DE69836552T3 - Herstellung von proteinen in pflanzensamen - Google Patents

Herstellung von proteinen in pflanzensamen Download PDF

Info

Publication number
DE69836552T3
DE69836552T3 DE69836552.6T DE69836552T DE69836552T3 DE 69836552 T3 DE69836552 T3 DE 69836552T3 DE 69836552 T DE69836552 T DE 69836552T DE 69836552 T3 DE69836552 T3 DE 69836552T3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
barley
seed
hordein
monocot
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69836552.6T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69836552D1 (de
DE69836552T2 (de
Inventor
Peggy Lemaux
Myeong-Je Cho
Robert BUCHANAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22029950&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69836552(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of DE69836552D1 publication Critical patent/DE69836552D1/de
Publication of DE69836552T2 publication Critical patent/DE69836552T2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69836552T3 publication Critical patent/DE69836552T3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Expression von heterologen Proteinen in Pflanzensamen
  • Die Expression von heterologen Proteinen in Pflanzensamen ermöglicht beispielsweise die Produktion großer Mengen von leicht zu erntenden Polypeptiden sowie die Expression von Proteinen, welche die Getreidequalität verbessern. Ausführungen zu diesem Konzept können in US-Patent Nr. 5,714,474 (”Production of enzymes in seeds and their uses”) gefunden werden.
  • Hordein-Speicherproteine
  • Die Samenspeicherproteine der Gerste machen etwa 8 bis 15% des Trockengewichts des reifen Getreidekorns der Gerste aus. Die hauptsächlichen Samenspeicherproteine der Gerste sind alkohollösliche Prolamine, die als Hordeine bezeichnet werden, und in zwei Hauptgruppen (B und C) und in zwei Nebengruppen (D und γ) eingeteilt werden (Shewry 1993). Abhängig vom Stickstoffgehalt machen diese vier Gruppen etwa 35 bis 55% des Gesamtproteins im Gerstensamen aus. Die B- und C-Hordeine machen etwa 70–80% bzw. 10–20% der gesamten Hordein-Fraktion aus, wobei geringe Mengen D-Hordein (2 bis 4%) und γ-Hordein (nicht genau bestimmt) vorkommen. Die B-, D- und γ-Hordeine sind schwefelreiche Prolamine, während die C-Hordeine schwefelarme Prolamine sind (Bright und Shewry 1983). Die Hordeine werden koordiniert in dem sich entwickelnden, stärkereichen Endospermgewebe gebildet (Giese et al. 1983; Sørensen et al. 1989). Sie werden co-translational in das Lumen des rauen endoplasmatischen Retikulums transportiert, wobei gleichzeitig das Signalpeptid abgespalten wird, und sie werden schließlich in Proteinkörperchen eingelagert (Cameron-Mills 1980; Cameron-Mills und von Wettstein 1980; Cameron-Mills und Madrid 1989).
  • Genetische Untersuchungen zeigen, dass alle Hordeine von Strukturgenen auf Chromosom 5 (1H) der Gerste kodiert werden; die Loci Hor1, Hor2, Hor3 und Hor5 auf Chromosom 5 kodieren für das C-, B-, D-, bzw. γ-Hordein-Polypeptid (Jensen et al. 1980; Shewry et al., 1980; Blake et al. 1982; Shewry et al. 1983; Shewry und Parmar 1987). Die Gene für B-, C- und D-Hordein sind isoliert und charakterisiert worden (Brandt et al. 1985; Forde et al. 1985; Rasmussen und Brandt 1986; Sørensen et al. 1996). Die B- und C-Hordeine werden von Multigenfamilien kodiert, die 10 bis 20 Mitglieder umfassen, während D-Hordein von einem einzelnen Gen kodiert wird (Brandt et al. 1985; Rasmussen und Brandt 1986; Sørensen et al. 1996). Die Regulation und Expression dieser Hordein-Promotoren ist mit Hilfe von transienten Expressionsassays im Endosperm der Gerste untersucht worden (Entwistle et al. 1991; Müller und Knudsen 1993; Sørensen et al. 1996). Wie in diesen Assays durch Verwendung von Promotor-uidA-Fusionen festgestellt wurde, ist der D-Hordein-Promotor 3- bis 5-mal aktiver als die untersuchten Promotoren von B- oder C-Hordein (Sørensen et al. 1996). Der B-Hordein-Promotor wurde auch unter Verwendung einer stabilen Transformation von Tabak mit Promotor-cat-Fusionen untersucht (Marris et al. 1988).
  • Obwohl die Gene für B-, C- und D-Hordein isoliert und charakterisiert worden sind, ist ihre Regulation und Expression nur in transienten Expressionsassays bei der Gerste und in stabil transformiertem Tabak untersucht worden (Brandt et al. 1985; Forde et al. 1985; Marris et al. 1988; Sørensen et al. 1996).
  • In Gerste, Weizen und Mais werden die hauptsächlich vorkommendenen, hochgradig unlöslichen Prolamin-Speicherproteine an Polysomen synthetisiert, die eng mit dem endoplastischen Retikulum (ER) assoziiert sind. (Siehe Seeds: Physiology of Development and Germination, 2nd ed., Hrsg. Bewley and Black, Plenum Press, New York, 1994). Neu synthetisierte Proteine durchqueren die ER-Membran in das Lumen, wo sie zu kleinen Partikeln assoziieren, die nach und nach größere Aggregate und Proteinkörperchen bilden (welche im Elektronenmikroskop beobachtet werden können).
  • Im sich entwickelnden Endosperm von Weizen reichern sich zwei Arten von Proteinkörperchen unabhängig voneinander an: Körperchen mit geringer Dichte, die sich früher entwickeln, und Körperchen mit hoher Dichte, die sich später entwickeln und vom ER abgeleitet sind. Die Proteine mit hoher Dichte werden gebildet, wenn die Aggregation von Proteinen im Inneren des Lumens des ER eine Belastung auf die Membran ausübt und ihr Zerreißen verursacht. Die Membran kann sich frei von Proteinaggregaten neu bilden, nachdem ein Intervall aufgetreten ist, in dem der Proteinkörper selbst nicht von einer Membran gebunden ist. In anderen Getreidearten (außer in Weizen und Gerste), wie beispielsweise in Hirse, Reis, Mais und Sorghum, verbleiben die Proteinkörperchen sogar im reifen Samen als einzelne membrangebundene Einheiten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene monokotyle Pflanze bereit, die einen für die Samenreifung spezifischen Promotor und eine in funktionsfähiger Weise mit diesem Promotor verknüpfte Signal-DNA-Sequenz, die für eine monokotyle samenspezifische Sequenz kodiert, welche in der Lage ist, ein damit verknüpftes Polypeptid zielgerichtet zu einem Proteinspeicherkörper in monokotylen Samen zu leiten, und eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Protein kodiert, das kein Samenspeicherprotein ist, wobei die DNA-Sequenz in funktionsfähiger Weise mit der Signal-DNA-Sequenz verknüpft ist, umfasst, wie es in den anliegenden Ansprüchen definiert ist.
  • Die Erfindung stellt ferner transgene Samen dieser transgenen Pflanzen bereit, die als Bezugsquelle für die exprimierten Polypeptide nützlich sind, oder die Qualität des Getreides verbessern können.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind die bereitgestellten transgenen Pflanzen stabil transformierte monokotyle Pflanzen, beispielsweise Getreidepflanzen, wie Gerste oder Weizen. In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung stabil transformierte Gerstenpflanzen mit Genotypen bereit, umfassend: Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages und Baronesse. Die Erfindung stellt ferner stabil transformierte Weizenpflanzen mit Gentypen bereit, umfassend: Anza, Karl, Bobwhite und Yecora Rojo.
  • Die Erfindung stellt ferner Samen von stabil transformierten Pflanzen bereit, die das ausgewählte Polypeptid in ihren Samen exprimieren. Das Polypeptid kann verwendet werden, um die Qualität des Getreides zu verbessern, oder es kann zu einem Zeitpunkt der maximalen Expression oder Stabilität aus dem Samen extrahiert werden, um für andere Zwecke verwendet zu werden.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1A ist ein schematisches Diagramm einer Strategie mit vier Primern zur Herstellung chimärer Produkte unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR).
  • 1B ist ein schematisches Diagramm einer Strategie mit drei Primern zur Herstellung chimärer Produkte unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR).
  • 1C ist eine Karte eines Konstrukts, das (von 5' nach 3') den B1-Hordein-Promotor, die B1-Hordein-Signalsequenz, das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator umfasst.
  • 2A und 2B zeigen Alignments von Konstrukten, die den B1-Hordein-Promotor, das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator umfassen, mit (2A) oder ohne (2B) B1-Hordein-Signalsequenz.
  • 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz des B1-Hordein-Promotors und die B1-Hordein-Signalsequenz aus 57 bp (unterstrichen).
  • 4 zeigt die Nukleinsäuresequenz des D-Hordein-Promotors und die D-Hordeinsignalsequenz aus 63 bp (unterstrichen).
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das die GUS-Aktivität in reifen Gerstensamen zeigt, die Konstrukte exprimieren, welche den B1-Hordein-Promotor, das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator entweder mit (+SS) oder ohne (–SS) die B1-Hordein-Signalsequenz umfassen.
  • 6 ist ein Balkendiagramm, das die GUS-Aktivität in unreifen Gerstensamen zeigt, die Konstrukte exprimieren, welche den B1-Hordein-Promotor, das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator entweder mit (+SS) oder ohne (–SS) die B1-Hordeinsignalsequenz umfassen.
  • 7 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme, in der ein Immunsignal spezifisch für Proteinkörper in GUS-exprimierendem unreifem Endosperm einer Linie ist, die mit dem B1-Hordein-uidA-DNA-Konstrukt transformiert wurde, das die N-terminale Signalpeptidsequenz aus 19 Aminosäuren enthält.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • Die Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen, die in dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufgeführt sind, werden unter Verwendung von Standardbuchstabenabkürzungen für Nukleotidbasen sowie dem 3 Buchstabenkode für Aminosäuren gezeigt. Es ist jeweils nur ein Strang jeder Nukleinsäuresequenz gezeigt, wobei es jedoch verständlich ist, dass der komplementäre Strang durch Verweis auf den gezeigten Strang eingeschlossen ist.
  • SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz des Gersten-B1-Hordein-Promotors und die Signalsequenz.
  • SEQ ID NO: 2 zeigt die Aminosäuresequenz der Gersten-B1-Hordein-Signalsequenz.
  • SEQ ID NO: 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz des Gersten-D-Hordein-Promotors und der Signalsequenz.
  • SEQ ID NO: 4 zeigt die Aminosäuresequenz der Gersten-D-Hordein-Signalsequenz.
  • SEQ ID NOs: 5–16 zeigen PCR-Primer, die zur Amplifikation der vorliegend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle verwendet wurden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • I. Abkürzungen und Definitionen
  • A. Abkürzungen
    • HMW:
      Hochmolekulargewicht
      CAT:
      Chloramphenicol-Acetyltransferase
      GUS:
      β-Glucuronidase
      uidA:
      β-Glucuronidase-Gen
      PCR:
      Polymerasekettenreaktion
      PEG:
      Polyethylenglykol
      MS-Medium:
      Medium nach Murashige und Skoog
      CIM:
      Kallus-Induktionsmedium
      IIM:
      intermediäres Inkubationsmedium
      RM:
      Regenerierungsmedium
      2,4-D:
      2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
      BAP:
      6-Benzylaminopurin
      2iP:
      N6-(2-Isopentyl)adenin
      GFP:
      grün fluoreszierendes Protein
      CaMV:
      Blumenkohlmosaikvirus
      rbcS:
      RUBISCO (D-Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase/Oxygenase) kleine Untereinheit
  • B. Definitionen
  • Soweit nicht anderweitig angegeben, werden technische Begriffe gemäß der herkömmlichen Gebrauchsweise verwendet. Definitionen herkömmlicher Begriffe der Molekularbiologie können in Lewin, Genes V, veröffentlicht bei Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (Hrsg.), The Encyclopedia of Molecular Biology, veröffentlicht bei Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); und Robert A. Meyers (Hrsg.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, veröffentlicht bei VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) gefunden werden.
  • Um einen Überblick über die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung zu ermöglichen, werden die nachfolgenden Definitionen der Begriffe bereitgestellt:
  • Promotor:
  • Eine Nukleinsäuresequenz, die die Transkription eines Proteins steuert. Dieser umfasst nicht nur Moleküle mit prototypischen Sequenzen, sondern auch Promotoren von Genhomologen. Ebenfalls umfasst sind Moleküle, die sich von den offenbarten prototypischen Molekülen durch geringfügige Abweichungen unterscheiden. Solche abweichenden Sequenzen können durch Manipulation der Nukleotidsequenz eines Promotors unter Verwendung von Standardverfahren erzeugt werden.
  • Hordein-Promotor:
  • Eine Nukleinsäuresequenz, die die Transkription eines Hordein-Proteins in den Samen einer Pflanze steuert. Die spezifisch durchgeführten Beispiele beschreiben die Verwendung der Promotorsequenzen des B1-Hordein-Gens und des D-Hordein-Gens der Gerste. Nukleinsäuresequenzen der prototypischen B1- und D-Hordein-Gene von Gerste sind in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3 sowie in 3 bzw. 5 gezeigt. Die Promotorregion schließt diejenigen Nukleotide aus, die für die Signalsequenz kodieren (die unterstrichenen Sequenzen, die in den 3 und 4 gezeigt sind). Der Fachmann wird verstehen, dass die Länge der Promotorregion auch größer oder kleiner sein kann als die dargestellten Sequenzen. Beispielsweise könnte eine zusätzliche 5'-Sequenz aus der stromaufwärts gelegenen Region des Hordein-Gens an die Promotorsequenz angefügt werden, oder es können Basen von den dargestellten Sequenzen entfernt werden. Jede Hordein-Promotorsequenz muss jedoch in der Lage sein, die Transkription einer in funktionsfähiger Weise damit verknüpften Sequenz in Pflanzensamen zu steuern. Die Fähigkeit eines Hordein-Promotors der Gerste, die Transkription eines Proteins in einem Pflanzensamen zu steuern, kann problemlos festgestellt werden, indem man die Promotorsequenz in funktionsfähiger Weise mit einem offenen Leserahmen (ORF) (der vorzugsweise für ein leicht nachzuweisendes Protein kodiert), wie beispielsweise mit dem offenen Leserahmen von GUS, verknüpft, das resultierende Konstrukt in Pflanzen einbringt und die Expression des Proteins in den Samen dieser Pflanze feststellt, wie im nachfolgenden ausführlich beschrieben wird. Der Hordein-Promotor wird eine für die Samenreifung spezifische Expression verleihen, was bedeutet, dass die Expression des Proteins, welches von dem in funktionsfähiger Weise verknüpften ORF kodiert wird, in den Samen der stabil transfizierten Pflanze in der Regel mindestens doppelt so hoch sein wird (Bestimmung auf Basis der Aktivität) wie in anderen Geweben, beispielsweise in Blättern. Üblicherweise wird der Hordein-Promotor in den Samen eine Expression erzeugen, die mindestens fünfmal höher ist als die Expression in anderen Geweben der Pflanze. Die Expression des Proteins in den Samen wird für die Samenreifung spezifisch sein.
  • Hordein-Signalsequenz (SS):
  • Die Erfinder haben erkannt, dass das Einschließen einer B1- oder D-Hordein-Signalsequenz in Verbindung mit einem Hordein-Promotor zu einer verstärkten Expression bestimmter heterologer Proteine in Samen führt. Insbesondere die Expression eines Proteins in unreifen Samen wird in hohem Maße verstärkt, wenn der für das Protein kodierende ORF in funktionsfähiger Weise sowohl mit einem Hordein-Promotor als auch mit einer Hordein-Signalsequenz verknüpft ist, im Vergleich zu einem äquivalenten Konstrukt, in dem die Hordein-Signalsequenz fehlt.
  • Die Hordein-Signalsequenz umfasst üblicherweise die ersten 15–25 Aminosäuren des offenen Leserahmens von Hordein, in der Regel etwa 18–21 Aminosäuren. Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz der Hordein-Signalsequenzen der prototypischen Hordein-Gene B1 und D der Gerste sind in SEQ ID NOS: 1–4 gezeigt. Der Fachmann wird verstehen, dass diese bestimmten Signalsequenzen zwar im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Beispiele verwendet werden, die Erfindung jedoch nicht auf diese spezifischen prototypischen Sequenzen beschränkt ist.
  • Sequenzidentität:
  • Die Ähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder zwei Aminosäuresequenzen wird durch die Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen ausgedrückt, die auch als Sequenzidentität bezeichnet wird. Die Sequenzidentität wird häufig als prozentuale Identität (oder Ähnlichkeit oder Homologie) gemessen; je höher der Prozentsatz, desto ähnlicher sind die beiden Sequenzen. Verfahren für das Alignment von Sequenzen für einen Vergleich sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Verschiedene Programme und Algorithmen für ein Alignment sind beschrieben in: Smith and Waterman (1981); Needleman und Wunsch (1970); Pearson und Lipman (1988); Higgins und Sharp (1988); Higgins und Sharp (1989); Corpet et al. (1988); Huang et al. (1992) und Pearson et al. (1994). Altschul et al. (1994) liefert eine ausführliche Erörterung von Verfahren für das Sequenzalignment und die Homologieberechnung.
