DE69926883T2

DE69926883T2 - Hochdurchsatz-screening

Info

Publication number: DE69926883T2
Application number: DE69926883T
Authority: DE
Inventors: David Geraint Histon OWEN; Nicholas Gerard Histon BYRNE
Original assignee: Xention Discovery Ltd
Current assignee: Xention Ltd
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-14
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-06-15
Also published as: DE69926883D1; HUP0102915A2; GB9812783D0; JP2002518678A; PL201770B1; NO20006295D0; EP1084410B1; EP1084410B3; US20150068925A1; AU4283599A; AU768862B2; US8449825B2; EP1621888A1; WO1999066329A1; US6936462B1; US20050221282A1; DK1084410T5; IL140199A0; ATE302951T1; US20110048939A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Struktur, umfassend eine biologische Membran und ein poröses oder perforiertes Substrat, eine biologische Membran, ein Substrat, ein Hochdurchsatzsieb bzw. ein Hochdurchsatz-Screening, ein Verfahren zum Herstellen der Strukturmembran und des Substrats, und ein Verfahren zum Screenen bzw. Sichten einer großen Anzahl von Testverbindungen in einer kurzen Zeitdauer. Genauer bezieht sie sich auf eine Struktur, umfassend eine biologische Membran, die an einem porösen oder perforierten Substrat anhaftet, eine biologische Membran, die fähig ist, mit einem hohen Widerstand Dichtungen an einem Substrat, wie perforiertem Glas anzuhaften, und die Fähigkeit, Blätter auszubilden, die vorherrschend einen Ionenkanal oder -transporteur von Interesse aufweisen, ein Hochdurchsatz-Screening zum Bestimmen des Effekts von Testverbindungen auf eine Ionenkanal- oder -transporteuraktivität bzw. -wirksamkeit, ein Verfahren zum Herstellen der Struktur, der Membran und des Substrats, und ein Verfahren zum Überwachen einer Ionenkanal- oder -transporteuraktivität in einer Membran.
In dem Kontext dieser Beschreibung wird das Wort "umfassen" genommen, um "beinhalten" zu meinen, und es ist nicht beabsichtigt, "ist beschränkt auf lediglich" zu bedeuten.
Ionenkanäle sind Transmembranproteine, welche Poren in der Membran ausbilden, welche es Ionen ermöglichen, von einer Seite zu der anderen durchzutreten (Hille, 1992). Sie können Ionenspezifität zeigen, welche spezifischen Ionen ermöglicht, passiv über eine Membran entsprechend ihrer elektrochemischen Gradienten zu diffundieren. Obwohl bestimmte Arten von Kanälen im Mittel die gesamte Zeit und bei allen physiologischen Membranpotentialen offen sind (sogenannte Leckkanäle), haben zahlreiche Kanäle "Tore" bzw. "Gates", welche in Antwort auf eine spezifische Störung der Membranen öffnen. Störungen, die bekannt sind, daß sie ein Öffnen von Ionenkanälen bewirken, beinhalten eine Änderung in dem elektrischen Potential über die Membran (durch Spannung torgesteuerte Kanäle), mechanische Stimulation (mechanisch torgesteuerte Kanäle) oder das Binden eines signalisierenden bzw. Signalmoleküls (durch Ligand torgesteuerte Kanäle).
Transporter bzw. Transporteure sind Proteine in der Zellmembran, welche die Bewegung von anorganischen Ionen, wie Na⁺ und K⁺, ebenso wie von organischen Molekülen, wie Neurotransmitter, wie in dem Fall von sogenannten Wiederaufnahmepumpen, z.B. GABA, Dopamin und Glyzin katalysieren. Zwei unterscheidende Merkmale von Trägern gegen Poren sind i) ihre kinetische bzw. Kinetikbewegung von Ionen, über Transporteure ist sehr viel langsamer als die > 10⁶ Ionen pro Sekunde, welche bei Ionenkanälen angetroffen werden, und ii) Ionenkanäle leiten abwärts entlang von elektrochemischen Gradienten, während Transporteure "nach oben" pumpen können, d.h. gegen Konzentrationsgradienten (Hille, 1992). Das letztere Verfahren ist normalerweise direkt von der Energie abhängig, die in einer stöchiometrischen Weise zur Verfügung gestellt wird.
Die Erfindung hat eine Anwendung insbesondere bzw. hauptsächlich in der Messung von Ionenkanalaktivität, jedoch auch von Transporteuren, wo diese elektrogen sind, z.B. Na⁺/K⁺; Na⁺/Ca²; Glutamat-Wiederaufnahme-Transporteur (Brew & Attwell, 1987).
Ionenkanalaktivität wurde unter Verwendung einer Technik studiert, die als "Flickenklemmen" bezeichnet ist (Hamill et al, 1981). Gemäß dieser Technik wird ein kleiner Fleck bzw. Flicken bzw. ein Stück einer Zellmembran allgemein an der Spitze einer Mikropipette durch ein Pressen bzw. Drücken der Spitze gegen die Membran isoliert. Es wurde nahegelegt bzw. vorgeschlagen, daß, wenn eine dichte Abdichtung zwischen der Mikropipette und dem Membranstück bzw. -flicken ausgebildet wird, ein elektrischer Strom durch die Mikropipette nur über Ionenkanäle in dem Membranstück hindurchtreten kann. Wenn dies erreicht wird, können die Aktivität der Ionenkanäle und ihre Wirkung auf Membranpotential, Widerstand und Strom überwacht werden. Wenn das elektrische Potential über die Membran konstant bleibt, ist der zu dieser Zeit zugeführte Strom gleich dem Strom, der durch Ionenkanäle in der Membran fließt. Wenn sich Ionenkanäle in der Membran verschließen, steigt der Widerstand der Membran. Wenn der angelegte Strom konstant bleibt, ist der Anstieg des Widerstands direkt proportional einem Anstieg des elektrischen Potentials über die Membran.
Von zahlreichen Wirkstoffen bzw. Medikamenten ist bekannt, daß sie ihren Effekt durch Modulation von Ionenkanälen ausüben, wobei jedoch die Entwicklung von neuen Verbindungen, die auf sie wirken, stark durch die Schwierigkeit eines Siebens bzw. Screenings bei hohen Durchsatzgeschwindigkeiten bzw. -raten in bezug auf die Aktivität behindert ist.
Konventionelle elektrophysikalische Verfahren, wie Flicken- oder Spannungsklemmtechniken stellen definitive mechanische bzw. mechanistische Information zur Verfügung, jedoch leiden sie an dem Problem, daß sie für das schnelle Überprüfen bzw. Screening von Testverbindungen nicht geeignet sind.
WO 96/13721 beschreibt eine Vorrichtung zum Ausführen einer Flicken- bzw. Stückklemmtechnik, die beim Studieren der Wirkung von bestimmten Materialien auf Ionentransferkanäle in biologischem Gewebe verwendet wurde. Sie offenbart eine Flickenklemmvorrichtung, die einen Autosampler bzw. eine automatische Sammeleinrichtung verwendet, wie sie durch die HPLC Vorrichtungen verwendet werden, um einen höheren Durchsatz als jenen zur Verfügung zu stellen, der durch die konventionelle Flickenklemmtechnik erreicht werden kann. Diese Vorrichtung leidet an den Problemen, daß sie lediglich das Wirkstoffabgabe- bzw. -zufuhrsystem halb automatisch betreibt, und nicht die Flickenklemmaufzeichnung. Sie leidet daher an denselben Begrenzungen bzw. Beschränkungen wie ein traditionelles Flickenklemmen in Bezug auf die Geschwindigkeit einer Ver- bzw. Bearbeitung von Verbindungen und kann in keiner Weise als ein Hochdurchsatzsystem betrachtet werden. Dieses System erfordert immer noch eine lineare Bearbeitung (d.h. ein Bearbeiten von Daten, die von einer Zelle nach der anderen erhalten werden). In direktem Kontrast bzw. Gegensatz stellt die hier beschriebene Erfindung ein paralleles Verarbeiten und somit einen echten Hochdurchsatz von Verbindungen zur Verfügung.
WO 97/25616 beschreibt einen Ionenkanalsensor (ICS), welcher eine Lipiddoppelschichtmembran zum Screenen in Bezug auf Antikörper oder Antigene in einer biologischen Probe verwendet, um die Kompatibilität von zwei Blutproben zu bestimmen und um Antigene zu detektieren.
Blutprodukte werden in eine Biosensorzelle eingebracht, welche einen ICS enthält, in welchem das Ionophor und die Membran überspannenden Lipide (MSL's) Moleküle präsentieren bzw. darstellen, die fähig sind, sich an epitopische Stellen auf einer roten Blutzelle derart zu binden, daß die Ankunft der Blutzelle an der Membran das Ionophor und MSL verknüpft bzw. verkettet und den Ionenstrom durch die Membran beeinflußt. Die Blutprodukte müssen eine dünne Schicht von Perkolationskügelchen bzw. Filtrationskügelchen durchlaufen, um die Membran zu erreichen. Die bevorzugten Moleküle, die fähig sind, sich an epitope Stellen an einer roten Blutzelle bzw. dem roten Blutkörperchen zu binden, sind Antikörper, welche sich selektiv an Glycoproteinmoleküle binden, die auf der Oberfläche des roten Blutkörperchens vorhanden sind. Es stellt weiters die Bestimmung des Koagulationszustands einer Population von Erythrocyten zur Verfügung, indem ein Feld von Goldelektroden kleinen Durchmessers verwendet wird, welche eine Biosensormembran tragen, in welcher das Erkennungselement typischerweise ein Anti-Glycoprotein-Antikörper war. Jede Elektrode ist unabhängig adressierbar, indem ein gemultiplextes Feld verwendet wird.
