DE69838552T2

DE69838552T2 - Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine

Info

Publication number: DE69838552T2
Application number: DE69838552T
Authority: DE
Inventors: George N. Louisville COX
Original assignee: Bolder Biotechnology Inc
Current assignee: Bolder Biotechnology Inc
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-13
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2018-07-14
Also published as: US20040265269A1; US20040230040A1; US7795396B2; JP2001510033A; JP2009096810A; US20050214254A1; US7959909B2; BR9812267B1; US7732572B2; US20030162949A1; IL133974A; US20080317713A1; CA2296770A1; DE69838552D1; HK1116497A1; WO1999003887A1; US20040175800A1; US20140163204A1; US20170369547A1; US20110250169A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf gentechnisch veränderte therapeutische Proteine. Genauer umfassen die veränderten Proteine Wachstumshormon und verwandte Proteine.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die folgenden Proteine werden durch Gene aus der Wachstumshormon(Growth Hormone = GH)-Supergenfamilie kodiert (Bazan (1990); Mott und Campell (1995); Silvennoinen und Ihle (1996)): Wachstumshormon, Prolaktin, plazentales Laktogen, Erythropoietin (EPO), Thrombopoietin (TPO), Interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35-Untereinheit), IL-13, IL-15, Onkostatin M, neurotropher Ciliarfaktor, Leukämieinhibitorischer Faktor, Alphainterferon, Betainterferon, Gammainterferon, Omegainterferon, Tauinterferon, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granuloyzytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) und Kardiotrophin-1 (CT-1) ("die GH-Supergenfamilie"). Es wird erwartet, dass zusätzliche Mitglieder dieser Genfamilie durch Genklonen und -sequenzieren in der Zukunft identifiziert werden werden. Mitglieder der GH-Supergenfamilie haben ähnliche sekundäre und tertiäre Strukturen, abgesehen von der Tatsachse, dass sie allgemein eine begrenzte Aminosäuren- oder DNS-Sequenzidentität aufweisen. Die gemeinsamen strukturellen Merkmale erlauben es, neue Mitglieder dieser Genfamilie schnell zu identifizieren.
Es besteht erhebliches Interesse auf Seiten der Patienten und Gesundheitsversorger an der Entwicklung von lang wirkenden "benutzerfreundlichen" Proteintherapeutika. Proteine sind kostspielig in der Herstellung und anders als konventionelle Kleinmolekülarzneimittel werden sie durch den Körper nicht schnell absorbiert. Darüber hinaus werden sie digeriert, wenn sie oral aufgenommen werden. Deshalb müssen natürliche Proteine durch Injektion verabreicht werden. Nach der Injektion werden die meisten Proteine schnell vom Körper ausgeschieden, was häufige, oft tägliche Injektionen erforderlich macht. Patienten mögen Injektionen nicht, was zu einer reduzierten Akzeptanz und reduzierter Arzneimittelwirksamkeit führt. Einige Proteine, wie beispielsweise Erythropoietin (EPO), sind wirksam, wenn sie weniger häufig (dreimal pro Woche im Falle von EPO) verabreicht werden, weil sie glykosyliert sind. Glykosylierte Proteine werden jedoch unter Verwendung von kostspieligen Säugetierzellenexpressionssystemen hergestellt.
Die Zeitdauer, für die ein injiziertes Protein im Körper verbleibt, ist endlich und wird z. B. durch die Größe des Proteins und dadurch bestimmt, ob das Protein kovalente Modifikationen, so wie Glykosylierung, enthält oder nicht. Kreislaufkonzentrationen von injizierten Proteinen ändern sich ständig, oft über mehrere Größenordnungen binnen eines Zeitraums von 24 Stunden. Sich schnell ändernde Konzentrationen von Proteinagonisten haben dramatische nachgeordnete Konsequenzen, wobei Targetzellen zeitweise unterstimuliert und zu anderen Zeiten überstimuliert werden. Ähnliche Probleme beeinträchtigen Proteinantagonisten. Die Fluktuationen können zu reduzierter Effizienz und erhöhter Häufigkeit des Auftretens von nachteiligen Nebenwirkungen bei Proteintherapeutika führen. Die schnelle Ausscheidung von rekombinanten Proteinen aus dem Körper erhöht signifikant die Menge an Protein, die pro Patient erforderlich ist, und erhöht dramatisch die Behandlungskosten. Es wird erwartet, dass die Kosten von humanen Proteinpharmazeutika in den nächsten Jahren dramatisch steigen werden, da neue und existierende Arzneimittel für mehr Krankheitsindikationen zugelassen werden.
Deshalb besteht ein Bedürfnis, Proteinaustragstechnologien zu entwickeln, die die Kosten von Proteintherapeutika für Patienten und Gesundheitsversorger senken. Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für dieses Problem bereit, indem Verfahren zum Verlängern der Kreislaufhalbwertszeiten von Proteintherapeutika im Körper bereitgestellt werden, so dass die Proteine nicht häufig injiziert werden müssen. Diese Lösung befriedigt auch die Bedürfnisse und Wünsche von Patienten nach Proteintherapeutika, die "benutzerfreundliche" sind, d. h. Proteintherapeutika, die keine häufigen Injektionen erfordern. Die vorliegende Erfindung löst diese und andere Probleme, indem biologisch aktive Varianten von Mitgliedern der Wachstumshormonsupergenfamilie bereitgestellt werden, denen Cystein hinzugefügt ist. Die Erfindung stellt auch die chemische Modifikation dieser Varianten mit Cystein-reaktiven Polymeren oder anderen Typen von Cystein-reaktiven Gruppen bereit, um Derivate davon herzustellen, und die so hergestellten Moleküle.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der erste Aspekt der Erfindung stellt Wachstumshormonscysteinvarianten (SEQ ID NO: 1) bereit, die die Fähigkeit haben, in vitro-Vermehrung einer Zelllinie zu verursachen, welche sich als Antwort auf Wachstumshormon vermehrt. Die Varianten weisen die vier nativen Cysteine, C 53, C 165, C 182 und C 189 auf, und weisen auch einen Cysteinrest auf, der für eine Aminosäure substituiert ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: einer Aminosäure, die an dem N-terminalen Ende der A-B-Schleife angeordnet ist, welche den Aminosäuren 34 bis 52 von SEQ ID NO: 1 entspricht, einer Aminosäure, die in der B-C-Schleife angeordnet ist, einer Aminosäure, die in der C-D-Schleife angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den drei ersten oder drei letzten Aminosäuren in Helix A angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den drei ersten oder drei letzten Aminosäuren in Helix B angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den drei ersten oder drei letzten Aminosäuren in Helix C angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den drei ersten oder drei letzten Aminosäuren in Helix D angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den Helix A vorangehenden Aminosäuren angeordnet ist und einer Aminosäure, die in den Helix D folgenden Aminosäuren angeordnet ist.
Vorzugsweise weist die Cysteinvariante einen Cysteinrest auf, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: F1, T3, P5, E33, A34, K38, E39, Q40, S43, Q46, N47, P48, Q49, T50, S51, A98, N99, S100, G104, A105, S106, E129, D130, G131, S132, P133, T135, G136, Q137, K140, Q141, T142, S144, K145, D147, T148, N149, S150, H151, N152, D153, S184, E186, G187, S188 und G190.
Die Cysteinvariante kann eine solche sein, bei der das substituierte Cystein mit einer Cysteinreaktiven Gruppe modifiziert ist. Die Cysteinvariante kann mit Polyethylenglykol (PEG) modifiziert sein, so wie durch Modifizieren des substituierten Cysteinrests mit PEG.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt eine Cysteinvariante des ersten Aspekts der Erfindung zur Verwendung in der Medizin bereit.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung einer Cysteinvariante des ersten Aspekts der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Stimulierung des Knochen-, Knorpel- oder Muskelstoffwechsels, für die Stimulierung des körperlichen Wachstums während der Kindheit, zum Behandeln von Kleinwuchs resultierend aus Wachstumshormonmangel und zum Behandeln von Niereninsuffizienz in der Kindheit oder zum Behandeln von Kachexie bei Aids-Patienten oder von mit anderen Erkrankungen verbundener Kachexie bereit.
Dementsprechend offenbart die vorliegende Erfindung Cysteinvarianten von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie. Die Varianten weisen einen Cysteinrest auf, der für eine nicht-essentielle Aminosäure des Proteins substituiert ist. Vorzugsweisen weisen die Varianten einen Cysteinrest auf, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus den Aminosäuren in den Schleifenregionen, den Enden der Alphahelices, proximal der ersten amphipathischen Helix und distal der finalen amphipathischen Helix ausgewählt sind, oder wobei der Cysteinrest an dem N-Terminus oder dem C-Terminus des Proteins hinzugefügt ist. Bevorzugte Plätze für die Substitution sind die N- und O-gebundenen Glykosylierungsplätze.
Genauer werden Cysteinvarianten offenbart, wobei die Schleifenregion, in die das Cystein eingeführt wird, die A-B-Schleife, die B-C-Schleife, die C-D-Schleife oder die D-E-Schleife von Interferon-/Interferon-10-artigen Mitgliedern der GH-Supergenfamilie ist.
Solche Cysteinsubstitutionen oder Einsetzungsmutationen können auch die Einsetzung von einer oder mehreren zusätzlichen Aminosäuren aminoterminal oder carboxyterminal von der Cysteinsubsitution oder -einsetzung umfassen.
Andere Beispiele von Cysteinvarianten umfassen Erythropoietinvarianten. Erythropoietinvarianten umfassen solche, bei denen die substituierte Aminosäure in der A-B-Schleife, der B-C-Schleife, der C-D-Schleife, in den Aminosäuren proximal zur Helix A und distal zur Helix D oder in dem N- oder C-Terminus angeordnet ist. Noch genauer umfassen die EPO-Cysteinvarianten Moleküle, wobei die unten angegebenen Aminosäuren durch Cystein substituiert sind: Serin-126, N24, I25, T26, N38, I39, T40, N83, S84, A1, P2, P3, R4, D8, S9, T27, G28, A30, E31, H32, S34, N36, D43, T44, K45, N47, A50, K52, E55, G57, Q58, G77, Q78, A79, Q86, W88, E89, T107, R110, A111, G113, A114, Q115, K116, E117, A118, S120, P121, P122, D123, A124, A125, A127, A128, T132, K154, T157, G158, E159, A160, T163, G164, D165, R166 und S85.
Die Mitglieder der GH-Supergenfamilie umfassen Wachstumshormone, Prolaktin, plazentales Laktogen, Erythropoietin, Thrombopoietin, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12 (p35- Untereinheit), Interleukin-13, Interleukin-15, Onkostatin M, neurotrophen Cciliarfaktor, Leukämie-inhibitorischen Faktor, Alphainterferon, Betainterferon, Gammainterferon, Omegainterferon, Tauinterferon, Granulocytenkolonie-stiumulierenden Faktor, Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor, Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor, Kardiotrophin-1 und andere Proteine, die als Mitglieder der Familie identifiziert und klassifiziert werden. Diese Proteine können von jeder Tierart erhalten werden, einschließlich Menschen, Haustieren und Farmtieren.
Andere Variationen und Modifikationen der Erfindung werden dem Fachmann basierend auf der Beschreibung und den darin festgelegten "Regeln" offensichtlich werden. Alle diese werden als Teil der Erfindung betrachtet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Cysteinvarianten und – unter anderen Dingen – auf die platzspezifische Konjugation eines solchen Proteins mit Polyethylenglykol (PEG) oder anderen solchen Gruppen. PEG ist ein nicht-antigenes, inertes Polymer, das die Zeitdauer, die ein Protein im Körper zirkuliert, signifikant verlängert. Dies erlaubt es dem Protein, für einen längeren Zeitraum wirksam zu sein. Kovalente Modifikation von Proteinen mit PEG hat sich als nützliches Verfahren erwiesen, die Kreislaufhalbwertszeit von Proteinen im Körper auszudehnen (Abuchowski et al., 1984; Hershfield, 1987; Meyers et al., 1991). Kovalentes Anhängen von PEG an ein Protein erhöht die effektive Größe des Proteins und reduziert seine Ausscheidungsrate aus dem Körper. PEG sind in verschiedenen Größen kommerziell erhältlich, was es erlaubt, die Kreislaufhalbwertszeit von PEG-modifizierten Proteinen für individuelle Indikationen durch die Verwendung von PEG unterschiedlicher Größe zuzuschneiden. Andere Nutzen von PEG-Modifikationen umfassen einen Anstieg bei der Proteinlöslichkeit, einen Anstieg bei der in vivo-Proteinstabilität und einen Abfall bei der Proteinimmunogenizität (Katre et al., 1987; Katre, 1990).
Das bevorzugte Verfahren für das PEGylieren von Proteinen ist es, PEG unter Verwendung von Cystein-reaktiven PEG kovalent an Cysteinreste anzuhängen. Eine Anzahl von hochspezifischen Cystein-reaktiven PEG mit unterschiedlichen reaktiven Gruppen (z. B. Maleimid, Vinylsulfon) und PEG unterschiedlicher Größe (2–20 kDa) sind kommerziell verfügbar (z. B., von Shearwater, Polymers, Inc., Huntsville, AL). Bei neutralem pH hängen sich diese PEG- Reagenzien selektiv an "freie" Cysteinreste an, d. h. an Cysteinreste, die nicht in Disulfidbindungen einbezogen sind. Diese Konjugaten sind hydrolytisch stabil. Verwendung von Cystein-reaktivem PEG erlaubt die Entwicklung von homogenen PEG-Proteinkonjugaten definierter Struktur.