  • Das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) des NCBI (Altschul et al. 1990) ist von verschiedenen Quellen verfügbar, einschließlich vom National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) sowie aus dem Internet, und kann mit den Sequenzanalyseprogrammen blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx verwendet werden. Es kann abgerufen werden unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Eine Beschreibung des Verfahrens, mit dem die Sequenzidentität unter Verwendung dieses Programms bestimmt werden kann, ist verfügbar unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
  • Oligonukleotide:
  • Eine lineare Polynukleotidsequenz mit einer Länge von bis zu etwa 100 Nukleotidbasen.
  • Vektor:
  • Ein Nukleinsäuremolekül, wie es in eine Wirtszelle eingebracht wird, wodurch eine transformierte Wirtszelle gebildet wird. Ein Vektor kann Nukleinsäuresequenzen umfassen, die es ihm erlauben, sich in einer Wirtszelle zu replizieren, wie beispielsweise einen Replikationsursprung. Ein Vektor kann ferner ein oder mehrere selektierbare Markergene und andere im Stand der Technik bekannte genetische Elemente umfassen.
  • Transformiert:
  • Eine transformierte Zelle ist eine Zelle, in die durch molekularbiologische Verfahren ein Nukleinsäuremolekül eingebracht worden ist. Wie vorliegend verwendet umfasst der Begriff Transformation alle Methoden, durch die ein Nukleinsäuremolekül in eine Zelle eingebracht werden kann, einschließlich die Transfektion mit viralen Vektoren, die Transformation mit Plasmidvektoren sowie das Einbringen nackter DNA durch Elektroporation, Lipofektion und Beschleunigung mittels einer Partikel-Gun, und er umfasst transiente sowie auch stabile Transformanten.
  • Isoliert:
  • Ein ”isolierter” biologischer Bestandteil (wie beispielsweise eine Nukleinsäure oder ein Protein oder ein Organell), der im Wesentlichen von anderen biologischen Bestandteilen der Zelle des Organismus, in der der Bestandteil natürlicherweise vorkommt, d. h. von anderer chromosomaler und extrachromosomaler DNA und RNA, Proteinen und Organellen, getrennt oder gereinigt wurde. Nukleinsäuren und Proteine, die ”isoliert” worden sind, umfassen Nukleinsäuren und Proteine, die durch Standardreinigungsverfahren gereinigt worden sind. Der Begriff umfasst ferner Nukleinsäuren und Proteine, die durch rekombinante Expression in einer Wirtszelle hergestellt worden sind, sowie chemisch synthetisierte Nukleinsäuren.
  • In funktionsfähiger Weise verknüpft:
  • Eine erste Nukleinsäuresequenz ist in funktionsfähiger Weise mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz verknüpft, wenn die erste Nukleinsäuresequenz in einem funktionalen Zusammenhang mit der zweiten Nukleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist ein Promotor in funktionsfähiger Weise mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor die Transkription oder die Expression der kodierenden Sequenz bewirkt. üblicherweise sind in funktionsfähiger Weise verknüpfte DNA-Sequenzen zusammenhängend und (sofern notwendig, um zwei für Proteine kodierende Regionen zu verbinden) im selben Leserahmen.
  • Rekombinant:
  • Eine rekombinante Nukleinsäure ist eine solche, die eine Sequenz aufweist, die nicht natürlich vorkommt, oder die eine Sequenz aufweist, die durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Sequenzsegmenten erzeugt wurde. Diese künstliche Kombination wird oftmals durch chemische Synthese oder in den meisten Fällen durch künstliche Manipulation von isolierten Nukleinsäuresegmenten erreicht, z. B. durch gentechnische Verfahren.
  • cDNA (komplementäre DNA):
  • Ein Stück DNA, dem interne, nicht-kodierende Segmente (Introns) und regulatorische Sequenzen, die die Transkription bestimmen, fehlen. cDNA wird im Labor durch reverse Transkription von Boten-RNA hergestellt, die aus Zellen extrahiert wurden.
  • ORF (offener Leserahmen):
  • Eine Folge von Nukleotidtriplets (Kodons), die für Aminosäuren ohne jegliches Terminationskodon kodieren. Diese Sequenzen sind üblicherweise in ein Peptid translatierbar.
  • Transgene Pflanze:
  • Wie vorliegend verwendet bezeichnet dieser Begriff eine Pflanze, die rekombinantes genetisches Material enthält, welches normalerweise nicht in Pflanzen dieser Art gefunden wird und welches durch menschliche Manipulation in die besagte Pflanze (oder in Vorläufer dieser Pflanze) eingebracht worden ist. Somit ist eine Pflanze, die ausgehend von einer Pflanzenzelle angezüchtet wird, in die rekombinante DNA durch Transformation eingebracht wurde, eine transgene Pflanze sowie auch alle Nachfahren dieser Pflanze, die das eingebrachte Transgen enthalten (entweder durch sexuelle oder asexuelle Produktion erzeugt).
  • Der Begriff ”transgene Pflanze” umfasst ferner Teile von Pflanzen, einschließlich Frucht, Samen und Pollen.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf monokotyle Pflanzen anwendbar, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) auf grasartige monokotyle Pflanzen, wie beispielsweise Weizen (Triticum spp.), Reis (Oryza spp.), Gerste (Hordeum spp.), Hafer (Avena spp.), Roggen (Secale spp.), Mais (Zea mays), Sorghum und Hirse (Pennisettum spp.). Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise mit Genotypen der Gerste verwendet werden, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages, Baronesse; und mit Genotypen von Weizen, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Yecora Rojo, Bobwhite, Karl und Anza. Die Erfindung ist im Allgemeinen bei Getreiden besonders nützlich.
  • Samenreifung:
  • Samenreifung oder Kornentwicklung bezieht sich auf einen Zeitraum, der mit der Befruchtung beginnt, und in dem Nährstoffreserven (z. B. Proteine, Lipide, Stärke etc.) in dem sich entwickelnden Samen gespeichert werden, insbesondere in Speicherorganen des Samens, einschließlich dem Endosperm, der Testa, der Aleuronschicht, dem Embryo und dem Scutellumepithel, was zu einer Vergrößerung und Ausfüllung des Samens führt, und der mit der Trocknung des Samens endet.
  • Induzierbar:
  • Charakterisiert durch einen Promotor, der in Gegenwart oder Abwesenheit eines kleinen Moleküls hochreguliert wird; umfasst ist sowohl eine direkte als auch eine indirekte Induktion.
  • Für die Samenreifung spezifischer Promotor:
  • Ein Promotor, der während der Samenreifung induziert wird, beispielsweise ein solcher, der um 25% oder mehr während der Samenreifung erhöht ist.
  • Signal-/Leader-/Ziel-/Transport-Sequenz:
  • Eine N-terminale oder C-terminale Polypeptidsequenz, die bewirkt, dass das Polypeptid oder Protein, an das sie angeheftet ist, co-translational oder post-translational zu einem Proteinspeicherkörpergebracht wird. Ein Beispiel in Gerste ist die B1- oder D-Hordein-Signalsequenz.
  • Terminale Prozessierung oder Terminationssequenz:
  • Eine DNA-Sequenz, die 3' von der kodierenden Sequenz lokalisiert ist, und die RNA-Polymerase dazu zwingt, die Transkription eines Gens abzubrechen und von der DNA zu dissoziieren. Ein Beispiel ist der nos 3'-Terminator. Ein Terminator kann darüber hinaus während der posttranskriptionalen Prozessierung der mRNA in vivo auftreten, um anzuzeigen, wo ein Vorläufer-mRNA-Molekül gespalten werden soll, um eine reife mRNA-Spezies zu erhalten, die translatiert wird. Ein Segment, das ein terminal prozessierendes Signal enthält, kann durch Vergleich von cDNA erhalten werden, die ein Endosperm-exprimiertes Produkt kodiert, welches für dasselbe Produkt kodiert, wobei der 3'-Terminus der cDNA identifiziert wird. Durch Isolierung eines genomischen DNA-Segments, das 50 bis 100 Basenpaare auf jeder Seite des 3'-Terminus umfasst, kann man sicher sein, dass ein Segment mit dem terminalen prozessierenden Signal erhalten wird.
  • Proteinkörper:
  • Intrazelluläre Struktur, die Proteine innerhalb einer einheitlichen Membranstruktur enthält. In einigen Fällen wird diese Struktur als Vakuole bezeichnet.
  • Samenspeicherprotein:
  • Ein endogenes Pflanzenprotein, das synthetisiert und während der Samenreifung angereichert wird, in dem getrockneten Korn gespeichert wird und während der Reifung mobilisiert wird. Solche Proteine werden oft in einem Proteinkörper in einem Pflanzensamen gespeichert. Beispiele für solche Speicherproteine umfassen Arachin, Avenin, Cocosin, Conarchin, Concocosin, Conglutin, Conglycinin, Convicin, Crambin, Cruciferin, Cucurbitin, Edestin, Excelsin, Gliadin, Gluten, Glytenin, Glycinin, Helianthin, Hordein, Kafirin, Legumin, Napin, Oryzin, Pennisetin, Phaseolin, Psophocarpin, Secalin, Vicilin, Vicin und Zein.
  • II. Samenspezifische Expression von Proteinen unter Verwendung von Hordein-Promotor/Hordein-Signalsequenz-Konstrukten
  • a. Konstrukte
  • Wir offenbaren rekombinante Konstrukte, die geeignet sind, einen hohen Grad an Expression eines spezifischen Polypeptids in Pflanzensamen zu erzielen. Die Konstrukte können allgemein als Ph-hSS-X wiedergegeben werden, wobei Ph ein Hordein-Promotor ist, hSS eine Gersten-B1- oder -D-Hordein-Signalsequenz, und X ein Nukleinsäuremolekül ist, das für das spezifische Polypeptid kodiert. Jeder dieser drei Bestandteile ist in funktionsfähiger Weise mit dem nächsten verknüpft, d. h. der Hordein-Promotor ist mit dem 5'-Ende der für die Hordein-Signalsequenz kodierenden Sequenz verknüpft, und die Hordein-Signalsequenz ist in funktionsfähiger Weise mit der X-Sequenz verknüpft. Das Konstrukt wird darüber hinaus üblicherweise 3'-regulatorische Sequenzen umfassen, wie beispielsweise die Nos 3'-Region.
  • Die Eigenschaften von Hordein-Promotoren und Signalsequenzen sind oben beschrieben. Die B1- und D-Hordein-Gene sind von Brandt et al. (1985) und Sørensen et al. (1996) beschrieben worden. Wenn der Promotor Ph ist, kann das Polypeptid ”X” jedes beliebige heterologe Polypeptid sein, das kein Samenspeicherprotein ist. Die Polypeptide X, die wie vorliegend beschrieben in Pflanzensamen als Teil von P-SS-X- oder Ph-SS-X-Konstrukten exprimiert werden können, umfassen Proteine, wie beispielsweise humane therapeutische Proteine (z. B. Erythropoietin, Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase oder Prourokinase, Wachstumshormone, Zytokine, Faktor VIII, Epoetin-α, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, Antikörper, Impfstoffe usw.) oder pflanzenspezifische Proteine, wie beispielsweise Enzyme für die Stärkebiosynthese (z. B. ATP-Glucosepyrophosphorylase, EC 2.7.7.27; Stärkesynthase, EC 2.4.1.21; und verzweigendes Enzym, R, Q) und samenspezifische Proteine, wie beispielsweise diejenigen, die dem Samen einen erhöhten Nährwert verleihen. Nukleinsäuren, die für solche Proteine kodieren, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Die kodierende Region für ein solches Protein kann so modifiziert sein, dass es in höherem Maße der bevorzugten Kodonverwendung einer bestimmten Wirtszelle entspricht.
  • Andere heterologe Proteine, die keine Samenspeicherproteine sind, die von chimären Genen kodiert werden, umfassen Polypeptide, die immunologisch aktive Epitope bilden, und Enzyme, die die Umwandlung von intrazellulären Metaboliten katalysieren, wobei es zu einem konsequenten Aufbau der ausgewählten Metaboliten in der Zelle kommt.
  • Die Expressionskassette oder die chimären Gene in dem transformierenden Vektor weisen üblicherweise eine Transkriptions-Terminationsregion am entgegengesetzten Ende zu der regulatorischen Region für die Transkriptionsinitiation auf. Die Transkriptionsterminationsregion kann normal mit der Transkriptionsinitiationsregion aus einem anderen Gen assoziiert sein. Die Transkriptionsterminationsregion kann selektiert sein, insbesondere hinsichtlich der Stabilität der mRNA, um die Expression zu verstärken. Beispielhafte Transkriptionsterminationsregion umfassen den NOS-Terminator aus dem Ti-Plasmid von Agrobakterium und den Terminator der α-Amylase aus Reis.
  • Polyadenylierungs-Anhänge werden ebenfalls üblicherweise der Expressionskassette zugefügt, um einen optimal hohen Transkriptionsgrad bzw. eine geeignete Transkriptionstermination zu erhalten.
  • Molekularbiologische Standardverfahren, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion können verwendet werden, um diese Konstrukte herzustellen.
  • b. Allgemeine Grundlagen der Pflanzentransformation
  • Das Einbringen des Ph-hSS-X-Konstrukts in Pflanzen wird üblicherweise durch Verwendung von Standardverfahren erreicht. Der grundlegende Ansatz besteht darin, das Konstrukt in einen Transformationsvektor zu klonieren, der anschließend durch eines von mehreren Verfahren (z. B. Elektroporation) in die Pflanzenzellen eingebracht wird, und Nachkommenpflanzen, die das eingebrachte Konstrukt enthalten, zu selektieren. Vorzugsweise wird der gesamte oder ein Teil des Transformationsvektors stabil in das Genom der Pflanzenzelle integrieren. Der Teil des Transformationsvektors, der in die Pflanzenzelle integriert, und der die eingebrachte Ph-hSS-X-Sequenz (das eingebrachte ”Transgen”) enthält, kann als die rekombinante Expressionskassette bezeichnet werden.
  • Die Selektion von Nachkommenpflanzen, die das eingebrachte Transgen enthalten, kann auf Basis des Nachweises der Expression von Protein X oder anhand von Samen oder anhand einer erhöhten Resistenz gegen ein chemisches Mittel (wie beispielsweise ein Antibiotikum) als Ergebnis des Einschlusses eines dominanten, selektierbaren Marker-Gens erfolgen, das in den Transformationsvektor eingebracht wurde.
  • Erfolgreiche Beispiele für die Modifikation von Pflanzeneigenschaften durch Transformation mit klonierten Nukleinsäuresequenzen sind in der technischen und wissenschaftlichen Literatur vielfältig vorhanden. Ausgewählte Beispiele, die dazu dienen, das Wissen auf diesem Stand der Technologie zu veranschaulichen, umfassen:
    US-Patent Nr. 5,571,706 (”Plant Virus Resistance Gene and Methods”)
    US-Patent Nr. 5,677,175 (”Plant Pathogen Induced Proteins”)
    US-Patent Nr. 5,510,471 (”Chimeric Gene for the Transformation of Plants”)
    US-Patent Nr. 5,750,386 (”Pathogen-Resistant Transgenic Plants”)
    US-Patent Nr. 5,597,945 (”Plants Genetically Enhanced for Disease Resistance”)
    US-Patent Nr. 5,589,615 (”Process for the Production of Transgenic Plants with Increased Nutritional Value Via the Expression of Modified 2S Storage Albumins”)
    US-Patent Nr. 5,750,871 (”Transformation and Foreign Gene Expression in Brassica Species”)
    US-Patent Nr. 5,268,526 (”Overexpression of Phytochrome in Transgenic Plants”)
    US-Patent Nr. 5,780,708 (”Fertile Transgenic Corn Plants”)
    US-Patent Nr. 5,538,880 (”Method For Preparing Fertile Transgenic Corn Plants”)
    US-Patent Nr. 5,773,269 (”Fertile Transgenic Oat Plants”)
    US-Patent Nr. 5,736,369 (”Method for Producing Transgenic Cereal Plants”)
    US-Patent Nr. 5,610,042 (”Methods For Stable Transformation of Wheat”).
  • Die Beispiele umfassen die Beschreibung der Auswahl eines Transformationsvektors, von Transformationsverfahren und von der Konstruktion von Konstrukten, die erstellt werden, um ein eingebrachtes Transgen zu exprimieren. Im Hinblick auf das oben gesagte und die vorliegende Bereitstellung des Ph-hSS-X-Konstrukts ist es ersichtlich, dass der Fachmann in der Lage sein wird, diese Konstrukte in Pflanzen einzubringen, um Pflanzen herzustellen, die das gewünschte Protein (X) in ihren Samen exprimieren.