Der Ausdruck "biologische Membran", welcher hier verwendet wird, wird genommen, um künstliche Membranen, wie Lipiddoppelschichten und andere Membranen zu beinhalten, die einem Fachmann bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Probleme, die mit den bekannten Screens bzw. Sieben und Screen- bzw. Untersuchungsverfahren assoziiert sind.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Struktur zur Verfügung, die eine biologische Membran umfaßt, die mit hochresistentem Verschluß an einem Substrat zur Verwendung in einem Screening- bzw. Siebverfahren mit hohem Durchsatz anhaftet, wobei die biologische Membran einen Ionenkanal oder -transporteur umfaßt und das Substrat aufgrund von Perforationen, die durch das Substrat Poren bilden, porös ist.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine biologische Membran zur Verwendung in der Struktur zur Verfügung, welche fähig ist, an einem Substrat mit einem hochresistentem Verschluß anzuhaften, wobei jede Zelle eine dichte Verbindung mit benachbarten bzw. angrenzenden Zellen bildet und einen Ionenkanal exprimiert, welcher in der Zellmembran lokalisiert ist.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Substrat zur Verwendung in einem Hochdurchsatzsieb bzw. -Screening zur Verfügung, welches perforiert ist.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Screening mit hohem Durchsatz (HiT) für die Detektion und die Untersuchung von Testverbindungen mit Aktivität auf durch Spannung torgesteuerte Ionenkanäle zur Verfügung, welche die biologische Membran umfaßt.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Struktur zur Verfügung, umfassend eine biologische Membran, die mit einer hochwiderstandsfähigen Abdichtung bzw. einem Verschluß an einem perforierten Substrat anhaftet, welches die Schritte eines Selektierens eines Substrats, Perforierens des Substrats, Zuführens bzw. Einbringens einer biologischen Membran zum Substrat und Verschließens jeder Pore mit biologischer Membran umfaßt.
In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen der biologischen Membran zur Verfügung, welches die Schritte umfaßt eines Auswählens einer Zellart, Evaluierens derselben in bezug auf die Fähigkeit, aneinandergrenzende Schichten von Zellen mit dichten Verbindungen und für niedrige oder vernachlässigbare Anzahlen von durch Spannung torgesteuerten Ionenkanälen auszubilden, Kultivierens der Zellen auf einem Substrat und Sicherstellens, daß eine benachbarte bzw. aneinandergrenzende Schicht von Zellen aufwächst.
In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines perforierten Substrats zur Verfügung, welches die Schritte eines Beleuchtens eines Lasers einer vorausgewählter Brennpunktfläche, Leistung oder Zeit einer Belichtung auf ein Deckglas umfaßt, um es zu perforieren. Dieses Verfahren kann auch den zusätzlichen Schritt einer Modifikation des perforierten Bereichs durch ein Aussetzen an ein Plasma und/oder ein lokalisiertes Erhitzen beinhalten, um das geeignete Niveau an Glätte der Perforation(en) zu erzielen.
In einem achten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen bzw. Sieben für die Detektion oder die Untersuchung von Verbindungen mit Aktivität auf Ionenkanälen zur Verfügung, welches die Schritte eines Anordnens einer biologischen Membran, welche Ionenkanäle von Interesse in Kontakt mit einer Testverbindung in physiologischer Lösung oder nicht-physiologischer Lösung, umfassend ein Lösungsmittel, wie Dimethylsulphoxid, exprimiert bzw. ausdrückt, und Messens des Widerstands oder der Impedanz der biologischen Membran unter dem Einfluß der Testverbindung umfaßt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran Zellen, die einen Ionenkanal oder -transporteur aufweisen, welcher natürlich in der Zellmembran davon vorliegt, oder er kann durch Transfektion mit cDNR und/oder cRNA eingesetzt sein, die den Ionenkanal oder -transporteur codiert. Die Erfindung hat somit den Vorteil, daß die Studien von nativen Kanälen oder Transporteuren ermöglicht, wo die präzise Sub- bzw. Untereinheitszusammensetzung unbekannt ist, oder sogar wo die molekulare bzw. Molekülidentität tatsächlich vollständig unbekannt ist, (d.h. noch nicht geklont), jedoch auch heterolog exprimierte geklonte Kanäle oder Transporteure, wo die Identität des nativen Kanals oder Transporteurs bekannt ist oder wo eine präzise Kenntnis betreffend die Wechselwirkung von Verbindungsstrukturen und chemischen Resten des Ionenkanals oder Transporteurs erforderlich ist. Daher ist das System im wesentlichen bedeutend vielseitiger als existierende Zugänge, welche unempfindlich sind und auf einem Erzielen bzw. Erhalten von hohen Zellkonzentrationen (nicht immer möglich mit Neuronen) und hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen beruhen, was ihre Verwendung auf nur bestimmte Arten von Zellen und Ionenkanäle limitiert bzw. beschränkt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran eine Mehrzahl von Ionenkanälen oder -transporteuren, welche vorherrschend vorausgewählte Ionenkanäle oder -transporteure von Interesse sind. Dies versieht die Erfindung mit dem Vorteil, daß ein paralleles bzw. Parallelscreening von unterschiedlichen Kanälen ermöglicht wird, die potentiell einen noch höheren Durchsatz von Verbindungen zur Verfügung stellen.
Noch bevorzugter umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran genetisch erzeugte Zellen, welche bearbeitet bzw. entworfen wurden, um vorherrschend einen Ionenkanal oder -transporteur auszudrücken bzw. zu exprimieren.
Vorzugsweise sind Ionenkanäle durch Spannung torgesteuerte Ionenkanäle.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran Zellen, die aus der Gruppe gewählt sind, welche HEK-293 Zellen, genetisch veränderte Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), primäres neuronales bzw. Nervenzellgewebe, wie Hippocampus, Spinalganglien, Ganglia cervicale superius usw.; Skelettmuskel; Weichteilmuskel; Herzmuskel; Immunzellen; Epithelien; Endothelien; etc. umfaßt.
CHO-Zellen und CHO-Subklone wie CHO-K1 und CHO-dhfr (auch bekannt als Dukx) haben exzeptionell bzw. überaus niedrige Niveaus einer endogenen Ionenkanalexpressionen, wodurch sie den Vorteil zur Verfügung stellen, daß sie ein exzellentes Signal-zu-Rausch-Verhältnis in einer Säugerzellen-Umgebung besitzen. In ähnlicher Weise exprimieren HEK-293(menschliche Embrionalniere-)Zellen niedrige Niveaus von nativen Kanälen und stellen einen menschlichen Expressions-"Hintergrund" zur Verfügung. Beide dieser Expressionssysteme sind infinit bzw. unbegrenzt bevorzugt gegenüber der gut bekannten verwendeten Xenopus Oocyte-Technik, wo nicht nur native Kanäle und Untereinheiten im Überfluß vorhanden sind, sondern die Amphibienzellumgebung sich in wichtigen Weisen von Säugerzellen unterscheidet.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran Ionenkanäle, die schnelle Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken besitzen, welche existierende Verfahren von eines Hochdurchsatz-Screenings nicht auflösen können. Existierende Systeme mitteln daher transiente Ionenkanalsignale häufig über Perioden von zahlreichen Sekunden. Kanäle, die mit Zeitkonstanten in der Größenordnung von Millisekunden und ohne eine Anwesenheit eines stabilen bzw. Gleichgewichtszustands inaktivieren, sind tatsächlich nicht in derartigen Systemen detektierbar. Die Erfindung, die hier zur Verfügung gestellt wird, hat jedoch den Vorteil, daß sie leicht derartige Kinetiken bzw. Bewegungen, ebenso wie es das traditionelle Flickenklemmen tut, jedoch bei bedeutend höheren Durchsatzgeschwindigkeiten bzw. -raten auflösen kann.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran Ionenkanäle, welche eine Spezifität für Ionen zeigen, die aus der Gruppe gewählt sind, welche Natrium, Kalium, Kalzium, Chlorid umfaßt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran eine benachbarte bzw. zusammenhängende Schicht von Zellen, die fähig ist, mit einem hochresistenten Verschluß an Substraten anzuhaften, die aus der Gruppe gewählt sind, welche perforiertes Glas, Kunststoffe, Gummi, Polytetrafluorethylen (PTFE), PTFE/Glasgewebe und Polyethylenterephthalat (PETP) umfaßt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran ein Pseudo-Epithel, wobei eine Seite einer benachbarten Schicht bzw. zusammenhängenden Lage von Zellen permeabilisiert ist bzw. wird, wodurch ein Zugang zu dem Inneren bzw. zur Innenseite der Zellen zur Verfügung gestellt wird. Dies hat den großen Vorteil, die Mittel für ein Strom- und Spannungsklemmen zur Verfügung zu stellen, welches mit jeglichen existierenden Hochdurchsatz-Screeningsystem nicht möglich ist. Dies erlaubt nicht nur eine Aufzeichnung bei hoher Zeitauflösung, sondern stellt auch die Mittel zum Stimulieren oder Aktivieren von durch Spannung torgesteuerten Ionenkanälen in einer präzisen und gesteuerten bzw. geregelten Weise zur Verfügung. Beispielsweise ist es nicht notwendig, die ionische Zusammensetzung, z.B. durch ein Erhöhen von K⁺ zu verändern, um Zellen zu depolarisieren, was in sich selbst die Kinetik von Ionenkanälen (z.B. K⁺ Kanälen) modulieren kann und auch die Aktivität von neuem Liganden durch Konkurrenz an Ionenkanalbindungsstellen verschleiern kann. Es ist ein sehr großer Vorteil gegenüber sämtlichen existierenden Systemen. Eine Permeabilisierung erlaubt auch das Einbringen zu dem Cytosol von Verbindungen, welches ansonsten entweder aufgrund des Molekulargewichts oder von physikochemischen Charakteristika nicht möglich ist.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung der biologischen Membran eine durchgehende bzw. zusammenhängende Schicht von Zellen, welche permeabilisiert ist durch ein Antibiotikum, gewählt aus der Gruppe, welche Amphotericin und Nystatin umfaßt; oder ein Detergens, welches aus der Gruppe gewählt ist, welche Digitonin und Saponin umfaßt; oder eine physische Unterbrechung bzw. Aufspaltung unter Verwendung eines Hochspannungsfelds; oder durch eine enzymatische Verdauung eines Teils der Membran unter Verwendung eines geeigneten Enzyms.