Erheblicher Fortschritt ist in den letzten Jahren beim Bestimmen der Strukturen von kommerziell wichtigen Proteintherapeutika und dem Verstehen, wie diese mit ihren Proteintargets, z. B. Zelloberflächenrezeptoren, Proteasen, usw., wechselwirken, gemacht worden. Diese Strukturinformationen können verwendet werden, um PEG-Proteinkonjugate unter Verwendung von Cystein-reaktiven PEG zu konstruieren. Cysteinreste nehmen bei den meisten Proteinen an Disulfidbindungen teil und sind für PEGylierung unter Verwendung von Cystein-reaktivem PEG nicht verfügbar. Durch in vitro-Mutationserzeugung unter Anwendung von rekombinanten DNS-Techniken können zusätzliche Cysteinreste irgendwo in das Protein eingeführt werden. Die zusätzlichen Cysteine können am Anfang des Proteins, am Ende des Proteins, zwischen zwei Aminosäuren in der Proteinsequenz eingeführt werden oder vorzugsweise für eine existierende Aminosäure in der Proteinsequenz substituiert werden. Die neu hinzugefügten "freien" Cysteine können als Plätze für das spezifische Anhängen eines PEG-Moleküls unter Verwendung von Cystein-reaktiven PEG dienen. Das hinzugefügte Cystein muss an der Oberfläche des Proteins exponiert und für die PEGylierung zugänglich sein, damit dieses Verfahren erfolgreich ist. Wenn der Platz, der zum Einführen eines zusätzlichen Cysteinrests verwendet wird, für die biologische Aktivität nicht essentiell ist, dann wird das PEGylierte Protein im Wesentlichen Wildtyp-(normale) in vitro-Bioaktivität zeigen. Die technische Hauptherausforderung beim PEGylieren von Proteinen mit Cystein-reaktivem PEG ist die Identifikation von an der Oberfläche exponierten, nicht essentiellen Regionen bei dem Zielprotein, wo Cysteinreste ohne Verlust an Bioaktivität hinzugefügt oder für existierende Aminosäuren substituiert werden können.
Varianten von einigen humanen Proteinen mit hinzugefügten Cystein- und PEG-Polymerkonjugaten dieser Proteine sind beschrieben worden. Das US-Patent 5,206,344 beschreibt Varianten von IL-2 mit hinzugefügtem Cystein. Diese Varianten mit hinzugefügtem Cystein sind innerhalb der ersten 20 Aminosäuren vom Aminoterminus der reifen IL-2-Polypeptidkette angeordnet. Die bevorzugte Cysteinvariante liegt an der Position 3 der reifen Polypeptidkette, was einem Threoninrest entspricht, der bei dem natürlich auftretenden Protein O-glykosyliert ist. Substitution von Cystein für Threonin an der Position 3 ergibt eine IL-2-Variante, die mit einem Cystein-reaktiven PEG PEGyliert werden kann und volle in vitro-Bioaktivität beibehält (Goodson und Katre, 1990). Im Gegensatz dazu zeigt natürliches IL-2, das mit Lysin-reaktivem PEG PEGyliert ist, reduzierte in vitro-Bioaktivität (Goodson and Katre, 1990). Die Effekte von Cysteinsubstitutionen an anderen Positionen in IL-2 wurden nicht berichtet.
Das US-Patent 5,166,322 lehrt Varianten von IL-3 mit zusätzlichem Cystein. Diese Varianten sind innerhalb der ersten 14 Aminosäuren von dem N-Terminus der reifen Proteinsequenz angeordnet. Das Patent lehrt Expressivierung der Proteine in Bakterien und kovalente Modifikation des Proteins mit Cystein-reaktiven PEG. Keine Information wird dazu bereitgestellt, ob die Varianten mit zusätzlichem Cystein und die PEG-Konjugate von IL-3 biologisch aktiv sind. Varianten mit zusätzlichem Cystein an anderen Positionen in der Polypeptidkette wurden nicht berichtet.
Die Weltpatentanmeldung WO9412219 und die PCT-Anmeldung US95/06540 lehren Varianten mit zusätzlichem Cystein von insulinartigem Wachstumsfaktor-I (IGF-I) IGF-I hat eine ganz andere Struktur als GH und ist kein Mitglied der GH-Supergenfamilie (Mott and Campbell, 1995). Cysteinsubstitutionen an vielen Positionen in dem IGF-I-Protein werden beschrieben. Nur bestimmte der Varianten mit zusätzlichem Cystein sind biologisch aktiv. Der bevorzugte Platz für die Variante mit zusätzlichem Cystein liegt an der Aminosäureposition 69 in der Kette des reifen Proteins. Cysteinsubstitutionen an Positionen nahe dem N-Terminus des Proteins (Reste 1–3) ergaben IGF-I-Varianten mit reduzierten biologischen Aktivitäten und falschen Disulfidbindungen.
Die Weltpatentanmeldung WO9422466 lehrt zwei Varianten mit zusätzlichem Cystein von insulinartigen Wachstumsfaktor(IGF)-bindendem Protein-1, das eine ganz andere Struktur als GH hat und kein Mitglied der GH-Supergenfamilie ist. Die den IGF-bindenden Protein-1-Varianten hinzugefügten zwei zusätzlichen Cysteine sind an den Positionen 98 und 101 in der Kette des reifen Proteins angeordnet und entsprechen Serinresten, die bei dem natürlich auftretenden Protein phosphoryliert sind.
Die US-Patentanmeldung 07/822296 lehrt Varianten mit zusätzlichem Cystein von Tumornekrosefaktor-bindendem Protein, das eine lösliche, abgeschnittene Form des Tumornekrosefaktorzellrezeptors ist. Tumornekrosefaktor-bindendes Protein hat eine ganz andere Struktur als GH und ist kein Mitglied der GH-Supergenfamilie.
IGF-I, IGF-bindendes Protein-1 und Tumornekrosefaktor-bindendes Protein haben sekundäre und tertiäre Strukturen, die ganz anders als GH sind, und die Proteine sind keine Mitglieder der GH-Supergenfamilie. Aus diesem Grund ist es schwierig, die Informationen zu verwenden, die aus den Studien von IGF-I, IGF-bindendem Protein-1 und Tumornekrosefaktor-bindendem Protein gewonnen wurden, um Varianten mit zusätzlichem Cystein von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie zu entwickeln. Die Studien mit IL-2 und IL-3 wurden durchgeführt, bevor die Strukturen von IL-2 und IL-3 bekannt waren (McKay 1992; Bazan, 1992), und bevor es bekannt war, dass diese Proteine Mitglieder der GH-Supergenfamilie sind. Frühere Experimente, die darauf zielten, bevorzugte Plätze für das Hinzufügen von Cysteinresten zu IL-2 und IL-3 zu identifizieren, waren weitestgehend empirisch und wurden vor den Experimenten durchgeführt, die darauf hinwiesen, dass Mitglieder der GH-Supergenfamilie ähnliche sekundäre und tertiäre Strukturen besitzen.
Basierend auf den jetzt für Mitglieder der GH-Supergenfamilie verfügbaren Strukturinformationen, stellt die vorliegende Erfindung "Regeln" für das a priori-Bestimmen bereit, welche Regionen und Aminosäurereste bei Mitgliedern der GH-Supergenfamilie verwendet werden können, um Cysteinreste ohne signifikanten Verlust an biologische Aktivität einzuführen oder zu substituieren. Im Gegensatz zu den natürlich auftreten Proteinen werden diese Varianten mit zusätzlichem Cystein von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie neue Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise die Fähigkeit, an bestimmten Plätzen innerhalb der Polypeptidkette mit Cystein-reaktiven Polymeren oder anderen Typen von Cystein-reaktiven Gruppen kovalent modifiziert zu werden. Die kovalent modifizierten Proteine werden biologisch aktiv sein.
GH ist das am besten untersuchte Mitglied der GH-Supergenfamilie. GH ist ein 22 kDa Protein, das von der Hypophyse sekretiert wird. GH stimuliert Stoffwechsel von Knochen, Knorpeln und Muskeln und ist das primäre Hormon des Körpers zum Stimulieren von Körperwachstum während der Kindheit. Rekombinantes humanes GH (rhGH) wird verwendet, um Kleinwuchs resultierend von GH-Unterversorgung und Nierenschäden bei Kindern zu behandeln. GH ist nicht glykosyliert und kann in vollständig aktiver Form in Bakterien hergestellt werden. Das Protein hat eine kurze in vivo-Halbwertszeit und muss für maximale Wirksamkeit durch tägliche subkutane Injektion verabreicht werden (MacGillivray et al., 1996). Rekombinantes humanes GH (rhGH) wurde kürzlich für die Behandlung von Kachexie bei AIDS-Patienten zugelassen und ist in der Untersuchung für die Behandlung von Kachexie, die mit anderen Erkrankungen verbunden ist.
Die Sequenz von humanem GH ist gut bekannt (siehe z. B. Martial et al. 1979; Goeddel et al. 1979, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden; SEQ ID NO: 1). GH ist bezüglich der Sequenz eng verwandt mit Prolaktin und plazentalem Laktogen, und diese drei Proteine wurden ursprünglich so betrachtet, dass sie eine kleine Genfamilie darstellen. Die primäre Sequenz von GH ist unter Tierarten hochgradig konserviert (Abdel-Meguid et al., 1987), was konsistent mit der Kreuzreaktivität des Proteins über viele Arten ist. Das dreidimensionale Faltungsmuster von Schweine-GH ist durch Röntgenkristallographie aufgelöst worden (Abdel-Meguid et al., 1987). Das Protein weist eine kompakte Kugelstruktur auf, die vier amphipathische alphahelikale Bündel umfasst, die durch Schleifen verbunden sind. Humanes GH hat eine ähnliche Struktur (de Vos et al., 1992). Die vier alphahelikalen Regionen werden A–D bezeichnet, beginnend am N-Terminus des Proteins. Auf die Schleifenregionen wird durch die helikalen Regionen Bezug genommen, die sie verbinden, z. B. verbindet die A-B-Schleife die helikalen Bündel A und B. Die A-B- und die C-D-Schleife sind lang, während die B-C-Schleife kurz ist. GH enthält vier Cysteinreste, von denen alle an Disulfidbindungen teilnehmen. Die Disulfidzuordnungen sind Cystein 53 verbunden mit Cystein 165 und Cystein 185 verbunden mit Cystein 189.
Die Kristallstruktur von GH gebunden an seinen Rezeptor ergab, dass GH zwei rezeptor-bindende Plätze aufweist und zwei Rezeptormoleküle bindet (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992). Die zwei rezeptorbindenden Plätze werden als Platz I und Platz II bezeichnet. Platz I umfasst das Carboxy(C)-terminale Ende von Helix D und Teile von Helix A und die A-B-Schleife, während Platz II die Amino(N)-terminale Region von Helix A und einen Teil von Helix C umfasst. Das Binden von GH an seinem Rezeptor erfolgt sequentiell, wobei Platz I immer zuerst bindet. Platz II greift dann an einem zweiten GH-Rezeptor an, was in Rezeptordimerisierung und Aktivierung des intrazellulären Signalwegs resultiert, der zu einer Zellantwort auf GH führt. Ein GH-Mutant, bei dem der Platz II mutiert wurde (eine Glycin in Arginin-Mutation an der Aminosäure 120) ist in der Lage, einen einzigen GH-Rezeptor zu binden, aber ist nicht in der Lage, GH-Rezeptoren zu dimerisieren. Dieser Mutant wirkt in vitro als GH-Antagonist, mutmaßlich durch Besetzen von GH-Rezeptorplätzen ohne Aktivierung des intrazellulären Signalwegs (Fuh et al., 1992).
Die Rollen von bestimmten Regionen und Aminosäuren bei der GH-Rezeptorbindung und dem intrazellulären Signalweg sind ebenfalls unter Verwendung von Techniken, so wie Mutationserzeugung, monoklonalen Antikörpern und proteolytischem Aufschluss, untersucht worden. Die ersten Mutationserzeugungsexperimente führten zum Ersetzen ganzer Domänen von GH mit ähnlichen Regionen des nahe verwandten Proteins Prolaktin (Cunningham et al., 1989). Ein Ergebnis war, dass das Austauschen der B-C-Schleife von GH mit derjenigen von Prolaktin die Bindung des GH-Hybridproteins an eine lösliche Form des humanen GH-Rezeptors nicht beeinträchtigte, was impliziert, dass die B-C-Schleife für die Rezeptorbindung nicht essentiell ist. Abtastende Alaninmutationserzeugung (Austausch von einzelnen Aminosäuren mit Alanin) identifizierte 14 Aminosäuren, die für die GH-Bioaktivität kritisch sind (Cunningham and Wells, 1989). Diese Aminosäuren sind in den Helices A, B, C und D und der A-B-Schleife angeordnet und entsprechen den Plätzen I und II, die durch die Strukturstudien Identifiziert wurden. Zwei Lysinreste an den Aminosäurepositionen 41 und 173, K41 und K172, wurden als kritische Komponenten des Rezeptorbindungsplatzes Platz I bestimmt, was die Abnahme bei der Bioaktivität erklärt, die beobachtet wird, wenn K172 acetyliert ist (Teh and Chapman, 1988). Modifikation von K168 reduzierte die GH-Rezeptorbindung und Bioaktivität ebenfalls signifikant (de la Llosa et al., 1985; Martal et al., 1985; Teh and Chapman, 1988). Regionen von GH, die für das Binden des GH-Rezeptors verantwortlich sind, sind auch unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern untersucht worden (Cunningham et al., 1989). Eine Reihe von acht monoklonalen Antikörpern wurde gegen humanes GH erzeugt und bezüglich der Fähigkeit analysiert, GH-Aktivität zu neutralisieren und Bindung von GH an seinen rekombinanten löslichen Rezeptor zu verhindern. Die letzteren Studien erlaubten es, den angenommenen Bindungsplatz für jeden monoklonalen Antikörper innerhalb der dreidimensionalen GH-Struktur zu lokalisieren. Von Interesse war, dass monoklonale Antikörper 1 und 8 nicht in der Lage waren, GH aus seiner Bindung an seinen Rezeptor zu verdrängen. Die bindenden Plätze für diesen monoklonalen Antikörper wurden in der B-C-Schleife (monoklonaler Antikörper Nr. 1) und dem N-terminalen Ende der A-B-Schleife (monoklonaler Antikörper Nr. 8) lokalisiert. Keine monoklonalen Antikörper wurden untersucht, die spezifisch die C-D-Schleife banden. Die monoklonalen Antikörperstudien weisen darauf hin, dass die B-C-Schleife und das N-terminale Ende der A-B-Schleife für die Rezeptorbindung nicht essentiell sind. Letztlich wurde begrenzte Spaltung von GH mit Trypsin gefunden, um ein Zweikettenderivat herzustellen, das volle Aktivität beibehielt (Mills et al., 1980; Li, 1982). Zuordnungsstudien wiesen darauf hin, dass Trypsin Aminosäuren zwischen den Positionen 134 und 149 spaltete und/oder zerstörte, was der C-D-Schleife entspricht. Diese Studien deuten darauf hin, dass die C-D-Schleife nicht in die Rezeptorbindung oder die GH-Bioaktivität einbezogen ist.
