DE69822463T2

DE69822463T2 - Regulation der expression von chinolatphosphoribosyltransferase

Info

Publication number: DE69822463T2
Application number: DE69822463T
Authority: DE
Inventors: A. Mark CONKLING; Nandini Mendu; Wen Song
Original assignee: North Carolina State University; University of California
Current assignee: North Carolina State University; University of California
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2018-06-11
Also published as: HK1027379A1; IL132184A0; US7304220B2; EP0991766A1; ID29311A; CN1304576C; GR20010300003T1; CA2287776A1; IL192232A0; SK161899A3; BG64319B1; US6586661B1; US7408098B2; NO324872B1; CN100482799C; JP2001522250A; YU64899A; EP1457562B1; US20060191036A1; EA009898B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) und eine DNA, die dieses Enzym kodiert. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA, die Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert, um transgene Pflanzen herzustellen, die genetisch veränderte Nikotinkonzentrationen aufweisen, und die Pflanzen, die derartig produziert werden.
Stand der Technik
Die Herstellung von Tabak mit verringertem Nikotinanteil ist wegen der bestehenden Bedenken hinsichtlich der Abhängigkeit hervorrufenden Wirkung von Nikotin wichtig. Darüber hinaus sind Tabakpflanzen mit extrem niedrigen Nikotinproduktionswerten oder gänzlich ohne Nikotinproduktion als Empfänger von Transgenen verlockend, aus denen sich wirtschaftlich wertvolle Produkte gewinnen lassen, wie Arzneimittel- und Kosmetikakomponenten oder Lebensmittelzusätze. Zur Entfernung von Nikotin aus Tabak sind verschiedene Verfahren entwickelt worden. Die meisten dieser Verfahren entfernen aus dem Tabak allerdings auch andere Inhaltsstoffe zusätzlich zu Nikotin, und beeinträchtigen somit den Tabak negativ. Traditionelle Pflanzenzuchttechniken haben Tabakpflanzen mit niedrigerem Nikotinanteil (etwa 8%) erzielt als Pflanzen wilder Tabaksorten. Wünschenswert sind Tabakpflanzen und Tabake, die einen noch weiter reduzierten Nikotinanteil aufweisen.
Ein Ansatz zur Verringerung des Anteils eines biologischen Produkts ist die Verringerung der Enzymmenge, die für einen biosynthetischen Ablauf benötigt wird, der zur Herstellung dieses Produkts führt. Wenn das betroffene Enzym in quotenbestimmender Menge natürlich vorkommt (im Verhältnis zu anderen für diesen Ablauf benötigten Enzymen) bewirkt jegliche Verringerung der vorhandenen Menge dieses Enzyms eine Produktionsreduzierung des Endprodukts. Falls der Enzymanteil normalerweise nicht quotenbestimmend ist, muss sein Anteil in einer Zelle auf quotenbeschränkende Werte reduziert werden, um den Ausstoß des Ablaufs zu verringern. Umgekehrt bewirkt jegliche Erhöhung der Enzymaktivität eine Produktionssteigerung des biosynthetischen Ablaufs, wenn die natürlich vorkommende Enzymkonzentration quotenbegrenzend ist.
Nikotin wird vorwiegend in den Wurzeln von Tabakpflanzen gebildet und anschließend in die Blätter transportiert, wo es gespeichert wird (Tso. Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). Ein unabdingbarer Schritt zur Nikotinbiosynthese ist die Bildung von Nikotinsäure aus Chinolinsäure, wobei dieser Schritt durch das Enzym Chinolinphosphoribosyltransferase (CPRTase) katalysiert wird. CPRTase scheint im Ablauf ein quotenbegrenzendes Enzym zu sein, das Nikotinsäure zur Nikotinsynthese in Tabak liefert. Siehe, z.B. Feth et al., „Regulation in Tobacco Callus of Enyzme Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, pp 402-07 (1986); Wagner et al., "The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol. Plant., 68, pp. 667-72 (1986). Die Veränderung von Nikotinkonzentrationen in Tabakpflanzen durch Antisense-Steuerung oder Putrescencemethyltransferase (PMTase) – Abgabe wird in den U.S. Patentschriften 5,369,023 und 5,260,205 von Nakatani und Malik vorgeschlagen. Die PCT-Anmeldung WO 94/28142 von Wahad und Malik beschreibt DNA, die PMT kodiert, und die Verwendung von PMT-Konstrukten in Lese- und Antisense-Richtung.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes DNA-Molekül, das die SEQ ID NO:1 umfasst; DNA-Sequenzen, die ein Enzym kodieren, das die SEQ ID NO: 2 umfasst; DNA-Sequenzen, die zu mindestens 65% mit einer derartigen DNA homolog sind, und die ein Chinolatphosphoribosyltransferaseenzym kodieren; und DNA-Sequenzen, die durch Degeneration des genetischen Kodes von der oben genannten DNA abweichen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Peptid, das von einer derartigen DNA kodiert wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, der einen Promotor umfasst, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, und ein DNA-Segment, das eine Chinolatphosphoribosyltransferase-Enzymstellung kodiert, die dem Promotor nachgeschaltet positioniert ist und mit diesem funktionell verbunden ist. Die DNA, die das Enzym kodiert, kann in Antisense- oder in Leserichtung erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen pflanzlichen Zelle, die eine verringerte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase)-Expression aufweist, indem eine Pflanzenzelle einer Sorte vorgesehen wird, von der bekannt ist, dass sie Chinolatphosphoribosyltransferase exprimiert; die pflanzliche Zelle mit einem exogenen DNA-Konstrukt transformiert wird, der einen Promotor und DNA umfasst, die wiederum einen Abschnitt einer Sequenz umfasst, der Chinolatphosphoribosyltransferase-mRNA kodiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze der Art Nicotiana, die im Vergleich zu einer nicht-transformierten Kontrollpflanze eine verringerte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) – Expression aufweist. Die Zellen derartiger Pflanzen umfassen einen DNA-Konstrukt, der ein Segment einer DNA-Sequenz umfasst, das ein pflanzliches Chinolatphosphoribosyltransferase-mRNA kodiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verringerung der Expression eines Chinolatphosphoribosyltransferase-Gens in einer pflanzlichen Zelle, indem eine pflanzliche Zelle kultiviert wird, die so transformiert wurde, dass sie exogene DNA umfasst, wobei ein transkribierter Strang der exogenen DNA, der zur Chinolatphosphoribosyltransferase-mRNA komplementär ist, die zur Zelle endogen ist. Die Transkription des komplementären Strangs verringert die Expression des endogenen Chinolatphosphoribosylgens.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Tabakpflanzen, die in den Blättern der Tabakpflanzen verringerte Nikotinkonzentrationen aufweisen, indem eine Tabakpflanze mit Zellen kultiviert wird, die eine exogene DNA-Sequenz umfassen, wobei ein transkribierter Strang der exogenen DNA-Sequenz zur endogenen Chinolatphosphoribosyltransferase-Messenger-RNA in den Zellen komplementär ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine erhöhte Chinolatphosphoribosyl-transferase (CPRTase)-Expression aufweist, indem eine Pflanzenzelle, von der bekannt ist, dass sie Chinolatphosphoribosyltransferase exprimiert, mit einem exogenen DNA-Konstrukt transformiert wird, der eine DNA-Sequenz umfasst, die Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Nicotiana-Pflanze, die eine erhöhte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase)-Expression aufweist, wobei die Zellen der transgenen Pflanze eine exogene DNA-Sequenz umfassen, die eine pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zu erhöhter Expression eines Chinolatphosphoribosyltransferase-Gens in einer pflanzlichen Zelle, indem eine pflanzliche Zelle kultiviert wird, die so transformiert ist, dass sie eine exogene DNA umfasst, die Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
Eine weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Tabakpflanze, die in den Blättern erhöhte Nikotinkonzentrationen aufweist, indem eine Tabakpflanze kultiviert wird, die Zellen aufweist, die eine exogene DNA-Sequenz aufweisen, die in den Zellen funktionelle Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen zeigen:
1 den biosynthetischen Ablauf, der zu Nikotin führt. Die Enzymaktivitäten, von denen bekannt ist, dass sie durch Nic1 und Nic2 gesteuert werden, sind CPRTase (Chinolatephosphoribosyltransferase) und PMTase (Putrescencemethyltransferase).
2A die vorgesehene Nukleinsäure-Sequenz der NtCkPT1cDNA (SEQ ID NO:1), wobei die Kodierungssequenz (SEQ ID NO:3) in Großbuchstaben dargestellt ist.
2B die vorgesehenen abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:2) der Tabak-CPTRase, die durch NtCPT1cDNA kodiert ist.
3 die Ausrichtung der abgeleiteten NtCPT1-Aminosäuresequenzen und die dazugehörigen Sequenzen der Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Eschrichia coli, des Menschen und der Saccaromyces cerevisiae.
4 die Ergebnisse der Komplementierung eines Escherichia coli – Mutanten, dem Chinolatphosphoribosyltransferase (TH265) fehlt, mit NtCPT1 cDNA. Zellen wurden mit einem Expressionsvektor transformiert, der NtCPT1 trägt; das Wachstum transformierter TH265-Zellen, die NtCPT1 auf Minimalmedium exprimieren, dem Nikotinsäure fehlt, zeigt, das NtCPT1 CPRTase kodiert.
5 vergleichend Nikotinkonzentrationen und die relativ gleich bleibenden NtCTP1 mRNA-Konzentrationen in 1 und Nic2 – Tabakmutanten: wilde Burley 21 – Sorten (Nic1/Ni1 Nic2/Nic2); Nic1 Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic2 Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); und Nic1^– Nic2^– Burley 21 (nic1/nic1 nic2/nic2). Absteigend schraffierte Balken bezeichnen mRNA-Transkriptionskonzentrationen; aufsteigend schraffierte Balken bezeichnen Nikotinkonzentrationen.