  • C. Pflanzentypen
  • Ph-hSS-X-Konstrukte können in nützlicher Weise in einer großen Vielzahl von monokotylen Pflanzen exprimiert werden, um eine samenspezifische Expression ausgewählter Polypeptide zu erreichen. Es wird erwartet, dass die Erfindung insbesondere bei monokotylen Getreidepflanzen anwendbar sein wird, einschließlich bei Gerste, Weizen, Reis, Roggen, Mais, Tricalat, Hirse, Sorghum, sowie bei Futterhafer und Rasengräsern. Die vorliegend beschriebenen Transformationsverfahren werden es insbesondere ermöglichen, dass die Erfindung mit Genotypen der Gerste, einschließlich Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Golden Promise, Steptoe, Klages und Baronesse, sowie mit kommerziell wichtigen Genotypen des Weizens, einschließlich Yecora Rojo, Bobwhite, Karl und Anza, verwendet werden kann.
  • d. Vektorkonstruktion
  • Mehrere rekombinante Vektoren, die für die stabile Transfektion von Pflanzenzellen oder für die Etablierung von transgenen Pflanzen geeignet sind, sind beschrieben worden, einschließlich diejenigen, die in Pouwels et al., (1987), Weissbach und Weissbach (1989) und Gelvin et al. (1990) beschrieben worden sind. Üblicherweise umfassen Pflanzentransformationsvektoren einen oder mehrere ORFs unter der Transkriptionskontrolle von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen sowie einen dominanten, selektierbaren Marker. Die Auswahl geeigneter 5'- und 3'-regulatorischer Sequenzen für die Konstrukte der vorliegenden Erfindung ist oben diskutiert worden. Dominante selektierbare Markergene, welche die einfache Selektion von Transformanten erlauben, umfassen diejenigen, die für antibiotische Resistenzgene kodieren (z. B. eine Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin, Bleomycin, G418, Streptomycin oder Spektinomycin) sowie für Herbizidresistenzgene (z. B. Phosphinothricin-Acetyltransferase).
  • e. Transformations- und Regenerierungsverfahren
  • Verfahren für die Transformation und Regenerierung von monokotylen Pflanzenzellen sind bekannt, und das geeignete Transformationsverfahren wird vom Anwender bestimmt werden. Die Wahl des Verfahrens wird mit dem Pflanzentyp variieren, der transformiert werden soll; der Fachmann wird die Eignung bestimmter Verfahren für bestimmte Pflanzentypen erkennen. Geeignete Verfahren können umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf): Elektroporation von Pflanzen-Protoplasten; Liposomenvermittelte Transformation; Polyethylenglykol(PEG)-vermittelte Transformation; Transformation unter Verwendung von Viren, Mikroinjektion von Pflanzenzellen; Mikroprojektil-Bombardement von Pflanzenzellen; Vakuuminfiltration sowie eine durch Agrobacterium tumefaciens(AT)-vermittelte Transformation. Typische Verfahren zur Transformation und Regenerierung von Pflanzen werden in den Patentdokumenten beschrieben, die zu Beginn dieses Abschnitts aufgeführt sind.
  • f. Selektion von transformierten Pflanzen
  • Nach der Transformation und Regenerierung von Pflanzen mit dem Transformationsvektor werden die transformierten Pflanzen üblicherweise unter Verwendung eines dominanten, selektierbaren Markers, der in den Transformationsvektor eingebaut ist, selektiert. Üblicherweise wird ein solcher Marker den Keimlingen der transformierten Pflanzen eine Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, und die Selektion von Transformanten kann erreicht werden, indem die Keimlinge geeigneten Konzentrationen des Antibiotikums ausgesetzt werden.
  • Nachdem transformierte Pflanzen selektiert und bis zur Reife angezüchtet worden sind, um die Samenanlage zu ermöglichen, können die Samen geerntet und in Bezug auf die Expression des exprimierten ”X”-Polypeptids untersucht werden.
  • III. Verwendung von im Samen exprimierten Polypeptiden
  • Die wie oben beschrieben transformierten Zellen werden zur Regenerierung von Pflanzen verwendet, und Samen aus diesen Pflanzen wird die Reifung erlaubt, die üblicherweise auf einem Feld stattfindet, wobei konsequent das heterologe Protein in den Samen hergestellt wird.
  • Die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren in Samen exprimierten Polypeptide können zu einem beliebigen Zeitpunkt nach Beginn der Expression aus den Samen geerntet werden. Dies bedeutet, dass es für die Samen nicht notwendig ist, dass diese vor der Ernte eine Reifung durchlaufen haben. Die exprimierten Proteine können (sofern dies gewünscht ist) durch herkömmliche Verfahren der Proteinaufreinigung aus den Samen isoliert werden. Beispielsweise können die Samen gemahlen und anschließend mit einem wässrigen oder organischen Extraktionsmedium extrahiert werden, gefolgt von einer Aufreinigung des extrahierten Fremdproteins. Abhängig von der Art des exprimierten Proteins und der beabsichtigten Verwendung können die Samen auch direkt ohne Aufreinigung des exprimierten Proteins verwendet werden.
  • Es gibt Unterschiede hinsichtlich der Anreicherungsmuster bei verschiedenen Polypeptiden oder Fraktionen innerhalb des Samens. Es wurde beispielsweise herausgefunden, dass die GUS-Expression mit der transgenen Zelllinie GPDhGN-6-9-6 ein Maximum bei etwa 20 Tagen aufweist, während die GUS-Expression in der Zelllinie GPBhGN-4-34-7-1-2 an den Tagen 10-14 einen höheren Wert aufweist als nach 20 Tagen. Diese differentiellen Expressionsmuster können verfolgt werden, und die Peptide können zum erwarteten Expressionsmaximum extrahiert werden.
  • Wenn das Protein zu einer Protein-lagerungsvakuole gebracht worden ist, kann die Vakuole zunächst aus einem Zellhomogenisat des Samens extrahiert und anschließend weiter fraktioniert werden, um das gewünschte Protein in angereicherter oder aufgereinigter Form zu erhalten.
  • IV. Alternative Expressionssysteme
  • Die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Expressionssysteme basieren auf dem System aus B1-Hordein-Promotor/Signalsequenz der Gerste. Dem Fachmann wird jedoch verständlich sein, dass die Erfindung nicht auf dieses spezielle System beschränkt ist.
  • Konstrukte, die solche Sequenzen verwenden, können dargestellt sein als:
    P-SS-X, wobei X das zu exprimierende Polypeptid ist (welches ein nicht pflanzliches oder ein nicht samenspezifisches oder ein nicht pflanzliches Speicherprotein sein kann), P ein für die Samenreifung spezifischer Promotor ist, SS eine Signalsequenz ist, die ein damit verknüpftes Polypeptid gezielt zu einem Proteinkörper leitet, in dem das Protein gespeichert wird.
  • Der Promotor P ist, für die Samenreifung spezifisch. Ein Promotor ist samenspezifisch, wenn seine Expression in einem Samen einer Pflanze mindestens 10-fach höher ist als in den Blättern oder in den Wurzeln der Pflanze, wenn der Promotor während der Samenreifung am stärksten exprimiert wird, und er wird als endospermspezifisch angesehen, wenn seine Expression im Endosperm mindestens 5-fach höher ist als in anderen Geweben eines Samens, wenn der Promotor am stärksten während der Samenreifung exprimiert wird. Zusätzlich zu den Hordein-Promotoren der Gerste kann die Erfindung Promotoren von Genen, die für folgendes kodieren verwenden: ein Reisglutelin, Reisoryzin oder Reisprolamin; ein Weizengliadin oder Weizenglutenin; ein Maiszein oder Maisglutelin; ein Haferglutelin; ein Sorghumkaferin; ein Hirsepennisetin oder ein Roggensekalin.
  • Um die Mengen eines exprimierten Polypeptids zu erhöhen, reichert sich das Protein an einer subzellulären Stelle an, an der das Polypeptid vor einer Proteolyse geschützt ist (d. h. der proteolytische Abbau des Polypeptids wird um mindestens 10% verringert, üblicherweise um mindestens 25%, wobei eine Verringerung um mindestens 50% noch üblicher ist). Daher wird das Polypeptid als Fusionspolypeptid exprimiert, das im selben Leserahmen die kodierende Sequenz für das Polypeptid und die kodierende Sequenz für ein Peptid (vorliegend in austauschbarer Weise als Signal-, Leader-, Transport- oder Targeting-Sequenz oder Peptid bezeichnet) umfasst, welche dazu führt, dass das Fusionsprotein co-translational oder post-translational zu einem Proteinspeicherkörper in einem monokotylen Samengeleitet wird. Das Signalpeptid ist vorzugsweise am 5'- oder am 3'-Ende des Fusionsproteins lokalisiert. Zusätzlich zu den B1- und D-Hordein-Signalpeptiden aus der Gerste kann die Erfindung ein Reisglutelin-Signalpeptid verwenden. Die Signalpeptide können durch zelluläre Enzyme co-translational oder post-translational abgespalten werden. Wenn das Signalpeptid nicht abgespalten wird, kann alternativ dazu das Fusionspolypeptid nach der Reinigung des Fusionspolypeptids abgespalten werden, sofern dies gewünscht ist. Zu diesem Zweck kann eine Aminosäuresequenz zwischen dem Signalpeptid und dem heterologen Protein eingebracht werden, um die enzymatische oder chemische Spaltung zur Entfernung des Signalpeptids zu ermöglichen.
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Erzeugung von Ph-hSS-X-Konstrukten
  • Die Polymerasekettenreaktion wurde verwendet, um Konstrukte für die Einbringung in Pflanzen herzustellen. Die verwendeten Verfahren waren Abwandlungen von den Verfahren, die von Higuchi et al. (1990), Horton et al. (1990), Pont-Kingdon et al. (1994) und Lefebvre et al. (1995) beschrieben wurden. Die Verfahren wurden verwendet, um ein Ph-hSS-X-Konstrukt herzustellen, in dem Ph der endospermspezifische B1-Hordein-Prmotor aus der Gerste war, hSS die B1-Hordein-Signalsequenz aus der Gerste war, und X der ORF für die β-Glucuronidase (uidA; gus) aus Escherichia coli war. Das Konstrukt umfasste ferner den 3'-Terminator der Nopalinsynthase (nos). Zwei PCR-Konstruktionsverfahren wurden verwendet: ein Verfahren mit 4 Primern, das in 1A dargestellt ist, sowie ein Verfahren mit 3 Primern, das in 1B dargestellt ist.
  • Alle PCR-Reaktionen wurden mit einem Thermocycler (MJ Research Inc.) unter Verwendung rekombinanter Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) in einem 100 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt. Der Reaktionspuffer enthielt 20 mM Tris-HCl (pM 8,2), 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 10 μg/ml nukleasefreies BSA und 50 μM eines jeden Desoxyribonukleosidtriphosphats. Die PCR-Bedingungen waren 25 Zyklen bei 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten, mit einem abschließenden Extensionsschritt bei 72°C für 7 Minuten.
  • Die rekombinanten PCR-Strategien sind in 1 gezeigt. Die zwei überlappenden Primer waren:
    5'-GCGGCAACAAGTACATTGCATTACGTCCTGTAGAAACCCCA-3' (BC-Primer) (SEQ ID NO: 5) und
    5'-TGGGGTTTCTACAGGACGTAATGCAATCGTACTTGTTGCCGC-3' (cb-Primer) SEQ ID NO: 6); die Sequenz des cb-Primers ist die umgekehrte komplementäre Sequenz des BC-Primers. Diese Primer enthalten einen Teil der für uidA kodierenden Sequenz und einen Teil der für das Signalpeptid kodierenden Sequenz aus dem B1-Hordein-Promotor. Die beiden externen Primer waren:
    5'-GTAAAGCTTTAACAACCCACACATTG-3' (A-Primer) (SEQ ID NO: 7 und
    5'-CGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACA-3' (d-Primer) (SEQ ID NO: 8),
    wobei diese jeweils eine einzelne Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) enthielten, nämlich HindIII bzw. EcoRI.
  • Bhorss (B1-Hordein-Promotor, der die Signalsequenz enthält)- und uidAnos(für uidA kodierende Sequenz plus nos 3'-Terminator)-Fragmente wurden unter Verwendung der nachfolgenden PCR-Bedingungen erhalten. (I) Bei Bhorss wurden 20 ng Matrize (ein das 2-4/HindIII-Plasmid enthaltender genomischer Klon von B1-Hordein; Brandt et al., 1985) und 40 pmol der Primer A und cb in 100 μl 1 × PCR-Puffer (Stratagene) gemischt. (II) Bei uidAnos wurden 20 ng Matrize (das Plasmid pDMC201.4, das uidA und nos ohne Promotor enthält (McElroy et al., 1995); das uidA-Gen wurde von dem pGUSN358->S-Plasmid erhalten, das durch ortsspezifische Mutagenese für Untersuchungen zum Vakuolen-Targeting verändert worden war (Farrell et al., 1990)) und 40 pmol der Primer BC und d in 100 μl 1 × PCR-Puffer gemischt. Nach Zugabe von 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase wurden die Reaktionsmischungen mit 50 μl Mineralöl überschichtet.
  • In der Strategie mit 4 Primern waren die beiden Hauptprodukte der PCR in der ersten Reaktion 0,49 kb für Bhorss und 2,07 kb für uidAnos. Ein Aliquot der ersten beiden Gruppen von PCR-Reaktionen wurde 50 mal ohne Gelaufreinigung verdünnt, und 5 μl des verdünnten Produktes wurden direkt als Matrize für die zweite PCR-Reaktion verwendet. 40 pmol externe Primer (A- und d-Primer) sowie 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase wurden zu 100 μl 1 × PCR-Puffer gegeben. Bei der Strategie mit 3 Primern wurde ein kürzeres Bhorss-Fragment von 0,49 kb durch PCR in der ersten Reaktion erzeugt, und dieses erste PCR-Produkt (Megaprimer genannt) wurde 50 mal verdünnt. Bei der zweiten PCR-Reaktion wurden 5 μl des verdünnten Bhorss-Megaprimers (Bhorss), 20 ng Matrize (pDMC201.4) und 40 pmol externe Primer (A und d) in einem Endvolumen von 100 μl in 1 × PCR-Puffer gemischt.
  • Die zweite Gruppe von PCR-Reaktionen, die sowohl die modifizierte Strategie mit 3 als auch die mit 4 Primern verwendete, erzeugte ein Fragment von 2,56 kb, das die DNA-Fragmente Bhorss und uidAnos enthielt (1C). Im Verhältnis zu der Strategie mit 4 Primern wurde bei Verwendung der Strategie mit 3 Primern eine geringere Menge des chimären Produkts erzeugt. Eine dritte PCR-Reaktion wurde ausgeführt, um ausreichende Mengen des chimären Produkts für ein Mikroprojektil-Bombardement zu erhalten. Das PCR-Produkt aus der Strategie mit 3 Primern wurde 50-fach verdünnt; 5 μl von diesem verdünnten Produkt wurden als Matrize zu 40 pmol A/d-Primern in 100 μl 1 × PCR-Puffer gegeben. Die finalen chimären Produkte, die in einem Endvolumen von 2 × 100 μl (2 Reaktionen) mittels der Strategie mit 3 Primern sowie aus der mit 4 Primern amplifiziert worden waren, wurden aus einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung des QIAquick-Gelextraktions-Kits (Qiagen Inc.) gereinigt. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden in 50 μl 1 × TE-Puffer eluiert, durch Restriktionsenzymverdau analysiert und in Mikroprojektil-Bombardement-Experimenten ohne weitere Subklonierung verwendet, um die Strategien bezüglich der DNA-Konstruktion zu untersuchen.
  • Beispiel 2: Transiente Assays in Zellen der Gerste
  • Vor dem Mikroprojektil-Bombardement wurden Gersteähren (Frühjahrssorte Golden Promise), die unreife Embryonen (15-25 Tage nach der Bestäubung) enthielten, für 10 bis 15 Minuten in 20%(v/v) Bleichmittel (5,25% Natriumhypochlorit) sterilisiert, und kurz 3 × 5 Minuten mit sterilem Wasser gewaschen. Das Endosperm wurde aseptisch von jedem Embryo manuell abgetrennt und mit der gefurchten Seite nach unten auf MS (Murashige und Skoog)-Basalmedium (8) gelegt, das mit 30 mg/l Maltose, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,25 mg/l Myo-Inositol, 1,0 g/l Caseinhydrolysat, 0,69 mg/l Prolin supplementiert und mit 3,5 g/l Phytagel (Sigma) verfestigt war. Das DNA-Bombardement wurde unter Verwendung von 1 μm Goldpartikeln (Analytical Scientific, Inc.) durchgeführt, die mit 12,5 μl der eluierten DNA-Fragmente (ungefähr 1 bis 2 μg) beschichtet waren, wobei die folgenden Modifikationen eines veröffentlichten Verfahrens (Lemaux et al., 1996) verwendet wurden. Goldpartikel und andere Bestandteile, die für die Präzipitation notwendig waren, wurden auf die Hälfte ihres Volumens verringert. Das DNA/Mikroprojektilpräzipitat wurde in 36 μl reinem Ethanol resuspendiert; 15 μl der Suspension wurden pro Bombardement in einer Biolistic PDS-1000/He-Vorrichtung (Bio-Rad) bei 1100 psi verwendet. Das beschossene Endosperm wurde bei 24 ± 1°C im Dunkeln für einen Tag inkubiert und im Hinblick auf die GUS-Aktivität gefärbt (Jefferson et al., 1987). Die Ergebnisse (nicht gezeigt) zeigten eine Expression von GUS im Endospermgewebe und stimmen mit der Tatsache überein, dass sich das chimäre DNA-Konstrukt, welches durch die oben beschriebenen PCR-Reaktionen hergestellt worden war, im Leserahmen befindet, wodurch die Erzeugung eines funktionellen uidA-Genprodukts ermöglicht wird. Nach der Bestätigung der Funktionalität in vivo wurde das chimäre Produkt in einen Vektor subkloniert, durch DNA-Sequenzierung bestätigt und für die stabile Transformation von Gerste zur Untersuchung des Proteintargetings verwendet.
