DE69822872T2

DE69822872T2 - Verfahren zur oxidativen bindung von glycoproteinen und glycopeptiden an oberflächen von medizinischen artikeln

Info

Publication number: DE69822872T2
Application number: DE69822872T
Authority: DE
Inventors: R. James KEOGH
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1997-12-04
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2018-12-04
Also published as: WO1999027968A2; EP1035871A2; DE69822872D1; US5891506A; WO1999027968A3; EP1035871B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Seit vielen Jahren werden etliche medizinische Artikel (z. B. Schrittmacher, Gefäßtransplantate, Stents, Herzklappen etc.), welche mit Körpergeweben oder -flüssigkeiten von lebenden Personen oder Tieren in Kontakt kommen, hergestellt und klinisch eingesetzt. Ein großes Problem mit solchen Artikeln besteht darin, dass ihre Oberflächen dazu neigen, eine Schicht aus Proteinen von Geweben und Flüssigkeiten wie Tränen, Urin, Lymphflüssigkeit, Blut, Blutprodukten und anderen Flüssigkeiten und Feststoffen, die aus dem Blut stammen, zu adsorbieren. Es wird angenommen, dass die Zusammensetzung und Organisation dieser adsorbierten Proteinschicht weitere biologische Reaktionen beeinflussen, wenn nicht sogar kontrollieren. Nachteilige biologische Reaktionen wie Thrombose und Entzündung können die Lebenszeit vieler Artikel verringern.
Implantierbare medizinische Artikel neigen auch dazu, als Herde für eine Infektion des Körpers mit einer Vielzahl bakterieller Species zu dienen. Diese mit dem Artikel im Zusammenhang stehenden Infektionen werden durch die Tendenz dieser Organismen gefördert, an den Oberflächen der Artikel zu haften und dort Kolonien zu bilden. Folglich war es von großem Interesse für Ärzte und die medizinische Industrie, Oberflächen zu entwickeln, die weniger dazu neigen, nachteilige biologische Reaktionen zu fördern, welche typischerweise mit der Implantation eines medizinischen Artikels einhergehen.
Ein Ansatz zur Minimierung unerwünschter, mit medizinischen Artikeln im Zusammenhang stehender biologischer Reaktionen ist, zur Anhaftung und für das Wachstum einer Zellschicht, die der Körper akzeptiert, verschiedene Biomoleküle an ihre Oberflächen zu binden. Hierfür wurden Biomoleküle wie Wachstumsfaktoren, Zellbindungsproteine und Zellbindungspeptide verwendet. Außerdem wurden auch Biomoleküle wie Antithrombogene, Antiplättchen-Substanzen, Entzündungshemmer, Antibiotika und dergleichen verwendet, um nachteilige, mit Biomaterial im Zusammenhang stehende Reaktionen zu minimieren.
Es wurden einige Ansätze vorgeschlagen, um solche Biomoleküle anzubinden. Diese Ansätze erfordern typischerweise die Verwendung von Kupplungsmitteln wie u. a. Glutaraldehyd, Bromcyan, p-Benzoquinon, Bernsteinsäureanhydride, Carbodiimide, Diisocyanate, Ethylchlorformiat, Dipyridyldisulfid, Epichlorhydrin, Azide, welche als Bindungsvehikel dienen, um Biomoleküle an Oberflächen von Biomaterial zu binden. Zum Beispiel ist die kovalente Bindung von Biomolekülen unter Verwendung von wasserlöslichen Carbodiimiden von Hoffman et al., „Covalent Binding of Biomolecules to Radiation-Grafted Hydrogels on Inert Polymer Surfaces", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 18, 10–18 (1972); und Ito et al., „Materials for Enhancing Cell Adhesion by Immobilization of Cell-Adhesive Peptide", J. of Biomed. Mat. Res., 25, 1325–1337 (1991), beschrieben.
Eine Art von Biomolekül, welches häufig mit Kupplungsmolekülen an Oberflächen von Biomaterial gekuppelt wird, sind Proteine. Proteine sind Polypeptide, die aus Aminosäureresten aufgebaut sind. Ein Protein, das zwei oder mehrere Polypeptid-Ketten umfasst, ist ein oligomeres Protein. Im Allgemeinen werden Proteine durch etablierte Kupplungsverfahren über Lysin-Aminosäurereste eines Proteins, die terminale Aminogruppen enthalten, an Substrat-Oberflächen gekuppelt. Dieses Verfahren weist mehrere inhärente Probleme auf. Zum Beispiel können, wenn auf einer Protein-Oberfläche viele Lysin-Reste vorhanden sind, mehrere Anbindungen auftreten. Mehrere Bindestellen können zu mehreren Konformationen des Proteins an der Oberfläche des Biomaterials führen. Der Mangel an Kupplungsspezifität kann die biologische Aktivität des Proteins, das gekuppelt wird, stören oder zerstören. Außerdem können Kupplungsmoleküle zur Instabilität der Oberfläche des Biomaterials beitragen und die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass das angebrachte Protein in der Kupplungsschicht begraben wird. Kupplungsmoleküle können auch zu unspezifischen und unerwünschten Vernetzungen zwischen Proteinmolekülen führen, wodurch die biologischen Eigenschaften des Proteins zerstört werden, oder Bindungen zwischen funktionellen Stellen an der Oberfläche bilden, wodurch die Anbindung inhibiert wird. Die Verwendung von Kupplungsmolekülen kann auch die Spezifität der Bindung des Proteins an die Oberfläche des Biomaterials verringern, wobei die Konformationskontrolle über Bindevorgang verloren geht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur kovalenten Bindung eines Biomoleküls an eine Substrat-Oberfläche bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines medizinischen Artikels bereit, welcher mindestens ein an einer Oberfläche eines Biomaterials immobilisiertes Glycoprotein und/oder Glycopeptid aufweist. Bei dem Verfahren vereinigt man ein Periodat mit einem Glycoprotein und/oder Glycopeptid, das eine 1,2-Dihydroxy-Einheit (RCHOHCHOHR') umfasst, um ein Aldehyd-funktionelles Material (RCHO) zu bilden; vereinigt das Aldehyd-funktionelle Material mit einem Material, das eine primäre Amin-Einheit (R''NH₂) umfasst, um die beiden Materialien über eine Imin-Einheit (R''N=CHR) zu verknüpfen; und setzt die Imin-Einheit mit einem Reduktionsmittel um, um über eine sekundäre Amin-Bindung (R''NH-CH₂R) ein immobilisiertes Glycoprotein und/oder Glycopeptid auf einer Biomaterial-Oberfläche eines medizinischen Artikels zu bilden.
Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren vereinigt man ein Periodat mit einem Glycoprotein und/oder Glycopeptid, das eine 1,2-Dihydroxy-Einheit umfasst, in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 4–9 und einer Temperatur von ungefähr 50°C, um ein Aldehyd-funktionelles Material zu bilden; vereinigt das Aldehyd-funktionelle Material mit einer Biomaterial-Oberfläche, die eine primäre Amin-Einheit umfasst, um das Glycoprotein und/oder Glycopeptid über eine Imin-Einheit auf der Substrat-Oberfläche zu immobilisieren; und setzt die Imin-Einheit mit einem Reduktionsmittel um, um auf der Biomaterial-Oberfläche ein über eine sekundäre Amin-Bindung immobilisiertes Glycoprotein und/oder Glycopeptid zu bilden.
