DE69834179T2

DE69834179T2 - Rekombinantes pockenvirus das das lösliche chemokine-bindende protein kodierende gen a41l nicht exprimieren kann.

Info

Publication number: DE69834179T2
Application number: DE69834179T
Authority: DE
Inventors: Universtiy of Oxford Geoffrey SMITH; Universtiy of Oxford Aylwin NG
Original assignee: Oxxon Therapeutics Ltd
Current assignee: Oxxon Therapeutics Ltd
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: AU6302098A; US20020071849A1; US20040142002A1; JP4191255B2; US6355252B1; EP1405916A1; US7384643B2; WO1998037217A1; JP2001513629A; AU749921B2; ATE323170T1; EP0985046B1; EP0985046A1; DE69834179D1

Description

Diese Erfindung beschreibt ein neues Chemokin-bindendes Protein und Chemokin-bindende Fragmente davon. Insbesondere beschreibt die Erfindung Verwendungen des Proteins oder Fragmenten in einem Medikament, beispielsweise als ein antivirales oder entzündungshemmendes Mittel, und Verfahren zum Nachweis und zur Hemmung von Chemokinen.
Chemokine sind eine Familie von kleinen sekretierten Polypeptiden, welche den Transport und Effektorfunktionen von Leukozyten reguliert und eine wichtige Rolle bei der Entzündung und dem Schutz eines Wirts gegen Pathogene spielt (D'Souza & Harden, 1996; Fauci, 1996; Howard et al., 1996; Murphy, 1996; Premack & Schall, 1996; Baggiolini et al., 1997). Es sind mehr als 30 Chemokine identifiziert worden und diese werden in mindestens drei strukturelle Gruppen unterteilt auf Basis der Zahl und der Anordnung von konservierten Cysteinen: CC (ß)-Chemokine wie etwa RANTES (für „regulationupon-activation, normal T cell expressed and secreted") und Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α, CXC (α)-Chemokine wie etwa Interleukin-8 (IL-8) und mit dem Wachstum verbundene Onkogene (GRO, „growth-related oncogene")-α, und das C-Chemokin Lymphotactin. Die unterschiedlichen Chemokine sind entstanden, um mit bestimmten Zelltypen zusammenzuwirken:
Viele CC-Chemokine sind Chemolockstoffe für Monozyten oder Thymozyten, während viele, aber nicht alle CXC-Chemokine Chemolockstoffe für Neutrophile sind. Es gibt jedoch keine Regel im Hinblick auf die Chemokinstruktur und die zelluläre Spezifität für andere Leukozyten-Subtypen. Beispielsweise ist das C-Chemokin Lymphotactin selektiv für T-Zellen, das CC-Chemokin Eotaxin ist spezifisch für Eosinophile und die CXC-Chemokine IFN-γ-induziertes Protein (IP-10) und durch IFN-γ induziertes Monokin (Mig) locken aktivierte T-Zellen an.
Chemokinrezeptoren (CKRs) sind Proteine mit sieben Transmembrandomänen, und sind mit G-Proteinen für die Signaltransduktion gekoppelt. Die meisten CXC-Chemokine besitzen für nur einen einzigen CRK eine hohe Affinität (IL-8 ist darin eine Ausnahme, da es an CXCR1 und CXCR2 bindet), wohingegen die meisten CC-Chemokine an mehr als einen CRK binden (Baggiolini et al., 1997).
Die Aktivität von Chemokinen ist eng reguliert, um eine übermäßige Entzündung, welche eine Erkrankung verursachen kann, zu verhindern. Die Inhibition von Chemokinen durch neutralisierende Antikörper in Tiermodellen (Sekido et al., 1993) oder die Störung von Maus-Chemokingenen (Cook et al., 1995) haben in vivo eine kritische Rolle von Chemokinen bei einer durch eine Virusinfektion vermittelten Entzündung oder anderen Prozessen bestätigt. Die Produktion von löslichen Versionen von Cytokinrezeptoren, welche nur die extrazelluläre Bindedomäne enthalten, stellt eine physiologische und therapeutische Strategie zur Blockade der Aktivität von einigen Cytokinen bereit (Rose-John & Heinrich, 1994). Jedoch macht die Struktur der CKRs mit sieben Transmembrandomänen die Konstruktion von löslichen, inhibitorischen CKRs schwierig, und folglich sind mutierte Chemokinantagonisten, blockierende Peptide oder Antikörper alternative Inhibitoren von Chemokinen, welche beurteilt werden (D'Souza & Harden, 1996; Howard et al., 1996).
CKRs spielen bei der Übertragung und Verbreitung von HIV dadurch eine kritische Rolle, da sie als Co-Faktor agieren, welcher zusammen mit CD4 für einen Eintritt des Virus und eine Infektion erforderlich ist (D'Souza & Harden, 1996; Fauci, 1996). Der CXCR4-CKR ist ein Co-Faktor für HIV-Isolate, welche einen T-Zelllinientropismus aufweisen, wohingegen CCR5 (und CCR3)-CRKs bei der Infektion durch HIV-Stämme eine Rolle spielen, welche einen Makrophagentropismus aufweisen. Die Bedeutung von CCR5 in vivo wird durch den Befund gestützt, dass Individuen, welche im Hinblick auf eine mutante Version des CCR5-Gens homozygot sind, gegenüber einer HIV-Infektion resistent sind. Die Bindung von Chemokinen oder mutierten Chemokinantagonisten an CRKs blockiert die HIV-Infektion, was das Potenzial der Blockade der HIV-CKR-Wechselwirkung als eine prophylaktische und therapeutische Strategie gegen HIV veranschaulicht (D'Souza & Harden, 1996; Fauci, 1996).
Pockenviren sind eine Gruppe von großen DNA-Viren, welche im Cytoplasma der Zelle replizieren und für viele ihrer eigenen Enzyme für die Transkription und die DNA-Replikation codieren (Moss, 1996). Das Vaccinia-Virus (VV) ist das am intensivsten untersuchte Pockenvirus und ist als das Lebendvakzin berühmt, welches verwendet wurde, um Pocken auszurotten (Fenner et al., 1988). Seit 1982 ist das VV ebenso in weitem Maß als ein Expressionsvektor und bei der Vakzinforschung verwendet worden (Moss, 1991). Das Genom des VV-Stamms Copenhagen ist komplett sequenziert worden und enthält ungefähr 200 Gene (Göbel et al., 1990). Diejenigen nahe des Zentrums des Genoms sind zwischen Pockenviren am höchsten konserviert und können für die Virusreplikation essenziell sein. Im Gegensatz dazu sind Gene, welche zu einem der Enden des Genoms hin angeordnet sind und zwischen unterschiedlichen Viren variabler sind, häufig für die Virusreplikation nicht essenziell (Johnson et al., 1993). Eine Untergruppe dieser nicht essenziellen Virusgene ist wichtig für die Blockierung spezieller Bestandteile des Immunsystems des Wirts und kann die Virulenz des Virus beeinflussen. Somit exprimieren das VV und andere Pockenviren Proteine, welche die Wirkung von Interferonen, Komplement, Cytokinen, Chemokinen, Entzündung und Fieber blockieren können (Alcami & Smith, 1995a; McFadden et al., 1995; Smith, 1996; Spriggs, 1996; Smith et al., 1997c). Viele dieser Proteine werden von der infizierten Zelle sekretiert und binden an Faktoren des Wirts in Lösung oder an der Zelloberfläche. In vielen Fällen besteht eine Aminosäureähnlichkeit zwischen dem Virusprotein und der extrazellulären Ligand-Bindedomäne eines Zelloberflächenrezeptors für einen bestimmten Liganden. In diesen Fällen scheint es wahrscheinlich, dass das Virusgen während der Evolution von dem Wirt abgeleitet wurde.
Lösliche Chemokin-bindende Proteine sind zuvor in Pockenviren nachgewiesen worden. Das Myxomavirus-T7-Protein, welches zuerst als ein lösliches IFN-γR identifiziert wurde (Upton et al., 1992), bindet zunächst durch eine Heparin-bindende Domäne an eine Reihe von Chemokinen und beeinflusst die Infiltration von Zellen in infiziertes Gewebe (Mossman et al., 1996, Lalani et al., 1997). Das Protein wird in WO 96/33730 beschrieben, bezeichnet als CBP-1. Im Gegensatz dazu bindet das IFN-γR von Orthopoxviren wie etwa W keine Chemokine (Alcami et al., 1998). Zweitens wurde demonstriert, dass der VV-Stamm Lister ein lösliches Protein mit 35 kDa exprimiert, welches von infizierten Zellen sekretiert wird und welches viele CC-Chemokine bindet (Graham et al., 1997; Smith et al., 1997a; Smith et al., 1997b; Alcami et al., 1998), aber keine CXC-Chemokine, durch eine Domäne, welche sich von der Heparinbindedomäne unterscheidet (Smith et al., 1997a; Smith et al., 1997b; Alcami et al., 1998). Dieses Protein ist vCKBP genannt worden (Alcami et al., 1998). Das Protein wird auch in WO 97/11714 beschrieben, als p35. Sehr ähnliche Proteine werden von einigen, aber nicht von allen VV-Stämmen, Kuhpockenviren, den Leporipoxviren, Shope-Fibrom-Virus (SFV) und Myxoma-Virus (T1-Protein genannt) und von Variola major-Viren, beispielsweise Protein G5R in Indien – 1967 (Shchelkunov et al., 1994) hergestellt. Ein anderes VV-Gen codiert für ein Protein, welches mit vCKBP entfernter verwandt ist. In dem VV-Stamm Copenhagen wurde dieses Protein A41L genannt (Goebel et al., 1990). Und im VV-Stamm WR wurde es ursprünglich SalF4L genannt (Howard et al., 1991), jedoch in SalF3L umbenannt (Smith et al., 1991). Hierin nachfolgend wird es als A41L bezeichnet. Es wurde die Verwandtschaft von A41L und SFV T1 zur Kenntnis genommen, umfassend die Co-Ausrichtung von 8 Cysteinresten, wurde bemerkt (Howard et al., 1991). Howard et al., 1991 bemerkten auch eine potenzielle Stelle für eine Anheftung eines Kohlenhydrats über einen Asparaginrest und ein mutmaßliches Signalpeptid, welches das Protein über die Membran des endoplasmatischen Retikulums und aus der Zelle translozieren könnte. Andere Autoren behaupteten, dass zwischen A41L und dem 35 kDa-Protein von VV Lister und dem SFV T1-Protein keine Ähnlichkeit besteht (Martinez-Pomares et al., 1995). In allen drei Stämmen des Variola major-Virus, welche sequenziert worden sind, gibt es einen offenen Leserahmen (ORF) mit einer Aminosäureidentität von mehr als 95% mit dem A41L-Protein von VV WR, welches im Stamm Harvey 16L genannt wird (Aguado et al., 1992), im Stamm Bangladesh-1975 A44L genannt wird (Massung et al., 1994) und im Stamm India-1967 A46L genannt wird (Shchelkunov et al., 1994).