Strukturen einer Anzahl von Cytokinen, einschließlich G-CSF (Hill et al., 1993), GM-CSF (Diederichs et al., 1991; Walter et al., 1992), IL-2 (Bazan, 1992; McKay, 1992), IL-4 (Redfield et al., 1991; Powers et al., 1992) und IL-5 (Milburn et al., 1993) sind durch Röntgenstreuungs- und NMR-Studien bestimmt worden und zeigen abgesehen von einem Fehlen von signifikanter primärer Sequenzhomologie auffällige Übereinstimmung mit der GH-Struktur. EPO wird basierend auf Modellier- und Mutationserzeugungsstudien als Mitglied dieser Familie betrachtet (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994). Eine große Anzahl von zusätzlichen Cytokinen und Wachstumsfaktoren einschließlich des neurotrophischen Ciliarfaktors (ciliary neurotrophic factor = CNTF), des Leukämie-inhibitorischen Faktor (LIF), von Thrombopoietin (TPO), von Onkostatin M, des Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), von IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 und Alpha-, Beta-, Omega-, Tau- und Gammainterferon, gehört zu dieser Familie (Übersicht in Mott und Campbell, 1995; Silvennoinen und Ihle, 1996). Alle obigen Cytokine und Wachstumsfaktoren werden jetzt so angesehen, als dass sie eine große Genfamilie darstellen, von der GH der Prototyp ist.
Zusätzlich dazu, dass sie ähnliche sekundäre und tertiäre Strukturen teilen, teilen Mitglieder dieser Familie die Eigenschaft, dass sie Zelloberflächenrezeptoren oligomerisieren müssen, um intrazelluläre Signalübertragungswege zu aktivieren. Einige GH-Familienmitglieder, z. B. GH und EPO, binden einen einzigen Typ von Rezeptor und bringen ihn dazu, Homodimere zu bilden. Andere Familienmitglieder, z. B. IL-2, IL-4, and IL-6, binden mehr als einen Typ von Rezeptor und bringen die Rezeptoren dazu, Heterodimere oder Aggregate höherer Ordnung zu bilden (Davis et al., 1993; Paonessa et al., 1995; Mott und Campbell, 1995). Mutationserzeugungsstudien haben gezeigt, dass diese anderen Cytokine und Wachstumsfaktoren wie GH mehrere Rezeptorbindungsplätze enthalten, typischerweise zwei, und ihre erkannten Rezeptoren sequentiell bilden (Mott und Campbell, 1995; Matthews et al., 1996). Wie GH treten die primären Rezeptorbindungsplätze für diese anderen Familienmitglieder primär in den vier Alphahelices und der A-B-Schleife auf (Übersicht in Mott und Campbell, 1996). Die spezifischen Aminosäuren in den helikalen Bündeln, die an der Rezeptorbindung teilhaben, unterscheiden sich zwischen den Familienmitgliedern (Mott and Campbell, 1995). Die meisten Zelloberflächenrezeptoren, die mit Mitgliedern der GH-Supergenfamilie Wechselwirken, sind strukturell verwandt und stellen eine zweite große Vielgenfamilie dar (Bazan, 1990; Mott und Campbell, 1995; Silvennoinen und Ihle, 1996).
Eine allgemeine Schlussfolgerung, die aus Mutationsstudien von verschiedenen Mitgliedern der GH-Supergenfamilie erzielt wurde, ist, dass die Schleifen, die die Alphahelices verbinden, allgemein dazu neigen, nicht in die Rezeptorbindung verwickelt zu sein. Insbesondere scheint die kurze B-C-Schleife für die Rezeptorbindung bei den meisten, soweit nicht allen, Familienmitgliedern nicht essentiell zu sein. Aus diesem Grund ist die B-C-Schleife eine bevorzugte Region für das Einführen von Cysteinsubstitutionen bei Mitgliedern der GH-Supergenfamilie. Die A-B-Schleife, die B-C-Schleife, die C-D-Schleife (und die D-E-Schleife von Interfereon/IL-2-10-artigen Mitgliedern der GH-Superfamilie) sind auch bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinmutationen. Aminosäuren proximal der Helix A und distal der finalen Helix neigen auch dazu, nicht in die Rezeptorbindung verwickelt zu sein und sind ebenfalls bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinsubstitutionen. Bestimmte Mitglieder der GH-Familie, z. B. EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 and Betainterferon enthalten N-gebundene und O-gebundene Zucker. Die Glykosylierungsplätze bei den Proteinen treten nahezu exklusiv in den Schleifenregionen auf und nicht in den alphahelikalen Bündeln. Weil die Schleifenregionen allgemein nicht in die Rezeptorbindung verwickelt sind und weil sie Plätze für das kovalente Anhängen von Zuckergruppen sind, sind sie bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinsubstitutionen in die Proteine. Aminosäuren, die die N- und O-gebundenen Glykosylierungsplätze in dem Protein aufweisen, sind bevorzugte Plätze für Cysteinsubstitutionen, weil diese Aminosäuren an der Oberfläche exponiert sind; das natürliche Protein kann an diesen Plätzen sperrige Zuckergruppen angehängt an die Proteine tolerieren, und die Glykosylierungsplätze neigen dazu, von den Rezeptorbindungsplätzen weg lokalisiert zu sein.
Viele zusätzliche Mitglieder der GH-Genfamilien werden wahrscheinlich in der Zukunft entdeckt werden. Neue Mitglieder der GH-Supergenfamilie können durch computergestützte Analysen der sekundären und tertiären Struktur der vorausgesagten Proteinsequenzen identifiziert werden. Mitglieder der GH-Supergenfamilie werden vier oder fünf amphipathische Helices besitzen, die durch nicht-helikale Aminosäuren (die Schleifenregionen) verbunden sind. Die Proteine können eine hydrophobe Signalsequenz an ihrem N-Terminus aufweisen, um Sekretion aus der Zelle zu fördern.
Hier werden "Regeln" für das Erzeugen biologisch aktiver Varianten mit zusätzlichem Cystein von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie offenbart. Diese "Regeln" können auf jedes existierende oder zukünftige Mitglied der GH-Supergenfamilie angewandt werden. Die Varian ten mit zusätzlichem Cystein werden neue Eigenschaften besitzen, die von den natürlich auftretenden Proteinen nicht geteilt werden. Am wichtigsten ist, dass die Varianten mit zusätzlichem Cystein die Eigenschaft besitzen werden, dass sie kovalent mit Cystein-reaktiven Polymeren oder anderen Typen von Cystein-reaktiven Gruppen modifiziert werden können, um biologisch aktive Proteine mit verbesserten Eigenschaften zu erzeugen, wie beispielsweise erhöhter in vivo-Halbwertszeit, erhöhter Löslichkeit und verbesserter in vivo-Wirksamkeit.
Biologisch aktive Cysteinvarianten von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie können durch Substituieren von Cysteinresten für nicht-essentielle Aminosäuren bei dem Protein präpariert werden. Vorzugsweise werden die Cysteinreste für Aminosäuren substituiert, die die Schleifenregionen ausbilden, für Aminosäuren nahe den Enden der Alphahelices und Aminosäuren proximal der ersten amphipathischen Helix oder distal der letzten amphipathischen Helix dieser Proteine. Andere bevorzugte Plätze für das Hinzufügen von Cysteinresten sind der N-Terminus oder der C-Terminus der Proteine. Cysteinreste können auch zwischen zwei Aminosäuren in den offenbarten Regionen der Polypeptidkette eingeführt werden. Es wird hier offenbart, dass N- und O-gebundene Glykosylierungsplätze in den Proteinen bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinsubstitutionen entweder durch Substitution für Aminosäuren, die diese Plätze ausbilden, oder im Falle von N-gebundenen Plätzen durch Einführen von Cysteinen dorthinein sind. Die Glykosylierungsplätze können Serin- oder Threoninreste sein, die O-glykolysiert werden, oder Asparaginreste, die N-glykolysiert werden. N-gebundene Glykosylierungsplätze haben die Grundstruktur Asparagin-X-Serin oder Threonin (N-X-S/T), wobei X jede Aminosäure sein kann. Der Asparaginrest, die Aminosäure in der X-Position und der Serin-/Threoninrest des N-gebundenen Glykosylierungsplatzes sind bevorzugte Plätze für das Erzeugen biologisch aktiver Varianten mit zusätzlichem Cystein dieser Proteine. Aminosäuren, die die O-gebundenen und N-gebundenen Glykosylierungsplätze direkt umgeben oder diesem benachbart sind (innerhalb von ungefähr 10 Resten auf beiden Seiten des Glykosylierungsplatzes) sind bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinsubstitutionen.
Allgemeiner können bestimmte der "Regeln" für das Identifizieren bevorzugter Plätze für das Erzeugen biologisch aktiver Proteinvarianten mit zusätzlichem Cystein auf jegliches Protein angewandt werden, nicht nur auf Proteine, die Mitglieder der GH-Supergenfamilie sind. Speziell sind bevorzugte Plätze für das Erzeugen biologisch aktiver Cysteinvarianten von Proteinen (anderen als IL-2) O-gebundene Glykosylierungsplätze. Aminosäuren, die die O-gebundenen Glykosylierungsplätze direkt umgeben (innerhalb ungefähr 10 Resten auf jeder Seite des Glykosylierungsplatzes) sind ebenfalls bevorzugte Plätze. N-gebundene Glykosylierungsplätze und die Aminosäurereste direkt benachbart auf jeder Seite des Glykosylierungsplatzes (innerhalb ungefähr 10 Resten von dem N-X-S/T-Platz) sind ebenfalls bevorzugte Plätze für das Erzeugen von Proteinvarianten mit zusätzlichem Cystein. Aminosäuren, die ohne signifikanten Verlust an biologischer Aktivität durch Cystein ersetzt werden können, sind ebenfalls bevorzugte Plätze für das Erzeugen von Proteinvarianten mit zusätzlichem Cystein. Solche nicht essentiellen Aminosäuren können durch Durchführen von abtastender Cysteinmutationserzeugung an dem Zielprotein und Messen der Effekte auf die biologische Aktivität identifiziert werden. Abtastende Cysteinmutationserzeugung hat das Hinzufügen oder Substituieren von Cysteinresten für individuelle Aminosäuren in der Polypeptidkette und das Bestimmen des Effekts der Cysteinsubstituierung auf die die biologische Aktivität zur Folge. Abtastende Cysteinmutationserzeugung ist der abtastenden Alaninmutationserzeugung (Cunningham et al., 1992) ähnlich, außer dass Zielaminosäuren einzeln durch Cysteinreste anstelle von Alaninresten ersetzt werden.
