DE69835438T2

DE69835438T2 - Photo-empfindlichkeit-erhöhende konjugate zur targeting von pathogene

Info

Publication number: DE69835438T2
Application number: DE69835438T
Authority: DE
Inventors: Tayyaba Arlington HASAN; R. Michael Revere HAMBLIN; Nikos Revere SOUKOS
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2018-02-28
Also published as: WO1998039011A1; AU6676798A; EP1017397A1; KR20000076016A; CN1255063A; ATE334676T1; CA2283868C; EP1017397A4; AU737574B2; JP2001513819A; US7268155B2; US20020183245A1; DE69835438D1; EP1017397B1; CA2283868A1; US6462070B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Konjugat, das einen Photosensibilisator und eine Zielsteuerungsgruppierung beinhaltet, sowie Verfahren zur Verwendung des Konjugats.
Hintergrund der Erfindung
Infektiöse Erkrankungen bleiben ein ungelöstes Problem, im wesentlichen bedingt durch das Erscheinen mehrfach antibiotikaresistenter Stämme von Bakterien, neu entdeckter viraler Erkrankungen und der Ausbreitung von Pilz- und Protozoenerkrankungen.
Die fortgeschrittene parodontale Erkrankung ist eine aus der großen Anzahl oraler infektiöser Erkrankungen, und sie ist der Hauptgrund von Zahnverlust bei den über 30-Jährigen. Parodontale Erkrankungen entstehen aus der Wechselwirkung zwischen Bakterienzellen und deren Produkten in dentalen Plaques und dem Abwehrmechanismus des Wirts (Antczak-Bonckoms, A., (1994), J. Dent. Educ. 58: 625-640). Die derzeitigen Behandlungen stützen sich oft auf die mechanische Entfernung von Plaque und Bakterien, was ineffizient sein kann (Unsal E. et al., (1995), J. Periodontol. 66: 47-51), oder auf antibiotische Therapie, die zu bakterieller Resistenz führen kann (Olsvik, B et al., (1995), J. Clin. Penodontol. 22: 391-396).
Die photodynamische Therapie (PDT) ist als ein attraktives Verfahren vorgeschlagen worden, um Mundbakterien und Bakterien in topischen und gastrointestinalen Infektionen zu eliminieren, da diese Stellen einer Beleuchtung relativ zugänglich sind. Beispielsweise kann Faseroptik verwendet werden, um Licht in die dentale Tasche zu übertragen (Wilson, M, (1993), J. Appl. Bacteriol. 75: 299-306).
Die WO 91/09631 offenbart ein Verfahren zur photodynamischen Inaktivierung von Viren mit einer Membranhülle. Das Verfahren verwendet substituierte Sapphyrin-Verbindungen, um eine virale Inaktivierung während der Bestrahlung mit Licht zu erreichen.
Die WO 92/14493 offenbart ein nicht-proteinisches intrazelluläres Bindemolekül, das über ein Linker-Molekül an therapeutische und diagnostische Mittel konjugiert ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfinder hat entdeckt, dass Klassen von Molekülen, die bislang nicht als Zielsteuerungs-Gruppierungen für Photosensibilisatoren verwendet wurden, verwendet werden können, um eine Zielsteuerung von Photosensibilisatoren zu verwirklichen.
Entsprechend betrifft die Erfindung ein Konjugat-Molekül, welches einen Photosensibilisator umfasst, der an eine Gruppierung mit einem nicht-paarbildenden Element (Nicht-Paar-Element, NPM) gekoppelt ist, die Affinität für einen Zielorganismus besitzt, wobei das nicht-paarbildende Element ein Polypeptid ist.
Die zielsteuernde Gruppierung (der zielsteuernde Rest) kann ein lineares, verzweigtes oder zyklisches Polypeptid sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein kleines antimikrobielles Peptid (SAMP). Histatine, Defensine, Cecropine, Magainine, Gram-positive Bacteriocine und Peptidantibiotika können SAMPs sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein bakterielles, pilzliches, tierisches, z.B. aus Säugern stammendes, z.B. menschliches, SAMP oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein Defensin oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon. Beispielsweise kann das Defensin folgendes sein: ein humanes Defensin, z.B. HNP-1, -2, -3 oder -4; ein Meerschweinchen-Defensin, z.B. GPNP, ein Kaninchen-Defensin, z.B. Kaninchen NP-1, -2, -3A, -3B oder 5; ein Ratten-Defensin, z.B. Ratten-NP-1, -2, -3 oder -4; murines Cryptin; Bactenecin oder Indolicidin aus Rinder-Granulozyten; oder Plasmin aus Rindersperma.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein SAMP mit Ursprung aus Insekten oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon, z.B. ein Cecropin aus Cecropia-Motten, Hummeln, Fruchtfliegen oder anderen Insekten, ein Apidaecin aus Honigbienen oder ein Adropin aus Fruchtfliegen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein SAMP mit Ursprung aus Amphibien oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon, z.B. ein Magainin, ein PGLA, ein XPF, ein LPF, ein CPG, ein PGQ, ein Bombinin, ein Bombinin-artiges Peptid BLP-1, -2, -3 oder -4, oder ein Brevinin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein SAMP aus einem Invertebraten oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon, z.B. Tachyplesin I, II oder III oder Polyphemusin I oder II aus dem Pfeilschwanzkrebs. Bei bevorzugten Ausführungsformen stammt die zielsteuernde Gruppierung aus einem Fisch, z.B. Pardaxin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Bacteriocin, bevorzugter ein Gram-positives Bacteriocin oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon, z.B. ein Nisin, ein Subtilin, Epidermin, Gallidermin, Salivarin oder ein Lacticin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein Peptid-Antibiotikum oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon, z.B. ein Tyrocidin oder ein Bacitracin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein Histatin oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon, z.B. Histatin-1 bis -8, bevorzugt Histatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung die Histatin-5-Reste 13-24 oder entsprechende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein Histatin-Molekül, das hergestellt wurde, um eine innere Duplikation zu beinhalten.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein Polypeptid mit einer Affinität für ein Polysaccharid-Ziel, z.B. ein Lektin. Dabei kann das Lektin beispielsweise ein Lektin aus Samen, Bohnen, Wurzeln, aus Rinde/Borke, aus Algen/Tang, aus Pilzen, Bakterien oder Invertebraten sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die zielsteuernde Gruppierung ein Pflanzenpolypeptid, z.B. ein Lektin aus Jackbohne, z.B. Concanavalin A oder ein Lektin aus einer Linse, Lens culinaris.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Speichel-Polypeptid oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon. Beispiele für Speichelpolypeptide sind die Histatine, z.B. Histatin-1 bis -8, oder, bevorzugter, Histatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung die Histatin-5-Reste 13-24 oder entsprechende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatinmolekül, das so hergestellt wurde, dass es eine interne Duplikation beinhaltet.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Gramnegatives Bacteriocin, z.B. Colicin B, Colicin E1 oder Colicin Ia.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung bakteriell entwickeltes Polypeptid, z.B. Nisin, Subtilin, Epidermin, Gallidermin, Salivarin oder Lacticin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerugsgruppierung ein Molekül, z.B. ein Peptid, das etwas anderes ist als ein Antikörper oder eines von beiden Elementen eines Rezeptor-Liganden-Paars.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Peptid, bei dem wenigstens 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% der Aminosäurereste einem Aminosäurerest angehören, z.B. einem positiv geladenen Aminosäurerest, z.B. einem Lysinrest, einem Argininrest oder einem Ornithinrest. Besonders bevorzugte Zielsteuerungsgruppierungen sind Polyaminosäuren, z.B. Polylysin, Polyarginin oder Polyornithin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsteuerungsgruppierung wie folgt beschaffen: sie ist kationisch; sie besitzt eine positive Nettoladung von +1, +2 oder +3 pro Molekül; sie besitzt eine positive Nettoladung größer oder gleich +4; sie beinhaltet einen positiv geladenen Aminosäurerest, z.B. Lysin; sie beinhaltet wenigstens 2, 3, 4 oder mehr positiv geladene Aminosäurereste, z.B. einen Lysin-, Arginin- oder Ornithinrest.
Bei anderen Ausführungsformen ist die Zielsteuerungsgruppierung wie folgt beschaffen: sie ist anionisch; sie besitzt eine negative Nettoladung von -1, -2 oder -3 pro Molekül; sie besitzt eine negative Nettoladung größer oder gleich -4; sie beinhaltet einen negativ geladenen Aminosäurerest, z.B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure; sie beinhaltet wenigstens 2, 3, 4 oder mehr negativ geladene Aminosäurereste, z.B. Glutaminsäure; sie beinhaltet wenigstens 10, 20, 30, 40 oder 50% oder mehr negativ geladene Aminosäurereste, z.B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsteuerungsgruppierung wie folgt beschaffen: sie ist etwa neutral in der Ladung; sie beinhaltet wenigstens 50, 60, 70, 80 oder 90% Aminosäurereste, die neutrale Aminosäurereste sind, wie etwa Serin, Threonin, Alanin, Methionin, Cystein oder Valin.
Bei bevorzugten Ausführungsformen besitzt die Zielsteuerungsgruppierung ein Molekulargewicht von mehr als 1200, 1800, 2400, 3000, 6000, 10.000, 25.000, 50.000, 100.000 oder 200.000 Dalton. Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zielsteuerungsgruppierung ein Molekulargewicht von weniger als 250.000, 150.000, 60.000, 25.000, 10.000, 8.000 oder 6.000 Dalton. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beträgt das Molekulargewicht der Zielsteuerungsgruppierung zwischen 300 und 1.800, 600 und 2.400, 1.200 und 6.000, 5.000 und 8.000, 8.000 und 15.000, 15.000 und 30.000, 35.000 und 70.000, 70.000 und 150.000 oder 150.000 und 300.000 Dalton.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Peptid von mindestens 3, 6, 12, 18, 24, 30, 60, 100, 250, 500, 1.000 oder 2.500 Resten Länge. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsteuerungsgruppierung ein Peptid von weniger als 3.000, 1.500, 700, 300, 150, 100, 80, 60, 40, 30 oder 15 Resten Länge. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Peptid zwischen 6 und 15, 12 und 18, 18 und 30, 20 und 40, 30 und 60, 80 und 120, 150 und 300, 300 und 600, 800 und 1.200, oder 2.000 und 3.000 Resten Länge.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Protein, das eine Pore in der Petmeabilitätsbarriere des Zielorganismus ausbildet, z.B. in Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Leishmania donovani oder Giardia lamblia.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Lipoprotein niedriger Dichte, ein Lipoprotein hoher Dichte oder ein Lipoprotein sehr niedriger Dichte.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsteuerungsgruppierung unter Verwendung eines Oberflächenmoleküls des Zielorganismus über Affinitätsselektion oder -Screen ausgewählt bzw. selektiert worden, z.B. ist die zielsteuernde Gruppierung in einer chemischen Bibliothek oder einer Phage Display-Bibliothek selektiert worden.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polylysin-Molekül. Das Polylysin kann zwischen 6 und 15, 12 und 18, 18 und 30, 20 und 40, 30 und 60, 80 und 120, 150 und 300, 300 und 600, 800 und 1.200 oder 2.000 und 3.000 Resten Länge aufweisen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polypeptid, z.B. eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, um deren Ladung zu verändern, z.B. die Ladung von Seitenketten eines oder mehrerer Aminosäurereste der Polyaminosäure. Beispielsweise können eine oder mehrere, oder ungefähr 10, 25, 50, 75, 90 oder 100% der geladenen Seitenketten modifiziert werden. Mit „modifiziert" ist gemeint, dass eine negative Seitenkette, z.B. eine Glutaminsäure- oder eine Asparaginsäure-Seitenkette, in ihrer Ladung positiv oder neutral gemacht wird, bzw. dass eine positiv geladene Seitenkette, z.B. die Seitenkette von Lysin, Arginin oder Ornithin, negativ oder neutral in der Ladung gemacht wird. Beispielsweise können eine oder mehrere der Seitenketten von Polylysin in ihrer Ladung neutral oder negativ gemacht werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist es z.B. so, dass der Photosensibilisator Singulett-Sauerstoff bei Absorption elektromagnetischer Strahlung des richtigen Energieniveaus und der richtigen Wellenlänge produziert; dass der Photosensibilisator ein Porphyrin oder Porphyrinderivat beinhaltet; dass der Photosensibilisator Chlorin e6 oder ein Chlorin-Derivat beinhaltet.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat weiterhin ein Rückgrat-Element. Bei solchen Ausführungsformen wird das Rückgrat sowohl an einen Photosensibilisator als auch an eine zielsteuernde Gruppierung gekoppelt. Das Rückgrat kann außerdem selbst eine zielsteuernde Gruppierung, z.B. Polylysin, sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Konjugatmolekül Affinität für einen Zielorganismus. Der Zielorganismus kann z.B. folgendes sein: ein Mikroorganismus, z.B. eine Bakterienzelle, eine Pilzzelle, eine Protozoenzelle, eine Zelle von Pneumocystis carinii; ein Virus oder ein parasitärer Wurm; oder ein Arthropode.
Bei bevorzugten Ausfühnungsformen, bei denen die Zelle eine Bakterienzelle ist, kann die Bakterienzelle folgendes sein: eine Zelle von Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Escherichia, Erwinia, Klebsiella, Borrelia, Treponema, Campylobacter, Helicobacter, Bordetella, Neisseria, Legionella, Leptospira, Serpulina, Mycoplasma, Bacteroides, Klebsiella, Yersinia, Chlamydia, Vibrio, Actinobacillus, Porphyria, Haemophilus, Pasteurella, Peptostreptococcus, Listeria, Propionibacterium, Mycobacterium, Corynebacterium oder Dermatophilus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen die Zelle eine Pilzzelle ist, kann die Zelle eine Zelle von Candida oder Aspergillus sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Organismus Pneumocystis carinii.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Zielorganismus eine Protozoenzelle ist, ist die Zelle eine Zelle von Entamoeba, Toxoplasma, Giardia, Leishmania, Cryptosporidium oder eine Schistosoma.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Zielorganismus ein Virus ist, ist das Virus ein HIV-Virus, ein HTLV-Virus, ein Hepatitisvirus, ein Influenzavirus, ein Rhinovirus, ein Papillomavirus, ein Masernvirus, ein Herpesvirus, ein Rotavirus, ein Parvovirus, ein Psittakose-Virus oder ein Ebolavirus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Zielorganismus ein Arthropode ist, ist der Arthropode eine parasitäre Milbe.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Zielorganismus ein Wurm ist, ist der Wurm ein Nematode oder ein Trematode.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Zielorganismus eine orale Bakterienart, z.B. Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Konjugat-Molekül, das einen Photosensibilisator, der mit einem Zielsteuerungspeptid mit einem nicht-paarbildenden Element (Nicht-Paar-Element, NPM) gekoppelt ist, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger beinhaltet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Konjugat-Molekül, das einen Photosensibilisator beinhaltet, der mit einem Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt ist, die eine Nicht-Paar-Element (NPM)-Polypeptidgruppierung beinhaltet, die Affinität für eine orale Bakterienspezies besitzt.
Die Zielsteuerungsgruppierung kann ein lineares, verzweigtes oder zyklisches Polypeptid sein.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polylysin-Molekül. Das Polylysin kann zwischen 6 und 15, 12 und 18, 18 und 30, 20 und 40, 30 und 60, 80 und 120, 150 und 300, 300 und 600, 800 und 1.200 oder 2.000 und 3.000 Reste lang sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polypeptid, z.B. eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, um ihre Ladung zu verändern, z.B. die Ladung von Seitenketten eines oder mehrerer Aminosäurereste der Polyaminosäure. Beispielsweise können ein oder mehrere, oder ungefähr 10, 25, 50, 75, 90 oder 100% der geladenen Seitenketten modifiziert werden. Mit „modifiziert" ist gemeint, dass eine negative Seitenkette, z.B. eine Glutaminsäure- oder eine Asparaginsäure-Seitenkette, in ihrer Ladung positiv oder neutral gemacht wird, bzw. dass eine positiv geladene Seitenkette, z.B. die Seitenkette von Lysin, Arginin oder Ornithin, negativ oder neutral in der Ladung gemacht wird. Beispielsweise können eine oder mehrere der Seitenketten von Polylysin in ihrer Ladung neutral oder negativ gemacht werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist es z.B. so, dass der Photosensibilisator Singulett-Sauerstoff bei Absorption elektromagnetischer Strahlung des richtigen Energieniveaus und der richtigen Wellenlänge produziert; dass der Photosensibilisator ein Porphyrin oder Porphyrinderivat beinhaltet; dass der Photosensibilisator Chlorin e6 oder ein Chlorin-Derivat beinhaltet.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat weiterhin ein Rückgrat-Element. Bei solchen Ausführungsformen wird das Rückgrat sowohl an einen Photosensibilisator als auch an eine zielsteuernde Gruppierung gekoppelt. Das Rückgrat kann außerdem selbst eine zielsteuernde Gruppierung, z.B. Polylysin, sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat Chlorin e6, das an Polylysin konjugiert ist, z.B. 1 oder 2 bis 20 Chlorin e6-Moleküle, die an ein Polylysin mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 1.000 bis 3.000 konjugiert sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat Chlorin e6, konjugiert an ein Histatin-Polypeptid oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon, z.B. 1 oder 2 bis 4 Chlorin e6-Moleküle, die an ein Histatin-5-Polypeptid konjugiert sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat Chlorin e6 und ein Histatin-Polypeptid oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon, konjugiert an ein Polylysin-Rückgrat, z.B. entweder mit ein bis vier Polylysinketten (MW 1.000 bis 3.000 Dalton, jeweils enthaltend 1 oder 2 bis 20 Chlorin e6-Moleküle), die mit einem Histatin-5-Polypeptid verbunden sind, oder mit einem bis vier Histatin-5-Polypeptiden, die mit einer Polylysinkette (MW 1.000 bis 3.000) verbunden sind und 1 oder 2 bis 16 Chlorin e6-Moleküle enthalten.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Zielorganismus eine orale Bakterienspezies, z.B. Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Speichelpolypeptid oder ein aktives Fragment oder Analoges hiervon. Beispiele von Speichelpolypeptiden sind die Histatine, z.B. Histatin-1 bis -8, oder, bevorzugter, Histatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung die Histatin 5-Reste 13-24 oder entsprechende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatinmolekül, das künstlich erzeugt wurde, um eine innere Duplikation zu beinhalten.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts gegen eine Erkrankung, die durch die Anwesenheit eines nicht gewünschten Organismus charakterisiert ist. Das Verfahren beinhaltet: Verabreichen eines Konjugats an das Subjekt, wobei das Konjugat einen Photosensibilisator beinhaltet, der an eine NPM-Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt ist, z.B. ein hier beschriebenes Konjugat; Bestrahlen des Subjekts mit Energie einer Wellenlänge, die geeignet ist, um einen zytotoxischen Effekt durch den Photosensibilisator zu erzeugen; dadurch Behandeln des Subjekts im Hinblick auf die Krankheit, die durch die Anwesenheit eines unerwünschten Organismus charakterisiert ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen kann der unerwünschte Organismus beispielsweise folgendes sein: ein Mikroorganismus, z.B. eine Bakterienzelle, eine Pilzzelle, eine Protozoenzelle, eine Zelle von Pneumocystis carinii, ein Virus, oder ein parasitärer Wurm oder ein Arthropode.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der unerwünschte Organismus eine Bakterienzelle ist, kann die Bakterienzelle folgendes sein: eine Zelle von Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Escherichia, Erwinia, Klebsiella, Borrelia, Treponema, Campylobacter, Helicobacter, Bordetella, Neisseria, Legionella, Leptospira, Serpulina, Mycoplasma, Bacteroides, Klebsiella, Yersinia, Chlamydia, Vibrio, Actinobacillus, Porphyria, Haemophilus, Pasteurella, Peptostreptococcus, Listeria, Propionibacterium, Mycobacterium, Corynebacterium oder Dermatophilus.
Bei bevorzugteren Ausführungsformen kann die Bakterienzelle eine Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis, eine Bacteroides-Spezies, einschließlich B. gingivalis (nun bekannt als Porphyromonas gingivalis), Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wolinella recta, eine Eubacterium-Spezies, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Bacteroides forsythus, eine Capnocytophaga-Spezies, Actinobacillus actinomycetamcomitans und Streptococcus mutans sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen die Bakterienzelle eine Treponema-Zelle ist, ist die Erkrankung Gingivitis ulcerativa necroticans, Frambösie oder Pinta. Bei anderen Ausführungsformen ist die Erkrankung Impetigo oder zystische Akne.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der unerwünschte Organismus eine Pilzzelle ist, kann die Zelle eine Candida- oder eine Aspergillus-Zelle sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Organismus Pneumocystis carinii.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, wo der unerwünschte Organismus eine Protozoenzelle ist, ist die Zelle eine Entamoeba, eine Toxoplasma, eine Giardia, eine Leishmania, eine Cryptosporidium oder eine Schistosoma.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der unerwünschte Organismus ein Virus ist, ist das Virus ein HIV-Virus, ein HTLV-Virus, ein Hepatitisvirus, ein Influenzavirus, ein Rhinovirus, ein Papillomavirus, ein Masernvirus, ein Herpesvirus, ein Rotavirus, ein Parvovirus, ein Psittakosevirus oder ein Ebolavirus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Zielorganismus ein Arthropode ist, ist der Arthropode eine parasitäre Milbe.
Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Zielorganismus ein Wurm ist, ist der Wurm ein Nematode oder ein Trematode. Bei bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Wurm ein Nematode ist, findet sich der Nematode in einem Subjekt mit Fadenwurmbefall.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Zielorganismus eine orale Bakterienspezies, z.B. Porphyromonas (Bacferoides) gingivalis.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts bei einer Erkrankung der Mundhöhle, gekennzeichnet durch die Gegenwart eines unerwünschten Organismus. Das Verfahren beinhaltet:
Verabreichen eines Konjugats an das Subjekt, wobei das Konjugat einen Photosensibilisator beinhaltet, der an eine NPM-Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt ist, z.B. ein hier beschriebenes Konjugat;
Bestrahlen des Subjekts mit Energie einer Wellenlänge, die geeignet ist, um einen zytotoxischen Effekt durch den Photosensibilisator zu erzeugen;
dadurch Behandeln des Subjekts im Hinblick auf die Krankheit, die durch die Anwesenheit eines unerwünschten Organismus charakterisiert ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die topische Verabreichung des Konjugats auf einer Fläche des Subjekts, die mit dem unerwünschten Organismus infiziert ist. Das Konjugat kann topisch verabreicht werden, z.B. allgemein auf den Oberflächen der Mundhöhle, auf dem Zahnfleisch, auf dem periodontalen Gewebe, an der periodontalen Tasche, auf durch Entzündung charakterisierten Flächen, auf Läsionen, auf Fissuren oder schadhaften Stellen in einem Zahn oder Zahnfleisch, auf Zahnkaries, auf Schnitten oder Einschnitten, z.B. auf solchen, die im Verlauf der dentalen oder einer andersartigen medizinischen Behandlung verursacht werden, oder auf Wunden. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die systemische Applikation, z.B. durch Einnahme oder Injektion. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die subkutane Zufuhr, z.B. durch subkutane Injektion. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die lokale Injektion an oder nahe der Stelle der Infektion mit dem unerwünschten Organismus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Bestrahlung Laserbestrahlung oder sie wird durch eine Faseroptik-Vorrichtung übertragen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an einer Erkrankung der Mundhöhle, die gekennzeichnet ist durch das Vorhandensein eines unerwünschten Organismus, z.B. eines mikrobiellen Organismus, z.B. eines unerwünschten Bakteriums, Pilzes, Virus oder Protozoen. Die Erkrankung kann eine sein, bei der beliebige von Zähnen, Zahnfleisch, z.B. dem periodontalen Gewebe, Zunge, Mandeln, Gaumenzäpfchen, Mundhöhlenauskleidung oder Ohrspeicheldrüsen durch den Organismus infiziert sind oder anderweitig von der Erkrankung betroffen sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Erkrankung eine infektiöse orale Erkrankung.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an: einer periodontalen Erkrankung, z.B. Periodontitis oder Parodontose; sich zurückbildendem Zahnfleisch; akuter ulcerativer Gingivitis; chronischer Gingivitis; periodontalem Abszess, früh einsetzender (juveniler) Periodontitis; Schwangerschafts-Gingivitis; Pericoronitis; infektiöser Stomatitis; Cancrum oris; eitriger Paratitis; akuter oder chronischer Osteomyelitis des Unterkiefers oder Oberkiefers; Pulpitis oder periapikalen Infektionen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an einer oralen Pilzinfektion, z.B. an einer Actinomykose, Histoplasmose, Phycomykose, Aspergillose, Cyrptococcose, Sporotrichose, Blastomykose oder an einer Paracoccidioidomykose-Infektion.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an einer oralen Hefeinfektion, z.B. einschließlich einer Candida-Infektion der Mundhöhle, z.B. Candidose (Candidiase), Soor, chronischer Candidose und candidaler (candidialer) Leukoplakie, oder an einer viralen Infektion, einschließlich primärer Herpes-Stomatitis oder Lippenherpes.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt zusätzlich dazu, dass es an einer Erkrankung der Mundhöhle leidet, an einer Immunerkrankung, z.B. einer erworbenen oder ererbten Immunerkrankung. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an AIDS oder ist HIV-positiv.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der unerwünschte Organismus eine orale Bakterienspezies, z.B. Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis; eine Bacteroides-Spezies, einschließlich B. gingivalis (nun bekannt als Porphyromonas gingivalis), Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wolinella recta, eine Eubacterium-Spezies, Prevofella (Bacteroides) intermedia, Bacteroides forsythus, eine Capnocytophaga-Spezies, Actinobacillus actinomycetamcomitans und Streptococcus mutans.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung des Konjugats ein Speichel-Polypeptid oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon. Beispiele für Speichelpolypeptide sind die Histatine, z.B. Histatin-1 bis -8, oder, bevorzugter, Histatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung die Histatin-5-Reste 13-24 oder entsprechende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatinmolekül, das so hergestellt wurde, dass es eine interne Duplikation beinhaltet.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polylysinmolekül.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polypeptid, z.B. eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, um deren Ladung zu verändern, z.B. die Ladung von Seitenketten eines oder mehrerer Aminosäurereste der Polyaminosäure. Beispielsweise können eine oder mehrere, oder ungefähr 10, 25, 50, 75, 90 oder 100% der geladenen Seitenketten modifiziert werden. Mit „modifiziert" ist gemeint, dass eine negative Seitenkette, z.B. eine Glutaminsäure- oder eine Asparaginsäure-Seitenkette, in ihrer Ladung positiv oder neutral gemacht wird, bzw. dass eine positiv geladene Seitenkette, z.B. die Seitenkette von Lysin, Arginin oder Ornithin, negativ oder neutral in der Ladung gemacht wird. Beispielsweise können eine oder mehrere der Seitenketten von Polylysin in ihrer Ladung neutral oder negativ gemacht werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist es z.B. so, dass der Photosensibilisator Singulett-Sauerstoff bei Absorption elektromagnetischer Strahlung des richtigen Energieniveaus und der richtigen Wellenlänge produziert; dass der Photosensibilisator ein Porphyrin oder Porphyrinderivat beinhaltet; dass der Photosensibilisator Chlorin e6 oder ein Chlorin-Derivat beinhaltet.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts gegen eine periodontale Erkrankung, die durch die Anwesenheit eines unerwünschten Organismus charakterisiert ist. Das Verfahren beinhaltet:
Verabreichen eines Konjugats an das Subjekt, wobei das Konjugat einen Photosensibilisator beinhaltet, der an eine NPM-Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt ist, z.B. ein hier beschriebenes Konjugat;
Bestrahlen des periodontalen Gewebes des Subjekts mit Energie einer Wellenlänge, die geeignet ist, um einen zytotoxischen Effekt durch den Photosensibilisator zu erzeugen;
dadurch Behandeln des Subjekts im Hinblick auf die periodontale Erkrankung.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die topische Verabreichung des Konjugats auf einer Fläche des Subjekts, die mit dem unerwünschten Organismus infiziert ist. Das Konjugat kann topisch verabreicht werden auf dem Zahnfleisch, auf dem periodontalen Gewebe, an der periodontalen Tasche, auf durch Entzündung charakterisierten Flächen oder Läsionen. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die systemische Applikation, z.B. durch Einnahme oder Injektion. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die subkutane Zufuhr, z.B. durch subkutane Injektion. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die lokale Injektion an oder nahe der Stelle der Infektion mit dem unerwünschten Organismus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an: Periodontitis oder Parodontose; sich zurückbildendem Zahnfleisch; akuter ulcerativer Gingivitis; chronischer Gingivitis; periodontalem Abszess, früh einsetzender (juveniler) Periodontitis; Schwangerschafts-Gingivitis.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt zusätzlich dazu, dass es an einer periodontalen Erkrankung leidet, an einer Immunerkrankung, z.B. einer erworbenen oder ererbten Immunerkrankung. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an AIDS oder ist HIV-positiv.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der unerwünschte Organismus eine orale Bakterienspezies, z.B. Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis, eine Bacteroides-Spezies, einschließlich B. gingivalis (nun bekannt als Porphyromonas gingivalis), Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wolinella recta, eine Eubacterium-Spezies, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Bacteroides forsythus, eine Capnocytophaga-Spezies, Actinobacillus actinomycefamcomitans und Streptococcus mutans.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung des Konjugats ein Speichel-Polypeptid oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon. Beispiele für Speichelpolypeptide sind die Histatine, z.B. Histatin-1 bis -8, oder, bevorzugter, Histatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung die Histatin-5-Reste 13-24 oder entsprechende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatinmolekül, das so hergestellt wurde, dass es eine interne Duplikation beinhaltet.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polylysinmolekül.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polypeptid, z.B. eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, um deren Ladung zu verändern, z.B. die Ladung von Seitenketten eines oder mehrerer Aminosäurereste der Polyaminosäure. Beispielsweise können eine oder mehrere, oder ungefähr 10, 25, 50, 75, 90 oder 100% der geladenen Seitenketten modifiziert werden. Mit „modifiziert" ist gemeint, dass eine negative Seitenkette, z.B. eine Glutaminsäure- oder eine Asparaginsäure-Seitenkette, in ihrer Ladung positiv oder neutral gemacht wird, bzw. dass eine positiv geladene Seitenkette, z.B. die Seitenkette von Lysin, Arginin oder Ornithin, negativ oder neutral in der Ladung gemacht wird. Beispielsweise können eine oder mehrere der Seitenketten von Polylysin in ihrer Ladung neutral oder negativ gemacht werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist es z.B. so, dass der Photosensibilisator Singulett-Sauerstoff bei Absorption elektromagnetischer Strahlung des richtigen Energieniveaus und der richtigen Wellenlänge produziert; dass der Photosensibilisator ein Porphyrin oder Porphyrinderivat beinhaltet; dass der Photosensibilisator Chlorin e6 oder ein Chlorin-Derivat beinhaltet.
Bei einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts mit einer erworbenen Immunerkrankung gegen eine Erkrankung der Mundhöhle, die durch die Anwesenheit eines unerwünschten Organismus gekennzeichnet ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der unerwünschte Organismus ein anderer als ein Organismus, der der Auslöser der erworbenen Immunerkrankung ist. Die erworbene Immunerkrankung kann z.B. AIDS oder eine HIV-Infektion sein. Das Verfahren beinhaltet:
Verabreichung eines Konjugats an das Subjekt, wobei das Konjugat einen Photosensibilisator beinhaltet, der an eine NPM-Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt ist, z.B. ein hier beschriebenes Konjugat;
Bestrahlen des Subjekts mit Energie einer Wellenlänge, die geeignet ist, um einen zytotoxischen Effekt durch den Photosensibilisator zu erzeugen;
dadurch Behandeln des Subjekts im Hinblick auf die Krankheit, die durch die Anwesenheit eines unerwünschten Organismus charakterisiert ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die topische Verabreichung des Konjugats auf einer Fläche des Subjekts, die mit dem unerwünschten Organismus infiziert ist. Das Konjugat kann topisch verabreicht werden, z.B. allgemein auf den Oberflächen der Mundhöhle, auf dem Zahnfleisch, auf dem periodontalen Gewebe, an der periodontalen Tasche, auf durch Entzündung charakterisierten Flächen, auf Läsionen, auf Fissuren oder schadhaften Stellen in einem Zahn oder Zahnfleisch, auf Zahnkaries, auf Schnitten oder Einschnitten, z.B. auf solchen, die im Verlauf der dentalen oder andersartigen medizinischen Behandlung verursacht werden, oder auf Wunden. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die systemische Applikation, z.B. durch Einnahme oder Injektion. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die subkutane Zufuhr, z.B. durch subkutane Injektion. Bei anderen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die lokale Injektion an oder nahe der Stelle der Infektion mit dem unerwünschten Organismus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Bestrahlung Laserbestrahlung oder wird durch eine Faseroptik-Vorrichtung übertragen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der unerwünschte Organismus z.B. ein mikrobieller Organismus, z.B. ein unerwünschtes Bakterium, ein unerwünschter Pilz, Virus oder Protozoe. Die Erkrankung kann eine sein, bei der beliebige von Zähnen, Zahnfleisch, z.B. dem periodontalen Gewebe, Zunge, Mandeln, Gaumenzäpfchen, Mundhöhlenauskleidung oder Ohrspeicheldrüsen durch den Organismus infiziert sind oder anderweitig von der Erkrankung betroffen sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Erkrankung eine infektiöse orale Erkrankung.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an: einer periodontalen Erkrankung, z.B. Periodontitis oder Parodontose; sich zurückbildendem Zahnfleisch; akuter ulcerativer Gingivitis; chronischer Gingivitis; periodontalem Abszess, früh einsetzender (juveniler) Periodontitis; Schwangerschafts-Gingivitis; Pericoronitis; infektiöser Stomatitis; Cancrum oris; eitriger Paratitis; akuter oder chronischer Osteomyelitis des Unterkiefers oder Oberkiefers; Pulpitis oder periapikalen Infektionen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an einer oralen Pilzinfektion, z.B. an einer Actinomykose, Histoplasmose, Phycomykose, Aspergillose, Cyrptococcose, Sporotrichose, Blastomykose oder an einer Paracoccidioidomykose-Infektion. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen leidet das Subjekt an einer oralen Hefeinfektion, z.B. einschließlich einer Candida-Infektion der Mundhöhle, z.B. Candidose (Candidiase), Soor, chronischer Candidose und candidaler (candidialer) Leukoplakie, oder an einer viralen Infektion, einschließlich primärer Herpes-Stomatitis oder Lippenherpes.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der unerwünschte Organismus eine orale Bakterienspezies, z.B. Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis; eine Bacteroides-Spezies, einschließlich B. gingivalis (nun bekannt als Porphyromonas gingivalis), Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wolinella recta, eine Eubacterium-Spezies, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Bacteroides forsythus, eine Capnocytophaga-Spezies, Actinobacillus actinomycetamcomitans und Streptococcus mutans.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung des Konjugats ein Speichel-Polypeptid oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon. Beispiele für Speichelpolypeptide sind die Histatine, z.B. Histatin-1 bis -8, oder, bevorzugter, Histatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung die Histatin-5-Reste 13-24 oder entsprechende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatinmolekül, das so hergestellt wurde, dass es eine interne Duplikation beinhaltet.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polylysinmolekül.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Polypeptid, z.B. eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, um deren Ladung zu verändern, z.B. die Ladung von Seitenketten eines oder mehrerer Aminosäurereste der Polyaminosäure. Beispielsweise können eine oder mehrere, oder ungefähr 10, 25, 50, 75, 90 oder 100% der geladenen Seitenketten modifiziert werden. Mit „modifiziert" ist gemeint, dass eine negative Seitenkette, z.B. eine Glutaminsäure- oder eine Asparaginsäure-Seitenkette, in ihrer Ladung positiv oder neutral gemacht wird, bzw. dass eine positiv geladene Seitenkette, z.B. die Seitenkette von Lysin, Arginin oder Ornithin, negativ oder neutral in der Ladung gemacht wird. Beispielsweise können eine oder mehrere der Seitenketten von Polylysin in ihrer Ladung neutral oder negativ gemacht werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist es z.B. so, dass der Photosensibilisator Singulett-Sauerstoff bei Absorption elektromagnetischer Strahlung des richtigen Energieniveaus und der richtigen Wellenlänge produziert; dass der Photosensibilisator ein Porphyrin oder Porphyrinderivat beinhaltet; dass der Photosensibilisator Chlorin e6 oder ein Chlorin-Derivat beinhaltet.
Bei einer anderen Ausführungsform beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Konjugatmolekülen, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
Bereitstellen eines Rückgrats, z.B. eines Polypeptidrückgrats;
Koppeln, z.B. kovalentes Koppeln, eines Photosensibilisators an das Rückgrat;
Koppeln, z.B. kovalentes Koppeln, einer Zielsteuerungsgruppierung, z.B. einer hier beschriebenen Zielsteuerungsgruppierung, an das Rückgrat.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhalten die Kopplungsreaktionen eine aktivierte Estergruppierung eines Photosensibilisators. Bei bevorzugteren Ausführungsformen reagiert eine Aminogruppe an dem Rückgrat als Nukleophil und verdrängt die Abgangsgruppe vom aktiven Ester des Photosensibilisators. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Zielsteuerungsgruppierung mit einem Kopplungsmittel an das Rückgrat gekoppelt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Kit für die Eliminierung eines unerwünschten Organismus. Das Kit beinhaltet einen Photosensibilisator, der mit einer Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt ist, sowie Gebrauchsanweisungen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Konjugat nicht, bzw. ist nicht gekoppelt, z.B. kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt, an ein PM, einen Antikörper, ein Enzym, ein Hormon, einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche oder den Liganden für einen Rezeptor auf einer Zelloberfläche.
Die photodynamische Therapie beinhaltet die Verwendung einer lichtaktivierbaren Verbindung oder eines Photosensibilisators zusammen mit Licht korrekter Wellenlänge, um einen zytotoxischen Effekt zu produzieren. Um die Spezifität des Photosensibilisators für sein Ziel zu erhöhen, kann der Photosensibilisator an eine Zielsteuerungsgruppierung gebunden werden. Verfahren und Konjugate der Erfindung betreffen die Verwendung von NPM-zielgesteuerten Photosensibilisatoren. NPMs können den Photosensibilisator in einer effizienten und kostengünstigen Weise an ein Ziel ausliefern. Die Zusammensetzungen der Erfindung sind insofern vorteilhaft, als (i) sie nicht internalisiert werden müssen, um Bakterien zu töten, da die Bestrahlung toxische Sauerstoff-Spezies erzeugt, die durch die bakterielle Zellwand diffundieren können, (ii) die Erzeugung toxischer Sauerstoffspezies einen lokalen Effekt beim Stimulieren der Wirtsimmunantwort haben kann, der dabei unterstützend wirken kann, Bakterien zu vernichten und die Wundheilung zu unterstützen, (iii) sie nur in dem Gebiet, das der Bestrahlung unterworfen ist, eine zytotoxische Antwort erzeugen.
Solange nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, mit der sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl beim Durchführen oder Testen der vorliegenden Erfindung Verfahren und Materialien verwendet werden können, die den hier genannten ähnlich oder äquivalent sind, sind die bevorzugten Verfahren und Materialien unten beschrieben. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und nicht als limitierend gedacht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist ein Diagramm der ersten der Reaktionen für die Synthese von Chlorin e6-Polylysin-Konjugaten verschiedener Ladung, wobei Pfeil 1 die Reaktion von Chlorin e6, Molekül I, mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und Dimethylsulfoxid zur Bildung von Chlorin e6-NHS-Ester, Molekül II, zeigt.
1B ist ein Diagramm, das die Reaktion 2 von Molekül II mit poly-L-Lysin, Molekül IV, zur Bildung von poly-L-Lysin-Chlorin e6, Molekül III, zeigt.
1C ist ein Diagramm, das die chemische Struktur von Histatin-5-Chlorin e6-Konjugat mit vier Chlorin e6-Gruppierungen, jeweils gekoppelt an eine ε-Aminogruppe jedes Lysinrests von Histatin-5, zeigt.
1D ist ein Diagramm, das die Reaktion von Molekül III mit Essigsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid in DMSO zur Ausbildung von zwei Spezies von Molekül V zeigt, wobei die Gruppe R für Chlorin e6-Polylysin-Essigsäureamid-Neutralkonjugat -COCH₃ darstellt, und die Gruppe R für Chlorin e6-Polylysin-Bernsteinsäureamid -COCH₂CH₂COOH darstellt; für Molekül III, das nicht weiter acyliert wird, stellt die Gruppe R in Spezies V -H dar.
2A ist ein Diagramm der ersten Reaktionsabfolgen für die Synthese kationischer, neutraler und anionischer Chlorin e6-Polylysin-Konjugate mit einem Histatin-5 16 Aminosäurereste-Fragment durch die Synthese von Molekülen, die die reaktive funktionelle Sulfhydrylgruppe 2-Pyridyl-dithio-3-propionyl enthalten, wobei Reaktion 4 Molekül V, Polylysin-Chlorin e6, zeigt, das mit N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithiol]propionat (SPDP) in DMSO reagiert, um Polylysin-Chlorin e6-SPDP, Molekül VI, zu erzeugen, um mit der weiteren Reaktion 5 von Molekül VI mit Essigsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid in DMSO die Acetyl- und Succinyl-Derivate zu erzeugen, wobei R in Molekül VII -COCH₃ bzw. -COCH₂CH₂COOH darstellt.
2B ist ein Diagramm, das die weiteren Reaktionen der Moleküle VII und eines 16-Aminosäurerestefragments von humanem Histatin-5 zeigt, um das Konjugat zu synthetisieren. Dabei zeigt Reaktion 6 die Reaktion des Histatin-5-Fragments mit SATA, um SATA-Histatin-5-Fragment, Molekül IX, zu produzieren, das dann in Reaktion 7 durch Hydroxylamin entschützt wird, um entschütztes SATA zu erzeugen, das mit Histatin-5-Fragment gekoppelt ist (Molekül X).
2C ist ein Diagramm, das Reaktion 8 von Molekül X zeigt, das hier jeweils an jedes der Polylysin-Chlorin e6-Moleküle und die Acetyl- und Succinylderivate von Molekül VII gekoppelt wird, um die Molekülspezies XI zu erzeugen, wobei R hier -H für das positiv geladene nicht-acylierte Konjugat, -COCH₃ für das neutrale Essigsäureamid, und -COCH₂CH₂COOH für das negativ geladene Bernsteinsäureamid darstellt.
3 ist ein Graph der Aufnahme von drei Polylysin-Chlorin e6-Konjugaten, in 10^–9 Mol an Chlorin e6 pro mg an Zellprotein, durch Zellen von Porphyromonas gingivalis, wobei die Aufnahme des kationischen Konjugats durch die durchgezogene Linie gezeigt ist, die die Kreise verbindet, die Aufnahme des anionischen succinylierten Konjugats durch die gestrichelte Linie gezeigt ist, die die Quadrate verbindet, und die Aufnahme des neutralen acetylierten Konjugats durch die gepunktete Linie gezeigt ist, die die ausgefüllten Kreise verbindet, jeweils als Funktion der Chlorin-Konzentration in μM.
4 ist ein Graph der Aufnahme der drei Chlorin e6-Konjugate, in 10^–11 Mol an Chlorin e6 pro mg an Zellprotein, durch Zellen von HCPC-1 Hamster-Backentaschen-Schuppenzell-Karzinomzellen als Funktion der Chlorin-Konzentration in μM, wobei die Symbole das jeweilige Konjugat darstellen, wie in der Legende von 3 beschrieben.
5 ist ein Graph des Überlebens von P. gingivalis-Zellen nach der Bestrahlung durch Licht der Wellenlänge 630-710 nm, wobei die Zellen zuvor Chlorin e6-Konjugate gemäß den in der Legende zu 3 angezeigten Symbolen aufgenommen hatten, wobei eine zusätzliche Zellprobe Photofrin II (dargestellt durch die gestrichelte Linie, die die x-Symbole verbindet) aufgenommen hatte und eine andere Zellprobe Benzoporphyrin-Derivat (gezeigt durch die dicke gestrichelte Linie, die die ausgefüllten Dreiecke verbindet) aufgenommen hatte, als Funktion der Fluenz von Licht.
6 ist ein Graph des Überlebens von HCPC-1 Hamster-Schuppenzell-Karzinomzellen nach der Bestrahlung durch Licht der Wellenlänge 630-710 nm, wobei die Zellen zuvor Chlorin e6-Konjugate gemäß den Symbolen in den 3 und 6 aufgenommen hatten, als Funktion der Fluenz von Licht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hier verwendet, bezieht sich ein Photosensibilisator auf eine Substanz, die bei Bestrahlung mit elektromagnetischer Energie der geeigneten Wellenlänge, für gewöhnlich Licht der geeigneten Wellenlänge, einen zytotoxischen Effekt hervorruft.