Die Ähnlichkeit von A41L mit vCKBP deutete darauf hin, dass das A41L-Protein wie vCKBP an Chemokine binden könnte (Alcami et al., 1998). Jedoch berichteten Alcami et al. (1998), dass die Überstände von Zellen, welche mit VV WR oder VV Lister, bei welchen das Gen deletiert worden war, welches für das 35 kDa-Protein codiert (Patel et al., 1990), infiziert wurden, kein Protein enthielten, welches mit MIP-1α, RANTES, IL-8 oder GRO-α vernetzt werden konnte (Alcami et al., 1998).
WO 98/63766 beschreibt die Verwendung des sekretorischen Hauptproteins des Pockenvirus mit 35 kDa als ein antivirales Mittel.
Traktman et al. (Journal Biol. Chem. Vol. 264, Nr. 36, S. 21458–21461, 1989) und Howard und Smith (J. Gen. Virol. (1989), 70, 3187–3201) beschreiben, dass das BIR-Gen für die virale Replikation essenziell ist.
Es ist nun gefunden worden, dass das Gen A41L für ein Protein mit 30 kDa codiert, welches von Zellen sekretiert wird, welche von allen Stämmen der untersuchten Orthopoxviren infiziert werden, einschließlich 16 Stämme VV und 2 Stämme Kuhpockenvirus. Außerdem wird vorhergesagt, dass es von allen drei Stämmen des Variola major-Virus exprimiert wird, von welchen Sequenzdaten verfügbar sind (Aguado et al., 1992; Massung et al., 1994; Shchelkunov, 1995). Das Protein enthält O- und N-gebundene Kohlenhydrate. Ee wurde eine Deletionsmutante von VV WR ohne das A41L-Gen konstruiert und es wurde gezeigt, dass sie in Zellkultur mit dem gleichen Titer wie der Wildtyp und revertante Viren repliziert. Unter Verwendung eines durch rekombinantes Baculovirus hergestellten A41L-Proteins bei einer Oberflächen-Plasmonresonanz (BIAcore) wurde gefunden, dass das Protein an die CXC-Chemokine Mig und IP-10 bindet, aber nicht an andere CXC-, CC- oder C-Chemokine.
Hierin wird ein Arzneimittel beschrieben, welches eine wirksame Menge eines A41L-Proteins oder eines Chemokin-bindenden Fragments davon umfasst, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Ebenso wird die Verwendung eines A41L-Proteins oder eines Chemokin-bindenden Fragments davon als entzündungshemmendes Mittel beschrieben.
Das A41L-Protein und Fragmente sind bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich, welche durch Chemokine vermittelt werden, insbesondere CXC-Chemokine und durch IFN-γ induzierte Chemokine wie etwa Mig und IP-10.
Weiterhin ist hierin die Verwendung eines A41L-Proteins oder eines Chemokin-bindenden Fragments als ein Antivirusmittel beschrieben. Das A41L-Protein oder Fragment inhibiert die Bindung an und/oder die Infektion einer Zielzelle durch Pathogene wie etwa HIV, welche die Infektion einer Zielzelle über einen zellulären Chemokinrezeptor vermitteln.
Die hierin beschriebenen Arzneimittel können bei der Behandlung und/oder Prophylaxe nützlich sein.
Die Erfindung stellt ein rekombinantes Pockenvirus bereit, welches genetisch so verändert ist, dass es kein natives A41L-Protein exprimieren kann.
Bevorzugt kann das rekombinante Pockenvirus das Chemokin-bindende A41L-Protein nicht exprimieren, beispielsweise aufgrund einer Deletion des gesamten oder eines wesentlichen Teils des A41L-Gens. Das rekombinante Pockenvirus kann beispielsweise ein genetisch verändertes Vaccinia-Virus sein. Das Vaccinia-Virus MVA, welches gegenwärtig für eine Verwendung in Vakzinen entwickelt wird, ist im Zusammenhang mit diesem Aspekt der Erfindung von besonderem Interesse. Das MVA, welches genetisch so verändert ist, dass es kein Chemokin-bindendes A41L-Protein exprimieren kann, besitzt die erwarteten Vorteile, dass es sicherer und weniger immunogen ist als sein Gegenstück, welches das native A41L-Protein exprimiert.
Ebenso wird ein Nachweisverfahren beschrieben, welches die Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines Chemokin-bindenden Moleküls, welches ein A41L-Protein oder ein Chemokin-bindendes Fragment davon ist,
b) Inkontaktbringen des Chemokin-bindenden Moleküls mit einer Probe,
c) Nachweisen einer Wechselwirkung des Chemokin-bindenden Moleküls mit einem Chemokin in der Probe.

Somit kann das Verfahren verwendet werden, um das Vorliegen von einem oder mehreren Chemokinen in einer biologischen Probe nachzuweisen. Das Chemokin-bindende Molekül kann zweckdienlich an einen festen Träger immobilisiert sein.
Außerdem wird hierin ein Verfahren beschrieben zum Inhibieren der Aktivität von einem oder mehreren Chemokinen in einer Probe, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einer wirksamen Menge eines Chemokin-bindenden Moleküls umfasst, welches ein A41L-Protein oder ein Chemokin-bindendes Fragment davon ist.
Weiterhin wird ein gereinigtes A41L-Protein oder ein Chemokin-bindendes Fragment davon beschrieben, für die Verwendung in einem Verfahren oder Arzneimittel wie hierin beschrieben, und ein Kit, welches solch ein gereinigtes A41L-Protein oder Fragment umfasst.
Eine Aminosäuresequenz für das A41L-Protein wird in 1 gezeigt. Die gezeigte Sequenz ist die des A41L-Proteins von VV WR (Hinterlegungsnummer D11079). Zum Vergleich ist auch die Aminosäuresequenz von vCKBP von VV Lister gezeigt (DNA-Datenbank von Japan, Hinterlegungsnummer D00612).
Die Erfindung betrifft A41L-Proteine (nun auch als vCKBP-2 bezeichnet) von Pockenviren einschließlich Vaccinia-Viren und Variola Major-Viren und einer beliebigen anderen viralen oder nicht viralen Quelle. Es wird erwartet, dass virale A41L-Proteine eine Aminoidentität von etwa 50% oder mehr mit der in 1 gezeigten A41L-Aminosäuresequenz aufweisen, oder insbesondere 80% oder mehr, oder 90% oder mehr, oder 95% oder mehr Aminosäureidentität mit der A41L-Sequenz in 1. Zelluläre Homologe des A41L-Proteins, welche die gleiche oder eine ähnliche Fähigkeit zur Chemokinbindung aufweisen, weisen erwartungsgemäß eine viel geringere Aminosäureidentität mit der in 1 gezeigten Sequenz auf, beispielsweise etwa 25%.
A41L-Proteine von unterschiedlichen Organismen können auch durch die folgenden gemeinsamen Eigenschaften identifiziert werden:

– Konservierte Cysteinreste in der Aminosäuresequenz, welche intramolekulare Disulfidbindungen bilden.
– Chemokin-bindende Eigenschaften.
– Eine ähnliche Größe.
– Eine Aminosäureidentität/Ähnlichkeit. Aminosäureähnlichkeit bedeutet, dass Aminosäurereste ähnliche Eigenschaften wie etwa Ladung und Hydrophobie aufweisen, wobei eine Aminosäure konservativ durch eine andere ersetzt werden kann (das bedeutet, ohne signifikante Wirkung auf die Struktur des Proteins), es liegt eine "Ähnlichkeit" zwischen den zweien vor.
– Acidität, die Proteine sind alle ziemlich sauer. Dies stimmt mit ihrer Funktion überein, da Chemokine dazu tendieren, basische Proteine zu sein. Der isoelektrische Punkt des A41L-Proteins von VV WR beträgt 5.4.

Die A41L-Proteine für eine erfindungsgemäße Verwendung können in nativer oder in mutierter Form bereitgestellt werden. Bekannte Verfahren, insbesondere genetische Manipulationsverfahren können verwendet werden, um modifizierte Versionen des Proteins bereitzustellen, welche im Vergleich mit dem nativen Protein veränderte Eigenschaften aufweisen. Wünschenswerte veränderte Eigenschaften können beispielsweise eine veränderte Bindefähigkeit zur Verstärkung der Bindung mit den Chemokinen sein.
Die Erfindung beschreibt auch die Verwendung von Fragmenten des A41L-Proteins, wobei die Fragmente Chemokin-bindende Eigenschaften aufweisen. Die Fragmente können Peptide sein, welche von dem Protein stammen. Die Verwendung solcher Peptide kann bevorzugt die Verwendung eines gesamten Proteins oder eines wesentlichen Teils eines Proteins sein, beispielsweise aufgrund der verringerten Immunogenität eines Peptids im Vergleich zu einem Protein. Solche Peptide können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich rekombinanter DNA-Techniken und synthetischer chemischer Verfahren.
Es ist auch offensichtlich, dass die beschriebenen A41L-Proteine auf eine Vielzahl von Arten hergestellt werden kann, insbesondere als rekombinante Proteine in einer Vielzahl von Expressionssystemen. Solche Expressions systeme umfassen beispielsweise Pockenvirus-Expressionssysteme oder andere Expressionssysteme als Pockenvirus. Alle Standardsysteme können verwendet werden, wie etwa Baculovirus-Expressionssysteme oder Säugerzelllinien-Expressionssysteme.
1 zeigt eine Anordnung des A41L-Proteins von VV WR mit vCKBP von VV Lister.
2 zeigt die Hydropathieprofile von A41L vom VV-Stamm WR und vCKB vom VV-Stamm Lister.