Anwendung der "Regeln" zum Erzeugen von Varianten mit zusätzlichem Cystein und Konjugaten von Proteinantagonisten wird ebenfalls erwogen. Überschussproduktion von Cytokinen und Wachstumsfaktoren ist in die Pathologie von vielen entzündlichen Zuständen in Verbindung gebracht worden, so wie von rheumatischer Arthritis, Asthma, Allergien und Wundvernarbung. Überschussproduktion von GH ist als Ursache von Akromelagie in Verbindung gebracht worden. Bestimmte Wachstumsfaktoren und Cytokine, z. B. GH und IL-6, sind mit der Vermehrung von bestimmten Krebsen in Verbindung gebracht worden. Viele der Wachstumsfaktoren und Cytokine, die mit Entzündungen und Krebs in Verbindung gebracht worden sind, sind Mitglieder der GH-Supergenfamilie. Es besteht erhebliches Interesse an der Entwicklung von Proteinantagonisten dieser Moleküle, um diese Erkrankungen zu behandeln. Eine Strategie umfasst das derartige Konstruieren der Cytokine und Wachstumsfaktoren, dass sie an Rezeptoren binden können, diese aber nicht oligomerisieren. Dies wird durch Mutierung des zweiten rezeptorbindenden Platzes (Platz II an den Molekülen) bewirkt. Die resultierenden Mutanten sind in der Lage, Rezeptorplätze zu binden und zu besetzen, sind aber nicht in der Lage, intrazelluläre Signalübertragungswege zu aktivieren. Diese Strategie ist erfolgreich auf GH angewandt worden, um einen GH-Antagonisten herzustellen (Cunningham et al., 1992). Ähnliche Strategien werden verfolgt, um Antagonisten von anderen Mitgliedern der GH-Supergenfamilie zu entwickeln, wie beispielsweise IL-2 (Zurawski et al., 1990; Zurawski und Zurawski, 1992), IL4 (Kruse et al., 1992), IL-5 (Tavernier et al., 1995), GM-CSF (Hercus et al., 1994) and EPO (Matthews et al., 1996). Da die bevorzugten Plätze für das Hinzufügen von Cysteinresten zu Mitgliedern der GH-Supergenfamilie, die hier beschrieben werden, außerhalb der Rezeptorbindungsplätze bei diesen Proteinen liegen, und somit gegenüber jeglichen Plätzen verschoben sind, die verwendet werden, um Proteinantagonisten zu erzeugen, könnten die hier beschriebenen Varianten mit zusätzlichem Cystein verwendet werden, um lange wirkende Versionen von Proteinantagonisten zu erzeugen. Z. B. entwickelten Cunningham et al. (1992) einen in vitro-GH-Antagonisten durch Mutieren eines Glycinrests (Aminosäure 120) zu einem Arginin. Dieser Gylcinrest ist eine kritische Komponente des zweiten rezeptorbindenden Platzes bei GH; wenn er durch Arginin ersetzt wird, kann GH Rezeptoren nicht dimerisieren. Die Glycin zu Arginin-Mutation an Position 120 kann in DNS-Sequenzen eingeführt werden, die die hier betrachteten GH-Varianten mit zusätzlichem Cystein kodieren, um einen GH-Antagonisten mit zusätzlichem Cystein zu erzeugen, der mit Cystein-reaktivem PEG oder anderen Typen von Cystein-reakiven Gruppen konjugiert werden kann. In ähnlicher Weise können Aminosäureänderungen bei anderen Proteinen, die die Proteine von Agonisten in Antagonisten umschalten, in DNS-Sequenzen eingebaut werden, die hier beschriebene Proteinvarianten mit zusätzlichem Cystein kodieren. Erheblicher Aufwand ist betrieben worden, um Aminosäureänderungen zu identifizieren, die Proteinagonisten in Antagonisten umwandeln. Hercus et al. (1994) berichteten, dass das Substituieren von Arginin oder Lysin für Glutaminsäure an der Position 21 bei dem reifen GM-CSF-Protein GM-CSF von einem Agonisten in einen Antagonisten umwandelt. Tavernier et al. (1995) berichteten, dass das Substituieren von Glutamin für Glutaminsäure an Position 13 von reifem IL-5 einen IL-5-Antagonisten erzeugt.
Experimentelle Strategien ähnlich jenen, die oben beschrieben werden, können verwendet werden, um Varianten (sowohl Agonisten als auch Antagonisten) mit zusätzlichem Cystein von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie zu erzeugen, die von verschiedenen Tieren erhalten werden. Dies ist möglich, weil die primäre Aminosäuresequenzen und -strukturen von Cytokinen und Wachstumsfaktoren zwischen Menschen und Tierarten weitgehend konserviert sind. Aus diesem Grund werden die hier offenbarten "Regeln" für das Erzeugen von biologisch aktiven Varianten mit zusätzlichem Cystein von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie für das Erzeugen biologisch aktiver Varianten mit zusätzlichem Cystein von Mitgliedern der GH-Supergenfamilie von Haustieren (z. B. Hunden, Katzen, Pferden) und kommerziellen Tierarten (z. B. Kühen, Schafen, Schweinen) nützlich sein. Konjugation dieser Varianten mit zusätzlichem Cystein mit Cystein-reaktivem PEG wird lange wirkende Versionen dieser Proteine erzeugen, was den Haustier- und kommerziellen Farmtiermärkten nützen wird.
Proteine, die Mitglieder der GH-Supergenfamilie sind (haematopoietische Cytokine) werden bei Silvennoimem und Ihle (1996) bereitgestellt. Silvennoimem und Ihle (1996) stellen auch Informationen über die Struktur und die Expressivierung dieser Proteine bereit. DNS-Sequenzen, kodierte Aminosäuren und in vitro- sowie in vivo-Biotests für die hier beschriebenen Proteine werden bei Aggarwal und Gutterman (1992; 1996), Aggarwal (1998), und Silvennoimem und Ihle (1996) beschrieben. Biotests für die Proteine werden auch in Katalogen von verschiedenen kommerziellen Lieferanten dieser Proteine bereitgestellt, wie beispielsweise R & D Systems, Inc. and Endogen, Inc.
Das folgende Beispiel wird bereitgestellt, um zu demonstrieren, wie diese "Regeln" angewendet werden können, um Varianten mit zusätzlichem Cystein von GH zu erzeugen. Das Beispiel ist nicht vorgesehen, beschränkend zu sein, sondern nur beispielhaft für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung.
BEISPIEL 1
Varianten von GH mit zusätzlichem Cystein
Dieses Beispiel offenbart bestimmte Aminosäuren bei GH, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind und die, wenn sie zu Cysteinresten mutiert werden, das normale Disulfidbindungsmuster und die Gesamtkonformation des Moleküls nicht ändern. Diese Aminosäuren sind an dem N-terminalen Ende der A-B-Schleife (Aminosäuren 34–52 der reifen Proteinsequenz; SEQ ID NO: 1; Martial et al. 1979; Goeddel et al. 1979), der B-C-Schleife (Aminosäuren 97–105 bei der Sequenz des reifen Proteins) und der C-D-Schleife (Aminosäuren 130–153 bei der Sequenz des reifen Proteins) angeordnet. Auch als bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinresten identifiziert werden die ersten drei oder letzten drei Aminosäuren in den A-, B-, C- und D-Helices und die Aminosäuren proximal zu der Helix A und distal zu der Helix D.
DNS-Sequenzen, die GH vom Wildtyp kodieren, können unter Verwendung der Polymerasekettenreaktionstechnik von kommerziell erhältlicher Einzelstrang-cDNS, die von humanen Hypophysen präpariert (ClonTech, San Diego, CA) oder unter Verwendung überlappender Oligonukleotide zusammengesetzt wurde, amplifiziert werden. Spezifische Mutationen können unter Verwendung einer Vielzahl von Prozeduren, wie beispielsweise von Phagentechniken (Kunkel et al. 1987), PKR-Mutationserzeugungstechniken (Innis et al. 1990; White 1993), Mutationserzeugungskits, so wie jene, die von Stratagene ("Quick-Change Mutagenesis"-Kit, San Diego, CA) oder Promega (Gene Editor, Kit, Madison WI) verkauft werden, in die GH-Sequenz eingeführt werden.
Cysteinsubstitutionen können in jede der Aminosäuren eingeführt werden, die die B-C-Schleife, die C-D-Schleife und das N-terminale Ende der A-B-Schleife ausmachen, oder in die ersten drei Aminosäuren der alphahelikalen Regionen, die an diese Regionen angrenzen, oder in die Region proximal zur Helix A oder distal zur Helix D. Bevorzugte Plätze für das Einführen von Cysteinresten sind F1, T3, P5, E33, A34, K38, E39, Q40, S43, Q46, N47, P48, Q49, T50, S51, S55, T60, A98, N99, S100, G104, A105, S106, E129, D130, G131, S132, P133, T135, G136, Q137, K140, Q141, T142, S144, K145, D147, T148, N149, S150, H151, N152, D153, S184, E186, G187, S188 und G190. Cysteinreste können auch am Anfang des reifen Proteins, d. h. proximal der F1-Aminosäure, oder nach der letzten Aminosäure bei dem reifen Protein, d. h. nach F191 eingeführt werden. Falls erwünscht können zwei oder mehr solcher Mutationen bei demselben Protein einfach kombiniert werden, entweder durch in vitro-DNS-Rekombination von geklonten mutanten Genen und durch sequentielle Konstruktionen von einzelnen gewünschten Mutationen.
1. Klonieren des Gens für humanes Wachstumshormon (GH)
Das humane GH-Gen wurde von humaner Einzelstranghypophysen-cDNS (kommerziell erhältlich von CLONTECH, Inc., Palo Alto, CA) unter Verwendung der Polymerasekettenreaktions(PKR)-Technik und von Primern BB1 und BB2 amplifiziert. Die Sequenz von BB1 ist 5'-GGGGGTCGACCATATGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3 (SEQ ID NO: 24). Die Sequenz von BB2 ist 5'-GGGGGATCCTCACTAGAAGCCACAGCTGCCCTC-3' (SEQ ID NO: 25). Der Primer BB1 war vorgesehen, um ein anfängliches Methionin zu kodieren, das der ersten Aminosäuren von reifem GH, Phenylalanin, vorausgeht, und SalI- und NdeI-Plätze für Klonierzwecke. Der Rückwärtsprimer BB2 enthält einen BamHI-Platz für Klonierzwecke. Die PKR-100 Mikroliter-Reaktionen enthielten 10 pmol von jedem Oligonukleotidprimer, 1X PKR Puffer (Perkin-Elmer-Puffer, der MgCl₂ enthielt), eine 200 mikromolare Konzentration von jedem der vier Nukleotide dA, dC, dG and dT, 2 ng Einzelstrang-cDNS, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) und 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase (Stratagene, Inc). Die PKR-Reaktionsbedingungen waren 96° C für 3 Minuten, 35 Zyklen von (95° C, 1 Minute; 63° C für 30 Sekunden; 72° C für 1 Minute), gefolgt von 10 Minuten bei 72° C. Der verwendete Thermocycler war der Amplitron II Thermal Cycler (Thermolyne). Das ungefähr 600 bp PKR-Produkt wurde mit SalI und BamHI aufgeschlossen, gelgereinigt und in entsprechend aufgeschlossenes Plasmid pUC (kommerziell erhältlich von New England BioLabs, Beverly, MA) kloniert. Die Ligationsmischung wurde in den E. coli-Stamm DH5alpha transformiert und Transformanten wurden auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, selektiert. Verschiedene Kolonien wurden über Nacht in LB-Medien gezogen, und Plasmid DNS wurde unter Verwendung des Miniplasmid DNA Isolation Kit, gekauft von Qiagen, Inc (Valencia, CA), isoliert. Klon LB6 wurde als die richtige DNS-Sequenz aufweisend bestimmt.
Für die Expression in E. coli wurde der Klon LB6 mit NdeI und EcoRI aufgeschlossen, das ungefähr 600 bp Fragment wurde gelgereinigt und in Plasmid pCYB 1 (kommerziell erhältlich von New England BioLabs, Beverly, MA), das mit denselben Enzymen aufgeschlossen und phosphatisiert worden war, kloniert. Die Ligationsmischung wurde in E. coli-DH5alpha transformiert, und Transformanten wurden auf LB-Ampicillin-Platten selektiert. Plasmid-DNS wurde von verschiedenen Transformanten isoliert und durch Aufschluss mit NdeI und EcoRI gescreent. Ein korrekter Klon wurde identifiziert und pCYBI: wtGH (pBBT120) benannt. Dieses Plasmid wurde in E. coli-Stämme JM109 oder W3110 (erhältlich von New England BioLabs und der American Type Culture Collection) transformiert.
2. Konstruktion von STII-GH
Der Wildtyp-GH-Klon 166 (pUC19: Wildtyp GH) wurde als Matrize verwendet, um einen GH-Klon zu konstruieren, der die E. coli-STII-Signalsequenz enthielt (Picken et al. 1983). Wegen ihrer Länge wurde die STII-Sequenz in zwei aufeinanderfolgenden PKR-Reaktionen hinzugefügt. Die erste Reaktion verwendete Vorwärtsprimer BB12 und Rückwärtsprimer BB10. BB10 hat die Sequenz: 5'CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3' (SEQ ID NO: 28). BB12 hat die Sequenz: 5'ATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3' (SEQ ID NO: 30).
Die PKR-Reaktionen waren so, wie für das Amplifizieren von Wildtyp-GH beschrieben wurde, außer dass ungefähr 4 ng des Plasmids LB6 anstelle der Einzelstrang-cDNS als Matrize verwendet wurden und dass die PKR-Bedingungen 96° C für 3 Minuten, 30 Zyklen von (95° C für 1 Minute; 63° C für 30 Sekunden; 72° C für 1 Minute) gefolgt von 72° C für 10 Minuten waren. Das ungefähr 630 bp PKR-Produkt wurde gelgereinigt unter Verwendung des Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc), 50-fach in Wasser verdünnt und 2 Mikroliter wurden als Matrize für die zweite PKR-Reaktion verwendet. Die zweite PKR-Reaktion verwendete Rückwärtsprimer BB10 and Vorwärtsprimer BB11. BB11 hat die Sequenz: 5'CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG-3' (SEQ ID NO: 29).
Primer BB11 enthält XbaI- und NdeI-Plätze für Klonierzwecke. Die PKR-Bedingungen waren wie für die erste Reaktion beschrieben. Das ungefähr 660 bp PKR-Produkt wurde mit XbaI und BamHI aufgeschlossen, gelgereinigt und in in gleicher Weise beschnittenes Plasmid pCDNA3.1 (+) (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA) kloniert. Von dem Klon pCDNA3.1 (+)::stlI-GH (5C) bzw. "5C" wurde bestimmt, dass er die korrekte DNS-Sequenz aufweist.
