DE69827621T2

DE69827621T2 - Immunogene zusammensetzungen gegen den cck-b-gastrin-rezeptor und verfahren zur behandlung von tumoren

Info

Publication number: DE69827621T2
Application number: DE69827621T
Authority: DE
Inventors: Dov Michaeli; Martyn Caplin; A. Susan WATSON; Stephen Grimes
Original assignee: Aphton Corp
Current assignee: Receptor Biologix Inc
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2005-03-31
Also published as: BR9811264A; US6548066B1; WO1998051337A2; CN1170593C; ATE282429T1; DE69827621T9; HUP0002760A3; NZ500748A; US20030086941A1; DE69827621D1; PT981369E; EP0981369B1; WO1998051337A3; CA2287872C; AU7574098A; JP2002511066A; EP0981369A2; AU746754B2; NZ511550A; JP2007063289A

Description

Hintergrund der Erfindung
Es wurde gezeigt, dass verschiedene Tumortypen, zum Beispiel kolorektale, Magen-, Pankreas- und hepatozelluläre Adenokarzinome, CCK-B/Gastrin-Rezeptoren in ihren Plasmamembranen besitzen und dass sie auf Gastrin mit einer starken Zellprolifertion reagieren (Rehfeld, J. F. 1972, Upp. et al. 1989 und Watson et al. 1993). Darüber hinaus wurde vor etwas kürzerer Zeit entdeckt, dass viele dieser Krebszellen auch Gastrin sekretieren und folglich einen autonomen Prolifertationsweg oder „autokrine Schleife" bewirken (Van Solinge et al. 1993, Nemeth et al. 1993 und Seva et al. 1994).
Es wurden eine Zahl von hochaffinen CCK-B/Gastrin-Rezeptorantagonisten sowohl in vitro als auch in vivo in einer Zahl von experimentellen gastointestinalen Krebsen therapeutisch beurteilt. Zum Beispiel wurde für Proglumid, ein Glutaminsäurederivat (Seva et al. 1990; Harrison et al. 1990), Benzotript, ein N-Acylderivat von Tryptophan; L-365,260, ein Derivat von Aspercillin (Bock et al. 1989), und C1-988, ein Molekül, das die C-terminale Pentapeptidseqnenz von CCK imitiert (Hughes et al. 1990), gezeigt, dass sie wirksam die Wirkungen von exogenem Gastrin auf das gastrointestinale Tumorwachstum sowohl in vitro als auch in vivo neutralisieren (Watson et al. 1991 und Romani et al. 1994). Diese Antagonisten haben jedoch schwere toxische Nebenwirkungen und ihnen fehlt die Spezifität, da sie die Wirkung von allen potenziellen Liganden des Rezeptors wie von Gastrin-34 (G34) und CCK in normalen Zellen blockieren. Jüngst wurden hochpotente und selektive CCK-B/Gastrin- Rezeptorantagonisten wie YM002 (Yuki et al., 1997) und YF476 (Takinami et al., 1997) beschrieben.
Proglumid und Benzotript wurden in vorklinischen Studien weitgehend beurteilt. Das Hauptproblem bei diesen Verbindungen ist, dass es ihnen an Wirksamkeit fehlt, wobei relativ hohe Konzentrationen benötigt werden, um Gastrin-17 (G17) zu verdrängen.
Auf Grund der geringen Spezifität für diese Klasse von gastrinantagonisierenden Mitteln für den CCK-B/Gastrin-Rezeptor kann die Inhibierung des Tumorwachstums nicht wirksam mit Gastrinantagonisten kontrolliert werden. Darüber hinaus binden die zellulären Rezeptoren, welche die Gastrine erkennen und binden, nicht alle die getesteten Inhibitoren (Seva et al., 1994). Folglich können dann, wenn keine vollständige Inhibierung der Gastrinbindung an den Rezeptor in der autokrinen Wachstumskaskade geschieht, die Gastrinantagonisten nicht in der Lage sein diesen Mechanismus der Tumorwachstumsförderung zu blockieren.
Die Aminosäuresequenz des humanen CCK-B/Gastrin-Rezeptors ist bekannt (Tarasova et al., 1994; Herget et al., 1994).
Bestimmte Peptide, die sich von dem CCK-B/Gastrin-Rezeptor ableiten, wurden mit Trägerproteinen konjugiert und verwendet, um Antikörper herzustellen. Folglich reagierten die Antisera, die gegen sieben Peptide hergestellt wurden, die den Rezeptoraminosäuren 40–57, 118–217, 153–160, 198–217, 205–217, 288–294 und 356–371 entsprachen, in Immunblots mit dem denaturierten Rezeptorprotein. Einige dieser Antisera wurden in einer immunhistochemischen Färbung verwendet, um die Anwesenheit des Rezeptors in Parietalzellen zu identifizieren (Tarasova et al., 1994).
Die Lokalisierung des CCK-B/Gastrin-Rezeptors in Magenzellen wurde unter Verwendung von aufgereinigtem Antikörper durchgeführt, der gegen die konjugierten Peptide hergestellt wurde, die sich von den Aminosäuren 42–55 und 253–264 ableiten (Helander et al., 1997).
Es wurde ein polyklonaler Antikörper, der gegen ein Epitop des Serums G17 hergestellt wurde, nicht beschrieben, verwendet, um die Serumgastrinlevel im Anschluss an eine partielle Hepatektomie für Lebertumoren im Menschen zu messen (Caplin et al., 1996).
Es wurde ein Antiserum gegen den Aminoterminus des CCK-B/Gastrin-Rezeptors verwendet, um die Rezeptorexpression von gastrointestinalen Zelllinien, von denen bekannt ist, dass sie Progastrin oder glycinverlängertes Gastrin enthalten, mittels Immunblotting von extranukleären Zellmembranen zu messen (Watson et al., 1995). Das Antiserum wurde nicht weiter beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Immunogen bereit, das ein aktives (immunmimikrierendes (Englisch: immunomimic)) Peptid umfasst, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 hat, konjugiert mit einem immunogenen Träger. Die Sequenz ist die der Aminosäuren 5–21 des CCK-B/Gastrin-Rezeptors, das heißt sie ist sehr nahe am N-Terminus. Die Antikörper, die durch dieses Immunogen hergestellt wurden, sind gegen den CCK-B/Gastrin-Rezeptor auf den Tumorzellen spezifisch und blockieren die wachstumsfördernden Wirkungen von Gastrin auf den Rezeptor. Sie halten die G17- und G34-Peptidhormone von der Bindung an die CCK-B/Gastrin-Rezeptoren auf gastrinabhängigen Tumorzellen ab; folglich wird das Tumorwachstum arretiert. Darüber hinaus werden die Antikörper überraschenderweise in Folge einer Bindung an de Rezeptor internalisiert und schnell in das Cytoplasma und den Nukleus der Tumorzellen translokiert. Diese Internalisierung kann bereits 10 Sekunden nach der Exposition der Zellen zu dem Antikörper stattfinden. Diese schnelle Internalisierung des Antikörper/Rezeptorkomplexes verursacht wiederum die betroffen Tumorzellen Apoptose oder Suizid zu durchlaufen.
Die Erfindung stellt ferner ein Immunogen der Erfindung, wie oben beschrieben, zur Verwendung für die Behandlung einer malignen Kondition bereit, verursacht durch gastrinabhängiges malignes Zellwachstum, und besonders für die Behandlung gastrinabhängiger Tumorzellen.
Die Immunogene der Erfindung können auch ein Spacerpeptid umfassen, welches an ein Ende des immunmimikrierenden Peptids gebunden ist. Der immunogene Träger ist vorzugsweise ein Proteinträger wie das Diphtherietoxoid, das Tetanustoxoid oder bovines Serumablbumin. Solche Spacer und Träger sind von den vorliegenden Anmeldern in dem Kontext der Immunogene beschrieben worden, die auf Peptiden mit einer unähnlichen Sequenz basieren, abgeleitet von G17, siehe zum Beispiel WO 90/08774, Seite 16 und WO 95/13297, Seite 2.
Die Antikörper, die durch die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Immunogene hergestellt wurden, binden an die CCK-B/Gastrin-Rezeptoren auf Tumorzellen und verhindern wirksam die Bindung von Peptidhormonen an die Rezeptoren, wodurch sie den autokrinen wachstumsstimulierenden Weg der Tumorzellteilung und letztlich das Tumorwachstum inhibieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt einen Antikörper als ein Immunogen der Erfindung an sich und zur Verwendung für die Behandlung eines gastrinabhängigen Tumors bereit, das heißt für eine passive Immunisierung. Wenn er an einen Patienten in einer ausreichenden Konzentration verabreicht wird, um an die CCK-B/Gastrin-Rezeptoren von Tumorzellen zu binden, blockieren sie die Bindung der Peptidhormone an den Rezeptor. Die Verhinderung der Bindung der Hormone an ihren Rezeptor inhibiert den wachstumsstimulierenden Weg der Tumorzellen, wodurch das Wachstum der hormonabhängigen Tumore inhibiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung können die Antikörper für die humane Therapie chimere, humanisierte oder humane monoklonale Antikörper sein, die mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden können. Zusätzlich können die CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper mit cytotoxischen Molekülen konjugiert sein, wie dem Choleratoxin oder radioaktiven Molekülen, die mit einem Radionuklid wie ¹²⁵I oder ¹³¹I markiert sind, um das Abtöten der Tumorzellen zu verbessern.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Diagnostizierung eines auf Gastrin reagierenden Tumors bereit, umfassend die immunchemische Detektion von gastrinabhängigen (CCK-B/Gastrin-Rezeptor-enthaltenden) Tumoren aus einer Gewebebiopsie, wobei die Antikörper der Erfindung verwendet werden. Die spezifischen anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper der Erfindung können mit einem Detektionssystem markiert werden, wobei solche Verbindungen wie Biotin, die Meerrettichperoxidase und Fluoreszein verwendet werden, um die CCK-B/Gastrin-Rezeptoren im Tumorgewebe zu detekieren, wobei immunchemische Standardverfahren verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch den Antikörper der Erfindung zur Verwendung bei der Diagnostizierung eines gatrinabhängigen kolorektalen Tumors in vivo bereit. Das Verfahren einer solchen Verwendung umfasst die Verabreichung eines radiomarkierten Antikörpers an einen Patienten, zum Beispiel mittels einer intravenösen Injektion und der Bildgebung des Tumors durch szintigraphisches Scanning. Bei diesem Aspekt der Erfindung sollten die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper mit Radionukliden wie ¹¹¹Inidium, ⁹⁰Yttrium oder ¹³¹I markiert sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Zeichnungen beziehen sich auf immunmimikrierende Peptide von dem Immunogen der Erfindung wie GRP-1. Auf ein weiteres Peptid, GRP-4, wird zum Vergleich Bezug genommen. Dieses Peptid entspricht der Aminosäuresequenz 360–374 des CCK-B/Gastrin-Rezeptors und hat die Sequenz SEC ID NO: 2.
