-
Die
chirurgische Implantierung von prothetischen Vorrichtungen (Prothesen)
in Menschen und andere Säuger
wird mit zunehmender Häufigkeit
durchgeführt.
Solche Prothesen schließen
beispielhaft Herzklappen, Gefäßtransplantate,
Harnblasen, Herzblasen, Linksherz-Entlastungssysteme und Ähnliches
ein. Die Prothesen können
aus natürlichen
Geweben, anorganischen Materialien, synthetischen Polymeren oder
Kombinationen daraus hergestellt sein. Beispielsweise bestehen mechanische
Herzklappenprothesen typischerweise aus steifen Materialien, wie
Polymeren, Materialien auf Kohlenstoffbasis und Metallen. Klappen-Bioprothesen werden
andererseits typischerweise entweder aus Schweine-Aortaklappen oder
Rinder-Perikard hergestellt.
-
Prothesen
aus natürlichem
Gewebe werden wegen bestimmter klinischer Vorteile gegenüber mechanischen
Vorrichtungen bevorzugt. Zum Beispiel benötigen Prothesen aus Gewebe
in der Regel keine Routine-Antikoagulationsbehandlung. Wenn darüber hinaus
Gewebe-Prothesen versagen, so degenerieren sie in der Regel allmählich, was
Monate oder sogar Jahre dauern kann. Bei mechanischen Vorrichtungen
andererseits tritt üblicherweise
plötzlicher
Vollausfall auf.
-
Zwar
kann jede prothetische Vorrichtung aufgrund von Mineralisation z.B.
Verkalkung versagen, bei Gewebe-Prothesen
ist diese Ursache für
Prothesendegeneration jedoch von besonderer Bedeutung. Verkalkung
wird bei Kindern für
50 % der Versagensfälle
von bioprothetischen Herzklappenimplantaten innerhalb von 4 Jahren
nach Implantation verantwortlich gemacht. Bei Erwachsenen tritt
dieses Phänomen
in etwa 20 % der Versagensfälle innerhalb
von 10 Jahren nach Implantation auf. Siehe beispielsweise Schoen
et al., J. Lab. Invest., 52, 523-532
(1985). Trotz der klinischen Relevanz des Problems versteht man
die Pathogenese der Verkalkung nicht völlig. Darüber hinaus ist derzeit offenbar
keine wirksame Therapie bekannt.
-
Als
Ausgangspunkt für
Mineralisation und insbesondere Verkalkung wurden z.B. in erster
Linie Zelltrümmer
in der Gewebematrix von Herzklappenbioprothesen sowohl aus Perikard
als auch aus Aortenwurzel festgestellt. Bioprothetisch vernetzte
Gewebeverkalkung wird auch auf die Gegenwart von alkalischer Phosphatase
zurückgeführt, die
mit Zelltrümmern
verbunden ist und möglicherweise
in Implantatgewebe aus dem Blut akkumuliert. Andere wiederum meinen,
dass Mineralisation eine Folge von Phospholipiden in den Zelltrümmern ist,
die Kalzium abtrennen und den Kernbildungskeim von Apatit (Kalziumphosphat)
bilden.
-
Unabhängig von
den Mechanismen, die zu Mineralisation in Bioprothesen führen, ist
Mineralisation und insbesondere Verkalkung die häufigste Ursache für klinisches
Versagen von Herzklappenbioprothesen, die aus Schweineaortenklappen
oder Rinderperikard hergestellt wurden. Bei menschlichen Aortenhomotransplantaten
wurde ebenfalls pathologische Verkalkung festgestellt, sowohl bei
Klappengewebe als auch an der angrenzenden Aortenwand, wenn auch
mit langsamerer Geschwindigkeit als bei Herzklappenbioprothesen. Pathologische
Verkalkung, die zu Klappenversagen führt, z.B. in der Form von Stenose
und/oder Regeneration, erfordert Reimplantation. Daher ist die Verwendung
von Herzklappenbioprothesen und Homotransplantaten begrenzt, weil
diese Gewebe zu Verkalkung neigen. Bei Patienten im Kindesalter
wurde sogar beschleunigte Verkalkung festgestellt, so dass die Verwendung
von Herzklappenbioprothesen für
diese Gruppe kontraindiziert ist.
-
Seit
dieses Problem erkannt wurde, wurden in der Literatur mehrere mögliche Verfahren
beschrieben, um Mineralisation von Herzklappenbioprothesen zu verringern
oder zu verhindern. Im allgemeinen wird bei diesen Verfahren die
Klappenbioprothese vor der Implantation mit verschiedenen Substanzen
behandelt. Die als wirksam erwiesenen Substanzen umfassen sulfatierte
aliphatische Alkohole, Phosphatester, Aminodiphosphonate, Carbonsäurederivate
und verschiedene Tenside. Dennoch hat sich keines dieser Verfahren
als völlig erfolgreich
erwiesen, das Problem von Mineralisation nach Implantation zu lösen.
-
"Chemical Modification
of Implantable Biologic Tissue for Anti-calcification" ASAIO Journal, Bd.
40, Nr. 3, 1. Juli 1994, Seiten 377-382, XP000498225 ISSN: 1058-2916
ist ein Artikel, der chemische Modifizierung biologischen Schweinegewebes
durch Koppelung von sulfonierten Polyethylenoxiden beschreibt.
-
EP-A-0364517
und EP-A-0172716 lehren die Behandlung von Bioprothesen mit ionischen
und nicht-ionischen Reinigungsmitteln zur Verhinderung von Verkalkung.
-
WO84101879
lehrt die Behandlung von implantierbarem biologischem Gewebe mit
einer wirksamen Menge eines Tensids, um die Verkalkung des implantierten
Gewebes zu reduzieren.
-
Gegenwärtig existieren
keine Herzklappenbioprothesen, die in vivo nicht mineralisieren
können.
Es gibt zwar ein Verfahren, das Aminölsäure (AOA) als Agens verwendet,
um zu verhindern, dass die Klappensegel aus Schweineaortenwurzel-Gewebe,
die als Herzklappenbioprothese verwendet werden, verkalken, aber AOA
hat sich nicht als wirksam erwiesen, die Mineralisation der Aortenwand
bei solchen Vorrichtungen zu verhindern. Folglich kann es vorkommen,
dass solche Vorrichtungen entfernt werden müssen.
-
Demgemäß besteht
ein Bedarf an der Bereitstellung von Langzeit-Widerstandsfähigkeit
gegen Verkalkung von Herzklappenbioprothesen und anderen implantierbaren
medizinischen Vorrichtungen aus Gewebe, die zu pathologischer Verkalkung
in vivo neigen.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um das Niveau
der Gewebemineralisation in einer implantierbaren medizinischen
Vorrichtung aus Gewebe zu verringern. Bevorzugt reduziert das Verfahren das
Niveau der Mineralisation von Klappenbioprothesen und insbesondere
die pathologische Verkalkung von Herzklappenbioprothesen.
