DE69924140T2

DE69924140T2 - Bestimmung der länge von repetitiven nukleinsäure-sequenzen durch eine diskontinuierliche primerverlängerung

Info

Publication number: DE69924140T2
Application number: DE69924140T
Authority: DE
Inventors: J. Kenneth LIVAK; L. Adam LOWE; J. Andrew BLASBAND
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: DE69924140D1; JP2010213709A; US20040126756A1; ATE290606T1; US7294464B2; US7414115B2; JP2002531106A; WO2000032824A2; US6309829B1; EP1135528A2; US20070178519A1; CA2353793A1; WO2000032824A3; US6773887B2; AU2037500A; EP1135528B1; AU758964B2; WO2000032824A9; US20050112619A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren und Kits, die zur Bestimmung der Länge von Nukleinsäurewiederholungssequenzen verwendbar sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren und Kits, die zur Bestimmung der Länge von Nukleinsäurewiederholungssequenzen durch Einsetzen einer diskontinuierlichen Primerverlängerungsreaktion verwendbar sind.
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HINTERGRUND
Verfahren für die Analyse von genetischen Polymorphismus finden einen breiten Einsatzbereich in der Grundlagenforschung, der klinischen Diagnostik, Forensik und anderen Bereichen. Ein besonders nützliches Verfahren zum Nachweis von genetischem Polymorphismus basiert auf Variationen in der Länge von Wiederholungssequenzen („Repeat-Sequenzen"), wobei solche Verfahren verschiedentlich als Short-Tandem-Repeat-Analyse (STR), variable Anzahl von Tandem-Repeat-Analyse (VNTR), Minisatellitenanalyse und Mikrosatellitenanalyse bezeichnet werden.
Der Nachweis von Längenpolymorphismus in Nukleinsäurewiederholungssequenzen basierte bis heute auf einer Gelelektrophorese zur Bestimmung der Länge der Wiederholungssequenz. Allerdings besitzt eine Gelektrophorese mehrere entscheidende Nachteile im Zusammenhang mit einer Wiederholungssequenz-Längenpolymorphismus-Analyse. Erstens sind molekulare Längenmessungen basierend auf der elektrophoretischen Mobilität in sich schon aufgrund einer komplizierten Beziehung zwischen der molekularen Größe und der elektrophoretischen Mobilität ungenau. Zweitens ist der Grad, bei dem der elektrophoretische Prozess mehrfach aufgeteilt ist, durch die Anzahl der Elektrophoresespuren und durch die Größe der unterschiedlichen Loci, die in einer Einzelspur laufen, limitiert, d.h. es müssen Loci ausgewählt werden, die nicht elektrophoretisch ko-migrieren.
ZUSAMMENFASSUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst eine diskontinuierliche Primerverlängerungsreaktion, wobei ein Primer durch bestimmte Zunahmen verlängert wird, so dass bei jeder Zunahme der Primerverlängerung der Primer um einen Betrag verlängert wird, der einer Einzelwiederholungseinheit entspricht. Nach jeder Zunahme der Primerverlängerung wird ein Detektionsschritt durchgeführt, bei dem eine Modulation in einem Signal nachgewiesen wird, wenn der Primer um einen Betrag ver längert wird, der der Gesamtlänge einer Wiederholungsregion („Repeat-Region") entspricht. Somit wird die Anzahl von Wiederholungseinheiten, aus denen die Wiederholungsregion besteht, bestimmt, indem die Anzahl der Zunahmen einer bestimmten Primerverlängerung, die zum Auslösen einer Modulation in dem Signal erforderlich sind, gezählt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein genaues und reproduzierbares Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Wiederholungseinheiten („Repeat-Einheiten"), aus denen eine Wiederholungsregion einer Nukleinsäurewiederholungssequenz besteht, bereitzustellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten, aus denen eine Wiederholungsregion einer Nukleinsäurewiederholungssequenz besteht, bereitzustellen, das eine große Anzahl von Messungen parallel durchführen kann.
Es ist eine weitere zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten, aus denen eine Wiederholungsregion einer Nukleinsäurewiederholungssequenz besteht, bereitzustellen, das keine elektrophoretische Auftrennung erforderlich macht.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Kits und Reagenzien, die zum Durchführen eines Verfahrens zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten, aus denen eine Wiederholungsregion einer Nukleinsäurewiederholungssequenz besteht, mit den oben beschriebenen Eigenschaften verwendbar sind, bereitzustellen.
In einem Aspekt werden die vorhergehenden und anderen Aufgaben der Erfindung durch ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten in einer Wiederholungsregion einer Zielnukleinsäure erreicht, das die Anlagerung eines Primer-komplementären Teils einer Zielnukleinsäure an einen Primer, wobei dadurch ein Ziel-Primer-Hybrid gebildet wird; Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenzes; Auftrennen des Ziel-Primer-Hybrids und des nicht reagierten ersten Primerverlängerungsreagenzes; Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines zweiten Primerverlängerungsreagenzes, wobei mindestens eines der ersten und zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleo tid mit einer daran verknüpften Markierung einschließt; Auftrennen des Ziel-Primer-Hybrids von dem nicht reagierten zweiten Primerverlängerungsreagenz; Messen eines Signals, das durch die Markierung erzeugt wird; Behandlung der Markierung, so dass die Markierung nicht detektierbar gemacht wird; und Wiederholen der oben genannten Schritte, bis das Signal im Wesentlichen geringer ist als ein Signal, das in einem vorhergehenden Zyklus nachgewiesen wurde, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform diesen Aspekts der Erfindung umfasst der Schritt der Durchführung einer zweiten Primerverlängerungsreaktion weiter das Umsetzen des Ziel-Primer-Hybrids mit einem Primerterminationsreagenz.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung ist die Markierung ein fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Molekül.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung ist die Markierung an das verlängerbare Nukleotid über einen spaltbaren Linker verknüpft.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung wird die Zielnukleinsäure vor der Analyse amplifiziert. Bevorzugt wird eine solche Amplifikation unter Verwendung von PCR erreicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung umfasst der Schritt der Behandlung der Markierung, so dass die Markierung nicht detektierbar gemacht wird, entweder die Spaltung der Markierung von dem markierten verlängerbaren Nukleotid oder das Zerstören einer signalerzeugenden Eigenschaft der Markierung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung ist das Ziel-Primer-Hybrid an einen Festträger verknüpft. Vorzugsweise ist einer der Primer oder die Zielnukleinsäure an den Festträger verknüpft.
In einer neuen bevorzugten Ausführungsform, die einen Festträger einsetzt, umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten („Repeat-Einheiten") in einer Wiederholungsregion („Repeat-Region") einer Zielnukleinsäure, umfassend die Schritte:

(A) In-Kontakt-Bringen einer Vielzahl von Primern mit unterschiedlicher Sequenz mit einer Polynukleotid-Probe unter Bedingungen, die wirksam sind, damit sich die Primer an Primer-komplementäre Regionen in einem oder mehreren Zielpolynukleotiden anlagern, um ein oder mehrere Ziel-Primer-Hybrid(e) zu bilden, wobei entweder (1) jeder Primer mit unterschiedlicher Sequenz (i) ein Zielbindesegment und (ii) ein tag-Markierungssegment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Zielbindesegment charakteristisch ist, enthält oder (2) ein oder mehrere Polynukleotide in der Probe tag-markierte Polynukleotide sind, die ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz enthalten, die für das gebundene Polynukleotid charakteristisch ist.
(B) Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion auf dem/den Hydrid(e) unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenzes;
(C) Auftrennen des/der Ziel-Primer-Hybrid(e) und des nicht reagierten ersten Primerverlängerungsreagenz;
(D) Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion auf dem/den Hydrid(e) unter Verwendung eines zweiten Primerverlängerungsreagenz, wobei mindestens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran verknüpften Markierung einschließt;
(E) Auftrennen des/der Ziel-Primer-Hybrid(e) von dem nicht reagierten zweiten Primerverlängerungsreagenz;
(F) Messen eines durch die Markierung erzeugten Signals;
(G) Behandlung der Markierung, so dass die Markierung nicht detektierbar gemacht wird; und
(H) Wiederholung eines Zyklus der Schritte (A) bis (G), bis das in dem/den Ziel-Primer-Hybrid(e) detektierte Signal im Wesentlichen geringer ist als ein in einem vorhergehenden Zyklus detektiertes Signal,

In einer Ausführungsform wird das In-Kontakt-Bringen in Schritt (I) vor dem Schritt (A) durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird das In-Kontakt-Bringen in Schritt (I) nach dem Schritt (A) und/oder vor einem der Schritte (B), (C), (D), (E) und (F) durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Schritte (A) bis (H) auf mindestens zwei Replikatsanordnungen durchgeführt und eine der Replikatsanordnungen wird mindestens einem weiteren Zyklus der Schritte (A) bis (G) als die zweite Replikatsanordnung ausgesetzt. In einem weiteren Aspekt, der nicht Teil der Erfindung ist, wie sie in den anhängenden Patentansprüchen definiert ist, werden die vorangegangenen und anderen Aufgaben durch ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten in einer Wiederholungsregion einer Zielnukleinsäure gelöst, umfassend die Anlagerung eines Primerkomplementären Teils einer Zielnukleinsäure an einen Primer, wobei dadurch ein Ziel-Primer-Hybrid gebildet wird; Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenzes; Auftrennen des Ziel-Primer-Hybrids von dem nicht reagierten ersten Primerverlängerungsreagenz; Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines zweiten Primerverlängerungsreagenz und mit einem Primerterminationsreagenz, wobei das Primerterminationsreagenz einen Nukleotidterminator mit einer daran verknüpften Markierung einschließt; Auftrennen des Ziel-Primer-Hybrids von dem nicht reagierten zweiten Primerverlängerungsreagenz und dem nicht reagierten Primerterminationsreagenz; Messen eines durch die Markierung erzeugten Signals; und Wiederholung der oben genannten Schritte, bis ein Signal nachgewiesen wird, das den Einbau des markierten Nukleotidterminators in das Primerverlängerungsprodukt anzeigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt ist die Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt wird die Zielnukleinsäure vor der Analyse amplifiziert. Vorzugsweise wird eine solche Amplifikation unter Verwendung von PCR erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt ist das Ziel-Primer-Hybrid an einen Festträger verknüpft. Vorzugsweise ist einer der Primer oder die Zielnukleinsäure an den Festträger verknüpft.
Ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Wiederholungseinheiten in einer Wiederholungsregion einer Zielnukleinsäure kann die Schritte umfassen:

(A) In-Kontakt-Bringen einer Vielzahl von Primern mit unterschiedlicher Sequenz mit einer Polynukleotid-Probe unter Bedingungen, die wirksam sind, damit sich die Primer an Primer-komplementäre Regionen in einem oder mehreren Zielpolynukleotiden anlagern, um ein oder mehrere Ziel-Primer-Hybrid(e) zu bilden, wobei entweder (1) jeder Primer mit unterschiedlicher Sequenz (i) ein Zielbindesegment und (ii) ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Zielbindesegment spezifisch ist, enthält oder (2) ein oder mehrere Polynukleotide in der Probe tag-markierte Polynukleotide sind, die ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz enthalten, die für das gebundene Polynukleotid charakteristisch ist.
(B) Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion auf dem/den Hydrid(e) unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenzes;
(C) Auftrennen des/der Ziel-Primer-Hybrid(e) von dem nicht reagierten ersten Primerverlängerungsreagenz;
(D) Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion auf dem/den Hydrid(e) unter Verwendung eines zweiten Primerverlängerungsreagenz, wobei mindestens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran verknüpften Markierung einschließt;
(E) Auftrennen des/der Ziel-Primer-Hybrid(e) von dem nicht reagierten zweiten Primerverlängerungsreagenz;
(F) Messen eines durch die Markierung erzeugten Signals; und
(G) Wiederholen eines Zyklus der Schritte (A) bis (F), bis ein Signal detektiert wird, das den Einbau des Nukleotidterminators anzeigt,

In einer Ausführungsform wird das In-Kontakt-Bringen in Schritt (H) vor dem Schritt (A) durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird das In-Kontakt-Bringen in Schritt (H) nach dem Schritt (A) und/oder vor einem der Schritte (B), (C), (D), (E) und (F) durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Schritte (A) bis (G) auf mindestens zwei Replikationsanordnungen durchgeführt und eine der Replikationsanordnungen wird mindestens einem weiteren Zyklus der Schritte (A) bis (F) als die zweite Replikationsanordnung ausgesetzt.