6 im Zeitverlauf die Konzentrationen von NtCPT1 mRNA in Tabakpflanzen, deren Triebe gekappt wurden, im Vergleich zu ungestutzten Kontrollpflanzen. Absteigend schraffierte Balken geben die Transkriptionskonzentrationen von mRNA an; aufsteigend schraffierte Balken bezeichnen die Nikotinkonzentrationen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Nikotin entsteht in Tabakpflanzen, wenn Nikotinsäure und 4-Methylaminobutanal kondensieren. Der biosynthetische Ablauf, der zur Nikotinproduktion führt, ist in 1 dargestellt. Zwei Steuerpunkte (Nic1 und Nic2) wirken als ausschlaggebende Regulatoren der Nikotinproduktion zusammen. Enzymanalysen der Wurzeln von Einzel- und Doppel-Nic-Mutanten zeigen, dass die Aktivitäten der beiden Enzyme, Chinolatphosphoribosyl-transferase (CPRTase) und Putrescencemethyltransferase (PMTase), zur Nikotinbiosynthese direkt proportional sind. Ein Vergleich der Enzymaktivität in Tabakzellen (Wurzel und Narben) unterschiedlicher Kapazitäten an Nikotinsynthese zeigen, dass sich die CPRTase-Aktivität genau parallel zum Nikotingehalt verhält (Wagner und Wagner, Planta 165:532 (1985). Saunders und Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) zeigten, dass sich die Konzentration von CPRTase in den Wurzeln von Niedrignikotin-Mutanten proportional zu den Nikotinkonzentrationen in den Blättern verhält.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine neue cDNA-Sequenz (SEQ ID NO:1), die ein pflanzliches Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) von SEQ ID NO:2 kodiert. Da sich die CPRTase-Aktivität der Nikotinkonzentration genau kongruent verhält, führt die Herstellung von transgenen Tabakpflanzen, in denen CPRTase-Konzentrationen in den Wurzeln verringert wurde (im Verhältnis zu wilden Pflanzensorten), zu Pflanzen, die verringerte Nikotinkonzentrationen in den Blättern aufweisen. Die vorliegende Erfindung sieht Verfahren und Nukleinsäurekonstrukte zur Herstellung solcher transgenen Pflanzen vor, sowie derartige transgene Pflanzen. Derartige Verfahren umfassen die Expression von Antisense-NtCPT1 RNA, die die Konzentration von CPRTase in den Wurzeln von Tabakpflanzen senkt. Nikotin wurde außerdem in nicht zu den Tabaken gehörenden Pflanzenarten und -familien gefunden, obwohl hier normalerweise die vorhandene Konzentration viel niedriger liegt als bei N. Tabacum.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem in Lese- und Antisense-Orientierung rekombinierte DNA-Moleküle vor, die CPRTase oder CPRTase-Antisense-RNA-Moleküle kodieren, und Vektoren, die diese rekombinierten DNA-Moleküle umfassen, sowie transgene pflanzliche Zellen und Pflanzen, die mit derartigen DNA-Molekülen und -Vektoren transformiert worden sind. Erfindungsgemäße transgene Tabakzellen und -pflanzen sind gekennzeichnet durch niedrigere oder höhere Nikotinkonzentrationen als nicht transformierte Kontroll-Tabakzellen und -pflanzen.
Tabakpflanzen mit äußerst niedrigen Mengen an Nikotinexpression oder gar keiner Nikotinexpression sind als Empfänger von Transgenen wünschenswert, die wirtschaftlich wertvolle Produkte exprimieren, wie Arzneimittel- und Kosmetikkomponenten oder Lebensmittelzusatzstoffe. Tabak ist als Wirtspflanze für ein Transgen attraktiv, das ein gewünschtes Produkt kodiert, da Tabak einfach genetisch programmiert werden kann und pro Hektar eine sehr große Biomasse erzielt; Tabakpflanzen, die weniger Rohstoffe zur Nikotinproduktion verwenden, haben deshalb mehr Rohstoffe zur Verfügung, um transgene Produkte herzustellen. Verfahren zur Transformierung von Tabak mittels Transgenen, die die erwünschten Produkte herstellen, sind in Fachkreisen bekannt; jegliche geeignete Technik kann für Tabakpflanzen mit erfindungsgemäß niedrigem Nikotingehalt verwendet werden.
Erfindungsgemäße Tabakpflanzen mit verringerter CPRTase-Expression und verringerter Nikotinkonzentration sind für die Herstellung von Tabakprodukten wünschenswert, die eine verringerte Nikotinkonzentration aufweisen. Erfindungsgemäße Tabakpflanzen sind zur Verwendung in einem beliebigen herkömmlichen Tabakprodukt geeignet, einschließlich ohne Beschränkung in Pfeifen-, Zigarren- und Zigarettentabak sowie Kautabak, und können in beliebiger Form vorliegen, einschließlich Tabakblättern, zerfasertem oder geschnittenem Tabak.
Die erfindungsgemäßen Konstrukte können auch bei der Bereitstellung transgener Pflanzen nützlich sein, die in der Pflanze eine erhöhte CPRTase-Expression und eine erhöhte Nikotinkonzentration aufweisen. Derartige Konstrukte und Verfahren zur Verwendung dieser Konstrukte und der damit hergestellten Pflanzen können bei der Herstellung von Tabakprodukten wünschenswert sein, die eine geänderte Nikotinkonzentration aufweisen, oder bei der Produktion von Pflanzen, die für den Pflanzenschutz einen erhöhten Nikotingehalt aufweisen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben erkannt, dass das TobRD2-Gen (siehe Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) eine Nicotiana tabacum CPRTase kodiert, und sehen hiermit die cDNA-Sequenz des NtCPT1 (früher TobRD2 genannt) und die Aminosäuresequenz des kodierten Enzyms vor. Vergleiche der NtCPT1 Aminosäuresequenz mit der GenBank-Datenbank offenbaren beschränkte Sequenzähnlichkeiten zu bakteriellen Proteinen, die Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) kodieren (3).
Chinolatphosphoribosyltransferase wird wiederum zur Biosynthese von Nikotinadenin-Dinukleotid (NAD) benötigt, sowie bei Protokaryoten und Eukaryoten. Bei Tabak werden hohe CPRTase – Konzentrationen in der Wurzel aber nicht in den Blättern gemessen. Um zu beweisen, dass NTCPT1 CPRTase kodiert, verwenden die Erfinder der vorliegenden Erfindung Escherichia coli – Bakterienstränge (TH265), einen Mutanten, dem Chinolatphosphoribosyltransferase (nadC+) fehlt. Dieser Mutant kann auf Minimalmedium, dem Nikotinsäure fehlt, nicht gedeihen. In diesem Bakterienstrang stellt nun die Expression von NtCPT1-Protein die NadC+ – Erscheinungsform bereit (4) und bestätigt dadurch, dass NtCPT1 CPRTase kodiert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten die Auswirkungen von Nic1 und Nic2 – Mutanten auf Tabak, und die Auswirkungen des Stutzens auf Tabakpflanzen, auf NtCPT1 gleich bleibender mRNA-Konzentrationen und Nikotinkonzentrationen. (Beseitigung der vorstehenden Krone durch Kappen zu Beginn der Blüte ist allgemein dafür bekannt, dass es zu erhöhten Nikotinbiosynthesewerten und – transport innerhalb des Tabaks führt und ist bei der Tabakherstellung ein Standartverfahren.) Falls NtCPT1 wirklich an der Nikotinbiosynthese beteiligt ist, ist es zu erwarten, dass (1) NtCPT1-mRNA-Konzentrationen in Nic1/Nic2-Doppelmutanten niedriger wären und (2) NtCPT1-mRNA-Konzentrationen nach dem Kronenstutzen steigen würden. NtCPT1-mRNA-Konzentrationen in Nic1/Nic2-Doppelmutanten lagen bei etwa 25% der Werte wilder Sorten (5.) Desweiteren stiegen innerhalb von sechs Stunden nach dem Kronenstutzen die NtCPT1-mRNA-Konzentrationen in Tabakpflanzen um etwa das achtfache an. Dadurch wurde NtCPT1 als Hauptsteuerungs-Gen beim Ablauf der Nikotin-Biosyntese bestimmt.
Transgene pflanzliche Zellen und Pflanzen
Die Steuerung von Genexpression in pflanzlichen Zell-Genomen kann durch die Integration von heterologer DNA unter transkribierender Kontrolle eines Promotors erreicht werden, der im Wirt funktionell ist, und in dem die transkribierten Stränge der heterologen DNA zu dem Strang der DNA komplementär ist, der vom endogenen Gen transkribiert wird, das gesteuert werden soll. Die eingeführte DNA, die als antisense DNA bezeichnet wird, sieht eine RNA-Sequenz vor, die zu natürlich hergestellten (endogenen) mRNAs komplementär ist, und die die Expression endogener mRNAs verhindert. Der Mechanismus derartiger Genexpressions-Regulatoren durch Antisense ist noch nicht völlig geklärt. Um nicht auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu werden, wird angemerkt, dass nur eine Theorie der Antisense-Steuerung unterstellt, dass die Transkribierung von Antisense-DNA RNA-Moleküle produziert, die sich an endogene mRNA-Moleküle anbinden und einer Tranksription vorbeugen oder diese verhindern.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann das Antisense-Produkt zu den kodierenden oder nicht kodierenden Anschnitten (oder beiden) der natürlich vorkommenden Ziel-RNA komplementär sein. Das Antisense-Konstrukt kann in beliebiger, angemessener Weise in die pflanzlichen Zellen eingeführt werden, und kann zur induzierbaren oder konstituierbaren Transkription der Antisense-Sequenz in die Pflanzengenome integriert werden. Siehe, z.B. die U.S.
Patentschriften Nr. 5,453,566 und 5,107,065 von Shewmaker et al. (in Gänze hierbei durch Verweis eingeschlossen.)
Wie hier verwendet bezeichnen exogene oder heterologe DNA (oder RNA) DNA (oder RNA), die in eine Zelle (oder einen Vorläufer der Zelle) durch menschlichen Eingriff eingeführt wurde. Eine solche heterologe DNA kann die Kopie einer Sequenz sein, die natürlich in der zu transformierenden Zelle oder Fragmenten davon vorkommt.
Um eine Tabakpflanze herzustellen, die verringerte CPRTase-Konzentrationen aufweist, und dadurch einen niedrigeren Nikotinanteil als nicht transformierte Kontroll-Tabakpflanzen, kann eine Tabakzelle mit einer exogenen CPRT Antisense-Transkriptionseinheit transformiert werden, die eine Teil-CPRT cDNA-Sequenz aufweist, eine CPRT cDNA-Sequenz voller Länge, eine Teil-CPRT Chromosomal-Sequenz oder eine CPRT-Chromosomalsequenz voller Länge, in Antisense-Ausrichtung mit der entsprechenden funktionell verbundenen Steuerungssequenz. Angemessene Steuerungssequenzen umfassen eine Transkriptions-Einleitungssequenz („Promotor"), der in der zu transformierenden Pflanze operieren kann, und eine Polyadenylierung/Transkriptions-Endsequenz. Standardtechnologien, wie ein Abgrenzungs-Mapping, Identifizierung von DNA-Abschnitten durch Elektrophorese nach Hybridisierung und die Analyse von Nukleotidsequenzen werden dann angewandt, um Klone zu identifizieren, die CPRTase-Sequenzen in der Antisense-Ausrichtung tragen, die funktionell mit den Steuerungssequenzen verbunden sind. Tabakpflanzen werden dann aus erfolgreich transformierten Zellen regeneriert. Es ist besonders bevorzugt, wenn die verwendeten Antisense-Sequenzen zu den endogenen Sequenzen komplementär sind, kleinere Abweichungen in den exogenen und endogenen Sequenzen können allerdings toleriert werden. Es ist bevorzugt, wenn die Antisense-DNA-Sequenzen zu den unten beschriebenen strikten Bedingungen eine ausreichende Sequenzähnlichkeit aufweisen, die eine Bindung der endogenen Sequenzen in der zu steuernden Zelle ermöglichen.