Wie hier verwendet, werden die Begriffe Peptid, Polypeptid und Protein, solange nicht anders spezifiziert, in austauschbarer Weise verwendet. Peptide, Polypeptide und Proteine, die in den hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, können rekombinant, aus natürlichen Quellen gereinigt oder chemisch synthetisiert sein. Beispielsweise beinhaltet die Referenz auf die Verwendung eines Bakterienproteins oder eines Proteins aus Bakterien die Verwendung rekombinant hergestellter Moleküle, von aus natürlichen Quellen gereinigten Molekülen oder von chemisch synthetisierten Molekülen.
Wie hier verwendet, ist ein nicht-paarbildendes Element (Nicht-Paar-Element, NPM) ein Molekül, z.B. ein Polypeptid, das an eine Zielstelle bindet. Eine Zielstelle kann ein Protein, eine Nukleinsäure, ein Lipid, Polysaccharid oder eine Struktur, die eine Kombination hiervon ist, darstellen. Antikörper, Rezeptoren, Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter und Enzyme sind keine NPM-Polypeptide und werden hier als Paar-Elemente (PMs) bezeichnet. NPMs zeigen keine komplementäre Beziehung zwischen dem NPM und der Bindungsstelle. Mit komplementärer Beziehung ist gemeint, dass die zwei Einheiten, die binden, eine komplementäre Kombination von Form, Kontur und Ladung aufweisen, die auf der Fähigkeit „gegenüberliegender" funktioneller Gruppen an einer Einheit basiert, in der Lage zu sein, nicht-kovalente Bindungen mit „gegenüberliegenden" funktionellen Gruppen auf der anderen Einheit auszubilden und dadurch die zwei Einheiten mittels einer Vielzahl nicht-kovalenter Wechselwirkungen zu komplexieren. Mit anderen Worten wird das NPM keine Kombination von Form, Konturen und Ladungsmustern besitzen, die zu denen an der Zielstelle komplementär sind. Allgemein wird ein NPM eine geringere Affinität für sein Ziel haben als es die PMs, z.B. die oben beschriebenen PMs, tun. Typische Affinitäten von NPMs für ihre Ziele sind Km-Werte im Bereich von mM bis μM. Das Lösen der Bindung von PMs, z.B. eines Enzyms von seinem Substrat, erfordert in vivo oft die Bindung eines zusätzlichen Proteins oder das Brechen oder Ausbilden einer kovalenten Bindung. In vitro werden PM-Paare zum Auftrennen in die Komponenteneinheiten oft mit Extremata von Hitze oder pH behandelt.
Verfahren der Erfindung können eine Zielsteuerungsgruppierung verwenden, die zusätzlich zu den Bindungseigenschaften, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, eine PM-Funktion aufweist. Beispielsweise binden LDL-Moleküle als PM-Typ-Liganden an klassische apo B/E LDL-Rezeptoren, und oxidierte oder anderweitig veränderte LDL-Moleküle binden als PM-Typ-Liganden an Scavenger-Rezeptoren auf Makrophagen. Jedoch besitzen LDL-Moleküle zusätzlich eine NPM-Typ-Affinität für Gram-negative Oberflächenkomponenten, was keine PM-Funktion, wie hier definiert, ist. PM-Interaktionen sind allgemein gekennzeichnet durch hohe Spezifität, sodass nur ein oder wenige zugehörige Moleküle erkannt werden, und eine hohe Affinität, mit Km-Werten allgemein im Bereich von μM bis pM.
Wie hier verwendet, meint „Zielorganismus" einen Organismus, der eine Erkrankung verursacht oder verschlimmert.
Der Begriff „Subjekt", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein lebendes Tier oder einen Menschen, der Träger eines unerwünschten Organismus ist, d.h, eines Organismus, der ein Ziel für die photodynamische Therapie darstellt. Das Subjekt kann immundefizient sein. Das Subjekt kann ein Säuger sein, einschließlich Menschen und nicht-menschlichen Säugern, wie etwa Hunden, Katzen, Schweinen, Kühen, Schafen, Ziegen, Pferden, Ratten und Mäusen. Das Subjekt kann zuvor durch Chemotherapie oder durch eine antibiotische Therapie behandelt worden sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich „natürlich vorkommend" auf ein Molekül, das in der Natur vorkommt. Ein nicht-natürlich vorkommendes Molekül ist ein Molekül mit einer Struktur, die nicht ohne menschliches Eingreifen vorkommt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „kleines antimikrobielles Peptid (SAMP)" auf ein Peptid von weniger als 60 Aminosäureresten Länge. Histatine, Defensine, Cecropine, Magainine, Gram-positive Bacteriocine und Peptidantibiotika, die diese Einschränkung erfüllen, sind SAMPs. Viele SAMPS liegen im Bereich von 20-40 Aminosäureresten Länge. SAMPs sind natürlich vorkommende Peptide und werden durch eine breite Vielzahl von Organismen hergestellt. SAMPs sind NPMs. Viele SAMPs besitzen ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität und können z.B. mehr als eine Spezies töten, und sie können in einigen Fällen auch entfernt verwandte Spezies abtöten, z.B. Gram-negative und Gram-positive Bakterienspezies.
Wie hier verwendet, ist ein aktives Fragment oder Analogon eines Polypeptids eines, das wenigstens 20% der antimikrobiellen Aktivität oder der Zielorganismus-Affinität des Polypeptids beibehält. Analoga eines Polypeptids teilen wenigstens 50% und, bevorzugter, 60, 70, 80 oder 90% Sequenzidentität mit dem Polypeptid.
Ein Speichelpolypeptid, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, das von einem Subjekt produziert wird und sich im Speichel des Subjekts findet. Die meisten Speichelpolypeptide werden von den Ohrspeicheldrüsen produziert.
Wie hier verwendet, ist ein „Peptidantibiotikum" ein lineares oder zyklisches Oligopeptid oder ein aktives Fragment oder ein Analogon hiervon, das antibiotische Aktivität gegen Bakterien- oder Pilz-Spezies besitzt und das enzymatisch an einem Multiproteinkomplex synthetisiert wird, an den es über eine Thioesterbindung angeheftet ist. Ein Peptidantibiotikum kann nicht-ribosomale Aminosäuren, wie etwa D-Aminosäuren, beinhalten, und es kann Nicht-Aminosäurereste, wie etwa Ester von Milchsäure oder Valeriansäure, beinhalten.
Photosensibilisatoren
Ein Photosensibilisator ist eine Substanz, die bei der Bestrahlung mit elektromagnetischer Energie der geeigneten Wellenlänge, für gewöhnlich Licht der geeigneten Wellenlänge, einen zytotoxischen Effekt hervorruft.
Viele Photosensibilisatoren erzeugen Singulett-Sauerstoff. Bei elektromagnetischer Bestrahlung bei geeignetem Energieniveau und geeigneter Wellenlänge wird ein solches Photosensibilisator-Molekül in eine energetisch angeregte Form überführt. Die energetisch angeregte Form kann mit atmosphärischem O₂ reagieren, sodass beim Abfall des Photosensibilisators auf den nicht-energetisch angeregten Zustand Singulett-Sauerstoff produziert wird. Singulett-Sauerstoff ist hochreaktiv und für den in Nachbarschaft befindlichen Zielorganismus giftig.
Die Lebensdauer seines energetisierten Triplett-Zustands sollte hinreichend lang sein (z.B. mehrere Mikrosekunden), um eine Interaktion mit benachbarten Molekülen zu erlauben, um zytotoxische Spezies zu produzieren.
Eine Photosensibilisator-Zusammensetzung sollte hinreichend elektromagnetische Energie der geeigneten Wellenlänge mit hoher Quantenausbeute absorbieren, um die energetisierte Form des Photosensibilisators effizient zu erzeugen. Die Toxizität für den Zielorganismus sollte bei Bestrahlung wesentlich ansteigen, bevorzugt 10-fach, 100-fach oder sogar mehr, bevorzugt 1000-fach. Ein Photosensibilisator sollte eine niedrige Hintergrund-Toxizität zeigen, d.h. eine niedrige Toxizität in Abwesenheit von Bestrahlung mit Energie der geeigneten Wellenlänge.
Andere bevorzugte Eigenschaften eines Photosensibilisators beinhalten hohe Löslichkeit und Stabilität in geeigneten Lösungsmitteln. Beispielsweise sollte ein Photosensibilisator unter Bedingungen löslich sein, die verwendet werden, um ihn an die Zielsteuerungsgruppierung oder das Rückgrat zu koppeln. Die gewünschten Löslichkeitseigenschaften werden sich mit den für die Reaktion ausgewählten Bedingungen unterscheiden, jedoch kann eine Löslichkeit in DMSO, Wasser, Ethanol, oder in einem Gemisch von Wasser und DMSO oder Ethanol, wie etwa in DMSO:Wasser oder Ethanol:Wasser mit 5%, 10% oder 15%, nützlich sein. Die Löslichkeit beträgt bevorzugt 50 μg/ml, 100 μg/ml, 500 μg/ml, 1 mg/ml oder 10 mg/ml in einem wässrigen Lösungsmittel oder einem Ethanol:Wasser-Lösungsmittel.
Bei Konjugation an eine zielsteuernde Gruppierung sollte das resultierende Konjugat aus Photosensibilisator und Zielsteuerungsgruppierung löslich sein unter physiologischen Bedingungen, in wässrigen Lösungsmitteln mit geeigneten Trägern und Hilfsstoffen, oder zusammen mit anderen Auslieferungssystemen, wie etwa in Liposomen. Die Moleküle der Erfindung können als freie Photosensibilisator:Zielsteuerungsgruppierung-Zusammensetzungen in Lösung ausgeliefert werden, und sie können außerdem in verschiedenen Formulierungen ausgeliefert werden, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Liposom, Peptid/Polymer-gebunden oder in Detergens enthaltenden Formulierungen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sollten während des Verlaufs wenigstens einer einzigen Behandlungsrunde durch kontinuierliche oder gepulste Bestrahlung stabil bleiben, während der jedes Molekül der Zusammensetzung bevorzugt wiederholt auf den energetisierten Zustand angeregt wird und mehrere Runden der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff durchmacht. Die bevorzugte Stabilität eines Photosensibilisator-Konjugat-Moleküls beim Überleben beträgt 10%, 50%, 90%, 95% oder 99% der Moleküle in aktiver Form für 1 Stunde, 30 min, 15 min oder für wenigstens 1 min bei 37°C unter physiologischen Bedingungen.
Photosensibilisatoren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Hämatoporphyrine, wie etwa Hämatoporphyrin HCl und Hämatoporphyrin-Ester (Dobson J. und M. Wilson, Archs. Oral Biol. 37: 883-887); Dihämatoporphyrin-Ester (Wilson, M. et al., 1993, Oral Microbiol. Immunol. 8: 182-187); Hämatoporphyrin IX (Russell et al. 1991, Can J. App. Spectros. 36: 103-107, erhältlich bei Porphyrin Products, Logan, UT) und dessen Derivate; 3,1-meso-tetrakis (o-Propionamidophenyl)porphyrin; Hydroporphyrine, wie etwa Chlorin, Herein und Bacteriochlorin der Tetra(Hydroxyphenyl)porphyrin-Reihe, und synthetische Diporphyrine und Dichlorine; o-substituierte Tetraphenylporphyrine („Lattenzaun-Porphyrine"); Chlorin e6-Monoethylendiamin-monoamid (CMA Goff, B.A. et al., 1994, 70: 474-480, erhältlich bei Porphyrin Products, Logan, UT); Mono-1-Aspartylderivat von Chlorin e6, und Mono- und Di-Aspartylderivate von Chlorin e6; das Hämatoporphyringemisch Photofrin II (Quardra Logic Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada); Benzoporphyrinderivate (BPD), einschließlich Benzoporphyrin-Monosäure Ring A (BPD-MA), Tetracyanoethylen-Addukte, Dimethyl-Acetylen-Dicarboxylat-Addukte, Diels-Alder-Addukte und Monosäure Ring „A"-Derivate; ein Naphthalocyanin (Biolo, R., 1994, Photochem. and Photobiol. 5959: 362-365); ein Zn(II)-Phthalocyanin (Shopara, M. et al., 1995, Lasers in Medical Science 10: 43-46); Toluidinblau O (Wilson, M. et al., 1993, Lasers in Medical Sci. 8: 69-73); Aluminiumsulfoniertes und disulfoniertes Phthalocyanin, ibidern, und Phthalocyanine ohne Metallsubstituenten, sowie mit verschiedenen anderen Substituenten; ein tetra-sulfatiertes Derivat; sulfonierte Aluminium-Naphthalocyanine; Methylenblau (ibidem); Nilblau; Kristallviolett; Azur-β-Chlorid; und Rose Bengal (Wilson, M., 1994, Intl. Dent. J. 44: 187-189). Zahlreiche Photosensibilisator-Einheiten sind offenbart in Wilson, M. et al., 1992, Curr. Micro. 25: 77-81, und in Okamoto, H. et al., 1992, Lasers in Surg. Med. 12: 450-485.
Andere potentielle Photosensibilisator-Zusammensetzungen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Pheophorbide, wie etwa Pyropheophorbid-Verbindungen, Anthracendione; Anthrapyrazole; Aminoanthrachinone; Phenoxazin-Farbstoffe; Phenothiazin-Derivate; Chalcogenapyrylium-Farbstoffe, einschließlich kationischen Selena- und Tellura-Pyrylium-Derivaten; Verdine; Purpurine, einschließlich Zinn- und Zink-Derivaten von Octaethylpurpurin und Etiopurpurin; Benzonaphthoporphyrazine; kationische Imminiumsalze und Tetrazykline.
Die Eignung eines Photosensibilisators zur Verwendung in einem Konjugat kann durch Verfahren bestimmt werden, die hier beschrieben sind, oder durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind.
Die Effizienz, mit der ein Photosensibilisator ein Zielmolekül oxidiert, ist ein Maß für dessen Nützlichkeit. Die Effizienz der Oxidation eines Zielmoleküls durch einen Photosensibilisator kann in vitro bestimmt werden. Beispiele von Substraten beinhalten 4-Nitroso-N,N-dimethylanilin (RNO; Hasan, T. et al., 1987, Proc. AACR 28: 395 Abstr. 1, 568) und Tryptophan oder Histidin (Lambert, C.R. et al., 1986, Photochem. Photobiol. 44: 595-601). Bei diesen Assays kann die Fähigkeit eines Kandidaten-Photosensibilisators, das Substrat zu „bleichen", spektroskopisch überwacht werden. Der Vorteil eines chemischen Assays besteht darin, dass eine große Anzahl putativer Photosensibilisator-Zusammensetzungen simultan durchgemustert werden kann. Parameter, die variiert werden können, beinhalten die Photosensibilisator-Konzentration, die Substrat-Konzentration, die optimale Intensität der Bestrahlung und die optimale Wellenlänge der Bestrahlung. Es können Hochdurchsatz-Technologien mit Plastik-Multi-Well-Schalen, automatisierten Multi-Pipettierern und online arbeitenden spektrophotometrischen Plattenlesegeräten verwendet werden. Nicht erstrebenswerte Kandidaten, z.B. Zusammensetzungen mit hohen Hintergründen unter unbestrahlten Bedingungen, einer ineffizienten Energie-Aufnahme oder ineffizientem Reaktionspotential können identifiziert und eliminiert werden.
In vivo-Assays mit Zellen eines oder mehrerer Modell-Zielorganismen können verwendet werden, um einen Photosensibilisator hinsichtlich der Zytotoxizität seiner Hintergrundform und seiner aktivierten Form zu bewerten. Die Effizienz des Abtötens des Organismus in Gegenwart von bestrahltem und unbestrahltem Photosensibilisator kann gemessen und mit dem Überleben der unbehandelten Kontrollzellprobe verglichen werden. Dieser Assay kann automatisiert werden. Die Verwendung von Auszählungen Kolonie-bildender Einheiten (CFU) oder des Zellwachstums kann die Inkubation der Proben erfordern, die auf einem Nährmedium appliziert wurden, mit einer gleichzeitigen Verlängerung der geeigneten Wachstumsperiode, um Koloniebildung zu erlauben.
Das Überleben von Zellen des Modellzielorganismus kann alternativ überwacht werden durch einen Assay eines biochemischen Prozesses, z.B. einen Assay der DNA-Synthese. Bei diesem Ansatz kann die Wirksamkeit eines Photosensibilisator-Kandidaten durch dessen Wirkung auf Proben von Zellen des Modellorganismus gemessen werden, die auch einem markierten DNA-Vorläufer, wie etwa Tritium-markiertem Thymidin, ausgesetzt werden. Die Zellen werden dann gesammelt, gewaschen, um nicht-eingebauten Vorläufer zu entfernen, und auf die Aufnahme des Vorläufers und den Einbau in Säure-unlösliches Präzipitat, der ein Maß für die Menge der DNA-Synthese ist, hin überwacht. Bei diesem Assay, der auch, wie oben beschrieben, automatisiert werden kann, kann die quantitative Auswertung der Wirkungen der Anwesenheit bestrahlter Photosensibilisator-Zusammensetzungen leicht bewertet und quantifiziert werden. Bei nichtbestrahlten Kontrollzellen und bei unbehandelten Zellen nimmt die DNA-Synthese als Funktion des Zellwachstums logarithmisch zu. Ein positives Ergebnis, das die Gegenwart eines putativ erfolgreichen neuen Photosensibilisators anzeigt, ist das Abschalten der DNA-Synthese in Zellen, die in Gegenwart dieses Photosensibilisators bestrahlt wurden.
Geeignete Modell-Zielorganismen sind: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus mutans. Eine geeignete Positivkontrolle für die Photosensibilisator-Aktivität ist Toluidinblau O.
Wenn eine große Anzahl von Kandidaten durchzumustern ist, kann es erstrebenswert sein, einen zwei-stufigen Screen zu verwenden, bei dem die erste Stufe ein in vitro-Screen ist und die zweite Stufe Zellen verwendet.
Bestrahlung
Die Bestrahlung mit der richtigen Wellenlänge für eine gegebene Verbindung kann mittels einer Vielzahl von Verfahren verabreicht werden. Diese Verfahren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Verabreichung von Laser, Nicht-Laser oder Breitbandlicht. Die Bestrahlung kann erzeugt werden durch extrakorporale oder intraartikuläre Erzeugung von Licht der geeigneten Wellenlänge. Bei der Erfindung verwendetes Licht kann unter Verwendung jedweder Vorrichtung verabreicht werden, die befähigt ist, die erforderliche Lichtenergie zu liefern, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, faseroptische Instrumente, arthroskopische Instrumente oder Instrumente, die Transillumination bereitstellen. Die Zufuhr von Licht zur Mundhöhle kann mittels flexibler Faseroptik erreicht werden, die in die Periodontaltasche eingeführt wird oder durch transgingivale Beleuchtung (durchschnittliche Dicke des Zahnfleischs 5-7 mm). Die Lichtquelle, die benötigt wird, um die Bakterien zu inaktivieren, kann ein preiswerter Diodenlaser oder eine nichtkohärente Lichtquelle sein.
Kopplungstechniken
Der Begriff „Kopplungsmittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Reagenz, das befähigt ist, einen Photosensibilisator an eine Zielsteuerungsgruppierung zu koppeln, oder einen Photosensibilisator oder eine Zielsteuerungsgruppierung an eine „Rückgrat"- oder „Brücken"-Gruppierung zu koppeln. Jedwede Bindung, die befähigt ist, die Komponenten so zu verbinden, dass sie unter physiologischen Bedingungen für die zur Verabreichung und Behandlung nötige Zeit stabil sind, ist geeignet, jedoch sind kovalente Bindungen bevorzugt. Die Verbindung zwischen zwei Komponenten kann direkt sein, z.B. da, wo ein Photosensibilisator direkt mit einer Zielsteuerungsgruppierung verbunden wird, oder indirekt, z.B. da, wo ein Photosensibilisator an ein Zwischenelement gebunden ist, z.B. mit einem Rückgrat verbunden ist, und wobei dieses Zwischenelement mit der zielsteuernden Gruppierung verbunden ist. Ein Kopplungsmittel sollte unter Bedingungen der Temperatur und des pH, unter Salzbedingungen, Bedingungen des Lösungsmittelsystems und im Zusammenhang mit anderen Reaktanten so funktionieren, dass die chemische Stabilität des Photosensibilisators, des Rückgrats (wenn vorhanden) und der Zielsteuerungsgruppierung jeweils im wesentlichen erhalten bleibt.
Ein Kopplungsmittel kann Komponenten verbinden, ohne dass Elemente des Kopplungsmittels zu den verbundenen Komponenten hinzugefügt werden. Andere Kopplungsmittel führen zur Hinzufügung von Elementen des Kopplungsmittels zu den verbundenen Komponenten. Beispielsweise können Kopplungsmittel Vernetzungsmittel sein, die homo- oder hetero-bifunktional sind, und bei denen eine oder mehrere atomare Komponenten des Mittels in der Zusammensetzung beibehalten werden. Ein Kopplungsmittel, das kein Vernetzungsmittel ist, kann während der Kopplungsreaktion vollständig entfernt werden, sodass das molekulare Produkt vollständig aus dem Photosensibilisator, der Zielsteuerungsgruppierung und einer Rückgrat-Gruppierung (wenn vorhanden) bestehen kann.
Viele Kopplungsmittel reagieren mit einem Amin und einem Carboxylat, um ein Amid auszubilden, oder mit einem Alkohol und einem Carboxylat, um einen Ester auszubilden. Kopplungsmittel sind in der Technik bekannt, siehe z.B. M. Bodansky, „Principles of Peptide Synthesis", 2. Auflage, hier als Referenz genannt, und T. Greene und P. Wuts, „Protective Groups in Organic Synthesis", 2 Auflage, 1991, John Wiley, NY. Kopplungsmittel sollten die Komponenten-Gruppierungen stabil verbinden, jedoch so, dass es nur eine minimale oder keine Denaturierung oder Deaktivierung des Photosensibilisators oder der Zielsteuerungsgruppierung gibt.