1A und 1B illustrieren schematische Ansichten des CCK-B/Gastrin-Rezeptors und seiner 7 Transmembrandomänen, wobei GRP-1 und GRP-4 auf der äußeren Seite der Plasmamembran gezeigt sind.
2 zeigt die Daten aus einem ELISA mit Antikörpern, welche in Kaninchen hergestellt werden, die mit einem Immunogen von dem Peptid 1 (= GRP-1) des CCK-B/Gastrin-Rezeptors immunisiert wurden.
3 zeigt die Daten aus ELISA-Nachweisen mit Antikörpern, welche in Kaninchen hergestellt werden, die mit einem Immunogen von dem Peptid 4 (= GRP-4) des CCK-B/Gastrin-Rezeptors immunisiert wurden.
4 ist ein Graph, der die Daten zeigt, welche aus einem Inhibitions-ELISA erhalten wurden, der verwendet wurde, um die Spezifität der affinitätsaufgereinigten Antikörper, die gegen das GRP-1-DT-Immunogen hergestellt wurden, zu beurteilen.
5 ist ein Balkendiagramm, das die Daten über die Inhibition der Bindung des ¹²⁵I-humanen G17 auf AR42J-Zellen durch Peptidinhibitoren zeigt.
6 ist ein Balkendiagramm der zellulären Verteilung von immunogoldmarkierten AR-4-2J-Zellen.
7 ist eine Fotographie einer Westernblotanalyse von Proteinextrakten aus nukleären Membranen von Adenokarzinomzellen, wobei Antikörper verwendet wurden, die gegen das Peptid 1 (GRP1) hergestellt wurden.
8 ist eine Fotographie einer Westernblotanalyse von Proteinextrakten aus extranukleären und Plasmamembranen von Adenokarzinomzellen, wobei Antikörper verwendet wurden, die gegen das Peptid 1 (GRP1) hergestellt wurden.
9 ist ein Graph, der das C170HM2-Tumorgewicht von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
10 ist ein Graph, der die Querschnittsfläche von C170HM2-Tumoren von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
11 ist ein Balkendiagramm, das die mittleren (mean) C170HM2-Tumorgewichte von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
12 ist ein Balkendiagramm, das die mittlere (mean) Querschnittsfläche von C170HM2-Tumoren von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
13 ist ein Balkendiagramm, das die mittlere (mean) Anzahl an C170HM2-Tumoren von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptorbehandelten Tieren zeigt.
14 ist ein Balkendiagramm, das das mittlere (median) C170HM2-Tumorgewicht von Lebermetastasen von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
15 ist ein Balkendiagramm, das die mittlere (median) Querschnittsfläche von C170HM2-Tumoren von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
16 ist ein Balkendiagramm, das die mittlere (median) Zahl an C170HM2-Tumoren in kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptorbehandelten Tieren zeigt.
17 ist ein Balkendiagramm, das die mittlere (mean) und mittlere (median) Zahl an C170HM2-Lebertumoren in kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
18 ist ein Balkendiagramm, das das mittlere (mean) und mittlere (median) C170HM2-Lebertumorgewicht in kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Tieren zeigt.
19 ist ein Balkendiagramm, das die mittleren (mean) und mittleren (median) Werte für die Querschnittsflächen in C170HM2-Lebertumormetastasen von kontroll- und anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptorbehandelten Tieren zeigt.
20 stellt einen Graph dar, der die Konzentration von radiomarkierten ¹²⁵I-Antikörpern in C170HM2- Lebertumorheterotransplantaten von kontroll-(normales Kaninchenserum) und anti-GRP-1-behandelten nackten Mäusen zeigt.
21 stellt einen Balkendiagramm dar, das die mittlere (mean) Zahl an C170HM2-Lebertumoren pro Leber von Heterotransplantaten von kontroll- und anti-GRP-1-behandelten nackten Mäusen zeigt.
22 stellt einen Balkendiagramm dar, das das mittlere (mean) C170HM2-Lebertumorgewicht von Leberheterotransplantaten von kontroll- und anti-GRP-1-behandelten nackten Mäusen zeigt.
23 stellt Westernblots von C170HM2-Lebertumorheterotransplantatproteinen von kontroll- und anti-GRP-1-behandelten nackten Mäusen dar.
24 ist eine Fotographie von einem histologischen Schnitt, die mit einem Lichtmikroskop aufgenommen wurde und einen Hematoxylin/Eosingefärbten Schnitt von einem C170HM2-Leberheterotransplantat aus einer Kontrollmaus zeigt.
25 ist eine Fotographie von einem histologischen Schnitt, die mit einem Lichtmikroskop aufgenommen wurde und einen Hematoxylin/Eosingefärbten Schnitt von einem C170HM2-Leberheterotransplantat aus einer Maus zeigt, die mit Kaninchen-anti-GRP-1-Antikörpern behandelt wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Immunogene der Erfindung können auch ein Extensions- oder Spacerpeptid umfassen, das geeignet ist das immunmimikrierende Peptid von dem Proteinträger wegzuprojezieren und seine Kapazität an die Lymphocytenrezeptoren zu binden zu steigern. Ein geeignetes Spacerpeptid hat die Aminosäuresequenz SSPPPPC (Serin(Ser)-Spacer, SEO ID NO.: 3 in der Sequenzliste). Andere Spacerpeptide wären jedoch auch geeignet. Die immunmimikrierenden Peptide mit oder ohne Spacer werden dann mit einen Proteinträger wie dem Diphtherietoxoid über einen Cysteinrest an dem carboxyterminalen Ende konjugiert. Die Spacerpeptide sind immunologisch nicht mit den CCK-B/Gastrin-Rezeptor-abgeleiteten Peptiden verwandt und sollten demnach die spezifische Immunogentität der rezeptorabgeleiteten Peptide steigern aber nicht determinieren.
Die Anwesenheit und die Dichte der CCK-B/Gastrin-Rezeptoren auf den Tumorzellen in einem Patienten kann bestimmt werden, indem markierte anti-Rezeptor-Antikörper mit einer Probe, die von einer Tumorbiopsieprobe erhalten wurden, zur Reaktion gebracht werden. Die anti-Rezeptor-Antikörper können entweder mit einem radioaktiven Indikator, einem Farbstoff oder eine Fluoreszenzmarker markiert werden. Zusätzlich kann die Empfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber Gastrin in vitro von einer Tumorbiopsieprobe des Patienten unter Verwendung von Standardtechniken beurteilt werden. Die Patienten, die Tumore haben, bei denen die Biopsieproben für den CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörpernachweis positiv sind, sind typische Kandidaten für die Behandlung mit den Verfahren der Erfindung.
Eine wirksame Dosierung, die von 0,001 bis 2 mg des Immunogens reicht, wird an den Patienten zur Behandlung des gastrointestinalen Kebses verabreicht wird. Die wirksame Dosierung des Immunogens sollte in der Lage sein eine Immunantwort in einem Patienten hervorzurufen und aus wirksamen Leveln von Antikörpertitern gegen den CCK-B/Gastrin-Rezeptor 1–3 Monate nach der Immunisierung bestehen. Im Anschluss an die Immunisierung eines Patienten wird die Wirksamkeit des Immunogens mittels klinischen Standardverfahren wie Ultraschall oder Kernspinntomographie (MRI für Englisch: magentic resonance imaging) überwacht, um die Anwesenheit und die Größe der Tumore zu festzustellen. Die Level der Antikörperfiter gegen den Rezeptor können auch mit einer Blutprobe überwacht werden, die einem Patienten entnommen wurde. Die Boosterimmunisierungen sollten nach Bedarf gegeben werden, um einen wirksamen Antikörpertiter aufrechtzuerhalten. Eine wirksame Behandlung von gastrinabhängigen Krebsen wie von Magen-, Leber-, Pankreas- und kolorektalen Adenokarzinomen gemäß diesem Verfahren sollten zu einer Inhibierung des Tumorwachstums und einer Verminderung in der Tumorgröße führen.
Die Antikörper, die durch die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Immunogene der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können antitrophische Wirkungen gegen gastrinabhängige Tumore mittels drei potentiellen Mechanismen haben: (i) die Inhibierung der Bindung von Gastrin an seinen Rezeptor, (ii) die Degradierung oder Unterbrechung der Signaltransduktionskaskade für die Tumorzellproliferation; und (iii) die Induktion von Apoptose (oder Zellsuizid) in Zellen, in welchen die Rezeptor/Antikörperkomplexe internalisiert sind und zu dem Nukleus migrieren.
Die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper werden an einen Patienten verabreicht, der einen auf den CCK-B/Gastrin-Rezeptor-reagierenden Tumor besitzt. Die Antikörper binden spezifisch an die CCK-B/Gastrin-Rezeptoren auf den Tumorzellen. Die Bindung der Antikörper an die Rezeptoren verhindert die Bindung von Gastrin an seinen Liganden in den Zellmembranen und deshalb wird das Wachstumssignal für die gastrinabhängigen Tumorzellen inhibiert und das Tumorwachstum arretiert. Die Antikörper sind vorzugsweise chimere oder humanisierte Antikörper oder Fragmente davon, die wirksam an den Targetrezeptor binden und die durch Standardtechniken wie jene veröffentlicht in den U.S. Pat. Nrn. 5,023,077, 5,468,494, 5,607,676, 5,609,870, 5,688,506 und 5,662,702 hergestellt werden können. Diese exogen hergestellten Antikörper können auch für das Abtöten von Tumorzellen nützlich sein, die den CCK-B/Gastrin-Rezeptor auf ihren Plasmamembranen tragen, durch die Wirkung ihrer Inhibierung des Tumorzellwachtums oder durch das Überbringen einer toxischen Substanz an die Tumorzellen. Die Inhibition des Tumorwachstums in diesem Immunisierungsverfahren wird auch durch eine Ultraschallbildgebung und eine MRI überwacht und wiederholt.
Die Wirksamkeit der Antikörper bei der Inhibition des Tumorzellwachstums und dem Abtöten von Tumorzellen kann durch die Konjugation von cytotoxischen Molekülen an die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper gesteigert werden. Die cytotoxischen Moleküle können Toxine sein, zum Beispiel das Cholertoxin, Ricin, α-Amanitin oder radioaktive Moleküle, die zum Beispiel mit ¹²⁵I oder ¹³¹I oder chemotherapeutischen Mitteln, zum Beispiel Cytosinarabinosid oder 5-Fluorouridin, markiert sind.