Antisense-Technologie ist in verschiedenen Labors verwendet worden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, die durch bestimmte Enzymkonzentrationen gekennzeichnet sind, die unter den normalen Werten liegen. Beispielsweise wurden Pflanzen mit verringerter Chalkonsynthase erzeugt, einem Enyzm eines biosynthetischen Blütenpigmentablaufs, indem ein Chalkonsynthase-Antisense-Gen in das Genom von Tabak und Petunia eingeführt wurde. Diese transgenen Tabak- und Petuniapflanzen treiben Blüten hellerer Farbe als normal (Van der Krol et al., „An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature, 333, pp. 866-69 (1988). Antisense-RNA-Technologie wurde auch erfolgreich angewandt, um die Produktion von Enzympolygalacturonase in Tomaten zu verhindern (Smith et al., „Antisense RNA inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature, 334, pp. 724-26 (1988); Sheehy et al., „Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA", Proc. Natl. Acad Sci., USA, 85, pp. 8805-09 (1988)), und eine kleine Untereinheit des Enzyms Ribulose-Bisphosphatcarboxylase in Tabak (Rodermel et al., „Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, pp. 673-81 (1988)). Andererseits können transgene Pflanzen, die durch übernormale Mengen eines bestimmten Enzyms gekennzeichnet sind, erzeugt werden, indem die Pflanzen mit dem Gen für dieses Enzym in Leserichtung (d.h. normalen Richtung) transformiert werden. Nikotinkonzentrationen in erfindungsgemäßen transgenen Tabakpflanzen können mit Standard-Nikotinanalyseverfahren bestimmt werden. Transformierte Pflanzen, in denen die Konzentration von CPRTase im Vergleich zu nicht transformierten Kontrollpflanzen verringert wurde, weisen entsprechend niedrigere Nikotinkonzentrationen auf im Vergleich zur Kontrolle; transformierte Pflanzen, in denen die Konzentration von CPRTase im Vergleich zu nicht transformierten Kontrollpflanzen erhöht ist, weisen entsprechend höhere Nikotinkonzentrationen auf im Vergleich zur Kontrolle.
Die heterologe Sequenz, die im erfindungsgemäßen Antisense-Verfahren verwendet wird, kann so ausgewählt werden, dass sie ein RNA-Produkt erzeugt, das zur gesamten CORTase mRNR-Sequenz oder einem Teil davon komplementär ist. Die Sequenz kann zu einer beliebigen zusammenhängenden Sequenz der natürlichen Messenger-RNA komplementär sein, d.h. sie kann zur endogenen mRNA-Sequenz komplementär sein, die sich nahe der 5'End- oder Deckelseite, der Deckelseite nachgeschaltet, zwischen der Deckelseite und dem Anfangskodon befindet, und kann den gesamten oder nur einen Teil des nicht-kodierten Bereichs bedecken, kann einen nicht-kodierten und einen kodierten Bereich überbrücken, kann zum gesamten oder einem Teil des kodierten Bereichs komplementär sein, kann zum 3'Ende des kodierten Bereichs komplementär sein, oder komplementär zum 3'nicht-transformierten Bereich der mRNA. Geeignete Antisense- Sequenzen können von mindestens 13 bis etwa 15 Nukleotiden reichen, mindestens jedoch von etwa 16 bis 21 Nukleotiden, mindestens etwa 20 Nukleotiden, mindestens etwa 30 Nukleotiden, mindestens etwa 50 Nukleotiden, mindestens etwa 75 Nukleotiden, mindestens etwa 100 Nukleotiden, mindestens etwa 125 Nukleotiden, mindestens etwa 150 Nukleotiden, mindestens etwa 200 Nukleotiden oder mehr. Außerdem können die Sequenzen an ihrem 3' oder 5'Ende verlängert oder verkürzt sein.
Die bestimmte Antisense-Sequenz und die Länge der Antisense-Sequenz variieren entsprechend des Grads an gewünschter Hemmungsstärke, der Stabilität der Antisense-Sequenz und ähnlichem. Ein Fachmann wird sich bei der Auswahl der geeigneten CPRTase Antisense-Sequenz von Techniken leiten lassen, die in Fachkreisen bekannt und hier als Information vorgesehen sind. Bezüglich der vorliegenden 2A und SEQ ID NO:1 kann ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ein zusammenhängendes Fragment einer CPRTase cDNA-Sequenz in Antisense-Ausrichtung sein und eine beliebige Länge aufweisen, die ausreicht, den gewünschten Effekt zu erzielen, wenn sie in eine Empfänger-Pflanzenzelle transformiert wird.
Die vorliegende Erfindung kann auch in Verfahren zur Sense-Mitunterdrückung bei der Nikotinproduktion verwendet werden. Sense-DNAs, die verwendet werden, die vorliegende Erfindung auszuführen, weisen eine ausreichende Länge auf, um die Expression des der Pflanze eigenen CPRTase Proteins zu unterdrücken, wenn es in einer pflanzlichen Zelle exprimiert wird, wie es hier für diese pflanzliche Zelle beschrieben wird. Derartige Sense-DNAs können im Wesentlichen ganze Genome oder komplementäre DNAs sein, die das CPRTase-Enzym kodieren, oder Fragmente derselben, wobei solche Fragmente normalerweise mindestens etwa 15 Nukleotiden lang sind. Dem Fachmann sind die Verfahren bekannt, die Länge der Sense-DNA zu bestimmen, die die Expression eines natürlichen Gens in einer Zelle unterdrücken.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführung werden Nicotiana Pflanzenzellen mit einem DNA-Konstrukt transformiert, das ein DNA-Segment enthält, das ein enzymatisches RNA-Molekül kodiert (d.h., ein „ribozym"), wobei das enzymatische RNA-Molekül gegen die mRNA-Transkription der DNA gerichtet ist (d.h. abspaltet), die die pflanzliche CPRTase wie hier beschrieben kodiert. Ribozyme enthalten Substrate, die Bezirke binden, die sich an zugängliche Bereiche der Ziel-mRNA anbinden, und Bezirke, die die Spaltung von RNA katalysieren, und damit die Transformierung und die Proteinproduktion verhindern. Die bindenden Bezirke können Antisense-Sequenzen umfassen, die komplementär zur Ziel-mRNA-Sequenz sind; das katalytische Motiv kann hier ein Hakenkopf-Motiv oder ein anderes Motiv sein, wie das Haarnadelmotiv. Ribozym-Abspaltungsstellen innerhalb einer Ziel-RNA können zuerst durch Abtasten des Zielmoleküls auf Ribozym-Abspaltungsstellen identifiziert werden (z.B.: GUA, GUU oder GUC-Sequenzen). Nach der Identifizierung können kurze RNA-Sequenzen von 15, 20, 30 oder mehr Ribonukleotiden, die dem Bezirk des Zielgens zugeordnet sind, der die Abspaltungsstelle enthält, auf erwartete strukturelle Eigenschaften bewertet werden. Die Eignung des anvisierten Ziels kann auch bewertet werden, indem dessen Zugänglichkeit für Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden getestet wird, wobei Ribonuklease-Herstellungsroutinen verwendet werden, die in der Fachwelt bekannt sind. DNA-kodierende enzymatische RNA-Moleküle können gemäß bekannter Techniken hergestellt werden. Siehe, z.B., T. Cech et al., U.S. Patentschrift Nr. 4,987,071; Keefe et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,559.021; Donson et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,589,367; Torrence et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,583,032; Joyce, U.S. Patentschrift Nr. 5,580,967; Gold et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,595,877; Wagner et al., U.S. Patentschriften Nr. 5,591,601; und U.S. Patentschrift Nr. 5,622,854 (deren Offenlegung hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit hierin enthalten ist). Die Herstellung eines derartigen enzymatischen RNA-Moleküls in einer pflanzlichen Zelle und die Störung der CPRTase-Proteinproduktion verringert die CPRTase-Aktivität in pflanzlichen Zellen auf im Wesentlichen die gleiche Weise wie die Produktion eines Antisense-RNA-Moleküls: das heißt, durch Störung der Transformierung der mRNA in der Zelle, die das Enzym produziert. Der Ausdruck „Ribozym" wird hier verwendet, eine RNA-enthaltende Nukleinsäure zu beschreiben, die wie ein Enzym wirkt (beispielsweise als eine Endoribonuklease) und die wechselweise mit „enzymatischen RNA-Molekülen" verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin DNA, die Ribozyme kodiert und DNA, die Ribozyme kodiert, die in einen Expressionsvektor eingebracht wurden, Wirtszellen, die derartige Vektoren enthalten, und Verfahren zur Verringerung der CPRTase-Produktion in Pflanzen, die Ribozyme verwenden.
Nukleinsäuresequenzen, die verwendet werden, die vorliegenden Erfindung auszuführen, umfassen solche, die Sequenzen aufweisen, die SEQ ID NO:1 ähneln, und ein Protein kodieren, das Chinoiatphosphoribosyltransferase-Aktivitäten kodiert. Diese Definition soll natürliche alle Abarten des CPRTase-Proteins einschließen. Folglich können auch DNA-Sequenzen verwendet werden, die zur DNA von SEQ ID NO:1 hybridisieren und zur Expression von CPRTase kodiert sind, insbesondere pflanzlichem CPRTase-Enzym, um die vorliegenden Erfindung auszuführen.
Verschiedene Formen des Tabak-CPRT-Enzyms können vorkommen. Die verschiedenen Formen eines Enzyms können von Modifizierungen eines einzelnen Genprodukts nach der Transformierung herrühren oder von verschiedenen Formen des NtCPRT1-Gens.