Die Photosensibilisator-Konjugate der Erfindung können hergestellt werden durch Koppeln des Photosensibilisators an Zielsteuerungsgruppierungen unter Verwendung von Verfahren, die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, oder durch in der Technik bekannte Verfahren. Eine Vielzahl von Kopplungsmitteln, einschließlich Vernetzungsmitteln, kann für die kovalente Konjugation verwendet werden. Beispiele von Vernetzungsmitteln beinhalten N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; Pierce), N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), ortho-Phenylendimaleimid (o-PDM) und Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC). Siehe z.B. Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160: 1686, 1984; und Liu, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 8648, 1985. Andere Verfahren beinhalten diejenigen, die von Paulus, Behring Ins. Mitt., Nr. 78, 118-132, 1985; Brennan et al. Science 229: 81-83, 1985 und Glennie et al., J. Immunol., 139: 2367-2375, 1987, beschrieben wurden. Eine große Anzahl von Kopplungsmitteln für Peptide und Proteine, zusammen mit Puffern, Lösungsmitteln und Verwendungsverfahren, ist beschrieben im Pierce Chemical Co. Katalog, Seiten T-155 bis T-200, 1994 (3747 N. Meridian Rd., Rockford IL, 61105, USA; Pierce Europa B.V., P.O. Box 1512, 3260 BA Oud Beijerland, Niederlande).
DCC ist ein nützliches Kopplungsmittel (Pierce #20320; Rockland, IL). Es unterstützt die Kopplung des Alkohols NHS an Chlorin e6 in DMSO (Pierce #20684), wobei ein aktivierter Ester gebildet wird, der mit Polylysin vernetzt werden kann. DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) ist ein Carboxy-reaktiver Vernetzer, der gebräuchlich als Kopplungsmittel bei der Peptidsynthese verwendet wird und ein Molekulargewicht von 206,32 besitzt. Ein weiteres nützliches Vernetzungsmittel ist SPDP (Pierce #21557), ein heterobifunktionaler Vernetzer zur Verwendung mit primären Aminen und Sulfhydrylgruppen. SPDP besitzt ein Molekulargewicht von 312,4, eine Länge des Abstandshalterarms von 6,8 Angstrom, es ist reaktiv mit NHS-Estern und Pyridyldithio-Gruppen und erzeugt eine spaltbare Vernetzung, sodass das Mittel bei weiterer Reaktion eliminiert wird, sodass der Photosensibilisator direkt mit einem Rückgrat oder einer zielsteuernden Gruppierung verbunden werden kann. Andere nützliche Konjugationsmittel sind SATA (Pierce #26102) für das Einführen blockierter SH-Gruppen für eine zweistufige Vernetzung, die durch Hydroxylamin-HCl (Pierce #26103) entblockiert wird, und Sulfo-SMCC (Pierce #22322), das reaktiv ist gegenüber Aminen und Sulfhydrylen. Andere Vernetzungs- und Kopplungsmittel sind ebenfalls bei Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) erhältlich. Zusätzliche Verbindungen und Prozesse, insbesondere diejenigen, die eine Schiff-Base als Zwischenprodukt verwenden, für die Konjugation von Proteinen an andere Proteine oder an andere Zusammensetzungen, z.B. an Reportergruppen oder an Chelatbildner für die Metallionenmarkierung eines Proteins, sind in der EPO 243,929 A2 (veröffentlicht Nov. 4, 1987), offenbart.
Photosensibilisatoren, die Carboxylgruppen enthalten, können mit Lysin ε-Aminogruppen in den Ziel-Polypeptiden verbunden werden, wobei dies entweder über reaktive Ester (wie etwa N-Hydroxysuccinimidester) oder über Ester durchgeführt wird, die in situ durch eine Carbodiimidvermittelte Reaktion konjugiert werden. Das gleiche gilt für Photosensibilisatoren, die Sulfonsäuregruppen enthalten, die zu Sulfonylchloriden umgewandelt werden können, die mit Aminogruppen reagieren. Photosensibilisatoren, die Carboxylgruppen aufweisen, können durch ein in situ-Carbodiimid-Verfahren mit Aminogruppen an dem Polypeptid verbunden werden. Photosensibilisatoren können auch an Hydroxylgruppen von Serin- oder Threoninresten oder an Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten angeheftet werden.
Verfahren zum Verbinden der Komponenten eines Konjugats, z.B. durch Kopplung von Polyaminosäureketten, die Photosensibilisatoren tragen, an antibakterielle Polypeptide, können heterobifunktionelle Vernetzungsmittel verwenden. Diese Mittel binden an eine funktionelle Gruppe in einer Kette und an eine andersartige funktionelle Gruppe in der zweiten Kette. Diese funktionellen Gruppen sind typischerweise Amino, Carboxyl, Sulfhydryl und Aldehyd. Es gibt viele Permutationen geeigneter Gruppierungen, die mit diesen Gruppen und mit unterschiedlich formulierten Strukturen reagieren werden, um diese miteinander zu verbinden. Siehe hierzu Pierce Katalog, und Merrifield, R.B. et al. Ciba Found Symp. 186: 5-20, 1994.
Die Produktion und Reinigung von Konjugaten aus Photosensibilisator und Zielsteuerungsgruppierung kann durch in der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Die Ausbeuten von Kopplungsreaktionen können durch die Spektroskopie desjenigen Produkts bestimmt werden, das bei einer chromatographischen Fraktionierung im letzten Schritt der Reinigung eluiert wird. Die Gegenwart von nicht-gekoppeltem Photosensibilisator und Reaktionsprodukten, die den Photosensibilisator enthalten, kann durch die physikalische Eigenschaft verfolgt werden, dass diese Photosensibilisatorgruppierung Licht bei einer charakteristischen Wellenlänge und mit einem charakteristischen Extinktionskoeffizienten absorbiert, sodass der Einbau in Produkte durch die Extinktion bei dieser Wellenlänge oder einer ähnlichen Wellenlänge überwacht werden kann. Die Kopplung eines oder mehrerer Photosensibilisatormoleküle an eine Zielsteuerungsgruppierung oder an ein Rückgrat verschiebt den Extinktions-Peak im Elutionsprofil bei den Fraktionen, die unter Verwendung von größenabhängiger Gelchromatographie eluiert werden, wobei die geeignete Wahl z.B. Sephadex G50, G100 oder G200 oder andere derartige Matrizes (Pharmacia-Biotech, Piscataway, NJ) sein kann. Die Auswahl geeigneter Größengele, z.B. von Sephadex-Gel, kann durch dasjenige Gel bestimmt werden, bei dem der Photosensibilisator selbst in einer Fraktion nach dem ausgeschlossenen Volumen des Materials eluiert, das zu groß ist, um mit den Beads zu interagieren, d.h. die nicht gekoppelte Ausgangs-Photosensibilisator-Zusammensetzung interagiert in einem gewissen Maße mit den Fraktionierungs-Beads und wird gleichzeitig in einem gewissen Maße zurückgehalten. Das korrekte, nützliche Gel kann anhand des Molekulargewichts des nicht-gekoppelten Photosensibilisators vorhergesagt werden. Die erfolgreichen Reaktionsprodukte der Photosensibilisator-Zusammensetzungen, gekoppelt an zusätzliche Gruppierungen, besitzen allgemein ein höheres charakteristisches Moleklargewicht, was bewirkt, dass sie mit dem chromatographischen Bead in einem geringeren Ausmaß interagieren, und somit erscheinen sie in Fraktionen, die früher eluieren als Fraktionen, die das nicht-gekoppelte Photosensibilisator-Substrat enthalten. Nicht umgesetztes Photosensibilisator-Substrat erscheint allgemein in Fraktionen, die für das Ausgangsmaterial charakteristisch sind, und die Ausbeute aus jeder Reaktion kann somit sowohl aus der Größe des Peaks des Materials mit größerem Molekulargewicht als auch aus der Abnahme des Peaks des charakteristischen Ausgangsmaterials bestimmt werden. Die Fläche unter dem Peak der Produktfraktionen wird unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten in die Größe der Ausbeute umgesetzt.
Das Produkt kann unter Verwendung von NMR und einer Integration von Flächen der geeigneten Produkt-Peaks analysiert werden, um die relativen Ausbeuten mit verschiedenen Kopplungsmitteln zu bestimmen. Eine Rotverschiebung in der Absorption eines Photosensibilisators von mehreren nm ist oft nach der Kopplung an eine Polyaminosäure beobachtet worden. Die Kopplung an eine größere Gruppierung, wie etwa an ein Protein, kann eine vergleichbare Verschiebung erzeugen, da die Kopplung an einen Antikörper in einer Verschiebung um etwa 3-5 nm in dieser Richtung resultierte, wenn man es mit der Absorption des freien Photosensibilisators verglich. Die relevanten Absorptionsmaxima und Extinktionskoeffizienten in 0,1 M NaOH/1% SDS sind für Chlorin e6, 400 nm und 150.000 M^–1, cm^–1 und für Benzoporphyrin-Derivat 430 nm und 61.000 M^–1, cm^–1.
Rückgrat-Grugqierungen
Konjugate der Erfindung aus Photosensibilisator und Zielsteuerungsgruppierung beinhalten diejenigen, bei denen ein Photosensibilisator direkt an eine Zielsteuerungsgruppierung, wie etwa ein Histatin, gekoppelt wird. Andere erfindungsgemäße Konjugate aus Photosensibilisator und Zielsteuerungsgruppierung beinhalten eine „Rückgrat"- oder „Brücken"-Gruppierung, wie etwa eine Polyaminosäure, wobei dieses Rückgrat sowohl an einen Photosensibilisator als auch an eine Zielsteuerungsgruppierung gekoppelt wird. Das Rückgrat selbst kann eine Zielsteuerungsgruppierung, z.B. ein Polylysin (siehe Beispiel 4 und 5 und 6), sein.
Die Einbeziehung eines Rückgrats in ein Konjugat mit einer Photosensibilisatorgruppierung und einer Zielsteuerungsgruppierung kann eine Anzahl von Vorteilen bereitstellen, einschließlich der Bereitstellung größerer stöchiometrischer Bandbreite von Photosensibilisator und Zielsteuerungsgruppierungen, die pro Rückgrat angekoppelt sind. Wenn das Rückgrat intrinsische Affinität für einen Zielorganismus besitzt, so kann die Affinität der Zusammensetzung durch die Kopplung an das Rückgrat gesteigert werden. Die spezifische Bandbreite von Organismen, die mit einer Zusammensetzung angesteuert werden können, kann erweitert werden durch Koppelung von zwei oder mehr verschiedenen Zielsteuerungsgruppierungen an eine einzelne Photosensibilisator-Rückgrat-Zusammensetzung.
Peptide, die für die Verfahren und Verbindungen der Erfindung, zur Erstellung und Charakterisierung von Rückgrat-Gruppierungen, nützlich sind, beinhalten Polyaminosäuren, die Homo- und Hetero-Polymere aus L-, D-, racemischen DL- oder gemischten L- und D-Aminosäurezusammensetzungen sein können, und die von definierter oder zufällig gemischter Zusammensetzung und Sequenz sein können. Beispiele natürlich vorkommender Peptide mit gemischten D- und L-Aminosäureresten beinhalten Bacitracin und Tyrocidin. Diese Peptide können nach bestimmten natürlichen Peptiden modelliert sein und optimiert werden durch die Technik von Phage Display und Selektion auf gesteigerte Bindung an ein ausgewähltes Ziel, sodass das selektierte Peptid der höchsten Affinität charakterisiert und dann synthetisch erzeugt werden kann. Weitere Modifikationen funktioneller Gruppen können zu Zwecken eingeführt werden, wie z.B. einer gesteigerten Löslichkeit, einer verringerten Aggregation und einem veränderten Ausmaß der Hydrophobizität. Beispiele für Nicht-Peptid-Rückgrate beinhalten Nukleinsäuren und Derivate von Nukleinsäuren, wie etwa DNA, RNA und Peptid-Nukleinsäuren; Polysaccharide und Derivate, wie etwa Stärke, Pektin, Chitine, Cellulosen und hemimethylierte Cellulosen; Lipide, wie etwa Triglyceridderivate und Cerebroside; synthetische Polymere, wie etwa Polyethylenglykole (PEGs) und PEG Star-Polymere; Dextran-Derivate, Polyvinyl-Alkohole, N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamid-Copolymere, poly(DL-Glycolsäure-Milchsäure); und Zusammensetzungen, die Elemente beliebiger dieser Klassen von Verbindungen enthalten.
Modifikation der Ladung von Konjugaten
Die Affinität eines Konjugats für einen Zielorganismus kann verfeinert werden, indem man die Ladung einer Komponente des Konjugats modifiziert.
Konjugate, wie etwa poly-L-Lysin-Chlorin e6 können in variierenden Größen und mit variierenden Ladungen (kationisch, neutral und anionisch) erzeugt werden; dazu werden z.B. freie NH₂-Gruppen des Polylysins mit einer „Kappe" aus Acetyl, Succinyl oder anderen R-Gruppen versehen, um die Ladung der endgültigen Zusammensetzung zu verändern. Die Nettoladung eines Konjugats der vorliegenden Erfindung kann durch isoelektrische Fokussierung (IEF) bestimmt werden. Diese Technik verwendet angelegte Spannung, um einen pH-Gradienten in einem nichtsiebenden Acrylamid- oder Agarosegel durch die Verwendung eines Systems von Ampholyten (synthetische Puffer-Komponenten) zu erzeugen. Wenn geladene Polypeptide auf das Gel appliziert werden, werden sie entweder zu höheren pH-Regionen oder niedrigeren pH-Regionen des Gels wandern, und zwar gemäß derjenigen Position, an der sie ungeladen werden und somit unfähig, sich weiter zu bewegen. Diese Position kann bestimmt werden durch die Bezugnahme auf die Positionen einer Reihe bekannter IEF-Marker-Proteine.
Aufgrund der Kombination polarer geladener Gruppen an der Polyaminosäure und wegen der hydrophoben Anziehung zwischen den planaren aromatischen Tetrapyrrolringen können diese Konjugate pH-abhängige Konformationen annehmen, die mit bakteriellen Zellwänden interagieren können. Zusätzlich enthalten Histatine und verwandte Polypeptide wenigstens einen Lysinrest, der durch die Anwendung zweier heterobifunktionaler Reagenzien zu einer kovalenten Disulfidbindung zwischen dem Histatin und den Polylysin-Chlorin e6-Molelülen führen wird. Die optimale Zusammensetzung, Konzentration und Anwendungszeit des Photosensibilisators gegen verschiedene pathogene orale Bakterien kann jeweils bestimmt werden.
Zielsteuerungsgruppierungen
Erstrebenswerte Charakteristika für die Zielsteuerungsgruppierungen beinhalten: Spezifität für einen oder mehrere unerwünschte Zielorganismen, Affinität und Avidität für solche Organismen und Stabilität im Hinblick auf Bedingungen von Kopplungsreaktionen und die Physiologie des betreffenden Organs oder Gewebes. Spezifität muss nicht eng definiert werden; z.B. kann es erstrebenswert für ein Zielsteuerungsmolekül sein, Affinität für ein breites Spektrum von Zielorganismen zu haben, wie etwa alle Gram-negativen Bakterien.
Die Zielsteuerungsgruppierung, wenn sie in ein Konjugat-Molekül der Erfindung eingebaut wird, sollte für die Zellen des Subjekts nicht-toxisch sein.
Die Zielsteuerungsgruppierung kann aus den Sequenzen natürlich vorkommender Proteine und Peptide ausgewählt werden, aus Varianten dieser Peptide und aus biologisch oder chemisch synthetisierten Peptiden. Natürlich vorkommende Peptide, die Affinität für einen oder mehrere Zielorganismen besitzen, können Sequenzen bereitstellen, von denen ausgehend zusätzliche Peptide mit gewünschten Eigenschaften, z.B. einer gesteigerten Affinität oder Spezifität, einzeln oder als Mitglieder einer Bibliothek verwandter Peptide, synthetisiert werden können. Solche Peptide können auf Basis von Affinität für den Zielorganismus ausgewählt werden.
Natürlich vorkommende Peptide mit Affinität für Zielorganismen, die in den Verfahren und Verbindungen der Erfindung nützlich sind, beinhalten Speichelproteine, z.B. Histatine, mikrobiell erzeugte Proteine, z.B. Bacteriocine, Peptide, die Spezies binden und/oder abtöten, die mit den produzierenden Stämmen eng verwandt sind, und Proteine, die durch Tierspezies erzeugt werden, wie etwa Defensine, die von Säugern produziert werden, und die Cecropine und Magainine, die von Motten, bzw. Amphibien produziert werden.
Histatine, Defensine, Cecropine und Magainine sind Beispiele einer Klasse von Polypeptiden, die in der Natur in breitem Umfang zu finden sind, die das Charakteristikum einer kleinen Größe teilen (allgemein etwa 30 Aminosäurereste, und zwischen 10 Resten und 50 Resten), und die eine breite Spezifität der antimikrobiellen Aktivität und niedrige Affinität für den Zielorganismus besitzen.
Die Verwendung von Histatinen als Photosensibilisator-Zielsteuerungsgruppierungen wird die Zielsteuerung eines Photosensibilisators zu einer Bakterienzelle erlauben, während das Wirtsgewebe unbeschädigt gelassen wird. Die Histatine sind eine Familie Histidin-reicher kationischer Polypeptide, die bakterizide und candidazide Eigenschaften besitzen und Bestandteile des normalen menschlichen Speichels sind (Oppenheim, G.G. et al., J. Biol. Chem. 263: 7472-747, 1988). Man nimmt an, dass an ihrem Wirkungsmechanismus eine Kombination aus α-helikaler Konformation und kationischer Ladung beteiligt ist, die sie dazu bringt, sich zwischen den polaren Kopfgruppen in die Bakterienzellwand zu inserieren (Raj, P.A. et al., J. Biol. Chem. 269: 9610-9619, 1994).
Während Histatine in nützlicher Weise als orale Bakterizide verwendet werden können, erfolgt ihre Wirkung über Zeitspannen von Stunden, was zu dem Problem führt, Auslieferungsvehikel, wie etwa Gele, zu formulieren, um die Histatine in der Region der Infektion zu halten. Die photodynamische Inaktivierung oraler Bakterien kann jedoch eine nur kurze Applikation des auf die Bakterien abzielenden Photosensibilisators erfordern, wie etwa bei der Anwendung in einer Mundspülung. Da Bakterien 50-100mal kleiner als die durchschnittliche Säugerzelle sind, und man annimmt, dass der Mechanismus der photodynamischen Therapie die Produktion von molekularen Spezies, wie etwa Singulett-Sauerstoff, beinhaltet, die in Geweben sehr kurze Diffusionsabstände besitzen (weniger als 50 nm für Singulett-Sauerstoff), ist zu sehen, dass moderate Niveaus der Sensibilisator-Selektivität für Bakterien zu hohen Selektivitätsniveaus der Zytotoxizität führen können. Es ist für niedrige Niveaus der PDT beim Menschen und bei Versuchstieren gezeigt worden, dass sie Komponenten des Wirtsimmunsystems, wie etwa Makrophagen und Lymphozyten, aktivieren, und dass diese aktivierten Wirtszellen eine anteilige Rolle dabei spielen können, Bakterien zu zerstören und die Regeneration des durch die Erkrankung zerstörten Gewebes zu unterstützen.
Die Histatine-1, -3 und -5 enthalten jeweils 7 Histidinreste bei einer Gesamtlänge des Polypeptids von 38, 32 bzw. 24 Resten. Histatine besitzen eine Reihe von Aktivitäten, z.B. eine Anti-Pilz-Aktivität, z.B. gegen Candida-Pathogene (US-Patent 5,486,503). Eine rekombinante Verdoppelung der Histatin-5-Reste 13-24 ergibt ein Peptid mit gesteigerter candidazider Aktivität (Zuo, F. et al., Gene 161: 87-91, 1995). Histatin-5 ist ein Inhibitor der Trypsin-artigen Protease, die durch die orale Bakterienspezies Porphyromonas (Bacferoides) gingivalis produziert wird, wobei diese Protease an der Gewebezerstörung bei der periodontalen Erkrankung beteiligt ist (Nishikata, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 174: 625-630, 1991). Etwa 3.600 Histatin-5-Moleküle binden P. gingivalis mit einer K_d in der Größenordnung von 10^–6 M (Murakami, Y. et al., FEMS Microbiol. Letts 82: 253-256, 1991). Die Histatine-5 und -8 inhibieren die Co-Aggregation von P. gingivalis und S. mitis (Murakami, Y. et al., Inf. Immun. 59: 3284-3286, 1991), was die Anheftung von P. gingivalis an Gram-positive Bakterien, die zuvor an die oralen Gewebe gebunden haben, modulieren kann.
Histatin-5 besitzt bakterizide Aktivität wenigstens gegen die oralen Bakterienspezies P. gingivalis (Colon, J.O. et al., J. Dent. Res. 72 IADR Abstr.: 322, Abstr. 1751) und Actinomyces viscosus, A. naeslundii und A. odontolyticus (Kalpidis, CD. et al., op. Cit. 71: 305, Abstr. 1595). Die direkte antimikrobielle Aktivität gegen die letzte Spezies scheint ohne Rezeptoraktivität für die Agglutination von Actinomyces-Zellen zu sein. Ein synthetisches Peptid von Histatin-5 ist ein potenter Inhibitor von P. (B.) gingivalis Hämagglutinin (Murakami, Y. et al., Archs. Oral. Biol. 35: 775-777). Das synthetische Peptid ist stark kationisch (es enthält in 22 Resten 6 His, 4 Lys und 3 Arg) und kann als Bindedomäne für P. gingivalis auf epithelialen Zellen, Speichelmembranen und Grampositiven Zellen fungieren.
Histatine, die am C- oder N-Terminus chemisch abgedeckt (mit einer „Kappe" versehen) wurden, und die mit einem Metall komplexiert wurden, z.B. mit Ag, Cu, Zn oder Sn, sind geeignet für eine Reihe antimikrobieller Anwendungen, wie etwa Anti-Plaque-, Anti-Karies-, Anti-Mundgeruch-Oral-Applikationen, deodorierenden Anwendungen, Anwendungen der Körperpflege und so weiter (EPO-Patentanmeldung 721 774 A2).
Bacteriocine, die Proteine darstellen, die durch Bakterien produziert werden und die andere Stämme und Spezies von Bakterien abtöten (Jack, R.W. et al., Microbiol. Rev. 59: 171-200, 1995) können als Zielsteuerungsgruppierungen verwendet werden. Ein beispielhaftes Gram-positives Bacteriocin ist Nisin, produziert von Lactococcus lactis und mit zuerkanntem GRAS-Status (allgemein als sicher angesehen) seitens der Food and Drug Administration für die Anmeldung zur Lebensmittelkonservierung.