  • Referenzbeispiel 3: Stabile Expression von Ph-X-Konstrukten in Gerste
  • Material und Methoden
  • Pflanzen
  • Die zweizeilige Frühjahrsgerstensorte Golden Promise wurde wie zuvor beschrieben in Wachstumskammern angezüchtet (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al. 1996).
  • Nukleinsäuren
  • Das Plasmid p16 (Sorensen et al. 1996) enthält ein pUC18-Rückgrat mit dem Gen für die β-Glucuronidase (uidA; gus), das von 550 bp des endospermspezifischen B1-Hordein-Promotors aus Gerste kontrolliert und von dem 3'-Polyadenylierungssignal nos der Nopalinsynthase aus Agrobacterium tumefaciens terminiert wird. Das Plasmid pD11-Hor3 (Sorensen et al. 1996) enthält uidA, das von 434 bp des D-Hordein-Promotors kontrolliert wird, sowie einen nos-Terminator. pAHC20 (Christensen und Quail 1996) enthält bar, das von dem Ubiquitin-Promotor und dem ersten Intron aus Mais gesteuert und von dem nos 3'-Ende terminiert wird. Beide Konstrukte umfassen Hordein-Promotoren, jedoch keine Hordein-Signalsequenz. Daher entsprechen sie Konstrukten des Typs: Ph-X. pAHC25 (Christensen und Quail 1996) besteht aus uidA und bar, wobei jedes unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors (Ubi1) und des ersten Introns aus Mais stehen und von nos terminiert werden.
  • Transformationsverfahren
  • Stabile transgene Zelllinien von Gerste, die B1-Hordein-uidA und D-Hordein-uidA enthielten, wurden nach Modifikationen des veröffentlichten Protokolls (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al. 1996) erhalten. Die Modifikationen waren für die Transformation von kommerziellen Genotypen der Gerste erforderlich. Das vorliegend beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um kommerzielle Gentypen von monokotylen Pflanzen, einschließlich Gerste und Weizen, zu transformieren, die sich der Transformation unter Verwendung veröffentlichter Verfahren widersetzen (beispielsweise die Gentypen der Gerste Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages und Baronesse sowie die Gentypen des Weizens Anza, Karl, Bobwhite und Yecora Rojo).
  • Die Donor-Gerstenpflanzen wurden zur Gewinnung der unreifen Embryonen wie beschrieben unter kontrollierten Bedingungen in Wachstumskammern auf Erde angezüchtet (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al. 1996). Unreife zygotische Embryonen wurden oberflächensterilisiert, mit der Scutellumseite nach unten auf DBC2-Medium aufgebracht und bei 24 ± 1°C inkubiert. Regenerative Gewebe wurden für 3 bis 4 Wochen beibehalten, anschließend in kleine Stücke geschnitten (etwa 3 bis 5 mm), auf frisches DBC2-Medium überführt und unter abgeblendeten Lichtbedingungen angezüchtet. Nach weiteren 3 Wochen wurden grüne Kallusbereiche in Stücke gebrochen (etwa 3 bis 5 mm) und auf frisches DBC2-Medium überführt. Grüne regenerative Gewebe wurden auf DBC2-Medium gehalten, wobei in Intervallen von 3 bis 4 Wochen Subkultivierungen erfolgten.
  • Für das Bombardement wurden grüne regenerative Gewebe (etwa 3 bis 5 mm, 4 Monate alt) für 1 Tag im Dunkeln bei 24 ± 1°C gehalten, anschließend auf DBC2-Medium überführt, das 0,2 M Mannitol und 0,2 M Sorbitol enthielt. 4 Stunden nach Behandlung mit dem Osmotikum wurden grüne Gewebe wie von Lemaux et al. (1996) beschrieben mit Goldpartikeln (Analytical Scientific Instruments, Alameda, CA) beschossen, die mit pAHC25, mit einer Mischung aus pAHC20 und p16 (molares Verhältnis 1:2) oder mit einer Mischung von pAHC20 und pD11-Hor3 (molares Verhältnis 1:2) beschichtet waren. 16 bis 18 Stunden nach dem Bombardement wurden grüne Gewebe auf DBC2-Medium ohne Osmotikum überführt und bei 24 ± 1°C unter abgeblendeten Lichtverhältnissen angezüchtet (etwa 10 μE, 16 h Licht).
  • Nach einer anfänglichen Kultivierung für 3 bis 4 Wochen auf nicht selektivem Medium wurde jedes Stück des grünen Gewebes in 1 bis 2 Stücke gebrochen (etwa 4 bis 5 mm, abhängig von der Größe des ursprünglichen Gewebestücks) und für die bar-Selektion auf DBC2-Medium überführt, das mit 5 mg/l Bialaphos supplementiert war. Die grünen Gewebe wurden auf DBC2-Medium selektiert, und Gewebe von 4 mm bis 5 mm wurden in Intervallen von 3 bis 4 Wochen subkultiviert. Bialaphos-resistente Kalli wurden auf FHG-Medium (Hunter 1988) regeneriert, das 1 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP) und 3 mg/l Bialaphos enthielt. Regenerierte Sprößlinge wurden in Magenta-Boxen überführt, die Wurzelmedium (rooting medium) (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) enthielten, welches 3 mg/l Bialaphos enthielt. Wenn die Keimlinge den Deckel der Box erreichten, wurden die Pflänzchen auf Erde überführt und bis zur Reife in einem Gewächshaus angezüchtet.
  • Das DBC2-Medium, das für die Transformation verwendet wurde, basiert auf MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962), das mit 30 g/l Maltose, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,25 g/l myo-Inisitol, 1,0 g/l Caseinhydrolysat und 0,69 g/l Prolin supplementiert ist und mit 3,5 g/l Phytagel (Sigma, St. Louis, MO) verfestigt wird. Das Medium war darüber hinaus mit 2,5 mg/l des Pflanzenauxins 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 0,1 mg/l des Pflanzenzytokinins 6-Benzylaminopurin (BAP) und 5 μM Kupfer (als Kupfersulfat) supplementiert. Die Gegenwart einer erhöhten Menge Kupfer sowie ein Verhältnis von viel Auxin/wenig Zytokinin hat sich als notwendig für die wirksame Erzeugung des grünen regenerativen Materials aus Phänotypen der Gerste und des Weizens herausgestellt, die sich ansonsten der Transformation widersetzen. Die Zusammensetzung des DBC2-Mediums kann jedoch in Abhängigkeit von dem jeweiligen zu transformierenden Gentyp verändert werden. Die Hauptbestandteile des Mediums werden sich im Rahmen der folgenden Bereiche bewegen: ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Zytokinin in einer Konzentration von 0 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM (wobei etwa 1 bis 10 μM üblicher sind). Eine effizientere Transformation kann erreicht werden, wenn als Kohlenstoffquelle im Medium Maltose in einer Konzentration von bis zu etwa 60 g/l verwendet wird, üblicherweise etwa 30 g/l (entweder anstelle der Sucrose oder in Kombination mit Sucrose).
  • Es wurde eine histochemische Färbung im Hinblick auf GUS durchgeführt (Jefferson et al. 1987), wobei 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO) verwendet wurde. Die Proben wurden über Nacht bei 37°C in einem GUS-Assaypuffer inkubiert.
  • Quantitative Messungen der GUS-Aktivität wurden nach dem Verfahren von Jefferson et al. (1987) unter Verwendung des 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid(MUG)-Substrats (Sigma, St. Louis, MO) durchgeführt. Aus homozygoten Linien wurde ein einzelnes unreifes Endosperm 10 bis 14, 20 und 30 Tage nach der Bestäubung isoliert oder aus reifem Endosperm, in flüssigem Stickstoff gefroren und in GUS-Extraktionspuffer gemahlen; jede Behandlung wurde mit 4 Ansätzen durchgeführt. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände dazu verwendet, die GUS-Aktivität zu bestimmen. Die Fluoreszenz von 4-Methylumbelliferon (4-MU) (Sigma, St. Louis, MO) wurde auf einem geeigneten TKO 100 Minifluorometer (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen. Die Proteine wurden wie zuvor beschrieben extrahiert (Jefferson 1987, Jefferson et al. 1987), und die Proteinkonzentrationen in den Extrakten wurden nach Bradford (1976) gemessen, wobei das BioRad-Reagenz (Bio-Rad, Richmond, CA) verwendet wurde.
  • Um die Herbizidsensitivität der T0-Pflanzen und ihre Nachkommen zu bestimmen, wurde ein Teil der Blattspreite im Blattstadium 4 bis 5 unter Verwendung eines Baumwolltupfers mit 0,25% Lösung (v/v) der BastaTM-Lösung (Anfangskonzentration 200 g/l Phosphinothricin, Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) plus 0,1% Tween 20 gefärbt. Die Pflanzen wurden 1 Woche nach der Herbizidanwendung bewertet.
  • Es wurde die gesamte genomische DNA aus unabhängigen Kalli oder Blattgeweben wie von Dellaporta (1993) beschrieben aufgereinigt. Um das Vorhandensein von uidA in genomischer DNA der putativ transformierten Zelllinien zu untersuchen, wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung des Primersets aus UIDA1 (5'-AGCGGCCGCATTACGTCCTGTAGAAACC-3' (SEQ ID NO: 9) und UID2R (5'-AGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCC-3') (SEQ ID NO: 10) amplifiziert. Das Vorhandensein von bar wurde unter Verwendung des Primersets aus BAR5F (5'-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3') (SEQ ID NO: 11) und BAR1R (5'-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3') (SEQ ID NO: 12) (Lemaux et al. 1996) untersucht. Die Amplifikationen wurden mit einer Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt. 25 μl des PCR-Produktes wurden mit Ladepuffer elektrophoretisch auf einem 0,8%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid getrennt und unter Verwendung von UV-Licht photographiert. Das Vorhandensein eines 1,8 kb-Fragments bei den UIDA-Primern stimmte mit einem intakten uidA-Fragment überein; mit den BAR-Primern wurde ein internes 0,34 kb-Fragment erzeugt. Für die DNA-Hybridisierungsanalyse wurden 10 μg der genomischen Gesamt-DNA von Blattgewebe jeder Zelllinie mit EcoRI und BamHI verdaut, auf einem 1%igen Agarosegel getrennt, auf eine Zeta-Probe GT-Membran (Bio-Rad, Hercules, CA) überführt und mit einer radioaktiv markierten uidA-spezifischen Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers hybridisiert. Das uidA enthaltende 1,8 kb-XbaI-Fragment aus pBI221 wurde unter Verwendung des QIAEX Gelextraktionskits (QIAGEN), Chatsworth, CA) gereinigt und unter Verwendung von Zufallsprimern mit α-32P-dCTP markiert.
  • Ergebnisse
  • Zweiundzwanzig unabhängige, stabil transformierte Kalluslinien der Gerste, die entweder B1- oder D-Hordein-Promotor-uidA-Fusionen enthielten, wurden aus einer ersten Serie von Transformationen erhalten. 13 Linien waren regenerierbar, sieben B1-Hordein-uidA-Transformanten und sechs D-Hordein-uidA-Transformanten. Es wurde die genomische DNA aus dem Kallus von regenerierbaren Transformanten isoliert. Die PCR-Analyse wurde unter Verwendung der UIDA- und BAR-Primern durchgeführt. Die PCR-Amplifikation führte in den T1-Nachkommen zu einem intakten uidA-Fragment von 1,8 kb und einem internen bar-Fragment von 0,34 kb. Von den T0-Blattgewebe der 13 untersuchten Linien produzierte jedoch eine (GPDhGN-22) kein PCR-amplifiziertes Fragment für uidA (Tabelle 2). Nach Southern-Hybridisierung der genomischen DNA aus Blattgewebe der sieben B1-Hordein-uidA-Transformanten und der sechs D-Hordein-uidA-Transformanten produzierten 12 der 13 transformierten Linien die erwarteten Hordein-uidA-Fusionsfragmente von 2,35 kb oder 2,25 kb. Die verbleibende Linie (GPDhGN-22) produzierte keine Fragmente, die mit uidA hybridisierten, obwohl diese Linie Banden enthielt, die mit bar hybridisierten und von geeigneter Größe waren (Daten nicht gezeigt).
  • Verschiedene Gewebe von stabilen Transformanten wurden in Bezug auf die histochemische GUS-Aktivität untersucht. Eine starke GUS-Expression wurde in Endospermgeweben beobachtet, die sowohl mit dem T1- als auch mit dem D-Hordein-Promotor transformiert worden waren, jedoch nicht den Geweben von Embryo, Fruchtknoten, Stigma, Anthere oder Blatt. Eine GUS-Expression unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors (Ubi1) aus Mais wurde in allen Geweben beobachtet: keine GUS-Expression wurde in der nicht transformierten Kontrolle beobachtet. Keimende Wurzeln und Sprößlinge von T1-Samen von B1- oder D-Hordein-Promotor-uidA-Fusionstransformanten wiesen ebenfalls keine sichtbare histochemische GUS-Aktivität auf (Daten nicht gezeigt).
  • Die relativen Aktivitäten der B1- und D-Hordein-uidA-Konstrukte wurden durch fluorimetrische Analyse von GUS in Extrakten von sich entwickelnden und reifen Samen von homozygoten Linien bestimmt (Tabelle 1). Die spezifischen Aktivitäten von GUS, das von dem B1-Promotor gesteuert wurde, hatten maximale Expressionsmengen bei 10 bis 20 Tagen nach der Bestäubung. Der D-Hordein-Promotor zeigte ein Entwicklungsmuster mit Peak-spezifischen Aktivitäten bei 20 bis 30 Tagen nach der Bestäubung.
  • Die Enzymaktivität von Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT, Produkt von bar) und GUS wurde in T0-Pflanzen und ihren Nachkommen durch Färbung der Blätter mit Basta für PAT und durch einen histochemischen Assay auf GUS untersucht. Blattgewebe von T0-Pflanzen aller dreizehn unabhängigen Linien zeigten eine Basta-Resistenz (Tabelle 2). Bei den T1-Nachkommen zeigten sieben von dreizehn Linien, die sowohl auf uidA als auch auf bar untersucht worden waren, ein 3:1-Segregationsmuster für die Expression von GUS (Tabelle 2). Von den verbleibenden sechs Linien wies eine Linie (GPDhGN-6) ein 43:2-Segregationsverhältnis für die GUS-Expression auf; eine Linie (GPDhGN-22) exprimierte PAT, enthielt jedoch kein uidA, eine Linie (GPBhGN-13) enthielt weder uidA noch bar und drei Linien (GPBhGN-2, GPDhGN-12 und GPDhGN-14) waren steril. Das T1-Endosperm von allen fertilen transgenen T0-Linien zeigte positive DNA-Hybridisierungssignale für uidA [2,35 kb-Fragment bzw. 2,25 kb-Fragment für das B1-Hordein-uidA-Gen bzw. das D-Hordein-uidA-Gen] auf, zeigte eine starke GUS-Aktivität (Tabelle 2), mit Ausnahme von GPBhGN-13 und GPDhGN-14. Das bar-Gen war stabil auf die T1-Nachkommen aller fertilen Linien übergegangen, außer bei GPBhGN-13; es wurde eine stabil exprimierende homozygote Linie (GPDhGN-16) erhalten (Tabelle 2). Die Expression von uidA, das entweder von dem B1-Hordein-Promotor oder von dem D-Hordein-Promotor gesteuert wurde, wurde auch stabil auf die T2-Nachkommen aller 7 unabhängig getesteten Linien (GPBhGN-4, -7, -12, -14, GPDhGN-6, -11 und -16) vererbt (Tabelle 1). Die Expression des uidA-Gens war stabil in der einen Linie übertragen worden, welche in der T5-Generation getestet wurde (GPBhGN-4), in zwei Linien, die in der T4 getestet wurden (GPBhGN-7 und GPDhGN-16) in 3 Linien der T3 (GPBhGN-12, GPDhGN-6 und -11), in einer Linie der T2 (GPBhGN-14) und in einer Linie der T1 (GPBhGN-3) (Tabelle 1). Homozygote transgene Linien, die uidA stabil exprimierten, wurden in den Fällen von GPBhGN-4, -7, GPDhGN-6 und -16 erhalten (Tabellen 1 und 2).
    Figure DE000069836552T3_0001
    Figure DE000069836552T3_0002
    Figure DE000069836552T3_0003
    Tabelle 2. Spezifische GUS-Aktivitäten in sich entwickelnden und reifen transgenen Gerstensamen
    GUS-Aktivität (pmol/min/mg Protein)
    Tage nach Bestäubung 10–14 20 30 reif
    transgene Linie
    GPBhGN-4-34-7-1-2 3514 ± 1326 2309 ± 454 1313 ± 340 106 ± 37
    GPDhGN-6-9-6 402 ± 363 3812 ± 969 2806 ± 949 281 ± 52
    nicht transgene Kontrolle 80 + 31 81 ± 23 36 ± 13 43 ± 9
  • Die GUS-Aktivität wurde durch fluorimetrische Assays mit Proteinextrakten aus sich entwickelndem und reifem Endosperm von homozygoten Linien bestimmt. Die Werte für die GUS-Aktivität stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 4 Ansätzen für jede Behandlung dar.