Auf herkömmliche Weise können die Bedingungen bestimmt werden, die es anderen DNA-Sequenzen ermöglichen, die zur Expression eines Proteins kodiert sind, das CPRTase-Aktivitäten aufweist, zu DNA der SEQ ID NO:1 oder zu anderen DNA-Sequenzen zu hybridisieren, die das in SEQ ID No.2 dargestellte Protein kodieren. Beispielsweise kann die Hybridisierung derartiger Sequenzen unter mehr oder weniger strengen Bedingungen ausgeführt werden (z.B. Bedingungen, die durch eine Waschknappheit von 0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 60°C oder sogar 70°C hinsichtlich DNA repräsentiert werden, die das hier als SEQ ID NO:2 vorgesehene Protein in einer Standard – in situ Hybridisierungsprobe kodieren. Siehe J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Im allgemeinen sind derartige Sequenzen zu mindestens 65%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar 95% und mehr der Sequenz ähnlich, die hier als SEQ ID N0:1 angegeben ist oder DNA-Sequenzen, die Proteine der SEQ ID Nr.1 kodieren. (Bestimmungen von Sequenzähnlichkeiten werden durchgeführt, indem die beiden Sequenzen auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet werden; bei der Ermittlung der maximalen Übereinstimmung darf es Lücken in der einen oder anderen der beiden Sequenzen geben, die aufeinander ausgerichtet werden. Lückenlängen von 10 oder weniger sind bevorzugt, Lückenlängen von 5 oder weniger sind besonders bevorzugt, und Lückenlängen von 2 oder weniger werden noch mehr bevorzugt.)
Es gibt Differential-Hybridisierungsverfahren, die die Isolierung von cDNA-Klonen ermöglichen, die so kleine mRNA-Konzentrationen wie 0,05 der poly(A+)RNR aufweisen. Siehe M. Conkling et al., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). In Kürze, cDNA-Dateien werden durch die Verwendung von Einzelstrang-cDNA-Proben von entgegengesetzt transkribierten mRNA aus pflanzlichen Zellen geprüft (z.B., Wurzeln bzw. Blättern.) Zur Unterschiedsprüfung wird eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran mit 5xSSC getränkt, in einen 96-rohrigen Saugverteiler gegeben, über Nacht werden in jedes Rohr 150 μL stationärer Kultur aus einer Masterplatine übertragen und Unterdruck angelegt bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter gelaufen ist. 150 μL der denaturierten Lösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) werden mittels einer Mehrfachpipette in jedes Rohr eingebracht und etwa 3 Minuten stehen gelassen. wie oben wird Unterdruck angelegt, der Filter entfernt und in 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert, 1,5 M NaCl. Dann wird es 2 Stunden lang im Vakuum erhitzt und mit den relevanten Proben inkubiert. Durch die Verwendung von Nylonmembranfiltern und die Tatsache, dass die Mutterplatine bei –70°C in 7% DMSO gelagert wird, können die Filter mehrfach mit verschiedenen Proben und geeigneten Klonen geprüft werden, die auch nach mehreren Jahren der Lagerung wieder hervorgeholt wurden.
In der hier vorliegenden Verwendung bezeichnet das Wort „Gen" eine DNA-Sequenz, die (1) vorgeschaltete (5') Steuerungssignale einschließlich Promotoren umfasst, (2) einen Kodierungsbezirk, der das Produkt, das Protein oder die RNA des Gens festlegt, (3) nachgeschaltete (3') Bezirke einschließlich Transkriptionsend- und Polyadenylierungssignale und (4) dazugehörige Sequenzen, die zur effizienten und bestimmten Expression benötigt werden.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann im Wesentlichen aus der hier vorgesehenen Sequenz bestehen (SEQ ID NO:1) oder gleichwertigen Nukleotidsequenzen, die alle oder polymorphe Varianten dieses Gens darstellen oder kodierende Bereiche davon.
Die Verwendung des Ausdrucks „wesentliche Sequenzähnlichkeit" in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bezeichnet diejenigen DNA-, RNA- oder Aminosäure-Sequenzen, die geringe und wirkungslose Sequenzvariationen von der eigentlichen hier offen gelegten und beanspruchten Sequenz aufweisen und sollen als den Sequenzen der vorliegenden Erfindung gleichwertig betrachtet werden. In diesem Sinne bedeuten „geringe und wirkungslose Sequenzvariationen", dass „ähnliche" Sequenzen (z.B., diejenigen Sequenzen, die wesentliche Sequenzähnlichkeiten mit der DNA, RNA oder den Proteinen aufweisen, die hier offen gelegt und beansprucht werden) den offen gelegten und in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Sequenzen funktionell gleichwertig sind. Funktionell gleichwertige Sequenzen wirken im Wesentlichen auf gleiche Weise, um im Wesentlichen die gleichen Verbindungen wie die hier offen gelegten und beanspruchten Nukleinsäuren und Nukleinsäureverbindungen herzustellen.
Hier vorgesehene DNA-Sequenzen können in eine Vielzahl an Wirtszellen transformiert werden. In der Fachwelt steht eine Vielzahl an geeigneten Wirtszellen bereit, die erwünschte Wachstums- und Weiterleitungseigenschaften aufweisen.
Die Verwendung des Ausdrucks „isoliert" oder „im Wesentlichen rein" in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen als Regler von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen heißt, dass die dafür bestimmten DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteine durch menschliche Einwirkung von ihrer in vivo Zellumgebung getrennt wurden.
Wie hier verwendet bezeichnet eine „native DNA-Sequenz" oder „natürliche DNA-Sequenz" eine DNA-Sequenz, die aus nicht-transgenen Zellen oder -Gewebe isoliert werden kann. Native DNA-Sequenzen sind solche, die nicht künstlich, wie durch ortsspezifische Mutagenese verändert worden sind. Sind native DNA-Sequenzen einmal identifiziert, können DNA-Moleküle, die native DNA-Sequenzen aufweisen, chemisch synthetisiert oder hergestellt werden, indem in der Fachwelt bekannte DNA-Rekombinierungsverfahren verwendet werden. Wie hier verwendet, stellt eine native pflanzliche DNA-Sequenz eine solche dar, die von nicht-transgenen pflanzlichen Zellen oder -Geweben isoliert werden kann. Wie hier verwendet stellt eine native Tabak-DNA-Sequenz eine solche dar, die aus nicht-transgenen Tabakzellen oder – geweben isoliert werden kann.
Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte oder „Transkriptionskassetten" umfassen einen wie hier diskutierten Promotor, eine wie hier beschriebene DNA-Sequenz, die funktionell dem Promotor verbunden ist, und gegebenenfalls eine Endsequenz einschließlich eines Haltesignals für RNA-Polymerase und ein Polyadenylationssignal zur Polyadenylase 5' bis 3' in Richtung der Transkription. Diese Regelbereiche sollten alle in den Zellen des zu transformierenden Gewebes operieren können. Bei der erfindungsgemäßen Ausführung kann ein beliebiges geeignetes Endsignal verwendet werden, Beispiele hierzu umfassen ohne Beschränkung den Nopalinsynthase(nos)Terminator, den Octapinsymphase(ocs)Terminator, den CaMV-Terminator oder native Endsignale, die von den gleichen Genen abgeleitet wurden wie der Transkriptions-Anfangsbereich oder von einem anderen Gen abgeleitet wurden. Siehe, z.B. Rezian et al. (1988) s.o. und Rodermel et al. (1988), s.o.
Der Ausdruck „funktionell verbunden", wie er hier verwendet wird, bezeichnet DNA-Sequenzen eines einzelnen DNA-Moleküls, die so zugeordnet sind, dass die Funktion der einen von der anderen beeinflusst wird. Deshalb ist ein Promotor mit einer DNA funktionell verbunden, wenn er die Transkription dieser DNA beeinflussen kann (d.h. die DNA unterliegt der Transkriptionssteuerung des Promotors). Der Promotor soll der DNA „vorgeschaltet" positioniert sein, die wiederum dem Promotor „nachgeschaltet" positioniert sein soll.
Die Transkriptionskassette kann in einem DNA-Konstrukt vorgesehen sein, der ebenfalls mindestens ein Replikationssystem aufweist. Der Einfachheit halber wird gewöhnlich Replikationssystem funktional in Escherichia coli vorgesehen, wie ColE1, pSC101, pACZC184 oder ähnlichen. Auf diese Weise kann der entstehende Konstrukt in jeder Phase einer beliebigen Manipulation geklont, sequentiert und auf die Richtigkeit der Manipulation kontrolliert werden. Zusätzlich oder anstelle des E.coli Replikationssystems können eine ganze Reihe verschiedener Wirts-Replikationssysteme verwendet werden, wie die Replikationssysteme des P-1-Unverträglichkeitsplasmids, z.B., pRK290. Zusätzlich zu den Replikationssystemen ist häufig mindestens ein Marker vorgesehen, der in einem oder mehreren Wirten nützlich sein kann, oder auch verschiedene Marker für die einzelnen Wirte. Das heißt, ein Marker kann für die Auswahl in einem prokarzotischen Wirt verwendet werden, während ein anderer Marker für die Auswahl in einem eukaryotischen Wirt verwendet werden kann, insbesondere dem pflanzlichen Wirt. Die Marker können gegen ein Pflanzenschutzmittel schützen, wie ein Antibiotikum, Gift, Schwermetall oder ähnlichem; sie können Komplementierungen vorsehen, indem ein auxotropher Wirt mit Prototropie versehen wird; oder dadurch, dass eine sichtbare Erscheinungsform durch die Herstellung einer neuen Verbindung in der Pflanze vorgesehen wird.
Die verschiedenen Fragmente umfassen verschiedene Konstrukte, Transkriptionskassetten, Marker und ähnliches, die nach einander eingeführt werden können, indem Enzymspaltungen eines geeigneten Replikationssystems eingeschränkt werden und bestimmte Konstrukte oder Fragmente in eine vorhandene Stelle eingefügt werden. Nach der Ligierung und dem Klonen kann das DNA-Konstrukt für weitere Manipulationen isoliert werden. All diese Techniken werden in der Literatur ausreichend anhand von Beispielen dargestellt, wie beispielsweise von J. Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory).
Vektoren, die verwendet werden können, um Pflanzengewebe mit erfindungsgemäßen Nukleinsäure-konstrukten zu transformieren, umfassen sowohl Agrobacterium-Vektoren und Stoßvektoren sowie Vektoren, die zur DNA-vermittelten Transformierung geeignet sind.
Der Ausdruck „Promotor" betrifft einen Bereich einer DNA-Sequenz, der die notwendigen Signale zur effizienten Expression kodierter Sequenzen enthält. Dieser kann Sequenzen umfassen, an die sich eine RNA-Polymerase bindet, ist aber nicht auf derartige Sequenzen beschränkt und kann Bereiche umfassen, an die sich andere Steuerproteine zusammen mit Bereichen anbinden, die sich mit der Steuerung der Proteintranslation beschäftigen, und können kodierende Sequenzen umfassen.