Ein weiteres Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um in Lösung oder auf Biomaterial-Oberflächen vorliegende Glycoproteine und/oder Glycopeptide, welche sowohl eine 1,2-Dihydroxy-Einheit als auch eine primäre Amin-Einheit umfassen, zu vernetzen. Bei diesem Verfahren vereinigt man ein Periodat mit dem Glycoprotein und/oder Glycopeptid, um die 1,2-Dihydroxy-Einheit zu oxidieren und eine Aldehyd-Einheit zu bilden; vereinigt die Aldehyd-Einheit mit der Amin-Einheit, wobei eine Imin-Einheit gebildet wird; und setzt die Imin-Einheit mit einem Reduktionsmittel um, um ein sekundäres Amin und ein vernetztes Material zu bilden. Dieses vernetzte Material kann als Biomaterial oder als Biomaterial-Beschichtung verwendet werden. Des Weiteren kann ein solches vernetztes Material weiter modifiziert werden, so dass es zusätzliche Biomoleküle enthält. Zum Beispiel können Aldehyd-enthaltende Biomoleküle an übrige Amin-Einheiten gebunden werden, die in dem vernetzten Material oder an der Oberfläche des vernetzten Materials vorhanden sind. Alternativ können Amin-enthaltende Biomoleküle an übrige Aldehyd-Einheiten gebunden werden, die in dem vernetzten Material oder auf der Oberfläche des vernetzten Materials vorhanden sind. Ferner können Glycoproteine und/oder Glycopeptide, die sich auf einer Biomaterial-Oberfläche befinden, gemäß einem noch weiteren Verfahren der vorliegenden Erfindung vernetzt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen hierzu besitzen die folgenden Begriffe die jeweiligen unten dargelegten Bedeutungen und Definitionen.
Ich definiere den hierin vorkommenden Begriff „Glycoprotein" als konjugiertes Protein, das mindestens eine Kohlenhydrat-Gruppe enthält. Somit enthält ein typisches Glycoprotein gemäß meiner Definition eine oder mehrere Oligosaccharid-Einheiten, die entweder über N-glycosidische Bindungen an Asparagin-Aminosäurereste oder über O-glycosidische Bindungen an Serin- oder Threonin-Aminosäurereste gebunden sind. Die Saccharid-Einheit, die direkt an Asparagin gebunden ist, ist typischerweise N-Acetylglucosamin, wohingegen N-Acetylgalactosamin meistens die Saccharid-Einheit ist, die an Serin- oder Threonin-Reste gebunden ist. An Glycoproteine gebundene Oligosaccharide können eine Vielfalt von Kohlenhydrat-Einheiten enthalten und liegen normalerweise an einer von der biologisch aktiven Stelle des Proteins entfernten Stelle vor. Somit können Oligosaccharid-Einheiten von Glycoproteinen typischerweise mit wenig oder keiner Auswirkung auf die biologischen Eigenschaften des Proteins modifiziert werden. Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Glycoproteine schließen mindestens eine Kohlenhydrat-Gruppe ein, die zwei oder mehrere Hydroxyl(-OH)-Gruppen besitzt, die sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befinden. Zwei Hydroxyl-Gruppen, die sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befinden, werden als 1,2-Dihydroxy-Einheit bezeichnet.
Ich definiere den hierin vorkommenden Begriff „Glycopeptid" als konjugiertes Peptid, welches mindestens eine Kohlenhydrat-Gruppe enthält. Somit sind gemäß meiner Definition Peptide kurze Ketten, die aus zwei oder mehreren über substituierte Amid-Bindungen, die Peptidbindungen genannt werden, kovalent verknüpfte Aminosäuren gebildet sind. Zwei über eine Peptidbindung verbundene Aminosäuren bilden ein Dipeptid. Drei über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren bilden ein Tripeptid; entsprechend gibt es Tetrapeptide und Pentapeptide. Wenn viele Aminosäuren miteinander verbunden sind, wird die Struktur ein Polypeptid genannt. Im Allgemeinen enthalten Polypeptide weniger als 100 Aminosäurereste und Proteine enthalten 100 oder mehr Aminosäurereste. Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Glycopeptide schließen mindestens eine Kohlenhydrat-Gruppe ein, die zwei oder mehrere Hydroxyl(-OH)-Gruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen enthält.
Ich definiere den hierin vorkommenden Begriff „Glycoprotein und/oder Glycopeptid" so, dass er für jedes beliebige Glycoprotein oder mehrere Glycoproteine alleine, eine Kombination verschiedener Glycoproteine, ein Glycopeptid alleine, eine Kombination verschiedener Glycopeptide oder eine Kombination eines Glycoproteins oder mehrerer Glycoproteine mit einem Glycopeptid oder mehreren Glycopeptiden steht.
Ich definiere den hierin vorkommenden Begriff „Biomaterial" als Material, das so gestaltet und aufgebaut ist, dass es in dem oder an dem Körper platziert werden oder mit Körperflüssigkeit in Kontakt kommen kann. Idealerweise wird ein Biomaterial keine unerwünschten Reaktionen im Körper induzieren, wie Blutgerinnung, Gewebetod, Tumorbildung, eine allergische Reaktion, Fremdkörperreaktion (Abstoßung) oder Entzündungsreaktion; wird die für den beabsichtigten Zweck erforderlichen physikalischen Eigenschaften besitzen; kann leicht gereinigt, hergestellt und sterilisiert werden; wird im Wesentlichen seine physikalischen Eigenschaften und die Funktion während der Zeit beibehalten, die es im Körper implantiert oder mit dem Körper in Kontakt bleibt. Biomaterialien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen eine Amin-Einheit ein.
Außerdem können Biomaterialien durch Vernetzung von Glycoproteinen und/oder Glycopeptiden, die sowohl eine 1,2-Dihydroxy-Einheit als auch eine primäre Amin-Einheit umfassen, gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Ich definiere den hierin vorkommenden Begriff „medizinischer Artikel" als Vorrichtung, die Oberflächen besitzt, welche im Laufe ihres Einsatzes mit Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten in Kontakt kommen, wobei die Flüssigkeiten anschließend in Patienten verwendet werden. Der Umfang dieser Definition schließt zum Beispiel extrakorporale Artikel zur Verwendung bei Operationen, wie Blutoxigenatoren, Blutpumpen, Blutsensoren, einen Schlauch zum Aufnehmen von Blut und dergleichen ein, welche mit Blut in Kontakt kommen, das dann dem Patienten rückgeführt wird. Der Umfang der Definition schließt auch Endoprothesen, die in einem menschlichen oder tierischen Körper in Kontakt mit Blut implantiert sind, wie Gefäßtransplantate, Stents, Schrittmacherzuleitungen, Herzklappen und dergleichen ein, welche in Blutgefäßen oder im Herzen implantiert sind. Der Umfang der Definition schließt auch Artikel zur temporären intravaskulären Verwendung, wie Katheter, Führungsdrähte und dergleichen ein, welche zu Zwecken der Kontrolle oder Reparatur in Blutgefäßen oder im Herzen platziert werden.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Lösung einiger Probleme, die mit der Verwendung von medizinischen Artikeln im Zusammenhang stehen. Der Umfang der vorliegenden Erfindung schließt ein oxidatives Verfahren zur kovalenten Bindung von Glycoproteinen und/oder Glycopeptiden an Oberflächen von Biomaterial zur Verwendung in medizinischen Artikeln ein. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein oxidatives Verfahren zur Herstellung vernetzter Biomaterialien oder vernetzter Biomaterial-Beschichtungen bereit, die Glycoproteine und/oder Glycopeptide umfassen.
Proteine und/oder Peptide, die ein Kohlenhydrat besitzen, das eine 1,2-Dihydroxy-Einheit besitzt, sind mit Periodat oxidierbar, welches als Periodsäure oder Salze davon, wie Natriumperiodat, Kaliumperiodat oder andere Alkalimetallperiodate, bereitgestellt werden kann. Typischerweise wird eine stöchiometrische Menge Periodat verwendet, um die 1,2-Dihydroxy-Einheit zu oxidieren, es kann jedoch auch ein Überschuss verwendet werden. Die Oxidation solcher Glycoproteine und/oder Glycopeptide bildet reaktive Aldehyd-Einheiten innerhalb des Glycoproteins und/oder Glycopeptids.