Zusätzlich zu den Antikörpern, die mit ¹²⁵I oder ¹³¹I markiert sind, können die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper auch mit Radionukliden wie ¹¹¹Iridium und ⁹⁰Yttrium. Bei diesem Aspekt der Erfindung sind die Antikörper für die Detektion und Diagnostizierung von CCK-B/Gastrin-Rezeptor-besitzenden Tumoren in vivo nützlich, indem diese Antikörper an den Patienten verabreicht werden und die an die CCK-B/Gastrin-Rezeptor-enthaltenden Tumorzellen gebundenen Antikörper nachgewiesen werden. Nachdem den radiomarkierten anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörpern ermöglicht wurde den Tumor zu erreichen, werden etwa 1–2 Stunden nach der Injektion die radioaktiven "hot spots" abgebildet, wobei szintigraphische Standardverfahren wie früher offenbart verwendet werden (Harrison).
Die Zusammensetzungen, in welchen die Immunogene zur Behandlung von gastrinabhängigen Tumoren in Patienten verabreicht werden, können eine Vielzahl von Formen haben. Diese schließen zum Beispiel feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen wie Pulver, flüssige Lösungen, Suspensionen, Zäpfchen und injezierbare und infusible Lösungen mit ein. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Verabreichungsweise und den therapeutischen Anwendungen ab. Die Zusammensetzungen umfassen die vorliegenden Immunogene und geeignete pharmazeutische Bestandteile und können andere medizinische Mittel, Träger, Adjuvantien, Exzipienten etc. mit einschließen. Geeignete Adjuvantien können Normuramyldipeptid (nor-MDP, Peninsula Labs., CA) und Öle wie Montanide ISA 703 (Seppic, Inc., Paris France) mit einschießen, welche unter Verwendung von Standardverfahren gemischt werden können. Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen in Form von Dosierungseinheiten. Die Menge aktiven Verbindung, die für die Immunisierung oder als ein Medikament auf Einmal oder über eine Zeitspanne verabreicht wird, hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, der Weise und Form der Verabreichung und der Beurteilung des behandelnden Mediziners.
Die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper der Erfindung für die passive Immunisierung werden vorzugsweise an einen Patienten intravenös verabreicht, wobei ein pharmazeutisch akzeptabler Träger wie eine Salzlösung, zum Beispiel eine phosphatgepufferte Saline, verwendet wird.
BEISPIEL 1
Herstellung von GRP1-DT- und GRP4-DT-Konjugaten
Die CCK-B/Gastrin-Rezeptorpeptide wurden mittels Standardfestphasenpeptidsynthese hergestellt. Um die Immunogene zu befähigen spezifische Immunantworten zu induzieren wurden Peptid 1 und Peptid 4 jeweils so synthetisiert, dass sie die Spacersequnenz SSPPPPC (SEQ ID NO.: 3 in der Sequenzliste) an ihrem Carboxyterminus enthielten. Diese Peptide wurden anschließend an Aminogruppen, die in dem Träger, dem Diphtherietoxoid ("DT"), vorhanden sind, über den terminalen Peptidaminosäurecysteinrest des Spacers, wobei ein heterobifunktionales Vernetzungsmittel verwendet wurde, das einen Succinimidylester an dem einen Ende und ein Maleimid an dem anderen Ende des Vernetzungsmittels enthält, durch entweder das Verfahren A oder B wie unten beschrieben konjugiert.
Verfahren A: Wie früher in dem U.S. Patent Nr. 5,023,077 beschrieben wird die Vernetzung von dem Peptide 1 oder 4, oben, und dem Träger wie folgt bewirkt. Das trockene Peptid wurde in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, mit einem dreißigfachen molaren Überschuß an Dithiothreitol ("DTT") gelöst. Die Lösung wurde in einer wassergesättigten Stickstoffgasatmosphäre für vier Stunden gerührt. Das Peptid, welches reduziertes Cystein enthielt, wurde von den anderen Bestandteilen mittels Chromatographie über einer G10 Sephadexsäule getrennt, die mit 0,2 M Essigsäure äquilibriert war. Das Peptid wurde lyophilisiert und bis zu Verwendung unter Vakuum aufbewahrt. Der Träger wurde durch die Behandlung mit dem heterobifunktionalen Vernetzungsmittel, zum Beispiel Epsilon-maleimidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester ("EMCS"), in Verhältnissen aktiviert, die ausreichend sind, eine Aktivierung von etwa 25 freien Aminogruppen pro 10⁵ Trägermolekulargewicht zu erzielen. In einem spezifischen Beispiel für das Diphtherietoxoid machte dies die Zugabe von 6,18 mg EMCS (Reinheit 75%) zu jeweils 20 mg Diphtherietoxoid aus.
Die Aktivierung des Diphtherietoxoids wurde durch das Lösen von jedem 20 mg Aliqout des Diphtherietoxoids in 1 ml 0,2 M Natriumphosphatpufer, pH 6,45, durchgeführt. Die Alipuots von 6,18 mg EMCS wurden in 0,2 ml Dimethylformamid ("DMF") gelöst. Unter verdunkelten Bedingungen wurde das EMCS tropfenweise in 50 Mikroliter ("μl")-mengen zu dem DT unter Rühren zugegeben. Nach 2 Stunden Inkubation in Dunkelheit wurde die Mischung auf einer G50-Sephadexsäule chromatographiert, die mit 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 6,0, äqulibriert war, der 0,1 mM EDTA enthielt.
Die Fraktionen des EMCS-aktivierten Diphtherietoxoids wurden über einer PM 10 Ultrafiltrationsmembran unter dunklen Bedingungen konzentriert. Der Proteingehalt des Konzentrats wurde entweder mittels dem Lowry- oder Bradfordverfahren bestimmt. Der EMCS-Gehalt des Trägers wurde durch die Inkubation des aktivierten Trägers mit Cystein-HCl bestimmt, gefolgt von einer Reaktion mit 10 mM Reagenz nach Ellman 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) 10 mM. Die optische Dichtedifferenz zwischen einem Leertube, das Cystein-HCl enthielt, und dem Probentube, das Cystein-HCl und den Träger enthielt, wurde in den EMCS-Gruppengehalt übersetzt, wobei der molare Extinktionskoeffizient von 13,6 × 10³ für 5-Thio-2-nitrobenzoesäure bei 412 nm verwendet wurde.
Der reduzierte Cysteingehalt (-SH) des Peptids wurde auch unter Verwendung des Reagenzes nach Ellman bestimmt. Es wurde etwa 1 mg des Peptids in 1 ml Stickstoffgas, das mit Wasser gesättigt war, gelöst und 0,1 ml Aliquots dieser Lösung wurden mit dem Reagenz nach Ellman reagiert. Unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten von 5-Thio-2-nitrobenzoesäure (13,6 × 10³) wurde das freie Cystein-SH berechnet. Es wurde eine Peptidmenge, die ausreichend freies -SH enthielt, um mit jeweils 25 EMCS-aktivierten Aminogruppen an dem Träger zu reagieren, in 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 6,0, gelöst, der 0,1 mM EDTA enthielt, und tropfenweise zu dem EMCS-aktivierten Träger unter verdunkelten Bedingungen zugegeben. Nachdem die gesamte Peptidlösung zu dem Träger zugegeben worden war wurde die Mischung über Nacht im Dunkeln in einer wassergesättigten Stickstoffgasatmosphäre inkubiert.
Das Konjugat von dem Peptid, verbunden mit dem Träger via EMCS, wurde von anderen Bestandteilen der Mischung mittels Chromatographie über einer G50-Sephadexsäule getrennt, die mit 0,2 M Ammoniumbicarbonat äquilibriert war. Das Konjugat, das aus dem Hohlraumvolumen der Säule eluiert wurde, wurde lyophilisiert und bei 20°C bis zur Verwendung getrocknet aufbewahrt.
Das resultierende Konjugat kann hinsichtlich des Peptidgehalts durch eine Zahl von Methoden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, charakterisiert werden, einschließlich der Gewichtszunahme, einer Aminosäureanalyse, etc. Für die Konjugate der Peptide 1 und 4 mit Spacer und Diphterietoxoid, die mit diesem Verfahren hergestellt wurden, wurde ein wirksames Peptid/Trägerverhältnis von 5–35 Mol Peptid pro 100 KD MW des Trägers bestimmt und alle wurden als Immunogene zur Immunisierung von Testtieren für geeignet gehalten. Vorzugsweise ergab der Peptidbereich von 10–30 Mol pro 100 KD MW des DT eine wirksame Immunantwort.
Verfahren B: In einem bevorzugten Verfahren wurden die Konjugate, die das GRP1-, gekoppelt an das DT, und das GRP4-Peptid, gekoppelt an das DT, umfassen, bei Raumtemperatur wie folgt hergestellt. Es wurde aufgereinigtes DT (400 mg) in 20 ml 0,5 M Phosphatpuffer, pH = 6,6, gelöst und mit Stickstoffgas gesättigt, um eine DT-Lösung mit 20 mg/ml zu ergeben. Die DT-Lösung wurde in eine 60 ml dunkelbraune Glasflasche gegeben (diese dient als ein Reaktionsgefäß und Fitrationsreservoir). Das EMCS-Vernetzungsreagenz (123,6 mg) wurde in 2,0 ml Dimethylformamid gelöst. Die EMCS-Lösung wurde tropfenweise zu der DT-Lösung über eine 15 Minuten dauernde Zeitspanne unter kontinuierlichem Rühren zugegeben. Die Flasche wurde mit einer Verschlußkappe versehen und die Mischung bei Raumtemperatur für eine weitere 1 Stunde und 45 Minuten gerührt, um aktiviertes DT (M-DT) zu bilden. Das M-DT wurde dann mittels Diafiltration aufgereinigt, wobei ein Amicon Model TFC10 Thin-Channel-Ultrafiltrationssystem durch das Maschinenhandbuch I-113G mit einer XM50 Diaflow-Ultrafiltrationsmembran verwendet wurde. Das M-DT wurde zweimal gegen die Volumina von 420 ml Phosphatpuffer gewaschen, wobei jedes Mal auf 20 ml konzentriert wurde, dann wurde es nochmals mit 420 ml 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH = 6,0, gewaschen, der 0,1 M EDTA enthielt, und die Lösung auf 20 ml aufkonzentriert.