Promotoren, die verwendet werden, die vorliegende Erfindung auszuführen, können konstitutiv aktive Promotoren sein. Zahlreiche konstitutiv aktive Promotoren stehen zur Verfügung, die in Pflanzen funktionell sind. Ein bevorzugtes Beispiel ist der Blumenkohl-Mosaik Virus (CaMV) 35S – Promotor, der in den meisten Pflanzenzellen konstitutiv expliziert wird. Alternativ kann der Promotor auch ein wurzelspezifischer Promotor oder ein wurzelcortexspezifischer Promotor, wie nachstehend näher erläutert.
Antisense Sequenzen wurden in transgenen Tabakpflanzen expliziert, die den Blumenkohl-Mosaik Virus (CaMV) 35S Promotor verwenden. Siehe, z.B., Cornelissen et al., „Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco", Nucleic Acids Res. 17, pp. 833-43 (1989); Rezaian et al., „Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus", Plant Molecular Biology 11, pp. 463-71 (1988); Rodermel et al., „Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell 55, pp. 673-81 (1988); Smith et al., „Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature 334, pp. 724-26 (1988); Van der Krol et al., „An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature 333, pp. 866-69 (1988).
Die Verwendung des CaMV 35S Promotor ist bevorzugt für die Expression von CPTRase in erfindungsgemäß transformierten Tabakzellen und -pflanzen. Die Verwendung des CaMV-Promotors zur Expression anderer rekombinanter Gene in Tabakwurzeln ist reichlich beschrieben (Lam et al., „Site-Specific Mutations Alter in Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants", Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 86, pp. 7890-94 (1989); Poulsen et al., „Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8S Gene", Mol. Gen. Genet. 214, pp. 16-23 (1988)).
Andere Promotoren, die nur in Wurzelzellen (wurzelspezifische Promotoren) funktionell sind, sind ebenfalls für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet. Siehe, z.B., U.S. Patentschrift Nr. 5,459,252 von Conkling et al., Yamamoto et al., The Plant Cell, 3:371 (1991). Der TobRD2 wurzelcortex-spezifische Promotor kann ebenfalls verwendet werden. Siehe, z.B., die U.S. Anmeldung SN 08/508,786, die inzwischen zugelassen wurde, von Conkling et al., PCT WO 9705261. Alle hier herangezogenen Patente sind hierbei in Gänze durch Verweis eingeschlossen.
Die CPRTase rekombinierten DNA-Moleküle und -Vektoren, die zur Herstellung der erfindungsgemäß transformierten Tabakzellen und -pflanzen verwendet wurden, können außerdem ein dominantes, wählbares Marker-Gen umfassen. Geeignete dominante, wählbare Marker zur Verwendung in Tabak umfassen, unter anderen, antibiotikaresistente Gene, die Neomycinphosphattransferase (NPTII), Hygromycinphosphotransferase (HPT) und Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodieren. Ein anderer bekannter, dominanter, wählbarer Marker, der zur Verwendung in Tabak geeignet ist, ist ein mutantes Dihydrofolatreductase-Gen, das methotrexatresistente Dihydrofolatreduktase kodiert. DNA-Vektoren, die geeignete antibiotikaresistente Gene enthalten, und deren zugehörige Antibiotika sind im Handel erhältlich.
Transformierte Tabakzellen werden aus dem sie umgebenden Gewebe nicht transformierter Zellen ausgewählt, indem eine Sammlung unterschiedlicher Zellen in ein Kulturmedium gegeben wird, das eine geeignete Konzentration Antibiotika enthält (oder andere, nomalerweise für Tabakzellen giftige Verbindungen), gegen die die gewählten dominanten, wählbaren Markergen-Produkte resistent sind. Dadurch überleben und vermehren sich nur solche Tabakzellen, die transformiert wurden.
Verfahren, die erfindungsgemäße rekombinante Pflanzen herstellen, beginnen im allgemeinen indem eine regenerierbare pflanzliche Zelle vorgesehen wird (normalerweise befindet sich eine solche pflanzliche Zelle in einem regenerierbaren Gewebe). Die pflanzliche Zelle wird dann mit einem DNA-Konstrukt transformiert, das eine erfindungsgemäße Transkriptionskassette umfasst (wie hier beschrieben) und aus der transformierten pflanzlichen Zelle wird eine rekombinierte Pflanze regeneriert. Wie nachstehend erläutert, wird der Transformationsschritt mittels der Fachwelt bekannter Techniken ausgeführt, einschließlich ohne Beschränkung durch Beschießen der pflanzlichen Zellen mit Mikropartikelchen, die die Transkriptionskassette tragen, die die Zellen mit einem Agrobacterium tumefaciens infizieren, das ein Ti-Plasmid enthält, das die Transkriptionskassette trägt, oder einer anderen beliebigen Technik, die geeignet ist, transgene Pflanzen herzustellen.
Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind zahlreiche Agrobacterium-Vektorsysteme bekannt. Beispielsweise legt die U.S. Patentschrift Nr. 4,459,355 ein Verfahren zur Transformierung empfänglicher Pflanzen, einschließlich zweikeimblättriger Pflanzen, mit einem Agrobacterium-Strang offen, das das Ti-Plasmid enthält. Die Transformation holziger Pflanzen mit einem Agrobacterium-Vektor wird in der U.S. Patentschrift Nr. 4,795,855 offen gelegt. Desweiteren legen die U.S. Patentschriften Nr. 4,940,838 von Schilperoort et al. einen binären Agrobacterium-Vektor offen (d.h., einen, in dem das Agrobacterium ein Plasmid enthält, das die vir-Region des Ti-Plasmids aber keine T-Region, und ein zweites Plasmid, das eine T-Region aber keine vir-Region enthält), das zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
Mikropartikelchen, die einen erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt tragen, dessen Mikropartikelchen zur ballistischen Transformierung einer pflanzlichen Zelle geeignet sind, können auch zur Herstellung erfindungsgemäß transformierter Pflanzen verwendet werden. Das Mikropartikelchen wird in eine pflanzliche Zelle geschossen, um eine transformierte pflanzliche Zelle herzustellen, und aus der transformierten pflanzlichen Zelle wird eine Pflanze regeneriert. Jegliches geeignete ballistische Zell-Transformations-Verfahren und -geräte können zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geräte- und Verfahrensbeispiele werden in Sanford and Wolf, U.S. Patentschrift Nr. 4,945,050 und in Christou et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,015,580 offen gelegt. Wenn ballistische Transformationsverfahren verwendet werden, kann die Transkriptionskassette in ein Plasmid eingebracht werden, das replizierbar ist, oder in der zu transformierenden Zelle. Beispiele geeigneter Mikropartikelchen zur Verwendung in derartigen Systemen umfassen 1 bis 5 μm Goldkügelchen. Das DNA-Konstrukt kann durch eine beliebige, geeignete Technik auf dem Mikropartikelchen aufgebracht werden, beispielsweise durch Abscheidung.
Pflanzenarten können mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt durch eine DNA-vermittelte Transformation von pflanzlichen Zellprotoplasten transformiert werden und nachfolgender Regenerierung der Pflanze aus den transformierten Protoplasten entsprechend in der Fachwelt bekannter Verfahren. Die Fusion von Tabakprotoplasten mit DNA-enthaltenden Liposomen oder mittels elektrochemischem Polieren ist in der Fachwelt bekannt (Shillito et al., „Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation", Methods in Enzymology 153, pp. 313-36 (1987).
In der vorliegenden Anwendung bezieht sich Transformation auf die Einführung exogener DNA in Zellen, um transgene Zellen herzustellen, die mit der exogenen DNA stabil transformiert wurden.
Transformierte Zellen werden mittels Anwendung von Tabakzellen und in der Fachwelt bekannter Zellkultur-Verfahren eingeführt, um intakte Tabakpflanzen zu regenerieren. Das Verfahren zur Pflanzenregenerierung wird so gewählt, dass es mit den Transformationsverfahren verträglich ist. Die stabile Anwesenheit und die Ausrichtung der CPRTase-Sequenz in transgenen Tabakpflanzen kann anhand der CPTRase Sequenz durch die Mendelschen Erbgesetze bestätigt werden, wie es sich durch in der Erblehre verwendete Standardverfahren der DNA-Analyse aus Kontrollkreuzungen ergibt. Nach der Regenerierung transgener Tabakpflanzen aus transformierten Zellen, wird die eingeführte DNA-Sequenz auf einfache Weise mittels herkömmlicher Pflanzenzuchtverfahren und ohne unnötige Experimente auf andere Tabaksorten transferiert.
Beispielsweise kann man zur Analyse der Trennung des Transgens regenerierte transformierte Pflanzen (R₀) zur Reife kultivieren, auf Nikotinkonzentrationen testen und durch Selbstbestäubung vermehren, um R₁-Pflanzen herzustellen. Ein Teil der R₁-Pflanzen, die das Transgen tragen, sind für das Transgen homozyg. Um homozyge R₁-Pflanzen zu identifizieren, werden transgene R₁-Pflanzen zur Reife kultiviert und durch Selbstbestäubung vermehrt. Homozyge R₁-Pflanzen produzieren R₂-Nachkommen, wobei jede Nachkommenspflanze das Transgen trägt; die Nachkommen heterozyger R₁-Pflanzen trennen sich im Verhältnis 3:1.
Da Nikotin als ein natürliches Pestizid wirkt, hilft es, Tabakpflanzen vor Beschädigung durch Ungeziefer zu schützen. Es kann deshalb wünschenswert sein, zusätzlich Pflanzen, die durch die vorliegenden Verfahren niedrigen oder gar keinen Nikotinanteil aufweisen, mit einem Transgen (wie dem Bacillus thuringiensis) zu transformieren, der zusätzlichen Schutz vor Insekten bietet.
Eine für das vorliegende Verfahren bevorzugte Pflanze ist die Art Nicotiana, oder Tabak, einschliesslich N. Tabacum, N. Rustica und N. Glutinosa. Beliebige Tabakstränge oder – Sorten können verwendet werden. Bevorzugt werden Stränge, die bereits einen niedrigen Nikotingehalt aufweisen, wie die Nic1/Nic2 – Doppelmutanten.