Die Oxidation wird in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer wässrigen gepufferten Lösung, bei Raumtemperatur, bei welcher die biologischen Eigenschaften der Glycoproteine und/oder Glycopeptide nicht zerstört werden, durchgeführt. Im Allgemeinen können Puffer mit einem pH-Wert in einem Bereich von ungefähr 4–9 verwendet werden, wobei ein pH-Wert von ungefähr 6–8 für bestimmte pH-empfindliche Glycoproteine und/oder Glycopeptide bevorzugt ist. Im Allgemeinen wird die Oxidation bei einer Temperatur von ungefähr 0–50°C und vorzugsweise bei einer Temperatur von ungefähr 4–37°C durchgeführt. Abhängig von den Glycoproteinen und/oder Glycopeptiden, können die Oxidationsreaktionen für einige Minuten bis viele Tage durchgeführt werden. Gewöhnlich ist die Oxidation innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen. Langzeit-Oxidationsreaktionen werden bevorzugt im Dunkeln durchgeführt, um eine „Überoxidation" zu vermeiden.
Die Behandlungszeiten und Temperaturen für das Oxidationsverfahren stehen meistens invers miteinander in Verbindung. Das heißt, dass höhere Temperaturen im Allgemeinen kürzere Behandlungszeiten erfordern. Die Zeit- und Temperatur-Begrenzungen der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen durch die biologische Stabilität der Glycoproteine und/oder Glycopeptide, die am Oxidationsverfahren teilnehmen, bestimmt. Die optimalen Bedingungen für bestimmte Systeme können innerhalb eines weiten Spielraums bestimmt werden. Solche Bedingungen können vom Fachmann leicht durch Routineversuche unter Berücksichtigung der hierin dargelegten Informationen bestimmt werden.
Nach der Oxidation kann die Reaktionslösung vor der Bindung an ein Substrat bei ungefähr 4°C aufbewahrt werden. Typischerweise kann sich die Aufbewahrungsstabilität der Reaktionslösung bei neutralem pH-Wert oder leicht saurem pH-Wert auf zwischen ungefähr ein und ungefähr vierzehn für 1–14 Tage und manchmal sogar Monate belaufen, wenn sie im Dunkeln aufbewahrt wird.
Die resultierenden Aldehyd-Einheiten treten mit Stellen an einer Oberfläche eines Biomaterials in Wechselwirkung, um die Glycoproteine und/oder Glycopeptide anzubinden. Diese Bindestellen der Biomaterial-Oberfläche umfassen Amin-Einheiten, welche mit Aldehyd-Einheiten unter Bildung von Iminen reagieren. Die Substrat-Oberfläche, an die das Glycoprotein gekuppelt werden soll, sollte eine geeignete Dichte an Amin-Einheiten zur Bindung der gewünschten Anzahl an Glycoproteinen und/oder Glycopeptiden besitzen.
Biomaterialien der vorliegenden Erfindung, die keine Amine an ihren Oberflächen enthalten, können leicht durch eine Reihe im Fachgebiet wohlbekannter Verfahren aminiert werden. Zum Beispiel können Amine durch Plasma-Behandlung der Materialien mit Ammoniakgas bereitgestellt werden, wie es in Holmes und Schwartz, „Amination of Ultra-high Strength Polyethylene using Ammonia Plasma", Composites Science and Technology 38, 1–21 (1990) offenbart ist. Alternativ können Amine bereitgestellt werden, indem Acrylamid an das Substrat gepfropft wird, gefolgt von einer chemischen Modifikation, um Amingruppen durch dem Fachmann wohlbekannte Verfahren einzuführen, z. B. durch Hofmann-Umlagerung. Polyvinylamine oder Polyalkylimine können auch gemäß dem im U.S. Patent Nr. 4,521,564 (Solomone et al.) gelehrten Verfahren kovalent an Polyurethan-Oberflächen gebunden werden. Alternativ kann, zum Beispiel, ein Aminosilan an die Oberfläche gebunden werden, wie es im U.S. Patent Nr. 5,053,048 von Pinchuk dargelegt ist, ein gepfropftes Acrylamid-enthaltendes Polymer kann durch Strahlungspfropfen gebunden werden, wie es im U.S. Patent Nr. 3,826,678 von Hoffman et al. dargelegt ist, ein gepfropftes N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-enthaltendes Polymer kann durch Cerionen-Pfropfen, wie es im U.S. Patent Nr. 5,344,455 von Keogh et al. dargelegt ist, gebunden werden.
Typischerweise wird, wenn eine Aldehyd-Einheit (RCHO) mit einer primären Amin-Einheit (R'NH₂) reagiert, ein Gleichgewicht mit dem Reaktionsprodukt, das eine relativ instabile Imin-Einheit (R'N=CHR) ist, gebildet. Diese Kupplungsreaktion kann unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie oben für die Oxidation beschrieben sind, welche so geschaltet sind, dass das Glycoprotein und/oder Glycopeptid vor Beschädigung geschützt wird. Um die Bindung zwischen dem Glycoprotein und/oder Glycopeptid und der Oberfläche des Biomaterials zu stabilisieren, wird eine nachfolgende reduktive Alkylierung der Imin-Einheit unter Verwendung von Reduktionsmitteln (d. h. Stabilisierungsmitteln), wie zum Beispiel Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid und Aminborane, durchgeführt, um ein sekundäres Amin (R'NH-CH₂R) zu bilden. Diese Reaktion kann auch unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie oben für die Oxidation beschrieben sind. Typischerweise werden die Kupplungs- und Stabilisationsreaktionen jedoch in neutraler oder leicht basischer Lösung und bei einer Temperatur von ungefähr 0–50°C durchgeführt. Bevorzugt ist der pH-Wert bei den Kupplungs- und Stabilisierungsreaktionen ungefähr 6–10 und die Temperatur beträgt ungefähr 4–37°C. Diese Reaktionen (Kupplung und Stabilisierung) kann man nur für ein paar Minuten oder für viele Stunden ablaufen lassen. Üblicherweise sind die Reaktionen (d. h. Kupplung und Stabilisierung) innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen.
Im Allgemeinen können gemäß dieser Erfindung verwendete Glycoproteine zum Beispiel koagulationshemmende und antithrombotische Proteine, Gerinnungsproteine, Plättchen-Proteine, entzündungshemmende Proteine, Antikörper, Immunoglobuline, Abwehrproteine, Enzyme, Hormone, Wachstumsfaktoren, globuläre Proteine, Blutproteine, regulatorische Proteine, Transportproteine, fibröse Proteine, Strukturproteine, Membranproteine, Zellbindungsproteine, Proteoglymays, Toxine, Antibiotika und Liganden sein. Die Glycoproteine können in der Natur gefunden oder chemisch synthetisiert werden. Sofern das Glycoprotein eine 1,2-Dihydroxy-Einheit enthält, kann es durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung an eine aminierte Biomaterial-Oberfläche gebunden werden. Wenn das Glycoprotein zusätzlich zu einer 1,2-Dihydroxy-Einheit eine Amin-Einheit enthält, kann es vernetzt werden, um ein Material zu bilden, welches als Biomaterial oder als Biomaterial-Beschichtung verwendet werden kann.