Um das GRP1-Konjugat zu machen, wurden 2,02 ml M-DT-Lösung (die 22,3 mg M-DT enthielt) in eine 10 ml dunkelbraune Glasphiole gegeben, dann wurden 13 mg des GRP-1-Peptids in dem Citratpuffer gelöst, um 40 mg/ml Peptid zu ergeben, und tropfenweise zu der M-DT-Lösung unter Rühren zugegeben. Um das GRP4-Konjugat zu machen, wurden 2,21 ml M-DT-Lösung (die 24,4 mg M-DT enthielt) in eine 10 ml dunkelbraune Glasphiole gegeben, dann wurden 13 mg des GRP4-Peptids in dem Citratpuffer gelöst, um 40 mg/ml Peptid zu ergeben, und tropfenweise zu der M-DT-Lösung unter Rühren zugegeben.
Den Reaktionen wurde erlaubt über Nacht abzulaufen. Es wurde jedes Konjugat aus dem Reaktionsgefäß entfernt und separat in 12000–14000 MW Abschneidedialyseschläuchen (Englisch: cutoff dialysis tubing) gegen 5 Wechsel von 500 ml 0,1 M Ammoniumbicarbonatlösung dialysiert. Es wurde jedes Konjugat lyophilisiert. Die Konjugate wurden dann mittels Aminosäureanalyse analysiert und ihre Peptide zu den DT-Substitutionsverhältnissen mit 21,8 Peptiden pro 10⁵ MW des DT für GRP1-DT und 21,1 Peptiden pro 10⁵ MW des DT für GRP4-DT bestimmt.
Die Konjugate der Peptide 1 und 4 mit Spacer und DT, die mit diesem Verfahren hergestellt wurden, haben ein wirksames Peptid/Trägerverhältnis von 5–35 Mol Peptid pro 100 KD MW des Trägers und alle wurden für geeignete Immunogene gehalten. Ein bevorzugter Verhältnisbereich, um eine wirksame Immunantwort zu bewirken, ist von 10–25 Mol Peptid pro 100 KD MW des DT's.
Herstellung des Immunogens
Die Immunogene, die entweder das Peptid 1 oder das Peptid 2 enthalten und einen Spacer haben, der mit dem DT wie oben beschrieben konjugiert ist, wurden verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Die Immunogene wurden wie folgt hergestellt: Das Konjugat wurde in 0,15 M natriumphosphatgepufferter Saline, pH 7,3, mit einer Konzentration von 3,79 mg/ml gelöst. Die Konjugatlösung wurde zu Montanide ISA(703)-Adjuvant (Seppic Inc.) in einem 30 : 70 (Gew : Gew)-Verhältnis von Konjugatlösung zu Montanide ISA 703 zugegeben und die Mischung wurde dann homogenisiert, wobei ein Silverson Homogenisierer für 3 Minuten bei 8000 rpm verwendet wurde, um eine Emulsion zu bilden, die 1 mg/ml Konjugat enthielt.
Immunisierung und Probenentnahme
Es wurde Kaninchen intramuskulär 0,1 ml Immunogen injeziert, das aus entweder 0,1 mg GRP1-DT- oder GRP4-DT-Konjugat bestand. Jedem Kaninchen wurden Injektionen des Immunogens nach 0 und 4 Wochen gegeben. Es wurde jedem Kaninchen nach 6 und 8 Wochen des Experiments Blut entnommen. Das Serum wurde von jeder Blutprobe hergestellt und bei –20°C bis zur Verwendung in den Nachweisen aufbewahrt, um die Anwesenheit von anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörpern zu untersuchen.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Es wurde ein Festphasen-ELISA verwendet, um auf eine Reaktion oder Kreuzreaktion der Antisera zu sceenen, die gegen das Peptid 1 und das Peptid 4 von jedem immunisierten Kaninchen hergestellt wurden. Der ELISA wurde durchgeführt, indem Polystyrol-96-Lochplatten (IMMULON II, Dynatech) mit 25 μl/Loch von 10 μg/ml Peptid 1, verbunden mit bovinem Serumalbumin (BSA) („GRP1-BSA"), oder Peptid 4, verbunden mit BSA („GRP4-BSA)-Antigen, in 0,1 M Glycin-HCL-Puffer, pH 9,5, beschichtet wurden. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend in Puffer gewaschen.
Die Antisera, die von den immunsierten Kaninchen erhalten wurden, wurden seriell auf einen Bereich von 10^–1 bis 10^–8 in 1% BSA-FTA-hämagglutinationspuffer, pH 7,2, verdünnt. Es wurden 25 μl der Testantiserums pro Loch mit jedem Testpeptid für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten gründlich mit Puffer gewaschen, um allen ungebundenen Antikörper zu entfernen. Jedes Loch wurde mit 25 μl biotyniliertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (H + L), verdünnt 1 : 1000 in 1% BSA-FTA Verdünnungspuffer, für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Nach dem Waschen der Platten, um ungebundenes anti-Kaninchenreagenz zu entfernen, wurde jedes Loch für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 25 μl Avidin-alkalische Phosphatase-Konjugat, verdünnt 1 : 1000 in 1% BSA-FTA-Buffer, inkubiert. Die Platten wurden gründlich gewaschen, um ungebundenes Avidin-alkalische Phosphatase-Reagenz zu entfernen, und mit 25 μl 1 mg/ml p- Nitrophenylphosphat („PNPP") in 10% Diethanolaminpuffer inkubiert, der 0,01% MgCl₂·6H₂O, pH 9,8, enthielt. Die Platten wurden entwickelt bis die Absorption der Reaktion bei 490 nm Wellenlänge eine optische Dichte von 0,8 bis 1,5 erreichte. Um die Spezifität der von den Kaninchen hergestellten Antisera zu testen, wurden die Kaninchen auch mit DT immunisiert und für die ELISA-Untersuchung wurden die Platten mit dem DT als Antigen beschichtet, um die Reaktivität der Antisera, die gegen den Träger hergestellt wurden, zu bestimmen.
2 zeigt die ELISA-Ergebnisse, wobei das Peptid1/GRP1 verwendet wurde, und 3 zeigt die ELISA-Ergebnisse, wobei das Peptid4/GRP4 als das Antigen verwendet wurde. Wie aus 2 ersichtlich zeigen die ELISA-Ergebnisse, dass die Kaninchen, die mit dem Peptid 1-Spacer-DT-Konjugat immunisiert wurden, höhere Antikörpertiter produzierten, die spezifisch an das Peptid 1 binden, wie durch den Antikörper angezeigt, der das Peptid 1 sogar bei hohen (1 : 100000) Verdünnungen des Antiserums bindet. Ähnlich zeigt 3, dass Kaninchen, die mit dem Peptid 4-Spacer-DT-Konjugat immunisiert wurden, hohe Titer der anti-Peptid 4-Antikörper produzierten. Wie aus den 2 und 3 ersichtlich ist, produzierten die Kaninchen, die gegen das jeweilige Peptid immunisiert wurden, Antikörper, die spezifisch das jeweilige Peptid bei geringen Antiserakonzentrationen banden. Die Daten zeigen an, dass die anti-Peptid 1- und die anti-Peptid 2-Antikörper eine große Kapazität haben, um die Peptide 1 und 4 des CCK-B/Gastrin-Rezeptors zu binden. Die Daten zeigen auch, dass die Immunisierung der Kaninchen mit den Konjugaten starke Immunantworten gegen das Peptid 1 beziehungsweise das Peptid 4 auslöst. Außerdem schienen und verhielten sich die Kaninchen normal, die entweder mit dem Peptid 1- oder dem Peptid 4-Konjugat immunisiert wurden, und sie wiesen keine Symptome von Erkrankungen oder Pathologien während den Experimenten auf.
BEISPIEL 2
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Spezifität der Antikörper zu festzustellen, die in den Kaninchen gegen das GRP1-DT-Peptid hergestellt wurden, das einen Ser-Spacer, beschrieben in Beispiel 1, enthielt, wobei das Verfahren B verwendet wurde. Es wurde eine Serie von Test durchgeführt, um die Spezifität der Kaninchenantikörper zu beurteilen, die durch die Immunisierung mit dem GRP1-DT induziert wurden und mittels Immunadsorption über einer GRP1-Ser-Sepharosesäule affinitätsaufgereinigt wurden.
Es wurde ein Inhibitions-ELISA verwendet, um die Spezifität der affinitätsaufgereinigten Antikörper für das GRP1-Ser-Peptid zu bewerten. Die Nachweise sind wie folgt verlaufen: Es wurden 96-Lochplatten (Immulon U bottom) mittels einer Inkubation über Nacht von 50 μl einer 2 μg/ml-Lösung des Konjugats in Glycinpuffer (0,1 M, pH = 9,5) bei 4°C mit dem GRP1-Ser-BSA-Konjugat beschichtet. Der affinitätsaufgereinigte anti-GRP1-Antikörper (mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml) wurde mit verschiedenen Inhibitoren (in 1 : 10 Verdünnungsreihen) kombiniert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inhibitoren umfassten GRP1-Ser, GRP1 EPT, Ser, humanes Gastrin 17(1–9)-Ser-Spacer (hG17(9)-Ser), GRP1 EPT + Ser und Puffer (kein Inhibitor). Der Inkubationspuffer bestand aus PBS + 0,5% BSA + 0,05% Tween 20 + 0,02% NaN₃. Die anschließenden Schritte verwendeten denselben Puffer ohne BSA. Die 96-Lochplatten wurden von nichtgebundenem GRP1-Ser-BSA freigewaschen und der Antikörper + Inhibitormischungen wurden zugegeben (50 μg/Loch). Nach 1 Stunde wurden die Platten gewaschen und ein Ziegen-anti-Kaninchen-Ig(H + L)-alkalische Phosphatase-Konjugat (Zymed) zugegeben (1 : 2000 Verdünnung). Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen, um nichtgebundenes Reagenz zu entfernen und es wurden 50 μl/Loch von der pNPP-Substrat(Sigma)-Lösung (1 mg/ml) in Substratpuffer (PBS + 0,1 mg/ml MgM₂ + 10% Diethanolamin + 0,02% NaN₃) zugegeben. Im Anschluss an 60 Minuten Inkubation wurde die Absorbance auf einem MRX-Reader (Dynatech Laboratories) gemessen. Die Proben wurden als Duplikate gelaufen und die Mittelwerte (means) wurden für jede Konzentration berechnet. Die Hintergrundsbindung (festgestellt mit affinitätsaufgereinigtem Kaninchen-anti-GnRH-Antikörpern) wurde von allen Werten abgezogen und die % Inhibition relativ zu keinem zugegebenen Inhibitor (anti-GRP1-Antikörper + Puffer) für jeden getesteten Inhibitor berechnet: % Inhibition = (100)(1 – ((Anichtinhibiert – Ainhibiert)/Anichtinhibiert),wobei A = Absorption ist. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
4 zeigt die Prozent der Inhibition der Antikörperbindung als eine Funktion der Inhibitorkonzentration. Wie aus der Figur erkannt werden kann inhibiert das GRP1-Ser-Peptid die Antikörperbindung an GRP1-Ser-BSA vollständig. Es wurden etwa 60% Inhibition mit dem GRP1 EPT-Peptid erzielt, welches nicht die Ser-Spacer-Sequenz enthält, und durch eine äqimolare Mischung aus GRP1 EPT plus Ser-Spacer. Das Versagen dieser Peptide eine volle Inhibierung zu produzieren legt nahe, dass ein Teil der Antikörper für ein Eptiop(e) spezifisch ist, die Elemente von sowohl den GRP1- als auch den Ser-Spacer-Sequenzen umfassen. Es wurde weder durch die Ser-Spacer-Sequenz selbst noch durch ein unverwandtes Peptid, welches den Ser-Spacher trug („hG17(9)-Ser", bestehend aus den aminoterminalen neun Resten von hG17, gefolgt von dem Spacer), eine Inhibierung erreicht. Diese ELISA-Ergebnisse zeigen, dass die affinitätsaufgereinigte Antikörperherstellung für das GRP1-Ser-Peptid spezifisch war und dass 60% der Bindungsaktivität gegen den Gastrin-Rezeptorepitopbestandteil des Peptids gerichtet war.