3 zeigt eine Analyse von vΔA41L- und Wildtyp- und revertanten Viren.
4 zeigt das Vorliegen von rekombinantem A41L-Protein in Überständen von Zellen, welche mit einem Baculovirus infiziert sind, welcher A41L exprimiert.
5 zeigt das Vorliegen von A41L in Überständen von mit Virus infizierten Zellen.
6 zeigt das Vorliegen von Proteinen, welche durch einen Anti-A41L-Antikörper erkannt werden, in Überständen von Zellen, welche mit verschiedenen Pockenviren infiziert wurden.
7 zeigt Bindeprofile für A41L und vCKBP mit einer Vielzahl von Chemokinen.
8 zeigt die Nukleotidsequenz A41L-Gens des VV-Stamms WR und flankierende Sequenzen.
Die Erfindung wird nun weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, welche die Erfindung veranschaulichen sollen und in keiner Weise den Umfang der Erfindung beschränken sollen.
BEISPIELE
Material und Methoden
Zellen und Viren
Die in dieser Untersuchung verwendeten Orthopoxvirus-Stämme werden anderswo beschrieben (Alcami & Smith 1995b; Alcami et al. 1998). Der VV-Stamm WR wurde in BS-C-1-Zellen in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet und wurde auf diesen Zellen wie zuvor beschrieben titriert (Mackett et al. 1985). D980R- und CV-1-Zellen wurden in DMEM mit 10% FBS gezüchtet.
Chemokine
Die rekombinanten humanen Chemokine IL-8, Neutrophilen-aktivierendes Protein (NAP)-2, GRO-α, Plättchenfaktor (PF) 4, vom Stromafaktor (SDF)-1α, epitheliales Neutrophilen-aktivierendes Protein (ENA)-78, Mig, IP-10, RANTES, MIP-1α, MCP-1, MCP-2, Eotaxin und Lymphotaxin wurden von PeproTech bezogen, GRO-γ und I-309 wurden von R&D Systems bezogen, und das Anaphylatoxin C5a wurde von Sigma bezogen.
Konstruktion einer VV-A41L-Deletion und von revertanten Viren
Ein Plasmid, welches geeignet ist für die Konstruktion einer Mutante des VV-Stamms WR ohne das A41L-Gen durch transiente dominante Selektion (Falkner & Moss, 1990), wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Klonierung zusammengebaut. Oligonukleotide, welche die linke oder rechte Seite des A41L-Gens flankieren, wurden zur Erzeugung von PCR-Produkten verwendet, welche terminate Hindlll- und BamHI-(linke Flanke) oder BamHI- und EcoRI-(rechte Flanke) Restriktionsenzymstellen enthielten. Diese PCR-Fragmente wurden dann an ihren Termini mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und nacheinander in das Plasmid pSJH7, welches mit den gleichen Enzymen geschnitten war, kloniert (Hughes et al., 1991), um ein Plasmid pΔA41L zu bilden. Diesem Plasmid fehlten 90% des A41L-ORFs (Codons 1–210) und es enthielt das Guanylphosphoribosyltransferasegen (Ecogpt) von Escherichia coli (Boyle & Coupar, 1988) unter der Kontrolle des VV p7.5K-Promotors (Mackett & Smith, 1982), distal zu den Sequenzen, welche das A41L-Gen umgeben. Die Genauigkeit der Sequenz der von der PCR stammenden Regionen des Plasmids wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines automatisierten DNA-Fluoreszenz-Sequenzierers „Applied Biosystems Inc. 373" bestätigt. Dann wurde das Plasmid pΔA41L in CV-1-Zellen transfiziert, welche mit dem VV-Stamm WR mit 0,05 pfu („plaque forming units")/Zelle infiziert worden waren. 2 Tage später wurde das in den Zellen vorliegende Virus geerntet, verdünnt und dann verwendet, um Monolayer von BS-C-1-Zellen in Gegenwart von Mykophenolsäure (MPA), Xanthin und Hypoxanthin zu infizieren, wie beschrieben (Falkner & Moss, 1988). Die in Gegenwart von MPA gebildeten Plaques stellten Viren dar, welche aufgrund der Integration des Plasmids pΔA41L durch ein einzelnes Crossover-Rekombinationsereignis Ecogpt exprimierten. Nach einer zusätzlichen Plaquereinigung auf BS-C-1-Zellen in Gegenwart von MPA wurden MPA-resistente Virusisolate verwendet, um Monolayer von D980R-Zellen in Gegenwart von 6-Thioguanin (6-TG) zu infizieren, wie beschrieben (Kerr & Smith, 1991). Gebildete Plaques repräsentierten Virusisolate, aus welchen die Ecogpt-Kassette und Plasmidsequenzen durch Rekombination verloren gegangen waren oder welche entweder einen Wildtyp darstellten oder eine A41L-Deletionsmutante (ΔA41L). Diese wurden durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, welche das A41L-Gen flankierten, unterschieden. Ein Plaque-gereinigter Wildtypvirus (vA41L) und eine Deletionsmutante (vΔA41L), welche von dem gleichen MPA-resistenten Zwischenvirus stammten, wurden zweimal öfter Plaque-gereinigt und dann wie zuvor beschrieben amplifiziert und gereinigt (Mackett et al., 1985).
Ein revertantes Virus, bei welchem das A41L-Gen wieder in vΔA41L insertiert wurde, wurde durch transiente dominante Selektion (Falkner & Moss, 1990) unter Verwendung des Plasmids pA41L konstruiert. Dieses Plasmid enthielt das vollständige A41L-Gen und flankierende Sequenzen, welche zwischen die Sall- und EcoRI-Stellen des Plasmids pSJH7 kloniert waren. pA41L wurde in mit vΔA41L infizierte CV-1-Zellen transfiziert und es wurde wie oben beschrieben MPA-resistentes Virus isoliert. Solch ein Virus wurde dann in Gegenwart von 6-TG auf D980R-Zellen ausplattiert und 6-TG-resistente Viren wurden mittels PCR im Hinblick auf einen Wildtyp-A41L-Genotyp gescreent (wie oben). Nach einer weiteren Plaquereinigung wurde dieses Virus amplifziert, gereinigt und als vA41L-rev bezeichnet.
Genomanalyse von Virusisolaten
Die Viren vA41L, vΔA41L und vA41L-rev wurden in BS-C-1-Zellen gezüchtet und die DNA wurde von gereinigten Viruskernen gereinigt wie zuvor beschrieben (Esposito et al., 1981). Diese DNA-Proben wurden dann mittels PCR und Southern Blotting (Southern, 1975) analysiert. Bei der PCR-Analyse wurden Oligonukleotide verwendet, welche den A41L-Lokus flankieren, um zwischen Wildtyp- und Mutanten-A41-Allelen zu unterscheiden. Für die Southern Blot-Analysen wurde Virus-DNA mit EcoRV verdaut, auf einem 0,8%-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonfilter (Hybond-N, Amersham) übertragen. Die Filter wurden mit Fluorescein-markierten DNA-Sonden hybridisiert, welche entweder von innerhalb der Region von A41L, deletiert von vΔA41L oder von einer Region stammen, welche sich vom 5'-Ende des Gens in die linke flankierende Region erstreckt. Gebundene Sonden wurden mit Peroxidase-konjugierten Anti-Fluorescein-Antikörpern und ECL („enhanced chemiluminescence")-Reagenzien (Amersham) nachgewiesen.
Expression und Reinigung des A41L-Proteins von rekombinantem Baculovirus
Der A41L-ORF wurde durch PCR amplifziert unter Verwendung von Oligonukleotiden, welche die Restriktionsenzymstellen Hindlll und Xhol am 5'-Ende bzw. 3'-Ende des ORFs einfügten. Das DNA-Fragment wurde mit den gleichen Enzymen verdaut und in mit Hindlll und Xhol geschnittenen pBAC-1 (R&D Systems) kloniert, wobei das Plasmid pAcA41Lhis erzeugt wurde, so dass der A41L-ORF stromabwärts des Polyhedrongen-Promotors des Autographa californica nukleären Polyhedrosisvirus (AcNPV) lokalisiert war und mit 6 Histidinresten am C-Terminus verbunden war. Das Plasmid pAcA41Lhis wurde verwendet, um rekombinante Baculoviren zu konstruieren, wie beschrieben (Alcami & Smith, 1992, Alcami et al., 1998). Spodoptera frugiperda (Sf)21-Zellen wurden mit gereinigter linearer AcNPV-DNA (BacPAK6, Clontech) und pAcA41Lhis gemäß den Anweisungen des Herstellers cotransfiziert und es wurde das rekombinante Virus AcA41Lhis isoliert. Es wurde aus dem Arbeitsmaterial ein hochtitriges Material (10⁸ pfu/ml) von AcA41Lhis erzeugt und verwendet, um Sf21-Zellen (ausgesät mit 2 × 10⁵ Zellen/cm² in Plastikflaschen) mit 10 pfu/Zelle in TC100-Medium mit 10% FBS zu infizieren. Nach 3 h wurde die Virusimpflösung entfernt, die Zellen wurden gewaschen und mit serumfreiem TC100 überschichtet. Nach 60 h wurde der Überstand gesammelt, bei 2000 rpm (GH-3.7-Rotor in einer Beckman GPR-Zentrifuge) für 5 min bei 4°C zur Entfernung von Zelltrümmern zentrifugiert, durch einen 0,2 μm Filter (Nalgene) filtriert und dann bei 20.000 rpm (SW28-Rotor in einer Beckmann L8-M-Ultrazentrifuge) für 30 min bei 4°C zentrifugiert, um die Viruspartikel zu pelletieren. Der Überstand wurde gesammelt, gegen 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) in 500 mM NaCl dialysiert und durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie gereinigt. Nitrilotriessigsäure (NTA)-Harz, vorgeladen mit Ni²⁺ (Qiagen) wurde in Bindepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, 5 mM Imidazol) equilibriert, ehe es mit dem Überstand gemischt wurde. Die Aufschlämmung wurde kontinuierlich für 3 h rotiert, mit 50 ml Bindepuffer gewaschen, gefolgt von 50 ml 20 mM Imidazol im Bindepuffer und dann in eine Säule geschüttet. Die Säule wurde weiter gewaschen (mit einer Fließrate von 0,2 ml/min) mit Bindepuffer, welcher eine steigende Konzentration von Imidazol bis 50 mM enthielt, ehe das gebundene A41Lhis-Protein mit 120 mM Imidazol eluiert wurde. Aliquots der Fraktionen wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) auf 10%-igen Gelen analysiert und durch Färben mit Coomassie Blue sichtbar gemacht. Die Fraktionen, welche das eluierte A41Lhis-Protein enthielten, wurden vereinigt, in 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 20 mM NaCl dialysiert zum Entfernen des Imidazols und zur Herstellung der Probe für eine weitere Aufreinigung und Konzentration durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) unter Verwendung eines Mono-Q-Anionenaustauschers (Pharmacia). A41Lhis weist einen vorhergesagten isoelektrischen Punkt (pl) von 5.4 auf und wird so bei pH 7,0 leicht an Mono-Q gebunden, und wurde bei 400 mM NaCl während des Waschens der Säule mit einem 10 ml-Gradienten von 20 mM bis 1 M NaCl eluliert. Die Proteinkonzentration in den Fraktionen wurde durch einen Bradford-Assay und durch Vergleiche mit bekannten Konzentrationen von BSA-Standards auf einem SDS-PAGE bestimmt.