In einem dritten Aspekt werden die vorhergehenden und anderen Aufgaben der Erfindung durch einen Kit gelöst, der zur Bestimmung der Anzahl von Wiederholungseinheiten in einer Wiederholungsregion einer Zielnukleinsäure verwendbar ist, umfassend einen Primer mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einem Primerkomplementären Teil einer Zielnukleinsäure; ein erstes Primerverlängerungsreagenz; und ein zweites Primerverlängerungsreagenz, wobei mindestens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran verknüpften Markierung einschließt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des dritten Aspekts der Erfindung ist der Primer an einen Festträger verknüpft.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform von dem zweiten Aspekt der Erfindung ist die Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von dem zweiten Aspekt der Erfindung ist die Markierung an das verlängerbare Nukleotid über einen spaltbaren Linker verknüpft.
Diese und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme zu der folgenden Beschreibung, Zeichnungen und den anhängenden Patentansprüchen besser verstanden werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine schematische Darstellung einer Zielnukleinsäure.
2A–C zeigen einen ersten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei ein verlängerbares Nukleotid markiert ist und die Markierung nach jeder bestimmten Zunahme der Primerverlängerung nicht detektierbar gemacht wird.
3A–B zeigen einen zweiten Aspekt, wobei ein Nukleotidterminator markiert ist.
4 und 5 zeigen beispielhafte Schemata zur Durchführung der Erfindung unter Verwendung eines Festphasenträgers, der eine Anordnung von tag-Komplementen zum gleichzeitigen Erhalten von Sequenz-Wiederholungsinformationen für eine Vielzahl von unterschiedlichen Proben unter Verwendung von tag-markierten Primern oder tag-markierten Probennukleotiden enthält.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. DEFINITIONEN
Soweit nicht anderweitig definiert, sollen die folgenden hier verwendeten Ausdrücke und Satzteile die folgenden Bedeutungen haben:
„Nukleosid" bezeichnet eine Verbindung, die aus einer Purin-, Deazapurin-, oder Pyrimidin-Nukleosidbase besteht, z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin und dergleichen, die an eine Pentose an der 1'-Position gebunden ist, einschließlich 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen (Stryer).
Der Ausdruck „Nukleotid" wie hier verwendet bezeichnet ein Phosphatester eines Nukleosids, z.B. ein Triphosphatester, worin die am meisten übliche Veresterungsstelle die Hydroxyl-Gruppe ist, die mit der C-5-Position der Pentose verknüpft ist. Vielzählige Male in der vorliegenden Offenbarung soll der Ausdruck Nukleosid sowohl Nukleoside als auch Nukleotide einschließen. Die Ausdrücke Nukleotid und Nukleosid wie hier verwendet sollen synthetische Analoga mit modifizierten Nukleosidbasenresten, modifizierten Zuckerresten und/oder modifizierten Phosphatesterresten einschließen, z.B. wie beschrieben in (Scheit: Eckstein).
„Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" bezeichnet lineare Polymere von Nukleotidmonomeren, einschließlich Einzel-, Doppel- und Dreifach-Strang-Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, α-anomerische Formen davon und dergleichen. Gewöhnlicher Weise sind Nukleosidmonomere durch Phosphordiesterbindungen verbunden, wobei der hier verwendete Ausdruck „Phosphordiesterbindung" Phosphordiesterbindungen oder Bindungen, die Phosphatanaloga davon einschließen, bezeichnet, wobei das Phosphoratom in dem +5 Oxidationszustand vorliegt und ein oder mehrere Sauerstoffatome mit einem Nicht-Sauerstoffrest ersetzt ist. Beispielhafte Phosphatanaloga umfassen Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoroselenoat, Phosphorodiselenoat, Phosphoroanilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat, Boronphosphate und dergleichen, einschließlich damit verbundenen Gegenionen, z.B. H⁺, NH₄ ⁺, Na⁺ und dergleichen, wenn solche Gegenionen vorliegen. Alternativ können Polynukleotide Polymere von nicht nukleotidischen Monomeren umfassen, die über Phosphordiesterbindungen oder anderen Bindungen, die zur Bildung von Sequenzspezifischen Hydriden mit einer Zielnukleinsäure fähig sind, verbunden sind, z.B. Peptidnukleinsäurepolymere (PNAs, z.B. siehe Knudsen, 1996). Polynukleotide variieren typischerweise in der Größe von ein paar Monomer-Einheiten, z.B. 8-40 bis mehrere 1000 Monomereinheiten. Wenn ein Polynukleotid durch eine Buchstabensequenz dargestellt wird wie „ATGCCTG", soll es so verstanden werden, dass die Nukleotide in der 5'->3'-Reihenfolge von links nach rechts angeordnet sind und dass „A" Desoxyadenosin, „C" Desoxycytitin, „G" Desoxyguanosin und „T" Thymidin bezeichnet, soweit nicht anders angegeben.
„Verlängerbares Nukleotid" bezeichnet ein beliebiges Nukleotid, das bei Einbau in einem Primerverlängerungsprodukt während einer Primerverlängerungsreaktion die weitere Verlängerung eines solchen Primerverlängerungsprodukts ermöglicht. Beispielhafte verlängerbare Nukleotide umfassen 2'-Desoxynukleotidtriphosphate, z.B. 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxy-7-deazadesoxyguanosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat und 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat. Gegebenenfalls schließen ein oder mehrere der verlängerbaren Nukleotide eine Markierung ein.
„Nukleotidterminator" bezeichnet ein beliebiges Nukleotid, das bei Einbau in einem Primerverlängerungsprodukt die weitere Verlängerung eines solchen Primerverlängerungsprodukts verhindert. Ein Erfordernis eines Nukleotidterminators ist es, dass die 3'-Position keine Hydroxy-Gruppe, die unmittelbar durch eine Polymerase verwendet werden müsste, um zusätzliche Nukleotide einzubauen, aufweisen darf, wenn der Nukleotidterminator ein Ribofuranosezuckerteil einschließt. Alternativ könnte ein Ribofuranoseanalog wie Arabinose verwendet werden. Beispielhafte Nukleotidterminatoren umfassen 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl, β-D-Arabinofuranosyl, 3'-Desoxy-β-D-arabinofuanosyl, 3'-Amino-2',3'-didesoxy-β-D-ribofuranosy und 2',3'-Didesoxy-3'-fluor-β-D-ribofuranosyl (Chidgeavadze, 1984, 1985). Nukleotidterminatoren umfassen auch reversible Nukleotidterminatoren (Metzker) und 3'-Desoxy-Substituenten wie Wasserstoff, 3'-Fluor-, 3'-Amino- und 3'-Azid-, z.B. (Mikhailopulo et al., 1989; Krayevski et al., 1984; Chidgeavadze, 1986).
„Polymerase" bezeichnet ein Enzym oder einen anderen Katalyst, der zur Katalyse einer Reaktion fähig ist, die zu einem Zielsequenz-abhängigen Einbau eines Nukleotids an ein 3'-Ende eines Primers oder eines Primerverlängerungsprodukts führt, wenn ein solcher Primer oder Primerverlängerungsprodukt an eine Zielnukleinsäure angelagert wird. Beispielhafte Polymerasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Pfu-DNA-Polymerase, E. Coli-Polymerase I, T-7-Polymerase, reverse Transkriptase, Taq-DNA-Polymerase und dergleichen (Kornberg und Baker).
„Markierung" bezeichnet einen Rest, der ein solches Nukleotid oder Polynukleotid unter Verwendung von bekannten Selektionsmitteln detektierbar macht, wenn sie an ein erfindungsgemäßes Nukleotid oder Polynukleotid verknüpft ist. Markierungen können direkte Markierungen sein, die selbst detektierbar sind oder indirekte Markierungen, die in Kombination mit anderen Agenzien detektierbar sind. Beispielhafte direkte Markierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluorophore, Chromophore, Radioisotope, Spin-Markierungen, chemilumineszierende Markierungen und dergleichen. Beispielhafte indirekte Markierungen umfassen Enzyme, die ein Signal erzeugendes Ereignis katalysieren und Liganden wie ein Antigin oder Biotin, das mit hoher Affinität spezifisch an einen detektierbaren Anti-Liganden wie einem markierten Antikörper oder Avidin binden kann.
„Primerverlängerungsreaktion" bezeichnet eine Reaktion zwischen einem Ziel-Primer-Hybrid und einem Nukleotid, was zu dem Anheften des Nukleotids an ein Ende des Primers, gewöhnlicher Weise an das 3'-Ende führt, so dass das zugefügte Nukleotid komplementär ist zu dem korrespondierenden Nukleotid der Zielnukleinsäure.
„Primerverlängerungsreagenz" bezeichnet ein Reagenz, das Bestandteile einschließt, die notwendig sind, um eine Primerverlängerungsreaktion zu bewirken. Primerverlängerungsreagenzien umfassen typischerweise (1) ein Polymerase-Enzym, (2) einem Puffer und (3) ein oder mehrere verlängerbare Nukleotide.
„Spezifisches Bindungspaar" bezeichnet ein Paar von Molekülen, die spezifisch aneinander binden, um einen Bindungskomplex zu bilden. Beispiele von spezifischen Bindungspaaren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Antikörper-Antigin (oder Hapten)-Paaren, Ligand-Rezeptor-Paaren, Enzym-Substrat-Paaren, Biotin-Avidin-Paaren, Polynukleotiden mit komplementären Basenpaaren und dergleichen.
„Primer" ist ein Polynukleotid, das zur selektiven Anlagerung einer spezifischen Zielsequenz fähig ist und dadurch als Initiationspunkt einer Primerverlängerungsreaktion dient, wobei der Primer in die 3'->5' einer 5'->3'-Richtung, typischerweise das letztere, verlängert wird.
II. MATERIALIEN, DIE IN DEN ERFINDUNGSGEMÄSSEN VERFAHREN VERWEN-DET WERDEN
A. Zielnukleinsäure
Die Zielnukleinsäuren, die in der Erfindung verwendet werden, können von einem beliebigen lebenden oder einmal lebenden Organismus stammen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Prokaryonten, Eukaryonten, Pflanzen, Tiere und Viren sowie synthetische Nukleinsäuren. Die Zielnukleinsäuren können ihren Ursprung in einer breiten Vielzahl von Probentypen haben, wie Zellkerne (z.B. genomische DNA) und extranuklearen Nukleinsäuren, z.B. Plasmide, mitrochondriale Nukleinsäuren und dergleichen. Die Zielnukleinsäuren können DNA oder RNA einschließen und sind gewöhnlicher Weise DNA.
Es sind viele Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung einer Nukleinsäure, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verfügbar. Ein bevorzugtes Aufreinigungsverfahren sollte eine Zielnukleinsäure bereitstellen, bei der im ausreichenden Maße kein Protein vorhanden ist, um eine effiziente Primerverlängerung und Nukleinsäureamplifikation zu ermöglichen. Bevorzugte Aufreinigungsverfahren umfassen (i) eine organische Extraktion gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, z.B. unter Verwendung eines organischen Phenol/Chloroform-Reagenz (Ausubel) vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Extraktors, z.B. das DNA-Extraktor Modell-341 erhältlich von PE Applied Biosystems (Foster City, CA), (ii) Festphasenadsorptionsverfahren (Walsh, Boom) und (iii) Salz-induzierte DNA-Präzipitationsverfahren (Miller), wobei solche Verfahren typischerweise als „Entsalzungs-Verfahren" bezeichnet werden. Idealerweise werden die oben genannten Aufreinigungsverfahren mit Hilfe eines Enzymverdauschrittes durchgeführt, um Protein aus der Probe leichter zu entfernen, beispielsweise durch einen Verdau mit Proteinase K, oder ähnlichen Proteasen.
Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, wird die Zielnukleinsäure vor dem Durchführen des Verfahrens unter Verwendung eines geeigneten Nukleinsäureamplifikationsverfahrens amplifiziert. Eine solche Amplifikation kann entweder linear oder exponentiell erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Amplifikation der Zielnukleinsäure unter Verwendung der Polymerasenkettenreaktion (PCR) erreicht (Mullis). Im Allgemeinen besteht die PCR aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt, der die Stränge einer doppelsträngigen Nukleinsäureprobe voneinander trennt, gefolgt durch eine Wiederholung (i) eines Anlagerungsschrittes, der die spezifische Anlagerung von Amplifikationsprimern an Stellen, die eine Zielsequenz flankieren, ermöglicht, (ii) einem Verlängerungsschritt, der die Primer in einer 5'->3'-Richtung verlängert und dadurch ein Nukleinsäure-Amplicon bildet, das komplementär ist zu der Zielsequenz und (iii) einem Denaturierungsschritt, der die Auftrennung des Amplicons und der Zielsequenz bewirkt. Jeder der oben genannten Schritte kann bei einer unterschiedlichen Temperatur durchgeführt werden, wobei die Temperaturänderungen mit Hilfe eines Thermocyclers (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) erreicht werden können.
Die verallgemeinerte Struktur einer Zielnukleinsäure, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in 1 gezeigt, wobei die Zielnukleinsäure 5 einen 5'-flankierenden Teil 10 einschließt, der einen Primer-komplementären Teil 15, einen 3'-flankierenden Teil 25 und eine Wiederholungsregion 20, die zwischen dem 5'-flankierenden Teil und dem Ende des 3'-flankierenden Teils angeordnet ist, einschließt. Die Wiederholungsregion 20 der Zielnukleinsäure umfasst mehrere Wiederholungseinheiten (R)_n 21, wobei R eine Wiederholungseinheit bezeichnet und n die Anzahl der Wiederholungseinheiten kennzeichnet, aus denen die Wiederholungsregion besteht. Die Wiederholungsregion R kann ein beliebiges Wiederholungsmotiv sein, zum Beispiel, jedoch nicht beschränkt auf eine Mikrosatellitenwiederholung (Webber and May; Smeets; Williamson), Minisatellitenwiederholung (Jeffreys, Caskey) oder eine α-Satellitenwiederholung (Jabs).
Die Wiederholungsregion kann aus mehreren Arten von Wiederholungseinheiten oder Wiederholungseinheiten, die selbst polymorph sind, aufgebaut sein.
B. Primer
Primer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden entworfen, um ein Gleichgewicht zwischen der Spezifität der Primeranlagerung, d.h. der Häufigkeit, mit der eine unerwünschte Zielsequenz in einer Primerverlängerungsreaktion beteiligt ist und der Wirksamkeit der Primerverlängerung, d.h. dem Grad, mit dem eine gewünschte Zielsequenz in der Primerverlängerungsreaktion beteiligt ist, aufrechtzuerhalten.
Die Spezifität der Primeranlagerung wird im Allgemeinen durch die Länge des Primers und die Temperatur der Anlagerungsreaktion gesteuert. Polynukleotide zwischen ungefähr 18 und 24 Basen sind bevorzugt, da solche Polynukleotide dazu tendieren, sehr sequenzspezifisch zu sein, wenn die Anlagerungstemperatur inner halb ein paar Grade einer Primerschmelztemperatur eingestellt wird (Dieffenbach). Um eine Primerverlängerung zu ermöglichen, schließt ein 3'-Ende eines Primers eine -OH-Gruppe oder einen anderen Rest, der den Einbau eines Nukleotids an das 3'-Ende des Primers ermöglicht, ein. Es gibt eine Anzahl von Computerprogrammen, die eine Primerauswahl in verschiedenen Zusammenhängen ermöglichen (Osborne; Montpetit).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz des Primers so ausgewählt, dass sich der Primer an dem Primer-komplementären Teil des 5'-flankierenden Teils der Zielnukleinsäure anlagert. Vorzugsweise lagert sich der Primer so an, dass ein 3'-Ende des Primers benachbart zu einem 5'-Ende einer Wiederholungsregion einer Zielnukleinsäure liegt. Jedoch kann sich der Primer auch an ein Segment der Wiederholungsregion der Zielnukleinsäure anlagern, solange er zumindest teilweise an den 5'-flankierenden Teil des Ziels gebunden ist.
In Ausführungsformen der Erfindung, in denen Probenidentifizierungs-tag-Markierungen und Anordnungen von tag-Komplementen verwendet werden, setzt die Erfindung eine Vielzahl von verlängerbaren Primern mit unterschiedlicher Sequenz zum Nachweis von Zielsequenzen von Interesse ein. In einer Ausführungsform umfasst der tag-markierte Primer ein Zielbindungssegment, ein tag-Segment und ein verlängerbares Primer-Ende (5' oder 3'). Das Zielbindungssegment umfasst eine Polynukleotidsequenz, die so ausgewählt ist, dass sie an eine ausgewählte Zielsequenz bindet. Das tag-Segment enthält eine einzigartige Polynukleotidsequenz, welche die Identifizierung des Zielbindungssegmentes, an das das tag-Segment verbunden ist, ermöglicht. Das tag-Segment kann direkt mit dem distalen Ende des Zielbindungssegmentes verknüpft sein oder es ist gegebenenfalls an das tag-Segment durch eine zwischenliegende Trenngruppe gebunden. In einer anderen Ausführungsform ist das tag-Segment an eine interne Stelle innerhalb des Zielbindungssegmentes gebunden. Somit kann die tag-Markierung an eine mehrere Untereinheiten verbindende Gruppe oder an eine Nukleotidbase innerhalb des Zielbindungssegmentes gebunden sein. Vorzugsweise ist die tag-Markierung an ein Ende des Zielbindungssegmentes, das distal bezüglich des verlängerbaren Endes des Primers liegt, verknüpft.
Die Sequenz von jedem Zielbindungssegment wird ausgewählt, damit sie an ein ausgewähltes komplementäres Ziel hybridisiert, das einen potentiellen Polymorphismus oder eine Mutation enthält, vorzugsweise so, dass das 3'-Ende des Primers benachbart zu einem 5'-Ende einer Wiederholungsregion von einer Zielnukleinsäure liegt (zur Verlängerung in der 5' nach 3'-Richtung). Jedoch kann der Primer auch an ein Segment der Wiederholungsregion von der Zielnukleinsäure anlagern, solange er mindestens teilweise an den 5'-flankierenden Teil des Ziels gebunden ist.
Die Länge des Zielbindungssegmentes in jedem tag-markierten Primer wird ausgewählt, um eine spezifische Hybridisierung des Primers an das gewünschte Ziel ohne einer signifikanten Kreuzhybridisierung an Nichtziel-Nukleinsäuren in der Probe sicherzustellen. Auch ist es zum Erhöhen der Primerspezifität bevorzugt, dass die Schmelztemperaturen der Zielbindungssegmente nur ein paar wenige Grade voneinander abweichen. Vorzugsweise fallen die Schmelztemperaturen der Zielbindungssegmente innerhalb eines ΔTm-Bereichs (Tmax-Tmin) von 10°C oder weniger und bevorzugt von 5°C oder weniger. Dies kann beispielsweise durch eine geeignete Wahl von Bindungssegmentlängen basierend auf bekannten Verfahren zur Vorhersage von Primerschmelztemperaturen bewerkstelligt werden (Breslauer, 1986; Rychlik, 1989 und 1990; Wetmur, 1991; Osborne, 1991; Montpetit, 1992). Wie oben sind Zielbindungssegmente mit einer Länge zwischen ungefähr 18 und 24 Basen bevorzugt.
Das tag-Segment in jedem tag-markierten Primer ist so entworfen, dass es eine Sequenz enthält, die für das verknüpfte Zielbindungssegment charakteristisch ist. Daher sollten die tag-Sequenzen ausgewählt sein, um (1) eine interne Selbsthybridisierung, (2) eine Hybridisierung mit anderen tag-Markierungen der selben Sequenz, (3) eine Hybridisierung mit anderen tag-Komplementen mit unterschiedlicher Sequenz, (4) und eine Hybridisierung mit den Probenpolynukleotiden möglichst gering zu halten. Auch ist es bevorzugt, dass jede tag-Markierung deren korrespondierenden tag-Komplement unter den selben Bedingungen wie für alle tag-Markierungen in den Primern spezifisch erkennen und daran hybridisieren kann. tag-Sequenzen können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren ausgewählt werden, z.B. werden Computeralgorithmen für ausgewählte nichtkreuz-hybridisierende Sätze von tag-Markierungen beschrieben in Brenner (1996) und Shoemaker (1997). Vorzugsweise besitzen die tag-Sequenzen Stränge, die innerhalb eines vorausgewählten Temperaturbereichs liegen, wie dies oben bezüglich der verlängerbaren Primer diskutiert worden ist. Vorzugsweise fallen die Schmelztemperaturen der Zielbindungssegmente innerhalb eines ΔTm-Bereichs (Tmax-Tmin) von 10°C oder weniger und vorzugsweise innerhalb von 5°C oder weniger, was entsprechend unter Verwendung der oben genannten Verfahren berechnet wird (z.B. Breslauer). Vorzugsweise haben die tag-Segmente eine Länge von mindestens 12 Basen, um eine spezifische Hybridisierung an die korrespondierenden tag-Komplemente zu ermöglichen. Typischerweise haben tag-Segmente eine Länge von 12 bis 60 Basen und typischerweise eine Länge von 15 bis 30 Basen.
Tags und tag-Komplemente können einzel- oder doppelsträngig vorliegen, so dass eine sequenzspezifische Hybridisierung entweder Duplexe durch Watson und Crick-Basenpaarung oder Triplexe durch eine Vorwärts- oder Reverse-Hogsteen-Bindung erzeugt. In Ausführungsformen, in denen eine spezifsche Hybridisierung über eine Triplex-Bildung stattfindet, folgt die Codierung von tag-Sequenzen den selben Prinzipien wie für Duplex-bildende tag-Markierungen. Allerdings gibt es weitere Einschränkungen bezüglich der Auswahl von Wortsequenzen. Im Allgemeinen ist eine Drittstrangverbindung über eine Hoogsteen-artige Bindung entlang von Homopyrimidin-homopurin-Abschnitten in einem doppelsträngigen Ziel am stabilsten. Gewöhnlicher Weise bilden sich Basentriplets in T-A*T- oder C-G*C-Motiven (worin „-„ eine Watson-Crick-Paarung und "*" eine Hoogsteen-artige Bindung bezeichnet); jedoch sind auch andere Motive möglich. Zum Beispiel ermöglicht eine Hoogsteen-Basenpaarung parallele und antiparallele Orientierungen zwischen dem dritten Strang (dem Hoogsteen-Strang) und den Purin-reichen Strang der Duplex, an die der dritte Strang bindet in Abhängigkeit von den Bedingungen und der Zusammensetzung der Stränge.
Es gibt viele Richtlinien in der Literatur bezüglich der Auswahl von geeigneten Sequenzen, der Orientierung, den Bedingungen, dem Nukleosid-Typ (z.B. ob Ribose- oder Desoxyribosenukleoside eingesetzt werden), und der Basenmodifikation (z.B. methyliertes Cytosin und dergleichen), um die in bestimmten Ausführungsformen erwünschte Triplex-Stabilität zu maximieren oder auf andere Art und Weise zu regulieren, z.B. Brenner (supra). Im Allgemeinen sind Bedingungen zur Anlagerung von einzelsträngigen oder Duplex-tag-Markierungen an einzelsträngige oder Duplex-Sequenz-Komplementen gut bekannt, z.B. Brenner (supra), Ji et al. (1993), Cantor et al. (supra), Wetmur (1991), Breslauer et al. (1986), Schena (1995) und dergleichen.
Vorzugsweise werden Polynukleotide konventionell mit einem automatisierten DNA-Synthesegerät, z.B. einem DNA/RNA-Syntheseapparat Modell-392 oder -394 von PE Applied Biosystems (Foster City, CA) unter Verwendung von chemischen Standard-Verfahren, z.B. Phosphoramidit-Chemie (Beaucage) synthetisiert. In einem alternativen Verfahren können Primer aus einer biologischen Herkunftsquelle isoliert werden.
C. Festphasenträger
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Ziel-Primer-Hybrid an einen Festphasenträger während eines Auftrennungsschrittes verknüpft. Eine solche Verknüpfung kann entweder über die Zielnukleinsäure oder das Primer-Polynukleotid erfolgen.
Festphasenträger, die in der Erfindung verwendet werden, weisen eine breite Vielzahl von Formen auf, einschließlich Mikropartikeln, Kügelchen, Membranen, Objektträgern, Platten, mikromaschinierten Chips und dergleichen. Zusätzlich können erfindungsgemäße Festphasenträger eine breite Vielfalt von Zusammensetzungen, einschließlich Glas, Plastik, Silikon, Alkanethyolat-derivatisiertem Gold, GaAs, Kupfer, Germanium, Cellulose, niedrig-kreuzvernetztem und hoch-kreuzvernetztem Polystyrol, kreuzvernetzte Polyacrylamidmatrices, Silica-Gel, Polyamid, Membranen wie Nylon, Polyvinylidindifluorid (PVDF) oder Polytetrafluorethylen und dergleichen.
Wo die Verknüpfung des Ziel-Primer-Hybrids über dem Primer erfolgt, können Primer zusammen mit einem Festphasenträger verwendet werden, auf dem sie synthetisiert worden sind, oder sie können getrennt synthetisiert werden und an einen Festphasenträger verknüpft werden, um sie während oder vor dem Auftrennungsschritt des Verfahrens zu verwenden.
Wenn Primer auf oder mit dem selben Festphasenträger synthetisiert oder verwendet werden, kann ein solcher Träger eine Vielzahl von Formen umfassen, einschließlich einer Vielzahl von Bindungsresten. Solche Träger können Mikropartikel oder ebene Anordnungen, oder Matrices von Bereichen mit im Wesentlichen einheitlichen Primerpopulationen umfassen. Eine breite Vielzahl von Mikropartikelsyntheseträger können in der Erfindung eingesetzt werden einschließlich Mikropartikel, die aus kontrolliertem Porenglas (CPG), hoch-kreuzvernetztem Polystyrol, Acrylcopolymere, Cellulose, Nylon, Dextran, Latex, Polyacrolein und dergleichen hergestellt wurden. Mikropartikelträger umfassen weiter kommerziell erhältliches Nukleosid-derivatisiertes CPG und Polystyrolkügelchen (z.B. erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, CA); derivatisierte magnetische Kügelchen; Polystyrol, bei dem Polyethylenglycol eingesetzt wurde (z.B. TentaGel^®, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland); und dergleichen. Die Auswahl der Trägereigenschaften wie Material, Porösität, Größe, Form und dergleichen und die Art des eingesetzten Bindungsrestes hängen von den Bedingungen ab, unter denen die Primer verwendet werden. Beispielsweise sind in der vorliegenden Erfindung Träger und Linker bevorzugt, die sterische Barrieren der Polymerase-Enzyme gering halten und die Zugang zum Nukleotidsubstrat ermöglichen. Andere wichtige Faktoren, die bei der Auswahl des am meisten geeigneten Mikropartikelträgers in Erwägung zu ziehen sind, schließen die Größeneinheitlichkeit, Effizienz als ein Syntheseträger, Grad, bei dem die Oberfläche bekannt ist und optische Eigenschaften ein, z.B. besitzen klare weiche Beads instrumentelle Vorteile, wenn mit einer großen Anzahl von Beads auf einer Oberfläche gearbeitet wird.
Wie oben erwähnt, können Primer auch auf einem einzelnen (oder ein Paar) Festphasenträgern synthetisiert werden, um eine Anordnung von Regionen zu bilden, die einheitlich mit Primern beschichtet sind. Das bedeutet, dass innerhalb jeder Region in einer solchen Anordnung der selbe Primer synthetisiert wird. Synthesetechniken für solche Anordnungen sind an anderer Stelle offenbart (Pease; Southern).
Wenn Primer getrennt synthetisiert werden und danach zur Verwendung an einen Festphasenträger verknüpft werden, können die Primer an den Träger über eine kovalente Bindung oder eine nicht kovalente Bindung an den Träger verknüpft werden. Wenn der Primer an den Festträger über eine nicht-kovalente Bindung verknüpft wird, umfasst der Primer ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares, z.B. Biotin, wobei das andere Mitglied des Paares an den Festträger verknüpft ist, beispielsweise Avidin. Mehrere Verfahren sind zur kovalenten Bindung von Polynukleotiden an Festträgern verfügbar, z.B. durch Reaktion eines 5'-Aminopolynukleotids mit einem mit Isothiocyanat funktionalisierten Glasträger (Guo). Eine breite Vielfalt von beispielhaften Bindungsresten zur kovalenten oder nicht-kovalenten Verknüpfung von Primern an Festträgern sind an anderer Stelle offenbart (Pon; Webb; Barany; Damha; Beattie; Maskos und Southern).
Wo die Verknüpfung des Primer-Matrize-Hybrids über die Matrizennukleinsäure erfolgt und die Matrizennukleinsäure ein PCR-Amplicon ist, können die Mittel zur kovalenten oder nicht kovalenten Bindung in einem PCR-Primer eingebaut werden, der in der PCR eingesetzt wird. Daher kann der PCR-Primer ein Mitglied eines spezi fischen Bindungspaares enthalten, z.B. Biotin oder einen reaktiven Rest, der mit einem funktionalisierten Festträger reagieren kann, um eine kovalente Bindung, z.B. eine 5'-Amino-Gruppe, die mit einem mit Isothiocyanat funktionalisierten Glasträger reagiert, zu erzeugen.
Wie oben erwähnt, setzt die Erfindung auch einen Satz von tag-Komplementen ein, die komplementär sind zu den korrespondierenden tag-Sequenzen in den tag-markierten Primern. Die tag-Komplemente werden als eine adressierbare Anordnung bereitgestellt, entsprechend der Design-Wahl des Benutzers. Unter einer „adressierbaren Anordnung" versteht man, dass die Sequenz des Zielbindungssegmentes von jedem Primer bekannt ist oder aus der Position der Hybridisierung von jedem Primer auf der Anordnung bestimmt werden kann. Vorzugsweise werden die tag-Komplemente an bestimmten Bereichen auf einer ebenen Oberfläche immobilisiert, so dass jeder bestimmter Bereich nur ein tag-Komplement mit einer spezifischen Sequenz enthält und die Sequenz des tag-Komplements bei jeder unterschiedlichen bestimmten Region bekannt ist. Üblicherweise sind die tag-Komplemente als periodische zweidimensionale Anordnung von einzelnen tag-Komplement-Regionen verteilt, die über X- und Y-Koordinaten zugeordnet werden können, oder einem beliebigen Äquivalent davon. tag-Komplemente können an geeignete Festphasenträgermaterialien unter Berücksichtigung der selben Erwägungen, wie sie oben für die Verknüpfung von Primern diskutiert wurden, verknüpft werden.
Um die Menge an Assay-Reagenzien, die zur tag-Detektion verwendet werden, zu minimieren und die Sequenzierung von einer großen Anzahl von Fragment-Sequenzen zu ermöglichen, werden die Anordnungen vorzugsweise als Mikroanordnungen mit tag-Komplement-Regiondichten von mehr als 100 Regionen/cm², 300 Regionen/cm², 10³ Regionen/cm², 3 × 103 Regionen/cm², 104 Regionen/cm², 105 Regionen/cm² oder 106 Regionen/cm² gebildet. Zusätzlich ist die Anzahl von tag-Komplementen mit unterschiedlicher Sequenz in jeder Anordnung vorzugsweise gleich oder größer als 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 3000, 10000, 30000, 100000 oder 300000.
D. Markierte Nukleotide
In den erfindungsgemäßen Verfahren umfassen ein oder mehrere verlängerbare Nukleotide und/oder Nukleotidsterminatoren eine Markierung. Die Markierung ist an das Nukleotid auf eine Weise verknüpft, dass die Markierung so gut wie nicht mit einem Polymerasen-vermittelten Einbau des markierten Nukleotids in einer Primerverlängerungsreaktion interferiert. Viele alternative Verfahren sind zur Markierung von Nukleotiden verfügbar in einer Weise, dass sie in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können (Kricka). In einer bevorzugten Klasse von Markierungsverfahren wird eine Nukleosidbase des Nukleotids modifiziert, um eine Markierung einzuschließen, d.h. die N-6-Position einer Purinbase oder die C-5-Position einer Pyrimidinbase. Eine besonders bevorzugte Klasse von markierten Nukleotiden sind die Propargylethoxyaminonukleotide (Khan).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein markiertes verlängerbares Nukleotid in der Lage, nicht detektierbar gemacht zu werden, z.B. nach Behandlung mit einem geeigneten Reagenz oder durch elektromagnetische Strahlung. In dieser Ausführungsform kann das markierte verlängerbare Nukleotid nicht detektierbar gemacht werden, indem entweder die Markierung von dem Nukleotid entfernt wird oder indem die Signal erzeugenden Eigenschaften der Markierung zerstört werden.
Mehrere Verfahren sind verfügbar zur Verknüpfung einer Markierung an ein verlängerbares Nukleotid, so dass die Markierung leicht entfernt werden kann. Beispielhafte spaltbare Linker zur Bindung einer Markierung an ein Nukleotid umfassen sind aber nicht beschränkt auf (N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), (bis[2-(Succinimidooxycabonyloxyl)ethyl]sulfon (BSOCOES), Disuccininimidyltartarat (DST) und Ethylenglycobis[succinimidylsuccinat] (EGS) und dergleichen (Pierce Katalog).
Bevorzugte Markierungen, deren Signal erzeugenden Eigenschaften nach Behandlung mit einem geeigneten Reagenz oder elektromagnetischen Strahlung zerstört werden können, umfassen fluoreszierende Markierungen, deren fluoreszierende Eigenschaften durch Fotodestruktion über ein Aussetzen gegenüber Licht mit hoher Intensität oder durch chemischen Abbau über Behandlung mit oxidierenden Chemikalien, z.B. Sauerstoff, Natriumhypochlorit, Permanginat und dergleichen zerstört werden können. Alternative bevorzugte Klassen von Markierungen umfassen Enzyme, die durch Reaktion mit einem irreversiblen Enzym-Inhibitor oder durch Denaturierung nicht detektierbar gemacht werden können, sowie chemilumineszierende Markierungen, die lediglich eine Einzellicht erzeugende Transformation durchmachen und somit autodestruktiv sind.
E. Erste und zweite Primerverlängerungsreagenzien
Die vorliegende Erfindung umfasst erste und zweite Primerverlängerungsreagenzien, die, wenn sie entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Verlängerung eines Primers zur Fortsetzung in bestimmten Zuwächsen von Einzelwiederholungseinheiten ermöglichen, d.h. der Primer wird lediglich um eine Wiederholungseinheit pro einzelnen Primerverlängerungsreaktionszyklus verlängert.
Das erste erfindungsgemäße Primerverlängerungsreagenz umfasst einen Satz von verlängerbaren Nukleotiden, die eine Primerverlängerungsreaktion nur bis zu dem Punkt ermöglichen, an dem ein Primer um einen Betrag, der weniger als eine vollständige Wiederholungseinheit ausmacht, verlängert wird. Somit kann in Abhängigkeit von der spezifischen Sequenz der Wiederholungseinheit das erste Primerverlängerungsreagenz eine Vielzahl von möglichen verlängerbaren Nukleotidkombinationen einschließen. Zum Beispiel könnte das erste Primerverlängerungsreagenz verlängerbare Nukleotide T (komplementär zu A), T und C (komplementär zu A und G) oder T und C und G (komplementär zu A und G und C) einschließen, wenn die Sequenz der Wiederholungseinheit AGCT ist. Um jedoch eine unkontrollierte kontinuierliche Primerverlängerung zu verhindern, sollte das erste Primerverlängerungsreagenz keine verlängerbare Nukleotide T, C, G und A zusammen enthalten.
In bestimmten Situationen ist es wünschenswert, das erste Primerverlängerungsreagenz in getrennte Unterreagenzien zu unterteilen, so dass jedes Unterreagenz verlängerbare Nukleotide einschließt, die ausreichend sind, um eine Verlängerung eines Primers zu dem Maß zu ermöglichen, dass ein Unterteil der Wiederholungssequenz gebildet wird. Zum Beispiel könnten ein Unterreagenz des ersten Primerverlängerungsreagenz die verlängerbaren Nukleotide T, A und C einschließen, wenn die Wiederholungseinheit ATGCCGT ist, während ein anderes Unterreagenz des ersten Primerverlängerungsreagenz die verlängerbaren Nukleotide G und C einschließen könnte.
Das erfindungsgemäße zweite Primerverlängerungsreagenz umfasst einen Satz von verlängerbaren Nukleotiden, die das Fortsetzen einer Primerverlängerungsreaktion nur zu dem Maß ermöglichen, dass der durch das erste Primerverlängerungsreagenz nicht synthetisierte Teil einer Wiederholungseinheit synthetisiert wird. Somit kann in Abhängigkeit von der spezifischen Sequenz der Wiederholungseinheit und der Zusammensetzung des ersten Primerreagenz das zweite Primerverlängerungs reagenz eine Vielzahl von möglichen Nukleotidkombinationen einschließen. Wenn das oben genannte Beispiel fortgeführt wird, bedeutet dies, dass, wenn die Sequenz der Wiederholungseinheit AGCT ist und das erste Primerverlängerungsreagenz die verlängerbaren Nukleotide T und C einschließt, das zweite Primerverlängerungsreagenz die verlängerbaren Nukleotide G und A einschließen können.
F. Primerterminationsreagenz
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Primerterminationsreagenz zum Bewirken der Termination einer Primerverlängerung, so dass eine weitere Primerverlängerung nicht fortgesetzt wird, wenn ein Primerverlängerungsprodukt mit dem Primerterminationsreagenz reagiert hat.
Das erfindungsgemäße Primerterminationsreagenz umfasst ein oder mehrere Nukleotidterminatoren und gegebenenfalls einen Satz von verlängerbaren Nukleotiden, die eine Primerverlängerungsreaktion nur zu dem Maß ermöglichen, dass ein Primer um einen Betrag, der weniger ausmacht als eine vollständige Wiederholungseinheit in einer Primerverlängerungsreaktion verlängert wird. Somit kann in Abhängigkeit von der spezifischen Sequenz der Wiederholungseinheit die Sequenz des 3'-flankierenden Teils der Zielnukleinsäure und die Zusammensetzung der ersten und zweiten Primerverlängerungsreagenzien das Primerterminationsreagenz eine Vielzahl von möglichen Kombinationen von verlängerbaren Nukleotiden und Nukleotidterminatoren einschließen. Zum Beispiel würde das Primerterminationsreagenz nur den Nukleotidterminator C einschließen, wenn die Sequenz der Wiederholungseinheit AGCT wäre und das erste Nukleotid des 3'-flankierenden Teils G wäre und die ersten und zweiten Primerverlängerungsreagenzien die verlängerbaren Nukleotide T, C, G und A einschließen, so dass der Nukleotidterminator komplementär ist zu dem G, das sich in dem 3'-flankierenden Teil befindet. Alternativ würde das Primerterminationsreagenz die verlängerbaren Nukleotide G und A und den Nukleotidterminator C einschließen, wenn die ersten und zweiten Primerverlängerungsreagenzien nur die verlängerbaren Nukleotide T und C einschließen.
In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung umfasst das Primerterminationsreagenz einen markierten Nukleotidterminator. Die Markierung des Nukleotidterminators wird im Wesentlichen, wie oben in Abschnitt D beschrieben, durchgeführt.
III. DAS VERFAHREN
Eine bevorzugte Ausführungsform eines ersten Aspekts des erfindungsgemäßen Verfahrens ist schematisch in den 2A–C dargestellt. In der Figur wird das Verfahren an eine Zielnukleinsäure 5 mit einer Wiederholungsregion 20, die aus zwei Kopien einer 2-Basen-Wiederholung mit der Sequenz „AC" und einem 3'-flankierenden Teil 25 mit einem G-Nukleotid, das an die Wiederholungsregion angrenzt, aufgebaut ist, angewendet. In dieser bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts wird ein Primer 200 an einen Primer-komplementären Teil 15 der Zielnukleinsäure 5 angelagert, so dass dadurch ein Ziel-Primer-Hybrid gebildet wird. Da Ziel-Primer-Hybrid wird dann mit einem ersten Primerverlängerungsreagenz einschließlich einem markierten verlängerbaren Nukleotid T umgesetzt, was den Einbau des markierten T-Nukleotids (T*) in das 3'-Ende eines Primerverlängerungsprodukts 210 bewirkt. Nach der Reaktion mit dem ersten Primerverlängerungsreagenz wird das erste Primerverlängerungsreagenz von dem Ziel-Primer-Hybrid entfernt und das Ziel-Primer-Hybrid wird dann mit einem zweiten Primerverlängerungsreagenz, das ein verlängerbares G-Nukleotid einschließt, umgesetzt, was die Anlagerung des G-Nukleotids an ein 3'-Ende des Primerverlängerungsprodukts 215 bewirkt. Als nächstes wird das nicht reagierte Primerverlängerungsreagenz von dem Ziel-Primer-Hybrid getrennt und es wird eine Messung durchgeführt, um die Menge von markiertem verlängerbaren Nukleotid, das in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut ist, zu bestimmen. Wie durch das Histogramm in der Figur gezeigt, wird an diesem Verfahrenspunkt ein starkes Signal nachgewiesen, was auf die Gegenwart des eingebauten markierten T-Nukleotids hinweist. Schließlich wird die Markierung, die an das eingebaute verlängerbare Nukleotid gebunden ist, nicht detektierbar gemacht, um ein Ziel-Primer-Hybrid für einen nachfolgenden bestimmten Primerverlängerungsreaktionszyklus herzustellen. In dem Beispiel werden die oben beschriebenen Verfahrensschritte zwei weitere Male wie in den 2B und 2C gezeigt, wiederholt. In dem dritten Zyklus, der in 2C gezeigt ist, ist die Intensität des gemessenen Signals im Vergleich zu den Signalintensitäten, die in den ersten beiden Zyklen beobachtet wurden, wesentlich reduziert, da das markierte verlängerbare Nukleotid T an diesem Punkt nicht in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut werden kann. Daher zeigt diese Verringerung in dem gemessenen Signal, das in dem dritten Zyklus beobachtet wurde, dass die Wiederholungsregion nur zwei Kopien der AC-Wiederholungseinheit enthält.
Ein anderer Aspekt des Verfahrens ist in den 3A bis B gezeigt. Wie oben wird das Verfahren an eine Zielnukleinsäure mit einer Wiederholungsregion, die aus zwei Kopien einer Zwei-Basen-Wiederholung mit der Sequenz „AC" und einem 3'-flankierenden Teil mit einem G-Nukleotid, der an die Wiederholungsregion angrenzt, aufgebaut ist, angewendet. Das Ziel-Primer-Hybrid wird dann mit einem ersten Primerverlängerungsreagenz, das ein nicht markiertes verlängerbares Nukleotid T einschließt, umgesetzt, was den Einbau des nicht markierten T-Nukleotids in das 3'-Ende eines Primerverlängerungsprodukts 310 bewirkt. Nach der Reaktion mit dem ersten Primerverlängerungsreagenz wird das erste Primerverlängerungsreagenz von dem Ziel-Primer-Hybrid getrennt, und das Ziel-Primer-Hybrid wird dann als ein zweites Primerverlängerungsreagenz, das ein verlängerbares G-Nukleotid einschließt, und einem Primerterminationsreagenz, das einen markierten C-Nukleotidterminator (C*) einschließt, umgesetzt, was bewirkt, dass lediglich das verlängerbare G-Nukleotid in das 3'-Ende des Primerverlängerungsprodukts 315 angeheftet wird. Als nächstes wird das nicht reagierte zweite Primerverlängerungsreagenz und das Primerterminationsreagenz von dem Ziel-Primer-Hybrid getrennt und es wird eine Messung durchgeführt, um die Menge von markiertem Nukleotidterminator, der in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut ist, zu bestimmen. Wie in der Figur gezeigt, wird an diesem Punkt des Verfahrens kein Signal nachgewiesen, was darauf hinweist, dass der markierte Nukleotidterminator nicht in das Primerverlängerungsprodukt während diesem Zyklus des Verfahrens eingebaut ist. In 3B wird der oben beschriebenen Verfahrensschritt wiederholt. In diesem zweiten Zyklus, der in 3B gezeigt ist, ist die Intensität des gemessenen Signals im Vergleich zu der nominellen Nullsignalintensität, die in dem ersten Schritt des Verfahrens beobachtet wurde, wesentlich erhöht, da während des zweiten Schritts, der markierte Nukleotid C-Terminator (C*) in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut ist.
Die folgende Diskussion stellt eine detailliertere Beschreibung der oben beschriebenen Verfahrensschritte des ersten und des zweiten Aspekts der Erfindung bereit.
A. Primeranlagerung
Die Anlagerungsreaktion wird unter Bedingungen durchgeführt, die stringent genug sind, um eine ausreichende Sequenzspezifität zu gewährleisten, um so die Bildung von stabilen Hybriden mit einer akzeptablen Rate zu ermöglichen. Die Temperatur und die benötigte Zeit, die zur Primeranlagerung erforderlich ist, hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Basenzusammensetzung, der Länge und Konzentration der Primer und der Art des verwendeten Lösungsmittels, z.B. die Konzentration von Co-Lösungsmittel wie DMSO, Formamid oder Glycerin und Gegenionen wie Magnesium. Typischerweise wird eine Hybridisierung mit synthetischen Polynukleotiden bei einer Temperatur durchgeführt, die ungefähr 5° bis 10°C unterhalb der Schmelztemperatur des Ziel-Primer-Hybrids in dem Anlagerungslösungsmittel liegt. Vorzugsweise liegt die Anlagerungstemperatur in dem Bereich von 55° bis 75°C und die Primerkonzentration beträgt ungefähr 0,2 μM. Unter diesen bevorzugten Bedingungen wird die Anlagerungsreaktion in nur ein paar wenigen Sekunden fertig sein.
B. Primerverlängerungsreaktion
Die zum Bewirken einer Primerverlängerungsreaktion erforderliche Zeit hängt von der Länge und Konzentration der Zielsequenz und der Reaktionstemperatur ab. Schätzungen bezüglich der Nukleotid-Zusatzrate unter typischen Bedingungen variieren von 35-100 Nukleotiden pro Sekunde in Abhängigkeit von dem Puffer, pH, der Salzkonzentration, dem Polymerase-Enzym und der Art der DNA-Matrize. Um eine Primerverlängerungsreaktion zu erreichen, die in bestimmten Zuwächsen von Einzelwiederholungseinheiten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren stattfindet, wird die Primerverlängerungsreaktion in zwei unabhängige Schritte aufgeteilt: einer ersten Primerverlängerungsreaktion und einer zweiten Primerverlängerungsreaktion. In der ersten Primerverlängerungsreaktion wird der Primer um einen Betrag verlängert, der geringer ist als die Länge einer Einzelwiederholungseinheit, wobei die Kontrolle des Grades der Primerverlängerung durch die Zusammensetzung von einem ersten Primerverlängerungsreagenz bewirkt wird. In der zweiten Primerverlängerungsreaktion wird der Primer um einen Betrag verlängert, so dass in Kombination mit der ersten Primerverlängerungsreaktion, der Primer um einen Betrag verlängert wird, der der Länge einer Einzelwiederholungseinheit entspricht.
Gemäß dem ersten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein markiertes verlängerbares Nukleotid.
Auch umfasst entsprechend dem ersten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Variante der oben beschriebenen einzelnen zweistufigen Primerverlängerungsreaktion das zweite Primerverlängerungsreagenz ein Primerterminationsreagenz. Daher wird ein Nukleotidterminator in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut, wenn nach einer zweiten Primerverlängerungsreaktion der Primer bis zu dem Ende der Wiederholungsreaktion der Zielnukleinsäure verlängert worden ist und verhindert dadurch eine weitere Verlängerung von diesem Primerverlängerungsprodukt. Dies ist vorteilhaft, da es die Möglichkeit ausschließt, dass eine un beabsichtigte Primerverlängerung außerhalb der Wiederholungsregion von der Zielnukleinsäure stattfinden wird. Diese Ausführungsform der Erfindung ist besonders bevorzugt, wenn zwei Allele einer Wiederholungssequenz gleichzeitig untersucht werden.
Gemäß einem anderen Aspekt wird ein Primerterminationsreagenz, das einen markierten Nukleotidterminator einschließt, in die zweite Primerverlängerungsreaktion eingeschlossen. Vorzugsweise wird der markierte Nukleotidterminator so ausgewählt, dass er komplementär zu dem Nukleotid an dem 3'-Ende des 3'-flankierenden Teils der Zielnukleinsäure ist, das an die Wiederholungsregion einer solchen Zielnukleinsäure angrenzt.
C. Auftrennung von Primer und Primerverlängerungsreagenzien
Zwischen den ersten und zweiten Primerverlängerungsreaktionen wird ein Auftrennungsschritt durchgeführt, um das Vermischen der ersten und zweiten Primerverlängerungsreagenzien zu verhindern und um dadurch eine unkontrollierte Primerverlängerung zu verhindern. Die Mittel, die zum Bewirken eines solchen Auftrennungsschrittes verwendet werden, können beliebige Mittel sein, die zur Auftrennung des Ziel-Primer-Hybrids von den ersten und/oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien fähig sind. Beispielhafte Auftrennungsverfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf HPLC, Elektrophorese, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Fest-Flüssig-Extraktion, Adsorption und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ziel-Primer-Hybrid an einen Festträger während des Auftrennungsschrittes gebunden, so dass die Primerverlängerungsreagenzien von dem Ziel-Primer-Hybrid einfach durch Waschen des Festträgers aufgetrennt werden können. Entsprechend dieser Ausführungsform kann der Primer an den Festträger vor oder nach der Durchführung der ersten Primerverlängerungsreaktion verknüpft werden. Die Waschbedingungen werden so gewählt, dass der Ziel-Primer-Hybrid nicht wesentlich gestört wird und eine nicht spezifische Adsorption der Primerverlängerungsreagenzien minimal gehalten wird.
D. Messung eines Signals
Es wird entweder nach der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreaktion ein Detektionsschritt durchgeführt, bei dem die Menge an intakter Markierung, die in einem Primerverlängerungsprodukt eingebaut worden ist, bestimmt wird. Es kann ein beliebiges Nachweisverfahren verwendet werden, das für die Art der eingesetzten Markierung geeignet ist. Daher umfassen mögliche Nachweisverfahren eine radioaktive Detektion, Detektion aufgrund optischer Absorption, z.B. UV-sichtbare Absorptionsdetektion, optische Emissionsdetektion, z.B. Fluoreszenz oder Chemilumineszenz.
Der Messschritt kann an verschiedenen Punkten in dem Verfahren stattfinden, was von dem durchgeführten Aspekt der Erfindung und der Zusammensetzung der ersten und zweiten Primerverlängerungsreagenzien abhängt. Im ersten Aspekt findet der Messschritt vorzugsweise dann statt, nachdem das Primerverlängerungsreagenz einschließlich dem markierten verlängerbaren Nukleotid mit dem Ziel-Primer-Hybrid umgesetzt worden ist und von ihm getrennt worden ist. In dem zweiten Aspekt findet der Messschritt statt, nachdem das Primerverlängerungsreagenz einschließlich dem markierten Nukleotidsterminator mit dem Ziel-Primer-Hybrid umgesetzt worden ist und von ihm getrennt worden ist.
Wenn der/die Ziel-Primer-Hybrid(e) auf einem Festträger zur Analyse immobilisiert sind, können verlängerte Primer in einer adressierbaren Anordnung nachgewiesen werden, indem alle oder Teile von jeder Anordnung gleichzeitig oder nacheinander in Abhängigkeit von dem verwendeten Durchmusterungsverfahren durchmustert werden. Für eine Fluoreszenzmarkierung können ausgewählte Regionen auf einer Anordnung eines nach dem anderen oder Reihe für Reihe unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskop-Apparates, wie in Fodor (1995) und Mathies et al. (1992) beschrieben, seriell durchmustert werden. Hybridisierungsmuster können auch unter Verwendung einer CCD-Kamera (z.B. Modell TE/CCD512SF, Princeton Instruments, Trenton, NJ) mit geeigneten Optiken (Ploem, 1993) durchmustert werden, wie in Yershov et al. (1996) beschrieben oder können durch TV-Beobachtung (Khrapko, 1991) abgebildet werden. Für radioaktive Signale (z.B.³²P) kann eine Phosphor-Imager-Vorrichtung verwendet werden (Johnston et al., 1990; Drmanac et al., 1992; 1993). Andere kommerzielle Anbieter von Abbildungsinstrumenten umfassen General Scanning Inc., (Watertown, MA, www.genscan.com), Genix Technologies (Waterloo, Ontario, Kanada; www.confocal.com) und Applied Precision Inc. Solche Detektionsverfahren sind insbesondere nützlich, um ein gleichzeitiges Durchmustern von mehreren tag-Komplement-Regionen zu erreichen.
E. Das Nichtdetektierbarmachen einer Markierung
Gemäß dem ersten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Markierung nicht detektierbar gemacht, nachdem ein Signal von einer Markierung nachgewie sen worden ist und bevor ein nachfolgender Zyklus einer bestimmten Primerverlängerungsreaktion durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung nicht detektierbar gemacht, indem die Markierung von dem markierten verlängerbaren Nukleotid, das in dem Primerverlängerungsprodukt eingebaut ist, abgespaltet wird. Das Verfahren, das zur Spaltung der Markierung von dem Nukleotid verwendet wird, hängt von der Art der spaltbaren Bindung ab, die verwendet wird, um die Markierung und das Nukleotid zu verbinden (siehe oben). Beispielhafte Spaltungsreagenzien umfassen Thiol, Basen, Periodat, Hydroxylamin und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung an einen Basenteil von einem Uracilnukleotid verknüpft und nach der Detektion wird die Markierung von dem markierten verlängerbaren Nukleotid durch eine Behandlung mit dem Enzym Uracil-N-glycosylase (UNG) abgespalten.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung nicht detektierbar gemacht, indem die Signal erzeugenden Eigenschaften der Markierung selbst zerstört werden. In Abhängigkeit von der Art der verwendeten Markierung gibt es mehrere Verfahren, die zum Zerstören der Signal erzeugenden Eigenschaften der Markierung eingesetzt werden können. Zum Beispiel kann die Markierung, wenn es sich bei der Markierung um einen Fluoreszenzfarbstoff handelt, nicht detektierbar gemacht werden, indem der Farbstoff unter Verwendung einer intensiven Lichtquelle in einer sauerstoffreichen Umgebung einer Fotoausbleichung unterzogen wird. Wenn die Markierung ein Enzym ist, kann die Markierung nicht detektierbar gemacht werden, indem die Markierung mit einem irreversiblen Enzym-Inhibitor umgesetzt wird, was das Enzym so verändert, dass es nicht mehr zur Katalyse einer Signal erzeugenden Reaktion der Lage ist. Wenn die Markierung ein chemilumineszierendes Agenz ist, das nur eine einzelne lichterzeugende Transformation durchmachen kann, ist die Markierung autodestruktiv und benötigt daher keine getrennte Reaktion, um die Markierung nicht detektierbar zu machen (Bronstein).
F. tag-Komplement-Anordnungen
Wie oben erwähnt umfasst die Erfindung auch Ausführungsformen, die Primer oder Probenpolynukleotide einsetzen, die tag-Sequenzen enthalten, die für die verknüpften Primer oder Probenpolynukleotide spezifisch sind und die zur parallelen Analy se von mehreren Probenpolynukleotiden auf adressierbaren Anordnungen immobilisiert werden können.
Eine Vielzahl von Primern mit unterschiedlicher Sequenz werden mit einer Polynukleotid-Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die wirksam sind, damit sich die Primer an die Primer-komplementären Regionen in einem oder mehreren Ziel-Polynukleotiden anlagern, um ein oder mehrere Ziel-Primer-Hybrid(e) zu bilden, worin entweder (1) jeder Primer mit unterschiedlicher Sequenz (i) ein Zielbindungssegment und (ii) ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Zielbindungssegment charakteristisch ist, enthält oder (2) ein oder mehrere Polynukleotide in der Probe tag-markierte Polynukleotide sind, die ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz enthalten, die für das verknüpfte Polynukleotid charakteristisch ist. Es werden ein oder mehrere Frimerverlängerungszyklen wie oben beschrieben durchgeführt und das Auftreten oder der Verlust des Signals wird zu bestimmten Zeiten bestimmt, um die Wiederholungslängen zu messen.
In Abhängigkeit von den Vorzügen des Benutzers können die tag-markierten Primer oder tag-markierten Probenpolynukleotide mit einer adressierbaren Anordnung von immobilisierten tag-Komplementen mit unterschiedlicher Sequenz, die jeweils eine Sequenz enthalten, die komplementär ist zu einem der tag-Segmente unter Bedingungen, die zur Hybridisierung der tag-Segmente an die korrespondierenden tag-Komplemente auf dem Träger wirksam sind, in Kontakt gebracht werden. Zur Veranschaulichung sind Ausführungsformen, die entweder tag-markierte Primer oder tag-markierte Probenpolynukleotide verwenden, in den 4 bzw. 5 gezeigt, nachdem die tag-Segmente an einen Festphasenträger hybridisiert worden sind und ein Ziel-Primer-Hybrid gebildet worden ist, um tertiäre Polynukleotidkomplexe hervorzubringen.
4 zeigt einen tertiären Komplex, bei dem ein tag-Komplement-Oligonukleotid 410, das auf einem Festphasenträger 400 immobilisiert ist, spezifisch an einen tag-markierten Primer 420 hybridisiert. Der tag-markierte Primer 420 enthält ein Zielbindungssegment 422 und ein tag-Segment 424. Die vertikalen Linien zwischen dem tag-Komplement-Oligonukleotid 410 und dem tag-Segment 424 bezeichnen eine komplementäre Basenpaarung. Es ist auch ein Probenpolynukleotid 440 gezeigt, das eine Sequenz 442 umfasst, die an das Zielbindungssegment 422 hybridisiert und das in der gezeigten Ausführungsform an einem Nukleotid abschließt, das unmittelbar benachbart zu einer Probenwiederholungsregion 444 liegt. Das Pro benpolynukleotid 440 umfasst gegebenenfalls die flankierenden Sequenzen 446 und 448, die nicht an den tag-markierten Primer hybridisieren. Wenn das Polynukleotid 440 und der tag-markierte Primer 420 ein Ziel-Primer-Hybrid gebildet haben, kann der Hybrid, wie in den vorhergehenden Abschnitten diskutiert, behandelt werden, um das verlängerbare Ende des Primers in die Wiederholungsregion des Probenpolynukleotids zu verlängern. Es werden Verlängerungszyklen wiederholt, bis das Ende der Wiederholungsregion erreicht ist oder die gewünschte Anzahl von Wiederholungen gezählt worden ist.
5 zeigt einen alternativen tertiären Komplex, bei dem ein tag-Komplement-Oligonukleotid 510, das an einen Festphasenträger 500 immobilisiert wurde, spezifisch an ein tag-markiertes Probenpolynukleotid 520 hybridisiert wurde. Polynukleotid 520 umfasst ein tag-Segment 524, das an das Oligonukleotid 510 hybridisiert ist und das an eine Probensequenz 522 gebunden ist. Die Sequenz 522 umfasst eine Wiederholungsregion 528, die auf beiden Seiten durch erste und zweite Probensegmente 526 und 530 flankiert ist. Ein verlängerbarer Primer 540 wird an eines der Probensegmente 526 und 530 angelagert, um ein Ziel-Primer-Hybrid zu bilden, so dass das verlängerbare Ende benachbart zu der Probenwiederholungsregion 528 liegt oder darin hineinragt. Der Hybrid kann wie oben behandelt werden, um das verlängerbare Ende des Primers in die Wiederholungsregion des Probenpolynukleotids zu verlängern, bis das Ende der Wiederholungsregion erreicht worden ist.
tag-markierte Probenpolynukleotide können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren gebildet werden. Üblicherweise werden tag-markierte Proben durch eine PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primer-Paaren gebildet, die erste und zweite Ziel-spezifische Primer umfassen, welche jede Probensequenz von Interesse flankieren, wobei eine der Sonden ein Identifizierungs-tag-Segment enthält. In einer Ausführungsform wird der tag-markierte Primer so konstruiert, dass das tag-Segment während der Amplifikation entweder aufgrund des Vorhandenseins von nicht standardisierten Internukleosidverknüpfungen (z.B. PNA-Verknüpfungen) oder aufgrund des Vorhandenseins einer Nicht-Polynukleotidlinkerregion, welche das tag-Segment von dem Zielbindungssegment trennt, kopiert werden kann und durch Standardsyntheseverfahren hergestellt werden kann. Nachdem das tag-Segment an ein tag-Komplement auf einer adressierbaren Anordnung hybridisiert ist, kann der nicht tag-markierte Strang von dem tag-markierten Strang beispielsweise durch erhöhte Temperatur und/oder erniedrigte Salzkonzentration entfernt werden, um die DNA-DNA-Duplex-Struktur zu destabilisieren, insbesondere wenn entweder der Tag bei einer höheren Temperatur als die Schmelztemperatur zwischen dem Zielbindungssegment des Primers und des Probenpolynukleotids von dem tag-Komplement schmilzt. Viele andere Ansätze zum Erhalt eines ausgewählten Strangs aus Duplex-Nukleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. (1) die Verwendung eines biotinilierten Primers in einer PCR, um das Einfangen und die Auftrennung des nicht tag-markierten Strangs von dem tag-markierten Strang unter denaturierenden Bedingungen zu ermöglichen, (2) die Verwendung eines PCR-Primers (nicht tag-markiert), der ein kurzes RNA-Segment enthält, das mit RNAse am Ende einer PCR abgebaut werden kann, gefolgt durch den Abbau des zweiten RNAse-degradierten Strangs mit einem Enzym, das eine Exonuklease-Aktivität besitzt (z.B. eine geeignete DNAse) oder ein asymmetrisches PCR-Verfahren, das die Amplifikation des tag-markierten Primerstrangs begünstigt.
Obwohl in den 4 und 5 bevorzugte Ausführungsformen gezeigt sind, ist es offensichtlich, dass andere Variationen in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Zum Beispiel kann unter Bezugnahme zu 5 ein verlängerbarer Primer 540 entworfen werden, der zwischen dem tag-Segment und der Wiederholungsregion statt dem Probensegment 526 bindet, so dass das verlängerbare Ende von dem Primer wiederum benachbart zur Probenwiederholungsregion 528 liegt.
Die tag-markierten Primer oder tag-markierten Probenpolynukleotide können an eine tag-Komplement-Anordnung einer beliebigen geeigneten Zeit während des Primerverlängerungsprozesses hybridisiert werden. Zum Beispiel können die tag-markierten Primer von den Probenpolynukleotiden auf dem Träger vor dem ersten In-Kontakt-Bringungs-Schritt, bei dem die Primer mit unterschiedlicher Sequenz und die Probenpolynukleotide angelagert werden, um Ziel-Primer-Hybride zu bilden, immobilisiert werden. Alternativ kann eine Immobilisierung nach der ersten Primerverlängerungsreaktion oder nach der zweiten Primerverlängerungsreaktion durchgeführt werden. In dem letzteren Fall kann ein kleines Aliquot des Verlängerungsreaktionsgemisches nach jedem Verlängerungszyklus entfernt werden und an replikative Anordnungen hybridisiert werden, so dass jede replikative Anordnung nach jedem Zyklus zählende Daten bereitstellt.
IV. KITS ZUR DURCHFÜHRUNG DES VERFAHRENS
Die vorliegende Erfindung umfasst Kits zur Durchführung der verschiedenen Aspekte und Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren. In einem ersten Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen Kits einen Primer, ein erstes Primerverlängerungsreagenz und ein zweites Primerverlängerungsreagenz, wobei mindestens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran verknüpften Markierung einschließt. Vorzugsweise kann die an das verlängerbare Nukleotid verknüpfte Markierung nach einem Behandlungsschritt, der zur Spaltung der Markierung von einem Primerverlängerungsprodukt und/oder in dem die Signal erzeugenden Eigenschaften der Markierung zerstört werden, wirksam ist, nicht detektierbar gemacht werden. Vorzugsweise ist der Primer an einen Festträger gebunden oder ist fähig, an einen Festträger über ein spezifisches Bindungspaar oder durch einen kovalenten Bindungsrest gebunden zu werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst dieser Aspekt der Erfindung einen Festphasenträger zur Verknüpfung an ein Ziel-Primer-Hybrid über den Primer oder die Zielnukleinsäure. Gegebenenfalls umfassen die Kits von diesem ersten Aspekt der Erfindung ein Primerterminationsreagenz. In einer anderen Ausführungsform können die Kits (A) eine Vielzahl von Primern mit unterschiedlicher Sequenz, wobei jeder (i) ein Zielbindungssegment und (ii) ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Zielbindungssegment charakteristisch ist, enthält; ein erstes Primerverlängerungsreagenz; ein zweites Primerverlängerungsreagenz, wobei mindestens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran verknüpften Markierung einschließt und/oder (B) eine adressierbare Anordnung von immobilisierten unterschiedlichen tag-Komplementen, wobei jedes unterschiedliche tag-Komplement eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem der Primer-tag-Segmente, unter Bedingungen, die zur Hybridisierung der tag-Segmente an die entsprechenden tag-Komplemente auf dem Träger wirksam sind, einschließen.
Die Erfindung wird im Lichte der folgenden Beispiele, welche die Erfindung jedoch nicht limitieren sollen, weiter begriffen werden.
BEISPIELE
Die folgende Untersuchung veranschaulicht beispielhaft die Probenhybridisierungsbedingungen und Verlängerungszyklen zum Zählen der Wiederholungen in vier unterschiedlichen Probensequenzen unter Verwendung einer Anordnung von Ziel-spezifischen Capture-Oligonukleotiden, die auf einem Festträger immobilisiert sind.
A. Träger. Glasmikroskopobjektträger wurden in 1 N HNO₃ für 1 bis 2 Stunden eingelegt, gefolgt durch eine Spülung mit deionisiertem Wasser. Gegebenenfalls wurden die Objektträger über Nacht in 5% HCl getaucht, um die langfristige Stabilität der nachfolgenden Funktionalisierung zu verbessern. Die Objektträger wurden dann nacheinander in den folgenden drei Lösungsmitteln für jeweils 10 Minuten sonifiziert: Hexan, Aceton und Ethanol, gefolgt von einer Trocknung an der Luft. Eine Lösung von 2% (v/v) Aminopropyltriethoxysilan (0,8 ml in 40 ml) in 95% Aceton: 5% Wasser wurde in einem verwerfbaren Plastik-Falcon-Gefäß hergestellt. Diese Menge an Lösung reichte gewöhnlicher Weise aus, um mindestens drei Objektträger zu beschichten. Der Lösung wurde es ermöglicht für 5 bis 20 Minuten zu stehen, um die Ethoxy-Gruppen zu Hydroxyl-Gruppen zu hydrolysieren. Luftgetrocknete Objektträger wurden in die Lösung für jeweils 2 Minuten eingetaucht und dann gespült, indem sie in drei oder mehr aufeinanderfolgenden Aceton-Bädern eingetaucht wurden.
Die Objektträger wurden in einem 100°C-Ofen für 45 Minuten getrocknet. Die getrockneten Objektträger wurden für zwei Stunden mit einer 0,2%-Lösung von 1,4-Phenylen-diisothiocyanat (PDITC) in 10% Pyridin:Dimethylformamid behandelt, gefolgt von Waschriten in Bädern mit Methanol und Aceton und einer Lufttrocknung. Die Objektträger wurden unter Vakuum mit einem Desiccanten bei 4°C gelagert. Das Übereinanderlagern von Objektträgern hilft auch die Funktionalisierung zu erhalten und die funktionalisierten Oberflächen von Partikeln freizuhalten (in einer alternativen Ausführungsform können anstelle von 1,4-Phenylendiisothiocyanat mit einer 1 mM Lösung von EMCS (N-(ε-Maleimidocaproxyl)succinimid in Methanol:Dimethylsulfoxid (80:20) für zwei Stunden behandelt werden).
B. Immobilisierung von Capture-Oligonukleotiden.
Synthetische Capture-Oligonukleotide wurden durch standardgemäße Phosphoramiditsyntheseverfahren hergestellt. Die Capture-Oligonukleotide hatten die folgende allgemeine Struktur: 5'-Amino-[(PEO)₂]-[capture-oligo (24 nt)], worin PEO = -O-(CH₂CH₂O)₆ über DMT-O-(CH₂CH₂O)₆-phosphoramidit angeheftet wurde. Die Capture-Oligonukleotide wiesen Polynukleotidsequenzen auf, die komplementär sind zu den doppelt unterstrichenen Sequenzen in den vier Probensequenzen, die in Abschnitt C unten gezeigt sind.
Die Capture-Oligonukleotide wurden in einem rechteckigen Anordnungsmuster auf den Objektträgern, die wie oben unter Verwendung eines ASYMTEC^® Roboterladegeräts (Asymtec, Carlsbad, CA, Modell Nr. C-708) hergestellt wurden, bei Oligonukleotidkonzentrationen von ungefähr 50 μM (in 100 mM Na₂CO₃, pH 9,0) und Punkt-Volumina von ungefähr 02, bis 1 nL punktförmig aufgetragen. Das Muster schloss einen separaten Satz von acht Punkten (2 × 4 Reihen) für jedes unterschiedliche Capture-Oligonukleotid ein, um eine Redundanz zu ermöglichen. Die Punkte hatten Durchmesser von ungefähr 200 μm und waren ungefähr 320 μm vom Zentrum zum Zentrum voneinander getrennt. Das Roboterladegerät umfasste einen Objektträgerhalter, um die Objektträger während der Oligonukleotidablagerung zu halten und eine Arbeitsfläche, um die Spenderspitzen zu reinigen. Nach der Punktauftragung wurden die Capture-Oligos auf den Objektträgern fixiert, indem die Objektträger in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wurden, gefolgt von einem Eintauchen in 1% Na₄OH (aq) für 20 Minuten und in 0,2% Casein in TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8) für 20 Minuten. Die Objektträger wurden in deionisiertem Wasser gewaschen und bei 4°C gelagert.
C. Probenhybridisierung und Analyse.
Es wurden 4 unterschiedliche Proben-Oligos hergestellt, welche vier unterschiedliche Mikrosatellitenallele darstellen. Kurz gesagt, umfassten die Probenpolynukleotide die folgenden Sequenzen, wobei eine Einzelunterstreichung Wiederholungsregionen bezeichnet und eine Doppeltunterstreichung Segmente für die Hybridisierung an komplementäre Capture-Oligonukleotide auf dem Träger bezeichnet:
Proben-Oligo 2260-2G (SEQ ID NO:1)
5'-GTCAGGACACAAAGTGATTTGATGTAGATTTTGA-3'
Proben-Oligo 1411-1G (SEQ ID NO:2)
5'-GTCAGGACTGATAAAGTGTAAAAGTGTATGAT-3'
Proben-Oligo 3149-2T (SEQ ID NO:3)
5'-GTCATTACACTGTATGATAAAGGATTTTGATTGA-3'
Proben-Oligo 4223-4T (SEQ ID NO:4)
5'-GTCATTACACACACGTATTGATTTGATTGATTGAGATT-3'
Ein Gemisch der vier Proben-Oligos (jeweils 0,33 μM in 1 X PCR-Puffer, enthaltend 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 0,001% (w/v) Gelatine) wurde über die Capture-Oligonukleotide auf der Anordnung aufgetragen und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Nach der Inkubation wurden nicht gebundene Oligonukleotide mit 1 X TE (10 mM Tris, pH8, 1 mM EDTA), enthaltend 50 mM NaCl, entfernt. Doppelte Objektträger wurden unterschiedlichen Anzahlen von Verlängerungszyklen (eins, zwei, drei oder vier Zyklen) ausgesetzt. Jeder Verlängerungszyklus (auch als „ein Reagenzzyklus" bezeichnet) beinhaltete die folgenden Schritte:

1) Inkubieren des Objektträgers für vier Minuten bei 37°C in einem Extensionsgemisch, enthaltend: 500 μM dGTP 20 μM Big Dye^® R6G ddATP (Perkin-Elmer, Foster City, CA, Emax = 560 nm) 20 μM Big Dye^® dRox ddCTP (Perkin-Elmer, Foster City, CA, Emax = 615 nm) 1 U/μL AMPLITAQ^® FS (plus 0,125 U/μL Pyrophosphatase) 1 X Puffer (80 mM Tris, pH 9,0, 2,5 mM MgCl₂)
2) Spülen des Objektträgers mit 1 X TE enthaltend 50 mM NaCl, dann dreimal Waschen durch Eintauchen in der selben Lösung.
3) Inkubieren des Objektträgers für 4 Minuten bei 37°C in einem Extensionsgemisch enthaltend: 500 μM dTTP 20 μM Big Dye^® R6G ddATP (Perkin-Elmer, Foster City, CA, Emax = 560 nm) 20 μM Big Dye^® dRox ddCTP (Perkin-Elmer, Foster City, CA, Emax = 615 nm) 1 U/μL AMPLITAQ^® FS (plus 0,125 U/μL Pyrophosphatase) 1 X Puffer (80 mM Tris, pH 9,0, 2,5 mM MgCl₂)
4) Spülen des Objektträgers mit 1 X TE enthaltend 50 mM NaCl, dann dreimal Waschen durch Eintauchen in der selben Lösung.

Nachdem 4 Verlängerungszyklen beendet worden sind (jeder Zyklus beinhaltete die Schritte 1 bis 4), wurde jeder Objektträger mit einem Visualisierungspuffer enthaltend 50% (w:v) Harnstoff und 1X TBE (0,09 M Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH ~ 8,3) überlagert, um eine alkalische pH-Umgebung bereitzustellen, um die Fluoreszenzemissionen der Farbstoffmarkierungen zu verstärken.
Die Objektträger wurden jeweils unter Verwendung einer Abbildungsvorrichtung, die zur Detektion von Fluoreszenzemission bei 560 nm und 610 nm eingestellt war, angeschaut. Die Vorrichtung bestand aus einem Abbildungsfluorimeter, der ein zweidimensionales Bildfeld von Emissionsintensitäten erzeugt (elektronisches Abbild). Jeder Punkt in dem Bildfeld entspricht einem physikalischen Ort auf dem Probenobjektträger. Die Anregungsquelle war ein 40 mW Argonionenlaser. Die Anregungswellenlänge kann aus einem der zwei natürlichen Laserlinien (488 nm und/oder 514 nm) ausgewählt werden. Die Auswahl der Laserwellenlängen wird durchgeführt, indem der Strahl, der Licht von beiden Wellenlängen enthält, über einen von drei Filtern durchgelassen wird. Der ausgewählte Filter lässt entweder nur 488 nm, nur 514 nm oder sowohl 488 als auch 514 nm durch. Die Filter sind auf einer motorgetriebenen Plattform eingebaut, so dass die Auswahl unter Computerkontrolle erfolgen kann. Der Strahl, der entweder eine oder beide Wellenlängen enthält, geht durch einen klassischen Strahl-Expander hindurch. Der gerichtete expandierte Strahl wird dann in einem kommerziell erhältlichen Anbau gerichtet (Scanlab, Puchheim, Deutschland, Modell SK1020), der zwei rechtwinklige „Galvo-Spiegel" enthält. Dies entspricht einer mechanischen Vorrichtung, die so entworfen ist, dass jeder der beiden Spiegel schnell und präzise über einen kleinen Winkel rotieren kann. Die Rotationsachsen sind rechtwinklig zueinander und unabhängig, so dass der Strahl über ein rechteckiges Muster, ebenfalls unter Computerkontrolle, gerastert werden kann.
Der durchmusterte Strahl wird über eine f-Theta-Linse fokussiert, welche einen durchmusterten Laserspot bei einer Brennweite erzeugt. Die Punktgröße beträgt 20 μm Durchmesser. Typischerweise tritt er über eine Fläche von 20 mm × 20 mm mit Zuwächsen von 20 μm hervor, und erzeugt dadurch eine Anordnung von 1000 × 1000 Pixel. Der fokussierte Laserspot wird gebildet, nachdem er über einen dichromatischen Strahlungsteiler durchgelassen wurde, der entworfen wurde, um die Laseranregungswellenlängen zu reflektieren, aber die Emission der Fluorophore weiterzuleiten.
Da der Laserstrahl über eine fluoreszierende Region fährt, wird der Teil der Fluoreszenzstrahlung innerhalb des Festwinkels der Sammlung der Emissionsoptiken durch den dichromatischen Spiegel übertragen und durch eine Linse mit einer Brennweite von 150 mm gerichtet. Der gerichtete Strahl wird dann über einen Langpass-Interferenzfilter filtriert, der das Laserlicht weiter zurückhält. Eine zweite Linse mit einer Brennweite von 75 mm fokussiert den Strahl auf die Fotokathode einer rot-sensitiven Fotomultiplier-Röhre (PMT). Die PMT-Fotokathode benötigt keine genaue Einstellung, da der Fokus nicht kritisch ist. Ein Filterrad vor dem PMT ermöglicht, dass nur ein kleines Wellenlängenband (10 nm) den Detektor erreicht. Das Filterrad kann auf eine von 6 Positionen eingestellt werden, um eine Emission von mehreren zu unterscheidenden Fluorophoren zu ermöglichen.
Der elektrische Output des PMT ist proportional zu der Intensität des Lichtes, das die Fotokathode erreicht. Das Computersystem ist fähig, die Signale bei jeder Anordnung der Spiegelpositionen zu speichern, um das elektronische Abbild zu erzeugen.
Die Ergebnisse waren wie erwartet. Insbesondere wurde bei Oligo 1 (SEQ ID NO:1) bis zum Ende des zweiten Zyklus kein Signal nachgewiesen, nach dem zwei GT-Dimere und ein Fluoreszenz-markierter ddC-Terminator an das immobilisierte Capture-Oligonukleotid angefügt wurden, das auch als der verlängerbare Primer diente. In gleicher Weise wurde für die Oligonukleotide 2 bis 4 (SEQ ID NO:2 bis 4) das dazugehörende fluoreszierende Signal nach 1, 2 bzw. 4 Verlängerungszyklen beobachtet.
SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Repeat-Einheiten in einer Repeat-Region einer Ziel-Nukleinsäure, umfassend die Schritte: (A) In Kontakt bringen einer Vielzahl von Primer mit unterschiedlicher Sequenz mit einer Polynukleotidprobe unter Bedingungen die für diese Primer wirksam sind, um sich an Primerkomplementäre Regionen in einem oder mehreren Ziel-Polynukleotiden anzulagern, um ein oder mehrere Ziel-Primer-Hybrid(e) zu bilden, wobei entweder (1) jeder Primer mit unterschiedlicher Sequenz (i) ein Ziel-Bindesegment und (ii) ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Ziel-Bindesegment charakteristisch ist, enthält, oder (2) ein oder mehrere Ziel-Polynukleotide in der Probe tag-markierte Polynukleotide sind, die ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz enthalten, die für das gebundene Polynukleotid charakteristisch ist; (B) Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion auf dem/den Hybride(n) unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenz, wobei das erste Primerverlängerungsreagenz einen Satz verlängerbarer Nukleotide einschließt, die eine Fortsetzung der Primerverlängerungsreaktion nur bis zu dem Maß erlauben, dass ein Primer für weniger als eine volle Repeat-Einheit verlängert wird; (C) Auftrennen von dem/den Ziel-Primer-Hybrid(en) und des nichtumgesetzten ersten Primerverlängerungsreagenz; (D) Durchführen einer zweiten Verlängerungsreaktion auf dem/den Hybrid(en) unter Verwendung eines zweiten Verlängerungsreagenz, wobei das zweite Verlängerungsreagenz einen Satz verlängerbarer Nukleotide einschließt, die eine Fortsetzung der Primerverlängerungsreaktion nur bis zu dem Maß erlauben, dass der Teil einer Repeat-Einheit, der nicht durch das erste Primerveriängerungsreagenz synthetisiert worden ist, synthetisiert wird; (E) Auftrennen von dem/den Ziel-Primer-Hybrid(en) von dem nichtumgesetzten zweiten Primerverlängerungsreagenz; (F) Messen eines Signals, das durch die Markierung erzeugt wird; (G) Behandeln der Markierung, so dass die Markierung nichtdetektierbar gemacht wird; und (H) Wiederholen eines Zyklus der Schritte (A) bis (G) bis das in dem/den Ziei-Primer-Hybrid(en) detektierte Signal wesentlich geringer ist als ein in einem vorhergehenden Zyklus detektiertes Signal, wobei (I) vor dem Schritt (F) mindestens ein Aliquot von entweder (1) den Primern mit unterschiedlicher Sequenz oder (2) den Polynukleotiden der tag-markierten Probe mit einer adressierbaren Anordnung von immobilisierten, unterschiedlichen tag-Komplementen in Kontakt gebracht werden und wobei jedes unterschiedliche tag-Komplement eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem der tag-Segmenten ist, unter Bedingungen, die zum Hybridisieren der tag-Segmente an korrespondierende tag-Komplemente auf dem Träger wirksam sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (D) weiter das Umsetzen von dem/den Ziel-Primer-Hybrid(en) mit einem Primerterminationsreagenz einschließt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jeder Primer mit unterschiedlicher Sequenz (i) ein Ziel-Bindesegment und (ii) ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Ziel-Bindesegment charakteristisch ist, enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das in Kontakt bringen in Schritt (I) vor dem Schritt (A) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das in Kontakt bringen in Schritt (I) nach dem Schritt (A) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren auf mindestens zwei Replikatsanordnungen durchgeführt wird und eine der Replikatsanordnungen mindestens einem Zyklus der Schritte (A) bis (G) mehr als eine zweite Replikatsanordung ausgesetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Polynukleotide in der Probe tag-markierte Polynukleotide sind, die ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz enthalten, die für das gebundene Polynukleotid charakteristisch ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das in Kontakt bringen in Schritt (I) vor dem Schritt (A) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das in Kontakt bringen in Schritt (I) nach dem Schritt (A) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verfahren auf mindestens zwei Replikatsanordnungen durchgeführt wird und eine der Replikatsanordnungen mindestens einem Zyklus der Schritte (A) bis (G) mehr als eine zweite Replikatsanordung ausgesetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehen aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung an das verlängerbare Nukleotid über einen spaltbaren Linker gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ziel-Nukleinsäure vor der Analyse amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Amplifikation durch Verwendung einer PCR erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt zum Behandeln der Markierung, so dass die Markierung nichtdetektierbar gemacht wird, das Spalten der Markierung von dem markierten verlängerbaren Nukleotid einschließt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt zum Behandeln der Markierung, so dass die Markierung nichtdetektierbar gemacht wird, das Zerstören einer Signal-erzeugenden Eigenschaft der Markierung einschließt.
Kit, der zum Bestimmen der Anzahl von Repeat-Einheiten in einer Repeat-Region einer Ziel-Nukleinsäure verwendbar ist, umfassend: eine Vielzahl von Primern mit unterschiedlicher Sequenz, wobei jeder Primer (i) ein Ziel-Bindesegment und (ii) ein tag-Segment mit einer Nukleotidsequenz, die für das Ziel-Bindesegment charakteristisch ist, enthält, ein erstes Primerverlängerungsreagenz; wobei das erste Primerverlängerungsreagenz einen Satz verlängerbarer Nukleotide einschließt, die eine Fortsetzung der Primerverlängerungsreaktion nur bis zu dem Maß erlauben, dass ein Primer für weniger als eine volle Repeat-Einheit verlängert wird, und ein zweites Primerverlängerungsreagenz, wobei das zweite Verlängerungsreagenz einen Satz verlängerbarer Nukleotide einschließt, die eine Fortsetzung der Primerverlängerungsreaktion nur bis zu dem Maß erlauben, dass der Teil einer Repeat-Einheit, der nicht durch das erste Primerverlängerungsreagenz synthetisiert worden ist, synthetisiert wird, wobei mindestens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran gebundenen Markierung einschließt.
Kit nach Anspruch 17, der weiter eine adressierbare Anordnung von immobilisierten unterschiedlichen tag-Komplementen einschließt, wobei jedes unterschiedliche tag-Komplement eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem der Primer-tag-Segmenten ist, unter Bedingungen, die zum Hybridisieren der tag-Segmente an korrespondierende tag-Komplemente auf dem Träger wirksam sind.
Kit nach Anspruch 17, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
Kit nach Anspruch 17, wobei die Markierung an das verlängerbare Nukleotid über einen spaltbaren Linker gebunden ist.