  • GPBhGN-4-34-7-1-2 und GPDhGN-6-9-6 sind homozygote Linien, die mit B1-Hordein-uidA (p16)-Konstrukten bzw. D-Hordein-uidA(pD11-Her3)-Konstrukten transformiert wurden, und T5- bzw. T3-Samen produzieren.
  • Beispiel 4: Vergleich der Samenexpression in Gerstenpflanzen, die stabil mit Ph-hSS-X-Konstrukten oder Ph-X-Konstrukten transformiert wurden
  • Um die Wirkung der Hordein-Signalsequenz auf das Ausmaß der Proteinexpression zu bestätigen, wurden Gerstenpflanzen mit Konstrukten transformiert, in denen der Hordein B1-Promotor in funktionsfähiger Weise mit dem uidA-Gen verknüpft war, entweder mit der Hordein-B1-Signalsequenz (Konstrukt pdBhssGN5-6) oder ohne die Signalsequenz (Konstrukt pdBhGN1-2), wie in 2 veranschaulicht ist. Details und Ergebnisse dieser Verfahren sind nachfolgend beschrieben.
  • Material und Methoden
  • Plasmide
  • Es wurden zwei DNA-Konstrukte, die den B1-Hordeinpromotor und die kodierende Region gus mit oder ohne Signalpeptidsequenz enthielten, hergestellt, um die Funktionalität der B1-Hordein-Promotor-gus-Fusionen zu überprüfen und ihr Targeting zu untersuchen:
    • (1) pdBhssGN5-6 (mit Signalsequenz, 2A): das chimäre DNA-Konstrukt, welches das B1-Hordein-Promotor-Signalsequenz-uidA-nos enthielt und nach den in Beispiel 1 beschriebenen PCR-Verfahren hergestellt worden war, wurde mit HindIII und SnaBI verdaut, und das HindIII/SnaBI-Fragment wurde in den HindIII-SnaBI-verdauten pDMC201.4 (McElroy et al., 1995) ligiert, wobei das Plasmid pdBhssGN5-6 erzeugt wurde. Das pDMC201.4-Plasmid enthält uidA ohne Promotor sowie nos; das uidA-Gen wurde aus dem pGUSN358->S-Plasmid erhalten, das durch ortsspezifische Mutagenese für Untersuchungen zum Vakuolen-Targeting verändert worden war (Farrell und Beachy, 1990). Das mittels PCR amplifizierte Fragment (B1-Hordein-Promotor mit seiner Signalpeptidsequenz plus die Verbindungsregion mit dem 5' uidA) des chimären Produkts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
    • (2) pdBhGN1-2 (ohne Signalsequenz, 2B): die SphI- und XbaI-Schnittstellen enthaltenden Primer Bhor3 (5'-cgcatgcGTGCAGGTGTATGAGTCATT-3') (SEQ ID NO: 13) und Bhor2R (5'-ccctctagaAGTGGATTGGTGTTAACT-3') (SEQ ID NO: 14), jeder jeweils mit einer einzelnen Restriktionsenzymschnittstelle (klein geschriebene Buchstaben), wurden für die Amplifikation der B1-Hordein-5'-Region von 0,55 kb verwendet, wobei das Plasmid p16, welches B1-Horderin-Promotor-uidA-nos enthielt (Sørensen et al., 1996) als Matrize verwendet wurde. Das mittels PCR amplifizierte Fragment von 0,55 kb wurde mit SphI und XbaI geschnitten und in einen SphI/XbaI-verdauten pUC19 ligiert, wobei pBhor-1 erzeugt wurde. pBhGN-1 wurde hergestellt, indem der CaMV35S-Promotor in p35SGN-3 (der CaMV35S-Promotor-uidA-nos enthielt) durch das SphI/XbaI-B1-Hordein-Fragment aus pBhor-1 ersetzt wurde. Das HindIII/SnaBI-Fragment aus pBhGN-1 wurde durch das HindIII/SnaBI-Fragment in pDMC201.4 ersetzt, wobei pdBhGN1-2 erzeugt wurde. Die das B1-Hordein 5'-flankierende Region von 120 bp war folglich sowohl in pdBhssGN5-6 als auch in pdBhGN1-2 deletiert.
  • Die zwei resultierenden chimären DNA-Konstrukte wurden für Assays auf die stabile Genexpression unter Verwendung von Mikroprojektil-Bombardement in unreifes Endospermgewebe der Gerste eingebracht. Stabile Transformationsverfahren, GUS-Färbung und GUS-Quantifizierung sowie die Basta-Sensitivität wurden wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt.
  • Isolierung genomischer DNA, Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Blut-Hybridisierung
  • Die gesamte genomische DNA aus unabhängigen Kalli oder Blattgeweben wurde wie beschrieben aufgereinigt (Dellaporta, 1993). Um die Gegenwart von uidA in genomischer DNA von putativ transformierten Linien zu überprüfen, wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung des Primersets aus UIDA1 und UID2R amplifiziert. Das Primerset aus Bhor8 (5'-GAAGAGATGAAGCCTGGCTAC-3') (SEQ ID NO: 15) und GUS5516 (5'-CGATCCAGACTGAATGCCCACAGG-3') (SEQ ID NO: 16) wurden verwendet, um zwischen dem B1-Hordein-Promotor mit Signalsequenz und dem ohne Signalsequenz zu unterscheiden. Ein Hybridprodukt aus 229 bp wird ausgehend von dem Konstrukt erwartet, dass den B1-Hordein-Promotor mit der Signalsequenz enthält, während ein PCR-Produkt aus 178 bp ausgehend von dem Konstrukt erwartet wird, das den B1-Hordein-Promotor ohne die Signalsequenz enthält. Das Vorhandensein von bar wurde unter Verwendung des Primersets aus BAR5F und BAR1R (Lemaux et al. 1996) untersucht. Die Amplifikationen wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt. 25 μl des PCR-Produkts wurden mit Ladepuffer elektrophoretisch auf einem 0,8%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid getrennt und unter Verwendung von UV-Licht photographiert. Das Vorhandensein eines Fragments von 1,8 kb bei den UIDA-Primern verwies auf ein intaktes uidA-Fragment; ein internes Fragment von 0,34 kb wurde mit den BAR-Primern erzeugt. Für die DNA-Hybridisierungsanalyse wurden 10 μg der gesamten genomischen DNA aus dem Blattgewebe jeder Linie mit HindII und SacI verdaut, auf einem 1%igen Agarosegel getrennt und auf eine Zeta-Probe GT-Membran (Bio-Rad, Hercules, CA) überführt und mit einer radiomarkierten uidA-spezifischen Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers hybridisiert. Das uidA-enthaltene XbaI-Fragment von 1,8 kb aus pBI221 wurde unter Verwendung eines QIAEX-Gelextraktionskits (QIAGEN, Chatsworth, CA) gereinigt und mit α-32P-dCTP unter Verwendung von Zufallsprimern markiert.
  • Immunogold-Markierungsassay
  • Transgenes und nicht transgenes unreifes Endosperm wurde etwa 20 Tage nach der Bestäubung unter Verwendung einer Hochdruckgefriermethode (McDonald, 1998) geerntet. Die Gewebe wurden in weißes Harz eingebettet, und die Immunhistochmie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Phillip et al., 1998).
  • Ergebnisse
  • PCR und DNA-Blot-Hybridisierungsanalyse von transgenen Pflanzen
  • Um die Funktionalität der N-terminalen Signalpeptidsequenz des B1-Hordein-Promotors zu überprüfen, und um die Mechanismen des Targetings zu untersuchen, erhielten wir 10 unabhängige, stabil transformierte Gerstenlinien, die entweder pdBhssGNS-6 oder pdBhGN1-2 enthielten. Von diesen Linien wurden 3 Linien von jedem DNA-Konstrukt mit uidA- und bar-Genen co-exprimiert. Es wurde die genomische DNA dieser Transformanten isoliert. Die PCR-Analyse wurde unter Verwendung der UIDA- und BAR-Primer durchgeführt. Die PCR-Amplifikation führte bei allen 6 Linien zu einem intakten uidA-Fragment von 1,8 kb und einem internen bar-Fragment von 0,34 kb (Tabelle 3). Es wurde ein Größenunterschied von 51 bp zwischen den Fragmenten, die ausgehend von den B1-Hordein-uidA-Transformaten mit oder ohne Signalsequenz amplifiziert wurden, beobachtet, was auf das Vorhandensein der Signalsequenz in den Linien GPdBhGN-1, -2 und -16 zurückzuführen ist.
  • Expression von Hordein-uidA in transgenen Pflanzen
  • T1-Samen wurden in Bezug auf die histochemische GUS-Aktivität untersucht. Eine starke GUS-Expression wurde in Endospermgeweben beobachtet, die mit beiden B1-Hordein-Promotoren mit und ohne Signalsequenz transformiert worden waren, jedoch nicht im Embryo. Die GUS-Expression, die von den beiden B1-Hordein-uidA-Konstrukten ausging, war im sich entwickelnden Endosperm besonders auffällig, insbesondere in peripheren Zellen des Endospermgewebes und in Endospermgewebe nahe der Scutellumstelle. Der B1-Hordein-Promotor mit der Signalsequenz zeigte sogar eine noch stärkere Expression im Endosperm als derjenige ohne Signalsequenz. Es wurde keine GUS-Expression in den nicht transformierten Kontrollgeweben beobachtet.
  • Die relativen Aktivitäten der B1-Hordein-uidA-Konstrukte wurde durch fluorimetrische Analyse von GUS in Extrakten von sich entwickelnden und reifen Samen von homozygoten Linien bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten von GUS, das durch den B1-Hordein-Promotor mit der Signalsequenz gesteuert wurde, waren sowohl im sich entwickelnden als auch im reifen Samen höher als im Falle ohne Signalsequenz (6 und 7).
  • Insbesondere im sich entwickelnden Endospermgeweben, die mit dem B1-Hordein-Promotor mit der Signalsequenz transformiert worden waren, wurden im Vergleich zum B1-Hordein-Promotor ohne Signalsequenz eine mehr als 30-fach höhere GUS-Aktivität nachgewiesen.
  • Analyse von T0- bis T2-Nachkommen
  • Die Enzymaktivität von Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT, Produkt von bar) und GUS wurde in T0-Pflanzen und ihren Nachkommen durch Färbung der Blätter mit Basta für PAT und durch einen histochemischen Assay auf GUS untersucht. Blattgewebe von T0-Pflanzen aller 6 unabhängigen Linien zeigten eine Basta-Resistenz (Tabelle 1). Bei den T1-Nachkommen zeigten alle 6 Linien, die auf uidA getestet worden waren, ein 3:1-Segregationsmuster für die Expression von GUS. Das bar-Gen wurde ebenfalls stabil auf die T1-Nachkommen von 5 Linien übertragen, mit Ausnahme von GPdBhssGN-10; die Linie GPdBhssGN-10 exprimierte PAT nicht. Homozygote transgene Linien, die uidA stabil exprimieren, wurden in 4 Fällen erhalten, GPdBhGN-1, GPdBhssGN-7, -10 und -23.
  • Elektronenmikroskopie und Immunogold-Markierung
  • Das Immunsignal, das bei der Elektronenmikroskopie beobachtet wurde, war spezifisch für Proteinkörper in GUS-exprimierendem, unreifem Endosperm der Linie, die mit dem B1-Hordein-uidA-DNA-Konstrukt transformiert worden war, welches die N-terminale Signalpeptidsequenz von 19 Aminosäuren enthielt (7).
  • Diskussion
  • Die obige Untersuchung richtete sich auf die Funktionalität der B1-Hordein-Promotoren der Gerste mit und ohne N-terminale Signalpeptidsequenz von 19 Aminosäuren, wobei sowohl transiente als auch stabile Expressionsassay in der Gerste verwendet wurden. Im Einklang mit früheren Untersuchungen (Müller und Knudsen 1993; Sørensen et al., 1996) wurde die transiente Expression von GUS unter Kontrolle der B1-Hordein-Promotor-uidA-Fusion ohne Signalsequenz in sich entwickelndem Endosperm, jedoch nicht in Embryonen beobachtet. Der B1-Hordein-Promotor mit Signalsequenz zeigte das gleiche Expressionsmuster, jedoch eine stärkere Expression. Die PCR-Analyse bestätigte das Vorhandensein von uidA und bar in genomischer DNA von T0-Pflanzen von 6 verschiedenen Linien, die stabil mit B1-Hordein-Promotoren mit und ohne Signalsequenz transformiert worden waren.
  • Stabil transformierte, sich entwickelnde und reife Gerstensamen wurden im Hinblick auf die Gewebespezifität und das Timing der vom Hordein-Promotor gesteuerten GUS-Expression untersucht. GUS, das sowohl von dem B1-Hordein-Promotor mit als auch von dem ohne Signalsequenz gesteuert wurde, wurde ausschließlich im Endospermgewebe exprimiert, nicht jedoch in anderen Geweben. Darüber hinaus verstärkte das Vorhandensein der Signalsequenz bei dem B1-Hordein-Promotor die GUS-Expression in sich entwickelndem, transgenem Endosperm erheblich. Dies stimmt mit den Ergebnissen von Fiedler und Conrad (1995) überein, wonach ein antigenbindendes, einzelkettiges Fv(scFv)-Protein lediglich in Samen von Tabakpflanzen nachweisbar war, die mit Konstrukten transformiert worden waren, welche eine Signalpeptidsequenz enthielten. Nach Lagerung der reifen Tabaksamen für 1 Jahr bei Raumtemperatur gab es keinen Verlust an scFv-Protein oder seiner antigenbindenden Aktivität, wohingegen in Pflanzen, die mit einem Konstrukt ohne Signalpeptid transformiert worden waren, keine nachweisbare Anreicherung von scFv in reifen oder sich entwickelnden Samen auftrat. Es wurde angenommen, dass das Fehlen der GUS-Proteinexpression im Cytosol das Ergebnis einer translationalen oder post-translationalen Regulation durch cytosolische Proteasen ist, die das scFv-Protein abbauen, wenn es nicht in den sekretorischen Weg eintritt. Im Gegensatz dazu waren die Mengen von GUS-mRNAs in sich entwickelnden Samen und die GUS-Aktivität in reifen Samen in Tabaklinien, welche die N-terminale Aminosäuresequenz des Sojabohnenembryo-spezifischen Lektin-Gens aus 32 Aminosäuren aufwiesen, im Vergleich zu solchen, die diese Sequenz nicht aufwiesen, übereinstimmend höher (Phillip et al., unveröffentlichte Beobachtung). Die GUS-Expression, die von den zwei B1-Hordein-uidA-Konstrukten ausging, war insbesondere in peripheren Zellen des sich entwickelnden Endospermgewebes und im Endospermgewebe nahe der Scutellumstelle in transformierter Gerste besonders auffällig.
  • Man würde erwarten, dass transgene Pflanzen, die eine einzelne Stelle aufweisen, an der es zu einer Integration des Transgens gekommen ist, ein Segregationsverhältnis für das Transgen (und seine Expression) von 3:1 aufweisen. Alle 6 Linien ergaben ein solches Verhältnis für die GUS-Expression. Homozygote transgene Linien, die stabil GUS exprimierten, wurden von 4 Linien erhalten. Die Expression des vom Ubiquitin-Promotor aus Mais gesteuerten PAT wurde ebenfalls stabil auf die T1-Nachkommen von 5 transgenen Linien vererbt; eine Linie (GPdBhssGN-10) zeigte jedoch keine PAT-Expression bei den T2-Nachkommen.
  • Die vorliegend dargestellten Ergebnisse zeigen dass der D-Hordein-Promotor oder der B1-Hordein-Promotoren verwendet werden können, um ein System zu entwickeln, mit dem die Expression von Fremdgenen auf das Endosperm eines Gerstensamens beschränkt werden kann. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Verwendung von Pflanzen, die mit einem samenspezifischen Promotor mit Signalsequenz transformiert worden waren, die Expression des Transgens erheblich verstärkte. Dies ermöglicht die Erzeugung von neuen Getreidesorten für ernährungstechnische und pharmazeutische Zwecke unter Verwendung von Strategien des Vakuolen-Targetings.
  • Referenzbeispiel 5: Embryospezifische Expression
  • Dieses Beispiel verwendet den Glb1-Promotor aus Mais mit oder ohne Deletion einer 5'-flankierenden Sequenz, fusioniert mit dem bakteriellen Reportergen, dem β-Glucuronidase-Gen (uidA; gus), um die Funktionalität des Glb1-Promotors aus Mais für die embryospezifische Expression in transgener Gerste zu zeigen.
  • Eine zweizeilige Frühjahrsgerstensorte wurde wie zuvor beschrieben in Wachstumskammern angezüchtet (Wan und Lemaux 1994; Lemaux et al. 1996).