Immunisierung von Kaninchen, um einen monospezifischen A41L-Antikörper zu erzeugen
Weiße New Zealand-Kaninchen wurden intramuskulär mit 80 μg des gereinigten A41Lhis-Proteins, emulgiert mit einem gleichen Volumen von Freund's komplettem Adjuvans injiziert und 3x in dreiwöchigen Intervallen mit 200 μg des gleichen Antigens, emulgiert in Freund's nicht komplettem Adjuvans aufgefrischt. Präimmune und immune Serumproben wurden vor der Immunisierung und 2 Wochen nach der letzten Immunisierung entnommen.
Immunoblotting
BS-C-1-Zellen wurden mit den angegebenen Orthopoxviren mit 10 pfu/Zelle für 1,5 h bei 37°C infiziert und nach dem Abwaschen von nicht gebundenem Virus wurden die Zellen für 16 h in MEM („minimal essential medium") ohne Serum inkubiert. Die Überstände von infizierten Zellen wurden dann präpariert wie zuvor beschrieben (Alcami & Smith, 1995b). Alternativ wurden Sf21-Zellen mit AcNPV oder AcA41Lhis mit 10 pfu/Zelle infiziert und 3 Tage später wurden die Überstände geerntet und durch Zentrifugation geklärt (2.000 × g, 10 min bei 4°C). Alle Proben wurden durch SDS-PAGE auf 10%-igen Gelen aufgetrennt. Nach einem elektrophoretischen Transfer der Proteine auf Nitrocellulosemembranen (Towbin et al., 1979) wurden die Blots nacheinander mit Kaninchen-Anti-A41L-Serum (1:2000 verdünnt), einem Ziege-Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat und ECL-Reagenzien (Amersham) inkubiert, wie zuvor beschrieben (Parkinson & Smith, 1994) und wie durch den Hersteller vorgegeben.
Oberflächen-Plasmon-Resonanz (BIAcore-Analyse)
Die carboxymethylierte Dextranoberfläche eines BIAcore-Sensorchips CM5 wurde mit 35 μl 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 200 mM N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/min über den Chip aktiviert, durch drei der vier Fließzellen. Eine Kopplung von Proteinen auf die aktivierte Chipfläche wurde erreicht durch Leiten von 35 μl gereinigtem, von Baculovirus exprimierten A41Lhis (10 ng/μl) und 35 Khis (10 ng/μl) (Alcami et al., 1998) in 15 mM Acetat, pH 4,0 durch die Fließzellen 3 bzw. 4, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/min. Dies wurde gefolgt von einem Leiten von 35 μl 1 M Ethanolaminhydrochlorid-NaOH, pH 8,5 mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/min durch die drei mit NHS/EDC aktivierten Fließzellen, um die Chipfläche zu deaktivieren. Verschiedene rekombinante Chemolockstoffmoleküle (z.B. Anaphylatoxin C5a und Chemokine der CXC-, CC- und C-Familien) wurden entlang einer CM5-Sensorchipfläche geleitet mit einer Konzentration von 1 μM in HEPES-gepufferter Saline (HBS) (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA), welche 0,005% Tween-20 enthielt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/min über die Fließzellen, wobei A41Lhis oder 35 Khis an die Chipfläche gekoppelt war oder nicht. Eine positive Wechselwirkung der Chemolockstoffmoleküle (Analyt) mit den oberflächengekoppelten Proteinen (Ligand) wurde angezeigt durch einen Anstieg der endgültigen Bezugslinie (in Reaktions-Einheiten), nachdem der injizierte Analyt aus den Fließzellen eluiert worden war. Nach jeder Injektion des Analyten wurde die Sensorchipfläche mit einem Impuls von 5 μl 0,1 M HCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/min regeneriert, um den gebundenen Analyten von dem Liganden, welcher mit der Chipfläche gekoppelt ist, abzustreifen, um die Chipfläche für das nächste zu injizierende Chemolockstoffmolekül zu präparieren.
Histologische Untersuchung von durch VV induzierten Läsionen in einem Kaninchenhautmodell
Die VVs vA41L, vΔA41L und vA41L-rev wurden in PBS verdünnt und wurden subkutan mit 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ pfu/Stelle entlang den linken und rechten Flanken eines weiblichen weißen Neuseeland-Kaninchens (Gewicht 1,5 kg) injiziert, welches 3 Tage nach der Injektion getötet wurde. Die Titer der für die Infektion verwendeten Viren wurden durch Plaque-Assays bestätigt. Biopsiegewebeproben von Läsionen, welche sich an den Injektionsstellen entwickelten, wurden unter Verwendung von O.C.T. Tissue-Tek (Bayer Diagnostics) in einem Isopentanbad über Trockeneis für Kryoschnitte eingefroren. Die Kryoschnitte (10 μm dick) wurden auf Glasobjektträgern (Horwell Superfrost) platziert, in 2% (w/v) Formaldehyd auf Eis fixiert und mit 0,1% Triton-X100 in PBS einer Membranpermeabilisierung unterzogen, unter Verwendung von Glukoseoxidase (0,5 Units/ml) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4), welcher 0,2% (w/v) Glukose und 1 mM Natriumazid enthielt, bei 37°C für 5 min abgeschreckt, um endogene Peroxidase zu entfernen, 3x (für 5 min) mit PBS (mit 0,1% Triton) gewaschen und für 30 min mit 5% normalem Pferdeserum (Sigma) blockiert. Die Schnitte wurde dann einer Immunfärbung unterzogen, entweder mit Maus-Anti-Kaninchen-CD43-Antikörpern (Serotec) mit einer Verdünnung von 1:100 in 5% normalem Pferdeserum (für 1 h) zum Nachweisen von infiltrierenden Leukozyten (insbesondere T-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen), oder mit einem monoklonalen Maus-Anti-14k-Antikörper (MAb 5B4/2F2) (Czerny & Mahnel, 1990) mit einer Verdünnung von 1:1000 (für 1 h) im Hinblick auf das Vorliegen von VV in den Schnitten. Die Schnitte wurden (3x) in PBS mit 0,1% Triton gewaschen, gefolgt von einer Inkubation für 30 min mit einem 1:100-verdünnten biotinylierten sekundären Pferd-Anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratories), wie zuvor gewaschen und dann für 30 min mit Vectastain Elite ABC-Reagenz (Vector Laboratories) behandelt. Nach 2x Waschen für 5 min wurden die immungefärbten Schnitte unter Verwendung des chromogenen Substrats Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) (Sigma) mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml in 10 mM Imidazol sichtbar gemacht, was ein rötlich braunes Präzipitat erzeugt, gefolgt von zwei weiteren Wäschen (wie oben) und einer anderen mit PBS. Die Schnitte wurden mit Cresyl-Violett-Acetat (1%) gegengefärbt, durch steigende Konzentrationen von 70%, 80%, 95% und absolutem Ethanol dehydriert und mit Deckgläschen unter Verwendung von DPX (BDH Merck) fixiert. Die histologische Untersuchung dieser Schnitte wurde unter einer Hellfeldabbildung unter Verwendung eines Zeiss-Axiophot-Photomikroskops durchgeführt.
Ergebnisse
Das A41L-Protein ist verwandt mit der T1/35 kDa-Proteinfamilie
Es wurde vorhergesagt, dass das A41L-Gen für ein Protein mit 25 kDa mit 219 Aminosäureresten codiert (Goebel et al., 1990; Howard et al., 1991). Computeranalysen ergaben, dass dieses Protein mit dem SFV T1-Protein verwandt war (Howard et al., 1991). Das A41L-Genprodukt weist auch eine 25%-ige Aminosäureidentität mit dem kürzlich beschriebenen Chemokinbindenden Protein vCKBP auf, welches von Orthopoxviren und verschiedenen VV-Stämmen exprimiert wird, einschließlich Lister, aber nicht von WR (Graham et al., 1997; Smith et al., 1997a; Alcami et al., 1998). Diese Ähnlichkeit wird weiterhin in 1 durch die Anordnung des A41L-Proteins von VV WR mit vCKBP von VV Lister veranschaulicht (Patel et al., 1990). A41L ist auch mit dem G5R-Protein des Variolavirus-Stamms Bangladesh-1975 (Massung et al., 1994) und dem SFV T1-Protein (Upton et al., 1987) verwandt. Das A41L-Protein des VV-Stamms WR weist eine 97,7%-ige Aminosäureidentität mit dem A41L-Protein des VV-Stamms Copenhagen (Goebel et al., 1990), und eine 96,3%-ige Identität mit dem 16L-Protein des Variolavirus-Stamms Harvey (Aguado et al., 1992) auf, und ähnliche Ausmaße des Verwandtheitsgrads mit dem Protein A44L des Variolavirus-Stamms Bangladesh-1975 (Massung et al., 1994) und dem Protein A46L des Variolavirus-Stamms India-1967 (Shchelkunov et al., 1994). Zu beachten ist die Konservierung von 8 Cysteinresten und die ähnliche Länge dieser Proteine. Sowohl das A41L-Genprodukt als auch vCKBP weisen keine signifikanten Ähnlichkeiten mit anderen nicht viralen Proteinsequenzen in Datenbanken auf. Der Zusammenhang zwischen dem VV-A41L-Protein und vCKBP wird auch veranschaulicht durch die ähnlichen Hydropathieprofile der zwei Proteine (2) und deren saure Natur, pl 5,4 für A41L und 4,3 für vCKBP.
Das A41L-Gen ist für die Virusreplikation in Zellkultur nicht essenziell
Eine Sequenzanalyse der Genome der Variolavirus-Stämme Harvey, India-1967 und Bangladesh-1975 und der VV-Stämme Copenhagen und WR zeigte, dass in jedem Virus ein Protein vorliegt, welches zu dem A41L-Protein von VV WR äquivalent ist und hoch konserviert ist. Dies deutete darauf hin, dass das Protein eine wichtige Funktion für das Virus aufweisen könnte. Um dies weiter zu erforschen, haben wir Versuche durchgeführt, um eine VV-Deletionsmutante ohne das A41L-Gen herzustellen. Da das A41L-Protein mit vCKBP von VV Lister und einigen anderen VV-Stämmen (Alcami et al., 1998) verwandt ist, bestand die Möglichkeit, dass vCKBP den Verlust des A41L-Gens funktionell kompensieren könnte. Um diese mögliche Komplikation zu vermeiden, wurde der VV-Stamm WR ausgewählt, da er vCKBP nicht exprimiert. Trotz der Konservierung von A41L wurde eine lebensfähige Deletionsmutante isoliert.
Eine Analyse der Genome der Viren vΔA41L und des Wildtyps (vA41L) und der Revertante (VA41L-rev) zeigte, dass sie die vorhergesagten Genomstrukturen aufweisen (3). Mit EcoRV verdaute DNA von einem nicht klonierten WR-Virus, vA41L und vA41L-rev, ergab Fragmente von 1991 bp, welche mit einer Sonde nachgewiesen wurde, welche sich von der 5'-Region des Gens in die linken flankierenden Sequenzen erstreckt, und durch eine Sonde nahe dem 3'-Ende des Gens innerhalb der Region, welche bei vΔA41L deletiert ist. Wie erwartet, konnte durch diese 3'-Sonde in vΔA41L kein Fragment nachgewiesen werden, und mit der 5'-Sonde konnte ein kleineres Fragment von 1391 bp nachgewiesen werden, was mit dem Verlust des Großteils des A41L-ORF übereinstimmt. Eine PCR-Analyse unter Verwendung von Oligonukleotiden, welche den ORF flankieren, wiesen bei den Viren WR, vA41L und vA41L-rev Fragmente mit einer nicht unterscheidbaren Größe nach, und ein um 600 Nukleotide kleineres Fragment bei vΔA41L (Daten nicht gezeigt).
Das Wachstum von vA41L-, vΔA41L- und vA41L-rev-Viren war in Zellkultur äquivalent. Die auf BS-C-1-Zellen durch jeden Virus gebildeten Plaques besaßen die gleiche Größe und die Ausbeuten an intrazellulärem Virus, erzeugt 24 h nach Infektion (hpi) von BS-C-1-Zellen mit 1 pfu/Zelle war für jeden Virus nicht unterscheidbar (Daten nicht gezeigt).
Expression und Reinigung des A41L-Proteins
Um die Expression des A41L-Proteins von Baculovirus zu zeigen, wurden die Proteine in den Überständen von mit AcA41Lhis infizierten Sf21-Zellen analysiert mittels Immunoblotting mit einem monoklonalen Antikörper gegen das His(6)-Tag (Clontech) (4a). Dieser Antikörper weist ein Protein von 30 kDa nach, welches von AcA41Lhis, jedoch nicht von AcNPV hergestellt wird, was bestätigt, dass das A41L-Protein von den mit Baculovirus infizierten Zellen exprimiert und sekretiert wurde.
Das A41Lhis-Protein wurde durch Nickelaffinitätschromatographie von mit Baculovirus infizierten Sf21-Zellüberständen gereinigt (4b). A41Lhis wurde durch Färben mit Coomassie Blue als das in Zellüberständen vorherrschende Protein nachgewiesen. Das A41Lhis-Protein wurde selektiv durch Leiten des geklärten Überstands durch die Nickelsäule entfernt. Das gebundene A41Lhis-Protein wurde aus der Säule in steigenden Konzentrationen an Imidazol eluiert, wobei der Großteil des A41Lhis-Proteins in 60 mM Imidazol eluierte. Das eluierte Protein wurde weiterhin durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Mono-Q-Säule und FPLC gereinigt. Das erhaltene gereinigte Protein schien homogen zu sein (Daten nicht gezeigt) und wurde für die Immunisierung von Kaninchen und für die BIAcore 2000-Oberflächenplasmonresonanzanalyse verwendet, wie in Material und Methoden beschrieben wird.
Das A41L-Protein wird von mit VV infizierten Zellen sekretiert. Um das A41L-Protein von VV zu identifizieren und zu charakterisieren, wurde ein Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen mit dem gereinigten A41Lhis-Protein erzeugt und in einem Immunblot verwendet, um das A41L-Protein nachzuweisen, welches von den mit VV infizierten Zellen hergestellt wurde (4). Es wurde ein Protein mit 30 kDa in dem Überstand von Zellen nachgewiesen, welche mit WR, vA41L und vA41L-rev infiziert waren, jedoch nicht bei vΔA41L (5a). Um zu bestimmen, wann dieses Protein während der Infektion produziert wird, wurden die Überstände zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion oder nach einer Infektion in Gegenwart von Cytosinarabinosid (araC), einem Inhibitor der Virus-DNA-Replikation und daher der intermediären und späten Proteinsynthese entnommen (5b). Das A41L-Protein wurde schon 2 h nach der Infektion und in Gegenwart von araC nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass es früh exprimiert wurde. Jedoch wurde das Protein auch spät während der Infektion exprimiert, da die Spiegel weiterhin bis 16 h nach der Infektion anstiegen. Diese frühe und späte Expression ist parallel zu der von vCKBP, welches durch den early/late p7.5-Promotor exprimiert wird, welcher weithin in Pockenvirus-Expressionsvektoren verwendet worden ist (Smith, 1991). Das A41L-Protein besaß bei einer Synthese entweder in Gegenwart von Tunicamycin oder von Monensin eine verringerte Größe, und enthält deshalb sowohl N- als auch O-gebundene Kohlenhydrate (5c).
Das A41L-Protein ist in Orthopoxviren konserviert. Die DNA-Sequenzdaten von Orthopoxvirusgenomen zeigten, dass das A41L-Gen hoch konserviert ist. Dies wurde weiterhin durch Immunoblotting mit Überständen von Zellen untersucht, welche mit 16 Stämmen von VV und 2 Stämmen des Kuhpockenvirus infiziert waren (6). Die Daten zeigen, dass alle diese Viren ein Protein mit ähnlicher Größe, jedoch in unterschiedlichen Mengen exprimieren, welches durch den Anti-A41L-Antikörper erkannt wird.
Das A41L-Protein bindet die CXC-Chemokine Mig und IP-10. Die Ähnlichkeit des A41L-Proteins mit vCKBP deutet darauf hin, dass dieses ähnlich wie vCKBP Chemokine binden könnte. Jedoch zeigten Überstände von mit VV WR infizierten Zellen kein Protein, welches die humanen CC-Chemokine MIP-1α oder RANTES oder die humanen CXC-Chemokine GRO-α und IL-8 bindet. Um zu bestimmen, ob das A41L-Protein an andere Chemokine bindet, welche nicht in dieser Untersuchung enthalten waren, wurden die gereinigten Proteine A41Lhis und 36Khis (vCKBP) mittels EDC auf einem mit NHS aktivierten carboxymethylierten Cellulose-CM5-Biosensorchip in separaten Fließzellen des BIAcore 2000-Systems (Pharmacia) chemisch vernetzt. Die Chipfläche wurde dann unter Verwendung von Ethanolaminhydrochlorid deaktiviert, um ungebundene Proteine zu entfernen. Verschiedene rekombinante humane Chemolockstoffproteine (einschließlich 6 CC-Chemokinen, 6 CXC-Chemokinen, dem C-Chemokin Lymphotactin und dem Komplement C5A-Anaphylatoxin) wurden nacheinander über die Chipfläche in allen Fließzellen geleitet. Es wurde Salzsäure (0,1 M) verwendet, um die Chipfläche jedes Mal zu regenerieren, nachdem ein Chemolockstoffprotein darüber geleitet wurde. Wie erwartet, ergaben die CC-Chemokine MIP-1α und MCP-1 positive Signale mit vCKBP im Vergleich zu A41L oder einer Kontrolle (7b), was bestätigt, dass sie durch vCKBP gebunden wurden, jedoch durch A41L. Bei den CXC-Chemokinen IL-8 und NAP-2 wurde keine Bindung an vCKBP oder A41L beobachtet, jedoch banden sowohl Mig als auch IP-10 spezifisch an A41L (7a). Alle anderen untersuchten Chemokine NAP-2, GRO-α, GRO-γ, PF4, SDF-1α, ENA-78, RANTES, MCP-2, Eotaxin, I-309, Lymphotactin und das Anaphylatoxin C5a wurden nicht von A41L gebunden (Daten nicht gezeigt).
Das A41L-Protein inhibiert die Infiltrierung von Zellen in infizierte Kaninchenhaut
Um zu bestimmen, ob das A41L-Protein die Wirtsreaktion gegenüber einer Infektion mit VV beeinflussen könnte, wurden die Viren vA41L, vΔA41L und vA41L-rev (10⁴ pfu) subkutan in Kaninchenhaut injiziert und die Läsionen wurden 3 Tage später untersucht. Es gab deutliche Unterschiede bei der zellulären Infiltration und dem viralen Antigen zwischen den Läsionen, welche durch das Virus (vΔA41L), welches kein A41L exprimiert und denjenigen, welche A41L exprimieren (vA41L und vA41L-rev), induziert worden waren. Eine Immunfärbung der Läsionen, welche mit vΔA41L infiziert waren, unter Verwendung eines Anti-Kaninchen-CD43-Antikörpers, ergab eine starke Infiltration von CD43⁺-Zellen (rötlich braun gefärbt) in die unteren vaskulären Regionen der Haut im Vergleich mit der bei vA41L und vA41L-rev, welche wenige infiltrierende Zellen aufwiesen. Die Menge des in der Dermis und Epidermis vorliegenden VV-Antigens, deutlich gemacht durch Immunfärbung mit dem monoklonalen Anti-14k-Antikörper, war bei Läsionen, welche durch vA41L und vA41L-rev verursacht waren, intensiver (rötlich braun gefärbt) als bei denen von vΔA41L. Dies zeigt, dass das A41L-Protein die Infiltration von Monozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten während einer antiviralen Immunreaktion in vivo herunterregulieren kann (vermutlich durch Binden und Inhibieren von IP-10 und Mig), und somit eine größere virale Ausbreitung durch die Läsion der Haut ermöglicht. Dies steht im Gegensatz zu dem vΔA41L-Virus, welcher eine verringerte virale Ausbreitung aufwies, wenn er mit einer Immuninfiltration konfrontiert wurde.