BEISPIEL 3
AR42J-Tumorzellen (European Collection of Animal Cell cultures, Porton Down, UK) sind von einem pankreatischen Adenokarzinom in Ratten abgeleitet und bekannt dafür gut charakterisierte CCK-B/Gastrin-Rezeptoren zu haben. Folglich wurden die AR42J getestet, um die Expression des CCK-B/Gastrin-Rezeptors und die Spezifität des Rezeptors für hG17 mittels Radioligandinhibition zu bestätigen. Es wurden AR42J-Zellen bei 37°C mit 7% CO₂ in komplettem RPMI 1640 (Sigma) kultiviert, welches mit 10% FCS (Gemini Bioproducts), 2 mM Glutamin (JRH Biosciences), 1 mM Natriumpyruvat (JRH B.) und 50 μg/ml Gentamicin (Gemini Products) versetzt wurde. Die Zellen wurden aus 175 cm² T-Flaschen (Falcon Plastic) mit PBS, das 0,25% EDTA enthielt, geerntet und dann zweimal mit PBS (ohne EDTA) mittels Zentrifugation (400 × g für 10 min) gewaschen. Die Zellen wurden für alle Manipulation auf 0–4°C gehalten. Es wurde eine Einzelzellsuspension in Puffer hergestellt und die Zellkonzentration auf 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Es wurden 1 ml Aliquots der Zellsuspension zu 12 × 75 mm Kulturtubes zugegeben, dann wurden die Zellen zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden in PBS (0,1 ml/Tube), das humanes G17 (hG17), Gonadotropin freisetzenden Hormon (GnRH) oder kein Peptid enthielt, resuspendiert. Die Peptidkonzentrationen waren 1,0 ng/ml, 100 ng/ml und 10 μg/ml. Es wurde ein Aliquot von 0,1 ml ¹²⁵I-hG17 (NEN), das etwa 26300 CPM (spezifische Aktivität, 2200 Ci/mmol) enthielt, zu jedem Tube zugegeben. Die Tubes wurden gevortext und dann für 15 Minuten inkubiert. Die Zellen wurde zweimal mit PBS gewaschen und dann in einem γ-Zähler (Wallace) gezählt. Die Proben wurden als Duplikate ausgeführt. Die Hintergrundszähler wurden subtrahiert und dann wurden die % Inhibition der ¹²⁵I-hG17-Bindung durch jeden Inhibitor berechnet, wobei die Gleichung verwendet wurde: % Inhibition = (100)(1 – ((CPMnichtinhibiert – CPMinhibiert)/CPMnichtinhibiert).
Die Ergebnisse der Radioligandinhibitionstests sind in 5 gezeigt, welche die Mittelwerte (means) (±SE) der individuellen Werte zeigt. Es kann in der Figur erkannt werden, dass die Bindung von ¹²⁵I-hG17 an die AR42J-Zellen durch hG17 inhibiert wurde. Der Inhibitionsgrad wurde mit der Qunatität des zugegebenen Inhibitors auf 32% Inhibition bei 1 μg hG17 pro Tube erhöht, der höchsten Konzentration des getesteten Peptids. Umgekehrt produzierte GnRH bei den beiden höchsten getesteten Konzentrationen (die 6% Inhibition, die mit 100 pg GnRH erhalten wurden, wurden für unspezifisch gehalten) keine Inhibition, was anzeigt, dass die Inhibition durch hG17 spezifisch für Gastrin war. Diese Ergebnisse bestätigten die Zelloberflächenexpression des Gastrin-Rezeptors durch die AR42J-Tumorzellen.
BEISPIEL 4
Die Bindung der GRP1-Ser-spezifischen Antikörper an die AR42J-Zellen wurde mittels Immunfluoreszenz bewertet. Es wurden AR42J-Zellen wie in den vorhergegangenen Beispielen wachsen gelassen und mit Zellschabern aus 175 cm² T-Flaschen geerntet und zweimal mit Puffer (PBS mit 0,02% NaN₃) mittels Zentrifugation (400 × g für 7 min) gewaschen. Die Zellen wurden für alle Manipulationen auf 0–4°C gehalten. Es wurde eine Einzelzellsuspension in Puffer hergestellt und die Zellkonzentration auf 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde in 1,5 ml Microfugetubes (1 ml/Tube) gegeben. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation pelletiert und die Überstände aspiriert. Die Zellen wurden in Puffer (0,1 ml/Tube) resuspendiert, der Peptidinhibitoren enthielt (1,0 mg/ml). Die Inhibitoren schlossen GRP1-Ser, GnRH, hG17(9)-Ser und Puffer (ohne Inhibitor) ein. Die Antikörper, einschließlich von dem Kaninchen-anti-GRP1-Ser (100 μg/ml), dem affinitätsaufgereinigtem Kaninchen-anti-DT (Negativkontrolle, 100 μg/ml), dem Mäuse-anti-AR42J-Antiserum (Positivkontrolle, 1 : 100-Verdünnung, hitzeinaktiviert) und normales Mausantiserum, wurden zu den passendem Tubes zugegeben und die Inhalte gemischt. Die Zellen wurden für 1 Stunde unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Die Zellen wurden den dreimal mit Puffer gewaschen und 0,1 ml Fluoreszein-markierter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Antibodies Incorporated) (verdünnt 1 : 50) pro Tube zugegeben. Die Zellen, die mit den Mausseren behandelt wurden, wurden mit Fluoreszein-anti-Maus-IgG-Reagenz (Zymed) entwickelt. Die Zellen wurden mittels Vortexen resuspendiert und dann für 1 Stunde inkubiert. Die Zellen wurden wieder dreimal gewaschen und in Glycerol : PBS (1 : 1, v : v), 50 μl/Tube, resuspendiert. Es wurden mit den Inhalten von jedem Tube Nassmengen (Englisch: wet amounts) hergestellt und die Zellen unter Verwendung eines Laborlux 12 Fluoreszenzmikroskops (Leitz) untersucht. Die Fluoreszenz wurde auf einer Scala von 0 bis 4 notiert, wobei 0 die Hintergrundfluoreszenz (erhalten mit dem normalem Mausserum) und 4 die maximale Fluoreszenz repräsentierte (erhalten mit dem Maus-anti-AR42J-Positivkontrollantiserum).
Die Ergebnisse der Immunfluoreszenztests sind in Tabelle 1 gezeigt. Es kann von der Tabelle erkannt werden, dass die AR42J-Zellen, die mit den anti-GRP1-Ser-Antikörpern in Abwesenheit von Peptidinhibitoren behandelt wurden, stark fluoreszierten, was anzeigt, dass die Antikörper an die Zellen gebunden haben. Die Kaninchen-anti-DT-Antikörper produzierten keine Fluoreszenzfärbung, was zeigt, dass die Färbung, die mit den anti-GRP1-Ser-Antikörpern beobachtet wurde nicht die Folge einer unspezifischen Oberflächenbindung des Kaninchenimmunglobulins ist. Außerdem wurde gezeigt, dass die Bindung spezifisch für das GRP1-Ser-Peptid ist. Die Zugabe von GRP1-Ser inhibierte die Bindung vollständig, während unverwandte Peptide, einschließlich hG17(9)-Ser und GnRH, versagten zu inhibieren. Da das GRP1-Epitop die Reste 5–21 des Gastrin-Rezeptors umfasst, wurde gefolgert, dass die anti-GRP1-Ser-Antikörper für den Gastrin-Rezeptor, der von den AR42J-Zellen exprimiert wird, spezifisch sind.
Tabelle 1
BEISPIEL 5
Es wurden AR42J-Zellen, Passagierungsnummern 16–18 (Englisch: passage nos.), in RPMI-1640-Medium kultiviert, das 10% FCS und 2 mM Glutamin enthielt. Es wurden alle Zellen bei 37°C mit 5% CO₂ in der Luft bei 100% Humidität gehalten, bis zu 80% Konfluenz in T75-Flaschen (Falcon, London, UK) wachsen gelassen und im Anschluß an eine Behandlung mit 0,02% EDTA, um adherente Zellen in Suspension zu bringen, passagiert. Die Zellen wurden für 10 Sekunden, 30 Sekunden, 30 Minuten und 1 Stunde mit anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper (aGR) inkubiert, der in Kaninchen mit einem CCK-B/Gastrin-Peptid 1-Rezeptor-Immunogen der Erfindung wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde und welcher mittels Affinitätschromatographie auf einer Säule, die mit den Peptid 1 hergestellt wurde, aufgereinigt wurde.