Der Klon "5C" wurde mit NdeI und BamHI gespalten und in in gleicher Weise beschnittenes pBBT108 (ein Derivativ von pUC19, dem ein Pst I-Platz fehlt, dieses Plasmid wird unten beschrieben) kloniert. Ein Klon mit der korrekten Einsetzung wurde nach Aufschluss mit diesen Enzymen identifiziert. Dieser Klon, pBBT111 bezeichnet, wurde mit NdeI und SalI aufgeschlossen; das 660 bp Fragment, das das stlI-GH-Fusionsprotein enthielt wurde gelgereinigt und in den Plasmidexpressionsvektor pCYB1 (New England BioLabs) kloniert, der mit denselben Enzymen aufgeschlossen und phosphatiert worden war. Ein rekombinantes Plasmid, das die stlI-GH-Einsetzung enthielt, wurde durch Restriktionsendonukleaseaufschlüsse identifiziert. Ein solches Isolat wurde für weitere Studien ausgewählt und wurde pBBT114 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde in E. coli-Stämme JM109 oder W3110 (erhältlich von New England BioLabs und der American Type Culture Collection) transformiert.
3. Konstruktion von ompA-GH
Wildtyp-GH-Klon LB6 (pUC19: Wildtyp-GH) wurde als Matrize verwendet, um einen GH-Klon zu konstruieren, der die E. coli-ompA-Signalsequenz enthält (Mowa et al. 1980). Aufgrund ihrer Länge wurde die ompA-Sequenz in zwei aufeinanderfolgenden PKR-Reaktionen hinzugefügt. Die erste Reaktion verwendete Vorwärtsprimer BB7: 5'GCAGTGGCACTGGCTGGTTT CGCTACCGTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG3' (SEQ ID NO: 31) und Rückwärtsprimer BB10: 5'CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3' (SEQ ID NO: 28).
Die PKR-Reaktionen waren so, wie für das Amplifizieren von Wildtyp-GH beschrieben wurde, außer dass ungefähr 4 ng des Plasmids LB6 anstelle der Einzalstrang-cDNS als Matrize verwendet wurden und dass die PKR-Bedingungen 96° C für 3 Minuten, 30 Zyklen von (95° C für 1 Minute; 63° C für 30 Sekunden; 72° C für 1 Minute) gefolgt von 72° C für 10 Minuten waren. Das ungefähr 630 bp PKR-Produkt wurde unter Verwendung des Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc) gelgereinigt, 50-fach in Wasser verdünnt und 2 Mikroliter wurden als Matrize für die zweite PKR-Reaktion verwendet. Die zweite PKR-Reaktion verwendete Rückwärtsprimer BB10 und Vorwärtsprimer BB6: 5'CCCCGTCGACACATATGAAGAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTC3' (SEQ ID NO: 32).
Die PKR-Bedingungen waren so, wie für die erste Reaktion beschrieben wurde. Das ungefähr 660 bp PKR-Produkt wurde gelgereinigt, mit SalI und BamHI aufgeschlossen und in pUC19 (New England BioLabs), das mit SalI and BamHI beschnitten war, oder pCDNA3.1 (+) (Invitrogen), das mit XhoI and BamHI beschnitten war (SalI and XhoI produzieren kompatible Einzelstrangüberhänge), kloniert. Als verschiedene Klone sequenziert wurden, wurde entdeckt, dass alle pUC19-Klone (8/8) Fehler in der Region der ompA Sequenz enthielten. Nur ein pCDNA3.1 (+)-Klon wurde sequenziert, und er enthielt eine Sequenzmehrdeutigkeit in der ompA-Region. Um ein korrektes ompA-GH-Fusiongen zu erzeugen, wurden Segmente von zwei sequenzierten Klonen, die unterschiedliche Fehler getrennt durch einen geeigneten Restriktionsplatz enthielten, rekombiniert und in das pUC19-Derivativ kloniert, dem der Pst I-Platz fehlte (siehe pBBT108 wie unten beschrieben). Das resultierende Plasmid, pBBT112 benannt, trägt das ompA-GH-Fusionsgen kloniert als ein NdeI-BamHI-Fragment in denselben Platz bei pBBT108. Dieses Plasmid wird pBBT112 bezeichnet und in einer PKR-basierten, platzspezifischen Mutationserzeugung von GH verwendet, wie unten beschrieben wird.
4. Konstruktion von Pst-pUC19
Um die Mutationserzeugung bei dem geklonten GH-Gen für die Konstruktion von ausgewählten Cysteinsubstitutions- und Einsetzungsmutationen zu erleichtern, wurde ein Derivat des pUC19 (New England BioLabs), dem ein Pst I-Platz fehlt, wie folgt konstruiert. pUC19-Plasmid-DNS wurde mit PstI aufgeschlossen und nachfolgend bei 75° C mit PFU-DNS-Polymerase (Stratagene) behandelt, wobei der vom Verkäufer gelieferte Reaktionspuffer mit 200 μM dNTPs angereichert war. Unter diesen Bedingungen wird die Polymerase den 3'-Einzelstrangüberhang, der durch PstI-Aufschluss erzeugt wurde, aufschließen, aber nicht in den doppelstrangigen Bereich hinein aufschließen. Das Nettoergebnis wird die Auslöschung der vier einzelstrangigen Basen sein, die die mittleren vier Basen des Pst I-Erkennungsplatzes ausbilden. Das resultierende Molekül hat doppelstrangige, d. h. "stumpfe", Enden. Nach diesen enzymatischen Reaktionen wurde das lineare Monomer unter Verwendung des Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc) gelgereinigt. Diese gereinigte DNS wurde mit T4 DNS-Ligase (New England BioLabs) gemäß den Protokollen des Verkäufers behandelt, mit PstI aufgeschlossen und verwendet, um E coli-DH5alpha zu transformieren. Transformanten wurden selektiert und durch Restriktionsausschluss mit PstI and BamHI analysiert. Einer der Transformanten, der nicht durch PstI aber an dem naheliegenden BamHI-Platz gespalten wurde, wurde ausgewählt und als pBBT108 bezeichnet.
5. Konstruktion von GH-Mutanten
GH-Mutanten wurden allgemein unter Anwendung von platzgerichteter PKR-basierter Mutationserzeugung wie in PCR Protocols: Current Methods and Applications, herausgegeben von B. A. White, 1993 Humana Press, Inc., Totowa, NJ, und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, herausgegeben von Innis, M. A. et al. 1990 Academic Press Inc San Diego, CA, konstruiert. Typischerweise sind PKR-Primeroligonukleotide vorgesehen, um Nukleotidänderungen in die kodierende Sequenz von GH einzubauen, die in die Substitution eines Cysteinrests für eine Aminosäure an einer spezifischen Position innerhalb des Proteins resultieren. Solche mutagenen Oligonukleotidprimer können auch vorgesehen werden, um einen zusätzlichen Cysteinrest an dem Carboxyterminus oder dem Aminoterminus der kodierenden Sequenz von GH einzubauen. In diesem letzteren Fall könnte eine oder könnten mehrere zusätzliche Aminosäurereste aminoterminal und/oder carboxyterminal von dem hinzugefügten Cysteinrest eingebaut werden, falls dies wünschenswert wäre. Darüber hinaus können Oligonukleotide vorgesehen werden, um Cysteinreste als Einsetzungsmutationen an spezifischen Positionen innerhalb der GH-kodierenden Sequenz einzubauen, falls dies wünschenswert wäre. Erneut könnte eine oder könnten mehrere zusätzliche Aminosäuren zusammen mit dem Cysteinrest eingesetzt werden, und diese Aminosäuren könnten aminoterminal und/oder carboxyterminal von dem Cysteinrest positioniert werden.
Die Cysteinsubstitutionsmutation T135C wurde wie folgt konstruiert. Das mutagene Rückwärtsoligonukleotid BB28: 5'CTGCTTGAAGATCTGCCCACACCGGGGGCTGCCATC'3 (SEQ ID NO: 33) wurde vorgesehen, um den Kodon ACT für Threonin an dem Aminosäurerest 135 in ein TGT-Kodon, das ein Cystein kodiert, zu ändern und den naheliegenden BglII-Platz zu überspannen. Dieses Oligonukleotid wurde bei PKR zusammen mit dem Vorwärtsoligonukleotid BB34 5'GTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATT3' (SEQ ID NO: 34) verwendet, das an die Verbindungsregion des ompA-GH-Fusiongens hybridisiert und nicht mutagen ist. Die PKR wurde in einer 50 μl Reaktion in 1X PKR-Puffer (Perkin-Elmer-Puffer, 1.5 mM MgCl2 enthaltend), bei einer 200 mikromolaren Konzentration von jedem der vier Nukleotide dA, dC, dG and dT, wobei jeder Oligonukleotidprimer zu 0,5 μM vorlag, 5 pg von pBBT112 (oben beschrieben) als Matrize und 1,25 Einheiten von Amplitac DNS-Polymerase (Perkin-Elmer) und 0,125 Einheiten PFU-DNS-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Die Reaktionen wurden in einem Robocycler Gradient 96 Thermocycler (Stratagene) durchgeführt. Das verwendete Programm ergab: 95° C für 3 Minuten gefolgt von 25 Zyklen von 95° C für 60 Sekunden, 45° C oder 50° C oder 55° C für 75 Sekunden, 72° C für 60 Sekunden gefolgt von einer Haltezeit bei 6° C. Die PKR-Reaktionen wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert, um Hybridisierungstemperaturen zu identifizieren, die ein signifikantes Produkt der erwarteten Größe, ungefähr 430 bp, ergaben. Die 45° C-Reaktion wurde unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) "aufgereinigt", aufgeschlossen mit BgfII und PstI. Das resultierende 278 bp BglII-Pst I-Fragment, das die angenommene T135C-Mutation umfasst, wurde gelgereinigt und in pBBT111 ligatiert, das pUC19-Derivativ, das das stlI-GH-Fusionsgen (oben beschrieben) trägt und das mit BglII und PstI aufgeschlossen und gelgereinigt worden war. Transformanten von dieser Ligatierung wurden anfänglich durch Aufschluss mit BglII und PstI gescreent, und anschließend wurde ein Klon sequenziert, um die Anwesenheit der T135C-Mutation und die Abwesenheit jeder zusätzlichen Mutation zu bestätigen, die potentiell durch die PKR-Reaktion oder durch die synthetischen Oligonukleotide eingeführt sein könnte. Der sequenzierte Klon wurde als die korrekte Sequenz aufweisend befunden.
Die Substitutionsmutation S132C wurde unter Verwendung des oben für T135C beschriebenen Protokolls mit den folgenden Unterschieden konstruiert: mutagenes Rückwärtsoligonukleotid BB29 5'CTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCAGCCATCTTC3' (SEQ ID NO: 35) wurde anstelle von BB28 verwendet, und die PKR-Reaktion mit der Hybridisierungstemperatur von 50° C wurde für das Klonieren verwendet. Von einem von zwei sequenzierten Klonen wurde gefunden, dass er die korrekte Sequenz hatte.
Die Substitutionsmutation T148C wurde unter Verwendung eines analogen Protokolls aber unter Anwendung einer unterschiedlichen Klonierstrategie konstruiert. Das mutagene Vorwärtsoligonukleotid BB30 5'GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACTGCAACTCACACAAC3' (SEQ ID NO: 36) wurde bei PKR zusammen mit dem nichtmutagenen Rückwärtsprimer BB33 5'CGCGGTACCCGGGATCCGATTAGAATCCACAGCT3' (SEQ ID NO: 37) verwendet, der an das am weitesten 3'-liegende Ende der GH-kodierenden Sequenz hybridisiert und den BamHI-Platz direkt stromab überspannt. PKR wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die verwendeten Hybridisierungstemperaturen 46, 51 und 56° C waren. Nach PKR und Gelanalyse wie oben beschrieben wurden die 46 und 51 °C-Reaktionen für das Klonieren zusammengefasst. Diese wurden mit BamHI und BglII aufgeschlossen, gelgereinigt und in pBBT111 kloniert, das mit BamHI und BglII aufgeschlossen, mit Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (Promega) gemäß den den Protokollen des Verkäufers behandelt und gelgereinigt worden war. Transformanten von dieser Ligatierung wurden durch Aufschluss mit BamHI und BglII analysiert, um Klone zu identifizieren, bei denen das mutagene 188 bp BamHI-BglII-PKR-Fragment in der richtigen Orientierung kloniert war. Weil BamHI und BglII kompatible Enden erzeugen, ist dieser Klonierschritt nicht orientierungsspezifisch. Von fünf von sechs getesteten Klonen wurde gezeigt, dass sie korrekt orientiert waren. Einer von diesen wurde sequenziert, und von ihm wurde gezeigt, dass er die gewünschte T148C-Mutation enthält. Die Sequenz des Rests des mutagenen 188bp BamHI-BglII-PKR-Fragments dieses Klons wurde als korrekt bestätigt.
Die Konstruktion der Substitutionsmutation S144C war identisch zu der Konstruktion von T148C, mit den folgenden Ausnahmen. Mutagenes Vorwärtsoligonukleotid BB31 5'GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGAC3' (SEQ ID NO: 38) wurde anstelle von BB30 verwendet. Von zwei von sechs getesteten Klonen wurde gezeigt, dass sie korrekt orientiert waren. Einer von diesen wurde sequenziert, und von ihm wurde gezeigt, dass er die gewünschte S144C-Mutation enthielt. Die Sequenz des Rests des mutagenen 188 bp BamHI-BglII-PKR-Fragments bei diesem Klon wurde als korrekt bestätigt.