Im Allgemeinen können gemäß dieser Erfindung verwendete Glycopeptide zum Beispiel koagulationshemmende und antithrombotische Peptide, Gerinnungspeptide, Plättchenpeptide, entzündungshemmende Peptide, Abwehrpeptide, Enzyme, Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter, Cytokine, Blutpeptide, regulatorische Peptide, fibröse Peptide, Strukturpeptide, Transportpeptide, Membranpeptide, Zellbindungspeptide, Proteoglymays, Toxine, Antibiotika und Liganden sein. Die Glycopeptide liegen in der Natur vor oder können chemisch synthetisiert werden. Sofern das Glycopeptid eine 1,2-Dihydroxy-Einheit enthält, kann es durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung an eine aminierte Biomaterial-Oberfläche gebunden werden. Wenn das Glycopeptid zusätzlich zu einer 1,2-Dihydroxy-Einheit eine Amin-Einheit enthält, kann es vernetzt werden, um ein Material zu bilden, welches als Biomaterial oder als Biomaterial-Beschichtung verwendet werden kann.
Glycoproteine oder Glycopeptide oder eine Kombination von Glycoproteinen und Glycopeptiden kann durch eine Vielzahl dem Fachmann wohlbekannter Verfahren chemisch synthetisiert werden. Typischerweise werden Verfahren zur Synthese von Proteinen oder Peptiden ausgehend von Aminosäuren in zwei Kategorien unterteilt: (klassische) Syntheseverfahren in Lösung und Syntheseverfahren an der Festphase (z. B. SPPS). Peptide variierender Länge können auch durch teilweise Hydrolyse sehr langer Polypeptidketten von Proteinen gebildet werden. Glycoproteine und/oder Glycopeptide können ausgehend von natürlichen oder chemisch synthetisierten Proteinen und/oder Peptiden mittels Glycosylierung, welche die Addition von Kohlenhydrat-Seitenketten ist, gebildet werden.
Es gibt eine Vielzahl dem Fachmann wohlbekannter Verfahren zur Glycosylierung von Proteinen oder Peptiden. Zum Beispiel kann eine Seitenketten-Glycosylierung für Serin- und Threonin-Aminosäurereste mit Glycosylbromiden und für Asparaginsäure-Aminosäurereste mit Glycosylaminen, wobei Asparagin-Aminosäurereste gebildet werden, chemisch durchgeführt werden. Außerdem können Glycosylierungsenzyme verwendet werden, um Kohlenhydrat-Seitenketten an Proteine oder Peptide anzubringen.
Manche Glycoproteine oder Glycopeptide sind anfällig für Konformationsänderungen, wenn sie mit einer hydrophoben Substrat-Oberfläche in Kontakt gebracht werden. Diese Konformationsänderungen können zu einem Exponieren interner nichtpolarer Gruppen führen, was zu hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Glycoprotein und/oder Glycopeptid und der Oberfläche führen kann. Diese hydrophoben Wechselwirkungen können zu einem Ausschluss von Wassermolekülen führen, die die Glycoproteine und/oder Glycopeptide in Lösung normalerweise umgeben. Dieser Ausschluss von Wassermolekülen zwischen dem Protein oder Peptid und der Oberfläche verstärkt die hydrophobe Wechselwirkung und kann zu einer weiteren Konformationsänderung des Proteins oder Peptids führen. Der Grad an Konformationsänderung, den ein Glycoprotein und/oder Glycopeptid erfährt, kann seine biologischen Eigenschaften zerstören oder nicht. Daher muss man die hydrophobe Natur der Substrat-Oberfläche berücksichtigen, wenn Glycoproteine und/oder Glycopeptide gebunden werden, die zu hydrophoben Wechselwirkungen neigen. In solchen Fällen ist es bevorzugt, eine hydrophile Umgebung auf der Oberfläche des Biomaterials zu erzeugen, wodurch unerwünschte hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Glycoprotein und/oder Glycopeptid und der Oberfläche, welche die biologischen Eigenschaften des Proteins oder Peptids zerstören können, verhindert werden.
Es gibt viele dem Fachmann bekannte Oberflächen-Derivatisierungs-Techniken (z. B. Pfropftechniken), um hydrophile Substrat-Oberflächen zu erzeugen. Zum Beispiel sind Techniken bekannt, die auf einer Cerionen-Initiierung, Ozon-Behandlung, Koronaentladung, UV-Strahlung und ionisierender Strahlung (⁶⁰Co, Röntgenstrahlen, Hochenergieelektronen, Plasmagasentladung) basieren.
Substrate, die gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, schließen Metalle wie Titan, Titanlegierungen, TiNi-Legierungen, Formgedächtnis-Legierungen, superelastische Legierungen, Aluminiumoxid, Platin, Platinlegierungen, Edelstahl, Edelstahllegierungen, MP35N, Elgiloy, Haynes 25, Stellit, pyrolytischer Kohlenstoff, Silber- oder Glaskohlenstoff; Polymere wie Polyamide, Polycarbonate, Polyether, Polyester, Polyolefine, einschließlich Polyethylene oder Polypropylene, Polystyrole, Polyurethane, Polyvinylchloride, Polyvinylpyrrolidone, Silikonelastomere, Fluorpolymere, Polyacrylate, Polyisoprene, Polytetrafluorethylene, Gummi, Mineralien oder Keramiken wie Hydroxyapatit; menschliches oder tierisches Protein oder Gewebe wie Knochen, Haut, Zähne, Kollagen, Laminin, Elastin oder Fibrin; organische Materialien wie Holz, Zellulose oder Presskohle und andere Materialien wie Glas und dergleichen ein. Biomaterialien der vorliegenden Erfindung, die unter Verwendung dieser Materialien hergestellt sind, können beschichtet oder unbeschichtet, derivatisiert oder undervatisiert sein. Ein Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um Substrate beliebiger Gestalt oder Form, einschließlich röhrenförmiger, folienförmiger, stabförmiger Gestalt oder Form, und Artikel passender Form zur Verwendung bei einer Vielzahl von medizinischen Artikeln wie Gefäßtransplantaten, Aortotransplantaten, arteriellen, venösen oder vaskulären Schläuchen, vaskulären Stents, Dialysemembranen, -schläuchen oder -verbindungsstücken, Blutoxigenatorschläuchen oder -membranen, Ultrafiltrationsmembranen, Intraaortoballonen, Bluttaschen, Kathetern, Nahtmaterialien, Weich- oder Hartteilprothesen, synthetischen Prothesen, Herzklappenprothesen, Gewebeklebern, Herzschrittmacherzuleitungen, künstlichen Organen, Endotrachealtubi, Linsen für das Auge wie Kontakt- oder Intraokularlinsen, Bluthandhabungsausrüstungen, Aphereseausrüstungen, diagnostischen und Kontroll-Kathetern und Sensoren, Biosensoren, dentalen Artikeln, Wirkstofftransportsystemen oder Körperimplantaten jeglicher Art zu modifizieren.
Der Fachmann wird auch erkennen, dass Glycoproteine oder Glycoprotein-Beschichtungen sowie Glycopeptide und/oder Glycopeptid-Beschichtungen unter Verwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung vernetzt werden können. Das heißt, dass Glycoproteine und/oder Glycopeptide oder Glycoprotein- und/oder Glycopeptid-Beschichtungen, die sowohl primäre Amin-Einheiten als auch 1,2-Dihydroxy-Einheiten enthalten, vernetzt werden können, um erwünschte physikalische und biologische Eigenschaften bereitzustellen. Die durch das Vernetzen der Aldehyde (die durch Oxidation der 1,2-Dihydroxy-Einheiten entstehen) und Amine gebildeten resultierenden Imine können unter Verwendung von Reduktionsmitteln wie oben beschrieben stabilisiert werden.