Diskussion
Hier wird eine Charakterisierung des Proteins präsentiert, welches durch das VV-Gen A41L codiert wird. Dieses Genprodukt ist ein sekretiertes Glykoprotein mit 30 kDa, welches von allen 18 untersuchten Stämmen des Orthopoxvirus exprimiert wird, und das Gen ist auch in 3 Stämmen des Variolavirus hoch konserviert. Trotz der Konservierung ist das Protein für die VV-Replikation und die Ausbreitung in der Zellkultur nicht erforderlich. Nichtsdestotrotz bindet das A41L-Protein an die CXC-Chemokine Mig und IP-10, jedoch nicht an 15 andere CC- und CXC-Chemokine. In dieser Hinsicht zeigt es eine viel größere Chemokinselektivität als das kürzlich identifizierte vCKBP, mit welchem es eine strukturelle Ähnlichkeit verbindet, welches durcheinander an alle untersuchten CC-Chemokine bindet (Alcami et al., 1998). Hierin nachfolgend wird das A41L-Protein vCKBP-2 genannt, das 35 kDa-Protein des VV-Stamms Lister wird vCKBP-1 genannt.
IP-10 und Mig stellen eine Untergruppe der CXC-Chemokine dar, für einen Überblick siehe Farber, 1997. Sie sind enger miteinander verwandt (37% Aminosäureidentität) als andere CXC-Chemokine, und ihre Expression von Keratinozyten, Endothelialzellen, Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen wird durch IFN-γ induziert (Luster & Ravetch, 1987b; Luster & Ravetch, 1987a; Farber, 1993; Cassatella et al., 1997). IP-10 und Mig unterscheiden sich auch dahingehend von anderen CXC-Chemokinen, dass sie Neutrophile nicht anlocken, sondern anstelle dessen die Migration von Monozyten und aktivierten T-Lymphozyten stimulieren (Taub et al., 1993). Die für IP-10 und Mig codierenden Gene liegen nahe zusammen auf dem Chromosom 4 an einem Lokus, welcher von dem Cluster von anderen CXC-Chemokingenen entfernt ist (Lee & Farber, 1996). Sowohl IP-10 als auch Mig werden durch einen 7-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptor (CXCR3) gebunden, welcher eine größere Selektivität aufweist als einige andere CKRs und welcher insbesondere IP-10 und Mig erkennt, aber nicht andere CXC- und CC-Chemokine (Loetscher et al., 1996). CXCR3 zeigt auch eine Selektivität dahingehend, dass auf er auf T-Zellen nur nach deren Aktivierung exprimiert wird (Loetscher et al., 1996). Diese spezifische Expression deutet auf eine selektive, IFN-α-abhängige Rekrutierung oder Infilitrierung von Effektor-T-Lymphozyten durch Mig und IP-10 hin. Diese Chemokine sind bei der Rekrutierung solcher Zellen in DTH ("delayed-type hypersensitivity")-Hautläsionen bei der tuberkuloiden Lepra (Kaplan et al., 1997), der Hautleishmaniose (Kaplan et al., 1987) und bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen wie etwa Psoriasis (Gottlieb et al., 1988; Gottlieb, 1990) in Verbindung gebracht worden, in welchen hohe IP-10-Expressionsniveaus nachgewiesen wurden. Mig und IP-10 werden mit der Rekrutierung von aktivierten T-Zellen nach einer Virus- oder Protozoeninfektion in Verbindung gebracht (Amichay et al., 1996; Asensio & Campbell, 1997; Cheret et al., 1997; Narumi et al., 1997), und in einigen Situationen können sie zur Pathologie beitragen, z.B. bei einer chronischen Infektion mit dem Hepatitis C-Virus (Narumi et al., 1997). Andere Erkrankungen, bei welchen IP-10 eine ursächliche Rolle bei der Erkrankung spielen kann, sind das ARDS („adult respiratory distress syndrome") (Abdullah et al., 1997), die Lyme-Krankheit (Ebnet et al., 1996), Atherosklerose und Restenose (Wang et al., 1996), Migration, Invasion und Metastasierung von Brustkrebszellen (Youngs et al., 1997), kutane T-Zelllymphome (Sarris et al., 1996) und tubulointerstitielle Nephritis, verbunden mit einer Glomeruluserkrankung (Tang et al., 1997). IP-10 und Mig unterdrücken auch die Produktion von hämatopoietischen Vorläuferzellen (Schwartz et al., 1997), was nach Knochenmarkstransplantationen von Nachteil sein kann.
Als ein löslicher und selektiver Inhibitor von Mig und IP-10 stellt vCKBP-2 eine neue Verbindung dar, welche eine pharmazeutische Bedeutung aufweist als ein selektives Mittel zur Inhibition von übermäßigen entzündlichen Reaktionen und einem Gewebeschaden, induziert durch diese Chemokine. Es kann möglich sein, eine Erkrankung zu verhindern oder zu lindern, welche durch diese Chemokine induziert wird, durch Verabreichung von vCKBP-2 oder davon abstammenden Molekülen. Zusätzlich kann eine Untersuchung der strukturellen Wechselwirkungen von vCKBP-2, komplexiert mit Mig und IP-10, wertvolle Informationen über die Wechselwirkungen dieser Chemokine mit dem zellulären Rezeptor CXCR3 bereitstellen. Diese Informationen würden beim Design von kleinen Inhibitoren zur Blockierung der Wechselwirkung von Mig und IP-10 mit CXCR3 hilfreich sein. Gegenwärtig ist es nicht einfach, diese Ziele durch Manipulation von CXCR3 zu erreichen, aufgrund dessen Membranverbindung und dem Fehlen von löslichen Molekülderivaten, welche die Chemokinbindeaktivität beibehalten.
Die Spezifität von vCKBP-2 ist interessant im Hinblick auf die Biologie von VV und anderen Orthopoxviren, welche dieses Protein exprimieren. Mehrere Orthopoxviren exprimieren auch ein Protein (vCKBP-1), welches an CC-Chemokine bindet und deshalb die Rekrutierung von Monozyten und anderen Zellen, welche durch CC-Chemokine angelockt werden, einschränkt, wie etwa Eosinophile durch Eotaxin (Graham et al., 1997; Smith et al., 1997a; Alcami et al., 1998). Jedoch exprimieren sie kein CXC-Chemokin-bindendes Protein (anders als vCKBP-2, welches Mig- und IP-10-spezifisch ist), welches die Rekrutierung von Neutrophilen hemmen würde. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Rekrutierung von aktivierten T-Zellen, Monozyten und Makrophagen für die Kontrolle und Klärung einer VV-Infektion wichtiger ist als die Rekrutierung von Neutrophilen. Alternativ ist möglich, dass VV einen anderen Mechanismus zum Blockieren der normalen Funktion von Neutrophilen aufweist.
Wir zeigen hier, dass vCKBP-2 die Rekrutierung von Entzündungszellen an Stellen einer VV-Infektion in Kaninchenhaut und das Ausmaß der Virus replikation und das Ausbreiten, wie durch die Menge des Virusantigens gezeigt wird, stark beeinflusst. Dies stimmt überein mit den Beobachtungen, dass eine VV-Infektion die Expression von Mig und IP-10 induziert (Amichay et al., 1996), und dass die Expression von Mig und IP-10 von rekombinantem VV eine Verringerung der VV-Virulenz verursacht (Ramshaw et al., 1997). Die Entfernung des A41L-Gens steigert wahrscheinlich auch die Immunogenität und Sicherheit von VV-Stämmen wie etwa VV MVA, einem sicheren und immunogenen VV-Stamm, welcher entwickelt wird als ein rekombinantes therapeutisches Vakzin gegen verschiedene Krebsarten und eine Reihe von Pathogenen, einschließlich beispielweise Malaria, HPV („human papilloma virus") und dem humanen Immundefizienzvirus (HIV).
Zusammenfassend haben wir ein neues Protein identifiziert, welches von Pockenviren exprimiert wird, welches an die CXC-Chemokine Mig und IP-10 bindet und deshalb in die Reaktion des Wirtes auf die Infektion eingreift. Dieses Molekül, vCKBP-2 genannt, besitzt ein therapeutisches Potenzial als ein Inhibitor bei Erkrankungen, welche durch eine übermäßige Mig- und IP-10-Aktivität induziert werden, und bei Infektionen, welche durch Pathogene induziert werden, welche an CXCR3 binden. Es kann ein nützliches Reagenz für den Nachweis dieser Chemokine in Kits sein, und die Manipulation des codierenden Gens kann die Konstruktion von immunogeneren Vakzinen auf Basis des Pockenvirus ermöglichen.
Referenzen

Abdullah, F., Ovadia, P., Feuerstein, G., Neville, L. F., Morrison, R., Mathiak, G., Whiteford, M., und Rabinovici, R. (1997). "The novel chemokine mob-1: involvement in adult respiratory distress syndrome". Surgery 122, 303–312.
Aguado, B., Selmes, I. P., und Smith, G. L. (1992). "Nucleotide sequence of 21.8 kbp of variola major virus strain Harvey and comparison with vaccinia virus". J. Gen. Virol. 73, 2887–2902.
Alcami, A., und Smith, G. L. (1992). "A soluble receptor for interleukin-1β encoded by vaccinia virus: a novel mechanism of virus modulation of the host response to infection". Cell 71, 153–167.
Alcami, A., und Smith, G. L. (1995a). "Cytokine receptors encoded by poxviruses: a lesson in cytokine biology". Immunol. Today 16, 474–478.
Alcami, A., und Smith, G. L. (1995b). "Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity". J Virol 69, 4633–9.
Alcami, A., Symons, J. A., Collins, P. D., Williams, T. J., und Smith, G. L. (1998). "Blockade of chemokine activity by a soluble chemokine-binding protein from vaccinia virus". J. Immunol. 160, 624–633.
Amichay, D., Gazzinelli, R. T., Karupiah, G., Moench, T. R., Sher, A., und Farber, J. M. (1996). "Genes for chemokines MuMig and Crg-2 are induced in protozoan and viral infections in response to IFN-gamma with patterns of tissue expression that suggest nonredundant roles in vivo". J. Immunol. 157, 4511–4520.
Asensio, V. C., und Campbell, I. L. (1997). "Chemokine gene expression in the brains of mice with lymphocytic choriomeningitis". J. Virol. 71, 7832–7840.
Baggiolini, M., Dewald, B., und Moser, B. (1997). "Human chemokines: an update". Annu. Rev. Immunol. 15, 675–705.
Boyle, D. B., und Coupar, B. E. H. (1988). "A dominant selectable marker for the construction of recombinant poxviruses". Gene 65, 123–128.
Cassatella, M. A., Gasperini, S., Calzetti, F., Bertagnin, A., Luster, A. D., und McDonald, P. P. (1997). "Regulated production of the interferon-gamma-inducible protein-10 (IP-10) chemokine by human neutrophils". Eur. J. Immunol. 27, 111–115.
Cheret, A., Le Grand, R., Caufour, P., Neildez, O., Matheux, F., Theodoro, F., Boussin, F., Vaslin, B., und Dormont, D. (1997). "Chemoattractant factors (IP-10, MIP-1alpha, IL-16) mRNA expression in mononuclear cells from different tissues during acute SIVmac251 infection of macaques". J. Med. Primatol. 26, 19–26.
Cook, D. N., Beck, M. A., Coffman, T. M., Kirby, S. L., Sheridan, J. F., Pragnell, I. B., und Smithies, O. (1995). "Requirement of MIP-1a for an inflammatory response to viral infection". Science 269, 1583–1585.
Czerny, C. P., und Mahnel, H. (1990). "Structural and functional analysis of orthopoxvirus epitopes with neutralizing monoclonal antibodies". J. Gen. Virol. 71, 2341–2352.
D'Souza, M. P., und Harden, V. A. (1996). "Chemokines and HIV-1 second receptors". Nature Medicine 2, 1293–1300.
Devereux, J., Haeberli, P., und Smithies, O. (1984). "A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucl. Acids. Res. 12,387–395.
Ebnet, K., Simon, M. M., und Shaw, S. (1996). "Regulation of chemokine gene expression in human endothelial cells by proinflammatory cytokines and Borrelia burgdorferi". Ann. N. Y. Acad. Sci. 797, 107–117.
Esposito, J. R., Condit, R. C., und Obijeski, J. (1981). "The preparation of orthopoxvirus DNA". J. Virol. Meth. 2, 175–179.
Falkner, F. G., und Moss, B. (1988). "Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors". J. Virol. 62, 1849–1854.
Falkner, F. G., und Moss, B. (1990). "Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses". J. Virol. 64, 3108–3111.
Farber, J. M. (1993). HuMIG: "A new human member of the chemokine family of cytokines". Biochem. Biophys. Res. Com. 192, 223–230.
Farber, J. M. (1997). "Mig and IP-10: CXC chemokines that target lymphocytes". J. Leukoc. Biol. 61, 246–57.
Fauci, A. S. (1996). "Host factors and the pathogenesis of HIV-induced disease". Nature 384, 529–534.
Fenner, F., Anderson, D. A., Arita, I., Jezek, Z., und Ladnyi, I. D. (1988). "Smallpox and Its Eradication". Weltgesundheits organisation, Genf.
Goebel, S. J., Johnson, G. P., Perkus, M. E., Davis, S. W., Winslow, J. P., und Paoletti, E. (1990). "The complete DNA sequence of vaccinia virus". Virology 179, 247–266.
Gottlieb, A. B. (1990). "Immunologic mechanisms in psoriasis". J. Invest. Dermatol. 95, 18S–19S.
Gottlieb, A. B., Luster, A. D., Posnett, D. N., und Carter, D. M. (1988). "Detection of a gamma interferon-induced protein IP-10 in psoriatic plaques". J. Exp. Med. 168, 941–948.
Graham, K. A., Lalani, A. S., Macen, J. L., Ness, T. L., Barry, M., Liu, L., Lucas, A., Clark-Lewis, I., Moyer, R. W., und McFadden, G. (1997). "The T1/35kDa family of poxvirus-secreted proteins bind chemokines and modulate leukocyte influx into virus-infected tissues". Virology 229, 12–24.
Howard, O. M., Ben-Baruch, A., und Oppenheim, J. J. (1996).
"Chemokines: progress toward identifying molecular targets for therapeutic agents". Trends Biotechnol. 14, 46–51.
Howard, S. T., Chan, Y. S., und Smith, G. L. (1991). "Vaccinia virus homologues of the Shope fibroma virus inverted terminal repeat proteins and a discontinuous ORF related to the tumor necrosis factor receptor family". Virology 180, 633–647.
Hughes, S. J., Johnston, L. H., de Carlos, A., und Smith, G. L. (1991). "Vaccinia virus encodes an active thymidylate kinase that complements a cdc8 mutant of Saccharomyces cerevisiae". J. Biol. Chem. 266, 20103–20109.
Johnson, G. P., Goebel, S. J., und Paoletti, E. (1993). "An update on the vaccinia virus genome". Virology 196, 381–401.
Kaplan, G., Luster, A. D., Hancock, G., und Cohn, Z. A. (1987). "The expression of a gamma interferon-induced protein (IP-10) in delayed immune responses in human skin". J. Exp. Med. 166, 1098–1108.
Kerr, S. M., und Smith, G. L. (1991). "Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virus replication: recovery of plasmids from virus-infected cells". Virology 180, 625–632.
Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature 227, 680–685.
Lalani, A. S., Graham, K., Mossman, K., Rajarathnam, K., Clark-Lewis, I., Kelvin, D., und McFadden, G. (1997). "The purified myxoma virus gamma interferon receptor homolog M-T7 interacts with the heparin-binding domains of chemokines". J. Virol. 71, 4356–4363.
Lee, H. H., und Farber, J. M. (1996). "Localization of the gene for the human MIG cytokine on chromosome 4q21 adjacent to INP10 reveals a chemokine "mini-cluster". Cytogenet. Cell Genet. 74, 255–258.
Loetscher, M., Gerber, B., Loetscher, P., Jones, S. A., Piali. L., Clark-Lewis, I., Baggiolini, M., und Moser, B. (1996). "Chemokine receptor specific for IP10 and MIG: structure, function, and expression in activated T-lymphocytes". J. Exp. Med. 184, 963–969.
Luster, A. D., und Ravetch, J. V. (1987a). "Biochemical characterization of a gamma interferon-inducible cytokine (IP-10)". J. Exp. Med. 166, 1084–1097.
Luster, A. D., und Ravetch, J. V. (1987b). "Genomic characterization of a gamma-interferon-inducible gene (IP-10) and identification of an interferon-inducible hypersensitive site". Mol. Cell. Biol. 7, 3723–3731.
Mackett, M., und Smith, G. L. (1982). "Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415–7419.
Mackett, M., Smith, G. L., und Moss. B. (1985). "The construction and characterization of vaccinia virus recombinants expressing foreign genes". In "DNA Cloning: A Practical Approach". (D. M. Glover, Ed.), Vol. 2, pp. 191–211. IRL Press, Oxford.
Martinez-Pomares, L., Thompson, J. P., und Moyer, R. W. (1995). "Mapping and investigation of the role in pathagenesis of the major unique secreted 35-kDa protein of rabbitpox virus". Virology 206, 591–600.
Massung, R. F., Liu, L., Qi, J., Knight, J. C., Yuran, T. E., Kerlavage, A. R., Parsons, J. M., Venter, J. C., und Esposito, J. J. (1994). "Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975". Virology 201, 215–240.
McFadden, G., Graham, K., Ellison, K., Barry, M., Macen, J., Schreiber, M., Mossman, K., Nash, P., Lalani, A., und Everett, H. (1995). Interruption of cytokine networks by poxviruses: lessons from myxoma virus". J. Leukocyte Biol. 57, 731–738.
Moss, B. (1991). "Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development". Science 252, 1662–1667.
Moss, B. (1996). "Poxviridae: the viruses and their replication". In "Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley, Eds.), pp. 2637–2671. 2 vols. Lippincott Raven Press, New York.
Mossman, K., Nation, P., Macen, J., Garbutt, M., Lucas, A., und McFadden, G. (1996). "Myxoma virus M-T7, a secreted homolog of the interferon-gamma receptor, is a critical virulence factor for the development of myxomatosis in European rabbits". Virology 215, 17–30.
Murphy, P. M. (1996). "Chemokine receptors: structure, function and role in microbial pathogenesis". Cyt. Growth Fact. Revs. 7, 47–64.
Narumi, S., Tominaga, Y., Tamaru, M., Shimai, S., Okumura, H., Nishioji, K., Itoh, Y., und Okanoue, T. (1997). "Expression of IFN-inducible protein-10 in chronic hepatitisy". J. Immunol. 158, 5536–5544.
Parkinson, J. E., und Smith, G. L. (1994). "Vaccinia virus gene A36R encodes a M_r 43–50 K protein on the surface of extracellular enveloped virus. Virology 204, 376–390.
Patel, A. H., Gaffney, D. F., Subak-Sharpe, J. H., und Stow, N. D. (1990). "DNA sequence of the gene encoding a major secreted protein of vaccinia virus, strain Lister". J. Gen. Virol. 71, 2013–2021.
Premack, B. A., und Schall, T. J. (1996). "Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection". Nature Medicine 2, 1174–1178.
Ramshaw, I. A., Ramsay, A. J., Karupiah, G., Rolph, M. S., Mahalingam, S., und Ruby, J. C. (1997). "Cytokines and immunity to viral infections". Immunol. Revs. 159, 119–135.
Rose-John, S., und Heinrich, P. C. (1994). "Soluble receptors for cytokines and growth factors: generation and biological function". Biochem. J. 300, 281–290.