Ein Vorteil einer Verwendung von Hochspannungsfeldern zum Permeabilisieren der Membran (Elektropermeabilisierung) ist, daß eine derartige Technik die Plasmamembran permeabilisieren kann, während kleinere intrazelluläre Strukturen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum geschont werden. Die Technik kann auch sehr präzise gesteuert bzw. geregelt werden und würde keinerlei Anlage bzw. Einrichtung zum Austausch von Lösungen in einer unteren Kammer der Aufzeichnungsvorrichtung erfordern.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Substrats eine perforierte Deckglasplatte bzw. ein perforiertes Coverslip.
Vorzugsweise hat eine Ausbildung des Substrats Poren mit Durchmessern zwischen 0,5 μm und 10 μm. Noch bevorzugter sind die Poren von Durchmessern zwischen 1 μm und 7 μm. Noch bevorzugter ist der Durchmesser 1–2 μm.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Substrats ein Porengitter mit einer größeren Anzahl als 4, jedoch weniger als 10. Dies stellt den Vorteil einer. statistisch akzeptablen Anzahl von Parallelaufzeichnungen (d.h. ≥ 4) in jeder Behandlung dar, ist jedoch klein genug, daß das Verhältnis von Poren zu Zellen verschwindend klein gemacht werden kann und somit die Möglichkeit bzw. Wahrscheinlichkeit, daß eine Pore versiegelt und somit durch eine Zelle verlegt wird, extrem hoch ist.
Vorzugsweise wird eine Ausbildung des Substrats gemäß der Erfindung aus einem Material hergestellt, das aus der Gruppe gewählt ist, welche Glas, Kunststoffe, Gummi, Polytetrafluorethylen (PTFE), PTFE/Glasfaser bzw. -gewebe und Polyethylenterephthalat (PETP) umfaßt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Siebes:
eine Mehrzahl von Kammern, die jeweils eine permeable Umfangsoberfläche aufweisen, die ein Substrat für die biologische Membran zur Verfügung stellt;
eine Mehrzahl von Vertiefungen, die jeweils fähig sind, eine Kammer und eine Testverbindung in einer physiologischen Lösung oder nicht-physiologischen Lösung aufzunehmen, die Dimethylsulfoxid (DMSO) oder ein anderes Lösungsmittel umfaßt;
eine Mehrzahl von Referenz- bzw. Bezugselektroden, wobei wenigstens eine einen elektrischen Kontakt mit jeder Vertiefung aufweist;
einen bewegbaren Aufzeichnungskopf, der wenigstens eine Aufzeichnungselektrode trägt, wodurch das Basis- bzw. Grunderfordernis für ein automatisiertes Aufzeichnen von Ionenkanalaktivität in einem Mehrvertiefungsplattenformat zur Verfügung gestellt wird;
Mittel zum Messen des elektrischen Widerstands oder der Impedanz zwischen den Aufzeichnungs- und Referenzelektroden; wobei
ein elektrischer Strom zwischen den Aufzeichnungs- und Referenzelektroden durch die permeable Umfangsoberfläche von jeder Kammer nur über Ionenkanäle oder -transporteure in der biologischen Membran hindurchtreten kann.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Siebes Vertiefungen, welche durch eine Mehrvertiefungsplatte zur Verfügung gestellt werden bzw. sind. Der Vorteil davon ist, daß ein hoher Durchsatz unter Verwendung von Komponenten mit Industriestandard erreicht werden kann, welche unter Verwendung von kommerziell verfügbaren automatisierten Ein richtungen oder Robotern bearbeitet werden können. Benutzer werden die Möglichkeit einer Verwendung ihrer bestehenden Plattenbearbeitungseinrichtung bzw. -ausrüstung besitzen, wodurch Kosten beim Einrichten eines Elektrophysiologie-Siebes mit hohem Durchsatz gemäß dem Stand der Technik gering gehalten werden.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Siebes ein perforiertes Substrat für die biologische Membran.
Vorzugsweise umfaßt eine weitere Ausbildung des Siebes eine Struktur oder biologische Membran, die oben beschrieben ist, die Ionenkanäle von Interesse in einem Feld von Tröpfchen auf einem porösen Substrat aufweist. Vorzugsweise ist bzw. wird ein Feld von Miniaturaufzeichnungskammern durch Anordnen eines "Deckels", der Aufzeichnungselektroden enthält, über der Matrix von Tröpfchen ausgebildet bzw. erzeugt, so daß ein Meniskus der Tröpfchenlösung aufgebaut bzw. ausgebildet wird. Vorzugsweise wird eine Testverbindung in elektrisch leitender Lösung in wenigstens einem der Tröpfchen angeordnet oder über Zugriffsöffnungen in dem "Deckel" aufgebracht und der Widerstand/die Impedanz (in Strom-Klemmenkonfiguration) der biologischen Membran oder die Leitfähigkeit (in Spannungs-Klemmenkonfiguration) wird unter dem Einfluß der Testverbindung gemessen. Ein Vorteil dieses Zugangs ist, daß Blätter von Substrat ohne das Erfordernis ausgebildet bzw. entworfen werden können, Stücke des Substrats (z.B. Scheiben) zu Mehrfach-Vertiefungsplatten zu übertragen, und auch die Ausbildung eines komplexen Kammerdesigns mit Dichtungen, "O"-Ringen und dgl. vermeidet. Die Erfindung kann immer noch eine Addition bzw. Zugabe von Lösungen aufnehmen und hat einen zusätzlichen Vorteil, daß sehr kleine Volumina und somit kleine Mengen an Reagenzien und Zellen verwendet werden. Eine exzellente Isolation wird durch die Luftspalte zwischen benachbarten Tröpfchen zur Verfügung gestellt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Aufzeichnungskopfs eine einzige bzw. einzelne Aufzeichnungselektrode, die fähig ist, bewegt zu werden, um jede Kammer sequentiell zu besuchen. Noch bevorzugter umfaßt eine Ausbildung des Aufzeichnungskopfs eine Mehrzahl von Aufzeichnungselektroden, die in einer Reihe bzw. Linie angeordnet sind. Noch bevorzugter umfaßt der Aufzeichnungskopf eine Mehrzahl von Aufzeichnungselektroden, die in einer Matrix angeordnet sind. Der Vorteil dieser Konfiguration ist, daß ein gleichzeitiges Aufzeichnen von allen Vertiefungen über ein Datenaufnahme-Multiplexsystem möglich ist.
Vorzugsweise ist eine Ausbildung des Siebes fähig, bis zu 384 Aufzeichnungselemente zu einem Datenerfassungsystem unter Verwendung von mehreren Spannungs-Klemmenverstärkern zu multiplexen. Dies hat den Vorteil, daß eine extrem hohe Zeitauflösung und effektiv eine simultane Messungen von allen Vertiefungen zur Verfügung gestellt wird. Dies hat den Vorteil, daß dem TERM System das Potential zur Verfügung gestellt wird, Durchsatzraten zu erzielen, die ähnlich zu den bestmöglichen für konventionell auf Fluoreszenz basierende Ligand-Rezeptor-Bindungsversuche (≥ 150,000 Verbindungen pro Woche) sind.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Verfahrens zum Herstellen der Struktur die Schritte eines simultanen Perforierens einer Deckplatte bzw. eines Coverslips und eines Abdichtens der Poren mit biologischer Membran. Diese Ausbildung stellt den Vorteil zur Verfügung, daß Schritte beim Ausbilden der Endkonfiguration eliminiert werden, nämlich Verfahren bzw. Prozeduren, die erforderlich sind, um die Wahrscheinlichkeit einer Zellabdichtung mit Poren in dem perforierten Substrat zu optimieren. Dies hat den Vorteil, daß das Endprodukt vereinfacht wird.
Vorzugsweise beinhaltet eine Ausbildung des Verfahrens zum Herstellen der biologischen Membran den Schritt eines Permeabilisierens einer Oberfläche der zusammenhängenden Schicht bzw. Lage von Zellen, wodurch ein Zugang zu dem Inneren der Zellen zur Verfügung gestellt wird. Dies hat den großen Vorteil, daß die Mittel für ein Strom- und Spannungsklemmen zur Verfügung gestellt werden, welches mit jeglichem existierenden Hochdurchsatz-Screeningsystem nicht möglich ist. Nicht nur erlaubt dies eine Aufzeichnung mit hoher Zeitauflösung, sondern stellt auch die Mittel zum Stimulieren oder Aktivieren von durch Spannung torgesteuerten Ionenkanälen in einer präzisen und kontrollierten bzw. gesteuerten bzw. geregelten Weise zur Verfügung. Beispielsweise ist es nicht notwendig, die Ionenzusammensetzung, z.B. durch Erhöhen von K⁺ zu verändern, um Zellen zu depolarisieren, was in sich selbst die Kinetik von Ionenkanälen (z.B. K⁺ Kanälen) modulieren kann und auch die Aktivität von neuen Liganden durch Konkurrenz an Ionenkanalbindungsstellen verdunkeln kann. Dies ist ein sehr großer Vorteil gegenüber allen existierenden Systemen. Eine Permeabilisierung erlaubt auch die Einbringung zu dem Cytosol von Verbindungen, was andererseits entweder aufgrund des Molekulargewichts oder aufgrund von physikochemischen Charakteristika nicht möglich wäre.
Vorzugsweise wird die Permeabilisierung ausgeführt durch den Schritt eines Kontaktierens der Oberfläche mit einem Antibiotikum, das aus der Gruppe gewählt ist, welche Amphothericin und Nystatin umfaßt; oder einem Detergens, das aus der Gruppe gewählt ist, welche Digitonin und Saponin umfaßt; oder eine physische Aufspaltung unter Verwendung eines Hochspannungsfelds; oder durch enzymatische Verdauung eines Teils der Zellmembran unter Verwendung eines geeigneten Enzyms.
Ein Vorteil einer Verwendung von Hochspannungsfeldern zum Permeabilisieren der Membran (Elektropermeabilisation) ist jener, daß eine derartige Technik die Plasmamembran permeabilisieren kann, während kleinere intrazelluläre Strukturen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum ver- bzw. geschont werden. Die Technik kann auch sehr präzise gesteuert bzw. geregelt werden und würde keine Anlage zum Austausch von Lösungen in einer unteren Kammer der Aufzeichnungsvorrichtung erfordern.
Vorzugsweise beinhaltet eine Ausbildung des Verfahrens zum Herstellen der biologischen Membran die Schritte eines Transfizierens von Zellen mit cDNA oder cRNA, die einen Ionenkanal von Interesse codieren, und Klonierungszellen, die den Ionenkanal von Interesse exprimieren. Diese Schritte versehen die Erfindung mit dem Vorteil, daß Studien an heterolog exprimierten geklonten Kanälen erlaubt werden, wo die Identität des nativen Kanals bekannt ist oder wo eine präzise Kenntnis der Wechselwirkung von Verbindungsstrukturen und chemischen Resten des Ionenkanals erforderlich ist.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Verfahrens zum Herstellen des perforierten Substrats die Schritte eines Ein stellens des Profils, der Verjüngung bzw. Neigung oder des Durchmessers der Pore mit einem Laser.
Vorzugsweise wird die Laserquelle durch eine automatisierte Stufe unter Steuerung bzw. Regelung eines Computers und eines invertierten bzw. umgekehrten Phasenkontrastmikroskops gesteuert bzw. geregelt, welches den Vorteil zur Verfügung stellt, daß eine visuelle Überprüfung der Porencharakteristika, z.B. des Profils, der Neigung bzw. Verjüngung und des Durchmessers ermöglicht bzw. erlaubt wird.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Verfahrens zum Herstellen des perforierten Substrats andere Nicht-Laserverfahren, wie Photoätzen, Gießen und physikalisches Durchstechen des Substrats.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Screen- bzw. Siebverfahrens den Schritt eines Messens einer Ionenkanalaktivität durch ein Überwachen von Trans-Epithel-Widerstandsmessungen (TERM) über eine intakte Zellschicht bzw. -lage.
In einer weiteren Ausbildung des Screeningverfahrens wird eine Oberfläche der durchgehenden bzw. zusammenhängenden Zellschicht vorzugsweise permeabilisiert, wodurch ein Zugang zu dem Inneren der Zellen zur Verfügung gestellt wird. Dies hat den großen Vorteil, die Mittel für Strom- und Spannungsklemmen zur Verfügung zu stellen, was mit jeglichem anderem existierendem Hochdurchsatz-Screeningsystem nicht möglich ist. Nicht nur erlaubt dies eine Aufzeichnung bei hoher Zeitauflösung, sondern stellt auch die Mittel zum Stimulieren oder Aktivieren von durch Spannung torgesteuerten Ionenkanälen in einer präzisen und gesteuerten bzw. geregelten Weise zur Verfügung. Beispielsweise ist es nicht notwendig, die ionische Zusammensetzung z.B. durch Erhöhen von K⁺ zu verändern, um Zellen zu depolarisieren, was in sich selbst die Kinetik von Ionenkanälen (z.B. K⁺ Kanäle) modulieren kann und auch die Aktivität von neuen Liganden durch Konkurrenz an Ionenkanalbindungsstellen verdunkeln kann. Dies ist ein sehr großer Vorteil gegenüber allen existierenden Systemen. Eine Permeabilisierung erlaubt auch die Einbringung zu dem Cytosol von Verbindungen, was ansonsten entweder aufgrund des Molekulargewichts oder physikochemischer Charakteristika nicht möglich ist.
Vorzugsweise ist eine Oberfläche der durchgehenden Zellschicht permeabilisiert durch Antibiotika, die aus der Gruppe gewählt sind, welche Amphotericin und Nystatin umfassen; oder Detergentien, die aus der Gruppe gewählt sind, welche Digitonin und Saponin umfassen; oder physische Aufspaltung unter Verwendung eines Hochspannungsfelds; oder durch enzymatische Verdauung eines Teils der Membran unter Verwendung eines geeigneten Enzyms, wodurch es ermöglicht wird, daß intrazelluläre Spannungs- oder Strommessungen ausgeführt werden.
Ein Vorteil eines Verwendens von Hochspannungsfeldern zum Permeabilisieren der Membran (Elektropermeabilisation) ist jener, daß eine derartige Technik die Plasmamembran permeabilisieren kann, während kleinere intrazelluläre Strukturen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum geschont werden. Die Technik kann auch sehr präzise gesteuert bzw. geregelt werden und erfordert keinerlei Einrichtung zum Tauschen von Lösungen in einer unteren Kammer der Aufzeichnungsvorrichtung.
Vorzugsweise stellt eine Ausbildung der Erfindung ein Screnningverfahren zur Verfügung, welches den Schritt eines Multiplexens von bis zu 384 Aufzeichnungselementen zu einem Datenerfassungssystem unter Verwendung von mehreren Spannungsklemmenverstärkern beinhaltet. Dies hat den Vorteil, daß eine extrem hohe Zeitauflösung und effektiv simultane Messungen von allen Vertiefungen zur Verfügung gestellt werden. Dies hat den Vorteil, das TERM System mit dem Potential zu versehen, daß Durchsatzraten ähnlich den bestmöglichen erzielt werden, die für konventionelle, auf Fluoreszenz basierende Ligand-Rezeptor-Bindungsversuche möglich sind (≥ 150,000 Verbindungen pro Woche).
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Verfahrens eines Screening für die Detektion oder einen Test von Verbindungen mit Aktivität auf Ionenkanäle von Interesse in einem Feld vom Tröpfchen auf einem porösen Substrat. Ein Feld von Miniaturaufzeichnungskammern kann durch Anordnen eines "Deckels", der die Aufzeichnungselektroden aufnimmt, über der Matrix von Tröpfchen derart erzielt werden, daß ein Meniskus einer Tröpfchenlösung ausgebildet bzw. aufgebaut wird. Eine Testverbindung beim Durchführen bzw. Ausbilden einer Lösung wird in wenigstens einem der Tröpfchen angeordnet oder über Zugriffsöffnungen in dem "Deckel" aufgebracht und der Widerstand der biologischen Membran oder die Leitfähigkeit (in der Spannungsklemmenkonfiguration) wird unter dem Einfluß der Testverbindung gemessen.
In einer alternativen Ausbildung des Screeningverfahrens wird die biologische Membran in einer Mehrzahl von Kammern angeordnet und eine Testverbindung in physiologischer Lösung oder nicht-physiologischer Lösung, umfassend ein Lösungsmittel, z.B. Dimethylsulfoxid, wird zu den Kammern zugesetzt.
Vorzugsweise umfaßt eine Ausbildung des Screeningverfahrens die Schritte einer Wirkstoffzufuhr und eines Waschens der Platte mit mehreren Vertiefungen.
Vorzugsweise beinhaltet bzw. inkorporiert eine Ausbildung des Screeningverfahrens einen Schritt einer Stimulation von Zellen, die die Verwendung eines photoaktivierbaren "Ionenfängers" involvieren, z.B. von Ionen wie K⁺. Die aktive Gesamtheit kann durch ein Blitzen bzw. Beleuchten der gesamten Platte auf einmal mit einer Lichtquelle hoher Intensität, z.B. einem Laser oder einer Xenonlampe freigesetzt bzw. freigegeben werden. Der Vorteil dieses Systems ist, daß das Membranpotential durch Verändern der ionischen Verteilung in einer nicht-invasiven Weise und mit feiner zeitlicher Kontrolle bzw. Regelung verändert werden kann.
Es wurde überraschend gefunden, daß eine biologische Membran mit einer Hochwiderstandsabdichtung bzw. einem hochresistenten Verschluß an einem perforierten Substrat zur Verwendung in einem Hochdurchsatz-Screnning für Testverbindungen angehaftet werden kann, die eine Aktivität auf Ionenkanäle besitzen. Dies wurde anfangs als nicht offensichtlich bzw. nicht erwartet für einen Fachmann unter Berücksichtigung der Tatsache betrachtet, daß eine Erzielung einer Hochwiderstandsabdichtung nicht ohne eine übermäßige Last möglich war. Weiters wurden perforierte Substrate, die eine biologische Membran daran geklebt bzw. versiegelt aufwiesen, nicht zur Verwendung in Hochdurchsatzsieben bzw. einem Hochdurchsatz-Screening nahegelegt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß eine biologische Membran, die fähig ist, mit einer Hochwiderstandsabdichtung an einem Substrat anzuhaften, zur Verwendung in einem Hochdurchsatzsieb bzw. -screening konstruiert werden kann. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die biologische Membran konstruiert werden kann, daß sie Ionenkanäle besitzt, welche vorherrschend die Ionenkanäle von Interesse sind. Weiters wurde überraschenderweise gefunden, daß ein Hochdurchsatzsieb konstruiert und verwendet werden kann, um einen Durchsatz von Testverbindungen zu detektieren und zu untersuchen, welche mehr als 30000 pro Woche betragen können.
Überraschenderweise kann das Sieb verwendet werden, um bona fide bzw. in gutem Glauben elektrophysiologische Daten zu erhalten, die sich auf die funktionelle Ionenkanalaktivität beziehen.
Die biologische Membran der Erfindung war für einen Fachmann in der Technik anfangs nicht erwartet bzw. offensichtlich. Eine Konstruktion einer biologischen Membran, die Hochwiderstandsversiegelungen bzw. -abdichtungen mit einem Substrat, wie perforiertem Glas aufweist, wurde noch nicht erzielt und wurde nicht ohne eine übermäßige Last bzw. Belastung als möglich erachtet. Zusätzlich wurde eine Konstruktion einer Membran, die Ionenkanäle besitzt, welche vorherrschend ein Ionenkanal von Interesse sind, ohne eine übermäßige Belastung nicht als möglich erachtet.
Die Hochdurchsatzsiebe und Verfahren der Erfindung waren anfangs nicht offensichtlich für einen Fachmann im Hinblick auf die Tatsache, daß es ohne eine übermäßige Belastung als nicht möglich erachtet wurde, den hohen Durchsatz von Test verbindungen, welcher durch die Erfindung erzielt werden kann, zu screenen bzw. zu sieben.
Zusätzlich zu dem Vorteil eines hohen Durchsatzes von Testverbindungen, können Ausbildungen des Siebs bzw. Screenings und des Verfahrens der Erfindung funktionelle Versuche bzw. Assays zur Verfügung stellen (z.B. Ligandenbindungen), in welchen die Art einer Tätigkeit (z.B. Blockieren oder Verstärken) der Testverbindung auf durch Spannung torgesteuerte Ionenkanäle über Änderungen in dem Membranwiderstand oder durch Aufzeichnen des Stroms gemessen wird, der durch die Ionenkanäle in der Membran direkt fließt.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele von bevorzugten Ausbildungen und die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in welchen:
1 eine Epithelzellversion eines Siebs entsprechend einer Ausbildung der Erfindung zeigt.
2 eine Ausbildung des Siebs der Erfindung zeigt, das ein perforiertes Substrat aufweist.
3 eine Adaptierung einer kommerziell erhältlichen Mehrvertiefungsplatte zur Verwendung in einem Screening bzw. Sieb gemäß einer Ausbildung der Erfindung zeigt. Diese Figur zeigt einen integralen Mehrfach-Aufzeichnungselektroden-Kopfcluster.
4 eine Ausbildung unter Verwendung eines bewegbaren Aufzeichnungskopfs zeigt, wobei ein einziger Aufzeichnungskopf sequentiell einzelne Vertiefungen liest.
5 eine Ausbildung eines Fluidmatrixsystems zeigt, wobei ein Feld von kleinen bzw. Miniaturaufzeichnungskammern ausgebildet wird, indem Tröpfchen auf das Aufzeichnungssubstrat in einem vorbestimmten Muster und Dichte verteilt werden. 5(f) zeigt das vollständige Sandwich (Aufzeichnungskonfiguration) des Systems.
6 eine weitere Ausbildung eines Fluidmatrixsystems zeigt, wobei mehrere Felder bzw. Arrays von Tröpfchen miteinander sandwichartig verbunden sind.
7 eine Pore zeigt, die in einem Substrat gemäß der Erfindung ausgebildet ist. Dieser Lichtmikrograph zeigt eine Pore in einem dünnen Glassubstrat. Die Pore, welche etwa 2 Mikrometer im Durchmesser war, wurde unter Verwendung von Pulsen von fokussierter Laserenergie, gefolgt durch eine Kombination von Feuerpolieren und Plasmamodifikation hergestellt. Der Meßbalken ist 10 Mikrometer quer.
Beispiele
Eine Ausbildung des Siebs bzw. Screens der Erfindung umfaßt eine Platte mit mehreren Vertiefungen mit integrierten Aufzeichnungsvorrichtungen, wodurch eine massiv parallele Spannungsklemme (MPVC) auf einer Mehrzahl von Vertiefungen in einer Ebene innerhalb kurzer Zeiträume (ca. 1–60 s) durchgeführt werden kann. Vorzugsweise wurden verfügbare Platten mit 96 oder 384 Vertiefungen angewandt bzw. eingesetzt, oder das Array- bzw. Feldformat mit 96 oder 384 Positionen wird angenommen.
Eine Ausbildung des Siebs der Erfindung stellt vorzugsweise einen Durchsatz von Testverbindungen von mehr als 30,000 pro Woche mit bona fide elektrophysiologischer "Auslesung" einer funktionellen Ionenkanalaktivität zur Verfügung. Eine Ausbildung des Siebs kann eine hohe Auflösung sowohl in Bezug auf die Zeit für eine Platte mit 96 Vertiefungen, lms/Punkt/Spannungsklemmen-Anordnung zur Verfügung stellen. Die Empfindlichkeit gegenüber einer Modulation der Kanalaktivität ist ≥ 1%.
Eine Ausbildung der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, welches die Schritte eines Messens von transepithelialen, elektrischen Widerstands über eine durchgehende Schicht bzw. zusammenhängende Lage von Zellen zur Verfügung stellt, welche hauptsächlich einen Ionenkanal von Interesse exprimiert. Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, daß das Verfahren von der Anhaftung der Zellen an einem Substrat abhängt, welches eine Bildung von dichten bzw. festen Verbindungen zwischen benachbarten Zellen erlaubt, so daß ein Hochwiderstandsblatt ausgebildet wird. Änderungen in der Aktivität der Ionenkanäle, die in den Membranen von individuellen Zellen exprimiert sind bzw. werden, werden durch Veränderungen in dem Widerstand über das Blatt als Gesamtes reflektiert. In einer Verfeinerung dieser Ausbildung der Erfindung wird ein Zugriff zu dem Inneren der Zellen, umfassend das Blatt, durch Mittel erhalten, welche erlauben, daß eine Populations-Strom- und Spannungsklemmablesung bzw. -aufzeichnung gemacht wird.
Transepithel-Widerstandsmessungen wurden wie folgt ausgeführt:
a) Epithelial/Endothelial-artige Zellen.
Der gesamte transepitheliale Widerstand besteht aus zwei Hauptkomponenten, der Summe der "Gesamtzell"-Leitfähigkeiten der individuellen Zellen, die das Pseudo-Epithel aufbauen, und der Summe der intrazellulären Leitfähigkeitswege.
Natürlich vorkommende Epithel-(und Endothel-)Zellen bilden dichte bzw. feste Verbindungen miteinander. Diese dichte Packung reduziert das Lecken von Ionen/Soluten bzw. lösbaren Stoffen zwischen den Zellen, was in einer relativ niedrigen Zahl von intrazellulären Leitfähigkeitswegen über die Membran als Gesamtes resultiert. Daher sind, wo Bedingungen es erlauben, daß dichte Verbindungen ausgebildet werden, Änderungen in der Zelltransmembranleitfähigkeit meßbar. Ein Zugang für dieses Verfahren war es, eine Hostbzw. Wirtszelle mit geeigneten Wachstumseigenschaften zu wählen. Zellarten bzw. -typen, welche auch native Ionenkanäle bei niedrigen Niveaus exprimieren, sind bzw. werden als geeignet für eine Expression bzw. Exprimierung von geklonten Ionenkanälen betrachtet. Eine große Hürde für einen Fachmann in diesem Zugang liegt im Erhalten von Zellen, in welchen das Letztere gültig ist.
b) Transepithel-Widerstandsmessung in Nicht-Epithelzellen
Eine Alternative zu dem oben beschriebenen Versuch ist es, Nicht-Epithelzellen zu verwenden, für welche bekannt ist, daß sie negierbare Anzahlen von Ionenkanälen von sich selbst als ein Basisexpressionssystem für geklonte Zellen exprimieren, welche Ionenkanäle der Wahl exprimieren. Es gibt zahlreiche Zellarten, welche dieses Kriterium erfüllen. Jedoch war eine große Hürde für einen Fachmann darin präsentiert, daß sie nicht durchgehende bzw. zusammenhängende Schichten von Zellen in der Kultur mit dichten Verbindungen ausbilden. In einer Ausbildung der Erfindung wird eine Hochwiderstands-"Epithel"-Schicht zur Verfügung gestellt, in welcher diese Hürde beseitigt bzw. überwunden wurde.
Transepithel-Strommessung (massiv parallele Spannungsklemme (MPVC)
Eine Ausbildung der Erfindung war durch ein Erzielen eines Zugangs zum Inneren von Zellen in dem "Epithel" gegeben, indem eine Seite bzw. Fläche von jeder Zelle, die zu der Zellschicht beiträgt, zerstört bzw. aufgespalten oder permeabilisiert wurde. Dies wurde durch chemische Verfahren ausgeführt, beispielsweise, indem es bestimmten Arten von Antibiotika (z.B. Amphotericin) oder Detergentien (Digitonin) ermöglicht wurde, in Kontakt mit einer Seite der Zelloberfläche zu gelangen, oder durch physikalische Zerstörung bzw. Aufspaltung, z.B. unter Verwendung von Hochspannungsfeldern (Elektroporation/Integralzapper).
Elektrische Aufzeichnungssysteme
Eine Anzahl von Systemen wurde entwickelt und sie werden unten beschrieben bzw. umrissen:
Pilot- bzw. Vortestsysteme
Für ein Pilot- bzw. Vortesten der Integrität von Pseudo-Epithelschichten, wurden Transepithel-Widerstände unter Verwendung einer Kammer gemessen, in welche permeable Gewebekulturträger bzw. Kulturträger eines permeablen Gewebes eingesetzt wurden (1). Zellen wurden in Kultur gezüchtet bzw. wachsen gelassen, um auf diesem Support zusammenzuschließen. In dem Fall von perforierten Substraten wurde das Material (z.B. ein Deckglas bzw. Coverslip) in einen für diesen Zweck gebauten Testaufbau eingesetzt, welcher eine Änderung in dem Druck in dem unteren Abteil und/oder der oberen Kammer ermöglichte und zur selben Zeit erlaubte, daß Widerstandsmessungen durchgeführt wurden (2). Um eine Polarisation der Elektroden zu vermeiden, wurde ein oszillierendes Spannungssignal über die Zellschicht über lineare oder kreisförmige Elektroden hindurchgeleitet, die über und unter dem permeablen Support positioniert waren, auf welchem die Schicht von Zellen aufwachsen gelassen wurde, und die Impedanz der Zellschicht wurde gemessen. In dem Fall von permeabilisierten Zellschichten (1b und 2b), wurde ein Spannungs- und Stromklemmenaufzeichnen unter Verwendung eines Spannungsklemmenverstärker durchgeführt, der mit einem Computer gekoppelt war, um experimentelle Protokolle zu steuern bzw. zu regeln und die Daten zu sammeln.
Maßstabvergrößerungen und Betriebssysteme
In entweder TERM oder MPVC verwenden kommerzielle Siebe ein Meßsystem einer Platte mit mehreren Vertiefungen (3), oder etwas Äquivalentes (z.B. Verwenden einer Tröpfchenmatrix, die unter Verwendung eines Nanoliter-Piezoverteilers generiert bzw. erzeugt wird). Diese wurden in einem gewissen Ausmaß von dem Vortestaufbau abgeleitet, erfordern jedoch das Design eines integralen bzw. einstückigen Aufzeichnungskopfs, von welchem Ausbildungen der Erfindung eine Anzahl von Möglichkeiten beinhalten. Sie sind unten beschrieben.

i) Einziger Aufzeichnungskopf, welcher einzelne Vertiefungen sequentiell liest (4).
ii) Bewegbare lineare Reihe von Aufzeichnungsköpfen (z.B. 12 für ein Plattensystem mit 96 Vertiefungen; 24 für ein System mit 384 Vertiefungen), welche über die Platte in 8 (96 Vertiefungen) oder 16 (384 Vertiefungen) Schritten bewegt werden.
iii) Elektrodenmatrix, die in die Platte eingebaut ist mit einem Multiplexen für ein Aufzeichnungs-Kopfzustands- & Erfassungssystem. Für Platten größerer Dichte wurden mehrfache Spannungsklemmen verwendet, um eine Abtast- bzw. Probennahmefrequenz und somit eine Zeitauflösung aufrecht zu erhalten (3).
iv) Tröpfchensystem (5).

Vielfachvertiefungs-Platten-Adaptierung
Ausbildungen des Siebs der vorliegenden Erfindung beinhalten vorzugsweise einen integralen automatisierten Pipettierer in den Arbeitsversionen von TERM und MPVC.
Vorzugsweise beinhalten Ausbildungen des Siebs der Erfindung eine Anlage zum Waschen von Aufzeichnungsköpfen zwischen einer Verwendung in gesonderten Reihen.
Gemäß einer Ausbildung der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung der biologischen Membran die Schritte eines Erhaltens einer Hochwiderstandsabdichtung bzw. eines hochresisten Verschlusses mit einem perforierten Glassubstrat (oder einem anderen Support) und/oder den Schritt eines Erhaltens einer Zellinie, die die Fähigkeit besitzt, Blätter auszubilden, und die eine niedrige oder vernachlässigbare Anzahl von nativen bzw. ursprünglichen Ionenkanälen aufweist.
Epithelzell-Versuch bzw. -Näherung
Natürlich auftretende Zellinien und künstliche Zellinien wurden entwickelt. Sie werden unten beschrieben:
Natürlich auftretende Zellinien
Zellinien, auf welche in der Literatur Bezug genommen wird, wurden in bezug auf die von der "Lager"-Eignung evaluiert. Ursprüngliche Kandidaten beinhalteten ECV-304, RBE4 und C6 Gliomazellen. Kriterien für eine Verwendung waren:

a) Fähigkeit, durchgehende bzw. zusammenhängende Schichten von Zellen mit dichten bzw. festen Verbindungen auszubilden; Transepithel-Widerstand von ≥ 125 Ω cm^–2.
b) niedrige bis vernachlässigbare Anzahlen von durch Spannung torgesteuerten Hintergrund-Ionenkanälen, wie diese durch eine Gesamtzellen-Flickenklemme durch Standardverfahren beurteilt werden. Vorzugsweise ist das Leitfähigkeitsniveau ≤ 2 nS pro Zelle.

Künstliche bzw. entwickelte Zellinien
Eine geeignete Zellinie wurde durch molekulares Engineering bzw. Molekularbearbeitung hergestellt. Wenn Hintergrundleitfähigkeiten von natürlich auftretenden Zellinien über dem in (b) oben gegebenen Schwellwert lagen, wurde die Zellinie in bezug auf ein mögliches Gen-Knockout überprüft, um eine neue Host- bzw. Wirtszelle zu erzeugen.
Künstliches Epithel
Perforierte Substrate
Perforierte Substrate wurden, wie unten ausgeführt, hergestellt:
Durch Laser generierte bzw. erzeugte Substrate
a) Prototypen
Glas-Deckgläser bzw. -Coverslips wurden in einer sequentiellen Weise (1 Loch pro Zeiteinheit) unter Verwendung einer Laserenergiequelle im Zusammenhang mit einer automatisierten Stufe unter Computersteuerung bzw. -regelung und eines umgekehrten optischen Mikroskops hergestellt. Dies erlaubte, daß Prototypen mit einer feinen Steuerung bzw. Regelung von Parametern, wie dem Fokus- bzw. Brennpunktbereich, der Laserleistung und der Zeit einer Belichtung erzeugt wurden. Die Fähigkeit zum Erzielen einer Hochwiderstandsabdichtung bzw. eines hochresisten Verschlusses zwischen den Zellen und dem Substrat wurde unter Verwendung von Coverslips getestet, die auf diese Weise erzeugt bzw. hergestellt wurden.
Gittermuster wurden reproduzierbar in variablen Formaten mittels einer computergesteuerten bzw. -geregelten Stufe erzeugt, welche mit dem Laser über den Computer zwischengeschaltet bzw. verbunden war. Deckgläser bzw. Coverslips von verschiedenen Materialien, beinhaltend Glas (ebenso wie Kunststoffe und andere biokompatible Materialien), wurden verwendet. Ihre Durchmesser waren 10 mm (Platte mit 96 Vertiefungen) oder 5 mm (Platte mit 384 Vertiefungen); und sie waren von variabler Dicke (ca. 1–20 μm). Poren wurden mit Durchmesser erzeugt bzw. generiert, die zwischen 0,5 μ und 10 μ variierten. Das Profil der Bohrung, ihre Neigung bzw. Verjüngung und ihre Innen- und Außendurchmesser wurden evaluiert, um eine Dichtung mit den Testzellen zu optimieren. Es ist wichtig, das geeignete Niveau einer Glätte der Bohrung aufzubauen. Die Porendichte wurde in Bezug auf Signal-zu-Rausch-Charakteristika, Wiedergabetreue der Spannungs-Klemmaufzeichnung und statistische Betrachtungen bzw. Überlegungen optimiert.
Um ein Abdichten zwischen der Zelle und der Pore zu unterstützen bzw. zu ermutigen, wurde eine Anzahl von Näherungen bzw. Zugängen eingenommen (1). Diese sind unten ausgeführt bzw. umrissen:

i) Negativer Druck in einem unteren flüssigen bzw. Flüssigkeitsabteil, z.B. unter Verwendung eines Venturi-Effekts, der durch ein Fließen einer Lösung über die vordere bzw. ventrale Öffnung und/oder durch ein Zuführen der fließenden Lösung bei einem reduzierten Gesamtdruck bewirkt ist.
ii) Positiver Druck in dem oberen Flüssigkeitsabteil.
iii) Beschichten des Coverslips mit einem Antihaftmaterial, welches in dem Porenbereich während des Porenherstellungsverfahrens abgebrannt wird (z.B. laserinduzierte Porenausbildung).
iv) Einrichtung, um das Coverslip zu schütteln oder zu vibrieren, um die Zellen zu ermuntern, Poren "zu finden", bevor sie an dem Substrat an Nicht-Porenstellen anhaften.
v) Entweder ein Deckglas- bzw. Coverslip-Karussell oder ein Mehrvertiefungs-Platten-Karussell, um ein Zentrifugieren zu erlauben.
vi) Anlegen eines Spannungsfelds über Poren, um Zellen in einem Porenmund zu bewegen.

Überraschenderweise stellte eine laserinduzierte Porenbildung bemerkenswerte Ergebnisse zur Verfügung.
7 zeigt eine typische Pore, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde. Wenn physiologische Lösungen zu jeder Seite der Pore hinzugefügt wurden, wurden Transsubstratwiderstände typischerweise in dem Bereich von 200 kOhm bis 400 kOhm routinemäßig beobachtet. Durch den Zusatz von Zellen war der beobachtete Widerstand dieser Figur etwa doppelt. Mit der zusätzlichen Anwendung von einem oder mehreren der Zugänge, die oben angeführt wurden, wurden Widerstandsmessungen, die sich dem Gigaohm-Bereich annäherten, beobachtet.
b) Maßstabsvergrößerungen
Eine Bulk- bzw. Volumsperforation und ein gleichzeitiges Aufzeichnen (Abdichten) wurden evaluiert. Der Zugang umfaßte ein "Blitzen" bzw. Beleuchten der gesamten Bodenoberfläche einer Mehrvertiefungs-Platte (oder einer äquivalenten Matrix) mit einer Hochenergie-Laserquelle. Mit einer geeigneten Vertiefungsstruktur war der präzise Ort der erforderlichen Poren bekannt und mit einer geeigneten bzw. entsprechenden Titration einer Zelldichte wurde eine hohe Wahrscheinlichkeit erzielt, daß eine Zelle "vorliegt". Die Platte wurde perforiert und die ventrale Zelloberfläche brach nahezu gleichzeitig. Dies erforderte einen Laser viel höherer Energie als jener, der in den Prototypen (oben) verwendet wurde.
c) Zellarten
Obwohl Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) verwendet wurden, um die Erfindung zu entwickeln, wird es einem Fachmann offensichtlich sein, daß eine große Vielzahl von Zellinien und primären Zellen, wie z.B. Neuronen, die aus intakten Geweben isoliert sind, angewandt bzw. eingesetzt werden kann.
Andere Perforationsverfahren
Alternative Verfahren zum Perforieren von Glas-Coverslips und andere Materialien wurden evaluiert, wie ein Ätzen, Glasgießen oder Kunststoffblätter.
Poröser Kautschuk bzw. Gummi
Poröse Gummisubstrate sind kommerziell verfügbar bzw. erhältlich, um Zellen in Zellkultur zu züchten bzw. aufwachsen zu lassen. Die Porosität wurde in dem Kontext der Widerstands- und Strommeßanwendungen evaluiert, die hierin beschrieben sind.
Andere Materialien
Es wird einem Fachmann in der Technik offensichtlich sein, daß zusätzliche Materialien, wie PTFE, PETP usw. in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewandt werden können. Diese haben den Vorteil, daß sie hohe Dielektrizitätskonstanten besitzen, jedoch auch in extrem dünnen Blättern hergestellt werden. Dies hat den Vorteil, daß die minimalen Serienwiderstände in dem Gesamtsystem reduziert werden und auch das Einbringen von exogenen Substanzen zu dem Zellcytosol erleichtert wird.
Mehrvertiefungsplatten-Aufzeichnungsvorrichtung
Die grundsätzliche Mehrvertiefungsplatten-Aufzeichnungsvorrichtung nimmt vorzugsweise ein 96-Vertiefungs/Stellen-Format ein. Vorzugsweise werden mehrere des 96-Vertiefungs-Formats mit einer minimalen Ausdehnung bzw. Aufweitung auf das Format mit 384 Vertiefungen konstruiert. Der Vorteil des Erhöhens der Vertiefungs-Dichte ist jener, daß die Menge an Testverbindung, die verwendet wird, reduziert wird und weniger Platten verwendet werden mit den damit einhergehenden Reduktionen in zusätzlichen Betriebskosten pro getesteter Verbindung.
Die folgenden zwei Näherungen wurden evaluiert: –

a) eine TΩRM Arbeitsstation, die ausgebildet ist, um mit kommerziell verfügbaren Robotern und Plattenprozessoren zusammenzuwirken.
b) Vollständig integriertes Stand-Alone-System, welches eine Plattenhandhabung, Lösungsänderungen und Aufzeichnungsstufen zur Verfügung stellt.