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor kann ein beliebiges pflanzliches Gewebe, das sich anschließend geklont fortpflanzen kann, unabhängig von Organogenese oder Embryogenese, transformiert werden. Der Ausdruck „Organogenese", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Verfahren, durch das sich Triebe und Wurzeln nacheinander aus meristematischen Kernen entwickeln; der Ausdruck „Embryogenese", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Verfahren, durch das sich Triebe und Wurzeln auf konzertierte Art gemeinsam entwickeln (nicht nacheinander), unabhängig ob somatische oder geschlechtliche Zellen vorliegen. Das bestimmte ausgewählte Gewebe hängt von dem vorhandenen und am besten geeigneten geklonten Fortpflanzungssystem für die bestimmte zu transformierende Art ab. Anvisierte Gewebebeispiele umfassen Blattscheiben, Pollen, Embryos, Cotyledons, Hypocotyle, Hautgewebe, bestehendes Stammzellen-Gewebe (z.B. Wurzelhauptstamm-Zellen, Hilfsknospen, und Wurzelstämme) und eingeführtes Stammzellengewebe (z.B., Keimblatt-Stammzellen und Subkeimblatt-Stammzellen).
Erfindungsgemäße Pflanzen können eine Reihe verschiedener Formen aufweisen. Die Pflanzen können Kombinationszüchtungen transformierter Zellen und nicht transformierter Zellen sein; die Pflanzen können geklonte Transformanten sein (z.B., alle Zellen wurden transformiert, um die Transkriptionskassette zu enthalten); die Pflanzen können Pfropfen transformierten und nicht transformierten Gewebes enthalten (z.B., einen transformierten Wurzelstock, der auf einen nicht transformierten Ballen einer Zitronenart transformiert wurde). Die transformierten Pflanzen können sich auf vielfache Weise vermehren, wie durch geklonte Fortpflanzung oder klassische Züchtungstechniken. Beispielsweise kann sich die erste Generation (oder T1) transformierter Pflanzen mittels Selbstbestäubung fortpflanzen, um eine homozytische zweite Generation (oder T2) transformierter Pflanzen zu erhalten, und die T2 Pflanzen können sich dann durch klassische Züchtungstechniken weiter fortpflanzen. Ein dominanter, wählbarer Marker (wie der nptll) kann zur Unterstützung der Züchtung der Transkriptionskassette zugeordnet werden.
Im Hinblick auf das oben dargestellte ist es offensichtlich, dass die Pflanzen, an denen die vorliegende Erfindung ausgeführt werden können, auch diejenigen der Gattung Nicotiana einschliessen.
Ein Fachmann in den oben beschriebenen rekombinanten DNA-Verfahren erkennt, dass ein CPRTase cDNA Molekül ganzer Länge oder ein CPTRase Chromosomen-Gen ganzer Länge verwendet werden kann, das mit geeigneten funktionell verbundenen Steuersequenzen in Leserichtung verbunden wird, um transgene Tabakzellen und -pflanzen zu konstruieren. (Ein Fachmann wird auch erkennen, dass geeignete Steuersequenzen zur Expression von Genen in Leserichtung zusätzlich zu den oben beschriebenen Promotor- und Polyadenylations-/Transkriptionsterminierungs-Sequenzen auch alle bekannten Anfangssequenzen von Kernzellen-Translationen einschliessen. Derartige transformierte Tabakpflanzen sind durch erhöhte CPRTase-Werte gekennzeichnet, und damit durch höhere Nikotinkonzentrationen als nicht-transformierte Kontroll-Tabakpflanzen.
Es ist deshalb verständlich, dass die Verwendung von CPRTase DNA – Sequenzen zur Verringerung oder Erhöhung der CPRTase-Enzym – Werte und dadurch die Verringerung oder Erhöhung der Nikotinwerte in Tabakpflanzen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt.
Wie hier verwendet, umfasst eine Ernte eine Vielzahl an erfindungsgemäßen Pflanzen, die gleichen Geschlechts sind und zusammen auf einem landwirtschaftlichen Feld angebaut werden. Ein „landwirtschaftliches Feld" bezeichnet ein gemeinsames Stück Erde oder ein Gewächshaus. Deshalb sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenernte vor, die geänderte CPRTase-Aktivitäten aufweist und deshalb erhöte oder verringerte Nikotinwerte aufweist im Vergleich zu ähnlichen Ernten nicht-transformierter Pflanzen der gleichen Gattung und Sorte.
Die nachfolgenden Beispiele sind zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung aufgefürt und sollen nicht als Einschränkung darauf betrachtet werden.
BEISPIEL 1
Isolierung und Sequentierung
TobRD2cDNA(Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) wurde sequentiert und ist hier als SEQ ID NO:1 und die abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ ID NO:2 vorgesehen. Der abgeleiteten Aminosäuresequenz ging ein cytosoles Protein voraus. Obwohl pflanzliche CPRase-Gene nicht nachgewiesen wurden, zeigen Vergleiche von NtPT1-Aminosäuresequenzen mit der GenBank Datenbank (3) in begrenztem Umfang Sequenzähnlichkeiten mit bestimmten bakteriellen und anderen Proteinen; Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase)- Aktivitäten wurden für die S.typhimurium, E.coli. und N. Tabacum-Gene nachgewiesen. Die mit NtCPT1 kodierte CPTase weist Ähnlichkeiten zu den abgeleiteten Peptidfragmenten auf, die durch eine Arabidopsis EST (Expressionssequenztab) – Sequenz kodiert wird (Genbank Zugangs-Nr. F20096), was einen Teil des Arabidopsis CPTase-Gens darstellen kann.
BEISPIEL 2
In-Situ Hybridisierung
Um die räumliche Verteilung von TobRD2 mRNA-Transkriptionen in den verschiedenen Wurzelgeweben zu bestimmen, wurden in situ Hybridisierungen an nicht-transformierten Pflanzen vorgenommen. In-situ Hybridisierungen des Antisense-Strangs von TobRD2 zu TobRD2 mRNA in Wurzelgewebe wurde mittel Techniken durchgeführt, die in Meyerowitz, Plant Mol. Bio. Rep. 5,242 (1987) und Smith et al., Plant Mol. Biol. Rep. 5,237 (1987) beschrieben wurden. Die Wurzeln von sieben Tage alten Tabak- (Nicotania tabacum) Setzlingen wurden auf phosphatgepuffertes Glutaraldehyd aufgebracht, in Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) eingebettet und auf 8mm Dicken unterteilt, um sowohl Längs- als auch Querschnitte zu erhalten. Antisense-TobRD2-Transkriptionen, die in Gegenwart von 35S-ATP in vitro synthetisiert wurden, wurden als Proben verwendet. Die markierte RNA wurde mit einer Alkalibehandlung hydrolysiert, um vor der Verwendung durchschnittliche Massenlängen von 100 bis 200 Basen zu erhalten.
Die Hybridisierungen wurden in 50%igem Formamid innerhalb 16 Stunden bei 42°C vorgenommen, wobei etwa 5 × 10⁶ Teile der bezeichneten RNA pro Minute (cpm) pro Milliliter hybridisierter Lösung gezählt wurden. Nach Exponierung wurden die Objektträger entwickelt und unter heller und dunkler Feldmikroskopie betrachtet.
Das Hybridisierungssignal wurde auf der cortischen Zellebene in den Wurzeln lokalisiert (Ergebnisse nicht dargestellt). Vergleiche der beiden hellen und dunklen Feldbilder der gleichen Abschnitte lokalisierten TobRD2-Transkriptionen der Parenchymat-Zellen des Wurzelcortex. In der Epidermis des Stengels war kein Hybridisierungssignal sichtbar.
BEISPIEL 3
TobRD2 mRNA – Werte in Nic1 und Nic2 – Tabakmutanten und die Beziehung zu Nikotinwerten
Gleich bleibende mRNA-Werte von TobRD2 wurden in Nic1 und Nic2-mutierten Tabakpflanzen untersucht. Von Nic1 und Nic2 ist bekannt, dass sie Chinolatphosphoribosyl-transferase-Aktivitäten und Putrescencemethyltransferase-Aktivitäten steuern, und dass sie zusammen dominante Regulatoren der Nikotinproduktion sind. Die vorliegenden Ergebnisse sind in den Figuren 5A und 5B dargestellt und zeigen, dass TobRD2 Expression durch Nic1 und Nic2 gesteuert wird.
RNA wurde aus den Wurzeln von Tabakpflanzen der wilden Sorte Burley 21 isoliert (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); Wurzeln von Nic1-Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2), Wurzeln von Nic2 – Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); und Wurzeln von Nic1-Nic2-Burley 21 (nic1/nic1 nic2/nic2).
Vier Burley 21 Tabaklinien (nic) wurden über einen Monat in Erde aus Samen kultiviert und einen Monat lang in einem Gewächshaus in hydropone Kammern in belüftete Nährstofflösung transferiert. Diese Linien waren genetisch gleich, mit Ausnahme der beiden nikotinarmen Stellen, und wiesen Erscheinungsformen von Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2 auf. Aus etwa 20 Pflanzen wurden für jede Erscheinungsform Wurzeln gewonnen und zur RNA-Isolierung gesammelt. Die gesamte RNA (1 μg) jeder Erscheinungsform wurde durch ein 1%iges Agarose-Gel elektrophoresziert, das 1,1 M Formaldehyd enthielt und auf eine Nylonmembran gemäß Sambrook et al. (1989) transferiert. Die Membrane wurden mit ³²P-bezeichneten TobRD2 cDNA-Fragmenten hybridisiert. Die relative Intensität von TobRD2-Transkripts wurden mittels Densiometrie gemessen. 5 (absteigende Schraffierung) zeigt die relative Transkriptkonzentration (verglichen mit Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) jedes der vier Erscheinungsformen auf. Die relative Nikotinkonzentration (verglichen mit Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) der vier Erscheinungsformen sind durch die aufsteigende Schraffierung dargestellt.
5 vergleicht grafisch die relativ gleich bleibenden TobRD2 mRNA-Werte, indem die in wilden Burley 21 Arten (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) gefundenen Werte als Referenzwerte verwendet werden. Die TobRD2 mRNA-Werte in Nic1/Nic2-Doppelmutanten betrugen etwa 25% derer wilder Tabaksorten. Figur 5B vergleicht weiter die relativen Nikotinwerte in den nahezu gen-gleichen Tabakreihen, die in dieser Studie untersucht wurden (absteigende Schraffuren zeigen TobRD2-Transkriptionswerte; aufsteigende Schraffuren zeigen Nikotinwerte). Es gab eine enge Verbindung zwischen den Nikotinwerten und den TobRD2-Transkriptionswerten.
BEISPIEL 4
Die Auswirkung des Stutzens auf TobRD2 mRNA-Werte
In der Fachwelt ist allgemein bekannt, dass das Entfernen der Blütenköpfe von Tabakpflanzen (Stutzen) das Wurzelwachstum fördert und den Nikotingehalt der Blätter dieser Pflanze erhöht. Das Stutzen der Pflanzen ist eine Standardpraxis in kommerziellem Tabakanbau, und der optimale Zeitpunkt des Stutzens einer gegebenen Tabakpflanze kann bei einer bestimmten Anzahl bekannter Bedingungen von einem Fachmann einfach bestimmt werden.
