DE69923554T3 - Mutantstämme von Lactobacillus Bulgaricus frei von Beta-Galactosidase Aktivität - Google Patents

Description

• Diese Stämme und Fermente können für die Herstellung von Milchprodukten, die ausgehend von mit Glucose versetzter Milch fermentiert werden, verwendet werden.
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Varianten von Bulgaricus und ihre Verwendung zur Herstellung von fermentierten Milchprodukten.
• Joghurts werden traditionell durch Fermentation von Milch mit einer Assoziation von Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus erhalten. Im Verlauf der Fermentation, die bei einer Temperatur von etwa 40 bis 45°C abläuft, verwenden diese Bakterien hauptsächlich Lactose als Energiesubstrat und produzieren Milchsäure, was die Milchgerinnung nach sich zieht; wenn der pH einen Wert von etwa 4,8 bis 4,5 erreicht, beendet man diese Fermentationsstufe (auch „Säuerung” genannt), indem man das Produkt kühlt. Dieses wird dann während des Herstellungs- und Verpackungsverfahrens und bis zum Verzehr in der Kälte gehalten.
• Jedoch beendet die Kühlung die Milchsäurefermentation nicht vollständig; selbst wenn das Produkt bei 4°C gehalten wird, beobachtet man eine progressive Erhöhung seiner Azidität im Lauf der Zeit.
• Dieses Phänomen, das unter dem Namen Nachsäuerung bekannt ist, ist für einen Abbau der organoleptischen Qualität des Produktes während seiner Konservierung verantwortlich.
• Die Nachsäuerung resultiert im Wesentlichen aus der Verwertung der Lactose, die am Ende der Stufe der kontrollierten Säuerung in dem Produkt zurückbleibt, durch die Bakterien und hauptsächlich durch L. bulgaricus. Um dies zu vermeiden, wurde vorgeschlagen, L. bulgaricus-Stämme zu verwenden, die Lactose nicht oder sehr wenig fermentieren.
• Eines der Enzyme, die für die Fermentation der Lactose essentiell sind, ist β-Galactosidase, die die Lactose in Glucose und Galactose hydrolysiert. Es wurde vorgeschlagen, um Stämme von L. bulgaricus zu erhalten, die nicht nachsäuernd sind, künstliche Mutanten zu produzieren oder natürliche Mutanten zu selektionieren, bei denen die Aktivität dieses Enzyms angegriffen ist.
• Beispielsweise beschreibt das Patent EP 402 450 von GENENCOR die Herstellung von konditionellen Mutanten von L. bulgaricus durch ortsspezifische Mutagenese des Gens der β-Galactosidase, wobei bei diesen die β-Galactosidase, die während der Fermentation bei 40°C aktiv ist, ihre Aktivität bei der Temperatur oder dem pH, die Lagerungsbedingungen der fermentierten Milchprodukte entsprechen, verliert.
• Die Anmeldung JP 90053437 beschreibt den Erhalt einer künstlichen Mutanten von L. bulgaricus, die die Fähigkeit, Lactose zu fermentieren, vollständig verloren hat, und die Selektion einer natürlichen Mutanten mit verringerter Fähigkeit, Lactose zu fermentieren; diese Mutanten sind dennoch fähig, und zwar die eine wie die andere, sich in Gegenwart von S. thermophilus normal zu entwickeln und normal zu säuern, unter der Bedingung, dass das Medium mit Glucose supplementiert ist. Die Subkulturen dieser Mutanten konservieren ihre Säuerungsmerkmale in Milch, die frei von Glucose ist, nach 10-maligem Replattieren.
• Das Patent EP 0 518 096 der SOCIÉTÉ DES PRODUITS NESTLÉ schlägt vor, zur Herstellung von Joghurt schwach nachsäuernde Mutanten von Lactobacillus bulgaricus zu verwenden, die vorher nach dem Kriterium der Deletion eines Fragments des Gens der β-Galactosidase selektioniert wurden. Die Durchmusterung und die Charakterisierung dieser Mutanten werden durch die Tatsache erleichtert, dass das Vorliegen dieser Deletion mit den Restriktionsprofilen leicht verwirklicht werden kann. Im Übrigen ist bekannt, dass die Deletionen irreversible Mutationen sind, die es ermöglichen, ausgehend vom Mutterstamm leicht stabile Mutantenstämme zu erhalten. Das Patent EP 0 518 096 beschreibt 2 Typen von Mutanten, die schwach nachsäuernd sind und auf diese Weise selektioniert wurden. Die ersten haben eine Deletion, die lediglich das Gen der β-Galactosidase berührt; wenn sie mit S. thermophilus kombiniert und auf Milch kultiviert werden, weisen sie selbst in Abwesenheit eines Glucosezusatzes Wachstums- und Säuerungseigenschaften auf, die denen des Wildstamms, von dem sie abstammen, vergleichbar sind. Die zweiten weisen eine wichtigere Deletion auf, die sich auf mindestens 1 kb stromabwärts des Gens der β-Galactosidase erstreckt; wenn sie mit S. thermophilus assoziiert werden, wachsen sie viel langsamer und säuern viel weniger als der Wildstamm, von dem sie abstammen, der Zusatz von Glucose zum Kulturmedium hat auf ihre Säuerungs- und Nachsäuerungseigenschaften wenig Einfluss.
• Die natürlichen Mutanten, bei denen die β-Galactosidase inaktiv ist, sind im Fall der Punktmutationen viel schwieriger zu selektionieren und in Reinkultur zu halten, als dies bei Deletionsmutanten der Fall ist; dies erklärt sich durch die schwächere Wahrscheinlichkeit, dass eine Punktmutation ein inaktives Protein produziert, durch die äußerst große Schwierigkeit, die Punktmutationen durch Restriktionsprofile zu lokalisieren und zu charakterisieren und durch die sehr beachtliche Umkehrrate.
• Die Anmelderin hat nun andere natürliche Mutanten von L. bulgaricus gefunden, die in dem Gen, das für die β-Galactosidase kodiert, keine Deletion tragen und vorteilhafte technologische Charakteristika aufweisen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ausgehend von einer Kultur eines wilden L. bulgaricus eine Nonsens-Mutante isoliert, die unfähig ist, Lactose zu assimilieren. Assoziiert mit S. thermophilus in Kultur auf Milch säuert er viel langsamer als der Wildstamm, von dem er abstammt. Dafür sind sein Wachstum und seine Säuerung quasi normal, wenn die Milch mit Glucose supplementiert wird.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Mutantenstamm von L. bulgaricus, der an β-Galactosidase-Aktivität verarmt ist bzw. keine β-Galactosidase-Aktivität hat, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mangel an β-Galactosidase-Aktivität aus einer Mutation resultiert, die ein Nichtsinn-Codon in die Sequenz einführt, die für die β-Galactosidase codiert.
• Ein Stamm von L. bulgaricus gemäß der Erfindung wurde entsprechend dem Budapester Vertrag am 14. Januar 1998 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), die vom Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, in Paris, unterhalten wird, unter der Nummer I-1968 hinterlegt.
• Dieser Stamm weist die folgenden morphologischen und biochemischen Charakteristika auf:
• – Morphologie: Gram-positiver Mikroorganismus, feine, pleomorphe, asporogene Bazillen, isoliert oder in kurzen Ketten, unbeweglich;
• – Metabolismus: homofermentativ, Katalase (–);
• – Fermentation der Zucker: D-Glucose (+), D-Fructose (+), D-Mannose (+), Aesculin (+).
• Die Erfinder haben das Lactoseoperon bei der Mutanten I-1968 sequenziert. Die entsprechende Sequenz ist im Sequenzprotokoll im Anhang unter der Nummer SEQ ID NO: 1 angegeben. Die Sequenzen der Translationsprodukte (Permease und β-Galactosidase) sind entsprechend unter den Nummern SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 angegeben.
• Die Analyse dieser Sequenz lässt zwei Punktmutationen erscheinen: Eine auf der Ebene des Gens der Permease (Position 122 der Sequenz SEQ ID NO: 1) induziert einen Aminosäureaustausch (Lys → Asn); die andere auf dem Niveau des Gens der β-Galactosidase (Position 4519 der Sequenz SEQ ID NO: 1) führt ein Terminierungskodon ein. Obgleich ihre aktiven Stellen (Positionen 464 und 531) konserviert werden, ist die β-Galactosidase, die durch diese Mutante produziert wird, inaktiv. Die Erfinder haben außerdem festgestellt, dass diese Mutation nach mehreren Replattierungsserien auf ein Kulturmedium, das Glucose enthält, stabil blieb. Auf einem Kulturmedium ohne Glucose kehrt diese Nichtsinn-Mutation sehr schnell mit einer Rate von etwa 10^–6 in den ursprünglichen Zustand zurück.
• Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mutantenstämme, die unfähig sind, die Lactose zu assimilieren und die vom Stamm I-1968 abgeleitet sind. Solche Stämme können zum Beispiel erhalten werden, indem durch gerichtete Mutagenese andere Mutationen im Lactoseoperon des Stamms I-1968 induziert werden.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Milchferment, insbesondere ein Joghurtferment, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens einen L. bulgaricus-Stamm gemäß der Erfindung, wie er oben definiert ist, vorzugsweise in Kombination mit wenigstens einem S. thermophilus-Stamm umfasst.
• Um ein Ferment gemäß der Erfindung zu erhalten, kann man einen beliebigen S. thermophilus-Stamm verwenden, der für die Herstellung von Joghurt geeignet ist; die Wahl eines S. thermophilus-Stamms oder mehrerer S. thermophilus-Stämme kann als Funktion der zusätzlichen Charakteristika, die man gegebenenfalls dem Endprodukt verleihen möchte, durchgeführt werden.
• Als Beispiel für S. thermophilus-Stämme, die in Kombination mit einem Stamm von L. bulgaricus gemäß der Erfindung verwendet werden können, kann man die folgenden Stämme nennen, die bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), die vom Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, Paris, unterhalten wird, hinterlegt wurden:
• – der Stamm, der am 25. August 1994 unter der Nummer I-1470 hinterlegt wurde, und der Stamm, der am 23. August 1995 unter der Nummer I-1620 hinterlegt wurde; diese 2 Stämme sind in der europäischen Patentanmeldung beschreiben, welche unter der Nummer 96/06924 publiziert wurde;
• – die Stämme, die am 30. Dezember 1994 unter den Nummern I-1520 und I-1521 hinterlegt wurden; diese 2 Stämme sind in der Internationalen Patentanmeldung PCT WO 96/20607 beschrieben;
• – der Stamm, der am 24. Oktober 1995 unter der Nummer I-1630 hinterlegt wurde; die Merkmale dieses Stamms sind in der Internationalen Patentanmeldung PCT WO 96/01701 beschrieben: Diese Stämme können untereinander kombiniert werden oder können mit einem oder mehreren anderen industriellen Stämmen von S. thermophilus kombiniert werden.
• Der Stamm oder die Stämme von S. thermophilus werden mit dem Stamm oder den Stämmen von L. bulgaricus gemäß der Erfindung in der gleichen Weise und in denselben Verhältnissen wie die traditionellen Fermente des Joghurts kombiniert; die Bakterienpopulation L. bulgaricus gemäß der Erfindung kann zum Beispiel zwischen 10 und 90%, vorzugsweise zwischen 20 und 50%, der gesamten bakteriellen Population darstellen.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines fermentierten Milchprodukts, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Stufe umfasst, im Verlauf der man Milch mithilfe eines Milchferments, das mindestens einen L. bulgaricus-Stamm gemäß der Erfindung umfasst, in Gegenwart mindestens eines durch den Stamm assimilierbaren Zuckers fermentiert; dabei kann es sich insbesondere um Fructose, Mannose und vorzugsweise Glucose handeln. Vorteilhafterweise ist das fermentierte Milchprodukt ein Joghurt.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ähnelt den traditionellen Verfahren zur Herstellung des Joghurts, was die Hauptmodalitäten der Durchführung der Stufe der kontrollierten Säuerung betrifft; diese Säuerung wird insbesondere bei einer Temperatur zwischen 20 und 45°C und vorzugsweise zwischen 30 und 45°C und in „Charge” durchgeführt, d. h., in einer einzigen Stufe und unter Verwendung eines einzigen Fermentationsbottichs.
• Die Dauer dieser Stufe der kontrollierten Säuerung liegt im Allgemeinen in der Größenordnung von 6 bis 24 Stunden und vorzugsweise in der Größenordnung von 6 bis 16 Stunden; sie ist demnach länger als im Fall der klassischen Verfahren zur Joghurtherstellung (wo sie 3 bis 5 Stunden bei 44°C durchgeführt ist). In der Tat wachsen die Stämme von L. bulgaricus gemäß der Erfindung, selbst in Kombination mit S. thermophilus, viel langsamer und säuern viel langsamer als die Wildstämme.
• Außerdem variiert die Geschwindigkeit des Wachstums und der Säuerung der erfindungsgemäßen Stämme von L. bulgaricus sehr deutlich in Funktion der Glucosemenge, die der Milch zugesetzt wird. Diese Eigenschaft ermöglicht es, ihr Wachstum und ihre Säuerung zu kontrollieren, und zwar durch einfachen Zusatz der gewünschten Glucosemenge zu Beginn der Fermentation.
• Die Erfinder haben darüber hinaus beobachtet, dass sich die Säuerung bei Verwendung der erfindungsgemäßen L. bulgaricus-Stämme oder der erfindungsgemäßen Fermente beträchtlich verlangsamt, wenn der pH die Zone von 4,8 bis 4,5 erreicht (was der pH-Zone entspricht, bei der man die Säuerung im Fall eines traditionellen Verfahrens anhält) und sich stabilisiert, selbst wenn man die Milch bei Fermentationstemperatur bei einem pH-Level hält. Der Wert dieses pH-Levels hängt im Wesentlichen von der zugesetzten Glucosemenge ab.
• Diese Eigenschaft ermöglicht es, die Abkühlungsphase, die in den traditionellen Verfahren zur Herstellung von Joghurt verwendet wird, um die Fermentation zu stoppen, zu reduzieren, sogar zu eliminieren. Sie unterdrückt im Übrigen die Notwendigkeit, den pH zu messen, um den optimalen Zeitpunkt zum Anhalten der Fermentation zu bestimmen; es ist möglich, für ein vorgegebenes Ferment und eine vorgegebene Glucosezusatzmenge ohne Gefahr einer Übersäuerung die Fermentation am Ende eines vorgegebenen Zeitraums anzuhalten, wobei dieser Zeitraum als Funktion der Zeit berechnet wird, die notwendig ist, um den pH-Level zu erreichen. Dies ermöglicht die beste Kontrolle der Regulierung des End-pHs und der Textur des Produktes am Ende der Fermentation.
• Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und entsprechend dem Säuerungsgrad, den man erreichen möchte, liegt die Menge an Glucose, die vor der Fermentation der Milch zugesetzt wird, vorzugsweise zwischen 0,5 und 10 g/l, bevorzugter zwischen 0,5 und 5 g/l.
• Das derart erhaltene fermentierte Produkt kann mehrere Stunden bei einer Temperatur nahe der Fermentationstemperatur ohne pH-Senkung aufbewahrt werden; dies ermöglicht es, die Anlagen zur Zwischenlagerung in der Kälte zu reduzieren und die Kapazität der Fermentationsbottiche zu vergrößern.
• Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht es, die Nachsäuerung in den fermentierten Produkten im Verlauf ihrer Konservierung über einen längeren Zeitraum zu verringern. Der Nachsäuerungsgrad kann entsprechend der Zusammensetzung des Ferments und der verwendeten Glucosemenge variieren. Jedoch liegt die Nachsäuerung immer deutlich unter der, die im Fall von Joghurts beobachtet wird, die mit den traditionellen Fermenten und den traditionellen Verfahren erhalten werden.
• Beispielsweise haben von den Erfindern durchgeführte Experimente gezeigt, dass der ΔpH-Wert unter denselben Konservierungsbedingungen (28 Tage Konservierung bzw. Aufbewahrung bei 10°C) (ΔpH = Differenz zwischen dem pH am Tag 0 und dem pH am Tag 28) zwischen 0,05 und 0,4 im Fall der Produkte liegt, die mithilfe eines erfindungsgemäßen Ferments erhalten werden, während er im Fall von Vergleichsfermenten, bei denen der Stamm L. bulgaricus gemäß der Erfindung durch einen Wildstamm ersetzt wurde, immer über 0,7 lag.
• Diese schwache Nachsäuerung ist von einem guten Überleben der Stämme des Ferments begleitet; die Population von L. bulgaricus ist am Ende der Konservierung in dem erfindungsgemäß erhaltenen Produkt nur leicht weniger als im Vergleichsprodukt.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch fermentierte Milchprodukte, die unter Verwendung eines Verfahrens gemäß der Erfindung erhalten werden.
• Diese Produkte können über eine längere Zeit und bei einer höheren Temperatur als die Produkte, die durch die traditionellen Verfahren erhalten werden, konserviert werden und besitzen organoleptische Charakteristika, die im Verlauf der Aufbewahrung stabil bleiben.
• BEISPIEL 1: BIOCHEMISCHE DOSIERUNG DER BETA-GALACTOSIDASE-AKTIVITÄT EINER MUTANTE GEMÄSS DER ERFINDUNG
• Die β-Galactosidase-Aktivität des Stamms I-1968 wurde mit der des Wildstamms von L. bulgaricus (im Folgenden LbS genannt), von dem er abstammt, verglichen.
• Man kultivierte die Bakterien während einer Nacht auf MRS-Agar (MERCK) als Medium bei 37°C in einem Anaerobiosebehälter (MERCK) in Gegenwart eines Sauerstofffixierungsmittels (AnaerocultA^®, MERCK).
• Eine Öse mit 10 Mikroliter (NUNC) Bakterien wird in 1 Milliliter sterilem Wasser resuspendiert. Die Bakterien werden durch zwei Zyklen starker Bewegung, 20 Sekunden bei 5.000 Umdrehungen pro Minute in Gegenwart von Glasmikrokügelchen (0,5 mm Durchmesser, BIOSPECT PRODUCTS), danach Zusatz von 0,15 ml Chloroform, lysiert. Man rührt das Ganze 30 Minuten lang bei 37°C, dann ergänzt man mit sterilem Wasser mit 4°C auf 2 ml. Dann wird die β-Galactosidase-Aktivität gemessen: zu 0,2 ml der Zellsuspension gibt man 1,2 ml 0,067 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 6,8, 0,05 ml L-Cystein (SIGMA) mit 0°C, 0,05 ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (SIGMA). Die enzymatische Reaktion wird nach 0, 2, 5 oder 10 Minuten durch einen Milliliter 10% Na₂CO₃-Puffer angehalten und dann führt man eine Messung der OD bei 400 Nanometer mit dem Überstand nach Zentrifugation des Reaktionsmediums durch.
• Die Galactosidaseaktivitäten des Mutterstamms LbS und der Mutante I-1968 gemäß der Erfindung, die gemessen wurden, sind als Funktion der Zeit in 1 dargestellt.
• Die Resultate zeigen, dass die β-Galactosidase bei der erfindungsgemäßen Mutante vollständig inaktiv ist.
• BEISPIEL 2: STABILITÄT DER MUTANTE I-1968 VON L. BULGARICUS
• Die Stabilität der Mutante I-1968 wurde in Medien getestet, die als Kohlenstoffquelle entweder ein Gemisch aus Glucose und Lactose oder nur Lactose enthalten.
• Eine Kultur von I-1968, erhalten aus MRS-Medium, das Glucose enthält, wird auf sterilisierter Milch, die mit einem Hefeautolysat (2 g/l) versetzt ist und mit Glucose (20 g/l) supplementiert ist oder nicht, in Subkultur gebracht. Wenn ein pH von 5,2 (Gerinnung der Milch) erreicht ist, entnimmt man Proben aus jeder Subkultur, an denen man die Fähigkeit der Bakterien, die Zucker zu fermentieren, sowie das Vorliegen von β-Galactosidase-Aktivität (Test auf X-Gal-Platte: weiße Kolonien = β-Galactosidase-minus; blaue Kolonien = β-Galactosidase-plus) analysiert.
• Die Resultate werden durch die Tabelle I unten veranschaulicht. TABELLE I

  Medium	Milch + Glucose (20 g/l)	Milch
  Zeit bis zur Erreichung von pH 5,2	6 h 00	20 h 00
  Fermentation der Zucker	Glucose, Fructose, Mannose	Lactose, Glucose, Fructose, Mannose
  Test auf X-gal-Platte	100% weiße Kolonien	20% weiße Kolonien 80% blaue Kolonien

• Diese Resultate zeigen, dass der Stamm I-1968 in Gegenwart von Glucose sich nicht in einen Stamm umwandelt, der Lactose verwenden kann. In einem Medium, das Lactose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, beobachtet man dagegen eine schnelle Umwandlung des Stamms I-1968 zum ursprünglichen Zustand.
• BEISPIEL 3: SÄUERUNGSEIGENSCHAFTEN, NACHSÄUERUNGSEIGENSCHAFTEN UND ÜBERLEBEN DER VARIANTE I-1968 VON L. BULGARICUS IN SYMBIOSE MIT S. THERMOPHILUS: VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES FESTEN JOGHURTS (FERMENTATION IN BELÜFTETER TROCKENKAMMER)
• Man stellt Joghurtfermente, die mit dem Stamm I-1968 gemäß der Erfindung in Verbindung stehen, mit verschiedenen industriellen Stämmen von S. thermophilus (die verwendeten S. thermophilus-Stämme werden im Nachfolgenden ST1, ST2 und ST3 genannt) her.
• Zum Vergleich stellt man Fermente, die mit dem Mutterstamm LbS und denselben Stämmen von S. thermophilus kombiniert sind, her.
• Zur Herstellung der Fermente werden die Stämme getrennt mit 1% auf die folgende Zusammensetzung geimpft:
  
  Zusammensetzung pro 1 Liter:
  135 g Magermilchpulver
  2 g Hefe-Autolysat
  920 ml destilliertes Wasser
  20 g Glucose (nur für Stamm I-1968)
  Hydratisierung: 10 min
  Pasteurisierung: 30 min bei 95°C.
• Die Milch wird dann auf 44°C abgekühlt und inokuliert, danach bei 44°C bis zum Erhalt einer Azidität von 85°D (Grad Dornic) für die Streptokokken und 80°D für die Lactobazillen inkubiert.
• Die Kulturen werden dann vereinigt, um ein Ferment zu erhalten, das zu 80% aus Streptococcus thermophilus und zu 20% aus Lactobacillus bulgaricus besteht.
• Die so erhaltenen Fermente werden verwendet, um die folgende Präparation zu inokulieren:
  
  Zusammensetzung pro 1 Liter:
  99% Milch
  0, 1 oder 2 g/l Glucose
  Hydratisierung: 10 min
  Pasteurisierung: 10 min bei 95°C.
• Die Milch wird dann auf 44°C gekühlt und mit 1% inokuliert.
• Für jedes Experiment sind die Zusammensetzung des Ferments und die Menge an zugesetzter Glucose in der Tabelle II unten angegeben: TABELLE II

  Experiment	Glucose g/l	Stämme	Prozentualer Anteil
  1	0	ST3 ST2 LbS	64% 16% 20%
  2	0	ST3 St2 I-1968	64% 16% 20%
  3	1	ST3 ST2 I-1968	64% 16% 20%
  4	0	ST1 LbS	80% 20%
  5	0	St1 I-1968	80% 20%
  6	2	ST1 I-1968	80% 20%

• Nach Inokulierung wird die Milch in Kolben verteilt und bei einer Temperatur von 44°C inkubiert. Während der Inkubation wird das Säuerungsprofil verfolgt. Die Produkte werden durch Abkühlung in einer Kühlzelle (16 Stunden bei 4°C) bei pH 4,6 geronnen.
• Die Produkte werden danach einem Lagerungstest bei 10°C unterworfen. Bei diesem Test misst man den pH und die Domic-Azidität nach 1, 14, 21 und 28 Tagen Lagerung bzw. Konservierung.
• Die Säuerungsresultate (Zeit zur Erreichung eines pHs von 4,6 und der Wert des pHs bei 24 h) sind in der folgenden Tabelle III angegeben: TABELLE III

  Experiment	Zeit zur Erreichung des pHs von 4,6 (min)	Zeit zur Erreichung des pHs von 4, 5 (min)	pH bei 24 h
  1	215	236	3,67
  2	550	778	4,33
  3	416	507	4,26
  4	225	241	3,67
  5	660	> 1500	4,54
  6	390	465	4,35

• Die Resultate des Lagerungstests bzw. Konservierungstests bei 10°C (Verfolgung des pHs und der Dornic-Azidität) und auf Überleben (Populationen von S. thermophilus und L. bulgaricus) über 28 Tage sind in der folgenden Tabelle IV angegeben: TABELLE IV

  Experiment	Lagerungszeit (Tage)	pH	Dornic-Azidität	Streptococcus thermophilus – Zellen/ml	Lactobacillus bulgaricus – Zellen/ml
  1 1 1 1	1 14 21 28	4,41 3,98 3,95 3,9	101 140 145 148	7,25E+08 NB NB 7,35+08	3,35E+08 NB NB 3,30E+08
  2 2 2 2	1 14 21 28	4,5 4,23 4,18 4,19	93 110 112 114	5,60E+08 NB NB 5,65E+08	2,90E+07 NB NB 1,87E+07
  3 3 3 3	1 14 21 28	4,49 4,14 4,15 4,15	96 115 117 120	6,90E+08 NB NB 8,65E+08	7,45E+07 NB NB 6,30E+07
  4 4 4 4	1 14 21 28	4,39 3,91 3,9 3,85	105 145 151 157	6,30E+07 NB NB 4,70E+08	4,40E+08 NB NB 6,40E+08
  5 5 5 5	1 14 21 28	4,6 4,58 4,53 4,61	85 80 80 79	9,05E+08 NB NB 9,40E+08	6,70E+07 NB NB 7,00E+07
  6 6 6 6	1 14 21 28	4,51 4,38 4,39 4,42	89 90 96 90	1,05E+09 NB NB 1,62E+09	1,96E+08 NB NB 1,91E+08

  NB: Nicht bestimmt
• Diese Resultate zeigen, dass die Joghurts, die mit den Symbiosen, die den Stamm I-1968 mit einem oder zwei Stämmen von S. thermophilus kombinieren, erhalten werden, eine extrem verringerte Nachsäuerung im Vergleich zu denselben Symbiosen mit dem Mutterstamm LbS aufweisen, wobei am Ende der Fermentation eine reichliche Population und ein gutes Überleben während 28 Tagen bei 10°C beibehalten werden.
• Das Anhalten der Säuerung und das Halten des pHs um 4,6 bis 4,5 während wenigstens 24 Stunden bei 44°C ermöglicht es im Rahmen der Herstellung von fermentiertem Joghurt die Abkühlungsphase im Bottich, die üblicherweise durchgeführt wird, zu reduzieren oder sogar zu eliminieren. SEQUENZPROTOKOLL

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

Claims (9)

1. Mutantenstamm von L. bulgaricus, der an β-Galactosidase-Aktivität verarmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mangel an β-Galactosidase-Aktivität aus einer Nichtsinn-Mutation in der Sequenz, die für die β-Galactosidase kodiert, resultiert.
2. Mutantenstamm von L. bulgaricus nach Anspruch 1, der am 19. Januar 1998 gemäß CNCM unter der Nummer I-1968 hinterlegt wurde.
3. Milchferment, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen L. bulgaricus-Stamm nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.
4. Milchferment nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der L. bulgaricus-Stamm mit mindestens einem S. thermophilus-Stamm kombiniert ist.
5. Verfahren zur Herstellung eines fermentierten Milchproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Stufe umfasst, im Verlauf der man Milch mit Hilfe eines Milchferments, das mindestens einen L. bulgaricus-Stamm nach einem der Ansprüche 1 oder 2 umfasst, in Gegenwart mindestens eines durch den Stamm assimilierbaren Zuckers fermentiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der assimilierbare Zucker Glukose ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anhalten der Fermentation ohne Abkühlen des Milchproduktes erfolgt.
8. Fermentiertes Milchprodukt, das durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7 erhältlich ist.
9. Fermentiertes Milchprodukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt ein Joghurt ist.

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