Zum Beispiel können strukturelle Glycoproteine und/oder Glycopeptide vernetzt werden, um ein Material zu bilden, das als Biomaterial oder als Biomaterial-Beschichtung verwendet werden kann. Auch können zusätzliche Glycoproteine und/oder Glycopeptide, wie hierin beschrieben, an übrige Amin-Einheiten geknüpft werden, die in einem oder an einem hergestellten vernetzten Glycoprotein- und/oder Glycopeptid-Biomaterial oder einer Biomaterial-Beschichtung, wie hierin beschrieben, enthalten sind. Alternativ können Amin-enthaltende Biomoleküle an übrige Aldehyd-Einheiten geknüpft werden, die in oder an einem hergestellten vernetzten Glycoprotein- und/oder Glycopeptid-Biomaterial oder einer Biomaterial-Beschichtung, wie hierin beschrieben, enthalten sind.
Ein Beispiel für ein Glycoprotein der vorliegenden Erfindung ist Fibrin(ogen). Fibrin(ogen), welches ein Strukturprotein ist, weist Oligosaccharide auf, welche mit einer Periodat-Quelle oxidiert werden können, die als Periodsäure oder Salze davon, wie Natriumperiodat, Kaliumperiodat oder andere Alkalimetallperiodate bereitgestellt werden können, um eine entsprechende Aldehyd-Einheit zu bilden. Die resultierenden Aldehyd-Einheiten können verwendet werden, um das Fibrinogen) über Bindungen zu vernetzen, die sich zwischen den Aldehyden und Aminen (Lysin-Aminosäurereste), die an benachbarten Fibrin(ogen)-Molekülen enthalten sind, ausgebildet haben. Die resultierenden Imin-Bindungen können dann unter Verwendung eines milden Reduktionsmittels wie Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid oder Aminborane reduziert werden. Diese Vernetzungen können das Fibrinogen- und/oder Fibrin- (Thrombin-polymerisiertes Fibrinogen) Biomaterial oder die Biomaterial-Beschichtung ohne Verwendung eines Kupplungsmittels mit wünschenswerten biologischen und/oder physikalischen Eigenschaften wie u. a. mechanischer Festigkeit, anti-Immunogenität, Biostabilität ausstatten. Somit beseitigt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Notwendigkeit der Verwendung von Glutaraldehyd, welches ein üblicherweise verwendetes cytotoxisches Kupplungsmittel ist, um das Fibrinogen und/oder Fibrin zu vernetzen, um seine physikalischen und biologischen Eigenschaften zu kontrollieren.
Die durch Oxidation von Fibrinogen) gebildeten Aldehyd-Einheiten können auch verwendet werden, um eine Vielfalt Amin-enthaltender Biomoleküle an das vernetzte Fibrin(ogen)-Biomaterial oder die Biomaterial-Beschichtung zu kuppeln. Auch ermöglicht die Fähigkeit, Aldehyd-Einheiten entlang von Fibrin(ogen)-Molekülen zu erzeugen, diese kovalent an Amin-enthaltende Biomaterial-Oberflächen zu binden. Solche Fibrinogen/Fibrin-beschichteten Biomaterial-Oberflächen können zum Beispiel als Zellansiedlungsoberflächen, Zellbindeoberflächen, Zellseparationsoberflächen, Fibrinogen/Fibrin-beschichtete Stents, Fibrinogen/Fibrin-beschichtete Gefäßtransplantate oder Fibrinogen/Fibrin-Klebstoffe verwendet werden.
Obwohl sich die unten beschriebenen Beispiele im Allgemeinen auf die Behandlung von polymeren Filmen oder Gewebekulturplatten als Substrat-Oberflächen beziehen, sind diese Beispiele lediglich zur Veranschaulichung gedacht und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung auf keine Weise beschränken.
Beispiel 1: Periodat-Oxidation von Rinderfibrinogen
Ein Rinderfibrinogen-Glycoprotein, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde in Natriummetaperiodat (NaIO₄), das auch von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Es wurden die folgenden vier Fibrinogen-Lösungen hergestellt, um die Oxidation von Fibrinogen mit variierenden Mengen an Periodat zu untersuchen: (1) 0,03 mM Fibrinogen, 0,2 mM NaIO₄, 0,008 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,14 M NaCl, pH 7,4; (2) 0,03 mM Fibrinogen, 0,1 mM NaIO₄, 0,008 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,14 M NaCl, pH 7,4; (3) 0,03 mM Fibrinogen, 0,05 mM NaIO₄, 0,008 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,14 M NaCl, pH 7,4; und (4) 0,03 mM Fibrinogen, 0,008 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,14 M NaCl, pH 7,4. Die vier Fibrinogen-Lösungen wurden für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Lösungen, jeweils 500 μl, wurden zu 2 ml einer unter der Warenbezeichnung PURPALD von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhältlichen Lösung zugegeben, die 0,8 g NaOH, 0,2 g 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol in 20 ml entionisiertem Wasser enthielt, und für 15 Minuten bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt. Dickinson und Jacobsen, Chem. Commun., 1719 (1970) haben die spezifische und empfindliche Reaktion von Aldehyden mit PURPALD beschrieben, um lila-bis-magenta-gefärbte 6-Mercapto-s-triazolo-(4,3-b)-s-tetrazine zu erhalten.
Nach 15 Minuten Schütteln bei Raumtemperatur wurden die resultierenden Lösungen spektrophotometrisch bei 550 nm analysiert. Probe 4 wurde als Blindprobe verwendet. Die bei 550 nm erhaltenen Extinktionen der Proben waren 0,54 für Probe 1, 0,53 für Probe 2 und 0,51 für Probe 3, was zeigt, dass das Fibrinogen in allen Proben erfolgreich oxidiert wurde, um Aldehyd-Gruppen zu bilden.
Beispiel 2: Periodat-Oxidation von Rindervitronectin
Ein Rindervitronectin-Glycoprotein, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde in Natriummetaperiodat (NaIO₄), das auch von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Es wurden die folgenden zwei Vitronectin-Lösungen hergestellt: (1) 0,001 mM Vitronectin, 0,05 M NaIO₄ und (2) 0,001 mM Vitronectin. Beide Lösungen wurden im Dunkeln für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Lösungen, jeweils 100 μl, wurden zu 2 ml PURPALD-Lösung, die in Beispiel 1 beschrieben ist, zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt.
Nach 30 Minuten Schütteln bei Raumtemperatur wurden die resultierenden Lösungen spektrophotometrisch bei 550 nm analysiert. Die PURPALD-Lösung wurde als Blindprobe verwendet. Die bei 550 nm erhaltenen Extinktionen der Proben waren 0,09 für Probe 1 und 0,04 für Probe 2, was zeigt, dass Vitronectin in allen Proben erfolgreich oxidiert wurde, um Aldehyd-Gruppen zu bilden.
Beispiel 3: Periodat-Oxidation von Rinderfibronectin
Ein Rinderfibronectin-Glycoprotein, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde in Natriummetaperiodat (NaIO₄), das auch von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Es wurden die folgenden zwei Fibronectin-Lösungen hergestellt: (1) 0,002 mM Fibronectin, 0,05 M NaIO₄, 0,5 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 7,5; und (2) 0,002 mM Fibronectin, 0,5 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 7,5. Beide Lösungen wurden im Dunkeln für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Lösungen, jeweils 100 μl, wurden zu 2 ml PURPALD-Lösung zugegeben, die in Beispiel 1 beschrieben ist, und für 30 Minuten bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt.
Nach 30 Minuten Schütteln bei Raumtemperatur wurden die resultierenden Lösungen spektrophotometrisch bei 550 nm analysiert. Nach einer anfänglichen Analyse wurde bemerkt, dass Probe 1 zu viele Aldehyde enthielt, um genau messen zu können. Deshalb wurde Probe 1 1 : 50 mit entionisiertem Wasser verdünnt, um eine Lösung bereitzustellen, die eine messbare Menge an Aldehyden enthält. Die PURPALD-Lösung wurde als Blindprobe verwendet. Die bei 550 nm erhaltenen Extinktionen der Proben betrugen 0,81 für Probe 1 und 0,0 für Probe 2, was zeigt, dass das Fibronectin in Probe 1 erfolgreich oxidiert wurde, um Aldehyd-Gruppen zu bilden. Das Fibronectin in Probe 2 wurde wegen des Weglassens von Periodat nicht oxidiert.
Beispiel 4: Bindung von Fibronectin an aminierte Substrate
Ein Fibronectin wurde kovalent an eine Substrat-Oberfläche gebunden. Die Bindungsmethode hat mit der Pfropfcopolymerisation von Acrylamid (AAm)- und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid (APMA)-Monomeren auf eine Ozon-behandelte Polystyrol-Gewebekulturplatte mit Cer (Ce^IV)-Ionen begonnen. Die Ce^IV-Ionen bildeten an der Ozon-behandelten Oberfläche freie Radikale, welche die Pfropfcopolymerisation der Acrylamide initiiert haben. Das Ausmaß an Oberflächen-Aminierung (Pfropfcopolymerisation von APMA und AAm), welche an der Substrat-Oberfläche ablief, wurde mittels Anfärben mit Ponceau S-Farbstoff, einem negativ geladenen Farbstoffmolekül, gemessen. Nach dem Pfropfen wurde Fibronectin an die Amin-enthaltende derivatisierte Substrat-Oberfläche gekuppelt. Fibronectin wurde erst mit Natriummetaperiodat (NaIO₄) unter Bildung reaktiver Aldehyd-Gruppen oxidiert. Diese Aldehyd-Gruppen wurden dann verwendet, um Fibronectin kovalent an die an der Substrat-Oberfläche vorhandenen primären Amino-Gruppen zu binden. Dann wurde Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH₃) verwendet, um die Imin-Bindungen zu stabilisieren. Die genauen Vorgehensweisen für jeden dieser Schritte sind unten beschrieben.
Polystyrol-24-Well-Gewebekulturplatten wurden Ozon-behandelt, indem die Kulturplatten für 30 Minuten in einen Ozon-Reaktionsbehälter eingebracht wurden, während Sauerstoff, der Ozon enthielt, mit einer Flussrate von 1,3 cm³/min durchgeleitet wurde. Das Sauerstoff-enthaltende Ozon wurde erzeugt, indem man den Sauerstoff durch einen Koronaentladungsapparat durchgeleitet hat, welcher den strömenden Sauerstoff einem elektrischen Potential von 8000 V ausgesetzt hat. Nach der Ozon-Behandlung wurden die Platten für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Stickstoff-gespültes entionisiertes Wasser getaucht. Nach dem 30-minütigen Eintauchen in Stickstoff-gespültes entionisiertes Wasser wurden die Platten mit Acrylamid (AAm)- und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid (APMA)-Monomeren (von Eastman Kodak Co., Rochester, NY) unter Verwendung von Ammoniumcer(IV)nitrat (von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) gepfropft. Die Pfropflösung enthielt 11,2 M AAm, 1,1 M APMA, 400 mM Salpetsäure und 40 mM Ammoniumcer(IV)nitrat in entionisiertem Wasser. Man ließ die Platten für 3 Stunden in einem Stickstoffgespülten 65°C-Ofen pfropfen. Nach dem Pfropfen wurden die Platten sorgfältig mit entionisiertem Wasser gespült. Die gepfropften Platten wurden dann mit Ponceau S Farbstoff untersucht. Nach dem Anfärben wurde der Ponceau S Farbstoff unter Verwendung einer 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung von der Oberfläche gelöst und bei 520 nm spektrophotometrisch quantifiziert. Die bei 520 nm erhaltenen Extinktionen der Proben betrugen 0,00 für nicht-derivatisierte Platten und 1,44 für Oberflächen-derivatisierte Platten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Oberflächen-derivatisierten Platten primäre Amine an ihren Oberflächen enthielten.
Rinderfibronectin, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde dann in Natriummetaperiodat (NaIO₄), das auch von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Es wurde die folgende Fibronectin-Lösung hergestellt: 0,002 mM Fibronectin, 0,05 M NaIO₄, 0,5 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 7,5. Die Lösung wurde im Dunkeln für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Natriumcyanoborhydrid (1 mg/ml) zu der Fibronectin-Lösung zugegeben. Die resultierende Lösung wurde sofort zu jedem der Amin-enthaltenden Oberflächen-derivatisierten Gewebekulturplatten-Wells (ungefähr 1 ml Lösung/Well) zugegeben. Die Fibronectin-Lösung wurde in den derivatisierten Gewebekulturplatten-Wells über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Wells dann sorgfältig mit Phosphat-gepufferter Saline(PBS)-Lösung gespült. Die Bindung von Fibronectin an die Amin-enthaltenden Oberflächen-derivatisierten Gewebekulturplatten-Oberflächen wurde unter Verwendung von Toluidin-Blau-Farbstoff, einem positiv geladenen Farbstoff-Molekül, bestimmt. Dieser Farbstoff verbindet sich ionisch mit den negativen Ladungen an einer Substrat-Oberfläche. Deshalb wird jede Bindung von Toluidinblau-Farbstoff an eine Fibronectin-derivatisierte Oberfläche durch das Vorhandensein von negativen Ladungen in dem Fibronectin verursacht.
Die Wells jeder Platte wurden mit einer Lösung von 1% Toluidinblau-Farbstoff in entionisiertem Wasser gefüllt. Nach einer ungefähr 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Farbstofflösung entfernt, und die Wells wurden sorgfältig mit PBS gespült. Der Oberflächen-assozierte Farbstoff in jedem Welt wurde dann durch mechanisches Schütteln der Platten in einer Lösung von 1% SDS in entionisiertem Wasser über Nacht eluiert. Die Menge an von den Wells eluiertem Farbstoff wurde dann spektrophotometrisch bei 630 nm bestimmt. Die bei 630 nm erhaltenen Extinktionen der Proben betrugen 0,05 für die nicht-derivatisierte Probenplatte, 0,54 für die AAm/APMA-derivatisierte Probenplatte und 1,83 für die Fibronectin-derivatisierte Probenplatte, was zeigt, dass das Fibronectin erfolgreich oxidiert und dann kovalent an die Substrat-Oberfläche gebunden worden ist.
Beispiel 5: ELISA und zelluläres Anhaften an Fibronectin-gekuppelte Oberflächen
Ein Polyurethan in Form von Pellethane 2363-55D wurde von Dow Chemical Co. (Midland, MI) erhalten und zu einem Film extrudiert. Der Film wurde in 1 cm² große Probenscheiben geschnitten. Dann wurden die Probenscheiben mit Ethanol gereinigt und mit AAm- und APMA-Monomeren unter Verwendung des Ce^IV-Ions gepfropft. Die Pfropflösung umfasste 11,2 M AAm, 1,1 M APMA, 400 mM Salpetersäure und 40 mM Ammoniumcer(IV)nitrat in entionisiertem Wasser. Die Probenscheiben wurden in die Pfropflösung eingebracht, und man ließ sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur pfropfen. Nach dem Pfropfen wurden die Probenscheiben sorgfältig mit entionisiertem Wasser gewaschen. Dann wurde Fibronectin über zwei Verfahren an die resultierenden APMA/AAm-Oberflächen-derivatisierten Probenscheiben gekuppelt.