Fluidmatrixsystem
Ein Feld bzw. Array von Miniaturaufzeichnungskammern wurde durch ein Verteilen von Tröpfchen, enthaltend eine Suspension von Zellen, auf das Aufzeichnungssubstrat in einem vorbestimmten Muster und einer vorbestimmten Dichte erzeugt (siehe 5). Das Substrat kann eines der Arten sein, die oben beschrieben wurden, z.B. perforiertes Glas, Kunststoff, Gummi usw. Die vollständige Aufzeichnungskonfiguration ist bzw. wird durch Anordnen eines "Deckels" oder eines bewegbaren Aufzeichnungskopfs, der Aufzeichnungselektroden enthält, über der Matrix von Tröpfchen erzielt bzw. erhalten, so daß ein Meniskus der Tröpfchenlösung ausgebildet wird, wie dies in 5 beispielhaft dargestellt ist. Ein Feld von Tröpfchen kann auch auf der Rückseite des porösen Substrats generiert bzw. erzeugt werden, um einen leitenden Pfad zu wenigstens einer Referenz- bzw. Bezugselektrode und auch die Mittel zur Verfügung zu stellen, durch welche Substanzen auf die untere Oberfläche des Substrats und somit die Zellmembranen aufgebracht werden können. In gleicher Weise können Reagenzien über eine weitere Tröpfchenmatrix aufgebracht werden, die auf die "Aufzeichnungsplatte" aufgebracht wird, wie dies in 6 gezeigt ist. Wirkstofflösungen können auf eine Aufzeichnungs-"Kopf-"Platte aufgegeben werden; die Platte kann dann invertiert werden; und die invertierte Platte kann mit der Zellmatrix verbunden werden, um die Wirkstoffe in Kontakt mit den Zellen zu bringen. Der Vorteil dieses Zugangs ist, daß Blätter des Substrats ausgebildet bzw. entwickelt werden können, ohne das Erfordernis, Substratscheiben zu Mehrvertiefungsplatten zu transferieren, und er vermeidet auch komplexe Kammerdesigns mit Dichtungen, "O"-Ringen und dgl. Die Erfindung kann unverändert bzw. dennoch einen Zusatz von Lösungen aufnehmen, und hat den zusätzlichen Vorteil, sehr kleine Volumina und somit kleine Mengen von Reagenzien und Zellen zu verwenden.
Referenzen

Brew, H and Attwell, D. (1987). Electrogenic glutamate uptake is a major current carrier in the membrane of axolotl retinal glial cells. Nature, 327, 707–9
Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. & Sigworth, F. J. (1981). Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflüger's Archives, 391, 85–100.
Hille, B. (Hrsg.). Ionic channels of excitable membranes. 1992.
Sinauer Associates, Sunderland. Sakmann, B. & Neher, E. (Hrsg.). Single-channel recording. 1995. Plenum Press, New York & London.
Margolskee, R. F., McHendry-Rinde, B. and Horn, R. (1993). Panning transfected cells for electrophysiological studies. Biotechniques, 15, 906–911
Sheng, M. (1996). PDZs and receptor/channel clustering: rounding up the latest suspects. Neuron, 17.

1: Zellen
2: permeabilisierte Zelloberfläche
3: Spannungsklemme
4: poröses Substrat
5: Elektrode
6: Vertiefungswand
7: Lösungsperfusionskanal
8: Zellinie oder primäre Zelle
9: permeabilisierte Zelle
10: Mehrvertiefungs-Platte (z.B. 96 Vertiefungen)
11: integraler Aufzeichnungskopfcluster
12: Multiplexer
13: ADC/Computer
14: Fluidniveau
15: Pore
16: O-Ring
17: Aufzeichnungsanordnung
18: Zellplatte
19: Bezugs- bzw. Referenzplatte
20: Aufzeichnungsplatte
21: Referenz- bzw. Bezugselektrode
22: Aufzeichnungselektrode
23: "Halb-Sandwich"
24: Vollsandwich (Aufzeichnungskonfiguration)

Claims

Struktur, die eine biologische Membran umfasst, die mit hochresistentem Verschluss an einem Substrat zur Verwendung in einem Siebverfahren mit hohem Durchsatz anhaftet, wobei: die biologische Membran einen Ionenkanal oder -transporteur umfasst; und das Substrat aufgrund von Perforationen, die durch das Substrat Poren bilden, porös ist.
Struktur nach Anspruch 1, wobei die biologische Membran eine zusammenhängende Lage von Zellen umfasst, die an einem Substrat mit hochresistentem Verschluss anhaften kann, wobei jede Zelle eine Zell-Zell-Verbindung mit angrenzenden Zellen bildet und einen Ionenkanal oder -transporteur exprimiert, der sich in der Zellmembran befindet.
Struktur nach Anspruch 1 oder 2, die Zellen mit einem Ionenkanal oder -transporteur umfasst, der naturbedingt in deren Zellmembran liegt oder durch Transfektion mit cDNA und/oder cRNA eingefügt werden kann, die den Ionenkanal oder -transporteur kodiert.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, die eine Mehrzahl von Ionenkanälen oder -transporteure umfasst, die überwiegend zuvor ausgewählte Ionenkanäle oder -transporteure von Interesse sind.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend gentechnisch bearbeitete Zellen, die so bearbeitet würden, dass sie überwiegend einen Ionenkanal oder -transporteur exprimieren.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend spannungsgesteuerte Ionenkanäle.
Struktur nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus HEK-293 Zellen, genetisch veränderten Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Primärnervenzellgewebe wie Hippocampus, Spinalganglien, Ganglia cervicale superius usw.; Skelettmuskel; Weichteilmuskel; Herzmuskel; Immunzellen; Epithelien; Endothelien.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, die einen Ionenkanal mit schneller Aktivierungs- und Inaktivierungskinetik umfasst.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche mit einem Ionenkanal, der Spezifität für ein Ion aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium, Calcium, Chlorid.
Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die zusammenhängende Lage von Zellen mit hochresistentem Verschluss an einem Substrat anhaften kann, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Kunststoff, Gummi, Polytetrafluorethylen (PTFE), PTFE/Glasgewebe und Polyethylenterephthalat (PETP).
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, die ein Pseudo-Epithelumfass, wobei eine Fläche einer zusammenhängenden Lage von Zellen permeabilisiert wird, wodurch ein Zugang zur Innenseite der Zellen ermöglicht wird.
Struktur nach Anspruch 11, die ein Pseudo-Epithel umfasst, wobei eine Fläche der zusammenhängenden Lage von Zellen permeabilisiert wird durch ein Antibiotikum, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amphotericin und Nystatin; oder ein Detergens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Digitonin und Saponin; oder physische Aufspaltung mit einem Hochspannungsfeld; oder enzymatischen Verdau eines Teils der Membran unter Verwendung eines geeigneten Enzyms.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat perforiert ist.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, die ein perforiertes Coverslip umfasst.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat Poren mit einem Durchmesser zwischen 0,5 μm und 10 μm hat.
Struktur nach Anspruch 15, wobei die Poren einen Durchmesser zwischen 1 μm und 7 μm haben.
Struktur nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Poren einen Durchmesser von 1 bis 2 μm haben.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, die ein Coverslip mit einem Gitter aus Poren umfasst.
Struktur nach einem der vorherigen Ansprüche, die ein perforiertes Substrat umfasst, das aus einem Material hergestellt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Kunststoff, Gummi, Polytetrafluorethylen (PTFE), PTFE/Glasgewebe und Polyethylenterephthalat (PETP).
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz zum Erfassen und Prüfen von Verbindungen mit Aktivität auf spannungsgesteuerten Ionenkanälen, die eine Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 19 umfasst.
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz nach Anspruch 20, die Folgendes umfasst: eine Mehrzahl von Kammern mit jeweils einer durchlässigen peripheren Oberfläche, die ein Substrat für die biologische Membran bereitstellt; eine Mehrzahl von Wells, die jeweils eine Kammer und eine Testverbindung in einer physiologischen Lösung oder nichtphysiologischen Lösung, umfassend Dimethylsulfoxid, aufnehmen können; eine Mehrzahl von Referenzelektroden, die elektrischen Kontakt zu jedem Well haben; einen beweglichen Aufzeichnungskopf, der wenigstens eine Aufzeichnungselektrode trägt; ein Mittel zum Messen des elektrischen Widerstands oder der Impedanz zwischen den Aufzeichnungs- und Referenzelektroden; wobei elektrischer Strom zwischen den Aufzeichnungs- und Referenzelektroden durch die durchlässige periphere Oberfläche jeder Kammer nur über Ionenkanäle oder -transporteure in der biologischen Membran fliegen kann.
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz nach Anspruch 21, wobei die Wells von einer Multiwellplatte bereitgestellt werden.
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz nach Anspruch 20, die eine Anordnung von Tröpfchen auf einem porösen Substrat umfasst.
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz nach einem der Ansprüche 22 bis 25, die einen Aufzeichnungskopf mit einer einzelnen Aufzeichnungselektrode umfasst, die bewegt werden kann, um die einzelnen Kammern nacheinander aufzusuchen.
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz nach einem der Ansprüche 20 bis 23, end einen Aufzeichnungskopf mit einer Mehrzahl von in einer Reihe angeordneten Aufzeichnungselektroden umfasst.
Siebvorrichtung mit hohem Durchsatz nach einem der Ansprüche 20 bis 23, die einen Aufzeichnungskopf mit einer Mehrzahl von in einer Matrix angeordneten Aufzeichnungselektroden umfasst.
Verfahren zur Herstellung der Struktur nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend die folgenden Schritte: Selektieren eines Substrats, Perforieren des Substrats, Zuführen einer biologischen Membran zum Substrat und Verschließen jeder Pore mit biologischer Membran.
Verfahren nach Anspruch 27, umfassend die folgenden Schritte: simultanes Perforierens eines Substrats und Verschließen der Poren mit biologischer Membran.