Die Zellen wurden in 1% Glutaraldehyd für eine Stunde fixiert und für die Immunelektronenmikroskopie(ImmunoEM)-Untersuchungen unter Verwendung von Standardtechniken vorbereitet. Die Zellsuspensionen wurden zweimal bei 2000 rpm für 2 Minuten zentrifugiert und das Zellpellet dann in phosphatgepufferter Saline (PBS) resuspendiert. Das Zellpellet wurde mit LRwhite Kunststoffharz (Englisch: LRwhite plastic resin) infiltriert. Es wurden ultradünne Schnitte von 70–90 nm Dicke geschnitten und auf Pioloform-beschichtete Nickelgitter plaziert. Die Gitter wurden in normales Ziegenserum (Dako, High Wycombe, UK) in 0,1% bovinem Serumalbumin (BSA) (Sigma, Poole, Dorset) gegeben und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Gitter wurden in PBS gespühlt und dann mit einem sekundären Antikörper, einem biotinkonjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (goldmarkiert), verdünnt 1 : 50 in 1% BSA, für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kontrollexperimente wurden ohne sekundären Antikörper durchgeführt. Nach dem letzten Waschen mit PBS wurden die Gitter in gesättigtem wässerigem Uranylacetat für 3 Minuten und Bleicitrat nach Reynold für 3 Minuten gegengefärbt. Die Goldpartikel auf der Zellmembran, in dem Cytoplasma und der nukleären Membran und innerhalb den Nukleus wurden gezählt. Es wurden 25 Zellen/Gitter durch einen unabhängigen Beobachter gezählt. Für die Kontrollen wurden AR42J-Zellen zu Antikörpern für weniger als 1 Sekunde exponiert und es wurden Leberzellen, welche keinen CCK-B/Gastrin-Rezeptor haben, verwendet. Die AR42J-Zellen wurden zu normalem IgG exponiert und auch als Kontrollen zur Bestimmung einer unspezifischen Bindung der anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper verwendet. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 2 und 6 gezeigt. Tabelle 2 Verteilung der CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Immunogoldpartikel innerhalb der AR42J-Zellen
(Mittelwert (mean) ± SEM für 25 Zellen, wiederholt n = 5)
Wie in Tabelle 2 und 6 gezeigt, wurden die Immunogold-Antikörperpartikel, die an den CCK-B/Gastrin-Rezeptor gebunden waren, auf der Cytoplasmamembran, im Cytoplasma, auf der nukleären Membran und in der nukleären Matrix der Adenokarzinomzellen lokalisiert, was ferner zeigt, dass der Antikörper/Rezeptorkomplex von den Zellen internalisiert wird.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich zeigen die ImmunoEM-Untersuchungen unter Verwendung eines Antiserums, das gegen das aminoterminale Ende des CCK-B/Gastrin-Rezeptors gerichtet ist, dass nach einer Stunde Inkubation die Verteilung der Immunogold-markierten CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper schnell internalisiert wird, da 12% des Antikörper-Rezeptorkomplexes mit der Zellmembran assoziiert sind, 36,6% innerhalb des Cytoplasmas sind, 7,9% in der nukleären Membran und recht überraschend 43,5% innerhalb des Zellnukleus. Bereiche mit einer intensiven CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Immunreaktivität innerhalb des Nukleus werden am Chromatin gefunden, was spezifische Bindungsstellen für die DNA-Regulation nahelegt.
Diese elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit anti-Immunglobulin-konjugierten Goldkügelchen (Immunogold) deckten auf, dass ein extrem schneller Umsatz des anti-Rezeptor/Rezeptorkomplexes in den Tumorzellen stattfindet; bereits 10 Sekunden nach der Exposition zu den Antikörpern sind Komplexe im Zellnukleus wie aus 6 ersichtlich detektierbar.
BEISPIEL 6
Es wurden Adenokarzinomzelllinien, nämlich AR42J, HCT116, C170HM2, LoVo, ST16 und MGLVA1, in vitro wachsen gelassen und wie in Beispiel 3 beschrieben geerntet. Die Zellen von 30 × T-75-Flaschen wurden in 5 ml Homogenisierungspuffer (1 mM Natriumhydrogencarbonat, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 nM Phenylmethylsulphonylfluorid, 40 mM Natriumchlorid, 10 μl Leupeptin, 1 μM Pepstatin, 5 nM EDTA [Sigma]) suspendiert. Die Homogenisierung wurde mittels 5 Brüchen mit 5 Sekunden dauer in einem Homogenisierer durchgeführt. Für die extranukleären Membranen wurde die Gewebedebris mittels Zentrifugation bei 500 g, 7 Minuten und 4°C pelletiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand bei 500 g und 4°C zentrifugiert, um weitere Debris zu entfernen. Der Überstand wurde bei 48000 g für 1 Stunde bei 4°C rezentrifugiert. Das Pellet, das die Präparation der extranukleären Membran enthielt, wurde in Tris/NP- 40-Lösung (0,1 M TRIZMA, 0,5% NONIDET P40 [Sigma Chemical]) suspendiert.
Für nukleäre Membranpräparationen wurde im Anschluß an eine Homogenisierung in einem zweiten Homogenisierungspuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% TRITON 100, 0,32 M Saccharose, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 0,1 mM Sperimidintetrahydrochlorid, 2 mM PMSF, 10 mM Bezomidinhydrochlorid, 3 mM EGTA-Aminoactonitrilhydrochlorid [Sigma]) die Gewebedebris mittels Zentrifugation bei 400 g für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Das Pellet wurde in 55% (0,2 M) Saccharose in HPLC-Wasser resuspendiert. Diese Mischung wurde bei 60000 g für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 0,4% NONIDET P40 in Homogenisierungspuffer ohne TRITON 100 gewaschen. Das Pellet wurde bei 700 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und in Homogenisierungspuffer ohne TRITON 100 resuspendiert.
Der Proteingehalt wird mittels dem Lowry-Verfahren bestimmt (unter Verwendung eines Kits von Pierce). Es wurden Proben, die 10–15 μg Protein enthielten, auf ein Gel 8–16% Tris/Glycingradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese-PAGE (Novex R and D Systems) in Tris/Glycinpuffer aufgetragen und für 90 Minuten bei 125 konstanten Volt und 36 mA laufen gelassen. Das Gel wurde in 10% Eisessigsäure für 1 Stunde fixiert und die Proben auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Die Membranen wurden in 1% BSA für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde mit GRP1-Antiserum (mit und ohne Präabsorption). Die Antikörperbindung wurde durch das Avidin : Biotin-Peroxidasekomplex-Verfahren nachgewiesen, wobei Diaminobeziden als das Substrat verwendet wurde. Die Ergebisse der Westernblotanalyse, wobei das Kaninchen-Antiserum verwendet wurde, das gegen das Peptid 1 (Kaninchen anti-GRP1-Antiserum) hergestellt wurde, sind in 7 und 8 gezeigt.
Wie in 7 gezeigt reichen die Proteinmolekulargewichtsmarker von 116, 66, 45 bis 29 kDa. Der Blot zeigt eine hervorstechende anti-Peptid 1-immunreaktive Bande, die bei etwa 43 kDa in allen untersuchten Andenokarzinomzelllinien lokalisiert ist, das heißt in HCT116, C170HM2, LoVo, ST16 und MGLVA1, ausgenommen einer (AP5LV). Dieses Protein entspricht einer verstümmelten Form des CCK-B/Gastrin-Rezeptors. Einige Zelllinien (HCT116 und C170HM2) zeigen wenigsten 3 andere Banden, die im Molekulargewicht zwischen 60 und 100 kDa rangieren. Die Daten zeigen an, dass die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper verschiedene Isoformen des CCK-B/Gastrin-Rezeptors in Tumorzellen erkennen und an sie binden können.
8 zeigt einen Westernblot der extranukleären (ENM) und der Plasmamembran von C170HM2- und HCT116-Adenokarzinomzellen. Wie in 8 gezeigt, weisen die Adenokarzinomzelllinien, die auf ENM-CCK-B/Gastrin-Rezeptoren getestet wurden, die Existenz von zwei stark gefärbten Banden auf eine bei etwa 43 kDa und die andere bei etwa 66 kDa. Wenn nur die Plasmamembranfraktion gefärbt wurde, war eine einzelne Bande bei etwa 66 kDa vorhanden. Folglich bestätigen die Westernblotuntersuchungen die ImmunoEM-Ergebnisse, dass der CCK-B/Gastrin-Rezeptor in Adenokarzinomtumorzellen vorhanden ist, obwohl die ImmunoEM-Untersuchungen nicht zwischen den Isoformen des CCK-B/Gastrin-Rezeptors unterscheiden. Die Daten zeigen an, dass die vorliegenden Immunogene anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper hervorrufen, welche verschiedene Isoformen des Rezeptors erkennen und binden können, was für die Behandlung dieser Tumoren von Vorteil wäre.
BEISPIEL 7
Es wurden C170HM7-Adenokarzinomzellen intraperitoneal in nackte Mäuse injeziert und den Tumoren wurde erlaubt in der Leber zu wachsen. Die Kontrollmäuse erhielten einer Infusion von phosphatgepufferter Saline (PBS) und die experimentellen Mäuse eine Infusion von einem der anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper. In Gruppe 1 wurde jede Maus täglich mit 0,5 mg Kaninchen-anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörpern infusioniert, die gegen das Peptid 1 hergestellt wurden (Kaninchen-anti-Peptid 1, Rbt@GRP1). In Gruppe 2 erhielt jede Maus täglich 0,5 mg Kaninchen-anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper, die gegen das Peptid 4 hergestellt wurden (Kaninchen-anti-Peptid 4, Rbt@GRP4). Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 40 Tagen nach der Antikörperinfusion untersucht, getötet und die Tumore für die Untersuchung entfernt. Das Gewicht, die Größe und die Querschnittsfläche der Tumore wurden mittels Standardtechniken beurteilt. Die Ergebnisse sind in den 9 und 10 gezeigt.
Wie aus den 9 und 10 ersichtlich ist, führt die Implantation der koloraktalen Adenokarzinom-Krebszellinie C170HM2 in Mäusen ohne Behandlung zu einem schnellen Wachstum und großen Tumormassen, wie es durch das Tumorgewicht oder die Tumorgröße und die Tumorquerschnittsfläche der Tumore bestimmt wurde. Die Infusion der Tiere mit Kaninchen-anti-Peptid 1- oder Kaninchen-anti-Peptid 4-Antikörpern führte zu einer bezeichnenden Abnahme in der Anzahl an Tieren, die irgendwelche nachweisbaren Tumore haben, sowie einer Abnahme im Gewicht und der Größe der Tumore in Tieren, die welche haben, wenn sie mit den Kontrollen verglichen wurden. Derselbe Effekt kann für die anti-Peptid 1-Antikörper beobachtet werden, wenn das mittlere (mean) Tumorgewicht, die mittlere (mean) Tumorgröße oder die mittlere (mean) Tumorzahl berechnet wird. Diese Daten sind in den 11, 12 und 13 gezeigt.
Es werden weitere Einblicke in die Verteilung innerhalb der Population gewonnen, indem die Mittelwerte (medians) der Tumorzahl, des Tumorgewichts oder der Tumorgröße berechnet werden. Die Ergebsnisse sind in den 14, 15 und 16 gezeigt. Wie aus diesen Figuren ersichtlicht ist, war das Kaninchen-anti-Peptid 1-Immunogen durchwegs wirksamer bei der Inhibierung des Tumorwachstums als das Kaninchen-anti-Peptid 4.
BEISPIEL 8
Es wurde in nackten Mäusen eine größere Tumorlast durch ein Verfahren wie in Beispiel 7 beschrieben erzeugt, wobei die Kolonkrebszelllinie C170HM2 verwendet wurde, allerdings mit einem höheren anfänglichen Inoculum. Die C170HM2 sind ein leberinvasives Heterotransplantatmodel. Die Kontroll- und experimentellen Mäuse wurden auch wie in Beispiel 7 beschrieben behandelt.