Es wurde auch eine Mutation konstruiert, die einen Cysteinrest zu dem natürlichen Carboxyterminus von GH hinzufügte. Die Konstruktion dieser stpI92C bezeichneten Mutation, war ähnlich zu derjenigen von T148C, aber verwendete unterschiedliche Oligonukleotidprimer. Das mutagene Rückwärtsoligonukleotide BB32 5'CGCGGTACCGGATCCTTAGCAGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC3' (SEQ ID NO: 39), das ein TGC-Kodon für ein Cystein zwischen dem Kodon für den carboxyterminalen phe-Rest von GH und dem TAA-Translationsstopkodon einsetzt und den naheliegenden BamHI-Platz überspannt, wurde zusammen mit BB34 5'GTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATT3' (SEQ ID NO: 40) verwendet, das so wie oben beschrieben ist. Nach PKR und Gelanalyse wie oben beschrieben wurde die 46° C-Reaktion zum Klonieren verwendet. Von drei von sechs getesteten Klonen wurde gezeigt, dass sie korrekt orientiert sind. Einer von diesen wurde sequenziert, und von ihm wurde gezeigt, dass er die gewünschte stpI92C-Mutation enthielt. Die Sequenz des Rests des mutagenen 188 bp BamHI-BglII-PKR-Fragments bei diesem Klon wurde als korrekt bestätigt.
Analoge PKR-Mutationserzeugungsprozeduren können verwendet werden, um andere Cysteinmutationen zu erzeugen. Die Wahl von Sequenzen für mutagene Oligonukleotide wird durch die Position diktiert werden, an der der gewünschte Cysteinrest anzuordnen ist, und durch die Nähe der nutzbaren Endonukleaseplätze. Allgemein ist es wünschenswert, die Mutation, d. h. das fehlgepasste Segment nahe der Mitte des Oligonukleotids anzuordnen, um das Hybridisieren des Oligonukleotids an die Matrize zu fördern. Geeignete Hybridisierungstemperaturen für jegliche Oligonukleotide können empirisch bestimmt werden. Es ist für das mutagene Oligonukleotid auch wünschenswert, sich über einen einzigen Restriktionsplatz zu erstrecken, so dass das PKR-Produkt gespalten werden kann, um ein Fragment zu erzeugen, das leicht in einen geeigneten Vektor kloniert werden kann, z. B. einen, der verwendet werden kann, um den Mutanten zu expressivieren, oder das geeignete Restriktionsplätze zum Ausschneiden des mutierten Gens und zum einfachen Klonieren desselben in solch einen Expressionsvektors bereitstellt. Manchmal sind Mutationsplätze und Restriktionsplätze durch Abstände voneinander getrennt, die größer als das sind, was für die Synthese von synthetischen Oligonukleotiden wünschenswert ist. Es ist allgemein wünschenswert, solche Oligonukleotide in der Länge unter 80 Basen zu halten, und Längen von 30 bis 40 Basen sind mehr bevorzugt.
In Fällen, in denen dies nicht möglich ist, können Gene, die für die Mutationserzeugung vorgesehen sind, neu konstruiert oder neu synthetisiert werden, um Restriktionsplätze an geeigneten Positionen einzubauen. Alternativ können auch Variationen der PKR-Mutationserzeugungsprotokolle, die oben verwendet werden, so wie das sogenannte "Megaprimerverfahren" (Bank, S., Sn. 277–286 in Methods in Molecular Biology, Vol. 15; PCR Protocols: Current Methods and Applications herausgegeben von B. A. White, 1993, Humana Press, Inc., Totowa, NJ) oder "Gene Splicing by Overlap Extension" (Norton, R. M., Sn. 251–261, in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, herausgegeben von B. A. White, 1993, Humana Press, Inc., Totowa, NJ) verwendet werden, um solche Mutationen zu konstruieren.
6. Expression von GH in pCYB1
Um GH in E. coli zu expressivieren, wurden pBBT120 (GH-Gen ohne Führersequenz kloniert in den Tac-Expressionsvektor pCYB1) und pBBT114 (GH-Gen mit stlI-Führersequenz kloniert in den Tac-Expressionsvektor pCYB1) in E. coli-Stämme JM109 und W3110 transformiert. Der Ausgangsvektor PCYB1 wurde ebenfalls in JM109 und W3110 transformiert. Den Stämmen wurden die folgenden Bezeichnungen gegeben:

BOB119: JM109 (pCYB1)

BOB130: W3110 (pCYB1)

BOB129: JM109 (pBBT120)

BOB133: W3110 (pBBT120)

BOB121: JM109 (pBBT114)

BOB132: W3110 (pBBT114)
Zur Expression wurden die Stämme über Nacht bei 37° C in Luria Broth (LB) (Sambrook, et al. 1989) gezogen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Diese gesättigten Übernachtkulturen wurden auf ungefähr 0,03 CD bei A₆₀₀ in LB, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, verdünnt und bei 37° C in Schüttelkobeln in einem Rotationsschüttler inkubiert, typischerweise bei 250–300 U/min. Die OD wurde überwacht und IPTG wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, wenn die Kultur-OD ungefähr 0,25–0,5, typischerweise zwischen 0,3 und 0,4 erreichte. Die Kulturen wurden typischerweise 1, 3, 5 und ungefähr 16 Stunden nach der Induktion getestet. Die "ungefähr 16 Stunden"-Zeitpunkte geben Übernachtinkubationen der Kulturen wieder und exakte Zeiten variierten von ungefähr 15 bis 20 Stunden. Beispiele von induzierten und nichtinduzierten Kulturen wurden durch Zentrifugieren pelletiert, in 1X Testpuffer (50 dM Tris-HCl (pH 6,8), 2 % Natriumlaurylsulfat, 10 % Glycerol, 0,1 % Bromphenol blau) unter Zugabe von 1 % β-Mercaptoehtanol resuspendiert. Die Proben wurden für ungefähr 10 Minuten gekocht oder für ungefähr 10 Minuten auf 95° C erhitzt. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, bevor sie auf SDS-Polyakrylamidgele geladen wurden, oder sie wurden bei –20° C gelagert, falls sie nicht sofort laufen gelassen wurden. Die Proben wurden auf vorgefertigten 15 % Polyakrylamid "Ready Gels" (Bio-Rad, Hercules, CA) unter Verwendung eines Ready Gel Cell-Elektrophoresegeräts (Bio-Rad) gemäß den Protokollen des Verkäufers laufengelassen. Typische Gene wurden bei 200 Volt für ungefähr 35–45 Minuten laufengelassen. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt oder wurden durch Western-Blot nach Elektroblotten analysiert. Coomassie-Färbung von ganzen Zelllysaten von den Stämmen BOB129, BOB133, BOB121 und BOB132 zeigte ein Band von ungefähr 22 kD, das zusammen mit dem gereinigten rekombinanten GH-Standard wanderte, der von Research Diagnostics Inc (Flanders, NJ) gekauft wurde. Dieses Band stach bei induzierten Kulturen nach Übernachtinduktion am stärksten vor. Ein Band bei diesem Molekulargewicht wurde jedoch auch bei nichtinduzierten Kulturen dieser selben Stämme beobachtet und konnte auch mit und ohne Induktion bei den BOB119- und BOB130-Kontrollstämmen beobachtet werden, die den Expressionsvektor pCYB1 trugen, dem das GH-Gen fehlte. Um diese Beobachtung aufzuklären, wurden Western-Blot-Analysen an ganzen Zelllysaten von induzierten Kulturen der Stämme BOB119, BOB130, BOB129, BOB133, BOB121 und BOB132 durchgeführt. Western Blots wurden mit polyklonalen anti-Mensch-Kaninchen-GH-Antiserum durchgeführt, das von United States Biological; Katalog-Nr. G 9000-11 (Swampscott, MA) gekauft wurde. Dieser primäre Antikörper wurde in einer 1:5000 Verdünnung verwendet, und seine Bindung wurde mit anti-Kaninchen-IgG-Fc konjugiert an alkalische Phosphatase (Produkt-Nr. 31341), gekauft von Pierce (Rockford, IL), detektiert. Dieser sekundäre Antikörper wurde in einer 1:10,0000 Verdünnung verwendet. Alkalische Phosphataseaktivität wurde unter Verwendung des ImmunoPure MK Fast Red TR/AS-MX Substrate Kit (Pierce, Rockford IL) gemäß den Protokollen des Verkäufers detektiert. Die Western-Blots demonstrierten eindeutig die Anwesenheit von GH in Lysaten von induzierten Kulturen von BOB129, BOB133, BOB121 und BOB132 sowohl 3 als auch 16 Stunden nach der Induktion. Bei den induzierten Kulturen der Kontrollstämme BOB119 und BOB130 wurde kein GH durch Western-Blot zu den Zeitpunkten 3 oder 16 Stunden nach der Induktion detektiert.
In diesen vorläufigen Experimenten wurden die höchsten Ausbeuten an GH von BOB132 W3110(pBBT114) erhalten, bei dem das GH-Gen stromab der stlI-Sekretionssignalsequenz fusioniert ist. Dieser Stamm wurde weiter getestet, um zu bestimmen, ob das Protein in das Periplasma sekretiert wurde, wie zu erwarten war. Eine induzierte Kultur von BOB132 wurde wie oben beschrieben präpariert und osmotischem Schock gemäß der Prozedur von Koshland und Botstein (Cell 20 (1980) S. 749–760) unterworfen. Diese Prozedur bricht die äußere Zellmembran auf und setzt die Inhalte des Periplasmas in das umgebende Medium frei. Nachfolgendes Zentrifugieren trennt die periplasmischen Inhalte, die in dem Überstand von dem Rest der zellzugehörigen Komponenten vorliegen. Bei diesem Experiment wurde die Masse des durch BOB132 synthetisierten GH im Periplasma lokalisiert gefunden. Dieses Resultat ist konsistent mit dem Befund, dass die Masse des gesamten GH ebenfalls in der Größe von dem gereinigten GH-Standard ununterscheidbar ist, was darauf hinweist, dass die stlI-Signalsequenz entfernt worden war. Dies ist ein Hinweis auf Sekretion. Eine größerskalige (500 ml) Kultur von BOB132 wurde ebenfalls induziert, über Nacht kultiviert und osmotischem Schock gemäß der Prozedur unterworfen, die von Hsiung et al., 1986 (Bio/Technology 4, Sn. 991–995) beschrieben ist. Gelanalyse demonstrierte erneut, dass die Masse des produzierten GH löslich, perisplasmisch und in der Größe von dem GH-Standard ununterscheidbar war. Dieses Material konnte auch quantitativ gebunden werden an und eluiert von einer Q-Sepharosesäule unter Verwendung von Bedingungen sehr ähnlich zu denjenigen, die von Becker and Hsiung, 1986 (FEBS Lett 204 Sn. 145–150) für rekombinantes humanes GH beschrieben wurden.
7. Klonieren des humanen GH-Rezeptors
Der humane GH-Rezeptor wurde unter Verwendung von Vorwärtsprimer BB3 und Rückwärtsprimer BB4 durch PKR kloniert. BB3 hatte die Sequenz: 5'-CCCCGGATCCGCCACCATGGATCTCTGGCAGCTGCTGTT-3' (SEQ ID NO: 26). BB4 hatte die Sequenz: 5'CCCCGTCGACTCTAGAGCTATTAAATACGTAGCTC TTGGG-3' (SEQ ID NO: 27). Die Matrize war einzelstrangige cDNS präpariert von humaner Leber (kommerziell erhältlich von CLONTECH Laboratories). Primer BB3 und BB4 enthalten BamHI- bzw. SalI-Restriktionsplätze für Klonierzwecke. Die 100 μl PKR-Reaktionen enthielten 2,5 ng der Einzelstrang-cDNS und 20 picomol von jedem Primer in 1X PKR-Puffer (Perkin-Elmer-Puffer, MgCl₂ enthaltend), eine 200 mikromolare Konzentration von jedem der vier Nukleotide dA, dC, dG und dT, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) und 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase (Stratagene, Inc). Die PKR-Reaktionsbedingungen waren 96° C für 3 Minuten, 35 Zyklen von (95° C, 1 Minute; 58° C für 30 Sekunden; 72° C für 2 Minuten), gefolgt von 10 Minuten bei 72° C. Der verwendete Thermocycler war der Amplitron II Thermal Cycler (Thermolyne). Das ungefähr 1,9 kb PKR-Produkt wurde mit BamHI und SalI aufgeschlossen und mit ähnlich beschnittenem Plasmid pUC19 ligatiert (New England BioLabs). Keiner der Transformanten, die von dieser Ligatierungsreaktion erhalten wurde, enthielt jedoch das 1,9 kb PKR-Fragment. Leung et al. (Nature 1987 330 Sn. 537–543) scheiterten auch daran, cDNS-Klone voller Länge des humanen GH-Rezeptors in pUC 19 zu erhalten. Nachfolgend wurde das PKR-Fragment in einen Vektor mit niedriger Kopieanzahl, pACYC (New England BioLabs), an den BamHI- und SalI-Plätzen in diesem Vektor kloniert. Solche Klone wurden mit vertretbaren Frequenzen erhalten, aber E. Coli-Stämme, die das klonierte PKR-Fragment enthielten, wuchsen schlecht, bildeten dünne und heterogen aussehende Kolonien in der Anwesenheit von Chloramphenicol, das verwendet wird, um nach Erhaltung von pACYC184 zu selektieren.
Das PKR-Fragment wurde gleichzeitig in pCDNA3.1 (+) (Invitrogen) kloniert. Das ungefähr 1,9 kb PKR-Produkt wurde mit BamHI und SalI aufgeschlossen und in die BamHI- und XhoI-Klonierplätze von pCDNA3.1 (+) ligatiert. Nur selten auftretende Transformanten von dieser Ligatierung enthielten die klonierte GH-Rezeptor-cDNS, und von allen von diesen wurde gefunden, dass sie Auslöschungen von Segmenten der rezeptorkodierenden Sequenz enthielten. Einer dieser Klone wurde sequenziert und befunden, eine Auslöschung von 135 bp innerhalb der GH-rezeptorkodierenden Sequenz zu enthalten: Die Sequenz des Rests des Gens war in Übereinstimmung mit derjenigen, die von Leung et at. (1987) berichtet wurde.
8. Klonieren des Kaninchen-GH-Rezeptors
Der Kaninchen-GH-Rezeptor wurde unter Verwendung von Vorwärtsprimer BB2 (oben beschrieben) und Rückwärtsprimer BB36 durch PKR kloniert. BB36 hat die Sequenz 5'CCCCGTCGACTCTAGAGCCATTAGATACAAAGCTCTTGGG3' (SEQ ID NO: 41) und enthält XbaI- und SalI-Restriktionsplätze für Klonierzwecke. Kaninchenleber-poly(A)⁺mRNS wurde von CLONTECH, Inc. gekauft und als Substrat bei Synthese des ersten Strangs von Einzelstrang-cDNS verwendet, um Matrize für PKR-Amplifizierung zu produzieren. Synthese des ersten Strangs von Einzelstrang-cDNS wurde bewirkt unter Verwendung eines 1st Strand cDNA Synthesis Kit für das RT-PCR(AMV)-Kit von Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN) gemäß den Protokollen des Verkäufers. Parallele cDNS-Synthese des ersten Strangs wurde unter Verwendung von zufälligen Hexameren oder BB36 als Primer durchgeführt. Nachfolgende PKR-Reaktionen mit den Produkten der Synthese des ersten Strangs als Matrize wurden mit Primern BB3 and BB36 gemäß dem 1st Strand cDNA Synthesis Kit für das RT-PCR(AMV)Kit-Protokoll und unter Verwendung von 2,5 Einheiten Amplitak-DNS-Polymerase (Perkin-Elmer) und 0,625 Einheiten Pfu-DNS-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Die PKR-Reaktionsbedingungen waren 96° C für 3 Minuten, 35 Zyklen von (95° C, 1 Minute; 58° C für 30 Sekunden; 72° C für 2 Minuten), gefolgt von 10 Minuten bei 72° C. Der verwendete Thermocycler war der Amplitron II Thermal Cycler (Thermolyne). Das erwartete ungefähr 1,9 kb PKR-Produkt wurde in PKR-Reaktionen beobachtet, die die mit zufälligem Hexamer geprimte oder mit BB36 geprimte cDNS als Matrize verwendeten. Die mit zufälligem Hexamer geprimte cDNS wurde in nachfolgenden Klonierexperimenten verwendet. Sie wurde mit BamHI und XbaI aufgeschlossen und über ein 1,2 % Agarosegel auslaufen gelassen. Dieser Aufschluss erzeugt zwei Fragmente (ungefähr 365 bp und ungefähr 1600 bp), weil das Kaninchen-GH-Rezeptorgen einen inneren BamHI-Platz enthält. Beide Fragmente wurden gelgereinigt. Anfänglich wurde das ungefähr 1600 bp BamHI-XbaI-Fragment in pCDNA3.1 (+) kloniert, das mit denselben zwei Enzymen aufgeschlossen worden war. Diese Klone wurden leicht mit angemessenen Frequenzen erhalten und zeigten keinen Hinweis auf Auslöschungen, wie durch Restriktionsaufschlüsse und nachfolgendes Sequenzieren bestimmt wurde. Um einen Klon voller Länge zu erzeugen, wurde eines der Plasmide, die das 1600 bp BamHI-XbaI-Fragment (pCDNA3.1(+):: rab-ghr-2A) enthielten, mit BamHI aufgeschlossen, mit Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (Promega) gemäß den Protokollen des Verkäufers behandelt, gelgereinigt und mit dem gelgereinigten ungefähr 365 bp BamHI-Fragment ligatiert, das den 5'-Anteil des Kaninchen-GH-Rezeptorgens enthielt. Transformanten von dieser Ligatierung wurden ausgewählt und durch Restriktionsaufschluss und PKR analysiert, um die Anwesenheit des ungefähr 365 pb Fragments zu bestätigen und um seine Orientierung relativ zu dem distalen Segment des Kaninchen-GH-Rezeptorgens zu bestimmen. Drei von vier analysierten Klonen wurden als das in der richtigen Orientierung für die Rekonstitution des Kaninchen-GH-Rezeptorgens klonierte ungefähr 365 bp Fragment befunden. Das Fehlen von Komplikationen beim Klonieren des Kaninchengens in E coli im Gegensatz zu dem humanen Gen ist konsistent mit den Resultaten von Leung et al. (1987), die bereits leicht cDNS-Klone voller Länge für das Kaninchen-GH-Rezeptorgen erhielten, aber nicht in der Lage waren, eine cDNS voller Länge des humanen Gens in E coli zu klonieren. Der Kaninchen-GH-Rezeptor kann in Tests mit humanem GH als Ligant verwendet werden, da gezeigt worden ist, dass das humanes GH den Kaninchenrezeptor mit einer hohen Affinität bindet (Leung et al. 1987). Plasmide, die den klonierten Kaninchen-GH-Rezeptor enthalten, sollten sequenziert werden, um einen Kaninchen-GH-Rezeptor-cDNS mit der richtigen Sequenz vor der Verwendung zu identifizieren.
9. Konstruktion eines chimären humanen/Kaninchen-GH-Rezeptorgens
Als Alternative zu dem Kaninchenrezeptor konnte ein chimärer Rezeptor konstruiert werden, der die extrazelluläre Domäne des humanen Rezeptors mit den Transmembran- und Cytoplasmadomänen des Kaninchenrezeptors kombiniert. Solch ein chimärer Rezeptor konnte durch Rekombinieren des humanen und Kaninchengens an dem einmaligen NcoI-Platz konstruiert werden, der bei beiden vorliegt (Leung et al. 1987). Solch ein Rekombinant, der das humane Gensegment 5'-angeordnet zu dem oder "stromauf von dem NcoI-Platz und das Kaninchengensegment 3' zu dem oder "stromab" von dem NcoI-Platz enthält, würde einen chimären Rezeptor von präzise dem gewünschten Typ kodieren, mit der extrazellulären Domäne des humanen Rezeptors zusammen mit den transmembranen und cytoplasmischen Domänen des Kaninchenrezeptors. Dies würde eine Analyse der Wechselwirkung von GH, GH-Mutanten und PEGylierten GH-Mutanten mit dem natürlichen Rezeptorbindungsplatz erlauben, aber würde die Notwendigkeit des Klonierens des humanen GH-Rezeptors in voller Länge in E. coli vermeiden.
Die GH-Mutanten können in einer Vielzahl von Expressionssystem expressiviert werden, so wie Bakterien-, Hefe- oder Insektenzellen. Vektoren zum Expressivieren von GH-Mutanten in diesen Systemen sind kommerziell von einer Anzahl von Lieferanten verfügbar, wie beispielsweise Novagen, Inc. (pET15b für die Expressivierung in E. coli), New England Biolabs (pC4BI für die Expressivierung in E. coli) Invitrogen (pVL1392, pVL1393 und pMELBAC für die Expressivierung in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirusvektoren, Pichiavektoren für die Expressivierung in Hefezellen und pCDNA3 für die Expressivierung in Säugetierzellen). GH ist in E. coli erfolgreich als cytoplasmisches Protein und als sekretiertes periplasmisches Protein produziert worden, unter Verwendung der E. coli OmpA- oder STII-Signalsequenzen, um die Sekretion des Protein in den Periplasmaraum zu fördern (Chang et al., 1987; Hsiung et al., 1986). Es ist bevorzugt, dass die GH-Mutanten als sekretierte Proteine expressiviert werden, so dass sie keinen N-terminalen Methioninrest enthalten, der bei dem natürlichen humanen Protein nicht vorliegt. Zur Expression in E. coli können DNS-Sequenzen, die GH oder GH-Mutanten kodieren, in E. coli-Expressionsvektoren kloniert werden, so wie pET15b, das den starken T7-Promoter verwendet oder pCYBI, das den TAC-Promoter verwendet. Hinzufügen von IPTG (Isopropylthiogalaktopyranosid, erhältlich von Sigma Chemical Company) zu dem Wachstumsmedium kann Expressivierung des Proteins induzieren. Rekombinantes GH wird in den periplasmischen Raum sekretiert werden, aus dem es freigesetzt werden kann durch und folgend auf osmotischen Schock gereinigt werden kann (Becker und Hsiung, 1986). Das Protein kann unter Anwendung anderer chromatographischer Methoden weiter gereinigt werden, so wie Ionenaustausch-, hydrophobe Wechselwirkungs-, Größenausschluss- und Umkehrphasenchromatographie, von denen alle dem Fachmann wohl bekannt sind (siehe z. B. Becker and Hsiung, 1986). Proteinkonzentrationen können unter Verwendung kommerziell erhältlicher Proteintestkits bestimmt werden, so wie jener, die von BioRad Laborstories (Richmond, CA) verkauft werden. Wenn die GH-Proteine unlöslich sind, wenn sie in E. coli expressiviert werden, können sie unter Verwendung von Prozeduren neu gefaltet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind (siehe Cox et al., 1994 und die Weltpatentanmeldungen WO9422466 und WO9412219 ).
Alternativ können die Proteine in Insektenzellen als sekretierte Proteine expressiviert werden. Das Expressivierungsplasmid kann modifiziert werden, um die GH-Signalfrequenz zu enthalten, um die Sekretion des Proteins in das Medium zu fördern. Die cDNS können in kommerziell verfügbare Vektoren kloniert werden, z. B. pVL1392 von Invitrogen, Inc., und können verwendet werden, um Insektenzellen zu infizieren. Das GH und die GH-Mutanten können von konditionierten Medien unter Verwendung konventioneller Chromatographieprozeduren aufgereinigt werden. Antikörper gegen rhGH können in Verbindung mit Western-Blots verwendet werden, um Fraktionen zu lokalisieren, die das GH-Protein bei der Chromatographie enthalten. Alternativ können Fraktionen, die GH enthalten, unter Verwendung von ELISA-Tests identifiziert werden.
Die GH-Varianten mit zusätzlichem Cystein können ebenfalls als intrazelluläre oder sekretierte Proteine in eukaryotischen Zellen, so wie Hefezellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen expressiviert werden. Vektoren für das Expressivieren der Proteine und Verfahren zum Durchführen solcher Experimente sind in Katalogen von verschiedenen kommerziellen Versorgerfirmen, so wie Invitrogen, Inc., Stratagene, Inc. und ClonTech, Inc beschrieben. Das GH und die GH-Mutanten können unter Verwendung konventioneller Chromatographieprozeduren gereinigt werden.
Biologische Aktivität der GH-Mutanten kann unter Verwendung einer Zelllinie gemessen werden, die sich als Antwort auf GH vermehrt. Fuh et al. (1992) erzeugten eine auf GH ansprechende Zelllinie durch stabiles Transformieren einer Myeloidleukämiezelllinie, FDC-P1, mit einem chimären Rezeptor, der die extrazelluläre Domäne des Kaninchen-GH-Rezeptors fusioniert an dem Maus-G-CSF-Rezeptor aufweist. Diese Zelllinie vermehrt sich als Antwort auf GH mit einer halbmaximalen effektiven Konzentration (EC₅₀) von 20 picomolar. Eine ähnliche Zelllinie kann unter Verwendung der publizierten Sequenzen dieser Rezeptoren und molekularbiologischen Standardtechniken konstruiert werden (Fuh et al., 1992). Alternativ kann die extrazelluläre Domäne des humanen GH-Rezeptors mit dem Maus-G-CSF-Rezeptor unter Verwendung der publizierten Sequenzen dieser Rezeptoren und molekularbiologischen Standardtechniken fusioniert werden. Transformierte Zellen, die den chimären Rezeptor expressivieren, können aufgrund der Fähigkeit von transformierten Zellen, radiomarkiertes GH zu binden, unter Verwendung von markiertem GH, durch Durchflusscytometrie identifiziert werden, oder aufgrund der Fähigkeit von transformierten Zellen, sich als Antwort auf zugegebenes GH zu vermehren. Gereinigtes GH und gereinigte GH-Mutanten können in Zellvermehrungstests unter Verwendung von Zellen gestestet werden, die den chimären Rezeptor expressivieren, um die spezifischen Aktivitäten der Proteine zu messen. Zellen können in 96 Loch-Platten mit verschiedenen Konzentrationen an GH oder GH-Mutanten plattiert werden. Nach 18 Stunden werden die Zellen für 4 Stunden mit ³H-Thymidin behandelt und zur Bestimmung der eingebauten Radioaktivität geerntet. Die EC₅₀ kann für jeden Mutanten bestimmt werden. Tests sollten für jeden Mutanten unter Verwendung von 3-fachen Löchern für jeden Datenpunkt mindestens 3-fach durchgeführt werden. GH-Mutanten, die ähnlich optimale Niveaus an Stimulation und EC₅₀-Werte vergleichbar mit oder größer als GH vom Wildtyp zeigen, sind bevorzugt.
GH-Mutanten, die in vitro-Aktivität beibehalten, können unter Verwendung eines Cysteinreaktiven 8 kDa PEG-Maleimids (oder PEG-Vinylsulfons) kommerziell erhältlich von Shearwater, Inc. PEGyliert werden. Allgemein werden Verfahren zum PEGylieren dieser Proteine mit diesen Reagenzien mit kleineren Modifikationen ähnlich denjenigen sein, die in den Weltpatentanmeldungen WO 9412219 und WO 9422466 und der PCT-Anmeldung US95/06540 beschrieben sind. Die rekombinanten Proteine müssen partiell mit Dithiothreitol (DTT) reduziert werden, um optimale PEGylierung des freien Cysteins zu erreichen. Obwohl das freie Cystein nicht in eine Disulfidbindung verwickelt ist, ist es relativ unreaktiv gegenüber Cystein-reaktivem PEG solange dieser teilweise Reduktionsschritt nicht durchgeführt wird. Die Menge an DTT, die erforderlich ist, um jeden Mutanten partiell zu reduzieren, kann unter Verwendung eines Bereichs an DTT-Konzentrationen empirisch bestimmt werden. Typischweise ist ein 5 bis 10-facher molarer Überschuss an DTT für 30 Minuten bei Raumtemperatur ausreichend. Partielle Reduzierung kann durch eine leichte Verschiebung bei dem Elutionsprofil des Proteins von einer Umkehrphasensäule detektiert werden. Es muss darauf geachtet werden, dass Protein nicht zu überreduzieren und nicht zusätzlich Cysteinreste zu exponieren. Überreduktion kann durch Umkehrphasen-HPLC (das Protein wird eine Rückhaltezeit ähnlich dem vollständig reduzierten und denaturierten Protein aufweisen) und durch das Auftreten von GH-Moleküle, die zwei PEG enthalten (detektierbar durch Molekulargewichtsänderung bei SDS-PAGE), detektiert werden. GH vom Wildtyp kann als Kontrolle dienen, da es unter ähnlichen Bedingungen nicht PEGylieren sollte. Überschüssiges DTT kann durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von Spinsäulen entfernt werden. Partiell reduziertes Protein kann mit verschiedenen Konzentrationen an PEG-Maleimid (PEG: Protein-Molverhältnisse von 1:1, 5:1, 10:1 und 50:1) reagiert werden, um das optimale Verhältnis der beiden Reagenzien zu bestimmen. PEGylierung des Proteins kann durch eine Molekulargewichtsverschiebung unter Verwendung von Natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) überwacht werden. Die niedrigste Menge an PEG, die signifikante Mengen an einfach-PEGyliertem Produkt ergibt, ohne zweifach-PEGyliertes Produkt zu ergeben, wird als optimal betrachtet (80 % Umwandlung in einfach-PEGyliertes Produkt wird als gut angesehen). Allgemein kann einfach-PEGyliertes Protein von den nicht-PEGyliertem Protein und unreagiertem PEG durch Größenausschluss- oder Ionenaustauschchromatographie aufgereinigt werden. Das gereinigte PEGylierte Protein kann in dem oben beschriebenen Zellvermehrungstest gestestet werden, um seine spezifische Aktivität zu bestimmen.
Die obigen Experimente werden die Identifizierung von Aminosäuren in der B-C-Schleife, der C-D-Schleife oder dem N-terminalen Ende der A-B-Schleife bei GH erlauben, die zu Cysteinresten verändert werden, PEGyliert werden und ihre biologische in vitro-Aktivität beibehalten können. Diese Mutanten können in Tierkrankheitsmodellen getestet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Experimente können durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass das PEG-Molekül an dem richtigen Platz an das Protein angehängt ist. Dies kann bewirkt werden durch proteolytischen Aufschluss des Proteins, Aufreinigung des PEG-Peptids (das ein großes Molekulargewicht haben wird) durch Größenausschluss-, Ionenaustauch- oder Umkehrphasenchromatographie, gefolgt von Aminosäurensequenzieren oder Massenspektroskopie. Die PEG-gekoppelte Aminosäure wird bei dem Aminosäuresequenzierlauf als leer erscheinen.
Die pharmakokinetischen Eigenschaften des PEG-GH-Proteins können wie folgt oder wie in der Weltpatentanmeldung WO9422466 bestimmt werden. Paare von Ratten oder Mäusen können eine intravenöse Bolusinjektion des Testproteins erhalten. Kreislaufniveaus des Proteins werden über den Verlauf von 24 Stunden durch Entfernen einer kleinen Blutprobe von den Tieren zu den gewünschten Zeitpunkten gemessen. Kreislaufniveaus der Testproteine können unter Verwendung von ELISA-Tests quantifiziert werden. Zusätzliche Experimente können unter Verwendung der subkutanen Route, um die Proteine zu verabreichen, durchgeführt werden. Ähnliche Experimente sollten mit dem nicht-PEGylierten Protein durchgeführt werden, um als Kontrolle zu dienen. Diese Experimente werden ergeben, ob das Anhängen eines PEG-Reagens an das Protein seine pharmakokinetischen Eigenschaften verändert. Kovalente Modifikationen des Proteins mit PEG sollte die Kreislaufhalbwertszeit des Proteins gegenüber dem nicht-PEGylierten Protein erhöhen. Größere PEG-Moleküle und/oder Anhänge von mehreren PEG-Molekülen sollten die Kreislaufhalbwertszeit länger als kleinere PEG-Moleküle verlängern.
PEG-GH-Proteine können in Nagetiermodellen von Wachstumshormondefizienz (Cox et al., 1994) und Kachexie (Tomas et al., 1992; Read et al., 1992) getestet werden, um optimale Dosierungspläne zu bestimmen und Wirksamkeit zu demonstrieren. Diese Studien können PEG-Moleküle unterschiedlicher Größe, z. B. 8 und 20 kDa, und Dosierungspläne auswerten, um die optimale PEG-Größe und den optimalen Dosierungsplan zu bestimmen. Es wird erwartet, dass das größere PEG-Molekül Kreislaufhalbwertszeit stärker erhöht als das kleinere PEG-Molekül und eine weniger häufige Dosierung erfordert. Große Proteine haben jedoch potentiell reduzierte Verteilungsvolumen in vivo; so ist es möglich, dass ein 20 kDa PEG angehängt an GH seine Bioverfügbarkeit begrenzt, was seine Wirksamkeit reduziert. Nagetiermodelle werden die Bestimmung erlauben, ob dies der Fall ist. Nachdem die optimalen Dosierungspläne und PEG-Größen bestimmt sind, kann die Wirksamkeit von PEG-GH mit GH in den Tiermodellen verglichen werden. Während alle PEG-GH-Proteine, die GH-Aktivität aufweisen, in die Erfindung eingeschlossen sind, sind die bevorzugten PEG-GH-Proteine jene, die das Wachstum ähnlich oder überlegen gegenüber GH fördern, aber die weniger häufig verabreicht werden können. PEG-GH sollte wirksamer sein als GH, wenn beide unter Verwendung der weniger häufigen Dosierungspläne verabreicht werden.
Ein GH-Defizienzmodell, das verwendet werden kann, ist eine hypophysektomisierte Ratte. In diesem Modell stimuliert GH Körpergewichtszusatz und Knochen- und Knorpelwachstum (Cox et al., 1994). Hypophysektomisierte Ratten können von Charles River gekauft werden. Ratten kann GH, PEG-GH oder Placebo injiziert werden, und Gewichtszunahmen können täglich über einen Zeitraum von 10–14 Tagen gemessen werden. Zum Zeitpunkt der Tötung kann die tibiale Epiphysenweite als Maß für das Knochenwachstum bestimmt werden. Experimentelle Methoden zum Durchführen dieser Studien sind in Cox et al. (1994) beschrieben.
Die Wirksamkeit von PEG-GH in Nagetierkachexiemodellen kann in ähnlicher Weise getestet werden. Tägliche Verabreichung von Dexamethason über osmotische Pumpen oder durch subkutane Injektion kann verwendet werden, um Gewichtsverlust zu induzieren (Tomas et al., 1992; Read et al., 1992; PCT-Patentanmeldung US95/06540 ).
Alle zitierten Dokumente werden durch Bezugnahme hierein eingeschlossen.
Die hier offenbarten Proteinanaloge können für die bekannten therapeutischen Verwendungen des nativen Proteins in im Wesentlichen denselben Formen und Dosierungen verwendet werden, die sämtlich dem Stand der Technik bekannt sind.
Während die beispielhaft bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hier besonders beschrieben sind, wird der Fachmann andere Änderungen, Modifikationen, Zusätze und Anwendungen erkennen, als sie hier speziell beschrieben sind, und mag die bevorzugten Ausführungsformen und Verfahren anpassen, ohne von dem Geist dieser Erfindung abzuweichen.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Wachstumshormoncysteinvariante (SEQ ID NO: 1), wobei die Variante die vier natürlichen Cysteine C53, C165, C182 und C189 enthält, und wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: einer Aminosäure, die in dem N-terminalen Ende der A-B-Schleife entsprechend den Aminosäuren 34–52 von SEQ ID NO: 1 angeordnet ist, einer Aminosäure, die in der B-C-Schleife angeordnet ist, einer Aminosäure, die in der C-D-Schleife angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den ersten drei oder den letzten drei Aminosäuren in Helix A angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den ersten drei oder den letzten drei Aminosäuren in Helix B angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den ersten drei oder den letzten drei Aminosäuren in Helix C angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den ersten drei oder letzten drei Aminosäuren in Helix D angeordnet ist, einer Aminosäure, die in den Aminosäuren angeordnet ist, die Helix A vorangehen, und einer Aminosäure, die in den Aminosäuren angeordnet ist, die Helix D folgen; wobei die Variante die Fähigkeit hat, in vitro-Vermehrung einer Zelllinie zu verursachen, die sich als Antwort auf Wachstumshormon vermehrt.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: F1, T3, P5, E33, A34, K38, E39; Q40, S43, Q46, N47, P48, Q49, T50, S51, A98, N99, S100, G104, A105, S106, E129, D130, G131, S132, P133, T135, G136, G137, K140, Q141, T142, S144, K145, D147, T148, N149, S150, H151, N152, D153, S184, E186, G187, S188 und G190.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, welche in der Wachstumshormonregion angeordnet ist, die Helix A vorangeht.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei ein Cysteinrest für F1 subsituiert ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 3, wobei ein Cysteinrest für T3 substituiert ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 3, wobei ein Cysteinrest für P5 substituiert ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in der Wachstumshormonregion angeordnet ist, welche Helix D folgt.
Cysteinvariante nach Anspruch 7, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus S184, E186, G187, S188 und G190 besteht.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in dem N-terminalen Ende der A-B-Schleife von Wachstumshormon entsprechend den Aminosäuren 34 bis 52 von SEQ ID NO: 1 angeordnet ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 9, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: A34, K38, E39, Q40, S43, Q46, N47, P48, Q49, T50 und S51.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in der C-D-Schleife von Wachstumshormon angeordnet ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 11, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus D130, G131, S132, P133, T135, G136, Q137, K140, Q141, T142, S144, K145, D147, T148, N149, S150, H151, N152 und D153.
Cysteinvariante nach Anspruch 11, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus S132, P133, Q137, K140, S144 und T148.
Cysteinvariante nach Anspruch 11, wobei ein Cysteinrest für P133 substituiert ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 11, wobei ein Cysteinrest für S132 substituiert ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante ein Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in der B-C-Schleife von Wachstumshormon angeordnet ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 16, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus A98, N99, S100, G104 und A105.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in einer Wachstumshormonregion angeordnet ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den ersten drei Aminosäuren in Helix A oder den letzten drei Aminosäuren in Helix A besteht.
Cysteinvariante nach Anspruch 18, wobei ein Cysteinrest für E33 substituiert ist.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in einer Wachstumshormonregion angeordnet ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den ersten drei Aminosäuren in Helix B oder den letzten drei Aminosäuren in Helix B besteht.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in einer Wachstumshormonregion angeordnet ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den ersten drei Aminosäuren in Helix C oder den letzten drei Aminosäuren in Helix C besteht.
Cysteinvariante nach Anspruch 21, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus S106 und E129.
Cysteinvariante nach Anspruch 1, wobei die Variante einen Cysteinrest aufweist, der für eine Aminosäure substituiert ist, die in einer Wachstumshormonregion angeordnet ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den ersten drei Aminosäuren in Helix D oder den letzten drei Aminosäuren in Helix D besteht.
Cysteinvariante nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei der substituierte Cysteinrest mit einer Cystein-reaktiven Gruppe modifiziert ist.
Cysteinvariante nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Cysteinvariante mit Polyethylenglykol (PEG) modifiziert ist.
Cysteinvariante nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei der substituierte Cysteinrest mit Polyethylenglykol (PEG) modifiziert ist.
Wachstumshormoncysteinvariante nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung einer Wachstumshormoncysteinvariante wie durch einen der Ansprüche 1 bis 26 definiert bei der Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren des Stoffwechsels von Knochen, Knorpel oder Muskel, zum Stimulieren des körperlichen Wachstums während der Kindheit, zum Behandeln von Kleinwuchs resultierend aus Wachstumshormonmangel und Niereninsuffizienz in der Kindheit oder zum Behandeln von Kachexie bei AIDS-Patienten oder mit anderen Erkrankungen verbundener Kachexie.