Bei einem ersten Verfahren wurde das Fibronectin mit Natriummetaperiodat oxidiert. Fibronectin (0,1 mg/ml) wurde im Dunkeln für 3 Stunden bei Raumtemperatur 1 μg/ml Natriummetaperiodat in entionisiertem Wasser ausgesetzt. Die APMA/AAm-derivatisierten Probenscheiben wurden dann für 24 Stunden bei Raumtemperatur in die Lösung von oxidiertem Fibronectin eingebracht. Die Probenscheiben wurden dann sorgfältig mit entionisiertem Wasser gespült. Die Proben wurden dann für 24 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung von 3 mg/ml Natriumcyanoborhydrid in entionisiertem Wasser inkubiert. Die Probenscheiben wurden dann sorgfältig mit entionisiertem Wasser gespült.
Bei einem zweiten Verfahren verwendete man Glutaraldehyd als Kupplungsmittel. Das zweite Verfahren schloss das Eintauchen der APMA/AAm-derivatisierten Probenscheiben in eine Lösung von 2% Glutaraldehyd in entionisiertem Wasser für zwei Stunden bei Raumtemperatur ein. Die Probenscheiben wurden dann sorgfältig mit entionisiertem Wasser gespült. Nach dem Spülen wurden die Probenscheiben für 24 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung von 0,1 mg/ml Fibronectin in entionisiertem Wasser inkubiert. Die Probenscheiben wurden dann sorgfältig mit entionisiertem Wasser gespült. Die Probenscheiben wurden dann für 24 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung von 3 mg/ml Natriumcyanoborhydrid in entionisiertem Wasser inkubiert. Die Probenscheiben wurden dann sorgfältig mit entionisiertem Wasser gewaschen.
Dann wurde ein Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) durchgeführt, um die Fähigkeit eines Antikörpers zu bestimmen, das Fibronectin zu erkennen, welches an die Probenoberflächen gebunden wurde. Die Probenscheiben wurden für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Waschpuffer (pH 7,4) gewaschen, der 10 mM Tris, 0,15 M NaCl und 0,05% Tween enthielt. Die Probenscheiben wurden dann für 30 Minuten bei 37°C in Blockierungspuffer inkubiert, der 10 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween und 0,05% Gelatine enthielt, gefolgt von drei 10-minütigen Waschvorgängen mit Waschpuffer. Dann wurden die Probenscheiben bei 37°C für eine Stunde in einer Lösung mit Primärantikörper (pH 7,4), die 10 mM Tris, 0,15 M NaCl und 2 μg/ml monoklonalen anti-Fibronectin-Antikörper von der Maus (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, inkubiert. Die Probenscheiben wurden dann drei Mal mit Waschpuffer gewaschen (10 Minuten pro Waschvorgang). Die Probenscheiben wurden dann bei 37°C für 1 Stunde in einer Lösung mit Peroxidase-markiertem Sekundärantikörper (pH 7,4), die 10 mM Tris, 0,15 M NaCl und 0,5 ng/ml anti-Maus IgG Peroxidase-Antikörper-Konjugat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, inkubiert, gefolgt von dreimaligem Spülen der Probenscheiben mit Waschpuffer (10 Minuten pro Waschvorgang).
Die Probenscheiben wurden dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Phosphat-Citrat-Puffer (pH 5,0) inkubiert, der 0,4 mg/ml o-Phenyldiamindihydrochlorid und 0,2 μl/ml 30%iges Wasserstoffperoxid enthielt. Der Phosphat-Citrat Puffer enthielt 50 mM zweibasiges Natriumphosphat und 25 mM Zitronensäure in entionisiertem Wasser. Nach der 15-minütigen Inkubation wurde die Peroxidreaktion mit 3 M HCl gestoppt, und das Absorptionsmaß der resultierenden Lösung wurde spektrophotometrisch bei 492 nm gemessen. Die APMA/AAm-derivatisierten Probenscheiben wurden für dieses Experiment als Kontrollen verwendet. Die aus der spektrophotometrischen Analyse erhaltenen Extinktionen der Proben betrugen 0,016 ± 0,038 für APMA/AAm-derivatisierte Proben, die Glutaraldehyd-gekuppeltes Fibronectin enthielten, und 0,204 ± 0,068 für APMA/AAm-derivatisierte Proben, die Periodat-oxidiertes Fibronectin enthielten. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Periodat-Oxidationsverfahren erfolgreicher bei der Bindung von Fibronectin an Probenoberflächen ist.
Es wurde auch ein zellulärer Adhärenzassay durchgeführt, um die Fähigkeit der Zellen zu bestimmen, an Fibronectin-derivatisierte Probenoberflächen anzuhaften. Probenscheiben wurden für 1 Stunde bei 37°C in einem Blockierungspuffer inkubiert, der 1 mg/ml Ovalbumin in Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7,4, enthielt. Maus-Fibroblasten (C3T3), die von der Amerimay Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten wurden und in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Rinderserum versetzt wurde, gehalten wurden, wurden unter Verwendung von Trypsin : EDTA geerntet und in Serum-freiem DMEM, das 2 mg/ml Ovalbumin enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen, ausgezählt und bis zu einer Enddichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml in Serumfreiem DMEM, das 2 mg/ml Ovalbumin enthielt, resuspendiert. Die Probenscheiben wurden dann in der Zellsuspension für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nichtanhaftende Zellen wurden durch Waschen mit PBS entfernt. Die Probenscheiben wurden in 3% Paraformaldehyd-Lösung für 30 Minuten fixiert. Anhaftende Zellen wurden dann mit einer Färbelösung, die 1% Toluidinblau-Farbstoff und 3% Paraformaldehyd in PBS enthielt, angefärbt. Nach dem Anfärben wurden die Probenoberflächen dann unter Verwendung eines Lichtmikroskops auf die Zellanhaftung hin untersucht. Bei der Untersuchung schien es, dass APMA/AAm-derivatisierte Proben und APMA/AAm-derivatisierte Proben, die Glutaraldehyd-gekuppeltes Fibronectin enthielten, keine anhaftenden Zellen aufwiesen. Im Gegensatz dazu schien es, dass Zellen an APMA/AAm-derivatisierte Proben anhafteten, die Periodat-oxidiertes Fibronectin enthielten.
Beispiel 6: Vernetzung von Fibrinogen
Schweinefibrinogen, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde in Natriummetaperiodat (NaIO₄), das auch von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, und Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH₃), das von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) erhalten wurde, inkubiert. Es wurde die folgende Fibrinogen-Lösung hergestellt: 0,03 mM Fibrinogen, 0,02 M NaIO₄, 0,02 M NaCNBH₃, 0,008 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,14 M NaCl, pH 7,4. Die Lösung wurde dann kräftig geschüttelt und in eine 24-Well-Gewebekulturplatte eingebracht (ungefähr 1 ml Fibrinogen-Lösung/Well).
Die Platte wurde dann im Dunkeln für zwei Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 2 Stunden wurde beobachtet, dass die Lösung trüb und sehr viskos geworden ist, was anzeigt, dass das Fibrinogen vernetzt worden ist. Die Probe wurde dann für zusätzliche 22 Stunden im Dunkeln geschüttelt. Nach der Inkubation wurde das vernetzte Fibrinogen unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen PURPALD-Lösung auf übrige Aldehyde hin untersucht. Die Ergebnisse des PURPALD-Assays zeigten, dass wenig übrige Aldehyde vorhanden waren, was die Bildung von kovalenten Vernetzungen zwischen den Aldehyden und den Aminen, die entlang der Fibrinogen-Moleküle vorliegen, anzeigt.