Tabakpflanzen (N. Tabacum SR1) wurden einen Monat lang aus Samen in Erde gezogen und in Töpfe mit Sand verpflanzt. Die Pflanzen wurden weitere zwei Monate im Gewächshaus kultiviert bis sie anfingen, Knospen anzusetzen. Die Blüten und zwei Knoten wurden dann von vier Pflanzen entfernt (gekappt). Von jeder Pflanze wurde nach der angegeben Zeit ein Abschnitt der Wurzeln geerntet und zur RNA-Extrahierung gesammelt. Die Kontrollpflanzen wurden nicht gestutzt. Die gesamte RNA (1 μg) eines jeden Zeitpunkts wurde mittels 1%igem Agarose-Gel elektrophoresziert, das 1,1 M Formaldehyde enthält, und auf eine Nylonmembran gemäß Sambrook, et al. (1989) transformiert. Die Membranen wurden mit ³²P-bezeichneten TobRD2 cDNA Fragmenten hybridisiert. Die relative Intensität der TobRD2-Transkriptionen wurden mittels Densitometrie gemessen. 6 zeigt die relativen Transkriptionskonzentrationen (im Vergleich zum Nullpunkt) eines jeden Zeitpunkts für gestutzte (absteigende Schraffierung) oder nicht gestutzte Pflanzen (aufsteigende Schraffierung).
Die relativen TobRD2-Konzentrationen von Wurzelgewebe wurden über 24 Stunden bestimmt; die Ergebnisse sind in 6 dargestellt (absteigende Schraffuren zeigen TobRD2-Transkriptionskonzentrationen gestutzter Pflanzen an; aufsteigende Schraffuren zeigen die TobRD2-Transkriptionskonzentrationen nicht gestutzter Kontrollen an.) Innerhalb von sechs Stunden nach dem Stutzen der Tabakpflanzen steigen in den gestutzten Pflanzen die mRNA-Konzentrationen von TobRD2 um etwa das achtfache; in den Kontrollpflanzen wurde in der gleichen Zeit kein Anstieg festgestellt.
BEISPIEL 5
Romplementierung bakterieller Mutanten Fehlende CPRTase in DNA von SEQ ID NO:1
Der Escherichia coli Strang TH265 ist ein Mutant, dem Chinolatphosphoribosyltransferase (nadC-) fehlt, und kann deshalb nicht auf Medien wachsen, denen Nikotinsäuren fehlen.
TH265-Zellen wurden mit einem Expressionsvektor (pWS161) transformiert, der DNA von SEQ ID NO:1 enthält, oder ausschließlich mit dem Expressionsvektor (pKK233) transformiert. Das Wachstum der transformierten Bakterien wurde mit dem Wachstum der TH265 (pKK233) Transformanten verglichen und mit dem Wachstum des nicht-transformierten TH265 nadC-Mutanten. Das Wachstum wurde auf ME Minimalmedium (dem Nikotinsäure fehlt) und auf ME Minimalmedium mit zugesetzter Nikotinsäure verglichen.
Der E. Coli Strang mit der CPTase-Mutation (nadC), TH265, wurde freundlicherweise von Dr. K.T.Hughes (Hughes et al., J. Bact. 175:479 (1993) bereit gestellt. Die Zellen wurden auf LB-Medium unterhalten und kompetente Zellen wurden wie in Sambrook et al (1989) beschrieben präpariert. Ein Expressionsplasmid wurde in pKK2233 konstruiert (Brosius, 1984), wobei die TobRD2 cDNA unter der Kontrolle des Tac Promotor geklont wurden. Das resultierende Plasmid, pWS161, wurde in TH265-Zellen transformiert. Die transformierten Zellen wurden dann auf Minimalmediums-Agarplatten mit und ohne dem Hilfsstoff Nikotinsäure (0,0002) aufgetragen (Vogel und Bonner, 1956). TH265-Zellen alleine und TH265, das mit pKK2233 transformiert wurde, werden auf ähnliche Platten aufgetragen, um als Kontrolle zu dienen.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Nur das TH265, das mit DNA von SEQ ID NO:1 transformiert war, gedieh in dem Medium ohne Nikotinsäure. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die Expression von DNA auf SEQ ID NO:1 in TH265-Bakterienzellen auf das NadC+ dieser Zellen überträgt, und bestätigt damit, dass diese Sequenz CPRTase kodiert. Die TobRD2-Nomenklatur wurde deshalb in NtCPT1 abgeändert.
BEISPIEL 6
Transformierung von Tabakpflanzen
DNA von SEQ ID NO:1 in Antisense-Richtung ist funktionell mit einem pflanzlichen Promotor (CaMV 35S oder TobRD2 wurzelcortex-spezifischen Promotor) verbunden, um zwei verschiedene DNA-Kassetten herzustellen: CaMV35S Promotor/Antisense SEQ ID NO:1 und TobRD2 Promotor/Antisense SEQ ID NO:1.
Ein Tabakstamm einer wilden Sorte und ein nikotinarmer Tabakstamm werden zur Transformierung ausgewählt, z.B. ein wilder Burley 21 Tabak (Nic1+/Nic2+) und homozyger nic1/nic2-Burley 21. Eine grosse Anzahl an pflanzlichen Tabakzellen jeden Stamms werden mit jeder der DNA-Kassetten transformiert. Die Transformation wird mittels eines Agrobacterium-Vektor durchgeführt, d.h., ein binärer Agrobacterium-Vektor trägt eine Ti-Randsequenz und das nptll-Gen (das Widerstand gegen Kanamycin unter der Kontrolle des nos-Promotors (nptll)überträgt).
Transformierte Zellen werden ausgewählt und in transgene Tabakpflanzen regeneriert (R₀). Die R₀-Pflanzen werden zur Reife kultiviert und auf ihre Nikotinkonzentration geprüft; eine Teilgruppe der transformierten Tabakpflanzen zeigten deutlich niedrigere Nikotinkonzentrationen verglichen mit nicht-transformierten Kontrollpflanzen.
R₀-Pflanzen werden dann mit Selbstbestäubung vermehrt und die Teilung der Transgene in der R₁-Nachkommenschaft wird analysiert. R₁-Nachkommen werden zur Reife kultiviert und mit Selbstbestäubung vermehrt; die Trennung der Transgene unter den R2-Nachkommen zeigt an, welche R₁-Pflanzen für das Transgen homozyg sind.
Sequenzliste
(1) Allgemeine Informationen:

(i) Anmelder: Conking, Mark A Mendu, Nandini Song, Wen
(ii) Titel der Erfindung: Steuerung der Chinolatphosphoribosyltransferase-Expression
(iii) Anzahl der Sequenzen: 4
(iv) Korrespondenzanschriften: (A) Adressat: Kenneth Sibley. Bell Seltzer Park & Gibson (B) Strasse: Post Office Drawer 34009 (C) Stadt: Charlotte (D) Bundesstaat: North Carolina (E) Staat: USA (F) PLZ: 28234
(v) Elektronische Version: (A) Art des Mediums: Floppy disk (B) Computer: IBM PC kompatibel (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: PatentIn Release #1.0. Versino #1.30
(vi) Aktuelle Anmeldungsdaten: (A) Anmeldenummer (B) Anmeldedatum (C) Klassifizierung
(viii) Informationen zur Rechtsvertretung i. Name: Sibley, Kenneth D. ii. Anmeldenummer: 31.665 iii. Aktenzeichen/Docket-Nr. 5051-338P b. Telekommunikationsdaten: i. Telefon: 919-420-2200 ii. Telefax: 919-881-3175
(ix) Informationen zur SEQ ID NO:1: a. Sequenzeigenschaften: i. Länge: 1399 Basispaare ii. Art: Nukleinsäure iii. Strangart: Einzel iv. Topologie: linear
(ii) Molekülart: cDNA
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel: CDS (B) Position: 52..1104

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:1
(2) Information zu SEQ ID NO:2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(ii) (A) Länge: 351 Aminosäuren (B) Art: Aminosäure (C) Topologie: linear
(iii) Molekülart: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:2:
(2) Information zu SEQ ID NO:3:

(i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 1053 Basispaare (B) Art: Aminosäure (C) Strangart: Einzel (D) Topologie: linear
(iv) Molekülart: cDNA

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:3:

Claims

Isoliertes DNA Molekül, welches eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus folgendem besteht: (a) SEQ ID NO:1; (b) DNA Sequenzen, welche ein Enzym mit SEQ ID NO: 2 kodieren; (c) DNA Sequenzen, die mit einer isolierten DNA aus obigem (a) oder (b) hybridisieren und welche ein Chinolatphosphoribosyltransferase Enzym kodieren; und (d) DNA Sequenzen, die sich von der DNA aus obigem (a), (b) oder (c) anhand der Degenerierung des genetischen Kodes unterscheiden.
DNA Konstrukt mit einer Expressionskassette, welches Konstrukt in der 5' – 3' Richtung einen in pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor und eine DNA Sequenz mit einer eine Chinolatphosphoribosyltransferase kodierenden Sequenz nach Anspruch 1 beinhaltet, welche abwärts von dem genannten Promotor positioniert und funktionell mit diesem verbunden ist.
DNA Konstrukt mit einer Expressionskassette, welches Konstrukt in der 5' – 3' Richtung einen pflanzlichen Promotor und eine DNA Sequenz mit einer eine Chinolatphosphoribosyltransferase kodierenden Sequenz nach Anspruch 1 beinhaltet, welche abwärts von dem genannten Promotor positioniert und funktionell mit diesem verbunden ist, wobei die genannte DNA Sequenz in antisense Orientierung ist.
DNA Konstrukt, das in 5' – 3' Richtung einen in pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor und pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase kodierende DNA, welche aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, aufweist, wobei die genannte DNA funktionell mit genanntem Promotor verbunden ist.
DNA Konstrukt, das in 5' – 3' Richtung einen in pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor und pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase kodierende DNA, welche aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, aufweist, wobei die genannte DNA in antisense Orientierung und funktionell mit genanntem Promotor verbunden ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, 3, 4 oder 5, dessen Promotor in pflanzlichen Zellen konstitutiv aktiv ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, 3, 4 oder 5, wobei der genannte Promotor selektiv in Zellen des pflanzlichen Wurzelgewebes oder des pflanzlichen Wurzelcortexgewebes aktiv ist.
DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das genannte Konstrukt weiter ein Plasmid enthält.
DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 8, welches von einem Pflanzentransformationsvektor getragen wird.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, wobei der Pflanzentransformationsvektor ein Agrobacterium tumefaciens – Vektor ist.