  • Plasmide
  • ppGlb1GUS (Liu und Kriz, 1996), ein Plasmid, welches das uidA-Reportergen unter Kontrolle des embryospezifischen Globulin(Glb1)-Promotors aus Mais enthält und von nos terminiert wird, wurde von DEKALB Plant Genetics, Mystic, CT erhalten. Das ppGlb1GUS wurde mit EcoRI verdaut, um eine das Globulin 5'-flankierende Region von 1,04 kb zu entfernen. Das 2,58 kb-EcoRI-Fragment, das den 0,36 kb-Globulin-Promotor, die kodierende Sequenz uidA und der nos-3'-Terminator enthielt, wurde in EcoRI-verdautem pUC19 ligiert, wobei pdGlbGUS-6 entstand. Die das Globulin 5'-flankierende Region von 1,04 kb war folglich in pgGlbGUS-6 deletiert. Die beiden oben genannten chimären DNA-Konstrukte wurden unter Verwendung von MikroprojektilBombardement in unreifes Endospermgewebe der Gerste eingebracht, um Assays für die transiente und die stabile Genexpression durchzuführen.
  • Transiente Genexpression der uidA-Gene, die von Globulin-Promotoren gesteuert wird
  • Ähren wurden etwa 20 bis 25 Tage nach der Bestäubung für 10 bis 15 Minuten in 20% (v/v) Bleichmittel (5.25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert, und anschließend dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Unreife Embryonen und Endospermgewebe wurden aseptisch getrennt und mit oder ohne Osmotikumbehandlung (Cho et al., 1998b) mit der Scutellumseite nach oben auf MS-Medium aufgebracht (Murashige und Skoog 1962), das mit 3,5 g/l Phytagel (Sigma, St. Louis, MO) supplementiert war. Die Gewebe wurden unter Verwendung einer Biolistic PDS-1000 He-Gun (Bio-Rad, Hercules, CA) bei 1100 psi nach dem Protokoll von Lemaux et al. (1996) mit 1,0 μm Goldpartikeln beschossen, die entweder mit ppGlb1GUS oder pdGlbGUS-6 beschichtet waren. Die osmotische Behandlung umfasste 0,2 M Mannitol und 0,2 M Sorbitol, wobei eine Endkonzentration von 0,4 M erhalten wurde, mit einer Vorbehandlung von 4 h und einer Nachbehandlung von 1 oder 2 h.
  • Stabile Gerstentransformationen
  • Stabile transgene GP-Linien wurden mittels Mikropartikel-Bombardement erhalten, wie es im Wesentlichen von Wan und Lemaux 1994; Lemaux et al. 1996; und Cho et al. 1998a, beschrieben wurde. Goldpartikel (1,0 μm) wurden mit 25 μg eines molaren Verhältnisses von 1:1 aus pAHC20 und ppGlb1GUS oder pdGlbGUS-6 beschichtet und wie beschrieben in den Bombardement-Experimenten verwendet. Das Plasmid pAHC20 (Christensen und Quail, 1996) enthält das Herbizid-Resistenzgen bar aus Streptomyces hygroscopicus unter Kontrolle des Ubiquitin-Ubi1-Promotors aus Mais, sowie das erste Intron des nos-3'-Terminators. Bialaphos-resistente Kalli wurden auf FHG-Medium (Hunter 1988) regeneriert, das 1 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP) und 3 mg/l Bialaphos enthielt. Regenerierte Sprößlinge wurden in Magentaboxen überführt, die Wurzelmedium (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) enthielten, welches 3 mg/l Bialaphos enthielt. Wenn die Sprößlinge den Deckel der Box erreichten, wurden die Pflänzchen auf Erde überführt und bis zur Reife in einem Gewächshaus angezüchtet.
  • Histochemische und quantitative Assays der GUS-Aktivität
  • Die histochemische Färbung in Bezug auf GUS wurde unter Verwendung von 5-Brom-4-chior-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO) durchgeführt. Die Proben wurden über Nacht bei 37°C in GUS-Assaypuffer inkubiert.
  • Herbizid-Verwendung
  • Um die Herbizid-Sensitivität von T0-Pflanzen und ihrer Nachkommen zu bestimmen, wurde ein Teil der Blattspreite im Blattstadium 4 bis 5 unter Verwendung eines Baumwolltupfers mit einer 0,25%igen Lösung (v/v) von BastaTM-Lösung (Startkonzentration 200 g/l Phosphinothricin, Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) plus 0,1% Tween 20 angefärbt. Die Pflanzen wurden 1 Woche nach der Herbizid-Verwendung bewertet.
  • Isolierung genomischer DNA, Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Blut-Hybridisierung
  • Die gesamte genomische DNA von unabhängigen Kalli oder Blattgeweben wurde wie beschrieben gereinigt (Dellaporta, 1993). Um das Vorhandensein von uidA in genomischer DNA von putativ transformierten Linien zu untersuchen, wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR amplifiziert, wobei das Primerset aus UIDA1 (5'-agcggccgcaTTACGTCCTGTAGAAACC-3') und UID2R (5'-agagctcTCATTGTTTGCCTCCCTG-3') verwendet wurde; jeder enthält eine Restriktionsschnittstelle (klein gedruckte Buchstaben) für die Subklonierung eines weiteren DNA-Konstrukts, das das uidA-Gen enthält (Cho et al. 1998a; b). Das Vorhandensein von bar wurde unter Verwendung des Primersets aus BAR5F (5'-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3') und BAR1R (5'-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3') durchgeführt (Lemaux et al. 1996). Die Amplifikationen wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt (Cho et al. 1998a; b). 25 μl des PCR-Produktes wurden mit Ladepuffer elektrophoretisch auf einem 0,8%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid getrennt und unter Verwendung von UV-Licht photographiert. Das Vorhandensein eines 1,8 kb-Fragments bei den UIDA-Primern stimmte mit einem intakten uidA-Fragment überein; mit den BAR-Primern wurde ein internes 0,34 kb-Fragment erzeugt.
  • Ergebnisse
  • Transiente Genexpression der Globulin-uidA-Gene
  • Um die Funktionalität des embryospezifischen Globulin-Promotors aus Mais zunächst zu etablieren, wurden die Plasmide ppGlb1GUS und pdGlb1GUS-6 in transienten Assays verwendet, die ein Mikroprojektil-Bombardement eines unreifen Gerstenendosperm bzw. eines Gerstenembryos umfassten. Zwei Kontrollen wurden eingeschlossen, eine Negativkontrolle, bei der mit 1 × TE-Puffer beschossen wurde und eine Positivkontrolle, bei der mit pAHC25 beschossen wurde, das uidA unter Kontrolle des konstitutiven Ubiquitin-Promotors aus Mais enthielt. GUS, das von den embryospezifischen Globulin-Promotoren aus Mais gesteuert wurde, wurde in Embryogewebe schwach exprimiert, im Endospermgewebe hingegen überhaupt nicht. Die GUS-Expression, die von den zwei Globulinpromotor-uidA-Fusionen gesteuert wurde, war in unreifen Gerstenembryonen mit osmotischer Behandlung stärker als ohne osmotische Behandlung. Das Ausmaß der uidA-Genexpression in Embryonen, die von dem undeletierten Globulin-Promotor (1,4 kb ppGlb1GUS) gesteuert wurde, schien geringfügig schwächer zu sein als die Expression, die von dem deletierten Globulin-Promotor (0,36 kb pdGlbGUS-6) gesteuert wurde. Die ABA-Behandlung verstärkte die GUS-Expression in unreifen Embryonen ohne osmotische Behandlung, jedoch nicht in solchen mit osmotischer Behandlung. Die Negativkontrolle zeigte keine GUS-Expression.
  • Embryospezifische Expression in transgenen Pflanzen Um darüber hinaus die Konstrukte aus Mais-Glb1 und uidA zu untersuchen, wurden zehn unabhängige, stabil transformierte Gerstenlinien erhalten; 5 waren mit dem undeletierten Globulin-Promotor transformiert, und weitere 5 waren mit einem deletierten Globulin-Promotor transformiert. Genomische DNA von regenerierbaren Transformanten wurde isoliert, und es wurde eine PCR-Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse der PCR-Amplifikation von uidA-Gen und bar-Gen mit genomischer DNA, die aus Kallusgewebe extrahiert worden war, zeigten, dass die transgenen Gerstenlinien sowohl das intakte uidA-Fragment von 1,8 kb als das interne bar-Fragment von 0,34 kb bildeten.
  • Verschiedene Gewebe von stabilen Transformanten wurden histochemisch in Bezug auf die GUS-Aktivität untersucht. Eine schwache uidA-Genexpression zeigte sich ausschließlich in Embryogeweben, die mit den Glb1-Promotoren aus Mais transformiert worden waren, jedoch nicht im Endospermgewebe. Auf der anderen Seite wurde eine GUS-Expression unter Kontrolle des Ubiquitin(Ubil)-Promotors aus Mais in allen Geweben beobachtet; es wurde keine GUS-Expression bei der Negativkontrolle beobachtet.
    Figure DE000069836552T3_0004
    Sequenzprotokoll
    Figure DE000069836552T3_0005
    Figure DE000069836552T3_0006
    Figure DE000069836552T3_0007
    Figure DE000069836552T3_0008
  • Literaturhinweise
    • Blake TK, Ullrich SE, Nilan RA (1982) Mapping of the Hor-3 locus encoding D hordein in barley. Theor Appl Genet 63: 367–371
    • Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248–254
    • Brandt A (1976) Endosperm protein formation during kernel development of wild type and a highlysine barley mutant. Cereal Chem 53: 890–901
    • Brandt A, Montembault A, Cameron-Mills V, Rasmussen SK (1985) Primary structure of a B1 hordein gene from barley. Carlsberg Res Commun 50: 333–345
    • Brandt, A., Montembault, A., Cameron-Mills, V. and Rasmussen, S. K. (1985) Primary structure of a B1 hordein gene from barley. Carlsberg Res. Commun. 50, 333–345.
    • Bright SW, Shewry PR (1983) Improvement of protein quality in cereals. CCC Critical Plant Reviews 1: 49–93
    • Cameron-Mills V (1980) The structure and composition of protein bodies purified from barley endosperm by silica sol density gradients. Carlsberg Res Commun 45: 557–576
    • Cameron-Mills V, Brandt A (1988) A
      Figure DE000069836552T3_0009
      gene. Plant Mol Biol 11: 449–461
    • Cameron-Mills V, Madrid SM J (1988) The signal peptide cleavage site of a B1 hordein determined by radiosequencing of the in vitro synthesized and processed polypeptide. Carlsberg Res Commun 54: 181–192
    • Cameron-Mills V, Wettstein D von (1980) Protein body formation in the developing barley endosperm. Carlsberg Res Commun 45: 577–594
    • Cho M-J, Jiang W, Lemaux PG (1998) Transformation of recalcitrant barley genotypes through improvement of regenerability and decreased albinism. Plant Sci (submitted)
    • Christensen AH, Quail PH (1996) Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5: 213–218
    • Dellaporta S (1993) Plant DNA miniprep and microprep. Freeling M. Walbot V (eds) In: Maize Handbook. p 522–525
    • Entwistle J, Knudsen S, Müller M, Cameron-Mills V (1991) Amber codon suppression: the in vivo and in vitro analysis of two C-hordein genes from barley. Plant Mol Biol 17: 1217–1231
    • Farrell, L. B. and Beachy, R. N. (1990) Manipulation of ☐-glucuronidase for use as a reporter in vacuolar targeting studies. Plant Mol. Biol. 15, 821–825.
    • Fiedler U, Conrad U (1995) High-level production and long-term storage of engineered antibodies in trangenic tobacco seeds. Bio/Technol 13: 1090–1093
    • Forde BG, Heyworth A, Pywell J, Kreis M (1985) Nucleotide sequence of a B1 hordein gene and the identification of possible upstream regulatory elements in endosperm storage protein genes from barley, wheat and maize. Nucl Acids Res 13: 7327–7339
    • Giese H, Anderen B, Doll H (1983) Synthesis of the major storage protein, hordein, in barley. Pulselabeling study of grain filling in liquid-cultured detached spikes. Planta 159: 60–65
    • Higuchi, R. (1990) Recombinant PCR, in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innes, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J., eds.), Academic Press, San Diego, CA, pp. 177–183.
    • Horton, M. R., Cai, Z., Ho, S. N. and Pease L. R. (1990) Gene splicing by overlap extension: tailormade genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques 8, 528–535.
    • Hunter CP (1988) Plant regeneration from microspores of barley, Hordeum vulgare. PhD thesis. Wye College, Univerity of London, Ashford, Kent
    • Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants. The GUS fusion system. Plant Mol Biol Rep 1: 387–405
    • Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6: 3901–3907
    • Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W. (1987) GUS fusions: ☐-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901–3907.
    • Jensen J, J☐rgnesen JH, Jensen HP, Giese H, Doll H (1980) Linkage of the hordein loci Hor1 and Hor2 with the powdery mildew resistance loci Ml-k and Ml-a on barley chromosome 5. Theor Appl Genet 58: 27–31
    • Lefebvre, B., Formstecher, P. and Lefebvre, P. (1995) Improvement of the gene splicing overlap (SOE) method. BioTechniques 19, 186–187.
    • Lemaux PG, Cho M-J, Louwerse J, Williams R, Wan Y (1996) Bombardment-mediated transformation methods for barley. Bio-Rad US/EG Bulletin 2007: 1–6
    • Lemaux, P. G., Cho, M.-J., Louwerse, J., Williams, R. and Wan, Y. (1996) Bombardment-mediated transformation methods for barley. Bio-Rad US/EG Bulletin 2007, 1–6.
    • Marris C, Gallois P, Copley J, Kreis M (1988) The 5' flanking region of a barley B hordein gene controls tissue and developmental specific CAT expression in tobacco plants. Plant Mol Biol 10: 359–366
    • McElroy, D., Chamberlain, D. A., Moon, E. and Wilson, K. J. (1995) Development of gusA reporter gene constructs for cereal transformation: Availability of plant transformation vectors from the CAMBIA Molecular Genetic Resource Service. Mol. Breeding 1, 27–37.
    • Müller M, Knudsen S (1993) The nitrogen response of a barley C-hordein promoter is controlled by positive and negative regulation of the GCN4 and endosperm box. Plant J 4: 343–355
    • Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473–497
    • Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15, 473–497.
    • Pont-Kingdon, G. (1994) Construction of chimeric molecules by a two-step recombinant PCR method. BioTechniques 16, 1010–1011.
    • Rasmussen SK, Brandt A (1986) Nucleotide sequences of cDNA clones for C-hordein polypeptides. Carlsberg Res Commun 51: 371–379
    • Shewry PR (1993) Barley seed protein. In barley: Chemistry and technology. Eds AW MacGregor and RS Bahatty, 131–197. St Paul, MN, Amer Assoc Cereal Chemists, Inc.
    • Shewry PR, Faulks AJ, Pickering RA, Jones IT, Finch RA, Miflin BJ (1980) The genetic analysis of barley storage proteins. Heredity 44: 383–389
    • Shewry PR, Finch RA, Parmer S, Franklin BJ (1983) Chromosomal location of Hor3, new locus governing storage proteins in barley. Heredity 50: 179–189
    • Shewry PR, Parmer S (1987) The HrdF (Hor5) locus encodes ☐-type hordein. Barley Genet Newslett 17: 32–35
    • Sørensen MB, Cameron-Mills V, Brandt A (1989) Transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression in developing barley endosperm. Mol Gen Genet 217: 195–201
    • Sørensen MB, Müller M, Skerritt J, Simpson D (1996) Hordein promoter methylation and transcriptioal activity in wild-type and mutant barley endosperm. Mol Gen Genet 250: 750–760
    • Wan Y. Lemaux PG (1994) Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol 104: 37–48

Claims (12)

  1. Transgene monokotyle Pflanze, umfassend (a) einen für die Samenreifung spezifischen Promotor, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Promotoren der Reisgluteline, Reisoryzine, Reisprolamine, Gerstenhordeine, Weizengliadine, Weizengluteline, Maiszeine, Maisgluteline, Hafergluteline, Sorghumkafirine, Hirsepennisetine und Roggensekaline, (b) eine in funktionsfähiger Weise mit diesem Promotor verknüpfte Signal-DNA-Sequenz, die für eine monokotyle samenspezifische Sequenz kodiert, welche in der Lage ist, ein damit verknüpftes Polypeptid zielgerichtet zu einem Proteinspeicherkörper in monokotylen Samen zu leiten, wobei die Signal-DNA-Sequenz ausgewählt ist aus den Signalsequenzen, die umfasst sind von der Gruppe bestehend aus den Genen für Reisglutelin, Gersten-D-Hordein und Gersten-B1-Hordein, und (c) eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Protein kodiert, das kein Samenspeicherprotein ist, wobei die DNA-Sequenz in funktionsfähiger Weise mit der Signal-DNA-Sequenz verknüpft ist.
  2. Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Signal-DNA-Sequenz eine monokotyle samenspezifische N-terminale Leadersequenz ist.
  3. Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1, wobei die monokotyle Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Reis, Gerste und Weizen.
  4. Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1, wobei die monokotyle Pflanze Reis ist.
  5. Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1, wobei die monokotyle Pflanze Gerste ist.
  6. Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1, wobei die monokotyle Pflanze Weizen ist.