-
Die
Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Herstellung einer implantierbaren
vaskulären
Bioprothese aus Gewebe, wobei das Verfahren umfasst Gewinnen von
Gewebe, welches einem Tier entnommen wurde; und Entfernen von Zelltrümmern aus
dem entnommenen Gewebe mittels eines Verfahrens, das folgendes umfasst:
Kontaktieren des entnommenen Gewebes mit einer Zusammensetzung,
die wenigstens ein Oxidationsmittel enthält, bevor eine beträchtliche
Zersetzung des entnommenen Gewebes eintritt; und Waschen des mit dem
Oxidationsmittel kontaktierten Gewebes, um wenigstens einen Teil
des Oxidationsmittels zu entfernen; und wobei das Oxidationsmittel
ausgewählt
wird aus der Gruppe bestehend aus Natriumhypochlorit, Perameisensäure, Perjodsäure und
Kombinationen daraus.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung weist die implantierbare medizinische Vorrichtung
aus Gewebe, das mit einem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt
wurde, verbesserte Anti-Mineralisationseigenschaften
auf und/oder längere
Widerstandsfähigkeit
gegen pathologische Verkalkung in vivo als andere Verfahren zur
Reduzierung und/oder Verhinderung von Mineralisation. Eine Beschränkung auf
die Lehre ist zwar nicht gewünscht,
jedoch kann das erfindungsgemäße Verfahren
Enzyme und andere im Gewebe vorhandene Proteine (z.B. Kalzium bindende
Proteine) bei der Ausübung
ihrer spezifischen Funktionen hemmen. Diese Proteine sind im allgemeinen
an Phosphat- und Kalzium-Metabolismus
beteiligt und können für die Bildung
von Kalziumphosphat, dem Hauptbestandteil mineralisierten Gewebes,
wichtig sein. Eine Behandlung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann solche Proteinaktivität
wirksam inaktivieren und die Akkumulation von Phosphaten und/oder
Kalzium im Gewebe nach Implantation reduzieren und somit die Auslösung des
Mineralisationsprozesses verringern.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
können
z.B. unmittelbar nach Herausschneiden von Gewebe aus einem Tier
oder nach Einsetzen des Gewebes in die Vorrichtung Behandlungsschritte
durchgeführt
werden. Eine bevorzugte Vorrichtung ist eine Herzklappenbioprothese.
Das Verfahren reduziert Mineralisation bei Herzklappensegeln und
Klappengerüsten,
z.B. bei Aortenwänden,
nach Implantierung der Vorrichtung in Patienten. Reduzierung der
Mineralisation sowohl bei Herzklappensegeln als auch Aortenwänden ermöglicht verbesserte
Leistung der Vorrichtung über
die Lebensdauer des Implantats.
-
Bevorzugt
ist die implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe eine
Herzklappe, die gewonnen werden kann aus Schweine-Aortenwurzelgewebe,
Rinder-Aortenwurzelgewebe,
Schweine-Herzbeutel, Rinder-Herzbeutel,
Rindervenen, Schweinevenen, Rinderarterien sowie Schweinearterien.
-
Die
Zusammensetzung, die ein Oxidationsmittel enthält, enthält ferner bevorzugt wenigstens
einen Chelatbildner. Beispiele für
geeignete Chelatbildner umfassen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),
Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure (EGTA), Zitronensäure, ihre
Salze sowie Kombinationen davon. Die Zusammensetzung, die ein Oxidationsmittel
enthält,
enthält
ferner bevorzugt auch einen Puffer (d. h. Pufferagens). Bevorzugt
weist der Puffer einen pKa-Wert von etwa 7,0 bis etwa 7,5 auf. Noch
bevorzugter ist der Puffer ein organischer Puffer wie z.B. HEPES,
TES, BES, MES, MOPS oder PIPES. Verschiedene Kombinationen von Oxidationsmitteln,
Puffern und Chelatbildnern können
in solchen Zusammensetzungen verwendet werden.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird Gewebe, z.B. Schweineaortenwurzel-Gewebe, von Tierherzen disseziert
und dann auf Eis transportiert, um autolytische Gewebsschädigung zu
verringern und Bakterienwachstum während des Transports zu minimieren.
Bevorzugt kann das Gewebe entweder bei der Schlachtung oder kurz
danach, bevor beträchtliche
Gewebeschädigung
und/oder -Zersetzung auftreten kann, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
behandelt werden. Zum Beispiel kann das Gewebe in eine Salzlösung eingetaucht
werden (bevorzugt Kochsalz mit einer Konzentration von etwa 0,8
bis etwa 1,0 Gew.-%), die etwa 20 Millimol (mM) bis etwa 30 mM EDTA
oder EGTA enthält,
etwa 10 mM bis etwa 30 mM HEPES, und eine Konzentration von Natriumhypochlorit
(5% Bleichkonzentratlösung)
von wenigstens etwa 1:400 Verdünnung
oder nicht mehr als etwa 1:50 Bleichmittelkonzentrat (die im allgemeinen
etwa 2 mM bis etwa 20 mM entspricht). Das Gewebe wird bei Raumtemperatur
in der Bleichlösung
getaucht und zwar bevorzugt für
einen Zeitraum von wenigstens etwa 24 Stunden und noch bevorzugter
nicht mehr als etwa 36 Stunden.
-
Bevor
oder nachdem das Gewebe mit der das Oxidationsmittel enthaltenden
Zusammensetzung kontaktiert wird, wird das Gewebe bevorzugt mit
einer Reinigungszusammensetzung kontaktiert. Noch bevorzugter umfasst
dies ein Kontaktieren des Gewebes mit einer ersten Reinigungszusammensetzung
und danach einer zweiten Reinigungszusammensetzung. Bevorzugt umfasst
die erste Reinigungszusammensetzung ein ionisches Reinigungsmittel
und die zweite Reinigungszusammensetzung ein ioneninaktives Reinigungsmittel. Bevorzugt
werden diese Schritte bei einer Temperatur von wenigstens etwa 30°C durchgeführt. In
bestimmten Ausführungsformen
umfassen diese Schritte eine Behandlung des Gewebes mittels Ultraschall
während des Tauchens
in den Reinigungszusammensetzungen bei einer Temperatur von etwa
30°C bis
etwa 45°C.
-
Proteine,
die mutmaßlich
an der Auslösung
der Verkalkung beteiligt sind, sind wegen ihrer Tertiärstruktur,
die Gruppen verbergen kann, nicht unbedingt zugänglich. Daher kann die Verwendung
von Reduktionsmitteln nützlich
sein, weil diese biologisch aktive Proteine wirksam inaktivieren
können.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
kann daher die Reinigungszusammensetzung ein Reduktionsmittel enthalten
wie z.B. DTT und andere, die Disulfidbindungen reduzieren können.
-
Bevorzugt
umfasst das Verfahren: Kontaktieren des Gewebes mit einer nicht-phosphatgepufferten
organischen Salzlösung;
Kontaktieren des Gewebes mit einer Zusammensetzung, die wenigstens
ein Oxidationsmittel enthält;
Waschen des Gewebes, um wenigstens einen Teil des Oxidationsmittels
zu entfernen; Kontaktieren des Gewebes mit einer ersten Reinigungszusammensetzung,
die wenigstens ein ionisches Detergens und wenigstens ein Reduktionsmittel
enthält;
Waschen des Gewebes, um wenigstens einen Teil der ersten Reinigungszusammensetzung
zu entfernen; und Kontaktieren des Gewebes mit einer zweiten Reinigungszusammensetzung,
die wenigstens ein nicht-ionisches Detergens und wenigstens ein
Reduktionsmittel enthält,
vor Implantation der medizinischen Vorrichtung.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen sind
typischerweise alle auf Wasserbasis. Ferner können die Behandlungsschritte
der vorliegenden Erfindung in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann das Gewebe mit einer Zusammensetzung behandelt
werden, die ein Oxidationsmittel enthält, darauffolgend mit einer
oder mehreren Reinigungszusammensetzungen mit oder ohne Reduktionsmittel,
darauffolgend wird das Gewebe fixiert. Alternativ kann das Gewebe
mit einer Reinigungszusammensetzung behandelt werden mit oder ohne
Reduktionsmittel, darauffolgend mit einem Oxidationsmittel, darauffolgend
mit einer zweiten Reinigungszusammensetzung mit oder ohne Reduktionsmittel,
worauf Fixierung folgt. Oder die Fixierung (z.B. auf Basis von Glutaraldehyd
oder Carbodiimid) kann zuerst durchgeführt werden z.B. vor dem Kontaktieren
des Gewebes mit einem Oxidationsmittel oder einer Reinigungszusammensetzung.
-
Der
hier verwendete Begriff "implantierbare
medizinische Vorrichtung aus Gewebe" schließt ein Organ oder Gewebe ein,
welches ganz oder teilweise von einem Tier stammt, typischerweise
einem Säuger,
oder welches aus anderen organischen Geweben hergestellt ist und
welches allein oder als Teil einer Bioprothese implantiert werden
kann. Somit schließt
dieser Begriff generell bioprothetisches Gewebe ein wie Herzen,
Herzklappen, Aortenwurzelgewebe und andere Herzbestandteile, Perikard,
Gefäßtransplantate,
z.B. Venen und/oder Arterien, oder sonstiges Gewebe, Herzersatz,
Harntrakt- und Blasenersatz, Darm- und Gewebeteile allgemein, und
dergleichen.
-
Der
hier verwendete Begriff "pathologische
Verkalkung" bedeutet
die unerwünschte
Ablagerung von Kalziumphosphat-Mineralsalzen. Ohne Beschränkung auf
eine Lehre oder einen Mechanismus sei erwähnt, dass Verkalkung auf Faktoren
des Wirts, des Implantats und anderen äußerlichen patientenbezogenen
Faktoren beruhen kann. Es gibt Beweise für die Annahme, dass Kalziumablagerungen
mit abgestorbenen Zellen zusammenhängen und insbesondere mit Zellmembranen,
die Kalziumkanäle
haben, die nicht mehr oder schlecht funktionieren. Es wurde beobachtet,
dass Verkalkung mit einer Akkumulation von Kalzium und Phosphor
beginnt; wenn diese in geeigneter Konzentration und Ausrichtung
der Moleküle
vorhanden sind, bilden sie Hydroxyapatit, das sich zu Knötchen entwickelt,
die dann später
in einer implantierbaren Vorrichtung aus Gewebe zu Herzklappenversagen
führen
können.
-
Der
hier verwendete Begriff "reduzierte
Mineralisation" bezieht
sich auf die quantitative Abnahme der beobachteten Mineralienakkumulation
wie z.B. Kalziumphosphatmineralsalze, auf eine erfindungsgemäße implantierbare
Vorrichtung aus Gewebe und bezieht sich vorzugsweise auf die Aortenwände und
Klappensegel derartiger Vorrichtungen.
-
Detaillierte Beschreibung
bevorzugter Ausführungsformen
-
1. Beschaffung und Anfangsbehandlung
von Gewebe.
-
Eine
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahrenen
verwendete implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe kann
von der Gattung der Säuger
gewonnen werden. Geeignete Säuger
als Gewebespender für
eine erfindungsgemäße implantierbare
medizinische Vorrichtung aus Gewebe umfassen z.B. Schweine, Kühe, Schafe
etc. Bevorzugte Säuger
sind Schweine oder Kühe.
Bevorzugte Gewebe zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung
umfassen z.B. Schweine-Aortenwurzelgewebe, Rinder-Aortenwurzelgewebe, Schweine-
und/oder Rinder-Herzbeutel oder Venen und Arterien. Bevorzugt enthält die implantierbare
medizinische Vorrichtung aus Gewebe eine Herzklappe.
-
Typischerweise
wird das Gewebe für
eine implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe direkt im
Schlachthaus gewonnen und im Schlachthaus disseziert, um unerwünschtes
anhängendes
Gewebe zu entfernen. Das Gewebe wird entweder bei der Schlachtung
oder kurz danach, bevor beträchtliche
Gewebeschädigung
und/oder – Zersetzung
auftreten kann, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt. Es
kann gemäß den verschiedenen
erfindungsgemäßen Schritten
in jeder beliebigen Reihenfolge behandelt werden.
-
Typischerweise
wird das Gewebe, sobald es gewonnen wurde, auf Eis transportiert,
um autolytische Gewebsschädigung
zu verringern und Bakterienwachstum während des Transports zu minimieren.
Bevorzugt wird das Gewebe so transportiert, dass es innerhalb von
etwa 24 Stunden an einem Ort ankommt, wo die hierin beschriebene
Behandlung des Gewebes durchgeführt
werden kann.
-
Gemäß einem
Verfahren wird das Gewebe mit einer nicht-phosphatgepufferten organischen Salzlösung gründlich gewaschen.
Die nicht-phosphatgepufferte organische Salzlösung stabilisiert die Gewebematrix und
unterstützt
dabei das Entfernen von überschüssigem Blut
und Körperflüssigkeiten,
die evtl. mit dem Gewebe in Kontakt kommen. Eine nicht-phosphatgepufferte
organische Salzlösung
wird erfindungsgemäß bevorzugt,
da sie zum Entfernen phosphathaltiger Stoffe aus der implantierbaren
medizinischen Vorrichtung aus Gewebe dient.
-
Geeignete
Puffer für
die nicht-phosphatgepufferte organische Salzlösung zur erfindungsgemäßen Verwendung
sind Puffer mit einer ausreichenden Pufferkapazität, um einen
physiologisch akzeptablen pH aufrecht zu erhalten und die keine
schädigende
Wirkung auf die implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe haben.
Bevorzugt enthält
die nicht-phosphatgepufferte organische Salzlösung einen Puffer mit einer
Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 30 mM. Puffer umfassen z.B.
Acetat, Borat, Citrat, HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), BES
(N,N-bis[2-Hydroxyethyl]-2-aminoethansulfonsäure), TES (N-tris[Hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonsäure), MOPS
(Morpholinpropansulfonsäure),
PIPES (Piperazin-N,N'-bis[2-ethan-sulfonsäure]), oder
MES (2-Morpholinoethansulfonsäure), und
stellt Pufferung typischerweise in einem pH-Bereich von etwa 6,5
bis etwa 8,5 bereit. Organische Puffer sind bevorzugt, weil sie typischerweise
zu der Gewebematrix kein zusätzliches
Phosphat hinzufügen,
das an der Bildung von Hydroxyapatit beteiligt sein kann, wie es
von anderen auf dem Fachgebiet bekannten physiologischen Puffern,
z.B. Natriumphosphat, bekannt ist. Organische Puffer stellen auch
eine Pufferlösung
zur Verfügung,
ohne nachfolgende Vernetzungschemie zu beeinträchtigen. Bevorzugt ist der
Puffer HEPES, TES, BES, MOPS, PIPES oder MES. Noch bevorzugter ist
der in einer erfindungsgemäßen Salzlösung verwendete
Puffer HEPES, weil er einen pKa-Wert von etwa 7,4 bereitstellt,
der zur Gewebeverarbeitung sehr geeignet ist.
-
Die
Verwendung einer nicht-phosphatgepufferten organischen Salzlösung verringert
typischerweise die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Kristallisierung.
Die Verwendung von Phosphatsalzen zur Pufferung von Lösungen kann
den Phosphatgehalt PO43- so weit hinaufsetzen, dass es verfügbare zweiwertige
Kationen wie Kalzium bindet und damit eine Umgebung herstellt, die
zur Ausfällung
von Kalziumphosphatsalzen neigt. Übermäßig hohe Phosphat- und Kalziumgehalte
sind in vitro in Verkalkungsmodellen verwendet worden. Matrizes,
die von diesen Elementen befreit sind, verhindern im voraus das
frühzeitige
Auftreten von Kernbildung während
der Gewebebildungsvorgänge,
da Kernbildung nach Fixierung und Lagerung des Gewebes vor der Implantation
eine Langzeitwirkung haben kann. Daher ist es bevorzugt, disseziertes
Gewebe in einem ersten Behandlungsschritt so rasch wie möglich, typischerweise
innerhalb von 24 Stunden, mit einer erfindungsgemäßen, nicht-phosphatgepufferten
organischen Salzlösung
zu behandeln. Rasche Behandlung des Gewebes ist bevorzugt, da lösliche Ionen
wie z.B. Kalzium, Phosphat, Magnesium, zweiwertige Kationen und
anionische Verbindungen allgemein, besser aus dem Gewebe herausdiffundiert
werden können.
Diese Elemente sind Hauptkomponenten von dystropher Mineralisation
allgemein und insbesondere Verkalkung.
-
Die
zur erfindungsgemäßen Verwendung
geeignete nicht-phosphatgepufferte
organische Salzlösung enthält typischerweise
Zusatzkomponenten, umfassend z.B. eine Salzlösung, vorzugsweise etwa 0,8
bis etwa 1,0 Gew.-%. Zusätzlich
enthält
die nicht-phosphatgepufferte organische Salzlösung vorzugsweise einen Chelatbildner.
Vorzugsweise ist der Chelatbildner in einer Konzentration von etwa
20 mM bis etwa 30 mM in der Lösung
vorhanden.
-
Geeignete
Chelatbildner umfassen zum Beispiel EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), EGTA
(Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure), Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure, Zitronensäure oder
ihre Salze sowie Natriumcitrat. Ein gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzter Chelatbildner bindet vorzugsweise zweiwertige Kationen
wie z.B. Kalzium, Magnesium, Zink und Mangan. Ein Entfernen dieser
Ionen aus der implantierbaren medizinischen Vorrichtung aus Gewebe
zu Beginn der Bearbeitung kann das Gewebe weniger anfällig machen
für spontanes
Ausfällen
solcher zweiwertiger Ionen mit Phosphationen, die evtl. im Gewebe
vorhanden sind. Daher verhindert ein Entfernen solcher zweiwertiger
Kationen die Bildung von Apatit.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
besteht die erfindungsgemäße nicht-phosphatgepufferte
organische Salzlösung
aus etwa 0,9 Gew.-% Kochsalzlösung,
gepuffert zu einem pH von etwa 7,4 mit etwa 10 (millimolar) mM bis
etwa 30 mM HEPES-Puffer und enthält
etwa 20 mM bis etwa 30 mM EDTA. Nach dem Waschen in der nicht-phosphatgepufferten
organischen Salzlösung,
wie oben beschrieben, kann die medizinische Vorrichtung aus Gewebe
bei etwa 4°C
etwa 4 bis etwa 16 Stunden lang bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden.
-
2. Nachbehandlung, Transport
und Lagerung des Gewebes
-
Nach
Waschen und Lagerung der implantierbaren medizinischen Vorrichtung
aus Gewebe vor dem Transport wird das erhaltene Gewebe vorzugsweise
in eine Zusammensetzung, die ein Oxidationsmittel enthält, gelegt
und getaucht. Alternativ kann das Gewebe sofort gewaschen und in
einer Zusammensetzung, die ein Oxidationsmittel enthält, gelagert
werden. Diese Zusammensetzung kann zum Transport des Gewebes vom
Schlachthaus zum Bearbeitungsort verwendet werden. Die Zusammensetzung
enthält
ein oder mehrere Oxidationsmittel. Typischerweise können Oxidationsmittel
zwar Elektronen aufnehmen, jedoch tritt diese Funktion in dem vorliegenden
System nicht unbedingt auf. Vorzugsweise wird das Oxidationsmittel
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Natriumhypochlorit, Natriumbromat,
Natriumhydroxid, Natriumiodat, Natriumperiodat, Perameisensäure, Perjodsäure, Kaliumdichromat,
Kaliumpermanganat, Chloramin T, Peressigsäure und Kombinationen daraus.
Noch bevorzugter wird das Oxidationsmittel ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Natriumhypochlorit, Perameisensäure, Perjodsäure, Peressigsäure und
Kombinationen daraus. Das Oxidationsmittel ist in der Zusammensetzung
bevorzugt in der Menge von etwa 2 mM bis etwa 20 mM und noch bevorzugter
von etwa 5 mM bis etwa 10 mM vorhanden.