Pflanzliche Zelle mit einem DNA Konstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 10.
Transgene Pflanze, welche pflanzliche Zellen nach Anspruch 12 aufweist.
Ein Peptid mit SEQ ID NO: 2.
Peptid kodiert durch eine DNA Seguenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus folgendem besteht: (a) SEQ ID NO:1; (b) DNA Sequenzen, welche mit einer isolierten DNA aus obigem (a) hybridisieren und welche ein Chinolatphosphoribosyltransferase Enzym kodieren; und (c) DNA Sequenzen, welche sich von der DNA aus obigem (a) oder (b) anhand der Degenerierung des genetischen Kodes unterscheiden.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen pflanzlichen Zelle mit reduzierter Expression von Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase), welches Verfahren folgendes umfasst: Bereitstellung einer pflanzlichen Zelle eines Typs, der bekannt ist, Chinolatphosphoribosyltransferase zu exprimieren; Bereitstellung eines exogenen DNA Konstrukts, welches in 5' – 3' Richtung einen in pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor und eine , Chinolatphosphoribosyltransferase mRNA kodierende DNA Sequenz aufweist, welche aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, wobei die genannt DNA funktionell mit genanntem Promotor verbunden ist; und Transformieren der genannten pflanzlichen Zelle mit dem genannten DNA Konstrukt zur Erzeugung transformierter Zellen, wobei die genannte Pflanzenzelle eine reduzierte Expression von CPRTase verglichen mit einer nicht transformierten Zelle aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die genannte DNA, die einen Teil einer Chinolatphosphoribosyltransferase mRNA kodierender Sequenz, welche aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, aufweist, in Leserichtung oder in antisense Orientierung ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die genannte Pflanzenzelle Nicotiana tabacum ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, welches weiterhin das Regenerieren einer Pflanze von der genannten transformierten pflanzlicher Zelle umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der genannte Promotor konstitutiv aktiv ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der genannte Promotor selektiv in Zellen des pflanzlichen Wurzelgewebes oder des pflanzlichen Wurzelcortexgewebes aktiv ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei der genannte Tranfsormationsschritt durch Bombardieren der genannten pflanzlichen Zelle mit Mikropartikelchen, welche genannte DNA tragen, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei der genannte Tranfsormationsschritt durch Infizierung der genannten pflanzlichen Zelle mit einem Agrobacterium tumefaciens durchgeführt wird, welcher ein das genannte DNA Konstrukt tragendes Ti Plasmid enthält.
Verfahren zur Produktion von transgenen Tabaksamen, welche das Ernten von Samen transgener Tabakpflanzen umfaßt, die nach dem Verfahren nach Anspruch 17 erzeugt wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei die genannte exogene DNA Sequenz eine Chinolatphosphoribosyltransferase Enzym kodierende Sequenz aufweist, aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist und komplementär ist mit der genannten Chinolatphosphoribosyltransferase – Messenger – RNA (CPRT mRNA), welche in der genannten Pflanzenzelle in einer Region exprimiert ist, die ausgewählt ist aus: (a) der 5' – nicht translatierten Sequenz der genannten CPRT mRNA; (b) der 3' – nicht translatierten Sequenz der genannten CPRT mRNA; und (c) der translatierten Region der genannten CPRT mRNA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei die genannte exogene DNA Sequenz eine Chinolatphosphoribosyltransferase Enzym kodierende Sequenz aufweist, aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist und komplementär ist mit mindestens 15 Nukleotiden der genannten Chinolatphosphoribosyltransferase – Messenger – RNA, die in der genannten pflanzlichen Zelle exprimiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei die genannte exogene DNA Sequenz eine Chinolatphosphoribosyltransferase Enzym kodierende Sequenz aufweist, aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist und komplementär ist mit mindestens 200 Nukleotiden der genannten Chinolatphosphoribosyltransferase – Messenger – RNA, die in der genannten pflanzlichen Zelle exprimiert ist. 27 Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei genannte exogene DNA Sequenz eine Chinolatphosphoribosyltransferase kodierende Sequenz beinhaltet, welche von den DNA Sequenzen nach Anspruch 1 ausgewählt ist.
Transgene Pflanze der Art Nicotiana mit reduzierter Chinolatphosphoribosyltransferase Expression in Bezug auf eine nicht transformierte Kontrollpflanze, welche genannte transgene Pflanze pflanzliche Zellen aufweist, welche folgendes enthalten: ein exogenes DNA Konstrukt, umfassend in 5' – 3' Richtung einen in pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor und DNA, welche ein Segment einer DNA Sequenz beinhaltet, die pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase mRNA kodiert und aus den DNA Sequenzen den Anspruchs 1 ausgewählt ist, wobei die genannte DNA funktionell mit dem genannten Promotor verbunden ist; wobei die genannte Pflanze eine reduzierte Chinolatphosphoribosyltransferase Expression im Vergleich zu einer nicht transformierten Kontrollpflanze aufweist.
Pflanze nach Anspruch 28, wobei das genannte DNA Segment, welches ein Segment von Chinolatphosphoribosyltransferase mRNA kodierender DNA Sequenz beinhaltet, aus den DNA Sequenzen den Anspruchs 1 ausgewählt ist und in Leserichtung oder antisense Orientierung ist.
Transgene Pflanze der Art Nicotiana, welche eine reduzierte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) Expression in Bezug auf eine nicht transformierte Kontrollpflanze aufweist, wobei die genannte transgene Pflanze ein Nachkomme einer Pflanze nach Anspruch 28 ist.
Samen von transgener Pflanze der Art Nicotiana, welche reduzierte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) Expression bezüglich einer nicht transformierten Kontrollpflanze hat, wobei genannte transgene Pflanze eine Pflanze nach Anspruch 28 oder deren Nachkommen ist.
Ernte umfassend große Mehrzahl von Pflanzen nach Anspruch 28, welche zusammen auf einem landwirtschaftlichem Feld angebaut wurden.
Verfahren zur Reduktion der Expression eines Chinolatphosphoribosyltransferase Gens in einer pflanzlichen Zelle, welches folgendes umfasst: Kultivierung einer pflanzlichen Zelle, welche transformiert wurde, um aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählte, exogene DNA zu enthalten, wobei ein transkribierter Strang der genannten exogenen DNA komplementär mit der für die genannte Zelle endogenen Chinolatphosphoribosyltransferase mRNA ist, wodurch die Transkription des genannten komplementären Strangs die Expression des genannten Chinolatphosphoribosyltransferase Gens reduziert.
Verfahren zur Herstellung einer Tabakpflanze, welche reduzierte Nikotin Werte in den Blättern der genannten Tabakpflanze aufweist, wobei das genannte Verfahren folgendes umfasst: Kultivierung einer Tabakpflanze oder deren Nachkommen, wobei die genannte Pflanze Zellen mit einem DNA Konstrukt beinhaltet, das eine in genannter Pflanze funktionsfähige Transkriptionsinitiierungsregion und eine exogene DNA Sequenz aufweist, welche aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt und funktionell an genannter Transkriptionsinitiierungsregion angeschlossen ist, wobei der transkribierte Strang der genannten DNA Sequenz komplementär mit der endogenen Chinolatphosphoribosyltransferase – Messenger – RNA in den genannten Zellen ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen pflanzlichen Zelle, welche eine erhöhte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) Expression aufweist, welches folgendes umfasst: Bereitstellung einer pflanzlicher Zelle eines Typs, der bekannt ist, Chinolatphosphoribosyltransferase zu exprimieren; Bereitstellung eines exogenen DNA Konstrukts, das in 5' – 3' Richtung einen in pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor und DNA Sequenz aufweist, die eine Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert und aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, wobei die genannte DNA Sequenz funktionell mit dem genannten Promotor verbunden ist, und Transformieren der genannten pflanzlichen Zelle mit dem genannten DNA Konstrukt, um transformierte Zellen zu produzieren, wobei die genannte Pflanzenzelle eine erhöhte Expression von CPRTase verglichen mit einer nicht transformierten Kontrollpflanze aufweisen.
Transgene Pflanze der Art Nicotiana, welche erhöhte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) Expression bezogen auf eine nicht transformierte Kontrollpflanze aufweist, wobei die genannte transgene Pflanze transgene Pflanzenzellen aufweist, welche enthalten: ein exogenes DNA Konstrukt, welches in 5' – 3' Richtung einen in der genannten pflanzlichen Zelle funktionellen Promotor und eine DNA Sequenz enthält, welche pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert und aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, wobei die genannte DNA funktionell mit dem genannten Promotor verbunden ist; wobei die genannte Pflanze eine erhöhte CPRTase Expression verglichen mit einer nicht transformierten Kontrollpflanze aufweist.
Transgene Pflanze der Art Nicotiana, welche eine erhöhte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) Expression in Bezug auf eine nicht transformierte Kontrollpflanze aufweist, wobei die genannte transgene Pflanze ein Nachkommen einer Pflanze nach Anspruch 36 ist.
Verfahren zur Erhöhung der Expression eines Chinolatphosphoribosyltransferase Gens in einer pflanzlichen Zelle, welches folgendes umfasst: Kultivierung einer pflanzlichen Zelle, welche transformiert ist, um eine aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählte, exogene DNA zu enthalten, wobei die genannte exogene DNA Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die genannte transformierte pflanzliche Zelle durch ein Verfahren erhalten wird, welches folgendes umfaßt: Integrieren in das Genom einer pflanzlichen Wirtszelle eines Konstrukts, welches in der Transkriptionsrichtung einen in der genannten pflanzlichen Zelle funktionsfähigen Promotor, eine in der genannten Zelle funktionsfähige Chinolatphosphoribosyltransferase kodierende DNA Sequenz, welche aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt und funktionell mit genanntem Promotor verbunden ist, und eine in genannter Zelle funktionsfähige transkriptionsterminierende Region umfaßt, wodurch eine transformierte pflanzliche Zelle erhalten wird.
Verfahren zur Herstellung von Tabakpflanze, welche erhöhte Werte von Nikotin in Blättern der genannten Tabakpflanze aufweisen, welches folgendes umfaßt: Kultivierung einer Tabakpflanze oder deren Nachkommen, wobei die genannten pflanzlichen Zellen ein DNA Konstrukt umfassen, welches eine in der genannten Zelle funktionsfähige transkriptionsinitiierende Region und eine exogene DNA Sequenz aufweist, die funktionell mit der genannten transkriptionsinitiierender Region verbunden und aus den DNA Sequenzen des Anspruchs 1 ausgewählt ist, wobei die genannte DNA Sequenz eine in den genannten Zellen funktionsfähige Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.