  7. Transgener Samen, der aus der transgenen monokotylen Pflanze nach Anspruch 1 hergestellt ist, umfassend (a) einen für die Samenreifung spezifischen Promotor, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Promotoren der Reisgluteline, Reisoryzine, Reisprolamine, Gerstenhordeine, Weizengliadine, Weizengluteline, Maiszeine, Maisgluteline, Hafergluteline, Sorghumkafirine, Hirsepennisetine und Roggensekaline, (b) eine in funktionsfähiger Weise mit diesem Promotor verknüpfte Signal-DNA-Sequenz, die für eine monokotyle samenspezifische Sequenz kodiert, welche in der Lage ist, ein damit verknüpftes Polypeptid zielgerichtet zu einem Proteinspeicherkörper in monokotylen Samen zu leiten, wobei die Signal-DNA-Sequenz ausgewählt ist aus den Signalsequenzen, die umfasst sind von der Gruppe bestehend aus den Genen für Reisglutelin, Gersten-D-Hordein und Gersten-B1-Hordein, und (c) eine DNA-Sequenz die für ein heterologes Protein kodiert, das kein Samenspeicherprotein ist, wobei die DNA-Sequenz in funktionsfähiger Weise mit der Signal-DNA-Sequenz verknüpft ist.
  8. Transgener monokotyler Samen nach Anspruch 7, wobei in der Signal-DNA-Sequenz eine monokotyle, samenspezifische N-terminale Leadersequenz ist.
  9. Transgener monokotyler Samen nach Anspruch 7, wobei der monokotyle Samen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Reis, Gerste und Weizen.
  10. Transgener monokotyler Samen nach Anspruch 7, wobei der monokotyle Samen Reis ist.
  11. Transgener monokotyler Samen nach Anspruch 7, wobei der monokotyle Samen Weizen ist.
  12. Transgener monokotyler Samen nach Anspruch 7, wobei der monokotyle Samen Gerste ist.
DE69836552.6T 1997-09-30 1998-09-30 Herstellung von proteinen in pflanzensamen Expired - Lifetime DE69836552T3 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6051097P 1997-09-30 1997-09-30
US60510P 1997-09-30
PCT/US1998/020691 WO1999016890A2 (en) 1997-09-30 1998-09-30 Production of proteins in plant seeds
EP98949710.2A EP1019517B2 (de) 1997-09-30 1998-09-30 Herstellung von proteinen in pflanzensamen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE69836552D1 DE69836552D1 (de) 2007-01-11
DE69836552T2 DE69836552T2 (de) 2007-09-13
DE69836552T3 true DE69836552T3 (de) 2014-10-09

Family

ID=22029950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69836552.6T Expired - Lifetime DE69836552T3 (de) 1997-09-30 1998-09-30 Herstellung von proteinen in pflanzensamen

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6642437B1 (de)
EP (1) EP1019517B2 (de)
JP (2) JP2001518305A (de)
AT (1) ATE346944T1 (de)
AU (1) AU746032B2 (de)
CA (1) CA2305628C (de)
DE (1) DE69836552T3 (de)
ES (1) ES2276475T5 (de)
WO (1) WO1999016890A2 (de)

Families Citing this family (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1019517B2 (de) * 1997-09-30 2014-05-21 The Regents of The University of California Herstellung von proteinen in pflanzensamen
US7053282B1 (en) 1998-02-09 2006-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
CA2376383C (en) 1999-06-07 2009-11-17 Basf Plant Science Gmbh .delta.6-acetylenase and .delta.6-desaturase from ceratodon purpureus
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
US6403862B1 (en) * 1999-09-24 2002-06-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from maize
FR2799205B1 (fr) * 1999-09-30 2004-04-16 Meristem Therapeutics Promoteurs synthetiques et chimeriques, cassettes d'expression, plasmides, vecteurs, plantes de semences transgeniques les contenant, et leur methode d'obtention
KR20020073580A (ko) 2000-02-09 2002-09-27 바스프 악티엔게젤샤프트 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법
WO2001059141A2 (en) * 2000-02-10 2001-08-16 Washington State University Research Foundation Methods and compositions that utilize barley as a foodstuff for animals
EP1130104A1 (de) * 2000-02-16 2001-09-05 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Verminderung des Abbaus von rekombinanten Planzenprodukten in der Pflanze
EP1311693B1 (de) 2000-04-07 2006-09-13 BASF Plant Science GmbH Stress-gekoppelter transkriptionsfaktor und dessen verwendung in pflanzen
US7304208B2 (en) * 2000-05-02 2007-12-04 Ventria Bioscience Expression of human serum albumin (HSA) in monocot seeds
US7417178B2 (en) 2000-05-02 2008-08-26 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
JP2002017186A (ja) * 2000-06-30 2002-01-22 Hayashibara Biochem Lab Inc トランスジェニック植物
DK1353941T3 (da) 2001-01-22 2013-06-17 Sangamo Biosciences Inc Modificerede zinkfingerbindingsproteiner
JP2004528022A (ja) * 2001-02-14 2004-09-16 ベントリア バイオサイエンス トランスジェニック植物におけるヒト乳タンパク質の発現
ATE540575T1 (de) 2001-03-16 2012-01-15 Basf Plant Science Gmbh Regulatoren des zucker- und lipidstoffwechsels in pflanzen
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
AU2002305858B2 (en) 2001-06-04 2007-08-23 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants II
US7897845B2 (en) 2001-08-09 2011-03-01 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
AU2002322212B8 (en) 2001-08-09 2008-08-21 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
MXPA04001056A (es) 2001-08-09 2005-02-17 Northwest Plant Breeding Compa Plantas de trigo que tienen resistencia incrementada a los herbicidas de imidazolinona.
US7135618B2 (en) 2001-08-10 2006-11-14 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants III
US7456335B2 (en) 2001-09-03 2008-11-25 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants
EP1423508B1 (de) 2001-09-05 2012-01-18 BASF Plant Science GmbH Mit stress verbundene proteinphosphatase-polypeptide und verfahren zur verwendung in pflanzen
CA2465951A1 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Basf Plant Science Gmbh Transcription factor stress-related polypeptides and methods of use in plants
US8558058B2 (en) 2001-12-06 2013-10-15 Applied Biotechnology Institute Monocotyledonous seed expressing exo-1,4B-glucanase
AU2002346656A1 (en) * 2001-12-06 2003-06-23 Prodigene, Inc. Methods for the cost-effective saccharification of lignocellulosic biomass
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
ITRM20020115A1 (it) * 2002-03-01 2003-09-01 Plantechno S R L Espressione di enzimi lisosomiali in seme.
US7393998B2 (en) * 2002-03-08 2008-07-01 Prodigene, Inc. Commercial production of insulin and insulin-like proteins in plants
DE10212892A1 (de) 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression
US7579517B2 (en) 2002-05-08 2009-08-25 Basf Plant Science Gmbh Methods for increasing oil content in plants
ES2224792B1 (es) * 2002-06-28 2007-02-16 Era Plantech, S.L. Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas.
WO2004016073A2 (en) 2002-07-10 2004-02-26 The Department Of Agriculture, Western Australia Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
ATE405658T1 (de) 2002-07-26 2008-09-15 Basf Plant Science Gmbh Neue selektionsverfahren
WO2004013304A2 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants iv
EP1529112A2 (de) 2002-08-07 2005-05-11 BASF Plant Science GmbH Mit einer abiotischen stressreaktion assoziierte proteine codierende nukleinsäuresequenzen
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
US20060117401A1 (en) 2002-12-20 2006-06-01 Oliver Schmitz Method for producing aminoacids
AU2004213800A1 (en) 2003-02-17 2004-09-02 Metanomics Gmbh Preparation of organisms with faster growth and/or higher yield
ATE517984T1 (de) 2003-02-27 2011-08-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
WO2004087902A2 (de) 2003-03-31 2004-10-14 University Of Bristol Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte fettsäuren
EP2184362A3 (de) 2003-04-15 2010-10-06 BASF Plant Science GmbH Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine in Zusammenhang mit abiotischer Stressreaktion kodieren, sowie Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Umweltstressverträglichkeit
RS20050889A (en) 2003-05-28 2008-04-04 Basf Aktiengesellschaft, Wheat plants having increased tolerance to imidaz olinone herbicides
BRPI0411479A (pt) * 2003-06-17 2006-07-25 Sembiosys Genetics Inc métodos para a produção de insulina em plantas
CN1852985A (zh) 2003-08-01 2006-10-25 巴斯福植物科学有限公司 产生精细化学品的方法
JP5031366B2 (ja) 2003-08-01 2012-09-19 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー トランスジェニック生物における多不飽和脂肪酸の製造方法
UA102522C2 (ru) 2003-08-11 2013-07-25 Квеек-Эн Рисерчбедрейф Агрико Б.В. Стойкое к грибкам трансгенное растение solanaceae
EP2085477A1 (de) 2003-08-13 2009-08-05 Japan Tobacco, Inc. Verfahren zur Erhöhung der Transformationseffizienz einer Anlage durch Hinzufügen eines Kupferions
ES2379553T3 (es) 2003-08-29 2012-04-27 Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria Plantas de arroz que tienen tolerancia aumentada a herbicidas de imidazolinona
JP4019147B2 (ja) * 2003-10-31 2007-12-12 独立行政法人農業生物資源研究所 種子特異的プロモーターおよびその利用
EP1691822A4 (de) * 2003-12-09 2008-01-02 Ventria Bioscience Hochexpression von fusionspolypeptiden in pflanzensamen mit samenaufbewahrungsproteinen als fusionsträger
EP1711048A4 (de) * 2003-12-23 2008-05-14 Ventria Bioscience Verfahren zum exprimieren von heterologem protein in pflanzensamen mit hilfe von promotern aus monokotylen pflanzen, bei denen es sich nicht um samenspeicherproteinpromoter handelt
CA2548944C (en) 2003-12-23 2013-04-30 Basf Plant Science Gmbh Transgenic plants expressing a putative palmitoyl protein thioesterase
JP4567047B2 (ja) 2004-02-27 2010-10-20 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法
CA2558726C (en) 2004-02-27 2017-11-07 Basf Plant Science Gmbh Method for producing unsaturated .omega.-3-fatty acids in transgenic organisms
WO2005103253A1 (en) 2004-04-22 2005-11-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
EP2404499A3 (de) 2004-06-16 2012-05-02 BASF Plant Science GmbH Nukleinsäuremoleküle zur Kodierung Wrinkled1-artiger Polypetide und Verfahren für deren Verwendung in Pflanzen
AU2005321630A1 (en) 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
CN104178511A (zh) 2004-07-31 2014-12-03 梅坦诺米克斯有限公司 制备具有更快生长和/或更高产量的生物
WO2006030492A1 (ja) * 2004-09-14 2006-03-23 Nippon Paper Industries Co.,Ltd. Ｇｌｐ−１誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法
US8362319B2 (en) 2004-09-20 2013-01-29 Basf Plant Science Gmbh Arabidopsis genes encoding proteins involved in sugar and lipid metabolism and methods of use
BRPI0515902A (pt) 2004-09-24 2008-08-12 Basf Plant Science Gmbh célula de planta, planta, semente, molécula de ácido nucleico isolada, construto de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, proteìna relacionada à tensão isolada, métodos de produção de uma planta transgênica e de modificação de toleráncia à tensão de uma planta, e, usos de um ácido nucleico que codifica srp e de toleráncia e/ou resistência aumentada à tensão ambiental e/ou ácido nucleico
AU2005286427B2 (en) 2004-09-24 2011-09-15 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
CN101065491B (zh) 2004-09-29 2012-01-11 胶原植物有限公司 生产胶原的植物及其生成和使用方法
US8455717B2 (en) 2004-09-29 2013-06-04 Collplant Ltd. Collagen producing plants and methods of generating and using same
GB0426160D0 (en) * 2004-11-29 2004-12-29 Era Plantech S L Production of proteins
GB0426161D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Era Plantech S L Protein isolation and purification
CA2585798A1 (en) 2004-12-17 2006-06-17 Metanomics Gmbh Process for the control of production of fine chemicals
US20140199313A1 (en) 2005-03-02 2014-07-17 Metanomics Gmbh Process for the Production of Fine Chemicals
EP1871883A1 (de) 2005-03-02 2008-01-02 Metanomics GmbH Verfahren zur produktion von feinchemikalien
WO2006094976A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Basf Plant Science Gmbh Expression enhancing intron sequences
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
CA2606220A1 (en) 2005-04-19 2006-12-21 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
CN101321872B (zh) 2005-05-23 2012-09-05 阿凯迪亚生物科学公司 高γ-亚麻酸红花
EP1896575B1 (de) 2005-06-17 2012-07-18 BASF Plant Science GmbH Mit Stress verbundene, Lecitin-ähnliche Proteinkinase-Polypeptide und Verfahren zur Verwendung in Pflanzen
ATE495265T1 (de) 2005-06-23 2011-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verbesserte verfahren zur herstellung stabil transformierter und fruchtbarer buntmais-pflanzen
EP1902135A1 (de) 2005-07-06 2008-03-26 CropDesign N.V. Pflanzenertragsverbesserung durch ste20-ähnliche genexpression
ES2437577T3 (es) 2005-07-18 2014-01-13 Basf Plant Science Gmbh Aumento del rendimiento en plantas que sobreexpresan los genes de ACCDP
CA2615943A1 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Basf Plant Science Gmbh Yield increase in plants overexpressing the shsrp genes
NZ565631A (en) 2005-08-03 2011-01-28 Adelaide Res & Innovation Pty Polysaccharide synthases
WO2007020198A2 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
EP2573179A1 (de) 2005-09-15 2013-03-27 CropDesign N.V. Erhöhung der Pflanzenausbeute durch Gruppe 3 lea Genexpression
CA2620387C (en) 2005-09-20 2018-09-18 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-sirna
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
US8362323B2 (en) 2005-11-08 2013-01-29 Basf Plant Science Gmbh Use of armadillo repeat (ARM1) polynucleotides for obtaining pathogen resistance in plants
AU2006315096B2 (en) 2005-11-18 2013-03-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Feedstuffs for Aquaculture comprising stearidonic acid
US7723574B2 (en) 2005-11-24 2010-05-25 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of Δ5-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
CA2632405A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid molecules encoding polypeptides involved in regulation of sugar and lipid metabolism and methods of use viii
WO2007081487A2 (en) * 2005-12-15 2007-07-19 Ventria Bioscience Production of human defensins in plant cells
AU2007204341B2 (en) 2006-01-12 2012-10-04 Basf Plant Science Gmbh Use of stomatin (STM1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
US8163880B2 (en) * 2006-02-23 2012-04-24 Era Biotech S.A. Production of biologically active proteins
EP2343375A3 (de) 2006-03-24 2012-02-08 BASF Plant Science GmbH Mit der abiotischen Stressreaktion assoziierte Proteine und Homologe
MX2008010669A (es) 2006-03-31 2008-09-03 Basf Plant Science Gmbh Plantas con caracteristicas mejoradas y un metodo para prepararlas.
WO2008034648A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
US20090241218A1 (en) 2006-05-30 2009-09-24 Cropdesign N.V. Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
US20090300794A1 (en) 2006-05-31 2009-12-03 Metanomics Gmbh Manipulation Of The Nitrogen Metabolism
CN1884517B (zh) * 2006-06-08 2010-06-30 武汉禾元生物科技有限公司 利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用
US8273952B2 (en) 2006-06-08 2012-09-25 Basf Plant Science Gmbh Plants having improved growth characteristics and method for making the same
EP2189533A1 (de) 2006-08-02 2010-05-26 CropDesign N.V. Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften bezüglich des Ertrags und Verfahren zu ihrer Herstellung
WO2008022963A2 (en) 2006-08-24 2008-02-28 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
US8222486B2 (en) 2006-08-30 2012-07-17 Basf Plant Science Gmbh Method for increasing resistance to pathogens in transgenic plants
FR2906818B1 (fr) * 2006-10-04 2012-04-27 Plant Advanced Technologies Pat Sas Procede de production de proteines recombinantes a l'aide de plantes carnivores
AU2007304229B2 (en) 2006-10-06 2013-09-19 Basf Plant Science Gmbh Processes for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP2078087A1 (de) 2006-10-12 2009-07-15 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen
EP2455472A3 (de) 2006-10-13 2012-08-29 BASF Plant Science GmbH Pflanzen mit erhöhtem Ertrag
WO2008087141A2 (en) 2007-01-15 2008-07-24 Basf Plant Science Gmbh Use of subtilisin (rnr9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
NZ610301A (en) 2007-01-30 2015-03-27 Bp Corp North America Inc Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2674499A1 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Basf Plant Science Gmbh Use of alanine racemase genes to confer nematode resistance to plants
MX2009007608A (es) 2007-02-06 2009-07-27 Basf Plant Science Gmbh Composiciones y metodos que utilizan arn de interferencia para el control de nematodos.
WO2008095970A1 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using rna interference of cdpk-like for control of nematodes
CN101631868B (zh) 2007-02-16 2016-02-10 巴斯福植物科学有限公司 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列
CA2679571A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Basf Plant Science Gmbh Use of nematode chitinase genes to control plant parasitic nematodes
EP2163636A1 (de) 2007-03-23 2010-03-17 BASF Plant Science GmbH Transgene Pflanzen mit verbesserter Stresstoleranz und höherem Ertrag
CN101657540A (zh) * 2007-04-13 2010-02-24 巴斯福植物科学有限公司 调节作物中高水平组织优选表达的多核苷酸
WO2008135467A2 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Basf Plant Science Gmbh Enhancement of seed oil / amino acid content by combinations of pyruvate kinase subunits
US20100251416A1 (en) 2007-05-22 2010-09-30 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production
CA2687635A1 (en) 2007-05-22 2008-11-27 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-ko
CA2687320A1 (en) 2007-05-29 2008-12-04 Basf Plant Science Gmbh Transgenic plants with increased stress tolerance and yield
WO2009010460A2 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Basf Plant Science Gmbh Transgenic plants with increased stress tolerance and yield
AR067795A1 (es) 2007-08-02 2009-10-21 Basf Plant Science Gmbh Plantas transgenicas con mayor tolerancia al estres y mayor rendimiento
US7847160B2 (en) * 2007-08-15 2010-12-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters
AU2008300579B2 (en) 2007-09-18 2014-11-13 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield
EP2594646A3 (de) 2007-09-21 2013-11-06 BASF Plant Science GmbH Pflanze mit erhöhtem Ertrag
US7964770B2 (en) * 2007-09-28 2011-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from Sorghum kafirin gene
CN101889089B (zh) 2007-11-27 2013-10-23 巴斯夫植物科学有限公司 具有增加的胁迫耐受性和产率的转基因植物
EP2222856A2 (de) 2007-12-14 2010-09-01 BASF Plant Science GmbH Promotoren aus brassica napus zur samenspezifischen genexpression
WO2009077545A2 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Basf Plant Science Gmbh Lipid metabolism protein and uses thereof i (bzip transcription factor)
EP2235184A2 (de) 2007-12-17 2010-10-06 BASF Plant Science GmbH Lipidstoffwechselproteine, zusammensetzungen von lipidstoffwechselproteinen und verwendungen davon
EP2222857A2 (de) 2007-12-19 2010-09-01 BASF Plant Science GmbH Pflanzen mit erhöhtem ertrag und/oder erhöhter toleranz gegenüber umweltstress (iy-bm)
CA2708499A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (ko nue)
DE112009000313T5 (de) 2008-02-27 2011-04-28 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit erhöhtem Ertrag
JP5158639B2 (ja) 2008-04-11 2013-03-06 独立行政法人農業生物資源研究所 植物の内胚乳に特異的に発現する遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用
US20110126325A1 (en) 2008-04-25 2011-05-26 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
CA2726489A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Basf Plant Science Gmbh Fatiy acid dehydratases and uses thereof
WO2010000708A2 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
US8637316B2 (en) * 2008-07-16 2014-01-28 Sumitomo Chemical Company, Limited Glycinin signal sequence for producing secreted proteins in plants
EP2352822A2 (de) 2008-08-19 2011-08-10 BASF Plant Science GmbH Pflanzen mit erhöhtem ertrag mittels steigerung oder erzeugung von einer oder mehreren aktivitäten in der pflanze oder einem teil dieser
WO2010023202A2 (en) 2008-08-26 2010-03-04 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
EP2328916A1 (de) 2008-08-27 2011-06-08 BASF Plant Science GmbH Nematodenresistente transgene pflanzen
AU2009295982A1 (en) 2008-09-23 2010-04-01 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (LT)
JP5667062B2 (ja) 2008-10-10 2015-02-12 エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマＥｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓ．Ａ． 免疫原特異的アジュバントとしての組換えタンパク粒
DE112009002577T5 (de) 2008-10-23 2012-06-21 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit erhöhtem Ertrag (NUE)
MX2011004269A (es) 2008-10-23 2011-05-30 Basf Plant Science Gmbh Un metodo para producir una celula transgenica con mayor contenido de acido gamma aminobutirico (gaba).
NO2358882T3 (de) 2008-11-18 2017-12-23
ES2653727T3 (es) 2008-12-12 2018-02-08 Basf Plant Science Gmbh Desaturasas y proceso para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos
EP2430166A1 (de) 2009-05-13 2012-03-21 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferasen und verwendungen davon bei der fettsäureherstellung
WO2010142522A2 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongation components and uses thereof
US8956834B2 (en) 2009-06-29 2015-02-17 Synthetic Genomics, Inc. Acyl-ACP thioesterase genes and uses therefor
CA2768082C (en) 2009-07-17 2020-07-21 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and uses thereof
WO2011009801A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Basf Plant Science Company Gmbh Plants with increased yield
WO2011017315A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Recombinetics, Inc. Methods and compositions for targeted gene modification
US20120151629A1 (en) 2009-08-25 2012-06-14 Basf Plant Science Company Gmbh Nematode-Resistant Transgenic Plants
EP3418387B1 (de) 2009-08-31 2020-11-25 Basf Plant Science Company GmbH Regulatorische nukleinsäuremoleküle zur verstärkung samenspezifischer genexpression in pflanzen, welche die verstärkte synthese mehrfach ungesättigter fettsäuren unterstützen
US8709742B2 (en) 2009-10-22 2014-04-29 Applied Biotechnology Institute, Inc. Methods of saccharification of polysaccharides in plants
US8709761B2 (en) 2009-10-22 2014-04-29 Applied Biotechnology Institute, Inc. Methods of saccharification of polysaccharides in plants
CN102770543A (zh) 2009-11-17 2012-11-07 巴斯夫植物科学有限公司 具有增加的产量的植物
US9347049B2 (en) 2009-11-24 2016-05-24 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid elongase and uses thereof
EP2504427B1 (de) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Neuartige fettsäuredesaturase und ihre verwendung
US8927812B2 (en) 2009-12-09 2015-01-06 Basf Plant Science Company Gmbh Methods for increasing the resistance of plants to fungi by silencing the fungal SMT1-gene
US20110165561A1 (en) * 2009-12-31 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Direct and continuous root alone or root/shoot production from transgenic events derived from green regenerative tissues and its applications
BR112012019609A2 (pt) 2010-02-23 2019-09-24 Basf Plant Science Gmbh vetor de expressão isolado , plantas,transgenicas metodo para produzir uma planta transgenica e metodo para conferir a resistencia a nematoides em uma planta
US8993844B1 (en) 2010-05-27 2015-03-31 University Of Wyoming Production of spider silk protein in corn
EP2418284A1 (de) 2010-08-13 2012-02-15 ERA Biotech, S.A. Polypeptidsequenzen zur Induzierung von Proteinkörpern
US9388437B2 (en) 2010-06-25 2016-07-12 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
EP2585589B1 (de) 2010-06-28 2017-06-21 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Verfahren zur herstellung von lipiden
EP2630235B1 (de) 2010-10-21 2017-04-05 BASF Plant Science Company GmbH Neuartige fettsäuredesaturasen und -elongasen, verlängerungsbestandteile und ihre verwendung
EP2655627A1 (de) 2010-12-20 2013-10-30 BASF Plant Science Company GmbH Nematodenresistente transgene pflanzen
EP2927323A3 (de) 2011-04-11 2015-12-09 Targeted Growth, Inc. Identifikation und verwendung von krp-mutanten in pflanzen
US10308948B2 (en) 2011-07-27 2019-06-04 Applied Biotechnology Institute, Inc. Method of increasing expression of nucleic acid molecules in plants using multiple transcription units
WO2013024121A2 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Basf Plant Science Company Gmbh Increase of sucrose transporter activity in the seeds of plants
CN104271743B (zh) 2011-12-27 2019-11-05 联邦科学技术研究组织 产生脂质的方法
EP2798063B1 (de) 2011-12-27 2022-03-30 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Herstellung von dihydrosterculinsäure und derivaten davon
AU2012324003B2 (en) 2011-12-27 2016-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and supressing gene silencing in the same cell
EP2612918A1 (de) 2012-01-06 2013-07-10 BASF Plant Science Company GmbH In planta-Rekombination
PL2861059T3 (pl) 2012-06-15 2017-10-31 Commw Scient Ind Res Org Wytwarzanie długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w komórkach roślinnych
KR101339703B1 (ko) 2012-07-23 2013-12-11 전북대학교산학협력단 식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (ｐｅｄｖ) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 ｐｅｄｖ 백신
EP2880050B1 (de) 2012-08-03 2018-07-04 BASF Plant Science Company GmbH Neuartige enzyme, enzymbestandteile und verwendungen davon
US10462994B2 (en) 2013-01-29 2019-11-05 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing HCP7
US10435705B2 (en) 2013-01-29 2019-10-08 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing HCP6
US10231397B2 (en) 2013-01-29 2019-03-19 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing EIN2
WO2014135682A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing mybtf
WO2015004174A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Basf Se Rnai for the control of phytopathogenic fungi and oomycetes by inhibiting the expression of cyp51 genes
JP2017500862A (ja) 2013-12-17 2017-01-12 ビーエーエスエフ プラント サイエンス カンパニー ゲーエムベーハー デサチュラーゼの基質特異性を変換するための方法
NZ721036A (en) 2013-12-18 2023-07-28 Grains Res & Dev Corp Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
SG11201610596PA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
RU2743384C2 (ru) 2014-07-07 2021-02-17 Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн Способы получения промышленных продуктов из растительных липидов
AU2015344977B2 (en) 2014-11-14 2021-12-23 Basf Plant Science Company Gmbh Stabilising fatty acid compositions
US20160208274A1 (en) * 2015-01-21 2016-07-21 Northeastern State University Blood clot-dissolving proteins produced in seeds
US11248234B2 (en) 2015-02-11 2022-02-15 Basf Se Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases
MX2018002013A (es) * 2015-08-25 2018-06-19 Unilever Nv Articulo concentrado sazonado conformado.
ES2842501T5 (es) 2015-09-21 2023-04-13 Modern Meadow Inc Materiales compuestos de tejido reforzados con fibras
KR20180109859A (ko) 2015-11-18 2018-10-08 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 두꺼워진 호분을 갖는 벼 낟알
KR20170096093A (ko) 2016-02-15 2017-08-23 브렌던 패트릭 퍼셀 복합체 생제작된 물질
CA3008850A1 (en) 2017-06-29 2018-12-29 Modern Meadow, Inc. Yeast strains and methods for producing collagen
EP3684788A1 (de) * 2017-09-20 2020-07-29 Aarhus Universitet Nepenthesin-1 abgeleitete resistenz gegen pilzpathogene bei grösseren kulturpflanzen
AU2018253595A1 (en) 2017-11-13 2019-05-30 Modern Meadow, Inc. Biofabricated leather articles having zonal properties
CA3089883A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
EP3704202A4 (de) 2019-01-17 2020-12-16 Modern Meadow, Inc. Geschichtete kollagenmaterialien und verfahren zu ihrer herstellung
AU2020223182A1 (en) 2019-02-14 2021-09-09 Basf Plant Science Company Gmbh Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
CA3191387A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4699644A (en) 1985-12-23 1987-10-13 Brandt Alan E Plant nutrient composition
GB8611818D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Shell Int Research Plant generation method
US5403736A (en) 1987-03-06 1995-04-04 Mitsui Petrochemical Industries, Ltd. Method of inducing formation of adventitious bud
JPS6427466A (en) 1987-04-24 1989-01-30 Matsushita Electric Works Ltd Method for cultivating tissue
US5350688A (en) 1988-03-31 1994-09-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for regeneration of rice plants
US5270200A (en) * 1988-04-12 1993-12-14 The Plant Cell Research Institute Arcelin seed storage proteins from phaseolus vulgaris
WO1989012102A1 (en) 1988-06-01 1989-12-14 The Texas A&M University System Method for transforming plants via the shoot apex
JPH04500153A (ja) * 1988-07-29 1992-01-16 ザ・ワシントン・ユニバーシティ 遺伝的に形質転換された内乳組織を有する商品価値のあるポリペプチドの産生
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
AU7583691A (en) * 1990-03-05 1991-10-10 Upjohn Company, The Protein expression via seed specific regulatory sequences
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
ES2147551T3 (es) 1990-11-23 2000-09-16 Aventis Cropscience Nv Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
DK0539563T3 (da) 1991-05-15 2001-11-12 Monsanto Technology Llc Fremgangsmåde til skabelse af en transformeret risplante
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5565355A (en) 1991-12-19 1996-10-15 New Zealand Forest Research Institute Limited Growth medium
US5773691A (en) * 1992-03-19 1998-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
US5281529A (en) 1992-11-16 1994-01-25 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for in vitro sexual reproduction of corn plants
US5320961A (en) 1992-11-16 1994-06-14 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for asexual in vitro propagation of fertile corn plants
DE69431748D1 (de) * 1993-03-02 2003-01-02 Du Pont Erhöhung des methionin-gehaltes in pflanzensamen durch expression von 10kd zein aus mais
WO1994019930A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 National Research Council Of Canada Enhanced regeneration system for cereals
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
EP0734445B1 (de) 1993-11-30 2006-07-05 E.I. Du Pont De Nemours And Company Chimaere gene und verfahren zur steigerung des lysin-gehalts der samen von mais, soja und raps pflanzen
JPH07213183A (ja) 1994-02-04 1995-08-15 Sapporo Breweries Ltd オオムギ植物体の再生方法
JPH07255304A (ja) 1994-03-17 1995-10-09 New Oji Paper Co Ltd アカシア属植物の大量増殖法
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
AU697373B2 (en) 1994-07-29 1998-10-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transgenic cereal plants
US5650558A (en) * 1996-01-16 1997-07-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Glutenin genes and their uses
CA2246242A1 (en) * 1996-02-08 1997-08-14 Institut Fur Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung Cassettes for the expression of storable proteins in plants
US5850016A (en) * 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US5773269A (en) 1996-07-26 1998-06-30 Regents Of The University Of Minnesota Fertile transgenic oat plants
US6066781A (en) 1997-02-13 2000-05-23 Applied Phytologics, Inc. Production of mature proteins in plants
US6235529B1 (en) * 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
EP1019517B2 (de) * 1997-09-30 2014-05-21 The Regents of The University of California Herstellung von proteinen in pflanzensamen

Also Published As

Publication number Publication date
ATE346944T1 (de) 2006-12-15
DE69836552D1 (de) 2007-01-11
US7157629B2 (en) 2007-01-02
WO1999016890A2 (en) 1999-04-08
AU9598098A (en) 1999-04-23
ES2276475T3 (es) 2007-06-16
CA2305628A1 (en) 1999-04-08
DE69836552T2 (de) 2007-09-13
WO1999016890A3 (en) 1999-05-20
US20040088754A1 (en) 2004-05-06
JP2010252820A (ja) 2010-11-11
AU746032B2 (en) 2002-04-11
JP2001518305A (ja) 2001-10-16
CA2305628C (en) 2008-08-26
EP1019517A2 (de) 2000-07-19
EP1019517B2 (de) 2014-05-21
EP1019517B1 (de) 2006-11-29
US6642437B1 (en) 2003-11-04
ES2276475T5 (es) 2014-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69836552T3 (de) Herstellung von proteinen in pflanzensamen
DE69735580T2 (de) An aminosaeure angereicherte speicherproteine, insbesondere an lysin angereicherte mais-gamma-zeine, und diese exprimierende pflanzen
DE60113936T2 (de) Verwendung von hydroxylphenyl pyruvate dioxygenase ( HPPD )
JP2002533057A (ja) 植物において導入遺伝子を発現するための方法および組成物
EP0808370A1 (de) Stresstolerante pflanzen und verfahren zu deren herstellung
DE60024607T2 (de) Pflanzentransformationsverfahren
DE60024500T2 (de) Transformationsverfahren und dadurch hergestellte transgene pflanzen
DE60018416T2 (de) Verwendung des transkriptionsaktivators bnm3 zur kontrolle pflanzlicher embryogenese und regenerationsprozesse
DE60215938T2 (de) Verfahren zur herstellung einer monokotylen pflanze, welche ein gewünschtes gen ohne fremdsequenzen enthält
EP1409697B1 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von nukleinsäuren
EP1445321B1 (de) Embryo-spezifischer Promoter aus Mais und dessen Verwendung
EP1711612B1 (de) Expressionskassetten zur bidirektionalen transgenen expression von nukleinsäuren in pflanzen
WO2002012474A2 (de) Verfahren zur selektion auf wirtszellen mit eliminierten dna-sequenzen
EP1664307B1 (de) Neuer endospermspezifischer pflanzenpromotor für kulturpflanzen
WO2003008596A2 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von selektionsmarkern
DE60029461T2 (de) Synthetische und chimere promotoren, expressionskassetten, plasmide, vektore, transgene pflanzen und diese enthaltende samen, sowie verfahren zu ihrer herstellung
DE60018754T2 (de) Verfahren zur herstellung von isotransgenen zellinien
DE10133407A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
KR102081963B1 (ko) 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도
US6849779B1 (en) Method for producing high methionine corn seeds
uidAnos Bhorss 1mm lPciu lrcai
Vinchurkar et al. Study of factors influencing agrobacterium mediated genetic transformation in Vigna unguiculata
Sparks et al. Wheat biotechnology: recent developments and future trends.
Buising Direct introduction of DNA into embryonic axes of Glycine max by microprojectile bombardment
Castillo et al. Transgenic Cereals: Secale cereale and Sorghum bicolor (rye and sorghum)

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent