen findet man hier insbesondere:

– die transgenen Tiere, die ein Defizit an einem der Bestandteile des LSR aufweisen. Man erhält sie mit Hilfe der homologen Rekombination an embryonalen Stammzellen, Transfer dieser Stammzellen in Embryos, Selektion der Chimären, die im Bereich der Keimbahnen eine Veränderung aufweisen, und Wachstum der genannten Chimären;
– die transgenen Mäuse, die ein oder mehrere der Gene des LSR Komplexes der Maus und/oder des Menschen überexprimieren. Die Mäuse erhält man mit Hilfe der Transfektion von Multicopies der Gene des LSR Komplexes unter der Kontrolle eines starken ubiquitären Promotors oder eines selektiven eines Gewebetyps, vorzugsweise der Leber;
– die transgenen Tiere (vorzugsweise Mäuse, bei denen ein Defizit an einem oder mehreren der Gene des LSR Komplexes durch Inaktivierung mit Hilfe des Systems LOXP/CRE Rekombinase (Rohlmann et al., 1996) oder mit Hilfe eines beliebigen anderen Systems der Inaktivierung der Expression eines Gens in einem bestimmten Alter des Tieres erzeugt wurde;
– die Tiere (vorzugsweise Ratten, Kaninchen, Mäuse), die ein oder mehrere der Gene des LSR Komplexes nach viraler Transkription oder Gentherapie überexprimieren;
– die Kreuzungen von Tieren mit einem LSR-Defizit (insbesondere Maus) mit Tieren, die ein Defizit an folgenden Stoffen aufweisen oder diese überexprimieren:
– LDL Rezeptor (Herz et al., 1995; Ishibashi et al., 1993),
– Leberlipase (Homanics et al., 1995; Kobayashi et al., 1996),
– Apoprotein B (Purcelhuynh et al., 1995; Fan et al., 1995),
– Apoprotein E (Plump et al., 1992; Zhang et al., 1992, Huang et al., 1996),
– ApoCII (Aalto-Setälä et al., 1992; Ito et al., 1990; Maeda et al., 1994).

Der Erhalt transgener Tiere und die viralen oder nicht-viralen Transfektionen werden bevorzugterweise an folgenden Ratten- und Mäuselinien durchgeführt:

– Ratte Zucker (fa/fa) Lida et al., 1996),
– Maus AKR/J (West et al., 1992),
– Maus ob/ob (Zhang et al., 1994),
– Maus ob2j/on2j) (ibid),
– Maus Tubby (Kleyn et al., 1996; Nobben-Trauth et al., 1996),
– fat/fat (Heldin et al., 1995),
– Maus Agouti (Lu et al., 1994; Manne et al., 1995),
– Maus db/db (Chen et al., 1996).

Die Zellen und Säugetiere nach der Erfindung sind in einem Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach der Erfindung, wie nachfolgend beschrieben wird, verwendbar und können ebenfalls als Analyse- und Musterungsmodell dienen.
Die transformierten Zellen oder Säugetiere, wie sie oben beschrieben sind, können so als Modelle verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen den Polypeptiden des LSR Komplexes, zwischen diesen und ihren Partnern, chemischen oder Proteinverbindungen, die direkt oder indirekt an den Aktivitäten des Rezeptors für Lipoproteine oder des Rezeptors für Zytokine und insbesondere für das Leptin beteiligt sind, zu untersuchen und um die verschiedenen Mechanismen und Wechselwirkungen je nach Art der Aktivität oder je nach dem, ob es sich um einen normalen Komplex handelt oder ob mindestens einer der Bereiche eine Variante ist, zu untersuchen.
Sie können vor allem für die Selektion von Produkten verwendet werden, die mit dem LSR Komplex oder einem seiner normalen oder veränderten Bereiche als Cofaktor oder Inhibitor, insbesondere als kompetitiver Inhibitor, interagieren oder eine Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität auf die Veränderungen der Konfiguration des LSR Komplexes haben. Vorzugsweise verwendet man die genannten transformierten Zellen als Modell, die insbesondere die Selektion von Produkten erlauben, die zur Bekämpfung der Fettleibigkeit oder oben genannter Erkrankungen dienen können. Die genannten Zellen können ebenfalls zum Nachweis der möglichen Risiken bestimmter Verbindungen verwendet werden.
Herstellung von Polypeptiden aus dem LSR Rezeptor
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Synthese von synthetischen oder rekombinanten Polypeptiden der Erfindung, insbesondere mit Hilfe der chemischen Synthese oder durch Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung.
Die Polypeptide nach dieser Erfindung können mit Hilfe der chemischen Synthese hergestellt werden, und zwar durch Anwendung einer beliebigen der zahlreichen bekannten Peptidsynthesen, zum Beispiel Methoden, bei denen Festphasen eingesetzt werden, oder Methoden, die partielle Festphasen verwenden, mit Hilfe der Kondensation oder mit Hilfe einer Synthese in klassischer Lösung.
Wenn die Verbindungen nach dieser Erfindung mit Hilfe der Methode in der Festphase synthetisiert wurden, ist die C-Terminal-Aminosäure auf einem festen reaktionslosen Träger gebunden und enthält Schutzgruppen ihrer Aminogruppe in alpha (und wenn dies erforderlich ist, Schutz an ihren seitlichen funktionalen Gruppen).
Am Ende dieser Stufe wird die Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe eliminiert und man lagert die zweite Aminosäure an, die ebenso den erforderlichen Schutz enthält.
Die N-terminalen Schutzgruppen werden eliminiert, nachdem jede Aminosäure gebunden wurde, man erhält hingegen selbstverständlich den Schutz an den Seitenketten aufrecht. Wenn die Polypeptidkette vollständig ist, spaltet man das Peptid von seinem Träger ab und eliminiert die seitlichen Schutzgruppen.
Das Syntheseverfahren in der Festphase ist dem Fachmann wohl bekannt. Siehe insbesondere Stewart et al., (1984) und Bodansky (1984).
Die mit Hilfe der chemischen Synthese hergestellten Polypeptide, die die entsprechenden nicht-natürlichen Aminosäuren enthalten können, sind ebenfalls ein Teil der Erfindung.
Das Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung in rekombinanter Form ist ebenfalls in dieser Erfindung enthalten und ist dadurch gekennzeichnet, dass man die transformierten Zellen, insbesondere die Zellen oder Säugetiere dieser Erfindung, unter Bedingungen züchtet, die die Expression eines rekombinanten Polypeptids, das von einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung codiert ist, erlauben und dass man das genannte rekombinante Polypeptid gewinnt.
Ebenfalls Teil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass bei diesem ein Vektor oder eine Wirtszelle verwendet wird, der oder die mindestens eine der Promotor- und/oder Regulatorsequenzen nach der Erfindung oder mindestens eine der Sequenzen der zellulären Adressierung nach der Erfindung oder eines ihrer Fragmente enthält.
Die rekombinanten Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mit Hilfe des genannten Herstellungsverfahrens erhalten werden können, sind ebenfalls ein Teil der Erfindung.
Die nach dem oben genannten Verfahren hergestellten rekombinanten Polypeptide können ebenso in Glycosylform oder Nicht-Glycosylform vorliegen und können eine natürliche tertiäre Struktur aufweisen oder auch nicht.
Diese Polypeptide können aus den oben definierten Nukleinsäuresequenzen nach den dem Fachmann bekannten Verfahren zur Herstellung rekombinanter Polypeptide hergestellt werden. In diesem Fall befindet sich die verwendete Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle von Signalen, die deren Expression in einer Wirtszelle erlauben.
Ein effizientes System zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids erfordert, dass man über einen Vektor und eine Wirtszelle nach der Erfindung verfügt.
Diese Zellen können hergestellt werden, indem man eine in einen Vektor, wie er oben definiert ist, inserierte Nukleotidsequenz in Wirtszellen einbringt und anschließend die genannten Zellen unter Bedingungen, die die Replikation und/oder die Expression der transfektierten Nukleotidsequenz erlauben, züchtet.
Die zur Reinigung von rekombinanten Polypeptiden angewandten Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Das rekombinante Polypeptid kann aus Lysaten und Zellextrakten, dem überstehenden Teil des Kulturmediums mit Hilfe einzeln oder in Kombination angewandter Verfahren wie die Fraktionierung, die Chromatografiemethoden, die Verfahren der Immunaffinität mit Hilfe von spezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern etc. ... gereinigt werden.
Eine bevorzugte Variante besteht darin, ein rekombinantes Polypeptid herzustellen, das mit einem „Trägerprotein" (chimäres Protein) vereinigt ist. Der Vorteil dieses Systems ist der, dass es eine Stabilisierung und eine Verringerung der Proteolyse des rekombinanten Produktes, eine Erhöhung der Löslichkeit während der in vitro Renaturierung und/oder eine Vereinfachung der Reinigung erlaubt, wenn der Fusionspartner eine Affinität für einen spezifischen Liganden besitzt.
Antikörper
Die mono- oder polyklonalen Antikörper oder ihre Fragmente, chimären Antikörper oder Immunkonjugate, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage sind, ein Polypeptid oder einen Rezeptor nach der Erfindung spezifisch zu erkennen, sind ein Teil der Erfindung.
Die spezifischen polyklonalen Antikörper können aus dem Serum eines Tieres gewonnen werden, das zum Beispiel gegen Folgendes immunisiert ist:

– den gereinigten LSR Rezeptor aus Zellmembranen, die den genannten Rezeptor aufweisen, mit Hilfe von dem Fachmann wohl bekannten Verfahren wie die Affinitätschromatografie, wobei zum Beispiel rekombinantes Leptin als spezifischer Ligand verwendet wird, oder
– ein Polypeptid nach der Erfindung, das insbesondere mit Hilfe der genetischen Rekombination oder mit Hilfe der Peptidsynthese nach gebräuchlichen Verfahren aus einer Nukleinsäuresequenz nach der Erfindung hergestellt wurde.

Es ist insbesondere auf die Bedeutung von Antikörpern hinzuweisen, die bestimmte Polypeptide, Varianten oder Fragmente, insbesondere biologisch aktive, nach der Erfindung spezifisch erkennen.
Die spezifischen monoklonalen Antikörper können nach dem von Köhler und Milstein 1975 beschriebenen Verfahren für die Kultur von Hybridomen hergestellt werden.
Die Antikörper nach der Erfindung sind zum Beispiel chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, Fragmente Fab oder F(ab')₂. Sie können ebenfalls als Immunkonjugate oder zwecks Erhalt eines nachweisbaren und/oder quantifizierbaren Signals als markierte Antikörper vorliegen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren für den Nachweis und/oder die Reinigung eins Polypeptids nach der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Antikörper nach der Erfindung verwenden.
Die Erfindung betrifft ferner gereinigte Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Hilfe eines Verfahrens nach der Erfindung erhalten werden.
Im Übrigen können die Antikörper der Erfindung außer zur Reinigung von Polypeptiden ebenfalls für den Nachweis dieser Polypeptide in einer biologischen Probe verwendet werden.
Sie sind ebenfalls ein Mittel für die immunzytochemische oder immunhistochemische Untersuchung der Expression von Polypeptiden des LSR Rezeptors an spezifischen Gewebeschnitten, zum Beispiel mit Hilfe der Immunfluoreszenz, Goldmarkierung, von enzymatischen Immunkonjugaten.
Sie erlauben insbesondere, eine anormale Expression dieser Polypeptide in den Geweben oder biologischen Proben nachzuweisen, was sie nützlich für den Nachweis einer anormalen Expression des LSR Rezeptors oder für die Beobachtung der Evolution von Methoden zur Prävention oder Behandlung macht.
Ganz allgemein können die Antikörper der Erfindung vorteilhafterweise in jeder Situation eingesetzt werden, in der die Expression eines Polypeptids des LSR Rezeptors, normal oder mutiert, beobachtet werden muss.
Nachweis der allelischen Variabilität und Diagnostik
Ebenfalls ein Teil der Erfindung sind die Verfahren zur Bestimmung einer allelischen Variabilität, einer Mutation, einer Deletion, einem Verlust von Heterozygotie oder einer genetischen Anomalie, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz oder einen Antikörper nach der Erfindung verwenden.
Diese Verfahren betreffen zum Beispiel die Diagnoseverfahren der Prädisposition zur Fettleibigkeit, zu damit verbundenen Risiken und zu mit Störungen des Zytokin-Stoffwechsels verbundenen Krankheiten, wobei anhand einer biologischen Probe des Patienten das Vorhandensein von Mutationen in mindestens einer der oben beschriebenen Sequenz nachgewiesen wird. Die analysierten Nukleinsäuresequenzen können ebenfalls der genomischen DNA, der cDNAc oder der mRNA sein.
Auf dieser Erfindung basierende Nukleinsäuren oder Antikörper können ebenfalls verwendet werden, um eine positive und differenzierende Diagnose bei einem isoliert genommenen Kranken zu erlauben. Die Nukleinsequenzen werden vorzugsweise für eine präsymptomatische Diagnose bei einem Risikopatienten verwendet, insbesondere mit einer Vorgeschichte in der Familie. Es ist ebenfalls möglich, eine vorgeburtliche Diagnose in Betracht zu ziehen.
Ferner kann der Nachweis einer spezifischen Mutation eine evolutive Diagnose erlauben, insbesondere in Bezug auf die Intensität der Erkrankung oder auf den wahrscheinlichen Zeitpunkt des Auftretens.
Die Verfahren, die den Nachweis einer Mutation in einem Gen im Vergleich zum natürlichen Gen erlauben, sind selbstverständlich sehr zahlreich. Man kann sie im Wesentlichen in zwei große Kategorien einteilen. Der erste Typ von Verfahren ist der, bei dem man das Vorhandensein einer Mutation durch einen Vergleich der mutierten Sequenz mit der entsprechenden natürlichen und nicht mutierten Sequenz nachweist, und der zweite Typ ist der, bei dem das Vorhandensein der Mutation indirekt nachgewiesen wird, zum Beispiel durch Nachweis von Fehlpaarungen auf Grund des Vorhandenseins der Mutation.
Bei diesen Verfahren können die in dieser Erfindung beschriebenen Sonden und Starter verwendet werden. Es handelt sich im Allgemeinen um gereinigte Hybridisierungs-Nukleinsequenzen, die mindestens 8 Nukleotide enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich spezifisch mit einer Nukleinsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, SEQ ID 9, SEQ ID 11, SEQ ID 13, SEQ ID 14, SEQ ID 15, SEQ ID 19 und SEQ ID 41, hybridisieren können. Vorzugsweise sind die spezifischen Hybridisierungsbedingungen so wie die, die in den Beispielen definiert sind, oder so, dass sie mindestens 95% Homologie gewährleisten. Die Länge dieser Hybridisierungs-Nukleinsequenzen kann zwischen 8, 10, 15, 20 oder 30 und 200 Nukleotiden variieren, insbesondere zwischen 20 und 50 Nukleotiden, bevorzugt zwischen 20 und 30 Nukleotiden.
Unter den Verfahren zum Nachweis einer allelischen Variabilität, einer Mutation, einer Deletion, einem Verlust der Heterozygotie oder einer genetischen Anomalie bevorzugt man die Verfahren, die mindestens eine sogenannte Amplifikationsstufe mit Hilfe der PCR (Kettenreaktion durch Polymerase) oder PCR-like der Zielsequenz nach der Erfindung, die eine Anomalie aufweisen kann, mit Hilfe eines Starterpaares von Nukleotidsequenzen nach der Erfindung umfasst. Die vervielfältigten Produkte können mit Hilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms behandelt werden, bevor man den Nachweis oder die Bestimmung des Zielproduktes vornimmt.
Unter PCR-like versteht man alle Verfahren, bei denen direkte oder indirekte Reproduktionen der Sequenzen von Nukleinsäuren eingesetzt werden oder auch bei denen die Markierungssysteme vervielfältigt wurden. Die Techniken sind selbstverständlich bekannt, im Allgemeinen handelt es sich um die Amplifikation der DNA durch eine Polymerase; wenn die Ausgangsprobe eine RNA ist, ist zuvor eine Reverstranskription vorzunehmen. Es gibt heute sehr zahlreiche Verfahren, die diese Amplifikation erlauben, zum Beispiel die sogenannten NASBA-Verfahren, „Nucleic Acid Sequence Based Amplification", (Compton, 1991), TAS „Transcription based Amplification System" (Guatelli et al., 1990), LCR „Ligase Chain Reaction" (Landegren et al., 1988), „Endo Run Amplification" (ERA), „Cycling Probe Reaction" (CPR) und SDA „Strand Displacement Amplification" (Walker et al., 1992), die dem Fachmann bekannt sind.
Die Erfindung betrifft ferner die Verfahren zur Diagnose von Krankheiten und/oder Pathogenesen im Zusammenhang mit einer anormalen Expression des Polypeptids und/oder Rezeptors nach der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Antikörper nach der Erfindung mit dem zu untersuchenden biologischen Material unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die eventuelle Bildung von spezifischen immunologischen Komplexen zwischen dem genannten Polypeptid und dem genannten Antikörper erlauben, und dass man die eventuell gebildeten immunologischen Komplexe nachweist.
Die Mutationen eines Gens oder eines der Gene des LSR Komplexes können für unterschiedliche Modifizierungen ihres Produkts oder ihrer Produkte verantwortlich sein, Modifizierungen, die für die Diagnostik verwendbar sind. Die Modifizierungen der Antigenizität können nämlich die Entwicklung spezifischer Antikörper erlauben. Die Unterscheidung der verschiedenen Konfigurationen des LSR kann mit Hilfe dieser Verfahren vorgenommen werden. Alle diese Veränderungen können dank mehrerer bekannter Verfahren, die auf der Verwendung mono- und polyklonaler Antikörper basieren, die das normale Peptid oder mutierte Varianten erkennen, wie zum Beispiel mit Hilfe von RIA oder ELISA, in der Diagnostik verwendet werden.
Diese Diagnoseverfahren betreffen ebenfalls die bildgebenden Diagnoseverfahren in vivo oder ex vivo, bei denen monoklonale oder polyklonale Antikörper nach der Erfindung verwendet werden, insbesondere die markierten, und die allen oder einem Teil der mutierten Polypeptide entsprechen (zum Beispiel Bildgebung mit Hilfe von Antikörpern, die an ein durch Bildgebung vom Typ PET-scan nachweisbares Molekül gekoppelt sind).
Musterung von Verbindungen, die von Interesse sind
Ebenfalls Teil der Erfindung sind die Verfahren zur Selektion von chemischen oder biochemischen Verbindungen, die in der Lage sind, direkt oder indirekt mit dem Rezeptor nach der Erfindung zu interagieren, und/oder erlauben, die Expression oder die Aktivität des genannten Rezeptors zu modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Rezeptor, eine Nukleinsäure, ein Polypeptid, einen Vektor, eine Zelle oder ein Säugetier nach der Erfindung verwenden.
Musterung von Verbindungen, die die Aktivität des LSR Rezeptors modifizieren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Musterung von Verbindungen, die die Aktivität des LSR Rezeptors modifizieren, das in der Messung der Auswirkung von Kandidatenverbindungen auf verschiedene Parameter besteht, die direkt oder indirekt, unabhängig voneinander oder in Kombination, eine Aktivität des LSR Rezeptors wiedergeben.
Für die Musterung von Verbindungen, die in der Lage sind, die LSR Aktivität der Clearance von Lipoproteinen zu modulieren, ist die bevorzugte wichtigste Auswirkung die Auswirkung der Verbindung auf die Aktivität der Bindung, der Internalisierung und des Abbaus von Lipoproteinen durch den LSR Rezeptor.
Diese Auswirkung kann in Abwesenheit oder in Gegenwart von freien Fettsäuren oder von jedem anderen Wirkstoff, der dafür bekannt ist, dass er die Aktivität des LSR auf die Clearance von Lipoproteinen herbeiführt oder hemmt, oder in Abwesenheit oder in Gegenwart von Leptin oder jedem anderen Wirkstoff, der in der Lage ist, die Funktion des LSR der Clearance von Zytokinen herbeizuführen oder zu hemmen, untersucht werden. Sie kann ferner in Abwesenheit oder in Gegenwart von Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Lipase-Aktivitäten entweder intrazellulär oder extrazellulär zu begünstigen oder zu vermindern, sowie in Gegenwart oder in Abwesenheit bekannter alternativer Wege des Abbaus von Lipoproteinen gemessen werden.
Es können ebenfalls verschiedene indirekte Parameter gemessen werden, darunter die folgenden:

– die durch die Verabreichung der Verbindung herbeigeführte Gewichtsveränderung,
– die durch die Verabreichung der Verbindung herbeigeführte Nahrungsaufnahme,
– die durch die Verabreichung der Verbindung herbeigeführte post-prandiale lipämische Reaktion während oder nach der Einnahme einer Mahlzeit, die zum Beispiel fettreich ist.