Die Mäuse wurden 40 Tage nach der Antikörperinfusion getötet und die Lebertumore entfernt und untersucht. Die 17, 18 und 19 zeigen die Ergebnisse dieser Experimente. Die 17 zeigt die mittlere (mean) und mittlere (median) Lebertumoranzahl der kontroll- und der anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper-behandelten Tiere. Die Daten zeigen, dass die Kaninchen-anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper („Kaninchen@GRP") wirksam sind das Wachstum der metastatischen Tumore in der Leber zu inhibieren. Es gibt eine statistisch signifikate Abnahme in der mittleren (mean) Lebertumorzahl in Mäuselebern unter der Verwendung von Kaninchen-anti-Peptid 1 (Student's Test), p = 0,0084, und in der mittleren (median) Tumorzahl, p = 0,0016 (Mann Whitney), verglichen mit den Kontrollen. Die Mäuse, die mit den Anti-Peptid 4-Antikörpern behandelt wurden, zeigen auch eine Abnahme in der mittleren (mean) Lebertumorzahl, jedoch gab es keinen Unterschied in der mittleren (mean) Lebertumorzahl in diesen letzteren Tieren verglichen mit den Kontrollen.
Die 18 zeigt, dass die anti-Peptid 1- und anti-Peptid 4-Antikörper auch in der Lage waren die mittleren (mean) und mittleren (median) Tumorgewichte der Lebermetastasen verglichen mit den Kontrolltieren zu reduzieren. Die Daten in 19 zeigen, dass die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-behandelten Mäuse auch eine signifikante Abnahme in den mittleren (mean) und mittleren (median) Querschnittssflächen der Lebertumore, verglichen mit den Kontrollen, hatten.
Die Daten für den anti-Peptid 1 zeigen an, dass die anti-CCK-B/Gastrin-Rezeptor-Antikörper der Erfindung wirksam sind die Ausbreitung und das Wachstum eines gastrinabhängigen Kolonkrebes in der Leber zu kontrollieren, was den Hauptort für die metastatische Ausbreitung dieses Krebses darstellt.
BEISPIEL 9
Diese Untersuchungen wurden ausgeführt, um die GRP1-Immunreaktivität auf C170HM2-Zellen zu bestätigen. Das Ziel dieser Untersuchung war es die Tumorlokalisiation von Antiserum zu beurteilen, das gegen GRP1 hergestellt wurde, und den therapeutischen Effekt auf das Wachstum der C170HM2-Zellen innerhalb der Leber von nackten Mäusen zu bestimmen. Es wurden C170HM2-Zellen intraperitoneal in nackte Mäuse wie in Beispiel 7, oben, beschrieben injeziert. Das GRP1-Anitserum wurde in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum wurde mit ¹²⁵I radiomarkiert und an die nackten Mäuse mit etablierten C170HM2-Heterotransplantaten mittels einer Schwanzveneninjektion verabreicht. Die Kontrollmäuse erhielten ein ¹²⁵I- radiomarkiertes normales Kaninchenantiserum. Die Mäuse wurden zu zunehmenden Zeitpunkten im Anschluss an die Injektion einer Einzeldosis von ¹²⁵I-Antikörpern getötet. Die Radioaktivität wurde als Zähler pro Minute pro Gramm (CPM/g) Gewebe gemessen und das Leber/Leberiumor-Verhältnis berechnet.
20 zeigt einen Graph, der die radiomarkieten Kaninchen anti-GRP1-Antikörper, gebunden an die Lebertumore, versus der Kontrolle zeigt. Wie aus der Figur ersichtlich ist sind mehr anti-GRP1-Antikörper an das Lebertumorgewebe gebunden, verglichen mit den Kontrollen. 20 zeigt auch das Leber/Lebertumor-Verhältnis auf der y-Achse mit der zunehmenden Zeit auf der x-Achse für sowohl normales radiomarkiertes Kaninchenserum als auch GRP1-Antiserum. Das normale Kaninchenserum erreichte ein Verhältnis von 1 am Tag 1, welches bis Tag 5 konstant blieb. Dies zeigt an, das der Level an Radiomarkierung in dem Lebertumor und der normalen Leber gleich war. Das Verhältnis für das GRP1-Antiserum akkumulierte exponentiell, wobei es sich am Tag 5 einem Verhältnis von 2 näherte. Dies zeigt an, dass das radiomerkierte GRP1-Antiserum sich spezifisch innerhalb der C170HM2-Lebertumore lokalisiert.
BEISPIEL 10
Therapeutischer Effekt von GRP1-Antiserum auf C170HM2-Heterotransplantate
Die C170HM2-Tumorheterotransplantate wurden mittels intraperitonealen Injektionen von Zellen initiiert. Es wurden drei verschiedene Zellinocula verwendet, um 3 Level in der Tumorlast zu erzeugen. Das GRP1- Antiserum wurde passiv durch eine Schwanzveneninjektion täglich vom Tag 0 an verabreicht. Die Therapie wurde am Tag 40 beendet.
Effekt des GRP1-Antiserums auf die Tumorangehrate („take-rate")
Der anfänglich beurteilte Parameter war die mittlere (mean) Tumorzahl innerhalb der Leber, welche in 21 gezeigt ist. Die mit normalen Kaninchenanitserum behandelten Kontrollen wurden nach zunehmenden Zellinocula gruppiert. Wie aus 21 ersichtlich, war in den Kontrollgruppen die mittlere (mean) Tumorzahl pro Leber zwischen 1 und 3. In der GRP1-Antiserum-behandelten Gruppe war die mittlere (mean) Tumoranzahl pro Leber kleiner als 1 für alle 3 Zellinocula, was für alle drei Experimente signifikant war (ein Inukulum, n = 18, p = 0,003; 2 Inocula, n = 12, p = 0,0001 und 3 Inocula, n = 20, p = 0,0068, Mann Whitney-Analyse).
Effekt des GRP1-Antiserums auf das Tumorgewicht von etbalierten Tumoren
Die 22 zeigt das mittlere (mean) Tumorgewicht für die mit normalem Kaninchenantiserum-behandelten Kontrollen auf der rechten Feld für 3 zunehmenden Zellinocula. Die Figur zeigt auch das mittlere (mean) Tumorgewicht von nackten Mäusen im Anschluß an eine Behandlung mit GRP1-Antiserum, wobei das mittlere Tumorgewicht um 60% bei allen 3 Zellinocula reduziert wurde, was für alle 3 Experimente signifikant war (ein Inukulum, p = 0,0016; 2 Inocula, p = 0,0084 und 3 Inocula, p = 0,0001, Mann Whitney-Analyse).
GRP1-Immunreaktivität in C170HM2-Heterotransplantaten wie mittels Westernblotting bestimmt
Es wurden extranukleäre Membranproteine von C170HM2-Heterotransplanten aus den 2/3 Experimenten hergestellt. Diese wurden mittels Westernblotting unter Verwendung von AGP1-Antiserum analysiert. 23 ist eine Fotographie des Wetsernblots, welcher in den mit normalem Kaninchenserum-behandelten Heterotransplantaten 2 immunreaktive Banden zeigt, die bei 74 und 50 kDa vorhanden waren, wobei die erste Bande die stärkste Immunreaktivität zeigt. In den mit GRP1-Antiserum-behandelten Heterotransplantaten gibt es 2 immunreaktive Banden, zusammen mit einer dazwischen liegenden Bande, welche in den Kontrollheterotransplantaten oder Zellen, die in in vitro gewachsen wurden, nicht sichtbar war. Eine 50 kDa-Bande zeigt die stärkste Immunreaktivität. Dies zeigt an, dass in den mit GRP1-Antiserum-behandelten Heterotransplantate ein größerer Anteil an CCK-B/Gastrin-Rezeptoren als eine internalisierte Form vorhanden sein kann.
Histologische Analyse der C170HM2-Heterotransplantate
24 zeigt eine mikrokopische Aufnahme von einem C170HM2-Heterotransplantat, die in eine Leber von nackten Mäusen invadiert. Der Tumor ist im Allgemeinen aus einem nekrotischen Zentrum mit einem lebensfähigem Rand zusammengesetzt, welcher die Hepatocyten zerquetscht, während er in die Leber invadiert. Der Apoptosegrad wurde in dem lebensfähigem Rand der C170HM2-Tumore mittels dem Tunel-Verfahren gemessen, wobei positive Zellen mittels in situ-Hybridisierung visualisiert wurden. 25 zeigt, dass apoptotische Zellen in den lebensfähige Tumorzellen in den mit dem GRP1-Antiserum-behandelten Heterotransplantaten vorhanden waren, aber nicht in den mit normalem Kaninchenantiserum-behandelten Tumoren.
Die Daten zeigen, dass das Antiserum, welches gegen das aminoterminale Epitop des CCK-B/Gastrin-Rezeptors hergestellt wurde, sich selektiv innerhalb des leberinvasiven C170HM2-Tumors lokalisiert. Die Neutralisiation des GRP1-Epitops induzierte einen signifikanten Effekt auf sowohl die Tumor „take rate" als auch auf die Bruttotumorlast von Tumoren, die sich etabliert haben. Dieser tumorinhibitorische Effekt kann auf Grund (a) eines generallen cytostatischen Effekts sein, der durch das Blockieren des CCK-B/Gastrin-Rezeptors induziert wurde, und/oder kann (b) ein direkter Effekt von der Ausrichtung eines Antikörpers auf den Nukleus der Zelle sein, was möglicherweise zur Apoptose führt.

1. Bock, M. G., DiPardio, R. M., Evans, B. E., Rittle, K. E., Whitter, A., Veber, D, Anderson, E., und Freidinger, A. Benzodiazepine, gastrin and brain cholecystokinin receptor ligands: L-365,260. J. Med. Chem., 32: 13–17, 1989.
2. Curtis, B. M., Widmer, M. B., de Roos, P., Qwarnstrom, E. E. IL-1 and its receptor are translocated to the nucleus. J. Immunol. 1990; 144: 1295–1303.
3. Dickinson C. J. Relationship of gastrin processing to colon cancer (editorial). Gastroenterology 1995; 109: 1384–1388.
4. Edkins, J. S.. On the chemical mechanism of gastric secretion. Proc. Soc. Lond. 1905; 76: 376.
5. Fourmy, D., Zahidi, A., Pradayrol, I., Vayssette, J., Ribet, A. Relationship of CCK/gastrin-receptor binding to amylase release in dog pancreatic acini. Regul. Pept. 1984; 10: 57–68.