Sarris, A. H., Daliani, D., Ulmer, R., Crow, M., Broxmeyer, H. E., Pugh, W., Reiss, M., Cabanillas, F., Deisseroth, A. B., und Duvic, M. (1996). "Interferon-inducible protein-10 and the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas". Leuk. Lymphoma 24, 103–110.
Schwanz, G. N., Liao, F., Gress, R. E., und Farben, J. M. (1997). "Suppressive effects of recombinant human monokine induced by IFN-gamma (rHuMig) chemokine on the number of committed and primitive hemopoietic progenitors in liquid cultures of CD34+ human bone marrow cells". J. Immunol. 159, 895–904.
Sekido, N., Mukaida, N., Harada, A., Nakanishi, I., Watanabe, Y., und Matsushima, K. (1993). "Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8". Nature 365, 654–657.
Shchelkunov, S. N. (1995). "Functional organization of variola major and vaccinia virus genomes". Virus Genes 10, 53–71.
Shchelkunov, S. N., Blinov, V. M., Resenchuk, S. M., Totmenin, A. V., Olenina, L. V., Chirikova, G. B., und Sandakhchiev, L. S. (1994). "Analysis of the nucleotide sequence of 53 kbp from the right terminus of the genome of variola virus strain India-1967". Virus Res. 34, 207–236.
Smith, C. A., Smith, T. D., Smolak, P. J., Friend, D., Hagen, H., Gerhart, M., Park, L., Pickup, D. J., Torrance, D., Mohler, K., Schooley, K., und Goodwin, R. G. (1997a). "Poxvirus genomes encode a secreted, soluble protein that preferentially inhibits β chemokine activity yet lacks sequence homology to known chemokine receptors". Virology 236, 316–327.
Smith, G. L. (1991). "Vaccinia virus vectors for gene expression". Curr. Opin. Biotechnol. 2, 713–717.
Smith, G. L. (1996). "Virus proteins that bind cytokines, chemokines or interferons". Curr. Opin. Immunol. 8, 467–471.
Smith, G. L., Alcami, A., und Symons, J. A. (1997b). "Poxvirus chemokinebinding protein". Britische Patentanmeldung Nr: 9703592.7.
Smith, G. L., Chan, Y. S., und Howard, S. T. (1991). "Nucleotide sequence of 42 kbp of vaccinia virus strain WR from near the right inverted terminal repeat". J. Gen. Virol. 72, 1349–1376.
Smith, G. L., Symons, J. A., Khanna, A., Vanderplasschen, A., und Alcami, A. (1997c). "Vaccinia virus immune evasion". Immunol. Revs. 159, 137–154.
Southern, E. (1975). "Detection of specific DNA sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". J. Mol. Biol. 98, 503–517.
Spriggs, M. K. (1996). "One step ahead of the game: viral immunomodulatory molecules". Annu. Rev. Immunol. 14, 101–130.
Tang, W. W., Qi, M., Warren, J. S., und Van, G. Y. (1997). "Chemokine expression in experimental tubulointerstitial nephritis". J. Immunol. 159, 870–876.
Taub, D. D., Lloyd, A. R., Conlon, K., Wang, J. M., Ortaldo, J. R., Harada, A., Matsushima, K., Kelvin, D. J., und Oppenheim, J. J. (1993). "Recombinant human interferon-inducible protein 10 is a chemoattractant for human monocytes and T lymphocytes and promotes T cell adhesion to endothelial cells". J. Exp. Med. 177, 1809–1814.
Towbin, H., Staehelin, T., und Gordon, J. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 4350–4354.
Upton, C., DeLange, A. M., und McFadden, G. (1987). "Tumorigenic poxviruses: genomic organisation and DNA sequence of the telomeric region of the Shope fibroma virus genome". Virology 160, 20–30.
Upton, C., Mossman, K., und McFadden, G. (1992). "Encoding of a homolog of the IFN-gamma receptor by myxoma virus". Science 258, 1369–1372.
Wang, X., Yue, T. L., Ohlstein, E. H., Sung, C. P., und Feuerstein, G. Z. (1996). "Interferon-inducible protein-10 involves vascular smooth muscle cell migration, proliferation, and inflammatory response". J. Biol. Chem. 271, 24286–93.
Youngs, S. J., Ali, S. A., Taub, D. D., und Rees, R. C. (1997).
"Chemokines induce migrational responses in human breast carcinoma cell lines". Int. J. Cancer 7l, 257–266.

Legende der Figuren
1. Anordnung der Aminosäuresequenzen des A41L-Proteins von VV WR (Smith et al., 1991), vCKBP von VV Lister (Patel et al., 1990), erzeugt unter Verwendung der Programme PILEUP und PRETTYPLOT der Genetics Computer Group Inc. Wisconsin (Devereux et al., 1984). Die Aminosäuren in Kästchen sind zwischen beiden Proteinen konserviert. Die 8 konservierten Cysteinreste nach dem N-terminalen Signalpeptid sind mit einem Punkt gekennzeichnet.
2. Hydrophobieplots der Proteine A41L von VV WR (Smith et al., 1991) und vCKBP (Patel et al., 1990), erzeugt mit dem GCG-Paket (Devereux et al., 1984). Die Regionen zwischen den vertikalen Linienpaaren von vCKBP stellen Regionen dar, welche beim A41L-Protein fehlen.
3. Southern Blot-Analyse von rekombinanten Virusgenomen. (a) Diagramm, welches die vorhergesagten Strukturen der Virusgenome zeigt, die Größen des EcoRV-Fragments, welches das A41L-Gen bei unterschiedlichen Viren umspannt und die Positionen zwischen den zwei Sonden, welche für Southern Blotting verwendet wurden. (b) Southern Blot. Virus-DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRV verdaut, auf einem 0,8%-igen Agarosegel aufgetrennt, auf Nylonfilter übertragen und mit Fluorescein-markierten DNA-Sonden sondiert, welche von den Regionen stammen, die in (a) angegeben sind. Gebundene Sonden wurden nachgewiesen, wie es in Material und Methoden beschrieben wird. Es sind die Größen der Nukleotidbanden angegeben, welche mit den zwei Sonden nachgewiesen wurden.
4. Expression und Reinigung des A41L-Proteins. (a) Immunoblot. Proteine in den Überständen von mit AcA41Lhis (Klone 1 und 2) infizierten Sf21-Zellen wurden durch SDS-PAGE (10% Gel) aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einem Kaninchen-Antiserum gegen das A41L-Protein sondiert. (b) Ein Mit Coomassie gefärbtes Gel, welches die Reinigung des A41Lhis-Proteins durch Nickelchelat-Affinitätschromatographie zeigt. Die im unbehandelten Überstand vorliegenden Proteine werden verglichen mit den Proteinen im Durchfluss nach der Anwendung der Nickelsäule und mit Proteinen, welche in steigenden Konzentrationen von Imidazol eluieren. Die Größen der Proteinmolekularmassenmarker sind in kDa angezeigt.
5. Immunblots, welche eine Charakterisierung des von VV WR erzeugten A41L-Proteins zeigen. (a) BS-C-1-Zellen wurden mit den angegebenen Viren mit 10 pfu/Zelle infiziert oder zum Schein infiziert, und die Überstände wurden 16 h nach Infektion hergestellt. Nach einer Auftrennung durch SDS-PAGE (10% Gel) und einem Transfer auf Nitrocellulose wurden die Blots mit Kaninchen-Antiserum gegen das A41L-Protein inkubiert und gebundener Antikörper wurde nachgewiesen, wie es in Material und Methoden beschrieben wird. (b) Das A41L-Protein wird früh und spät während der Infektion hergestellt. Die Zellen wurden mit WR-Virus für die angegebene Zeitdauer infiziert oder in Gegenwart von 40 μg/ml araC infiziert oder zum Schein infiziert. Die Überstände wurden hergestellt und analysiert wie in (a). (c) Das A41L-Protein enthält N- und O-gebundene Kohlenhydrate. Die Zellen wurden mit dem WR-Virus mit oder ohne Monensin (1 μM) oder Tunicamycin (1 μg/ml) für 16 h infiziert. Die Überstände wurden hergestellt und analysiert wie in (a). Die Größen der Proteinmolekularmassemarker sind in kDa angegeben.
6. Das A41L-Protein ist in Orthopoxviren konserviert. BS-C-1-Zellen wurden mit den angegebenen Viren infiziert oder zum Schein infiziert und die Überstände wurden 16 h nach Infektion präpariert, wie es in Material und Methoden beschrieben wird. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE (10% Gel) analysiert, auf Nitrocellulose übertragen und mit dem Kaninchen-Antiserum gegen das A41L-Protein sondiert. Gebundener Antikörper wurde wie in Material und Methoden beschrieben nachgewiesen. Die Größen der Proteinmolekularmassemarker sind in kDa angegeben.
7. BIAcore 2000-Analyse. Gereinigte A41Lhis- oder vCKBP-Proteine wurden in getrennten Fließzellen immobilisiert und die Bindung der angegebenen Chemokine wie in Material und Methoden beschrieben analysiert. Die Kontrolle stellt eine dritte Fließzelle dar, in welcher kein Protein an die Chipfläche gekoppelt war. (a) CXC-Chemokine. (b) CC-Chemokine. Es werden Sensorgramme gezeigt.
8. Die Nukleotidsequenz des A41L-Gens und flankierende Sequenzen des VV-Stamms WR (Smith et al., 1991). Die codierende Region des A41L-Gens beginnt an Position 121 und endet an Position 780.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombiantes Pockenvirus, welches genetisch so verändert ist, dass es kein natives Chemokin-bindendes A41L-Protein exprimieren kann, worin das Protein die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein Protein umfasst, welches mit dieser eine mindestens 80%ige Aminosäuresequenzidentität aufweist.
Rekombiantes Pockenvirus nach Anspruch 1, worin das Protein eine mindestens 95%ige Aminosäuresequenzidentität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist.
Rekombiantes Pockenvirus nach Anspruch 1 oder 2, worin das gesamte oder eine wesentlicher Teil des Gens für das native A41L-Protein entfernt worden ist.
Rekombiantes Pockenvirus nach Anspruch 3, welches ein genetisch verändertes Vaccinia-Virus ist.
Rekombiantes Pockenvirus nach Anspruch 4, worin das für das native A41L-Protein codierende Gen die Nukleotidsequenz umfasst, welche in 8 gezeigt ist, beginnend bei dem ATG an Position 121.
Medikament umfassend das rekombinante Pockenvirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe.