DE69924006T2

DE69924006T2 - Injizierbares hyaluronsäurederivat mit pharmazeutika/zellen

Info

Publication number: DE69924006T2
Application number: DE69924006T
Authority: DE
Inventors: Marco Radice; Andrea Pastorello; Alessandra Pavesio; Lanfranco Callegaro
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: US20020076810A1; DE69924006D1; ITPD980298A0; WO2000037124A1; EP1140240B1; US7157080B2; CA2355768C; IT1302534B1; US20040142465A1; ITPD980298A1; EP1140240A1; AU1791600A; AU771409B2; ES2239471T3; US6699471B2; CA2355768A1; ATE289829T1; JP2002532568A

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf eine injizierbare, biokompatible und biologisch abbaubare Zusammensetzung gerichtet, umfassend mindestens einen Hyaluronsäurebenzylester oder ein auto-vernetztes Derivat, in Kombination mit mindestens einer Säugerzelle.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Obwohl injizierbare Zusammensetzungen und Träger für derartige Zusammensetzungen auf dem Fachgebiet bekannt sind, existiert immer noch ein Bedarf für injizierbare Zusammensetzungen, die biokompatibel sind, biologisch abbaubar sind, schützende Aspekte für die wirksame Komponente bieten und erhöhte Bioverfügbarkeit der wirksamen Komponenten bereitstellen. Das ist zum Beispiel auf dem Gebiet der Gelenkknorpelwiederherstellung wichtig.
Das Ziel der Wiederherstellung von Gelenkknorpel ist es, die Oberfläche des Gelenks wiederherzustellen, Schmerz zu reduzieren und die weitere Verschlechterung der Gewebe zu verhindern. Bis jetzt sind viele Verfahren zur Behandlung von Knorpelschäden angewandt worden, von denen jedes Nachteile aufgewiesen hat (Tom Minas et al., „Current Concepts in the treatment of Articular Cartilage Defects", Orthopedics, Juni 1997, Band 20, Nr. 6).
Die Knochenmarkstimulierungstechnik besteht darin, subchondrale Knochengewebebereiche mittels Abschürfen oder Perforation zu erreichen und dadurch die Bildung eines Fibrin-Blutgerinnsels, das pluripotente Stammzellen enthält, zu stimulieren. Anschließend differenziert das Blutgerinnsel und nimmt Form an, wobei faserknorpeliges Regenerationsgewebe gebildet wird. Dieses Gewebe hat jedoch nicht die mechanischen Eigenschaften oder die physiologischen und strukturellen Kennzeichen von gesundem, dauerhaftem Gelenkknorpel.
Eine andere Technik besteht darin, in die Schadensstelle ein Stück periostales und perichondrales Gewebe, das beispielsweise aus dem Rippenknorpel entnommen wird, zu implantieren. Eine derartige Behandlung löst die Entwicklung von hyalinem Knorpel aus, aber das Regenerationsgewebe wird schlecht in die umgebenden gesunden Gewebe integriert und das implantierte Gewebe verknöchert anschließend.
Autologe und homologe osteochondrale Transplantate sind invasiv, erfordern komplexe Operationstechniken und tragen das Risiko von beispielsweise Virusinfektion.
Andere Versuche, den Gelenkknorpel zu rekonstruieren, bestehen darin, synthetische Matrizen zu implantieren, in denen allogene Chondrozyten oder Wachstumsfaktoren dispergiert sind, welche die Vermehrung der Chondrozyten stimulieren können. Diese Verfahren erfordern, dass man das Knochengewebe in vitro wachsen lässt und dann in die schadhafte Stelle implantiert. Die am häufigsten verwendeten synthetischen Matrizen sind Kollagengele, Matrizen aus Polyanhydriden, Polyorthoestern, Polyglykolsäure und deren Copolymere. Der Hauptnachteil der Verwendung derartiger Matrizen wird durch die gegen das implantierte Material gerichtete Immunantwort dargestellt. Von Chondrozyten ist bekannt, dass sie in einem Gel gezüchtet werden können, das aus Agarose, Hyaluronsäure, Fibrinkleber, Kollagen und Alginat gebildet wird. Diese Kulturen in einem Gel stellen jedoch nicht die mechanische Stabilität bereit, die für sie notwendig wäre, um sich an der Implantationsstelle anzuhaften und um die Rekonstruktion der Knorpelstruktur zulassen zu können. Darüberhinaus entdifferenzieren Chondrozytenkulturen in Stoffen, wie zum Beispiel Fibrin, zu Zellen, die Fibroblasten ähnlich zu sein scheinen. Obwohl Gele, die aus Stoffen, wie zum Beispiel Agarose, bestehen, Chondrozyten-Redifferenzierung induzieren, ist die Verwendung dieser Verbindung letztendlich noch nicht für interne Anwendung beim Menschen genehmigt worden.
Gelenkknorpelschäden sind auch mit Suspensionen isolierter Chondrozyten in der Abwesenheit von unterstützenden Matrizen behandelt worden. Es wird jedoch angenommen, dass Chondrozyten ihre Lebensfähigkeit verlieren und/oder nicht an der Schadensstelle bleiben und dass sie in fibröses Gewebe versenkte, faserknorpelige Knorpelinseln bilden (siehe US Patent 5.723.331).
Einige aus Hyaluronsäure-Derivaten bestehende biologische Materialien sind verwendet worden, um poröse, abbaubare Gerüste zur Gewebewiederherstellung, zur Rekonstruktion und zur Wundheilung herzustellen (WO-A-97/45532). Es ist gezeigt worden, dass andere das Wachstum von wenig resistenten und schwachen Zellen unterstützen (WO-A-98/56897). Diese Materialien sind jedoch nicht injizierbar.
Diese Nachteile des Stands der Technik werden durch die vorliegende Erfindung überwunden, indem eine injizierbare Zusammensetzung bereitgestellt wird, wie zum Beispiel eine, die Chondrozyten oder Knochenmarksstromazellen enthält, die in einem Gel dispergiert sind, das mindestens ein Hyaluronsäurebenzylester-Derivat oder ein auto-vernetztes Derivat enthält.
Verschiedene Anhaltspunkte sind kürzlich in der Literatur aufgetaucht (siehe beiliegende Zusammenfassung), welche die Verwendung von Zellsuspensionen für Injektionszwecke betreffen, insbesondere Keratinozyten für die Behandlung chronischer Geschwüre und Verbrennungen. Siehe Silverman et al., Plast. Reconstr. Surg., Juni 1999, 103 (7) 1809 – 18 (Kombination von Fibrinogen und Chondrozyten); Atala et al., J. Urol., August 1993, 150 (2 Teil 2) S. 745 – 7 (Chondrozyt-Alginatgel). Keratinozytenkulturen können nach verschiedenen in der Literatur zitierten Verfahren entwickelt werden (in der An- oder Abwesenheit von fötalem Kälberserum, mit chemisch definiertem Kulturmedium, usw.).
Diese Kulturen werden dann in die Wirtsunterlage eingeschleust, indem sie in verschiedenen Medien suspendiert werden, von denen Fibrin sowohl aus autologem als auch kommerziellem Ursprung eins der am häufigsten zitierten ist. Die Verwendung derartiger Verfahren hat erhebliche Nachteile. Erstens muss die Zellsuspension unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden, also müssen die Zellen in einem Medium mit einer anderen Zusammensetzung als der für ihre Anwendung verwendeten gelagert werden, während andere Probleme mit dem als Vehikel verwendeten Fibrinkleber auftreten können, insbesondere wenn dieser nicht autolog ist.
Diese Probleme werden durch die vorliegende Erfindung überwunden, indem Epithelzellen (wie zum Beispiel Keratinozyten) oder Derivate anderen embryonischen Ursprungs aus verschiedenen Gründen in einem auf Hyaluronsäure beruhenden Medium dispergiert werden. Die Herstellung ist perfekt biokompatibel und biologisch sicher, und die Überlebensrate der Zellen ist höher als in Zellsuspensionen in völlig flüssigen Medien. Dieser letzte Punkt ist besonders wichtig. In Fällen, in denen der Patient oder die Anwendungsstelle weit entfernt vom Herstellungsort der Komponente ist, wird der sichere Transport zu einem Problem. Das Produkt wird unvermeidlicherweise während des Transports herumgeschüttelt werden, wobei die Zellen beschädigt werden, und dieses Problem muss gelöst werden. Wenn die Zellen jedoch erfindungsgemäß in einem hochviskosen Medium dispergiert sind, ist dieses Problem überwunden, weil das Wirtsmedium als Polster wirkt. Ein weiterer Vorteil leitet sich aus der Möglichkeit ab, die Zellsuspension effizient auf der zu behandelnden Oberfläche auszubreiten, was eine einfachere Anwendungsweise ist als die derzeit verwendeten Verfahren, die auf Fibrinkleber beruhende Sprays beinhalten.
Eine andere erfindungsgemäße Anwendung betrifft die Möglichkeit, die Zellen im Medium zu suspendieren und sie dann durch Injektion anzuwenden. Andere nichtbeschränkende Anwendungen sind die Verabreichung von (autologen) Fibroblasten für schönheitschirurgische Zwecke oder als Füllstoffe für Gewebeschäden, Herstellungen von (autologen, heterologen oder homologen) Adipozyten zur Vermehrung von Weichgewebe für Anwendungen, wie zum Beispiel die Rekonstruktion von Brüsten oder anderen weichen Körperteilen, und Injektionen von Zellen der Harnwege, wie zum Beispiel Fibroblastoiden oder Knorpelzellen, für die Behandlung von Harninkontinenz. In allen diesen Beispielen hat das auf Hyaluronsäure beruhende Material die doppelte Funktion, als ein Vehikel für Injektionen zu wirken und die Zellpräparation während des Transports zu schützen.
Hyaluronsäure spielt bekanntermaßen eine wesentliche Rolle bei vielen biologischen Vorgängen, wie zum Beispiel Hydratation von Gewebe, Proteoglykan-Organisation, Zelldifferenzierung, Vermehrung und Angiogenese (J. Aigner et al., L. Biomed. Mater. Res. 1998, 42, 172 – 181). Hyaluronsäure-Derivate halten alle Eigenschaften des Glykosaminoglykans aufrecht, mit dem Vorteil, in verschiedene Formen verarbeitet werden zu können und Löslichkeits- und Abbauzeiten zu haben, die nach Art und Prozentsatz der Derivatbildung variieren ( EP 0216453 B1 ). Darüberhinaus bieten die Hyaluronsäure-Derivate aufgrund der Einfügung spezifischer Moleküle in die Struktur der Hyaluronsäure neue Möglichkeiten. Zum Beispiel haben die sulfatierten Derivate der Hyaluronsäure antikoagulierende Eigenschaften und sind resistent gegen Hyaluronidase (WO 95/25751). Es ist gezeigt worden, dass die Zusammensetzungen keine Immunantworten des Organismus auslösen und dass die Chondrozyten, die sie enthalten, ihren Phänotyp aufrechterhalten. Hyaluronsäure-Derivate sind nicht zytotoxisch und lassen die Synthese von Komponenten der extrazellulären Matrix zu, die für die Entwicklung des Knorpelgewebes notwendig sind. Darüberhinaus stellen die Derivate kein einfaches Vehikel für die Zellen dar, sondern sind in der Lage, deren Vermehrung zu stimulieren, und lassen während ihres Abbaus die Entwicklung der Zellen zu dreidimensionalen Strukturen zu. Neben der Stimulierung des Wachstums implantierter Zellen sind die Hyaluronsäure-Derivate in der Lage, eine dem von Säugerföten ähnliche extrazelluläre Umgebung zu schaffen, was die Wiederherstellung von Geweben stimuliert. Darüberhinaus setzen die Hyaluronsäure-Derivate während ihres Abbaus Oligomere frei, wodurch sie die Rekrutierung von Chondrozyten-Vorläuferzellen stimulieren und deren Entwicklung in Richtung der Chondrozyten-Zelllinie begünstigen. Derartige Hyaluronsäure-Derivate sind zur Verwendung bei der Behandlung von Arthropathien vorgeschlagen worden (WO-A-97/49412).
Bekanntermaßen können Hyaluronsäure-Derivate als dreidimensionale, feste Gerüste in Form von Vliesen, Schwämmen, Granulaten, Mikrosphären, Röhren und Gazen verwendet werden, um Stammzellen in vitro wachsen zu lassen (WO 97/18842), in Form von Vliesstoffen, assoziiert mit einer perforierten Membran, für das in vitro-Wachstum von Fibroblasten und Keratinozyten (WO96/33750) und in Form von Vliesstoffen für das Wachstum von Chondrozyten (J. Aigner et al., L. Biomed. Mater. Res., 1998, 42, 172 – 181). Bis jetzt hat jedoch niemand ein injizierbares Gel hergestellt, das Hyaluronsäure-Derivate und Säugerzellen, wie zum Beispiel Chondrozyten, enthält, und das dem Chirurgen ermöglicht, nur gering invasive Operationstechniken zu verwenden, wie zum Beispiel Endoskopie, was den Zellen ermöglicht, in eine Zusammensetzung aufgenommen zu werden, um den Transport zu überleben und unregelmäßig geformte Läsionsstellen vollständig auszufüllen.
Im Gegensatz zu dem Verfahren, feste Unterlagen mit Zellen zu beimpfen, werden die Zellen in der vorliegenden Erfindung gleichmäßig in allen drei Dimensionen überall in der Zusammensetzung in Form eines Gels dispergiert, das erfindungsgemäß hergestellt wird. Die Zusammensetzungen lassen zu, dass sich das regenerierte Gewebe perfekt in das den Schaden umgebende Knorpelgewebe integriert. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können vorteilhaft zur Behandlung sowohl oberflächlicher als auch tiefer Knorpelschäden verwendet werden. Oberflächliche Schäden sind solche, die das Knorpelgewebe allein betreffen, während tiefe Schäden solche sind, die auch das subchondrale Knochengewebe und die Schicht calcifizierten Knorpels zwischen dem subchondralen Knochengewebe und dem Knorpel einschließen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft injizierbare, biokompatible und biologisch abbaubare Zusammensetzungen, welche mindestens ein Hyaluronsäurebenzylester-Derivat und/oder auto-vernetztes Derivat enthalten, und mindestens eine Säugerzelle, insbesondere chondrogene Zellen.
1. Die Hyaluronsäure-Komponente
Die vorliegende Erfindung beschreibt deshalb injizierbare biokompatible, auf einem Benzylester der Hyaluronsäure oder auf einem auto-vernetzten Derivat der Hyaluronsäure beruhende Zusammensetzungen, die einzeln oder im Gemisch miteinander verwendet werden und durch hohe Biokompatibilität gekennzeichnet sind. Auch sind die Materialien vollständig biologisch abbaubar und brauchen nicht von der Anwendungsstelle entfernt zu werden, wodurch eine zweite Operation vermieden wird. Wenn sie in der Form von Gelen hergestellt werden, stellen die vernetzten/querverbundenen Derivate Materialien mit wesentlich höherer Viskosität als das unmodifizierte Polymer und mit variablen Abbauzeiten dar.
Der Begriff „Hyaluronsäure" wird in der Literatur zur Bezeichnung eines sauren Polysaccharids mit verschiedenen Molekulargewichten, gebildet aus Resten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin, verwendet, welches natürlich auf Zelloberflächen, in basischen extrazellulären Stoffen des Bindegewebes von Vertebraten, in der Synovialflüssigkeit der Gelenke, im Glaskörper des Auges, im Gewebe der menschlichen Nabelschnur und im Kamm eines Hahns vorkommt.
Hyaluronsäure spielt im biologischen Organismus eine wichtige Rolle, erstens als eine mechanische Unterstützung der Zellen vieler Gewebe, wie zum Beispiel der Haut, der Sehnen, der Muskel und des Knorpels, und sie ist deshalb die Hauptkomponente der extrazellulären Matrix. Aber Hyaluronsäure übt auch andere Funktionen in den biologischen Vorgängen aus, wie zum Beispiel die Hydratation von Geweben, Schmierung, Zellwanderung, Zellfunktion und Differenzierung. (Siehe zum Beispiel A. Balazs et al., Cosmetics & Toiletries, Nr. 5/84, Seiten 8 – 17). Hyaluronsäure kann aus den vorstehend erwähnten natürlichen Geweben, wie zum Beispiel dem Hahnenkamm, oder auch aus bestimmten Bakterien extrahiert werden.
Heute kann Hyaluronsäure auch durch mikrobiologische Verfahren hergestellt werden. Das Molekulargewicht der ganzen durch Extraktion erhaltenen Hyaluronsäure liegt im Bereich von 8 – 13 Millionen Dalton. Die molekulare Kette des Polysaccharids kann jedoch sehr leicht unter dem Einfluss verschiedener physikalischer und chemischer Faktoren, wie zum Beispiel mechanischer Einflüsse, und unter dem Einfluss von Strahlung, Hydrolysierung, Oxidierung oder enzymatischen Mitteln abgebaut werden. Aus diesem Grund werden im normalen Reinigungsverfahren der ursprünglichen Extrakte oft abgebaute Fraktionen mit einem niedrigeren Molekulargewicht erhalten (siehe Balazs et al., vorstehend zitiert). Hyaluronsäure, ihre molekularen Fraktionen und die entsprechenden Salze sind als Medikamente verwendet worden und ihre Verwendung in der Kosmetik ist vorgeschlagen worden (siehe zum Beispiel den vorstehend erwähnten Artikel von Balazs et al., und das französische Patent Nr. 2478468).
Obwohl der Begriff „Hyaluronsäure" üblicherweise, wie aus dem Vorstehenden ersichtlich, in einer unrichtigen Weise in der Bedeutung einer ganzen Reihe von Polysacchariden mit abwechselnden Resten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin mit verschiedenen Molekulargewichten oder sogar von abgebauten Fraktionen derselben verwendet wird, und obwohl die Pluralform „Hyaluronsäuren" angemessener erscheinen mag, soll die Diskussion hierin weiterhin die Singularform verwenden, um Hyaluronsäure in ihren unterschiedlichen Formen einschließlich ihrer molekularen Fraktionen zu bezeichnen, und die Abkürzung „Hyaluronsäure" wird auch oft verwendet werden, um diesen kollektiven Begriff zu beschreiben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt injizierbare, Hyaluronsäure-Derivate enthaltende Zusammensetzungen, die als geeignete Träger für biologische/pharmakologische Zellen oder Moleküle funktionieren. Hyaluronsäure-Derivate sind sicherlich geeigneter als andere nach dem Stand der Technik bekannte Biomaterialien/Gerüste. Im Vergleich zu einem biologisch abgeleiteten System, wie zum Beispiel azellulärem Kadavermaterial, hat Hyaluronsäure den Vorteil, in unbegrenztem Angebot leicht verfügbar und nicht, wie zum Beispiel allogene Donorgewebe, stark immunogen zu sein. Zusätzlich besteht für Hyaluronsäure kein Risiko der Kreuzkontamination mit Infektionskrankheiten, insbesondere Virusabgeleiteten (HIV, Hepatitis etc.). Im Vergleich zu gereinigteren biologisch abgeleiteten Molekülen, wie zum Beispiel Kollagen, Proteoglykanen oder Fibrin, oder biokompatiblen synthetischen Polymeren, wie zum Beispiel PLLA/PGA, PTFE, hat Hyaluronsäure verschiedene günstige Eigenschaften. Zu allererst ist Hyaluronsäure ein Polysaccharid, das weniger immunogene Reaktionen als übliche Protein- oder auf Proteinen beruhende Verbindungen zeigt. Zweitens wird Hyaluronsäure üblicherweise in allen Säugerarten ohne Modifikation der Molekülstruktur gefunden, und wird daher durch den menschlichen Körper sehr gut gekannt und toleriert. Drittens hat Hyaluronsäure viele biologische Wirkungen sowohl in sich entwickelnden als auch in erwachsenen Menschen, die das Molekül in jedem regenerativen/wiederherstellenden Prozess fundamental erscheinen lassen. Zuletzt ist ein weiterer günstiger Punkt, dass Hyaluronsäure, als Hauptkomponente der extrazellulären Matrix, in fast allen Geweben/Organen des menschlichen Körpers vorliegt. Diese Tatsache macht, zusammen mit der einfachen Zusammensetzung des Polymers, Hyaluronsäure unterschiedlich zu vielen extrazellulären Protein-Matrixmolekülen, wie zum Beispiel Kollagen, die sehr häufig gewebe- bzw. organspezifisch sind. Dieser letzte Punkt ist beim Entwurf eines allgemeinen und biokompatiblen Abgabevehikels, das für verschiedene Kompartimente des menschlichen Körpers verwendet werden soll, sehr wichtig.
2. Die Benzylester-Derivate
Das erste bevorzugte erfindungsgemäße Material beruht auf dem Benzylester der Hyaluronsäure, insbsondere auf den 50 – 75%igen Estern, worin 50% bis 75% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure mit einem Benzylrest verestert sind. Derartige Benzylester, worin 50 bis 75% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure mit einem Benzylrest verestert sind, werden als „partielle Ester" bezeichnet, weil nur ein Teil der Carboxygruppen verestert ist und die übrigen Carboxygruppen entweder frei sind oder als Salz mit einem Alkali- oder Erdalkalimetall wie zum Beispiel Natrium, Calcium oder Kalium voliegen.
Am meisten bevorzugt für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind die Benzylester, worin 50% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure verstert sind. Die erfindungsgemäßen Benzylester der Hyaluronsäure können durch per se bekannte Verfahren zur Veresterung von Carboxysäuren hergestellt werden, zum Beispiel durch Behandlung freier Hyaluronsäure mit dem Alkohol (Benzylalkohol) in Anwesenheit katalysierender Stoffe, wie zum Beispiel starker anorganischer Säuren oder Ionenaustauscher vom sauren Typ, oder mit einem Mittel zur Veretherung, das in der Lage ist, den gewünschten Alkoholrest in der Anwesenheit anorganischer oder organischer Basen einzuführen.
Die Benzylhyaluronsäureester können jedoch vorzugsweise nach einem besonderen, in EP 0 216 453 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, um zum Vorteil zu gereichen. Dieses Verfahren besteht daraus, ein quaternäres Ammoniumsalz der Hyaluronsäure mit einem Mittel zur Veretherung zu behandeln, vorzugsweise in einem aprotischen organischen Lösungsmittel.
Zur Herstellung von Benzylestern ist es möglich, Hyaluronsäuren jeglichen Ursprungs zu verwenden, wie zum Beispiel die aus den vorstehend erwähnten natürlichen Ausgangsmaterialen extrahierten Säuren, zum Beispiel aus Hahnenkämmen. Die Herstellung derartiger Säuren ist in der Literatur beschrieben; vorzugsweise werden gereinigte Hyaluronsäuren verwendet. Erfindungsgemäß werden insbesondere Hyaluronsäuren, umfassend molekulare Fraktionen vollständiger Säuren, verwendet, die direkt durch Extraktion organischer Materialien erhalten werden, mit Molekulargewichten, die in einem weiten Bereich variieren, zum Beispiel von etwa 90% bis 80% (M = 11,7 bis 10,4 Millionen Dalton) bis 0,2% (M = 30.000 Dalton) des Molekulargewichts der vollständigen Säure, die ein Molekulargewicht von 13 Millionen Dalton aufweist, vorzugsweise zwischen 5% und 0,2%. Derartige Fraktionen können mit verschiedenen in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel durch Hydrolysierung, Oxidierung, enzymatische oder physikalische Verfahren, wie zum Beispiel mechanische, oder Strahlungsverfahren. Ursprüngliche Extrakte werden daher oft während derselben Reinigungsverfahren gebildet (siehe zum Beispiel den vorstehend zitierten Artikel von Balazs et al., in „Cosmetics & Toiletries"). Die Trennung und Reinigung der so erhaltenen molekularen Fraktionen wird durch bekannte Techniken zustande gebracht, zum Beispiel durch Molekularfiltration.
Eine zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete Fraktion gereinigter Hyaluronsäure ist zum Beispiel das als „entzündungshemmende NIF-Na-Hyaluronsäure" bekannte Natriumhyaluronat, von Balazs in dem Büchlein „Healon" – A guide to its use in Opthalmic Surgery, D. Miller & R. Stegmann, Hrsg. John Wiley & Sons, N. Y., 81983: S. 5 beschrieben.
Besonders wichtig als Ausgangsmaterial für die Benzylester sind zwei aus Hyaluronsäure erhältliche gereinigte Fraktionen, zum Beispiel die aus Hahnenkämmen extrahierten, als „Hyalastin" und „Hyalectin" bekannten. Die Fraktion Hyalastin hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 50.000 bis 100.000 Dalton, während die Fraktion Hyalectin ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen etwa 500.000 und 730.000 Dalton hat. Eine kombinierte Fraktion dieser beiden Fraktionen ist auch isoliert worden und ist durch ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 250.000 bis etwa 350.000 Dalton gekennzeichnet. Diese kombinierte Fraktion kann mit einer Ausbeute von 80% der gesamten im jeweiligen Ausgangsmaterial verfügbaren Hyaluronsäure erhalten werden, während die Fraktion Hyalectin mit einer Ausbeute von 30% und die Fraktion Hyalastin mit einer Ausbeute von 50% der anfänglichen Hyaluronsäure erhalten werden. Die Herstellung dieser Fraktionen wird in EP 0 138 572 beschrieben.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung der Benzylester der Hyaluronsäure.
Beispiel 1 – Herstellung des 50%igen Benzylesters der Hyaluronsäure (Hyaluronsäure) – 50% veresterte Carboxygruppen – 50% als Salz vorliegende Carboxygruppen (Na)
12,4 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000 Dalton, entsprechend 20 Milliäquivalent einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25°C solubilisiert, 10 Milliäquivalent) Benzylbromid werden hinzugefügt und die so erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur von 30 12 Stunden lang aufbewahrt.
Eine 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthaltende Lösung wird hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wird langsam unter ständigem Rühren in 3.500 ml Aceton gegossen. Ein Niederschlag bildet sich, der filtriert und drei Mal mit 500 ml Aceton/Wasser 5:1 und drei Mal mit Aceton gewaschen und schließlich acht Stunden lang bei 30° Vakuum-getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml 1 % Natriumchlorid enthaltendem Wasser gelöst und die Lösung wird langsam unter ständigem Rühren in 3.000 ml Aceton gegossen. Ein Niederschlag bildet sich, der filtriert und zwei Mal mit 500 ml Aceton/Wasser (5:1) und drei Mal mit 500 ml Aceton gewaschen und schließlich 24 Stunden lang bei 30° Vakuum-getrocknet wird. 8,6 g der partiellen Benzylester-Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Esterreste wird unter Verwendung des Verfahrens von R. H. Cundiff und P. C. Markunas ausgeführt [Anal. Chem. 33, 1028 – 1030, (1961)].
Beispiel 2 – Herstellung des 75%igen Benzylesters der Hyaluronsäure (Hyaluronsäure) – 75% veresterte Carboxygruppen – 25% als Salz vorliegende Carboxygruppen (Na)
12,4 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 250.000 Dalton, entsprechend 20 Milliäquivalent einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25°C solubilisiert, 2,5 g (15 Milliäquivalent) Benzylbromid werden hinzugefügt und die so erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur von 30° 12 Stunden lang aufbewahrt.
Eine 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthaltende Lösung wird hinzugefügt und das so erhaltene Gemisch wird langsam unter ständigem Rühren in 3.500 ml Aceton gegossen. Ein Niederschlag bildet sich, der filtriert und drei Mal mit 500 ml Aceton/Wasser 5:1 und drei Mal mit Aceton gewaschen und schließlich acht Stunden lang bei 30°C Vakuum-getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml 1 % Natriumchlorid enthaltendem Wasser gelöst und die Lösung wird langsam unter ständigem Rühren in 3.000 ml Aceton gegossen. Ein Niederschlag bildet sich, der filtriert und zwei Mal mit 500 ml Aceton/Wasser 5:1 und drei Mal mit 500 ml Aceton gewaschen und schließlich 24 Stunden lang bei 30°C Vakuum-getrocknet wird. 9 g der partiellen Benzylester-Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Esterreste wird unter Verwendung des Verfahrens von R. H. Cundiff und P. C. Markunas ausgeführt [Anal. Chem. 33, 1028 – 1030, (1961)].
Beispiel 3 – Herstellung des 75%igen Esters der Hyaluronsäure – 75% veresterte Carboxygruppen – 25% als Salz vorliegende Carboxygruppen (Na)
12,4 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 80.000 Dalton, entsprechend 20 Milliäquivalent einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25° solubilisiert, 2,5 g (15 Milliäquivalent) Benzylbromid werden hinzugefügt, und die so erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur von 30° 12 Stunden lang aufbewahrt.
Eine 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthaltende Lösung wird hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wird langsam unter ständigem Rühren in 3.500 ml Aceton gegossen. Ein Niederschlag bildet sich, der filtriert und drei Mal mit 500 ml Aceton/Wasser-Gemisch 5:1 und drei Mal mit Aceton gewaschen und schließlich acht Stunden lang bei 30° Vakuum-getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml 1 % Natriumchlorid enthaltendem Wasser gelöst und die Lösung wird langsam unter ständigem Rühren in 3.000 ml Aceton gegossen. Ein Niederschlag bildet sich, der filtriert und zwei Mal mit 500 ml Aceton/Wasser-Gemisch 5:1 und drei Mal mit 500 ml Aceton gewaschen und schließlich 24 Stunden lang bei 30° Vakuum-getrocknet wird. 9 g der partiellen Benzylester-Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Esterreste wird unter Verwendung des Verfahrens von R. H. Cundiff und P. C. Markunas ausgeführt [Anal. Chem. 33, 1028 – 1030, (1961)].
3. Die auto- (oder intern) vernetzten Hyaluronsäure-Derivate (ACP-Derivate)
Die in den erfindungsgemäßen Materialien verwendeten auto-vernetzten Hyaluronsäure-Derivate werden in EP 0 341 745 beschrieben. Die vernetzten/querverbundenen Derivate sind inter- und/oder intramolekulare Ester der Hyaluronsäure, worin ein Teil der Carboxygruppen mit Hydroxylgruppen desselben Moleküls und/oder anderer Moleküle der Hyaluronsäure verestert sind, wobei Lactone oder intermolekulare Esterbindungen gebildet werden. Diese „inneren" Ester, in welchen es keine Intervention von OH-Gruppen anderer Alkohole gibt, können auch als „autovernetzte Hyaluronsäure" (auch als „ACP" bezeichnet) definiert werden, da die Bildung einer mono- oder polymolekularen Vernetzung/Querverbindung die Folge der vorstehend erwähnten internen Veresterung ist. Die Adjektive „vernetzt/querverbunden" beziehen sich auf die quer hinübergehenden Verbindungen zwischen den Carboxy- und Hydroxylgruppen der Hyaluronsäure-Moleküle.
Die auto-vernetzten Produkte sind insbesondere partielle innere Ester, worin der Prozentsatz von „Vernetzungen/Querverbindungen" vorzugsweise zwischen 3 und 15% der Anzahl an Carboxygruppen in der Hyaluronsäure variiert. Im Herstellungsverfahren werden die Carboxygruppen des Hyaluronsäure-Moleküls durch die Zugabe von Stoffen aktiviert, die zur Induktion einer derartigen Aktivierung in der Lage sind. Die aus der Aktivierungsreaktion erhaltenen unstabilen Intermediärprodukte trennen sich spontan, entweder nach der Zugabe von Katalysatoren und/oder auf einen Temperaturanstieg folgend, wobei sie die vorstehend erwähnten inneren Esterbindungen mit Hydroxylgruppen desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls bilden. Nach dem Grad der erwünschten inneren Veresterung werden entweder alle oder ein Aliquot der Carboxyfunktionen aktiviert (wobei das Aliquot durch Verwendung eines Überschusses der aktivierenden Stoffe oder durch geeignete Dosierungsverfahren erhalten wird).
Die in innere Esterreste umzuwandelnden Carboxygruppen können ausgehend von Hyaluronsäure, die freie Carboxygruppen enthält, aktiviert werden, oder vorzugsweise von Hyaluronsäure, die als Salz vorliegende Carboxygruppen enthält, zum Beispiel Metallsalze, vorzugsweise Alkali- oder Erdalkalimetalle, und vor allem mit quaternären Ammoniumsalzen, wie zum Beispiel die nachstehend beschriebenen. Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Amine, können jedoch auch als Ausgansgsmaterial verwendet werden.
Verfahren zur Aktivierung von freien oder als Salz vorliegenden Carboxygruppen sind per se bekannt, besonders auf dem Gebiet der Peptidsynthese, und Fachleute können leicht bestimmen, welches Verfahren am geeignetsten ist, besonders ob die Ausgangsstoffe in ihrer freien oder als Salz vorliegenden Form verwendet werden sollen oder nicht. Per se für Peptidsyntheseverfahren bekannte und in den erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren nützliche Aktivierungsverfahren werden zum Beispiel in Bodanszky, M., In search of new methods in peptide synthesis, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 1985, 449 – 474; und Gross, E., et al., The Peptides, Analysis Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., 1979, Band 1, Kapitel 2, beschrieben. Nach derartigen Verfahren wird eine Carboxykomponente aktiviert, d. h. eine Carboxykomponente wird in eine reaktive Form umgewandelt. Eine derartige Aktivierung schließt normalerweise eine Reaktion zwischen einer Säure und einem aktivierenden Mittel nach dem folgenden Schema ein:
worin X eine Elektronen entziehende Einheit ist. Die meisten aktivierten Derivate von Carboxylsäuren sind daher gemischte Anhydride, im weiten Sinne auch Säureazide und Säurechloride einschließend, welche als gemischte Anhydride der Stickstoffwasserstoffsäure und HCl als den aktivierenden Mitteln betrachtet werden können. Zusätzlich kann die Aktivierung der Carboxykomponente durch die Bildung von intermediären „aktivierten Estern" erreicht werden. Diese „aktivierten Ester" können verschiedener Art sein, aber besonders nützliche „aktivierte Ester" sind jene, die durch Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid, p-Nitrophenylestern, Trichlorphenylestern, Pentachlorphenylestern und O-Acyl-Derivaten von Hydroxylaminen, insbesondere Ester von N-Hydroxysuccinimid, hergestellt werden.
Alle diese verschiedenen Arten von Aktivierungsverfahren sind bei der Herstellung der erfindungsgemäßen vernetzten/querverbundenen Hyaluronsäure nützlich, da alle diese Verfahren als solche gekennzeichnet werden können, die wichtigerweise die Reaktion einer Carboxygruppe mit einem aktivierenden Mittel einschließen, was im Wesentlichen zur Bildung eines Substituentenrestes führt, der leicht mit einer Hydroxylgruppe reagiert, wodurch sich die innere Esterverbindung leicht bildet, die für die erfindungsgemäßen Produkte kennzeichnend ist, wobei die Zahl der in innere Ester umzuwandelnden Carboxyfunktionen im Verhältnis zur Zahl der aktivierten Carboxyfunktionen steht und diese Zahl von der Qualität der aktivierenden Mittel abhängt.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung vernetzter/querverbundener Hyaluronsäure ist daher durch die Behandlung von Hyaluronsäure mit freien oder als Salz vorliegenden Carboxygruppen mit einem Mittel gekennzeichnet, welches die Carboxyfunktion aktiviert, möglicherweise in Anwesenheit eines Hilfsmittels, das die Bildung von aktivierten intermediären Derivaten begünstigt und/oder einer tertiären organischen oder anorganischen Base, durch Einwirkung von Wärme oder Strahlung (insbesondere mit UV-Licht) auf das Gemisch, und, falls gewünscht, durch Salzbildung freier Carboxygruppen oder durch Freisetzung als Salz vorliegender Carboxygruppen. Von den Stoffen, die in der Lage sind, die Carboxygruppe zu aktivieren, können die üblichen in der Literatur beschriebenen verwendet werden, zum Beispiel jene, die normalerweise bei der Synthese von Peptiden verwendet werden, jedoch mit Ausnahme von denen, welche eine Veränderung oder Zerstörung der Molekularstruktur der Ausgangs-Hyaluronsäure bewirken würden, wie zum Beispiel jene, die für die Bildung von Carboxylhaliden verwendet werden. Bevorzugte Stoffe, die zur Bildung aktivierter Ester führen, sind zum Beispiel Carbodiimide, Dicyclohexylcarbodiimid, Benzylisopropylcarbodiimid, Benzylethylcarbodiimid; Ethoxyacetylen; Woodward's Reagenz (N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3-sulfonat) oder Halogen-Derivate aus aliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen oder aus einer heterozyklischen Verbindung mit Halogen, das durch die Anwesenheit einer oder zweier aktivierender Gruppen mobil gemacht wird, wie zum Beispiel Chloracetonitril und besonders die Salze von 2-Chlor-N-alkylpyridin, wie zum Beispiel das Chlorid von 2-Chlor-N-methylpyridin oder andere Alkylderivate mit Niederalkylresten, wie zum Beispiel jene mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen. Anstelle der Chlorid-Derivate können natürlich andere Halogenderivate verwendet werden, wie zum Beispiel Bromid-Derivate.
Diese Aktivierungsreaktion kann in organischen Lösungsmitteln ausgeführt werden, besonders in aprotischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Dialkylsulfoxiden, Dialkylcarboxylamiden, wie zum Beispiel insbesondere Niederalkyl-Dialkylsulfoxide, besonders Dimethylsulfoxid, Polymethylensulfoxide, wie zum Beispiel Tetra methylensulfoxid, Dialkyl- oder Polymethylensulfone, wie zum Beispiel Tetramethylensulfon, Sulfolan und Niederalkyl-Dialkylamide niederaliphatischer Säuren, in welchen die Alkylreste höchstens sechs Kohlenstoffatome haben, wie zum Beispiel Dimethyl- oder Diethylformamid oder Dimethyl- oder Diethylacetamid. Andere Lösungsmittel können jedoch auch verwendet werden, und diese müssen nicht immer aprotisch sein, wie zum Beispiel Alkohole, Ether, Ketone, Ester, wie zum Beispiel niederaliphatische Dialkyloxyhydrocarbide, wie zum Beispiel Dimethoxyethan, und besonders aliphatische oder heterozyklische Alkohole und Ketone mit einem niedrigen Siedepunkt, wie zum Beispiel niedere N-Alkylpyrrolidone, wie zum Beispiel N-Methylpyrrolidon oder N-Ethylpyrrolidon, Hexafluorisopropanol und Trifluorethanol. Wenn Halogen-Derivate als carboxylaktivierende Stoffe verwendet werden, besonders in Form von Salzen, wie zum Beispiel das vorstehend erwähnte 2-Chlor-N-methylpyridiniumchlorid, ist es besser, ein Metallsalz oder ein Salz der organischen Base des Ausgangs-Polysaccharids zu verwenden, besonders eines der nachstehend beschriebenen quaternären Ammoniumsalze, wie zum Beispiel ein Tetrabutylammoniumsalz. Diese Salze haben den besonderen Vorteil, in den vorstehend erwähnten organischen Lösungsmitteln sehr löslich zu sein, in denen die Vernetzungs-/Querverbindungsreaktion am besten bewirkt wird, wodurch eine ausgezeichnete Ausbeute garantiert wird. Es ist ratsam, dem Gemisch einen Säureabziehenden Stoff hinzuzufügen, wie zum Beispiel organische Basen, Carbonate, Bicarbonate oder Alkali- oder Erdalkaliacetate oder organische Basen und speziell tertiäre Basen, wie zum Beispiel Pyridin und seine Homologen, wie zum Beispiel Collidin, oder aliphatische Aminbasen, wie zum Beispiel Triethylamin oder N-Methylpiperazin.
Die Verwendung quaternärer Ammoniumsalze stellt ein besonders vorteilhaftes Verfahren dar. Derartige Ammoniumsalze sind wohlbekannt und werden auf die gleiche Weise hergestellt wie andere bekannte Salze. Sie leiten sich von Alkylresten mit vorzugsweise zwischen 1 und 6 Kohlenstoffatomen ab. Es wird bevorzugt, dass Tetrabutylammoniumsalze verwendet werden. Eine Abweichung des Verfahrens, bei dem quaternäre Ammoniumsalze verwendet werden, besteht daraus, ein Alkalisalz, zum Beispiel ein Natrium- oder Kaliumsalz, in Anwesenheit einer katalysierenden Menge eines quaternären Ammoniumsalzes, wie zum Beispiel Tetraammoniumiodid, umzusetzen.
Die Stoffe, welche die Aktivierung der den aktivierenden Mitteln hinzuzufügenden Carboxygruppen katalysieren, sind in der Literatur angegeben, und auch diese sind vorzugsweise Basen, wie zum Beispiel die vorstehend erwähnten. So wird zum Beispiel bevorzugt, dass ein wenig Triethylamin zum Reaktionsgemisch hinzugefügt wird, wenn die Carboxygruppen mit Isothiazolinsalzen aktiviert werden.
Die Bildungsreaktion aktivierter Zwischenprodukte, wie zum Beispiel und besonders von Estern, wird bei der in der Literatur empfohlenen Temperatur ausgeführt, und diese Temperatur kann jedoch variiert werden, sollten die Umstände dies erfordern, wie von einem Fachmann leicht bestimmt werden kann. Die Bildung innerer Esterbindungen kann innerhalb eines recht weiten Temperaturbereichs zustande kommen, zum Beispiel zwischen 0 und 150, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder etwas darüber, zum Beispiel zwischen 20 und 75. Temperaturerhöhung begünstigt die Bildung innerer Esterbindungen, wie auch die Einwirkung von Strahlung mit einer geeigneten Wellenlänge, wie zum Beispiel UV-Strahlung.
Das Substrat der Hyaluronsäure kann aus jeglichem Ursprung stammen und unterschiedlicher vorstehend diskutierter Art sein. Die bevorzugten Hyaluronsäure-Ausgangsmaterialien sind jene mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 150.000 bis 730.000 Dalton, besonders 150.000 bis 450.000 Dalton.
Zusätzlich kann die Menge der internen Vernetzung/Querverbindung variieren, aber bevorzugte erfindungsgemäße Materialien verwenden zu einem Grad von 3 bis 15% der Carboxygruppen vernetzte/querverbundene Hyaluronsäure.
Wenn die vernetzten/querverbundenen Derivate in Form von Gelen hergestellt werden, haben sie eine höhere Viskosität als die unmodifizierte Hyaluronsäure. Durch Kontrolle der Viskosität kann sowohl die Abbauzeit als auch die Wirkung auf die Adhäsionsvermeidung variiert werden. Gele mit einer Viskosität von mindestens 200 Pa·sec-1 werden bevorzugt. Stärker bevorzugt sind Gele mit einer Viskosität von mindestens 250 Pa·sec'' oder sogar 300 Pa·sec'' und am meisten bevorzugt sind Gele mit einer Viskosität von mindestens 350 Pa sec-1 oder 400 Pa sec-1.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung nützlicher vernetzter/querverbundener Hyaluronsäureprodukte bei der Herstellung erfindungsgemäßer Materialien.
Beispiel 4: Herstellung der 3% vernetzten/querverbundenen Hyaluronsäure (Hyaluronsäure)
Produktbeschreibung:
3% der Carboxygruppen bei der internen Veresterung verwendet.
97% der Carboxygruppen als Natriumsalz vorliegend.
6,21 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000 Dalton entsprechend 10 Milliäquivalent einer monomeren Einheit werden in 248 ml DMSO bei 25°C solubilisiert. 0,03 g (0,3 Milliäquivalent) Triethylamin werden hinzugefügt.
Eine Lösung von 0,076 g (0,3 Milliäquivalent) 2-Chlor-1-methylpyridiniumchlorid in 60 ml DMSO wird langsam tropfenweise über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt, und das Gemisch wird 15 Stunden lang bei 30°C stehen gelassen.
Eine aus 100 ml Wasser und 2,5 g Natriumchlorid gebildete Lösung wird dann hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wird dann langsam in 750 ml Aceton gegossen, wobei ständiges Rühren beibehalten wird. Ein Niederschlag bildet sich, der dann filtriert und drei Mal in 100 ml Aceton/Wasser 5:1 und drei Mal mit 100 ml Aceton gewaschen wird und schließlich 24 Stunden lang bei 30° Vakuum-getrocknet wird.
4 g der Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Esterreste wird nach dem auf den Seiten 169 – 172 von „Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Auflage, John Wiley and Sons Publication, beschriebenen Verseifungsverfahren ausgeführt.
Beispiel 5 – Herstellung der 5% vernetzten/querverbundenen Hyaluronsäure (ACP 5%)
Produktbeschreibung:
5% der Carboxygruppen bei der internen Veresterung verwendet.
95% der Carboxygruppen als Natriumsalz vorliegend.
6,21 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 95.000 Dalton entsprechend 10 Milliäquivalent einer monomeren Einheit werden in 248 ml DMSO bei 25°C solubilisiert. 0,051 g (0,5 Milliäquivalent) Triethylamin wird hinzugefügt, und die so erhaltene Lösung wird 30 Minuten lang gerührt.
Eine Lösung von 0,128 g (0,5 Milliäquivalent) 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid in 60 ml DMSO wird langsam tropfenweise über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt, und das Gemisch wird 15 Stunden lang bei 30°C aufbewahrt.
Eine aus 100 ml Wasser und 2,5 g Natriumchlorid gebildete Lösung wird dann hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wird dann langsam in 750 ml Aceton gegossen, wobei ständiges Rühren beibehalten wird. Ein Niederschlag bildet sich, der dann filtriert und drei Mal in 100 ml Aceton/Wasser 5:1 und drei Mal mit 100 ml Aceton gewaschen wird und schließlich 24 Stunden lang bei 30°C Vakuumgetrocknet wird.
3,95 g der Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Esterreste wird nach dem auf den Seiten 169 – 172 von „Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschriebenen Verseifungsverfahren ausgeführt.
Beispiel 6: Herstellung der 10% vernetzten/querverbundenen Hyaluronsäure (Hyaluronsäure)
Produktbeschreibung:
10% der Carboxygruppen bei der internen Veresterung verwendet.
90% der Carboxygruppen als Natriumsalz vorliegend.
6,21 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 620.000 Dalton entsprechend 10 Milliäquivalent einer monomeren Einheit werden in 248 ml DMSO bei 25°C solubilisiert. 0,101 g (1,0 Milliäquivalent) Triethylamin wird hinzugefügt und die so erhaltene Lösung wird 30 Minuten lang gerührt.
Eine Lösung von 0,255 g (1,0 Milliäquivalent) 2-Chlor-1-methylpyridiniumchlorid in 60 ml DMSO wird langsam tropfenweise über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt und das Gemisch wird 15 Stunden bei 30°C aufbewahrt.
Eine aus 100 ml Wasser und 2,5 g Natriumchlorid gebildete Lösung wird dann hinzugefügt und das so erhaltene Gemisch wird langsam in 750 ml Aceton gegossen, wobei ständiges Rühren beibehalten wird. Ein Niederschlag bildet sich, der dann filtriert und drei Mal in 100 ml Aceton/Wasser 5:1 und drei Mal mit 100 ml Aceton gewaschen wird und schließlich 24 Stunden lang bei 30°C gefriergetrocknet wird.
3,93 g der Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der Esterreste wird nach dem auf den Seiten 169 – 172 von „Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschriebenen Verseifungsverfahren ausgeführt.
Beispiel 7: Herstellung der 15% vernetzten/querverbundenen Hyaluronsäure Hyaluronsäure)
Produktbeschreibung:
15% der Carboxygruppen bei der internen Veresterung verwendet.
85% der Carboxygruppen als Natriumsalz vorliegend.
6,21 g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000 Dalton entsprechend 10 Milliäquivalent einer monomeren Einheit werden in 248 ml DMSO bei 25°C solubilisiert. 0,152 g (1,5 Milliäquivalent) Triethylaminchlorid wird hinzugefügt, und die so erhaltene Lösung wird 30 Minuten lang gerührt.
Eine Lösung von 0,382 g (1,5 Milliäquivalent) 2-Chlor-1-methylpyridiniumchlorid in 20 ml DMSO wird langsam tropfenweise über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt, und das Gemisch wird 30 bis 45 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Eine aus 100 ml Wasser und 2,5 g Natriumchlorid gebildete Lösung wird hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wird langsam in 750 ml Aceton gegossen, wobei ständiges Rühren beibehalten wird. Ein Niederschlag bildet sich, der dann filtriert und drei Mal mit 100 ml Aceton/H₂O 5:1 und drei Mal mit 100 ml Aceton gewaschen wird und schließlich 24 Stunden lang bei 30°C Vakuum-getrocknet wird.
3,9 g der Titelverbindung werden erhalten. Eine quantitative Bestimmung der gesamten Esterreste wird gemäß dem auf den Seiten 169 – 172 von „Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschriebenen Verseifungsverfahren ausgeführt.
4. Die Säugerzellkomponente
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders nützlich, um ein optimales Abgabesystem für die lokale Anwendung von Zellen bereitzustellen. Viele Pathologien sind auf wesentlichen Substanzverlust zurückzuführen, der durch natürliche wirtsgetriebene Mechanismen kaum selbst wiederhergestellt wird oder sogar überhaupt nicht wiederhergestellt wird. In fast allen Fällen ergibt die Wiederherstellung ein Gewebe, dass im Hinblick auf biologische, histologische und funktionelle Eigenschaften dem ursprünglichen ungeschädigten Gewebe nicht gleich ist. In dieser Beziehung bietet die Gewebekultur, d. h. die Kombination von eingebetteten oder auf ein biokompatibles Gerüst geschichteten Zellen nun die Möglichkeit, in vitro eine gewebeähnliche Struktur aufzubauen, die nach Transplantation in den Patienten eine weitere Reifung/Differenzierung mit der Möglichkeit durchlaufen kann, das ursprüngliche, verloren gegangene Gewebe vollständig zu regenerieren (Ref.: Langer und Vacanti, Science, 1993).
Noch andere Pathologien können einen viel komplexeren Behandlungsansatz erfordern. Insbesondere benötigen bestimmte Krankheiten, wie zum Beispiel dysmetabolische Zustände, nicht nur eine lokale Abgabe des heilenden Medikaments, sondern auch eine biointeraktive Kontrolle bei der Verabreichung des Stoffs. Ein paradigmatisches Beispiel wird durch die Behandlung von insulinabhängigem Diabetes (Typ I) gebildet. Der Erfolg jedes therapeutischen Protokolls beruht auf der Verabreichung von Insulin nur dann, wenn die Blutglucosespiegel bestimmte Werte erreichen. In diesem Fall kann nur ein biologisch empfindliches, Insulin produzierendes System angemessen auf die Körperbedürfnisse antworten. Da Inselzellen des Pankreas tatsächlich nicht leicht mit der Zellkulturtechnologie manipulierbar sind, können in dem besonderen Fall andere Zelltypen, zum Beispiel Fibroblasten, genetisch modifiziert werden, um Insulin in kontrollierter Weise zu exprimieren. Für diese bestimmten Krankheiten sollte das ideale klinische Protokoll aus der lokalen Abgabe von auf die Produktion spezifischer biologischer/pharmakologischer Moleküle festgelegten Zellen in einem geeigneten Träger bestehen. Die durch die vorliegende Erfindung abgebbaren Zellen sind Säugerzellen, besonders jene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege und Stammzellen, sowohl von erwachsenem als auch von embryonalem Gewebe.
Die chondrogenen Zellen können zum Beispiel direkt aus bereits existierendem Knorpelgewebe isoliert werden, zum Beispiel aus hyalinem Knorpel, elastischem Knorpel oder Faserknorpel. Insbesondere können chondrogene Zellen aus Gelenkknorpel (entweder aus gewichttragenden oder nicht gewichttragenden Gelenken), Rippenknorpel, Nasenknorpel, Ohrmuschelknorpel, Trachealknorpel, Kehldeckelknorpel, Schilddrüsenknorpel, Stellknorpel und Ringknorpel isoliert werden. Verfahren zur Isolierung chondrogener Zellen aus derartigen Geweben werden nachstehend dargelegt. In einer anderen Ausführungsform können chondrogene Zellen aus Knochenmark isoliert werden. Siehe zum Beispiel US Pat. Nr. 5.197.985 und Nr. 4.642.120 und Wakitani et al., (1994) J. Bone Joint Surg. 76: 579 – 91, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Wenn die chondrogenen Zellen einmal aus den bereits existierenden Geweben isoliert worden sind, vermehrt man sie ex vivo in Kultur in einzelliger Schicht unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet wohlbekannter Techniken. Siehe zum Beispiel Pollack (1975) in „Readings in Mammalian Cell Culture", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Kurz gesagt wird die Population chondrogener Zellen durch Züchtung der Zellen in einzelliger Schicht und durch serielles Passagieren der Zellen vergrößert. Die chondrogenen Zellen werden passagiert, nachdem sich die Zellen zu einer derartigen Dichte vermehrt haben, dass sie einander auf der Oberfläche der Zellkulturplatte berühren. Während des Passagierschrittes werden die Zellen vom Substrat abgelöst. Dies wird routinemäßig durch Gießen einer ein proteolytisches Enzym enthaltenden Lösung, d. h. Trypsin, auf die einzellige Schicht ausgeführt. Das proteolytische Enzym hydrolysiert Proteine, welche die Zellen auf dem Substrat verankern. Als Ergebnis werden die Zellen von der Oberfläche des Substrats abgelöst. Die so erhaltenen Zellen, jetzt in Suspension, werden mit Kulturmedium verdünnt und in eine neue Gewebekulturschale bei einer derartigen Zelldichte wieder ausplattiert, dass die Zellen einander nicht berühren. Die Zellen heften sich anschließend wieder an die Oberfläche der Gewebekultur an und beginnen wieder, sich zu vermehren. In einer anderen Ausführungsform können die Zellen in Suspension für die anschließende Verwendung unter Verwendung von im Fachgebiet wohlbekannter Techniken kryokonserviert werden. Siehe zum Beispiel Pollack (vorstehend).
Die Zellen werden wiederholt passagiert, bis genügend Zellen gezüchtet worden sind, um ein Stück synthetischen Knorpels von vorbestimmter Größe herzustellen. Als Ergebnis kann eine ursprünglich aus einer Biopsieprobe isolierte Population, die eine kleine Zahl von chondrogenen Zellen enthält, in vitro vergrößert werden, um dadurch eine große Zahl von chondrogenen Zellen für die anschließende Verwendung in der erfindungsgemäßen Durchführung zu erzeugen.
4.1 Verfahren zur Isolierung von Chondrozyten
Kurz gesagt wird chondrogene Zellen enthaltendes Gewebe disaggregiert, um freigelegte chondrogene Zellen aus ihrer extrazellulären Matrix freizusetzen. Die freigelegten Zellen werden dann isoliert und in einzelliger Schicht in einem undifferenzierten Zustand ex vivo vermehrt. Das Passagierverfahren kann viele Male (n) wiederholt werden, zum Beispiel bis zu etwa 7 bis 10 Passagen, bis genügend Zellen gezüchtet worden sind, um ein Stück Knorpel von vorbestimmter Größe herzustellen. Diese Schritte vergrößern die Zahl der chondrogenen Zellen in einer Population, die anschließend zur Bildung des dreidimensionalen, aus mehreren Zellschichten bestehenden Füllstücks synthetischen Knorpels verwendet werden kann.
Eine vorgeformte Vertiefung mit einer Zellkontakt bildenden, zelladhäsiven Oberfläche wird dann mit den vermehrten aber undifferenzierten chondrogenen Zellen beimpft. Die zelladhäsive Oberfläche verhindert, dass sich in der Vertiefung gezüchtete chondrogene Zellen an die Oberfläche der Vertiefung anhaften. Die Zellen, denen ihre Verankerung entzogen wurde, interagieren miteinander und wachsen innerhalb von Stunden zusammen, wodurch ein zusammenhängender Zellpfropfen gebildet wird. Die chondrogenen Zellen fangen dann an zu differenzieren, gekennzeichnet durch die Produktion und Sekretion von knorpelspezifischen Markern, d. h. Kollagen Typ II und sulfatierten Proteoglykanen. Kollagen Typ II wird spezifisch in Knorpel gefunden. Die chondrogenen Zellen werden dann genügend lang gezüchtet, um die Bildung eines dreidimensionalen, aus mehreren Zellschichten bestehenden Füllstücks synthetischen Knorpels zu erlauben. Das so erhaltene synthetische Knorpelfüllstück umfasst chondrogene Zellen, die mit einer neuen, endogen produzierten und sezernierten extrazellulären Matrix dispergiert sind. Die während dieses Verfahrens abgelagerte extrazelluläre Matrix ist biochemisch und morphologisch der in natürlichem Knorpel gefundenen extrazellulären Matrix ähnlich. Insbesondere umfasst die synthetische Matrix Fasern des Kollagen Typ II und sulfatierte Proteoglykane wie zum Beispiel Chondroitinsulfat und Keratansulfat.
4.2 Isolierung chondrogene Zellen enthaltenden Gewebes
In der gegenwärtigen erfindungsgemäßen Durchführung nützliche chondrogene Zellen können aus einer Vielzahl von Quellen in einem Säuger, der derartige Zellen enthält, als Probe genommen werden, zum Beispiel aus bereits existierendem Knorpelgewebe, perichondralem Gewebe oder Knochenmark.
Obwohl Rippenknorpel, Nasenknorpel, Ohrmuschelknorpel, Trachealknorpel, Kehldeckelknorpel, Schilddrüsenknorpel, Stellknorpel und Ringknorpel nützliche Quellen von chondrogenen Zellen sind, ist Gelenkknorpel (aus entweder gewichttragenden oder nicht gewichttragenden Gelenken) die bevorzugte Quelle. Biopsieproben von Gelenkknorpel können ohne weiteres durch einen Chirurgen isoliert werden, der Arthroskopie oder offene Gelenkchirurgie durchführt. Verfahren zur Isolierung von Biopsiegewebe sind im Fachgebiet wohlbekannt und werden daher hier nicht im Einzelnen beschrieben. Siehe zum Beispiel, „Operative Arthroscopy" (1991) von McGinty et al., Raven Press, New York, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Perichondrales Gewebe ist das membranartige Gewebe, das die Oberfläche aller Arten von Knorpel überzieht, außer Gelenkknorpel. Perichondrales Gewebe stellt den im darunterliegenden, nicht vaskularisierten Knorpelgewebe lokalisierten Chondrozyten Nährstoffe bereit. Aus dem Rippenknorpel von an Osteoporose leidenden Patienten entnommenes perichondrales Gewebe stellt eine Quelle von chondrogenen Zellen bereit, wenn der normale Gelenkknorpel erkrankt oder nicht verfügbar ist. Biopsieproben perichondralen Gewebes können aus der Oberfläche von Rippenknorpel oder in einer anderen Ausführungsform von der Oberfläche des Ohrmuschelknorpels, Nasenknorpels und Ringknorpels unter Verwendung von einfachen chirurgischen, im Fachgebiet wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Siehe zum Beispiel: Skoog et al., (1990) Scan. J. Plast. Reconstr. Hand Surg. 24: 89 – 93; Bulstra et al., (1990) J. Orthro. Res. 8: 328 – 335; und Homminga et al., (1990) J. Bone Constr. Surg. 72: 1003 – 1007, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Es wird auch ins Auge gefasst, dass bei der erfindungsgemäßen Durchführung nützliche chondrogene Zellen, besonders mesenchymale Zellen, aus Knochenmark isoliert werden können. Bei der Isolierung von Knochenmark nützliche Operationsverfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt und werden daher hier nicht im Einzelnen beschrieben. Siehe zum Beispiel Wakitani et al., (1994) J. Bone Joint Surg. 76: 579 – 591, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
4.3. Herstellung freigelegter chondrogener Zellen
Protokolle zur Herstellung freigelegter chondrogener Zellen aus Knorpelgewebe, perichondralem Gewebe und Knochenmark sind nachstehend dargelegt.
A. Aus Gelenkknorpel
Gelenkknorpel, sowohl belasteter (gewichttragender) als auch unbelasteter (nicht gewichttragender) kann enzymatischer Behandlung unterzogen werden, um das Gewebe zu disaggregieren und freigelegte chondrogene Zellen aus der extrazellulären Matrix freizusetzen. Proteolytische Enzyme, zum Beispiel Chondroitinase ABC, Hyaluronidase, Pronase, Kollagenase oder Trypsin enthaltende Lösungen können dem Gelenkknorpelgewebe hinzugefügt werden, um die extrazelluläre Matrix zu verdauen. Siehe zum Beispiel Watt & Dudhia (1988) Differentiation 38: 140 – 147, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
In einem bevorzugten Verfahren wird Gelenkknorpel zunächst in Stücke von etwa 1 mm Durchmesser oder weniger geschnitten. Dies wird routinemäßig unter Verwendung eines sterilen Skalpells ausgeführt. Das kleingeschnittene Gewebe wird dann enzymatisch disaggregiert, zum Beispiel durch die Zugabe einer 0,1% Kollagenase enthaltenden Lösung (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland). Ungefähr 1 ml Kollagenase wird pro 0,25 ml Äquivalent des kleingeschnittenen Gewebes hinzugefügt. Die Probe wird dann gemischt und über Nacht (bis zu 16 Stunden lang) bei 37°C unter Rühren inkubiert. Dem Übernacht-Verdau folgend werden die verbleibenden Gewebestücke durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wird entfernt, und die übrigen Knorpelstücke werden durch Zugabe einer beispielsweise 0,25% Kollagenase und 0,05% Trypsin (Sigma Chemical Co., St. Louis) enthaltenden Lösung nachverdaut. Ungefähr 1 ml 0,25% Kollagenase und 0,05% Trypsin wird pro 0,25 ml Äquivalent des verbleibenden Gewebes hinzugefügt. Die Probe wird dann gemischt und 2 bis 4 Stunden lang bei 37°C unter Rühren inkubiert. Jegliches zurückbleibende Gewebe wird durch Zentrifugation pelletiert und die Zellsuspension geerntet. Der Kollagenase-Trypsin-Schritt wird 2 bis 4 Mal wiederholt oder so lange, bis das Gewebe völlig disaggregiert ist.
Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von Gewebekulturmedium, ergänzt mit ungefähr 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone, Logan, Utah) beendet. Ein bevorzugtes Zellkulturmedium enthält zum Beispiel Dulbecco's minimales essentielles Medium (DMEM) (Sigma Chemical Co., St. Louis), ergänzt mit 10% FBS. Ein alternatives Zellkulturmedium schließt ein 1:1 (Vol/Vol) Gemisch von Medium 199 (Sigma Chemical Co., St. Louis) bzw. Molecular Cell Developmental Biology Medium 202 (MCDB 202) (Sigma Chemical Co., St. Louis) ein, jeweils ergänzt mit 10% FBS. In einer anderen Ausführungsform schließt ein anderes bei der erfindungsgemäßen Durchführung nützliches Kulturmedium ein 3:1 (Vol/Vol) Gemisch von DMEM bzw. Ham's F-12 (F12) (Sigma Chemical Co., St. Louis) ein, jeweils ergänzt mit 10% FBS. Freigelegte chondrogene Zellen enthaltende Fraktionen werden vereinigt, und eine Zellkulturplatte wird zur Zellvermehrung und zum Testen mit den Zellen bei einer Zelldichte von etwa 1 × 10² – 5 × 10⁵ Zellen/cm², vorzugsweise etwa 5 × 10² – 1 × 10⁵ Zellen/cm² und am meisten bevorzugt etwa 1 × 10³ – 1 × 10⁴ Zellen/cm² beimpft.
Chondrozyten können mit dem vorstehend erwähnten Verfahren aus Rippenknorpel, Nasenknorpel, Ohrmuschelknorpel, Trachealknorpel, Kehldeckelknorpel, Schilddrüsenknorpel, Stellknorpel und Ringknorpel isoliert werden.
B. Aus perichondralem Gewebe
Freigelegte chondrogene Zellen werden vorzugsweise unter Verwendung der gleichen Verfahren wie vorstehend in Sektion II A beschrieben aus perichondralem Gewebe isoliert.
Kurz gesagt wird das Gewebe in Stücke von etwa 1 mm Durchmesser oder weniger zerkleinert. Das zerkleinerte Gewebe wird wiederholt mit proteolytischen Enzymen, zum Beispiel Trypsin und Kollagenase, verdaut. Eine Zellkulturschale wird mit den so erhaltenen freigelegten Zellen zur Zellvermehrung und zum Testen mit einer Plattierungsdichte von etwa 1 × 10² – 5 × 10⁵ Zellen/cm² beimpft, vorzugsweise etwa 5 × 10² bis 1 × 10⁵ Zellen/cm², und am meisten bevorzugt etwa 1 × 10³ – 1 × 10⁴.
In einer anderen Ausführungsform kann ein nichtzerstörerisches Verfahren verwendet werden, um chondrogene Zellen aus perichondralem Gewebe zu isolieren. Bei diesem Verfahren wird intaktes explantiertes Gewebe in eine Zellkulturschale gegeben und in Nährmedium inkubiert. Die im Gewebe lokalisierten chondrogenen Zellen wandern aus dem Gewebe heraus und auf die Oberfläche der Gewebekulturplatte, wo sie anfangen, sich zu vermehren. Siehe zum Beispiel Bulstra et al., (1990) J. Orthop. Res. 8 : 328 – 335, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Kurz gesagt werden Stücke des zerkleinerten explantierten Gewebes in eine Gewebekulturmedium enthaltende Gewebekulturplatte gegeben. Ein bevorzugtes Zellkulturmedium umfasst mit 10% FBS ergänztes DMEM. Die explantierten Gewebe werden bei 37°C und 5% CO₂ 3 bis 7 Tage lang inkubiert. Während dieser Zeit wandern die chondrogenen Zellen aus dem explantierten Gewebe heraus und auf die Oberfläche der Gewebekulturschale. Nach dem Wiederanhaften an die Oberfläche der Platte fangen die Zellen an, sich wieder zu vermehren.
C. Aus Knochenmark
Chondrogene Zellen, besonders mesenchymale Zellen, können aus Knochenmarksproben isoliert werden. Zur Isolierung mesenchymaler Zellen aus Knochenmark nützliche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt, siehe zum Beispiel: US Pat. Nr. 5.197.985, Nr. 4.642.120; und Wakitani et al. (1994, vorstehend). Zum Beispiel kann in einem bevorzugten Verfahren ein Knochenmarkspfropfen operativ aus dem jeweils interessierenden Säuger entfernt werden und zu Zellkulturmedium hinzugefügt werden. Bevorzugte vollständige Wachstumsmedien werden in US Pat. Nr. 5.197.985 offenbart. Das Gemisch wird dann verwirbelt, um den Gewebepfropfen aufzubrechen. Die so erhaltene Suspension wird zentrifugiert, um Knochenmarkszellen von großen Stücken partikulärem Material, d. h. Knochenfragmenten, abzutrennen. Die Zellen werden dann dissoziiert, indem man die Zellen durch eine Spritze zwingt, die nacheinander mit einer 16-, 18- und 20-G-Kanüle bestückt wird, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben. Die Zellen werden dann in eine Zellkulturplatte bei einer Zelldichte von etwa 1 × 10⁵ – 1 × 10⁴ Zellen/cm² ausplattiert, um knochenmarksabgeleitete mesenchymale Zellen von den übrigen in der Suspension vorhandenen Zellen selektiv abzutrennen und/oder zu isolieren.
III. In vitro Vermehrung freigelegter chondrogener Zellen Aus Knorpelgewebe, perichondralem Gewebe oder Knochenmark unter Verwendung der in Sektion II vorstehend beschriebenen Verfahren isolierte chondrogene Zellen können zur Vermehrung in Kultur in einzelliger Schicht gegeben werden. Das Verfahren erlaubt es, die Zahl der isolierten chondrogenen Zellen zu vergrößern. Im Prinzip kann der Fachmann eine im Wesentlichen unbegrenzte Zahl von chondrogenen Zellen und deshalb im Wesentlichen eine unbegrenzte Menge synthetischen Knorpels herstellen. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die chondrogenen Zellen während der Vermehrung entdifferenzieren und ihre Fähigkeit verlieren, knorpelspezifische extrazelluläre Matrix zu sezernieren. Ein Verfahren zur Analyse, ob die undifferenzierten Zellen ihr chondrogenes Potential noch beibehalten, wird hierin nachstehend beschrieben.
4.4 Zellvermehrung
Protokolle zur Zellvermehrung durch Kultur in einzelliger Schicht sind im Fachgebiet wohlbekannt, siehe zum Beispiel Pollack (vorstehend), und werden daher hier nicht im Einzelnen beschrieben.
Kurz gesagt werden Kulturen in einzelliger Schicht durch Animpfen primärer chondrogener Zellen, entweder aus Knorpelgewebe oder perichondralem Gewebe isoliert, in einer Zellkulturschale bei einer Zelldichte von etwa 1 × 10² – 5 × 10⁵ Zellen/cm², bevorzugt etwa 5 × 10² – 1 × 10⁵ Zellen/cm² und am meisten bevorzugt etwa 1 × 10³ – 1 × 10⁴ Zellen/cm² begonnen. Chondrogene Zellen, die einer oder mehrerer Passagerunden unterzogen wurden, werden auch bei der gleichen Plattierungsdichte ausplattiert. Aus Knochenmark isolierte primäre chondrogene Zellen werden bei einer Zelldichte von etwa 1 × 10⁵ – 1 × 10⁶ Zellen/cm² in eine Zellkulturplatte ausplattiert. Chondrogene Zellen aus Knochenmark, die einer oder mehrerer Passagerunden unterzogen wurden, werden bei Zelldichten von etwa 1 × 10² – 5 × 10⁵ Zellen/cm², bevorzugter etwa 5 × 10² – 1 × 10⁵ Zellen/cm² und am meisten bevorzugt etwa 1 × 10³ – 1 × 10⁴ Zellen/cm² ausplattiert. Die chondrogenen Zellen werden anschließend bei 37°C, 5% CO₂ in Zellkulturmedium gezüchtet.
Ein bevorzugtes Zellkulturmedium umfasst mit 10% FBS ergänztes DMEM. In einer anderen Ausführungsform kann ein Zellkulturmedium, umfassend ein mit 10% FBS ergänztes 1:1 (Vol/Vol) Gemisch von jeweils Medium 199 und MCDB 202, verwendet werden. Noch ein anderes bei der erfindungsgemäßen Durchführung nützliches Kulturmedium umfasst ein mit 10% FBS ergänztes 3:1 (Vol/Vol) Gemisch von jeweils DMEM und F12.
Wenn die Zellkulturen einmal konfluent werden, d. h. die Zellen auf der Plattenoberfläche zu einer derartigen Dichte gewachsen sind, dass sie einander berühren, werden die Zellen passagiert und in eine neue Platte überimpft. Dies kann erreicht werden, indem das die einzellige Zellschicht bedeckende Zellkulturmedium zunächst abgesaugt wird, und die einzellige Zellschicht mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen wird. Das PBS wird durch Absaugen entfernt, und eine ein proteolytisches Enzym, d. h. 0,1 % Trypsin, enthaltende Lösung wird dann auf die einzellige Schicht gegossen. Das proteolytische Enzym hydrolysiert Proteine, welche die Zellen auf der Oberfläche der Platte verankern, und setzt dadurch die Zellen von der Plattenoberfläche frei. Das proteolytische Enzym in der Zellsuspension wird dann durch Zugabe von FBS zu der Suspension bis zu einer Endkonzentration von 10% (Vol/Vol) inaktiviert. Die Zelldichte in der Suspension wird dann abgeschätzt und die Zellen werden in eine neue Zellkulturplatte bei einer Dichte von etwa 1 × 10² – 5 × 10⁵ Zellen, stärker bevorzugt etwa 5 × 10² – 1 × 10⁵ Zellen und am meisten bevorzugt etwa 1 × 10³ – 1 × 10⁴ Zellen pro cm² neu ausplattiert. Das Passageverfahren kann viele Male wiederholt werden, zum Beispiel etwa 7 bis 10 Mal, bis genügend Zellen gezüchtet worden sind, um ein Stück Knorpel der vorbestimmten Größe herzustellen.
Es ist selbstverständlich, dass Suspensionen von vermehrten Zellen für unbestimmte Zeit unter Verwendung im Fachgebiet wohlbekannter Verfahren kryokonserviert werden können. Siehe zum Beispiel Pollack (vorstehend). Demgemäß können Populationen chondrogener Zellen für die anschließende Verwendung gelagert werden, wann immer sich die Notwendigkeit ergibt.
4.5 Analyse zum Messen des chondrogenen Potentials vermehrter Zellen
Undifferenzierte chondrogene Zellen, in Kultur als einzellige Schicht vermehrt, können analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie ihr chondrogenes Potential noch beibehalten. Dies kann durch Züchtung der Zellen in einem halbfesten Medium in einem Agarosekultur genannten Verfahren ausgeführt werden. Dieses Verfahren wird in Benya et al. (1982) Cell 30: 215 – 224 beschrieben, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Kurz gesagt wird eine Lösung von 2% warmer niedrigschmelzender Agarose (LT-Agarose) (BioRad, Richmond, Calif.) mit vermehrten chondrogenen Zellen beimpft. Die Verwendung von LT-Agarose erlaubt es, die Agarose mit den Zellen ohne thermale Schädigung der Zellen zu beimpfen. Die Agarose wird vor Zugabe der Zellen auf etwa 39 – 41 °C gekühlt. Ungefähr 1 × 10³ – 1 × 10⁶ Zellen werden in 1 ml flüssige Agarose beimpft.
Die Zellen werden anschließend bei 37°C, 5% CO₂ 3 bis 4 Wochen lang in einem vorzugsweise DMEM enthaltenden, mit 10% FBS ergänztem Zellkulturmedium gezüchtet. Während dieser Zeit replizieren die chondrogenen Zellen unter Bildung von Kolonien, die eine extrazelluläre Matrix zu sezernieren beginnen. Die so erhaltenen Kolonien erscheinen wie kleine, in die Agarose eingebettete „Knötchen". Die Kolonien können gezählt werden, und der chondrogene Anteil der Zellen kann histochemisch und immunhistochemisch unter Verwendung im Fachgebiet wohlbekannter Verfahren bestimmt werden.
4.6 Herstellung von Zellkulturen aus dem Knochenmarkstroma
Knochenmarkstroma kann nach Standardverfahren durch Absaugung aus dem Beckenkamm unter sterilen Bedingungen mittels eines heparinbehandelten, mit einer 10-ml-Spritze verbundenen und 1 ml Heparinlösung (3.000 Einheiten/ml) enthaltenden Plastikschlauchs isoliert werden. Es ist möglich, außer Knochenmark selbst aus Knochenmark isolierte Stammzellen zu verwenden. In diesem Fall wird die mediale proximale Oberfläche der Tibia (oder jedes anderen Knochens) unter Anästhesie mit einem kleinen Einschnitt freigelegt. Das subkutane Gewebe und das Periost werden eingeschnitten und zurückgefaltet, um die Knochenoberfläche freizulegen. Die Tibia wird mit einer 16- oder 18-G-Kanüle perforiert und das Knochenmark wird durch einen heparinbehandelten Plastikschlauch abgesaugt, der an einer 1 ml Heparinlösung (3.000 Einheiten/ml) enthaltenden Spritze befestigt ist. Das abgesaugte Material wird unter sterilen Bedingungen in ein 50-ml Plastikröhrchen transferiert und 10 Minuten bei 1.300 Upm zentrifugiert. Die abzentrifugierten Zellen werden drei Mal mit warmer Hanks-Lösung (HBSS) gewaschen, wieder abzentrifugiert und in einem alpha-minimal-essentiellen-Medium (α-MEM) enthaltenden, vollständigen Kulturmedium, angereichert mit einer 1-%igen Antibiotikalösung (10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg/ml Steptromycin), 10% fötalem Rinderserum (FBS), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) (10 ng/ml) und Dexamethason (0,4 μg/ml) suspendiert. Die Zellsuspension wird bei einer Dichte von 3 – 5 × 10⁶ kernhaltigen Zellen pro cm² in eine 35-mm Petri-Kapsel gegossen. Die mesenchymalen Stammzellen werden in einem vollständigen Kultumedium bei 37°C in einer angefeuchteten, 5% CO₂ und 95% Luft enthaltenden Atmosphäre inkubiert.
Nach 4 Tagen Primärkultur werden die undifferenzierten Zellen durch Waschen mit einer phosphatgepufferten Lösung entfernt. Das Kulturmedium wird alle drei Tage gewechselt.
Wenn die Zellen nach etwa 2 – 3 Wochen Konfluenz erreichen, werden sie durch 7-minütigen enzymatischen Verdau mit 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA bei 37°C aus dem Kulturbehälter entfernt. Die Reaktion wird durch Zugabe von vollständigem Kulturmedium unterbrochen, die Zellsuspension wird in ein 50-ml Plastikröhrchen transferiert und 10 Min. lang bei 1.400 Upm zentrifugiert. Die Zellen werden in Kulturmedium resuspendiert und mit einem Hämocytometer gezählt.
Um in den mesenchymalen Stammzellen und Knochenmarkszellen Chondrogenese zu induzieren, wird die Massenkulturtechnik verwendet (ursprüngliche Zelldichte > 1 × 10⁶ Zellen/cm²).
4.7 Herstellung von Zellkulturen aus Knorpelgewebe
Eine Biopsie von Gelenkknorpel wird nach Standardoperationsverfahren entnommen.
Die Knorpelprobe wird durch enzymatischen Verdau unter Verwendung einer 0,1 %igen Kollagenase-Lösung aufgespalten. Ungefähr 1 ml Kollagenase wird pro 0,25 ml des zerkleinerten Gewebes hinzugefügt. Die Probe wird gemischt und 16 Stunden lang bei 37°C unter Rühren inkubiert. Anschließend werden die Fragmente des zurückbleibenden Gewebes durch Zentrifugation abgetrennt, und der Überstand wird entfernt. Die Fragmente des zurückbleibenden Knorpels werden in einer 0,25% Kollagenase und 0,05% Trypsin enthaltenden Lösung wieder einem enzymatischen Verdau ausgesetzt. Die Probe wird gemischt und 2 – 4 Stunden lang bei 37°C unter Rühren inkubiert. Das zurückbleibende Gewebe wird durch Zentrifugation abgetrennt, und die Behandlung wird wiederholt, bis der Verdau vollständig ist.
Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe eines Kulturmediums unterbrochen, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) oder mit Dulbeccos minimalem essentiellem Medium, angereichert mit 10% FBS, angereichert ist.
Die Zellsuspension wird bei einer Dichte von 3 – 5 × 10⁶ Zellen pro cm² in eine 35-mm Petrischale gegossen.
5. Die pharmazeutisch oder biologisch wirksame Komponente
Da festgestellt wurde, dass die 50 – 70% Benzylester der Hyaluronsäure und die 3 – 15% ACP Hyaluronsäure-Derivate ausgezeichnete Träger für ein Abgabesystem injizierbarer Verabreichung sind, kann die biologisch oder pharmazeutisch wirksame Komponente von jeder zur Verabreichung an einen Säuger, wie zum Beispiel einen menschlichen Patienten, gewünschten Art sein. Von besonderer Wichtigkeit als pharmakologisch wirksame Stoffe sind Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Antiseptika, aktive Hormone, Antitumormittel und Antivirusmittel, die per se im Fachgebiet bekannt sind.
Die biologisch aktiven Stoffe sind vorzugsweise jene, die einen Effekt auf den biologischen Vorgang des Säugers oder Patienten haben. Von besonderer Wichtigkeit sind Stoffe, welche die Zelladhäsion an Biomaterial fördern, wie zum Beispiel Fibronectin, RGD- oder Integrin-Sequenzen, die Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel Transformationswachstumsfaktor β (TGF), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGF), Epidermiswachstumsfaktoren (EGF), saure oder basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (aFBF oder bFBF), Hepatozyt-Wachstumsfaktor (HGF), Keratinozyt-Wachstumsfaktor (KGF), Knochenbildungsproteine (BMPs) wie zum Beispiel BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5 und BMP-6 und osteogene Proteine (OPs) wie zum Beispiel OP-1, OP-2 und OP-3, die Nucleinsäuren, die bestimmte Gene codieren oder Gensequenzen oder Gentranskripte, wie zum Beispiel DNA oder RNA, und Differenzierungs-/Modulationsfaktoren.
6. Zusätzliche Komponenten
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden in Form eines mindestens einen der Benzylester- oder ACP-Derivate und mindestens eine biologisch oder pharmakologisch wirksame Komponente und/oder Säugerzelle enthaltenden Gels hergestellt. Das Gel kann auch ein oder mehrere Hyaluronsäure-Derivate, in einer oder mehreren verschiedenen Formen, wie zum Beispiel Fasern, Granulate, Mikrosphären, Nanosphären und Schwamm-Fragmente enthalten. Diese Formen können eine Verankerung für die Säugerzellen der Zusammensetzung bereitstellen und bestehen vorzugsweise aus dem vollständigen Benzylester-Derivat der Hyaluronsäure (HYAFF-11). Diese Formen können vorzugsweise durch die folgenden Verfahren hergestellt werden.
Die Mikrosphären werden vorzugsweise durch das in EP0517565 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Nanosphären werden vorzugsweise durch das in WO 96/29998 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Schwämme werden vorzugsweise durch das in US Patent Nr. 4.851.521 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Fasern können nach den in den US Patenten 5.520.916 und 5.824.335 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 8 – Mikrosphären
Ein vollständiges Benzylester-Derivat der Hyaluronsäure, bei dem alle Carboxygruppen der HAYFF11, wie in US Patent Nr. 4.851.521 beschrieben, wird in einem aprotischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid bei einer zwischen 5 und 10% (Gew/Vol) variierenden, im allgemeinen 7% (Gew/Vol) Konzentration gelöst. Wenn das Polymer einmal solubilisiert ist, wird das so erhaltene Gemisch nachstehend als die diskontinuierliche Phase bezeichnet werden. Zur gleichen Zeit wird in einem geeigneten Reaktor ein Gemisch aus einem hochviskosen Mineralöl hergestellt, das ArlacelR, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, in einer Konzentration von 1 % Gew/Vol enthält.
Dieses Gemisch wird nachstehend als die kontinuierliche Phase bezeichnet werden.
Die kontinuierliche Phase wird unter Rühren bei einer konstanten Geschwindigkeit von 1000 Upm bei 25° aufbewahrt, dann wird die wie vorstehend beschrieben hergestellte diskontinuierliche Phase zu ihr hinzugefügt. Unter diesen Bedingungen findet sofortige Emulgation der beiden Phasen statt. Das Verhältnis zwischen den beiden Phasen (diskontinuierliche und kontinuierliche) ist etwa 1 bis 16.
Nach 15-minütigem Rühren wird Acetylacetat hinzugefügt. Dieses Lösungsmittel vermischt sich perfekt mit den beiden Phasen der Emulsion, aber es ist kein Lösungsmittel für das Polymer und das humane Insulin-Polypeptid. Es ist bewiesen worden, dass das zur vollständigen Extraktion benötigte Volumen des extrahierenden Lösungsmittels das Zweieinhalbfache des Gesamtvolumens der Emulsion ist. Um die Extraktion zu erleichtern, wird die Rührgeschwindigkeit 10 min lang auf 1400 – 1500 Upm gestellt und dann auf 500 Upm gesenkt. Die so erhaltene Suspension wird weiter gerührt, während sie bei einer Einstellung von 1 Atmosphäre mit einer Schneckenpumpe durch eine Filterpresse gepumpt wird. Nach Abschluss dieser Filtration wird sie durch ein Filter von normal-Hexan gepumpt, wobei dies ein Lösungsmittel mit der doppelten Wirkung ist, das Präparat zu „trocknen" und jeglichen verbleibenden oberflächenaktiven Stoff zu solubilisieren, der auf der Oberfläche der Mikrosphären vorhanden sein kann. Das Produkt wird dann in geeignete Behälter gegeben und bei 4°C gelagert.
Unter diesen Arbeitsbedingungen ist die so erhaltene durchschnittliche Partikelgröße 10 μm.
7. Beispielhafte erfindungsgemäße Zusammensetzungen
Die Folgenden stellen Beispiele der erfindungsgemäßen Zusammensetzung dar.
Beispiel 9 – Zusammensetzung eines Gels der auto-vernetzten Hyaluronsäure (ACP enthaltend Schwammfragmente der auto-vernetzten Hyaluronsäure (ACP) oder des Gesamt-Benzylesters (HYAFF-11) und Zellen
Ein Schwamm von ACP (oder HYAFF-11) wird in flüssigem Stickstoff auf eine Temperatur unter –150°C gebracht, gepresst und gesiebt, um eine Granulometrie von weniger als 100 Mikron zu erhalten. Einhundert mg ACP Granulat wird mit 0,5 ml ACP gemischt.
Fünf bis zehn ml Heparin-behandeltes Knochenmark wird in eine sterile Spritze (22 G) von 10 – 20 ml transferiert, die ACP-Granulat und Gel enthält. Das Gemisch wird langsam in eine zweite Spritze gedrückt, um ein homogenes Gemisch zu erhalten.
Die Zellen können sofort anschließend in vivo in den osteochondralen Schaden injiziert werden oder man lässt sie vor dem Implantieren 3 – 4 Stunden lang bei 37°C sich an die Mikropartikel anheften.
Wenn die Zellen vorher in vitro für eine bestimmte Zeitdauer (2 – 3 Wochen lang) vermehrt werden, wird eine bekannte Zahl von Zellen in einem bestimmten Volumen suspendiert, bevor die Kultur mit dem Gel gemischt wird. Das Volumen der Suspension wird so berechnet, dass eine übermäßige Verdünnung des Gels vermieden wird.
Eine andere Ausführungsform besteht darin, 1 – 2 ml Knochenmark und mesenchymale Stammzellen in einer sterilen Spritze (22 G) mit einem Gemisch, bestehend aus 100 mg Schwammfragmenten und 35 mg ACP-Pulver, zu mischen. Das Gemisch wird 3 – 4 Stunden lang bei 37°C aufbewahrt, damit das Pulver hydratisiert werden kann und die Zellen an die Schwammfragmente anhaften können.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung und Verabreichung verschiedener Kombinationen der zuvor beschriebenen Hyaluronsäure-Komponente und der Säugerzelle und/oder molekularen Komponente. Diese Beispiele sind sowohl bei weichen Geweben anwendbar, wie zum Beispiel Haut, Leber und Darm, als auch bei harten, Knochen und Knorpel.
Beispiel 10 – Behandlung von chondralen und osteochondralen Schäden mit in ein injizierbares, auf Hyaluronsäure beruhendes Gel eingebetteten chondrogenen Zellen
Die beabsichtigte Zusammensetzung kann in Form eines injizierbaren, mindestens ein Hyaluronsäure-Derivat enthaltenden Gels hergestellt werden, worin die chondrogenen Zellen gleichmäßig dispergiert sind. Das Gel kann auch ein oder mehr Derivate der Hyaluronsäure in verschiedenen Formen wie zum Beispiel Fasern, Granulat, Mikrosphären, Nanosphären, Schwammfragmente etc. enthalten. Zuerst werden die chondrogenen Zellen, wie zum Beispiel erwachsene differenzierte Chondrozyten oder undifferenzierte mesenchymale Stammzellen, aus dem ursprünglichen Gewebe isoliert, bei dem es sich zum Beispiel um nicht gewichttragenden Gelenkknorpel und Knochenmarkstroma handelt. Zellen werden mit normalen, routinemäßig vom Fachmann verwendeten Zellkulturtechniken isoliert und vermehrt. Wenn eine geeignete Zellzahl, je nach Größe und Tiefe des Schadens, erreicht ist, werden die Zellen von den zweidimensionalen Kulturoberflächen abgelöst und in ein aus ACP oder teilweise verestertem HYAFF bestehendes Gel eingebettet. Der relative Vernetzungs-/Querverbindungs- oder Veresterungsgrad des auf Hyaluronsäure beruhenden Verabreichungsvehikels kann je nach der im Patienten zu erzielenden gewünschten Abbauzeit im Patienten variieren. Beispiele der Herstellung von Benzylestern der Hyaluronsäure und autovernetzten Hyaluronsäure-Derivaten sind zuvor berichtet worden.
Das Gel kann mechanisch so manipuliert werden, dass sich im Träger gleichmäßig dispergierte Zellen ergeben. Dann wird die Kombination unter Verwendung einer sterilen Spritze und/oder einer arthroskopischen Vorrichtung, wie sie routinemäßig von im Fachgebiet geübten Chirurgen verwendet wird, injiziert, um die Größe des Schadens auszufüllen. Infolge der Eigenschaft des Hyaluronsäure-Trägers bleiben die Zellen im Schaden und beginnen, eine extrazelluläre Matrix herzustellen, die den Träger in der Regenerations-/Wiederherstellungsphase ersetzen wird. Darüberhinaus können Differenzierungs- und/oder Wachstumsfaktoren zur abgegebenen Kombination von Zellen und Gel hinzugefügt werden, um undifferenzierte chondrogene Zellen festzulegen, zum Beispiel bei der Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, oder um das Wachstum der verabreichten Zellen und/oder Wirtszellen zu stimulieren.
Beispiel 11 – Behandlung von chondralen und osteochondralen Schäden mit in injizierbare Feststoff-Gel-Formulierungen mit Hyaluronsäure-Derivaten eingebetteten chondrogenen Zellen
Um eine Zusammensetzung von Zellen zu injizieren, die einige extrazelluläre Matrixmoleküle hergestellt haben können oder auf einer Adhäsions-Oberfläche stabilisiert sein können, kann der Träger ein in ein Gel eingebettetes Gemisch aus einer Feststoffsuspension, Mikropartikeln sein. Mikropartikel können nicht nur als Verankerungsträger für injizierte Zellen wirken, sondern auch als Verankerungsträger für wirtsabgeleitete Zellen, da diese Partikel nicht vollständig mit den vorher beimpften chondrogenen Zellen bedeckt sind.
Diese beabsichtigte Zusammensetzung kann in Form einer injizierbaren Kombination aus einem mindestens ein Hyaluronsäure-Derivat enthaltenden Gel mit einer mindestens einen Hyaluronsäure-abgeleiteten Feststoff enthaltenden Feststoff-Suspension hergestellt werden, in der die chondrogenen Zellen gleichmäßig dispergiert sind. Zellen werden wie in Beispiel 11 beschrieben geerntet, isoliert und vermehrt. Dann werden die Zellen in einem flüssigen Medium gemischt, das mindestens ein Hyaluronsäure-Derivat in Form von Fasern, Granulat, Mikrosphären, Nanosphären oder Schwammfragmenten enthält, die wie oben beschrieben aus einem ACP oder Benzylester-Derivat hergestellt sind. Man lässt Zellen in einem Zeitraum, umfassend von 15 Minuten bis zu 48 Stunden, oder besser 30 Minuten bis zu 24 Stunden oder stärker bevorzugt 1 Stunde bis 3 Stunden bei Raumtemperatur im Operationssaal oder sogar in einer kontrollierteren Umgebung wie zum Beispiel einem Zellkulturinkubator sich an die Mikropartikel anheften. Dann werden die an den Mikropartikeln haftenden Zellen in das Gel eingebettet und schließlich wie oben beschrieben injiziert. Die Kombination der Hyaluronsäure-abgeleiteten Komponenten ist derart, dass ein Verhältnis zwischen der Mikropartikelfraktion und der Gelfraktion berechnet werden kann. Das optimale Verhältnis muss an die besondere klinische Anwendung angepasst werden und kann von 9:1 bis 1:9 Anteilen Mikropartikel gegenüber dem Gel variieren.
Beispiel 12 – Behandlung von fehlender Frakturheilung mit einer injizierbaren Kombination eines einen Wachstumsfaktor einbettenden Hyaluronsäure-Derivat-Trägers
Fehlende Frakturheilungen sind gewöhnlich Komplikationen, die bei orthopädischen Operationen auftreten, wenn komplexe Knochenschäden oder von Dysmetabolismus betroffene Patienten behandelt werden. Dem derzeitigen Stand der Technik entsprechende Behandlungen für fehlende Frakturheilung beruhen auf Verabreichung von Arzneistoffen oder Anwendung azellulären Biomaterials. Ein relativ kürzlicher Ansatz ist die Verwendung eines bestimmten biologischen Faktors, um das Wirts-Reparatursystem zu stimulieren, damit Bedingungen überwunden werden, welche die Knochenkallusbildung behindern. Derartige biologisch aktive Moleküle sind zum Beispiel die Knochenbildungsproteine (BMPs). Da Stoffe jedoch lokal wirken müssen und nicht durch das (vaskuläre und/oder lymphatische) Kreislaufsystem verteilt werden dürfen, testen Fachleute verschiedene Träger. Hyaluronsäure-abgeleitete Verbindungen als erfindungsgemäßer Gegenstand sind für diese Indikation besonders geeignet, weil Hyaluronsäure nicht nur osteokonduktiv sondern auch osteoinduktiv ist. So kann Hyaluronsäure, während sie eine bestimmte Menge BMP freisetzt, auch den Effekt dieses biologisch aktiven Proteins verstärken und die Knochenbildung fördern.
Die für das Einwachsen in den Knochen zu verwendende Formulierung ist entweder ein Gel, in das BMP eingebettet wird, zum Beispiel BMP-2, oder eine Kombination von einem Gel und Mikropartikeln, in die BMP engebettet wird. Das Verhältnis von Gel und Mikropartikel kann wie oben beschrieben angepasst werden. Diese letztere Kombination ist bestimmt zur, aber nicht beschränkt auf die Stimulierung der Osteogenese durch direkte Wirkung der Hyaluronsäure auf Knochenvorläufer (Osteoinduktion), und auch die Stimulierung der Osteokonduktion durch Gewebeführung. Zusätzlich kann Knochenwachstum durch Kombination von beispielsweise BMP-2 mit einem bestimmten Antibiotikum vor Infektion geschützt werden, einer häufigen Komplikation bei fehlender Frakturheilung.
Beispiel 13 – Behandlung kutaner Missbildungen durch Injizieren verschiedener Zellen in auf Hyaluronsäure-Derivaten beruhenden Gel- und Gel-/Feststoff-Kombinationen
Kutane Missbildungen haben einen wesentlichen Einfluss auf die Lebensqualität eines Menschen, zum Beispiel nach Mastektomie oder ausgedehnter Verbrennung des Gesichts. Dem Stand der Technik entsprechende Behandlungsprotokolle beruhen auf der Verabreichung von Gewebe vermehrenden abbaubaren Stoffen, zum Beispiel Kollagen. Eine derartige zeitweise Vorrichtung eliminiert jedoch die unschöne Eigenschaft nicht dauerhaft und muss ständig verabreicht werden. Ein stabiler Aufbau kann nur ereicht werden, wenn extrazelluläre Matrix auf eine korrekte Weise produziert wird, um die ursprüngliche Hautkontur wiederherzustellen. In einer flüssigen Suspension injizierte Zellen werden wahrscheinlich entweder durch das vaskuläre oder lymphatische System verteilt, wodurch sie die Kapazität zur Synthese einer permanenten, organisierten extrazellulären Matrix verlieren. Ein Trägersystem, welches eine zeitlich stabile Verankerung mit dem umgebenden Gewebe garantiert, bis eine permanente Anhaftung stattfindet, kann durch eine auf einem Hyaluronsäure-Derivat beruhende Formulierung gebildet werden. Zusätzlich kann Hyaluronsäure teilweise direkt durch Stimulierung des Wundheilungsprozesses wirken, wie in der Literatur bekannt.
So können extrazelluläre Matrix produzierende Zellen, wie zum Beispiel Fibroblasten, eingeschleust werden, indem sie in ein auf einem Hyaluronsäure-Derivat beruhenden Gel wie oben beschrieben eingebettet werden. Fibroblasten werden dann in den subkutanen Raum injiziert und an der Stelle befestigt, bis der natürliche Vorgang der Adhäsion an das umgebende Gewebe stattfindet. In einer anderen Ausführungsform kann eine Kombination von Mikropartikeln verwendet werden, auf denen zuerst in einem Gel eingebettete Fibroblasten zur Abgabe gleichmäßig dispergierter Zellen befestigt werden müssen. Das Verhältnis und die Zusammensetzungen verschiedener Formulierungen werden vorstehend beschrieben. Andere Zellen als Fibroblasten können verwendet werden, um eine Hautvertiefung auszufüllen, wie zum Beispiel Brustdrüsenzellen oder Adipozyten (entweder differenziert oder nicht festgelegt).
Beispiel 14 – Behandlung von Autoimmunerkrankungen mit gentechnisch veränderten Zellen, eingebettet in injizierbare Feststoff-/Gel-Formulierungen aus Hyaluronat-Derivaten
Autoimmunerkrankungen sind auf eine selbstreaktive Antwort des Immunsystems auf bestimmte Körperfaktoren zurückzuführen, wie zum Beispiel Insulin bei juvenilem Diabetes oder Knorpelgewebekomponenten bei rheumatoider Arthritis. Autoimmunerkrankungen sind chronische Pathologien, die Millionen von Menschen auf der Welt betreffen. Derzeitige pharmakologische Protokolle konzentrieren sich auf die Symptomatologie der Krankheit durch Gabe von generischen entzündungshemmenden Stoffen, die entweder lokal oder systemisch abgegeben werden, mit begleitenden Komplikationen. Behandlungen der neuen Generation werden die Verwendung von stärkeren und spezifischeren Verbindungen wie zum Beispiel enzymatischen Inhibitoren oder Rezeptorantagonisten beinhalten. Permanente Kontrolle der Krankheiten beruht jedoch auf der andauernden Verabreichung dieser Stoffe mit dem Risiko, Arzneistoff-bezogene Komplikationen zu entwickeln. Eine weitere Lösung der vordersten Front wird zum Beispiel durch die ex vivo Verwendung genetisch transformierter Zellen zur Herstellung bestimmter biologischer oder pharmakologischer Stoffe gebildet, um der Immunreaktion entgegen zu wirken. In dieser besonderen Anwendung müssen Zellen lokal injiziert werden und sie müssen ihre Lebensfähigkeit über eine lange Zeit aufrechterhalten, möglicherweise über die gesamte Lebensdauer des Einzelnen. Zu diesem Zweck müssen Zellen in die Anwendungsstelle integrieren, und dies kann erreicht werden, indem ein Träger bereitgestellt wird, in welchem die Zellen ursprünglich abgegeben werden und eingebettet sind. Die in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Hyaluronsäure-Derivate können dieses Bedürfnis mit der besonderen Eigenschaft, in fast allen Kompartimenten des menschlichen Körpers akzeptiert zu werden, befriedigen. So können, wie vorstehend beschrieben, chondrogene Zellen geerntet und isoliert werden. Dann werden die Zellen mit von Fachleuten routinemäßig angewendeten Techniken transfiziert, um in einer biologisch regulierten Weise antirheumatische Mittel, wie zum Beispiel anti-IL-1 oder anti-TNF zu exprimieren, und vermehrt. Schließlich werden die Zellen in Patienten mit rheumatoider Arthritis in demselben zuvor verwendeten Vehikel abgegeben.

Claims

Injizierbare biokompatible Zusammensetzung, umfassend Säugerzellen, welche in einem Gel dispergiert sind, umfassend mindestens ein Hyaluronsäure-Derivat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Benzylester der Hyaluronsäure, worin 50 bis 75% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind; und (b) einem auto-vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, worin 3 bis 15% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Benzylester ein solcher ist, worin 50% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin ungefähr 5% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines andere Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Säugerzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege und Stammzellen, sowohl von Erwachsenen als auch vom Embryo, unter der Voraussetzung, daß die Säugerzellen keine menschlichen embryonalen Stammzellen sind.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Säugerzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege und erwachsenen Stammzellen.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zellen Chondrozyten sind.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung weiterhin eine pharmakologisch wirksame Komponente umfaßt.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die pharmakologisch wirksame Komponente ein Antibiotikum, ein entzündungshemmendes Mittel, ein Antiseptikum, ein Wirkstoffhormon, ein Antitumormittel oder ein Antivirusmittel darstellt.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die pharmakologisch wirksame Komponente ein Wachstumsfaktor oder ein Differenzierungs-/Modulationsfaktor ist.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin der Wachstumsfaktor ein aus der aus Transformationswachstumsfaktor, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor, Epidermiswachstumsfaktor, dem sauren und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem Hepatozyt-Wachstumsfaktor, dem Keratinozyt-Wachstumsfaktor, Knochenbildungsproteinen und osteogenen Proteinen bestehenden Gruppe ausgewähltes Element ist.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die pharmakologisch wirksame Komponente eine Nucleinsäure, wie DNA und RNA, ist.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche weiterhin Fasern, Granulate, Mikrosphären, Nanosphären oder Schwamm-Fragmente eines Derivats der Hyaluronsäure umfaßt.
Injizierbare biokompatible Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das Derivat der Hyaluronsäure das vollständige Benzylester-Derivat ist.
Verwendung mindestens eines Hyaluronsäure-Derivats zur Herstellung einer injizierbaren biokompatiblen Zusammensetzung, welche Säugerzellen, dispergiert in einem für die Injektionsverabreichung angepaßten Gel, umfaßt, worin das Hyaluronsäure-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Benzylester der Hyaluronsäure, worin 50 bis 75% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind; und (b) einem auto-vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, worin 3 bis 15% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 14, worin der Benzylester ein solcher ist, worin 50% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die Hyaluronsäure ein autovernetztes Derivat der Hyaluronsäure darstellt, worin ungefähr 5% der Carboxygrupppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind:
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin die Säugerzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege und Stammzellen, sowohl von Erwachsenen als auch vom Embryo, unter der Voraussetzung, daß die Säugerzellen keine menschlichen embryonalen Stammzellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin die Säugerzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege, erwachsenen Stammzellen und genetisch modifizierten Zellen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin die Zellen Chondrozyten sind.
Verwendung von mindestens einem Hyaluronsäure-Derivat zur Herstellung einer injizierbaren Zusammensetzung zur Wiederherstellung von Knorpel, worin die Zusammensetzung Chondrozyten umfaßt, dispergiert in einem Gel, enthaltend mindestens ein Hyaluronsäure-Derivat; wobei das Hyaluronsäure-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Benzylester der Hyaluronsäure, worin 50 bis 75% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind; und (b) einem auto-vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, worin 3 bis 15% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 20, worin das Hyaluronsäure-Derivat einen Benzylester der Hyaluronsäure darstellt, worin 50% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind.
Verwendung nach Anspruch 20, worin die Hyaluronsäure ein autovernetztes Derivat der Hyaluronsäure darstellt, worin ungefähr 5% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Verwendung mindestens eines Derivats der Hyaluronsäure zum Schutz von Säugerzellen während der Lagerung und des Transports; wobei das Hyaluronsäure-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Benzylester der Hyaluronsäure, worin 50 bis 75% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind; und (b) einem auto-vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, worin 3 bis 15% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 23, worin das Hyaluronsäure-Derivat einen Benzylester der Hyaluronsäure darstellt, worin 50% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind.
Verwendung nach Anspruch 23, worin die Hyaluronsäure ein autovernetztes Derivat der Hyaluronsäure darstellt, worin ungefähr 5% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin die Säugerzelle ausgewählt ist aus der Gruppe; bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege und Stammzellen, sowohl von Erwachsenen als auch vom Embryo, unter der Voraussetzung, daß die Säugerzellen keine menschlichen embryonalen Stammzellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin die Säugerzelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Osteozyten, Fibroblasten, Keratinozyten, Adipozyten, Muskelzellen, Nervenzellen, Zellen des peripheren Nervensystems, Endothelzellen, hämatopoetischen Zellen, Drüsenzellen, Zellen der Harnwege, erwachsenen Stammzellen und genetisch modifizierten Zellen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 27, worin die Zellen Chondrozyten sind.
Verwendung von Chondrozyten in Kombination mit einem Hyaluronsäure-Derivat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Benzylester der Hyaluronsäure, worin 50 bis 75% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind; und (b) einem auto-vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, worin 3 bis 15% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind; zur Herstellung einer injizierbaren biokompatiblen Zusammensetzung, umfassend die in einem Gel, welches das Hyaluronsäure-Derivat enthält, dispergierten Chondrozyten, zur Verwendung in der Behandlung von Knorpelschäden durch Injizieren der Zusammensetzung in den intra-artikulären Bereich eines Patienten.
Verwendung nach Anspruch 29, worin das Hyaluronsäure-Derivat einen Benzylester der Hyaluronsäure darstellt, worin 50% der Carboxygruppen mit einem Benzylrest verestert sind.
Verwendung nach Anspruch 29, worin die Hyaluronsäure ein auto-vernetztes Derivat der. Hyaluronsäure darstellt, worin ungefähr 5% der Carboxygruppen der Hyaluronsäure an eine Hydroxylgruppe desselben oder eines anderen Hyaluronsäure-Moleküls vernetzt/querverbunden sind.