6. Grider, J. R., Malchlouf, G. M. Distinct receptors for cholecystokinin and gastrin on muscle cells of stomach and gallbladder. Am. J. Physiol. 1990; 259: G184–G190.
7. Harrison's Principles of Internal Medicine, Isselbacher et al. Eds. 13^th Ed. Pages 1690–1691, 1994.
8. Holt, S. J., Alexander, P., Inman, C., Davies, D. Epidermal growth factor induced tyrosine phosphorylating of nuclear proteins associated with translocation of epidermal growth factor receptor into the nucleus. Biochem. Pharm. 1994; 43: 1l7–126.
9. Hughes, J., Boden, F., Costall, B., Dameney, A., Kelly, E., Horwell, D. C., Hunter, J. C., Pinnock, R. D., and Woodruff, G. N. Development of a class of selective cholecystokinin type B receptor antagonists having potent anxiolytic activity. Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 6728–6732, 1990.
10. Johnson L. New aspects of the trophic actin of gastrointestinal hormones. Gastroenterology 1997; 72: 788–792.
11. Kopin, A. S., Lee, Y. M., McBride, E. W., Miller, L. J., Lu, M., Lin, H. Y., Kolakowski, L. F., Beinborn, M. Expression cloning and characterization of the canine parietal cell gastrin-receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1992; 89: 3605–3609.
12. Laudron P. M. From receptor internalization to nuclear translocation: new targets for long-term pharmacology. Biochem. Pharm. 1994; 47: 3–13.
13. Le Meuth, V., Philouz-Rome, V., LeHuerou-Luron, L., Formal, M., Vaysse, N., Gespach, C., Guilloteau, P., Fourmy, D. Differntial expression of A- and B-subtypes of cholecystokinin/gastrin-receptors in the developing calf pancreas. Endocrinology 1993; 133: 1182–1191.
14. Matsumoto, M., Park, J., Yamada, T. Gastrin-receptor characterization: affinity cross-linking of the gastrin-receptor on canine gastric parietal cells. Am. J. Physiol. 1987; 252: G143–147.
15. Nakata, H., Matsui, T., Ito, M., Taniguchi, T., Naribayashi, Y., Arima, N., Nakamura, A., Kinoshita, Y., Chibara, K., Hosoda, S., Chiba, T. Cloning and characterization of gastrin-receptor from ECL carcinoid tumor of Mastomys natalensis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 187: 1151–1157.
16. Narayan, S., Chicone, L., Singh, P. Characterization of gastrin binding to colonic mucosal membranes of guinea pigs. Mol. Cell. Biochem. 1992; 112: 163–171. Nemeth, J., Taylor, B., Pauweis, S., Varro, A & Dockray, G. J. Identification of progastrin derived peptides in colorectal carcinoma extracts. Gut 1993; 34: 90–95.
17. Palnaes, Hansen C., Stadil, F., Rehfeld, J. F. Metabolism and influence of glycine-extended gastrin on gastric acid secretion in man. Digestion 1996; 57: 22–29.
18. Podlecki, D. A., Smith. R. M., Kao, M., Tsai, P., Huecksteadt, T., Brandenburg, D., Lacher, R. S., Jarett, L., Olefsky, J. M. Nuclear translocation of the insulin receptor. J. Biol. Chem. 1987; 262: 3362–3368.
19. Rehfeld, J. F., Bardram, L., Hilsted, L. Gastrin in human bronchogenic carcinomas: constant expression but variable processing of progastrin. Cancer Res. 1989; 49: 2840–2843. Rehfeld, J. F. Three components of gastrin in human serum. Biochim, Biophys. Acta 1972, 285: 364–372.
20. Romani, R., Howes, L. G., und Morris, D. L. Potent new family of gastrin-receptor antagonists (GRAs) produces in vitro and in vivo inhibition of human colorectal cancer cell lines. Procs. AACR, 35: 397 (Abstract), 1994.
21. Scemma, J. L., Fourmy, A., Zahidi, L., Praydayrol, L., Susini, C., Ribet, A. Characterization of gastrin-receptors on a rat pancreatic acinar cell line (AR4-2J). A possible model for studying gastrin mediated cell growth and proliferation. Gut 1987; 28: 233–236.
22. Seva, C., Dickinson, C. J., Yamada, T. Growth-promoting effects of glycine-extended prograstrin. Science 1994; 265: 410–412. Seva, C., Dickinson, C. J., Sawada, M., Yamada, T. Characterization of the glycine-extended gastrin (G-gly) receptor on AR 42Z cells. Gastroenterology 1995, A742.
23. Singh, P., Owlia, A., Espeijo, R., Dai, B. Novel gastrin-receptors mediate mitogenic effects of gastrin and processing intermediates of gastrin on Swiss 3T3 fibroblasts. Absence of detectable cholecystokinin (CCK)-A and CCK-B receptors. J. Biol. Chem. 1995; 270: 8429–8438.
24. Singh, P., Townsend, Jr. C. M., Thompson, J. C., Narayan, S., Guo, Y. S. Hormones in colon cancer: past and prospective studies. Cancer J. 1990; 3: 28–33.
25. Soll, A. H., Amiran, L. P., Thomas, T., Reedy, T. J., Elashoff, J. D. Gastrin-receptors on isolated canine parietal cells. J. Clin. Invet. 1984; 73: 1434–1447.
26. Taniguchi, T., Matsui, T., Ito, M., Marayama, T., Tsukamota, T., Katakami, Y., Chiba, T., Chihara, K. Cholecystokinin-B/gastrin-receptor signaling pathway involve styrosine phosphorylatins of p125FAK and p42MAP. Oncogene 1994; 9: 861–867.
27. Todisco, A., Takeuchi, Y., Seva, C., Dickinson, C. J., Yamada, T. Gastrin and glycine-extended progastrin processing intermediates induce different programs of carly gene activation. J. Biol. Chem. 1995; 279: 28337–28341.
28. Ulrich, A., Schlessinger, J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 1990; 61: 203–212. Upp, J. R., Singh, S., Townsend, C. M., and Thompson, J. C. Clinical significance of gastrin receptors in human colon cancers. Cancer Res. 1989, 49: 488–492.
29. Van-Solinge, W. W., Nielsen, F. C., Friis-Hansen, L., Falkmer, U. G. und Rehfeld, J. F. Expression but incomplete maturation of progastrin in colorectal carcinoma. Gastroenterology 1993; 104: 1099–1107.
30. Wank, S. A. Cholecystokinin receptors (editorial). Am. J. Physiol. 1995; 269: G628–G646.
31. Wank, S. A., Pisegna, J. R., de Weerth, A. Brain and gastrointestinal cholecystokinin receptor family: structure and functional expression. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1992; 89: 8691–8695.
32. Watson, S. A., Durrant, L. G., Crosbie, J. D, Morris D. L. The in vitro growth response of primary human colorectal and gastric cancer cells to gastrin. Int. J. Cancer 1989; 43: 692–696.
33. Watson, S. A., Durrant, L. G., Elston, P., und Morris, D. L. Inhibitory effects of the gastrin-receptor antagonist (L-365,260) on gastrointestinal tumor cells. Cancer, 1991, 68, 1255–1260.
34. Watson, S. A., Crosbie, D. M., Moris, D. L., Robertson, J. F., Makovec, F., Rovati, L. C. et al. Therapeutic effect of the gastrin receptor antagonist, CR2093 on gastrointestinal tumour cell growth. B. J. Cancer 1992, 65(6): 879–883.
35. Watson, S. A., Morris, D. L., Durrant, L. G., Robertson, J. F., Hardcastle, J. D. Inhibition of gastrin-stimulated growth of gastrointestinal tumour cells by octreatide and the gastrin/cholecystokinin receptor antagonists, proglumide and lorglumide. Eur. J. Cancer 1992, 28A(8–9): 1462–1467.
36. Watson, S. A., Steele, R. Gastrin-receptors on gastrointestinal tumor cells. In: Gastrin-receptors in gastrointestinal Tumors. R. G. Landes Co., Austin TX:CRC 1993 p. 20–[TEXT FEHLT]
37. Waston, S. A., Michaeli, D., Grimes, S., Morris, T. M., Robinson, G., Varro, A., Justin, T. A., Hardcastle, J. D., Gastrinmune raises antibodies that neutralise amidated and glycine-extended gastrin-17 and inhibit the growth of colon cancer. Cancer Res. 1996, 56: 880–885.

Claims

Immunogen, umfassend ein aktives Peptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, konjugiert mit einem immunogenen Träger.
Immunogen nach Anspruch 1, umfassend ferner eine Spacerpeptidsequenz, welche zwischen dem aktiven Peptid und dem Träger einen Abstand schafft.
Immunogen nach Anspruch 2, worin das Spacerpeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 hat.
Immongen nach einem der vorhergegangenen Ansprüche, worin der Träger das Diphtherietoxoid, das Tetanustoxoid oder bovines Serumalbumin ist.
Immunogen nach einem der vorhergegangenen Ansprüche zur Verwendung für die Behandlung einer malignen Kondition, verursacht durch gastrinabhängiges malignes Zellwachstum.
Antikörper gegen ein Immunogen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, welcher den CCK-B/Gastrin-Rezeptor erkennt und an ihn bindet.
Antikörper nach Anspruch 7 in chimerer, monoklonaler oder humanisierter Form.
Antikörper nach Anspruch 7 oder 8, konjugiert mit einem cytotoxisch oder radioaktiv markiertem Molekül.
Antikörper nach Anspruch 9, worin das cytotoxische Molekül das Choleratoxin ist oder das radioaktive Molekül mit ¹²⁵I oder ¹³¹I markiert ist.
Antikörper nach Anspruch 7, 8, 9 oder 10 zur Verwendung für die Behandlung eines gastrinabhängigen Tumors.
Verfahren zur Detektion eines auf Gastrin reagierenden Tumors, der CCK-B/Gastrin-Rezeptoren enthält, umfassend die Exposition eines Antikörpers, beansprucht in Anspruch 7, zu Zellen, die aus einer Tumorbiopsieprobe isoliert wurden, und die Detektion des CCK-B/Gastrin-Rezeptors, der an den Antikörper gebunden ist.
Antikörper nach Anspruch 7 zur Verwendung in vivo für die Bildgebung eines gastrinabhängigen kolorektalen Tumors in einem Patienten.
Antikörper nach Anspruch 13, radiomarkiert mit ¹¹¹Indium oder ⁹⁰Yttrium.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7, 8, 9 oder 10 für die Herstellung eines Mittels zur Behandlung eines gastrinabhängigen Tumors.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7 für die Herstellung eines Mittels zur Bildgebung eines gastrinabhängigen koloraktalen Tumors in einem Patienten.