Man bevorzugt die Selektion von Verbindungen, die in der Lage sind, die Konzentrationen an Triglyzeriden im Plasma und/oder die Bindung, die Internalisierung und den Abbau von Lipoproteinen oder Partikeln mit hohem Triglyzeridgehalt in der Leber zu beeinflussen.
Für die Musterung von Verbindungen, die in der Lage sind, die LSR Aktivität der Clearance von Zytokinen, insbesondere von Leptin, zu modulieren, ist die bevorzugte wichtigste Auswirkung die Auswirkung der Verbindung auf die Aktivität der Bindung, der Internalisierung und des Abbaus von Zytokinen durch den LSR Rezeptor in der Leber in Abwesenheit oder in Gegenwart von freien Fettsäuren.
Die Messung der Bindung, Internalisierung und/oder des Abbaus von Lipiden oder Zytokinen kann zum Beispiel an Hepatozyten oder Fibroblasten in Kultur oder an jeder anderen Zelle, die an ihrer Oberfläche den LSR Rezeptor exprimiert, durchgeführt werden. Die Zellen sind vorzugsweise Zellen, die einen rekombinanten LSR Rezeptor exprimieren, insbesondere Zellen, die einen rekombinanten LSR Rezeptor exprimieren und wo der endogene LSR Rezeptor deaktiviert oder nicht vorhanden ist. Diese Zellen können den LDL Rezeptor exprimieren oder nicht.
Die Musterung von Verbindungen, die die LSR Aktivität modulieren, verwendet vorzugsweise Zellen oder Modelltiere nach der Erfindung, insbesondere der Maus, der Ratte oder des Menschen, insbesondere die oben oder in den folgenden Beispielen beschriebenen.
Musterung von Verbindungen, die die Expression des LSR Rezeptors modifizieren
Die Musterung kann angewendet werden, um Verbindungen zu testen, die in der Lage sind, das Niveau und/oder die Spezifität der Expression des LSR Rezeptors zu modifizieren, entweder indem sie sich kompetitiv an die Bindungsstellen der in dem LSR-Promotor befindlichen Transkriptionsfaktoren anlagern oder indem sie sich direkt an die Transkriptionsfaktoren anlagern.
Das Expressionsniveau des LSR Rezeptors und seine Lokalisierung können mit Hilfe der Hybridisierung in Lösung mit großen Sonden, wie in dem Patent PCT WO 97/05277 beschrieben wird, untersucht werden, wobei die Lehre dieser Druckschrift in der Literaturliste genannt ist. Kurz gesagt, wird eine genomische cDNA oder DNA des LSR Rezeptors oder auch ein Fragment derselben in eine Klonierungsstelle unmittelbar stromabwärts eines Promotors einer RNA Polymerase eines Bakteriophagen (T3, T7 oder SP6) inseriert, um eine Antisens-RNA herzustellen. Vorzugsweise enthält das Insert mindestens 100 aufeinanderfolgende Nukleotide der genomischen Sequenz des LSR Rezeptors oder einer der cDNA dieser Erfindung, insbesondere eine oder mehrere der cDNA mit SEQ ID 9, SEQ ID 11 oder SEQ ID 13. Das Plasmid wird linearisiert und in Gegenwart von Ribonukleotiden, die modifizierte Ribonukleotide wie Biotin-UTP und Digoxygenin-UTP enthalten, transkribiert. Ein Überschuss an dieser markierten RNA wird mit den aus Zellen oder interessanten Geweben isolierten mRNA in Lösung hybridisiert. Die Hybridisierungen werden unter stringenten Bedingungen durchgeführt (40–50°C für eine Dauer von 16 Std. in einer Lösung aus 80% Formamid, 0,4 M NaCl, pH 7–8). Die nicht-hybridisierte Sonde wird durch Verdauung mit den spezifischen Ribonukleasen der einsträngigen RNA (Rnasen CL3, T1, PhyMm U2 oder A) eliminiert. Das Vorhandensein modifizierter Nukleotide Biotin-UTP erlaubt das Einfangen von Hybriden auf Mikrotitrationsplatten, die Streptavidin enthalten. Das Vorhandensein der DIG Modifizierung erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung der Hybriden mit Hilfe von ELISA, wobei Anti-DIG-Antiköper, die an die alkalische Phosphatase gekoppelt sind, verwendet werden.
Eine quantitative Analyse der Expression des Gens des LSR Rezeptors kann ebenfalls durchgeführt werden, indem man DNA-Arrays verwendet, wobei das Ende des DNA-Array eine eindimensionale, zweidimensionale oder multidimensionale Anordnung einer Vielzahl von Nukleinsäuren, die eine ausreichende Länge aufweisen, um einen spezifischen Nachweis der Expression der mRNA, die in der Lage sind, sich zu hybridisieren, bezeichnet. Zum Beispiel können die DNA-Arrays eine Vielzahl von Nukleinsäuren enthalten, die von Genen abgeleitet sind, von denen man das Expressionsniveau bestimmen möchte. Die DNA-Arrays können die genomischen Sequenzen von LSR, die einer cDNA dieser Erfindung, inbesondere eine oder mehrere der cDNA mit SEQ ID 9, SEQ ID 11 oder SEQ ID 13, alle komplementären Sequenzen derselben oder alle Fragmente derselben einschließen. Vorzugsweise enthalten die Fragmente mindestens 15 oder mindestens 25, mindestens 50, mindestens 100 oder mindestens 500 aufeinanderfolgende Nukleotide der Nukleinsequenzen, von denen sie stammen.
Eine quantitative Analyse der Expression des LSR Rezeptors kann zum Beispiel mit einem DNA-Array, das die cDNA des LSR Rezeptors aufweist, wie bei Schena et al. (1995 und 1996) beschrieben wird, durchgeführt werden. cDNA des LSR Rezeptors oder Fragmente derselben werden mit Hilfe der PCR-Methode amplifiziert und aus einer 96-Loch-Mikroplatte auf einem sylatierten Objektträger fixiert, wobei ein sehr schneller Roboter verwendet wird. Das so hergestellte Array wird in einem Feuchtraum inkubiert, um die Rehydratisierung zu erlauben. Es wird anschließend ein Mal eine Minute lang in 0,2% SDS, zweimal 1 Minute lang in Wasser und ein Mal 5 Minuten lang in einer Lösung aus Natriumborhydrid gewaschen. Das Array wird dann 2 Minuten in Wasser von 95°C getaucht, 1 Minute lang in 0,2% SDS transferiert, zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Dunklen bei 25°C aufbewahrt.
Die mRNA von Zellen oder von Geweben werden isoliert oder im Handel erhalten, zum Beispiel von der Gesellschaft Clontech. Die Sonden werden mit Hilfe eines Reverstranskriptionzyklus hergestellt. Die Sonden werden anschließend an das DNA-Array von 1 cm² unter einem Deckglas 14 × 14 mm 6–12 Stunden lang bei 60°C hybridisiert. Das Array wird 5 Minuten bei 25°C in einer Waschpufferlösung mit geringer Stringenz (1 × SSC/0,2% SDS), anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem Puffer mit hoher Stringenz (0,1 × SSC/0,2% SDS) gewaschen. Das Array wird in 0,1 × SSC analysiert, wobei ein Laserfluoreszenzmikroskop mit einem geeigneten Satz von Filtern verwendet wird. Man erhält genaue Messungen der differentiellen Expression, indem man den Mittelwert der Verhältnisse von zwei unabhängigen Hybridsierungen nimmt.
Eine quantitative Analyse der Expression des LSR Rezeptors kann ebenfalls mit cDNA des LSR Rezeptors oder Fragmenten derselben an DNA-Arrays nach der Beschreibung von Pietu et al. (1996) durchgeführt werden. Die cDNA des LSR Rezeptors oder Fragmente derselben werden mit Hilfe der PCR-Methode amplifiziert und auf Membranen fixiert. Die von verschiedenen Geweben oder Zellen stammenden mRNA werden mit radioaktiven Nukleotiden markiert. Nach der Hybridisierung und dem Waschen unter kontrollierten Bedingungen werden die hybridisierten mRNA mit einem Phosphor Imager oder mit Hilfe der Autoradiographie nachgewiesen. Die Versuche werden als Doppelversuche durchgeführt und es kann eine quantitative Analyse der differentiell exprimierten mRNA vorgenommen werden.
Alternativ kann die Analyse der Expression des LSR Rezeptors mit DNA-Arrays mit hoher Dichte, wie sie Lockhart et al. (1996) und Sosnowski et al. (1997) beschrieben haben, durchgeführt werden. Oligonukleotide mit 15 bis 20 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 20 Nukleotiden, extrahiert aus den Sequenzen der genomischen DNA oder cDNA des LSR Rezeptors oder ihren komplementären Sequenzen werden direkt auf einem Chip synthetisiert oder werden synthetisiert und anschließend auf den Chip aufgebracht.
cDNA-Sonden des LSR, die mit einer geeigneten Verbindung wie Biotin oder Digoxigenin oder einem fluoreszierenden Molekül markiert sind, werden aus einer mRNA-Population synthetisiert und werden in Oligonukleotide mit durchschnittlich 50 bis 100 Nukleotiden fragmentiert. Die so erhaltenen Sonden werden an den Chip hybridisiert. Nach einem Waschen, wie es bei Lockhart et al. (1996) beschrieben wird, und einer Anwendung verschiedener elektrischer Felder (Sosnowski et al., 1997) werden die markierten Verbindungen nachgewiesen und quantifiziert. Die Hybridisierungen werden dupliziert. Eine vergleichende Analyse der Intensität der Signale, die von den Sonden auf einem Ziel-Oligonukleotid in verschiedenen cDNA-Proben erzeugt werden, ergibt eine differentielle Expression der mRNA des LSR Rezeptors.
Die oben genannten Verfahren erlauben die Analyse der Expressionsniveaus des LSR Rezeptors in ein und derselben Zelle und ein und demselben Gewebe unter unterschiedlichen Bedingungen, zum Beispiel Induktion oder nicht, jedoch ebenfalls die Analyse der Gewebespezifität dieser Expression unter Bedingungen, die ebenfalls variieren können. Dank dieser Verfahren kann man die Expression der einen oder anderen Untereinheit des LSR Rezeptors und ganz allgemein der verschiedenen aus dem alternativen Splicing hervorgegangenen Formen analysieren, indem man die Sonden entsprechend definiert.
Die Auswirkung der Kandidatenverbindungen auf die Modulation des Niveaus oder der Spezifität der Expression oder des Splicing der verschiedenen Formen des LSR Rezeptors kann so in großem Maßstab analysiert werden, indem man die Zellen, die Quellen von Messenger-RNA sind, insbesondere die Modellzellen nach der Erfindung, gleich ob sie den LSR natürlich exprimieren oder ob es rekombinante Zellen sind, mit den genannten Kandidatenverbindung in Kontakt bringt.
Musterung von Verbindungen, die mit dem LSR Rezeptor interagieren
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung besteht in Verfahren zur Identifizierung von Molekülen, die in der Lage sind, sich an den LSR Rezeptor zu binden. Derartige Moleküle können verwendet werden, um die Aktivität des LSR Rezeptors zu modulieren. Derartige Moleküle können zum Beispiel verwendet werden, um den Abbau von Lipoproteinen, vorzugsweise Lipoproteinen mit hohem Triglyzeridgehalt, oder Zytokinen, vorzugsweise Leptin, zu stimulieren oder zu verringern. Derartige Moleküle können ebenfalls verwendet werden, um die Aktivierung der LSR Aktivität durch Leptin oder durch freie Fettsäuren zu hemmen.
Es gibt zahlreiche Verfahren zur Identifizierung von Liganden des LSR Rezeptors. Eins dieser Verfahren wird in dem Patent US 5.270.170 beschrieben, dessen Lehre in der Literaturliste genannt ist. Kurz gesagt, man stellt eine Bank aleatorischer Peptide, die eine Vielzahl von Vektoren enthalten, die jeweils für eine Fusion zwischen einem Kandidatenpeptid für eine Bindung an den LSR Rezeptor codieren, und ein Protein her, das sich an die DNA anlagert, wie der Repressor Lac, der von dem Gen lacI codiert wird. Die Vektoren der Bank aleatorischer Peptide enthalten ebenfalls Bindungsstellen für die Proteine, die sich an die DNA anlagern, wie die Bindungsstelle LacO, wenn das Protein der Repressor Lac ist. Die Bank aleatorischer Peptide wird in eine Wirtszelle eingebracht, in der das Fusionsprotein exprimiert wird. Die Wirtszelle wird anschließend unter Bedingungen, die die Bindung des Fusionsproteins an die Bindungsstellen des Vektors erlaubt, lysiert.
Die Vektoren, die das Fusionsprotein gebunden haben, werden mit dem immobilisierten LSR Rezeptor, einer Untereinheit des immobilisierten LSR Rezeptors oder einem Fragment des immobilisierten LSR Rezeptors unter Bedingungen, die den Peptiden erlauben, sich spezifisch zu binden, in Kontakt gebracht. Zum Beispiel kann der LSR-Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren durch Bindung an eine Oberfläche wie z. B. ein Plättchen oder ein Kunststoffteilchen immobilisiert werden.
Die Vektoren, die für die Peptide codieren, die in der Lage sind, sich an den LSR Rezeptor zu binden, werden durch Wechselwirkungen zwischen dem Peptid und dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit des Rezeptors und einem Fragment desselben spezifisch an der Oberfläche zurückgehalten.
Alternativ können Moleküle, die in der Lage sind, mit dem LSR Rezeptor zu interagieren, identifiziert werden, indem man ein 2-Hybriden-System wie Matchmaker Two Hybrid System 2 verwendet. Entsprechend den Anweisungen des Handbuchs zum Matchmaker Two Hybrid System 2 (Katalog Nr. K1604-1, Clontech), dessen Lehre in der Literaturliste genannt ist, werden die Nukleinsäuren, die für den LSR Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren codieren, so in einen Expressionsvektor inseriert, dass sie in Phase mit der DNA sind, die für die Bindung des Aktivators der Transkription der Hefe GAL 4 mit der DNA codiert. Die Nukleinsäuren einer Bank, die für Proteine oder Peptide codiert, die in der Lage sind, mit dem LSR Rezeptor zu interagieren, werden so in einen zweiten Expressionsvektor inseriert, dass sie in Phase mit der DNA sind, die für den Aktivierungsbereich des Aktivators GAL4 codiert. Die Hefen werden durch die beiden Expressionsplasmide transformiert und werden in ein Milieu gebracht, das die Selektion von Zellen erlaubt, die in jedem der Vektoren enthaltene Marker exprimieren, oder die, die das Gen HIS3, dessen Expression von GAL4 abhängt, exprimieren. Die transformierten Zellen, die auf einem Milieu ohne Histidin wachsen können, werden für die Expression von LacZ in Abhängigkeit von GAL4 analysiert. Die Zellen, die ohne Histidin wachsen und LacZ exprimieren, enthalten ein Plasmid, das für Proteine oder Peptide codiert, die mit dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren interagieren.
Um die Wechselwirkung des LSR Rezeptors, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren mit kleinen Molekülen wie denen, die durch Kombinationschemie entstehen, zu untersuchen, ist es möglich, eine Mikrodialyse, gekoppelt an eine HPLC-Methode, wie sie bei Wang et al. (1997) beschrieben wird, oder eine Kapillar-Affinitätslektrophorese, wie sie bei Busch et al. (1997) beschrieben wird, wobei die Lehre in der Literaturliste genannt ist, anzuwenden.
In anderen Methoden können die Peptide oder kleinen Moleküle, die in der Lage sind, mit dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren zu interagieren, an nachweisbare Marker, wie zum Beispiel radioaktive, fluoreszierende oder enzymatische Marker, gebunden werden. Diese markierten Moleküle werden mit dem immobilisierten LSR Rezeptor, einer immobilisierten Untereinheit desselben oder einem immobilisierten Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren unter Bedingungen, die eine spezifische Wechselwirkung erlauben, in Kontakt gebracht. Nach Eliminierung der nicht-gebundenen Moleküle werden die gebundenen Moleküle mit Hilfe geeigneter Mittel nachgewiesen.
Diese Methoden können insbesondere die Identifizierung von Fettsäuren oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle der Fettsäuren auf dem LSR zu binden, von Lipoproteinen oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle der Lipoproteine auf dem LSR Rezeptor zu binden, von Derivaten des Leptins oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle des Leptins auf dem LSR zu binden, oder von Derivaten des Rezeptors gC1qR oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle von gC1qR auf dem LSR zu binden, erlauben.
Ferner können die Peptide oder kleinen Moleküle, die sich an den LSR, vorzugsweise an die Bindungsstellen der Fettsäuren, der Lipoproteine, der Zytokine, insbesondere des Leptins, oder von gC1qR oder einem seiner analogen Proteine auf dem LSR Rezeptor binden, mit Hilfe von Kompetitionsversuchen identifiziert werden. Bei derartigen Versuchen wird der LSR Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren auf einer Oberfläche wie einem Kunststoffträger immobilisiert. Steigende Mengen von Peptiden oder kleinen Molekülen werden mit dem immobilisierten LSR Rezeptor, einer immobilisierten Untereinheit desselben oder einem immobilisierten Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 und über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren in Gegenwart des markierten Liganden des Rezeptors in Kontakt gebracht, wobei dieser Ligand zum Beispiel das Leptin, das Oleat, die LDL oder gC1qR sein können. Der Ligand des LSR Rezeptors kann mit einem radioaktiven, fluoreszierenden oder enzymatischen Marker markiert werden. Die Fähigkeit des getesteten Moleküls zur Wechselwirkung mit dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestes 20, mindestens 30 und über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren wird mit Hilfe der Messung der in Gegenwart des getesteten Moleküls gebundenen Menge an markiertem Liganden bestimmt. Eine Verringerung der gebundenen Menge an Ligand in Gegenwart des getesteten Moleküls zeigt an, dass dieses in der Lage ist, mit dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren zu interagieren.
Diese Methoden können insbesondere die Identifizierung von Fettsäuren oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle der Fettsäuren auf dem LSR zu binden, von Lipoproteinen oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle der Lipoproteine auf dem LSR Rezeptor zu binden, von Derivaten des Leptins oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle des Leptins auf dem LSR zu binden, oder von Derivaten des Rezeptors gC1qR oder analogen Verbindungen, die in der Lage sind, sich an die Bindungsstelle von gC1qR auf dem LSR zu binden, erlauben. Man kann insbesondere die Fähigkeit derartiger Verbindungen oder jeder beliebigen Kandidatenverbindung, mit dem Oleat, den Lipoproteinen, dem Leptin oder gC1qR um die Bindung an den LSR zu konkurrieren, messen.
Die BIACORE-Methode kann ebenfalls zur Musterung von Verbindungen, die in der Lage sind, mit dem LSR Rezeptor zu interagieren, verwendet werden. Diese Methode wird bei Szabo et al. (1995) und Edwards und Leartherbarrow (1997) beschrieben, deren Lehre in der Literaturliste genannt ist, und erlaubt den Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Molekülen in Echtzeit ohne Verwendung einer Markierung. Sie basiert auf dem SPR-Phänomen (surface plasmon resonance). Kurz gesagt, wird das zu analysierende Molekül auf einer Oberfläche gebunden (wobei typischerweise ein Carboxymethyldextran-Array verwendet wird). Auf die Seite der Oberfläche, die nicht die Probe enthält, wird ein Lichtstrahl gerichtet und wird von dieser reflektiert. Das SPR-Phänomen führt zu einer Reduzierung der Intensität des reflektierten Lichtes mit einer spezifischen Kombination von Winkel und Wellenlänge. Die Geschehnisse bei der Bindung von Molekülen führen zu einer Veränderung des Brechungskoeffizienten an der Oberfläche, die wie eine Modifizierung des SPR-Signals nachgewiesen wird. Um eine Musterung von Verbindungen, die in der Lage sind, mit dem LSR Rezeptor zu interagieren, vorzunehmen, immobilisiert man den LSR Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren auf einer Oberfläche. Diese Oberfläche stellt eine Seite einer Zelle dar, in die das zu testende Molekül geht. Die Bindung des Moleküls auf dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren wird durch eine Veränderung des SPR-Signals nachgewiesen. Die getesteten Moleküle können Proteine, Peptide, Kohlenhydrate, Lipide oder kleine, durch die Kombinationschemie gebildete Moleküle sein. Die Kandidatenproteine können aus allen beliebigen Geweben von allen Spezies extrahiert werden. Die BIACORE-Methode kann ebenfalls angewendet werden, indem man Eukaryonten- oder Prokaryontenzellen oder Lipidvesikel, die einen endogenen oder rekombinanten LSR Rezeptor an ihrer Oberfläche aufweisen, immobilsiert.
Einer der größten Vorteile dieser Methode ist, dass sie die Bestimmung der Assoziationskonstanten zwischen dem LSR Rezeptor und den interagierenden Molekülen erlaubt. So ist es möglich, die Moleküle, die mit großen oder kleinen Assoziationskonstanten interagieren, spezifisch auszuwählen.
Die Proteine oder anderen Moleküle, die mit dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren interagieren, können identifiziert werden, indem man Affinitätssäulen verwendet, die den LSR Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren enthalten. Der LSR Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren kann an die Säule gebunden werden, indem man klassische Methoden, die die chemische Kopplung an ein geeignetes Säulen-Array wie die Agarose, Affi Gel, oder andere dem Fachmann bekannte Arrays einschließen, anwendet. Unter einem anderen Aspekt der Erfindung kann die Affinitätssäule chimäre Proteine enthalten, in denen der LSR Rezeptor, eine Untereinheit desselben oder ein Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren zum Beispiel mit dem Gluthation S-Transferase fusioniert ist. Die zu testenden oben beschriebenen Moleküle werden anschließend auf die Säule gebracht. Die mit dem LSR Rezeptor, einer Untereinheit desselben oder einem Fragment desselben mit mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder über 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren interagierenden Moleküle werden auf der Säule zurückgehalten und können durch Eluierung isoliert werden. Wenn die getesteten Moleküle Proteine sind, können sie anschließend auf einem Elektrophoresegel 2-D, wie Ramunsen et al. (1997) beschreiben, deren Lehre in der Literaturliste genannt ist, analysiert werden. Alternativ können die auf der Affinitätssäule zurückgehaltenen Proteine oder anderen Moleküle mit Hilfe der Elektrophorese gereinigt und sequenziert werden. Eine ähnliche Methode kann angewandt werden, um Antikörper zu isolieren, um „Phage Display"-Produkte oder menschliche Antikörper aus dem „Phage Display" zu mustern.
Musterung von Verbindungen, die mit den Promotor- und/oder Regulatorsequenzen des LSR Rezeptors interagieren
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zur Musterung von Verbindungen, die mit den Promotor- und/oder Regulatorsequenzen des LSR Rezeptors interagieren.
Die Nukleinsäuren, die für Proteine, die mit den Promotor- und/oder Regulatorsequenzen des LSR Rezeptors interagieren, codieren, insbesondere eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1 bis 1897 mit SEQ ID 19 entspricht, oder ein Fragment derselben können identifiziert werden, indem man ein Ein-Hybrid-System, wie das in dem Handbuch zum Kit Matchmaker One-Hybrid-System von Clontech (Katalog Nr. K1603-1) beschriebene, dessen Lehre in der Literaturliste genannt ist, verwendet. Kurz gesagt, wird die Ziel-Nukleotidsequenz stromaufwärts von einem auswählbaren Markergen kloniert und in ein Hefegenom integriert. Die das integrierte Markergen enthaltenden Hefen werden mit Hilfe einer Bank, die Fusionen zwischen cDNA, die für Kandidatenproteine für die Bindung auf Promotor- und/oder Regulatorbereiche des Gens des Rezeptors codieren, und dem Aktivatorbereich eines Transkriptionsfaktors der Hefe wie GAL4 enthält, transformiert. Die Hefen werden in ein Milieu gebracht, das die Selektion von Zellen, die das Markergen exprimieren, erlaubt. Die selektionierten Hefen enthalten ein Fusionsprotein, das in der Lage ist, sich auf der Zielregion des Promotors und/oder Regulators zu binden. Die cDNA der Gene, die für die Fusionsproteine codieren, werden anschließend sequenziert. Die entsprechenden Inserts können dann in Expressions- oder Transkriptionsvektoren in vitro kloniert werden. Die Bindung der so codierten Polypeptide an die Zielsequenzen des Promotors kann mit Hilfe dem Fachmann bekannter Methoden bestätigt werden, darunter die Versuche durch Verlangsamung auf Gel oder Schutz mit DNAse.
Die Musterung von Verbindungen, die in der Lage sind, die Expression des LSR Rezeptors zu modifizieren, indem sie sich an Regulator- und/oder Promotorsequenzen binden, kann ebenfalls mit Hilfe von Reportergenen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine am 5' Ende der codierenden Sequenz des LSR Rezeptors befindliche Genomregion, insbesondere eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1 bis 1897 mit SEQ ID 19 oder einem Fragment derselben entspricht, in einen Vektor wie pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Enhancer oder pEGFP-1, die bei Clontech verfügbar sind, kloniert werden. Kurz gesagt, enthält jeder dieser Vektoren Mehrfachklonierungsstellen, die sich stromaufwärts von einem Markergen, das für ein leicht nachweisbares Protein wie die alkalische Phosphatase, die β-Galactosidase oder das GFP (green fluorescent protein) codiert, befinden. Nach Inserierung der Genomregion am 5' Ende der codierenden Sequenz des LSR Rezeptors, insbesondere eine Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 1 bis 1897 mit SEQ ID 19 entspricht, oder ein Fragment derselben, wird das Expressionsniveau der Markerproteine gemessen und mit einem kein Insert enthaltenden Vektor verglichen. Die Auswirkung von Kandidatenverbindungen auf die von Regulator- und/oder Promotorsequenzen des LSR ausgehende Expression kann so beurteilt werden.
Die Musterung von Verbindungen, die in der Lage sind, sich auf Regulator- und Promotorregionen des Gens des LSR Rezeptors zu binden, können ebenfalls mit Hilfe dem Fachmann bekannter Versuche der Verlangsamung auf Gel, die bei Fried und Crothers (1981), Garner und Revzin (1981) und Dent und Latchman (1993) beschrieben werden, deren Lehre in der Literaturliste genannt ist, durchgeführt werden. Diese Versuche basieren auf dem Prinzip, dass ein an ein Protein gebundenes DNA-Fragment langsamer wandert als dasselbe Fragment ohne Protein. Kurz gesagt, die Ziel-Nukleotidsequenz wird markiert. Anschließend wird sie entweder mit einem Kernextrakt oder mit ganzen Zellen, die so hergestellt werden, dass sie die Transkriptionsfaktoren enthalten, oder mit verschiedenen zu testenden Verbindungen in Kontakt gebracht. Die Wechselwirkung zwischen der Regulator- und/oder Promotorregion des Gens des LSR Rezeptors und der Verbindung oder dem Transkriptionsfaktor wird mit Hilfe der Elektrophorese durch Verlangsamung der Wanderung nachgewiesen.
Verbindungen
Die chemischen oder biochemischen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Modulation der Expression oder der Aktivität des erfindungsgemäßen Rezeptors erlauben, bilden ebenso einen Bestandteil der Erfindung.
Die chemischen oder biochemischen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage sind, direkt oder indirekt mit dem erfindungsgemäßen Rezeptor zu interagieren, bilden einen Bestandteil der Erfindung.
Die chemischen oder biochemischen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch die obenstehend definierten Verfahren ausgewählt werden, bilden ebenso einen Bestandteil der Erfindung.
Insbesondere wird von den erfindungsgemäßen Verbindungen ein Leptin oder eine seiner abgeleiteten Verbindungen, vorzugsweise eine seiner Proteinvarianten, oder die Leptine, die chemisch modifiziert oder durch genetische Rekombination erhalten wurden oder eines ihrer Fragmente bevorzugt.
Man kann durch Verbindungen, die es gestatten, die Expression oder Aktivität des Rezeptors zu modulieren, Verbindungen konstruieren, die es insbesondere gestatten, die Zahl, die Umsatzgeschwindigkeit und/oder den Konformationswechsel des erfindungsgemäßen Rezeptors zu reduzieren, zu stabilisieren oder zu erhöhen oder die gesamte Aktivität oder die Aktivität einer der Domänen des Rezeptors zu begünstigen oder zu inhibieren oder überdies die normale Expression des Rezeptors wiederherzustellen, z. B. im Falle, wenn eine genetische Anomalie festgestellt wurde. Diese Verbindungen können als spezifische Liganden des Rezeptors oder einer seiner Domänen interagieren, z. B. in der Eigenschaft als Kofaktor oder Inhibitor, insbesondere kompetitiv, oder überdies mit einer agonistischen oder antagonistischen Aktivität auf Konformationsänderungen des Komplexes. Diese Verbindungen können ebenso durch Neutralisieren der spezifischen natürlichen Liganden des Rezeptors interagieren und auf diese Weise die Aktivität des Rezeptors inhibieren, die durch seine Liganden induziert wurde.
Von diesen Verbindungen werden die Verbindungen bevorzugt, die es erlauben, die Zahl der Polypeptide des Rezeptors, seine Umsatzgeschwindigkeit und/oder die Selektivität seiner Aktivität zu modulieren.
Es werden ebenso die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Erhöhung der Gesamtaktivität oder der Expression des erfindungsgemäßen Rezeptors und/oder eine spezifische Erhöhung der Rezeptoraktivität der Zytokinclearance, insbesondere der Leptinclearance und/oder eine spezifische Erhöhung der Rezeptoraktivität der Lipoproteinclearance erlauben.
Ebenso werden die Verbindungen bevorzugt, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Verminderung der Gesamtaktivität oder der Expression des erfindungsgemäßen Rezeptors und/oder eine spezifische Verminderung der Rezeptoraktivität der Zytokinclearance, insbesondere der Leptinclearance und/oder eine spezifische Verminderung der Rezeptoraktivität der Lipoproteinclearance erlauben.
Ebenso sind die Verbindungen bevorzugt, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Modulation der Zytokinelimination erlauben, insbesondere des Leptins, und/oder eine Modulation der Elimination von Lipoproteinen, von Rückständen von Chylomikronen und/oder von Triglyzeriden.
Die Erfindung umfasst ebenso die erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Modulation des Verhältnisses von Zytokinen, insbesondere der Leptinämie und/oder eine Modulation des Verhältnisses von Lipoproteinen, von Rückständen von Chylomikronen und/oder von Triglyzeriden erlauben.
Stärker bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kontrolle des Verhältnisses von Zytokinen erlauben, insbesondere der Leptinämie.
Auf eine ebensolche Weise bevorzugt umfasst die Erfindung die erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kontrolle, vorzugsweise eine Verminderung des Verhältnisses von Lipoproteinen, eine Verminderung der Plasmakonzentration von Resten von Chylomikronen und/oder eine Verminderung der Triglyzeridämie erlauben.
Von den am meisten bevorzugten Verbindungen werden diejenigen bevorzugt, gekennzeichnet dadurch, dass sie ausgewählt sind aus:

a) einem erfindungsgemäßen Antikörper;
b) einem erfindungsgemäßen Polypeptid;
c) einem erfindungsgemäßen Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es einer löslichen Form des erfindungsgemäßen Rezeptors entspricht;
d) einem erfindungsgemäßen Vektor;
e) einem erfindungsgemäßen Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er auf der äußeren Oberfläche eine spezifische Erkennungsstelle für Leberzellen präsentiert;
f) einem erfindungsgemäßen Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsprodukt der Nukleinsäure, die durch den Vektor in die Zielzelle inseriert wurde, entweder in der transformierten Zielzelle gebunden oder durch die transformierte Zielzelle ausgeschieden wird;
g) einem erfindungsgemäßen Sense- oder Antisense-Oligonukleotid;
h) einem Leptin, oder einer seiner Proteinvarianten oder einem Leptin, das chemisch oder durch genetische Rekombination modifiziert wurde oder einem seiner Fragmente.

Die Erfindung betrifft schließlich die erfindungsgemäßen Verbindungen als Medikament.
Insbesondere werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Medikament für die Prävention und/oder die Behandlung von Krankheiten und/oder der Entstehung von Krankheiten, die mit Störung des Ernährungsverhaltens verbunden sind, bevorzugt.
Ebenso werden erfindungsgemäße Verbindungen als Medikament zur Prävention und/oder zur Behandlung von Krankheiten und/oder der Entstehung von Krankheiten, die mit Störungen des Zytokinmetabolismus verbunden sind, bevorzugt.
Auf dieselbe Weise bevorzugt betrifft die Erfindung ebenso die erfindungsgemäßen Verbindungen als Medikament für die Prävention oder für die Behandlung von Fettleibigkeit oder Anorexie.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen als Medikament für die Prävention und/oder für die Behandlung von Krankheiten und/oder der Entstehung von Krankheiten, die mit Fettleibigkeit assoziiert sind oder durch Fettleibigkeit induziert werden, sind bevorzugte Verbindungen.
Insbesondere werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Medikament für die Prävention und/oder für die Behandlung der Herzinsuffizienz, der Koronarinsuffizienz, der Apoplexie, der atheromatösen Krankheit, der Atherosklerose, der arteriellen Hypertension, des insulinunabhängigen Diabetes, der Hyperlipidämie und/oder der Hyperurikämie bevorzugt.
Am meisten bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen als Medikament für die Prävention und/oder die Behandlung der Atheromatose und/oder der Atherosklerose.
Schließlich umfasst die Erfindung erfindungsgemäße Verbindungen für die gentherapeutische Prävention und/oder für die gentherapeutische Behandlung von Krankheiten und/oder der Entstehung von Krankheiten, die mit Störungen des Ernährungsverhaltens verbunden sind, der Fettleibigkeit und/oder von Krankheiten und/oder der Entstehung von Krankheiten, die mit der Fettleibigkeit assoziiert sind oder durch die Fettleibigkeit induziert werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen als aktive Grundbestandteile eines Medikaments sind bevorzugt in flüssiger Form, verbunden mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Solche Verbindungen, die als Medikament verwendbar sind, bieten einen neuen Ansatz für die Vorbeugung und/oder für die Behandlung der Krankheiten und/oder der Entstehung der Krankheiten, die mit Störung des Ernährungsverhaltens verbunden sind, wie die Fettleibigkeit oder die Anorexie und die damit verbundenen Risiken und/oder Komplikationen.
Vorzugsweise werden diese Verbindungen systemisch verabreicht, insbesondere intravenös, intramuskulär, intradermal oder oral.
Ihre Verabreichungsweisen, Dosierungen und optimale galenische Formen können gemäß der generellen Kriterien bestimmt werden, die bei der Festlegung einer Behandlung in Betracht gezogen werden, die an einen Patienten adaptiert ist, wie z. B. das Alter oder das Körpergewicht des Patienten, die Schwere seines generellen Zustandes, die Toleranz gegenüber der Behandlung und festgestellte Nebeneffekte, etc...
Wie vorher erwähnt, kann es je nach dem Fall angemessen sein, die Aktivität des LSR zu verstärken, z. B. in pathologischen Fällen, die von der Tatsache herrühren, dass wenigstens eines seiner Gene nicht exprimiert, unzureichend exprimiert oder in einer anormalen Form exprimiert wird, die es nicht erlaubt, dass das Genprodukt seine Funktionen erfüllt, durch Befördern der Expression seiner Gene oder durch Erhöhen der Aktivität seiner Genprodukte, oder im Gegenteil eine Überexpression oder eine anormale Expression dieser Gene zu reprimieren. Es ist folglich angemessen, auf generelle Weise den Mangel oder die Überexpression von Genprodukten dieses Genes durch eine „Ersatz"-Therapie zu beseitigen, die die Verstärkung oder die Verminderung von Aktivitäten des LSR Komplexes erlaubt.
Die „Ersatz"-Therapie kann in den Fällen, wo eines der Gene z. B. unzureichend exprimiert wird oder auch, wenn es in einer anormalen Form exprimiert wird, durch Gentherapie verwirklicht werden, d. h. durch Einführen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der entsprechenden Gene mit Elementen, die ihre Expression in vivo erlauben.
Die Grundsätze der Gentherapie sind bekannt. Man kann erfindungsgemäße virale Vektoren verwenden; es ist ebenso möglich, nicht-virale Vektoren vorzusehen, d. h. synthetische Vektoren, die die viralen Sequenzen nachahmen oder die auch aus nackter DNA oder RNA gemäß der Technik gebildet werden, die besonders durch die VICAL-Gesellschaft entwickelt wurde.
In den meisten Fällen müssen Zielelemente vorgesehen werden, die eine spezifische Expression der Leber auf eine Weise sicherstellen, die die Expressionsgebiete von in die Leptinclearance und die Lipoproteinclearance mit einbezogenen Proteinen beschränken zu können. Es ist ebenso interessant, in bestimmten Fällen Vektoren zur transienten Expression oder wenigstens zur kontrollierten Expression zu haben, die man blockieren kann, wenn es notwendig ist.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung erscheinen in der Fortsetzung der Beschreibung mit den Beispielen und den Abbildungen, deren Legenden nachstehend dargestellt sind.
LEGENDE DER ABBILDUNGEN
1: Schematische Darstellung der drei Formen des LSR-Proteins der Ratte: LSR 66 (Untereinheit α), LSR 64 (Untereinheit α') und LSR 58 (Untereinheit β).
2: Alignment der Proteinsequenzen der langen Formen (Untereinheiten α) des menschlichen LSR (LSR1.Hs), der Ratte (LSR1.Rn) und der Maus (LSR1.Mm). Die Symbole (*) unter dem Alignment bezeichnen die konservierten Aminosäuren, die Symbole (.) bezeichnen die konservativen Substitutionen der Aminosäuren. Vom NH₂-terminalen Ende bis zum COOH-terminalen Ende, die mögliche Bindungsstelle von Fettsäuren (FFA) eingerahmt, die Bindungsstelle für Clathrin [NPGY], der auf Lysosomen gerichtete Konsensus: Dileucin LI-X10-LL, die Transmembrandomäne TM durch Überstrich gekennzeichnet, das Motiv [RSRS], und die mögliche Bindungsstelle von Lipoproteinen (+–+–) eingerahmt. Durch Überstrich ist das Muster des TNF-Rezeptors mit (Pfeil) gekennzeichnet; wobei die konservierten Aminosäuren im Muster angezeigt sind. Die transmembrane Domäne ist zwischen dem letzten Dileucin und dem TNF-Muster gelegen.
3: Alignment von Proteinsequenzen der drei Typen von Untereinheiten des menschlichen LSR (α: LSR1.Hs; α': LSR2.Hs; β: LSR3.Hs). Die Bedeutung der Symbole, der Einrahmungen und der Überstriche ist dieselbe wie in 2.
4: Alignment von Proteinsequenzen der drei Typen von Untereinheiten des LSR der Ratte. Die Bedeutung der Symbole, der Einrahmungen und der Überstriche ist dieselbe wie in 2.
5: Alignment von Proteinsequenzen der drei Typen von Untereinheiten des LSR der Maus. Die Bedeutung der Symbole der Einrahmungen und der Überstriche ist dieselbe wie in 2.
6: Schematische Darstellung der drei Formen des LSR, die beim Menschen nachgewiesen sind und die die konservierten Motive in jeder von ihnen anzeigt.
A: Schematische Darstellung der genomischen Organisation des menschlichen LSR vom ersten kodierenden Exon an. Die Exons sind durch Kästen angezeigt, die Introns durch unterbrochene Striche. Die Größe der Exons und der Introns ist in Nukleotiden über ihnen angegeben. Die Elemente, die den Boten und das kodierte Protein kennzeichnen, sind in die Abbildung übertragen. Der Rahmen auf der rechten Seite gibt die Bedeutung der verwendeten Symbole an.
B: Struktur der Form LSR-Hs-2062 des menschlichen LSR. Diese Form kodiert für ein Protein mit 649 Aminosäuren.
C: Struktur der Form LSR-Hs-2005 des menschlichen LSR. Diese Form kodiert für ein Protein mit 630 Aminosäuren.
D: Struktur der Form LSR-Hs-1858 des menschlichen LSR. Diese Form kodiert für ein Protein mit 581 Aminosäuren.
7: Alignment der Nukleotidsequenzen der langen Formen der cDNA (kodierend für die Untereinheit α) des menschlichen LSR (Isr1.Hs), der Ratte (Isr1.rRn) und der Maus (Isr1.Mm). Die konservierten Nukleotide in den 3 Sequenzen sind durch ein Zeichen * unter den Sequenzen markiert. Striche sind im Inneren der Sequenzen hinzugefügt, wenn das optimale Alignment der Sequenzen nur Mikrodeletionen erzeugen kann.
8: Identifikation des LSR Rezeptors durch Liganden- und Western-Blotting von solubilisierten Proteinen von Membranen der Leber der Ratte (Spuren 1, 2 und 4) oder von dem 240 kD-Protein, das teilweise gereinigt wurde (Spur 3).
Spuren 1, 2 und 3: Ligandenblotting. Spur 1: In Abwesenheit von Oleat und von ¹²⁵I-LDL; Spur 2: In Anwesenheit von Oleat und von ¹²⁵I-LDL; Spur 3: In Anwesenheit von Oleat und von ¹²⁵I-LDL.
Spur 4: Western-Blotting mit Anti-LSR-Antikörpern.
9: Wirkungen von Anti-LSR-Antikörpern auf die LSR Aktivität.
A. Bindung von ¹²⁵I-LDL an die Plasmamembranen von Hepatozyten der Ratte in Anwesenheit von Oleat und ansteigenden Konzentrationen von Anti-LSR-Antikörpern (
) oder Kontrollantikörpern (☐), ausgedrückt als Prozent der Gesamtmenge des gebundenen ¹²⁵I-LDL in Abwesenheit von Antikörper.
B. Bindung, Inkorporation und Abbau von ¹²⁵I-LDL in Hepatozyten der Ratte in Primärkultur in Anwesenheit von Oleat und Anti-LSR-Antikörper (
) oder Kontrollantikörper (☐), jeweils ausgedrückt als% der Gesamtbindung, der Gesamtinkorporation und des Gesamtabbaus von ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit unspezifischer Antikörper.
10: Identifikation des LSR Rezeptors durch Immunopräzipitation von Lysaten von Hepatozyten markiert mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein, in Anwesenheit eines Kontrollantikörpers (Spur 1) oder eines Anti-LSR-Antikörpers (Spuren 2 bis 4) nach Trennung durch Elektrophorese in nicht-reduzierenden Bedingungen (Spuren 2 und 3) oder reduzierenden Bedingungen (Spur 1 und 3).
11: Klonierung der cDNA kodierend für das LSR α und β.
A. Northern-Blot-Analyse, die mehrere Größen der Boten-RNA von LSR zeigt.
B. Northern-Blot-Analyse mit vielen Geweben von mRNA von LSR mit einer Sonde, die spezifisch für LSR ist und einer Kontrollsonde, die spezifisch für das β-Aktin ist.
C. Analyse von mRNA des LSR mit RT-PCR unter Verwendung von 5 Primerpaaren, die die gesamte Sequenz abdecken und Nachweis der 3 Formen, die das Ergebnis des alternativen Splicings im Amplifikationsfragment sind, das mit dem Primerpaar bc' erhalten wurde. Das Schema stellt die Ergebnisse der Sequenzanalyse der drei entsprechenden cDNA-Formen von LSR dar: die karierte Region ist in den zwei kurzen Formen abwesend, die schraffierte Region ist einzig in der kürzesten Form abwesend.
12: in vitro-Translation der beiden kompletten cDNAs kodierend für die längste Form (66 kDa, Spur 2) und die kürzeste Form (58 kDa, Spur 3) des LSR der Ratte und einer Kontroll-cDNA, die zur cDNA kodierend für die längste Form des LSR gegensinnig ist (Spur 1).
Die in vitro Translationsprodukte, die durch ³⁵S-Methionin markiert sind, werden nach Elektrophorese bei nicht-reduzierten Bedingungen analysiert.
13: Identifikation der LSR-Untereinheiten α und β, die für die LSR Aktivität verantwortlich sind.
A. Schema, das die Lokalisation und die Sequenz des N-terminalen Peptids von LSR zeigt, das zur Generierung von Antikörpern gegen das LSR-Peptid verwendet wurde.
B. Western- und Ligandenblotting der Untereinheiten α und β des LSR. Das Western-Blotting wird unter Verwendung des Anti-LSR-Antikörpers (Spur 1) oder des Antikörpers gegen das LSR-Peptid (Spur 2) durchgeführt. Das Ligandenblotting wird in Anwesenheit von ¹²⁵I-LDL mit (Spur 4) oder ohne (Spur 3) Oleat durchgeführt.
C. Wirkung eines Antikörpers gerichtet gegen ein synthetisches LSR-Peptid auf die LSR Aktivität von Plasmamembranen der Leber der Ratte. Die LSR Aktivität wird in Anwesenheit eines Kontrollantikörpers (☐) oder des Antikörpers gegen das LSR-Peptid gemessen (
).
14: Identifikation der Untereinheiten des LSR Rezeptors und inhibitorische Wirkung eines Antikörpers gerichtet gegen ein synthetisches C-terminales Peptid, das aus LSR hervorgegangen ist.
A- Schema, das die Lokalisation und die Sequenz des synthetischen Peptids 170 zeigt.
B- Western-Blotting von Lysaten von Hepatozyten der Ratte unter Verwendung der Antikörper gerichtet gegen das synthetische Peptid 170 (Spur 2) oder eines Kontrollantikörpers (Spur 1); Spur 3: Molekulargewichtsmarker.
C- Bindung von ¹²⁵I-LDL durch den LSR Rezeptor in Anwesenheit von Oleat und von Kontrollantikörper oder Antikörper gerichtet gegen das LSR-Peptid 170.
15: Wirkung einer transienten Transfektion von CHO-K1-Zellen mit den Plasmiden, die die Untereinheiten α und β des LSR Rezeptors exprimieren, auf die Bindung von LDL in Anwesenheit oder Abwesenheit von Oleat. Ansteigende Konzentration von Plasmid α allein (❍☐); feste Konzentration von Plasmid α und ansteigende Konzentration von Plasmid β (
).
16: Wirkung einer transienten Transfektion von CHO-K1-Zellen mit den Plasmiden, die die Untereinheiten α und β des LSR Rezeptors exprimieren, auf die Internalisierung und den Abbau von LDL. Ansteigende Konzentration von Plasmid α allein (
); feste Konzentration von Plasmid α und ansteigende Konzentration von Plasmid β (
). Die Ergebnisse werden als Differenz der Messwerte in Anwesenheit und Abwesenheit von Oleat ausgedrückt.
17: Charakterisierung der LSR Aktivität aus CHO-K1-Zellen, die transient mit Nukleinsäuresequenzen transfiziert wurden, die für die Untereinheiten α und β des LSR Rezeptors kodieren, verglichen mit der LSR Aktivität aus denselben Zellen, die nicht-transfiziert wurden (Kontrolle).
A- Bindung von ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit eines Kontrollantikörpers oder eines Anti-LSR-Antikörpers.
B- Bindung von ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von nichtmarkierten Lipoproteinen; Chylomikronen der Ratte (♦), menschlichen VLDL (
), LDL (☐), HDL (
), LDL behandelt mit Pronase (❍) oder LDL modifiziert durch Cyclohexandion (LDL-chd,
).
18: Wirkung von Oleat, RAP-39, von Anti-LSR-Antikörpern und von Chloroquin auf den spezifischen Abbau des Leptins in Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte.
19: Western-Blot-Analyse mit Anti-LSR-Antikörpern von der Proteinfraktion der Plasmamembran der Leber der Ratte, die auf einer Säule zur Affinitätschromatographie zurückgehalten wurde und die das Leptin enthält.
20: Clearance des ¹²⁵I-Leptins in Kontrollmäusen (☐), ob/ob- (
) und db/db-Mäusen ( ) in der Leber und der Niere. Die Ergebnisse werden als Differenz zwischen den Mengen von ¹²⁵I-Leptin und von ¹²⁵I-β2-Mikroglobulin ausgedrückt, die in der Leber und in der Niere wiedergefunden werden.
21: Scheinbare Anzahl der exprimierten LSR Rezeptoren in der Leber von Kontrollmäusen, ob/ob- und db/db-Mäusen.
22: Wirkung von Anti-LSR-Antikörpern auf das Verhältnis der Mengen von ¹²⁵I-Leptin, verteilt in der Leber und in der Niere.
23: Wirkung von ansteigenden Leptinkonzentrationen auf die LSR Aktivität von Hepatozyten der Ratte in Primärkultur. Die Ergebnisse stellen die Differenzen der Aktivität von Zellen dar, die mit oder ohne Oleat in Anwesenheit von entweder ¹²⁵I-LDL oder ¹²⁵I-VLDL inkubiert wurden.
24: Die Fähigkeit des Leptins zur Induktion der LSR Aktivität von Hepatozyten der Ratte in Primärkultur.
A. Anzahl der scheinbaren exprimierten Rezeptoren auf der Oberfläche von Hepatozyten in Anwesenheit oder in Abwesenheit von Leptin, abgeschätzt durch die Messung der Menge von ¹²⁵I-LDL gebunden in Anwesenheit von Oleat.
B. Wirkung von Cycloheximid, von Colchicin und von Cytochalasin B auf die Induktion der LSR Aktivität durch das Leptin.
25: Wirkung des Leptins auf die lipämische postprandiale Antwort bei Kontrollmäusen (❍), ob/ob- (
) und db/db-Mäusen (☐), wiedergespiegelt durch den Verlauf der Plasmakonzentration von Triglyzeriden (TG) nach Einnahme einer fettreichen Mahlzeit, mit einer (B) und ohne eine (A) Injektion von rekombinantem Leptin der Maus.
26: Wirkung des Leptins in Anwesenheit und Abwesenheit von Laktoferrin auf die lipämische postprandiale Antwort der ob/ob-Maus, ausgedrückt durch die Messung der Plasmakonzentration von Triglyzeriden (TG) nach Einnahme einer fettreichen Mahlzeit.
27: Wirkung einer Leptininjektion auf die scheinbare Zahl der LSR Rezeptoren, die in der Leber der ob/ob- und db/db-Maus exprimiert wurden.
28: Lipämische postprandiale Antwort und LSR Aktivität bei Kontrollmäusen (C57BL6), ob/ob- und db/db-Mäusen.
A- Gewicht von männlichen Kontrollmäusen, ob/ob- und db/db-Mäusen.
B- Lipämische postprandiale Antwort der Kontrollmaus, der ob/ob- und db/db-Maus.
C- Scheinbare Anzahl von LSR Rezeptoren, abgeschätzt durch die Messung der Bindung von LDL und ausgedrückt in willkürlichen Einheiten durch Vergleich mit der Aktivität von 5'-Nukleotidase in jeder Plasmamembranpräparation.
D- Northern-Blot eines RNA-Gesamtextrakts der Leber. Die GAPDH wird als Kontrolle verwendet.
29: Wirkung einer Langzeitbehandlung mit Leptin auf ob/ob-Mäuse.
A- Gewichtsveränderung in 30 Tagen.
B- Lipämische postprandiale Antwort am 29. Behandlungstag.
C- Scheinbare Anzahl von LSR Rezeptoren am Tag 30, abgeschätzt durch die Messung der Bindung von LDL und ausgedrückt in willkürlichen Einheiten durch Vergleich mit der Aktivität von 5'-Nukleotidase in jeder Plasmamembranpräparation.
D- Northern-Blot-Analyse der LSR-Expression mit einem Extrakt der gesamten RNA der Leber. GAPDH und Aktin werden als Kontrollen verwendet.
30: Wirkung der Oleate auf die Bindung und die Internalisierung der ¹²⁵I-LDL in normalen menschlichen Fibroblasten unter normalen Bedingungen.
31: Wirkung von ansteigenden Leptinkonzentrationen auf die LSR Aktivität von menschlichen FH-Fibroblasten (familiäre Hypercholesterolämie).
32: Inhibitorische Wirkung eines Antikörpers gerichtet gegen ein NH₂-terminales (
) oder COOH-terminates (❍) Peptid von gC1qR oder von Kontrollantikörpern (☐) auf die LSR Aktivität von Plasmamembranen von Hepatozyten der Ratte, ausgedrückt als Prozentwert der Menge von ¹²⁵I-LDL gebunden in Abwesenheit von Antikörpern.
33: Wirkung von ansteigenden Konzentrationen von C1q auf die Bindung, Internalisierung und den Abbau von ¹²⁵I-LDL in Hepatozyten der Ratte in Primärkultur, in Anwesenheit (
) oder Abwesenheit (☐) von Oleat.
34: Wirkung von 25 ng/ml von rekombinantem AdipoQ auf die LSR Aktivität in einer Primärkultur von Hepatozyten der Ratte.
35: Wirkung von zwei aufeinanderfolgenden Injektionen von 1 mg AdipoQ auf die lipämische postprandiale Antwort bei der Ratte nach Einnahme einer fettreichen Mahlzeit.
36: Wirkung der intraperitonealen Verabreichung von AdipoQ über drei Tage auf das Gewicht und die plasmatischen Triglyzeridkonzentrationen von Ratten bei normaler Lebensweise oder fetter Diät.
37: Wirkung einer täglichen Injektion von 100 μg AdipoQ über 5 Tage auf die Nahrungsaufnahme bei fettleibigen ob/ob- und db/db-Mäusen.
BEISPIELE
Experimentelle Verfahren
Material
Na¹²⁵I wurde von Amersham (Les Ulis, Frankreich) geliefert. Ölsäure, Rinderserumalbumin (A 2153) (BSA) und Triton X-100 stammen von Sigma (St Quentin Fallavier, Frankreich). Das menschliche Laktoferrin (Serva) und das Natriumheparin wurden von Biowhittaker (Fontenay sous Bois, Frankreich) bzw. von den Choay-Laboratorien (Gentilly, Frankreich) geliefert. Die enzymatischen Kits für die Bestimmung von Triglyzeriden (TG) stammen von Boehringer Mannheim (Meylan, Frankreich). Das Natriumsuramin wurde von CBC Chemicals (Woodburg, CT) erhalten. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das Trypsin und das fötale Kälberserum wurden von Life Technologies, Inc. (Eragny, Frankreich) geliefert.
Tiere
Die Mäuse C57BL/6J-Wildtyp, C57BL/6J ob/ob, C57BL/Ks Wildtyp und C57BL/Ks db/db werden vom R. Janvier Breeding Center (Le Genest St Isle, Frankreich) erhalten.
Zellen
Normale Fibroblasten (GMO8333) und FH-Fibroblasten (GM00486A, GM007001B, GM00488C) werden vom NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository (Camden, NJ) geliefert. Die Zellen werden in 36 mm-Petrischalen ausgesäht wie vorher beschrieben (300.000 normale Fibroblasten pro Loch, 150.000 FH-Fibroblasten pro Loch) und werden in einem Inkubator in feuchtem CO₂ in DMEM-Medium kultiviert, das 10% (normale Fibroblasten) oder 20% (FH-Fibroblasten) fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 u/ml Penicillin und 100 u/ml Streptomycin enthält.
Die Hepatozyten in Primärkultur werden nach dem zuvor beschriebenen Protokoll (Mann et al., 1995) erhalten. Darauf werden die Zellen zu 900.000 Zellen pro Loch oder 22 × 10⁶ Zellen pro 165 cm²-Flasche ausgesäht. Die Zellen werden für die Studien nach 48 Stunden in Kultur verwendet.
Präparation und Radiomarkierung von Lipoproteinen
Die VLDL (d < 1,006 g/ml) und LDL (1,025 < d < 1,055 g/ml) werden durch sequentielle Ultrazentrifugation aus frischem Plasma von Freiwilligen isoliert (Bihain und Yen, 1992; Goldstein et al., 1983) und vor Ablauf von 2 Wochen verwendet. Die Lipoproteine werden radioiodiniert (Bilheimer et al., 1972) und weniger als eine Woche nach der Markierung verwendet. ¹²⁵I-LDL und ¹²⁵I-VLDL werden unmittelbar vor der Verwendung filtriert (Membran 0,22 μm, Gelman).
Präparation und Radiomarkierung des rekombinanten Leptins der Maus
Die cDNA von Leptin wird aus mRNA von Fettgewebe der C57BL/6J-Maus durch PCR erhalten. Der 5' PCR-Primer führt ein Startkodon nach der Signalsequenz, die deletiert ist, und eine Sequenz, die für ein Hexahistidinende kodiert, ein. Die modifizierte Sequenz, die für das Mäuseleptin kodiert, wird in einen Expressionsvektor pSE280 (Invitrogen, Frankreich) kloniert und in E. coli exprimiert. Die Sequenzierung der Plasmid-DNA bestätigt die kodierende Sequenz. Die Bakterien werden bei 37°C kultiviert, und die Synthese des Proteins wird durch 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert. Die Bakterien, die nach milder Zentrifugation zurückgewonnen werden, werden durch Gefrieren-Auftauen lysiert, und die DNA wird durch eine Desoxyribonuclease I verdaut. Die Zellmembranen werden mit Hilfe eines Detergents extrahiert, und die Inklusionskörper werden nach Zentrifugation abgetrennt. Nach 3 Wäschen in PBS mit einem 1% Natriumdesoxycholat werden die Inklusionskörper in einer Lösung von 6 M Guanidin-HCl solubilisiert. Die Renaturierung des rekombinanten Proteins wird durch Verdünnung auf 1/100 in PBS ausgeführt. Das renaturierte Protein wird danach mit einer Affinitätschromatographiesäule mit Nickel zur Bildung von Metallchelaten (Probond, Invitrogen) gereinigt und konzentriert. Die Eluation wird mit Imidazol ausgeführt. Die Reinheit des rekombinanten Leptins wird durch SDS-PAGE-Elektrophorese kontrolliert, und seine Aktivität wird durch Abschätzung der Sättigung bei C57BL/6J ob/ob-Mäusen nach intraperitonealer Injektion von 25 μg Leptin kontrolliert. Das rekombinante Leptin wird danach unter Verwendung von Iodo-Beads (Pierce) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Methode radiomarkiert.
Klonierung der mRNA von AdipoQ. Produktion und Reinigung von rekombinanten AdipoQ-Proteinen
Klonierung von cDNA in einem Expressionsvektor
Fettgewebe der Maus wird von C57BL/6J-Mäusen erhalten, und die mRNA wird mit Hilfe von Poly-dT extrahiert, das auf magnetischen Kügelchen (Dynabeads, Dynal, Frankreich) gebunden ist. Eine cDNA-Bank wird aus Fettgewebe der Maus durch reverse Transkription bei 40°C unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Superscript Life Technologies) konstruiert, wobei den Anweisungen des Verkäufers gefolgt wird. Die cDNA, die für AdipoQ spezifisch ist, wird unter Verwendung der beiden folgenden Primer amplifiziert:
5' CTACATGGATCCAGTCATGCCGAAGAT 3' (SEQ ID 37)
5' CGACAACTCGAGTCAGTTGGTATCATGG 3' (SEQ ID 38).
Das Amplifikationsprodukt wird dann durch die Restriktionsenzyme BamH1 und Xho1 verdaut und in einen Expressionsvektor pTRC HisB (Invitrogen, Frankreich) in die entsprechenden Stellen inseriert. Die Version B von pTRC erlaubt die Expression von heterogenen Sequenzen stromabwärts eines Hexahistidin-Peptids, das eine Erkennungsstelle für eine Enterokinase und ein Epitop für den Anti-Xpress-Antikörper trägt.
Bakterielle Transfektion und Verifikation der Konstruktion
Das so erhaltene Plasmid wird in E.Coli DII5 α transfiziert. Außerdem wird die Plasmid-DNA extrahiert und das heterologe Insert wird sequenziert.
Zellkultur, Extraktion und Reinigung des rekombinanten Proteins
Die rekombinanten Bakterienzellen werden bei 37°C in einem LB-Medium, das Antibiotika enthält, kultiviert, bis die OD bei 600 nm 0,2 erreicht. Die Produktion des rekombinanten Proteins wird dann durch Hinzufügen von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid in die Kultur induziert. Die Bakterienkultur läßt man für 16 Stunden bei 37°C wachsen. Die Zellen werden durch Zentrifugation zurückgewonnen. Die Lyse der Zellen wird durch Verwendung von Lysozym in einem Trispuffer pH 7,4 in Gegenwart von NaCl, PMSF und Natriumdesoxycholat durchgeführt. Die DNA wird durch Sonifikation abgebaut. Nach der Zentrifugation wird das rekombinante Protein vom Überstand durch eine Probond-Säule (Invitrogen, Frankreich) getrennt. Diese Säule enthält geladenes Nickel, das eine Affinität für Hexahistidin-Peptide hat. Die Eluation wird in Anwesenheit von Imidazol ausgeführt. Die Proteinkonzentration wird durch die Methode von Lowry abgeschätzt, nachdem das Eluationsprodukt dialysiert wurde. Die Reinheit des erhaltenen Proteins wird durch SDS-PAGE-Elektrophorese getestet, die eine einzige Bande ergibt.
Beispiel 1: Identifikation des Proteinkomplexes, der für die LSR Aktivität verantwortlich ist: teilweise Reinigung und Charakterisierung mittels polyklonaler Antikörper
Die Technik des Ligandenblottings wurde verwendet, um den Proteinkomplex zu identifizieren, der für die LSR Aktivität verantwortlich ist. Diese Technik, beschrieben im Detail durch Mann et al., 1995, wird unten stehend ausführlich dargelegt.
Ligandenblotting
Die Technik besteht aus der Isolation der Membranen der Leber der Ratte durch differentielle Zentrifugation (Belcher et al., 1987) und aus der Solubilisation der Membranproteine in einer Lösung, die 125 mM Octylglucosid, 20 mM Tris und 2 mM EDTA pH 8 enthält. Die so solubilisierten Proteine werden unter nicht-denaturierenden Bedingungen auf einem präparativen SDS-Gel (Dicke 5 mm) getrennt, das einen Gradienten von 4 bis 12% Polyacrylamid bildet (35–50 mg Protein pro Gel). Darauf werden die Proteine für einen Teil des Gels auf eine Nitrocellulosemembran elektrotransferiert (Transfer halbtrocken, 21 V, 45 min, Biorad). Nach Blockierung der freien Stellen auf dieser Membran in einer PBS-Lösung, die 3% Albumin enthält, wird die Membran mit 40 μg/ml ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit (8, Spur 2) oder Abwesenheit (8, Spur 1) von 0,8 mM Oleat inkubier. Darauf wird die Membran fünfmal für 10 min in PBS enthaltend 0,5% (v/v) von Triton x100 gewaschen und auf dem Schirm eines Phosphorimagers exponiert.
Die Analyse des Bildes, das in Anwesenheit (8, Spur 2) oder Abwesenheit (8, Spur 1) von Oleat erhalten wurde, weist die Anwesenheit von 3 Hauptbanden nach, die die LDL gebunden haben. Das scheinbare Molekulargewicht der ersten Bande ist ungefähr 240 kDa, dasjenige der zweiten Bande ist 115 kDa und dasjenige der dritten ist 90 kDa. Auf der Basis dieser Beobachtungen werden zwei Hypothesen vorgebracht: einerseits ist die LSR Aktivität mit der Anwesenheit mehrerer verschiedener Proteine verknüpft; andererseits kann derselbe Bildertyp durch eine multimerische Organisation des Proteinkomplexes erklärt werden.
Um diese Hypothese zu verifizieren, haben die Erfinder die Reinigung der Bande unternommen, die das höchste scheinbare Molekulargewicht zeigt (240 kDa). Die teilweise Reinigung dieses Proteins, das mit „Bande A" bezeichnet wird, wird durch präparative Elektrophorese wie folgt ausgeführt.
Teilweise Reinigung des LSR
Die Technik besteht aus der Isolation der Membranen der Leber der Ratte durch differentielle Zentrifugation (Belcher et al., 1987) und aus der Solubilisation der Membranproteine in einer Lösung, die 125 mM Octylglucosid, 20 mM Tris und 2 mM EDTA pH 8 enthält. Die so solubilisierten Proteine werden unter nicht-denaturierenden Bedingungen auf einem präparativen SDS-Gel (Dicke 5 mm) getrennt, das einen Gradienten von 4 bis 12% Polyacrylamid bildet (35–50 mg pro Gel). Darauf werden die Proteine für einen Teil des Gels auf eine Nitrocellulosemembran elektrotransferiert (Transfer halbtrocken, 21 V, 45 min, Biorad). Nach Blockierung der freien Stellen auf dieser Membran in einer PBS-Lösung, die 3% Albumin enthält, wird die Membran mit 40 μg/ml ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit (8, Spur 2) oder Abwesenheit (8, Spur 1) von 0,8 mM Oleat inkubiert. Darauf wird die Membran fünfmal für 10 min in PBS enthaltend 0,5% (v/v) von Triton x100 gewaschen und auf dem Schirm eines Phosphorimagers exponiert. Die interessierenden Proteine werden elektroeluiert (Elektroeluter, Biorad).
Die Proteine der Plasmamembran der Leber der Ratte wurden präpariert und auf einem Polyacrylamidgel wie oben stehend getrennt. Die präzise Lokalisation der Bande A wurde durch Ligandenblotting festgestellt, das nach dem Elektrotransfer der Probe des präparativen Gels, die an verschiedenen Stufen entnommen wurde, ausgeführt wurde.
Die Fragmente des Gels, die die Bande A enthalten, wurden darauf entnommen, elektroeluiert und konzentriert (Speed-Vac), dann auf ihre Fähigkeit getestet, LDL in Anwesenheit von Oleat nach Elektrophorese und Transfer auf Nitrocellulosemembranen zu binden (8, Spur 3; 80 μg Protein pro Spur).
Die so erhaltenen Proteine wurden außerdem zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern verwendet, deren Spezifität durch Western-Blotting getestet wurde (8, Spur 4).
Herstellung von polyklonalen Antikörpern
Die LSR-Proteine, die als Antigene für die Produktion von Anti-LSR-Antikörpern verwendet wurden, wurden hergestellt wie oben stehend angezeigt.
Die Antigenpräparation wird subkutan in Anwesenheit des kompletten Freundschen Adjuvans in ein Kaninchen injiziert, wobei einem klassischen Immunisierungsprotokoll gefolgt wird. Der Titer der Antikörper, die gegen die Proteine der Ratte gerichtet sind, wird regelmäßig bestimmt (Dot-Blot-Technik). Da letzteres für ausreichend erachtet wird, wird die Spezifität von erhaltenen Antikörpern durch Western-Blotting mit einer Präparation solubilisierter Proteine von Membranen der Leber der Ratte, so beschaffen wie diejenigen oben stehend beschriebenen, mit Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern der Ziege als sekundäre Antikörper getestet, die mit Jod I¹²⁵ markiert sind.
Die Ergebnisse des Western-Blots nach Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigen an, dass die Antikörperprodukte von den Proteinen der Bande A an drei Hauptproteinbanden binden (240 kDa, 115 kDa und 90 kDa), die die ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit von Oleat binden (8, Spur 4). Um die Beziehung zwischen diesen Proteinkomplexen und der LSR Aktivität zu verifizieren, wurde die Wirkung dieser polyklonalen Antikörper auf die LSR Aktivität getestet.
Die verwendeten Methoden werden im Detail unten stehend beschrieben (Mann et al., 1995, Troussard et al., 1995). Die Aktivität des LSR wird durch Messung der Bindung von Lipoproteinen an die Plasmamembranen und durch Messung der Bindung, der Internalisierung und des Abbaus von Lipoproteinen in Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte abgeschätzt.
Messung der Bindung von Lipoproteinen an Plasmamembranen
Die Aktivität des LSR wird mit einer Präparation von Plasmamembranen der Leber der Ratte gemessen (Bartles und Hubbard, 1990). Diese Membranen zeigen eine 10 bis 15fache Anreicherung von 5-Nukleotidase (spezifischer Marker von Plasmamembranen). Aliquots von 100 μg Protein werden für 30 min bei 37°C in Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,8 mM Oleat in einem Endvolumen von 250 μl inkubiert, das durch 100 mM PBS, 2 mM EDTA, 350 mM NaCl, pH 8 komplettiert wurde (Puffer A). Das Oleat wird einem Volumen von 5 bis 10 μl Isopropanol hinzugefügt. Das nicht fixierte überschüssige Oleat wird darauf durch 6 Wäschen entfernt. Die Bodensätze werden in 250 μl Inkubationspuffer resuspendiert, 5 Sekunden mit Ultraschall behandelt, Leistung 1,90% des aktiven Zyklus, dann 15 min bei 18.000 rpm zentrifugiert. Die aktivierten Membranen werden für 1 Stunde bei 4°C mit verschiedenen Antikörperkonzentrationen inkubiert, dann ferner mit 5 μg/ml ¹²⁵I-LDL (1 Stunde bei 4°C). 25 μl 2% BSA werden zur Inkubationsmischung hinzugefügt. Nachdem 200 μl der Inkubationsmischung auf ein Bett von 5% (Gewicht/Volumen) BSA in Puffer A gebracht wurde, wird die Menge von ¹²⁵I-LDL, die an die Membranen gebunden ist, durch Sedimentation der Membranen durch Zentrifugation gemessen. Die Überstände werden durch Absaugen entfernt, die Böden der Röhrchen werden abgeschnitten und die Radioaktivität wird in einem γ-Zähler gezählt.
Der inhibitorische Effekt von Anti-LSR-Antikörpern auf die LSR Aktivität, verglichen mit derjenigen einer beliebigen Präparation von Immunglobulinen des Kaninchens wird in 9A gezeigt. Die Inhibition der LSR Aktivität durch die Anti-LSR-Antikörper bestätigt, dass der oben stehend beschriebene multimere Komplex für die Aktivität des Rezeptors verantwortlich ist und validiert die Technik des Ligandenblottings, die verwendet wurde, um dies zu identifizieren. Die Wirkung von Anti-Bande A-Antikörpern wurde außerdem bei den anderen Schritten der Rezeptoraktivität getestet: Bei der Internalisierung und dem Abbau von Lipoproteinen durch das LSR, das auf der Oberfläche von Hepatozyten in Primärkultur exprimiert war.
Messung der Bindung, der Internalisierung und des Abbaus von Lipoproteinen durch Hepatozyten
Die LSR Aktivität in den Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte wird durch die Bindung, die Internalisierung und den Abbau von ¹²⁵I-LDL und von ¹²⁵I-VLDL gemessen (LDL: Lipoprotein geringer Dichte; VLDL: Lipoproteine sehr geringer Dichte), wie beschrieben in Bihain und Yen, 1992 und Mann et al., 1995.
Für die Messung der Wirkung von Anti-LSR-Antikörpern auf die Bindung, die Internalisierung und den Abbau von LDL durch den LSR werden Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte (48 Stunden nach Aussähen) in Anwesenheit von 20 ng Leptin/Loch für 30 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Hinzufügung von Anti-LSR-Antikörper in Anwesenheit oder Abwesenheit von Oleat. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min wird das ¹²⁵I-LDL (20 μg/ml) hinzugefügt, dann werden die Zellen für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bindung, die Inkorporation und der Abbau des ¹²⁵I-LDL werden wie bei Bihain und Yen, 1992 und Mann et al., 1995 beschrieben gemessen.
Die Tatsachen der 9B zeigen, dass die Anti-Bande A-Antikörper den größten Teil der Bindungsaktivität des LDL an die LSR inhibieren, die auf der Ebene der Hepatozyten vorhanden sind. Diese Inhibition induziert eine Verminderung der Internalisierung und des proteolytischen Abbaus von Lipoproteinen in denselben Verhältnissen.
Die Anti-Bande A-Antikörper werden so charakterisiert wie Anti-LSR. Ihre relative Spezifität wurde durch eine selektive Immunopräzipitationsmethode definiert. Extrakte von Hepatozyten aus Primärkultur werden mittels vorher beschriebener Anti-LSR-Antikörper gemäß dem unten stehend beschriebenen Protokoll immunopräzipitiert.
Immunopräzipitation von Extrakten von Hepatozyten in Anwesenheit von spezifischen Antikörpern
Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte (Oukka et al., 1997) werden für 60 Minuten bis 2 Stunden in Anwesenheit eines Gemisches von ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein (Promix, Amersham) inkubiert. Dieses Medium wird darauf abgenommen, und die Zellen werden gewaschen, dann in PBS, enthaltend 1% Triton X100, inkubiert. Dies zelluläre Lysat wird darauf in Anwesenheit von nicht-spezifischen Antikörpern, dann in Anwesenheit von Protein A inkubiert. Das Äquivalent von 40 μg spezifischer Anti-LSR-Antikörper wird darauf hinzugefügt, und die LSR-Antikörper-Komplexe werden mit Hilfe einer zweiten Präparation von Protein A präzipitiert. Nach Waschen werden die Komplexe in Anwesenheit von 1% SDS dissoziiert, das durch 5% β-Mercaptoethanol supplementiert ist oder nicht, bei 100°C für 5–10 min inkubiert und auf einem 10%igen Acrylamidgel getrennt. Die Gele werden getrocknet und auf dem Schirm eines Phosphorimagers exponiert. Jede Spur enthält das Äquivalent einer 165 cm²-Flasche, d. h. 22 × 10⁶ Zellen.
Die Analyse der Ergebnisse der Immunopräzipitation zeigt an, dass bei nicht-reduzierten Bedingungen (10, Spuren 2 – ohne Inkubation bei 100°C – und 3 – mit Inkubation bei 100°C –), die Antikörper 3 Hauptproteinbanden offenbaren: 2 mit scheinbarem Molekulargewicht von 240 kDa und 180 kDa, 1 mit scheinbarem Molekulargewicht von 68 kDa. Es wird ebenso die Anwesenheit von 2 Banden mit schwächerer Intensität angemerkt, die einem Molekulargewicht von 115 kDa und 90 kDa entsprechen. Dieser experimentelle Ansatz weist folglich im wesentlichen dieselben Proteinelemente nach wie diejenigen, die durch die Methode des Ligandenblotting identifiziert wurden. Es wird übrigens beobachtet, dass unter reduzierten Bedingungen (10, Spuren 1 und 4) die Elemente mit hohem Molekulargewicht in 3 Elemente mit scheinbarem Molekulargewicht von 68 kDa, 56 kDa bzw. 35 kDa dissoziieren.
Die relativen Intensitäten der Banden von 68 kDa und 56 kDa liegen nahe beieinander, während diejenige der Bande mit 35 kDa ungefähr ¼ von derjenigen der beiden anderen ist.
Beispiel 2: Klonierung von cDNA kodierend für das LSR α und β
Das Mustern einer Expressionsbank mittels Anti-LSR-Antikörper, wie vorher beschrieben, wird wie unten stehend angezeigt durchgeführt.
Mustern einer Expressionsbank
Nach Infektion von Bakterien mit Bakteriophagen Lambda GT11, enthaltend cDNA der Leber der Ratte (kommerziell erhalten von Clontech Laboratories Inc (5' Strech Plus c-DNA Library), werden die Zellen auf LB-MgSO₄-Medium ausgesäht. Nach 4 Stunden Kultur bei 42°C wird eine Nitrocellulosemembran, die vorher mit einer 10 mM IPTG-Lösung inkubiert wurde, in die Petrischalen gebracht. 4 Stunden später wird die erste Membran herausgezogen und eine zweite auf die Petrischale aufgelegt.
Jede Membran wird unter Bewegung für 1 Stunde in eine Petrischale eingetaucht, die einen Blockierungspuffer enthält. Darauf wird der Antikörper in einer Endkonzentration von 10 μg/ml dem Blockierungspuffer hinzugefügt (Huynh et al., 1984; Young et Davis, 1983a und 1983b). Die Membranen werden darauf drei mal 10 min mit TNT gewaschen (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20).
Die Membranen werden in Anwesenheit von sekundärem Antikörper (mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Affinipure F(ab')-2-Fragment des anti-Kaninchen-IgG der Ziege; Immunotech) in einer Endkonzentration von 0,08 μg/ml Blockierungspuffer (TNT + 5% Magermilchpulver, Marke Pâturage) inkubiert.
Nach Waschen der Membranen im TNT werden diese in Anwesenheit von BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) und von NBT (Nitrotetrazoliumblau) inkubiert, bis eine Färbung erhalten wird.
Die positiven Klone werden dann aus den Schalen zurückgewonnen, titriert und derselben Prozedur der Immunomusterung unterworfen, um zu bestätigen, dass es sich um wirklich Positive handelt (sekundäre Musterung). Möglicherweise kann eine dritte Musterung durchgeführt werden. Die Phagen-DNA der zurückbekommenen Klone, isoliert aus einem Bakterienlysat (Protokoll Clontech), wird durch das Restriktionsenzym EcoR1 verdaut und in die EcoR1-Spaltstelle des Plasmids pBluescript SK+ inseriert.
Zwei Klone, die ein Insert von 1,8 kb enthalten, wurden so erhalten, und es hat sich erwiesen, dass die Sequenzen identisch sind. Die Hybridisierung der mRNA der Leber der Ratte (2 μg von mRNA polyA+) mit einer Sonde, die dem BgIII-XbaI-Fragment dieses Inserts entspricht, hat 2 Banden der Größe 1,9 kb bzw. 2,1 kb (11A) nachgewiesen. Die Analyse der Gewebeverteilung der entsprechenden Boten durch Northern-Blotting mit einer Sonde, die dem XbaI-XbaI-Fragment dieses Inserts entspricht, hat gezeigt, dass sie vorzugsweise in der Leber exprimiert werden (11B). Das Northern-Blotting wurde gemäß dem folgenden Protokoll ausgeführt.
Northern-Blotting
Die Membranen, die die mRNA der verschiedenen Gewebe der Ratte enthalten (Clontech) wurden mit Fragmenten der cDNA des LSR-Gens und der cDNA von menschlichen β-Aktin (Clontech), die mit dCTP[³³P] markiert wurden, in Puffer mit 5 × SSPE, 10 × Denhardt, 0,5% SDS, 100 μg/ml DNA aus Lachssamen, 50 entionisiertem Formamid bei 42°C für 16 Stunden hybridisiert. Darauf wurden die Membranen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur und in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen, dann mit einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) exponiert. Eine cDNA, die der 1,9 kb-Bande entspricht, wurde durch 5'Race-PCR von einem 1,8 kb-Fragment wiederhergestellt und sequenziert.
Um die Anwesenheit der vielfältigen Banden im Northern-Blotting aufzuklären, wurden mehrere Primerpaare, die Fragmente einer cDNA-Sequenz der Ratte definieren, synthetisiert und als Primer für eine PCR-Amplifikation verwendet (11C). Die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide sind unten stehend aufgeführt:

– a: 5'-GTTACAGAATTCGCCGCGATGGCGCCGGCG-3' (SEQ ID 20)
– b: 5'-GCCAGGACAGTGTACGCACT-3' (SEQ ID 21)
– c: 5'-ACCTCAGGTGTCCCGAGCAT-3' (SEQ ID 22)
– d: 5'-GAAGATGACTGGCGATCGAG-3' (SEQ ID 23)
– e: 5'-ACCTCTATGACCCGGACGAT-3' (SEQ ID 24)
– b': 5'-CACCACCCTGACAGTGCGTA-3' (SEQ ID 25)
– c': 5'-CTGGGGGCATAGATGCTCGG-3' (SEQ ID 26)
– d': 5'-GCCCTGGAAGGCCTCGATCG-3' (SEQ ID 27)
– e': 5'-CAAGTCCCTAGGATCGTCCG-3' (SEQ ID 28)

Während jedes Primerpaar ein einzelnes Fragment nachweist, erlaubt das Paar bc' die Amplifikation von drei Fragmenten mit verschiedenen Größen. Die Analyse der Sequenzen dieser Fragmente erlaubt die Wiederherstellung der Sequenz von drei vollständigen cDNAs von LSR der Ratte, die als Größe 2097 by (SEQ ID 1), 2040 by (SEQ ID 3) und 1893 by (SEQ ID 5) haben, und alle drei entsprechen demselben Boten-Vorläufer durch alternatives Splicing.
Diese drei cDNAs enthalten ein offenes Leseraster, das mit einem AUG-Kodon an der Position 219 beginnt, umgeben von der Kozak-Konsensussequenz (Kozak, 1987 und 1990). Die vorhergesagten Molekulargewichte der kodierten Proteine dieser drei cDNAs sind 66 kDa, 64 kDa bzw. 58 kDa.
Die zwei cDNAs kodierend für die längste Form bzw. die kürzeste Form des LSR der Ratte wurden darauf wie unten stehend angegeben in vitro-translatiert.
In vitro-Translation
Die cDNAs werden im Plasmid pcDNA3 subkloniert; die Transkription und die in vitro-Translation werden unter Verwendung des TNT-Kits von Promega ausgeführt. Die Translationsprodukte, markiert mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein, werden nach Elektrophorese mit Polyacrylamid-Gradientengel (10%) und Exposition auf einem Phosphorimager sichtbar gemacht.
Die Molekulargewichte der erhaltenen Produkte, entweder 68 kDa oder 56 kDa (12), entsprechen fast denjenigen der Untereinheiten α und β des LSR.
Um zu definieren, ob die Produkte dieser mRNAs verantwortlich für die Aktivität des Rezeptors sind, wurden drei verschiedene experimentelle Ansätze verwendet.
Erstens wurden zwei Peptide synthetisiert, die den Resten 169–186 (SAQDLDGNNEAYAELIVLGR: SEQ ID 29) des LSR-Produkts der mRNA der Größe 2097 by und den Resten 556–570 (EEGQYPPAPPPYSET: SEQ ID 30) entsprechen. Die drei oben stehend identifizierten Proteine haben die Sequenz dieser Peptide gemeinsam. Antikörper, gerichtet gegen diese synthetischen Peptide, wurden gemäß den Protokollen wie oben stehend angezeigt erhalten. Die 13C und 14C zeigen, dass diese Anti-LSR-Peptid-Antikörper einen inhibitorischen Effekt auf die Bindung des LDL an LSR, das auf den Plasmamembranen der Ratte vorhanden ist, aufweisen, gemessen gemäß dem Protokoll beschrieben in Beispiel 1.
Zweitens wurde eine teilweise Reinigung der Untereinheiten α und β durch selektive Solubilisation mit Hilfe von Sarkosyl erreicht; eine Western- und Ligandenblotting-Studie hat gezeigt, dass die Elemente α und β die polyklonalen Anti-LSR-Antikörper (13B, Spur 1), die Anti-LSR-Peptid-Antikörper (13B, Spur 2 und 14B, Spur 2) und die LDL nach Inkubation mit Oleaten (13B, Spur 4) binden. Das Ligandenblotting wurde gemäß dem Protokoll beschrieben in Beispiel 1 durchgeführt; das Western-Blotting wurde wie unten stehend angezeigt durchgeführt.
Western-Blotting
Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte werden wie in „Experimentelle Verfahren" angezeigt hergestellt. Die Zellen, die nach 48 Stunden Kultur geerntet werden, werden gewaschen und in PBS, enthaltend 1% Triton X100, lysiert. Die Lysate werden auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen (2% SDS, 5% β-Mercaptoethanol und 20 mM DTT, bei 56°C für 1 Stunde) gebracht. Nach Transfer auf eine Nitrocellulosemembran wird Western-Blotting mit IgG-Antikörpern, gerichtet gegen den LSR Rezeptor, durchgeführt.
Drittens werden die markierten Proteine LSR 66 und 58, die durch in vitro-Translation von den cDNAs LSR-Rn-2097 und LSR-Rn-1893 erhalten wurden, zur Abschätzung der Wirkung von Oleat auf die Bindung von LDL gemäß dem unten stehend ausführlich dargelegten Protokoll verwendet.
Bindung von LDL an die LSR-Proteine exprimiert in vitro („Aufschwimmen")
Die in vitro-Transduktionsprodukte (17 μl), die mit ³⁵S-Cystein oder ³⁵S-Methionin markiert sind, werden für 1 Stunde bei 37°C in Anwesenheit von 100 μg/ml LDL, 1 mM Oleat in Puffer A in einem Endvolumen von 400 μl inkubiert. Ein gleiches Volumen 8%iges BSA (w/v) wird hinzugefügt. Die Dichte wird auf 1,21 g/ml mit Natriumbromid eingestellt (unter der Annahme einer Ausgangsdichte von 1,025 g/ml). Die Proben werden dann auf eine Natriumbromidlösung mit 1,063 g/ml gebracht, dann 20 Stunden bei 4°C zentrifugiert (Rotor Beckman SW 41). Ein Volumen von 1 ml wird von der Oberfläche genommen, gegen einen Elektrophorese-Elutionspuffer dialysiert, und die Radioaktivität wird gezählt (Beckman-β-Zähler).
Das Oleat erhöht die Bindung des LDL an LSR 56 (bzw. LSR 68) um den Faktor 2 (bzw. 5). So wird gezeigt, dass die Untereinheiten α und β des LSR der Ratte, kodiert durch die cDNA LSR-Rn-2097 bzw. LSR-Rn-1893 (LSR 56 und LSR 68) vorzugsweise die LDL nach Inkubation mit Oleat binden.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt an, dass die cDNAs LSR-Rn-2097 und LSR-Rn-2040 für 2 Proteine kodieren, die durch Elektrophorese ununterscheidbar sind und deren scheinbares Molekulargewicht 68 kDa ist; diese Proteine entsprechen der Bande, die die Untereinheiten α und α' des LSR enthalten, die nach Immunopräzipitation unter reduzierten Bedingungen identifiziert wurden. Die Untereinheit β des LSR ist wahrscheinlich das Transduktionsprodukt von der cDNA LSR-Rn-1893. Die stöchiometrischen Analysen nach Immunopräzipitation zeigen an, dass der multimerische Komplex mit scheinbarem Molekulargewicht von 240 kDa das Ergebnis einer Zusammenfügung einer Untereinheit α mit drei Untereinheiten β ist. Die Analyse der verschiedenen Domänen der Proteine, die dem LSR α und β entsprechen, ist verträglich mit einer Funktion als Lipoprotein-Rezeptor.
Beispiel 3: Analyse der Aktivität eines rekombinanten LSR Rezeptors und seiner Untereinheiten in transfizierten Zellen
Die Erfinder haben ebenso die Expression eines rekombinanten LSR Rezeptors in CHO-Zellen gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt.
Transfektion durch die cDNA-Sequenzen kodierend für den LSR Rezeptor
Um die Aktivität jeder der rekombinanten Untereinheiten des LSR wie auch die Aktivität eines rekonstituierten Rezeptors zu studieren, haben die Erfinder das Expressionsplasmid pcDNA3 (No et al., 1996) verwendet, um in tierischen Zellen die Expression entweder der cDNA kodierend für die Untereinheit α (Plasmid α) oder einer cDNA kodierend für die Untereinheit β (Plasmid β) des LSR der Ratte zu studieren. Die cDNAs des LSR wurden in das Plasmid pcDNA3 (Invitrogen) unter Verwendung der EcoR1- und/oder NotI-Restriktionsstellen subkloniert. Diese einmal erhaltenen Konstrukte wurden zur Transfektion der tierischen CHO-Zellen verwendet (Ovarienzellen des Hamsters).
Nach 48 Stunden Kultur wurden die CHO-Zellen (Chinese hamster ovary) (CHO-K1, CCL-61, ATCC, Rockville, MD) auf eine 6-Loch-Platte (Falcon) zu 2,5–2,75 × 10⁵ Zellen/Loch verteilt. Nach 24 Stunden Kultur in Ham F-12-Medium, enthaltend 10% (v/v) FCS, 2 mM Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin und Streptomycin, wurden maximal 2 μg Plasmid/Loch unter Verwendung von Superfect (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Lieferanten (10 μl Superfect/Loch, 2 Stunden bei 37°C in Ham F-12-Medium frei von Serum) transfiziert. Die Platten wurden dann mit PBS gewaschen, um die Transfektionsreagenzien zu entfernen, und die Zellen wurden darauf in einem Ham F-12-Medium kultiviert, das Serum enthielt. Die LSR Aktivität wurde 48 Stunden nach der Transfektion gemäß den Protokollen gemessen, die in Beispiel 1 ausführlich dargelegt sind.
Die Erfinder haben die Wirkung einer Co-Transfektion mit den Plasmiden α und β im Vergleich zu derjenigen einer Transfektion mit dem Plasmid α allein oder dem Plasmid β allein über die drei Schritte der Aktivität des LSR Rezeptors gemäß den Protokollen getestet, die unten stehend ausführlich dargelegt sind. Die 15 und 16 zeigen die Vergleiche zwischen den LSR Aktivitäten, die mit den rekombinanten Zellen exprimierend die Untereinheit α allein oder die beiden Untereinheiten α und β erhalten wurden; ähnliche Resultate wurden für den Vergleich β gegen α und β erhalten, was verträglich mit der vergleichenden Analyse von Primärsequenzen jeder der Untereinheiten ist (jede von ihnen trägt ebenso die möglichen Bindungsstellen der Lipoproteinliganden und der Fettsäuren, so z. B. von Oleat).
Wirkung einer Transfektion mit dem Plasmid LSR (α) allein oder einer Co-Transfektion mit den Plasmiden LSR (α) und LSR (β) auf die Bindung, die Internalisierung und den Abbau der LDL
Die CHO-K1-Zellen wurden transient durch ansteigende Konzentrationen des Plasmids α transfiziert oder mit 0,4 μg Plasmid α und ansteigenden Konzentrationen des Plasmids β co-transfiziert. Nach 48 Stunden Kultur wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und 3 Stunden bei 37°C mit 20 μg/ml ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 1 mM Oleat in DMEM, enthaltend 0,2% BSA, 5 mM Hepes und 2 mM CaCl₂, pH 7,5, inkubiert. Darauf wurden die Zellen wie vorher beschrieben gewaschen und bei 4°C für 1 Stunde mit 10 mM Suramin in PBS inkubiert.
Für die Messung der Bindung der LDL (15) wurde das Medium zurückgewonnen und in einen γ-Zähler gebracht, um die Menge des gebundenen ¹²⁵I-LDL zu bestimmen. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte von zwei Messungen. Für die Messung der Internalisierung und des Abbaus von den LDL (16) wurde die Menge von internalisiertem und abgebautem ¹²⁵I-LDL gemäß den Protokollen gemessen, die in Beispiel 1 ausführlich dargelegt sind.
Die Co-Transfektion mit den Plasmiden α und β erlaubt, die drei Schritte der LSR Aktivität festzustellen (15 und 16).
Die Erfinder haben ebenso beobachtet, dass die Co-Transfektion mit den zwei Plasmiden α und β die LSR Aktivität im Vergleich zu einer Transfektion durch nur Plasmid α erhöht. Die Ergebnisse, die eine effektivere Aktivität des LSR nahelegen, da das Verhältnis ([β]/[α]) zwischen den Konzentrationen der exprimierten Untereinheiten α und β zunimmt, sind verträglich mit der Beobachtung, dass der LSR Rezeptor durch die Zusammenstellung einer Untereinheit α (oder α') und mehrerer, wahrscheinlich drei Untereinheiten β gebildet wird.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine einzige Co-Transfektion der Untereinheiten β und α die Überexpression eines LSR Rezeptors erlaubt, der vollständig funktionell ist, in dem Sinne, dass er den vollständigen proteolytischen Abbau des Proteins erlaubt.
Um die Aktivität des Abbaus von Lipoproteinen zu charakterisieren, wie oben stehend in Zellen erhalten, die durch die cDNAs von LSR transfiziert wurden, haben die Erfinder schließlich die Fähigkeit eines Anti-LSR-Antikörpers zur Inhibition der Bindung von den LDL, so wie oben stehend gemessen, als auch ihre Substratspezifität gemessen.
Charakterisierung der Aktivität des Abbaus von Lipoproteinen, erhalten in transfizierten Zellen, die den rekombinanten LSR Rezeptor exprimieren
Die CHO-Zellen wurden mit den Plasmiden α und β in einem Verhältnis der Konzentrationen von 1 bis 3 transfiziert.
Die 17A zeigt, dass die Aktivität zur Bindung der LDL, erhalten in den transfizierten Zellen (exprimiert im Vergleich zu derselben Aktivität, die in nicht-transfizierten Kontrollzellen beobachtet wird) auf spezifische Weise durch die Anti-LSR-Antikörper inhibiert wird.
Die 17B zeigt, dass die Aktivität zur Bindung der LDL, erhalten in den transfizierten Zellen in Anwesenheit verschiedener nicht-markierter Lipoproteine als kompetitiver Ligand wirkt. Die Ergebnisse zeigen eine Ligandenspezifität, die ähnlich zu derjenigen ist, die für die endogene LSR Aktivität in der Ratte beobachtet wurde (Mann et al., 1995): Die Chylomikronen der Ratte sind das bevorzugte Substrat des rekombinanten LSR der Ratte; insbesondere kommen darauf in absteigender Spezifität die VLDL und dann die LDL.
Beispiel 4: Einbeziehung des LSR in die Zytokinclearance
Die Analyse der Sequenz der Untereinheit α des LSR weist eine Region reich an Cystein nach, die einem Muster des Zytokinrezeptors vom Typ Tumor Necrosis Factor entspricht. Das LSR unterscheidet sich jedoch von Zytokinrezeptoren durch die Anwesenheit von Signalen, die die schnelle Endozytose des Rezeptor/Ligandenkomplexes (Clathrinmotiv) erlauben.
Die Erfinder haben die Hypothese gebildet, dass dieser Rezeptor der Reinigung der Zytokine dienen könnte, insbesondere des Leptins; um diese Hypothese zu verifizieren, haben sie den Abbau des rekombinanten Leptins durch die Hepatozyten in Primärkultur gemäß dem unten stehenden Protokoll analysiert.
Abbau des Leptins durch die Hepatozyten in Primärkultur
Die Primärzellen von Hepatozyten der Ratte werden für 4 Stunden bei 37°C mit 20 ng/ml von ¹²⁵I-Leptin in Abwesenheit oder in Anwesenheit von 0,5 mM Oleat, von 75 μg/ml RAP, von 200 μg/ml Antikörper, der unspezifisch oder Anti-LSR-spezifisch ist, oder von 50 μg Chloroquinin inkubiert. Darauf wird das Medium zurückgewonnen und die Menge des abgebauten ¹²⁵I-Leptin gemessen.
Wie in 18 angezeigt, wird der Abbau des Leptins durch die Hepatozyten in Primärkultur inhibiert durch:

a) die polyklonalen Antikörper gerichtet gegen das LSR. Diese Antikörper inhibieren ebenso in denselben Verhältnissen die LSR Aktivität
b) das 39 kD-Receptor Associated Protein (RAP); dieses Protein blockiert die LSR Aktivität in vitro und verlangsamt die Clearance der Chylomikronen in vivo (Troussard et al., 1995; Willow et al., 1994)
c) Chloroquin; dieses Zellgift verhindert die Azifizierung der Endozytosevesikel und inhibiert die Aktivität der lysosomalen Proteasen
d) Oleat; diese freie Fettsäure induziert den Konformationswechsel des LSR, der die Bindungsstelle der Lipoproteine freigibt.

Dieses zeigt an, dass die FAF-Konformation (Fatty Acid Free) des LSR wahrscheinlich alleine verträglich mit der Funktion der Bindung gefolgt vom Abbau des Leptins ist. Die unspezifischen Immunglobuline sind ohne Wirkung auf den Abbau des Leptins (18).
Um die Bindung des Leptins an LSR zu verifizieren, werden die Proteine der Plasmamembran der Leber der Ratte auf eine Affinitätschromatographiesäule gemäß dem unten stehend ausführlich dargelegten Protokoll gebracht, die das rekombinante Leptin enthält.
Affinitätschromatographie von Leptin
Es wird eine Hi-trap-Säule (Pharmacia) verwendet: 5 mg Leptin werden an 1 ml Säulenmaterial gemäß den durch den Hersteller vorgegebenen Methoden gebunden. Die Proteine der Plasmamembran werden aus Lebern der Ratte solubilisiert wie vorher angezeigt (Mann et al., 1995), dann eine Nacht gegen PBS pH 7,4, 0,1% Tween 20 dialysiert. Die Säule wird mit demselben Puffer gewaschen, und das Proteinextrakt wird mit einer Rate von 0,2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 6 ml desselben Puffers gewaschen. Darauf wird sie mit demselben Puffer eluiert, der mit 100 mM Glycin pH 3 supplementiert ist; 20 Fraktionen zu je 500 μl werden dann durch 5 μl PBS, 0,1% Tween 20 pH 8 neutralisiert. 50 μl jeder Fraktion werden auf eine Nitrocellulosemembran zur Dot-Blot-Analyse mittels des Anti-LSR-Antikörpers gebracht. Die positiven Fraktionen (1, 3, 4, 7 und 8) werden gegen 24 mM Ammoniumbicarbonat, 0,01% Tween 20 dialysiert, gepoolt und durch Speed-Vac auf ein Endvolumen von 300 μl konzentriert. 40 μl des Endproduktes werden durch Western-Blot mittels Anti-LSR-Antikörper analysiert.
Die 19 zeigt, dass die Anti-LSR-Antikörper spezifisch die Untereinheit α erkennen, die, nachdem sie an das Leptin gebunden ist, durch den Glycinpuffer wieder freigesetzt wurde.
Experimente mit stabiler Transfektion der Untereinheit α erlauben die Messung der Affinität des Leptins für diesen neuen Rezeptor.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse legt nahe, dass das LSR einen der Wege zum Abbau und zur Elimination des Leptins repräsentiert. Die in vivo-Injektion des rekombinanten radiomarkierten Leptins hat sowohl bei fettleibigen Mäusen als auch bei Kontrollmäusen eine hohe Clearancegeschwindigkeit und ein bevorzugtes Abfangen des Leptins durch die Leber und die Niere gezeigt: 50% der injizierten Dosis wird nach 10 min in diesen beiden Organen wiedergefunden. Um die Mechanismen des selektiven Abfangens des Leptins zu analysieren, haben die Erfinder die Mengen von Leptin und von β2-Mikroglobulin (lösliches Protein mit Molekulargewicht nahe demjenigen des Leptins, ausgewählt als Kontrolle) verglichen, die in der Niere und der Leber von normalen Mäusen und zwei Linien von fettleibigen Mäusen 5 min nach der Injektion der gleichen Isotopenindikatordosis dieser beiden radiomarkierten Proteine vorhanden ist.
Messung der Leptinclearance in den Mäusen
Weibliche Kontrollmäuse, ob/ob- oder db/db-Mäuse (6–8 Wochen), nüchtern, werden anästhesiert und erhalten über die Vena saphena eine Injektion von 80 ng rekombinantes ¹²⁵I-Leptin der Maus oder ¹²⁵I-β₂-Mikroglobulin (Sigma, markiert durch die Iodobead-Methode wie das Leptin). 5 min später werden die Tiere mit einer physiologischen Salzlösung (15 ml bei 4°C) perfundiert. Die Gewebe werden entfernt und auf ihre Radioaktivität gezählt (γ-Zähler). In einigen Fällen wird ein Anti-LSR-Antikörper oder ein Kontrollprotein 30 min vor der Injektion des ¹²⁵I-Leptins injiziert. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die Markierung des Leptins mit dem ¹²⁵I keine Wirkung auf seine biologische Aktivität hat.
Die Ergebnisse, die in 20 dargestellt sind, zeigen, dass die Menge des selektiv durch die Leber abgefangenen Leptins in den fettleibigen Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen vermindert ist, außerdem findet man keinen Unterschied zwischen den verschiedenen Linien, insoweit es das renale Abfangen des Leptins betrifft.
Die Erfinder haben darauf die Zahl der LSR Rezeptoren in Kontrollmäusen, ob/ob-Mäusen und db/db-Mäusen gemäß dem folgenden Protokoll gemessen.
Messung der scheinbaren Anzahl der LSR Rezeptoren auf Plasmamembranen
Die scheinbare Anzahl von LSR Rezeptoren auf Plasmamembranen wird wie vorher beschrieben (Mann et al., 1995) durch Abschätzung der Menge des LDL gebunden an eine Plasmamembranpräparation gemessen. Die Plasmamembranen (100 μg) werden mit 1 mM Oleat inkubiert; darauf werden sie dreimal wie oben stehend angezeigt gewaschen, dann 1 Stunde bei 37°C mit 40 μg/ml ¹²⁵I-LDL inkubiert. Die Menge von ¹²⁵I-LDL, die an Plasmamembranen gebunden ist, wird darauf durch Zählung bestimmt. Es wird der Mittelwert über drei Messungen pro Tier für 3 verschiedene Tiere in jeder der Gruppen festgestellt.
Die 21 zeigt, dass die Zahl der LSR Rezeptoren in den fettleibigen Tieren, die entweder einen Mangel an Leptin (ob/ob) oder einen Mangel des ob-Rezeptors (db/db) zeigen, signifikant vermindert ist. Die Verminderung des selektiven Abfangens des Leptins in der Leber in den fettleibigen Mäusen koinzidiert mit der Verminderung der scheinbaren Zahl der LSR Rezeptoren in diesen Tieren.
Die Erfinder haben schließlich gemäß dem unten stehend dargelegten Protokoll die Wirkung von Anti-LSR-Antikörpern auf die Verteilung des Leptins zwischen Leber und Niere 5 min nach der Injektion einer Isotopenindikatordosis getestet.
Messung der Verteilung des Leptins zwischen Leber und Niere in Anwesenheit eines Anti-LSR-Antikörpers
Kontrollmäuse werden anästhesiert, dann wird ihnen intravenös 1 mg unspezifischer IgG-Antikörper oder Anti-LSR-IgG-Antikörper injiziert. Nach 30 min werden 80 ng ¹²⁵I-Leptin und nach 5 min eine Perfusion von physiologischer Salzlösung von 4°C injiziert. Die Gewebe werden sofort entfernt, und es wird die Radioaktivität gemessen. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert und die Standartabweichung dar, die von 3 Tieren für jede der Gruppen erhalten wurden.
Wie es die 22 zeigt, ist durch die Anti-LSR-Antikörper das hepatische Abfangen des Leptins im Vergleich mit Kontrollimmunglobulinen vermindert und das renale Abfangen erhöht.
Die Ergebnisse zeigen folglich an, dass das LSR für das selektive hepatische Abfangen des Leptins verantwortlich ist und dass eine Verminderung der Zahl der Rezeptoren bei fettleibigen Tieren beobachtet wird. Eine derartige Verminderung kann das Syndrom des Widerstandes gegen das Leptin und die Erhöhung der Plasmakonzentration des Leptins erklären, die in der Mehrzahl der fettleibigen Menschen beobachtet wird.
Es ist ebenso möglich, dass der LSR Rezeptor als Weg für den Abbau von anderen Zytokinen dient, insbesondere derjenigen, die durch Fettgewebe produziert werden. Es wird insbesondere die Wichtigkeit des Tumor Necrosis Factor α und des Nerve Growth Factor festgehalten. Diese beiden Zytokine üben eine signifikante Abmagerungswirkung aus, wenn sie in Menschen injiziert werden (Cytokines and their receptors, 1996).
Beispiel 5: Kontrolle der LSR Aktivität durch die Zytokine
Die Untereinheit α des LSR Rezeptors bindet das Leptin und besitzt mögliche Phosphorylierungsstellen. Das macht sie zu einem Rezeptor, der nicht nur die Endozytose vermittelt, aber ebenso der zellulären Signalübertragung dienen könnte. Die Erfinder haben folglich die Hypothese getestet, gemäß der das Leptin die Aktivität des LSR wie unten beschrieben moduliert.
Messung der LSR Aktivität zur Bindung, Internalisierung und zum Abbau von Lipoproteinen in Anwesenheit von Leptin
Die Hepatozyten der Ratte in Primärkultur werden bei 37°C mit einer ansteigenden Leptinkonzentration für 30 min inkubiert, dann bei 37°C für 4 Stunden mit entweder 50 μg/ml ¹²⁵I-LDL (spezifische Aktivität: 209 cpm/ng) oder 50 μg/ml ¹²⁵I-VLDL (spezifische Aktivität 157 cpm/ng) in Abwesenheit oder in Anwesenheit von 500 μM Oleat inkubiert. Die Zellen werden darauf gewaschen, und die Mengen der gebundenen ¹²⁵I-Lipoproteine werden gemessen, die wie vorher in Beispiel 1 beschrieben inkorporiert und abgebaut worden sind (Bihain und Yen, 1992). Die Ergebnisse, die in 23 gezeigt werden, stellen die Unterschiede dar, die zwischen den inkubierten Zellen mit oder ohne Oleat erhalten wurden. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von drei Messungen dar. Die Standartabweichung jedes Punktes ist im Symbol enthalten.
Die Hinzufügung von ansteigenden Konzentrationen von Leptin zu den Hepatozyten in Kultur erhöht die Bindung, die Internalisierung und den Abbau des VLDL und des LDL (23).
Die Analyse der Fähigkeit der Induktion der LSR Aktivität durch das Leptin
Messung der scheinbaren Anzahl von LSR Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Hepatozyten der Ratte in Primärkultur in Anwesenheit von Leptin exprimiert werden
Die Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte werden für 30 min bei 37°C in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 ng/ml Leptin inkubiert, 10 min bei 37°C in Anwesenheit von 0,8 mM Oleat. Die Zellen werden mit auf 4°C vorgekühltem PBS-Puffer gewaschen, dann 2 Stunden bei 4°C in Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von ¹²⁵I-LDL inkubiert. Die Zellen werden darauf gewaschen, lysiert und die Menge des gebundenen ¹²⁵I-LDL wird gemessen.
Wirkung von Leptin in Anwesenheit von Cycloheximid, von Colchicin und von Cytochalasin B im Vergleich
Die Anfangsbedingungen sind identisch wie bei den oben stehend beschriebenen Zellen; nach Inkubation mit Leptin werden die Zellen für 30 min bei 37°C mit 5 μM Cycloheximid, 5 μM Colchicin oder 2,5 μM Cytochalasin B inkubiert. Die Zellen werden dann 10 min bei 37°C in Anwesenheit von 0,8 mM Oleat inkubiert. Die Zellen werden dann mit auf 4°C vorgekühltem PBS-Puffer gewaschen, dann 2 Stunden bei 4°C in Anwesenheit von 50 μg/ml ¹²⁵I-LDL inkubiert. Zwei Messungen werden durchgeführt, und die gemittelten Ergebnisse werden präsentiert.
So wird gezeigt, dass die Erhöhung der LSR Aktivität durch das Leptin durch die Vermittlung einer Erhöhung der scheinbaren Zahl der auf der Oberfläche der Hepatozyten exprimierten Rezeptoren erhalten wird (24A). Diese Erhöhung resultiert einerseits aus einer Erhöhung der Proteinsynthese (die ist teilweise inhibiert durch das Cycloheximid, das ein Inhibitor der Proteinsynthese ist). Auf der anderen Seite bezieht sie die Mobilisation von endozytotischen Vesikeln durch das System der Mikrotubuli ein (sie ist tatsächlich durch das Cytochalasin B inhibiert, das den mikrotubulären Transport blockiert) (24B).
Um die in vivo-Wirkung des Leptins auf die LSR Aktivität zu verifizieren, haben die Erfinder die triglyzeridämische postprandiale Antwort von Kontrollmäusen, ob/ob- und db/db-Mäusen nach Mästung mit einer Testmahlzeit gemäß den folgenden Protokollen charakterisiert.
Messung der lipämischen postprandialen Antwort in den Mäusen
Kontrollmäuse, ob/ob- und db/db-Mäuse, die seit dem Vortag nüchtern sind, werden mit einer Mahlzeit gemästet, die sehr reich an Fett ist [60% Fett (gesättigte Fettsäuren 37%, einfach ungesättigte 27% und mehrfach ungesättigte 36%), 20% Proteine und 20% Kohlenhydrate], wobei die Versorgung 56 kcal Energie/kg Gewicht des Tieres beträgt. Sofort nach der Mahlzeit (Zeit = 0 Stunden) werden den Mäusen 200 μl einer physiologischen Salzlösung intravenös injiziert. Zu verschiedenen Zeiten werden 20 μl Blut aus der Schwanzvene in Röhrchen entnommen, die 90 μg Dinatrium-EDTA enthalten, und nach der Trennung des Plasmas durch Zentrifugation wird die Plasmakonzentration von Triglyzeriden mittels eines Kits der enzymatischen Dosis bestimmt. Jeder Punkt der präsentierten Kurven entspricht dem Mittelwert mit Markierung der Abweichung erhalten aus drei Messungen pro Tier und drei verschiedenen Tieren.
Messung der Wirkung des Leptins auf die lipämische postprandiale Antwort bei den Mäusen
Die Prozedur ist dieselbe wie oben stehend, außer dass sofort nach der Mahlzeit (Zeit = 0 Stunden) den Mäusen intravenös entweder 200 μl physiologische Salzlösung oder 200 μl derselben Lösung, enthaltend 50 μg rekombinantes Leptin der Maus injiziert werden.
Messung der lipämischen postprandialen Antwort bei den Mäusen in Anwesenheit von Laktoferin und/oder Leptin
ob/ob-Mäuse, die seit dem Vortag nüchtern sind, werden mit einer Mahlzeit gemästet, die identisch zu der oben beschriebenen ist. Unmittelbar nach der Mahlzeit (Zeit = 0 Stunden) werden den Mäusen intravenös 200 μl Salzlösung injiziert, die entweder keinen Zusatz oder 0,5 μg Leptin oder 2,5 mg Laktoferin oder ein Gemisch von 0,5 μg Leptin und 2,5 mg Laktoferin enthalten. Das Blut wird zwischen 2 und 3 Stunden nach der Mahlzeit entnommen, und die Plasmakonzentration von Triglyzeriden (TG) wird gemessen. Die erhaltenen Werte stellen den Mittelwert mit Markierung der Abweichung dar, erhalten für vier Messungen pro Tier und für zwei verschiedene Tiere [p < 0,02 (ob/ob verglichen mit ob/ob+Leptin), p < 0,01 (ob/ob verglichen mit ob/ob+Laktoferin), NS (ob/ob+Laktoferin verglichen mit ob/ob+Leptin+Laktoferin)].
In Übereinstimmung mit der Verminderung der Zahl der LSR Rezeptoren, die in den fettleibigen Mäusen beobachtet wird, wird ebenso eine Verstärkung der lipämischen postprandialen Antwort in den nichtbehandelten fettleibigen Mäusen beobachtet. Die Verabreichung von Leptin über den intravenösen Weg zur selben Zeit wie die Testmahlzeit erlaubt es, die lipämische postprandiale Antwort in zwei Linien von fettleibigen Mäusen und in Kontrollmäusen zu reduzieren (25).
Die Verminderung der lipämischen Antwort, die durch Leptin induziert wird, wird durch die Verabreichung von Laktoferin unterdrückt (26), das die LSR Aktivität blockiert (Yen et al., 1994; Mann et al., 1995). Dieses legt nachdrücklich nahe, dass die Verminderung der lipämischen Antwort durch eine Erhöhung der LSR Aktivität erklärt werden kann.
Schließlich induziert die Verabreichung von Leptin auch in vivo eine Erhöhung der scheinbaren Zahl der LSR Rezeptoren, die auf der Oberfläche der Hepatozyten exprimiert werden. Diese Erhöhung ist sowohl in den ob/ob-Mäusen als auch in den db/db-Mäusen signifikant (27).
Das Leptin und wahrscheinlich andere Zytokine sind folglich Regulatoren der LSR Aktivität. Ein Syndrom des Widerstandes gegen das Leptin oder gegen andere Zytokine kann eine Hypertriglyzeridämie, entweder permanent oder beschränkt auf die postprandiale Phase zur Folge haben.
Beispiel 6: Wirkung des Leptins auf die LSR-Expression; therapeutische Folgen
Um die Korrelation zwischen der Verabreichung von Leptin, der Verminderung der lipämischen postprandialen Antwort und einer Expression oder gesteigerten Aktivität des LSR Rezeptors zu verstärken und die möglichen therapeutischen Einbeziehungen der Induktion der Aktivität der hepatischen Clearance von Lipoproteinen durch das Leptin besser einzukreisen, haben die Erfinder die vorstehenden Analysen durch eine folgende Analyse über die Entwicklung des Gewichtes, über die LSR Aktivität und die Expression von LSR-mRNA in mit Leptin behandelten oder nichtbehandelten Kontrolltieren oder fettleibigen Tieren vervollständigt.
Lipämische postprandiale Antwort und LSR Aktivität in den Kontrollmäusen und fettleibigen Mäusen
Männliche Kontrollmäuse (C57BL6) (n = 8) und fettleibige Mäuse (ob/ob, n = 8 -Tiere, die auf der Ebene des Leptingens defizient sind – und db/db, n = 8 – Tiere, die auf der Ebene des Leptinrezeptorgens defizient sind –) (17 Wochen alt) wurden gewogen, um auf quantitative Weise die Unterschiede des Gewichts zwischen Linien festzustellen (28A). Die lipämischen postprandialen Antworten der Tiere jeder Linie wurden in der Abwesenheit einer Behandlung durch das Leptin wie oben beschrieben gemessen. Die scheinbare Zahl der LSR Rezeptoren, die auf der Oberfläche der Leberzellen exprimiert wurden, wurde bei vier Tieren jeder Linie wie weiter oben beschrieben gemessen und im Vergleich zu der 5'-Nukleotidase-Aktivität (Enzym, das selektiv auf der Ebene der Plasmamembranen gemessen wird; Sigma-Kit) ausgedrückt. Schließlich hat ein Northern-Blotting erlaubt, das Expressionsniveau des LSR Rezeptors bei drei Tieren jede Linie abzuschätzen, wobei dem vorher beschriebenen Protokoll gefolgt wurde.
Die lipämische postprandiale Antwort, die am stärksten in den fettleibigen Tieren erhöht ist (28B), ist in Übereinstimmung mit der geringsten scheinbaren Anzahl von hepatischen LSR Rezeptoren in diesen selben Tieren (28C). Außerdem zeigen die Ergebnisse des Northern-Blotting (28D) an, dass diese Verminderung der scheinbaren Zahl von LSR Rezeptoren in den fettleibigen Tieren mit einer Verminderung des Expressionsanteils dieses Rezeptors in denselben Tieren verbunden ist. Die Erfinder haben gezeigt, dass tatsächlich eine Verminderung der Zahl der mRNAs, kodierend für den LSR Rezeptor, in fettleibigen ob/ob- und db/db-Mäusen festgestellt werden kann.
Die Erfinder haben ebenso die Wirkung einer Langzeitbehandlung durch Behandlung mit Leptin auf ob/ob-Mäuse studiert (29).
Wirkung einer Langzeitbehandlung durch Leptin auf ob/ob-Mäuse
Die fettleibigen ob/ob-Mäuse erhalten eine tägliche Injektion entweder von Leptin oder eines äquivalenten Volumens von sterilem PBS über 30 Tage. Die injizierten Dosen sind 50 μg/Tier von Tag 0 bis Tag 4, 100 μg/Tier von Tag 5 bis Tag 17 und 150 μg/Tier von Tag 18 bis Tag 30. Mehrere Parameter werden gemessen, wie unten stehend angezeigt:

– das Gewicht (29A): Die Veränderung des Gewichts wird für 6 Tiere für die Dauer der Behandlung gemessen;
– die lipämische postprandiale Antwort (29B): Sie wird für drei Tiere jeder Gruppe am Tag 29 gemäß dem Protokoll gemessen, das in Beispiel 5 ausführlich dargelegt wurde.
– die scheinbare Zahl von LSR Rezeptoren (29C): Sie wird für 3 Tiere jeder Gruppe am Tag 30 gemäß dem Protokoll gemessen, das in Beispiel 4 ausführlich dargelegt wurde.
– die Menge von LSR-mRNA (23D): Sie wird durch Northern-Blot abgeschätzt, wie im Protokoll von Beispiel 2 angezeigt.

Die Erfinder haben so einen sehr signifikanten Gewichtsverlust in den fettleibigen ob/ob-Mäusen festgestellt, die 30 Tage mit Leptin behandelt wurden. Außerdem ruft die Behandlung mit Leptin eine Netto-Verminderung der lipämischen postprandialen Antwort hervor. Diese Verminderung der lipämischen postprandialen Antwort ist mit einer Erhöhung der scheinbaren Zahl von LSR Rezeptoren auf der Oberfläche der Zellen und mit einer Erhöhung der mRNA-Menge, kodierend für die Untereinheiten des LSR Rezeptors korreliert.
Diese Ergebnisse stellen in vivo fest, dass das LSR den limitierenden Schritt der Reinigung der Nahrungslipide darstellt. Außerdem induziert die Behandlung dieser Fettleibigkeit einen Gewichtsverlust, ruft eine Erhöhung der Aktivität des hepatischen Abbaus von Nahrungslipiden und eine Verminderung der lipämischen postprandialen Antwort hervor.
Beispiel 7: Charakterisierung des menschlichen LSR Rezeptors Northern-Blot-Analyse
Nukleinsäuresonden von LSR der Ratte wurden zur Durchführung der Northern-Blots mit einer Membran (Human Multiple Tissue Northern-Blot, Clontech #7760-1), enthaltend poly A-RNAs vom menschlichen Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas verwendet. Eine Bande von ungefähr 2 kbp wird in der Leber und in der Niere nachgewiesen. Die näherungsweise Quantifizierung der Hybridisierungsergebnisse zeigt an, dass der LSR Rezeptor in der Leber wenigstens fünfmal stärker exprimiert wird als in der Niere.
Klonierung von cDNA; Studie der Splicing-Zone
Experimente zur RT-PCR mit mRNA haben erlaubt, die Größe von Exon 1 von der 5'-Seite und die Splicing-Stellen zwischen den Exons 1 und 2 mit größerer Genauigkeit zu bestimmen. Es ist jedoch nicht sicher, dass dieses Ende den Anfang dieses Exons bildet. Außerdem existiert eine zweite Initiationsstelle in Exon 1, die sich weiter stromabwärts der ersten befindet und die eine größere Wahrscheinlichkeit als letztere hat. Das Splicing zwischen den Exons 1 und 2 war zwischen der menschlichen RNA und derjenigen der Ratte verschieden.
Die Amplifikation wurde mit mehreren Primerpaaren durchgeführt:
Die Amplifikation, die mit dem Primerpaar ab durchgeführt wurde, hat zu zwei Produkten der Größen 1,8 kb und 2 kb nach Separation durch Gelelektrophorese geführt. Die Größen dieser beiden Produkte, die durch ein alternatives Splicing erklärt werden können, das ähnlich dem für die Ratte beschriebenen ist, und die anderen Amplifikationsprimer wurden nachgewiesen. Diese Primer haben gestattet, die drei cDNA-Formen, die aus dem alternativen RNA-Splicing resultieren, nachzuweisen.
Die erste cDNA, die die Gesamtheit von 10 Exon enthält, wird LSR-Hs-2062 genannt und entspricht der SEQ ID 7. Sie entspricht der cDNA der Ratte LSR-Rn-2097. Die zweite cDNA enthält die Exon 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 und wird LSR-Hs-2005 genannt. Sie entspricht der SEQ ID 9. Diese cDNA entspricht der cDNA der Ratte LSR-Rn-2040. Schließlich wird die cDNA, die die Exons 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 und 10 enthält, LSR-Hs-1858 genannt, und deren Sequenz wird in SEQ ID 11 gelistet. Sie entspricht der cDNA der Ratte LSR-Rn-1893.
Es ist festzustellen, dass ein Gleiten der Splicing-Stelle an der Grenze von Exon 8 nachgewiesen werden konnte. Dieses Gleiten von Triplett TAG an Position 19953–19955 von SEQ ID 19 zum benachbarten Triplett AAG an Position 19956–19958 in SEQ ID 19 resultiert in dem Verlust des Restes Glu an Position 386 der cDNA von SEQ ID 8.
Die Proteinsequenzen, kodiert durch die cDNAs LSR-Hs-2062, LSR-Hs-2005 bzw. LSR-Hs-1858, entsprechen den SEQ ID 8, 10 und 12. Die biologischen Proteinsequenzen können am ersten ATG-Kodon beginnen, das im Leseraster beobachtet wird (Position 35 der Proteinsequenz). Jedoch findet sich das bevorzugte Initiationskodon der Translation stärker stromabwärts an Position 83 der Proteinsequenz. Außerdem ist es ganz und gar möglich, dass das Initiationskodon stärker stromaufwärts in der 5'-Region des Exons 1 sein könnte, die noch nicht bestimmt wurde, oder in einem möglichen Exon, das dem letzteren vorhergeht.
Schließlich präsentiert die 3 eine schematische Darstellung der verschiedenen Formen von Proteinen, die beim Menschen nachgewiesen wurden, wobei die konservierten Motive angezeigt werden.
Diese Analyse gestattet es, beim Menschen auf die Existenz von drei LSR-Untereinheiten α, α' und β zu schließen, die den Formen LSR 66, LSR 64 und LSR 58 der Ratte äquivalent sind.
Identifikation und Isolierung der genomischen Sequenz des menschlichen LSR
Eine Musterung von Banken von gegebenen öffentlichen Nukleinsäuresequenzen (Genebank, version: 101) ebenso mit der lisch 7-Sequenz der Maus (Accession-Nummer: U49507) wie auch mit derjenigen von LSR-2097 der Ratte, die von den Erfindern isoliert wurde, hat gestattet, zwei menschliche genomische DNA-Sequenzen zu isolieren. Es handelt sich um Cosmide, deren Accession-Nummern A0002128 und AD 000684 sind und deren Größen 45.328 by bzw. 41.936 by sind. Diese beiden Cosmide überlappen sich teilweise. Das 3'-Ende des Cosmids A0002128 liegt für 12.838 by über dem 5'-Ende des Cosmids AD000684. Für den gemeinsamen Anteil von 12.838 by sind die Sequenzen zu 100% identisch, abgesehen von zwei Deletionen an den Positionen 822 und 3170 des Cosmids AD00684. Das menschliche LSR-Gen ist auf die beiden Cosmide verteilt. Um die Studie dieser Region zu erleichtern, wurde eine vollständige genomische Sequenz rekonstituiert: Die 45.328 by des Cosmids A0002128 wurden der Sequenz des Cosmids AD000684 zwischen der Base 12.839 und der Base 41.936 hinzugefügt. Die Gesamtheit stellt eine Sequenz von 74.426 by dar. Eine genomische Sequenz, die das LSR-Gen abdeckt, wurde extrahiert (SEQ ID 19).
Die putativen Exons des LSR-Gens wurden nach Alignment der Sequenz mit den Sequenzen der mRNAs von Lisch7 der Maus und von LSR der Ratte wie oben stehend beschrieben bestimmt. Die Gültigkeit der Splicing-Stellen der putativen Exons wurde gegenseitig verifiziert.
Außerdem wurde eine menschliche genomische Bank mit BACs durch die Methoden beschrieben in Chumakov et al., 1995 gemustert; die so isolierten Klone wurden zusammengebracht und subkloniert, dann sequenziert, um die menschliche genomische Sequenz kodierend für das LSR zu erhalten (SEQ ID 41).
Die beiden so erhaltenen Sequenzen (SEQ ID 19 und 41) tragen kleine Abweichungen, die in den beiliegenden Listings erwähnt sind.
Beispiel 8: LSR Aktivität beim Menschen
Primärkulturen von menschlichen Fibroblasten, die von Patienten isoliert wurden, die eine Deletion haben, die den Promotor und das erste Exon des Genes des LDL-Rezeptors beeinträchtigt, wurden hergestellt.
Die Inkubation dieser Zellen in Anwesenheit und in Abwesenheit von Oleat zeigt, dass letzteres eine Aktivität zur Bindung, Internalisierung und zum Abbau von LDL induziert, die einer Sättigungskinetik folgt (Bihain und Yen, 1992). Die Affinität dieses Rezeptors, die durch Oleat induziert wurde, ist für die Teilchen am größten, die reich an Triglyzeriden sind (VLDL und Chylomikronen), wie auch für die Teilchen aus Triolein und Phosphatidylcholin, die mit rekombinanten Apo-Protein E supplementiert sind. Die Affinität der LDL für den Rezeptor ist schwächer als diejenige der VLDL und der Chylomikronen, aber jedoch stärker als diejenige von Partikeln aus Triolein, Phosphatidylcholin, das kein ApoE enthält oder als diejenige von VLDL isoliert aus einem Patienten, der eine Hyperlipidämie vom Typ 3 und den E2/2-Phänotyp des ApoE zeigt (Yen et al., 1994).
Die LSR Aktivität konnte ebenso in den Fibroblasten von normalen Menschen gemessen werden (30), wobei den unten stehenden Protokollen gefolgt wurde.
Messung der Bindung, der Internalisierung und des Abbaus der LDL durch Fibroblasten
Die Fibroblasten werden vorrangig für eine Woche wie vorher beschrieben kultiviert, mit der Abweichung, dass das Milieu 20% fötales Kälberserum enthält (Goldstein et. al., 1983). Darauf werden sie mit ansteigenden Konzentrationen von ¹²⁵I-LDL in Abwesenheit oder in Anwesenheit von 1 mM Oleat inkubier. Darauf werden die Zellen gewaschen, lysiert und bezüglich ihrer Radioaktivität gezählt.
Beispiel 9: Wirkung des Leptins auf die LSR Aktivität beim Menschen
Die LSR Aktivität von menschlichen FH-Fibroblasten (familiäre Hypercholesterolämie) ist ebenso nach Inkubation mit dem Leptin erhöht (31), was nahe legt, dass das LSR ganz wie bei der Ratte beim Menschen an der Zytokinclearance mitwirkt und dass seine Aktivität durch diese moduliert wird. Die entsprechenden Messungen wurden, wie nachstehend angezeigt, durchgeführt.
Wirkung des Leptins auf die LSR Aktivität in den menschlichen Fibroblasten
Die FH-Fibroblasten werden 30 min bei 37°C mit ansteigenden Leptinkonzentrationen inkubiert, dann 2 Stunden bei 37°C mit 50 μg/ml ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit von 500 μM Oleat. Die Bindung, die Internalisierung und der Abbau der LDL wird, wie in Beispiel 1 angezeigt, gemessen.
Beispiel 10: Klonierung der cDNA des LSR der Maus; Analyse der Produkte des alternativen Splicings
Die Klonierung der cDNA des LSR der Maus wurde mit einer mRNA-Bank der Leber der Maus durchgeführt. Die verwendete Klonierungsmethode ist dieselbe wie für die cDNA des menschlichen LSR. Die mRNAs wurden gereinigt, und eine Amplifikation durch RT-PCR mit den spezifischen DNA-Primern wurde durchgeführt. Das Amplifikationsfragment wurde in einen Klonierungsvektor TA (Introgen) kloniert.
Eine Studie der Produkte des alternativen Splicings mit Primern, die in dem Exon 2 und dem Exon 9 gelegen sind, wurde ebenso auf ähnliche Weise durchgeführt wie diejenige, die für das menschliche LSR durchgeführt wurde.
Drei Produkte des alternativen Splicings wurden beobachtet: LSR-Mm-1886, LSR-Mm-1829 und LSR-Mm-1682. LSR-Mm-1886 enthält alle Exons von 1 bis 10. LSR-Mm-1829 und LSR-Mm-1682 enthalten nicht die Exons 4 bzw. die Exons 4 und 5. Diese drei biologischen cDNA-Formen entsprechen genau denjenigen, die bei dem Menschen und der Ratte beobachtet wurden. Die Nukleotidsequenzen der cDNAs LSR-Mm-1886, LSR-Mm-1829 und LSR-Mm-1682 werden in den SEQ ID 13, 14 bzw. 15 dargestellt. Die Proteinsequenzen, die durch die cDNAs LSR-Mm-1886, LSR-Mm-1829 und LSR-Mm-1682 kodiert werden, werden in den SEQ ID 16, 17 und 18 dargestellt.
Beispiel 11: Identifikation der Untereinheit γ des LSR
Die Untereinheiten α und β des LSR wurden wie oben angezeigt identifiziert. Die Analyse der Translationsprodukte der RNAs, kodierend für diese beiden Untereinheiten, erlaubt es nicht, die Anwesenheit einer dritten Untereinheit mit Molekulargewicht von ungefähr 35 kDa zu erklären. Diese letztere wurde nicht nach dem Abbau des LSR-Komplexes entdeckt (10, Spur 4).
Wir haben die NH₂-terminale Sequenz dieser Untereinheit γ gereinigt und erhalten.
Die Reinigung wurde durch Immunoaffinitätschromatographie gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt.
Reinigung der Untereinheit γ des LSR
Die Anti-LSR-Antikörper (Bande A) werden an ein Harz gekoppelt [2,5 mg IgG auf 3,5 ml des Harzes Affi-gel Hz immunoaffinity kit (Biorad 153-6060)], das darauf mit solubilisierten Proteinen von Gesamtmembranen der Leber der Ratte inkubiert wird (Puffer 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,125 M Octylglucosid (5 × CMC), 1 Inhibitorencocktail pH 7,4: 160 mg Membranproteine ergeben 41,3 mg solubilisierte Proteine (PS) in einem Volumen von 17 ml.

– Die Inkubation wird für 12 Stunden durchgeführt: 17 ml aufgefüllt auf 50 ml mit Puffer 20 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 7,4 mit den 3,5 ml des Harzes, unter rotierender Bewegung, bei Raumtemperatur. Das Harz wird mit 40 ml von Puffer 20 mM Tris, 2 mM EDTA pH 7,4 gewaschen, dann mit Puffer 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 200 mM Glycin, pH 2,5 über 30 Fraktionen zu 500 μl eluiert. Der pH jeder Fraktion wird mit 100 μl pro Röhrchen des Puffers 1 M Tris, 2 mM EDTA, pH 9 neutralisiert. 50 μl jeder Fraktion werden auf eine Nitrocellulosemembran zur Dot-Blot-Analyse gebracht: Inkubation mit dem Anti-LSR-Antikörper, dann mit einem sekundären Antikörper, der an die alkalische Phosphatase gekoppelt ist.
– Die positiven Fraktionen von 7 bis 28 werden 2 über 2 gepoolt und 2,5 mal mit der Speed-Vac konzentriert. Ein Western Blot mit den gepoolten konzentrierten und auf einem 10%igen PAGE-SDS-Gel getrennten Fraktionen wird durchgeführt. Banden werden in den Fraktionen 7 bis 14 (die Fraktionen werden gepoolt) beobachtet.
– Die 2 Pools werden gegen 24 mM Ammoniumbicarbonat dialysiert, dann mit der Speed-Vac lyophilisiert. Das Pulver wird in 80 μl Puffer 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 2% SDS, 3% Harnstoff, pH 7,4 aufgenommen und in Anwesenheit von 5% β-Mercaptoethanol 30 min bei 100°C reduziert.
– Nach Wanderung und feuchtem Transfer in 50 mM Tris, 50 mM Borat auf eine Sequenzierungsmembran (PVDF) bei 30 mA wird die Membran mit Amido black gefärbt.

Eine Bande mit scheinbarem Molekulargewicht von ungefähr 35 kDa wurde so identifiziert und zur Sequenzierung gemäß der Edman-Methode eingeschickt.
Die erhaltene Sequenz ist LHTGDKAFVEFLTDEIKEE. Diese Sequenz ist identisch mit derjenigen eines Proteins mit Molekulargewicht 33 kDa, das vorher als Protein der Zelloberfläche identifiziert wurde, das die globulären Köpfe des C1q (gC1q-R) (Ghebrehiwet et al., 1984) bindet. Eine neuere Beobachtung zeigt an, dass dieser mögliche Rezeptor des C1q ebenso in Vesikeln lokalisiert ist, die unter der zellulären Oberfläche gelegen sind (van den Berg et al., 1997). Dieses Protein entspricht ebenso einem Protein, das voher als p34 identifiziert wurde und das mit einem Laminrezeptor assoziiert ist. Dieser Rezeptor besitzt ein langes NH₂-terminales Segment, das zum Inneren des Zellkerns gerichtet ist, wie 8 Transmembrandomänen. Der Rezeptor bindet an das Lamin auf eine Weise, die vom Grad der Phosphorylierung abhängt. Schließlich ist gC1q-R mit dem "Splicingfaktor 2" assoziiert (Honoré et al., 1993). Der Laminrezeptor und der "Splicingfaktor 2" haben das Charakteristikum gemeinsam, eine repetierte Sequenz von Serin und Arginin (RSRS) zu enthalten, die im Falle des Laminrezeptors im NH₂-terminalen Segment und im Fall des SF2 carboxyterminal gelegen ist.
Es ist bemerkenswert festzustellen, dass sowohl LSR α als auch LSR β repetierte Segmente haben, die reich an Serin und Arginin sind (1). Unsere Hypothese ist, dass das Protein LSR γ ein molekulares Chaperon darstellt, das an die Untereinheiten α und β des LSR durch ihre RSRS-Domäne gebunden wird.
Um diese Hypothese zu verifizieren, haben wir polyklonale Antikörper hergestellt, die gegen 2 synthetische Peptide gerichtet sind, deren Sequenz am carboxy- oder NH₂-terminalen Ende des Proteins gC1q-R gelegen war:

– Das NH₂-terminale Peptid von gC1q-R: LRCVPRVLGSSVAGY(Aminosäuren 5 bis 19 von gC1q-R) (SEQ ID 39).
– COOH-terminales Peptid von gC1q-R: C YITFLEDLKSFVKSQ (Aminosäuren 268 bis 282 von gC1q-R) (SEQ ID 40).

Die 32 zeigt, dass diese Antikörper spezifisch die Aktivität des LSR inhibieren. Der Antikörper gerichtet gegen das COOH-terminale Ende scheint am effektivsten zu sein. Diese Ergebnisse zeigen an, dass gC1q-R oder eines seiner strukturell nahen Homologen ein molekulares Chaperon darstellt, das auf nicht-kovalente Weise an den multimerischen LSR-Komplex assoziiert ist.
Beispiel 12: Regulation der LSR Aktivität durch das C1q und seine Homologe
Es wurde gezeigt, dass gC1q-R den globulären Kopf des Faktors 1 des Komplements binden kann. Wir haben versucht, diese Eigenschaft von C1q zu nutzen, um gC1q-R, das an das LSR assoziiert ist, zu verlagern und haben die Wirkung von steigenden Dosen von C1q auf die Bindung, die Internalisierung und den Abbau von LDL durch die Hepatozyten in Primärkultur gemessen. Die 33 zeigt eine Erhöhung des Abfangens und des Abbaus der LDL, die durch menschliches C1q induziert wurde, wenn auch in Abwesenheit von Oleat.
Eine weniger wichtige aber dennoch signifikante Erhöhung wird ebenso in Anwesenheit von Oleat beobachtet. Unter diesen Bedingungen jedoch wird die maximale Wirkung für geringere C1q-Konzentrationen erhalten.
Es erscheint folglich, dass das gC1q-R in Hinsicht auf das LSR eine inhibitorische Wirkung ausübt, die vergleichbar mit derjenigen ist, die durch das 39 kD RAP in Hinsicht auf das LRP durch den LDL-Rezeptor und das LSR induziert wird (Troussard et al., 1995). Die Verlagerung des Chaperons gC1q-R unter Verwendung seiner Fähigkeit, an Komplement C1q zu binden, erlaubt die Aufhebung der inhibitorischen Wirkung. Die Analyse der Sequenz von gC1q-R ergibt, dass es nicht als typischer Membranrezeptor wirken kann. Tatsächlich besitzt das Protein keine hydrophobe Sequenz, die geeignet ist, um die Phospholipiddoppelschicht zu überqueren.
Die Wirkung von Komplement C1q auf die Aktivität des LSR öffnet wichtige Perspektiven im Rahmen der Genetik der Fettleibigkeit. Es ist tatsächlich möglich, dass die Mutationen, die entweder das Gen von C1q, dasjenige von gC1q-R oder außerdem diejenigen ihrer Analoge wie z. B. AdipoQ, das Cerebellin, das Kollagen alpha 1–10, SPA und SPD (Proteine des Surfactants der Lunge), das Protein, das an Mannan bindet, und der Scavenger-Rezeptor oder sein Homolog LRP (Hu et al., 1996; Drickamer et al., 1986; Krieger und Herz, 1994; Elomaa et al., 1995) beeinträchtigen, die Aktivität des LSR entweder gegenüber der Clearance der Lipoproteine oder gegenüber derjenigen des Leptins modulieren.
Mehrere Proteine können mit gC1q-R interagieren, denn sie zeigen Homologien mit dem Komplement C1q. Insbesondere 2 Proteine, die aus der Maus isoliert wurden, AdipoQ (Hu et al., 1996) und acrp30 (Scherer et al., 1995) und ein menschliches Protein APM1 (Maeda et al., 1996) zeigen markante Homologien. Diese 3 Proteine wie die Elemente des Komplements C1q (C1q A, B, C) sind sekretierte Proteine; sie haben ein NH₂-terminates Ende, das dem Kollagen ähnelt (Repetition des Motivs Gly-X-Y) und ein COOH-terminales Ende, das der globulären Domäne des Komplements C1q entspricht. Diese 3 Proteine werden bevorzugt im Fettgewebe exprimiert. Es gibt nur 3 unterschiedliche Aminosäuren zwischen AdipoQ und acrp30. APM1, ein Protein, dessen Bote charakterisiert wurde, dass er sehr stark in Adipozyten exprimiert wird, zeigt 79,7% Identität der Nukleinsäure und 80,6% der Aminosäuren mit AdipoQ. APM1 ist folglich sicherlich das menschliche Homolog von AdipoQ.
Beispiel 13: Musterung von Verbindungen, die die Aktivität des LSR Rezeptors modifizieren
Wie vorher beschrieben, haben die Erfinder die Hypothese aufgestellt, dass die "Bande γ" des LSR einem Protein, das sehr homolog zu gC1qR ist, mit dem LSR Rezeptor wie ein molekulares Chaperon interagiert und so einen "LSR-Komplex" bildet, umfassend die Untereinheiten α oder α' und β des LSR Rezeptors und ein Molekül vom Typ gC1qR. gC1qR wurde vorher als Protein der Zelloberfläche identifiziert, das die globulären Köpfe des Komplementfaktors C1q bindet. Außer C1q sind mehrere Proteine, die Homologien mit den C1q-Proteinen, insbesondere AdipoQ und acrp30 bei der Maus und APM1 beim Menschen zeigen, geeignet, um mit dem Protein, das homolog zu gC1qR ist, im LSR-Komplex zu interagieren und die LSR Aktivität zu modifizieren.
Musterungsparameter
Die Musterung einer Verbindung wie C1q oder AdipoQ wurde durch die Messung verschiedener Parameter ausgeführt, deren wichtigster das Maß der Wirkung der Verbindung auf die Aktivität des LSR Rezeptors ist. Die verschiedenen Parameter sind die folgenden:

– die Veränderung des Gewichts
– die Nahrungsaufnahme
– die lipämische postprandiale Antwort
– die Bindung, die Internalisierung und/oder der Abbau von Lipoproteinen wie z. B. des LDL.

Die Veränderung des Gewichts
Osmotische Pumpen wurden chirurgisch in die Bauchhöhlen von 12 männlichen Sprague-Drawley-Ratten von 400–450 g eingesetzt. Die osmotischen Pumpen enthielten entweder 2 ml PBS (phosphate buffered saline), pH 7,4 (Kontrolle, 6 Ratten), oder 2 ml rekombinantes AdipoQ-Protein (5 mg/ml PBS, 6 Ratten). Diese Pumpen wurden eingestellt, um 10 μl/h zu verabreichen (50 μg AdipoQ/h). Die Tiere werden gewogen und einzeln in Stoffwechselkäfigen untergebracht. 3 Tiere jeder Gruppe werden ad libitum entweder einer Normalernährung oder einer fetten Diät unterworfen (Tag 0). Die fette Diät besteht aus einer normalen Ernährung, die mit 2% (Gew./w) Cholesterol, 10% (Gew./w) gesättigte Fettsäure pflanzlicher Form, %, (Gew./w) Sonnenblumenöl und 15% (Gew./w) Saccarose supplementiert wurde. Am dritten Tag werden die Tiere gewogen und Blutproben werden über die Schwanzvene erhalten.
Die Menge der plasmatischen Triglyzeride wurde unter Verwendung eines enzymatischen Kits gemessen.
Die Nahrungsaufnahme
Das rekombinante AdipoQ-Protein (100 μg) oder PBS allein wurde ob/ob- oder db/db-Mäusen, die in Stoffwechselkäfigen gehalten wurden, täglich über 5 Tage in die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse werden jeden Tag gewogen, und die Menge der konsumierten Nahrung wird ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse entsprechen einer mittleren Nahrungsaufnahme und einer Standardabweichung für 4 Mäuse in jeder Gruppe.
Die lipämische postprandiale Antwort
Männliche Sprague-Drawley-Ratten (400–450 g), die seit dem Vortage nüchtern waren, wurden mit einer Mahlzeit gemästet, die sehr reich an Fett war (t = 0) (60% Fettsäure, davon 37% gesättigt, 27% einfach ungesättigt und 36% mehrfach ungesättigt, 20% Protein und 20% Kohlenhydrate, gesamte Versorgung 56 kcal/kg Körpergewicht) und haben sofort danach eine intravenöse Injektion (Vena femoralis) von entweder 300 μl PBS allein oder von demselben Volumen erhalten, das 1 mg rekombinantes AdipoQ-Protein der Maus enthielt. Blutproben wurden zu verschiedenen Zeiten entnommen (0, 2, 4 und 6 h). Die Menge von plasmatischen Triglyzeriden wurde unter Verwendung eines enzymatischen Kits gemessen. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und Standardabweichung über 3 Tiere dargestellt.
Die LSR Aktivität oder Bindung, Internalisierung und Abbau von Lipoproteinen
Primärkulturen von Hepatozyten der Ratte wurden hergestellt und auf 6-Loch-Platten verteilt (9.000.000 Zellen/Loch). Nach 48 Stunden wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen (2 ml/Loch) und 30 min bei 37°C mit 20 ng/ml rekombinantem Leptin der Maus inkubiert. Darauf wurden die Zellen 4 Stunden bei 37°C mit ansteigenden Konzentrationen von rekombinanten AdipoQ-Proteinen der Maus und 20 μg/ml ¹²⁵I-LDL in Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,5 mM Oleat inkubiert. Die Bindung, die Internalisierung und der Abbau von Lipoproteinen wurde, wie in Beispiel 1 angezeigt, gemessen.
C1q
Die Verbindung C1q wurde auf seine Fähigkeit zur Modulation der Aktivität des LSR Rezeptors getestet (Bindung, Internalisierung und Abbau der Lipoproteine). Die 33 zeigt, dass die Verbindung C1q die Eigenschaft hat, die Aktivität in Anwesenheit und in Abwesenheit von Oleat zu erhöhen. Auf diese Weise konnte diese Verbindung C1q als Modulator der LSR Aktivität durch den oben stehend beschriebenen Aktivitätstest selektioniert werden.
AdipoQ
Die Verbindung AdipoQ wurde gemäß den vier Parametern getestet, die oben stehend erklärt sind.
Die 34 zeigt, dass die Verbindung AdipoQ die LSR Aktivität in Anwesenheit von Oleat moduliert. Bei der Konzentration von 25 ng/ml erhöht sie tatsächlich die LSR Aktivität.
Die 35 zeigt, dass die Verabreichung von AdipoQ erlaubt, die lipämische postprandiale Antwort massiv zu vermindern.
Die 36 zeigt, dass eine dreitägige Behandlung mit Infusionen i. p. durch AdipoQ einen Gewichtsverlust bewirkt, der viel stärker ist, wenn die Ratte einer fetten Diät unterworfen ist. Außerdem haben die Erfinder festgestellt, dass das Verhältnis von plasmatischen Triglyzeriden bei den Tieren reduziert ist, die mit AdipoQ behandelt werden.
Die 37 zeigt, dass eine Injektion von AdipoQ die Nahrungsaufnahme in den fettleibigen Tieren vermindert.
Die Erhöhung der LSR Aktivität, die durch 25 ng/ml AdipoQ induziert wird, kann die Verminderung der lipämischen postprandialen Antwort und den Gewichtsverlust erklären.
So ist das Protein AdipoQ eine sehr interessante Verbindung, die insbesondere für die Behandlung der Fettleibigkeit verwendet werden könnte. Die Auswahl dieses Proteins als molekularer Kandidat zur Behandlung der Fettleibigkeit validiert die Musterungsparameter für eine Verbindung von Interesse, die die LSR Aktivität moduliert, wobei der wichtigste Parameter aus dem Maß der LSR Aktivität besteht.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes oder rekombinantes Polypeptid des LSR Rezeptors mit einer Sequenz, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 17 und 18, Sequenzen, die zumindest 90% Identität zu den Sequenzen SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 17 and 18 aufweisen, oder biologisch aktiven Fragmenten, die zumindest fünf aufeinanderfolgende Aminosäuren der Polypeptide der Sequenzen mit SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 17, and 18 aufweisen.
Gereinigtes oder rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biologisch active Fragment ausgewählt is aus einer Fettsäure-Bindungssteile, einer Clathrin-Bindungssteile, einer Zytokin-Bindungsstelie, einer Apoprotein-Liganden-Bindungsstelle, einem LI/LL Motiv, einem RSRS Motiv und einer hydrophoben Region.
Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass sie dazu fähig sind, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 spezifisch zu erkennen.
Hybridom, dadurch gekennzeichnet, dass es monoklonale Antikörper exprimiert, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 spezfisch erkennen.
Gereinigte, isolierte oder rekombinanße Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie für ein Polypeptid mit einer Sequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert.
Gereinigte, isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie die komplementäre Sequenz einer Nukleinsäure nach Anspruch 5 aufweist.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 oder 6 aufweist.
Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein rekombinantes Potypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enhält.
Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine rekombinante Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 und 6 aufweist.
Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 7 aufweist.
Säugetier, mit Ausnahme eines Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine rekombinante Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 oder 6 oder einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 7 aufweist.
Verfahren zum Nachweis der Expression eines Polypeptids des LSR Rezeptors, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes aufweist: a) In-Kontakt-bringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der dazu fähig ist, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 und 2 spezifisch zu erkennen; und b) Nachweis von immunologischen Komplexen zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid as Mittel zum Nachweis der Expression.
Verfahren zur Diagnose einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes aufweist: a) In-Kontakt-bringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der dazu. fähig ist, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 und 2 spezifisch zu erkennen; und b) Nachweis von immunologischen Komplexen zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid als Mittel zur Diagnose der Störung oder Krankheit.
Verfahren zur Diagnose einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes aufweist: a) In-Kontakt-bringen einer biologischen Probe mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 oder 6; und b) Nachweis von Mutationen in einer Nukleinsäure der biologischen Probe als Mittel zur Diagnose der Störung oder Krankheit.
Verfahren zur Diagnose einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes aufweist: a) In-Kontakt-bringen einer biologischen Probe mit einer Nukleinsäure die zumindest 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 19 aufweist; und b) Nachweis von Mutationen in einer Nukleinsäure der biologischen Probe als Mittel zur Diagnose der Störung oder Krankheit.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe vom einem Säugetier stammt.
Verfarhren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier ein Mensch ist.
Verfahren zur Selektion einer Verbindung, die zur Behandlung oder Prävention einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit brauchbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes aufweist: a) In-Kontakt-bringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer Kandidatenverbindung; und b) Nachweis eines Komplexes zwischen der Kandidatenverbindung und dem Polypeptid als Mittel zur Selektion der Verbindung, die zur Behandlung oder Prävention einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit brauchbar ist.
Verfahren zur Selektion einer Verbindung, die zur Behandlung oder Prävention einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit brauchbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes aufweist: a) In-Kontakt-bringen einer rekombinanten Zelle nach einem der Ansprüche 8 oder 9 mit einer Kandidatenverbindung; und b) Nachweis eines Ergebnisses, das ausgewählt ist aus der Interaktion einer Kandidatenverbindung mit der rekombinanten Zelle, Modulierung der Aktivität des LSR Rezeptors, und Modulierung der Expression des LSR Rezeptors als Mittel zur Selektion der Verbindung, die zur Behandlung oder Prävention einer mit Fettleibigkeit verbundenen Störung oder Krankheit brauchbar ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Kontakt-Bringen in Anwesenheit eines Liganden des LSR Rezeptors durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Zytokin, Oleat, LDL und gC1qR.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytokin Leptin ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität ausgewählt ist aus Lipoprotein-Bindung, -Intemalisierung und -Degradierung, und Leptin-Bindung, -Internalisierung und -Degradierung.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Kandidatenverbindung ausgewählt ist aus Peptiden, Fettsäuren; Lipoproteinen, Medikamenten und niedermolekularen Verbindungen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13, 15, 18 and 19, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fettleibigkeit verbundene Störung oder Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fettleibigkeit, Anorexie, Cachexie, Herzinsuffizienz, Koronarinsuffizienz, Apoplexie, atheromatösen Krankheiten, Arteriosklerose, arterieller Hypertension, Insulin-unabhängiger Diabetes, Hypertipidämie, und Hyperurikämie.