Die Bacteriocine Nisin, Subtilin, Epidermin, Gallidermin, Salivarin und Lacticin stellen beispielhaft die "lantibiotische Klasse" von Gram-positivem Bacteriocin dar, das als Bacteriocin definiert ist, bei dem ein oder mehrere Cysteinreste mit einem dehydratisierten Serin oder Threonin verbunden werden, um einen Thioether-gebundenen Rest zu erzeugen, der als Lanthionin (Lan) oder Threo-β-Methyllanthionin (MeLan) bekannt ist. Dies sind posttranslationale Modifikationen, die sich aufgrund der Produzentenzelle in diesen antimikrobiellen Peptiden finden. Lantibiotika enthalten Leader-Peptidsequenzen von 18-24 Resten, die abgespalten werden, um ein aktives antimikrobielles Peptid von etwa 22-35 Resten zu erzeugen. Das Züchten der produzierenden Bakterienspezies und die Präparation und Reinigung von Bacteriocinen erfolgen mittels veröffentlichter Verfahren und Techniken, die vom Fachmann durchgeführt werden können. Beispielsweise beschreiben Yang, R et al., Appl. and Env. Microbiol. 58: 3355-3359, 1992, die Reinigung von Bacteriocinen von jeder der vier Gattungen von Milchsäurebakterien, durch Optimieren der Absorption bei den produzierenden Zellen, gefolgt von der Verwendung von niedrigem pH für die selektive Elution von stark angereicherten Bacteriocin-Fraktionen. Mutante Formen jedes der Bacteriocine Nisin, produziert von Lactococcus lactis, und Subtilin, produziert von Bacillus subtilis, besitzen erstrebenswertere Eigenschaften als parentale Wildtyp-Formen (Liu, W. und N. Hansen, J. Biol. Chem. 267: 25.078-25.085, 1992). Prozeduren für die Isolierung geeigneter Gene und für die Mutagenese und Selektion von Stämmen, die wünschenswerte Mutationen tragen, finden sich in Maniatis, T et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboraton Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY und in der nachfolgenden zweiten Auflage, Sambrook, J. et al., 1989.
Antimikrobielle Peptide werden von einer Vielzahl von Tieren produziert (siehe Übersichtsartikel von Saberwal, G. und R. Nagaraj, Biochim. Biophys. Act. 1197: 109-131, 1994). Ein Beispiel ist ein Peptid der Cecropin-Familie, produziert durch Cecropia-Motten. Mehrere Cecropine enthalten 37 Reste, von denen 6 Lysin sind. Cecropine sind aktiv sowohl gegen Grampositive als auch Gram-negative Bakterien. Andere von Insekten produzierte Peptide beinhalten Apidaecin (aus Honigbienen), Andropin (aus Fruchtfliegen) und Cecropin-Familienmitglieder aus Hummeln, Fruchtfliegen und anderen Insekten.
Die Defensine werden von Säugern, einschließlich Menschen produziert und haben allgemein eine Länge von etwa 29-34 Resten, und die Magainine (etwa 23 Reste) werden von Amphibien, wie etwa Xenopus laevis produziert. Defensine aus dem Menschen (HNP-1, -2, -3 und -4), dem Meerschweinchen (GPNP), dem Kaninchen (NP-1, -2, -3A, -3B, -4 und -5) und der Ratte (NP-1, -2, -3 und -4) haben eine signifikante Zahl von Homologie-Regionen gemeinsam. Defensine können antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positive Bakterien oder Gram-negative Bakterien und Pilze haben, mit minimalen inhibitorischen Konzentrationen im mM-Bereich. Kaninchen NP-1 und NP-2 sind potentere antimikrobielle Mittel als andere in dieser Familie. Andere antimikrobielle Säugerpeptide beinhalten murines Cryptin, Bactenecin aus Rinder-Granulozyten und Indolicidin, sowie seminales Plasmin aus Rindersperma. Zusätzliche antimikrobielle Mittel aus Amphibien beinhalten PGLA, XPF, LPF, CPG, PGQ, Bombinin aus Bombina variegata, die Bombinin-artigen Peptide BLP-1, -2, -3 und -4 aus B. orientalis und Brevinine aus Rana esculenta. Invertebraten, wie etwa der Pfeilschwanzkrebs, können eine Quelle antimikrobieller Peptide sein, wie etwa von Tachyplesinen (I, II und III) und den Polyphemusinen (I und II).
Peptide in diesen Familien antimikrobieller Mittel sind im allgemeinen kationisch und können ein breites antimikrobielles Spektrum besitzen, einschließlich sowohl antibakterieller als auch antipilzlicher Aktivitäten. Das Hinzufügen positiv geladener Reste kann die antimikrobielle spezifische Aktivität mehrfach steigern. Man nimmt an, dass die positiven Ladungen beim Einsetzen der Peptide in die Membranen der empfindlichen Organismen helfen, wobei die Peptidmoleküle in diesem Zusammenhang Poren ausbilden können und einen Ausstrom von Ionen und anderen Metaboliten verursachen. Strukturelle Studien an dem 33 Reste großen Peptid-Neurotoxin Pardaxin der Mosesscholle z.B. zeigen, dass das succinylierte Pardaxin sich langsamer in Erythrocyten und Modellmembranen inseriert als unmodifiziertes Pardaxin (Shai, Y et al., J. Biol. Chem. 265: 20, 202-20, 209, 1990). Die positiv geladenen Magaininmoleküle können sowohl den Metabolismus von E. coli als auch das elektrische Potential der Mitochondrien zerstören (Westerhoff, H.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6597-6601, 1989).
Neue Peptide, z.B. ein Cecropin-Melittin-Hybrid und synthetische D-Enantiomere besitzen antimikrobielle Aktivität (Merrifield, R.B. et al., „Antimicrobial peptides", Ciba Foundation Symp. 186, John Wiley, Chichester, S. 5-26, 1994). Ein derartiges synthetisches Cecropin-Melittin-Peptid ist 5mal aktiver gegen Mycobacterium smegmatis als Rifampicin.
Zielsteuernde Gruppierungen können Pflanzenproteine mit Affinitäten für bestimmte Zielorganismen sein, z.B. ein Mitglied der Lektin-Proteinfamilie mit Affinität für Polysaccharide.
Zielsteuernde Gruppierungen können synthetische Peptide, wie etwa Polylysin, Polyarginin, Polyornithin und synthetische Heteropolypeptide sein, die wesentliche Anteile solcher positiv geladenen Aminosäurereste umfassen. Solche Peptide können chemisch synthetisiert oder biologisch in rekombinanten Organismen produziert werden, wobei in diesem Fall das Peptid der zielsteuernden Gruppierung als Teil eines größeren Proteins erzeugt werden kann, z.B. in Form der N-terminalen Reste, und von diesem größeren Protein abgespalten werden kann. Polypeptide, die als „Rückgrat"- und „Brücken"-Gruppierungen geeignet sind, sind auch als Zielsteuerungsgruppierungen geeignet, sofern sie genug Affinität für den Zielorganismus besitzen. Die beschriebenen Überlegungen sind somit angemessen für Überlegungen zu Zielsteuerungsgruppierungen. Zielsteuernde Gruppierungen können durch die Vielzahl der hier beschriebenen Verfahren synthetisiert, selektiert oder angereichert werden.
Zielsteuernde Gruppierungen müssen nicht auf Peptid-Zusammensetzungen beschränkt sein, sondern können Lektine, Polysaccharide, Steroide und metallorganische Zusammensetzungen sein. Zielsteuernde Gruppierungen können aus Zusammensetzungen aufgebaut sein, die sowohl aus Aminosäuren als auch aus Zuckern bestehen, wie etwa Mucopolysaccharide. Eine nützliche zielsteuernde Gruppierung kann in ihrer Natur teilweise ein Lipid und teilweise ein Peptid sein, wie etwa ein Lipoprotein niedriger Dichte.
Serum-Lipoproteine besonders hoher Dichte und Lipoproteine niedriger Dichte (HDL und LDL) können an Proteine auf bakteriellen Oberflächen binden (Emancipator, K. et al., Infect. Immun. 60: 596-601, 1992). HDL und speziell rekonstituiertes HDL neutralisieren bakterielle Lipopolysaccharide sowohl in vitro als auch in vivo (Wurfel MM et al., J. Exp. Med. 181: 1743-1754, 1995). Endogenes LDL kann gegen die letalen Effekte von Endotoxin und Gram-negativer Infektion schützen (Netea, M. et al., J. Clin. Invest. 97 1366-1372, 1996). Die geeigneten Bindungselemente der Lipoproteine an bakterielle Oberflächenkomponenten können durch in der Technik bekannte Verfahren der Molekularbiologie identifiziert werden, und das Bindungselement von Lipoproteinen kann als Zielsteuerungsgruppierung in Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Produktion und Durchtesten von Kandidaten für eine Peptid-Zielsteuerungsgruppierung
Der Erfinder hat entdeckt, dass Moleküle, z.B. Peptide, die keine Antikörper und Mitglieder von Ligandenpaaren hoher Affinität sind, verwendet werden können, um einen Photosensibilisator zu einem Zielorganismus zu leiten. Die folgenden Verfahren können verwendet werden, um die hier offenbarten Zielsteuerungsgruppierungen zu modifizieren oder zu verfeinern oder um neue Zielsteuerungsgruppierungen zu entdecken.
Sobald ein Beispiel für eine Zielsteuerungsgruppierung angemessener Affinität bereitgestellt worden ist, kann ein Fachmann die offenbarte Struktur (z.B. eines Polylysin-Polypeptids) verändern, indem er Fragmente oder Analoga produziert und die neu produzierten Strukturen auf eine Modifikation der Affinität oder Spezifität hin testet. Beispiele von Verfahren, die die Produktion und das Testen von Fragmenten und Analoga erlauben, sind unten beschrieben. Diese Verfahren können verwendet werden, um Fragmente und Analoga eines bekannten natürlich vorkommenden Polypeptids oder Proteins, das eine Zielsteuerungsgruppierung ist, z.B. ein Polypeptid, wie etwa Histatin oder ein Lipoprotein niedriger Dichte, von denen jedes Bindungsaffinität für Zellen einer oder mehrerer Bakterienspezies besitzt, herzustellen.
Erzeugung von Fragmenten
Fragmente eines Proteins können auf mehrere Weisen produziert werden, z.B. rekombinant, durch proteolytischen Verdau oder durch chemische Synthese. Innere oder terminale Fragmente eines Polypeptids können erzeugt werden, indem man ein oder mehrere Nukleotide von einem Ende (für ein terminales Fragment) oder von beiden Enden (für ein inneres Fragment) einer Nukleinsäure entfernt, die für das Polypeptid codiert. Die Expression der mutagenisierten DNA erzeugt Polypeptid-Fragmente. Der Verdau mit am Ende abspaltenden prozessiven Exonukleasen kann somit DNAs erzeugen, die für einen Array von Fragmenten codieren. DNAs, die für Fragmente eines Proteins codieren, können auch durch zufälliges Scheren, Restriktionsverdau oder durch eine Kombination der oben diskutierten Verfahren hergestellt werden.
Fragmente können außerdem unter Verwendung von Techniken chemisch synthetisiert werden, die in der Technik als konventionelle Merrifield Festphasen f-Moc- oder t-Boc-Chemie bekannt sind. Beispielsweise können Peptide der vorliegenden Erfindung willkürlich in Fragmente der gewünschten Länge ohne eine Überlappung der Fragmente unterteilt werden, oder sie können in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge unterteilt werden.
Erzeugung von Analoga: Herstellung veränderter DNA- und Peptidseguenzen durch Zufalls verfahren
Aminosäuresequenz-Varianten eines Proteins können durch Zufallsmutagenese von DNA hergestellt werden, die für ein Protein oder für eine bestimmte Domäne oder Region eines Proteins codiert. Nützliche Verfahren beinhalten PCR-Mutagenese und Sättigungsmutagenese. Eine Bibliothek zufälliger Aminosäuresequenz-Varianten kann auch durch die Synthese eines Sets degenerierter Oligonukleotidsequenzen erzeugt werden (Verfahren zum Durchtesten von Proteinen in einer Bibliothek von Varianten finden sich hier an anderer Stelle.)
PCR-Mutagenese
Bei der PCR-Mutagenese wird eine reduzierte Wiedergabetreue der Taq-Polymerase verwendet, um Zufallsmutationen in ein kloniertes DNA-Fragment einzuführen (Leung et al., 1989, Technique 1:11-15). Dies ist ein sehr wirksames und relativ schnelles Verfahren, um Zufallsmutationen einzuführen. Die zu mutagenisierende DNA-Region wird unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Bedingungen amplifiziert, die die Wiedergabetreue der DNA-Synthese durch Taq-DNA-Polymerase reduzieren, z.B. durch Verwendung eines dGTP/dATP-Verhältnisses von fünf und Zugeben von Mn²⁺ zu der PCR-Reaktion. Der Pool amplifizierter DNA-Fragmente wird in geeignete Klonierungsvektoren eingesetzt, um Bibliotheken von Zufallsmutanten zu erzeugen.
Sättigungsmutagenese
Sättigungsmutagenese erlaubt die schnelle Einführung einer großen Anzahl von Einzelbasensubstitutionen in klonierte DNA-Fragmente (Mayers et al., 1985, Science 229: 242). Diese Technik beinhaltet die Erzeugung von Mutationen, z.B. durch chemische Behandlung oder Bestrahlung von einzelsträngiger DNA in vitro und die Synthese eines komplementären DNA-Strangs. Die Mutationsfrequenz kann moduliert werden durch Modulieren des Schweregrads der Behandlung, und es können im Wesentlichen alle möglichen Basensubstitutionen erhalten werden.
Da dieses Verfahren keine genetische Selektion auf mutante Fragmente beinhaltet, werden sowohl neutrale Substitutionen als auch solche, die die Funktion verändern, erhalten. Die Verteilung von Punktmutationen ist nicht einseitig auf konservierte Sequenzelemente ausgerichtet.
Degenerierte Oligonukleotide
Eine Bibliothek von Homologen kann auch aus einem Satz degenerierter Oligonukleotidsequenzen erzeugt werden. Die chemische Synthese von degenerierten Sequenzen kann in einem automatischen DNA-Synthesegerät durchgeführt werden, und die synthetischen Gene können dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Synthese degenerierter Oligonukleotide ist in der Technik bekannt (siehe z.B. Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Herausgeber AG Walton, Amsterdam: Elsevier S. 273-289; Itakura et al. (1984) Annu Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11 : 477. Solche Techniken sind bei der gesteuerten Evolution anderer Proteine verwendet worden (siehe z.B. Scott et al., (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; ebenso wie die US-Patente der Nummern 5,223,409; 5,198,346 und 5,096,815.
Erzeugung von Analoga: Erzeugung veränderter DNA- und Peptidsequenzen durch gesteuerte Mutagenese
Nicht-zufällige oder gesteuerte Mutagenesetechniken können verwendet werden, um spezifische Sequenzen oder Mutationen in spezifischen Regionen bereitzustellen. Diese Techniken können verwendet werden, um Varianten zu erzeugen, die z.B. folgendes beinhalten: Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten der bekannten Aminosäuresequenz eines Proteins. Die Stellen für die Mutationen können einzeln oder in Serie modifiziert werden, z.B. durch (1) zunächst Substituieren mit konservierten Aminosäuren und dann mit einer radikaleren Auswahl in Abhängigkeit von den erreichten Ergebnissen, (2) Deletieren des Zielrests oder (3) Inserieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse angrenzend an die lokalisierte Stelle, oder Kombinationen der Optionen 1-3.
Alanin-Scanning-Mutagenese
Alanin-Scanning-Mutagenese ist ein nützliches Verfahren für die Identifizierung bestimmter Reste oder Regionen des gewünschten Proteins, die bevorzugte Orte oder Domänen für die Mutagenese sind (Cunningham und Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). Beim Alanin-Scannen wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z.B. geladene Reste, wie etwa Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure ersetzt (am bevorzugtesten Alanin oder Polyalanin). Der Austausch einer Aminosäure kann die Interaktion der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umwelt in oder außerhalb der Zelle beeinflussen. Diejenigen Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen zeigen, werden dann verfeinert, indem man weitere oder andere Varianten an oder für die Stellen der Substitution einführt. Somit, obwohl die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt ist, ist die Natur der Mutation als solche nicht zwingend vorbestimmt. Beispielsweise, zum Optimieren der Leistung einer Mutation an einer gegebenen Stelle, kann Alanin-Scanning- oder Zufallsmutagenese am Zielcodon oder an der Zielregion durchgeführt werden, und die exprimierten gewünschten Varianten der Protein-Untereinheiten werden auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität hin durchgemustert.
Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese
Die Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese ist ein nützliches Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertions-Varianten von DNA, siehe z.B. Adelman et al., (DNA 2:183, 1983). Kurz dargestellt, wird die gewünschte DNA verändert durch Anhybridisieren eines Oligonukleotids, das eine Mutation im Bezug auf eine DNA-Matrize codiert, wobei die Matrize die einzelsträngige Form eines Plasmids oder eines Bakteriophagen ist, der die unveränderte oder wildtypische DNA-Sequenz des gewünschten Proteins enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen vollständigen zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren, der somit den Oligonukleotid-Primer eingebaut haben wird und der für die ausgewählte Veränderung der gewünschten Protein-DNA codieren wird. Allgemein werden Oligonukleotide von wenigstens 25 Nukleotiden Länge verwendet. Ein optimales Oligonukleotid wird 12 bis 15 Nukleotide aufweisen, die auf beiden Seiten des/der Nukleotids/Nukleotide, die für die Mutation codieren, vollständig komplementär zur Matrize sein werden. Dies stellt sicher, dass das Oligonukleotid korrekt an das einzelsträngige DNA-Matrizenmolekül hybridisieren wird. Die Oligonukleotide werden leicht unter Verwendung von Techniken synthetisiert, die in der Technik bekannt sind, wie etwa denjenigen, die von Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765, 1978) beschrieben worden sind.
Kassetten-Mutagenese
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassetten-Mutagenese, basiert auf einer Technik, die von Wells et al. beschrieben wurde (Gene, 34: 315, 1985). Das Ausgangsmaterial ist ein Plasmid (oder ein anderer Vektor), der die zu mutierende DNA der Proteinuntereinheit enthält. Das/Die Codon(s), die in der DNA der Proteinuntereinheit mutiert werden sollen, werden identifiziert. Es muss eine singuläre Restriktionsendonuklease-Stelle an beiden Seiten der identifizierten Mutationsstelle(n) vorliegen. Wenn keine derartigen Restriktionsstellen vorliegen, so können sie unter Verwendung der oben beschriebenen Oligonukleotid-vermittelten Mutagenese erzeugt werden, um sie an geeigneten Positionen in der DNA der gewünschten Protein-Untereinheit einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt wurden, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonukleotid, das für die DNA-Sequenz zwischen den Restriktionsstellen codiert, jedoch die gewünschte Mutation bzw. die gewünschten Mutationen enthält, wird unter Verwendung von Standardprozeduren synthetisiert. Die beiden Stränge werden getrennt synthetisiert und dann unter Verwendung von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonukleotid wird als die Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist dafür vorgesehen, 3'- und 5'-Ende zu besitzen, die mit den Enden des linearisierten Plasmids vergleichbar sind, sodass sie direkt an das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die gewünschte mutierte DNA-Sequenz der Proteinuntereinheit.
Kombinatorische Mutagenese
Kombinatorische Mutagenese kann ebenfalls verwendet werden, um Mutanten zu erzeugen. Beispielsweise werden die Aminosäuresequenzen für eine Gruppe von Homologen oder anderen verwandten Proteinen einem Alignment unterzogen, bevorzugt, um die höchstmögliche Homologie zu fördern. Alle Aminosäuren, die an einer gegebenen Position der dem Alignment unterzogenen Sequenzen erscheinen, können dann ausgewählt werden, um ein degeneriertes Set kombinatorischer Sequenzen zu erzeugen. Die abgewandelte Bibliothek von Varianten wird durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt, und sie wird von einer abgewandelten Genbibliothek codiert. Beispielsweise kann ein Gemisch synthetischer Oligonukleotide enzymatisch in Gensequenzen ligiert werden, sodass das degenerierte Set potentieller Sequenzen in Form individueller Peptide exprimierbar ist, oder, alternativ, als Set größerer Fusionsproteine, die den Satz degenerierter Sequenzen enthalten.
Primäre Hochdurchsatzverfahren zum Durchmustern von Bibliotheken von Peptidfragmenten oder Homologen
Es sind in der Technik verschiedene Techniken bekannt, um die erzeugten Genprodukte durchzumustern. Techniken zum Durchmustern großer Bibliotheken beinhalten oft das Klonieren der interessierenden Nukleinsäuren in replizierbare Expressionsvektoren, das Transformieren geeigneter Zellen mit der resultierenden Bibliothek von Vektoren, und das Exprimieren der Gene unter Bedingungen, bei denen die Detektion einer gewünschten Aktivität, z.B. in diesem Fall die Bindung an einen Zielorganismus oder an eine Oberflächenkomponente des Zielorganismus, eine relativ einfache Isolierung des Vektors erleichtert, der das Gen codiert, dessen Produkt detektiert wurde. Jede der unten beschriebenen Techniken ist einer Hochdurchsatz-Analyse für das Durchmustern großer Zahlen von erzeugten Sequenzen zugänglich, z.B. mittels Techniken der Zufallsmutagenese.
Präsentations-Bibliotheken
Bei einem Ansatz der Screening-Assays werden die Kandidatenpeptide auf der Oberfläche einer Zelle oder eines Viruspartikels präsentiert, und die Fähigkeit bestimmter Zellen oder viraler Partikel, über das präsentierte Produkt an ein geeignetes Protein des Zielorganismus zu binden, wird in einem „Panning-Assay" detektiert. Beispielsweise kann die Genbibliothek in das Gen für ein Oberflächenmembranprotein einer Bakterienzelle kloniert werden, und das resultierende Fusionsprotein wird durch „Panning" detektiert (Ladner et al., WO 88/06630; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 1370-1371; und Goward et al. (1992) TIBS 18: 136-140). In einer ähnlichen Weise kann ein detektierbar markierter Ligand verwendet werden, um auf potentiell funktionelle Peptid-Homologe hin durchzutesten. Fluoreszent markierte Liganden, z.B. Zielorganismen, können verwendet werden, um Homologe zu detektieren, die die Ligandenbindungsaktivität beibehalten. Die Verwendung fluoreszent markierter Liganden ermöglicht es, Zellen visuell zu inspizieren und unter einem Fluoreszenzmikroskop abzutrennen, oder, wo es die Zellmorphologie erlaubt, diese durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer abzutrennen.