Es wurde die folgende Rinderfibrinogen (erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)-Lösung hergestellt: 0,02 mM Fibrinogen, 0,008 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,14 M NaCl, pH 7,4. Nach der Herstellung wurde die Lösung in vier gleiche Teile aufgeteilt. Dann wurde Natriummetaperiodat (0,05 mM) zu den Proben 3 und 4 zugegeben. Alle vier Fibrinogen-Lösungen wurden dann im Dunkeln für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 0,02 mM NaCNBH₃ zu den Proben 2 und 4 zugegeben. Wieder ließ man alle vier Fibrinogen-Lösungen für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur reagieren. Die Proben, jeweils 50 μl, wurden dann in 450 μl SDS-PAGE-Pufferlösung eingebracht, die 62,5 mM Tris-HCl, 5% b-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 2,3% SDS enthielt. Die Proben wurden dann für 3 Minuten gekocht. Die Proben, jeweils 10 μl, wurden dann auf ein Gel mit einem Gradienten von 4–15% geladen, und es wurde SDS-PAGE gemäß den in O'Farrell, "High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins", J. Biol. Chem. 250, 4007–4021 (1974) beschriebenen Vorgehensweisen durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt und die Identität der eluierten Proteine wurde durch Bezugnahme auf molekulare Gewichtsstandards bestimmt, die auf dem Gel enthalten waren. Die Ergebnisse von SDS-PAGE zeigten an, dass die Fibrinogen-Moleküle in Probe 4 stabile kovalente Vernetzungen gebildet hatten. Im Gegensatz dazu zeigten die Ergebnisse, dass die Fibrinogen-Moleküle in den Proben, die kein NaIO₄ enthielten, keine Vernetzungen gebildet hatten.
Dem Fachmann ist geläufig, dass die Erfindung zwar im Zusammenhang mit bestimmten Ausführungsformen und Beispielen beschrieben worden ist, die Erfindung aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt ist, und dass zahlreiche weitere Ausführungsformen, Beispiele, Verwendungen, Modifikationen und Abweichungen von den Ausführungsformen, Beispielen und Verwendungen von den hiernach angefügten Ansprüchen mit umfasst sein sollen.

Claims

Verfahren zur Bildung einer Beschichtung auf einer Oberfläche eines medizinischen Artikels, wobei die Beschichtung der Oberfläche verbesserte Biokompatibilitätseigenschaften verleiht und die Oberfläche geeignet ist für das Inkontakttreten mit in einem lebenden Säuger befindlichem oder zeitweise daraus entnommenem Gewebe, Blut und anderen Körperflüssigkeiten, wobei man: (a) ein Periodat mit einem Glycopeptid umsetzt, das eine 1,2-Dihydroxy-Gruppe und einen Aminosäurerest umfasst, so dass die 1,2-Dihydroxy-Gruppe unter Bildung eines Aldehyd-funktionellen Glycopeptids oxidiert wird; (b) den medizinischen Artikel bereitstellt, wobei der Artikel ein geeignetes, die Oberfläche bildendes Biomaterial aufweist und eine Amin-Gruppe auf der Oberfläche angeordnet ist; (c) das Aldehyd-funktionelle Glycopeptid mit der Amin-Gruppe vereinigt, um das Aldehyd-funktionelle Glycopeptid an die Amin-Gruppe zu binden und dadurch eine Imin-Gruppe zu bilden; und (d) die Imin-Gruppe mit einem Reduktionsmittel umsetzt, um eine Amin-Bindung zu bilden, wobei die Amin-Bindung das Glycopeptid auf der Oberfläche immobilisiert und das immobilisierte Glycopeptid die Beschichtung bildet.
Verfahren zum Vernetzen einer Beschichtung auf einer Oberfläche eines medizinischen Artikels, wobei die Beschichtung der Oberfläche verbesserte Biokompatibilitätseigenschaften verleiht und die Oberfläche geeignet ist für das Inkontakttreten mit in einem lebenden Säuger befindlichem oder zeitweise daraus entnommenem Gewebe, Blut und anderen Körperflüssigkeiten, wobei man: (a) ein Glycopeptid auf der Oberfläche immobilisiert, wobei das Glycopeptid die Beschichtung bildet und eine 1,2-Dihydroxy-Gruppe, einen Aminosäurerest und eine Amin-Gruppe umfasst; (b) ein Periodat mit der Beschichtung umsetzt, so dass die 1,2-Dihydroxy-Gruppe unter Bildung einer Aldehyd-Gruppe oxidiert wird; (c) die Aldehyd-Gruppe sich mit der Amin-Gruppe unter Bildung einer Imin-Gruppe vereinigen läßt; und (d) die Imin-Gruppe mit einem Reduktionsmittel unter Bildung eines sekundären Amins umsetzt, wodurch man eine Vernetzung zumindest von Teilen der Beschichtung herbeiführt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der medizinische Artikel ein mit Blut in Kontakt tretender medizinischer Artikel, ein mit Gewebe in Kontakt tretender medizinischer Artikel, ein mit Körperflüssigkeit in Kontakt tretender medizinischer Artikel, ein implantierbarer medizinischer Artikel, ein extrakorporaler medizinischer Artikel, ein Blutoxigenator, eine Blutpumpe, ein Schlauch zum Aufnehmen von Blut, ein medizinischer Artikel in Form einer Endoprothese, ein Gefäßtransplantat, ein Stent, eine Schrittmacherzuleitung, eine Herzklappe, ein temporärer intravaskulärer medizinischer Artikel, ein Katheter oder ein Führungsdraht ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche der medizinischen Artikels mindestens ein biokompatibles Material umfasst, das ausgewählt ist unter Titan, Titanlegierungen, Zinn-Nickel-Legierungen, Formgedächtnis-Legierungen, Aluminiumoxid, Platin, Platinlegierungen, Edelstahl, MP35N-Edelstahl, Elgiloy, Stellit, pyrolytischem Kohlenstoff, Silberkohlenstoff, Glaskohlenstoff, Polyamid, Polycarbonat, Polyether, Polyester, Polyolefin, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyurethan, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Silikonelastomer, Fluorpolymer, Polyacrylat, Polyisopren, Polytetrafluorethylen, Gummi, Keramik, Hydroxyapatit, menschlichem Protein, menschlichem Gewebe, tierischem Protein, tierischem Gewebe, Knochen, Haut, Zähnen, Kollagen, Laminin, Elastin, Fibrin, Holz, Zellulose, Presskohle und Glas.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Teil der Oberfläche des medizinischen Artikels einen Schlauch, einen Stab, eine Membran, einen ballon, eine Tasche oder eine Folie umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Glycopeptid ausgewählt ist unter natürlich vorkommenden oder synthetischen koagulationshemmenden Peptiden, antithrombotischen Peptiden, Gerinnungspeptiden, Plättchen-Peptiden, entzündungshemmenden Peptiden, Abwehrpeptiden, Enzymen, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern, Cytokinen, Blutpeptiden, regulatorischen Peptiden, Transportpeptiden, fibrösen Peptiden, Strukturpeptiden, Membranpeptiden, Zellbindungspeptiden, Toxinen, Antibiotika und Liganden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die 1,2-Dihydroxy-Gruppe durch Umsetzung mit Periodsäure, Natriumperiodat und/oder Kaliumperiodat in wässriger Lösung mit einem pH zwischen 4 und 9 und bei einer Temperatur zwischen 0 und 50 Grad Celsius oxidiert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Oxidation bei Abwesenheit von Licht durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bildung der Imin-Gruppe durch Umsetzung in wässriger Lösung mit einem pH zwischen 6 und 10 und bei einer Temperatur zwischen 0 und 50 Grad Celsius herbeigeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Imin-Gruppe durch Umsetzung mit Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid und/oder Aminboranen in wässriger Lösung mit einem pH zwischen 6 und 10 und bei einer Temperatur zwischen 0 und 50 Grad Celsius reduziert wird.
Medizinischer Artikel, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.