-
Die
Zusammensetzung umfasst bevorzugt auch einen Chelatbildner wie oben
beschrieben und umfasst bevorzugt auch einen Puffer und eine Salzlösung in
den oben beschriebenen Konzentrationen. Bevorzugt hat der Puffer
einen pKa-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5. Noch bevorzugter ist der
Puffer ein organischer Puffer wie z.B. HEPES, TES, BES oder andere,
wie oben beschrieben. Bevorzugt wird das Gewebe in eine 0.9% Salzlösung eingetaucht
(Kochsalz), enthaltend etwa 20 mM bis etwa 30 mM EDTA, etwa 10 mM
bis etwa 30 mM HEPES, und eine Konzentration von Natriumhypochlorit
(5% Bleichkonzentratlösung)
von wenigstens etwa einer 1:400 Verdünnung oder nicht mehr als etwa
1:50 Bleichkonzentrat (die im allgemeinen etwa 2 mM bis etwa 20
mM entspricht). Bevorzugt wird das Gewebe bei Raumtemperatur in
der Bleichlösung
getaucht gelassen und zwar für
einen Zeitraum von wenigstens etwa 24 Stunden und noch bevorzugter
nicht mehr als 36 Stunden.
-
Die
Zusammensetzung, die ein Oxidationsmittel, wie z.B. Natriumhypochlorit,
enthält,
kann so wirken, dass sie die Aktivität spezifischer Proteine, wie
z.B. Kinasen, Phospatasen und andere, in den Gewebematrizen, welche
für die
Auslösung
des Verkalkungsprozesses entscheidend sein können, "desaktiviert". Es wird angenommen, dass der Einsatz
von Oxidationsmitteln in der Zusammensetzung die biologischen Funktionen der
Proteinstruktur hemmt. Zum Beispiel kann die Oxidation spezifischer
-R Gruppen in Aminsäure-Seitenketten
das Falten spezifischer Proteine unterbrechen und somit die natürliche Konformation
der Enzyme zerstören,
so dass diese kein Substrat verarbeiten können.
-
Eine
Beschränkung
auf die Lehre ist zwar nicht gewünscht,
jedoch wird angenommen, dass das Oxidationsmittel Enzymreaktionen
entkoppelt, die in den Zellen in der extrazellulären Matrix (ECM) auftreten.
Diese Enzyme nutzen Kalzium und Phosphat in einer Reihe von Mechanismen
zur Energienutzung und Zellsignalisierung. Wenn während der
Gewebeverarbeitung die richtigen Bedingungen vorliegen, können solche
Enzyme für
die Abtrennung der Ionen verantwortlich sein, die zur Bildung von
Apatit (d.h. Hydroxyapatit) in der ECM nötig sind. Außer der
Modifikation von proteinaktiven Stellen können auch andere Reaktionen
stattfinden. In spezifischen Proteinen vorhandene Disulfidbindungen
können
zerstört
werden, was durch Änderung
ihrer Tertiärstruktur
zu einer Fehlfunktion der Proteine führt.
-
Zusammensetzungen,
die ein oder mehrere Oxidationsmittel enthalten, können die
Reduzierung von Zucker bewirken, der in Glycosaminoglycanen wie
z.B. Heparin, Chondroitinsulfat oder Dermatinsulfat vorhanden ist.
Der Oxidationsprozess könnte
diese Verbindungen für
Vernetzung empfänglich
machen. Diese Lösung kann
auch als Bakterizidlösung
betrachtet werden; sie hemmt Bakterienwachstum in der Lösung während des Transports.
Eine implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe, die in
die Zusammensetzung gelegt wird, die ein oben beschriebenes Oxidationsmittel
enthält,
kann beliebig gelagert und/oder transportiert werden.
-
3. Weiterverarbeitung
des Gewebes.
-
Nach
der oben beschriebenen Behandlung mit der Zusammensetzung, die ein
Oxidationsmittel enthält,
wird vorzugsweise die implantierbare medizinische Vorrichtung aus
Gewebe gründlich
mit einer oben beschriebenen nicht-phosphatgepufferten organischen Salzlösung gewaschen,
um die Oxidationsmittel vollständig
zu entfernen.
-
Vorzugsweise
wird die implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe etwa
8 bis etwa 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gewaschen. Bevorzugt
wird die nicht-phosphatgepufferte
organische Salzlösung
häufig
ausgetauscht, z.B. etwa alle 20 bis 30 Minuten. Der häufige Austausch
der Lösung
entspricht etwa dem 32-fachen
des Volumens, d.h. etwa 250 ml pro Volumentausch im Verlauf der
Waschbehandlung. Unabhängig
vom angewandten spezifischen Waschbehandlungsverfahren sollte das
Verhältnis
von Gewebe zu nicht- phosphatgepufferter
organischer Salzlösung,
d.h. das Verhältnis
Gewebe zu Volumen, relativ groß sein. Ein
verfahrensgemäß angewendetes
großes
Verhältnis
Gewebe zu Volumen dient der Schaffung des größtmöglichen Gradienten der Diffusion
(d.h. Entfernen) gelöster
Stoffe aus der Gewebe-ECM und der erleichterten Bewegung der Stoffe
in die umgebende nicht-phosphatgepufferte organische Salzlösung. Der
häufige
Volumenaustausch bewirkt die Aufrechterhaltung der Diffusionsgradienten
zur Unterstützung
des Entfernens des Oxidationsmittels aus der ECM. Während der
hier beschriebenen Waschbehandlung kann das Gewebe wahlweise einer
Ultraschallbehandlung mittels Ultraschallgerät unterzogen werden. Die Anwendung
eines Ultraschallgeräts
kann den Vorteil haben, die Diffusion der Stoffe aus dem Gewebe
weiter zu unterstützen.
-
Außerdem wird
die Temperatur während
der oben beschriebenen Waschbehandlung vorzugsweise bei weniger
als etwa 45°C
gehalten. Die Aufrechterhaltung der Temperatur der Waschbehandlung
wird erreicht durch die Verwendung eines Wärmetauschsystems in Verbindung
mit der Ultraschallbehandlung. Das Wärmetauschsystem umfasst Pumpen
der Reinigungszusammensetzung aus einem (das Gewebe enthaltenden)
Reaktionsgefäß in ein
Edelstahlheizrohr, das in ein Wasserbad getaucht ist (Wärmetauscher),
vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 35°C bis etwa 45°C, und wieder
zurück
in das Reaktionsgefäß.
-
4. Behandlung des Gewebes
mit einem Reinigungsmittel.
-
Nachdem
das Gewebe gründlich
gewaschen wurde, so dass das Oxidationsmittel sicher entfernt wurde,
wird das Gewebe bevorzugt in einer ersten Zusammensetzung getaucht,
die wenigstens ein Reinigungsmittel enthält. Bevorzugt ist das Reinigungsmittel
zwar ein ionisches Reinigungsmittel wie z.B. Natriumdodecylsulfat
(SDS), aber zahlreiche andere ionische Reinigungsmittel können auch
verwendet werden. Beispiele umfassen Natriumcaprylat, Natriumdeoxycholat
and Natrium-1-decansulfonat.
Die Konzentration an ionischem Reinigungsmittel liegt bevorzugt
im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 2,5% (Volumengewicht bei Feststoffen
bzw. Volumen/Volumen bei Flüssigkeiten)
und noch bevorzugter von etwa 0,5% bis etwa 1,5% (Volumengewicht
bei Feststoffen bzw. Volumen/Volumen bei Flüssigkeiten). Die Reinigungszusammensetzung
enthält
bevorzugt auch etwa 10 bis etwa 30 mM HEPES (oder einen anderen
oben beschriebenen Puffer), etwa 20 mM bis etwa 30 mM EDTA (oder
einen anderen oben beschriebenen Chelatbildner) und Kochsalzlösung in einer
Menge von etwa 0,8% bis etwa 1,0% (Gew.-%).
-
Die
Lösung
kann wahlweise auch ein Reduktionsmittel wie z.B. DTT (Dithiothreotol)
(oder ähnliches) in
einem Bereich von 10 mM bis etwa 200 mM enthalten. Beispiele für andere
geeignete Reduktionsmittel umfassen zum Beispiel 2-Mercaptoethylamin
und DTE (Dithioerythritol). Reduktionsmittel sind auch imstande, Proteine
zu inaktivieren, und eine solche Behandlung ändert die Tertiärstruktur
bioaktiver Verbindungen und macht sie inaktiv. Alternativ kann das
Gewebe mit einer wässrigen
Lösung
behandelt werden, die das Reduktionsmittel und wahlweise andere
Komponenten ohne Reinigungsmittel enthält.
-
Das
Gewebe wird anschließend
für einen
Zeitraum von wenigstens etwa 24 Stunden bei wenigstens etwa 30°C in die
erste Reinigungszusammensetzung gelegt. Die Temperatur, bei welcher
dieser Prozess stattfindet, kann beträchtliche Auswirkungen auf die
Fähigkeit
des Reinigungsmittels haben, in die Phospholipiden der Zellmembranen
und der zugehörigen
Proteine einzudringen, die entfernt oder modifiziert werden sollen. Es
ist bekannt, dass Phospholipid-Doppelschichten bei Erwärmung ihre
physischen Eigenschaften in spezifischen Temperaturbereichen verändern. Dieser "Phasenübergang" beruht auf verstärkter Bewegung
um die Karbon-Karbonbindungen
von Fettacylketten. Die Acylketten gehen von einem stark strukturierten,
gel-ähnlichen
Zustand bei niedrigeren Temperaturen (d.h. Raumtemperatur) in einen
beweglicheren flüssigen
Zustand bei höheren
Temperaturen über.
Während
des Übergangs
von Gel zu Flüssigkeit
wird Wärmeenergie
absorbiert, und die Doppelschicht passiert durch die "Schmelztemperatur" der Doppelschicht.
Die Fluidität
der Membran-Doppelschichten bei den Temperaturen, die in diesem
Verfahren verwendet werden, erleichtern die Auflösung der Zellmembrane.
-
Während der
Reinigungsmittelbehandlung des Gewebes kann das Gewebe der oben
beschriebenen Ultraschallbehandlung unterworfen werden. Die Temperatur
während
dieser Behandlung wird typischerweise auf weniger als 50°C und bevorzugt
auf weniger als 45°C
gehalten, z.B. durch Verwendung eines Wärmetauschersystems in Verbindung
mit dem Ultraschallsystem.
-
Das
Reinigungsmittel wird verwendet, um das Entfernen von Zellen, Zelltrümmern und
Zellorganellen aus der ECM zu erleichtern. Es ist bekannt, dass
Zellmembranen und Zellorganellenmembranen einen Großteil der
Enzyme und Proteine enthalten, die an der Kernbildung bei der Apatitbildung
während
der Mineralisation beteiligt sind. Ein Lösen dieser Membranen kann durch
Denaturieren der Proteine während
der Extraktion auch die Hemmung der Verkalkung unterstützen. Es
wurde auch angenommen, dass Phospholipide, die den größten Anteil
an Zellmembranen ausmachen, an der Auslösung der Verkalkung beteiligt
sind. Reinigungsmittelbehandlungen zerstören bei der Extraktion von
Proteinen die Phospholipid-Doppelschicht von Zellmembranen.
-
Nach
Behandlung mit der Reinigungszusammensetzung wird die implantierbare
medizinische Vorrichtung aus Gewebe üblicherweise mit einem weiteren
gründlichen
Waschverfahren unter Verwendung der oben beschriebenen nicht-phosphatgepufferten
organischen Salzlösung
bearbeitet. Nach dem Waschen wird die implantierbare medizinische
Vorrichtung aus Gewebe in eine zweite Reinigungszusammensetzung
gelegt. Die zweite Reinigungszusammensetzung hat vorzugsweise eine
größere Affinität zu Phospholipiden
als die erste oben erläuterte
Reinigungszusammensetzung. Bevorzugt enthält die zweite Reinigungszusammensetzung das
Reinigungsmittel NP-40, es können
jedoch auch andere nicht-ionische Reinigungsmittel wie Triton X-100, Tween
Serien und Octylglucosid verwendet werden. Die Verwendung dieses
Reinigungsmittels dient der weiteren Unterstützung beim Entfernen von Zellstoffen
und -trümmern.
-
Diese
zweite Reinigungszusammensetzung enthält bevorzugt auch etwa 10 bis
etwa 30 mM HEPES (oder einen anderen oben beschriebenen Puffer),
etwa 20 mM bis etwa 30 mM EDTA (oder einen anderen oben beschriebenen
Chelatbildner) und Kochsalzlösung
in einer Menge von etwa 0,8% bis etwa 1,0% (Gew.-%). Dieses Reinigungsmittel
kann auch ein Reduktionsmittel wie oben beschrieben in der ersten
Reinigungszusammensetzung enthalten. Die in der zweiten Reinigungszusammensetzung
verwendeten Reinigungsmittelkonzentrationen sind ähnlich zu
den Reinigungsmittelkonzentrationen, die in der ersten Reinigungszusammensetzung
verwendet werden, wobei die bevorzugt verwendete Standardkonzentration
etwa 0,5% bis etwa 2,5% (Volumen/Volumen bei Flüssigkeiten) und noch bevorzugter
etwa 0,5% bis etwa 1,5% (Volumen/Volumen bei Flüssigkeiten) beträgt. Die
hier beschriebenen nicht-ionischen Reinigungsmittel können bei
verschiedenen Konzentrationen auf verschiedene Weise wirken. Zum
Beispiel bei hoher Konzentration (oberhalb der kritischen Mizell-Konzentration)
machen nicht-ionische
Reinigungsmittel biologische Membranen löslich durch Bildung von gemischten
Mizellen aus Reinigungsmitteln, Phospholipiden und in der Membran enthaltenen
Proteinen. Bei niedriger Konzentration können nicht-ionische Reinigungsmittel
an die hydrophoben Bereiche der meisten Membranproteine binden,
wodurch diese in wässrigen
Lösungen
löslich
werden.
-
Üblicherweise
wird die implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe für einen
Zeitraum von wenigstens etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von
wenigstens etwa 30°C
in die zweite Reinigungsmittel-enthaltende Zusammensetzung gelegt.
Während
dieser Verfahrensstufe kann die implantierbare medizinische Vorrichtung
aus Gewebe wie oben beschrieben einer Ultraschallbearbeitung unterworfen
werden. Wie oben weiter beschrieben, wird die Temperatur dabei typischerweise
auf weniger als ca. 50°C und
bevorzugt auf weniger als ca. 45°C
gehalten durch Verwendung eines Wärmetauschersystems in Verbindung
mit dem Ultraschallsystem.
-
Nach
Behandlung mit der zweiten Reiniqungsmittel-enthaltenden Zusammensetzung wird die
implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe etwa 24 Stunden
lang bei Raumtemperatur (z.B. etwa 25°C bis etwa 30°C) gründlich in
der oben beschriebenen nicht-phosphatgepufferten
organischen Salzlösung
gewaschen. Bei Beendigung der Waschungsbehandlung kann die implantierbare
medizinische Vorrichtung aus Gewebe in die nicht-phosphatgepufferte
organische Salzlösung
gelegt und bis zur Fixierung bei 4°C gelagert werden.
-
Ein
Fachmann wird erkennen, dass die Reinigungsmittel-enthaltenden Zusammensetzungen
auch in anderer Reihenfolge angewendet werden können. Das heißt, die
Behandlung der implantierbaren medizinischen Vorrichtung aus Gewebe
mit einer nichtionischen Reinigungsmittel-enthaltenden Zusammensetzung kann vor
der Behandlung der implantierbaren medizinischen Vorrichtung aus
Gewebe mit einer ionischen Reinigungsmittel-enthaltenden Zusammensetzung
erfolgen. Außerdem
ist das hier beschriebene Verfahren insbesondere modular vorgesehen,
d.h. dass bestimmte Behandlungsschritte zu jeder beliebigen Zeit
innerhalb des Bearbeitungsprozesses für die implantierbare medizinische
Vorrichtung aus Gewebe stattfinden können. Zum Beispiel kann ein
Reinigungsmittel in einer Transportlösung verwendet werden, bevor
es den Oxidationsmitteln ausgesetzt wird, worauf eine weitere Reinigungsmittel-Behandlung
folgt.
-
5. Fixierung des Gewebes.
-
Bevorzugt
ist die Fixierung des Gewebes nach der oben beschriebenen Reinigungsmittel-Behandlung und
Waschbehandlung vorgesehen, jedoch könnte die Fixierung auch vor
den hier beschriebenen Behandlungsschritten stattfinden. Üblicherweise
wird vor der Fixierung die implantierbare medizinische Vorrichtung aus
Gewebe mit einer nicht-phosphatgepufferten organischen Salzlösung ähnlich der
oben beschriebenen nicht-phosphatgepufferten organischen Salzlösung gewaschen,
jedoch wird der Puffer, z.B. HEPES, in einer Konzentration von etwa
10 mM bis etwa 20 mM verwendet. Zwei alternative Fixierungsbehandlungen
zur Konservierung der implantierbaren medizinischen Vorrichtung
aus Gewebe können
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
angewendet werden. In einer ersten Fixierungsbehandlung wird ein
Vernetzungsprozess angewendet, wobei die implantierbare medizinische
Vorrichtung aus Gewebe in eine etwa 0,2%-ige Glutaraldehydlösung in
der oben beschriebenen vorbereiteten nicht-phosphatgepufferten organischen Salzlösung eingelegt wird.
Dieser Fixierungsprozess dauert etwa 7 Tage und ist dem Fachmann
wohlbekannt.
-
In
einer zweiten Fixierungsbehandlung wird ein Vernetzungsprozess verwendet,
wobei die implantierbare medizinische Vorrichtung aus Gewebe in
ein wasserlösliches
Carbodiimid eingelegt wird, wie es in den US-Patenten Nr. 5,447,536
(Giardot et al.) und 5,733,339 (Giardot et al.) sowie
EP 897942 A (Cahalan et al.) offenbart
ist. Dieser Fixierungsprozess besteht aus zwei Stufen, wobei weitere
der verfügbaren
Nebengruppen auf der Aminosäure-Hauptkette
der Kollagenmoleküle
genutzt werden.
-
Die
nachfolgenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung genauer.
Der Fachmann wird erkennen, dass die beschriebenen spezifischen
Reagenzien, Ausrüstungen
und Verfahren nur beispielhaft sind.
-
Beispiel
-
Enzymaktivität in Bezug
auf verschiedene alternative Gewebebehandlungsverfahren
-
1. Hintergrund
-
Aktuelle
Behandlungen zur Hemmung von Verkalkung bieten keinen umfassenden
Schutz sowohl für das
Klappensegel als auch die Wand. Gemäß den in der Literatur veröffentlichten
Berichten wird die Auslösung von
Verkalkung sicherlich durch die Zellen verursacht. Der genaue Mechanismus
des Kernbildungsvorgangs ist unbekannt, kann jedoch Proteine betreffen,
die an der Nutzung von Kalzium und/oder Phosphat beteiligt sind
bei der Signalumwandlung, Energienutzung, post-transnationale Modifikation von Proteinen
oder Ionengleichgewicht innerhalb einer Zelle.
-
Für einen
Versuch zu verstehen, ob diese ersten Schritte an Kernbildungsereignissen
beteiligt sein könnten,
wurden Proteine verwendet, um die Lehre zu prüfen, dass ihre Funktion durch
Denaturierung inaktiviert wird. Das Modellsystem verwendet Proteasen,
um die Funktion von Protein nach Behandlung zu testen. Diese Proteine
werden bei der Aufrechterhaltung ihrer Tertiärstruktur durch verschiedene
Bindungsmechanismen unterstützt,
Trypsin durch Wasserstoffbindungen und Chymotrypsin durch eine Kombination
von Disulfidbindungen und Wasserstoffbindungen.
-
Bei
diesen Experimenten wurden Trypsin und Chymotrypsin gewählt wegen
ihrer Fähigkeit,
ein Substrat auf Kollagenbasis (AZOCOLL, Sigma Chemical) abzubauen,
das nach einem Enzymangriff ein farbiges Reaktionsprodukt freisetzt.
-
II. Zusammenfassung
-
Trypsin
und Chymotrypsin wurden mehreren Denaturierungs/Inaktivierungs-Methoden
unterworfen, indem sie entweder Oxidationsmitteln oder Reduktionsmitteln
oder Reinigungsmittel(n) ausgesetzt wurden. Die vorläufigen Daten
zeigen an, dass eine Denaturierung diese Proteine durch Modifizierung
ihrer Tertiärstruktur
inaktivieren kann.
-
III. Werkstoffe
-
- Phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS), Sigma Produkt Nr. 1000-3, Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO
- Kochsalzlösung
(NS), Sigma 430AG-4, Sigma AZOCOLL (Azo-Farbstoff-imprägniertes
Kollagen, Produkt Nr. 194933) Calbiochem, San Diego, CA
- Natriumhypochlorit (Bleichmittel)
- Peressigsäure,
Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI SDS, Sigma Produkt Nr. L 4509,
Sigma Chemical Trypsin (Typ I, Rinderpankreas, Produkt Nr. T 4665),
Sigma
- Chymotrypsin (Rinderpankreas, Produkt Nr. C 4129), Sigma DTT
(Dithiothreatol, Produkt Nr. D 0632), Sigma Wasserbad
- Spektrophotometer (Beckman-Modell)
-
IV. Verfahren
-
Proteinzubereitung
-
Wegen
der Empfindlichkeit dieser Emzyme gegenüber Autodigestion wurden alle
Proteinlösungen
am Versuchstag frisch zubereitet und bis zur Verwendung auf Eis
gelagert.
-
Konzentrierte
Trypsin- und Chymotrypsinlösungen
wurden bei Raumtemperatur in PBS, pH 7,4, aus Trockenpulver gelöst, das
vom Hersteller geliefert wurde. Die Proteinkonzentrationen wurden
auf 1 mg/ml eingestellt. Die Proteinlösungen wurden steril durch
ein 0,45 μm
Spritzenfilter gefiltert, um potentielle bakterielle Kontamination
zu eliminieren.
-
Die
Arbeitslösung
des Proteins wurde durch Verdünnung
des Konzentrats auf eine Endkonzentration von 100 μg/ml zubereitet.
-
Proteinbehandlung
-
Jedes
Protein wurde unter den folgenden Bedingungen verschiedenen Agenzien
ausgesetzt.
-
Oxidationsmittel:
Proteine wurden für
2 Stunden bei Raumtemperatur entweder Peressigsäure oder einem Bleichmittel
ausgesetzt. Nach der Behandlung wurden die Proteine über eine
Entsalzungssäule
(Sephadex G-25) geleitet, um das Oxidationsmittel vom Protein zu
trennen. Protein wurde unter Verwendung von PBS aus der Säule eluiert.
Die Elution des Proteins wurde durch Überwachung der UV-Absorption
bei 280 nm verfolgt. Das eluierte Protein wurde in 0.5 ml Aliquoten
gewonnen. Die Aliquoten mit der höchsten UV-Absorption wurden
für die
Analyse verwendet.
-
Reduktionsmittel:
Chymotrypsin wurde DTT ausgesetzt (Endkonzentration 10 mM PBS, pH
7,4) in Gegenwart von SDS (1% Gew.:Vol.). Das Protein wurde 2 Stunden
lang mit den Agenzien inkubiert. Um sicherzustellen, dass eine Wirkung
auf alle Disulfidbindungen stattfand und diese vollständig reduziert
wurden, wurde die Reaktion bei erhöhter Temperatur durchgeführt (37°C – 40°C). Das Protein
wurde über
eine Sephadex-G-25-Säule
geleitet wie oben beschrieben, um es für den Assay aufzubereiten.
Nachdem das Protein von der Säule
eluiert worden war, wurde es sofort in dem Assay benutzt.
-
Denaturierung:
Trypsin wurde SDS ausgesetzt (Endkonzentration 1% Gew.:Vol in PBS,
pH 7,4). Das Protein wurde für
den Assay aufbereitet durch PBS-Dialyse,
um überschüssiges SDS
zu entfernen. Die Dialyse wurde bei 4°C durchgeführt, um Autodigestion zu minimieren.
-
Bewertung
der Enzymaktivität
-
Jedes
der Proteine, die einem Agens ausgesetzt wurden, wurde hinsichtlich
seiner Aktivität
bewertet, indem es mit einem Kollagensubstrat mit einem Azo enthaltenden
Farbstoff inkubiert wurde. AZOCOLL wurde bei einer Konzentration
von 1 mg/ml in PBS suspendiert. Für den Assay wurde 1 ml Protein
mit 1 ml AZOCOLL-Substrat gemischt. Die Reaktion wurde 20 Minuten
lang bei 37°C
in Ependorff Microfuge-Röhrchen durchgeführt. Am
Ende der Reaktionszeit wurde die Reaktion durch Zentrifugieren des
Gemisches beendet, wobei das nicht abgebaute AZOCOLL von der wässrigen
Lösung
separiert wurde. Die wässrige
Lösung
wurde aus den Zentrifugenröhrchen
entfernt und die Absorption der (löslichen Azo-Farbstoff enthaltenden)
Lösung wurde
bei 520 nm überwacht.
-
Die
Kontrolle war eine negative Kontrolle, d.h. PBS mit dem geeigneten
Agens wurde verwendet, um auf das Protein zu wirken, aber ohne das
Protein selbst. Positive Kontrollen waren Enzyme, die den Behandlungen
nicht ausgesetzt waren. Sie wurden portionsweise direkt von der
Konzentratlösung
in das AZOCOLL-Reaktionsgefäß gegeben.
-
Datenanalyse
-
Alle
Versuche wurden dreimal durchgeführt.
Die berichteten Daten sind das Mittel aus den 3 Ablesungen. Die
Versuche wurden durchgeführt,
um die Durchführbarkeit
des Modellsystems zu testen; es wurde keine statistische Analyse
der bzw. zwischen den verschiedenen Gruppen versucht.
-
V. Ergebnisse
-
Trypsin,
dem/den Oxidationsmittel/n ausgesetzt
| Probe | Abs.
@ 520 nm |
| Negative
Kontrolle | 0,089 |
| Positive
Kontrolle | 0,664 |
| Behandelte
Probe | 0,342 |
-
Trypsin,
dem/den Denaturierungsmittel/n (SDS) ausgesetzt
| Probe | Abs.
@ 520 nm |
| Negative
Kontrolle | 0,004 |
| Positive
Kontrolle | 0,544 |
| Behandelte
Probe | 0,066 |
-
Chymotrypsin,
dem Reduktionsmittel ausgesetzt
| Probe | Abs.
@ 520 nm |
| Negative
Kontrolle | 0,003 |
| Positive
Kontrolle | 0,523 |
| Behandelte
Probe | 0,031 |
-
Erörterung
-
Die
Daten deuten darauf hin, dass die obigen Behandlungen für das Inaktivieren
von Proteinen innerhalb der extrazellulären Gewebematrix hilfreich
sein können.
Mehrere Punkte müssen
bewertet werden, bevor ein Modell realisiert wird und als zuverlässig für die Bewertung
der nachfolgenden Gewebematrixbehandlungen betrachtet wird. Das
erste ist das Aussehen des reagierten Substrats bei den negativen
Kontrollen. Dies kann im Falle von Oxidationsmitteln bedeuten, dass
Reaktionen möglicherweise
durch Assoziation der Reagenzien auftreten.
-
Für die anderen
Experimente, bei denen SDS benutzt wird, kann der geringe Hintergrund
auf überschüssigem SDS
beruhen, das von dem Enzym, das der Reaktion ausgesetzt ist, in
den Assay hineingetragen wird. SDS kann an AZOCOLL binden, wodurch
es gegenüber
Zersetzung unempfindlicher wird.