Eine Genbibliothek kann als Fusionsprotein auf der Oberfläche eines viralen Partikels exprimiert werden. Bei Systemen mit filamentösen Phagen beispielsweise können Fremdpeptidsequenzen auf der Oberfläche infektiöser Phagen exprimiert werden, wodurch zwei signifikante Vorteile bereitgestellt werden. Erstens, da diese Phagen bei Konzentrationen von gut über 10³ Phagen pro Milliliter auf Affinitätsmatrizes appliziert werden können, kann eine große Anzahl von Phagen gleichzeitig durchgemustert werden. Zweitens, da jeder infektiöse Phage ein Genprodukt auf seiner Oberfläche präsentiert, kann der Phage, wenn ein bestimmter Phage in niedriger Ausbeute an einer Affinitätsmatrix gewonnen wird, durch eine weitere Infektionsrunde amplifiziert werden. Die Gruppe der nahezu identischen filamentösen E. coli-Phagen M13, fd und f1 wird bei Phage-Display-Bibliotheken am häufigsten verwendet. Es können entweder die Phagen-Hüllproteine gIII oder gVIII verwendet werden, um Fusionsproteine ohne eine Zerstörung der schlussendlichen Verpackung des Viruspartikels zu erzeugen. Fremdepitope können als NH₂-terminales Ende von pIII exprimiert werden, und Phagen, die solche Epitope tragen, werden aus einem großen Überschuss an Phagen, denen dieses Epitop fehlt, wiedergewonnen (Ladner et al. PCT-Veröffentlichung WO 90/02909; Garrard et al., PCT-Veröffentlichung WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352 : 624-628; und Barbas et al. (1992) PNAS 89 : 4457-4461).
Ein gebräuchlicher Ansatz verwendet den Maltoserezeptor von E, coli (das äußere Membranprotein, LamB) als Peptid-Fusionspartner (Charbit et al. (1986) EMBO 5, 3029-3037). Es sind Oligonukleotide in für das LamB-Gen codierende Plasmide inseriert worden, um Peptide zu produzieren, die in einen der extrazellulären Schleifen-Photosensibilisatoren des Proteins fusioniert worden sind. Diese Peptide sind für die Bindung an Liganden, z.B. an Antikörper, verfügbar und können eine Immunantwort auslösen, wenn die Zellen Tieren verabreicht werden. Andere Zelloberflächenproteine, z.B. OmpA (Schorr et al. (1991) Vaccines 91, S. 387-392), PhoE (Agterberg et al. (1990) Gene 88, 37-45) und PAL (Fuchs et al. (1991) Bio/Tech 9, 1369-1372), ebenso wie große bakterielle Oberflächenstrukturen, haben als Vehikel für die Peptidpräsentation gedient. Peptide können auch an Pilin fusioniert werden, ein Protein, das polymerisiert, um den Pilus, ein Leitelement für den interbakteriellen Austausch genetischer Information, aufzubauen (Thiry et al. (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993). Aufgrund seiner Rolle bei der Interaktion mit anderen Zellen liefert der Pilus einen nützlichen Träger für die Präsentation von Peptiden gegenüber der extrazellulären Umgebung. Eine weitere große Oberflächenstruktur, die für die Peptidpräsentation verwendet wird, ist das Bewegungsorgan des Bakteriums, die Flagelle. Die Fusion von Peptiden an das Untereinheitprotein Flagellin bietet eine dichte Anordnung vieler Peptidkopien auf der Wirtszelle (Kuwajima et al., (1988) Bio/Tech 6, 1080-1083). Oberflächenproteine anderer bakterieller Spezies haben ebenfalls als Peptidfusionspartner gedient. Beispiele hierfür beinhalten das Staphylococcus-Protein A und die Außenmembran-IgA-Protease von Neisseria (Hansson et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 4239-4245; Klauser et al. (1990) EMBO J. 9, 1991-1999).
Bei den oben beschriebenen filamentösen Phagen-Systemen und dem LamB-System erfolgt die physikalische Verbindung zwischen dem Peptid und der es codierenden DNA dadurch, dass die DNA in einem Partikel (Zelle oder Phage) enthalten ist, der das Peptid auf seiner Oberfläche trägt. Ein Einfangen des Peptids fängt auch den Partikel und die darin enthaltene DNA ein. Ein alternatives Schema verwendet das DNA-bindende Protein LacI, um eine Verbindung zwischen Peptid und DNA herzustellen (Cull et al., 1992, PNAS USA 89: 1865-1869). Dieses System verwendet ein Plasmid, das das LacI-Gen mit einer Oligonukleotid-Klonierungsstelle an seinem 3'-Ende enthält. Unter der kontrollierten Induktion durch Arabinose wird ein LacI-Peptid-Fusionsprotein produziert. Diese Fusion behält die natürliche Fähigkeit von LacI bei, an kurze DNA-Sequenzen zu binden, die als LacO-Operator (LacO) bekannt sind. Durch Installieren von zwei Kopien von LacO auf dem Expressionsplasmid bindet die LacI-Peptid-Fusion fest an das sie codierende Plasmid. Da die Plasmide in jeder Zelle nur eine einzige Oligonukleotidsequenz enthalten und jede Zelle nur eine einzige Peptidsequenz exprimiert, werden die Peptide spezifisch und stabil mit der DNA-Sequenz assoziiert, die ihre Synthese gesteuert hat. Die Zellen der Bibliothek werden vorsichtig lysiert und die Peptid-DNA-Komplexe werden einer Matrix mit immobilisiertem Rezeptor ausgesetzt, um die Komplexe, die aktive Peptide enthalten, wiederzugewinnen. Die assoziierte Plasmid-DNA wird dann für die Amplifikation und DNA-Sequenzierung erneut in Zellen eingeführt, um die Identität der Peptid-Liganden zu bestimmen. Als Demonstration der praktischen Anwendbarkeit des Verfahrens wurde eine große Zufallsbibliothek von Dodecapeptiden erstellt und über einen monoklonalen Antikörper selektiert, der gegen das Opioid-Peptid Dynorphin B erzeugt worden war. Es wurde eine Kohorte von Peptiden gewonnen, alle verwandt durch eine Konsensus-Sequenz, die einem Sechs-Reste-Abschnitt von Dynorphin B entspricht (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-1869).
Dieses Schema, manchmal bezeichnet als „Peptide auf Plasmiden", unterscheidet sich in zwei wichtigen Punkten von den Phage-Display-Verfahren. Erstens werden die Peptide an den C-Terminus des Fusionsproteins angeheftet, was in der Präsentation von Bibliotheksmitgliedern als Peptide mit freien Carboxy-Termini resultiert. Beide der filamentösen Phagen-Hüllproteine, pIII und pVIII, werden über ihre C-Termini an dem Phagen verankert, und die Gastpeptide werden in den sich nach außen ausdehnenden N-terminalen Domänen platziert. Bei einigen Ausgestaltungen werden die vom Phagen präsentierten Peptide genau am Amino-Terminus des Fusionsproteins präsentiert (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382). Ein zweiter Unterschied ist der Satz biologischer „Voreingenommenheiten", der die Population von Peptiden beeinflusst, die tatsächlich in den Bibliotheken vorhanden sind. Die LacI-Fusionsmoleküle sind auf das Zytoplasma der Wirtszellen beschränkt. Die Phagenhüll-Fusionen werden während der Translation kurz dem Kontakt mit dem Zytoplasma ausgesetzt, werden jedoch rasch über die innere Membran in das periplasmatische Kompartiment sekretiert, bleiben durch ihre C-terminalen hydrophoben Domänen in der Membran verankert, wobei die N-Termini, die die Peptide enthalten, ins Periplasma vorragen, während sie auf den Einbau in Phagen-Partikel warten. Die Peptide in den LacI- und Phagen-Bibliotheken können sich als Ergebnis ihrer Exposition gegenüber verschiedenen proteolytischen Aktivitäten signifikant unterscheiden. Die Phagenhüllproteine benötigen den Transport über die innere Membran und die Prozessierung durch Signalpeptidase als „Vorspiel" für den Einbau in den Phagen. Bestimmte Peptide üben eine schädliche Wirkung auf diese Prozesse aus und sind daher in den Bibliotheken unterrepräsentiert (Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251). Diese spezifischen Voreingenommenheiten sind im LacI-Präsentationssystem kein Faktor.
Die Anzahl kleiner Peptide, die in rekombinanten Zufallsbibliotheken verfügbar ist, ist enorm. Bibliotheken mit 10⁷-10⁹ unabhängigen Klonen werden routinemäßig hergestellt. Es sind Bibliotheken mit immerhin 10¹¹ Rekombinanten erzeugt worden, jedoch nährt sich diese Größe der praktischen Grenze für Klonbibliotheken. Diese Begrenzung der Bibliotheksgröße erfolgt durch den Schritt der Transformation der DNA, die die Zufallssegmente enthält, in die Wirtsbakterienzellen. Um diese Begrenzung zu umgehen, ist jüngst ein in vitro-System entwickelt worden, das auf der Präsentation naszierender Peptide in Polysomkomplexen basiert. Dieses Präsentationsbibliotheks-Verfahren besitzt das Potential, Bibliotheken zu erzeugen, die um 3-6 Größenordnungen größer sind als die derzeit erhältlichen Phage/Phagemid- oder Plasmid-Bibliotheken. Weiterhin erfolgen die Konstruktion der Bibliotheken, die Expression der Peptide und das Durchtesten in einem vollständig zellfreien Format.
Bei einer Anwendung dieses Verfahrens (Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251) wurde eine molekulare DNA-Bibliothek konstruiert, die 10¹² Decapeptide codiert, und die Expression der Bibliothek erfolgte in einem E. coli S30 in vitro-System mit gekoppelter Transkription/Translation. Die Bedingungen wurden so ausgewählt, dass sie die Ribosomen auf der mRNA anhalten bzw. abbremsen, was die Akkumulation eines wesentlichen Anteils der RNA in Polysomen verursacht und Komplexe ergibt, die naszierende Peptide beinhalten, die immer noch mit ihrer codierenden RNA verbunden sind. Die Polysomen sind hinreichend robust, um einer Affinitätsreinigung an immobilisierten Rezeptoren unterzogen werden zu können, und zwar im wesentlichen in derselben Weise, in der die konventionelleren rekombinanten Peptidpräsentationsbibliotheken durchgemustert werden. Die RNA aus den gebundenen Komplexen wird wiedergewonnen, zu cDNA umgesetzt und mittels PCR amplifiziert, um eine Matrize für die nächste Runde der Synthese und Durchmusterung zu erzeugen. Das Verfahren der Polysomen-Präsentation kann mit dem Phage-Display-System gekoppelt werden. Nach mehreren Runden der Durchmusterung wurde cDNA aus dem angereicherten Polysomenpool in einen Phagemid-Vektor kloniert. Dieser Vektor dient sowohl als Peptid-Expressionsvektor, der die mit dem Hüllprotein fusionierten Peptide präsentiert, als auch als DNA-Sequenziervektor für die Peptid-Identifizierung. Durch Exprimieren der von dem Polysom stammenden Peptide auf einem Phagen kann man entweder die Affinitätsselektionsprozedur in diesem Format weiterführen oder die Peptide auf einzelnen Klonen auf Bindungsaktivität in einem Phagen-ELISA oder auf Bindungsspezifität in einem Komplettierungs-Phagen-ELISA hin untersuchen (Barret et al., (1992) Anal Biochem 204, 357-364). Um die Sequenzen der aktiven Peptide zu identifizieren, sequenziert man die DNA, die von dem Phagemid-Wirt erzeugt wird.
Sekundäre Screens
An den oben beschriebenen Hochdurchsatz-Test können sich sekundäre Screens anschließen, um Moleküle zu identifizieren, anzureichern und zu selektieren, die eine angemessene Affinität für eine biologische Einheit besitzen. Sekundäre Screens hängen von der Fähigkeit der Zielsteuerungsgruppierung ab, ein Polymer von Interesse zu binden. Beispielsweise kann ein Oberflächenprotein oder ein Kohlenhydrat des interessierenden Zielorganismus verwendet werden, um Liganden aus einer Gruppe von Peptidfragmenten zu identifizieren, die durch einen der oben beschriebenen primären Screens isoliert wurden. Man kann hochreine Materialien verwenden, z.B. gereinigtes Protein aus einem viralen Pathogen, erhalten aus einem rekombinanten Organismus, der spezifisch zum Zweck der Produktion dieses Materials gewonnen wurde, oder man kann eine Rohpräparation des Zielorganismus verwenden, wie etwa eine Zellwand- oder Membranpräparation, sogar eine hitzeinaktivierte oder Formalin-behandelte Präparation des Zielorganismus.
Die Beispiele unten zeigen zwei Beispiele von Zielsteuerungs-Materialien, eine Polyaminosäure mit positiver Ladung, Polylysin, die Affinität für ein breites Spektrum von Bakterienspezies besitzt und außerdem als Rückgrat für die Ankopplung zusätzlicher Zielsteuerungsgruppierungen dienen kann; und das Speichelprotein Histatin, das Affinität für mehrere Spezies von Mundbakterien besitzt. Jedes dieser Materialien kann als Ausgangsmaterial bei den für die Phage-Display-Bibliothek beschriebenen Prozeduren, wie beschrieben, verwendet werden, z.B. durch den Einbau der Nukleinsäuresequenz in diejenige von Gen III des M13-Phage- Display-Vektors (siehe z.B. Scott et al. (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87 : 6378-6382; ebenso wie die US-Patente Nr. 5,223,409 ; 5,198,346 und 5,096,815). In diesem Fall kann das Zielmaterial für die Anreicherung der Phagenbibliothek eine Bakterienzellwand-Fraktion sein, isoliert durch Ultraschallbehandlung des Zielorganismus unter kalten Bedingungen in Gegenwart von Standard-Proteaseinhibitoren, Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um die Zellwände von dem Zytoplasma abzutrennen, und Resuspendieren des Wandmaterials in Puffer, zur Verwendung in mehreren Runden der Bindungsselektion mittels Phagenbibliothek. Die Prozeduren sind im US-Patent Nr. 5,223,409 ausführlich beschrieben. Nach zwei bis drei Selektionsrunden können Phagen isoliert werden, die Polyaminosäuresequenzen oder Histatinvarianten mit Affinität für die Zielzellwand tragen, die gegenüber derjenigen des Ausgangsmaterials beträchtlich gesteigert ist. Die Sequenz der verbesserten Varianten wird durch Standardprozeduren der DNA-Sequenzierung problemlos bestimmt, und das Peptid kann durch Standardverfahren der Peptidsynthese in großer Menge produziert werden. Somit sind die Prozeduren, die hier beschrieben sind, um Fragmente und Analoga zu erzeugen und diese auf eine gesteigerte Affinität gegenüber dem Zielorganismus zu testen, in der Technik bekannt.
Zielorganismen
Organismen, auf die die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung abzielen, finden sich auf allen für Licht zugänglichen Flächen oder in lichtzugänglichen Bereichen, z.B. in menschlichen und tierischen Subjekten, auf zu dekontaminierenden Materialien oder auf Nutzpflanzen. Im Falle von Menschen und Tieren sind Infektionen der Epidermis, der Mundhöhle, der Nasenhöhle, der Nebenhöhlen, der Ohren, der Lungen, des Urogenitaltrakts und des Gastrointestinaltrakts für Licht zugänglich. Epidermale Infektionen beinhalten solche mit unerwünschten Organismen von bakteriellem, pilzlichem, viralem und tierischem Ursprung und beinhalten subkutane Infektionen, insbesondere lokalisierte Läsionen, z.B. verursacht durch Protozoen, Parasiten oder parasitäre Milben, wobei diese Infektionen für Licht zugänglich sind. Infektionen der Bauchhöhle, wie etwa solche, die aus einem geplatzten Blinddarm resultieren, sind zumindest über laparoskopische Vorrichtungen für Licht zugänglich. Eine Vielzahl von Hautinfektionen, die hartnäckig gegenüber Antibiotika oder einer langfristigen Antipilzbehandlung sind, z.B. Dermatophykosen des Zehennagels, sind unter Verwendung von Zusammensetzungen der Erfindung für die PDT geeignet.
Ein Hauptgebiet für die Anwendung von Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung sind Erkrankungen und Infektionen der Mundhöhle, z.B. des Zahnfleischs. Die Verfahren der Erfindung sind besonders nützlich für die Behandlung oraler Infektionskrankheiten, z.B. periodontaler Erkrankungen. Da die infizierten Taschen der periodontalen Erkrankung sich innerhalb weniger Millimeter von der Oberfläche der Mundhöhle befinden, bietet die PDT signifikante Vorteile gegenüber den traditionellen physikalischen Verfahren des Abschabens und der antibiotischen Therapie für diesen Zustand. Unerwünschte orale Zielorganismen beinhalten eine große Anzahl bakterieller und pilzlicher Spezies, z.B. eine Bacteroides-Spezies, einschließlich B. gingivalis (nun bekannt als Porphyromonas gingivalis), Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Wolinella recta, eine Eubacterium-Spezies, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Bacteroides forsythus, eine Capnocytophaga-Spezies, Actinobacillus actinomycetamcomitans und Streptococcus mutans.
Eine Lungeninfektion kann durch eine Vielzahl bakterieller Gattungen und Spezies erfolgen, einschließlich der klassischen Tuberkulose durch Mycobacterium tuberculosis, den Pseudomonaden, die die primäre Todesursache bei Patienten mit zystischer Fibrose sind, und Klebsiella, und sie kann außerdem durch eine Vielzahl von Virusstämmen hervorgerufen werden. Eine Vielzahl von Pilzen und Parasiten sind opportunistische Pathogene der Lunge, und die Infektion mit Pneumocystis carinii ist eine häufige Todesursache bei immungeschwächten AIDS-Patienten. Da die Pathogene der Lunge zunehmend resistent gegenüber den klassischen antibiotischen Therapien sind, bietet die PDT mit Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ein alternatives Verfahren zum Eliminieren dieser unerwünschten Organismen, das unabhängig ist von mikrobiellen Resistenzmechanismen. Zusätzliche epidermale Infektionen und Infektionen tieferer Gewebe entstehen durch Verbrennungen, Schrammen, Schnitte und Stichwunden. Die PDT mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist nützlich zur Sterilisierung solcher potentiell infektiöser Stellen, die schnell zu toxischem Schock, einer häufigen Begleiterscheinung von Schussverletzungen, führen können, und zum Behandeln der Stellen zum Eliminieren oder Reduzieren unerwünschter infektiöser Organismen. Ein Hauptgrund der Infektion von Wunden, hauptsächlich Verbrennungen, ist das Gram-negative aerobe Bakterium Pseudomonas. Dieser Organismus produziert ein Exotoxin, für das gezeigt wurde, dass es die Wundheilung verzögert. Mehrfach antibiotikaresistente Stämme von P. aeruginosa werden zu einem signifikanten Problem, insbesondere bei den Verbrennungseinheiten in großen Kliniken. Pseudomonaden produzieren außerdem fulminante Infektionen der Hornhaut. Escherichia coli zusammen mit Staphylococcus aureus sind die zwei häufigsten Bakterien in infizierten Wunden.
Andere Stellen für unerwünschte Zielorganismen beinhalten den Urogenitaltrakt, die Bauchhöhle, das Innen- und Außenohr, die Nasenhöhle und den Gastrointestinaltrakt. Infektiöse Stellen der Proliferation unerwünschter Zielorganismen in Geweben mesothelialen und endothelialen Ursprungs sind ebenfalls über minimal invasive Techniken der PDT zugänglich.
Die Zielorganismen können zellulär oder viral sein. Viren, die unerwünschte Zielorganismen sein können, beinhalten jedwede pathogene Lebensform, umfassend Komponenten aus wenigstens einem Nukleinsäuremolekül und einer oder mehreren Proteinspezies, und sie können außerdem die umhüllten Viren beinhalten. Zielorganismen, die Zellen sind, beinhalten wenigstens eine umgrenzende Zellmembran und sind fähig zur Energieproduktion, Nukleinsäuresynthese und enthalten Ribosomen und sind befähigt zur Synthese von ribosomalem Protein. Die Zellen können einzellig oder mehrzellig sein, und die einzelligen Organismen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Prokaryotische Zielorganismen können Bakterien sein, wobei die Bakterien Gram-negativ oder Gram-positiv oder ohne Zellwand sein können. Die Unterscheidung von Bakterien auf Basis der Gram-Färbung, die darauf basiert, ob Zellen eines spezifischen Stammes oder einer Spezies von Bakterien einen Farbstoff annehmen oder nicht oder nur durch die Gegenfärbung gefärbt werden, ist Fachleuten bekannt. Bakterien, die Zielorganismen der Erfindung sind, können aerob, anaerob, fakultativ anaerob oder mikroaerophil sein. Spirochaeten der Erfindung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Gattungen Borrelia und Treponema. Diese letzte Gattung enthält Spezies, die in variabler Weise mit Erkrankungen wie Gingivitis ulcerativa necroticans, Pinta und Frambösie assoziiert sind, wobei die beiden letzten topische Hautinfektionen sind. Gram-negative helikal/vibroid bewegliche Bakteriengattungen, die als Zielorganismen geeignet sind, beinhalten Campylobacter und Helicobacter. Gram-negative aerobe und mikroaerophile Stäbchen und Kokken beinhalten die Gattungen Bordetella, Neisseria und Legionella. Fakultativ anaerobe Gram-negative Stäbchen beinhalten die Gattungen Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Erwinia, Enterobacter, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Actinobacillus, Klebsiella und Salmonella. Eine wichtige Gruppe von Bakterien als Zielorganismen für die vorliegende Erfindung sind die Gram-positiven Kokken, einschließlich der Gattungen Staphylococcus und Streptococcus, wobei ein Stamm des Letzteren dafür bekannt ist, dass er eine Vielzahl von Infektionen verursacht, einschließlich der Kinderhautkrankheit Impetigo, und einigen Stämmen des Ersteren, der populär als „fleischfressendes Bakterium" bezeichnet wurde. Gram-positive Stäbchen beinhalten Spezies von Listeria, die geeignet sind für die Behandlung durch die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung.
Für die Behandlung mit den Photosensibilisator-Zusammensetzungen geeignete Bakterien unter denjenigen, denen feste Zellwände fehlen, gehören z.B. zur Gattung Mycoplasma. Die Gruppe der Actinomyceten beinhaltet mehrere Spezies von Mycobacterium, die geeignete Zielorganismen der vorliegenden Erfindung darstellen. Weitere Bakteriengattungen, die mit den Konjugatmolekülen der Erfindung behandelt werden können, beinhalten: Enterococcus, Leptospira, Serpulina, Mycoplasma, Bacteroides, Yersinia, Chlamydia, Vibrio, Actinobacillus, Porphyromonas, Haemophilus, Pasteurella, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Corynebacterium und Dermatophilus. Diese und andere, hier nicht aufgelistete Bakteriengruppen und -Gattungen werden vom Fachmann als geeignete Zielbakterien für die Zusammensetzungen der Erfindung erkannt werden.
Viren, auf die durch Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung abgezielt werden kann, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Adenoviren, Herpesviren, Pockenviren und Retroviren. Repräsentative Gattungen pilzlicher Zielorganismen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Cryptococcus, Blastomyces, Paracoccidioides, Candida, Aspergillus, Mycetoma, und sie beinhalten weitere Gattungen, die verschiedene Dermatomykosen verursachen.
Eukaryotische Zielorganismen der vorliegenden Erfindung beinhalten einzellige Protozoen, Pilzpathogene und Parasiten, die eine mehrzellige Phase des Lebenszyklus aufweisen können. Parasiteninfektionen von Subjekten sind für Behandlungen mit den Zusammensetzungen der Erfindung geeignet. Häufige Parasiten, die den Intestinal- und Urogenitaltrakt infizieren oder besiedeln, beinhalten Amöben, Flagellaten und Nematoden. Zusätzlich kann die Infektion mit Trematoden, Cestoden, Ciliaten, kokkidischen und microsporidischen Parasiten in diesen Trakten erfolgen. Mitglieder der Gattungen Leishmania und Onchocerca verursachen Hautgeschwüre, und die Gattung Acanthamoeba kann in Hornhautkratzern des Auges gefunden werden. Leishmania donovani verursacht die tropische geschwürige Hauterkrankung Kala Azar, die geeignet ist für die Behandlung mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Gattungen des Darmtrakts, die geeignet sind für die Zielsteuerung durch Zusammensetzungen der Erfindung beinhalten Entamoeba, Giardia, Cryptosporidium und Microsporidien, Madenwurm und Helminthen-Gattungen. Lungengewebe kann Pneumocystis carinii und, seltener, Amöben, wie etwa Entamoeba, Trematoden oder Cestoden, enthalten. Der Urogenitaltrakt kann mit Trichomonas und mit Schistosoma infiziert sein, die mit Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können.
Virale, prokaryotische und eukaryotische Zielorganismen sind nicht auf Pathogene und Parasiten beschränkt und können höhere Ordnungen, wie etwa Arthropoden, beinhalten. Zielorganismen sind nicht auf die Pathogene und Parasiten von tierischen Subjekten beschränkt und können Pflanzenkrankheiten beinhalten.
Diese Listen werden verwendet, um Anwendungen der vorliegenden Erfindung für Hauptgruppen geeigneter Zielorganismen zu veranschaulichen, nicht jedoch, um die Erfindung auf die aufgelisteten Spezies, Gattungen, Familien, Ordnungen oder Klassen zu begrenzen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Verbindungen der Erfindung beinhalten Konjugatmoleküle, die für die topische Applikation formuliert wurden, und ebenso für die Applikation auf verschiedenen äußeren Organen, wie etwa dem Außenohr oder bei Organen, die der äußeren Verabreichung zugänglich sind, wie etwa durch orale Applikation oder durch Spülen der Lunge. Die hier erwähnten Beispiele sind nicht als limitierend im Hinblick auf die Natur der konjugierten Photosensibilisatorzusammensetzungen der Erfindung oder im Hinblick auf eine bestimmte Verabreichungsroute gedacht, und weitere Routen sind hier aufgelistet. Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Photosensibilisatorzusammensetzungen durch Kombinationstherapie verabreicht werden, d.h. mit anderen Mitteln kombiniert werden. Beispielsweise kann die Kombinationstherapie eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung beinhalten, mit wenigstens einem anderen Photosensibilisator, wenigstens einem Antibiotikum oder einer anderen konventionellen Therapie.
Photosensibilisator-Konjugate, die in einem wässrigen Lösungsmittel in gewissem Maße unlöslich sind, können in einem Liposom oder in einer zeitverzögerten Weise appliziert werden, sodass die Bestrahlung stoßweise unter Verwendung eines Schemas von Bestrahlungsphasen, abwechselnd mit Phasen der Nicht-Bestrahlung, appliziert werden kann. Andere ins Auge gefasste Schemata sind durchgehende Bestrahlungsphasen auf niedrigerem Niveau, für die eine zeitverzögerte Formulierung geeignet ist.
Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antipilzliche Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen, die physiologisch kompatibel sind. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt. Bevorzugt ist der Träger geeignet für die orale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, parenterale, spinale oder epidermale Applikation (z.B. durch Injektion oder Infusion). In Abhängigkeit von der Verabreichungsroute kann die aktive Verbindung in ein Material geschichtet werden, um die Verbindung vor der Wirkung von Säuren und anderen natürlichen Bedingungen zu schützen, die die Verbindung inaktivieren könnten.
Die Konjugate der Erfindung können auch parenteral verabreicht werden. Der Ausdruck „parenteral verabreicht", wie er hier verwendet wird, bedeutet andere Weisen der Verabreichung als die orale und topische Verabreichung, üblicherweise durch Injektion, und er beinhaltet, ohne hierauf beschränkt zu sein, die intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subcutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoide, intraspinale, epidurale und intrasternale Injektion und Infusion.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch eine Vielzahl von in der Technik bekannten Verfahren verabreicht werden. Wie dem Fachmann ersichtlich sein wird, wird die Route und/oder Art und Weise der Verabreichung in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen variieren. Die aktive Verbindung kann mit Trägern hergestellt werden, die die Verbindung vor einer raschen Freisetzung schützen werden, sowie etwa mit Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung, einschließlich Implantaten, transdermalen Pflastern und mikroverkapselten Auslieferungssystemen. Es können biologisch abbaubare biokompatible Polymere verwendet werden, wie etwa Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Viele Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind patentiert oder dem Fachmann allgemein bekannt. Siehe z.B. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, Herausgeber, Marcel Dekker Inc., New York, 1978.
Die Dosis-Schemata werden angepasst, um die optimale erwünschte Antwort zu erhalten (siehe z.B. therapeutische Antwort). Beispielsweise kann ein einzelner Bolus verabreicht werden, es können mehrere unterteilte Dosen über die Zeit verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert oder erhöht werden, wie es durch die Dringlichkeit der therapeutischen Situation angezeigt ist.
Der Durchschnittsfachmann kann die erforderliche wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmen und verschreiben. Beispielsweise kann zum Erreichen des erwünschten therapeutischen Effekts mit Dosierungsniveaus der bekannten oder neuen Photosensibilisator-Zusammensetzung begonnen werden, die niedriger als erforderlich sind, und die Dosis graduell gesteigert werden, bis der gewünschte Effekt erreicht ist.
Weitere Ausführungsformen
Die Zusammensetzungen der Erfindung können verwendet werden, um nicht-belebte Objekte zu dekontaminieren, wie etwa medizinische und dentale Vorrichtungen, hitzeempfindliche Filter, Oberflächen von Transilluminatoren, Ultraschallsonden und viele andere Oberflächen, die für Licht zugänglich sind und unerwünschte Organismen tragen. Viele dieser Vorrichtungen können nicht autoklaviert werden, sodass in diesen Fällen die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung nützlich für die Dekontamination sein können.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können in ein Kit eingebaut werden, dieses enthaltend einen oder mehrere von einem Photosensibilisator, gekoppelt oder nicht gekoppelt an ein Rückgrat, ein oder mehrere Zielsteuerungsgruppierungen, ein Kopplungs- oder Vernetzungsmittel, Puffer und Gebrauchsanweisungen. Der Benutzer des Kits kann für die Anwendung bei dem speziellen, ausgewählten unerwünschten Organismus eine angemessene Zielsteuerungsgruppierung auswählen. Es können zwei oder mehr Zielsteuerungsgruppierungen an das Photosensibilisator-Rückgrat gekoppelt werden, sodass ein breiteres Spektrum unerwünschter Organismen durch die Anwendung eines einzigen Produkts eliminiert oder wesentlich reduziert werden kann.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als weitere Einschränkung zu verstehen sind. Der Inhalt aller Referenzstellen, anhängiger Patentanmeldungen und veröffentlichter Patente, die im Verlauf dieser Anmeldung zitiert werden, wird hiermit ausdrücklich durch Referenz in Bezug genommen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von Polylysin-Chlorin e6-Konjugaten mit verschiedenen Ladungen
Der N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester des Photosensibilisators Chlorin e6 wurde hergestellt, indem man 1,5 Äquivalente an Dicyclohexylcarbodiimid und 1,5 Äquivalente an NHS mit einem Äquivalent an Chlorin e6, dem Molekül I in 1A, oder einem anderem Photosensibilisator in trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) umsetzte, um den NHS-Ester, das Molekül II in 1A, zu erzeugen. Die Prozedur, die für das Material beschrieben wird, das für die Verwendung in diesen Beispielen hergestellt wird, hier mit dem Photosensibilisator Chlorin e6, ist auch für die Herstellung von Estern von Benzoporphyrinderivat oder einem beliebigen Carboxyl enthaltenden Tetrapyrrol-Photosensibilisator geeignet. Nach Inkubation im Dunklen bei Raumtemperatur für 24 Stunden wurde der NHS-Ester für die weitere Verwendung in Aliquots eingefroren. Polylysin (Molekül III aus 1B) -Hydrobromid (HBr, 50 mg), entweder mit der optischen L- oder D-Konfiguration und mit einer Bandbreite von Molekulargewichten (Molekulargewicht 40.000 bis 60.000 entsprechend 22.000 bis 33.000 freie Lysinbasen) wurde in 50 ml trockenem DMSO gelöst, und N-Ethylmorpholin (1 ml) wurde hinzugegeben. Zu dieser Lösung wurde trockenes DMSO (1 ml) mit Photosensibilisator-NHS-Ester (25 mg) hinzugegeben. Die Lösung wurde im Dunklen bei Raumtemperatur für 24 h inkubiert, um das Polylysin-Chlorin e6-Konjugat, das Molekül III in 1B (auch gezeigt in 1C), zu synthetisieren.
Die Modifikation der Ladung wurde wie folgt durchgeführt:
Um positive Ladungen an dem Polylysin zu neutralisieren, wurde das Molekül mit einem Acylierungsmittel, Essigsäureanhydrid, umgesetzt, Eine Probe der Lösung mit dem Polylysin-Chlorin e6-Konjugat (Molekül III in 1D) wurde mit einem Überschuss an Essigsäureanhydrid (100 mg, gelöst in 0,5 ml trockenem DMSO) behandelt, um ein ungeladenes neutrales Essigsäureamid-Konjugat zu erzeugen. Das resultierende Molekül war ungeladen. Man kann diese Bedingungen modifizieren, um Moleküle anderer Ladungen zu erzeugen. Dies erlaubt es einem, verschiedene Möglichkeiten herzustellen und zu testen und die beste für die Anwendung bei einem bestimmten Konjugat oder Zielorganismus auszuwählen.
Um positive Ladungen an dem Polylysin in negative Ladungen umzuwandeln, wurden die Moleküle mit einem Acylierungsmittel, Bernsteinsäureanhydrid, umgesetzt. Eine Probe des Polylysin-Chlorin e6 in DMSO wurde mit einem Überschuss an Bernsteinsäureanhydrid (100 mg, gelöst in 0,5 ml trockenem DMSO) behandelt, um das Bernsteinsäureamid herzustellen und die positiv geladenen Aminogruppen in negativ geladene Carbonsäuregruppen umzuwandeln. Bei dem resultierenden Molekül waren alle Lysine zu negativen Ladungen umgewandelt. Man kann die Bedingungen modifizieren, um Moleküle anderer Ladungen herzustellen. Dies würde es einem erlauben, verschiedene Möglichkeiten herzustellen und zu testen und die beste für die Anwendung bei einem bestimmten Konjugat oder Zielorganismus auszuwählen.
Nach der Inkubation der konjugierten Moleküle und der acylierten, ladungsmodifizierten Konjugate im Dunklen bei Raumtemperatur für 24 Stunden wurden die Lösungen auf Dialyseröhrchen mit dem korrekten molekularen Größenausschluss überführt, um die Dialyse von Polylysin zu erlauben, dies unter Verwendung von gegenüber DMSO beständigem Dialysematerial bei einer Dialysezeit von 24 h gegen 3 Austauschmengen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7). 1 D zeigt Molekül V, bei dem die Gruppe R für das neutrale Chlorin e6-Polylysin-Essigsäureamid-Konjugat -COCH₃ darstellt, wogegen die Gruppe R für das Chlorin e6-Polylysin-Bernsteinsäureamid -COCH₂CH₂COOH darstellt.
Beispiel 2: Herstellung von Histatin-Chlorin e6-Konjugaten mit variierenden Ladungen
Histatin-5 (10 mg) wurde in 2 ml an 0,1 M Na₂CO₃-Puffer, pH 9,5 gelöst und mit 0,1 ml DMSO, enthaltend 5 mg an Chlorin e6-N-Hydroxysuccinimid, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt. Die Reaktion wurde durch Inkubation für 24 Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen weiter fortgesetzt, und die Lösung wurde dreimal gegen 10 Liter PBS dialysiert. Das resultierende grüne Präzipitat wurde in 2 ml 0,1 M Na₂CO₃-Puffer, pH 10,5, gelöst.
Unter der Annahme, dass der Extinktionskoeffizient von Chlorin e6 bei 400 nm durch die Komplexbildung unverändert bleibt, d.h. 1,5 × 10⁵ M^–1 cm^–1 beträgt, und dass das gesamte Chlorin e6 nach der Dialyse kovalent an das Histatin angeheftet bleibt, wurde durch die Messungen des Extinktionsspektrums gezeigt, dass 4 Chlorin e6-Moleküle pro Histatin-5-Peptidkette angeheftet waren. Obwohl Histatin 5 basisch ist, wurde das Konjugat als sauer ermittelt, da Lysin-Aminogruppen durch zwei Carboxylgruppen an dem Chlorin ersetzt wurden. Die Struktur ist in 1C dargestellt.
Das Verhältnis von Histatin zu Chlorin e6 kann variiert werden, indem man das Verhältnis der zwei Spezies in der Reaktion verändert.
Beispiel 3: Herstellung von Histatin-Polylysin-Chlorin e6-Konjugaten mit variierenden Ladungen
Die DMSO-Lösung von Polylysin-Chlorin e6, auf die in Beispiel 1 Bezug genommen wird, wurde mit einer Lösung von N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithiopropionat] (SPDP) in DMSO behandelt, um Polylysin-Chlorin e6-SPDP, Molekül VI in 2A, zu erzeugen. Die Menge hängt vom Molekulargewicht des Polylysins ab, sollte jedoch etwa drei bis vier Äquivalente pro Polymerkette betragen. Die Reaktion wird im Dunklen für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Polylysin-Photosensibilisator-SPDP-Lösung wird dialysiert wie oben.
Das Histatin (oder ein anderes Polypeptid mit wenigstens einem Lysinrest, 5 mg) wird in 2 ml Phosphatpuffer (SATA, 50 mM, pH 7,5, enthaltend 1 mM EDTA) gelöst und für eine Stunde bei Raumtemperatur mit N-Succinimidyl-S-thioacetat (0,5 mg, gelöst in DMSO, 100 μl) behandelt, wie in Reaktion 6 von 2B gezeigt, um SATA-Histatin, das Molekül IX in 2B, zu bilden. Die Lösung des Peptids wird dann mit 200 μl einer Lösung behandelt, die Hydroxylamin-Hydrochlorid 0,5 mM, EDTA 25 mM und Natriumphosphat 50 mM, pH 7,5 enthält und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um das entschützte SATA-Derivat, Molekül X in 2B, zu bilden. Die Lösung wird dann auf einer P4-Säule entsalzt und mit Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5), enthaltend 10 mM EDTA, eluiert. Dies resultiert in der Erzeugung eines Peptids, das freie Thiolgruppen enthält.
Das freie Thiolgruppen enthaltende Peptid-Derivat von Polylysin-Chlorin e6, Molekül VII in 2A, das positiv, neutral oder negativ geladen sein kann, wird dann mit dem SPDP im Verhältnis des relativen Molekulargewichts von Peptid und Polylysin für 24 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Produkt, das ein Peptid-Polylysin-Chlorin e6-Konjugat umfasst, wie es in 2C gezeigt ist, wird dann auf einer Sephadex G50-Säule gereinigt.
Beispiel 4: Aufnahme von Photosensibilisator-Chlorin e6-Konjugat
Porphyromonas gingivalis 381, ein Gram-negatives Bakterium und eine der häufigsten Spezies in dentalen Plaques, wurde durch wöchentliche Subkultur in Trypticase Soja Agar (TSA) mit 1 % Hemin, 1 % Vitamin K und 5% Schafsblut aufrechterhalten. Für die Versuchszwecke wurde der Organismus anaerob in einer Kammer mit 80% N₂, 10% CO₂ bei 35°C für 48 h herangezüchtet, durch Zentrifugation geerntet und in Trypticase Soja Brühe (TSB) mit 1 % Hemin und 1 % Vitamin K resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall und wiederholte Passagen durch Pasteurpipetten dispergiert. Die Zellzahlen wurden in einem Spektrophotometer (bei einer Wellenlänge von 600 nm, bei der eine O.D. von 1 10⁸ Zellen/ml entspricht) unter Verwendung von 1-ml-Röhrchen gemessen, um die passende Anzahl von Bakterien für jeden Versuch zu erhalten (10⁹ Zellen/ml für Aufnahmestudien und 10⁸ Zellen/ml für Bestrahlungsstudien).
Es wurden Zellen der Hamster-Backentaschen-Schuppenzell-Karzinomzelllinie (HCPC-1) verwendet (Odukoya, O. et al., JNCI 71:6, 1253-1258, 1983). Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt (Gibco, Grand Island, NY), das mit hitzeinaktiviertem 10% fetalem Kälberserum (FCS, Gibco), 100 Units/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin (Sigma, St. Louis, MO) supplementiert war, herangezüchtet. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt, und es wurde wöchentlich eine Zellpassage unter Verwendung von Trypsin-EDTA durchgeführt. Alle Zellen wurden in 10 cm-Durchmesser-Kulturschalen mit 12 ml Wachstumsmedium bei 37°C in befeuchteter 95% Luft, 5% CO₂-Atmosphäre gehalten.
Es wurden die folgenden photosensibilisierenden Konjugate der Erfindung mit Poly-L-Lysin und Chlorin e6 (Molekulargewicht 1.000 bis 3.000) mit positiven, negativen und neutralen Ladungen verwendet: Polylysin-Chlorin e6 (kationisch, unacyliert); Polylysin-Chlorin e6 succinyliert (anionisch, Polylysin-Chlorin e6-succ); und Polylysin-Chlorin e6 acetyliert (neutral, Polylysin-Chlorin e6-ac). Die Synthese wird in Beispiel 1 beschrieben. Solange nicht vermerkt, waren alle Medien, Puffer, Lösungen und Glasgegenstände, die zur Anzucht und Haltung von Bakterien- und Tierzellen verwendet wurden, steril.
Proben der Suspensionen von P. gingivalis (10⁹ Zellen/ml) wurden im Dreieransatz im Dunklen bei Raumtemperatur für eine Minute mit Photosensibilisator mit 1, 5 und 10 μM Chlorin e6-Äquivalent (Endkonzentration in TSB) inkubiert. Die Zellsuspensionen wurden zentrifugiert, die den Photosensibilisator enthaltenden Überstände wurden abgesogen, und die Bakterien wurden einmal mit 1 ml sterilem PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 1,5 ml 0,1 M NaOH/1% Natriumdodecylsulfat (SDS) resuspendiert und für wenigstens 24 h inkubiert, um eine homogene Lösung zu erhalten.
Die Fluoreszenz jedes Zellextrakts wurde auf einem Spektrofluorimeter (Modell FluoroMax, SPEX Industries, Edison, NJ) gemessen. Die Anregungswellenlänge betrug 400 nm, und die Emissionsspektren der Zellsuspensionen wurden von 580 bis 700 nm aufgezeichnet. Der Proteingehalt jedes Zellextrakts wurde durch ein modifiziertes Lowry-Verfahren bestimmt (Markwell M.A. et al., Anal. Biochem, 87: 206, 1978), wobei Rinderserumalbumin verwendet wurde, das als Proteinstandard in 0,1 M NaOH/1% SDS gelöst worden war, um Eichkurven zu erstellen. Die Ergebnisse wurden als Mol Chlorin e6, das pro mg Zellprotein aufgenommen wurde, ausgedrückt.
HCPC-1-Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase wurden trypsinisiert und unter Verwendung eines Hämozytometers ausgezählt. Jedes Well der 24-Well-Kulturplatten wurde mit 10⁵ Zellen in 1 ml Wachstumsmedium mit 10% FCS angeimpft, gefolgt von Inkubation über Nacht, um den Zellen die Anheftung und Wiederaufnahme des exponentiellen Wachstums zu ermöglichen. Die Konjugate wurden den Wells wie folgt im Dreifachansatz hinzugegeben. Das Medium wurde entfernt und durch Medium ersetzt, das 10% FCS und die Konjugate bei den angegebenen Konzentrationen enthielt, und die Platten wurden für 1 min inkubiert. Die Konjugatlösungen wurden dann aus den Wells abgesogen, die Zellen wurden einmal mit 1 ml sterilem PBS gewaschen und dann für 10 min mit 1 ml Trypsin-EDTA inkubiert. Die resultierenden Zellsuspensionen wurden zentrifugiert, der Trypsinüberstand abgesogen, und die Pellets wurden in 0,1 M NaOH/1% SDS gelöst. Die Fluoreszenz jedes Zellextrakts wurde wie oben bestimmt.
Die Aufnahme von Konjugaten als Funktion der Konzentration ist in den 3 und 4 für P. gingivalis bzw. HCPC-1-Zellen dargestellt (die Ordinaten in diesen Figuren unterscheiden sich um einen Faktor von 50). Die Aufnahme von Chlorin e6-Konjugaten war dosisabhängig. Zellen von P. gingivalis und HCPC-1-Zellen akkumulierten bei jeder Konzentration 2-mal bzw. 2-4-mal mehr von dem kationischen Konjugat im Vergleich zu den anionischen und neutralen Konjugaten. Es wird ein hohes Maß an Selektivität bei der Akkumulation dieser Photosensiblisator-Konjugate in Bakterien beobachtet, wenn man dies mit der Akkumulation bei Säugerzellen vergleicht.
Beispiel 5: Photofoxizität von e6-Konjugaten
Um die Wirksamkeit und Selektivität dieser Konjugate beim Abtöten von Bakterien bei gleichzeitigem Verschonen von Säugerzellen zu etablieren, wurden die drei Konjugate mit zwei in breitem Umfang verwendeten klinischen Photosensibilisatoren, Photofrin II und Benzoporphyrin-Derivat (BPD) (QLT Phototherapeutics Inc., Vancouver, BC), verglichen. Die Masse des Photosensibilisator-Feststoffs wurde mit 1 mM in DMSO gelöst und in TSB verdünnt.
Suspensionen von P. gingivalis-Zellen (10⁸/ml) wurden im Zweifachansatz im Dunklen bei Raumtemperatur für 1 min mit 5 μM an Chlorin e6-Äquivalent von jedem Konjugat, mit Photofrin II und BPD, inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert, einmal mit sterilem PBS gewaschen, und es wurde 1 ml frisches TSB hinzugegeben. In dem vorliegenden Beispiel waren die Verhältnisse der Aufnahme von Chlorin e6 pro mg Zellprotein in P. gingivalis und HCPC-1-Zellen für die kationischen, anionischen und neutralen Konjugate 46:1, 60:1, bzw. 22:1.
Die Bakteriensuspensionen wurden in die Wells von 12-Well-Platten gegeben und dann im Dunklen bei Raumtemperatur unter Verwendung einer lichtemittierenden Dioden-Anordnung bestrahlt, die Licht mit Wellenlängen von 630-710 nm emittierte und somit die Extinktionsmaxima dieser Photosensibilisator-Zusammensetzungen abdeckte. Die Wells wurden von unten her belichtet, wobei Fluenzen von 0 bis 25 J/cm² bei einer Beleuchtungsdichte von 65 mW/cm² verwendet wurden. Die Platten wurden während der Bestrahlung abgedeckt, um die Sterilität der Kulturen aufrechtzuerhalten. Nach der Bestrahlung der passenden Wells wurden Serienverdünnungen des Inhalts jedes Wells in TSB hergestellt, und doppelte 100 μl-Aliquots wurden auf der Oberfläche von Blutagarplatten ausgestrichen. Die überlebenden Fraktionen für jedes Well wurden berechnet durch Auszählen der Kolonien auf den Platten und Teilen durch die Anzahl der Kolonien aus unbestrahlten Kontrollen, die mit Photosensibilisator im Dunkeln bei Raumtemperatur für Zeitspannen inkubiert wurden, die den Bestrahlungszeiten entsprachen. Andere Kontrollen waren: Bakterien, die weder mit Photosensibilisator noch mit Licht behandelt wurden und bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert wurden, und Zellen, die in Abwesenheit von Photosensibilisator Licht ausgesetzt wurden.
HCPC-1-Zellen, 2 × 10⁴ in Aliquots von 100 μl Wachstumsmedium mit 10% FCS, wurden in 96-Well-Platten ausgesät und für 24h kultiviert, bis 70% Konfluenz erreicht waren. Sechs Wells von jeder Platte wurden mit 5 μM jedes Photosensibilisators inkubiert und unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen mit frischem Medium bei 37°C für 24h inkubiert. Die Kontrollzellen wurden unter Bedingungen inkubiert wie in Beispiel 3. Die Zelllebensfähigkeit wurde 24h nach der Bestrahlung unter Verwendung des MTT-Mikrokultur-Tetrazolium-Assays bestimmt, einem Verfahren, das die Dehydrogenase-Aktivität in den Mitochondrien lebender Zellen misst (Mosmann T.J. Immunol. Methods 65, 55-63, 1983), und die Überlebensfraktionen wurden als 570 nm-Extinktion der behandelten Zellen, geteilt durch die Extinktion der unbestrahlten Zellen, berechnet.
Die 5 und 6 zeigen, dass die Konjugate hochgradig selektiv phototoxisch gegenüber P. gingivalis im Vergleich zu Säugerzellen sind. Das kationische Konjugat Polylysin-Chlorin e6 tötete 99,9% der Bakterien und weniger als 2% der HCPC-1-Zellen ab. Die hohe Selektivität des neutralen Konjugats, Polylysin-Chlorin e6-ac, das über 90% der Bakterien und keine HCPC-1-Zellen abtötete, ist ebenfalls gezeigt. Das anionische Konjugat Polylysin-Chlorin e6-succ verursachte eine 66% Reduktion hinsichtlich der Lebensfähigkeit von P. gingivalis, und HCPC-1-Zellen wurden durch diesen Photosensibilisator nicht abgetötet.
Im Gegensatz dazu zeigten PFII und BPD keine Abtötung bei den angezeigten Konzentrationen, mit Ausnahme von BPD, das HCPC-1-Zellen und nicht P. gingivalis abtötete.
Beispiel 6: In vivo-Studien in tierischen Wundmodellen
Infizierte Wunden werden auf der dorsalen Haut von Mäusen erzeugt, indem man ein Skalpell verwendete, um einen 3 cm-Einschnitt zu produzieren, der dann mit 10⁷ und 10⁸ CFU einer Bakterienspezies angeimpft wird. Eine infizierte Verbrennung wird erzeugt, wie beschrieben durch Stevens, E.J. et. al., J. Burn. Care Rehabil. 15, 232-235, 1994. Die Konjugate, die gegen die jeweiligen Bakterienspezies gerichtet waren, oder unkonjugiertes Chlorin e6 werden entweder periläsional oder intravenös injiziert. Die Dosen von Konjugat, Licht und das Intervall zwischen Injektion und Bestrahlung werden systematisch variiert. Die Antworten auf die Behandlung werden untersucht, indem man die Heilungsrate der Wunde und der Verbrennung beobachtet. Gewebeproben (2 mm Stanzbiopsien) werden nach der Behandlung in Intervallen genommen, um die Menge der Bakterien zu bestimmen und um Schnitte für die histopathologische Bewertung bereitzustellen. Die bakterielle Besiedlung in Wunden wird quantifiziert, indem man die CFU/g Gewebe etabliert und durch optisches Überwachen der Luciferase, die in den P. aeruginosa-Bakterienstamm transfiziert wurde.
Andere Ausführungsformen
Da, wo ein Wert für einen physikalischen Parameter, z.B. das Molekulargewicht oder die Anzahl von Aminosäureresten hier angegeben ist, können die Werte eine Population von Molekülen beschreiben, von denen alle oder weitgehend alle diesen Wert aufweisen, oder eine Population von Molekülen, bei denen der Wert einen Durchschnittswert, Mittelwert oder Moduswert (mode value) für diesen Parameter für die Population darstellt. Die Spezifizierung eines physikalischen Parameters, z.B. die Größe eines Peptids oder eines Proteinpolymers, in Form der Anzahl von Resten oder des Molekulargewichts kann die Möglichkeit eines Maßes an Heterogenität bei der Anzahl der Reste oder bei dem Molekulargewicht beinhalten, so etwa, wie es beim Prozess der chemischen Synthese solcher Polymere passiert, wobei diese Heterogenität durch Reinigungsverfahren vor der weiteren Verwendung reduziert, wenn auch im allgemeinen nicht vollständig eliminiert werden kann. Somit kann z.B. eine Präparation von Polylysin, für die angegeben ist, dass sie aus 10 Lysinresten zusammengesetzt ist, zu 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9% aus Molekülen dieser Länge bestehen, wobei die verbleibenden 20%, 10%, 5%, 1 % oder 0,1 % der Moleküle z.B. 9 oder 8 Reste oder, seltener, 11 oder 12 Reste aufweisen.
Die hier beschriebenen Konjugate können synthetisiert werden, indem man bei einer gemischten Population mit einer oder mehreren der hier diskutierten Gruppierungen substituiert. Beispielsweise kann eine reine Präparation einer einzelnen Photosensibilisatorgruppierung zu einem Reaktionsgemisch hinzugegeben werden, das ein Gemisch aus Rückgrat- und Zielsteuerungsgruppierungen als Substrate enthält, um Konjugate zu erzeugen, die einen einzelnen Typ von Photosensibilisatorgruppierung, konjugiert an ein Gemisch von Zielsteuerungsgruppierungen, oder an ein Gemisch von chemischen Einheiten aus Rückgrat- oder Zielsteuerungsgruppierungen, beinhalten.
Im Hinblick auf die hier beschriebenen Konjugate kann ein Gemisch in einer Formulierung des Konjugats vor der Verwendung zusammengestellt werden, z.B. eine Formulierung, die für die Anwendung bei einem Gemisch unerwünschter Organismen vorgesehen ist und die als Gemisch von zwei oder mehr Konjugaten hergestellt werden kann, wobei jedes Konjugat eine optimale Affinität für einen oder mehrere unerwünschte Organismen besitzt, sodass eine Vielzahl von Zielorganismen reduziert oder eliminiert werden kann.
Die Erfindung beinhaltet außerdem Fragmente, bevorzugt biologisch aktive Fragmente oder Analoga eines Histatins, z.B. von Histatin-5. Ein biologisch aktives Fragment oder Analogon ist eines, das eine beliebige in vivo- oder in vitro-Aktivität besitzt, die für die Histatinsequenz charakteristisch ist. Besonders bevorzugte Fragmente sind Fragmente, z.B. aktive Fragmente, die durch de novo-Synthese, proteolytische Spaltung oder alternative Spleißereignisse erzeugt werden. Da Peptide, wie etwa Histatine, oft eine Reihe physiologischer Eigenschaften besitzen, und da solche Eigenschaften verschiedenen Teilbereichen des Moleküls zugeordnet werden können, ist ein nützliches Histatinfragment oder Histatinanalogon eines, das eine biologische Aktivität in irgendeinem biologischen Assay auf Histatinaktivität zeigt. Am bevorzugtesten besitzt das Fragment oder Analogon wenigstens 20% der Aktivität des natürlich vorkommenden Histatins voller Länge in einem beliebigen in vivo- oder in vitro-Histatintest.
Analoga können sich von dem natürlich vorkommenden Histatin in der Aminosäuresequenz oder in Weisen, die die Sequenz nicht betreffen, oder in beiden Punkten von natürlich vorkommendem Histatin unterscheiden. Nicht-Sequenzmodifikationen beinhalten die chemische in vivo- oder in vitro-Derivatisierung von Histatin. Nicht-Sequenzmodifikationen beinhalten Veränderungen der Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Glykosylierung.
Bevorzugte Analoga beinhalten Histatin (oder biologisch aktive Fragmente hiervon), deren Sequenzen sich von wildtypischen Sequenzen um eine, zwei, drei, vier oder fünf oder mehr konservative Aminosäuresubstitutionen und/oder um eine, zwei, drei, vier oder fünf oder mehr nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen, die die biologische Histatinaktivität nicht aufheben, unterscheiden. Konservative Substitutionen beinhalten typischerweise die Substitution einer Aminosäure für eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, z.B. Substitutionen mit den folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Andere konservative Substitutionen können aus der unten stehenden Tabelle entnommen werden.
Andere Analoga innerhalb der Erfindung sind solche mit Modifikationen, die die Peptidstabilität erhöhen; solche Analoga können z.B. eine oder mehrere Nicht-Peptidbindungen (die die Peptidbindungen ersetzen) in der Peptidsequenz enthalten. Ebenfalls einbezogen sind: Analoga, die andere Reste beinhalten, als natürlich vorkommende L-Aminosäuren, z.B. D-Aminosäuren oder nicht-natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren, z.B. β- oder γ-Aminosäuren; und zyklische Analoga.
Wie hier verwendet, wird der Begriff „Fragment", wie er auf ein Histatin-Analogon angewendet wird, allgemein von hinreichender Länge sein, um biologische Aktivität zu verleihen, z.B. wenigstens 20% der Bindungsaktivität eines Moleküls voller Länge. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind die Fragmente 12 Reste lang oder länger. Fragmente von Histatin können durch hier beschriebene Verfahren und durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, erzeugt werden. Die Fähigkeit eines Kandidatenfragments, eine biologische Aktivität von Histatin zu zeigen, kann durch Verfahren bestimmt werden, die Fachleuten bekannt sind und wie sie hier beschrieben sind.
Um ein Histatin-Polypeptid zu erhalten, kann für Histatin codierende DNA in einen Expressionsvektor eingeführt werden, der Vektor in eine Zelle eingeführt werden, die für die Expression des gewünschten Proteins geeignet ist, und das Peptid durch Verfahren aus dem Stand der Technik gewonnen und gereinigt werden. Bevorzugt werden Histatinpeptide in vivo als Fusion an ein größeres Protein erzeugt und nach der anfänglichen Reinigung aus einem Zellextrakt in die Fragmente gespalten. Bevorzugt werden die Histatinpeptide chemisch synthetisiert, z.B. auf einem Peptidsynthesegerät. TABELLE 1 KONSERVATIVE AMINOSÄUREAUSTAUSCHE
Bei bevorzugten Histatin-1-Analoga sind folgende Bedingungen erfüllt:
R1 ist asp oder ist deletiert
R2 ist ser oder Phosphoserin oder ist deletiert
R3 ist his oder ist deletiert
R4 ist ala oder ist deletiert
R5 ist lys oder arg oder glu oder asp
R6 ist arg oder lys
R7 ist his
R8 ist his
R9 ist gly oder ala
R10 ist tyr oder phe
R11 ist lys oder arg
R12 ist arg oder lys
R13 ist lys oder arg
R14 ist phe oder tyr
R15 ist his
R16 ist glu oder asp
R17 ist lys oder arg
R18 ist his
R19 ist his
R20 ist ser oder thr oder phosphoser
R21 ist his oder ist deletiert
R22 ist arg oder lys oder ist deletiert
R23 ist gly oder glu oder asp oder ist deletiert
R24 ist tyr oder phe oder ist deletiert
R25 ist pro oder arg oder lys oder ist deletiert
R26 ist phe oder tyr oder leu oder ile oder ist deletiert
R27 ist phe oder tyr oder leu oder ile oder thr oder ser oder ist deletiert
R28 ist gly oder ala oder ist deletiert
R29 ist asp oder glu oder ist deletiert
R30 ist phe oder tyr oder leu oder ile oder ist deletiert
R31 ist gly oder ala oder ist deletiert
R32 ist deletiert oder ser oder thr oder phosphoser
R33 ist deletiert oder asn oder gln
R34 ist deletiert oder tyr oder phe
R35 ist deletiert oder leu oder ile oder tyr oder phe
R36 ist tyr oder phe oder leu oder ile oder ist deletiert
R37 ist deletiert oder asp oder glu
R38 ist deletiert oder asn oder gln
Bei bevorzugten Histatin-3-Analoga sind folgende Bedingungen erfüllt:
R1 ist asp oder ist deletiert
R2 ist ser oder Phosphoserin oder ist deletiert
R3 ist his oder ist deletiert
R4 ist ala oder ist deletiert
R5 ist lys oder arg oder glu oder asp
R6 ist arg oder lys
R7 ist his
R8 ist his
R9 ist gly oder ala
R10 ist tyr oder phe
R11 ist lys oder arg
R12 ist arg oder lys
R13 ist lys oder arg
R14 ist phe oder tyr
R15 ist his
R16 ist glu oder asp
R17 ist lys oder arg
R18 ist his
R19 ist his
R20 ist ser oder thr oder phosphoser
R21 ist his oder ist deletiert
R22 ist arg oder lys oder ist deletiert
R23 ist gly oder glu oder asp oder ist deletiert
R24 ist tyr oder phe oder ist deletiert
R25 ist arg oder lys oder ist deletiert
R26 ist deletiert oder ser oder thr oder phosphoser
R27 ist deletiert oder asn oder gln
R28 ist deletiert oder tyr oder phe
R29 ist deletiert oder leu oder ile oder tyr oder phe
R30 ist tyr oder phe oder leu oder ile oder ist deletiert
R31 ist deletiert oder asp oder glu
R32 ist deletiert oder asn oder gln
Bei bevorzugten Histatin-5-Analoga sind folgende Bedingungen erfüllt:
R1 ist asp oder ist deletiert
R2 ist ser oder Phosphoserin oder ist deletiert
R3 ist his oder ist deletiert
R4 ist ala oder ist deletiert
R5 ist lys oder arg oder glu oder asp
R6 ist arg oder lys
R7 ist his
R8 ist his
R9 ist gly oder ala
R10 ist tyr oder phe
R11 ist lys oder arg
R12 ist arg oder lys
R13 ist lys oder arg
R14 ist phe oder tyr
R15 ist his
R16 ist glu oder asp
R17 ist lys oder arg
R18 ist his
R19 ist his
R20 ist ser oder thr oder phosphoser
R21 ist his oder ist deletiert
R22 ist arg oder lys oder ist deletiert
R23 ist gly oder glu oder asp oder ist deletiert
R24 ist tyr oder phe oder ist deletiert
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatin oder ein aktives Fragment oder Analogon hiervon, z.B. Histatin-1 bis 8, bevorzugt Hitatin-1, -3 oder -5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Fragment eines Histatins, z.B. von Histatin-5. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung die Histatin-5-Reste 13-24 oder korrespondierende Reste aus anderen Histatinen. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatinmolekül, das so hergestellt wurde, dass es eine interne Duplikation beinhaltet.
Es versteht sich, dass, obwohl die Erfindung in Verbindung mit der detaillierten Beschreibung hiervon beschrieben wurde, die vorstehende Beschreibung dazu gedacht ist, den Schutzumfang der Erfindung, der durch den Schutzumfang der angehängten Ansprüche definiert wird, zu veranschaulichen und nicht zu limitieren.

Claims

Konjugatmolekül, welches einen Photosensibilisator umfaßt, der an eine Zielsteuerungsgruppierung eines nicht-paarbildenen Elements mit Affinität für einen Zielorganismus gekoppelt ist, wobei das ungepaarte Element ein Polypeptid ist.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1, wobei der Photosensibilisator ein Porphyrin ist.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zielorganismus eine Bakterienzelle ist.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der zielende Rest ein kationisches Peptid umfaßt.
Konjugatmolekül nach Anspruch 4, wobei das kationische Peptid Polylysin ist.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zielorganismus eine orale Bakterienspezies ist.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1, 2 oder 6, wobei die Zielsteuerungsgruppierung ein Histatin umfaßt.
Konjugatmolekül nach Anspruch 7, wobei das Histatin Histatin-5, Histatin-1 oder -3 umfaßt.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zielsteuerungsgruppierung ein Polypeptid umfaßt, welches aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: einem Histatin, einem Defensin, einem Cecropin, einem Magainin, einem Gram-positiven Bacteriocin und einem Peptidantibiotikum.
Zusammensetzung, die das konjugierte Molekül nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Konjugatmolekül nach Anspruch 1, 2 oder 6, wobei das Konjugat weiterhin ein Rückgratmolekül beinhaltet, an welches die Zielsteuerungsgruppierung und der Photosensibilisator gekoppelt sind.
Verwendung eines Konjugats, welches einen an eine Zielsteuerungsgruppierung eines nichtpaarbildenen Elements gekoppelten Photosensibilisator beinhaltet, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Subjekts auf eine Erkrankung in der Mundhöhle, die durch das Vorhandensein eines unerwünschten Organismus gekennzeichnet ist, wobei das ungepaarte Element ein Polypeptid ist, der unerwünschte Organismus ein Bakterium, ein Pilz, ein Virus oder ein Protozoon ist und die Erkrankung eine Erkrankung ist, bei der die Zähne oder das Zahnfleisch durch den Organismus infiziert werden, so daß, wenn das Subjekt mit Energie einer Wellenlänge bestrahlt wird, die geeignet ist, um durch den Photosensibilisator eine zytotoxische Wirkung zu erzeugen, das Subjekt behandelt wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der unerwünschte Organismus aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einer Protozoenzelle, einer Zelle von Pneumocystis carinii und einem Virus.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der unerwünschte Organismus ein Bakterium ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Bakterium sich im Rachen- und Mandelraum, in der Nebenhöhle, im Ohr, in der Nase, in der Bauchhöhle, auf der Epidermis, in der Lunge, im Blut oder in einer Wunde befinden kann.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13 zur Behandlung eines Subjekts, das zusätzlich zu der Erkrankung der Mundhöhle auch an einer erworbenen Störung des Immunsystems leidet.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Erkrankung der Mundhöhle eine periodontale Erkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Konjugat auf einen Bereich des Subjekts, der mit dem unerwünschten Organismus infiziert ist, topisch aufgebracht werden kann.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Konjugat auf periodontales Gewebe des Subjekts, das mit dem unerwünschten Organismus infiziert ist, topisch aufgebracht werden kann.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der unerwünschte Organismus eine orale Bakterienspezies ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der unerwünschte Organismus Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis ist.
Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Zielsteuerungsgruppierung des Konjugats ein Polypeptid aus dem Speichel oder ein Histatin beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Zielsteuerungsgruppierung des Konjugats Polylysin ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Photosensibilisator ein Porphyrin ist und/oder das Konjugat weiterhin ein Polylysinrückgrat umfaßt, an das eine Histatin-Zielsteuerungsgruppierung und ein Porphyrin-Photosensibilisator gekoppelt sind.
Verfahren zur Herstellung eines konjugierten Moleküls, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Bereitstellen eines Polypeptidrückgrats, kovalentes Binden eines Photosensibilisators an das Polypeptidrückgrat und kovalentes Binden einer Zielsteuerungsgruppierung eines nicht-paarbildenen Elements, der eine Affinität für einen Zielorganismus besitzt, an das Polypeptidrückgrat unter Bildung des konjugierten Moleküls, wobei das ungepaarte Element ein Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polypeptid ein Polylysin ist.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei der Photosensibilisator ein Porphyrin, Chlorin e6 oder ein Histatin ist.
Konjugat nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Medikament.
Konjugat nach Anspruch 28, wobei das Medikament der Behandlung eines Subjekts auf eine Erkrankung der Mundhöhle dient, welche durch das Vorhandensein eines unerwünschten Organismus gekennzeichnet ist, wobei das Subjekt auch an einer Störung des Immunsystems leidet und der unerwünschte Organismus kein Organismus ist, der die erworbene Störung des Immunsystems verursacht, wobei der Photosensibilisator eine zytotoxische Wirkung auf den Organismus zeigt, wenn ein Subjekt, dem das Konjugat verabreicht wurde, Energie mit einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird.
Konjugat nach Anspruch 29, wobei der unerwünschte Organismus eine orale Bakterienspezies ist.
Konjugat nach Anspruch 29, wobei der unerwünschte Organismus Porphyromonas (Bacferoides) gingivalis ist.
Konjugat nach Anspruch 28 oder 29, wobei die Zielsteuerungsgruppierung des Konjugats ein Polypeptid aus dem Speichel, ein Histatin oder Polylysin beinhaltet.
Konjugat nach Anspruch 28 oder 29, wobei der Photosensibilisator ein Porphyrin ist und/oder das Konjugat weiterhin ein Polylysinrückgrat umfaßt, an das eine Histatin-Zielsteuerungsgruppierung und ein Porphyrin-Photosensibilisator gekoppelt sind.